CN103893211A - 包含人胚胎干细胞和其衍生物的组合物、其使用方法和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由人胚胎干(hES)细胞制备物组成的药物组合物和将它们移植入人体中的方法，其中所述移植导致各种目前无法治愈和终结性医学病症、疾病和失调的临床症状逆转、治愈、稳定或变性被阻滞。本发明还涉及制备不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的新干细胞系的新方法。本发明还涉及分离、培养、维持、扩增、分化、储存和保存这类干细胞。

Description

包含人胚胎干细胞和其衍生物的组合物、其使用方法和制备方法

发明背景

本发明专利申请是国际申请号为PCT/IB2007/002292，国际申请日为2007年3月6日，进入中国国家阶段申请号为200780013128.X的发明专利的分案申请。

发明领域

本发明涉及含有人胚胎干(hES)细胞或其衍生物的药物组合物，所述干细胞不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基，用于治疗目前无法治愈的、终末的和医学的疾病、病症或失调。更具体说，本发明涉及通过移植方法治疗临床疾病以及绝症或目前无法治愈的疾病的方法。本发明还涉及制备新型干细胞系的新方法，该干细胞系不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基。本发明还涉及这类干细胞的分离、培养、维持、扩增、分化、储存和保藏。

背景技术

大量人类医学失调、病症和疾病目前通过现有药物、手术或移植方法无法治愈，或者说它们是绝症。

干细胞能够分裂产生保持该干细胞特性的“子”细胞，或者产生开始分化为更特化的细胞类型的子代，或者产生各种类型的子代细胞。因此，干细胞在正常人生长和发育中起到核心作用，因其固有特性，它们也是患病或损伤组织再生时新细胞的潜在来源。干细胞存在于所有发育阶段和许多(可能是大多数)成人组织中。来自不同组织和不同发育阶段的干细胞通常情况下产生的细胞数量和类型不同。按照这种分类方法，主要的干细胞类型是胚胎干细胞、体干细胞和胚胎生殖细胞。

受精后最早期(早至8细胞期)，所有胚细胞都是全能干细胞(即它们能够发育成完全发育所需的所有细胞类型，包括胚外组织如胎盘和脐带)。约2-5天后到达胚泡期。在这个50-100个细胞的球内产生内细胞群，它们发育成胚体。内细胞群约占此发育阶段所有细胞的四分之一，是一类独特的干细胞：胚胎干细胞。胚胎干细胞具有分化成200种左右身体细胞类型的先天能力或潜能，被称为多潜能干细胞。hES细胞在发育过程中产生所有组织类型的能力尚未完全证实，但它们在长期培养和数量扩增时不会改变其细胞基因型或表型，并且在这些条件下维持其多潜能状态。

胚泡期后，干细胞在胚胎、胎儿和成年人体中所占比例逐步降低。胎儿和成年人中许多(如果不是大多数)组织含有干细胞，它们在其正常位置上具有分化成有限数量的特定细胞类型的潜能，以便在其正常存在的组织中起到再生作用。这些干细胞(躯体干细胞)是多能干细胞，与胚胎干细胞相比它们可能具有更受限的潜能，因为它们通常产生一些，而非全部人体细胞类型。躯体干细胞的主要来源是胎儿和成年人的骨髓和脐带血。

胚胎干细胞用作研究细胞分化事件、药物筛选的重要体外系统，并用作再生性治疗应用所用的特化分化细胞的主要来源。

多潜能的胚胎干细胞具有产生任何分化的细胞类型的发育潜能。因此，可通过移植hES细胞或其衍生物置换缺陷型细胞和再生患病器官或组织，也通过刺激休眠和垂死组织治疗特定细胞类型的遗传或获得性衰竭或失调产生的疾病。

将hES细胞或其衍生物移植到人体内可能用作解决未满足的医学需要的方式。

虽然广泛认为，移植hES细胞将彻底改变各种疾病、病症和失调的治疗但迄今为止，研究仍限于小数和灵长动物的临床前研究。值得怀疑的是在动物模型上观察到的结果能否真实代表将这类细胞移植入人体后发生的事件。而且，因为该观念未临床使用，所以尚未确定和检测干细胞的药物组合物、实验方案、给药途径和给药剂量。而且，虽然临床上已经使用衍生自胚胎外来源的人类干细胞或异种移植其它物种的细胞、组织和器官；但这些尝试大部分不成功，或产生各种削弱性副作用。

本发明提供将含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物移植入患有各种目前无法治愈的或终结末的病症、疾病或失调的人。

美国专利5,453,457公开了一种包含原生殖细胞产生的非鼠哺乳动物多潜能细胞和碱性成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和白血病抑制因子的组合物。

美国专利6,800,480请求保护一种包含在细胞外基质上增殖的未分化hES细胞的组合物。

美国专利申请2003/0017587公开了利用不含饲细胞的培养基体外扩增获自流产胎儿或者新鲜或冷冻的卵裂期胚泡的未分化胚胎干细胞。一旦分离后，将胚胎干细胞加入补充有生长因子、胎牛血清、神经元生长因子、白血病抑制因子、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子或条件培养基的细胞培养基中，由于植入患者后可能产生副作用而不希望出现这些补充成分。同时，所述专利申请并未记载用于治疗遗传或临床疾病的方法，除了患者需要每种细胞类型各一剂。

美国专利申请2004/0071665提供了使用哺乳动物干细胞治疗心脏病的方法。该例提供分化形成心肌原性细胞群、在饲细胞上培养、然后注射到发生心肌梗塞的小鼠心脏的三个位点的胚胎干细胞。

美国专利申请2004/0107453公开了获得、维持和分化成人干细胞的方法和它们在治疗性治疗中的应用。

美国专利申请2005/0124003公开了获得、维持和分化胎儿干细胞的方法和它们在治疗性治疗中的应用。

具体说与本发明特别相关的是，将胚胎干细胞移植到小鼠脊髓损伤(SCI)模型中明确表明其用于急性SCI的一线治疗的潜能(McDonald等，(1999)Nature Med.5：1410；Kerr等，(2003)J.Neurosci.23:5131；Roy等(2004)Nature Biotechnology，22:297；Hori等(2003)Stem Cells，21:405；Harper(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101:7123)。尽管在动物模型中具有功效，但怀疑会产生移植物抗宿主排斥问题，可能终生需要给予免疫抑制剂以及形成肿瘤和畸胎瘤拖延了对于实验性人体试验中重现临床前安全性和功效的批准。面对设计临床研究并与本发明特别相关的的其它问题是，迄今为止，尚未建立给药方法或方案，没有研究应该使用的治疗有效剂量、活性药物组合物或何种细胞类型或细胞组合。

因此，本发明目的是开发悬浮于生物相容性溶液、载体或基质，从而适合人用的药物组合物，其含有hES细胞和其衍生物，不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基。

本发明的另一个目的是开发治疗目前无法治愈的疾病或绝症的方法。

本发明的另一个目的是开发治疗SCI(脊髓损伤)的方法。

本发明组合物易于制备、安全、经济、有效、易于运输、可扩大规模、具有良好的储存寿命并且不存在诸如抗体-抗原反应、异常神经支配、肿瘤原性、形成畸胎瘤或移植物抗宿主排斥等副作用。另外，本发明只需要一个胚胎，因此不需要连续供应人胚胎。同时，本发明治疗方案不需要使用免疫抑制剂，并且不依赖HLA分型，其对疾病、病症或失调的有效治疗不依赖被治疗对象的人种、性别或年龄，不会消退并且不需要对给药领域技术人员进行预先培训。因此，可以在世界上任何适当装备的临床机构根据本发明实践用药物组合物治疗对象。

出于治疗目的将人胚胎干细胞植入人体，这类细胞不含污染如细菌、病毒、朊病毒或类病毒很重要。采用标准操作实验规范如优质生产规范和优质临床规范能将这种污染的风险降低至可接受水平。

然而，通过现有细胞培养方法治疗对患者而言有风险。

主要风险是给予人对象的药品中存留的细胞培养基组分，因此代表患者发生无法通过动物水平的“安全性”研究来预测的尚未预料到的副作用的风险。

因此，需要消除这类风险。

给予人对象的胚胎干细胞培养来源的特征被鉴定为具有以下设计：它能够在延长时间内增殖而不分化，维持在培养期间忠实地保持所有供体特征的核型，在整个培养过程中维持分化成内胚层、中胚层和外胚层的衍生物的潜能，在没有外源因子的情况下培养时不会分化，不产生畸胎瘤，没有免疫原性，不会形成异常的结缔组织和异位组织，会作用于损伤组织，在体内不会连续分裂，如同在天然生命周期中它们会程序性进行这些行为。本发明所述的培养方法和细胞系中应该不存在污染物。

迄今为止研究的主要动力是开发满足这些要求的培养条件，但迄今为止，尚未通过临床试验发现或验证这类条件。具体说，迄今为止的研究关注于消除小鼠饲细胞作为培养基质和人胚胎干细胞培养物反分化的需要。通过去除饲细胞和补充“条件培养基”提供未知生长因子的部分补救也在理想培养基中引入了不可接受的风险。饲细胞条件培养基存在下培养的人胚胎干细胞仍然保留了污染的固有风险，因此在移植入人体期间是不可接受的风险。

设计给予人的人胚胎干细胞培养条件的其它因素是对所给药物组合物中可能存在而在细胞扩增期间必需的培养基的外源性补充剂的残留的疑问。

它们包括碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子、血清、清蛋白或清蛋白补充剂、氨基酸补充剂、维生素补充剂、转铁蛋白或转铁蛋白补充剂、抗氧化剂、胰岛素或胰岛素替代物、胶原前体或胶原前体替代物、痕量元素、“条件培养基”残留物、动物产品、饲细胞、生长因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂和维生素补充剂。

所述其它补充剂的残留物被视作移植人胚胎肝细胞过程中对患者安全性的不必要风险。此外，将这类因子补充到培养基中增加了环境污染的风险，并且提高了干细胞治疗应用的成本，因此限制了它在各种医学疾病、病症或失调中的实用性。

已采用许多方法降低此类风险，包括：美国专利和申请号5,843,780；5,690,926；6,642,048；6,800,480；5,166,065；6,200,806；5,453,357；6,090,622；6,562,619；6,921,632，2006/0073587和2002/076747。

然而，这些方法都没有提供一种产生含有人胚胎干细胞和其衍生物的药品的系统，所述药品不含给予人后可能影响人胚胎干细胞和其衍生物的功效和安全性的潜在污染性因子。

因此，本发明的另一个目的是开发一种以基本不分化的状态扩增hES细胞和其衍生物，以产生易于应用于各种医学疾病的药品的简化细胞培养系统。

更具体说，本发明的目的是提供一种产生不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的干细胞系的培养技术。

发明概述

本发明提供含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物和hES细胞和其衍生物在治疗各种病症、疾病或失调中的应用，其中通过各种给药途径、局部施用或损伤内插入途径将所述干细胞引入人体。

本发明还提供治疗患有终末的或目前无法治愈的疾病、失调或病症的对象的方法，所述方法包括通过肌肉内、静脉内、尾侧、玻璃体内、纹状体内、实质内、鞘内、硬膜外、眼球后、皮下、心内、囊内、关节内或鞘内注射、硬膜外导管输注、蛛网膜下腔阻滞导管输注、静脉内输注、通过喷雾器、喷雾、阴道内途径、局部的眼滴剂和耳滴剂给予治疗有效量的hES细胞或其衍生物的方案和通过局部或损伤内途径给予hES细胞和其衍生物的方案。

优选使用不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、维生素补充剂、氨基酸补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的hES细胞或其衍生物，以避免任何污染风险和副作用的可能。可通过任何已知或批准的细胞培养方法获得hES细胞和其衍生物，它不含饲细胞以及任何来源的污染物，对人移植而言是安全的。hES衍生物包括来自人体进一步分化的细胞。

本发明还提供治疗终结性或目前无法治愈的疾病、失调或病症的药物组合物，其包含悬浮于药学上可接受的生物相容性溶液或任何其它载体中的治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述hES细胞或其衍生物不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基。

本发明也包括不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基，包埋自生物相容性材料或基质中的hES细胞和/或其衍生物。所述生物相容性材料或基质可选自生物聚合物，包括多肽或蛋白质，多糖，包括纤连蛋白、各种类型的胶原、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶。

本发明组合物可以装在即用型药物形式中，其中所述干细胞具有足够活力，即它们的活力足够高，以便用于本发明一种或多种方法。在一个实施方式中，所述干细胞的活力大于约40%，如大于约50%、60%、70%或80%。该组合物还可包含抗微生物剂、抗菌剂、激素产品或其它药剂。

为了制备该组合物，将约750,000-160,000,000个hES细胞和/或一种或多种衍生物如造血干细胞祖细胞、神经元干细胞祖细胞、间充质干细胞祖细胞、产胰岛素干细胞祖细胞、肝细胞干细胞祖细胞、心脏干细胞祖细胞、上皮干细胞祖细胞或其混合物悬浮于约0.25-100ml载体中。在一个实施方式中，将约750,000-80,000,000个hES细胞悬浮于约0.25-10ml载体中。群体中优先富集特定分化的干细胞祖细胞类型，但组合物中将保留一定比例未分化的干细胞。在一个实施方式中，全部细胞群体中未分化干细胞的比例不超过约80%。在另一实施方式中，全部细胞群体中未分化干细胞的比例不超过约40%。

可按照本发明治疗或改善的终结性疾病和其它失调或病症包括但不限于：癌症、肝病和肾病、神经系统疾病、皮肤病、自身免疫病、遗传疾病、眼病、肌骨骼病、生育和生殖疾病、以及心血管病、包括但不限于：急性髓性白血病、腺癌、关节炎、星形细胞瘤、听觉神经萎缩、孤独症、自身免疫病、阿耳茨海默病、强直性脊柱炎、贝克尔肌营养不良、脑损伤、烧伤、脑血管损伤、脑性麻痹、昏迷、角膜溃疡、角膜移植片排斥、神经系统的皮质-基底变性、冠心病、糖尿病、痴呆、唐氏综合征、杜兴肌营养不良、晚期肾病、欧勃麻痹、面肩肌营养不良(Fascio Scapular MuscularDystrophy)、生育病、弗里德赖希共济失调、心力衰竭、肝细胞癌、遗传性脊髓运动神经元病、亨廷顿舞蹈症、克腊比病、肢带肌营养不良、肝硬化、黄斑变性、智力低下、多发性硬化、运动神经元病、心肌梗塞、肾病综合征、尼曼-皮克病、不愈合性皮肤溃疡、橄榄体脑桥小脑萎缩、视神经萎缩、帕金森病、电击后脑病、狂犬病疫苗后脑病、褥疮、进行性核上性麻痹、牛皮癣、眼球痨、限制型心肌病、视网膜色素变性、右束支传导阻滞、结节病、窦性心动过缓、脊髓性肌营养不良、脊髓小脑共济失调、史-约综合征、系统性红斑狼疮、血小板减少、珠蛋白生成障碍性贫血、溃疡性结肠炎、植物状态、囊性纤维化病、间质性肺病、无精子症、原发性卵巢功能衰竭、口疮性溃疡、激素失调、骨关节炎、霍纳综合征和成骨不全，以及通道病和低丙球蛋白血症。

