CN103965347A - 经修饰干扰素β多肽和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供经修饰干扰素β多肽和其用途。
Description
分案说明
本申请案是申请日为2008年4月30日,申请号为200880014461.7(国际申请号为PCT/US2008/062083),发明名称为经修饰干扰素β多肽和其用途的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及视情况经至少一个非天然编码氨基酸修饰的干扰素β多肽。
背景技术
干扰素(Interferon,IFN)是熟知的由多种真核生物细胞分泌的细胞激素家族。干扰素具有多种生物活性,包括抗病毒性、免疫调节性、免疫调控性、赘生性和抗增殖性且已用作治疗例如癌症的疾病和各种病毒性疾病的治疗剂。干扰素已显示治疗多种疾病的效用,且在治疗多发性硬化和病毒性肝炎中获得广泛应用;目前最常见的治疗应用是治疗丙型肝炎和多发性硬化。干扰素是生长激素(GH)超基因家族的成员(Bazan,F.Immunology Today11:350-354(1990);Mott,H.R.和Campbell,I.D.Current Opinion inStructural Biology5:114-121(1995);Silvennoinen,O.和Ihle,J.N.(1996)SIGNALING BYTHE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS),其表示一组具有类似结构特征的蛋白质。这一蛋白质家族的各成员包含四螺旋束(four helical bundle)。虽然还有更多这一家族的成员尚待鉴别,但这一家族的一些成员包括以下:生长激素、促乳素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚单元)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、ε干扰素、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和心肌营养素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。尽管GH超基因家族的成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性,但其具有类似的二级结构和三级结构。共有的结构特征使基因家族的新成员容易地被鉴别。四螺旋束和干扰素多肽描述于标题为“Modified Human Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses”的WO2005/074650、标题为“Modified Human Interferon Polypeptides and Their Uses”的WO2005/074524、标题为“Improved Human Interferon Polypeptides and Their Uses”的WO2006/133089和WO2006/133088中,所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中。
干扰素包括许多相关蛋白质,例如干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、干扰素-κ(IFN-κ,也称为干扰素-ε或IFN-ε)、干扰素-τ(IFN-τ)和干扰素-ω(IFN-ω)。这些干扰素蛋白质产生于多种细胞类型中:IFN-α(白细胞)、IFN-β(成纤维细胞)、IFN-γ(淋巴细胞)、IFN-ε或κ(角质形成细胞)、IFN-ω(白细胞)和IFN-τ(滋养细胞)。IFN-α、IFN-β、IFN-ε或κ、IFN-ω和IFN-τ归为I型干扰素,而IFN-γ归为II型干扰素。干扰素α由多基因家族编码,而其它干扰素似乎各由人类基因组中的单个基因编码。此外,人类群体的不同成员间的干扰素序列中存在一定的等位基因变异。
干扰素是由被病毒入侵或暴露于某些其它物质中的细胞释放的相对较小的单链糖蛋白。干扰素目前分为三个主要类别:称为1)白细胞干扰素(干扰素-α、α-干扰素、IFN-α),2)成纤维细胞干扰素(干扰素-β、β-干扰素、IFN-β)和3)免疫干扰素(干扰素-γ、γ-干扰素、IFN-γ)。淋巴细胞应答病毒性感染主要合成α-干扰素(和ω干扰素,IFN-ω),而成纤维细胞感染通常引发产生β-干扰素。IFNα和IFNβ共有约20-30%氨基酸序列同源性。人类IFN-β的基因缺乏内含子,且编码与人类IFN-α具有29%氨基酸序列一致性的蛋白质,表明IFN-α和IFN-β基因由共同的祖先进化而来(Taniguchi等人,Nature285547-549(1980))。相比之下,IFN-γ由淋巴细胞应答丝裂原而合成。Pestka等人在Annu.Rev.Immunol.(2004)22:929-79(以全文引用的方式并入本文中)中描述第2类α螺旋细胞激素,包括干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ、IFN-τ和IFN-γ)以及干扰素样分子,例如limitin、IL-28A、IL-28B和IL-29以及这些分子所使用的配体、受体和信号转导路径。干扰素具有不同种类和许多等位基因变异体。另外,已从患各种疾病的患者细胞中分离出具有新颖活性和突变序列的干扰素。
最初任选地使用引发剂从例如白细胞层(buffy coat leukocyte)和成纤维细胞的天然存在来源获得干扰素从而增加干扰素产生。也由重组DNA技术制成干扰素。成熟IFNβ的克隆和表达由Goeddel等人于Nucleic Acids Res.8,4057(1980)中描述。
I型干扰素似乎所有都结合共同受体,即I型IFN-R,这一受体由IFNAR1和IFNAR2亚单元构成。I型干扰素之间的确切结合模式和下游信号转导级联有些不同。然而,JAK/STAT信号转导路径一般在干扰素与干扰素受体结合后被激活。STAT转录因子然后移位到核,促使许多具有抗病毒活性、抗赘生活性和免疫调节活性的蛋白质的表达。
天然存在的I型干扰素蛋白质的性质对治疗用途来说并非最佳。I型干扰素会引发注射部位反应和许多其它副作用。其具有高免疫原性,在很大比例的患者中引发中和抗体和非中和抗体。干扰素从皮下注射部位不良吸收且具有短血清半衰期。最后,I型干扰素不可溶性表达于原核生物宿主中,因此迫使再折叠(refolding)或哺乳动物表达方案成本较高且困难较大。
可自市面上购得的IFN产品的具体实例包括IFNγ-1b()、IFNβ-1a(和)、IFNβ-1b()、复合干扰素(IFN alfacon-1,)、IFNα-2()、IFNα-2a(()、聚乙二醇化干扰素α-2a()和聚乙二醇化干扰素α-2b()。与产生聚乙二醇化形式的IFN蛋白相关的一些问题描述于Wang等人(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54:547-570和Pedder,S.C.SeminLiver Dis.2003;23增刊1:19-22中。Wang等人表征的位置异构体,而Pedder等人比较与描述所使用的聚乙二醇化化学物质的不稳定性和对调配的影响。包含9种可鉴别的同种型,这些具体同种型在抗病毒活性方面不同(Foser等人,Pharmacogenomics J2003;3:312)。虽然目前可在市面上获得若干IFN产品,但仍对干扰素治疗剂存在未被满足的需要。本发明针对鉴别具有改进性质的干扰素蛋白质。若干小组已产生具有改进性质的经修饰干扰素;所有以下参考文献以全文引用的方式明确并入本文中。
已产生排除半胱氨酸变异体(Cysteine-depleted variant)以使不想要的分子间或分子内双硫键的形成降到最小(美国专利第4,518,584号、第4,588,585号和第4,959,314号,以全文引用的方式并入本文中)。已产生排除蛋氨酸的变异体(Methionine-depletedvariant)以使对氧化的敏感性降到最小(EPO260350,以引用的方式并入本文中)。
已产生具有改良活性的干扰素(美国专利第6,514,729号、第4,738,844号、第4,738,845号、第4,753,795号、第4,766,106号、WO00/78266,以引用的方式并入本文中)。美国专利第5,545,723号和第6,127,332号(以引用的方式并入本文中)揭示干扰素β在位置101处经取代的突变体。已制备包含一种或一种以上干扰素的序列的嵌合干扰素(Chang等人,Nature Biotech.17:793-797(1999)、美国专利第4,758,428号、第4,885,166号、第5,382,657号、第5,738,846号,以引用的方式并入本文中)。也已描述干扰素β在位置49和51处的取代突变(美国专利第6,531,122号,以引用的方式并入本文中)。IFNβ变异体和接合物的表达和产生论述于美国专利第7,144,574号和第6,531,111号中,这些专利以全文引用的方式并入本文中。所论述的修饰包括引入IFNβ中或从多肽中去除的糖化位点、糖化位点附近的取代、与赖氨酸或半胱氨酸残基的结合和氨基酸的引入和去除。
已论述稳定性增强的干扰素β变异体,其中疏水核心已利用合理设计方法优化(WO00/68387,以引用的方式并入本文中)。也已揭示提高干扰素稳定性或溶解性的替代调配物(美国专利第4,675,483号、第5,730,969号、第5,766,582号、WO02/38170,以引用的方式并入本文中)。
已论述溶解性增强的干扰素β突变蛋白,其中数个亮氨酸和苯丙氨酸残基经丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基置换(WO98/48018,以引用的方式并入本文中)。改进溶解性的其它修饰论述于US2005/0054053中,这一专利以全文引用的方式并入本文中。
已论述免疫原性降低的干扰素α和干扰素β变异体(参看WO02/085941和WO02/074783,以引用的方式并入本文中)。
免疫原性是目前干扰素(包括但不限于干扰素β)治疗剂的主要限制。虽然对非人类蛋白质来说免疫反应通常最严重,但即使是例如干扰素β的基于人类蛋白质的治疗剂也时常观察到免疫原性。免疫原性是对感知为外来物质的物质所产生的一系列复杂反应且可包括产生中和抗体和非中和抗体、形成免疫复合物、补体激活、肥大细胞激活、发炎和过敏反应。若干患者对IFNβ产生中和抗体(Int.Arch.Allergy Immunol.118:368371,1999)。已显示IFNβ中和抗体的产生会降低对IFNβ的生物反应,且引起治疗效果减小的倾向(Neurol.50:12661272,1998)。中和抗体很可能也会阻碍IFNβ与其它疾病治疗相关的治疗效用(Immunol.Immuther.39:263268,1994)。
数种因素会造成蛋白质免疫原性,包括(但不限于)蛋白质序列、投药途径和频率和患者群体。聚集与相关蛋白质治疗剂干扰素α的免疫原性相关联[Braun等人,Pharm.Res.199714:1472-1478]。另一研究表明DR15MHC等位基因的存在会增加对中和抗体形成的敏感性;有趣的是,相同等位基因还赋予对多发性硬化的敏感性[Stickler等人,Genes Immun.20045:1-7]。
因为聚集可能造成干扰素(尤其干扰素β)的免疫原性,所以经工程改造以改进溶解性的变异体还可具有减小的免疫原性。已产生排除半胱氨酸的变异体以使不想要的分子间或分子内双硫键的形成降到最小(美国专利第4,518,584号、第4,588,585号、第4,959,314号,以全文引用的方式并入本文中);所述变异体显示减小的聚集倾向。已制备稳定性增强的干扰素β变异体,其中疏水核心已利用合理设计方法优化(WO00/68387,以引用的方式并入本文中);在一些情况下,可通过改进稳定性来增强溶解性。也已揭示提高干扰素稳定性和溶解性的替代调配物(美国专利第4,675,483号、第5,730,969号、第5,766,582号、WO02/38170,以引用的方式并入本文中)。已论述溶解性增强的干扰素β突变蛋白,其中数个亮氨酸和苯丙氨酸残基经丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基置换(WO98/48018,以引用的方式并入本文中)。
已通过添加聚乙二醇(“PEG”)来修饰干扰素(参看美国专利第4,917,888号、第5,382,657号和第6,962,978号、WO99/55377、WO02/09766、WO00/23114,所有以全文引用的方式并入本文中)。PEG添加可改进血清半衰期和溶解性。在一些情况下,已观察到聚乙二醇化通过空间上阻断接近抗体抗原限制位(agretope)来降低产生中和抗体的患者比例(参看例如Hershfield等人,PNAS199188:7185-7189(1991);Bailon等人,Bioconjug.Chem.12:195-202(2001);He等人,Life Sci.65:355-368(1999))。
还产生经预测以相对于野生型蛋白质减小的亲和力结合II类MHC等位基因的干扰素β变异体;在这两个实例中,主要使用丙氨酸突变减小结合[WO02/074783,以引用的方式并入本文中;Stickler同上]。针对对应于一部分IFN的合成肽的抗体的免疫反应性已论述于Redlich等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)88:4040-4044中。
已开发数种调节蛋白质免疫原性的方法;优选方法是通过去除MHC结合抗原限制位破坏T-细胞激活。这种方法比避开T-细胞受体或抗体结合易操作,因为MHC分子多样性仅包含约103个等位基因,而据估算抗体谱系为约108个且T-细胞受体谱系更大。通过在蛋白质序列内鉴别和去除或修饰II类MHC结合肽,可避开免疫原性分子基础。先前已揭示去除所述抗原限制位以产生具有较小免疫原性的蛋白质;参看例如WO98/52976和WO02/079232,以引用的方式并入本文中。
虽然可鉴别MHC结合抗原限制位中的大量经预测可减小免疫原性的突变,但大部分这些氨基酸取代将在能量方面不利。结果,使用上述方法鉴别出的绝大多数免疫原性减小的序列将与蛋白质的结构和/或功能不相容。为使去除MHC抗原限制位成为减小免疫原性的可行方法,关键在于同时努力维持蛋白质的结构、稳定性和生物活性。
免疫原性可以多种方式限制干扰素治疗剂的功效和安全性。治疗功效会直接因形成中和抗体而降低。还可间接降低功效,因为结合中和抗体或非中和抗体可改变血清半衰期。不想要的免疫反应可采用注射部位反应的形式,包括(但不限于)延迟型过敏反应。还有可能抗干扰素β中和抗体会与内源干扰素β交叉反应并阻断其功能。
仍对免疫原性降低的新颖干扰素蛋白质存在需要。免疫原性降低的干扰素的变异体可在许多干扰素反应性病状的治疗中获得应用。美国专利公开案第2005/0054053号(以引用的方式并入本文中)描述与野生型IFNβ相比免疫原性得到调节的变异IFNβ蛋白。
结果,对开发和发现具有改进性质的干扰素蛋白质存在需要,改进的性质包括(但不限于)增加的功效、减小的副作用、减小的免疫原性、增加的溶解性和增强的可溶性原核生物表达。对需要较低注射频率和/或减小产生中和抗体的风险的干扰素多肽存在需要。改进的干扰素治疗剂可能适用于治疗多种疾病和病状,尤其包括自体免疫疾病、病毒性感染和发炎性疾病、细胞增殖疾病、细菌性感染、增强性生育(enhancing fertility)和癌症以及移植排斥反应。另外,干扰素可用于促进某些哺乳动物怀孕。
充分确定人类干扰素β(干扰素家族的一个成员)可用于治疗多发性硬化。最近在欧洲和美国已许可两种形式的重组干扰素β用于治疗这种疾病。一种形式是干扰素-β-1a(商标为且以这一商标销售,mfg.Biogen,Inc.,Cambridge,Mass.,或商标为且以这一商标销售,mfg.Merck Serono),且在下文中“干扰素-β-1a”或“IFN-β-1a”或各种带连字符和不带连字符形式,其可互换使用。目前销售的AVONEX调配物具有30微克/剂量(200MIU/mg)且提供源自CHO(中国仓鼠卵巢)的IFN-β1a,肌肉内给药,每周四次。目前销售的REBIF调配物具有44微克/剂量(270MlU/mg),皮下给药,TIW,且还提供源自CHO的IFNβ1a。另一种形式是干扰素-β-1b(商标为且以这一商标销售,Berlex,Richmond,Calif.),在下文中,称为“干扰素-β-1b”。目前销售的BETASERON调配物具有250微克/剂量(32MlU/mg)且提供源自大肠杆菌的IFN-β1b,皮下给药,每隔一天一次或每天三次。干扰素β-1a在哺乳动物细胞中使用天然人类基因序列产生且经糖基化,而干扰素β-1b在大肠杆菌中使用在氨基酸位置17处含有基因工程改造的半胱氨酸-丝氨酸取代(C17S)的经修饰人类基因序列产生且未经糖基化。常见副作用包括(但不限于)发烧、头痛、疲劳、焦虑、抑郁、肝病和注射部位反应。Yong等人,Neurology(1998)51:682-689论述干扰素β在多发性硬化治疗中的用途且指出因MS致残的累积率降低。
糖基化人类干扰素β的晶体结构已由Karpusas等人于Proc Natl Acad Sci199794:11813-11818中描述。这种蛋白质在单个位点经糖基化(Asn80)。当在大肠杆菌中产生时,蛋白质具有聚集倾向(Mitsui等人,Pharmacol Ther199358:93-132)。Karpusas等人描述在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中产生人类干扰素β和使用蓝色琼脂糖和SP-琼脂糖(离子交换)纯化分泌的蛋白质。
α干扰素和β干扰素已用于治疗急性病毒性疾病-带状疱疹(T.C.Merigan等人,N.Engl.J.Med.298,981-987(1978);E.Heidemann等人,Onkologie7,210-212(1984)),慢性病毒性感染,例如丙型肝炎和乙型肝炎感染(R.L.Knobler等人,Neurology34(10):1273-9(1984);M.A.Faerkkilae等人,Act.Neurol.Sci.69,184-185(1985))。
人类IFNβ是分子量为约22kDa的由166个氨基酸残基组成的调控性多肽。其可由大多数细胞(尤其成纤维细胞)在体内应答病毒性感染或暴露于其它因素而产生。其结合多聚细胞表面受体,且产生性受体结合产生一连串细胞内事件,从而促成IFNβ诱导性基因表达,基因表达又可产生可分为抗病毒、抗增殖和免疫调节的作用。
已知人类IFNβ的氨基酸序列(Taniguchi,Gene10:11-15,1980和EP83069、EP41313和美国专利第4,686,191号,以引用的方式并入本文中)。人类和鼠类IFNβ晶体结构已描述于Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:11813-11818,1997;J.Mol.Biol.253:187-207,1995;美国专利第5,602,232号、第5,460,956号、第5,441,734号、第4,672,108号(以引用的方式并入本文中)中且论述于Cell Mol.Life Sci.54:1203-1206,1998中。已报导IFNβ的变异体(WO95/25170;WO98/48018;美国专利第6,572,853号;美国专利第5,545,723号;美国专利第4,914,033号;EP260350;美国专利第4,588,585号;美国专利第4,769,233号;Stewart等人,DNA第6卷第2期1987第119-128页;Runkel等人,1998,J.Biol.Chem.273,第14期,第8003-8008页,以引用的方式并入本文中)。美国专利第4,966,843号、美国专利第5,376,567号、美国专利第5,795,779号、美国专利第7,144,574号(以引用的方式并入本文中)描述IFNβ于CHO细胞中的表达。已报导具有特定糖基化模式的IFNβ分子和其制备方法(EP287075和EP529300)。
Pharmaceut.Res.15:641-649,1998中已比较IFNβ1a和IFNβ1b的结构和功能。已显示多发性硬化的进展被IFNβ延迟。多发性硬化是中枢神经系统的先呈复发性后呈进行性的发炎性退化疾病。IFNβ可具有的其它作用可包括(但不限于)对白细胞增殖和抗原呈递的抑制作用、针对抗发炎表型调节细胞激素产生的概况和通过抑制T-细胞基质金属蛋白酶的活性减少T-细胞迁移,以说明IFNβ在MS中的机制(Neurol.51:682-689,1998)。
IFNβ可用于许多疾病的治疗,包括(但不限于)骨肉瘤、基底细胞癌、子宫颈非典型增生、神经胶质瘤、急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin′s disease)、乳癌、黑素瘤和病毒性感染(包括但不限于乳头瘤病毒、病毒性肝炎、生殖器疱疹、带状疱疹、疱疹性角膜炎、单纯疱疹、病毒性脑炎、巨细胞病毒肺炎和鼻病毒)。目前IFNβ治疗剂的副作用包括注射部位反应、发烧、发冷、肌痛、关节痛和其它流感样症状(Clin.Therapeutics,19:883-893,1997)。
考虑目前IFNβ产品存在大量副作用、与频繁注射相关、产生阻碍IFNβ的期望治疗效果的中和抗体的风险和获得更优化的治疗IFNβ含量且伴随增强的治疗效果的潜能,需要改进的IFNβ样分子。
已比较干扰素-β-1a与干扰素-β-1b在功能测定中的相对活体外效能,且显示干扰素-β-1a的比活性是干扰素-β-1b的比活性的约10倍(Runkel等人,1998,Pharm.Res.15:641-649)。由经设计以鉴别这些活性差异的结构基础的研究,鉴别出糖基化是产品之间影响比活性的唯一一个已知的结构差异。碳水化合物的作用基本上通过其稳定结构的作用体现。碳水化合物的稳定作用在热变性实验和SEC分析中显而易见。缺乏糖基化作用还与聚集增加和对热变性的敏感性增加相关。用PNGase F从干扰素-β-1a酶促去除碳水化合物会引起去糖基化产品广泛沉淀。
本发明的干扰素-β分子可保持所有或大部分生物活性且可产生以下性质:促使半衰期增加和组织分布改变的改变的药物动力学和药效学(例如能够较长时间停留在血管中)、增加的于溶液中的稳定性、降低的免疫原性、防止蛋白水解消化和后续的活性废除。所述分子将在医药和医学领域获得实质性发展且将对各种干扰素具有一定效用的疾病(例如多发性硬化、纤维化和其它发炎性或自体免疫疾病、癌症、肝炎和其它病毒性疾病)的控制作出重要贡献。具体来说,能够较长时间逗留在血管中使得干扰素β可用于抑制血管生成并可能穿过血脑屏障。包含非天然编码氨基酸的干扰素β与另一分子(包括但不限于聚合物)之间形成的接合物可调节接合物的热稳定性。当调配干扰素-β呈粉末形式以用于后续通过吸入投药时,这种调节的热稳定性可能是优点。
与亲水性聚合物聚乙二醇(缩写为PEG)共价连接是对许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)增加水溶性、生物可用性,增加血清半衰期,增加治疗半衰期,调节免疫原性,调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已广泛用于药物、人工植入物,以及生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其它应用中。为最大化PEG的所需性质,连接到生物活性分子上的一种或一种以上PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加的水溶性和循环半衰期),而不会不利地影响母体分子的生物活性。
PEG衍生物通常通过例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端以及碳水化合物部分等反应性化学官能团与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常,最适于通过聚合物连接来修饰的位点在受体结合中起重要作用,并且对于分子的生物活性保持来说是必需的。因此,聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点的杂乱连接通常导致聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人,(1996),J.Biol.Chem.,271:21969-21977。为形成具有足够聚合物分子量以赋予标靶分子以所需优点的接合物,先前技术方法通常涉及多个聚合物臂与分子的随机连接,从而增大母体分子的生物活性降低或甚至完全丧失的风险。
形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)由多个α氨基酸序列构成,所述序列具有一般结构H2N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分(--COOH)连接形成酰胺键联,其可表示为--(NH--CHR--CO)n--,其中下标“n”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和用于连接PEG衍生物的反应性位点。
举例来说,在氨基酸赖氨酸的情况下,在ε位以及α位存在--NH2部分。ε--NH2在碱性pH值条件下不反应。用PEG进行蛋白质衍生领域中的许多技术是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--NH2部分的PEG衍生物。“Polyethylene Glycol andDerivatives for Advanced PEGylation”,Nektar Molecular Engineering Catalog,2003,第1-17页。然而,这些PEG衍生物都具有常见限制:其不能在蛋白质表面上存在的通常众多赖氨酸残基之间进行选择性安装。在赖氨酸残基对于蛋白质活性较为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下或在赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用(如在受体结合位点的情况下)的情况下,这可能是一个重要限制。
蛋白质聚乙二醇化的现有方法的又一个同样重要的复杂情况在于PEG衍生物可能进行与除所需残基以外的残基发生的不需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(其结构表示为--N(H)--),但许多与ε--NH2反应的化学反应性物质也可与--N(H)--反应。类似地,氨基酸半胱氨酸的侧链带有自由巯基,其结构表示为-SH。在一些情况下,针对赖氨酸的ε-NH2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的异质混合物,并且存在破坏所靶向生物活性分子的活性的风险。将需要开发出允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物,其随后将使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质表面上确定以及可预测的特定位点处的生物活性分子选择性偶合。
除赖氨酸残基之外,所属领域中也已作出相当大的努力来开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活化PEG试剂。例如参看以引用的方式并入本文中的美国专利第6,610,281号,以及“Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation”,Nektar Molecular Engineering Catalog,2003,第1-17页。可使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中,并且所得自由巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而,这种方法的复杂之处在于引入自由巯基可能使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此,将需要获得一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法,其使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质选择性偶合,同时可与巯基和蛋白质中通常可见的其它化学官能团相容(即,不会发生不需要的副反应)。
从所属领域中的取样来看,在已开发的用于连接蛋白质侧链(具体来说,赖氨酸氨基酸侧链上的--NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分)的这些衍生物中,已证实许多衍生物的合成和使用存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键联,其进行水解并因此分解、降解或以其它方式在水性环境中(例如在血流中)不稳定。一些衍生物形成较稳定的键联,但在形成所述键联之前进行水解,这表示PEG衍生物上的反应性基团可能在可连接蛋白质之前已失活。一些衍生物稍有毒性并且因此不太适于活体内使用。一些衍生物因反应过慢而不能实际使用。一些衍生物因与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物在其将连接的位点中不具特异性,这也可能导致所需活性丧失并缺乏结果的再现性。为克服与用聚乙二醇部分修饰蛋白质相关的挑战,已开发出更稳定(例如,美国专利6,602,498,其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如,美国专利6,610,281,其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。所属领域中无疑需要在要求选择性反应形成稳定化学键之前在生理环境中呈化学惰性的PEG衍生物。
近年来,已报导蛋白质科学中的全新技术,其有希望克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。具体来说,已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli;E.coli)(例如,L.Wang等人,(2001),Science292:498-500)以及真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae;S.cerevisiae)(例如,J.Chin等人,Science301:964-7(2003))的蛋白质生物合成机制中,其使得能够在活体内将非遗传编码氨基酸并入蛋白质中。使用此方法,已回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的许多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光致异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参看Chin,J.W.等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,99:11020-11024;和Chin,J.W.等人,(2002)J. Am.Chem.Soc.124:9026-9027)、酮基氨基酸、含重原子氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如参看J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society124:9026-9027;J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem3(11):1135-1137;J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America99:11020-11024;以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。所有参考文献都是以全文引用的方式并入本文中。这些研究已证实有可能选择性地并且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能团(例如酮基、炔基和叠氮部分),所述官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的所有官能团都呈化学惰性并且可用于有效并选择性地反应形成稳定共价键联。
在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可能提供天然存在的官能团(例如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的官能团呈惰性,但完全并有效地反应形成稳定键联。举例来说,所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下在水性条件下进行休斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。举例来说,通过在蛋白质结构中引入叠氮部分,能够并入对蛋白质中存在的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性,但也与乙炔部分平稳并有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是,在不存在乙炔部分的情况下,叠氮化物在其它蛋白质侧链存在下在生理条件下仍保持化学惰性并且不反应。
本发明尤其涉及与IFNβ多肽的活性和制备相关的问题,并且也涉及具有改良的生物或药理学性质(例如增强的抗病毒活性和/或改良的治疗半衰期)的IFNβ多肽的制备。
发明内容
本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的IFNβ多肽。
在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中,IFNβ多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中,IFNβ多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它IFNβ多肽连接。在一些实施例中,IFNβ多肽包含IFNβ的C17S突变体形式的一个或一个以上翻译后修饰。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中,水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中,非天然编码氨基酸是利用连接子与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键结。在一些实施例中,聚乙二醇分子是双官能聚合物。在一些实施例中,双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中,第二多肽是IFNβ多肽。本发明还包括外加在IFNβ中发生C17S突变的各上述实施例。
在一些实施例中,IFNβ多肽包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中,至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。在一些实施例中,包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物连接的氨基酸的IFNβ多肽包括C17S突变,在其它实施例中,在IFNβ多肽中,除一个或一个以上非天然编码氨基酸外,还包括位置17处的任何突变。
在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置中:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,这些并入中的一个发生在位置17处。
在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入对应于干扰素β中的如下二级结构的一个或一个以上以下区中的任何位置:SEQ ID NO:1的螺旋A(2-22)、螺旋B(51-71)、螺旋C(80-107)、螺旋D(118-136)、螺旋E(139-162)、AB环:AB1(23-35)、AB2(36-40)、AB3(41-50)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中,非天然编码氨基酸在选自由干扰素β的残基25-35、80-100和121-135(SEQID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。在其它实施例中,非天然编码氨基酸在选自由SEQ ID NO:1的干扰素β的残基41-49或在SEQID NO:3、4中的相应氨基酸组成的群组的位置处经取代。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的28、36、76、80、107、108、111和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的15、42、80、108、111、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的36、111或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,本发明的多肽包含一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽包含SEQ ID NO:1的C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,本发明的多肽包含C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)和一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在SEQ ID NO:4的信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在SEQ ID NO:4的信号序列中包含一个或一个以上天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,一个或一个以上非天然氨基酸并入SEQ ID NO:4的前导序列或信号序列或其它IFNβ序列中。本发明还包括外加IFNβ中发生C17S突变的各以上实施例。
在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)以下位置:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸或在另一个IFNβ序列中的相应氨基酸)。
在一些实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):SEQ ID NO:1的螺旋A(2-22)、螺旋B(51-71)、螺旋C(80-107)、螺旋D(118-136)、螺旋E(139-162)、AB环:AB1(23-35)、AB2(36-40)、AB3(41-50)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):干扰素β的残基25-35、80-100和121-135(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在其它实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):SEQ ID NO:1的干扰素β的残基41-49或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的28、36、76、80、107、108、111和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的15、42、80、108、111、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的36、111或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,信号序列或前导序列中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接(SEQ ID NO:4或其它IFNβ序列)。本发明还包括外加IFNβ中发生C17S突变的各以上实施例。
在一些实施例中,IFNβ多肽包含调节IFNβ多肽对IFN多肽受体或结合搭配物(包括(但不限于)蛋白质、多肽、小分子或核酸)的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的稳定性相比增加IFNβ多肽的稳定性的取代、添加或缺失。稳定性和/或溶解性可使用所属领域的技术人员已知的许多不同测定测量。这些测定包括(但不限于)SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的免疫原性相比调节IFNβ多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的血清半衰期或循环时间相比调节IFNβ多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的水溶性相比增加IFNβ多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的溶解性相比增加宿主细胞中产生的IFNβ多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的表达或合成相比增加IFNβ多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。包含这种取代的IFNβ多肽保持激动剂活性并且保持或提高在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的蛋白酶抗性相比增加IFNβ多肽的蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与在与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ多肽相互作用后受体的活性相比调节IFN受体的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ多肽的结合相比调节其与另一分子(例如受体)的结合的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ多肽的抗病毒活性相比调节其抗病毒活性的取代、添加或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ多肽的抗病毒活性相比增强其抗病毒活性的取代、添加或缺失。
在一些实施例中,IFNβ多肽包含与不具有取代、添加或缺失的相应IFNβ的相容性相比增加IFNβ多肽与医药防腐剂(例如,间甲酚、苯酚、苄醇)的相容性的取代、添加或缺失。这一增加的相容性将使得能够制备贮存期间保持蛋白质的生理化学性质和生物活性的防腐医药调配物。
在一些实施例中,一个或一个以上工程改造过的键是由一个或一个以上非天然氨基酸产生。分子内的键可以多种方式产生,包括(但不限于)蛋白质中两个氨基酸(一个或两个氨基酸可能为非天然氨基酸)在合适条件下反应;两个氨基酸(其各自可能经天然编码或非天然编码)与连接子、聚合物或其它分子在合适条件下反应等。
在一些实施例中,IFNβ多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在或非天然存在氨基酸取代。在一些实施例中,IFNβ多肽中的氨基酸可经天然存在或非天然存在氨基酸取代,条件是至少一个经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中,IFNβ多肽中的一个或一个以上氨基酸可经一个或一个以上天然存在氨基酸取代,并且另外至少一个经非天然编码氨基酸取代。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基(semicarbazide group)、叠氮基或炔基。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基;并且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基,并且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中,非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
在一些实施例中,多肽为IFNβ多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中,IFNβ多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在一些实施例中,水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中,IFNβ多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸以及一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
本发明还提供包含在严格条件下与SEQ ID NO:2或编码具有SEQ ID NO:3、4的多肽的核酸杂交的多核苷酸的分离核酸。本发明还提供包含在严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的多核苷酸或在严格条件下与编码如SEQ ID NO:3、4所示的多肽的多核苷酸杂交的多核苷酸的分离核酸,其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。本发明还提供包含编码如SEQ ID NO:1、3、4所示的多肽的多核苷酸的分离核酸。本发明还提供包含编码具有一个或一个以上非天然编码氨基酸的如SEQ ID NO:1、3、4所示的多肽的多核苷酸的分离核酸。所属领域的技术人员显而易见,多种不同的多核苷酸可编码本发明的任何多肽。
在一些实施例中,选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子(opalcodon)、独特密码子、稀有密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。
本发明还提供制造与水溶性聚合物连接的IFNβ多肽的方法。在一些实施例中,所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离IFNβ多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中,并入IFNβ多肽中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的水溶性聚合物反应。在一些实施例中,并入IFNβ多肽中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
在一些实施例中,通过使包含含羰基的氨基酸的IFNβ多肽与包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物连接的IFNβ多肽。在一些实施例中,氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基是通过酰胺键联与聚乙二醇分子连接。在一些实施例中,氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基是通过氨基甲酸酯键联与聚乙二醇分子连接。
在一些实施例中,通过使包含羰基的聚乙二醇分子与包含包括氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备与水溶性聚合物连接的IFNβ多肽。
在一些实施例中,通过使包含含炔的氨基酸的IFNβ多肽与包含叠氮部分的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物连接的IFNβ多肽。在一些实施例中,叠氮基或炔基是通过酰胺键联与聚乙二醇分子连接。
在一些实施例中,通过使包含含叠氮基的氨基酸的IFNβ多肽与包含炔部分的聚乙二醇分子反应来制备与水溶性聚合物连接的IFNβ多肽。在一些实施例中,叠氮基或炔基是通过酰胺键联与聚乙二醇分子连接。
在一些实施例中,聚乙二醇分子具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中,聚乙二醇分子具有介于0.1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中,聚乙二醇分子为分枝聚合物。在一些实施例中,聚乙二醇分枝聚合物的各支链具有介于1kDa与100kDa之间或介于1kDa与50kDa之间的分子量。
在一些实施例中,与IFNβ多肽连接的水溶性聚合物包含聚烷二醇部分。在一些实施例中,并入IFNβ多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中,并入IFNβ多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分,并且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中,并入IFNβ多肽中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分,并且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中,并入IFNβ多肽中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分,并且水溶性聚合物包含炔部分。
本发明还提供组合物,其包含包括非天然编码氨基酸的IFNβ多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中,非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
本发明还提供包含编码包含选择密码子的IFNβ多肽的多核苷酸的细胞。在一些实施例中,所述细胞包含用于将非天然编码氨基酸取代到IFNβ多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。
本发明还提供制造包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的方法。在一些实施例中,所述方法包含在允许IFNβ多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上编码IFNβ多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞;以及从细胞和/或培养基纯化IFNβ多肽。
本发明还提供增加IFNβ多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明还提供调节IFNβ多肽的免疫原性的方法。在一些实施例中,所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在IFNβ多肽中的任何一个或一个以上氨基酸和/或将IFNβ多肽与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
本发明还提供用有效量的本发明的IFNβ分子治疗需要这种治疗的患者的方法。在一些实施例中,所述方法包含向患者投与治疗有效量的医药组合物,所述医药组合物包含包括非天然编码氨基酸的IFNβ多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中,非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中,IFNβ多肽经糖基化。在一些实施例中,IFNβ多肽未经糖基化。
本发明还提供包含SEQ ID NO:1、3、4中所示的序列或任何其它IFNβ多肽序列的IFNβ多肽,但其中至少一个氨基酸是由非天然编码氨基酸取代。本发明还提供包含SEQID NO:1、3、4中所示的序列的IFNβ多肽。在一些实施例中,非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中,水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
本发明还提供医药组合物,其包含医药学上可接受的载剂和包含SEQ ID NO:1、3、4中所示的序列或任何其它IFNβ多肽序列的IFNβ多肽,其中至少一个氨基酸是经非天然编码氨基酸取代。本发明还提供医药组合物,其包含医药学上可接受的载剂和包含SEQ ID NO:1、3、4中所示的序列的IFNβ多肽。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中,水溶性聚合物通过糖部分与多肽连接。在一些实施例中,连接子、聚合物或生物活性分子通过糖部分与IFNβ多肽连接。
本发明还提供包含在单一氨基酸处通过共价键连接的水溶性聚合物的IFNβ多肽。在一些实施例中,水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中,与水溶性聚合物共价连接的氨基酸为多肽中存在的非天然编码氨基酸。
本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的IFNβ多肽,其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经由核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与多肽连接。在一些实施例中,多肽是经单聚乙二醇化。本发明还提供包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在预选位点处经由核糖体并入多肽中。
本发明范围内包括与IFNβ编码区连接的IFNβ前导序列或信号序列,以及与IFNβ编码区连接的异源信号序列。所选异源前导序列或信号序列应为识别和处理过的序列,例如由宿主细胞分泌系统分泌并可能由宿主细胞经由信号肽酶裂解。用本发明的IFNβ治疗病状或病症的方法意指用具有或不具有信号肽或前导肽的IFNβ治疗。
本发明还提供诱导细胞中的抗病毒活性增加的方法,所述方法包含向所述细胞投与有效诱导抗病毒活性增加的量的IFNβ。
在另一实施例中,由于用于接合非天然氨基酸的独特化学反应,包含一个或一个以上非天然存在氨基酸的IFNβ多肽与另一分子(包括(但不限于)PEG)的接合提供实质上经纯化的IFNβ。可能在其它纯化技术是在接合步骤之前或之后进行的情况下接合包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的IFNβ与另一分子(例如PEG),以提供实质上纯的IFNβ。
附图说明
图1:显示IFNβ的晶体结构的模型。所显示的位点各自经非天然编码氨基酸取代。
图2:显示IFNβ的晶体结构的模型。显示经选择用于用非天然编码氨基酸取代的位点。
图3:显示本发明IFNβ多肽的表达的SDS PAGE分析。
图4:显示本发明IFNβ多肽的表达的SDS PAGE分析。
图5:显示聚乙二醇化之前和之后的本发明IFNβ多肽。
图6A:实例27的3μg/kg剂量组的药物动力学数据的曲线图,显示随时间过去(以小时计)测量出的血清IFNβ浓度(以ng/mL计)。
图6B:实例27的15μg/kg剂量组的药物动力学数据的曲线图,显示随时间过去(以小时计)测量出的血清IFNβ浓度(以ng/mL计)。
图7A:实例27的50μg/kg剂量组的药物动力学数据的曲线图,显示随时间过去(以小时计)测量出的血清IFNβ浓度(以ng/mL计)。
图7B:实例27的用M36-30K处理的动物和Rebif对照组的药物动力学数据的曲线图,显示随时间过去(以小时计)测量出的血清IFNβ浓度(以ng/mL计)。
图8A:实例27的用M36-40K处理的动物和Rebif对照组的药物动力学数据的曲线图,显示随时间过去(以小时计)测量出的血清IFNβ浓度(以ng/mL计)。
图8B:实例27的用F111-30K处理的动物和Rebif对照组的药物动力学数据的曲线图,显示随时间过去(以小时计)测量出的血清IFNβ浓度(以ng/mL计)。
图9A:实例27的用F111-40K处理的动物和Rebif对照组的药物动力学数据的曲线图,显示随时间过去(以小时计)测量出的血清IFNβ浓度(以ng/mL计)。
图9B:实例27的数据曲线图,显示本发明的一些IFNβ变异体相对于对照的Cmax(血清IFNβCmax/剂量)。
图10A:实例27的曲线下面积(AUC)数据曲线图,显示本发明的一些IFNβ变异体相对于对照的AUC(血清IFN AUC/剂量)。
图10B:实例27的数据条形图,显示给予不同剂量的两种不同的本发明IFNβ变异体和对照后168小时的血清IFNβ浓度。
图11A:实例27的数据曲线图,显示3μg/kg剂量组的本发明的一些IFNβ变异体相对于安慰剂组和对照组的新喋呤(Neopterin)反应(血清新喋呤/时间)。
图11B:实例27的数据曲线图,显示15μg/kg剂量组的本发明的一些IFNβ变异体相对于安慰剂组和对照组的新喋呤反应(血清新喋呤/时间)。
图12A:实例27的数据曲线图,显示50μg/kg剂量组的本发明的一些IFNβ变异体相对于安慰剂组和对照组的新喋呤反应(血清新喋呤/时间)。
图12B:实例27的数据曲线图,显示本发明的一些IFNβ变异体相对于安慰剂和对照的血清新喋呤的曲线下面积量度与剂量之间的关系(血清新喋呤AUC/剂量)。
图13A:显示实例27的给予安慰剂、对照和三种不同剂量的M36-30K后168小时的血清新喋呤含量数据。
图13B:显示实例27的给予安慰剂、对照和三种不同剂量的M36-40K后168小时的血清新喋呤含量数据。
图13C:显示实例27的给予安慰剂、对照和三种不同剂量的F111-30K后168小时的血清新喋呤含量数据。
图13D:显示实例27的给予安慰剂、对照和三种不同剂量的F111-40K后168小时的血清新喋呤含量数据。
图14:显示实例27中所揭示的方案和BLA中Rebif的新喋呤AUC/剂量的曲线图。
图15A:显示恒河猴(rhesus monkeys)在静脉内投药后如由抗病毒活性所测量出的血清IFNβ1a含量(曲线图上的实心符号和实线)和新喋呤浓度(曲线图上的空心符号和虚线)的曲线图。
图15B:显示恒河猴在皮下投药后以抗病毒活性计量的血清IFNβ1a含量(曲线图上的实心符号和实线)和新喋呤浓度(曲线图上的空心符号和虚线)的曲线图。
图15C:显示使用经EMC病毒激发的人类肺癌(A549)细胞在抗病毒测定中评估的未经修饰和聚乙二醇化IFNβ1a的抗病毒活性的曲线图。与病毒一起培育2天后,用XTT使活细胞染色,在450nm下读取板,且在y轴上显示反映细胞生活力的吸光度。一式两份分析样品。
图16A:实例27的数据曲线图,显示随时间过去OAS1基因表达相对于预给予媒剂、Rebif和剂量为3μg/kg的四种不同的本发明IFNβ变异体的诱导倍数。
图16B:实例27的数据曲线图,显示随时间过去OAS1基因表达相对于预给予媒剂、Rebif和剂量为3种不同剂量的平均值的四种本发明IFNβ变异体的诱导倍数。
图17A:实例27的数据曲线图,显示随时间过去OAS1基因表达相对于预给予媒剂、Rebif和剂量为15μg/kg的四种不同的本发明IFNβ变异体的诱导倍数。
图17B:实例27的数据曲线图,显示随时间过去OAS1基因表达相对于预给予媒剂、Rebif和剂量为50μg/kg的四种不同的本发明IFNβ变异体的诱导倍数。
图18:实例27的数据曲线图,显示OAS1基因表达诱导倍数的曲线下面积对媒剂、对照和四种不同的本发明IFNβ1a变异体的剂量。
图19:在投药后头24小时期间注射部位反应的百分比的条形图。
图20:实例27中收集的各不同处理组的数据的表:N.S.指示不显著。
图21:实例27中收集的各不同处理组的数据的表:N.S.指示不显著。
图22:显示具有可能发生蛋氨酸氧化作用的位点的IFNβ晶体结构模型。M36和M117易发生氧化,M1稍易发生氧化,然而当于大肠杆菌中产生时,M1将裂解(然而可能不完全处理),且M62是不易发生氧化的位点。
图23:显示具有可能发生脱酰胺作用的位点的IFNβ晶体结构模型。M36和N25两个都是可能位点-N25是发生脱酰胺的已知位点。
图24:使用实例28中描述的方法分析的IFN M36pAF的色谱图。
图25:使用实例28中描述的方法分析的PEG40-M36pAF的色谱图。
图26:使用实例28中描述的方法获得的IFN M36pAF和PEG40-M36pAF的重叠色谱图。
图27:双硫键被还原的IFN-M36pAF并且使用实例28中描述的方法分析。
图28:双硫键被还原的PEG40-IFN36pAF并且使用实例28中描述的方法分析。
具体实施方式
定义
应了解,本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂,并且同样可改变。也应了解,本文中使用的术语只是为了达成描述特定实施例的目的,而并不打算限制本发明的范围,所述范围应仅由随附权利要求加以限制。
除非上下文另外明确指出,否则如本文和随附权利要求中所使用,单数形式“一”和“所述”包括多个提及物。因此,举例来说,提及“IFNβ”或“IFNβ多肽”和各种带连字符和不带连字符的形式是提及一种或一种以上所述蛋白质,并且包括所属领域的技术人员已知的其等效物等。
除非另外定义,否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解的含义相同的含义。虽然可将与本文中所述类似或等效的任何方法、装置和材料用于本发明的实践或测试中,但现仅对优选方法、装置和材料加以描述。
本文中所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中,以达到描述和揭示例如所述公开案中所述的可能与当前所述的发明结合使用的构筑体和方法的目的。本文中所讨论的公开案仅提供本申请案的申请日期之前的揭示内容。本文决不应解释为承认发明者无权由于先前发明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。
术语“实质上经纯化”是指可实质上或基本上不含通常伴随天然存在环境(即天然细胞,或者在重组产生IFNβ多肽的情况下为宿主细胞)中存在的蛋白质或与天然存在环境中存在的蛋白质相互作用的组分的IFNβ多肽。可实质上不含细胞物质的IFNβ多肽包括具有小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%(以干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当IFNβ多肽或其变异体是由宿主细胞重组产生时,蛋白质可以细胞干重的约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或1%以下存在。当IFNβ多肽或其变异体是由宿主细胞重组产生时,蛋白质可以细胞干重计约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或1mg/L以下存在于培养基中。因此,由本发明方法产生的“实质上经纯化”的IFNβ多肽可具有如通过适当方法(例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度水平,特定来说至少约75%、80%、85%的纯度水平,并且更特定来说至少约90%的纯度水平、至少约95%的纯度水平、至少约99%或99%以上的纯度水平。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指不管何种方法用于插入(例如,直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知用于产生重组宿主细胞的其它方法),包括外源多核苷酸的细胞。外源多核苷酸可保持非整合载体(例如,质粒)形式,或者可整合到宿主基因组中。
如本文中所用,术语“培养基”包括可支撑或容纳任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物,所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞和细胞内含物。因此,所述术语可涵盖已生长宿主细胞的培养基,例如已分泌IFNβ多肽的培养基,包括在增殖步骤之前或之后的培养基。例如,在IFNβ多肽已在细胞内产生并且宿主细胞已溶解或破裂以释放IFNβ多肽的情况下,所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂。
如本文中关于蛋白质再折叠所用的“还原剂”是定义为使巯基保持还原状态并还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)以及还原型谷胱甘肽。所属领域的技术人员显而易见,多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。
如本文中关于蛋白质再折叠所用的“氧化剂”是定义为能够从所氧化的化合物移除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇和氧气。所属领域的技术人员显而易见,多种氧化剂适用于本发明的方法中。
如本文中所用的“变性剂”是定义为会造成蛋白质可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的性质和浓度决定。合适的变性剂可为离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或两种或两种以上所述试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸钠。适用的清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂,例如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如吐温(Tween)或曲拉通(Triton)清洁剂)、Sarkosyl;温和非离子型清洁剂(例如,毛地黄皂苷(digitonin));温和阳离子型清洁剂,例如N->2,3-(二油烯基氧基)-丙基-N,N,N-三甲基铵;温和离子型清洁剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠);或两性离子型清洁剂,包括(但不限于)硫代甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)以及3-(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。可使用例如乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4烷醇,例如乙醇或异丙醇)或低碳烷二醇(尤其C2-C4烷二醇,例如乙二醇)等有机、水可混溶溶剂作为变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然存在磷脂,例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇;或合成磷脂衍生物或变异体,例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。
如本文中所用,“再折叠”描述将含有二硫键的多肽从不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。
如本文中所用,“共折叠”特定是指使用至少两种彼此相互作用的多肽并使得展开或不当折叠的多肽转化为天然、适当折叠多肽的再折叠过程、反应或方法。