更具体说，本发明提供了治疗对象的SCI的方法，所述方法包括：

a)通过皮下注射给予约750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物；

b)在预定时间后重复步骤(a)，然后通过肌肉内注射给予hES细胞和/或其衍生物；

c)通过静脉内注射或输注给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞；

d)通过硬膜外注射给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞，在预定时间后根据临床和/或神经学检测评估的对象状况重复所述剂量；

e)通过尾侧注射给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞；

f)通过鞘内注射或蛛网膜下腔阻滞导管给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞；

g)通过硬膜外注射或硬膜外导管给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞；

h)通过深度脊髓注射在脊髓任一侧给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物；和

i)通过静脉内输注给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物；

其中步骤(a)和(b)首先进行，其余步骤以任意顺序进行。在一个实施方式中，步骤(f)后进行步骤(g)，重复至少一次，直到对象表现出由所述SCI恢复的临床迹象。

本发明也提供一种患有疾病、失调或病症的对象的方法，所述方法包括通过肌肉内注射、静脉内注射、硬膜外注射、硬膜外导管、眼球后注射、皮下注射、心内注射、囊内注射、鞘内注射或者局部施用或损伤内施用给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，它们是用不含动物产品、饲细胞、条件培养基、生长因子、白血病抑制因子、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子或可溶性青灰因子的培养基中培养的。在一个实施方式中，所述疾病、失调或病症是终末的或目前无法治愈的疾病、失调或病症。

本发明也提供一种治疗发育疾病、变性疾病、家族性疾病以及外伤性神经系统疾病和脑血管疾病的方法，所述方法包括给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞，通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、鞘内注射、硬膜外导管输注和蛛网膜下腔阻滞导管输注。

本发明也提供一种治疗皮肤病的方法，所述方法包括通过皮下或静脉内注射给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗褥疮的方法，所述方法包括通过局部或局部施用和肌肉内注射给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物。

本发明也提供一种治疗自身免疫病的方法，所述方法包括通过肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射或关节内注射或者静脉内输注或其组合给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗遗传疾病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、鞘内注射、硬膜外导管输注或蛛网膜下腔阻滞导管输注或其组合给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗坏疽的方法，所述方法包括通过静脉内注射、肌肉内注射或在活和死的组织连接处局部施用或其组合给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物。

本发明也提供一种治疗与衰老相关的疾病的方法，所述方法包括以悬浮液或混合在生物相容性载体如凝胶、油膏剂、基质、糊剂或气溶胶喷雾中的形式通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射或局部施用给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物。

本发明也提供一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括通过静脉内或肌肉内注射或其组合给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括产胰岛素祖细胞。

本发明也提供一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、心内注射、血管造影或手术中的直接注射给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗肝病和肾病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、静脉内输注或局部注射给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞、产清蛋白干细胞祖细胞和产胆红素干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗生育病或生殖病的方法，所述方法包括通过局部肌肉内注射、睾丸内注射或附睾附近皮下注射给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗肌骨骼病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射或静脉内导管输注给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗眼病的方法，所述方法包括通过局部静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、眼球后注射、玻璃体内注射或局部施用给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞、造血干细胞祖细胞和间充质干细胞祖细胞。在一个实施方式中，通过眼球后注射给予包括神经元干细胞祖细胞在内的约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物。在另一实施方式中，通过玻璃体内注射给予包括神经元干细胞祖细胞在内的约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物。在另一实施方式中，将包括间充质干细胞祖细胞在内的约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物施加于接触镜片，放在眼球上治疗角膜擦伤(如用hES细胞和/或其衍生物培育该接触镜片，以便用细胞包被该接触镜片，然后将该镜片放在眼球上约24小时)。

本发明也提供一种治疗肺病的方法，所述方法包括通过肌肉内注射、静脉内注射、喷雾或喷雾器给予750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或与神经元干细胞祖细胞组合的造血干细胞祖细胞。在一个实施方式中，通过加入2ml生理盐水的喷雾器给予750,000-160,000,000个造血干细胞祖细胞。在另一实施方式中，通过喷雾(烟雾)给予750,000-160,000,000个造血干细胞祖细胞。

本发明也提供一种治疗激素疾病的方法，所述方法包括通过肌肉内和静脉内途径给予750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞和神经元干细胞。

本发明也提供一种治疗口疮性溃疡和其它溃疡的方法，所述方法包括通过肌肉内和静脉内途径给予750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括组合或单独的造血干细胞和神经元干细胞。

本发明也提供一种治疗膝关节和髋关节骨关节炎的方法，所述方法包括通过肌肉内、静脉内或关节内注射给予750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物。在一个实施方式中，通过关节内途径给予750,000-160,000,000个造血干细胞祖细胞。

本发明提供一种可用于培养hES细胞和其衍生物的细胞培养方法，所述hES细胞和其衍生物可用于移植给人，而不会引起任何副作用如形成畸胎瘤、形成肿瘤、抗原性问题或移植物抗宿主排斥。

该培养方法的设计特别用于产生移植入人体后可获得最佳治疗活性的足够活力和合适特性的hES细胞和其衍生物。

在优选实施方式中，用该细胞培养方法培养、扩增、分化和储存hES细胞。此外，本发明涉及立即注射型组合物，其含有在适合解冻后直接移植的储存条件下储存的hES细胞和/或其衍生物。

与将hES细胞维持于基本不分化状态的现有细胞培养方法相反，该培养基不含补充剂，如碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子、血清、清蛋白或清蛋白补充剂、氨基酸补充剂、维生素补充剂、转铁蛋白或转铁蛋白补充剂、抗氧化剂、胰岛素或胰岛素替代物、胶原前体或胶原前体替代物、痕量元素、“条件培养基”残留物、动物产品、饲细胞、生长因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂和维生素补充剂。

与扩增hES细胞的其它细胞培养方法相反，实施本发明不导致形成胚状体，从而避免了需要进行手术切除。此时值得注意的是，本发明产品完全是人产品，不需要进行异种移植(如动物检测)。第一次体外受精(IVF)怀孕的情况是必然的结果(corollary example)。

不像其它细胞培养方法，本发明细胞培养技术能够在基本不分化的情况下几乎无限制地扩增hES细胞。本发明的主要优点是一个胚胎足以提供治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，以治疗多个患者。因此，不需要重复获取人胚胎，可避免与施用人胚胎有关的许多伦理问题。

本发明方法的另一个优点是从免疫学角度看，hES细胞和其衍生物是普遍接受的产品，因此不需要患者和细胞的交叉匹配，不需要免疫抑制。

本发明一方面涉及分离hES细胞的方法，所述方法包括：

(a)将2-7日龄胚胎收集到最低必需培养基中，

(b)通过机械手段由胚胎获得hES细胞。

本发明一方面涉及扩增不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的人胚胎干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将人胚胎干细胞引入由最低必需培养基、孕激素和β-人绒毛膜促性腺素(βhCG)激动剂组成的细胞培养基中；和

(b)在约34℃-38℃的温度下、约3.5%-6%二氧化碳的环境中培育所述干细胞约12-48小时。

本发明另一方面涉及一种培养hES细胞的方法，该方法使细胞处于部分分化状态之前的状态，且不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基，该方法包括以下步骤：

(a)将hES细胞引入由最低必需培养基组成的细胞培养基中；和

(b)在约34℃-38℃的温度下、约3.5%-6%二氧化碳的环境中培育所述干细胞约12-48小时。

本发明另一方面涉及一种制备用于人类移植的即用型人胚胎干细胞制剂的方法：

(a)获得不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的人胚胎干细胞，

(b)离心所述干细胞获得沉淀，和

(c)将所述沉淀悬浮于生物相容性溶液。

本发明另一方面涉及以活条件储存人胚胎干细胞的方法，所述方法包括：

(a)取本发明方法制备的干细胞，

(b)加入冻存剂，和

(c)于-4至-80℃冷冻所述细胞。

按照本发明实践在不存在这类补充剂的条件下培养hES细胞的目的是降低将细菌、真菌、病毒或其它污染物引入培养物的风险。这降低了感染和细胞特征变化的风险。

本发明另一目的是提供一种以不含任何污染性残留物且人用安全的形式产生和扩增hES细胞和其衍生物的简单、经济、可扩大规模的方法。

因此，本发明目的是提供一种给予所有共同污染物的风险降低且补充因子的残留污染被消除的药品。

本发明另一目的是提供一种降低染色体畸变或遗传不稳定性的风险的细胞培养方法。

本发明另一目的是提供一种使移植所述培养物的患者中畸胎瘤形成风险降低的细胞培养方法。

本发明另一目的是提供一种使移植所述培养物的患者中肿瘤形成风险降低的细胞培养方法。

本发明另一目的是提供一种使移植所述培养物的患者中抗原性问题或移植物抗宿主排斥问题的风险降低的细胞培养方法。

本发明特别提供了含有hES细胞和其衍生物和生物相容性培养基的组合物，其形式与安全性和质量的国际规章标准相容，因此可立即注射给人患者进行治疗。

本发明也提供一种包含悬浮于生物相容性溶液的hES细胞和/或其衍生物悬浮液的制品，该制品包含在容器中以便储存、运输或直接移植给人。

本发明也提供一种扩增hES细胞和其衍生物的方法。

本发明也提供一种扩增hES细胞和其衍生物以及抑制其分化的方法。

本发明也提供一种培养hES细胞和其衍生物的方法，所述方法使hES细胞和其衍生物在移植入患有疾病、病症或失调的人后能对其进行有效治疗。

发明详述

定义

本文在以下说明书和实施例中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书，包括所述术语的给定范围的明确和一致的理解，提供以下定义。

可注意到，以保持其本领域普通技术人员公知含义的方式使用总体描述本发明的术语。

“胚胎干细胞”指人的多潜能细胞(即hES细胞)。在一个实施方式中，由前胚泡期胚胎分离hES细胞。在另一实施方式中，通过使至少部分分化的细胞(如多能细胞)去分化，制备hES细胞，它们实际上是全能细胞。制备hES细胞的方法是熟知的，参见例如，美国专利5,843,780、6,200,806、7,029,913、5,453,357、5,690,926、6,642,048、6,800,480、5,166,065、6,090,622、6,562,619、6,921,632和5,914,268，美国公开申请2005/0176707和国际申请WO2001085917。

“胎儿干细胞”指由胚儿组织，即将胚胎植入子宫后发育的人组织的产生的干细胞。

“多能”指只能产生密切相关细胞家族的细胞的干细胞。

“多潜能”指作为全能细胞后代的干细胞，可以生长成除全能干细胞以外的任何细胞类型。

“全能”指卵细胞和精子融合产生的干细胞。受精卵细胞前几次分裂产生的细胞也是全能的。这些细胞也可生长成任何类型的细胞。

本说明书中用“治疗有效量”描述在实施本发明一个或多个方面中能有效产生所需结果的组分如胚胎干细胞、神经祖细胞、神经元细胞、造血干细胞祖细胞、心脏干细胞祖细胞、或干细胞的任何其它衍生物、或其它物质或其混合物的浓度或用量。

本说明书中通篇使用“移植”来描述将本发明胚胎干细胞和/或其衍生物递送至人体部位的过程，所述部位是需要产生有益效果来治疗或改善本文所述疾病、失调或病症的细胞所处位点，这些有益效果包括但不限于，修复对象中枢神经系统的损伤、治疗神经变性疾病或治疗中风、心血管病、心脏病发作或物理损伤或外伤或者遗传损伤或环境刺激引起的(例如由事故或其它活动引起的)脑和/或脊髓或其它器官的神经损伤、肝损伤、自身免疫病、性或生殖功能障碍、眼睛的不同部分变性、肾损伤等。

本说明书中用“生物相容性溶液”指其中悬浮有hES细胞和/或其衍生物，用于移植或任何其它后续使用方案的溶液。这类生物相容性溶液包括盐水，还可包含其它成分如防腐剂、抗微生物剂等以及其它药学试剂。

本说明书中用“生物相容性载体”指其中悬浮有hES细胞和/或其衍生物用于局部治疗、移植或任何其它后续使用的固体载体、溶液和混合物。这类生物相容性载体包括凝胶剂、油膏剂、糊剂和气溶胶喷雾剂。

本说明书中，“生物相容性容器”指其中装有hES细胞和/或其衍生物并且不会妨碍细胞用于移植，即不会用不能给予对象的化合物污染细胞的容器(如细胞培养或储存容器)。生物相容性容器材料的例子包括但不限于：玻璃、不锈钢和聚苯乙烯。

“孕激素”是任何具有孕酮样活性，即在一种已知的生物学活性测定中具有至少25%的孕酮活性的天然或合成激素。例子包括但不限于：孕酮、地屈孕酮、甲羟孕酮、炔诺酮、左炔诺孕酮、炔诺孕酮、孕二烯酮和屈螺酮。其它孕激素的例子参见美国专利7,091,234、7,084,151、7,081,457、7,071,205、6,562,857、6,319,911、6,245,757、6,043,235和6,028,064。

"β-人绒毛膜促性腺激素(βhCG)激动剂"被定义为在一种已知的生物学活性测定中具有至少25%天然βhCG活性的任何天然产生的或合成的βhCG或者其片段或衍生物。βhCG激动剂的例子包括但不限于：βhCG和美国专利6,635,445、6,585,982、6,583,109、6,469,139和5,997,871所述的化合物。

在本说明书中，用“最低必需培养基”指含有氨基酸、盐、葡萄糖和维生素的细胞培养基。例子包括RPMI、DMEM、EMEM和GMEM。

“喷雾”指通过喷雾器将药物或物质递送至肺中。

关节内指给药至关节内空间。

眼球后指给药至眼球后空间。

静脉内输注指将含有产品或药品的iv液体给入静脉。

“硬膜外”注射或导管输注指给药至脑膜的硬脑脊膜外部区域。

“鞘内”注射或导管输注指给药至脑膜的最内层，即蛛网膜内与脑连通的脑脊液中。

“尾侧”注射指通过骶骨膜，即尾骨顶端上方约三厘米处给药，它与硬膜外空间相连通。

“深度脊髓注射”指注射到脊椎任一侧的竖脊肌内。

“肌肉内”注射指给药至肌肉片层之间。

“静脉内”注射指给药至静脉内。

“急性SCI”指SCI之日后至多三个月。

“亚急性SCI”指SCI之日后三个月至损伤日后至多九个月。

“慢性SCI”指SCI之日后九个月以上。

hES细胞的“衍生物”包括多能干细胞、多潜能干细胞、成人干细胞和组织特异性干细胞，不包括完全分化的细胞。组织特异性干细胞的例子可参见下表。

本发明涉及用于临床治疗目前无法治愈或终末疾病、病症或失调的含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物，所述干细胞不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基。在另一实施方式中，本发明涉及一种通过移植方法用hES细胞和/或其衍生物治疗目前无法治愈或终末病症的方法。

术语“不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基”不排除由于本发明培养方法而使药物组合物中存在痕量孕激素和βhCG激动剂。术语“动物产品”指任何非人产品。

在另一实施方式中，本发明方法提供一种以即用型形式且不含饲细胞和任何其它污染物的形式移植含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物的简单、安全、广泛适用、可重现和有效的方法。这些细胞可由任何培养方法产生，不管患者的遗传背景、年龄、种族和性别如何均可移植入人体来治疗各种疾病、病症和失调，而不会引起抗体-抗原反应或移植物抗宿主排斥，不形成畸胎瘤或肿瘤或者其它削弱性副作用，不会产生异常神经支配也不需要给予免疫抑制剂。

与其它已知方法相反，用不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基，因此不含可能干扰所需临床应用的安全性或效力的任何种类的污染物的培养基制备本发明药物组合物的hES细胞。

按照本发明实践，可通过肌肉内、静脉内、尾侧、玻璃体内、纹状体内、实质内、鞘内、硬膜外、眼球后、皮下、口服、心内、囊内、关节内或鞘内注射或硬膜外导管、蛛网膜下腔阻滞导管、静脉内输注、通过喷雾器、喷雾、阴道内途径和/或局部的眼滴剂和耳滴剂将hES细胞和/或其衍生物引入人体内。在另一实施方式中，通过局部或损伤内途径给予hES细胞和/或其衍生物。

各给药途径采用特定体积的注射液，因此采用来自hES细胞和/或其衍生物母液的特定数量范围的细胞，如表1所示。指明细胞类型(如下述注射方案表)时，所指细胞类型是细胞群体中主要存在的类型。

表1

给药途径	体积	细胞数
			肌肉内	0.25ml	750,000-1,500,000
静脉内	0.25ml	750,000-1,500,000
			皮下	0.25ml	750,000-1,500,000
尾侧	2ml	6,000,000-16,000,000
			硬膜外	2ml	6,000,000-16,000,000
鞘内	2ml	6,000,000-16,000,000
			关节内	2ml	6,000,000-16,000,000
眼球后	2ml	6,000,000-16,000,000
			硬膜外导管	4-5ml	12,000,000-40,000,000
静脉内输注	0.75ml	2,250,000-4,500,000
			喷雾器	2ml	6,000,000-16,000,000
阴道内	2ml	6,000,000-16,000,000

在实验室和最终用途，如临床或其它用途之间，药物组合物必须冷藏。在一个实施方式中，药物组合物储存于约+4℃至-160℃。在另一实施方式中，药物组合物储存于约-15℃至-72℃，例如约-20℃至-40℃。

在一个实施方式中，本发明所用hES细胞是由多余胚胎分离、由天然体外受精周期丢弃和通过知情同意书捐赠。在另一个实施方式中，本发明采用多潜能胎儿干细胞，如美国公开申请号2005/0124003公开的分离自绒毛膜绒毛、羊水和/或胎盘的干细胞。

本发明提供一种用hES细胞和/或其衍生物治疗各种疾病、病症和失调的方法，所述疾病、病症和失调包括但不限于：癌症、中风、遗传疾病、肝病、神经系统疾病、血管病、皮肤疾病和失调、自身免疫病、眼病、肾病、心脏病、肌骨骼病、生殖和生育疾病和关节炎。

可按照本发明治疗的癌症的非限制性例子包括脊髓肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌症、原发性脑癌、头颈癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、转移性病灶、肺癌、小细胞肺癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、泌尿生殖系统癌、甲状腺癌、食道癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌瘤、绒毛膜癌、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、多毛细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、真性红细胞增多、特发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、成骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤。

在一个实施方式中，不用分化剂处理hES细胞，具有胚胎性的细胞被编程，一旦给予对象后，该细胞立即迁移到损伤部位。在此部位，该细胞对体内分化信号相应而分化。在损伤部位，hES细胞和其衍生物不会无限增殖，因此需要重复注射的方案。hES细胞和其衍生物不会无限增殖的事实消除了形成肿瘤和畸胎瘤的可能性。

按照本发明实践用hES细胞和/或其衍生物处理后，患者应休息并采用严格的戒瘾方案，不能摄入可能损伤细胞功能和阻碍hES细胞和其衍生物迁移到损伤部位引发的再生过程的任何物质如酒精或烟草。患者也应该避免服用已知在怀孕期间有害的任何药物，因为这类药物可能对移植细胞产生不良影响。

用hES细胞和其衍生物治疗SCI

目前无法有效治愈SCI，包括急性脊髓损伤、亚急性脊髓损伤或慢性脊髓损伤，它们常常导致半身不遂、四肢麻痹和四肢瘫痪。移植hES细胞治疗SCI代表了解决尚未得到满足的医学需求的独特机会，显著改善了世界上受SCI后遗症影响的几百万人的生活。通过移植基本上呈祖细胞状态的hES细胞和其衍生物重新获得中枢神经系统和植物神经系统丢失的功能，能够通过由移植的hES细胞祖细胞替换丢失的细胞功能、再生丢失的神经细胞、消除物理障碍如疤痕组织、阻断抑制性信号传导途径和释放神经营养因子来恢复副交感神经、交感神经、运动神经、植物神经和感觉神经通路。

按照本发明移植hES细胞以恢复神经功能的好处是：改善运动神经和感觉神经功能、提高总体生活质量、减少通常由亲属提供的支持、降低对其它药物组合物和其它医疗器械和辅助物的依赖，改善精神和心理状态以及经济独立性。通过恢复副交感神经、交感神经、感觉神经和运动神经功能，降低医疗设备和失能辅助器材和药物依赖性的成本。提高自给自足能力、提高社会地位、改善婚姻状况和行使生殖权的能力，治疗期间每年只需进行有限次数的临床访问。按照本发明通过给予hES细胞和其衍生物进行治疗不会导致抗原性问题、肿瘤形成、畸胎瘤形成或异常神经连接。

同时，给予(特别是SCI患者)hES细胞和其衍生物导致褥疮被治愈、降低对高血压药或抗抑郁药的需求、恢复膀胱感觉和控制、恢复肠道感觉以及疼痛感和触感；恢复消失的反射；减轻冷汗症状；减轻眩晕感；血压的正常化和完全由横隔膜参与的呼吸的正常化。

下面详细给出将hES细胞给予患有亚急性脊髓损伤或慢性脊髓损伤且天然恢复机制失败的患者的方法。下面也详细提供了按照本发明在损伤三个月内作为一线治疗治疗急性SCI的不同方法。

准备给予的hES细胞的治疗有效剂量、给药方案和给药途径主要取决于三种因素：即疾病类型、患者的临床状况和所发生症状的严重性。在本发明实施过程中，已发现治疗有效剂量和方案不取决于年龄、性别、体重或种族。根据正在进行的患者评估过程单独建立对每个患者的方案。

在实施本发明的一个实施方式中，通过一系列注射将含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物给予患有目前无法治愈的疾病或终结性疾病或其它临床疾病(如上所述)的对象，以治疗该疾病。

下面参照以下实施例描述按照本发明治疗临床疾病和终末病症的各种实施方式。

治疗、剂量、方案、给药途径、评估和SCI患者的随访

在一个实施方式中，通过一系列注射将hES细胞和/或其衍生物给予患有SCI超过三个月(亚急性和慢性SCI)的对象，以治疗该疾病。在另一实施方式中，hES衍生物是造血祖细胞干细胞。在另一实施方式中，hES衍生物是神经元祖细胞干细胞。

测试剂量

在一个实施方式中，检测用无菌生理盐水稀释至最终体积约为0.25-1.0ml的约750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物的污染和活力，并用标准方法计数，然后作为测试剂量皮下注射到前臂以给药，其中所述细胞包括造血祖细胞干细胞和神经元祖细胞干细胞。在5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时和24小时后观察检测过敏性休克、注射部位的疼痛或炎症、全身发痒、脸红或发热。在一个实施方式中，hES细胞与造血祖细胞干细胞和神经元祖细胞干细胞的比例约为4:1-1:4。在另一实施方式中，该比例约为1:1。

初始给药剂量

该方案包括皮下、肌肉内和/或静脉内初始注射悬浮于体积约0.25ml-1.0ml的无菌生理盐水的含有约750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物的药物组合物以给药，其中所述细胞包括造血祖细胞干细胞和神经元祖细胞干细胞。通过在1周-10天中每天注射含有相同数量的hES细胞和其衍生物进行初始注射。

硬膜外注射和硬膜外导管注射

通过在初始注射7-10天后的连续3天中每日两次地在损伤位点上方或下方硬膜外注射或硬膜外导管注射。给予悬浮于体积为2ml的无菌生理盐水中并用5ml-40ml无菌生理盐水进一步稀释的约750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元祖细胞干细胞。根据患者表现的症状改善的临床过程和医生观点在损伤部位上方或下方重复硬膜外注射/硬膜外导管注射给药。也观察到，如果在硬膜外注射后患者仰卧，将显著改善感觉神经，如果是俯卧，则显著改善运动神经。在两种情况下，都不得不将患者的腿保持在抬高的位置上。

鞘内

初始注射开始2、5、8、12、17和22个月后在损伤部位上方或下方通过鞘内注射给予悬浮于2ml无菌生理盐水并用2ml无菌生理盐水进一步稀释至总体积为4ml的约750,000-11,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞。

在一个实施方式中，例如，治疗SCI后，在损伤后15天通过导管在损伤部位上方或下方硬膜外注射给予细胞。在一个实施方式中，注射悬浮于2ml体积无菌生理盐水中，然后稀释至15-40ml无菌生理盐水中的约750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞。这种治疗可以在一个半月后重复进行。

深度脊髓注射

根据观察到的症状逆转过程，可以用含有悬浮于0.25-1.0ml体积无菌生理盐水中的约750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物的药物组合物再次进行加强注射，其中所述细胞包括造血干细胞和神经元祖细胞干细胞。在一个实施方式中，通过每周或每隔一周的深度脊髓注射在脊柱背面给予该药物组合物。这种治疗会加强背部肌肉，一旦患者能够活动后则能加快躯体康复。

尾侧注射

按照本发明实践，通过尾侧注射给予重悬于2ml盐水并单独稀释至10ml或与至多20ml DEPOMEDROL(乙酸甲泼尼龙)一起稀释的约750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物的药物组合物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞。这种治疗会加强腰区肌肉，使腰区和骶骨区域重新获得感觉和运动能力。

除正在研究的hES细胞移植外，还通过日常物理疗法、再训练病人使用失去的运动功能和指导保持促进细胞功能和细胞再生过程的健康生活方式使患者恢复。

局部给药

除按照本发明实践用hES细胞和/或其衍生物直接治疗SCI外，可通过局部含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物快速有效地治疗由于患者长期固定不活动引起的褥疮。

可通过局部含有约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物的药物组合物治疗褥疮，其中所述细胞包括造血祖细胞。通过静脉内和肌肉内注射给予负荷剂量或初始剂量，以便内部治愈并促进新血管的形成。或者，将hES细胞和其衍生物重悬于2ml盐水中，用2-4ml盐水稀释，损伤内施用。

静脉内输注

按照本发明实践，将含有750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物的药物组合物重悬于100ml生理盐水中并通过静脉内途径给予，其中所述细胞包括造血和神经元祖细胞。这种治疗保证了干细胞连续流入人体，特别可用于因某种原因，如褥疮、患者过于虚弱等造成的其它直接给药途径不可用的情况。

治疗急性SCI的方案

快速介入急性SCI的治疗中能显著提高患者存活率。而且，通过实施本发明快速介入任何不可治愈疾病、病症或失调的治疗中能提高痊愈的概率。在本发明的另一个实施方式中，也可如下文所详述，成功治疗脊髓损伤后发生急性SCI小于三个月的患者。按照本发明实践，hES细胞和/或其衍生物的药物组合物以及有效的物理疗法、恢复和再训练课程是急性SCI的有效的一线疗法。

治疗急性SCI包括用于治疗亚急性和慢性SCI的所有步骤加上两个额外步骤。在损伤发生(如手术)后立即初始干涉SCI时，将hES细胞和/或其衍生物直接给予损伤部位。后续治疗包括在损伤三个月内的两次鞘内注射和一次硬膜外注射。

临床评价和观察

对下肢失去运动功能较长时间的患者而言，虽然可按照本发明治疗，但应随其下肢运动功能的恢复，进行行走再训练课程和其它物理疗法。作为这种课程中的第一个步骤，已证明在再训练中使用助行架和卡钳是有效的。另外，应进行上肢和上身的肌肉增强课程，以使患者能够在行走中独立支撑其体重。随着治疗的进行和患者病症的改善，可减少再训练课程。

除对医疗器械支持和物理疗法的需求降低外，因为通过本发明治疗改善患者的交感症状和副交感症状，所以降低了患者对药品的需求，包括血压波动药、抑郁药、褥疮药、用于肠和膀胱并发症的药物和医疗器械、抗-痉挛药物和泵。

除对治疗与SCI直接或间接相关症状的药物的需求降低外，还观察到按照本发明治疗糖尿病和SCI时对抗糖尿病药的需求也降低。

治疗过程中和症状缓解后常规监测对发生SCI并按照本发明治疗的患者所表现的症状改善过程的临床评价。评估许多生理学、交感神经、副交感神经、运动神经、自主神经和精神参数，以评价该技术逆转SCI症状的效力，详述见下。

检查主管医生的记录，包括症状描述、损伤部位分类、症状发展、临床介入、治疗和损伤病史。根据此种检查和对患者的彻底检查，包括磁共振成象(MRI)，肌电描记术(EMG)，神经传导速率(NCV)扫描和其它神经学检查和研究(包括在治疗前评估损伤程度和获得损伤记录的神经检查)，进行对按照本发明实践移植后改善进行半定量描述的方法，详述见下。

注意交感神经参数和神经学良好状态，包括患者的精神状态、是否抑郁、行为特征、脑神经功能和总体行为，作为精神评价的一部分。

评价与损伤部位的神经损伤和自主神经系统机能有关的征兆和症状。这包括神经学检查，检测感觉深度压力的能力、触觉、知觉、感觉疼痛的能力、感觉温度改变的能力、不随意运动、出冷汗、头晕、血压、呼吸困难、躺倒时姿势异常和自主就坐的能力。

评价膀胱和肠道功能。这包括膀胱控制、膀胱流和感觉到膀胱充盈，肠道控制、肠道排泄时间和肠道感觉。

评价上身运动功能，以评估中枢神经系统的损伤程度。这包括肩部运动、手腕和手指运动、腱反射和四肢运动强度、肌肉萎缩和手握力。

评价下身运动功能，以评估中枢神经系统的损伤程度。这包括臀部运动、膝盖运动、脚趾运动、腱反射和四肢运动强度、肌肉萎缩和足底反应。也在治疗期间定期进行详细的神经学检查，以监测四肢神经支配的进展。