如本文中所用,“IFNβ多肽”或“IFNβ”和其带连字符和不带连字符形式应包括具有IFNβ以及1a和1b形式、a和b形式、IFNβ类似物、IFNβ同种型、IFNβ模拟物、IFNβ片段、杂合IFNβ蛋白、其融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体和突变蛋白的至少一种生物活性的多肽和蛋白质,而不管所述物质的生物活性如何,并且更不管其合成或制造方法(包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸产生)、活体外、活体内、核酸分子的显微注射、合成、转基因和基因活化方法)如何。术语“IFNβ多肽”和“IFNβ”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的IFNβ多肽。
如本文所用,“干扰素”或“IFN”应包含具有干扰素(包括但不限于IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNε或IFNτ或例如limitin的干扰素样细胞激素)(例如以下专利中所述的干扰素:美国专利第4,414,150号、第4,456,748号、第4,727,138号、第4,762,791号、第4,929,554号、第5,096,705号、第4,695,623号、第4,614,651号、第4,678,751号、第4,925,793号、第5,460,811号、第5,120,832号、第4,780,530号、第4,908,432号、第4,970,161号、第4,973,479号、第4,975,276号、第5,098,703号、第5,278,286号、第5,661,009号、第6,372,206号、第6,433,144号、第6,472,512号、第6,572,853号、第6,703,225号、第6,200,780号、第6,299,869号、第6,300,475号、第6,323,006号、第6,350,589号、第5,705,363号、第5,738,845号、第5,789,551号、第6,117,423号、第6,174,996号、第5,540,923号、第5,541,293号、第5,541,312号、第5,554,513号、第5,593,667号,其以引用的方式并入本文中)以及其IFN类似物、IFN同种型、IFN模拟物、IFN片段、杂合IFN蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体、变异体、剪接变异体和突变蛋白的至少一种生物活性的多肽和蛋白质,而不管所述物质的生物活性如何,并且更不管其合成或制造方法(包括但不限于重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸产生)、活体外、活体内、核酸分子的显微注射、合成、转基因和基因活化方法)如何。IFN的具体实例包括(但不限于)IFNγ-1b()、IFNβ-1a(和)、IFNβ-1b()、组合干扰素(consensus IFN)、复合干扰素(IFN alfacon-1,)、IFNα-2()、IFNα-2a()、聚乙二醇化干扰素α-2a()、乙二醇化干扰素α-2b()、IFN类似物、IFN突变体、改变的糖基化人类IFN和PEG接合的IFN类似物。经修饰以表达内源人类IFN的细胞的具体实例描述于Devlin等人,J.Leukoc.Biol.41:306(1987);美国专利第6,610,830号、第6,482,613号、第6,489,144号、第6,159,712号、第5,814,485号、第5,710,027号、第5,595,888号、第4,966,843号中,其以引用的方式并入本文中。关于GH家族成员的表达,也参看美国专利第6,716,606号、第6,379,661号、第6,004,548号、第5,830,705号、第5,582,823号、第4,810,643号和第6,242,218号,其以引用的方式并入本文中。
已描述IFNβ中多个氨基酸位置处的取代。取代包括(但不限于)调节医药稳定性、增加激动剂活性、增加蛋白酶抗性、将多肽转化成拮抗剂等的取代,并且涵盖在术语“IFNβ多肽”或“IFNβ.”中。美国专利公开案第2005/0054053号中已描述包含一个或一个以上氨基酸取代的IFNβ多肽。已描述展现经修饰免疫原性的IFN-β变异体,其在选自由以下组成的群组的位置处包含至少一个修饰:1、2、3、4、5、6、8、9、12、15、16、22、28、30、32、36、42、43、46、47、48、49、51、92、93、96、100、101、104、111、113、116、117、120、121、124、130、148和155。对残基5、8、15、47、111、116和120的修饰可为选自由丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸组成的群组的取代突变。对残基22、28、30、32、36、92、130、148和155的修饰可选自包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸的群组。已描述这些变异体具有增加的溶解性,从而产生降低的免疫原性。本发明多肽中可存在一个选自由以下组成的群组的修饰:L5A、L5D、L5E、L5K、L5N、L5Q、L5R、L5S、L5T、F8A、F8D、F8E、F8K、F8N、F8Q、F8R、F8S、S12E、S12K、S12Q、S12R、W22E、L28Q、Y30H、L32A、E43K、E43R、L47K、Y92Q、E104R、E104K、E104H、E104Q、E104A、F111N、R113D、R113E、R113Q、R113A、L116D、L116E、L116N、L116Q、L116R、M117R、L120D、L120R、L130R、V148A和Y155S。本发明IFNβ多肽可包含一个或一个以上天然氨基酸取代。先前已描述C17S取代。美国专利第2005/0054053号描述除C17S取代外还具有L5Q取代的IFNβ变异体(美国专利第2005/0054053号的SEQ ID NO:19)、除C17S取代外还具有L5Q和F8E取代的IFNβ变异体(美国专利第2005/0054053号的SEQ ID NO:20)、除C17S取代外还具有L5Q、F8E和F111N取代的IFNβ变异体(美国专利第2005/0054053号的SEQ ID NO:21)、除C17S取代外还具有L5Q、F8E和L116E取代的IFNβ变异体(美国专利第2005/0054053号的SEQ ID NO:22)、除C17S取代外还具有F8E、F111N和L116E取代的IFNβ变异体(美国专利第2005/0054053号的SEQ ID NO:23)、除C17S取代外还具有L5Q、F8E、F111N和L116E取代的IFNβ变异体(美国专利第2005/0054053号的SEQ ID NO:24)和除C17S取代外还具有L5Q、F8E、L47K、F111N、L116E和L120R取代的IFNβ变异体(美国专利第2005/0054053号的SEQ ID NO:25)。
另一方面,免疫原性降低的变异体IFNβ蛋白展现减少的与至少一个人类II类MHC等位基因的结合。在这一实施例(以及其它经修饰免疫原性变异体)中,至少一个氨基酸修饰可在至少一个以下位置处进行:抗原限制位1:残基3-11;抗原限制位2:残基5-13;抗原限制位3:残基8-16;抗原限制位4:残基9-17;抗原限制位5:残基15-23;抗原限制位6:残基22-30;抗原限制位7:残基30-38;抗原限制位8:残基36-44;抗原限制位9:残基47-55;抗原限制位10:残基57-65;抗原限制位11:残基60-68;抗原限制位12:残基63-71;抗原限制位13:残基70-78;抗原限制位14:残基79-87;抗原限制位15:残基95-103;抗原限制位16:残基122-130;抗原限制位17:残基125-133;抗原限制位18:残基129-137;抗原限制位19:残基130-138;抗原限制位20:残基143-151;抗原限制位21:残基145-153;抗原限制位22:残基146-154;抗原限制位23:残基148-156;抗原限制位24:残基151-159;抗原限制位25:残基154-162;抗原限制位26:残基156-164;抗原限制位27:残基157-165。变异体还在2个或2个以上这些抗原限制位处包括氨基酸修饰。
另一方面,本发明提供编码变异蛋白的重组核酸、含有变异体核酸的表达载体、包含变异体核酸和/或表达载体的宿主细胞和产生变异蛋白的方法。另一方面,本发明通过向患者投与治疗有效量的通常与医药载剂一起的变异蛋白治疗干扰素反应性病症。另一方面,本发明提供通过改变MHC II类抗原决定基调节干扰素(尤其IFNβ)的免疫原性(尤其降低免疫原性)的方法。
美国专利第7,144,574号(其以全文引用的方式并入本文中)中论述的IFNβ突变体包括经糖基化或未经糖基化的包含一个或一个以上以下修饰的多肽:D110F、C17S、Q49N、Q51T、F111N、R113T、K19R、K33R、K45R、Q51S、R113S、Q48F、Q48V、Q48W、Q48Y、D110V、D110W、D110Y。WO2005/016371(其以引用的方式并入本文中)描述被选择性氧化的IFNβ-1b多肽。其它突变体包括(但不限于)包含位置25处的天冬酰胺脱去酰胺基的天然干扰素-β的类似物(参看WO2006/053134)和如WO2006/049423中所述的经不同糖基化的突变体,两篇专利以引用的方式并入本文中。WO2006/015165中描述IFNβ的大肠杆菌表达的密码子优化,其以引用的方式并入本文中。
关于缺乏前导序列的IFNβ的序列,参看本文的SEQ ID NO:1和3。关于具有前导序列的IFNβ的序列,参看本文的SEQ ID NO:4。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽实质上与SEQ ID NO:1、3、4或IFNβ多肽的任何其它序列一致。编码IFNβ多肽(包括突变体)的核酸分子和表达和纯化IFNβ多肽的方法众所周知且包括(但不限于)以下文献中揭示的那些:美国专利第4,462,940号、美国专利第4,518,584号、美国专利第5,702,699号、美国专利第6,962,978号、美国专利第5,814,485号、美国专利第6,887,462号、美国专利第6,800,735号、美国专利第6,514,729号、美国公开案第US2002/0137895号、美国公开案第US2004/0115169号和美国公开案第US2005/0054053号,其以全文引用的方式并入本文中。
术语“IFNβ多肽”还包括天然存在IFNβ的医药学上可接受的盐和前药,以及盐的前药、多形体、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体,以及天然存在IFNβ和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。术语“IFNβ多肽”涵盖氨基末端、羧基末端或两个末端处包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于):例如,由缺乏前导肽或信号肽的IFNβ的成熟形式或其部分重组表达所产生的使蛋氨酸与IFNβ的N末端连接的蛋氨酰基IFNβ(蛋氨酸与IFNβ的N末端连接,由重组表达产生);出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合);与血清白蛋白结合肽形成的融合体;和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。美国专利第5,750,373号(其以引用的方式并入本文中)描述一种选择新颖蛋白质(例如生长激素)和对各别受体分子的结合性质已改变的抗体片段变异体的方法。所述方法包含将编码所关注蛋白质的基因与丝状噬菌体M13的基因III外壳蛋白的羧基末端域融合。嵌合分子包含IFNβ和一个或一个以上其它分子。嵌合分子可含有IFNβ与其它分子中一种或两种分子的特定区或片段。可通过标准生物化学方法由蛋白质制备任何所述片段,或通过表达编码所述片段的多核苷酸来制备所述片段。IFNβ或其片段可以包含人类血清白蛋白(HSA)、Fc或其部分的融合蛋白形式产生。所述融合构筑体适于增强IFNβ或其片段在真核宿主细胞中的表达。如美国专利第5,766,883号和公开案WO97/24445(其以引用的方式并入本文中)中所揭示,例示性HSA部分包括N末端多肽(氨基酸1-369、1-419,以及由氨基酸1开始的中间长度)。其它嵌合多肽可包括具有与HSA的C末端和N末端各自连接的IFNβ或其片段的HSA蛋白。所述HSA构筑体揭示于以引用的方式并入本文中的美国专利第5,876,969号中。其它融合体可通过融合干扰素β与a)免疫球蛋白的Fc部分、b)免疫球蛋白的Fc部分的类似物和c)免疫球蛋白的Fc部分的片段来产生。美国专利公开案第2005/0054053号描述环状排列的干扰素β和IFNβ与免疫球蛋白或免疫球蛋白的区的融合体。
多个参考文献揭示通过聚合物接合或糖基化对多肽进行修饰。术语“IFNβ多肽”包括与例如PEG等聚合物接合的多肽,并且可包含一种或一种以上由半胱氨酸、赖氨酸或其它残基进行的其它衍生。另外,IFNβ多肽可包含连接子或聚合物,其中与连接子或聚合物接合的氨基酸可为根据本发明的非天然氨基酸,或可利用所属领域中已知的技术(例如与赖氨酸或半胱氨酸偶合)使所述氨基酸与天然编码氨基酸接合。
已报导天然IFNβ或其C17S变异体的聚合物修饰(EP229108、美国专利第5,382,657号、EP593868、美国专利第4,917,888号和WO99/55377,其以引用的方式并入本文中)。美国专利第6,962,978号也描述干扰素-β-1a的聚合物接合物,其以引用的方式并入本文中。美国专利公开案第US2005/0220762号、WO2006/133089和WO2006/133088中描述包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的干扰素,所述文献以全文引用的方式并入本文中。Basu等人,Bioconjugate Chem200617:618-630评估超过20种位点选择性单聚乙二醇化或多聚乙二醇化干扰素-β-1b多肽的稳定性、溶解性、聚集、免疫原性和药物动力学性质。接合物在赖氨酸残基或N-末端处形成。
聚乙二醇化IFN分子的实例包括美国专利第6,524,570号、第6,250,469号、第6,180,096号、第6,177,074号、第6,042,822号、第5,981,709号、第5,951,974号、第5,908,621号、第5,738,846号、第5,711,944号、第5,382,657号中揭示的那些,这些专利以引用的方式并入本文中。提及IFNβ为属于生长激素超家族的多肽的一个实例。WO00/23114揭示糖基化且聚乙二醇化的IFNβ。WO00/23472揭示IFNβ融合蛋白。例如参看美国专利第4,904,584号揭示聚乙二醇化的赖氨酸缺失多肽,其中至少一个赖氨酸残基已缺失或由任何其它氨基酸残基置换。WO99/67291揭示一种使蛋白质与PEG接合的方法,其中蛋白质上的至少一个氨基酸残基已缺失并且在足以实现与蛋白质接合的条件下使蛋白质与PEG接触。WO99/03887揭示属于生长激素超家族的多肽的聚乙二醇化变异体,其中半胱氨酸残基已由位于多肽指定区中的非必需氨基酸残基取代。WO00/26354揭示一种制备具有降低的变应原性(allergenicity)的糖基化多肽变异体的方法,所述变异体与相应母体多肽相比包含至少一个其它糖基化位点。揭示IFNβ为许多可根据美国专利第5,218,092号(以引用的方式并入本文中)描述的技术修饰的多肽的一个实例。美国专利第5,218,092号(其以引用的方式并入本文中)揭示对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽的修饰,以引入至少一个其它碳水化合物链(与天然多肽相比)。
术语“IFNβ多肽”也包括糖基化IFNβ,例如(但不限于)在任何氨基酸位置处糖基化的多肽、多肽的N连接或O连接糖基化形式。含有单一核苷酸变化的变异体也被视为IFNβ多肽的生物活性变异体。另外,也包括剪接变异体。术语“IFNβ多肽”也包括由化学方式连接或以融合蛋白形式表达的任何一种或一种以上IFNβ多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配体或任何类型的其它生物活性分子的IFNβ多肽异源二聚物、同源二聚物、异源多聚物或同源多聚物,以及含有例如特定缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。
除非另外说明(即,当说明基于SEQ ID NO:3、4或其它IFNβ序列进行比较时),否则所有对本文中所述的IFNβ中氨基酸位置的提及都是基于SEQ ID NO:1中的位置。举例来说,SEQ ID NO:1的位置1处的氨基酸是蛋氨酸,并且相应蛋氨酸位于SEQ ID NO:4中的位置22处。所属领域的技术人员应了解,在任何其它IFNβ分子(例如SEQ ID NO:3和4)中可容易地鉴别对应于SEQ ID NO:1中的位置的氨基酸位置。所属领域的技术人员应了解,在任何其它IFNβ分子(例如IFNβ融合体、变异体、片段等)中可容易地鉴别对应于SEQ ID NO:1、3、4或任何其它IFNβ序列中的位置的氨基酸位置。举例来说,可使用例如BLAST等序列比对程序来比对并鉴别与SEQ ID NO:1、3、4或其它IFNβ序列中的位置一致的特定蛋白质位置。本文中关于SEQ ID NO:1、3、4或其它IFNβ序列所述的氨基酸取代、缺失或添加也打算指代本文中所述或所属领域中已知的IFNβ融合体、变异体、片段等的相应位置中的取代、缺失或添加,并且由本发明明确涵盖。
术语“IFNβ多肽”或“IFNβ”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的IFNβ多肽。本发明的IFNβ多肽可包含一个或一个以上天然氨基酸修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已描述在天然存在IFNβ多肽中的多个氨基酸位置中的例示性取代,其包括(但不限于)调节医药稳定性的取代、调节IFNβ多肽的一种或一种以上生物活性(例如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、降低蛋白酶敏感性、将多肽转化成拮抗剂等)的取代,并且术语“IFNβ多肽”涵盖所述取代。在一些实施例中,IFNβ拮抗剂包含与IFNβ分子的受体结合区中存在的水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
在一些实施例中,IFNβ多肽进一步包含调节IFNβ多肽的生物活性的添加、取代或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽进一步包含调节IFNβ多肽的抗病毒活性的添加、取代或缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽进一步包含增强IFNβ多肽的抗病毒活性的添加、取代或缺失。举例来说,添加、取代或缺失可调节IFNβ的一种或一种以上性质或活性。举例来说,添加、取代或缺失可调节对IFN受体的亲和性,调节循环半衰期,调节治疗半衰期,调节多肽的稳定性,调节由蛋白酶进行的裂解,调节剂量,调节释放或生物可用性,促进纯化,或改良或改变特定投药途径。类似地,IFNβ多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括但不限于FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括但不限于FLAG、poly-His、GST等)或改良多肽的检测(包括但不限于GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包括但不限于生物素)。
术语“IFNβ多肽”也涵盖所连接的同源二聚物、异源二聚物、同源多聚物和异源多聚物,其包括(但不限于)通过非天然编码氨基酸侧链与相同或不同的非天然编码氨基酸侧链、与天然编码氨基酸侧链直接连接或通过连接子间接连接者。例示性连接子包括(但不限于)小的有机化合物、各种长度的水溶性聚合物(例如聚乙二醇或葡萄聚糖)或各种长度的多肽。
“非天然编码氨基酸”是指并非20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语“非天然编码氨基酸”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”。术语“非天然编码氨基酸”还包括(但不限于)通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而存在,但本身无法通过翻译复合物天然并入正在生长的多肽链中的氨基酸。这些非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸以及O-磷酸酪氨酸。
“氨基末端修饰基”是指可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地,“羧基末端修饰基”是指可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(例如血清白蛋白),或增加肽的血清半衰期的其它部分。
术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基”、“反应性位点”、“化学反应性基团”和“化学反应部分”在所属领域和本文中是用于指代分子中独特的可限定部分或单元。这些术语在化学领域中在一定程度上同义,并且在本文中是用于指示执行某种功能或活性并可与其它分子反应的分子部分。
术语“键联”或“连接子”在本文中用于指通常由于化学反应而形成并且通常为共价键联的基团或键。水解稳定键联意思是所述键联在水中实质上稳定并且在适用的pH值下(包括但不限于在生理条件下)长时间(或许甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解的键联意思是所述键联可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解的键联意思是所述键联可由一种或一种以上酶降解。所属领域中应了解,PEG和相关聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中可包括可降解键联。举例来说,由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键联通常在生理条件下水解以释放所述生物活性剂。其它水解可降解的键联包括(但不限于)碳酸酯键联;由胺与醛反应所产生的亚胺键联;由醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键联;作为酰肼与醛的反应产物的腙键联;作为醛与醇的反应产物的缩醛键联;作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键联;由包括(但不限于)例如PEG等聚合物的末端的胺基与肽的羧基形成的肽键联;以及由包括(但不限于)聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键联。
术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”在用于本文中时意思是可影响与生物体(包括但不限于病毒、细菌、噬菌体、转位子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物以及人类)有关的生物系统、路径、分子或相互作用的任何物理或生物化学性质的任何物质。具体来说,如本文中所用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或用于以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康状况的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、疫苗、免疫原、硬药(hard drug)、软药(soft drug)、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、类毒素、毒素、原核和真核细胞、病毒、多糖、从病毒、细菌、昆虫、动物或任何其它细胞或细胞类型、脂质体、微粒和胶束获得或得到的核酸和其部分。可将IFNβ多肽加入胶束调配物中;参看美国专利第5,833,948号,其以全文引用的方式并入本文中。适用于本发明的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显影剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎药、抗肿瘤药、心血管药、抗焦虑药、激素、生长因子、类固醇药、微生物产生的毒素等等。
“双官能聚合物”是指包含两个能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键联的不连续官能团的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用于形成包括第一生物活性组分、双官能连接子以及第二生物活性组分的接合物。已知使各种化合物与肽连接的众多程序和连接分子。例如参看欧洲专利申请案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号和第4,569,789号,其是以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键联的不连续官能团的聚合物。双官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需长度或分子量,并且可经选择以在与IFNβ连接的一个或一个以上分子与其受体或IFNβ之间提供特定所需间隔或构象。
当由从左向右书写的常规化学式表示取代基时,同样涵盖由从右向左书写的结构得到的化学上相同的取代基,例如,结构-CH2O-等同于结构-OCH2-。
术语“取代基”包括(但不限于)“无干扰取代基”。“无干扰取代基”为产生稳定化合物的基团。合适的无干扰取代基或基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C1-C12芳烷基、C1-C12烷芳基、C3-C12环烷基、C3-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C2-C12烷氧基芳基、C7-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO2、--CN、--NRC(O)--(C1-C10烷基)、--C(O)--(C1-C10烷基)、C2-C10烷基硫烷基、--C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、--SO2、=S、--COOH、--NR2、羰基、--C(O)--(C1-C10烷基)-CF3、--C(O)-CF3、--C(O)NR2、--(C1-C10芳基)-S--(C6-C10芳基)、--C(O)--(C1-C10芳基)、--(CH2)m--O--(--(CH2)m--O--(C1-C10烷基)(其中各m为1到8)、-C(O)NR2、--C(S)NR2、--SO2NR2、--NRC(O)NR2、--NRC(S)NR2、其盐等。如本文中所用,各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
除非另外说明,否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是直链或支链或环状烃基或其组合,其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和的并且可包括具有指定碳原子数目(即C1-C10意思是1到10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团,例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基;(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另外说明,否则术语“烷基”还打算包括下文更详细定义的烷基的衍生物,例如“杂烷基”。只限于烃基的烷基被称作“同系烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由烷烃衍生的二价基团,例如(但不限于)结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-,并且进一步包括下文描述为“亚杂烷基”的基团。通常,烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子,其中具有10个或10个以下碳原子的基团为本文中所述的方法和组合物的特定实施例。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”为通常具有8个或8个以下碳原子的较短链烷基或亚烷基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)是以其常规意义使用,并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的烷基。
除非另外说明,否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合时意思是由指定数目的碳原子以及至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成的稳定直链或支链或环状烃基或其组合,并且其中氮和硫原子可视情况经氧化且氮杂原子可视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或位于烷基与分子的其余部分连接的位置。实例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2,-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可相邻,例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地,术语“亚杂烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由杂烷基衍生的二价基团,例如(但不限于)-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基来说,相同或不同的杂原子也可占据链的一端或两端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。此外,对于亚烷基和亚杂烷基连接基团来说,连接基团的化学式所书写的方向并不表示连接基团的定向。举例来说,式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-与-R′C(O)2-。
除非另外说明,否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合时分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此,环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和和完全不饱和的环键联。另外,对于杂环烷基来说,杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外,所述术语涵盖双环和三环结构。类似地,术语“亚杂环烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由杂环烷基衍生的二价基团,并且术语“亚环烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由环烷基衍生的二价基团。
如本文中所用,术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与IFNβ多肽的连接可产生以下改变,其包括(但不限于)相对于未经修饰形式增加或经调节的血清半衰期或者增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特性(例如聚集和多聚物形成)、改变的受体结合、改变的与一种或一种以上结合搭配物的结合,以及改变的受体二聚或多聚。水溶性聚合物可能具有或可能不具有其本身的生物活性,并且可用作连接IFNβ与其它物质(包括(但不限于)一种或一种以上IFNβ多肽或一种或一种以上生物活性分子)的连接子。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中,所述专利是以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚以及α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺等,或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。
如本文中所用,术语“聚烷二醇”或“聚(烷二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖线性和分枝聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于(例如)商业供应商目录中,例如Shearwater Corporation的目录“Polyethylene Glycol and Derivatives for BiomedicalApplications”(2001)。
除非另外说明,否则术语“芳基”意思是可为单环或稠合在一起或共价连接的多环(包括(但不限于)1到3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环),其中氮和硫原子视情况经氧化,并且氮原子视情况经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一者的取代基都选自下文所述的可接受取代基的群组。
为了简便起见,当与其它术语组合使用时(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基),术语“芳基”包括如上文所定义的芳基与杂芳基环。因此,术语“芳基烷基”打算包括芳基与烷基连接的基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等),所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经(例如)氧原子置换的烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
以上术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)各自打算包括指定基团的经取代与未经取代形式。各类型基团的例示性取代基提供如下。
烷基和杂烷基(包括通常被称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的基团)的取代基可为选自(但不限于)以下的多种基团中的一种或一种以上基团:-OR′、=O、=NR′、=N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)=NR″″、-NR-C(NR′R")=NR″′、-S(O)R′、S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN以及-NO2,其数目在0到(2m′+1)的范围内,其中m′为此类基团中碳原子的总数。R′、R″、R″′和R″″各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(其包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说,当本发明的化合物包括一个以上R基团时,各R基团是独立地经选择,而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时,这些基团同样是各自独立地经选择。当R′和R″与同一氮原子连接时,其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说,-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述,所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团,例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与对于烷基所述的取代基类似,芳基和杂芳基的取代基存在改变且选自(但不限于):卤素、-OR′、=O、=NR′、=N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、C(O)R′、-CO2R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)2R′、-NR-C(NR′R″R″′)=NR″″、-NR-C(NR′R″)=NR″′、-S(O)R′、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-NRSO2R′、-CN和-NO2、-R′、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基,其数目在0到芳环系统上开放价态的总数的范围内;并且其中R′、R″、R″′和R″″独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说,当本发明的化合物包括一个以上R基团时,各R基团是独立地经选择,而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时,这些基团同样是各自独立地经选择。
如本文中所用,术语“经调节的血清半衰期”意思是经修饰IFNβ的循环半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。通过在投与IFNβ后的各个时间点取血样并测定每一样品中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地为至少约两倍,但例如当较小增加能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用时,较小增加也可适用。在一些实施例中,所述增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。
如本文中所用,术语“经调节的治疗半衰期”意思是治疗有效量的IFNβ的半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。通过在投与后的各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效性质来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期理想地能够促成特定有益的给药方案、特定有益的总剂量或避免不需要的作用。在一些实施例中,增加的治疗半衰期是由效力增加、经修饰分子与其标靶的结合增加或降低、酶(例如蛋白酶)对分子的分解增加或降低或未经修饰分子的另一参数或作用机制增加或降低或者分子的受体介导清除增加或降低引起。
当应用于核酸或蛋白质时,术语“经分离”表示所述核酸或蛋白质不含其在天然状态下缔合的细胞组分中的至少一些组分,或所述核酸或蛋白质已浓缩到高于其活体内或活体外产生浓度的程度。其可为均质状态。经分离物质可为干燥或半干燥状态,或为溶液(包括(但不限于)水溶液)形式。其可为包含其它医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的组分。通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上已经纯化。具体来说,经分离基因是从侧接所述基因并编码除所关注基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个条带。具体来说,其意思可能是核酸或蛋白质为至少85%纯、至少90%纯、至少95%纯、至少99%纯或更纯。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。除非特定限制,否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,所述核酸具有与参考核酸相似的结合性质并且是以类似于天然存在核苷酸的方式代谢。除非另外特定限制,否则所述术语也是指寡核苷酸类似物,其包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另外说明,否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体来说,可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位置是经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等人,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。也就是说,针对多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述,并且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用,所述术语涵盖任何长度的氨基酸链,包括全长蛋白质,其中氨基酸残基是通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在氨基酸,以及以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即,与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰R基团(例如,正亮氨酸)或经修饰肽主链,但仍保持与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。对氨基酸的提及包括例如天然存在的蛋白源性L-氨基酸、D-氨基酸;经化学修饰的氨基酸,例如氨基酸变异体和衍生物;天然存在的非蛋白源性氨基酸,例如β-丙氨酸、鸟氨酸等;以及具有所属领域中已知为氨基酸特征的性质的化学合成化合物。非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)α-甲基氨基酸(例如,α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、类组氨酸的氨基酸(例如,2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸)、侧链中另外具有亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸),以及侧链中的羧酸官能团经磺酸基置换的氨基酸(例如,半胱氨酸)。在本发明蛋白质中并入非天然氨基酸,包括合成非天然氨基酸、经取代氨基酸或一个或一个以上D-氨基酸宜以若干不同的方式进行。含D-氨基酸肽等与含L-氨基酸对应物相比展现增加的活体外或活体内稳定性。因此,当期望或需要较高细胞内稳定性时,构筑并入D-氨基酸的肽等可能尤其适用。更具体来说,D-肽等抗内源肽酶和蛋白酶,从而在期望改进的分子生物可用性和延长的活体内寿命时,提供这些性质。另外,不能有效处理D-肽等用于T辅助细胞的主要组织相容性复合体II类限制呈递,且因此不太可能在整个生物体中引发体液免疫反应。
在本文中,氨基酸可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。同样,核苷酸可由其通常接受的单字母代码来指代。
“保守性修饰变异体”适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说,“保守性修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸,或当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上一致的序列。由于遗传密码的简并性,大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在丙氨酸由密码子指定的每一位置处,密码子可改变为所述相应密码子中的任一个而不会改变所编码的多肽。所述核酸变异为“沉默变异(silent variation)”,其为保守性修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每一核酸序列也描述核酸的每一种可能的沉默变异。所属领域的技术人员应认识到,核酸中的各密码子(除AUG和TGG之外,AUG通常为蛋氨酸的独特密码子,而TGG通常为色氨酸的独特密码子)都可经修饰以产生功能相同的分子。因此,编码多肽的核酸的各沉默变异都隐含在各所述序列中。
关于氨基酸序列,所属领域的技术人员应认识到,改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变异体”,其中所述改变将导致氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属领域的技术人员已知提供功能类似氨基酸的保守性取代表。所述保守性修饰变异体除为多态变异体之外(并且不排除这些变异体),还为种间同源物和本发明的等位基因。
所属领域的技术人员已知提供功能类似胺基酸的保守性取代表。以下八组各自含有彼此为保守性取代的氨基酸:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V);
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(例如参看Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman&Co.;第2版(1993年12月))。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情形中,术语“一致”或“一致性”百分比是指相同的两个或两个以上序列或子序列。当通过比较窗比较和比对最大对应性时,或如使用下列序列比较算法(或所属领域的技术人员可用的其它算法)中的一种或通过手工比对和目测检查来测量指定区时,如果序列具有相同(即,在指定区上具有约60%一致性,约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%一致性)的氨基酸残基或核苷酸百分比,那么所述序列为“实质上一致”的。此定义也是指测试序列的互补序列。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区上,或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区上,或(在未指定时)多核苷酸或多肽的整个序列上。可通过包含以下步骤的方法获得编码本发明多肽的多核苷酸(包括来自非人类物种的同源物):在严格杂交条件下用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的经标记探针筛选文库,以及分离全长cDNA和含有所述多核苷酸序列的基因组克隆。所属领域的技术人员熟知所述杂交技术。
对于序列比较来说,通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。在使用序列比较算法时,将测试序列与参考序列输入计算机中,必要时指定子序列坐标,并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数,或可指定替代参数。随后,序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本文中所用,“比较窗”包括参考选自由20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150组成的群组的连续位置数中的任一者的区段,其中可在将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对后对两个序列进行比较。所属领域的技术人员已知用于比较的序列比对方法。可通过以下方法进行用于比较的最佳序列比对,所述方法包括(但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源算法;Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法;搜索Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85:2444的相似方法;所述算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或手工比对和目测检查(例如参看Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))。
适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法,其分别描述于Altschul等人,(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过经由万维网在ncbi.nlm.nih.gov上访问的美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X将决定比对的灵敏性和速率。BLASTN程序(对于核苷酸序列来说)使用字长(W)11、期望值(E)10、M=5、N=-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说,BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62得分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比对数(B)50、期望值(E)10、M=5、N=-4以及两条链的比较作为默认值。通常在“低复杂性”过滤器关闭的情况下进行BLAST算法。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallest sum probability,P(N)),其提供关于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指标。举例来说,如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、或小于约0.01,或小于约0.001,那么认为所述核酸与参考序列相似。
短语“与…选择性(或特异性)杂交”是指当复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列时,在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、双联或杂交。
短语“严格杂交条件”是指在所属领域中已知的低离子强度和高温条件下DNA、RNA、PNA或其它核酸模拟物或其组合的序列的杂交。通常,在严格条件下,探针会与其在核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中的标靶子序列杂交,但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具有序列依赖性并且在不同环境下会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes,″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)中。通常,选择严格条件为在规定离子强度、pH值下比特异性序列的热力学熔点(Tm)低约5℃-10℃。Tm为与标靶互补的探针的50%与标靶序列杂交处于平衡(因为标靶序列过量存在,在Tm下,在平衡时占据50%的探针)时的温度(在指定离子强度、pH值以及核酸浓度下)。严格条件可为在pH值为7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01M到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)来说为至少约30℃且对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)来说为至少约60℃的条件。也可通过添加例如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交来说,阳性信号可为至少两倍背景、视情况10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可如下:50%甲酰胺、5×SSC和1%SDS,在42℃下培育;或5×SSC、1%SDS,在65℃下培育,其中在65℃下在0.2×SSC和0.1%SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
如本文中所用,术语“真核生物”是指属于系统发育域(phylogenetic domain)真核域(Eucarya)的生物体,例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文中所用,术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说,非真核生物体可属于真细菌(Eubacteria)(包括(但不限于)大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)系统发育域,或古生菌(Archaea)(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和嗜盐菌种NRC-1)、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育域。
如本文中所用,术语“个体”是指动物,在一些实施例中为哺乳动物,并且在其它实施例中为人类,其为治疗、观察或实验的对象。动物可为伴侣动物(例如,狗、猫等)、家畜(例如,牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如,大鼠、小鼠、天竺鼠等)。
如本文中所用,术语“有效量”是指所投与的经修饰非天然氨基酸多肽的量,所述量会在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投与含有本文中所述的经修饰非天然氨基酸多肽的组合物来进行预防性、增强性和/或治疗性处理。
术语“增强”意思是增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此,对于增强治疗剂的作用来说,术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。如本文中所用,“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所需系统中的作用的量。当用于患者中时,关于此用途有效的量将视以下因素而定:疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。
如本文中所用,术语“经修饰”是指对给定多肽作出的任何改变,例如多肽长度、多肽的胺基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式“(经修饰)”术语意思是所讨论的多肽视情况经修饰,也就是说,所讨论的多肽可经修饰或未经修饰。
术语“翻译后修饰”是指在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后相对所述氨基酸发生的任何修饰。仅举例来说,所述术语涵盖共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(例如在不含细胞的翻译系统中)、翻译后活体内修饰以及翻译后活体外修饰。
在预防应用中,将含有IFNβ多肽的组合物投与易患特定疾病、病症或病状或者处于患特定疾病、病症或病状的风险中的患者。所述量是定义为“预防有效量”。在这一用途中,精确量也视患者的健康状况、体重等而定。认为通过常规实验(例如,剂量递增临床试验)确定所述预防有效量完全在所属领域的技能范围内。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在特定反应条件下发生反应的“保护基”或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说,如果化学反应性基团为胺或酰肼,那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇,那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基,那么保护基可为苄基或例如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与所述方法和组合物一起使用,其包括例如Nvoc和MeNvoc等光不稳定基团。所属领域中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与所述方法和组合物一起使用。
仅举例来说,封端/保护基团可选自:
其它保护基描述于Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,New York,NY,1999中,其是以全文引用的方式并入本文中。
在治疗应用中,将足以治愈或至少部分抑制疾病、病症或病状的症状的量的含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投与已罹患所述疾病、病状或病症的患者。所述量是定义为“治疗有效量”,且将视以下因素而定:疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。认为通过常规实验(例如,剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量完全在所属领域的技能范围内。
术语“治疗”是用于指预防性和/或治疗性处理。
本文中提出的非天然编码氨基酸多肽可包括一个或一个以上原子经原子质量或质量数与自然界中通常可见的原子质量或质量数不同的原子置换的经同位素标记的化合物。可并入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟和氯的同位素,分别为例如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本文中所述的某些经同位素标记的化合物(例如,合并有例如3H和14C等放射性同位素的化合物)可用于药物和/或底物组织分布测定中。此外,用例如氘(即2H)等同位素取代可提供由较高代谢稳定性产生的某些治疗优点,例如增加的活体内半衰期或降低的剂量需求。
所有异构体(包括(但不限于)非对映异构体、对映异构体和其混合物)都被视为本文中所述组合物的一部分。在另外或其它的实施例中,非天然编码氨基酸多肽在向需要产生代谢物的生物体投与之后代谢,所述代谢物随后用于产生所需作用(包括所需治疗作用)。在其它或另外的实施例中,其为非天然编码氨基酸多肽的活性代谢物。
在一些情况下,非天然编码氨基酸多肽可以互变异构体形式存在。另外,本文中所述的非天然编码氨基酸多肽可以未溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂(例如水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。也认为本文中揭示所述溶剂化形式。所属领域的技术人员应认识到,本文中的一些化合物可以若干互变异构形式存在。所有这种互变异构形式都被视作本文中所述组合物的一部分。
除非另外说明,否则使用所属领域的技能范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。
具体实施方式
I.引言
本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的IFNβ分子。在本发明的某些实施例中,具有至少一个非天然氨基酸的IFNβ多肽包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中,所述至少一个翻译后修饰包含利用所属领域的技术人员已知适用于特定反应性基团的化学方法,使包含第二反应性基团的分子与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸连接,所述包含第二反应性基团的分子包括(但不限于):标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分、光化辐射可激发的部分、可光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述物质的任何组合,或任何其它所需化合物或物质。举例来说,第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中,其中炔丙基有时也被称作乙炔部分),并且第二反应性基团为叠氮部分,并利用[3+2]环加成化学方法。在另一个实例中,第一反应性基团为叠氮部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中),并且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰IFNβ多肽的某些实施例中,使用至少一种包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸),其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中,翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中活体内进行。连接子、聚合物、水溶性聚合物或其它分子可将所述分子与多肽连接。分子可与多肽直接连接。
在某些实施例中,蛋白质包括至少一个由一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰,其中所述翻译后修饰通常无法通过另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中,蛋白质包括至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰,其中所述翻译后修饰通常无法通过非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成(palmitate addition)、磷酸化、糖脂键联修饰等。
在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上用于多肽的糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化或糖脂键联修饰的非天然编码氨基酸。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上用于多肽糖基化的非天然编码氨基酸。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上用于多肽的糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化或糖脂键联修饰的天然编码氨基酸。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上用于多肽糖基化的天然编码氨基酸。
在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽的糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽的糖基化的缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽中不同氨基酸处的糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽中不同氨基酸处的糖基化的缺失。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽中非天然编码氨基酸处的糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽中天然编码氨基酸处的糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽中不同氨基酸处的糖基化的天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽中天然编码氨基酸处的糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。在一些实施例中,IFNβ多肽包含一个或一个以上增强多肽中非天然编码氨基酸处的糖基化的非天然编码氨基酸添加和/或取代。
在一个实施例中,翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖与天冬酰胺连接(包括(但不限于)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一个实施例中,翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中,本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、为进行细菌表达而优化5′的真核生物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核生物)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和源自转位子的信号序列bla。任何此类序列都可经修饰以使多肽具有所需结果,包括(但不限于)用不同信号序列取代一个信号序列,用不同前导序列取代一个前导序列等。
所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可相同或不同,例如,在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同位点,其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中,蛋白质的天然存在形式中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸是经非天然氨基酸取代。
本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的IFNβ的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入IFNβ中可允许应用涉及特定化学反应(包括(但不限于)与一个或一个以上非天然编码氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应)的接合化学。在一些实施例中,包含非天然编码氨基酸的IFNβ是通过非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法,其涉及回应选择密码子将非遗传编码氨基酸(包括(但不限于)含有在20种天然并入氨基酸中未发现的官能团或取代基(包括(但不限于)酮、叠氮或乙炔部分)的氨基酸)选择性并入蛋白质中,并且随后用合适的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。一旦并入氨基酸侧链,就可通过利用所属领域的技术人员已知适用于非天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法适用于在本发明中将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括(但不限于)分别与(包括(但不限于))乙炔或叠氮化物衍生物进行休斯根[3+2]环加成反应(例如参看Padwa,A.Comprehensive Organic Synthesis,第4卷,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页;以及Huisgen,R.1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页)。
因为休斯根[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应,所以蛋白质可在极高选择性下经修饰。通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐,可在室温下在水性条件下以优良区域选择性(1,4>1,5)进行此反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064;和Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599;以及WO03/101972。可通过[3+2]环加成而加成到本发明蛋白质上的分子包括具有合适的官能团或取代基(包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物)的几乎任何分子。这些分子可分别加成到具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)上。
由休斯根[3+2]环加成得到的5元环在还原性环境中通常为不可逆的,并且在水性环境中长时间对水解稳定。因此,可在苛刻水性条件下用本发明的活性PEG衍生物修饰多种物质的物理和化学特征。甚至更重要的是,因为叠氮部分和乙炔部分彼此具有特异性(并且例如不与20种常见的遗传编码氨基酸中的任一种反应),所以可在一个或一个以上特异性位点中以极高的选择性修饰蛋白质。
本发明还提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的叠氮部分偶合。类似地,含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的乙炔部分偶合。
更具体来说,叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其它取代基,只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基,只要保持叠氮化物特异性反应性即可。
本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的接合物,所述其它物质包括(但不限于)标记;染料;聚合物;水溶性聚合物;聚乙二醇的衍生物;光交联剂;放射性核素;细胞毒性化合物;药物;亲和性标记;光亲和性标记;反应性化合物;树脂;第二蛋白质或多肽或多肽类似物;抗体或抗体片段;金属螯合剂;辅因子;脂肪酸;碳水化合物;多核苷酸;DNA;RNA;反义多核苷酸;糖类;水溶性树枝状聚合物;环糊精;抑制性核糖核酸;生物材料;纳米粒子;自旋标记;荧光团;含金属的部分;放射性部分;新颖官能团;与其它分子共价或非共价相互作用的基团;光笼化部分;光化辐射可激发的部分;可光致异构化部分;生物素;生物素衍生物;生物素类似物;结合有重原子的部分;可化学裂解的基团;可光裂解的基团;延长的侧链;碳连接的糖;氧化还原活性剂;氨基硫代酸;毒性部分;经同位素标记的部分;生物物理探针;磷光基团;化学发光基团;电子致密基团;磁性基团;插入基团;发色团;能量转移剂;生物活性剂;可检测标记;小分子;量子点;纳米传递素;放射性核苷酸;放射性传递素;中子俘获剂;或上述物质的任何组合,或任何其它所需化合物或物质。本发明还包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的接合物。举例来说,含有叠氮部分的PEG聚合物可在蛋白质中含有带有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处与生物活性分子偶合。使PEG与生物活性分子偶合的键联包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成产物。
所属领域中已明确确立,PEG可用于修饰生物材料的表面(例如参看美国专利6,610,281;Mehvar,R.,J.Pharm Pharm Sci.,3(1):125-136(2000),其是以引用的方式并入本文中)。本发明还包括包含具有一个或一个以上反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料,和通过休斯根[3+2]环加成键联与所述表面偶合的一种或一种以上本发明的含叠氮基或乙炔的聚合物。生物材料和其它物质也可通过除叠氮基或乙炔键联以外的其它键联(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键联)与由叠氮化物或乙炔活化的聚合物衍生物偶合以留下叠氮或乙炔部分用于后续反应。
本发明包括一种合成本发明的含叠氮基聚合物和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基的PEG衍生物的情况下,可使叠氮化物与聚合物的碳原子直接键结。或者,可通过将一端具有叠氮部分的连接剂与常规活化聚合物连接来制备含叠氮基的PEG衍生物,使得所得聚合物在其末端具有叠氮部分。在含乙炔的PEG衍生物的情况下,可使乙炔与聚合物的碳原子直接键结。或者,可通过将一端具有乙炔部分的连接剂与常规活化聚合物连接来制备含乙炔的PEG衍生物,使得所得聚合物在其末端具有乙炔部分。
更具体来说,在含叠氮基的PEG衍生物的情况下,具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物进行反应以产生具有反应性更强的部分(例如甲磺酸根、三氟乙磺酸根、甲苯磺酸根或卤素离去基)的经取代聚合物。所属领域的技术人员已知含有磺酰卤、卤素原子以及其它离去基的PEG衍生物的制备和使用。所得经取代的聚合物随后进行反应以在聚合物的末端用叠氮部分取代反应性更强的部分。或者,具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与一端具有叠氮基的连接剂发生反应,使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键,并且叠氮部分位于聚合物的末端。所属领域的技术人员已知亲核和亲电子部分,其包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。
更具体来说,在含乙炔的PEG衍生物的情况下,具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物进行反应以从含有乙炔部分的前体置换卤素或其它经活化的离去基。或者,具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与一端具有乙炔的连接剂发生反应,使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键,并且乙炔部分位于聚合物的末端。所属领域的技术人员充分确定卤素部分、经活化的离去基、亲核和亲电子部分在有机合成情形中的使用以及PEG衍生物的制备和使用。
本发明还提供一种选择性修饰蛋白质以将其它物质添加到经修饰蛋白质上的方法,所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物,例如PEG和含有叠氮或乙炔部分的PEG衍生物。含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物可用于改变表面和分子的性质(其中生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性较为重要),并同时提供一种比所属领域中先前已知的选择性更强的使PEG衍生物与蛋白质连接的方法。
II.干扰素β
已显示IFNβ的商业制剂可有效降低多发性硬化的恶化速率,且与安慰剂治疗患者相比,更多的患者长时间保持无恶化。此外,致残累积率降低(Neurol.51:682-689,1998)。目前产品中有三种是以名称(使用重组细菌细胞产生的未糖基化的干扰素β1b,具有N末端蛋氨酸残基缺失和C17S突变)和和(使用重组哺乳动物细胞产生的糖基化干扰素β1a)销售。
未来可能发现IFN家族的其它成员。可通过对预测的蛋白质序列的计算机辅助的二级和三级结构分析并且通过经设计用于鉴别与特定标靶结合的分子的选择技术来鉴别IFN家族的新成员。
因此,IFN家族的描述仅是出于说明性目的并且以举例的方式提供,且并不限制本文中所述的方法、组合物、策略和技术的范围。此外,本申请案中提及IFNβ是打算将此通称用作IFN家族的任何成员的实例。因此,应了解本文中关于IFNβ多肽或蛋白质所述的修饰和化学可同样适用于IFN家族的任何成员,包括本文中特定列出的成员。
III.本发明中使用的一般重组核酸方法
在本发明的众多实施例中,将使用重组方法分离、克隆并通常改变编码所关注的IFNβ多肽的核酸。所述实施例是用于(包括但不限于)蛋白质表达或用于源自IFNβ多肽的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间。在一些实施例中,编码本发明多肽的序列是可操作地连接到异源启动子上。
可以母体多肽的氨基酸序列(包括(但不限于)具有SEQ ID NO:1、3、4中所示的氨基酸序列)为基础来合成编码包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的核苷酸序列,并且随后改变所述核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即,并入或取代)或移除(即,缺失或取代)。可根据常规方法通过定点诱变来方便地修饰核苷酸序列。或者,可由化学合成来制备核苷酸序列,包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成器并且优先选择将产生重组多肽的宿主细胞中所偏好的密码子来制备核苷酸序列,其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列进行设计。举例来说,可通过PCR、连接或连接链式反应来合成并组装编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如参看Barany等人,Proc.Natl.Acad.Sci.88:189-193(1991);美国专利6,521,427,其是以引用的方式并入本文中。
本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示本发明中使用的一般方法的基础文章包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版,2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编,1994)。
描述分子生物技术的一般文章包括Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,第152卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger);Sambrook等人,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版),第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989(″Sambrook″)以及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人编,Current Protocols,GreenePublishing Associates,Inc.与John Wiley&Sons,Inc.的合资企业,(1999年全年增补)(″Ausubel″)。这些文章描述诱变、载体和启动子的使用以及许多其它相关主题,所述相关主题涉及(包括但不限于)包括用于制备包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶以及其对的蛋白质的选择密码子的基因或多核苷酸的产生。
本发明出于多种目的使用各种类型的诱变,所述目的包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA、使tRNA分子突变、使编码合成酶的多核苷酸突变、产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、在所关注的蛋白质或多肽中插入编码非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用带缺口的双螺旋DNA的诱变等、PCT介导的诱变,或其任何组合。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主菌株的诱变、限制选择和限制纯化、缺失诱变、通过总基因合成进行的诱变、双链断裂修复等。(包括但不限于)涉及嵌合构筑体的诱变也包括在本发明中。在一个实施例中,可由天然存在分子或已改变或突变的天然存在分子的已知信息(包括(但不限于)序列、序列比较、物理性质、二级、三级或四级结构、晶体结构等)来指导诱变。
本文中可见的文章和实例描述这些程序。其它信息可见于以下公开案和其中引用的参考文献中:Ling等人,Approaches to DNA mutagenesis:an overview,Anal Biochem.254(2):157-178(1997);Dale等人,Oligonucleotide-directed random mutagenesis using thephosphorothioate method,Methods Mol.Biol.57:369-374(1996);Smith,In vitromutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985);Botstein和Shortle,Strategies andapplications of in vitro mutagenesis,Science 229:1193-1201(1985);Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986);Kunkel,The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis,Nucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein,F.和Lilley,D.M.J编,SpringerVerlag,Berlin)(1987);Kunkel,Rapid and efficient site-specific mutagenesis-withoutphenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985);Kunkel等人,Rapid andefficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382(1987);Bass等人,Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities,Science242:240-245(1988);Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13-derived vectors:an efficient and general procedure for the production of pointmutations in any DNA fragment,Nucleic Acids Res. 10:6487-6500(1982);Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors,Methods in Enzymol.100:468-500(1983);Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:asimple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template,Methods in Enzymol.154:329-350(1987);Taylor等人,The use ofphosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA,Nucl. Acids Res.13:8749-8764(1985);Taylor等人,The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res. 13:8765-8785(1985);Nakamaye和Eckstein,Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application tooligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.14:9679-9698(1986);Sayers等人,5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl. Acids Res.16:791-802(1988);Sayers等人,Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presenceofethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res.16:803-814;Kramer等人,The gapped duplexDNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction,Nucl.Acids Res.12:9441-9456(1984);Kramer和Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367(1987);Kramer等人,Improvedenzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations,Nucl.Acids Res.16:7207(1988);Fritz等人,Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNA procedure withoutenzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16:6987-6999(1988);Kramer等人,Differentbase/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNAmismatch-repair system of E.coli,Cell38:879-887(1984);Carter等人,Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985);Carter,Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3vectors,Methods in Enzymol.154:382-403(1987);Eghtedarzadeh和Henikoff,Use of oligonucleotides togenerate large deletions,Nucl.Acids Res.14:5115(1986);Wells等人,Importance ofhydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin,Phil.Trans.R.Soc. Lond.A317:415-423(1986);Nambiar等人,Total synthesis and cloning of a gene codingfor the ribonuclease S protein,Science223:1299-1301(1984);Sakamar和Khorana,Totalsynthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein(transducin),Nucl.Acids Res.14:6361-6372(1988);Wells等人,Cassette mutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at definedsites,Gene34:315-323(1985);Grundstrom等人,Oligonucleotide-directed mutagenesis bymicroscale′shot-gun′gene synthesis,Nucl.Acids Res.13:3305-3316(1985);Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli:amethod for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986);Arnold,Protein engineering for unusual environments,Current Opinion in Biotechnology4:450-455(1993);Sieber等人,Nature Biotechnology,19:456-460(2001);W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91(1994);以及I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)。关于众多上述方法的其它细节可见于Methods in Enzymology第154卷中,所述文献也描述对于各种诱变方法带来的故障检修问题的有效控制。
通常根据由Beaucage和Caruthers,Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862,(1981)所描述的固相亚磷酰胺三酯法,例如使用如Needham-VanDevanter等人,Nucleic acids Res.,12:6159-6168(1984)中所述的自动合成器以化学方式合成例如用于本发明的诱变(例如,使合成酶文库突变或改变tRNA)中的寡核苷酸。
本发明也涉及通过正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。用本发明的多核苷酸或包括本发明多核苷酸的构筑体(包括(但不限于)本发明的载体,其可为例如克隆载体或表达载体)以遗传学方式工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)宿主细胞。举例来说,正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生的蛋白质的编码区可操作地连接到在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件上。载体可为例如质粒、粘粒(cosmid)、噬菌体、细菌、病毒、裸多核苷酸或接合多核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中,所述方法包括电穿孔(Fromm等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上由具有核酸的小粒子高速弹道渗透(Klein等人,Nature327,70-73(1987))等。适合活体外将核酸转移到细胞中的技术包括使用脂质体、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。活体内基因转移技术包括(但不限于)用病毒(通常逆转录病毒)载体转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染[Dzau等人,Trends in Biotechnology11:205-210(1993)]。在一些情形下,可能期望给核酸源提供例如对细胞表面膜蛋白或靶细胞具有特异性的抗体、靶细胞上的受体的配体等靶向靶细胞的因子。当使用脂质体时,可使用结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质来靶向和/或促进摄取例如衣壳蛋白或其对特定细胞类型具有向性的片段、在循环中经历内化的蛋白质的抗体、靶向细胞内定位和增强细胞内半衰期的蛋白质。
可在经改良适于例如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养工程改造过的宿主细胞。这些细胞可视情况经培养并进入转基因生物体中。(包括但不限于)关于细胞分离和培养(例如,关于后续核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley-Liss,New York以及其中引用的参考文献;Payne等人,(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,NY;Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture;Fundamental Methods Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,FL。
可使用将标靶核酸引入细胞中的数种熟知的方法,其中任一种方法都可用于本发明中。这些方法包括:受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法(projectile bombardment)以及经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期并且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参看Sambrook)。另外,可购得试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参看来自Pharmacia Biotech的EasyPrepTM、FlexiPrepTM;来自Stratagene的StrataCleanTM;以及来自Qiagen的QIAprepTM)。随后,进一步操纵分离并纯化过的质粒以产生其它质粒,使用所述质粒来转染细胞或将其并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调节特定标靶核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒,其含有至少一个独立的终止子序列、允许所述表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)以及用于原核系统与真核系统的选择标记。载体适于在原核细胞、真核细胞或两者中复制和整合。参看Giliman和Smith,Gene8:81(1979);Roberts等人,Nature.328:731(1987);Schneider,B.等人,Protein Expr.Purif.6435:10(1995);Ausubel,Sambrook,Berger(都同上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体的目录由(例如)ATCC提供,例如,由ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage(1992),Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑因素也可见于Watson等人,(1992)Recombinant DNA第2版 ScientificAmerican Books,NY中。另外,基本上任何核酸(以及实际上任何经标记核酸,无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一种定制或标准定购,这些商业来源例如Midland Certified Reagent Company(Midland,TX,可通过万维网在mcrc.com上获得)、The Great American Gene Company(Ramona,CA,可通过万维网在genco.com上获得)、ExpressGen Inc.(Chicago,IL,可通过万维网在expressgen.com上获得)、OperonTechnologies Inc.(Alameda,CA)以及许多其它来源。
选择密码子
本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机制的遗传密码子框架。举例来说,选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无义密码子(例如终止密码子,包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)、赭石密码子或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。所属领域的技术人员显而易见,可引入所需基因或多核苷酸中的选择密码子的数目范围很广,其包括(但不限于)在编码IFNβ多肽的至少一部分的单一多核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上选择密码子。
在一个实施例中,所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子以在活体内并入一个或一个以上非天然氨基酸。举例来说,产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA,并且通过O-RS利用所需非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。此O-tRNA无法由天然存在宿主的氨酰基-tRNA合成酶识别。可使用常规定点诱变在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包括(但不限于)TAG)。例如参看Sayers,J.R.等人,(1988),5′-3′Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res,16:791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时,回应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
活体内并入非天然氨基酸可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下进行。举例来说,因为对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制因子tRNA)与真核释放因子(包含但不限于eRF)(其与终止密码子结合并起始核糖体释放正在生长的肽)之间的竞争,所以可通过(包括但不限于)增加O-tRNA和/或抑制因子tRNA的表达水平来调节抑制效率。
也可利用稀有密码子来编码非天然氨基酸。举例来说,当活体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度降低时,已证明稀有精氨酸密码子AGG有效用于通过经丙氨酸酰化的合成tRNA插入Ala。例如参看Ma等人,Biochemistry,32:7939(1993)。在这种情况下,合成tRNA与在大肠杆菌中作为次要物质存在的天然存在tRNA Arg竞争。一些生物体不使用所有三联体密码子。已利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密码子AGA在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如参看Kowal和Oliver,Nucl.Acid.Res.,25:4685(1997)。可产生本发明的组分以在活体内使用这些稀有密码子。
选择密码子还包含延长密码子,其包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子,例如四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制(frameshift suppression)的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将(包括但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说,在存在具有反密码子环(例如,具有至少8-10nt的反密码子环)的突变O-tRNA(包括(但不限于)特定移码抑制因子tRNA)的情况下,将四个或四个以上碱基的密码子读作单一氨基酸。在其它实施例中,反密码子环可解码(包括但不限于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。因为存在256种可能的四碱基密码子,所以可使用四个或四个以上碱基的密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参看Anderson等人,(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology,9:237-244;Magliery,(2001)Expanding the Genetic Code:Selectionof Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-baseCodons with a Library Approach in Escherichia coli,J.Mol.Biol.307:755-769。
举例来说,使用活体外生物合成方法,已经用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看Ma等人,(1993)Biochemistry,32:7939;以及Hohsaka等人,(1999)J.Am. Chem.Soc.121:34。使用CGGG和AGGU,从而在活体外利用两个化学酰化的移码抑制因子tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生蛋白链菌素中。例如参看Hohsaka等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:12194。在活体内研究中,Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力,并且发现四联体UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13%到26%的效率解码,其中在0或-1框架中极少解码。参看Moore等人,(2000)J.Mol.Biol.,298:195。在一个实施例中,可在本发明中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子,其可减少在其它不合需要的位点处的错义通读和移码抑制。
对于给定系统来说,选择密码子也可包括一个天然三碱基密码子,其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说,这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现有遗传代码。一个额外的碱基对使三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包括稳定且具有选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延伸。可适于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括(例如)Hirao等人,(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acidanalogues into protein,Nature Biotechnology,20:177-182。还参看Wu,Y.等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:14626-14630。其它相关公开案列于下文中。
对于活体内使用来说,非天然核苷是膜可渗透的并且经磷酸化以形成相应的三磷酸盐。另外,增加的遗传信息稳定并且不受细胞酶破坏。Benner等人先前的工作利用与规范Watson-Crick配对不同的氢键合模式,其中最值得注意的实例为iso-C:iso-G配对。例如参看Switzer等人,(1989)J.Am.Chem.Soc111:8322;以及Piccirilli等人,(1990)Nature,343:33;Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水性堆积相互作用可代替氢键合来驱动碱基对的形成。参看Kool,(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.,4:602;以及Guckian和Kool,(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,36,2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中,Schultz、Romesberg和同事已系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身配对比天然碱基对稳定,并可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment,KF)有效地并入DNA中。例如参看McMinn等人,(1999)J.Am.Chem.Soc,121:11585-6;以及Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:3274。可通过KF以足以用于生物功能的效率和选择性合成3MN:3MN自身配对。例如参看Ogawa等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:8803。然而,这两种碱基都充当用于进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展,其可用于复制PICS自身配对。另外,也可复制7AI自身配对。例如参看Tae等人,(2001)J.Am.Chem.Soc,123:7439。也已开发新颖金属碱基对Dipic:Py,其在结合Cu(II)后形成稳定配对。参看Meggers等人,(2000)J.Am.Chem.Soc,122:10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交,所以本发明的方法可利用这一性质来产生正交tRNA以供其使用。
也可使用翻译旁路系统(translational bypassing system)将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中,将大序列并入基因中,但并未将其翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跳过所述序列并在插入下游重新开始翻译的提示的结构。
在某些实施例中,在本发明的方法和/或组合物中的所关注的蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常,核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。
可使用所属领域的技术人员已知并且在本文中描述的方法来诱变所关注的蛋白质或多肽的编码基因,从而使其包括(例如)一个或一个以上选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说,诱变所关注蛋白质的核酸以使其包括一个或一个以上选择密码子,从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包括(例如)包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白的任何这种变异体(包括但不限于突变体)形式。类似地,本发明还包括相应核酸,即,具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。
可容易地使编码所关注蛋白质(例如IFNβ多肽)的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属领域的技术人员已知适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法,例如美国专利第6,608,183号(其是以引用的方式并入本文中)中所述的方法,以及标准诱变技术。
IV.非天然编码氨基酸
多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。可将任何数目的非天然编码氨基酸引入IFNβ多肽中。一般来说,引入的非天然编码氨基酸实质上对20种常见的遗传编码氨基酸(即,丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)呈化学惰性。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包括与20种常见氨基酸中不存在的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮基、醛基以及氨氧基)有效并选择性地反应形成稳定接合物的侧链官能团。举例来说,包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽可与聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇)或者含有炔部分的第二多肽反应,以形成由于叠氮基与炔官能团选择性反应形成休斯根[3+2]环加成产物而引起的稳定接合物。
α-氨基酸的一般结构说明如下(式I):
非天然编码氨基酸通常为具有以上所列结构式(其中R基团为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)的任何结构,并且可适用于本发明中。因为本发明的非天然编码氨基酸通常仅关于侧链结构与天然氨基酸存在不同,所以非天然编码氨基酸以与天然存在多肽中形成酰胺键相同的方式与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键。然而,非天然编码氨基酸具有使其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说,R视情况包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。所关注的可适用于本发明中的其它非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或可光致异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(例如糖取代丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包括(但不限于)聚醚或长链烃,包括(但不限于)约5个以上或约10个以上碳)的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。
可适用于本发明中并且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物以及炔反应性基团的非天然编码氨基酸。在一些实施例中,非天然编码氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例还包括氨基酸与糖之间的天然存在N-或O-键联是由自然界中通常不存在的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。这些氨基酸的实例还包括天然存在蛋白质中通常不存在的糖,例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
本文中提供的多种非天然编码氨基酸可购自(例如)Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的分公司,Darmstadt,Germany)或Peptech(Burlington,MA,USA)。不可购得的非天然编码氨基酸是视情况如本文中所提供而合成,或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术,例如参看Fessendon和Fessendon,Organic Chemistry,(1982,第2版,Willard Grant Press,BostonMass.);March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York);以及Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry(第3版,A和B部分,1990,PlenumPress,New York)。还参看美国专利第7,045,337号和第7,083,970号,其是以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外,可适用于本发明中的非天然氨基酸也视情况包含经修饰的主链结构,包括(但不限于)如式II和III的结构所说明的结构:
其中Z通常包含OH、NH2、SH、NH-R′或S-R′;X和Y可相同或不同,通常包含S或O;并且R和R′视情况相同或不同,通常选自上文对于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的组成部分的相同清单以及氢。举例来说,本发明的非天然氨基酸视情况包含如式II和III所说明的氨基或羧基中的取代。这种类型的非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸盐,包括(但不限于)具有对应于20种常见天然氨基酸的侧链或非天然侧链的非天然氨基酸。另外,在α-碳上的取代视情况包括(但不限于)L、D或α-α-二取代氨基酸,例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸,例如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物;β和γ氨基酸,例如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。
多种非天然氨基酸是基于例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸并且适用于本发明中。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸以及间位取代的酪氨酸,其中经取代酪氨酸包含(包括但不限于)酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C6-C20直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等。另外,也涵盖多取代芳环。可适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ-取代衍生物、环状衍生物以及酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的例示性苯丙氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸,其中取代基包含(包括但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘基、溴基、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明中的非天然氨基酸的特定实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸以及对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构的实例是提供于(例如)标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO2002/085923中。关于其它蛋氨酸类似物,还参看Kiick等人,(2002)Incorporation of azidesinto recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS99:19-24,其是以引用的方式并入本文中。标题为“Compositions Containing,MethodsInvolving,and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides”的国际申请案第PCT/US06/47822号(其以引用的方式并入本文中)描述芳香族胺部分(包括(但不限于)对氨基苯丙氨酸)的还原性烷基化,和还原性胺化。
在一个实施例中,提供包括非天然氨基酸(例如对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的IFNβ多肽的组合物。还提供包含对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和(包括但不限于)蛋白质和/或细胞的各种组合物。一方面,包括对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(包括(但不限于)共价键结),其包括(但不限于)通过氨酰基键与正交tRNA共价键结、与正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH共价键结等。
可借助于非天然氨基酸并入蛋白质中的化学部分提供蛋白质的多种优点和操纵性。举例来说,酮基官能团的独特反应性允许利用多种含肼或含羟胺试剂中的任一者在活体外以及活体内选择性修饰蛋白质。例如,重原子非天然氨基酸可适用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸进行重原子的位点特异性引入还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。举例来说,光反应性非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于叠氮基苯)侧链的氨基酸)允许蛋白质的活体内和活体外有效光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸以及对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后,可通过激发光反应性基团(提供时间控制)使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中,(包括但不限于)在使用核磁共振以及振动光谱的情况下,可由作为局部结构和动力学的探针的经同位素标记的(包括但不限于)甲基取代非天然氨基酸的甲基。举例来说,炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。
并入多肽的氨基末端的非天然氨基酸可由R基团(其为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)和不同于α-氨基酸(参看式I)中通常存在的NH2基团的第二反应性基团构成。类似的非天然氨基酸可在羧基末端并入不同于α-氨基酸(参看式I)中通常存在的COOH基团的第二反应性基团。
可选择或设计本发明的非天然氨基酸以提供20种天然氨基酸中不可获得的其它特性。举例来说,可视情况设计或选择非天然氨基酸以改良(例如)并有所述非天然氨基酸的蛋白质的生物性质。举例来说,可视情况通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改良以下性质:毒性、生物分布(biodistribution)、溶解性、稳定性(例如,热稳定性、水解稳定性、氧化稳定性、酶促降解抗性等)、纯化和加工便利性、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化活性、氧化还原电位、半衰期、与其它分子(例如)共价或非共价反应的能力等。
非天然氨基酸的结构与合成:羰基、羰基样基团、经掩蔽羰基、经保护羰基和羟胺
基
在一些实施例中,本发明提供通过肟键与例如PEG等水溶性聚合物连接的IFNβ。
多种类型的非天然编码氨基酸适用于形成肟键。这些氨基酸包括(但不限于)含有羰基、二羰基或羟胺基的非天然编码氨基酸。此类氨基酸是描述于美国专利公开案第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及标题为“Compositionscontaining,methods involving,and uses of non-natural amino acids and polypeptides”的WO2006/069246中,所述文献是以全文引用的方式并入本文中。非天然编码氨基酸也描述于美国专利第7,083,970号和美国专利第7,045,337号中,所述文献是以全文引用的方式并入本文中。
本发明的一些实施例利用在一个或一个以上位置处经对乙酰基苯丙氨酸氨基酸取代的IFNβ多肽。对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中,所述文献是以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员可类似地制备其它含羰基或含二羰基的氨基酸。此外,本文中所包括的非天然氨基酸的非限制性例示性合成呈现于美国专利第7,083,970号的图4、24-34和36-39中,所述专利是以全文引用的方式并入本文中。
具有亲电子反应性基团的氨基酸允许多种通过亲核加成反应连接分子的反应。所述亲电子反应性基团包括羰基(包括酮基和二羰基)、羰基样基团(其具有类似于羰基(包括酮基和二羰基)的反应性并且在结构上与羰基类似)、经掩蔽羰基(其可容易地转化为羰基(包括酮基和二羰基)),或经保护羰基(其在脱保护后具有与羰基(包括酮基和二羰基)类似的反应性)。所述氨基酸包括具有式(IV)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
J为或
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基,或当存在一个以上R″基团时,两个R″视情况形成杂环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
R3和R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基,或R3和R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基;
或-A-B-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基;
或-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基;
条件是当A为亚苯基并且R3各自为H时,B存在;并且当A为-(CH2)4-并且R3各自为H时,B不为-NHC(O)(CH2CH2)-;并且当A与B都不存在并且R3各自为H时,R不为甲基。
另外,包括具有式(V)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
条件是当A为亚苯基时,B存在;并且当A为-(CH2)4-时,B不为-NHC(O)(CH2CH2)-;并且当A与B都不存在时,R不为甲基。
另外,包括具有式(VI)的结构的氨基酸:
其中:
B是选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′组成的群组,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外,包括以下氨基酸:
和其中所述化合物视情况氨基经保护、羧基经保护,或为其盐。另外,以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外,包括以下具有式(VII)的结构的氨基酸:
其中
B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′组成的群组,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;并且n为0到8;
条件是当A为-(CH2)4-时,B不为-NHC(O)(CH2CH2)-。
另外,包括以下氨基酸:
和其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护,或为其盐。另外,这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外,包括以下具有式(VIII)的结构的氨基酸:
其中A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外,包括以下具有式(IX)的结构的氨基酸:
B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
其中Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′组成的群组,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外,包括以下氨基酸:
和其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护,或为其盐。另外,这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外,包括以下具有式(X)的结构的氨基酸:
其中B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′组成的群组,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;并且n为0到8。
另外,包括以下氨基酸:
和其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护,或为其盐。另外,这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
除单羰基结构之外,本文中所述的非天然氨基酸也可包括例如二羰基、二羰基样基团、经掩蔽二羰基和经保护二羰基等基团。
举例来说,包括以下具有式(XI)的结构的氨基酸:
其中A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外,包括以下具有式(XII)的结构的氨基酸:
B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R′)=N-N(R′)-、-C(R′)=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
其中Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′组成的群组,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外,包括以下氨基酸:
和其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护,或为其盐。另外,这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外,包括以下具有式(XIII)的结构的氨基酸:
其中B是可选的,并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子:低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N=、-C(R′)=N-、-C(R')=N-N(R′)-、-C(R')=N-N=、-C(R′)2-N=N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′组成的群组,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基;并且n为0到8。
另外,包括以下氨基酸:
和其中所述化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护并且羧基也经保护,或为其盐。另外,这些非天然氨基酸以及以下非天然氨基酸中的任一者都可并入非天然氨基酸多肽中。
另外,包括以下具有式(XIV)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
X1为C、S或S(O);并且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基),其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外,包括以下具有式(XIV-A)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基),其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外,包括以下具有式(XIV-B)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基),其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外,包括以下具有式(XV)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
X1为C、S或S(O);并且n为0、1、2、3、4或5;并且各CR8R9基团上的R8和R9是各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组,或任何R8和R9可合起来形成=O或环烷基,或任何两个相邻R8基团可合起来形成环烷基。
另外,包括以下具有式(XV-A)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
n为0、1、2、3、4或5;并且各CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组,或任何R8和R9可合起来形成=O或环烷基,或任何两个相邻R8基团可合起来形成环烷基。
另外,包括以下具有式(XV-B)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
n为0、1、2、3、4或5;并且各CR8R9基团上的R8和R9各自独立地选自由H、烷氧基、烷基胺、卤素、烷基、芳基组成的群组,或任何R8和R9可合起来形成=O或环烷基,或任何两个相邻R8基团可合起来形成环烷基。
另外,包括以下具有式(XVI)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
X1为C、S或S(O);并且L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基),其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外,包括以下具有式(XVI-A)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基),其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外,包括以下具有式(XVI-B)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
L为亚烷基、经取代亚烷基、N(R′)(亚烷基)或N(R′)(经取代亚烷基),其中R′为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外,包括具有式(XVII)的结构的氨基酸:
其中:
A是可选的,并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基;
M为-C(R3)-、 或其中(a)表示与A基团键结,并且(b)表示与各自的羰基键结,R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基,或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基;
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
T3为键、C(R)(R)、O或S,并且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸。
另外,包括具有式(XVIII)的结构的氨基酸:
其中:
M为-C(R3)-、 或其中(a)表示与A基团键结,并且(b)表示与各自的羰基键结,R3和R4独立地选自H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基,或R3和R4或两个R3基团或两个R4基团视情况形成环烷基或杂环烷基;
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
T3为键、C(R)(R)、O或S,并且R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;
R1是可选的,并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;并且
R2是可选的,并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、氨基酸、多肽或多核苷酸;
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)kR′(其中k为1、2或3)、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′组成的群组,其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
另外,包括具有式(XIX)的结构的氨基酸:
其中:
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基;并且
T3为O或S。
另外,包括具有式(XX)的结构的氨基酸:
其中:
R为H、卤素、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基。
另外,包括以下具有式(XXI)的结构的氨基酸:
和
在一些实施例中,以化学方式修饰包含非天然氨基酸的多肽以产生反应性羰基或二羰基官能团。举例来说,可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于接合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时,例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其可正常存在,或可通过化学或酶促消化而暴露)在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992);Geoghegan,K.和Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992);Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而,所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白质的N末端氨基酸。