为了帮助患者在临床访问期间恢复，随着机能恢复用标准的物理疗法技术对患者进行调节，以使其恢复使用四肢和关节，并且提高其运动能力。

通过神经功能的恢复和神经学评价显示神经再生的证据。在本发明中SCI治疗方案的例子用作病例研究。

神经系统发育疾病的治疗

按照本发明实践给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，以治疗发育疾病如孤独症和智力低下。在另一实施方式中，给予测试剂量后，通过肌肉内或静脉内途径给予约750,000-80,000,000个细胞。也可采用鞘内途径。在另一个实施方式中，也可采用颅内移植。hES细胞和/或其衍生物主要是神经元祖细胞。在另一实施方式中，通过肌肉内或静脉内途径给予造血和神经元祖细胞。这种治疗由每日肌肉内注射开始持续一年，或经静脉内途径持续3个月。然后，按照医生观察在接下来的3-6个月中每周进行一次相同注射，在接下来的3个月中每两周进行一次，然后每月进行一次。鞘内注射仅包括于开始治疗6-8个月后的方案中，然后只有当患者对肌肉内和静脉内注射无反应时进行鞘内注射。在本发明另一实施方式中，将750,000-80,000,000个hES细胞和/或其衍生物重悬于100ml生理盐水，通过静脉内输注给药。

实施例1:

给予含有hES细胞和其衍生物的药物组合物后，诊断患有孤独症和扑动状震颤、多动症、无社交技巧、无视线接触、滚动运动(pin rollingmovement)、不能遵循指令、不愿意学习的患者得到改善，所述hES细胞和其衍生物包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。

此患者的注射方案参见表2。在此表和随后有关注射方案的所有表格中，细胞类型中的"神经元"指在促进分化成神经祖细胞干细胞的培养基(如DMEM)中已经部分分化的hES细胞细胞群。该细胞群包括主要是神经元祖细胞干细胞的hES细胞和干细胞。术语"非神经元"指在促进分化成除神经元祖细胞干细胞外的祖细胞干细胞的培养基(如RPMI)中已经部分分化的hES细胞细胞群。细胞群包括基本不是神经元祖细胞干细胞的hES细胞和各种干细胞。

表2

日期	给药途径	细胞类型
			3/13	测试剂量	非神经元
3/14	im	神经元
			3/16	im	神经元
3/17	im	神经元
			3/18	im	神经元
3/20	im	神经元
			3/21	im	神经元
3/22	im	神经元
			3/23	im	非神经元
3/24	im	神经元
			3/27	im	神经元
3/28	im	非神经元
			3/29	im	非神经元
3/30	im	非神经元
			3/31	im	神经元
4/3	im	神经元
			4/4	im	神经元

4/5	im	神经元
			4/6	im	神经元
4/7	im	神经元
			4/11	im	神经元
4/12	im	神经元
			4/13	im	神经元
4/14	im	神经元
			4/17	iv	神经元
4/19	im	神经元
			4/21	iv	神经元
4/24	im	神经元
			4/25	im	神经元
4/28	iv	神经元
			5/1	iv	神经元
5/3	iv	神经元
			5/5	im	神经元
5/8	iv	神经元
			5/10	im	神经元
5/12	im	神经元
			5/15	iv	神经元
5/17	im	神经元
			5/29	im	神经元
5/31	iv	神经元
			6/2	iv	非神经元
6/5	im	神经元
			6/7	iv	神经元
6/9	iv	非神经元
			6/12	iv	神经元
6/14	iv输注	神经元
			6/16	im	神经元
6/19	im	非神经元
			6/21	im	神经元
6/23	iv	神经元
			7/3	iv	神经元
7/5	iv输注	神经元
			7/7	im	非神经元
7/10	im	非神经元
			7/12	im	神经元
7/14	im	神经元
			7/17	iv输注x2	神经元

7/18	im	非神经元
			7/20	im	非神经元
7/24	im	非神经元
			7/28	im	非神经元
7/31	im	非神经元
			8/2	im	非神经元
8/4	im	非神经元
			8/7	im	非神经元
8/10	im	非神经元
			8/11	im	非神经元
8/14	im	非神经元
			8/18	im	非神经元
8/21	im	神经元
			8/23	im	非神经元
8/28	im	非神经元
			8/30	im	非神经元
9/1	im	非神经元
			9/4	im	非神经元

神经系统变性疾病的治疗

按照本发明实践给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，以治疗神经系统变性疾病，包括但不限于：皮质-基底变性、橄榄体脑桥小脑萎缩、阿耳茨海默病、帕金森病、多发性硬化、痴呆、听觉神经萎缩和运动神经元病，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。在另一实施方式中，给予约750,000-80,000,000个细胞。

虽然可改变给药方案以适合具体患者，但治疗儿童神经系统变性疾病的典型方案包括在第一个月每日肌肉内和静脉内注射，在第2-4个月每周注射三次，在第5和6个月每周注射，在第9-12个月每周加强注射。在成人中，典型方案包括每日肌肉内和静脉内注射，以及通过硬膜外导管、腰椎穿刺、鞘内或尾侧途径给药。之后，进行两次静脉内输注，其间至少间隔7天。最后，在6个月中每月给予一次加强注射，在之后的至少6个月中每2个月给药一次。因为疾病的进行性，继续治疗较长时间，甚至可能持续终身。

在进行性和变性疾病的情况下，通过按照本发明快速介入阻止或稳定疾病进程能够提高患者的自身依赖性。在稳定作用发生后即可观察到一些改善。

实施例2:

患有两年反复性进行性多发性硬化的每天服用SOLUMEDROL(甲泼尼龙)的患者无法行走、不能控制膀胱或肠道、并频繁发生呼吸道疾病。

按照本发明治疗，对象病症得到改善，患者能够行走，恢复对膀胱和肠道的控制，并使SOLUMEDROL的用量降低。MRI显示出50%改善。

此患者的注射方案参见表3。

表3

实施例3:

一位60岁男性两年前发生ALS(运动神经元病)，其上肢和手迅速恶化。他的上肢、手和舌头持续发生颤搐和肌束震颤。不能向上和向下转动左臂，或将左臂举高过头。右臂可颠着举起，手呈骨骼状。

治疗一年半后，通过双手小指球和手掌肌肉的再生，他的手已经从骨骼状框架恢复。双臂都能向上和向下转动。他发现同样有吞咽困难，但自治疗起并未恶化。他的下肢、呼吸和语言能力没有恶化。

此患者的注射方案参见表4。

表4

实施例4:

患者被诊断患有帕金森病。患者对标准治疗无反应，病情随时间恶化。他具有典型的曳行步态。右臂出现单侧震颤，他在生理上非常令人堪忧。他无法睁开眼睛。自从治疗开始后，该患者得到逐步改善，一年hES细胞治疗后，该患者得到显著改善。其步态正常，手的震颤减轻，精神状态乐观。他能完全睁开眼睛。并开始签名和写字，这在治疗开始时是不可能的。目前对他人的依赖性很小。

此患者的注射方案参见表5。

表5

脑性麻痹的治疗

按照本发明实践给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，以治疗脑性麻痹，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。该方案和剂量与神经变性疾病的治疗相同。

实施例5:

一位出生时在AIIMS诊断为CP的48岁男性具有言语不清、曳行步态、吞咽困难和左侧半身不遂的症状。绘制肌紧张性、反射和力量的图表以确认这些症状。

治疗6个月后，他的言语变得清晰、无吞咽困难、能够使用左侧躯体、并且步态改善。能够用左手剃须并能够用左手拿起茶杯等。他的平衡能力更好，能够进行长时间行走。

此患者的注射方案参见表6。

表6

实施例6:

患有CP的3岁女孩被带进诊所，她的外表和行为类似一个月大的婴儿，无法控制颈部、微弱哭泣、无反应和不能吮吸奶瓶。她绝对是松驰无力的。

治疗一年半后，她成长得看上去像2岁的婴儿。具有颈部控制力、能认出父母、在床上爬行、进食正常食物、认出时微笑和在有支撑的条件下就坐，她母亲抱住她时能够行走几步。她的步态是剪形步态，她也开始呼唤其父母。

此患者的注射方案参见表7。

表7

日期	给药途径	细胞类型
			8/4	im	神经元(测试剂量)
8/5	im	神经元
			8/8	im	神经元
8/9	im	神经元
			8/10	im	神经元
8/11	im	神经元
			8/12	im	神经元
8/16	im	神经元
			8/17	im	神经元
8/18	im	神经元
			8/19	im	非神经元
8/22	im	混合
			8/23	im	混合
8/25	im	混合
			8/26	im	神经元
8/29	im	神经元
			8/30	im	神经元
8/31	im	神经元
			9/1	im	神经元
9/2	im	神经元
			9/5	im	非神经元
9/6	im	神经元
			9/7	im	神经元
9/8	im	神经元
			9/12	im	混合
9/14	im	非神经元
			9/16	im	混合
9/19	im	神经元

9／23	im	神经元
			9／26	im	混合
9／28	im	混合
			9／30	im	混合
10／3	im	混合
			10／5	im	神经元
10／10	im	非神经元
			10／17	im	混合
10／19	im	非神经元
			10／21	im	神经元
10／24	im	混合
			10／28	im	混合
10／31	im	混合
			11／4	im	混合
11／7	im	非神经元
			11／9	im	非神经元
11／11	im	神经元
			11／14	im	神经元
11／15	im	非神经元
			11／16	im	非神经元
11／18	im	非神经元
			11／22	im	非神经元
11／23	im	非神经元
			11／25	m	非神经元
11／28	im	混合
			11／29	im	混合
12／2	im	混合
			12／7	im	非神经元
12／9	m	非神经元
			12／12	im	非神经元
12／14	m	神经元
			12／16	im	神经元
12／19	im	非神经元
			12／21	m	神经元
12／23	im	神经元
			12／26	m	非神经元
12／30	im	神经元
			1／5	im	神经元
1／11	im	神经元
			1／13	im	神经元

1/16	im	神经元
			1/18	im	神经元
1/23	im	神经元
			1/25	im	神经元
1/27	m	神经元
			1/30	im	神经元
2/1	im	神经元
			2/3	im	神经元
2/6	im	神经元
			2/8	im	神经元
2/10	im	神经元
			2/13	im	神经元
2/15	im	神经元
			2/17	im	非神经元
22.2.06	im	神经元
			2/24	im	神经元
2/27	im	神经元
			3/1	m	神经元
3/3	im	神经元
			3/6	im	非神经元
3/8	im	非神经元
			3/22	im	非神经元
3/24	im	神经元
			3/27	im	非神经元
3/29	im	神经元
			3/31	im	神经元
4/7	im	神经元
			4/10	im	神经元
4/12	im	神经元
			4/14	im	神经元
4/17	im	神经元
			4/19	im	神经元
4/21	im	神经元
			4/24	im	神经元
4/26	im	神经元
			5/1	im	神经元
5/8	im	非神经元
			5/18	im	神经元
5/22	im	神经元
			5/26	im	神经元

5/29	im	神经元
			5/31	im	神经元
6/2	im	神经元
			6/5	im	神经元
6/12	im	神经元
			6/16	im	神经元
6/19	im	神经元
			6/21	im	神经元
6/28	im	神经元
			6/30	im	神经元
7/4	im	神经元
			7/7	im	神经元
7/17	im	神经元
			7/19	m	神经元
7/21	im	神经元
			7/24	im	神经元
7/26	im	神经元
			7/31	im	非神经元
8/2	im	非神经元
			8/4	im	非神经元
8/7	im	非神经元
			8/9	im	非神经元
8/11	im	非神经元
			8/14	im	非神经元
8/16	im	非神经元
			8/18	im	非神经元
8/21	im	非神经元
			8/23	im	非神经元
8/25	im	非神经元
			8/28	im	非神经元
8/30	im	非神经元
			9/1	im	非神经元
9/4	im	非神经元
			9/11	im	非神经元
9/13	im	非神经元
			9/15	im	非神经元
9/20	im	非神经元
			9/25	im	非神经元
9/27	im	非神经元
			10/3	im	非神经元

10/4	im	非神经元
			10/13	im	非神经元
10/16	im	非神经元
			10/18	im	非神经元
10/19	im	非神经元
			10/23	im	非神经元
10/25	im	非神经元
			10/27	im	非神经元
10/30	im	非神经元
			10/31	im	非神经元
11/3	im	非神经元
			11/6	im	非神经元
11/8	im	非神经元
			11/10	im	非神经元
11/13	im	非神经元
			11/15	im	非神经元
11/17	im	非神经元
			11/20	im	非神经元
11/22	im	非神经元
			11/24	im	非神经元
11/27	im	非神经元
			11/29	im	非神经元
12/1	im	非神经元
			12/8	im	非神经元
12/11	im	非神经元
			12/15	im	非神经元
12/26	im	神经元
			12/27	im	神经元
1/3	im	非神经元
			1/7	im	非神经元
1/15	im	神经元
			1/24	im	神经元
1/25	im	神经元
			1/29	im	神经元

实施例8:

8岁儿童被诊断患有脑性麻痹和严重的智力低下，无法自主行走。她不能识别物体，注意广度非常低。经常流口水，并总是张着嘴巴。

治疗后，她不再流口水，其注意广度得到改善，看上去更机灵。能在很少支撑的情况下行走。

此患者的注射方案参见表8。

表8

神经系统外伤的治疗

按照本发明实践，给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，以治疗神经系统外伤，包括但不限于脑损伤、昏迷和植物状态，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。在另一实施方式中，给予约750,000-80,000,000个细胞。

虽然可改变给药方案以适合具体患者，但治疗神经系统外伤的典型方案包括在前2个月每天肌肉内和静脉内注射以及鞘内和硬膜外注射。

脑血管意外或中风的治疗

按照本发明实践，给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞，以治疗脑血管意外或中风。在另一实施方式中，给予约750,000-80,000,000个细胞。

虽然可改变给药方案以适合具体患者，但治疗脑血管意外的典型方案包括在第一个月中肌肉内和静脉内注射两周，然后静脉内输注3天，在第2和3个月中每15天静脉内输注2天，在第5个月静脉内输注2天和鞘内注射，在第8、10和12个月静脉内输注4天然后肌肉内注射4天。

实施例9:

诊断患有脑血管意外或中风的患者右侧半身不遂并具有流口水、吞咽困难以及并不能交谈和行走的症状。此外，该患者患有结肠癌。按照本发明治疗后，随着言语和运动活动的提高，该患者显示出改善迹象，脊柱变直且半身不遂被治愈。

此患者的注射方案参见表9。

表9

实施例9:

82岁男性5年前发生脑中风，出现右侧半身不遂，以及面部不对称和言语不清。使用拐杖一瘸一拐地行走，因难以协调不能用右手吃饭。他不能自主就坐或起床，在行走时拖曳着脚步。流口水，且不能良好地吞咽。

治疗两个月后，他能够在无支撑的情况下行走，自主就坐和站立，用右手吃饭，没有言语不清，没有面部不对称。他能够从椅子上站起来。他能够在行走中弯曲患病膝盖而保持平衡。

此患者的注射方案参见表10。

表10

家族性神经系统疾病的治疗

按照本发明实践，将约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞给予对象，以治疗家族性神经系统疾病，包括但不限于：橄榄体脑桥脑萎缩和亨廷顿舞蹈症。在另一实施方式中，给予约750,000-80,000,000个细胞。给药途径是肌肉内和静脉内以及鞘内、硬膜外导管和静脉内输注。这种治疗很可能要持续终生，但第一年是高强度治疗，随后，在至少3个月中每天进行肌肉内和静脉内注射，其间也给予鞘内、硬膜外导管和静脉内输注。在间隔一个半月后，21天给予同一组注射。继续每天进行肌肉内和静脉内注射，然后减少至每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、然后每月一次，这取决于患者的情况。可以4-6个月的间隔重复鞘内注射和硬膜外导管。每两周、每月或每两个月给予一次静脉内输注。