在本发明中,带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“经掩蔽”的醛官能团并入多肽中。举例来说,5-羟基赖氨酸带有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠,以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠,接着在黑暗环境中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号。
羰基或二羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含羟胺的试剂选择性反应,从而形成在生理条件下稳定的相应肟键联。例如参看Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959);Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外,羰基或二羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如参看Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996);Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992);Mahal,L.K.等人,Science276:1125-1128(1997)。
非天然氨基酸的结构与合成:含羟胺的氨基酸
美国临时专利申请案第60/638,418号是以全文引用的方式并入本文中。因此,美国临时专利申请案第60/638,418号中的第V章(标题为“Non-natural Amino Acids”B部分(标题为“Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids:Hydroxylamine-Containing Amino Acids”)中所提供的揭示内容完全适用于制备、纯化、表征和使用本文中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物(包括式I-XXXV)、技术和策略,其应用程度就如同所述揭示内容完全呈现于本文中。美国专利公开案第2006/0194256号、第2006/0217532号和第2006/0217289号以及标题为“Compositions containing,methods involving,and uses ofnon-natural amino acid s and polypeptides”的WO2006/069246也是以全文引用的方式并入本文中。
非天然氨基酸的化学合成
适用于本发明中的多种非天然氨基酸可购自例如Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee,WI,USA)。无法购得的非天然氨基酸是视情况如本文中所提供或如各种公开案中所提供而合成,或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术,例如参看Fessendon和Fessendon,Organic Chemistry,(1982,第2版,Willard Grant Press,BostonMass.);March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York);以及Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry(第3版,A和B部分,1990,PlenumPress,New York)。描述非天然氨基酸合成的其它公开案包括(例如)标题为“In vivoincorporation of Unnatural Amino Acids”的WO2002/085923;Matsoukas等人,(1995)J. Med.Chem.,38,4660-4669;King,F.E.和Kidd,D.A.A.(1949)A New Synthesis ofGlutamine and ofγ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates,J.Chem. Soc,3315-3319;Friedman,O.M.和Chatterrji,R.(1959)Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81,3750-3752;Craig,J.C.等人,(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine).J.Org.Chem.53,1167-1170;Azoulay,M.,Vilmont,M.和Frappier,F.(1991)Glutamine analogues asPotential Antimalarials,.Eur.J.Med.Chem.26,201-5;Koskinen,A.M.P.和Rapoport,H.(1989)Synthesis of4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino AcidAnalogues.J.Org.Chem.54,1859-1866;Christie,B.D.和Rapoport,H.(1985)Synthesis ofOptically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org. Chem.50:1239-1246;Barton等人,(1987)Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids andDerivatives Using Radical Chemistry:Synthesis of L-and D-alpha-Amino-Adipic Acids,L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron43:4297-4308;以及Subasinghe等人,(1992)Quisqualic acid analogues:synthesis ofbeta-heterocyclic2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novelquisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35:4602-7。还参看标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US2004/0198637号,其是以引用的方式并入本文中。
A.羰基反应性基团
具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种通过亲核加成或醇醛缩合反应连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)的反应。
例示性含羰基的氨基酸可如下表示:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基;并且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团,并且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基并且R2为简单烷基(即,甲基、乙基或丙基),并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中,n为1,R1为苯基并且R2为简单烷基(即,甲基、乙基或丙基),并且酮部分位于相对于烷基侧链的间位。
对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang,Z.等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中,其是以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员可类似地制备其它含羰基的氨基酸。
在一些实施例中,以化学方式修饰包含非天然编码氨基酸的多肽以产生反应性羰基官能团。举例来说,可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于接合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时,例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其可正常存在,或可通过化学或酶促消化而暴露)在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如参看Gaertner等人,Bioconjug.Chem.3:262-268(1992);Geoghegan,K.和Stroh,J.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992);Gaertner等人,J.Biol.Chem.269:7224-7230(1994)。然而,所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白质的N末端氨基酸。
在本发明中,带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“经掩蔽”的醛官能团并入多肽中。举例来说,5-羟基赖氨酸带有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠,以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠,接着在黑暗环境中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号,其是以引用的方式并入本文中。
羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应,以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲(semicarbazone)键联。例如参看Jencks,W.P.,J.Am.Chem.Soc.81,475-481(1959);Shao,J.和Tam,J.P.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。此外,羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如参看Cornish,V.W.等人,J.Am.Chem.Soc.118:8150-8151(1996);Geoghegan,K.F.和Stroh,J.G.,Bioconjug.Chem.3:138-146(1992);Mahal,L.K.等人,Science276:1125-1128(1997)。
B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团
含有亲核基团(例如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。
例示性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下表示:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在;X为O、N或S或不存在;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
在一些实施例中,n为4,R1不存在并且X为N。在一些实施例中,n为2,R1不存在并且X不存在。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X为O,并且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。
含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可获自商业来源。举例来说,L-谷氨酸-γ-酰肼可获自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。无法购得的其它氨基酸可由所属领域的技术人员制备。例如参看美国专利第6,281,211号,其是以引用的方式并入本文中。
含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与多种含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的分子有效并选择性地反应。例如参看Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基以及N末端)相比,酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团的反应性显著更强。
C.含氨氧基的氨基酸
含有氨氧基(也被称作羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。如同肼、酰肼以及氨基脲一样,氨氧基的增强的亲核性使其与多种含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的分子有效并选择性地反应。例如参看Shao,J.和Tam,J.,J.Am.Chem.Soc.117:3893-3899(1995);H.Hang和C.Bertozzi,Acc.Chem.Res.34:727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果为相应腙,但氨氧基与含羰基的基团(例如酮)的反应通常产生肟。
例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;m为0-10;Y=C(O)或不存在;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X为O,m为1,并且Y存在。在一些实施例中,n为2,R1和X不存在,m为0,并且Y不存在。
含氨氧基的氨基酸可由可易于获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸以及苏氨酸)制备。例如参看M.Carrasco和R.Brown,J.Org.Chem.68:8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸(例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸)已从天然来源分离(Rosenthal,G.,Life Sci.60:1635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可由所属领域的技术人员来制备。
D.叠氮化物和炔反应性基团
叠氮化物和炔官能团的独特反应性使其极适用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物(尤其是脂肪族叠氮化物)以及炔通常对常见的反应性化学条件稳定。具体来说,叠氮化物与炔官能团都对天然存在多肽中可见的20种常见氨基酸的侧链(即,R基团)呈惰性。然而,当叠氮化物和炔基团靠近时,其“弹簧加压(spring-loaded)”性质显露,并且其通过休斯根[3+2]环加成反应选择性并有效地反应产生相应三唑。例如参看Chin J.等人,Science301:964-7(2003);Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003);Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)。
因为休斯根环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参看Padwa,A.,COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS,第4卷,(Trost,B.M.编,1991),第1069-1109页;Huisgen,R.,1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY,(Padwa,A.编,1984),第1-176页)而非亲核取代,所以并入带有含叠氮基和含炔的侧链的非天然编码氨基酸使得所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮基或含炔的IFNβ多肽的环加成反应可在室温下在水性条件下通过在催化量的用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂存在下添加Cu(II)(包括(但不限于)呈催化量的CuSO4的形式)来进行。例如参看Wang,Q.等人,J.Am.Chem.Soc.125,3192-3193(2003);Tornoe,C.W.等人,J.Org.Chem.67:3057-3064(2002);Rostovtsev等人,Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括但不限于)抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+、Co2+以及外加电位。
在一些需要叠氮化物与炔之间的休斯根[3+2]环加成反应的情况下,IFNβ多肽包含包括炔部分的非天然编码氨基酸并且欲与氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者,也可进行逆向反应(即,在氨基酸上具有叠氮部分并且在水溶性聚合物上存在炔部分)。
叠氮官能团也可与含有芳基酯并且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键联。芳基膦基团原位还原叠氮基,并且所得胺随后与最接近的酯键有效反应以产生相应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi,Science287,2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可为烷基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。
含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示:
其中X可为O、N、S或不存在,Ph为苯基,W为水溶性聚合物并且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN以及-NO2。R′、R″、R″′和R″″各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说,当本发明的化合物包括一个以上R基团时,各R基团是独立地经选择,而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时,这些基团同样是各自独立地经选择。当R′和R″与同一氮原子连接时,其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说,-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述,所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团,例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
叠氮官能团也可与含有硫酯并且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键联。芳基膦基团原位还原叠氮基,并且所得胺随后与硫酯键有效反应以产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示:
其中n为1-10;X可为O、N、S或不存在,Ph为苯基,且W为水溶性聚合物。
例示性含炔的氨基酸可如下表示:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;m为0-10,R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X不存在,m为0并且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X为O,m为1并且炔丙基氧基位于相对于烷基侧链的对位(即,O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中,n为1,R1和X不存在且m为0(即,炔丙基甘氨酸)。
含炔的氨基酸在市面上有售。举例来说,炔丙基甘氨酸可购自Peptech(Burlington,MA)。或者,可根据标准方法来制备含炔的氨基酸。举例来说,例如可如Deiters,A.等人,J.Am.Chem.Soc.125:11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙基氧基苯丙氨酸,并且可如Kayser,B.等人,Tetrahedron53(7):2475-2484(1997)中所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域的技术人员可制备其它含炔的氨基酸。
例示性含叠氮基的氨基酸可如下表示:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X不存在,m为0并且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中,n为0-4并且R1和X不存在,并且m=0。在一些实施例中,n为1,R1为苯基,X为O,m为2并且β叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。
含叠氮基的氨基酸可获自商业来源。举例来说,4-叠氮基苯丙氨酸可获自Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)。对于无法购得的含叠氮基的氨基酸,可相对容易地使用所属领域的技术人员已知的标准方法来制备叠氮基,所述方法包括(但不限于)通过置换合适的离去基(包括(但不限于)卤离子、甲磺酸根、甲苯磺酸根)或通过打开经适当保护的内酯。例如参看March,Advanced Organic Chemistry(第3版,1985,Wiley and Sons,New York)。
E.氨基硫醇反应性基团
β取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其极其适用于通过形成噻唑烷来选择性修饰含有醛基的多肽和其它生物分子。例如参看J.Shao和J.Tam,J.Am.Chem.Soc.1995,117(14)3893-3899。在一些实施例中,β取代的氨基硫醇氨基酸可并入IFNβ多肽中并且随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中,水溶性聚合物、药物接合物或其它有效负载可通过形成噻唑烷而与包含β取代的氨基硫醇氨基酸的IFNβ多肽偶合。
F.其它反应性基团
以下专利申请案中描述可并入本发明的IFNβ多肽中的其它反应性基团和非天然编码氨基酸(包括但不限于对氨基-苯丙氨酸),所述专利申请案都是以全文引用的方式并入本文中:美国专利公开案第2006/0194256号;美国专利公开案第2006/0217532号;美国专利公开案第2006/0217289号;美国临时专利第60/755,338号;美国临时专利第60/755,711号;美国临时专利第60/755,018号;国际专利申请案第PCT/US06/49397号;WO2006/069246;美国临时专利第60/743,041号;美国临时专利第60/743,040号;国际专利申请案第PCT/US06/47822号;美国临时专利第60/882,819号;美国临时专利第60/882,500号;和美国临时专利第60/870,594号。这些申请案还论述可存在于PEG或其它聚合物上的反应性基团,包括(但不限于)接合用羟胺基(氨氧基)。
非天然氨基酸的细胞摄取
细胞对非天然氨基酸的摄取为设计并选择(包括但不限于)用于并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说,α-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物不可能为细胞可渗透的。通过以蛋白质为基础的转运系统的集合将天然氨基酸吸收到真核细胞中。可进行快速筛选以评估哪些非天然氨基酸(如果存在)是由细胞吸收。例如参看例如标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第US2004/0198637号(其是以引用的方式并入本文中)以及Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Progress toward the evolutionof an organism with an expanded genetic code.PNAS United States96:4780-4785中的毒性测定。尽管通过各种测定可容易地分析摄取,但设计适用于细胞摄取途径的非天然氨基酸的替代方案为提供在活体内产生氨基酸的生物合成途径。
非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成途径已存在于细胞中以用于产生氨基酸和其它化合物。自然界(包括(但不限于)细胞)中可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法,但本发明提供所述方法。举例来说,视情况通过添加新酶或改变现有宿主细胞途径而在宿主细胞中产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新酶视情况为天然存在的酶或人工开发的酶。举例来说,对氨基苯丙氨酸的生物合成(如在标题为“In vivo incorporation of unnatural aminoacids”的WO2002/085923中的实例中所呈现)依赖来自其它生物体的已知酶的组合的加入。可通过利用包含这些酶的基因的质粒转化细胞而将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时,所述基因提供合成所需化合物的酶促途径。视情况添加的酶类型的实例提供于下文实例中。其它酶序列可见于(例如)Genbank中。人工开发的酶也视情况以相同方式添加到细胞中。以此方式操纵细胞的细胞机构和资源以产生非天然氨基酸。
多种方法可用于产生用于生物合成途径中或用于发展现有途径的新颖酶。举例来说,视情况使用包括(但不限于)如Maxygen,Inc.(可通过万维网在maxygen.com上获得)所开发的递归重组来开发新颖酶和途径。例如参看Stemmer(1994),Rapid evolution ofa protein in vitro by DNA shuffling,Nature 370(4):389-391;以及Stemmer,(1994),DNAshuffling by random fragmentation and reassembly:In vitro recombination for molecularevolution,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。类似地,视情况将Genencor(可通过万维网在genencor.com上获得)所开发的DesignPathTM用于代谢途径工程改造,包括(但不限于)工程改造在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的途径。这项技术使用新基因(包括但不限于)经由功能基因组学以及分子进化和设计所鉴别的基因)的组合在宿主生物体中重建现有途径。Diversa公司(可通过万维网在diversa.com上获得)还提供快速筛选基因文库和基因途径的技术,从而包括(但不限于)建立新途径。
通常,由本发明的工程改造过的生物合成途径产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量),但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度产生。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在利用包含用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞并产生非天然氨基酸后,视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。
具有非天然氨基酸的多肽
可出于多种目的进行非天然氨基酸的并入,所述目的包括(但不限于)调整蛋白质结构和/或功能的改变;改变尺寸、酸度、亲核性、氢键合、疏水性、蛋白酶标靶位点的可接近性;靶向部分(包括(但不限于),对于蛋白质阵列);添加生物活性分子;连接聚合物;连接放射性核素;调节血清半衰期;调节组织渗透(例如肿瘤);调节主动转运;调节组织、细胞或器官特异性或分布;调节免疫原性;调节蛋白酶抗性等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增强或甚至全新的催化或生物物合理质。举例来说,视情况通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改良以下性质:毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应的能力(包括(但不限于)共价或非共价)等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包括但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括但不限于抗体)以及(包括但不限于)蛋白质结构和功能的研究。例如参看Dougherty,(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure andFunction,Current Opinion in Chemical Biology,4:645-652。
在本发明的一方面,组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)非天然氨基酸的蛋白质。非天然氨基酸可相同或不同,包括(但不限于)在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同位点,其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同的非天然氨基酸。另一方面,组合物包括蛋白质中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说,非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)所述蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸,或可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定蛋白质来说,非天然氨基酸可相同、不同或为相同种类的多个非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。
所关注的具有至少一个非天然氨基酸的蛋白质或多肽为本发明的特征。本发明还包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可与蛋白质一起存在。
通过在真核细胞中利用至少一个非天然氨基酸来产生所关注蛋白质或多肽,蛋白质或多肽通常应包括真核生物翻译后修饰。在某些实施例中,蛋白质包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰,其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说,翻译后修饰包括(包括但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键联修饰、糖基化等。一方面,翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联使寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)与天冬酰胺连接。参看表1,其列出真核生物蛋白的N-连接寡糖的一些实例(也可存在其它未绘示的残基)。另一方面,翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键联或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。
表1:通过GlcNAc键联连接的寡糖的实例
另一方面,翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降血钙素前体、降血钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工,组装成多亚单位蛋白或大分子组装物,翻译到细胞中的另一位点中(包括(但不限于)翻译到例如内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中,或通过分泌途径)。在某些实施例中,蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。
非天然氨基酸的一个优点在于,其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核细胞或非真核细胞中活体内进行或在活体外进行。因此,在某些实施例中,翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说,翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及亲核与亲电子反应搭配物之间的共价键形成,包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下,选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可接近性决定。在本发明的蛋白质中,可在活体外以及活体内使用其它选择性更大的反应,例如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如参看Cornish等人,(1996)J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151;Mahal等人,(1997)Science,276:1125-1128;Wang等人,(2001)Science292:498-500;Chin等人,(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027;Chin等人,(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024;Wang等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.,100:56-61;Zhang等人,(2003)Biochemistry,42:6735-6746;以及Chin等人,(2003)Science,301:964-7,所述文献都是以引用的方式并入本文中。这允许用包括荧光团、交联剂、糖类衍生物以及细胞毒性分子的大量试剂选择性标记几乎任何蛋白质。还参看标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利第6,927,042号,其是以引用的方式并入本文中。包括(但不限于)通过叠氮基氨基酸进行的翻译后修饰也可通过施陶丁格连接反应(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。例如参看Kiick等人,(2002)Incorporation of azides intorecombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation,PNAS99:19-24。
本发明提供选择性修饰蛋白质的另一种极为有效的方法,其涉及回应选择密码子而将非天然氨基酸(包括(但不限于)含有叠氮基或炔基部分)遗传并入蛋白质中。然后,可通过包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成反应(例如参看Padwa,A.,Comprehensive Organic Synthesis,第4卷,(1991)Trost,B.M.编,Pergamon,Oxford,第1069-1109页;和Huisgen,R.,1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry,(1984)Padwa,A.编,Wiley,New York,第1-176页)分别用包括(但不限于)炔基或叠氮衍生物来修饰这些氨基酸侧链。因为此方法涉及环加成而非亲核取代,所以可以极高选择性修饰蛋白质。可在室温下在水性条件下通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐而以极佳区域选择性(1,4>1,5)进行此反应。例如参看Tornoe等人,(2002)J.Org.Chem.67:3057-3064;以及Rostovtsev等人,(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:2596-2599。可使用的另一方法为在双砷化合物上用四半胱氨酸基元进行配体交换,例如参看Griffin等人,(1998)Science281:269-272。
可通过[3+2]环加成而加成到本发明的蛋白质中的分子包括具有叠氮基或炔基衍生物的几乎任何分子。这些分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖类衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇的衍生物)、光交联剂、化学毒性化合物、亲和性标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可分别加成到具有炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。
V.包含非遗传编码氨基酸的IFNβ多肽的活体内产生
可使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明的IFNβ多肽,以添加无法在天然存在的系统中编码的氨基酸或用所述氨基酸取代。
例如,使用天然存在的系统中无法编码的氨基酸来产生tRNA和tRNA合成酶的方法是描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中,所述专利是以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统的内源性合成酶和tRNA起作用(且因此有时被称作“正交”)的翻译机构。通常,翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)以及正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常,O-RS在翻译系统中优先利用至少一种非天然存在氨基酸使O-tRNA氨酰化且O-tRNA识别至少一个不被系统中的其它tRNA识别的选择密码子。因此,翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入系统中所产生的蛋白质中,从而“取代”氨基酸使其进入编码多肽的某一位置中。
所属领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶,并且其通常适用于本发明中。举例来说,酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶是描述于Wang,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:56-61(2003)以及Zhang,Z.等人,Biochem.42(22):6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多核苷酸序列编码并且包括美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中所揭示的氨基酸序列,所述专利各以引用的方式并入本文中。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中,所述专利是以引用的方式并入本文中。O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于WO2005/007870、WO2005/007624和WO2005/019415中。
叠氮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin,J.W.等人,J,Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号(其以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO:46-48和61-64。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利第7,083,970号(其以引用的方式并入本文中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO:1-3。对特定非天然编码氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于美国专利第7,045,337号(其以引用的方式并入本文中)中。在酿酒酵母中并入含酮基与含叠氮基的氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin,J.W.等人,Science301:964-967(2003)中。
已报导若干种其它正交对。已描述用于将非天然氨基酸潜在地并入大肠杆菌中的来源于酿酒酵母tRNA和合成酶的谷氨酰胺酰基(例如参看Liu,D.R.和Schultz,P.G.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:4780-4785)、天冬氨酰基(例如参看Pastrnak,M.等人,(2000)Helv.Chim.Acta83:2277-2286)和酪氨酰基(例如参看Ohno,S.等人,(1998)J. Biochem.(Tokyo,Jpn.)124:1065-1068;以及Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.98:2268-2273)系统。已描述用于酿酒酵母的来源于大肠杆菌谷氨酰胺酰基(例如参看Kowal,A.K.等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:2268-2273)和酪氨酰基(例如参看Edwards,H.和Schimmel,P.(1990)Mol.Cell.Biol.10:1633-1641)合成酶的系统。大肠杆菌酪氨酰基系统已用于在哺乳动物细胞中活体内并入3-碘-L-酪氨酸。参看Sakamoto.K..等人,(2002)Nucleic Acids Res.30:4692-4699。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子,但通常希望选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说,例示性密码子包括无义密码子(例如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石))、四个或四个以上碱基的密码子以及很少使用或未使用过的其它天然三碱基密码子。
可使用所属领域中已知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特定的选择密码子引入IFNβ多核苷酸编码序列的适当位置中。
用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机构的组分(例如O-RS、O-tRNA以及正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang,L.等人,Science292:498-500(2001);Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027(2002);Zhang,Z.等人,Biochemistry42:6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利第7,045,337号中,所述专利是以引用的方式并入本文中。用于选择用于生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利第7,045,337号和美国专利第7,083,970号中,所述专利是以引用的方式并入本文中。标题为“Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins”的PCT公开案第WO04/035743号(其是以全文引用的方式并入本文中)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为“Expanding the Eukaryotic Genetic Code”的PCT公开案第WO04/094593号(其是以全文引用的方式并入本文中)描述在真核宿主细胞中并入非天然编码氨基酸的正交RS和tRNA对。
用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含:(a)自第一生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库,所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体,例如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌(T.thermophilus)等;或真核生物体;(b)在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛选)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员,从而提供活性(视情况突变)RS的池;和/或(c)在所述池中选择(视情况通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括(但不限于)突变RS),从而提供至少一种重组O-RS;其中所述至少一种重组O-RS利用非天然编码氨基酸优先使O-tRNA氨酰化。
在一个实施例中,RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变而产生。举例来说,可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变为不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生非活性RS。
可使用所属领域中已知的各种技术来产生突变RS的文库,所述技术包括(但不限于)以蛋白质三维RS结构为基础的合理设计或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说,可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、合理设计以及本文中所述或所属领域中已知的其它方法产生突变RS。
在一个实施例中,在RS(视情况突变RS)的文库中选择(和/或筛选)(包括(但不限于))在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的活性成员包括:将阳性选择或筛选标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(视情况突变)RS的文库引入多个细胞中,其中阳性选择和/或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀、赭石或蛋白石密码子);使所述多个细胞在存在选择剂的情况下生长;通过抑制阳性选择或筛选标记中的至少一个选择密码子来鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞,从而提供含有活性(视情况突变)RS的池的经阳性选择细胞的子集。视情况可改变选择剂和/或筛选剂浓度。
一方面,阳性选择标记为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因并且在CAT基因中,选择密码子为琥珀终止密码子。视情况,阳性选择标记为β-内酰胺酶基因且在β-内酰胺酶基因中,选择密码子为琥珀终止密码子。另一方面,阳性筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。
在一个实施例中,在池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(视情况突变体)包括:将阴性选择或筛选标记与来自阳性选择或筛选的活性(视情况突变)RS的池引入第二生物体的多个细胞中,其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因,其包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因);以及鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应、但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞,从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞。举例来说,CAT鉴别方案在适当O-RS重组体的确定中视情况充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说,视情况在存在或不存在一个或一个以上非天然编码氨基酸的情况下在含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆池。因此,认为仅在含有非天然编码氨基酸的平板上生长的菌落含有重组O-RS。一方面,改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中,第一生物体与第二生物体不同。因此,第一生物体和/或第二生物体视情况包含:原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌(archaebacterium)、真细菌(eubacterium)、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中,筛选标记包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记。
在另一实施例中,在池中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(视情况突变)RS包括:从阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的池;将阴性选择或筛选标记和活性(视情况突变)RS的池引入第二生物体的多个细胞中,其中阴性选择或筛选标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因,其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因);以及鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应、但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性筛选反应的细胞,从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞,其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。一方面,所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例视情况可包括所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子的情形,以及第一生物体与第二生物体不同(包括(但不限于)各生物体视情况为(包括但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外,一些方面包括阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记视情况包含荧光或发光筛选标记或基于亲和性的筛选标记的情形。在本文中的实施例中,筛选和/或选择视情况包括筛选和/或选择严格度的变化。
在一个实施例中,用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含:(d)分离所述至少一种重组O-RS;(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变体);以及(f)重复步骤(b)和(c),直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS。视情况,将步骤(d)-(f)重复(包括(但不限于))至少约两次。一方面,可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。
在上述方法中,选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c))的严格度视情况包括改变选择/筛选严格度。在另一实施例中,阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)包含使用报告基因,其中报告基因是通过荧光激活细胞分类(FACS)检测或其中报告基因是通过发光检测。报告基因视情况呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等且根据涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中,突变合成酶是呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等。
用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括:(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制银子tRNA)的突变tRNA文库;(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下由来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA,从而提供tRNA(视情况突变体)的池;以及(c)在所述tRNA(视情况突变体)池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员,从而提供至少一种重组O-tRNA;其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中,所述至少一种tRNA为抑制因子tRNA和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子,或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中,重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中,O-tRNA无需修饰而视情况从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中,第一生物体与第二生物体相同或不同并且视情况选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外,重组tRNA是由非天然编码氨基酸视情况氨酰基化,其中非天然编码氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操纵生物合成。视情况将非天然编码氨基酸添加到至少第一生物体或第二生物体的生长培养基中。
一方面,在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选通过氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(视情况突变)tRNA(步骤(b))包括:将毒性标记基因和(视情况突变)tRNA文库引入来自第二生物体的多个细胞中,其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(static agent)的基因或生物体必需的基因,其中所述标记基因包含至少一个选择密码子);以及选择存活细胞,其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变)tRNA的池。举例来说,可通过使用比较比率细胞密度测定来选择存活细胞。
另一方面,毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一个实施例中,毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因,其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因视情况可包括两个或两个以上琥珀密码子。
在一个实施例中,在(视情况突变)tRNA的池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括:将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(视情况突变)tRNA的池引入来自第二生物体的多个细胞中,其中阳性标记基因包含药物抗性基因(其包括(但不限于)β-内酰胺酶基因,其包含至少一个选择密码子,例如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因;以及鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)的情况下生长的存活或筛选细胞,从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞池,其中所述至少一种重组tRNA是通过O-RS氨酰基化且回应所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中,改变选择剂和/或筛选剂的浓度。
提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括:(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库;(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下通过来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变)tRNA,从而提供(视情况突变)tRNA池;(c)在(视情况突变)tRNA池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员,从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子并且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)由第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变)RS的文库;(e)在所述突变RS文库中选择或筛选在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员,从而提供活性(视情况突变)RS池;和(f)在所述池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(视情况突变)RS,从而提供至少一个特异性O-tRNA/O-RS对,其中所述至少一个特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说,特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对(例如mutRNATyr-SS12TyrRS对)、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外,所述方法包括第一与第三生物体相同(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。
本发明中还包括选择用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括:将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第一组细胞中;将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的复制细胞组中;以及选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞,其中第一组与复制细胞组是在存在选择剂或筛选剂的情况下生长,其中存活或筛选细胞包含用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中,比较和选择或筛选包括活体内互补测定。可改变选择剂或筛选剂的浓度。
本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说,本发明方法的第一生物体与第二生物体可能相同或不同。在一个实施例中,生物体视情况为原核生物体,包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者,生物体视情况包含真核生物体,包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物,例如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中,第二生物体为原核生物体,包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者,第二生物体可为真核生物体,包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各个实施例中,第一生物体与第二生物体不同。
VI.非天然存在氨基酸在IFNβ多肽中的位置
本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入IFNβ多肽中。可将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入特定位置处而不破坏多肽活性。这可通过进行“保守”取代来实现,所述取代包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、用庞大氨基酸取代庞大氨基酸、用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或在活性不需要的位置中插入非天然存在氨基酸。
可使用多种生物化学和结构方法来选择IFNβ多肽内供非天然编码氨基酸取代的所需位点。所属领域的技术人员显而易见,多肽链的任何位置都适于选择以并入非天然编码氨基酸,并且选择可基于合理设计或通过随机选择来进行以实现任何目的或无特定需要的目的。所需位点的选择可用于产生具有任何所需性质或活性的IFNβ分子(包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂)、二聚物或多聚物形成、与天然分子相比不改变活性或性质,或操纵多肽的任何物理或化学性质(例如溶解性、聚集或稳定性)。举例来说,可使用所属领域中已知的点突变分析、丙氨酸扫描、饱和诱变和生物活性筛选或同源物扫描方法来鉴别肽中为IFNβ多肽的生物活性所需的位置。可使用其它方法鉴别用于IFNβ多肽的修饰的残基,包括(但不限于)序列信息分析(sequence profiling)(Bowie和Eisenberg,Science253(5016):164-70,(1991))、旋转异构体文库选择(Dahiyat和Mayo,Protein Sci5(5):895-903(1996);Dahiyat和Mayo,Science278(5335):82-7(1997);Desjarlais和Handel,Protein Science4:2006-2018(1995);Harbury等人,PNAS USA92(18):8408-8412(1995);Kono等人,Proteins:Structure,Function and Genetics19:244-255(1994);Hellinga和Richards,PNASUSA91:5803-5807(1994));和残基对势(residue pair potential)(Jones,Protein Science3:567-574,(1994))以及使用Protein Design技术合理设计。(参看美国专利第6,188,965号、第6,269,312号、第6,403,312号、WO98/47089,其以引用的方式并入本文中)。对IFNβ生物活性至关重要的残基、与医药稳定性有关的残基、抗体抗原决定基或受体结合残基可发生突变。美国专利第5,580,723号、第5,834,250号、第6,013,478号、第6,428,954号和第6,451,561号(其是以引用的方式并入本文中)描述通过用标靶物质鉴别影响多肽活性的活性域来系统分析多肽(诸如IFNβ)的结构和功能的方法。Runkel等人,Biochemistry(2000)39:2538-2551和Journal of Interferon and CytokineResearch(2001)21:931-941描述人类IFNβ1a的突变和单克隆抗体分析以鉴别涉及受体结合和生物活性的区。描述IFNβ突变体的克隆、表达、纯化、BIAcore分析和利用抗病毒和抗增殖测定进行的评估。Basu等人,Bioconjugate Chem(2006)17:618-630描述IFNβ的定点诱变和与PEG聚合物形成的不同接合物。除通过丙氨酸或同源物扫描诱变被鉴别为对生物活性至关重要的残基之外的残基可视多肽所追求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。或者,经鉴别为对生物活性至关重要的位点也可视多肽所追求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。另一替代方法将为在多肽链上的各个位置中利用非天然编码氨基酸简单地进行连续取代并且观察对多肽活性的影响。所属领域的技术人员显而易见,在任何多肽中选择供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。
也可检查含有缺失的IFNβ多肽的突变体的结构和活性以确定可能允许用非天然编码氨基酸进行取代的蛋白质区。可以类似方式使用蛋白酶消化和单克隆抗体来鉴别负责结合IFN受体的IFNβ区。在排除可能不允许经非天然编码氨基酸取代的残基后,可研究所提出的取代在各剩余位置处的影响。可根据其它IFN家族成员和IFN受体的三维晶体结构产生模型。蛋白质数据库(Protein Data Bank;PDB,通过万维网在rcsb.org上获得)是含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的集中数据库。如果无法获得三维结构数据,那么可建立模型来研究多肽的二级和三级结构。因此,所属领域的技术人员可容易地鉴别可经非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。
在一些实施例中,本发明的IFNβ多肽包含位于不破坏多肽的结构的蛋白质区中的一个或一个以上非天然存在氨基酸。
并入非天然编码氨基酸的例示性残基可能为潜在受体结合区中不包括的残基,可能完全或部分暴露在溶剂中,与附近残基具有最小或无氢键合相互作用,可能最低程度地受到附近的反应性残基影响,可能位于一个或一个以上暴露面上,可能为一个或一个以上与第二IFNβ或其它分子或其片段并列的位点,可能处于如根据与受体结合或未结合或者与另一生物活性分子偶合或未偶合的IFNβ的三维、二级、三级或四级结构所预测的高度可挠性或结构呈刚性的区中,或可能通过按需要改变完整结构的可挠性或刚性来调节IFNβ本身或包含一个或一个以上IFNβ的二聚物或多聚物的构象。
所属领域的技术人员认识到,这种对IFNβ的分析使得能够确定哪些氨基酸残基相比于隐藏在蛋白质三级结构内的氨基酸残基来说是表面暴露的。因此,用非天然编码氨基酸取代作为表面暴露残基的氨基酸是本发明的一个实施例。
在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置中:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入对应于干扰素β中的如下二级结构的一个或一个以上以下区中的任何位置处:SEQ ID NO:1的螺旋A(2-22)、螺旋B(51-71)、螺旋C(80-107)、螺旋D(118-136)、螺旋E(139-162)、AB环:AB1(23-35)、AB2(36-40)、AB3(41-50)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中,非天然编码氨基酸在选自由干扰素β的残基25-35、80-100和121-135(SEQID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。在其它实施例中,非天然编码氨基酸在选自由SEQ ID NO:1的干扰素β的残基41-49或在SEQID NO:3、4中的相应氨基酸组成的群组的位置处经取代。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的28、36、76、80、107、108、111和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的15、42、80、108、111、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,本发明的多肽包含一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽包含SEQ ID NO:1的C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,本发明的多肽包含C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)和一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在SEQ ID NO:4的信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在SEQ ID NO:4的信号序列中包含一个或一个以上天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,一个或一个以上非天然氨基酸并入SEQ ID NO:4的前导序列或信号序列或其它IFNβ序列中。
关于IFNβ或IFN家族成员的晶体结构以及其与IFN受体的相互作用的研究可指示哪些特定氨基酸残基具有可完全或部分接近溶剂的侧链。这些位置处的非天然编码氨基酸侧链可远离蛋白质表面并进入溶剂中。
在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸或在另一IFNβ序列中的相应氨基酸)。
在一些实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):SEQ ID NO:1的螺旋A(2-22)、螺旋B(51-71)、螺旋C(80-107)、螺旋D(118-136)、螺旋E(139-162)、AB环:AB1(23-35)、AB2(36-40)、AB3(41-50)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):干扰素β的残基25-35、80-100和121-135(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在其它实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):SEQ ID NO:1的干扰素β的残基41-49或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的28、36、76、80、107、108、111和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的15、42、80、108、111、155或其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,信号序列或前导序列中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接(SEQ ID NO:4或其它IFNβ序列)。
可用多种非天然编码氨基酸取代IFNβ多肽中的给定位置,或可将多种非天然编码氨基酸并入IFNβ多肽中的给定位置中。一般来说,根据对IFNβ多肽或其它IFN家族成员与其受体的三维晶体结构的研究来选择供并入的特定非天然编码氨基酸,其中优选保守取代(即,用基于芳基的非天然编码氨基酸(例如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)取代Phe、Tyr或Trp)以及希望引入IFNβ多肽中的特异性接合化学(例如,如果需要利用具有炔部分的水溶性聚合物来实现休根斯[3+2]环加成,或需要利用具有芳基酯(其又并入膦部分)的水溶性聚合物来形成酰胺键,那么引入4-叠氮基苯丙氨酸)。
在一个实施例中,所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白质中,其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团;以及使蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、放射性核素、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分、光化辐射可激发的部分、可光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子、量子点、纳米传递素、放射性核苷酸、放射性传递素、中子俘获剂或上述物质的任何组合,或任何其它所需化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以使分子通过[3+2]环加成与非天然氨基酸连接。在一个实施例中,第一反应性基团为炔基或叠氮部分,并且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说,第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中)并且第二反应性基团为叠氮部分。在另一实例中,第一反应性基团为叠氮部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)并且第二反应性基团为炔基部分。
在一些情况下,将非天然编码氨基酸取代与IFNβ多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响IFNβ多肽的其它生物特性。在一些情况下,其它添加、取代或缺失可增加IFNβ多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加IFNβ多肽对其受体的亲和性。在一些情况下,其它添加、取代或缺失可增加IFNβ多肽的医药稳定性。在一些情况下,其它添加、取代或缺失可增强IFNβ多肽的抗病毒活性。在一些情况下,其它添加、取代或缺失可增加IFNβ多肽的溶解性(包括(但不限于)在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中,添加、取代或缺失可增加在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达之后的IFNβ多肽溶解性。在一些实施例中,除并入非天然氨基酸的位点外还选择另一位点以供天然编码或非天然氨基酸取代,这使得在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后多肽溶解性增加。在一些实施例中,IFNβ多肽包含另一添加、取代或缺失,其调节对IFNβ多肽受体、结合蛋白或缔合配体的亲和性,调节与IFNβ受体结合后的信号转导,调节循环半衰期,调节释放或生物可用性,促进纯化或改良或改变特定投药途径。在一些实施例中,IFNβ多肽包含增加IFNβ变异体对其受体的亲和性的添加、取代或缺失。类似地,IFNβ多肽可包含改良多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、IFNβ尺寸减小或其它特性的化学或酶裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或连接分子(包括(但不限于)生物素)。
在一些实施例中,非天然编码氨基酸的取代产生IFNβ拮抗剂。在一些实施例中,在与受体结合有关的区中取代或添加非天然编码氨基酸。在一些实施例中,IFNβ拮抗剂包含至少一个使IFNβ充当拮抗剂的取代。在一些实施例中,IFNβ拮抗剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸,其存在于IFNβ分子的受体结合区中。
在一些情况下,用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上氨基酸。在一些情况下,IFNβ多肽进一步包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上用一个或一个以上非天然编码氨基酸对天然存在氨基酸的取代。举例来说,在一些实施例中,用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代IFNβ中的一个或一个以上残基。在一些情况下,将一个或一个以上非天然编码残基与一个或一个以上较低分子量的线性或分枝PEG连接,从而相对于与单一较高分子量PEG连接的物质增强结合亲和性并且具有相当的血清半衰期。
在一些实施例中,IFNβ的以下残基中至多有两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代。
VII.非真核细胞和真核细胞中的表达
为获得克隆IFNβ多核苷酸的高水平表达,通常将编码本发明的IFNβ多肽的多核苷酸亚克隆到含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(如果就编码蛋白质的核酸来说)供翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。所属领域的技术人员已知合适的细菌启动子,并且其例如描述于Sambrook等人以及Ausubel等人中。
用于表达本发明的IFNβ多肽的细菌表达系统可在(包括但不限于)大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和沙门氏菌(Salmonella)中获得(Palva等人,Gene22:229-235(1983);Mosbach等人,Nature302:543-545(1983))。用于这些表达系统的试剂盒在市面上有售。所属领域的技术人员已知哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统,并且其也在市面上有售。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上述)来表达本发明的IFNβ多肽的情况下,用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力进行选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(Gram-positive bacteria)(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(B.brevis)、枯草杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌),以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述,可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面,组合物视情况包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上包含非天然氨基酸的蛋白质,或可通过活体内蛋白质制备方法所实现的量的所述蛋白质(关于重组蛋白制备和纯化的细节提供于本文中)。另一方面,所述蛋白质视情况以在(包括但不限于)细胞溶菌液、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括但不限于体积(包括但不限于)约为约1nl到约100L或100L以上)中(包括但不限于)每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质或每升至少10毫克或10毫克以上蛋白质的浓度存在于组合物中。在真核细胞中产生大量(包括但不限于大于用其它方法(包括但不限于活体外翻译)通常可能获得的量)包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质是本发明的特征。
本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说,可在细胞提取物、细胞溶菌液、培养基、缓冲液等中产生蛋白质浓度为(包括但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的包含非天然氨基酸的蛋白质。
多种适于表达IFNβ的载体都可购得。有效用于真核生物宿主的表达载体包括(但不限于)包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒以及细胞肥大病毒的表达控制序列的载体。这些载体包括pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen,Carlsbad,Calif,USA)和pCI-neo(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)。可使用细菌质粒,例如来自大肠杆菌的质粒(包括pBR322、pET3a和pET12a)、较宽宿主范围质粒(例如RP4);噬菌体DNA,例如噬菌体λ(例如NM989)和其它DNA噬菌体(例如M13和丝状单链DNA噬菌体)的多种衍生物。2μ质粒和其衍生物、POT1载体(美国专利第4,931,373号,其以引用的方式并入本文中)、(Okkels,Ann.New York Aced.Sci.782,202207,1996)中描述的pJS037载体以及pPICZ A、B或C(Invitrogen)可与酵母宿主细胞一起使用。对于昆虫细胞,载体包括(但不限于)pVL941、pBG311(Cate等人,″Isolation of the Bovine and HumanGenes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In AnimalCells″,Cell,45,第68598页(1986))、pBluebac4.5以及pMelbac(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
编码IFNB多肽的核苷酸序列还可包括或可不包括编码信号肽的序列。当多肽是由表达所述多肽的细胞分泌时,存在信号肽。这种信号肽可为任何序列。信号肽可为原核生物信号肽或真核生物信号肽。Coloma,M(1992)J.Imm.Methods152:89104)描述用于哺乳动物细胞中的信号肽(鼠类Igκ轻链信号肽)。其它信号肽包括(但不限于)来自酿酒酵母的α-因子信号肽(美国专利第4,870,008号,其以引用的方式并入本文中)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(O.Hagenbuchle等人,Nature289,1981,第643-646页)、经修饰的羧基肽酶信号肽(L.A.Vails等人,Cell48,1987,第887-897页)、酵母BAR1信号肽(WO87/02670,其以引用的方式并入本文中)以及酵母天冬胺酸蛋白酶3(yeast asparticprotease3,YAP3)信号肽(参看M.Egel-Mitani等人,Yeast6,1990,第127-137页)。
所属领域的技术人员已知合适哺乳动物宿主细胞的实例。这些宿主细胞可为中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞(例如CHO-K1;ATCC-CCL-61)、绿猴细胞(Green Monkey cell,COS)(例如COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCCCRL-1651))、小鼠细胞(例如NS/O)、幼仓鼠肾(Baby Hamster Kidney,BHK)细胞系(例如(ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人类细胞(例如HEK293(ATCC CRL-1573))以及组织培养中的植物细胞。这些细胞系和其它细胞系可自例如美国典型微生物菌种保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Md)等公共寄存场所获得。为提供IFNβ多肽的改进的糖基化,可修饰哺乳动物宿主细胞以表达唾液酸转移酶,举例来说,如(例如)美国专利第5,047,335号中所述的1,6-唾液酸转移酶,所述专利以引用的方式并入本文中。
将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞中的方法包括(但不限于)磷酸钙介导的转染、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体以及Life TechnologiesLtd,Paisley,UK中所述的使用Lipofectamine2000的转染方法和Roche DiagnosticsCorporation,Indianapolis,USA中所述的使用FuGENE6的转染方法。这些方法在所属领域中为众所周知的且由Ausbel等人(编),1996,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,USA描述。哺乳动物细胞的培养可根据(例如)如(AnimalCell Biotechnology,Methods and Protocols,Nigel Jenkins编,1999,Human Press Inc.Totowa,N.J.,USA;以及Harrison Mass.和Rae IF,General Techniques of Cell Culture,Cambridge University Press1997)中所揭示的确定方法来进行。
I.表达系统、培养和分离
IFNβ多肽可在任何数目的合适表达系统(例如包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。例示性表达系统的描述提供于下文中。
酵母如本文中所用,术语“酵母”包括能够表达编码IFNβ多肽的基因的各种酵母中的任一种。所述酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous)和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科:蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科,即裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如,裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属)、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、脂酵母亚科(Lipomycoideae)以及酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如,毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属和酵母菌(Saccharomyces)属)。担孢子酵母包括白冬孢酵母(Leucosporidium)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、锁掷酵母(Sporidiobolus)属、线黑粉酵母(Filobasidium)属和香灰拟锁担菌(Filobasidiella)属。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科:掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如,掷孢酵母(Sporoholomyces)属和布勒掷孢酵母(Bullera)属)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如,假丝酵母(Candida)属)。
尤其受关注的供本发明使用的物种为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种,其包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白假丝酵母菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。
适用于表达IFNβ多肽的酵母的选择是在所属领域的技术人员的技能范围内。在选择用于表达的酵母宿主时,合适的宿主可包括显示具有(例如)良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白质产生以及总体坚固性的酵母宿主。酵母通常可获自多种来源,包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(Yeast Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics,University of California,Berkeley,CA)和美国典型菌种保藏中心(American Type CultureCollection,“ATCC”)(Manassas,VA)。
术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的酵母。所述术语包括已接受重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解,由于偶发突变或故意突变,单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全一致。与将要以相关性质(例如存在编码IFNβ多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
已开发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以将其转化到多种酵母宿主中。举例来说,已开发用于以下各酵母的表达载体:酿酒酵母(Sikorski等人,GENETICS(1989)122:19;Ito等人,J.BACTERIOL.(1983)153:163;Hinnen等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)75:1929);白假丝酵母菌(Kurtz等人,MOL.CELL.BIOL.(1986)6:142);麦芽糖假丝酵母(Kunze等人,J.BASIC MICROBIOL.(1985)25:141);汉森酵母(Gleeson等人,J.GEN.MICROBIOL.(1986)132:3459;Roggenkamp等人,MOL.GENETICS AND GENOMICS(1986)202:302);脆壁克鲁维酵母(Das等人,J.BACTERIOL.(1984)158:1165);乳酸克鲁维酵母(De Louvencourt等人,J.BACTERIOL.(1983)154:737;Van denBerg等人,BIOTECHNOLOGY(NY)(1990)8:135);谷勒氏酵母(Kunze等人,J.BASICMICROBIOL.(1985)25:141);巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号;第4,929,555号;和第4,837,148号;Cregg等人,MOL.CELL.BIOL.(1985)5:3376);粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach等人,NATURE(1982)300:706);以及解脂耶氏酵母(Y.lipolytica);构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人,BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.(1983)112:284-89;Tilburn等人,GENE(1983)26:205-221;和Yelton等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81:1470-74);黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes,EMBO J.(1985)4:475-479);里氏木霉(T.reesia)(EP0244234);和丝状真菌,例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO91/00357),其中各文献是以引用的方式并入本文中。
所属领域的技术人员已知用于酵母载体的控制序列,并且所述序列包括(但不限于)来自以下基因的启动子区:例如,醇脱氢酶(ADH)(EP0284044);烯醇酶;葡萄糖激酶;葡萄糖-6-磷酸异构酶;甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH);己糖激酶;磷酸果糖激酶;3-磷酸甘油酸变位酶;和丙酮酸激酶(PyK)(EP0329203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供适用的启动子序列(Miyanohara等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80:1)。用于酵母宿主的其它合适的启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人,J.BIOL.CHEM.(1980)255:12073)和其它糖解酶(例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(Holland等人,BIOCHEMISTRY(1978)17:4900;Hess等人,J.ADV.ENZYME REG.(1969)7:149))的启动子。具有由生长条件控制的转录的其它优点的可诱导酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP0073657中。
酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外,合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说,酵母启动子的上游活化序列(UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区连接,从而产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区连接的ADH调节序列。参看美国专利第4,880,734号和第4,876,197号,其是以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调节序列连接糖解酶基因(例如GAP或PyK)的转录活化区所组成的启动子。参看EP0164556。此外,酵母启动子可包括具有与酵母RNA聚合酶结合并起始转录的能力的非酵母来源的天然存在启动子。
可构成酵母表达载体的一部分的其它控制元件包括(例如)来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(Holland等人,J.BIOL.CHEM.(1981)256:1385)。另外,来自2μ质粒来源的复制起点适用于酵母。适用于酵母的选择基因为酵母质粒中存在的trp1基因。参看Tschumper等人,GENE(1980)10:157;Kingsman等人,GENE(1979)7:141。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变菌株提供选择标记。类似地,由带有Leu2基因的已知质粒补充Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)。
所属领域的技术人员已知将外源DNA引入酵母宿主中的方法,并且所述方法通常包括(但不限于)转化原生质球状体或经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说,可根据Hsiao等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76:3829和Van Solingen等人,J.BACT.(1977)130:946中所述的方法来进行酵母的转化。然而,也可如Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:A LAB.MANUAL(2001)中通常所述来使用将DNA引入细胞中的其它方法(例如通过核注射、电穿孔或原生质体融合)。随后,可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。
所属领域的技术人员已知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法。通常参看美国专利公开案第20020055169号;美国专利第6,361,969号;第6,312,923号;第6,183,985号;第6,083,723号;第6,017,731号;第5,674,706号;第5,629,203号;第5,602,034号;和第5,089,398号;美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号;PCT公开专利申请案WO99/07862;WO98/37208;和WO98/26080;欧洲专利申请案EP0946736;EP0732403;EP0480480;WO90/10277;EP0340986;EP0329203;EP0324274;和EP0164556。还参看Gellissen等人,ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62(l-2):79-93;Romanos等人,YEAST(1992)8(6):423-488;Goeddel,METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185:3-7,其各自以引用的方式并入本文中。
在使用所属领域的技术人员已知的标准进料分批发酵方法进行的扩增阶段期间,可使酵母宿主菌株在发酵罐中生长。所述发酵方法可适用于解释特定酵母宿主的碳利用途径或表达控制模式的差异。举例来说,酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复杂氮源(例如,酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相反,甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料,但仅需要简单铵(氮)盐以进行最佳生长和表达。例如参看美国专利第5,324,639号;Elliott等人,J.PROTEIN CHEM.(1990)9:95;和Fieschko等人,BIOTECH.BIOENG.(1987)29:1113,其是以引用的方式并入本文中。
然而,所述发酵方法可具有与所用的酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说,在扩增阶段期间,可将限制生长的营养素(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外,发酵方法通常使用经设计成含有适量碳、氮、基本盐、磷和其它微量营养素(维生素、痕量矿物和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中,其是以引用的方式并入本文中。
感染杆状病毒的昆虫细胞术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解,由于偶发突变或故意突变,单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。与将要以相关性质(例如存在编码IFNβ多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。美国专利第7,144,574号(其以引用的方式并入本文中)描述IFNβ多肽的杆状病毒表达。
所属领域的技术人员已知适用于表达IFNβ多肽的昆虫细胞的选择。多种昆虫物种在所属领域中得到充分描述并且在市面上有售,其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主时,合适的宿主可包括显示具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫通常可获自多种来源,包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(Berkeley,CA);和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。
通常,感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括:转移载体(通常为细菌质粒),其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达的异源基因的便利限制位点;野生型杆状病毒,其具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列(这允许将异源基因同源重组到杆状病毒基因组中);以及适当的昆虫宿主细胞和生长培养基。所属领域中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术并且可使用描述这些技术的手册。
在将异源基因插入转移载体中之后,将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中,其中载体与病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒,并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)。所属领域的技术人员通常已知这些技术,并且所述技术全面描述于SUMMERS AND SMITH,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN,第1555期,(1987)中,其是以引用的方式并入本文中。还参看RICHARDSON,39METHODS INMOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995);Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY16.9-16.11(1994);King和Possee,THEBACULOVIRUS SYSTEM:A LABORATORY GUIDE(1992);以及O′Reilly等人,BACULOVIRUSEXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)。
实际上,所属领域的技术人员已知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质。例如参看美国专利第6,368,825号;第6,342,216号;第6,338,846号;第6,261,805号;第6,245,528号;第6,225,060号;第6,183,987号;第6,168,932号;第6,126,944号;第6,096,304号;第6,013,433号;第5,965,393号;第5,939,285号;第5,891,676号;第5,871,986号;第5,861,279号;第5,858,368号;第5,843,733号;第5,762,939号;第5,753,220号;第5,605,827号;第5,583,023号;第5,571,709号;第5,516,657号;第5,290,686号;WO02/06305;WO01/90390;WO01/27301;WO01/05956;WO00/55345;WO00/20032;WO99/51721;WO99/45130;WO99/31257;WO99/10515;WO99/09193;WO97/26332;WO96/29400;WO96/25496;WO96/06161;WO95/20672;WO93/03173;WO92/16619;WO92/02628;WO92/01801;WO90/14428;WO90/10078;WO90/02566;WO90/02186;WO90/01556;WO89/01038;WO89/01037;WO88/07082,其是以引用的方式并入本文中。
所属领域中已知适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的载体,并且所述载体例如包括从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体,其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。从此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。通常参看O′Reilly等人,BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)。
在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前,通常将包含启动子、前导序列(必要时)、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组分组装到中间错位构筑体(intermediatetransplacement construct)(转移载体)中。中间错位构筑体通常保持在能够稳定保持在宿主(例如细菌)中的复制子(例如染色体外元件(例如,质粒))中。复制子将具有复制系统,因此使其保持在适用于克隆和扩增的宿主中。更具体来说,质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller,ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42:177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨比西林(ampicillin)抗性(amp)基因和复制起点。
一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经对所属领域的技术人员已知的多种其它载体进行设计,所述载体包括(例如)pVL985,其将多角体蛋白起始密码子从ATG改变为ATT,并且其在ATT下游32个碱基对处引入BamHI克隆位点。参看Luckow和Summers,VIROLOGY170:31(1989)。其它市售载体例如包括PBlueBac4.5/V5-His;pBlueBacHis2;pMelBac;pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)。
在插入异源基因之后,将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。所属领域中已知将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的方法。参看Summers和Smith,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN,第1555期,(1987);Smith等人,MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156;Luckow和Summers,VIROLOGY(1989)170:31。举例来说,可通过同源双交叉重组插入例如多角体蛋白基因等基因中;也可插入所需杆状病毒基因中工程改造过的限制酶位点中。参看Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91。
可通过电穿孔来实现转染。参看TROTTER和WOOD,39METHODS IN MOLECULARBIOLOGY(1995);MANN和KING,J.GEN.VIROL.(1989)70:3501。或者,可使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如参看Liebman等人,BIOTECHMQUES(1999)26(1):36;Graves等人,BIOCHEMISTRY(1998)37:6050;Nomura等人,J.BIOL.CHEM.(1998)273(22):13570;Schmidt等人,PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12:323;Siffert等人,NATURE GENETICS(1998)18:45;Tilkins等人,CELL BIOLOGY:A LABORATORYHANDBOOK145-154(1998);Cai等人,PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10:263;Dolphin等人,NATURE GENETICS(1997)17:491;Kost等人,GENE(1997)190:139;Jakobsson等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271:22203;Rowles等人,J.BIOL.CHEM.(L996)271(37):223/6;Reverey等人,J.BIOL.CHEM.(1996)271(39):23607-10;Stanley等人,J.BIOL.CHEM.(1995)270:4121;Sisk等人,J.VIROL.(1994)68(2):766;以及Peng等人,BIOTECHNIQUES(1993)14(2):274。市售脂质体例如包括和(Invitrogen,Corp.,Carlsbad,CA)。另外,也可使用磷酸钙转染。参看Trotter和Wood,39METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995);KITTS,NAR(1990)18(19):5667;以及Mann和King,J.GEN.VIROL.(1989)70:3501。
杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够与杆状病毒RNA聚合酶结合并起始编码序列(例如,结构基因)下游(3′)转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5′端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有被称作增强子的第二域,当存在所述域时,其通常在结构基因的末梢。此外,表达可经调节或为组成性的。
在感染周期的末期大量转录的结构基因提供尤其适用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多面体蛋白的基因(Friesen等人,The Regulation of Baculovirus Gene Expression,THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986);EP0127839和0155476)和编码p10蛋白的基因(Vlak等人,J.GEN.VIROL.(1988)69:765)的序列。
将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中并且随后可通过所属领域的技术人员已知的技术来纯化所生长斑块。参看Miller等人,BIOESSAYS(1989)11(4):91;SUMMERS和Smith,TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN,第1555期,(1987)。
已开发用于感染到多种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说,已开发用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看Wright,NATURE(1986)321:718;Carbonell等人,J.VIROL(1985)56:153;Smith等人,MOL.CELL.BIOL.(1983)3:2156。通常参看Fraser等人,IN VITRO CELL.DEV.BIOL.(1989)25:225。更具体来说,用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(Invitrogen Corp.,目录号11497-013(Carlsbad,CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-FiveTM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。
用于异源多肽在杆状病毒/表达载体中的直接表达和融合表达的细胞和培养基在市面上有售,并且所属领域的技术人员通常已知细胞培养技术。
大肠杆菌、假单胞菌种和其它原核生物 所属领域的技术人员已知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或低或高的多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的丰富文献、多种载体的商业可得性以及甚至描述载体和其限制酶图谱以及特征的手册,在本文中无需广泛讨论。众所周知,载体通常涉及允许选择的标记,这些标记可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记,其提供不同特征。
细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3′)转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5′端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有被称作操纵基因的第二域,其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许阴性调节(可诱导)转录,这是因为基因抑制蛋白可结合操纵基因并从而抑制特定基因的转录。在不存在阴性调节元件(例如操纵基因)的情况下可发生组成性表达。另外,可通过基因活化蛋白结合序列实现阳性调节,当存在所述结合序列时,所述序列通常最接近RNA聚合酶结合序列的(5′)。基因活化蛋白的实例为代谢产物活化蛋白(CAP),其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人,ANNU.REV.GENET.(1984)18:173]。因此,经调节的表达可为阳性或阴性,从而增强或减弱转录。
编码代谢途径酶的序列提供尤其适用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(例如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人,NATURE(1977)198:1056]以及麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(例如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddel等人,Nuc.Acids Res.(1980)8:4057;Yelverton等人,NUCL.ACIDS RES.(1981)9:731;美国专利第4,738,921号;欧洲公开案第036776号以及第121775号,其是以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)“The cloning of interferon andother mistakes.”Interferon3(I.Gresser编)]、噬菌体λPL[Shimatake等人,NATURE(1981)292:128]以及T5[美国专利第4,689,406号,其是以引用的方式并入本文中]启动子系统还提供适用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(例如T7启动子)来诱导高含量的IFNβ多肽。所属领域的技术人员已知这些载体的实例,并且其包括来自Novagen的pET29系列以及WO99/05297(其是以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的IFNβ多肽,而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。pET19(Novagen)是所属领域中已知的另一种载体。
另外,在自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说,可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接,从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号,其是以引用的方式并入本文中]。举例来说,tac启动子是包含trp启动子与lac操纵子序列的杂合trp-lac启动子,其由lac阻遏物调节[Amann等人,GENE(1983)25:167;de Boer等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80:21]。此外,细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子,其具有与细菌RNA聚合酶结合并起始转录的能力。也可将非细菌来源的天然存在启动子与可相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统是偶合启动子系统的实例[Studier等人,J.MOL.BIOL.(1986)189:113;Tabor等人,PROCNATL.ACAD.SCI.(1985)82:1074]。另外,杂合启动子也可包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区(欧洲公开案第267851号)。
除功能启动子序列之外,有效核糖体结合位点也适用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中,核糖体结合位点被称作Shine-Dalgarno(SD)序列并包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人,Nature(1975)254:34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人,″Genetic signals and nucleotidesequences in messenger RNA″,Biological Regulation and Development:Gene Expression(Ed.R.F.Goldberger,1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人,″Expression of cloned genes in Escherichia coli″,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,1989]。
术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解,由于偶发突变或故意突变,单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。与将要以相关性质(例如存在编码IFNβ多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。
所属领域的技术人员已知适用于表达IFNβ多肽的宿主细菌的选择。在选择用于表达的细菌宿主时,合适的宿主可包括显示具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性以及总体稳固性的宿主。细菌宿主通常可获自多种来源,包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(Berkeley,CA);以及美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas,VA)。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株的细菌(例如W3110)或来源于B菌株的细菌(例如BL21)。这些菌株因其生长参数为人熟知且稳定而特别适用。另外,这些菌株为非病原性的,出于安全性和环境原因,其在商业上较为重要。合适的大肠杆菌宿主的其它实例包括(但不限于)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本发明方法的另一实施例中,大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株,其包括(但不限于)OMP-和LON-。宿主细胞株可为假单胞菌种,包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌。已知荧光假单胞菌生物型1(命名为菌株MB101)适用于重组制备且可用于治疗性蛋白质的制备过程。假单胞菌表达系统的实例包括可以宿主菌株形式获自Dow Chemical Company的系统(Midland,MI,可通过万维网在dow.com上获得)。
在形成重组宿主细胞株(即,已将表达构筑体引入宿主细胞中并且分离出具有合适表达构筑体的宿主细胞)后,在适于产生IFNβ多肽的条件下培养重组宿主细胞株。所属领域的技术人员显而易见,重组宿主细胞株的培养方法将依赖于所利用的表达构筑体的性质以及宿主细胞的特点。通常使用所属领域的技术人员已知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳、氮以及无机盐来源并且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域的技术人员已知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有抗生素或抗真菌剂以防止不合需要的微生物和/或化合物(包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。
重组宿主细胞可以分批或连续模式培养,其中细胞收集(在IFNβ多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的收集为分批或连续模式。对于原核宿主细胞中的制备来说,优选分批培养和细胞收集。
本发明的IFNβ多肽通常是在重组系统中表达之后纯化。IFNβ多肽可通过所属领域中已知的多种方法从宿主细胞或培养基中纯化。细菌宿主细胞中所产生的IFNβ多肽可具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中,使用本文中揭示的方法以及所属领域中已知的方法,可容易地在IFNβ多肽中进行为增加重组产生的蛋白质的溶解性而选择的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下,可通过离心从宿主细胞溶菌液收集蛋白质,并且其后可接着进行细胞的均质化。在具有弱溶解性的蛋白质的情况下,可添加包括(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。随后可通过离心便利地收集沉淀的蛋白。使用所属领域的技术人员已知的多种方法,可使重组宿主细胞破裂或均质化以从细胞内部释放包涵体。可使用熟知的技术来进行宿主细胞的破裂或均质化,这些技术包括(但不限于)酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中,使用高压释放技术使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放IFNβ多肽的包涵体。在处理IFNβ多肽的包涵体时,最好使重复过程的均质化时间最小化以使包涵体产率最大化且不会由于例如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素造成损失。
随后,可使用所属领域中已知的多种合适的增溶剂中的任一种来溶解不溶性或沉淀的IFNβ多肽。可用尿素或盐酸胍溶解IFNβ多肽。应使溶解的IFNβ多肽的体积最小化,从而可使用可方便操作的批量大小来制备大批量。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中,这个因素可为重要的。另外,当在大规模商业装置中制造IFNβ多肽时,特别是对于人类医药用途来说,如果可能的话,应避免可损害机器和容器的苛刻化学品或其蛋白质产物。本发明的方法中已展示,可使用较温和的变性剂尿素代替较苛刻的变性剂盐酸胍来溶解IFNβ多肽包涵体。尿素的使用显著降低损害IFNβ多肽的制造和纯化过程中使用的不锈钢设备的风险,同时有效溶解IFNβ多肽包涵体。
在可溶性IFNβ蛋白的情况下,可将IFNβ分泌到周质空间或培养基中。另外,可溶性IFNβ可能存在于宿主细胞的细胞质中。可能需要在进行纯化步骤之前浓缩可溶性IFNβ。可使用所属领域的技术人员已知的标准技术从(例如)细胞溶菌液或培养基浓缩可溶性IFNβ。另外,可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来破裂宿主细胞且从宿主细胞的细胞质或周质空间释放可溶性IFNβ。
当制备呈融合蛋白形式的IFNβ多肽时,可去除融合序列。可通过酶促或化学裂解来实现融合序列的去除。可使用所属领域的技术人员已知的方法来实现融合序列的酶促去除。所属领域的技术人员将显而易见,用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的特点决定,并且反应条件将根据酶的选择进行指定。可使用所属领域的技术人员已知的试剂(包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂)来实现化学裂解。可通过所属领域的技术人员已知的方法从裂解的融合序列中纯化裂解的IFNβ多肽。所属领域的技术人员将显而易见,所述方法将由融合序列和IFNβ多肽的特点和性质决定。纯化方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
也可纯化IFNβ多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。虽然可通过所属领域中已知的任何合适的方法(例如沉淀或离子交换色谱)去除DNA,但也可通过用核酸沉淀剂(例如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可使用包括(但不限于)离心或过滤的熟知的标准方法使IFNβ多肽与沉淀的DNA分离。在将使用IFNβ多肽来治疗人类的背景中,宿主核酸分子的去除为重要因素,并且本发明的方法将宿主细胞DNA降到医药学上可接受的水平。
用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中,所述方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统以及搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一种都可以分批、分批馈料或连续模式方法进行。
通常,可使用所属领域中的标准方法来回收本发明的人类IFNβ多肽。举例来说,可离心或过滤培养基或细胞溶菌液以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积或透滤到合适的缓冲液中以调节供进一步纯化的制剂。本发明的IFNβ多肽的进一步纯化包括从完整形式中分离脱除酰胺基和剪短形式的IFNβ多肽变异体。
以下例示性程序中的任一种都可用于纯化本发明的IFNβ多肽:亲和色谱;阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAE SEPHAROSE);硅胶色谱;高效液相色谱(HPLC);反相HPLC;凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEX G-75);疏水性相互作用色谱;尺寸排阻色谱;金属螯合物色谱;超滤/透滤;乙醇沉淀;硫酸铵沉淀;色谱聚焦;置换色谱;电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦);差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀);SDS-PAGE;或萃取。
根据所属领域的技术人员已知并使用的标准程序,可将本发明的蛋白质(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的肽、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)部分或实质上纯化成均质。因此,可通过所属领域的技术人员已知的多种方法中的任一种来回收和纯化本发明的多肽,这些方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、外源凝集素色谱、凝胶电泳等。在制备正确折叠的成熟蛋白质时,必要时可使用蛋白质再折叠步骤。当需要高纯度时,在最后纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它合适的方法。在一个实施例中,使用针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质或肽)形成的抗体作为纯化试剂,从而(包括但不限于)用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质或肽的以亲和性为基础的纯化。必要时,在部分纯化或纯化成均质后,视情况将所述多肽用于多种应用,包括(但不限于)用作测定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或用作抗体产生的免疫原。可通过使用常规方案向动物(优选非人类动物)投与本发明的多肽或带抗原决定基的片段或细胞来获得针对本发明的多肽而产生的抗体。所属领域的技术人员可使用多种已知技术来产生抗体。此外,可使用转基因小鼠或其它生物体(包括其它哺乳动物)来表达人源化抗体。可使用上述抗体来分离或鉴别表达多肽的克隆或纯化多肽。也可利用针对本发明的多肽而产生的抗体来治疗疾病。
本发明的多肽和多核苷酸也可用作疫苗。因此,另一方面,本发明涉及一种在哺乳动物中诱导免疫反应的方法,其包含使哺乳动物接种足以产生抗体和/或T细胞免疫反应(例如包括产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞)的本发明多肽以保护所述动物免患疾病,而无论个体是否已产生所述疾病。也可用以下方法诱导哺乳动物中的免疫反应,所述方法包含:在活体内通过指导多核苷酸表达并编码多肽的载体传递本发明的多肽,以诱导所述免疫反应,从而产生抗体来保护所述动物免患本发明的疾病。一种投与载体的方式是以粒子上的涂层的形式或以其它形式使其加速进入所需细胞中。所述核酸载体可包含DNA、RNA、经修饰核酸或DNA/RNA杂合体。为用作疫苗,多肽或核酸载体通常将以疫苗调配物(组合物)形式提供。调配物可进一步包含合适的载剂。因为多肽可在胃中分解,所以其可肠外(例如,皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射)投与。适于肠外投与的调配物包括:水性和非水性的无菌注射溶液,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与接收者的血液等张的溶质;以及水性和非水性的无菌悬浮液,其可包括悬浮剂或增稠剂。疫苗调配物也可包括所属领域的技术人员已知的用于增强调配物的免疫原性的佐剂系统。剂量将视疫苗的特定活性而定并且可通过常规实验容易地确定。