实施例10:

诊断患有散发性脊髓小脑共济失调，不能上床、行走或就坐时无法改变位置的患者言语困难、发生震颤且不能抬起头颈。

按照本发明实践进行干细胞治疗后，注意到所有症状都得到改善，该患者能够平衡其自身并行走几步。言语变得连贯。

此患者的注射方案参见表11。

表11

实施例11:

该患者在约翰霍普金斯大学(John Hopkins University)诊断出患有家族性橄榄体脑桥脑萎缩。她的父亲、同胞姐姐(妹妹)和兄弟也患有相同疾病。她只能在呼气时谈话、不能离开轮椅、连续排尿、并且不得不手工排出粪便。她全身发生震颤，甚至坐时也不能自身平衡。有严重的体位性低血压。

治疗2年后，该患者能独自如厕、良好交谈、不震颤并能在有支撑的情况下行走。从治疗起就没有发生恶化，尽管她的同胞姐姐(妹妹)因相同疾病而卧床不起。她没有体位性低血压，根本没有恶化。

皮肤病的治疗

按照本发明实践，通过皮下或静脉内注射或者通过局部或局部途径，给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，以治疗皮肤病，包括但不限于不愈合的溃疡、牛皮癣、褥疮和结节病，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。在皮肤病的情况下，也可局部使用hES细胞以治疗皮肤疾病或损伤。在另一实施方式中，给予约750,000-80,000,000个细胞。

在一个实施方式中，可将hES细胞或分化的皮肤细胞和胚胎提取物与生物相容性载体，如凝胶剂、油膏剂或糊剂混合，并施加于受损的皮肤或粘膜组织以加速愈合以及治愈难以愈合的伤口，如糖尿病性或褥疮性溃疡。或者，该细胞可以悬液或乳液形式提供。在一个实施方式中，载体也含有抗微生物剂、镇痛药或其它药剂。

或者，在一个不同的实施方式中，在人工无菌多孔性基质如软棉布上培养hES细胞，直接适用于伤口。12-24小时后，取下该软棉布，干细胞继续生长，治愈该伤口。损伤内施用时，该hES细胞能分化并最终取代受损细胞。

实施例12:

70岁女性左踝被烧伤，用常规治疗无法治愈。将hES细胞施用于烧伤部位后，她的伤口开始愈合，3年后，皮肤完全恢复健康。

自身免疫病的治疗

按照本发明实践，通过肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射、关节内注射或静脉内输注或其组合给予约750,000-160,000,000个hES细胞和/或其衍生物，以治疗自身免疫病，包括但不限于：系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、心肌病、结节病、关节炎和溃疡性结肠炎，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。在另一实施方式中，给予约750,000-80,000,000个细胞。给予hES细胞不仅能高度有效地治疗自身免疫病，而且能高效恢复受抑制的免疫系统。作为免疫抑制剂治疗的替代方式或“预先处理”准备进行器官移植或其它医学介入的患者的方法，可利用hES细胞和其衍生物通过降低宿主-移植物排斥反应来接受器官。

虽然可改变给药方案以适合具体患者，但治疗自身免疫病的典型方案包括在最初两个月每天注射，在第三个月隔天注射和静脉内输注，在第5-7个月和第10-12个月每周注射和每15天连续静脉内输注2天，以及在一年中每3个月加强注射一次，然后在一年中每6个月加强注射一次。

实施例13:

在过去26年患有牛皮癣的患者不能离开轮椅，并患有高血压、糖尿病和牛皮癣关节炎，其左腿上发生不愈合且不顺从皮肤移植的巨大溃疡。

接受治疗6个月后，她的溃疡和关节炎消失。她的糖尿病和高血压得到控制。她开始自主行走，开始所有活动，在过去1年接受加强注射治疗。她声称自己在过去26年中第一次行走，并能够独自做所有家务劳动。

对伤口进行局部干细胞治疗，伤口被治愈。治疗后，没有检测到其它伤口。皮肤的起鳞程度和痒感以及下肢肿胀也减轻。也治愈了糖尿病，血压得到控制，致使用药减少。

此患者的注射方案参见表12。

表12

血液病的治疗

本发明方法的另一实施方式是通过静脉内注射hES细胞和/或其衍生物治疗血液病，如血小板减少、珠蛋白生成障碍性贫血、急性髓细胞性白血病，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。给予细胞10-14天，然后对良性疾病而言重复每周注射一次。对恶性病症而言，在40天中每天注射，然后如果复发则重复注射。

遗传疾病的治疗

按照本发明实践，hES细胞移植法的另一种实施方式是治疗遗传疾病，包括但不限于：唐氏综合征、弗里德赖希共济失调、亨廷顿舞蹈症、阿斯佩各综合征和脊髓性肌萎缩。

遗传疾病的症状表现为单独或组合的智力低下、肌骨骼功能障碍和器官衰竭，导致严重的不可治愈的衰弱并降低预期寿命。在患有遗传病的患者中，按照本发明实践给予该患者hES细胞，给予后，该细胞分化并为该患者提供表达丢失或缺损基因产物的细胞群体，随后恢复胞内稳态。

虽然可改变给药方案以适合具体患者，但治疗遗传疾病的典型方案包括在第一个月每天肌肉内和静脉内注射，在第2个月隔天注射，在第三个月每周注射两次，在第5、7、9、11和12个月每周注射一次，在1年中每三个月加强注射一次。另外，每15天进行静脉内输注。

实施例14:

唐氏综合征患者对语言命令无反应、不能上下楼梯、由于进食困难体重很低。该患者不能进食，显示出典型的大开立姿势(wide stance)并且频繁地咳嗽和感冒。眼睛呈先天愚型。

按照本发明的治疗，该患者能够理解并执行语言命令、开始说话和上下楼梯。DQ测试显示在1年内其精神年龄比她的实际年龄小1岁，相对的是2岁6个月。在社交上，她去上学并与其它儿童一起玩。她也能自己进食。

此患者的注射方案参见表13。

表13

实施例15:

一个3岁女孩被诊断患有唐氏综合征。她不能交谈、理解或上下楼梯。她无法独自进食，她的单词有限发音非常不清楚。

治疗8个月后，她能理解所有事情，说出三个词的句子，并能识别颜色、形状和大小。她能够独自上下楼梯，并开始独自进食。

此患者的注射方案参见表14。

表14

日期	给药途径	细胞类型
			1/30	im	神经元(测试剂量)
2/6	im	神经元
			2/7	im	神经元
2/8	im	神经元
			2/9	im	神经元
2/10	im	非神经元
			2/13	im	神经元
2/15	im	神经元
			2/16	im	神经元
2/17	im	神经元
			2/20	im	神经元
2/22	im	神经元
			2/24	im	非神经元
2/27	im	神经元
			3/1	im	神经元
3/3	im	非神经元
			3/6	im	非神经元
3/13	im	神经元
			3/15	im	神经元
3/22	im	神经元
			3/24	im	神经元
3/26	im	神经元

3/27	im	非神经元
			3/29	im	神经元
4/3	im	神经元
			4/5	im	神经元
4/7	im	神经元
			4/10	im	神经元
4/12	im	非神经元
			4/14	im	非神经元
4/21	im	神经元
			4/24	im	神经元
4/26	im	神经元
			4/28	im	神经元
5/1	im	神经元
			5/10	im	神经元
5/12	im	神经元
			5/13	im	非神经元
5/22	im	神经元
			5/24	im	神经元
5/29	im	神经元
			6/5	im	神经元
6/7	im	神经元
			6/10	im	神经元
6/14	im	神经元
			6/16	im	神经元
6/19	im	神经元
			6/21	im	神经元
6/23	iv	非神经元
			6/27	im	神经元
6/29	im	神经元
			7/3	im	神经元
7/5	im	神经元
			7/12	im	神经元
7/14	im	神经元
			7/17	im	神经元
7/19	im	神经元
			7/21	im	神经元
7/27	im	神经元
			7/28	im	非神经元
8/1	im	非神经元

8/3	im	非神经元
			8/5	im	非神经元
8/7	im	非神经元
			8/19	im	非神经元
8/24	im	非神经元
			8/26	im	神经元
8/28	im	非神经元
			8/31	im	非神经元
9/2	im	非神经元
			9/7	im	非神经元
9/9	im	非神经元
			9/11	im	非神经元
9/14	im	非神经元
			9/21	im	非神经元
9/23	im	非神经元
			9/25	im	非神经元
9/28	im	非神经元
			9/29	im	非神经元
10/4	im	非神经元
			10/7	im	非神经元
10/10	im	非神经元
			10/14	im	非神经元
10/16	im	非神经元
			10/18	im	非神经元
10/22	im	非神经元
			10/26	im	非神经元
10/28	im	非神经元
			11/1	im	非神经元
11/4	im	非神经元
			11/7	im	非神经元
11/9	im	非神经元
			11/13	im	非神经元
11/16	im	非神经元
			11/17	im	非神经元
11/20	im	非神经元
			11/23	im	非神经元
11/27	im	非神经元
			11/30	im	非神经元
12/3	im	非神经元

12/4	im x2	非神经元
			12/7	im	非神经元
12/9	im	非神经元
			12/11	im	非神经元
12/14	im x2	非神经元
			12/16	im	非神经元
12/21	im	非神经元
			12/24	im	非神经元
12/27	im	神经元
			1/1	im	混合
1/3	im	非神经元
			1/6	im	非神经元
1/9	im	非神经元
			1/12	im	非神经元
1/15	im	非神经元
			1/18	im	非神经元
1/22	im	混合
			1/25	im	神经元
1/28	im	神经元

实施例16:

一个13岁男孩患有遗传缺陷，注意力缺乏、频繁痉挛且视力受损。他具有完全管状视野。即使坐在前排他也难以在课堂上就坐以及看黑板。他的重要事件(milestone)延迟，如果他进行阅读，他不得不阅读三遍才能记住所阅读的内容。他也难以定位室内的物品。

自从开始hES细胞治疗后，他的视力得到改善，他坐在教室里的后两排并且能够更加清晰地看清黑板。他能够记住更多的事情，他对语言命令的相应时间得到改善。他的痉挛没有以前那么多，其用药也有所减少。眼科医生报道称其视野(periphery)的受限区域(deadened area)恢复。

此患者的注射方案参见表15。

表15

日期	给药途径	细胞类型
			6/8	im	神经元(测试剂量)
6/9	im	神经元
			6/12	im	神经元

6/13	im	神经元
			6/14	im	非神经元
6/15	im	非神经元
			6/16	im	神经元
6/20	im	神经元
			6/21	im	非神经元
6/22	im	神经元
			6/23	iv	非神经元
6/27	im	神经元
			6/28	im	神经元
6/29	im	神经元
			7/3	im	非神经元
7/4	im	神经元
			7/5	im	神经元
7/6	im	神经元
			7/7	im	神经元
7/10	im	神经元
			7/11	im	神经元
7/12	im	神经元
			7/13	im	非神经元
7/14	im	神经元
			7/17	im	神经元
7/18	im	神经元
			7/20	im	神经元
7/21	iv输注	神经元
			7/22	iv输注	神经元
7/24	im	神经元
			7/25	im	神经元
7/26	im	神经元
			7/27	im	神经元
7/28	im	非神经元
			7/31	im	非神经元
8/2	im	非神经元
			8/3	im	非神经元
8/4	im	非神经元
			8/7	im	非神经元
8/8	im	非神经元
			8/9	im	非神经元
8/10	im x2	非神经元

8/11	iv输注	非神经元
			8/12	iv输注	非神经元
8/13	im	非神经元
			8/14	im	非神经元
8/17	im x2	非神经元
			8/18	im	非神经元
8/21	im	非神经元
			8/22	im	非神经元
8/23	im	非神经元
			8/24	im	非神经元
8/25	im	非神经元
			8/2/	im	非神经元
8/29	im	非神经元
			8/30	im	非神经元
9/2	iv输注	非神经元
			9/3	iv输注	非神经元
9/4	im x3	非神经元
			9/5	im	非神经元
9/6	im	非神经元
			9/7	im	非神经元
9/8	im	非神经元
			9/11	im	非神经元
9/13	im	非神经元
			9/14	im	非神经元
9/16	im	非神经元
			9/18	im	非神经元
9/19	im	非神经元
			9/21	im x2	非神经元
9/22	iv输注	非神经元
			9/23	iv输注	非神经元
10/3	im	非神经元
			10/4	im	非神经元
10/5	im	非神经元
			10/6	im	非神经元
10/9	im	非神经元
			10/10	im	非神经元
10/11	im	非神经元
			10/12	im	非神经元
10/13	眼眶后	神经元

10/16	im	非神经元
			10/17	im	非神经元
10/18	im	非神经元
			10/20	im	非神经元
10/23	im	非神经元
			10/24	im	非神经元
10/25	im	非神经元
			10/26	im	非神经元
10/27	iv输注	非神经元
			10/28	iv输注x3	非神经元
10/31	im x2	非神经元
			11/2	im x2	非神经元
11/3	im x2	非神经元
			11/6	im x2	非神经元
11/8	im	非神经元
			11/9	im	非神经元
11/10	im	非神经元
			11/13	im	非神经元
11/14	眼眶后	神经元
			11/15	im	非神经元
11/16	im	非神经元
			11/17	im	非神经元
11/20	im	非神经元
			11/21	im	非神经元
11/23	im	非神经元
			11/24	im	非神经元
11/29	im	非神经元
			11/30	iv	混合
12/1	iv输注	混合
			12/4	im	非神经元
12/5	iv	混合
			12/6	im	非神经元
12/7	im	非神经元
			12/8	im	非神经元
12/11	im	非神经元
			12/12	im	非神经元
12/13	im	非神经元
			12/14	im	非神经元
12/18	im	非神经元

12/19	iv	非神经元
			12/21	im	非神经元
12/22	眼眶后	神经元
			12/29	im	神经元
2/2	im	非神经元

实施例17:

该患者是患有弗里德赖希共济失调的32岁男性，其姐姐(妹妹)死于该疾病。他不能站立、言语衰弱、难以吞咽、不能离开轮椅并且如厕需要帮助。他之前在德国和美国接受治疗，但没有结果。他的心脏扩张，功能水平为15-20%。

自从开始hES细胞治疗后，他已经出现改善。他能够更清晰地讲话，且没有吞咽困难。他的心脏有改善，所有尺寸回到正常值，机能容量提高至58-60%。没有恶化。

此患者的注射方案参见表16。

表16

眼病的治疗

按照本发明实践，hES细胞移植的另一应用是按照本发明实践将神经元祖细胞和hES细胞直接注射到眼睛的眼球后部位、眼睛的浅表区域和眼睛的内腔来治疗眼病，包括但不限于：视神经萎缩、黄斑变性、眼损伤、角膜移植排斥和视网膜色素变性。

虽然可改变给药方案以适合具体患者，但治疗眼病的典型方案包括肌肉内和静脉内注射10天，然后是眼球后或玻璃体内注射，肌肉内和静脉内注射15天，然后是眼球后注射，2次静脉内输注，2个月后进行眼球后注射。在8个月－1年的时间内给予共计4次眼球后注射，然后观察结果，在一些情况下在较早期观察结果。可利用玻璃体内途径。另外，可通过使用生长有干细胞的接触镜来修复角膜。也可使用含有干细胞的眼滴剂。

实施例18:

诊断有视神经萎缩的患者表现出以下病症，包括阅读小字困难，无法看清远处的物体。也不能看到深蓝色和紫色。视力为零，能感知光线，现在是6/24。

按照本发明干细胞疗法，即，通过眼球后注射给予包括神经元干细胞祖细胞的hES细胞和其衍生物，按照本发明实践，通过局部静脉内注射、皮下注射或肌肉内注射、玻璃体内注射或局部施用给予约750,000-160,000,000个给予包括神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞的hES细胞和其衍生物，该患者显示出显著改善。他能够读出时间，可以看到广告牌，并且能在一定距离外看电视。

此患者的注射方案参见表17。

表17

肝病和肾病的治疗

按照本发明实践，hES细胞移植的另一种应用是按照本发明实践移植来治疗肝病和肾病，包括但不限于：末期肾下垂和肾病综合征。给药途径是静脉内、肌肉内和静脉内输注。

实施例19:

诊断有肾病综合征的患者表现出尿素、肌苷和P蛋白水平升高。不能保持皮髓质分化，身体肿胀。按照本发明实践，通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射或静脉内输注给予约750,000-160,000,000个hES细胞和其衍生物，包括造血干细胞祖细胞、产清蛋白干细胞祖细胞和产胆红素干细胞祖细胞。用干细胞治疗后，身体的肿胀程度减轻，皮髓质分化得以恢复。尿素、肌苷和P蛋白水平也恢复标准。

此患者的注射方案参见表18。

表18

日期	给药途径	细胞类型
			8/10	测试剂量	神经元
8/11	im	神经元
			8/12	im	神经元
8/16	im	hES
			8/22	im	hES
8/24	im	hES

8/25	im	神经元
			8/29	im	神经元
9/1	im	神经元
			9/7	im	神经元
9/8	im	非神经元
			9/12	im	神经元和非神经元混合物
9/19	im	神经元和非神经元混合物
			10/3	im	神经元和非神经元混合物
10/10	im	神经元和非神经元混合物
			10/11	iv	神经元和非神经元混合物
10/31	iv	非神经元
			11/10	im	非神经元
11/21	im	非神经元
			12/8	im	非神经元
12/23	iv	非神经元
			2/7	im	非神经元
8/24	im	非神经元
			8/25	im	非神经元
9/9	im	非神经元

肌-骨骼疾病的治疗

按照本发明实践，hES细胞移植的另一种应用是治疗肌-骨骼疾病，包括但不限于：关节炎、杜兴肌营养不良、肢带肌营养不良、脊髓性肌营养不良和贝克尔肌营养不良。

虽然可改变给药方案以适应具体患者，但治疗肌-骨骼疾病的典型方案包括在第一个月每天肌肉内或静脉内注射，在第3、5、6和7个月每周注射两次，在第9-12个月每周注射，每3个月加强注射一次。每10-15天给予一次静脉内输注，每15-30天给予一次深度脊髓肌肉注射。

实施例20:

诊断有杜兴肌营养不良的患者的病史表现出以下症状，例如疲倦、大腿和面部肿胀，以及阳性高尔征候，10,000单位的高水平肌苷磷酸激酶(CPK)。

通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、静脉内导管输注、硬膜外导管输注或蛛网膜下腔阻滞导管输注，用hES细胞和其衍生物治疗该患者预定时间后，其CPK水平显著降低至1198单位，高尔征候为阴性，所述hES细胞和其衍生物包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。

此患者的注射方案参见表19。

表19

实施例21:

诊断有DMD的14岁男孩卧床不起，手腿无力，肌肉营养不良，同时伴有脊柱侧凸。

治疗8个月后，病人二头肌、三头肌和肱桡肌有所生长，并能将手臂举高至肘部水平。体重增长，并且长高，而没有任何相关的脊柱侧凸。他的CPK水平(表明肌肉降解速率)也降低。

此患者的注射方案参见表20。

表20

实施例22:

由于DMD不能离开轮椅的一个8岁男孩无法行走或站立。治疗6个月后，他的CPK水平降低。他并未恶化，能够移动其手臂。他开始在借助很少支撑的情况下行走。

此患者的注射方案参见表21。

表21

实施例23:

对一个诊断患有DMD、能够在有支撑的情况下走几步的10岁男孩进行治疗。他在床上无法自主翻身或自主就坐。他可以将手臂举高至300，直到肘部水平。几个月治疗后，他的CPK水平开始下降，他能够自主翻身，并可将一大杯水举高过头来沐浴。他的体重没有降低。

此患者的注射方案参见表22。

表22

心脏疾病和失调的治疗

按照本发明实践，hES细胞移植的另一种应用是治疗心脏疾病和失调，包括但不限于：限制型心肌病、心力衰竭、窦性心动过缓和冠心病。将某部分分化细胞掺入患者的心脏组织，再生和修复受损的肌肉。

虽然可改变给药方案以适应具体患者，治疗心脏疾病和失调的典型方案包括在2周中隔天进行肌肉内和静脉内注射，在接下来的2周中，每3天进行注射，在第3、6、10和12个月每月肌肉内注射和静脉内输注一次。可以在搭桥手术过程中在受损区域周围进行心内注射。

实施例23:

建议患有窦性索综合征(Sinus Corda Syndrome)和窦性心动过缓的患者植入起搏器。按照本发明实践治疗该患者，通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射或心内注射或在血管造影术期间给予约750,000-160,000,000个hES细胞和其衍生物，其中所述hES细胞和其衍生物包括造血干细胞祖细胞。用hES细胞治疗后该患者的征候改善，也不需要起搏器。

此患者的注射方案参见表22。

表22

癌细胞和癌组织的治疗

或者，可按照本发明实践给予hES细胞，以补充癌症患者的常规化疗。在常规化疗中，给予细胞毒剂以破坏癌细胞。然而，细胞毒剂不能区别正常细胞和癌细胞，且可能破坏患者的非癌细胞，包括患者免疫系统的细胞。结果是，在进行化疗时和化疗停止后的一段时间，由于免疫系统受损，癌症患者易受感染。通过将造血干细胞、神经元干细胞和hES细胞给予进行化疗的患者，一部分注射细胞将分化成新的免疫系统，取代被化疗破坏的白细胞、红细胞、血小板和其它细胞。同时，通过调节有丝分裂机制和恢复正常细胞通信通路使放疗和化疗引起的发育不全骨髓再生能促进免疫系统，进而终止失调的有丝分裂。可通过静脉内或肌肉内注射给予hES细胞和/或其衍生物，或者直接给予生长部位。这些细胞也作用于异常hedgehog途径并对其控制，以制止过量增殖。

实施例24:

患有III期腺癌的患者进行化疗和手术治疗未成功。因为开始出现多处肝转移并出现结节以及腹腔和胰腺后结节，该患者需要支持性护理。

按照本发明实践，给予该患者约750,000-160,000,000个hES细胞和其衍生物，引起显著改善，包括恢复了均一异质的肝脏(之前有结节)和淋巴结强回声(echogenic)面积增加。

此患者的注射方案参见表23。

表23

口疮性溃疡/扁平苔藓的治疗

hES细胞和/或其衍生物的另一项应用是治疗身体粘膜表面的溃疡，如口腔的口疮性溃疡。静脉内、肌肉内和局部给予该细胞。在最初4个月每日进行肌肉内或静脉内注射，每15-30天进行一次静脉内输注。也进行局部直接施用或通过与凝胶混合施用。

实施例25:

舌头上布满引起疼痛的坏死组织和口疮性溃疡的65岁妇女前来就诊。她难以进食、吞咽和谈话。接受hES细胞后，她有所改善；她能更容易地吞咽和谈话，并能将口张得更大。她也显示出溃疡和坏死组织的恢复。

骨关节炎、关节炎、强直性关节的治疗

hES细胞和/或其衍生物的另一项应用是治疗骨关节炎、关节炎和强直性关节。在最初的10天中每天进行肌肉内注射。关节内注射与萨鲁美卓(salumedrol)混合的750,000-80,000,000个hES细胞，11/2-3个月后重复注射。

臂神经丛损伤的治疗

hES细胞和/或其衍生物的另一项应用是治疗臂神经丛损伤，其中患病手臂是瘫痪的。通过肌肉内、静脉内途径将该细胞给入臂神经丛，每11/2个月重复一次，持续1年，或者直到该手臂有所改善。也采用静脉内输注。

实施例26:

患者是具有臂神经丛损伤(Lt.)手的26岁男性，在过去7-8年里，他已经失去该手的功能。用干细胞治疗后，他的左手直到肘部和腕部都比以前好得多，具有更好的运动能力。他能够移动手腕，该手不再像以前那样软弱无力。他也也能向上举起他的手臂。

生殖疾病的治疗

按照本发明实践，hES细胞移植的另一项应用是通过恢复睾丸萎缩、卵巢衰竭和无精子症患者的生育力治疗生殖疾病。

实施例27:

按照本发明实践，通过局部肌肉内注射用包括造血干细胞祖细胞在内的hES细胞和其衍生物治疗无精子症患者，导致产生精子。另外，也采用静脉内和肌肉内注射以及直接注射到睾丸中，也采用在附睾附近皮下注射。

此患者的注射方案参见表24。

表24

日期	给药途径	细胞类型
			2/1	测试剂量	非神经元
8/4	im	非神经元
			2/5	im	非神经元
8/7	im	非神经元
			2/2	im	神经元和非神经元混合物
7/27	im	神经元
			3/6	im	非神经元
9/1	im	神经元
			9/2	im	神经元
9/6	im	神经元
			9/7	im	神经元
9/12	im	神经元
			9/13	im	神经元和非神经元混合物
1/17	iv	非神经元
			3/27	im	非神经元
4/26	im	神经元
			5/8	im	非神经元
5/25	im	非神经元
			8/11	im	非神经元
8/17	im	非神经元
			9/7	im	非神经元

组织再生

按照本发明实践，可给予hES细胞，以诱导组织再生，包括但不限于肌肉再生，治疗肝硬化和形成新血管(新血管形成)，它能有效治疗变性疾病和不愈合的溃疡。

糖尿病的治疗

本发明的另一个实施方式是将hES细胞和/或其衍生物用于治疗糖尿病，其中所述细胞包括产胰岛素祖细胞。糖尿病患者发生心脏病发作或中风的风险是普通人的四倍，其多个器官变性和衰竭的风险也较高，这些器官包括肾脏、眼睛、神经系统和全身免疫。通过移植产胰岛素hES细胞从而恢复体内的胰岛素生产治疗糖尿病，使患者对胰岛素的需求降低，虚弱副作用也有所减轻。

虽然可改变给药方案以适应具体患者，治疗糖尿病的典型方案包括在第一个月中肌肉内和静脉内注射每周两次，在第3、6、11和12个月每周注射一次。也可在第6个月进行静脉内输注。

实施例28:

该患者是患有糖尿病的70岁男性，他患有酮酸过多中毒症，他服用52单位胰岛素并口服降血糖药。治疗6个月内，它不需要药物和胰岛素治疗，在过去一年半中能够在正常饮食情况下维持其血糖水平。他接受加强注射。

此患者的注射方案参见表25。

表25

日期	给药途径	细胞类型
			9/5	测试剂量	非神经元
9/6	im	神经元
			9/7	im	神经元
9/8	im	非神经元
			9/9	im	非神经元
9/12	iv	神经元
			9/13	im	非神经元
9/19	im	神经元和非神经元混合物
			9/22	iv	非神经元
9/26	im	神经元和非神经元混合物
			9/29	im	神经元和非神经元混合物
10/3	im	神经元和非神经元混合物
			10/5	im	非神经元
10/10	im	非神经元
			10/13	iv	非神经元
10/17	im	神经元和非神经元混合物
			10/20	iv	非神经元
10/24	iv	神经元和非神经元混合物
			10/31	iv	神经元和非神经元混合物
11/3	iv	神经元和非神经元混合物
			11/7	im	非神经元
11/10	im	非神经元
			11/14	iv	神经元

11/17	im	非神经元
			11/21	im	非神经元
12/12	iv	非神经元
			12/19	iv	神经元
12/26	iv	非神经元
			1/4	im	非神经元
8/18	im	非神经元
			8/21	im	非神经元
8/22	im	非神经元
			8/24	im	非神经元
8/26	im	非神经元

实施例29:

54岁男性过去三年患有无法控制的糖尿病，用42单位胰岛素和口服降血糖药治疗。他的禁食血糖水平为200mg/dl，在药物控制下他的正餐后血糖水平为280mg/dl。

用hES细胞治疗三周后，他停止胰岛素治疗，并且降低了降血糖药的剂量。他感觉非常好并且更警觉。

此患者的注射方案参见表26。

表26

日期	给药途径	细胞类型
			1/18	im	神经元(测试剂量)
1/19	im	非神经元
			1/20	im	非神经元
1/21	im	混合
			1/22	im	混合
1/23	im	混合
			1/24	im	神经元
1/25	im	神经元
			1/26	im	非神经元
1/27	im	非神经元
			1/28	im	神经元
1/29	im	神经元
			1/30	im	神经元
1/31	im	混合

实施例30:

一位45岁男性患有咽峡炎和糖尿病。他用胰岛素和口服降血糖药治疗，并做过血管成形术。

接受hES细胞治疗3个月后，他停止胰岛素治疗，并且降低口服降血糖药的剂量。他的血糖和用药记录显示血糖水平得到了很好的控制。

此患者的注射方案参见表27。

表27

间质性肺病的治疗

实施例31:

患有ILD(间质性肺病)的中年妇女前来就诊。她处于疾病末期，静息时SPO₂为69%。现在，通过hES细胞治疗，她的疾病不再进展。该患者的整体感觉好得多，其呼吸也有改善。该治疗仍在继续。听诊时可听到呼吸音，她的整体肺功能检测显示有一些改善。

此患者的注射方案参见表28。

表28

新药开发

hES细胞的另一项应用是开发和检测新药。例如，可按照本发明实践培养hES细胞，并用作药物研发中测试新化学实体、候选药物和新药的靶点、作用方式、摄取、代谢、排泄、毒性和安全性的底物。在一个实施方式中，本发明涉及测试化合物对hES细胞和/或其衍生物的作用的方法，其包括在该化合物存在下培养通过本发明方法获得的hES细胞和/或其衍生物和确定该化合物对该细胞的作用。

实施例32:

分析抗生素四环素和头孢曲松以及患者血清对培养的hES细胞的作用。这些药物以不同浓度单独或同时引入，研究对干细胞的作用。最后，确定药物的剂量和药物的功效。

药物递送

hES细胞和/或其衍生物的另一项应用是将药物携带至损伤或疾病的位点以进行局部递送。可以在药物存在下培育hES细胞和/或其衍生物，以使该细胞摄入该药物。然后可将加载细胞局部递送至治疗位点，在治疗位点药物从细胞中扩散出来进而治疗该损伤或疾病。在另一实施方式中，如果损伤或患病区域不适合直接施用该药物(例如，直接注射该药物对该区域的损伤太大)，可将加载细胞递送至该损伤或患病区域以外的位点。这种药物递送方法能够施用全身递送给对象时有毒性的药物。与其它给药途径相比，这种方法也能够将较高浓度的药物给予该位点。在另一个实施方式中，hES细胞和/或其衍生物可加载一种或多种药物，这些药物能提高细胞移植本身产生的治疗作用。非限制性例子包括含抗高血压药的加载细胞治疗心脏病，含化疗药的加载细胞治疗癌症患者和含神经营养因子的加载细胞治疗SCI。在一个实施方式中，本发明涉及将药物递送给对象的方法，其包括在该药物存在下培养本发明方法获得的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞摄入该药物，将该细胞给予对象位点，药物被递送至该位点。

在本发明的一个方面，本发明培养方法能够使hES细胞和/或其衍生物在移植前体外接触药物和其它活性剂，相对的是将该药物和活性剂直接给予患者。细胞体外接触药物有利于提供该药物的正面作用(如丙戊酸的神经营养作用)，同时避免全身给予该药物时产生的毒性。

脊髓损伤治疗：病例研究

用hES细胞和其衍生物临床治疗SCI产生了显著的结果。鉴于实施本发明的本旨和患者是无法治愈的志愿者以及它们的病症是ASIA A慢性SCI，因此超过了可能发生天然神经再生过程的阶段，所以根据医生誓言，没有进行双盲或安慰剂对照试验。通过下面提供的病例研究形式的详细实施例证明该方案的结果。

病例研究1

按照本文所述方法移植hES细胞而实施本发明会导致患有SCI的对象的SCI症状逆转。

ReRo1.3.4./000/220905/α，宣告无法用不同医疗方法治疗的发生C6-C7骨折和关节错位的29岁对象。该对象的乳房间区域向下都没有感觉，不能自主就坐，没有膀胱或肠道控制，不能移动手臂，双腿没有力量或紧张性。在三年中该对象已发生无法愈合的双侧褥疮。在如下条件下开始按照本发明实践给予hES细胞和其衍生物。

用无菌生理盐水将含有约750,000-80,000,000个hES细胞和其衍生物的药物组合物稀释至终体积为0.25-1.0ml，所述hES细胞和其衍生物包括造血干细胞祖细胞和神经元干细胞祖细胞，然后进行核型分析，检测污染、活力，并用标准方法计数，然后通过皮下注射给予前臂。在五分钟、十分钟、十五分钟、三十分钟、一小时和二十四小时后观察该对象的过敏性休克，注射部位的疼痛或炎症，全身痒感，脸红或发热。

通过给予重悬于0.25-1.0ml无菌生理盐水的药物组合物的皮下初始注射液治疗该对象，该药物组合物含有750,000-80,000,000个hES细胞和其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞和神经元干细胞祖细胞。还通过肌肉内注射给予携带重悬于0.25-1.0ml无菌生理盐水的相同数量的造血干细胞和神经元干细胞的初始注射液。最后通过静脉内注射给予重悬于0.25-1.0ml无菌生理盐水的750,000-80,000,000个神经元干细胞祖细胞的初始注射液。

将含有750,000-80,000,000个hES细胞和其衍生物的药物组合物重悬于2ml无菌生理盐水，进一步稀释至15-40ml无菌生理盐水中，第一次初始注射7天后通过硬膜外注射给予损伤位点、损伤位点以下和以上，从而按照本发明实践直接治疗SCI，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞。初始注射一个半月后、四个月后和六个月后重复硬膜外注射给予治疗。

除硬膜外给予外，还通过开始治疗2和5个月后鞘内注射悬浮于2ml无菌生理盐水的含有750,000-11,000,000个hES细胞和其衍生物的药物组合物治疗该对象，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞和神经元干细胞祖细胞。

此外，通过在连续三天中每天两次硬膜外注射重悬于2ml无菌生理盐水、进一步稀释至终体积4ml的含有750,000-80,000,000个hES细胞和其衍生物的药物组合物治疗该对象，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞。

此患者的注射方案参见表29。

表29

开始治疗后定期评估该对象的神经健康度，在两周后观察到该对象的精神状态和总体卫生情况显著改善，如表30所示。

表30

在治疗期间评价C6-C7骨折引起的自主神经系统损伤的典型征候和症状。如表31所示，观察到所有检测参数显著和不断的改进，这些参数包括感觉深层压力的能力、触觉、知觉、平衡能力、感觉疼痛的能力、感觉温度变化的能力、非随意运动、出冷汗、头晕、血压、呼吸困难、躺倒时姿势异常和自主就坐的能力。

表31

表31(续)

膀胱和肠道功能障碍常常与SCI引起的神经损伤相关。这种损伤导致膀胱控制、膀胱流和膀胱充盈知觉、肠道控制、肠道排泄时间和肠道知觉受损。在治疗过程中，观察到所有检测参数显著和不断的改进，如表32所示的治疗结果。

表32

在治疗期间评估作为C6-C7损伤位点神经再生证据的上半身运动能力改变。观察到肩部运动、手腕和手指运动、手指力量、腱反射、四肢运动强度、肌肉萎缩和握力显著和不断的改善，如表33所示。

表33

S=肩部；FA=前臂；W=手腕；F=手指；L=左；R=右

力量：0是差，4是好

萎缩：0是好，4是差

在治疗期间评估作为C6-C7损伤位点神经再生证据的下半身运动功能改变，包括臀部运动、膝盖运动、脚趾运动、腱反射、四肢强度、肌肉萎缩和足底反应。虽然在研究期间测试的任何参数都没有改善，但治疗3个月后，该对象能够在助行架的辅助下站立，如表34所示。

表34

病例研究2

ReRo1.3.4./001/051004/α001，因为从二楼屋顶上跌落后D6-D7骨折而发生外伤后截瘫SCI的22岁对象。该对象跌落后昏迷了两天才恢复意识，但发生双侧瘫痪，且从乳房间区到脚的下半身丧失了全部感觉和运动能力，不能抬起脚和腿，不能自主就坐或起身成就坐姿势。该对象永久性卧床，丧失膀胱和肠道控制能力，完全依赖家人的支持，但其上肢未受影响。

按照本发明实践，在损伤5个月后开始给予含有hES细胞和其衍生物的药物组合物。在5个月时间中，该对象恢复膀胱和肠道控制能力，且能够在无支持的条件下就坐，通过提起臀部滑上滑下。感官知觉恢复至会阴水平。该对象可以自主地将自身移动到助行架中，可以在助行架中熟练的站立而不需要膝盖支撑。该治疗导致该对象能够在膝关节固定带的帮助下用助行架行走，并恢复工作，即，他重新获得了正常的生活方式。

此患者的注射方案参见表35。

表35

日期	给药途径	细胞类型
			10/5	测试剂量	神经元
8/17	im x3	神经元
			8/18	im	神经元
8/19	im	神经元
			9/5	im	非神经元
9/6	im x2	神经元
			9/7	im	神经元
9/8	im	神经元
			9/10	im	非神经元
9/13	im	神经元和非神经元混合物
			9/14	im	神经元和非神经元混合物
9/15	im	非神经元
			11/6	硬膜外导管	神经元
11/7	硬膜外导管x3	神经元
			11/8	硬膜外导管x3	神经元
11/9	硬膜外导管x3	神经元
			11/10	硬膜外导管x3	神经元
11/11	iv	神经元
			11/12	im	神经元
11/13	iv	神经元
			11/14	iv	神经元
11/15	iv	神经元
			11/16	im	非神经元
11/18	im	非神经元
			1/12	im	神经元
2/14	im	非神经元
			2/15	im	神经元
2/16	im	非神经元

2/17	im	非神经元
			2/18	im	神经元
3/26	im	神经元
			3/27	硬膜外导管x3	神经元
3/28	硬膜外导管x4	神经元
			3/29	硬膜外导管x2	神经元
3/30	硬膜外导管x2	神经元
			3/31	iv	神经元
5/21	im	神经元
			5/24	鞘内	神经元
5/26	im	神经元
			7/14	im	神经元
7/15	im	神经元
			7/16	im	神经元
7/17	im	神经元
			7/18	鞘内	神经元
7/19	im	神经元
			7/21	im	神经元
7/22	im	神经元
			7/24	尾侧	神经元

病例研究3

ReRo1.3.4./002/040205/α，因为C5-C6损伤发生四肢瘫痪性SCI伴随颈部僵硬和疼痛的40岁对象。该对象六个月后接受手术，然后便四肢瘫痪。该对象在有支撑的状况下就坐时感觉下沉和眩晕、肩胛骨上缘以上部分有感觉、四肢无力、手术后立即丧失了肠道和膀胱功能。

手术9个月后开始按照本发明实践给予含有hES细胞和其衍生物的药物组合物。hES细胞治疗的结果是，该对象能够在无需支撑的条件下舒服地就坐，能够在轮椅中就坐时移动身体并弯至一侧，同时其下肢舒服地悬垂。该对象对上半身的控制显著改善。通过运动能力、独立性和活动的增加，该患者的总体精神状况显著改善。他能够在有支撑的条件下站立、下肢有力、能控制脚趾运动、没有手腕下垂现象。按照该对象状况的改善，治疗正在进行中。

病例研究4

ReRo1.3.4./003/260902/β，在17年前的一次公路交通事故后发生脊髓损伤和脑损伤，从此被限制在轮椅上的37岁对象。该对象也患有侧偏瘫、无法交谈、面瘫、记忆全部丧失且无法控制膀胱。

按照本发明实践，将含有hES细胞和其衍生物的药物组合物给予该对象一年零两个月，导致能够在助行架的辅助下行走、说出几个单词、颈部伸直、面瘫消除和记忆力改善。

病例研究5

ReRo1.3.4./004/030505/α，患有C5-C8外伤后骨折、骨折的椎骨错位(retrovulsion)引起脊髓挫伤和相关性前硬膜外出血、且截瘫的56岁对象。该对象不能移动双侧下肢，后背急性疼痛。

按照本发明实践，给予含有hES细胞和其衍生物的药物组合物一年，导致双腿恢复一些力量、恢复感官知觉(如双腿摇摆)，并能够在助行架的帮助下站立而不发生背痛。该对象可以在助行架的帮助下行走、恢复膀胱控制和知觉、并克服了冷汗和头晕的发作。

此患者的注射方案参见表36。

表36

病例研究6

ReRo1.3.4./005/130705/β，诊断在D6水平有博茨脊椎病(Potts Spinedisorder)、下肢截瘫的25岁对象进行了三次手术，为脊髓前部减压。该对象离不开轮椅，不能在无支撑的情况下就坐，腿部肌肉松弛而瘫痪，没有肠道控制，躺倒时排泄，没有膀胱感觉。

在损伤后十一年零六个月，按照本发明实践给予该对象含有hES细胞和其衍生物的药物组合物。在第一年按照该治疗方案导致后背力量增强、能够在无支撑的条件下就坐，并且感觉到腿的重量。该对象也恢复了月经期间的背痛和痛经。观察到大腿、腿的感觉以及膀胱感觉和控制的恢复。该对象能够在助行架的辅助下行走，双腿的运动功能恢复良好。治疗正在进行中。

此患者的注射方案参见表37。

表37

病例研究7

ReRo1.3.4./006/220805/α，患有C6-C7截瘫性SCI的30岁对象不能移动下肢，没有肠道控制和肠道感觉。该对象只有乳房间区向上区域有清晰和深层压觉。因此，该对象难以就坐。该对象的手力气很小，指头运动非常弱，该对象难以呼吸。

按照本发明实践，通过在损伤约3个月后含有hES细胞和其衍生物的药物组合物治疗该对象。该对象恢复在无支撑条件下的就坐能力、不再头晕、可感知腹股沟压力、可感觉到肘部内侧、如果患者尝试移动会感觉到腿部疼痛。该对象能容易地呼吸、膀胱和肠道有感觉、腿部有感觉，现在可在有支撑的情况下站立数分钟。该对象的手指力量和运动能力也有提高。治疗正在进行中。

此患者的注射方案参见表38。

表38

病例研究8

ReRo1.3.4./007/221005/β，由于D6SCI而截瘫的26岁对象不能移动双腿，但能在无支撑的情况下就坐。该对象没有膀胱或肠道控制，只有乳房间区域上方有感觉。

损伤约10个月后，按照本发明实践给予该对象含有hES细胞和其衍生物的药物组合物。该对象恢复身体侧面一直到肚脐区域(unbiliousregion)，以及双侧腋域至髋骨的感觉。该对象可以在助行架和卡钳的辅助下行走，双腿有运动能力。

此患者的注射方案参见表39。

表39

病例研究9

ReRo1.3.4./008/151005/β，患有外伤性四肢瘫痪并且难以交谈和呼吸、颈部僵直的27岁对象。该对象的腿瘫痪，该对象无法移动指头，身体其余部分无感觉。

损伤约两年后，开始按照本发明实践给予含有hES细胞和其衍生物的药物组合物进行治疗。该对象的颈部运动改善、交谈容易、对音调的控制能力提高。该对象发现呼吸没有以前困难，运动功能有所恢复，能够做一些指头运动。腿的痉挛程度减轻，该对象能够自主就坐。也恢复了脚趾运动，该对象能够移动肩部。

此患者的注射方案参见表40。

表40

病例研究10

ReRo1.3.4./009/300106/α，25岁对象曾经历交通事故，不能在无支撑的情况下就坐，脊椎倾向于弯曲，该对象丧失了膀胱和肠道控制，该对象的腿完全没有力气。

损伤约两年后，按照本发明实践通过给予含有hES细胞和其衍生物的药物组合物治疗该对象。该对象显示出快速改善，并且可以在无支撑的情况下就坐。该对象没有发生头晕、双脚能够运动、恢复指尖感觉，并可感觉到通过脊椎的冷流(chill flowing through the spine)。

病例研究11

ReRo1.3.4./010/020206/β，由于车祸在D12-L1发生SCI的26岁对象不能站立伴随膝盖收缩。该对象能够在无支撑的情况下就坐，四肢感觉正常。该对象没有膀胱或肠道控制能力，痉挛程度提高。

损伤约12年后，按照本发明实践给予含有hES细胞和其衍生物的药物组合物以治疗该对象。该对象的腿部运动功能得到明显恢复，痉挛程度降低，其右腿可以完全伸直，左腿力量得到恢复。该对象恢复了在卡钳和助行架的辅助下站立和行走的能力。该对象也恢复了膀胱和肠道感觉。

此患者的注射方案参见表41。

表41

病例研究12

该患者是D6-D8之间损伤后发生截瘫的26岁男性。他在2004年9月发生交通事故造成外伤。他完全卧床不起，胸部以下没有感觉，没有膀胱或肠道控制，胸部以下没有感觉或运动能力。后背生长极深度的褥疮，可以看到骶骨。

该患者在2006年4月27日开始hES细胞治疗。由于褥疮他无法进行任何O/T程序，每天通过静脉内和肌肉内给予一定剂量的细胞，最终将hES细胞直接施用于他的褥疮。也通过静脉内输注给予细胞。