除了本文中指出的其它参考文献外,所属领域的技术人员还已知多种纯化/蛋白质折叠方法,其包括(但不限于)以下文献中列出的那些方法:R.Scopes,Protein Purification.Springer-Verlag,N.Y.(1982);Deutscher,Methods in Enzymology第182卷:Guide to Protein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990);Sandana,(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press,Inc.;Bollag等人,(1996)Protein Methods,第2版,Wiley-Liss,NY;Walker,(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ;Harris和Angal,(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England;Harris和Angal,Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press atOxford,Oxford,England;Scopes,(1993)Protein Purification:Principles and Practice第3 版Springer Verlag,NY;Janson和Ryden,(1998)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications,第2版,Wiley-VCH,NY;以及Walker(1998),Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ;以及其中引用的参考文献。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生所关注的具有非天然氨基酸的蛋白质或多肽的一个优点在于,所述蛋白质或多肽通常将折叠为其天然构象。然而,在本发明的某些实施例中,所属领域的技术人员应认识到,在合成、表达和/或纯化之后,蛋白质或肽可能具有与相关多肽所需的构象不同的构象。在本发明的一方面,视情况使所表达的蛋白质或多肽变性并且随后使其复性。这是利用所属领域中已知的方法来实现,所述方法包括(但不限于)向所关注的蛋白质或多肽中添加伴侣蛋白(chaperonin)、将蛋白质溶解于例如盐酸胍等离液剂中、利用蛋白质二硫化物异构酶等。
一般来说,有时需要使所表达的多肽变性和还原并且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说,可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到所关注的翻译产物中。所属领域的技术人员已知使蛋白质还原、变性和复性的方法(参看上述参考文献以及Debinski等人,(1993)J.Biol.Chem.,268:14065-14070;Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.,4:581-585;以及Buchner等人,(1992)Anal.Biochem.,205:263-270)。例如,Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。可在含有(包括(但不限于))氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲剂中使蛋白质再折叠。可使再折叠试剂流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触,或者可使一种或一种以上多肽或其它表达产物流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。
在原核制备IFNβ多肽的情况下,如此产生的IFNβ多肽可能错误折叠并且因而缺乏生物活性或者生物活性降低。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般来说,通过使用(例如)一种或一种以上离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中IFNβ多肽也不可溶)、展开并还原多肽链而使错误折叠的IFNβ多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下,随后添加氧化剂(例如,氧、胱氨酸或胱胺),这可再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法使IFNβ多肽再折叠,所述方法例如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的方法,所述文献是以引用的方式并入本文中。IFNβ多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异源二聚体或异源多聚体。
在再折叠之后,可进一步纯化IFNβ。可使用所属领域的技术人员已知的多种技术纯化IFNβ,所述技术包括疏水性相互作用色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、反相高效液相色谱、亲和色谱等或其任何组合。其它纯化也可包括干燥或沉淀经纯化蛋白质的步骤。
在纯化后,可将IFNβ交换到不同缓冲液中和/或通过所属领域中已知的多种方法(包括(但不限于)透滤和透析)中的任一种使其浓缩。以单一纯化蛋白质形式提供的IFNβ可进行聚集和沉淀。
经纯化IFNβ可为至少90%纯(如由反相高效液相色谱(RP-HPLC)或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所测量),或至少95%纯,或至少98%纯,或至少99%或更纯。无论IFNβ的纯度的确切数值如何,IFNβ对于用作医药产品或用于进一步处理(例如与例如PEG等水溶性聚合物接合)来说都是足够纯的。
在一些实施例中,本发明的IFNβ多肽在药物动力学上具有剂量线性Cmax和AUC。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药物动力学的Cmax不小于相等剂量下Rebif的60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药物动力学的Cmax不小于相等剂量下Rebif的100%。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药物动力学的Cmax不小于相等剂量下Rebif的105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、200%或200%以上。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药物动力学的Cmax不小于在相等剂量下投与的Avonex或另一对照的60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药物动力学的Cmax不小于在相等剂量下投与的Avonex或另一对照的100%。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药物动力学的Cmax不小于在相等剂量下投与的Avonex或另一对照的105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、200%或200%以上。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药物动力学具有足以支持每周一次异速增加式给药的PK谷含量(PK trough level)。
在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药效学引发新喋呤并使新喋呤含量持续1周。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽引发持续的新喋呤含量10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天或更多天数。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽的药效学引发不小于阳性对照(目前销售的IFNβ治疗剂)的OAS1基因表现并使表现程度持续1周。在一些实施例中,本发明IFNβ多肽引发不小于阳性对照(目前销售的IFNβ治疗剂)的OAS1基因表现并使表现程度持续10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天或更多天数。在本发明的一些实施例中,注射部位反应不比相等剂量下实例27中的阳性对照差。在本发明的一些实施例中,注射部位反应比相等剂量下实例27中的阳性对照好。在其它实施例中,本发明IFNβ多肽引起5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%或80%以下的注射部位反应。
在不存在其它活性成分或蛋白质(除赋形剂、载剂和稳定剂、血清白蛋白等之外)的情况下,某些IFNβ分子可用作治疗剂,或其可与另一种蛋白质或聚合物复合。
一般纯化方法 可以任何适当顺序对包含IFNβ多肽的细胞溶菌液、提取物、培养基、包涵体、宿主细胞的周质空间、宿主细胞的细胞质或其它材料或由任何分离步骤得到的任何IFNβ多肽混合物进行多种分离步骤中的任一种,所述任何分离步骤包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。
用于实施本文中所述的技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监控器、记录器以及整个系统都可获自(例如)Applied Biosystems(Foster City,CA)、Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,CA)以及Amersham Biosciences,Inc.(Piscataway,NJ)。包括(但不限于)交换基质材料、培养基以及缓冲液的色谱材料也可获自这些公司。
使用专用设备(例如泵)可更迅速地实现平衡以及在本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(例如洗涤和洗提)。市售泵包括(但不限于)泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及馏分收集器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。也可使用混合器来形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
可使用任何市售监控器来监控色谱过程。这些监控器可用于收集如UV、pH值和传导率的信息。检测器的实例包括监控器UV-1、S II、监控器UV-M II、监控器UV-900、监控器UPC-900、监控器pH/C-900以及传导率监控器(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。实际上,整个系统都在市面上有售,其包括来自Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)的各种系统。
在本发明的一个实施例中,例如,可通过首先在尿素中使所得的经纯化IFNβ多肽变性,接着在合适的pH值下在含有还原剂(例如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来还原IFNβ多肽并使其变性。在另一个实施例中,使IFNβ多肽以约2M到约9M的浓度范围在尿素中变性,接着在约5.0到约8.0的范围内的pH值下在TRIS缓冲液中稀释。随后可培育这个实施例的再折叠混合物。在一个实施例中,再折叠混合物在室温下培育4小时到24小时。随后,可进一步分离或纯化经还原并变性的IFNβ多肽混合物。
如本文中所述,在进行任何后续分离步骤之前,可调节第一IFNβ多肽混合物的pH值。另外,可使用所属领域中已知的技术来浓缩第一IFNβ多肽混合物或其任何后续混合物。此外,可使用所属领域的技术人员已知的技术将包含第一IFNβ多肽混合物或其任何后续混合物的洗提缓冲液交换为适用于下个分离步骤的缓冲液。
离子交换色谱 在一个实施例中,并且作为可选的额外步骤,可对第一IFNβ多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY:PRINCIPLES ANDMETHODS(目录号18-1114-21,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ))。市售离子交换柱包括和柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。这些柱利用强阴离子交换剂,例如QFast Flow、QHighPerformance和QXL;强阳离子交换剂,例如SPHighPerformance、SPFast Flow和SPXL;弱阴离子交换剂,例如DEAEFast Flow;以及弱阳离子交换剂,例如CMFastFlow(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。可在纯化过程的任何阶段对IFNβ多肽进行阴离子或阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的IFNβ多肽。可使用任何合适的阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。适用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述物质的复合物。
阳离子交换基质可为任何合适的阳离子交换剂,包括强阳离子交换剂和弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂可能在宽pH值范围内保持离子化,并因此可能能够在宽pH值范围内与IFNβ结合。然而,弱阳离子交换剂可能随着pH值变化而丧失离子化。举例来说,当pH值降到约pH4或pH5以下时,弱阳离子交换剂可能失去电荷。合适的强阳离子交换剂包括(但不限于)带电官能团,例如磺丙基(SP)、甲基磺酰基(S)或磺乙基(SE)。阳离子交换基质可为优选具有约2.5到约6.0的IFNβ结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者,强阳离子交换剂可具有约pH2.5到约pH5.5的IFNβ结合pH值范围。阳离子交换基质可为具有约3.0的IFNβ结合pH值的强阳离子交换剂。或者,阳离子交换基质可为优选具有约6.0到约8.0的IFNβ结合pH值范围的强阳离子交换剂。阳离子交换基质可为优选具有约8.0到约12.5的IFNβ结合pH值范围的强阳离子交换剂。或者,强阳离子交换剂可具有约pH8.0到约pH12.0的IFNβ结合pH值范围。
在装载IFNβ之前,例如可使用多个柱体积的稀弱酸(例如,4个柱体积的20mM乙酸,pH3)来平衡阳离子交换基质。平衡后可添加IFNβ并且在洗提实质上经纯化的IFNβ之前,也可使用弱酸溶液(例如弱乙酸或磷酸溶液)将柱洗涤一到数次。举例来说,可使用约2-4个柱体积的20mM乙酸(pH3)来洗涤柱。例如,使用2-4个柱体积的0.05M乙酸钠(pH5.5)或使用与0.1M氯化钠混合的0.05M乙酸钠(pH5.5)进行其它洗涤。或者,使用所属领域中已知的方法,可使用多个柱体积的稀弱酸来平衡阳离子交换基质。
或者,可通过使阳离子交换剂基质与具有足够低的pH值或离子强度的缓冲液接触而置换基质中的IFNβ来洗提实质上经纯化的IFNβ。洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH6.0的范围内。更具体来说,洗提缓冲液的pH值可在约pH2.5到约pH5.5、约pH2.5到约pH5.0的范围内。洗提缓冲液可具有约3.0的pH值。另外,洗提缓冲液的量可在较大范围内改变并且通常将在约2到约10个柱体积的范围内。
在使IFNβ多肽吸附到阳离子交换剂基质上之后,可通过使基质与具有足够高的pH值或离子强度的缓冲液接触而置换基质中的IFNβ多肽来洗提实质上经纯化的IFNβ多肽。适用于实质上经纯化的IFNβ多肽的高pH值洗提的缓冲液可包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES以及MES缓冲液。
反相色谱 可根据所属领域的技术人员已知的合适方案进行RP-PIPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人,ANAL BIOCHEM.(1982)124:217-230(1982);Rivier等人,J.CHROM.(1983)268:112-119;Kunitani等人,J.CHROM.(1986)359:391-402。可对IFNβ多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的IFNβ多肽。关于这一点,可使用含有具有多种长度(包括(但不限于)至少约C3到至少约C30、至少约C3到至少约C20或至少约C3到至少约C18树脂)的烷基官能团的二氧化硅衍生的树脂。或者,可使用聚合树脂。举例来说,可使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂,其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合树脂。此外,可用例如乙醇等溶剂洗涤RP-HPLC柱。Source RP柱是RP-HPLC柱的另一个实例。
可使用含有离子配对剂和有机改质剂(例如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗提缓冲液从RP-HPLC柱洗提IFNβ多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵和乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗提,其中优选减少分离时间并降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用两种具有不同溶剂浓度范围的梯度。适用于本文中的洗提缓冲液的实例可包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。
疏水性相互作用色谱纯化技术 可对IFNβ多肽进行疏水性相互作用色谱(HIC)。通常参看HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK:PRINCIPLES ANDMETHODS(目录号18-1020-90,Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)),其是以引用的方式并入本文中。合适的HIC基质可包括(但不限于)经烷基或芳基取代的基质,例如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质,所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质以及混合模式树脂(包括(但不限于)聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水性相互作用柱色谱的市售来源包括(但不限于)和柱(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。
简单地说,在装载之前,可使用所属领域的技术人员已知的标准缓冲液(例如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。硫酸铵可用作装载HIC柱的缓冲液。在装载IFNβ多肽后,随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以去除不需要的物质,但将IFNβ多肽留在HIC柱上。可用约3到约10个柱体积的标准缓冲液(例如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液,或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗提IFNβ多肽。也可使用例如使用磷酸钾梯度的降低的线性盐梯度来洗提IFNβ分子。随后,可例如通过过滤(例如透滤或超滤)来浓缩洗出液。可使用透滤来去除用于洗提IFNβ多肽的盐。
其它纯化技术 可对第一IFNβ多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(GEL FILTRATION:PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1022-18,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ),其是以引用的方式并入本文中)、羟基磷灰石色谱(合适的基质包括(但不限于)HA-Ultrogel、High Resolution(Calbiochem)、CHT陶瓷羟基磷灰石(BioRad)、Bio-Gel HTP羟基磷灰石(BioRad))、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤,以去除任何过量盐并且用合适的缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最终药物产品的调配。
可使用所属领域的技术人员已知的技术来监控本文中所述的各步骤中IFNβ多肽(包括实质上经纯化的IFNβ多肽)的产率。所述技术也可用于在最后分离步骤后评估实质上经纯化的IFNβ多肽的产率。举例来说,可使用多个具有多种烷基链长度的反相高压液相色谱柱(例如氰基RP-HPLC、C18RP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)中的任一种来监控IFNβ多肽的产率。
在本发明的特定实施例中,各纯化步骤后IFNβ的产率可为各纯化步骤的起始物质中的IFNβ的至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、至少约99.9%或至少约99.99%。
可使用例如SDS-PAGE等标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA测定测量IFNβ多肽来测定纯度。举例来说,可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。所述抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。
RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶粒子组成,其表面带有C4烷基链。IFNβ多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水性相互作用强度的差异。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗提。使用不锈钢柱(填充2.8到3.2升Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液并且将其装载于Vydac C4柱上。使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗涤和洗提。收集洗提部分并且立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集在IPC限度内的IFNβ多肽洗提部分。
DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子性相互作用来介导IFNβ多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在这些物质被洗掉之后,通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱并且用具有增加的离子强度的缓冲液洗提IFNβ多肽。用DEAE Sepharose fast flow填充柱。调节柱体积以确保IFNβ多肽装载量在每毫升凝胶3-10mg IFNβ多肽的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤柱。装填HPLC洗出液的汇集洗提部分并且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱,接着用平衡缓冲液洗涤。随后,用洗提缓冲液(氯化钠、磷酸钠/磷酸钾)从柱中洗提IFNβ多肽并根据主要洗提概况将其收集成单一洗提部分。将DEAE Sepharose柱的洗出液调节到指定传导率。将所得药物无菌过滤到特富龙(Teflon)瓶中并贮存在-70℃下。
可使用的其它方法包括(但不限于)去除内毒素的步骤。内毒素为位于革兰氏阴性宿主细胞(例如,大肠杆菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。所属领域的技术人员已知用于降低内毒素含量的方法,并且所述方法包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉或羟基磷灰石的纯化技术;反相色谱;亲和色谱;尺寸排阻色谱;阴离子交换色谱;疏水性相互作用色谱;这些方法的组合等。可能需要修改或其它方法以从所关注的多肽中去除污染物(例如共迁移蛋白质)。所属领域的技术人员已知用于测量内毒素含量的方法,并且所述方法包括(但不限于)鲎变形细胞溶菌液(Limulus Amebocyte Lysate;LAL)测定。EndosafeTM-PTS测定为利用预装载LAL试剂、发色底物和对照标准内毒素的料筒以及手持式分光光度计的比色、单管系统。替代方法包括(但不限于)测量浊度并且使用96孔形式的动力学LAL方法。
可使用多种方法和程序来评估包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的IFNβ蛋白质的产率和纯度,所述方法包括(但不限于)Bradford测定、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)以及所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。
其它方法包括(但不限于):与蛋白质染色法结合的SDS-PAGE、免疫印迹法、基质辅助激光解吸附/离子化质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
VIII.替代系统中的表达
已使用多种策略将非天然氨基酸引入非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或不含细胞的系统中的蛋白质中。这些系统也适用于制备本发明的IFNβ多肽。例如Lys、Cys和Tyr等具有反应性侧链的氨基酸的衍生使得赖氨酸转化为N2-乙酰基-赖氨酸。化学合成还提供并入非天然氨基酸的直接方法。通过肽片段的酶促连接和天然化学连接的新近发展,有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem,69:923(2000)。化学肽连接和天然化学连接描述于美国专利第6,184,344号、美国专利公开案第2004/0138412号、美国专利公开案第2003/0208046号、WO02/098902和WO03/042235中,所述专利是以引用的方式并入本文中。已使用将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制因子tRNA添加到能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish,D.Mendel和P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed. Engl.1995,34:621(1995);C.J.Noren,S.J.Anthony-Cahill,M.C.Griffith,P.G.Schultz,Ageneral method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins,Science 244:182-188(1989);以及J.D.Bain,C.G.Glabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,Biosynthetic site-specific incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide,J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导。
已开发被称作选择性压力并入的活体内方法以使用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa,C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger,F.M.Dong,L.Moroder和R.Huber,FASEB J.,13:41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株在含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中生长,而靶基因的转录受到抑制。在静止生长期开始时,天然氨基酸被耗尽并且由非天然氨基酸类似物置换。对重组蛋白表达的诱导使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说,已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中,并且其在UV光谱中显示两个可容易地鉴别的特征肩峰,例如参看C.Minks,R.Huber,L.Moroder和N.Budisa,Anal. Biochem.,284:29(2000);已使用三氟蛋氨酸来代替噬菌体T4溶菌酶中的蛋氨酸,从而通过19F NMR研究其与壳寡糖配体的相互作用,例如参看H.Duewel,E.Daub,V.Robinson和J.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997);并且已并入三氟亮氨酸来代替亮氨酸,从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang,G.Ghirlanda,W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado和D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed. Engl.,40:1494(2001)。此外,将硒代蛋氨酸和碲代蛋氨酸并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson,J.R.Horton和D.M.Lemaster,EMBO J.,9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap,L.Lebioda和M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn,J.Kellermann和R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995);以及N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade,T.Neuefeind,L.Moroder和R.Huber,J.Mol. Biol.,270:616(1997)。也已有效并入具有烯或炔官能团的蛋氨酸类似物,从而允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,428:68(1998);J.C.M.van Hest,K.L.Kiick和D.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美国专利第6,586,207号;美国专利公开案第2002/0042097号,其是以引用的方式并入本文中。
这种方法的成功取决于氨酰基tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别,所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。一种扩展这种方法的范围的方式在于放宽氨酰基tRNA合成酶的底物特异性,这已在有限数目的情况下达成。举例来说,在大肠杆菌苯丙氨酰基tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置换Ala294可增加底物结合袋的尺寸,并且导致对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)使tRNAPhe酰化。参看M.Ibba,P.Kast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸来代替苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.Hennecke,FEBS Lett.,364:272(1995);以及N.Sharma,R.Furter,P.Kast和D.A.Tirrell,FEBS Lett.,467:37(2000)。类似地,显示接近大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser允许氮杂酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参看F.Hamano-Takaku,T.Iwama,S.Saito-Yano,K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soil和S.Nishimura,J.Biol. Chem.,275:40324(2000)。
在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略是修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶无法区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸并且因此使其活化。此错误在单独位点上得到修正,这使来自tRNA的错配氨基酸去酰化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性,那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能并且被并入。目前已用缬氨酰基tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.de Crecy-Lagard,P.Schimmel和P.Marliere,Science,292:501(2001)。ValRS可利用Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)使tRNAVal错误氨酰基化;随后,通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在使大肠杆菌染色体随机诱变之后,选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。因为Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团是由Abu中的-CH3置换),所以当这种突变大肠杆菌菌株在存在Abu的情况下生长时,突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质中的各缬氨酸位置处约24%的缬氨酸由Abu置换。
固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说,参看以下公开案和其中引用的如下参考文献:Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin,R.General nature of the genetic code for proteins.Nature,192:1227-1232(1961);Hofmann,K.,Bohn,H.Studies on polypeptides.XXXVI,The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptidefragment,J.Am Chem,88(24):5914-5919(1966);Kaiser,E.T.Synthetic approaches tobiologically active peptides and proteins including enyzmes,Ace Chem Res,22:47-54(1989);Nakatsuka,T.,Sasaki,T.,Kaiser,E.T.Peptide segment coupling catalyzed by thesemisynthetic enzyme thiosubtilisin,J Am Chem Soc,109:3808-3810(1987);Schnolzer,M.,Kent,S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Science,256(5054):221-225(1992);Chaiken,I.M.Semisynthetic peptides and proteins,CRC Crit Rev Biochem,11(3):255-301(1981);Offord,R.E.Protein engineering by chemical means?Protein Eng.,1(3):151-157(1987);以及Jackson,D.Y.,Burnier,J.,Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.,Wells,J.A.A Designed PeptideLigase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues,Science,266(5183):243(1994)。
已使用化学修饰在活体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参看Corey,D.R.,Schultz,P.G.Generation of a hybrid sequence-specificsingle-stranded deoxyribonuclease,Science,238(4832):1401-1403(1987);Kaiser,E.T.,Lawrence D.S.,Rokita,S.E.The chemical modification of enzymatic specificity,Annu Rev Biochem,54:565-595(1985);Kaiser,E.T.,Lawrence,D.S.Chemical mutation of enyzmeactive sites,Science,226(4674):505-511(1984);Neet,K.E.,Nanci A,Koshland,D.E.Properties of thiol-subtilisin,J Biol.Chem,243(24):6392-6401(1968);Polgar,L.et M.L.Bender,A new enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc,88:3153-3154(1966);以及Pollack,S.J.,Nakayama,G.Schultz,P.G.Introductionof nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites,Science,242(4881):1038-1040(1988)。
或者,使用以化学方式修饰的氨酰基tRNA的生物合成方法已用于将多种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献:Brunner,J.New Photolabeling and crosslinking methods,Annu.Rev Biochem,62:483-514(1993);以及Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascentpreprolactin of the54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl. Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。
先前已显示,可通过向利用含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中添加以化学方式氨酰基化的抑制因子tRNA而在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法,可使用特定氨基酸的营养缺陷型菌株,用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸,例如,用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren,C.J.,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz,P.G.A general method for site-specificincorporation of unnatural amino acids into proteins,Science,244:182-188(1989);M.W.Nowak等人,Science268:439-42(1995);Bain,J.D.,Glabe,C.G.,Dix,T.A.,Chamberlin,A.R.,Diala,E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into apolypeptide,J.Am Chem Soc,111:8013-8014(1989);N.Budisa等人,FASEB J.13:41-51(1999);Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C.J.,Schultz,P.G.Biosyntheticmethod for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins,Methods in Enz.,第202卷,301-336(1992);以及Mendel,D.,Cornish,V.W.和Schultz,P.G.Site-DirectedMutagenesis with an Expanded Genetic Code,Annu Rev Biophvs.Biomol Struct.24,435-62(1995)。
举例来说,制备识别终止密码子UAG的抑制因子tRNA并且用非天然氨基酸以化学方式使其氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers,J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5′-3′Exonuclease inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis,Nucleic Acids Res,16(3):791-802(1988)。当将酰基化抑制因子tRNA和突变基因组合到活体外转录/翻译系统中时,回应UAG密码子而并入非天然氨基酸,这得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[3H]-Phe的实验以及使用α-羟基酸的实验证实,在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。例如参看Noren等人,同上文;Kobayashi等人,(2003)Nature Structural Biology10(6):425-432;以及Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.G.Site-specific incorporation of novel backbonestructures into proteins,Science,255(5041):197-200(1992)。
可通过任何方法或技术(包括(但不限于)化学或酶促氨酰基化)利用所需氨基酸使tRNA氨酰基化。
可通过氨酰基tRNA合成酶或其它酶促分子(包括(但不限于)核糖酶)来实现氨酰基化。术语“核糖酶”可与“催化性RNA”互换。Cech和同事(Cech,1987,Science,236:1532-1539;McCorkle等人,1987,Concepts Biochem.64:221-226)证实存在可充当催化剂的天然存在RNA(核糖酶)。然而,尽管仅证实这些天然RNA催化剂对核糖核酸底物具有裂解和剪接作用,但关于核糖酶人工开发的新近发展已将催化谱系扩大到各种化学反应。研究已鉴别出可催化自身(2′)3′末端的氨酰基RNA键的RNA分子(Illangakekare等人,1995Science267:643-647),以及可将氨基酸从一个RNA分子转移到另一个RNA分子的RNA分子(Lohse等人,1996,Nature381:442-444)。
美国专利申请公开案2003/0228593(其是以引用的方式并入本文中)描述构建核糖酶的方法和其在利用天然编码和非天然编码氨基酸使tRNA氨酰基化中的用途。可使tRNA氨酰基化的酶分子(包括(但不限于)核糖酶)的底物固定形式使得能够有效地亲和纯化氨酰基化产物。合适的底物的实例包括琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。用于氨酰基化的底物固定形式的核糖酶的制备和使用描述于Chemistry and Biology2003,10:1077-1084以及美国专利申请公开案2003/0228593中,其是以引用的方式并入本文中。
化学氨酰基化方法包括(但不限于)避免在氨酰基化过程中使用合成酶的由Hecht和同事(Hecht,S.M.Ace.Chem.Res.1992,25,545;Heckler,T.G.;Roesser,J.R.;Xu,C;Chang,P.;Hecht,S.M.Biochemistry1988,27,7254;Hecht,S.M.;Alford,B.L.;Kuroda,Y.;Kitano,S.J.Biol.Chem.1978,253,4517)以及由Schultz、Chamberlin、Dougherty和其它人(Cornish,V.W.;Mendel,D.;Schultz,P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A.;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991,113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C;Schultz,P.G.Science1989,244,182;Bain,J.D.;Glabe,C.G.;Dix,T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989,111,8013;Bain,J.D.等人,Nature1992,356,537;Gallivan,J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4,740;Turcatti等人,J.Biol.Chem.1996,271,19991;Nowak,M.W.等人,Science,1995,268,439;Saks,M.E.等人,J.Biol.Chem.1996,271,23169;Hohsaka,T.等人,J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)(其是以引用的方式并入本文中)介绍方法。所述方法或其它化学氨酰基化方法可用于使tRNA分子氨酰基化。
产生催化性RNA的方法可涉及产生单独的随机核糖酶序列的池,对所述池进行定向演化,针对所需氨酰基化活性筛选所述池,并且选择显示所需氨酰基化活性的核糖酶序列。
核糖酶可包含促进酰化活性的基元和/或区,例如GGU基元和富含U的区。举例来说,已报导富含U的区可促进氨基酸底物的识别,并且GGU基元可与tRNA的3′末端形成碱基对。GGU基元和富含U的区的组合促进氨基酸与tRNA的同时识别,并且从而促进tRNA的3′末端的氨酰基化。
可通过使用与tRNAAsn CCCG接合的部分随机化r24mini进行活体外选择,接着系统性工程改造在活性克隆中发现的一致序列来产生核糖酶。由这种方法获得的例示性核糖酶被称作“Fx3核糖酶”并且描述于美国公开申请案第2003/0228593号(其内容是以引用的方式并入本文中)中,其充当合成各种装载有同源非天然氨基酸的氨酰基tRNA的通用催化剂。
在底物上固定可用于促成氨酰基化tRNA的有效亲和性纯化。合适的底物的实例包括(但不限于)琼脂糖、琼脂糖凝胶和磁性珠粒。可利用RNA的化学结构将核糖酶固定在树脂上,例如,可用高碘酸盐氧化RNA核糖上的3′-顺式二醇以产生相应的二醛,从而促进RNA在树脂上的固定。可使用各种类型的树脂(包括廉价的酰肼树脂),其中还原性胺化使树脂与核糖酶之间的相互作用产生不可逆键联。可通过这项柱上氨酰基化技术显著促进氨酰基tRNA的合成。Kourouklis等人,Methods2005;36:239-4描述一种以柱为基础的氨酰基化系统。
可以多种方式实现氨酰基化tRNA的分离。一种合适的方法是用缓冲液从柱中洗提氨酰基化tRNA,所述缓冲液例如具有10mM EDTA的乙酸钠溶液、含有50mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-(3-丙烷磺酸)、12.5mM KCl(pH7.0)、10mM EDTA的缓冲液或简单经EDTA缓冲的水(pH7.0)。
可将氨酰基化tRNA添加到翻译反应中以便将使tRNA氨酰基化的氨基酸并入翻译反应所产生的多肽中的所选位置中。可使用本发明的氨酰基化tRNA的翻译系统的实例包括(但不限于)细胞溶菌液。细胞溶菌液提供由所输入的mRNA活体外翻译多肽所必需的反应组分。所述反应组分的实例包括(但不限于)核糖体蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、翻译起始和延伸因子以及与翻译相关的其它因子。另外,翻译系统可为分批翻译或间隔翻译(compartmentalized translation)。分批翻译系统将反应组分组合到单一隔室中,而间隔翻译系统将翻译反应组分与可抑制翻译效率的反应产物分隔开。这些翻译系统在市面上有售。
此外,可使用偶合转录/翻译系统。偶合转录/翻译系统允许将所输入的DNA转录为相应mRNA,而所述mRNA又由反应组分进行翻译。市售偶合转录/翻译的实例为RapidTranslation System(RTS,Roche Inc.)。所述系统包括含有大肠杆菌溶菌液的混合物以提供例如核糖体和翻译因子等翻译组分。另外,还包括RNA聚合酶以将所输入DNA转录为mRNA模板以用于翻译。RTS可经由反应隔室(包括供应/消耗隔室和转录/翻译隔室)之间插入的膜来分隔反应组分。
可由其它试剂(包括(但不限于)转移酶、聚合酶、催化抗体、多功能蛋白质等)进行tRNA的氨酰基化。
Stephan在Scientist,2005年10月10日;第30-33页中描述将非天然编码氨基酸并入蛋白质中的其它方法。Lu等人在Mol Cell.2001年10月;8(4);759-69中描述一种以化学方式使蛋白质与含有非天然氨基酸的合成肽化学连接(经表达的蛋白质连接)的方法。
也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Science,268:439(1995);以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)与活体外产生的以下两种RNA物质共同注射:在所关注的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码标靶蛋白的mRNA,和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制因子tRNA。随后,卵母细胞的翻译机构将非天然氨基酸插入由UAG指定的位置处。这种方法已允许通常不适用于活体外表达系统的整体膜蛋白的活体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移来测量距离,例如参看G.Turcatti,K.Nemeth,M.D.Edgerton,U.Meseth,F.Talabot,M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel和A.Chollet,J.Biol.Chem.,271:19991(1996);并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基,例如参看J.P.Gallivan,H.A.Lester和D.A.Dougherty,Chem.Biol.,4:739(1997);使用笼化的酪胺酸类似物以实时监控离子通道中的构象变化,例如参看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);以及使用α羟基氨基酸以改变用于探究其门控机制的离子通道主链。例如参看P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty和H.A.Lester,Cell,96:89(1999);以及T.Lu,A.Y.Ting,J.Mainland,L.Y.Jan,P.G.Schultz和J.Yang,Nat.Neurosci4:239(2001)。
在活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供多种优点,其包括(但不限于)突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白在治疗性治疗和诊断使用中的使用。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性以及其它性质的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性并系统性地操纵蛋白质结构的能力,从而探究蛋白质功能并且产生具有新颖性质的新蛋白质或生物体。
在位点特异性地并入para-F-Phe的一次尝试中,将酵母琥珀抑制因子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter,Protein Sci.,7:419(1998)。
使用不含无细胞的(活体外)翻译系统获得本发明的IFNβ多核苷酸的表达也为是可能的。翻译系统可为细胞或无细胞翻译系统细胞性或不含细胞,并且可为原核或真核翻译系统。细胞翻译系统包括(但不限于)其中可将所需核酸序列可经转录为mRNA并且翻译所述mRNA经翻译的全细胞制剂,例如渗透细胞或细胞培养物。不含无细胞的翻译系统在市面上有售,并且众所周知许多不同的类型和系统。不含无细胞的系统的实例包括(但不限于)原核细胞溶菌液,例如大肠杆菌溶菌液;以及真核细胞溶菌液,例如麦芽提取物、昆虫细胞溶菌液、兔网织红细胞网状细胞溶菌液、兔卵母细胞溶菌液和人类细胞溶菌液。当所得蛋白质经糖基化、磷酸化或以其它方式经修饰时,可优选真核细胞提取物或溶菌液,这是因为许多所述修饰只可能在真核系统中发生。一些所述提取物和溶菌液在市面上有售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;La Jolla,Calif.;Amersham;Arlington Heights,Ill.;GIBCO/BRL;Grand Island,N.Y.)。也可用膜提取物(例如含有微粒体膜的犬胰腺提取物),其适用于翻译分泌蛋白。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或包括DNA作为模板(组合型活体外转录和翻译)的这些系统中,由核糖体指导活体外合成。已进行相当多的尝试来开发无细胞的蛋白质表达系统。例如参看Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology and Bioengineering,74:309-316(2001);Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology Letters,22,1537-1542,(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology Progress,16,385-390,(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,Biotechnology andBioengineering,66,180-188,(1999);以及Patnaik,R.和J.R.Swartz,Biotechniques24,862-868,(1998);美国专利第6,337,191号;美国专利公开案第2002/0081660号;WO00/55353;WO90/05785,其是以引用的方式并入本文中。另一种可用于表达包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94:12297-12302(1997);A.Frankel等人,Chemistry&Biology10:1043-1050(2003)。在这种方法中,在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)连接的mRNA模板翻译为肽。如果已对一种或一种以上tRNA分子进行修饰,那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子之后,嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽接合物在活体外测定中具有引人关注的性质,那么易于由mRNA序列揭示其特性。用这种方式,可筛选包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的文库,以鉴别具有所需性质的多肽。最近,已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译,其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人,Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100:6353(2003)。
也可使用重构翻译系统。已成功地使用经纯化翻译因子的混合物以及溶菌液或补充有经纯化翻译因子(例如起始因子-1(IF-1)、IF-2、IF-3(α或β)、延伸因子T(EF-Tu)或终止因子)的溶菌液的组合将mRNA翻译为蛋白质。无细胞系统也可为偶合转录/翻译系统,其中如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,WileyInterscience,1993)(其以引用的方式特别并入本文中)中所述,将DNA引入所述系统中,转录成mRNA并翻译所述mRNA。在真核转录系统中转录的RNA可为异核RNA(hnRNA)或5′端戴帽(7-甲基鸟苷)和3′端加聚腺苷酸尾的成熟mRNA的形式,其在某些翻译系统中可为优点。举例来说,在网织红细胞溶菌液系统中,以高效率翻译戴帽的mRNA。
IX.与IFNβ多肽偶合的大分子聚合物
可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上,所述官能团包括(但不限于)标记;染料;聚合物;水溶性聚合物;聚乙二醇的衍生物;光交联剂;放射性核素;细胞毒性化合物;药物;亲和性标记;光亲和性标记;反应性化合物;树脂;第二蛋白质或多肽或多肽类似物;抗体或抗体片段;金属螯合剂;辅因子;脂肪酸;碳水化合物;多核苷酸;DNA;RNA;反义多核苷酸;糖类;水溶性树枝状聚合物;环糊精;抑制性核糖核酸;生物材料;纳米粒子;自旋标记;荧光团;含金属的部分;放射性部分;新颖官能团;与其它分子共价或非共价相互作用的基团;光笼化部分;光化辐射可激发的部分;可光致异构化部分;生物素;生物素衍生物;生物素类似物;结合有重原子的部分;可化学裂解的基团;可光裂解的基团;延长的侧链;碳连接的糖;氧化还原活性剂;氨基硫代酸;毒性部分;经同位素标记的部分;生物物理探针;磷光基团;化学发光基团;电子致密基团;磁性基团;插入基团;发色团;能量转移剂;生物活性剂;可检测标记;小分子;量子点;纳米传递素;放射性核苷酸;放射性传递素;中子俘获剂;或上述物质的任何组合,或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述的组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例,以下描述将集中在将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽上,同时应了解,相关的组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时适当修饰,并且所属领域的技术人员可用本文中的揭示内容进行)添加其它官能团(包括(但不限于)上文列出的官能团)。
多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的IFNβ多肽连接以调节IFNβ多肽的生物性质和/或对IFNβ分子提供新颖的生物性质。这些大分子聚合物可通过天然编码氨基酸、通过非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团与IFNβ多肽连接。聚合物的分子量可具有宽范围,包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。聚合物的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
本发明提供实质上均质的聚合物:蛋白质接合物的制剂。如本文中所用,“实质上均质”意思是观察到聚合物:蛋白质接合物分子大于总蛋白质的一半。所述聚合物:蛋白质接合物具有生物活性并且本文中提供的本发明的“实质上均质”的聚乙二醇化IFNβ多肽制剂为足够均质以致显示均质制剂的优点(例如,易于在临床应用中预测各批次之间的药物动力学)的制剂。
也可选择制备聚合物:蛋白质接合物分子的混合物,并且本文中提供的优点在于可选择包括在素数混合物中的单一聚合物:蛋白质接合物的比例。因此,必要时,可制备各种蛋白质与各种数目的所连接的聚合物部分(即,二、三、四等)的混合物,并且将所述接合物与使用本发明的方法制备的单一聚合物:蛋白质接合物组合,并获得具有预定的单聚合物:蛋白质接合物比例的混合物。
所选聚合物可为水溶性的,以致其所连接的蛋白质在水性环境(例如生理环境)中不沉淀。聚合物可为分枝或未分枝的。对于最终产品制剂的治疗性使用来说,聚合物将为医药学上可接受的。
聚合物的实例包括(但不限于)聚烷基醚和其经烷氧基封端的类似物(例如,聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、聚氧乙二醇/丙二醇以及其经甲氧基或乙氧基封端的类似物,尤其聚氧乙二醇,后者也被称作聚乙二醇(polyethyleneglycol)或PEG);聚乙烯吡咯烷酮;聚乙烯基烷基醚;聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟基烷基噁唑啉;聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟基烷基丙烯酰胺(例如,聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物);聚羟基烷基丙烯酸酯;聚唾液酸和其类似物;亲水性肽序列;聚糖和其衍生物,其包括葡聚糖和葡聚糖衍生物,例如,羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖;纤维素和其衍生物,例如,羧甲基纤维素、羟基烷基纤维素;几丁质和其衍生物,例如,壳聚糖、琥珀酰基壳聚糖、羧甲基几丁质、羧甲基壳聚糖;透明质酸和其衍生物;淀粉;海藻酸盐;硫酸软骨素;白蛋白;支链淀粉和羧甲基支链淀粉;聚氨基酸和其衍生物,例如,聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺;马来酸酐共聚物,例如苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙醚马来酸酐共聚物;聚乙烯醇;其共聚物;其三聚物;其混合物;以及上述物质的衍生物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将改变,其在反应混合物中的浓度也将改变。一般来说,可通过所选聚乙二醇的分子量和可提供的可用反应性基团的数目来确定最佳比率(就存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物的反应的效率来说)。当涉及分子量时,通常聚合物的分子量越高,可与蛋白质连接的聚合物分子的数目就越少。类似地,当优化这些参数时,应将聚合物的分枝考虑在内。通常,分子量越高(或支链越多),聚合物:蛋白质比率就越高。
如本文中所用,并且当涵盖PEG:IFNβ多肽接合物时,术语“治疗有效量”是指使患者得到所需益处的量。所述量将随个体而变化并且将视多种因素而定,包括患者的整体身体状况和欲治疗病状的潜伏病因。用于疗法的IFNβ多肽的量提供可接受的变化速率并且将所需反应维持在有益水平上。所属领域的技术人员使用可公开获得的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。
水溶性聚合物可为任何结构形式,包括(但不限于)线性、分叉或分枝形式。水溶性聚合物通常为聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)),但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说,使用PEG来描述本发明的某些实施例。
PEG为众所周知的水溶性聚合物,其在市面上有售或可根据所属领域的技术人员已知的方法(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷,第138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子而不用考虑PEG的尺寸或其末端的修饰,并且可由下式表示为与IFNβ多肽连接:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y,
其中n为2到10,000并且X为H或末端修饰,其包括(但不限于)C1-4烷基、保护基或末端官能团。
在一些情况下,本发明中所用的PEG在一端以羟基或甲氧基封端,即,X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者,PEG可以反应性基团封端,从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活化碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活化酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性、但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意,PEG的另一端(在上式中由Y表示)将与IFNβ多肽直接连接或通过天然存在或非天然编码氨基酸间接与IFNβ多肽连接。举例来说,Y可为与多肽的胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N末端)连接的酰胺键联、氨基甲酸酯键联或尿素键联。或者,Y可为与硫醇基团(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基团)连接的马来酰亚胺键联。或者,Y可为与通过20种常见氨基酸通常不可接近的残基连接的键联。举例来说,PEG上的叠氮基可与IFNβ多肽上的炔基反应以形成休斯根[3+2]环加成产物。或者,PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应以形成类似产物。在一些实施例中,强亲核试剂(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮基反应以形成腙、肟或缩氨基脲,在一些情况下,适当时可通过由适当还原剂处理而进一步还原腙、肟或缩氨基脲。或者,强亲核试剂可通过非天然编码氨基酸并入IFNβ多肽中并且可用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基反应。
可按照实际需要使用任何分子质量的PEG,所述分子质量视需要包括(但不限于)约100道尔顿(Dalton;Da)到100,000Da或100,000Da以上(包括(但不限于)有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。PEG的分子量可具有宽范围,包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。PEG可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中,PEG介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,PEG介于约10,000Da与约40,000Da之间。也可使用支链PEG,其包括(但不限于)各链具有在1-100kDa(包括(但不限于)1-50kDa或5-20kDa)范围内的MW的PEG分子。支链PEG的各链的分子量可(包括但不限于)介于约1,000Da与约100,000Da或100,000Da之间。支链PEG的各链的分子量可介于约1,000Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,支链PEG的各链的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。多种PEG分子描述于(包括但不限于)Shearwater Polymers,Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中,所述目录以引用的方式并入本文中。
通常,PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说,可使用具有与氨基酸侧链反应的炔基和叠氮部分的PEG衍生物来使PEG与如本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮基,那么PEG通常将含有炔部分以实现[3+2]环加成产物的形成,或含有膦基的活化PEG物质(即,酯、碳酸酯)以实现酰胺键形成。或者,如果非天然编码氨基酸包含炔,那么PEG通常将含有实现叠氮部分以实现[3+2]休斯根环加成产物的形成。如果非天然编码氨基酸包含羰基,那么PEG通常将分别包含有效亲核试剂(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以实现相应腙、肟和缩氨基脲键的形成。在其它替代方案中,可使用上述反应性基团的相反定向,即,可使非天然编码氨基酸中的叠氮部分与含有炔的PEG衍生物反应。
在一些实施例中,具有PEG衍生物的IFNβ多肽变异体含有可与非天然编码氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。
在一些实施例中,本发明提供含叠氮基和乙炔的聚合物衍生物,其包含具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚乙二醇。然而,应了解包括(但不限于)聚乙二醇和其它相关聚合物(包括聚葡聚糖和聚丙二醇)的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明,并且术语PEG或聚乙二醇的使用打算涵盖并且包括所有这些分子。术语PEG包括(但不限于)呈任何形式的聚乙二醇,包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、支链PEG、侧接PEG(即具有一个或一个以上侧接到聚合物主链上的官能团的PEG或相关聚合物)或具有可降解键联的PEG。
PEG通常为透明、无色、无味的,可溶于水中,对热稳定,对许多化学试剂呈惰性,不水解或变质,并且通常无毒。认为聚乙二醇为生物相容性的,也就是说PEG能够与活组织或生物体共存而不引起危害。更具体来说,PEG实质上为非免疫原性的,也就是说PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与体内具有一些所要功能的分子(例如生物活性剂)连接时,PEG倾向于掩蔽所述试剂并且可减少或消除任何免疫反应,从而使生物体可耐受所述试剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质免疫反应或引起凝血或其它不需的作用。具有式--CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2--(其中n为约3到约4000,通常约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中,具有约800Da到约100,000Da的分子量的PEG尤其适于用作聚合物主链。PEG的分子量可具有宽范围,包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。PEG的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中,PEG的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,PEG的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
聚合物主链可为线性或分枝的。所属领域中通常已知分枝聚合物主链。通常,分枝聚合物具有一个中心分枝核心部分和多个与中心分枝核心连接的线性聚合物链。PEG通常以分枝形式使用,所述形式可通过将氧化乙烯添加到各种多元醇(例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇)上来制备。中心分枝部分也可源自多种氨基酸(例如赖氨酸)。分枝聚乙二醇可以一般形式R(-PEG-OH)m表示,其中R是源自例如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇等核心部分,并且m表示臂的数目。多臂PEG分子(例如在美国专利第5,932,462号;第5,643,575号;第5,229,490号;第4,289,872号;美国专利申请案2003/0143596;WO96/21469;以及WO93/21259中所述的多臂PEG分子,所述文献各自以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。
分枝PEG也可为由PEG(-YCHZ2)n表示的分叉PEG形式,其中Y为连接基团并且Z为通过规定长度的原子链与CH连接的活化末端基团。
另一种分枝形式侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链的末端处具有例如羧基等反应性基团。
除这些PEG形式之外,也可制备主链中具有弱键联或可降解键联的聚合物。举例来说,可制备聚合物主链中具有经受水解作用的酯键联的PEG。如下文所示,这一水解作用使聚合物裂解为较低分子量的片段:
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-
所属领域的技术人员应了解,术语聚乙二醇或PEG表示或包括所属领域中已知的所有形式,其包括(但不限于)在本文中所揭示的形式。
许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中,具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。合适的聚合物的实例包括(但不限于)其它聚烷二醇,例如聚丙二醇(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。尽管聚合物主链的各链的分子量可改变,但其通常在约800Da到约100,000Da、通常约6,000Da到约80,000Da的范围内。聚合物主链的各链的分子量可介于约100Da与约100,000Da之间,包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中,聚合物主链的各链的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。
所属领域的技术人员应认识到,实质上水溶性主链的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性,并且预期具有上述性质的所有聚合物材料都适用于本发明中。
在本发明的一些实施例中,聚合物衍生物为“多官能的”,意思是聚合物主链具有至少两个经官能团官能化或活化的末端并且可能具有多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物,其中各末端与可相同或不同的官能团键结。
在一个实施例中,聚合物衍生物具有以下结构:
X—A—POLY—B—N=N=N
其中:
N=N=N为叠氮部分;
B为连接部分,其可存在或不存在;
POLY为水溶性非抗原聚合物;
A为连接部分,其可存在或不存在并且其可与B相同或不同;并且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个并且可含有1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括例如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个并且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上碳原子可经氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号;第5,643,575号;以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团,所述文献各自以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到,连接部分的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性,并且预期具有上述性质的所有连接部分都适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。所属领域的技术人员应了解,所选X部分应与叠氮基相容以使得不与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能的,意思是第二官能团(即,X)也是叠氮部分;或为异双官能的,意思是第二官能团为不同的官能团。
术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下发生反应的保护基或保护部分。保护基应视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说,如果化学反应性基团是胺或酰肼,那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇,那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基,那么保护基可为苄基或例如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本发明中。
文献中末端官能团的特定实例包括(但不限于)碳酸N-琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参看Buckmann等人,Makromol.Chem.182:1379(1981);Zalipsky等人,Eur.Polym.J.19:1177(1983))、酰肼(例如参看Andresz等人,Makromol.Chem.179:301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(例如参看Olson等人,Poly(ethylene glycol)Chemistry&Biological Applications,第170-181页,Harris和Zalipsky编,ACS,Washington,D.C.,1997;还参看美国专利第5,672,662号)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(例如参看Abuchowski等人,Cancer Biochem.Biophys.7:175(1984)以及Joppich等人,Makromol.Chem.180:1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑酯(例如参看美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(例如参看Pitha等人,Eur.J Biochem.94:11(1979);Elling等人,Biotech.Appl.Biochem.13:354(1991))、氧羰基咪唑(例如参看Beauchamp等人,Anal.Biochem.131:25(1983);Tondelli等人,J.Controlled Release1:251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看Veronese等人,Appl.Biochem.Biotech.,11:141(1985);以及Sartore等人,Appl.Biochem.Biotech.,27:45(1991))、醛(例如参看Harris等人,J.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984);美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看Goodson等人,Biotechnology(NY)8:343(1990);Romani等人,Chemistry of Peptides and Proteins2:29(1984));以及Kogan,Synthetic Comm.22:2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参看Woghiren等人,Bioconj.Chem.4:314(1993))、丙烯醇(例如参看Sawhney等人,Macromolecules,26:581(1993))、乙烯基砜(例如参看美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
在本发明的某些实施例中,本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N
其中:
X为如上所述的官能团;并且
n为约20到约4000。
在另一个实施例中,本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-W-N=N=N
其中:
W为包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分;
n为约20到约4000;并且
X为如上所述的官能团,m介于1与10之间。
可通过所属领域中已知和/或本文中所揭示的多种方法来制备本发明的含叠氮基的PEG衍生物。在下文展示的一种方法中,具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适的离去基键结的第二末端)与叠氮基阴离子(其可与多种合适的抗衡离子(包括钠、钾、叔丁基铵等)中的任一种配对)反应。离去基进行亲核置换并且由叠氮部分置换,从而得到所需的含叠氮基的PEG聚合物。
X-PEG-L+N3 -→X-PEG-N3
如上所示,适用于本发明的聚合物主链具有式X-PEG-L,其中PEG为聚乙二醇并且X为不与叠氮基反应的官能团,并且L为合适的离去基。合适的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶以及酮。合适的离去基的实例包括(但不限于)氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根以及甲苯磺酸根。
在另一种制备本发明的含叠氮基的聚合物衍生物的方法中,使具有叠氮基官能团的连接剂与具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链接触,其中连接剂具有将与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应的化学官能团,以形成含叠氮基的聚合物衍生物产物,其中叠氮基是通过连接基团与聚合物主链分隔开。
例示性反应流程展示如下:
X-PEG-M+N-连接子-N=N=N→PG-X-PEG-连接子-N=N=N
其中:
PEG为聚乙二醇并且X为例如烷氧基等封端基团或如上所述的官能团;并且
M为不可与叠氮基官能团反应、但可与N官能团有效且选择性反应的官能团。
合适的官能团的实例包括(但不限于):如果N为胺,那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯;如果N为酰肼或氨氧基部分,那么M为酮;如果N为亲核基团,那么M为离去基。
可由已知方法(包括(但不限于)沉淀产物,必要时接着进行色谱)实现粗产物的纯化。
下文展示在PEG二胺的情况下的更特定实例,其中一个胺经例如叔丁基-Boc等保护基部分保护并且所得单保护的PEG二胺与具有叠氮基官能团的连接部分反应:
BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-N=N=N
在这种情况下,可使用多种活化剂(例如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂以及N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)使胺基与羧酸基团偶合以在单胺PEG衍生物与具有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键之后,所得经N-叔丁基-Boc-保护的含叠氮基的衍生物可直接用于修饰生物活性分子,或其可进一步经精细修饰以安装其它适用的官能团。举例来说,可通过用强酸处理使N-t-Boc基团水解以产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。可使用所得胺作为合成把手(synthetic handle)来安装其它适用的官能团(例如马来酰亚胺基团、活化二硫化物、活化酯等)以产生有价值的异双官能试剂。
当需要将不同分子与聚合物的各末端连接时,异双官能衍生物尤其有用。举例来说,ω-N-氨基-N-叠氮基PEG将允许具有活性亲电子基团(例如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)的分子与PEG的一个末端连接,并且将允许具有乙炔基团的分子与PEG的另一个末端连接。
在本发明的另一个实施例中,聚合物衍生物具有以下结构:
X—A—POLY—B—C≡C-R
其中:
R可为H或烷基、烯烃、烷氧基或芳基或经取代芳基;
B为连接部分,其可存在或不存在;
POLY为水溶性非抗原性聚合物;
A为连接部分,其可存在或不存在且其可与B相同或不同;并且
X为第二官能团。
A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个且可含有1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括例如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处分枝。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个并且可含有5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上个碳原子原子可经氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团,所述文献各自以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到,连接部分的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性,并且预期具有上述性质的多种连接部分适用于本发明中。
适用作X的官能团的实例包括羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃、酮以及乙炔。应了解,所选X部分应与乙炔基相容以使得不与乙炔基发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能的,意思是第二官能团(即,X)也是乙炔部分,或异双官能的,意思是第二官能团是不同的官能团。
在本发明的另一个实施例中,聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链:
X—CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH
其中:
X为如上所述的官能团;
n为约20到约4000;并且
m介于1与10之间。
各异双官能PEG聚合物的特定实例展示如下。
可使用所属领域的技术人员已知和/或本文中所揭示的方法来制备本发明的含乙炔的PEG衍生物。在一种方法中,使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适的亲核基团键结的第二末端)与具有乙炔官能团和适于与PEG上的亲核基团反应的离去基的化合物反应。当具有亲核部分的PEG聚合物与具有离去基的分子组合时,离去基进行亲核置换并且由亲核部分置换,从而得到所需含乙炔的聚合物。
X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR′
如上所示,用于反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu,其中PEG为聚乙二醇,Nu为亲核部分并且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。
Nu的实例包括(但不限于)主要通过SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基团的其它实例包括主要通过亲核加成反应来反应的官能团。L基团的实例包括氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根和预期进行亲核置换的其它基团,以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯基和预期进行亲核试剂加成的其它亲电子基团。
在本发明的另一个实施例中,A为具有1-10个碳原子的脂肪族连接子或具有6-14个碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团,并且L为合适的离去基。
在另一种用于制备本发明的含乙炔的聚合物衍生物的方法中,使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量、在一个末端上具有经保护官能团或封端剂并且在另一个末端上具有合适的离去基的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。
例示性反应流程展示如下:
X-PEG-L+-C≡CR′→X-PEG-C≡CR′
其中:
PEG为聚乙二醇并且X为例如烷氧基等封端基团或如上所述的官能团;并且
R′为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。
在上文实例中,当与足够浓度的乙炔阴离子接触时,离去基L应充分反应以进行SN2型置换反应。所属领域的技术人员已知由乙炔阴离子实现离去基的SN2置换所需的反应条件。
通常可由所属领域中已知的方法(包括(但不限于)沉淀产物,必要时接着进行色谱)来实现粗产物的纯化。
水溶性聚合物可与本发明的IFNβ多肽连接。水溶性聚合物可通过并入IFNβ多肽中的非天然编码氨基酸或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基或添加到非天然编码或天然编码氨基酸中的任何官能团或取代基连接。或者,水溶性聚合物是通过天然存在氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基)与并有非天然编码氨基酸的IFNβ多肽连接。在一些情况下,本发明的IFNβ多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸,其中一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)连接。在一些情况下,本发明的IFNβ多肽进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上与水溶性聚合物连接的天然编码氨基酸。在一些情况下,本发明的IFNβ多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸以及一个或一个以上与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中,相对于未接合形式,本发明中所用的水溶性聚合物增强IFNβ多肽的血清半衰期。
可调节与本发明的IFNβ多肽连接的水溶性聚合物的数目(即,聚乙二醇化或糖基化程度)以提供改变(包括(但不限于)增加或降低)的药理学、药物动力学或药效特征,例如活体内半衰期。在一些实施例中,IFNβ的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、增加到2倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍或至少约100倍。
含有强亲核基团(即,酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物
在本发明的一个实施例中,用含有直接与PEG主链连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽。
在一些实施例中,羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000(即,平均分子量介于5-40kDa之间)。
在一些实施例中,含肼或含酰肼的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=O)。
在一些实施例中,含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000。
在本发明的另一个实施例中,用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的IFNβ多肽。
在一些实施例中,羟胺末端PEG衍生物具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000(即,平均分子量介于5-40kDa之间)。
在一些实施例中,含肼或含酰肼的PEG衍生物具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10,n为100-1,000并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=O)。
在一些实施例中,含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000。
在本发明的另一个实施例中,用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的分枝PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的IFNβ多肽,其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且可为5-20kDa的MW。
在本发明的另一个实施例中,用具有分枝结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽。举例来说,在一些实施例中,肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000,并且X视情况为可存在或不存在的羰基(C=O)。
在一些实施例中,含有氨基脲基团的PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在,m为2-10并且n为100-1,000。
在一些实施例中,含有羟胺基团的PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),X视情况为NH、O、S、C(O)或不存在,m为2-10并且n为100-1,000。
水溶性聚合物与IFNβ多肽连接的程度和位点可调节IFNβ多肽与IFNβ多肽受体的结合。在一些实施例中,安置各键联,使得IFNβ多肽以通过平衡结合测定(例如在Spencer等人,J.Biol.Chem.,263:7862-7867(1988)中所述)所测量约400nM或400nM以下的Kd、以150nM或150nM以下的Kd并且在一些情况下以100nM或100nM以下的Kd与IFNβ多肽受体结合。
用于聚合物活化以及肽接合的方法和化学描述于文献中并且在所属技术领域中为已知的。聚合物活化的常用方法包括(但不限于)用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物(biepoxide)、表氯醇(epichlorohydrin)、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团。(参看R.F.Taylor,(1991),PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS,Marcel Dekker,N.Y.;S.S.Wong,(1992),CHEMISTRY OFPROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING,CRC Press,Boca Raton;G.T.Hermanson等人,(1993),IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES,Academic Press,N.Y.;Dunn,R.L.等人编,POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,ACS Symposium Series,第469卷,American Chemical Society,Washington,D.C.1991)。
可获得关于PEG的官能化和接合的若干评论和专论。例如参看Harris,Macromol.Chem.Phys.C25:325-373(1985);Scouten,Methods in Enzymology135:30-65(1987);Wong等人,Enzyme Microb.Technol14:866-874(1992);Delgado等人,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems9:249-304(1992);Zalipsky,Bioconjugate Chem.6:150-165(1995)。
活化聚合物的方法也可见于WO94/17039、美国专利第5,324,844号、WO94/18247、WO94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO90/13540、美国专利第5,281,698号和WO93/15189中,且使活化聚合物与酶接合的方法可见于以下对应不同酶的参考文献中,所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO94/15625)、血红蛋白(WO94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人,App.Biochem.Biotech.11:141-52(1985))。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
通过任何便利方法来进行含有非天然编码氨基酸(例如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的IFNβ多肽的聚乙二醇化(即,添加任何水溶性聚合物)。举例来说,用经炔封端的mPEG衍生物使IFNβ多肽聚乙二醇化。简单地说,在室温下在搅拌下向含对叠氮基-L-Phe的IFNβ多肽的水溶液中添加过量固体mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH。通常,用pKa接近进行反应的pH值(通常pH值约为4-10)的缓冲液缓冲水溶液。例如,适于在pH7.5下聚乙二醇化的缓冲液的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。必要时,连续监控并调节pH值。通常使反应持续进行约1-48小时。
随后,使反应产物经受疏水性相互作用色谱,以使聚乙二醇化IFNβ多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH以及当在分子的两端使未阻断PEG活化从而使IFNβ多肽变异体分子交联时可形成的聚乙二醇化IFNβ多肽的任何高分子量复合物分离开来。疏水性相互作用色谱期间的条件应使得游离mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH流过柱,而任何交联的聚乙二醇化IFNβ多肽变异体复合物则在实现所需形式后洗提出来,所需形式含有一个与一个或一个以上PEG基团接合的IFNβ多肽变异体分子。合适的条件视交联复合物相对于所需接合物的相对大小而改变,并且易于由所属领域的技术人员确定。通过超滤来浓缩含有所需接合物的洗出液且通过透滤使其脱盐。
必要时,可由所属领域的技术人员已知的一种或一种以上程序进一步纯化获自疏水性色谱的聚乙二醇化IFNβ多肽,所述程序包括(但不限于)亲和色谱;阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAE琼脂糖凝胶);硅胶色谱;反相HPLC;凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEX G-75);疏水性相互作用色谱;尺寸排阻色谱;金属螯合物色谱;超滤/透滤;乙醇沉淀;硫酸铵沉淀;色谱聚焦;置换色谱;电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦);差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀);或萃取。可通过与球状蛋白质标准物(Preneta,AZ,PROTEIN PURIFICATION METHODS,APRACTICAL APPROACH(Harris和Angal编)IRL Press1989,293-306)进行比较由GPC来估算表观分子量。可通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解),接着质谱分析来评估IFNβ-PEG接合物的纯度。Pepinsky RB.等人,J,Pharmcol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)。
与本发明的IFNβ多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物可进一步不受限制地衍生或经取代。
含叠氮基的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中,用含有叠氮部分的PEG衍生物修饰IFNβ多肽,所述叠氮部分将与非天然编码氨基酸侧链上存在的炔部分反应。一般来说,PEG衍生物将具有在1-100kDa范围内并且在一些实施例中在10-40kDa范围内的平均分子量。
在一些实施例中,叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000(即,平均分子量介于5-40kDa之间)。
在另一实施例中,叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10,p为2-10并且n为100-1,000(即,平均分子量介于5-40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中,用含有末端叠氮部分的分枝PEG衍生物修饰包含含炔的氨基酸的IFNβ多肽,其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且可为5-20kDa的MW。举例来说,在一些实施例中,叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10,p为2-10,并且n为100-1,000,并且X视情况为O、N、S或羰基(C=O),在各情况下,X都可存在或不存在。
含炔的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中,用含有炔部分的PEG衍生物修饰IFNβ多肽,所述炔部分将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应。
在一些实施例中,炔末端PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10并且n为100-1,000(即,平均分子量介于5-40kDa之间)。
在本发明的另一个实施例中,用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽。
在一些实施例中,炔末端PEG衍生物将具有以下结构:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)mNH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10,p为2-10并且n为100-1,000。
在本发明的另一个实施例中,用含有末端炔部分的分枝PEG衍生物修饰包含含叠氮基的氨基酸的IFNβ多肽,其中分枝PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且可为5-20kDa的MW。举例来说,在一些实施例中,炔末端PEG衍生物将具有以下结构:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等),m为2-10,p为2-10,并且n为100-1,000,并且X视情况为O、N、S或羰基(C=O)或不存在。
含膦的PEG衍生物
在本发明的另一个实施例中,用含有活化官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰IFNβ多肽,所述官能团进一步包含将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的芳基膦基团。一般来说,PEG衍生物将具有在1-100kDa范围内并且在一些实施例中在10-40kDa范围内的平均分子量。
在一些实施例中,PEG衍生物将具有以下结构:
其中n为1-10;X可为O、N、S或不存在,Ph为苯基,并且W为水溶性聚合物。
在一些实施例中,PEG衍生物将具有以下结构:
其中X可为O、N、S或不存在,Ph为苯基,W为水溶性聚合物并且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH2、-C(CH3)3、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)2R′、-S(O)2NR′R″、-CN和-NO2。R′、R″、R″′和R″″各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如,当本发明的化合物包括一个以上R基团时,R基团是各自独立地经选择,而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时,这些基团同样是各自独立地经选择。当R′和R″与同一氮原子连接时,其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说,-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述,所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团,例如卤烷基(包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
其它PEG衍生物和一般聚乙二醇化技术
例如,可与IFNβ多肽连接的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括以下文献中所述的分子和方法:美国专利公开案第2004/0001838号;第2002/0052009号;第2003/0162949号;第2004/0013637号;第2003/0228274号;第2003/0220447号;第2003/0158333号;第2003/0143596号;第2003/0114647号;第2003/0105275号;第2003/0105224号;第2003/0023023号;第2002/0156047号;第2002/0099133号;第2002/0086939号;第2002/0082345号;第2002/0072573号;第2002/0052430号;第2002/0040076号;第2002/0037949号;第2002/0002250号;第2001/0056171号;第2001/0044526号;第2001/0021763号;美国专利第6,646,110号;第5,824,778号;第5,476,653号;第5,219,564号;第5,629,384号;第5,736,625号;第4,902,502号;第5,281,698号;第5,122,614号;第5,473,034号;第5,516,673号;第5,382,657号;第6,552,167号;第6,610,281号;第6,515,100号;第6,461,603号;第6,436,386号;第6,214,966号;第5,990,237号;第5,900,461号;第5,739,208号;第5,672,662号;第5,446,090号;第5,808,096号;第5,612,460号;第5,324,844号;第5,252,714号;第6,420,339号;第6,201,072号;第6,451,346号;第6,306,821号;第5,559,213号;第5,747,646号;第5,834,594号;第5,849,860号;第5,980,948号;第6,004,573号;第6,129,912;WO97/32607、EP229,108、EP402,378、WO92/16555、WO94/04193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/18247、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、WO95/13090、WO95/33490、WO96/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、EP439508、WO97/03106、WO96/21469、WO95/13312、EP921131、WO98/05363、EP809996、WO96/41813、WO96/07670、EP605963、EP510356、EP400472、EP183503和EP154316,其是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任一种PEG分子都可以包括(但不限于)单链、分枝链、多臂链、单官能、双官能、多官能形式或其任何组合的任何形式使用。
其它聚合物和PEG衍生物(包括但不限于羟胺(氨氧基)PEG衍生物)描述于以下专利申请案中,所述专利申请案都是以全文引用的方式并入本文中:美国专利公开案第2006/0194256号;美国专利公开案第2006/0217532号;美国专利公开案第2006/0217289号;美国临时专利第60/755,338号;美国临时专利第60/755,711号;美国临时专利第60/755,018号;国际专利申请案第PCT/US06/49397号;WO2006/069246;美国临时专利第60/743,041号;美国临时专利第60/743,040号;国际专利申请案第PCT/US06/47822号;美国临时专利第60/882,819号;美国临时专利第60/882,500号;以及美国临时专利第60/870,594号。
异源Fc融合蛋白
上述干扰素β化合物可直接或通过肽连接子与免疫球蛋白的Fc部分融合。免疫球蛋白是含有通过二硫键结合在一起的多肽链的分子,通常具有两个轻链和两个重链。在各链中,一个域(V)具有取决于分子的抗体特异性的可变氨基酸序列。其它域(C)具有为相同类别的分子所共有的相当恒定的序列。
如本文中所用,免疫球蛋白的Fc部分具有免疫学领域中通常赋予这一术语的含义。具体来说,这一术语是指通过从抗体中去除两个抗原结合区(Fab片段)获得的抗体片段。一种去除Fab片段的方法是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白。因此,Fc部分是由来自两个重链的大小近似相等的恒定区片段形成,所述片段通过非共价相互作用和二硫键缔合。Fc部分可包括铰链区且延伸穿过抗体的CH2和CH3域到达C末端。人类和小鼠免疫球蛋白的代表性铰链区可见于Antibody Engineering,A Practical Guide,Borrebaeck,C.A.K.编,W.H.Freeman and Co.,1992中,其教示以引用的方式并入本文中。Fc部分可进一步包括一个或一个以上糖基化位点。所属领域中熟知多种含有铰链区、CH2和CH3域以及一个N-糖基化位点的代表性Fc蛋白的氨基酸序列。
存在五种类型的具有不同效应功能和药物动力学性质的人类免疫球蛋白Fc区:IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE。IgG是血清中最丰富的免疫球蛋白。IgG还具有任何免疫球蛋白中最长的血清半衰期(23天)。不同于其它免疫球蛋白,IgG在与Fc受体结合后可有效地再循环。存在四个IgG亚类G1、G2、G3以及G4,其各自具有不同的效应功能。G1、G2以及G3能结合C1q和固定补体,而G4则不能。虽然G3能够比G1有效地结合C1q,但G1在介导补体导向的细胞溶解中更有效。G2以极低效率固定补体。IgG中的C1q结合位点位于CH2域的羧基末端区。
所有IgG亚类都能够结合Fc受体(CD16、CD32、CD64),其中G1和G3比G2和G4有效。IgG的Fc受体结合区是由位于CH2域的铰链区和羧基末端区中的残基形成。
IgA可以单体形式和通过J-链结合在一起的二聚物形式存在。IgA是血清中第二丰富的Ig,但其半衰期仅为6天。IgA具有三种效应功能。其结合巨噬细胞和嗜酸性粒细胞上的IgA特异性受体,所述受体分别驱动吞噬作用和脱粒作用。其也可经由未知的替代途径固定补体。
IgM表达为通过J-链结合在一起的五聚物或六聚物。IgM具有5天的血清半衰期。其经由位于CH3域中的结合位点微弱地结合C1q。IgD具有3天的血清半衰期。尚不清楚哪些效应功能是归因于这种Ig。IgE是单体Ig且具有2.5天的血清半衰期。IgE结合驱动脱粒作用且引起促发炎剂释放的两种Fc受体。
取决于期望的活体内效应,本发明的异源融合蛋白可含有任一上述同种型,或可含有补体和/或Fc受体结合功能已改变的突变Fc区。因此,本发明的异源融合蛋白可含有与干扰素β化合物融合的免疫球蛋白的整个Fc部分、免疫球蛋白的Fc部分的片段或其类似物。
本发明的融合蛋白可由单链蛋白质组成或呈多链多肽形式。可产生两种或两种以上Fc融合蛋白,以致其通过天然形成于Fc区之间的二硫键相互作用。这些多聚物就干扰素β化合物来说可为同源的,或其可含有不同的在融合蛋白的Fc部分的N末端处融合的干扰素β化合物。
不管融合蛋白的最终结构如何,Fc或Fc样区可用于延长在N末端处融合的干扰素β化合物的活体内血浆半衰期。同时,融合蛋白化合物的干扰素β组成部分应保持干扰素β的至少一种生物活性。可使用本文描述或所属领域中已知的比较融合蛋白的半衰期与单独干扰素β化合物的半衰期的方法证明治疗或循环半衰期增加。生物活性可用所属领域已知的活体外和活体内方法确定。
因为由蛋白水解所产生的IgG的Fc区具有与完整IgG分子相同的活体内半衰期且Fab片段快速降解,所以认为用于延长半衰期的相关序列驻留在CH2和/或CH3域中。另外,文献中已显示不结合高亲和力Fc受体或C1q的IgG变异体的分解代谢率与亲本野生型抗体的清除率很难区分,表明分解代谢位点不同于参与Fc受体或C1q结合的位点。[Wawrzynczak等人,(1992)Molecular Immunology29:221]。使用鼠类IgG1Fc区的定点诱变研究提示,控制分解代谢率的IgG1Fc区的位点位于CH2-CH3域的界面处。Fc区可在分解代谢位点处经修饰以优化融合蛋白的半衰期。用于本发明的融合蛋白的Fc区可源自IgG1或IgG4Fc区,且可含有CH2和CH3区(包括铰链区)。
WO2006/000448中描述Fc-IFNβ融合蛋白,其以引用的方式并入本文中。
异源白蛋白融合蛋白
本文所述的干扰素β可直接或通过肽连接子、水溶性聚合物或前药连接子与白蛋白或其类似物、片段或衍生物融合。作为本发明融合蛋白的一部分的白蛋白一般可源自从包括人类的任何物种克隆的白蛋白。人类血清白蛋白(HSA)由具有585个氨基酸的单个非糖基化多肽链组成,化学式分子量为66,500。已知人类HSA的氨基酸序列[参看Meloun等人(1975)FEBS Letters58:136;Behrens等人,(1975)Fed.Proc.34:591;Lawn等人(1981)Nucleic Acids Research9:6102-6114;Minghetti等人(1986)J.Biol.Chem.261:6747,其各自以引用的方式并入本文中]。已描述白蛋白的多种多形变异体以及类似物和片段。[参看Weitkamp等人,(1973)Ann.Hum.Genet.37:219]。举例来说,在EP322,094中,各种较短形式的HSA。已揭示这些HSA片段中的一些,包括HSA(1-373)、HSA(1-388)、HSA(1-389)、HSA(1-369)和HSA(1-419)以及1-369与1-419之间的片段。EP399,666揭示白蛋白片段,包括HSA(1-177)和HSA(1-200)以及HSA(1-177)与HSA(1-200)之间的片段。
应了解,本发明的异源融合蛋白(包括片段、类似物和衍生物)包括与任何白蛋白偶合的干扰素β化合物,其中所述融合蛋白具有生物活性且血浆半衰期比单独干扰素β化合物长。因此,融合蛋白的白蛋白部分不必具有与天然人类白蛋白相等的血浆半衰期。片段、类似物和衍生物是已知的或可产生而具有较长半衰期或具有介于相关天然人类白蛋白与干扰素β化合物之间的半衰期。
本发明的异源融合蛋白涵盖在融合蛋白的干扰素β化合物和/或Fc或白蛋白部分中具有保守性氨基酸取代的蛋白质。“保守性取代”是用另一带相同净电荷且具有大致相同的大小和形状的氨基酸置换氨基酸。当具有脂肪族或经取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸的侧链中的碳和杂原子总数相差不超过约4时,具有大致相同的大小。当侧链中的分支数相差不超过1时,具有大致相同的形状。侧链中具有苯基或经取代苯基的氨基酸视为具有大致相同的大小和形状。除非本文另外特别提供,否则保守性取代优选用天然存在氨基酸进行。
野生型白蛋白和免疫球蛋白可从多种来源获得。举例来说,这些蛋白质可从cDNA文库获得,该文库又可从以可检测水平表达相关mRNA的组织或细胞制备。可用使用公开DNA或蛋白质序列针对相关特定蛋白质设计的探针筛选文库。举例来说,以下文献中描述免疫球蛋白轻链或重链恒定区:Adams等人(1980)Biochemistry19:2711-2719;Goughet等人(1980)Biochemistry19:2702-2710;Dolby等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:6027-6031;Rice等人(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:7862-7862;Falkner等人(1982)Nature298:286-288;和Morrison等人(1984)Ann.Rev.Immunol.2:239-256。一些揭示白蛋白和DNA序列的参考文献包括Meloun等人(1975)FEBS Letters58:136;Behrens等人(1975)Fed.Proc.34:591;Lawn等人(1981)Nucleic Acids Research9:6102-6114;和Minghetti等人(1986)J.Biol.Chem.261:6747。
表征本发明的异源融合蛋白
存在许多表征本发明融合蛋白的方法。一些这类方法包括(但不限于)与蛋白质染色法结合的SDS-PAGE或使用抗IgG或抗HSA抗体的免疫印迹法。其它方法例如包括基质辅助激光解吸附/离子化质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。
增强对血清白蛋白的亲和性
也可使各种分子与本发明的IFNβ多肽融合以调节IFNβ多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中,使分子与本发明的IFNβ多肽连接或融合以增强对动物中的内源血清白蛋白的亲和性。
举例来说,在一些情况下,制备IFNβ多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌(streptococcal)蛋白G的白蛋白结合域(例如参看Makrides等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.277:534-542(1996);和Sjolander等人,J,Immunol.Methods201:115-123(1997)),或白蛋白结合肽,例如在例如Dennis等人,J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)中所述的白蛋白结合肽。
在其它实施例中,用脂肪酸使本发明的IFNβ多肽酰化。在一些情况下,脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参看Kurtzhals等人,Biochem.J.312:725-731(1995)。
在其它实施例中,本发明的IFNβ多肽是直接与血清白蛋白(包括(但不限于)人类血清白蛋白)融合。所属领域的技术人员应认识到,也可使多种其它分子与本发明的IFNβ连接以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
X.IFNβ多肽的糖基化
本发明包括并有一种或一种以上带有糖残基的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽。糖残基可为天然残基(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然残基(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。糖可通过N或O-连接的糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或相应的C或S-连接的糖苷)与非天然编码氨基酸连接。
可在活体内或活体外将糖(包括(但不限于)糖基)部分添加到IFNβ多肽中。在本发明的一些实施例中,用由氨氧基衍生的糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽,以产生通过肟键连接的相应糖基化多肽。在糖与非天然编码氨基酸连接后,可通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精细修饰糖以产生与IFNβ多肽结合的寡糖。例如参看H.Liu等人,J.Am.Chem.Soc.125:1702-1703(2003)。
在本发明的一些实施例中,直接用以氨氧基衍生物形式制备的具有规定结构的聚糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽。所属领域的技术人员应认识到,可使用其它官能团(包括叠氮化物、炔、酰肼、肼和氨基脲)使糖与非天然编码氨基酸连接。
在本发明的一些实施例中,随后可通过(包括但不限于)休斯根[3+2]环加成反应分别用(包括但不限于)炔基或叠氮基衍生物修饰包含含叠氮基或炔基的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。
WO2007/022799描述在无血清培养条件下产生重组人类IFNβ和纯化具有独特糖基化模式的IFNβ的方法。
XI.IFNβ二聚物和多聚物
本发明还提供IFNβ和IFNβ类似物组合,例如同源二聚物、异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物(即,三聚物、四聚物等),其中含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的IFNβ直接与多肽主链结合,或通过连接子与另一IFNβ或其IFNβ变异体或非IFNβ或其IFNβ变异体的任何其它多肽结合。由于与单体相比分子量增加,所以IFNβ二聚物或多聚物接合物可展现新颖或所需性质,包括(但不限于)相对于单体IFNβ展现不同的药理学、药物动力学、药效学性质、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中,本发明的IFNβ二聚物将调节IFN受体的信号转导。在其它实施例中,本发明的IFNβ二聚物或多聚物将充当IFN受体的拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中,在含有IFNβ的二聚物或多聚物中存在的一个或一个以上IFNβ分子包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。
在一些实施例中,IFNβ多肽是(包括但不限于)通过Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键直接连接。在一些实施例中,IFNβ多肽和/或连接的非IFNβ分子将包含不同的非天然编码氨基酸以促进二聚化,其包括(但不限于)第一IFNβ多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔与第二分子的第二非天然编码氨基酸中的叠氮化物将通过休斯根[3+2]环加成接合。或者,包含含酮的非天然编码氨基酸的IFNβ和/或连接的非IFNβ分子可与包含含羟胺的非天然编码氨基酸的第二多肽接合,并且所述多肽是通过形成相应肟进行反应。
或者,两种IFNβ多肽和/或连接的非IFNβ分子是通过连接子连接。可使用任何异型双官能连接子或同型双官能连接子来连接两种分子和/或连接的非IFNβ分子,其可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下,用于将IFNβ和/或连接的非IFNβ分子连接在一起的连接子可为双官能PEG试剂。连接子可具有各种分子量或分子长度。可使用较大或较小分子量的连接子在IFNβ与连接实体之间或在IFNβ与其受体之间或在连接实体与其结合搭配物(如果存在的话)之间提供所需空间关系或构象。也可使用具有较长或较短分子长度的连接子在IFNβ与连接实体之间或在连接实体与其结合搭配物(如果存在的话)之间提供所需空间或可挠性。
在一些实施例中,本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子,所述结构包括:a)在聚合物主链的至少一个第一末端上的叠氮基、炔、肼、酰肼、羟胺或含羰基的部分;以及b)至少一个在聚合物主链的第二末端上的第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中,第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中,本发明提供包含分枝分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说,分枝分子结构可为树枝状。
在一些实施例中,本发明提供通过与水溶性活化聚合物反应而形成的包含一个或一个以上IFNβ多肽的多聚物,所述水溶性活化聚合物具有以下结构:
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
其中n为约5到3,000,m为2-10,X可为叠氮基、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或含羰基的部分,并且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基。R可为例如选自由以下组成的群组的官能团:羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳酸1-苯并三唑酯、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃以及酮。
XII.测量IFNβ多肽活性和IFNβ多肽对IFN受体的亲和性
可使用标准或已知活体外或活体内测定确定IFNβ多肽活性。可用所属领域中已知的合适方法分析IFNβ多肽的生物活性。如Meager,J.Immunol.Meth.,261:21-36(2002)中所述,所述测定包括(但不限于)干扰素应答基因的激活、受体结合测定、抗病毒活性测定、细胞病变效应抑制测定(Familletti等人,Meth.Enzymol.78:387-394)、抗增殖测定(Aebersold和Sample,Meth.Enzymol.119:579-582)、免疫调节测定(美国专利第4,914,033号、第4,753,795号)和监测MHC分子诱发的测定(例如Hokland等人,Meth.Enzymol.119:688-693)。
可分析IFNβ多肽激活干扰素敏感信号转导路径的能力。一个实例是干扰素刺激的反应元件(ISRE)测定。用ISRE-荧光素酶载体(pISRE-luc,Clontech)短暂转染组成性表达I型干扰素受体的细胞(例如希拉细胞(Hela cell),293T细胞)。转染后,用干扰素β多肽处理细胞。测试多个例如0.0001-10ng/mL的蛋白质浓度以产生剂量-反应曲线。如果干扰素β多肽结合和激活IFN受体,那么所得信号转导级联引发荧光素酶表达。可用多种方法测量发光,例如通过使用TopCountTM或FusionTM微板读取器和Steady-GloR荧光素酶测定系统(Promega)。
可分析IFNβ多肽结合I型干扰素受体(IFNAR)的能力。IFN受体可使用所属领域的技术人员已知的技术和方法制备。hIFN受体可如美国专利第6,566,132号、第5,889,151号、第5,861,258号、第5,731,169号、第5,578,707号(其以引用的方式并入本文中)中所述制备。举例来说,可使用应答hIF调节生长或MHC I类或II类抗原的产生或结合hIFN的细胞或细胞系(包括(但不限于)含有活性IFN受体的细胞,例如人类道迪类淋巴母细胞(lymphoblastoid Daudi cell)或重组IFN受体产生细胞)监测hIFN受体结合。对于包含非天然氨基酸的未聚乙二醇化或聚乙二醇化的IFNβ多肽,可使用BIAcoreTM生理传感器(Pharmacia)测量IFNβ对其受体的亲和力。合适结合测定包括(但不限于)BIAcore测定(Pearce等人,Biochemistry38:81-89(1999))和AlphaScreenTM测定(PerkinElmer)。AlphaScreenTM是基于珠粒的非放射性发光邻近测定,其中在680nm下用激光激发供体珠粒来释放单重态氧。单重态氧扩散并在受体珠粒的表面上与二甲基噻吩衍生物反应,在约600nm下产生荧光发射。荧光发射仅在供体和受体珠粒各自各别与配体和受体连接发生分子间相互作用而紧密邻近时发生。这种配体-受体相互作用可使用受体结合变异体竞争除去,而未结合变异体不会竞争。
无论用于产生本发明hIFN类似物的方法如何,都使类似物进行生物活性测定。可进行氚化胸腺嘧啶测定来确定细胞分裂的程度。然而,可使用其它生物测定来确定期望活性。可分析IFNβ多肽的抗病毒活性和/或抗增殖活性。所属领域的技术人员已知抗增殖测定。Basu等人Bioconjugate Chem(2006)17:618-630描述使用A549细胞和MTT测量增殖的抗增殖测定。例如测定抑制病毒复制的能力的生物测定还指示IFN活性。还可使用所属领域的技术人员已知的测定评估本发明IFNβ多肽的生物活性和潜在的副作用。
Platanias等人Experimental Hematology1999;27:1583-1592(其以引用的方式并入本文中)论述由干扰素激活的信号传导路径,包括Jak-Stat路径。可使用评估干扰素受体结合下游的信号传导和路径的测定评估本发明IFN多肽。
可用本发明IFNβ多肽进行病毒复制测定或活体内研究来筛选抗病毒活性。所属领域的技术人员已知病毒复制测定且这些测定可包括HCV(丙型肝炎病毒)、VSV(水泡性口炎病毒)或EMCV(脑心肌炎病毒)。还可用IFNβ多肽测量例如感染VSV的幼仓鼠肾BHK21细胞等细胞的细胞病变效应(CPE)的减小。可使用各种细胞系和计算算法确定在CPE测定中的效价。与已知参考标准比较且可计算国际单位。可使用其它活体外测定确定生物活性。一般来说,生物活性的测试应提供对期望结果的分析,例如生物活性的增加或减小(与未改变的IFNβ相比)、不同的生物活性(与未改变的IFNβ相比)、受体亲和力分析或血清半衰期分析。
其它测定包括(但不限于)抗病毒活性的抗体中和、蛋白激酶的诱发、寡腺苷酸2,5-A合成酶或磷酸二酯酶活性(EP41313,其以引用的方式并入本文中);免疫调节测定(美国专利第4,753,795号,其以引用的方式并入本文中)、生长抑制测定和用表达干扰素受体的细胞进行的结合测定(美国专利第7,144,574号,其以引用的方式并入本文中)。
无论用于产生IFNβ多肽的方法如何,都要使IFNβ多肽进行生物活性测定。一般来说,生物活性的测试应提供对期望结果的分析,例如生物活性的增加或减小(与经修饰IFNβ相比)、不同的生物活性(与经修饰IFNβ相比)、受体或结合搭配物亲和力分析、IFNβ本身或其受体的构象或结构变化(与经修饰IFNβ相比)或血清半衰期分析。
关于测定方法学的参考文献的上述汇编并不详尽,且所属领域的技术人员应认可适用于测试期望最终结果的其它测定。所属领域的技术人员已知所述测定的变化形式。
测量多肽的抗体形成和免疫原性临床前测试