在治疗的第11天，他可在完全卡钳(腰部至脚踝)和助行架的帮助下站立和走出2步。随着时间推移，他的肌肉力量增强，4个月后他可走出多达100步，并可站立长达20分钟。他能够感知腿部，也能移动。他也能感觉到膀胱和肠道充盈，能够仅借助膝关节固定带和助行架的支撑来行走。他的褥疮已经愈合，并继续他的研究。

此患者的注射方案参见表42。

表42

病例研究13

该患者是在2006年6月发生骑马事故，T-12、L-1截瘫的22岁男性。他腰部以下无力，没有肠道或膀胱控制，腰部以下无感觉。

该患者在2006年9月开始接受为期六周的治疗。他对hES细胞响应，一周内就凭借完全卡钳(腰部至脚踝)和助行架能够站立和步行几步。他已经有进步，能够通过膝关节固定带和助行架站立长达30分钟。他现在具有完全的感觉以及肠道和膀胱控制。他用手杖和拐杖能保持良好的平衡。他能够凭借卡钳和拐杖上下楼梯。

此患者的注射方案参见表43。

表43

病例研究14

患者是由于2004年9月发生的道路交通事故在T-12、L-1发生外伤性截瘫的26岁女性。她胸部以下无感觉，没有肠道或膀胱控制能力。她的腿没有运动力量，离不开轮椅。

该患者在2006年3月开始hES细胞治疗。9天后她凭借完全卡钳(腰部至脚踝)和助行架能够站立和步行几步，并且继续改善。她的目前状态是：可凭借卡钳和助行架连续行走，也能凭借膝关节固定带站立。肠道和膀胱感觉已恢复，有控制能力，不再使用导管插入术或栓剂。感觉已改善至脚踝水平。

此患者的注射方案参见表44。

表44

人类胚胎干细胞培养方法

用作根据本发明开发的细胞系起始材料的hES细胞衍生自子宫着床前的2-7日龄胚胎，如2-4日龄胚胎，如3日龄胚胎。

在胚胎分离中，卵子收集自签署知情同意书的正在进行常规IVF周期的人供者。使该卵子受精，用常规方法培育获得胚胎。将额外胚胎培育不同时间，以发育成细胞系。

将该胚胎悬浮于少量极限必需培养基(如RPMI，如含有2.2g/L碳酸氢钠的RPMI1640)，通过机械手段，如震荡分离该胚胎中的hES细胞。将额外培养基以及孕激素和βhCG激动剂加到分离的细胞中。在一个实施方式中，加入孕酮(16-64μl250mg/ml)和βhCG(16-64μl5000iu/ml)。在34-38℃的温度、3.5–6%二氧化碳的环境中培养分离细胞12-48小时，如24小时。

在一个实施方式中，在缺氧或明显缺氧的条件下培养hES细胞，以便在防止分化的同时扩增细胞。"明显缺氧"被定义为少于约10%O₂，如少于8%、6%、4%、2%或1%O₂。可用多气体(CO₂、O₂、N₂)细胞培养箱产生低氧条件，其中通过用氮气置换培养环境中的空气将氧气水平设定为0-20%。多气体培养箱的例子包括Fisher11-730系列、Napco7000系列、Sanyo MCO系列、Jouan IG750和Heraeus Heracell150。在另一实施方式中，在CO₂培养箱中培养细胞，通过含有细胞的培养瓶的形状和位置控制氧气水平。例如，当细胞培养瓶垂直放置时，该培养瓶中的许多培养基明显缺氧。相反，当细胞培养瓶水平放置时，该培养基明显有氧。可通过改变培养箱中细胞培养瓶的形状和/或位置或者培养瓶中培养基含量(例如液面上空间量)在明显缺氧和明显有氧之间改变培养基的氧气含量。

在扩增阶段，使培养瓶保持垂直位置，而非水平位置。在一个实施方式中，体积几乎完全被培养基占据并且保持垂直的培养容器中进行培育。结果是，大部分细胞不会在培养瓶壁上贴壁，培养基明显缺氧。

在这种生长条件下，细胞倍增或增殖周期为最大值，明显抑制细胞分化过程。扩增过程中细胞增殖周期为12-48小时，如24小时。

在hES细胞的传代或再培养中，离心该细胞悬液，将细胞沉淀重悬于少量含有孕酮和βhCG的新鲜培养基中，等分该细胞，加入不含孕酮和βhCG的新鲜培养基。在一个实施方式中，培育干细胞等份与新鲜细胞培养基的比例为约1:3.5-1:35体积/体积。在充有3.5-6%二氧化碳的34-38℃水夹套培养箱中，在明显缺氧的条件下再次培育该细胞12-48小时，如24小时。此时，可传代该细胞以继续扩增，或者储存待用。

通过碱性磷酸酶活性和不存在细胞特化或分化的特征性标记物证明，在这类条件下培养的hES细胞保持为基本未分化的形式。然而，注意到无法获得完全分化或完全不分化的细胞群。该细胞群是分化和未分化细胞系的混合物，未分化细胞与分化细胞的比例约为4:1-10:1。

为了储存扩增的hES细胞，例如储存于低温冰箱或液氮中，可将冻存剂，包括但不限于0.2–2%(w/v)二甲亚砜(DMSO)加入该培养基中。所用DMSO水平小于冻存所用的一般水平(如2-84μl/0.5ml试管)，以避免诱导细胞的分化或损伤。冻存剂含量与含有干细胞的培养基的比例可以是约1:500-16:1000。其它冻存剂包括但不限于：甘油、丙二醇、丁二醇、乙醇、葡萄糖、D-葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、巴巴拉秦(paparavine)、甲酰胺、丙丁酚(probuchol)、姜黄素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、硫酸软骨素、粘多糖、二甲亚砜、谷胺酰胺和丙酮酸钠。细胞悬液的冻存温度可以是约-15至-80℃，如约-15至-40℃。与储存人胚胎干细胞和其衍生物的其它技术相反，不需要急骤冷冻或储存在“吸管(straw)”中。储存后，可通过离心收集细胞和将细胞沉淀重悬于新鲜培养基，准备使该细胞连续扩增或分化。

离心(如700–1400rpm离心5–12分钟)细胞悬液以沉淀细胞，去除并弃去上清液，将该细胞重悬于少量含有孕激素和βhCG激动剂的新鲜培养基(如RPMI)中，从而使扩增的hES细胞部分分化(例如在新鲜分离的hES细胞扩增后或以前扩增的细胞储存后)。然后等份分离细胞，加入不含孕激素或βhCG的额外培养基(如极限必需培养基如RPMI或DMEM，如1X无谷氨酸DMEM或者含有4.5g/L葡萄糖和3.7g/L碳酸氢钠的DMEM)。在明显有氧的条件(例如在水平放置的培养瓶中)下培养细胞12-48小时，如24小时。"明显有氧"被定义为含有至少约15%O₂，如至少约18%或20%O₂。在明显有氧条件下，hES细胞开始分化。hES细胞的分化途径取决于该分化阶段所用的培养基。为了产生神经元祖细胞，用DMEM或其等效物培养hES细胞。为了产生神经元祖细胞以外的祖细胞，用RPMI或其等效物培养hES细胞。12-48小时增殖周期后，收集该细胞，重悬于新鲜培养基中以便继续分化。通常，分化阶段不应超过48-72小时，因为超过这一时间的过分分化会产生不适合用本发明方法移植的细胞。

一旦细胞部分分化后，如上所述加入冻存剂，将细胞储存于-15至-80℃，以便将细胞储存待用，或者制备用于本发明方法的细胞。为了制备使用的细胞，等份分离细胞，加入新鲜培养基(按照需要，如DMEM或RPMI)，在明显缺氧的条件下培养该细胞12-48小时，如24小时，以防止进一步分化。然后将细胞等份分入新鲜培养基中，继续扩增，或通过离心收集并重悬于生物相容性溶液(如盐水)准备移植。此时，可将细胞移植入患者，或储存于+4℃至-80℃以便将来移植。可以在有利于移植和临床使用的任何合适容器中储存，这些容器包括但不限于：试管、小瓶、注射器等。在一个实施方式中，以即用形式储存重悬于生物相容性溶液的细胞(例如储存于预填充注射器中)。需要时，让细胞等份自然解冻，不需要用水浴或培养箱解冻。

在生物相容性溶液中的所述贮存条件下，观察到储存6个月后再解冻细胞活力仍>40%，没有检测到基因型改变(遗传不稳定性)或表型改变，如非整倍体或异倍体。

在扩增、分化和储存的各个阶段，通过台盼蓝排除和显微镜镜检检测细胞等份的活力。也检测细胞培养物等份的微生物污染情况。其它细胞悬液等份也可放置在血球计上通过显微镜镜检，以确定细胞密度。也取其它等份测试碱性磷酸酶活性，它是细胞培养物分化状态的标记物。

在储存期间，可每月测定一次细胞的核型，以检测由培养方法引起的遗传不稳定性。

实施例

实施例1

在胚胎分离中，由签署知情同意书的进行过常规IVF周期的人供者收集卵子，该卵子产生8个卵泡。使该卵子受精，用常规方法培育获得胚胎。将三个胚胎植入供者体内。将额外胚胎培育不同时间，以发育成hES细胞系。

将完整或破碎的胚胎重悬于培养基中。另外，加入84μl孕酮(250mg/ml)和84μlβhCG(5000iu/ml)。检测含有胚胎细胞的培养基的污染情况，弃去受感染的胚胎。用这种形式的胚胎细胞进行扩增和储存。

培育1天后，将1ml含胚胎细胞的培养基加入50ml容器中含孕酮和βhCG的40ml细胞培养基(DMEM或RPMI)中。在室温、含有二氧化碳的环境中水平培育该培养基和干细胞。表45显示此种方法所遵循的一些实验条件。

培育24小时后，观察到相同数量的有核(部分分化)细胞和空白(未分化)细胞。在此阶段取约0.5ml等份储存。培育48小时后，用DMEM培养基观察到有少数几个触手(strand)的长方形细胞。然而，采用RPMI培养基时，观察到许多不同形状的有核细胞。培育48小时后发现容器容积充满至37ml标线处。在此阶段取0.5ml等份储存。用DMEM培育72小时后，观察到细胞的长触手交联起来，类似神经组织。RPMI培养基培育产生了几个小细胞和几个在中央细胞周围累积的细胞。在此阶段取0.5ml等份储存。

将在含有培养物的培养基中培养的胚胎细胞等份加入装在无菌容器(Tarsons steriflask)中的含有其它测试组分的更多细胞培养基(RPMI或DMEM)中。在室温、二氧化碳环境下以水平位置培育该干细胞不同时间，即18小时-5天。培育24小时后，再次将约0.5ml等份加入更多培养基中，再培育。取等份制备即用型组合物，并用于储存不同培育阶段的细胞。表46描述扩增hES细胞时所遵循的一些实验条件。

实施例2

将完整或破碎的胚胎悬浮于培养基中。另外，加入84μl孕酮和84μlβhCG。测试含有胚胎细胞的培养基的污染情况，弃去受感染的胚胎。用这种形式的胚胎细胞扩增和储存。

培育1天后，将1ml含胚胎细胞的培养基加入装在50ml容器中含有孕酮和βhCG的46ml细胞培养基(DMEM或RPMI)中。在室温、二氧化碳的环境下以垂直位置培养该干细胞。表47显示此实验所用的一些工作变量的例子。

培育24小时后，观察到有核细胞(部分分化)和空白细胞(未分化)的比例约为1:4。培育48小时后，观察到有核细胞和空白细胞的比例为1:2。在24小时和48小时阶段取0.5ml等份储存。

将在含有培养物的培养基中培养的0.5ml胚胎细胞加入装在无菌容器(Tarsons steriflask)中的含有其它测试组分的46ml细胞培养基(RPMI或DMEM)中。在室温、含二氧化碳环境下以水平位置培育该干细胞。培育24小时后，再次将约0.5ml等份加入46ml培养基中，再培育。表48描述扩增hES细胞时所遵循的一些实验条件。

24小时培育阶段后，取等份制备即用型组合物并储存。

实施例3：储存

为了储存，将hES细胞加入0.5ml储存管中，加入16μl冻存剂，如0.2%DMSO，温和震荡后储存于-20℃。让该细胞自然解冻，以制备即用型组合物或用于进一步扩增。检测解冻细胞的活力，发现64%-84%细胞有活力。定期检测储存细胞的污染情况以及活力。表49显示在五种不同实验中储存所遵循的实际参数和解冻后细胞的活力。

表49

实施例4

在扩增和储存阶段以不同间隔进行各种检测来检查胚胎细胞的污染或感染或异常，并鉴定各培养物中存在的hES衍生物。所述不同检测包括对HIV、HbSAg(肝炎)的检测，用于科赫检测(Kochs test)的常规PCR(结核病)，用吉木萨分带CG法进行染色体分析，通过吉-格法(Jendrasiik and Grofmethod)检测胆红素，用BCG染料结合法检测清蛋白(肝祖细胞)，通过CLIA法检测胰岛素(胰腺祖细胞)，通过免疫组化检测神经丝(神经元祖细胞)，通过免疫组化检测CD34(造血祖细胞)，通过PNPP法检测碱性磷酸酶(未分化细胞)，组织病理学检测(通过形态鉴定细胞)等。通过手工培养平板法和手工灵敏度检测培养条件，用versatrek/AP1鉴定真菌感染。进行所有这些检测，在各阶段检查细胞计数和细胞活力。表50提供了一些检测的结果。

实施例5：制备用于移植的hES细胞

取15ml干细胞悬液，1000r.p.m.离心7分钟。弃去上清液。将2-15ml盐水加入沉淀中，从而悬浮该干细胞。检查该悬液的微生物污染情况。也进行活力检查。

实施例6：以即用形式储存hES细胞

标记充满可移植hES细胞悬液的容器(注射器、试管、培养瓶、小瓶)，储存于-20℃。保持冷链至移植阶段。临移植前，让该悬液自然解冻。

细胞系

重复亚培养100次以上，以建立本发明hES细胞。另外，在扩增或储存的各个阶段检测亚培养物的污染/感染情况。发现在5年以上的亚培养周期中hES细胞系稳定，且无任何异常。

本发明范围不受具体实施方式和实施例的限制，它们旨在说明本发明的多个方面，功能上等同的任何实施方式都落入本发明范围。本领域技术人员应理解，或能够确定，不用过多的实验，就可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等效形式。这些和所有其它等效形式都应落入所附权利要求书的范围。将本文引用的所有专利、专利申请和发表物全文纳入本文作参考。

Claims (10)

1.一种治疗疾病、失调或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的人胚胎干(hES)细胞和/或其衍生物，其中所述hES细胞和/或其衍生物不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子或可溶性青灰因子或条件培养基，其中所述hES细胞和/或其衍生物悬浮于药学上可接受的生物相容性溶液中。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物装在即用形式中。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述即用形式是预填充注射器。

4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述干细胞具有有效治疗的足够活力。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述干细胞的活力大于40%。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述生物相容性溶液是盐水。

7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述生物相容性溶液还包含抗微生物剂、抗菌剂或其它药剂。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含治疗有效量的造血干细胞祖细胞。

9.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含治疗有效量的神经元干细胞祖细胞。

10.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含治疗有效量的造血干细胞祖细胞和神经元干细胞祖细胞。