测量和评估抗体形成的测定包括(但不限于)生物测定和结合测定。生物测定包括(但不限于)使用动物个体或患者的血清检测中和抗体的测定。测量血清中和外源分子的生物活性的能力。基于细胞的生物测定例如可测量增殖、细胞毒性、信号传导或细胞激素释放。检测中和抗体与非中和抗体的结合测定测量血清结合外源蛋白的能力。测量所述抗体的方法包括(但不限于)ELISA。这两种抗体存在的重要性论述于Schellekens,H等人Clinical Therapeutics2002;24(11):1720-1740,其以引用的方式并入本文中。
Schellekens,H等人,Clinical Therapeutics2002;24(11):1720-1740(其以全文引用的方式并入本文中)也论述在表达内源人类蛋白的非人类灵长类动物和转基因小鼠模型中的动物测试以及活体外测试方法。Whiteley等人J.Clin.Invest.1989;84:1550-1554(其以引用的方式并入本文中)论述使用转基因小鼠进行人类胰岛素免疫原性研究。Wadhwa,M.等人J of Immunol Methods2003;278:1-17(其以引用的方式并入本文中)论述若干检测和测量免疫原性的技术,例如表面等离子体共振(SPR;Biacore)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫测定(例如固相结合免疫测定)、桥联ELISA和竞争性ELISA以及免疫印迹法。其它技术包括(但不限于)电化学发光(ECL)。
Chirino等人DDT2004;9(2):82-90(其以引用的方式并入本文中)描述研究蛋白质治疗剂的免疫原性的体外T细胞激活测定。监测抗原呈递细胞对野生型和变异干扰素蛋白质的摄取。可使用体外T细胞激活测定实验上用数量表示免疫原性。在这种方法中,用相关肽或整个蛋白质激发抗原呈递细胞和匹配供体的天然T细胞一次或一次以上。随后,可使用若干方法检测T细胞激活,例如通过监测细胞激素的产生或测量氚化胸腺嘧啶的摄取。其它合适的T细胞测定包括以下文献中揭示的那些:Meidenbauer等人Prostate43,88-100(2000);Schultes,B.C和Whiteside,T.L.,J.Immunol.Methods279,1-15(2003);和Stickler等人,J.Immunotherapy,23,654-660(2000)。用于上述T细胞激活测定的PBMC供体可包含需要干扰素β反应性病症治疗的患者中常见的II类MHC等位基因。举例来说,对于大多数疾病和病症,期望测试包含群体中流行的所有等位基因的供体。然而,对于与特异性MHC等位基因相关的疾病或病症,集中筛选易感干扰素β反应性病症的等位基因可能更适当。可比较对干扰素β产生免疫反应的PBMC供体或患者的MHC单倍型与不产生反应患者的MHC单倍型。这一数据可用于引导临床前和临床研究以及有助于鉴别将极可能有利或不利应答干扰素β治疗剂的患者。可在转基因小鼠系统中测量免疫原性。举例来说,可使用完全或部分表达人类II类MHC分子的小鼠。可通过向一种或一种以上动物(包括啮齿动物和灵长类动物)投与干扰素β变异体并监测抗体形成来测试免疫原性。具有确定的MHC单倍型的非人类灵长类动物可能尤其适用,因为非人类灵长类动物的MHC分子的序列且因此肽结合特异性可能与人类的序列和肽结合特异性非常类似。类似地,可使用表达人类MHC肽结合域的基因工程改造的小鼠模型(例如参看Sonderstrup等人Immunol.Rev.172:335-343(1999)和Forsthuber等人J.Immunol.167:119-125(2001))。
所属领域的技术人员已知评估本发明多肽的其它方法。
XIII.测量效价、功能性活体内半衰期和药物动力学参数
本发明的一个重要方面是通过在使多肽与水溶性聚合物部分接合或不接合的情况下构筑IFNβ多肽获得的延长的生物半衰期。IFNβ多肽血清浓度的快速投药后降低使得对用接合和未接合IFNβ多肽和其变异体进行治疗产生的生物反应进行评估变得重要。本发明的接合和未接合IFNβ多肽和其变异体在通过例如皮下或静脉内投药投药后也可具有延长的血清半衰期,从而使例如通过ELISA方法或通过初级筛选测定进行测量成为可能。可使用商业来源的ELISA或RIA试剂盒,例如来自Invitrogen(Carlsbad,CA)。活体内生物半衰期的测量如本文中所述来进行。
包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的效价和功能性活体内半衰期可根据所属领域的技术人员已知的方案来测定。
包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的药物动力学参数可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(N=每处理组5只动物)中评估。动物将接受静脉内每只大鼠25微克或皮下每只大鼠50微克的单剂量,且将根据预定时程采集约5-7个血样,对包含非天然编码氨基酸的未与水溶性聚合物接合的IFNβ多肽来说通常覆盖约6小时,且对包含非天然编码氨基酸且与水溶性聚合物接合的hPP或hA多肽来说通常覆盖约4天。可直接比较无非天然编码氨基酸的IFNβ的药物动力学数据与包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽所获得的数据。
Basu等人,Bioconjugate Chem(2006)17:618-630描述IFNβ多肽在小鼠和大鼠中的药物动力学和免疫原性研究。药物动力学参数也可在例如猕猴的灵长类动物中评估。通常,皮下或静脉内投与单一注射液,且随时间监测血清IFNβ含量。
根据本发明的IFNβ多肽的比活性可由所属领域中已知的各种测定来确定。根据本发明获得和纯化的IFNβ多肽突变蛋白或其片段的生物活性可由本文中描述或参考或所属领域的技术人员已知的方法测试。
可分析IFNβ多肽在治疗诸如多发性硬化的小鼠或大鼠实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)模型等动物疾病模型中的功效。可使用诸如常用EAE模型等动物模型确定本发明多肽的功效。在EAE模型中,用源自髓鞘或髓鞘的蛋白质进行免疫从而引发模拟人类多发性硬化的大多数发炎和神经特征的疾病。EAE已用于小鼠、大鼠、兔子和狨猴中(Cannella等人PNAS,95,101005,1998;Zaprianova等人Morfologiia,112,258,1997;Hassouna等人J.Urology,130,80610,1983;Genain和Hauser J.Mol.Med.75,18797,1997)。其它包括泰勒氏鼠类脑脊髓炎病毒(Theiler′s murine encephalomyelitis virus,TMEV)模型(Murray等人J.Neurosci.18,730614,1998)的模型可用于确定IFNβ多肽的功效。
XIV.投药和医药组合物
本发明的多肽或蛋白质(包括(但不限于)包含一个或一个以上非天然氨基酸的IFNβ、合成酶、蛋白质等)视情况(包括但不限于)与合适的医药载剂组合用于治疗用途。例如,这些组合物包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。制备适用于投药模式的调配物。一般来说,所属领域的技术人员已知投与蛋白质的方法,并且所述方法可用于投与本发明的多肽。组合物可呈水溶性形式,例如以医药学上可接受的盐形式提供,医药学上可接受的盐打算包括酸加成盐与碱加成盐。
根据所属领域的技术人员已知的方法,视情况在疾病的一种或一种以上适当的活体外和/或活体内动物模型中测试包含一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物,从而证实功效、组织代谢并且估算剂量。具体来说,最初可通过本文中的非天然氨基酸同源物相对于天然氨基酸同源物(包括(但不限于)经修饰包括一个或一个以上非天然氨基酸的IFNβ多肽与天然氨基酸IFNβ多肽的比较和经修饰包括一个或一个以上非天然氨基酸的IFNβ多肽与目前可用的IFNβ治疗剂的比较)的活性、稳定性或其它合适的量度(即,在相关测定中)来确定剂量。
通过通常用于引导分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径进行投药。本发明的非天然氨基酸多肽是视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起以任何合适的方式投与。可使用向患者投与本发明上下文中的所述多肽的合适方法,并且虽然可使用超过一种途径来投与特定组合物,但特定途径通常可提供比另一途径即时并且有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂是部分由欲投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。因此,存在本发明的医药组合物的多种合适的调配物。
本发明的IFNβ多肽可通过适用于蛋白质或肽的任何常规途径来投与,所述途径包括(但不限于)肠外,例如(包括但不限于)皮下或静脉内注射或任何其它形式的注射或输液。可由多种途径投与多肽组合物,所述途径包括(但不限于)口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可通过脂质体投与。所属领域的技术人员通常已知所述投药途径以及适当调配物。IFNβ多肽可单独使用或与其它合适的组分(例如医药载剂)组合使用。IFNβ多肽可与其它药剂或治疗剂组合使用。
单独或与其它合适的组分组合的包含非天然氨基酸的IFNβ多肽也可制成通过吸入投与的气雾剂调配物(即,其可“雾化”)。气雾剂调配物可放置到加压的可接受推进剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。
适于肠外投与(例如,通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性的等张无菌注射溶液,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等张的溶质;以及水性和非水性的无菌悬浮液,其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。IFNβ的调配物可在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中提供。
肠外投药和静脉内投药为优选的投药方法。具体来说,已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN(例如IFNβ)、白细胞介素、抗体、FGF和/或任何其它医药学上传递蛋白的投药途径)与目前使用的调配物一起提供本发明多肽的优选投药途径和调配物。
在本发明的上下文中,视应用而定,投与患者的剂量足以随时间在患者体内产生有益的治疗反应,或其它适当活性。通过特定载体或调配物的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及欲治疗患者的体重或表面积来确定剂量。剂量大小也由特定患者体内伴随特定载体、调配物等的投与产生的任何有害副作用的存在、性质和程度决定。
在确定疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)的治疗或预防中欲投与的载体或调配物的有效量时,医师评估循环血浆含量、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
例如投与70公斤患者的剂量通常在等于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内,所述范围可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而进行调节。本发明的载体或医药调配物可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件,所述常规疗法包括抗体投与、疫苗投与、投与细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。
关于投药,本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对各种浓度的非天然氨基酸多肽的任何副作用(包括(但不限于)当关系到患者的体重和整体健康时)的观测结果所确定的速率投与。可通过单次剂量或分剂量实现投药。
如果经历调配物输液的患者出现发热、发冷或肌肉疼痛,那么他/她接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/发热控制药物。在即将输液前30分钟,用阿司匹林、醋氨酚或(包括但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)对经历输液反应(例如发热、肌肉疼痛和发冷)的患者进行前驱用药。哌替啶(meperidine)是用于不能对退热剂和抗组胺剂迅速作出反应的更为严重的发冷和肌肉疼痛。视反应的严重性而减缓或停止细胞输液。
本发明的人类IFNβ多肽可直接投与哺乳动物个体。通过通常用于向个体引入IFNβ多肽的任何途径进行投药。根据本发明的实施例的IFNβ多肽组合物包括适于口服、经直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、经颊(包括(但不限于)舌下)、经阴道、肠外(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即,皮肤与粘膜表面,其包括气管表面)、肺部、眼内、鼻内以及透皮投与的IFNβ多肽组合物,但在任何既定情况下最合适的途径将视所治疗病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身性投药。化合物的调配物可在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中提供。本发明的IFNβ多肽可制备为单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。也可通过连续输液(使用(包括但不限于)微型泵,例如渗透泵)、单次团注或缓释储槽式调配物来投与本发明的IFNβ多肽。
适于投药的调配物包括水溶液和非水溶液(等张无菌溶液),其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质;以及水性和非水性无菌悬浮液,其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备溶液和悬浮液。
冷冻干燥是用于从所关注的蛋白质制剂中去除水的通常用于呈现蛋白质的技术。冷冻干燥或冻干是首先使欲干燥的材料冷冻并且随后通过在真空环境中升华来去除冰或冷冻溶剂的过程。预先冻干的调配物中可包括赋形剂以增强在冷冻干燥过程中的稳定性和/或改良冻干产物在贮存时的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人,Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。
所属领域的技术人员也已知药物的喷雾干燥。举例来说,参看Broadhead,J.等人,″The Spray Drying of Pharmaceuticals,″Drug Dev.Ind.Pharm,18(11和12),1169-1206(1992)。除小分子药物外,也已将多种生物材料喷雾干燥并且这些生物材料包括:酶、血清、血浆、微生物和酵母。由于喷雾干燥可将液态医药制剂以单步骤工艺转化成无粉尘或团聚的细粉,所以喷雾干燥为有用的技术。基本技术包含以下四个步骤:a)将进料溶液雾化成喷雾液;b)喷雾液-空气接触;c)干燥喷雾液;和d)使干燥产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其是以引用的方式并入本文中)描述通过喷雾干燥来制备重组促红细胞生成素。
本发明的医药组合物和调配物可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂是部分由欲投与的特定组合物以及用于投与组合物的特定方法决定。因此,存在本发明的医药组合物的多种合适的调配物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)。(例如参看Remington′s Pharmaceutical Sciences,第17版,1985)。
合适的载剂包括(但不限于):缓冲剂,其含有琥珀酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括(但不限于)抗坏血酸;低分子量多肽,包括(但不限于)少于约10个残基的多肽;蛋白质,包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、蛋氨酸、谷氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,包括(但不限于)EDTA和乙二胺四乙酸二钠(edentate disodium);二价金属离子,包括(但不限于)锌、钴或铜;糖醇,包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇;成盐抗衡离子,包括(但不限于)钠和氯化钠;填充剂,例如微晶纤维素、乳糖、玉米淀粉和其它淀粉;粘合剂;甜味剂和其它调味剂;着色剂;和/或非离子型表面活性剂,包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween80(聚山梨醇酯80)和Tween20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它泊洛尼克酸(pluronic acid)(包括(但不限于)泊洛尼克酸F68(泊洛沙姆188(poloxamer188)))或PEG。合适的表面活性剂例如包括(但不限于)以聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)(即,(PEO-PPO-PEO))或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)(即,(PPO-PEO-PPO))或其组合为基础的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO以商品名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF Wyandotte Corp..,Wyandotte,Mich.)在市面上出售并且进一步描述于美国专利第4,820,352号中,所述专利是以全文引用的方式并入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可为合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于稳定聚乙二醇化IFNβ以抵抗一种或一种以上应力(包括(但不限于)由搅拌产生的应力)。一些上述物质可被称作“膨胀剂(bulkingagent)”。一些也可被称作“张力调节剂”。为达成产物稳定性和抗菌效率,也可应用抗菌防腐剂;合适的防腐剂包括(但不限于)苄醇、苯扎氯铵(bezalkonium chloride)、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、甲酚和苯酚或其组合。美国专利第7,144,574号(其以引用的方式并入本文中)描述可能适合用于本发明的医药组合物和调配物以及其它传递制剂中的其它物质。
本发明的IFNβ多肽(包括与例如PEG等水溶性聚合物连接的IFNβ多肽)也可通过持续释放系统或作为持续释放系统的一部分来投与。持续释放组合物包括(包括但不限于)呈成形物品(包括(但不限于)薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物可相容材料,例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981);Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,同上文)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号;EP58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-共-聚乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,22,547-556(1983))、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及硅酮。持续释放组合物也包括脂质体捕获的化合物。含有所述化合物的脂质体是由本身已知的方法来制备:DE3,218,121;Epstein等人,Proc.Natl.Acad,Sci U.S.A.,82:3688-3692(1985);Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美国专利第4,619,794号;EP143,949;美国专利第5,021,234号;日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号;以及EP102,324。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。
脂质体捕获的IFNβ多肽可由以下文献中描述的方法来制备:例如,DE3,218,121;Eppstein等人,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.,82:3688-3692(1985);Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美国专利第4,619,794号;EP143,949;美国专利第5,021,234号;日本专利申请案83-118008;美国专利第4,485,045号和第4,544,545号;以及EP102,324中。脂质体的组成和尺寸为众所周知的或能够由所属领域的技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于(例如)Park JW等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1327-1331(1995);Lasic D和Papahadjopoulos D(编):MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998);Drummond DC等人,Liposomal drug deliverySystems for cancer therapy,Teicher B(编):CANCER DRUG Discovery and Development(2002);Park JW等人,Clin.Cancer Res.8:1172-1181(2002);Nielsen UB等人,Biochim.Biophys.Acta1591(1-3):109-118(2002);Mamot C等人,Cancer Res.63:3154-3161(2003)中。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。已描述IFNβ的若干调配物,包括(但不限于)鼻内调配物、水凝胶调配物和液体调配物(参看WO2005/120551、WO2005/110466和WO2005/058346,其以引用的方式并入本文中)。WO95/31479和WO95/31213(其以引用的方式并入本文中)中论述其它调配物。
在本发明的上下文中,向患者投与的剂量应足以随时间在个体中产生有益反应。通常,每剂肠外投与的本发明的IFNβ多肽的总的医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01微克到约100微克,或者每天每公斤体重约0.05毫克到约1毫克的范围内,但这是以治疗判断为依据。给药频率也是以治疗判断为依据,并且可以比批准用于人类的市售IFNβ多肽产品的频率更高或更低。通常,本发明的聚乙二醇化IFNβ多肽可通过上述任何投药途径投与。
XV.本发明IFNβ多肽的治疗用途
本发明IFNβ多肽适用于治疗多种病症。
可向罹患多发性硬化的个体投与本发明IFNβ多肽。可使用其作为多种恶性疾病、癌症、肿瘤或肿瘤血管生成的治疗:例如急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病、基底细胞癌、卵巢癌、子宫颈非典型增生、子宫颈癌、喉乳头状瘤、蕈样肉芽肿、胶质瘤、急性骨髓白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金氏病、黑素瘤、乳癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤(佐剂型、晚期以及预防型)、类癌瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、慢性骨髓性白血病、肾细胞癌、复发性浅表性膀胱癌、结肠癌、毛细胞白血病和骨肉瘤。可使用IFNβ作为针对多种病毒性感染的治疗剂,包括(但不限于)病毒性肝炎、带状疱疹和生殖器疱疹、乳头瘤病毒、病毒性脑炎、巨细胞病毒肺炎、疱疹性角膜炎、单纯疱疹、鼻病毒慢性持续性肝炎、慢性活性HCV(I型)、慢性活性HCV(II型)和慢性乙型肝炎、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、胶质瘤、特发性肺纤维化、异常细胞生长或用于免疫调节。
本发明IFNβ多肽可用于治疗多发性硬化(MS)(例如一般公认的四种类型MS中的任一种(良性、复发性缓解性MS(RRMS)、原发性进行性MS(PPMS)和继发性进行性MS(SPMS)))和用于单症状MS)、癌症或肿瘤、肝炎(例如乙型肝炎和丙型肝炎)或疱疹感染(后一种治疗视情况与用IL-10治疗组合)。
本发明还包括一种治疗具有针对IFNβ1a(例如AvonexTM或RebifTM)或针对IFNβ1b(例如BetaseronTM)的循环抗体的哺乳动物的方法。所述方法包括投与有效量的与所述抗体的反应减弱或不与所述抗体反应的IFNβ多肽。待治疗的哺乳动物可罹患以上所列的任何疾病或适合用IFNβ治疗的任何病状。本发明还包括一种制造用于治疗具有针对IFNβ1a(例如AvonexTM或RebifTM)或针对IFNβ1b(例如BetaseronTM)的循环抗体的哺乳动物的医药产品的方法。与所述循环抗体的反应减弱或不与所述循环抗体反应(例如反应减弱了至少约25%、至少约50%、至少约75%或至少约100%(即,不反应)的本发明IFNβ多肽调配成可注射调配物或其它合适的调配物。应答用任何市售IFNβ制剂()处理而形成于哺乳动物中的抗体(尤其中和抗体)可称为“循环抗体”。
WO2007/042602(其以引用的方式并入本文中)描述使用IFNβ预防或治疗局部缺血性再灌注损伤或多器官衰竭。数种病状(包括腹部损伤、肠梗塞、心血管手术和休克)可导致肠缺血性再灌注损伤(IRI)。除引起局部损伤外,IRI还在远隔器官中引发全身性发炎反应,从而产生称为多器官衰竭的综合征。在这一综合征中,肺尤其容易受损。美国专利公开案第US2004/0105843号(其以引用的方式并入本文中)描述针对患者的缺氧/局部缺血相关的血流阻力使用干扰素β。
WO2007/025991(其以引用的方式并入本文中)描述治疗罹患脱髓鞘视神经炎(DON)的患者的方法,所述方法包含相继或同时投与类固醇化合物和干扰素β蛋白。具有早期ON(视神经炎)表现的患者似乎也受益于IFNβ治疗。
WO2006/064026(其以引用的方式并入本文中)描述使用IFNβ治疗先前未接受IFNα治疗的HCV感染个体。
WO2003/075944描述用于治疗中风或短暂性缺血性发作的干扰素β样多肽。可使用与其它药剂组合的IFNβ,包括与因子XIII结合治疗发炎性肠病(例如溃疡性结肠炎)和克罗恩氏病(Crohn′s disease)的干扰素β;与IL-2R拮抗剂组合用于自体免疫疾病(例如多发性硬化)的IFNβ;或与病毒唑组合的IFNβ(参看WO2004/017921、WO2004/002500、WO2004/075903,其以引用的方式并入本文中)。IFNβ多肽可用于CML单一疗法、B细胞淋巴瘤单一疗法、滤泡性淋巴瘤疗法、丙型肝炎单一疗法、多发性骨髓瘤单一疗法或肾癌单一疗法。IFNβ多肽可与阿糖胞苷组合用于CML疗法、与基于阿霉素(doxorubicin)的疗程组合用于B细胞淋巴瘤疗法、作为CHOP样区的佐剂用于滤泡性淋巴瘤疗法、与病毒唑组合用于丙型肝炎疗法、与VBMCP、BCNU或VBMCP+HiCy组合用于多发性骨髓瘤疗法或与长春花碱(Vinblastine)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟尿嘧啶或IL-10组合用于肾癌疗法。
IFNβ的平均量可变化且尤其应基于取得资格的医师的推荐和处方。IFNβ的确切量见仁见智受以下因素影响,例如所治疗的病状的确切类型、所治疗的患者的病状以及组合物中的其它成分。本发明还提供治疗有效量的另一活性剂的投药。所给的量可容易地由所属领域的技术人员基于用IFNβ的疗法确定。
可以常规方式制造本发明医药组合物。
实例
提供下列实例以说明本发明,但不限制本发明。
实例1
这一实例描述选择将非天然编码氨基酸并入IFNβ中的位点的许多组可能的标准中的一些。
基于分析具有蛋白质数据库编号(PDB ID)1AU1的晶体结构,选择七个位点用于用非天然编码氨基酸对乙酰基苯丙氨酸取代:28、36、76、80、107、108和111。参看图1。残基80(N80)是糖基化位点。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的28、36、76、80、107、108、111和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸是与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:SEQ ID NO:1的28、36、76、80、107、108、111和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。
在独立的分析中,基于晶体结构PDB ID1AU1计算干扰素β的平均Cx值。使用Cx程序(Pintar等人(2002)Bioinformatics,18,第980页)评估各蛋白质原子的突出程度。这一结构的坐标可从蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)(Bernstein等人,J.Mol.Biol.1997,112,第535页)获得。Karpusas,M.,Nolte,M.,Benton,C.B.,Meier,W.,Lipscomb,W.N.,Goelz,S.在Proc Natl Acad Sci199794:11813-11818中描述了人类干扰素β的晶体结构。使用以下标准评估干扰素β的各位置以引入非天然编码氨基酸:(a)残基基于结构分析不应干扰IFN受体的结合,b)残基不应受丙氨酸或同系物扫描诱变影响,(c)残基应表面暴露并与周围残基展现最小的范德华力或氢键相互作用,(d)残基在干扰素β变异体中应可缺失或可变异,(e)残基经非天然编码氨基酸取代后将产生保守性变化和(f)残基可见于高度可挠性区或结构刚性区中。
以下表示涉及不同螺旋的残基:残基2-22(螺旋A)、残基51-71(螺旋B)、残基80-107(螺旋C)、残基118-136(螺旋D)和残基139-162(螺旋E)。AB环可用以下区段表示--AB1(残基23-35)、AB2(残基36-40)和AB3(残基41-50)。干扰素β在位置80(Asn80)处糖基化。在干扰素β的野生型序列中,位置17处为游离半胱氨酸(Cys17)。中和抗体结合区是残基41-49。存在两个推定的IFN受体(IFNαR2)结合区:1)残基25-35和2)残基121-135。推定的IFNαR1结合区是:残基80-100。
在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入对应于干扰素β中的如下二级结构的一个或一个以上以下区中的任何位置处:SEQ ID NO:1的螺旋A(2-22)、螺旋B(51-71)、螺旋C(80-107)、螺旋D(118-136)、螺旋E(139-162)、AB环:AB1(23-35)、AB2(36-40)、AB3(41-50)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中,非天然编码氨基酸在选自由干扰素β的残基25-35、80-100和121-135(SEQID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。在其它实施例中,非天然编码氨基酸在选自由SEQ ID NO:1的干扰素β的残基41-49或在SEQID NO:3、4中的相应氨基酸组成的群组的位置处经取代。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:SEQ ID NO:1的8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。参看图1和2以及表2。在一些实施例中,一个或一个以上非天然编码氨基酸并入IFNβ的一个或一个以上以下位置处:15、42、80、108、111、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,本发明的多肽包含一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽包含SEQ ID NO:1的C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,本发明的多肽包含C17S取代(在位置17处用丝氨酸取代半胱氨酸)和一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在SEQ ID NO:4的信号序列中包含一个或一个以上非天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,本发明的多肽在SEQ ID NO:4的信号序列中包含一个或一个以上天然编码氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中,一个或一个以上非天然氨基酸并入SEQ ID NO:4的前导序列或信号序列或其它IFNβ序列中。
在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸或在另一IFNβ序列中的相应氨基酸)。
在一些实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):SEQ ID NO:1的螺旋A(2-22)、螺旋B(51-71)、螺旋C(80-107)、螺旋D(118-136)、螺旋E(139-162)、AB环:AB1(23-35)、AB2(36-40)、AB3(41-50)或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在其它实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):干扰素β的残基25-35、80-100和121-135(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在其它实施例中,一个或一个以上以下区中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于):SEQ ID NO:1的干扰素β的残基41-49或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,一个或一个以上以下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接,包括(但不限于)位置:15、42、80、108、111、155或其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。在一些实施例中,信号序列或前导序列中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接(SEQ ID NO:4或其它IFNβ序列)。
无前导或信号序列/多肽但具有C17S取代的IFNβ的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。无前导或信号序列/多肽且无C17S取代的IFNβ的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。具有前导或信号序列/多肽但无C17S取代的IFNβ的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实例2
这一实例详述包括非天然编码氨基酸的IFNβ多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。这一实例还描述评估经修饰IFNβ多肽的生物活性的方法。
所属领域的技术人员已知克隆IFNβ的方法。IFNβ的多肽和多核苷酸序列和IFNβ于宿主细胞中的克隆以及IFNβ的纯化详述于以下文献中:Goeddel等人,NucleicAcids Res.8,4057(1980);美国专利第7,144,574号、第6,531,111号、第4,966,843号、第5,376,567号、第5,795,779号、第7,144,574号、第4,462,940号、第4,894,330号、第4,518,584号、第5,702,699号、第6,962,978号、第5,814,485号、第6,887,462号、第6,800,735号、第6,514,729号和美国公开案第US2002/0137895号、第US2004/0115169号和第US2005/0054053号,所有以全文引用的方式并入本文中。
编码无前导序列或信号序列但有C17S取代的IFNβ的cDNA如SEQ ID NO:2所示。在5′端对野生型IFN基因序列进行修饰以使其在头四个密码子中富含更多A-T。5′端的这些修饰不会改变氨基酸序列。这一序列所编码的多肽如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:3是无前导序列或信号序列且无C17S取代的IFNβ的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是有前导序列但无C17S取代的IFNβ的氨基酸序列。
使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的引入翻译系统表达含有非天然编码氨基酸的IFNβ。O-RS优先利用非天然编码氨基酸使O-tRNA氨酰化。翻译系统又应答编码的选择密码子将非天然编码氨基酸插入IFNβ中。合适的O-RS和O-tRNA序列描述于标题为“Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase andUses Thereof”的WO2006/068802中(E9--SEQ ID NO:5和E9的D286R突变体--SEQ IDNO:24)和标题为“Compositions of tRNA and Uses Thereof”的WO2007/021297中(F13;SEQ ID NO:6),其以全文引用的方式并入本文中。
表3:O-RS和O-tRNA序列
用含有经修饰IFNβ多核苷酸序列和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对期望非天然编码氨基酸具有特异性)的质粒转化大肠杆菌使得可将非天然编码氨基酸位点特异性地并入IFNβ多肽中。IFNβ多肽的表达在T7启动子的控制下。
用对乙酰基苯丙胺酸(pAF)抑制
基于SEQ ID NO:3所示的多肽序列产生表达构筑体。构筑体各自具有将产生在一个以下位置处具有非天然编码氨基酸取代的IFNβ多肽的琥珀终止密码子:28、36、76、80、107、108、111。
将用于表达IFNβ多肽的质粒转化于BL21DE3大肠杆菌细胞中。向细胞中加入对乙酰基苯丙胺酸(pAF),且引发蛋白质表达。IFNβ多肽表达的SDS PAGE分析如图3所示,且IFNβ多肽用箭头标记。泳道1:原始野生型IFNβ多肽(从CODA,Laguna Hills,CA获得的多核苷酸序列);泳道2:L28pAF;泳道3:M36pAF;泳道4:S76pAF;泳道5:N80pAF;泳道6:E107pAF;泳道7:K108pAF;泳道8:F111pAF;泳道9:具有优化5′端的野生型IFNβ。对于pAF取代的IFNβ多肽,例如L28pAF是指在位置28(亮氨酸)处经对乙酰基苯丙氨酸取代的IFNβ多肽(关于取代之前的原始序列,参看SEQ ID NO:3)。图3中所示的以下IFN多肽不具有C17S取代:L28pAF、M36pAF、S76pAF、N80pAF、E107pAF、K108pAF和F111pAF。从CODA获得的多核苷酸序列不是天然IFNβ多核苷酸序列,但由这个多核苷酸序列产生的IFNβ氨基酸序列不变。对于泳道9中显示的样品,虽然IFNβ多核苷酸序列的头四个密码子经修饰以致这一区富含更多A-T,但IFNβ氨基酸序列不变。
还将表达IFNβ多肽的质粒转化于W3110-B2大肠杆菌细胞中。T7聚合酶的表达在阿拉伯糖诱导性启动子的控制下。向细胞中加入对乙酰基苯丙胺酸(pAF),且通过加入阿拉伯糖(最终浓度为0.2%)引发蛋白质表达。在37℃下培育培养物5小时。从1公升烧瓶培养物中,分离100-200mg包涵体。图4显示W3110-B2大肠杆菌细胞中的抑制的总溶解产物(TL)、上清液(S)和小球(P)的SDS PAGE分析;箭头指示所产生的IFNβ多肽。泳道1和8:标记物;泳道2:在多核苷酸序列中具有富含A-T的5′端修饰的野生型IFNβ的TL;泳道3:在多核苷酸序列中具有富含A-T的5′端修饰的野生型IFNβ的S;泳道4:在多核苷酸序列中具有富含A-T的5′端修饰的野生型IFNβ的P;泳道5:在多核苷酸序列中具有N80pAF取代且具有富含A-T的5′端修饰的IFNβ的TL;泳道6:在多核苷酸序列中具有N80pAF取代且具有富含A-T的5′端修饰的IFNβ的S;泳道7:在多核苷酸序列中具有N80pAF取代且具有富含A-T的5′端修饰的IFNβ的P。没有一个构筑体编码C17S取代。
其它构筑体
用具有富含A-T的5′端并且编码C17S突变的IFNβ多核苷酸序列和用于非天然氨基酸取代的选择密码子产生表达构筑体。分离用这些构筑体产生的IFNβ多肽并聚乙二醇化。
包涵体制备溶解
通过混合使细胞糊状物再悬浮于4℃包涵体(IB)缓冲液I(50mM Tris(pH8.0)、100mM NaCl、1mM EDTA、1%Triton X-100,4℃)中,达到最终10%的固体浓度。通过使再悬浮物质穿过微流化床(microfluidizer)共计两次溶解细胞。离心(14,000g;15分钟;4℃)样品并倾析出上清液。通过使包涵体小球再悬浮于另一体积的IB缓冲液I(50mM Tris(pH8.0)、100mM NaCl、1mM EDTA、1%Triton X-100,4℃)中洗涤包涵体小球,并且使再悬浮物质穿过微流化床共计两次。随后离心(14,000g;15分钟;4℃)样品并倾析出上清液。将包涵体小球各自再悬浮于1体积的缓冲液II(50mM Tris(pH8.0)、100mM NaCl、1mM EDTA,4℃)中。离心(14,000g;15分钟;4℃)样品并倾析出上清液。将包涵体小球再悬浮到1/2体积的缓冲液II(50mM Tris(pH8.0)、100mM NaCl、1mM EDTA,4℃)中。随后将包涵体等分到适当容器中。离心(14,000g;15分钟;4℃)样品并倾析出上清液。溶解包涵体或贮存在-80℃下直到进一步使用。
包涵体溶解
用溶解缓冲液(20mM Tris(pH8.0)、8M胍、10mMβ-ME)溶解包涵体,达到最终浓度为10-15mg/mL。随后在室温下在恒定混合下培育溶解的包涵体1小时或直到完全溶解。随后离心(10,000g;20分钟;4℃)样品以去除任何未溶解的物质。如果蛋白质浓度较高,那么随后通过再用溶解缓冲液稀释调节各样品的蛋白质浓度。
再折叠
通过用4℃的20mM Tris(pH8.0)、60%蔗糖稀释样品达到最终蛋白质浓度为0.5mg/mL进行再折叠。在4℃下再折叠5天。
纯化
用Milli-Q H2O1:1稀释再折叠物质。经0.22μm PES滤膜过滤物质并加载到在20mMTris(pH8.0)、0.15M NaCl(缓冲液A)中平衡的Blue Sepharose FF柱(GE Healthcare)上。在上升流中,用5柱体积30%缓冲液B(20mM Tris(pH8.0)、2M NaCl、50%乙二醇)洗涤柱。通过用10柱体积100%缓冲液B洗涤柱洗提IFNβ多肽。
聚乙二醇化和纯化
取IFNβ池并用Milli-Q水稀释10倍。用50%冰乙酸调节各样品的pH值至4.0。浓缩样品至约1.0mg/mL。向各样品中加入1:12摩尔过量的激活PEG(activated PEG)(羟胺PEG)。随后在27℃下培育样品48-72小时。取样品并用水(<8m/S)稀释8-10倍且加载于用缓冲液A(50mM NaAc(pH6.0)、50mM NaCl、0.05%两性洗涤剂(Zwittergent)3-14)平衡的SP HP柱(GE Healthcare)上。用5柱体积缓冲液B(50mM NaAc(pH6.0)、500mM NaCl、0.05%两性洗涤剂3-14)洗提IFNβ多肽。汇合IFNβ的部份且在用IFNβ贮存缓冲液(20mM NaAc(pH5.0)、150mM NaCl、0.05%两性洗涤剂3-14)平衡的Superdex200筛分柱(sizing column)上走柱。收集聚乙二醇化物质并贮存在4℃。
图5显示聚乙二醇化之前和之后的IFNβ多肽:泳道1:具有C17S取代的IFNβ;泳道2:具有C17S和L28pAF取代的IFNβ;泳道3:具有C17S和M36pAF取代的IFNβ;泳道4:具有C17S和S76pAF取代的IFNβ;泳道5:具有C17S和F111pAF取代的IFNβ;泳道6:具有C17S和L28pAF-30K PEG的IFNβ;泳道7:具有C17S和M36pAF-30K PEG的IFNβ;泳道8:具有C17S和S76pAF-30K PEG的IFNβ;泳道9:具有C17S和F111pAF-30K PEG的IFNβ。聚乙二醇化分子在显示用于pAF的位置处接合。所有这些IFNβ多肽的多核苷酸序列都具有先前提及的富含A-T的5′端修饰。
Biacore研究(受体结合亲和力)
从克隆MHS1011-61064(OpenBiosystems,Huntsville,AL)扩增IFNAR2细胞外域的序列(由206个氨基酸组成,以序列LLPPGQ结束)。将这一插入物在T7启动子下游克隆于pET20表达载体(Novagen)中。在BL21(DE3)细胞(Novagen)中用0.4mM IPTG引发蛋白质表达。
因为所表达的蛋白质不可溶,所以从溶解的细胞中纯化包涵体并溶解于6M GndCl中。在37℃下用10mM DTT还原5ml等分试样(量为50mg)45分钟。随后在4℃下将混合物注入200ml再折叠缓冲液(由50mM Tris(pH8)、20mM NaCl、0.5M精氨酸、10%甘油组成)中且在平缓搅拌下培育过夜。
随后使用艾美康搅拌式超滤器(Amicon stirring cell)浓缩再折叠反应物至25ml,且用20mM Tris(pH8)、20mM NaCl、10%甘油透析过夜。使用AKTA FPLC系统(Amersham)在HP Q Sepharose上纯化单体再折叠的IFNAR ECD。使用制造商推荐的赖氨酸特异性偶合程序将纯化的IFNAR2ECD固定于CM5Biacore芯片上。固定约200RU功能蛋白。以50微升/分钟的流速将各种浓度的于HBS-EP缓冲液(Biacore)中的IFNβ变异体注射于含有固定的IFNAR2的流量计(flowcell)上和含有固定的牛血清白蛋白的对照流量计上。使用BiaEvaluation软件(Biacore)将所产生的传感图(sensogram)拟合1:1交互模型来计算kon、koff和Kd值。包括干扰素α产品和作为对照样品。表4显示用IFNβ多肽获得的平均Kd。
VSV抗病毒测定
IFNβ多肽的抗病毒活性可用多种测定测量。使用水泡性口炎病毒(VSV)确定IFNβ多肽的抗病毒活性。用于这一测定的培养基是DMEM、10%FBS、1%青霉素/链霉素、5ml HEPES。其它试剂包括无FBS和酚红的RPMI。所使用的MTT储备溶液的浓度于PBS中为5mg/mL。这一储备溶液在4℃下仅贮存两周。
以每孔30,000个细胞接种人类WISH细胞于50微升培养基中。第二天,用培养基2倍连续稀释IFNβ多肽。使用具有C17S天然氨基酸取代的IFNβ作为这些实验的对照。一式三份向WISH细胞中加入100μL稀释过的IFNβ多肽,达到最终孔体积为150μL。在37℃下在CO2培育箱中培育细胞和IFNβ多肽6小时。这6小时的培育后,以体积为50μL的培养基每孔加入10,000PFU VSV,每板每96个孔,用5ml培养基稀释20μLVSV。感染后45小时,通过抽吸去除培养基。用纸巾轻拍板去除残余培养基。
加入50μL由5mg/mL MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基溴化四唑)储备溶液于无酚红和FBS的RPMI中制备的1mg/mL MTT。通常每次测定都新鲜制备1mg/mL MTT。接着,在37℃下在CO2培育箱中培育板3小时。通过抽吸小心地去除MTT。每孔加入50μL异丙醇。将板放置在板振荡器上30到40秒以完成MTT的形成。在560nm下读取板,其中690nm作为参考波长。将数据绘制成图并使用Sigma-Plot程序计算IC50。
表5概述IFNβ多肽的抗病毒活性。第二列列出各化合物的平均IC50值。两种分子(C17S)M36pAF-30K PEG和(C17S)F111pAF-30K PEG较野生型分子(C17S)-IFNβ具有提高的抗病毒活性。
表5
IFNβ分子 | IC50(ng/ml) |
(C17S)M36pAF-30K PEG | 0.028 |
(C17S)F111pAF-30K PEG | 0.055 |
(C17S)-IFNβ | 0.19 |
(C17S)S76pAF-30K PEG | 0.26 |
(C17S)M36pAF | 0.27 |
(C17S)F111pAF | 0.23 |
(C17S)S76pAF | 0.50 |
(C17S)L28pAF-30K PEG | 0.74 |
(C17S)L28pAF | 0.88 |
实例3
本实例详述含羰基的氨基酸的引入以及其与含氨氧基的PEG的后续反应。
本实例展示一种产生合并有含酮的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的方法,所述多肽随后与约5,000MW的含氨氧基的PEG反应。在位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)处的各残基分别由具有以下结构的非天然编码氨基酸取代:
用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入IFNβ中的序列为SEQ ID NO:1(IFNβ)和SEQ ID NO:6或7(muttRNA,詹氏甲烷球菌),以及在上述实例2中所述的SEQ ID NO:24、5、19、20、21(TyrRS LW1、5或6)。
包含含羰基的氨基酸的IFNβ多肽变异体在经修饰后与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R为甲基,n为3并且N为约5,000MW。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化IFNβ以10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mMHepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中,与10倍到100倍过量的含氨氧基的PEG反应,并且随后在室温下搅拌10-16小时(Jencks,W.J.Am.Chem,Soc.1959,81,第475页)。随后,将PEG-IFNβ稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化和分析。
实例4
与由通过酰胺键联与PEG连接的羟胺基组成的PEG接合。
具有以下结构的PEG试剂是使用实例3中所述的程序与含酮的非天然编码氨基酸偶合:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
其中R为甲基,n=4并且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。
实例5
本实例详述将两种不同的非天然编码氨基酸引入IFNβ多肽中。
本实例展示一种产生在以下残基中的两个位置处并入包含酮官能团的非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的方法:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。除选择密码子是在核酸内的两个不同位点处引入之外,如实例1和实例2中所述来制备IFNβ多肽。
实例6
本实例详述IFNβ多肽与含酰肼的PEG的接合以及后续的原位还原。
合并有含羰基的氨基酸的IFNβ多肽是根据实例2和实例3中所述的程序来制备。具有以下结构的含酰肼的PEG在经修饰后与IFNβ多肽接合:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
其中R为甲基,n=2且N=10,000MW,并且X为羰基(C=O)。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化IFNβ在介于0.1-10mg/mL之间的浓度下溶解于25mM MES(SigmaChemical,St.Louis,MO)(pH6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical,St.Louis,MO)(pH4.5)中,与1倍到100倍过量的含酰肼的PEG反应,并且通过加入溶解于H2O中直到最终浓度为10-50mM的储备液1M NaCNBH3(Sigma Chemical,St.Louis,MO)原位还原相应腙。在黑暗环境中在4℃到室温下进行反应达18-24小时。通过加入约pH7.6的1M Tris(Sigma Chemical,St.Louis,MO)直到最终Tris浓度为50mM来终止反应或将反应稀释于适当缓冲液中以进行立即纯化。
实例7
本实例详述将含炔的氨基酸引入IFNβ多肽中以及用mPEG-叠氮化物使其衍生化。
在位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)处的残基各自由以下非天然编码氨基酸取代:
用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入IFNβ中的序列为SEQ ID NO:1(IFNβ)、SEQ ID NO:7(muttRNA,詹氏甲烷球菌)以及在上文实例2中所述的12、13或14。在大肠杆菌中表达含有炔丙基酪氨酸的IFNβ多肽并且使用实例3中所述的条件进行纯化。
将含有炔丙基-酪氨酸的经纯化IFNβ在介于0.1-10mg/mL的浓度下溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠,0.15M NaCl,pH=8)中并且向反应混合物中加入10倍到1000倍过量的含叠氮基的PEG。随后,将催化量的CuSO4和铜丝加入反应混合物中。在混合物经培育(包括(但不限于)在室温或37℃下约4小时,或在4℃下整夜)后,加入H2O并且通过透析膜过滤混合物。可包括(但不限于)通过实例3中所述的类似程序来分析样品的添加。
在本实例中,PEG将具有以下结构:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
其中R为甲基,n为4并且N为10,000MW。
实例8
本实例详述IFNβ多肽中用炔丙基酪氨酸取代大的疏水性氨基酸。
存在于一个IFNβ的以下区域中的Phe、Trp或Tyr残基:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)如实例7中所述由以下非天然编码氨基酸取代:
PEG在经修饰后连接到包含含炔的氨基酸的IFNβ多肽变异体上。PEG将具有以下结构:
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3
并且偶合程序将遵循实例7中的程序。这个过程会产生IFNβ多肽变异体,其包含大致与一种天然存在的大的疏水性氨基酸等比容的非天然编码氨基酸并且在所述多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰。
实例9
本实例详述由一个或一个以上PEG连接子分隔的IFNβ多肽同源二聚物、异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物的产生。
使实例7中产生的含炔的IFNβ多肽变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应:
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3
其中n为4并且PEG具有约5,000的平均MW,以产生两个IFNβ分子由PEG物理分隔开的相应IFNβ多肽同源二聚物。IFNβ多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物。将如同实例7和实例3中进行偶合、纯化和分析。
实例10
本实例详述糖部分与IFNβ多肽的偶合。
位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)处的一个残基如实例3中所述由以下非天然编码氨基酸取代。
包含含羰基的氨基酸的IFNβ多肽变异体在经修饰后与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β-连接氨氧基类似物反应。在100mM水性乙酸钠缓冲液(pH5.5)中混合IFNβ多肽变异体(10mg/mL)与氨氧基糖(21mM),并且在37℃下培育7小时到26小时。通过在环境温度下将接合糖的IFNβ多肽(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和β-1,4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)在150mM HEPES缓冲液(pH7.4)中培育48小时而使第二种糖与第一种糖酶促偶合(Schanbacher等人,J.Biol.Chem.1970,245,5057-5061)。
实例11
本实例详述聚乙二醇化IFNβ多肽拮抗剂的产生。
残基(包括(但不限于)与IFN受体结合有关的残基)如实例3中所述由以下非天然编码氨基酸取代。
包含含羰基的氨基酸的IFNβ多肽变异体在经修饰后与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
其中R为甲基,n为4并且N为20,000MW,以产生在多肽内的单一位点处经PEG衍生物修饰的包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽拮抗剂。如同实例3中进行偶合、纯化和分析。
实例12
直接连接IFNβ分子的IFNβ多肽同源二聚物、异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物的产生
包含含炔的氨基酸的IFNβ多肽变异体可与另一种包含含叠氮基的氨基酸的IFNβ多肽变异体直接偶合。IFNβ多肽多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合以形成异源二聚物、同源多聚物或异源多聚物。如同实例3、实例6以及实例7中进行偶合、纯化和分析。
实例13
PEG-OH+Br-(CH2)n-C≡CR′→PEG-O-(CH2)n-C≡CR′
A B
使聚烷二醇(P-OH)与烷基卤化物(A)反应形成醚(B)。在这些化合物中,n为1到9的整数并且R′可为直链或支链、饱和或不饱和的C1到C20烷基或杂烷基。R′也可为C3到C7饱和或不饱和的环状烷基或环状杂烷基,经取代或未经取代的芳基或杂芳基,或经取代或未经取代的烷芳基(所述烷基为C1到C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。通常,PEG-OH为具有800道尔顿到40,000道尔顿(Da)的分子量的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例14
mPEG-OH+Br-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C≡CH
用THF(35mL)中的NaH(12mg,0.5mmol)处理具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g,0.1mmol,Sunbio)。随后,将溶解于二甲苯中的80重量%溶液形式的炔丙基溴溶液(0.56mL,5mmol,50当量,Aldrich)和催化量的KI加入溶液中并且将所得混合物加热到回流历时2小时。随后加入水(1mL)并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层,用无水Na2SO4干燥,并将体积缩减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物,用若干份冷乙醚洗涤并干燥,得到炔丙基-O-PEG。
实例15
mPEG-OH+Br-(CH2)3-C≡CH→mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
用THF(35mL)中的NaH(12mg,0.5mmol)处理具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH20kDa;2.0g,0.1mmol,Sunbio)。随后,将50当量的5-溴-1-戊炔(0.53mL,5mmol,Aldrich)和催化量的KI加入混合物中。将所得混合物加热到回流历时16小时。随后加入水(1mL)并且在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层,用无水Na2SO4干燥,并将体积缩减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴添加到乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物,用若干份冷乙醚洗涤并干燥,得到相应炔。5-氯-1-戊炔可用于类似反应中。
实例16
(1)m-HOCH2C6H4OH+NaOH+Br-CH2-C≡CH→m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(2)m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+MsCl+N(Et)3→m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH
(3)m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH+LiBr→m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4)mPEG-OH+m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH→mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
首先向3-羟基苄醇(2.4g,20mmol)溶于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中加入粉末状氢氧化钠(1.5g,37.5mmol),并且随后加入溶解于二甲苯中的80重量%溶液形式的炔丙基溴溶液(3.36mL,30mmol)。将反应混合物在回流下加热6小时。向混合物中加入10%柠檬酸(2.5mL)并且在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层,用MgSO4干燥并浓缩,得到3-炔丙基氧基苄醇。
在0℃下,将甲烷磺酰氯(2.5g,15.7mmol)和三乙胺(2.8mL,20mmol)加入化合物3(2.0g,11.0mmol)溶于CH2Cl2中的溶液中,并且将反应液放置到冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(2.4g,9.2mmol)溶解于THF(20mL)中并且加入LiBr(2.0g,23.0mmol)。将反应混合物加热到回流历时1小时并且随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)并在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层,用无水Na2SO4干燥并浓缩,得到所需溴化物。
将mPEG-OH20kDa(1.0g,0.05mmol,Sunbio)溶解于THF(20mL)中并且在冰浴中冷却所述溶液。在强烈搅拌下历经数分钟加入NaH(6mg,0.25mmol),接着加入上文获得的溴化物(2.55g,11.4mmol)和催化量的KI。移除冷却浴并且将所得混合物加热到回流历时12小时。向混合物中加入水(1.0mL)并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层,用无水Na2SO4干燥,并将体积缩减到约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中,产生白色沉淀物,收集所述沉淀物以得到PEG衍生物。
实例17
mPEG-NH2+X-C(O)-(CH2)n-C≡CR′→mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR′
如上所示,也可通过使含有末端官能团的聚乙二醇聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶合来获得末端含炔的聚乙二醇聚合物。n介于1与10之间。R′可为H或C1到C4的小烷基。
实例18
(1)HO2C-(CH2)2-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2)mPEG-NH2+NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
将4-戊炔酸(2.943g,3.0mmol)溶解于CH2Cl2(25mL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g,3.3mmol)和DCC(4.66g,3.0mmol)并且在室温下将溶液搅拌整夜。所得粗NHS酯7未经进一步纯化即用于下一反应中。
将具有5,000Da的分子量的mPEG-NH2(mPEG-NH2,1g,Sunbio)溶解于THF(50mL)中并且将混合物冷却到4℃。在强烈搅拌下逐份加入NHS酯7(400mg,0.4mmol)。将混合物搅拌3小时,同时升温到室温。随后加入水(2mL)并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(50mL)并且分离有机层,用无水Na2SO4干燥,并将体积缩减到约2mL。将此CH2Cl2溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物并在真空中干燥。
实例19
本实例表示聚乙二醇的甲烷磺酰基酯(其也可称作聚乙二醇的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯)的制备。可通过类似程序来制备相应的甲苯磺酸酯和卤化物。
mPEG-OH+CH3SO2C1+N(Et)3→mPEG-O-SO2CH3→mPEG-N3
在氮气下,将150mL甲苯中的mPEG-OH(MW=3,400,25g,10mmol)共沸蒸馏2小时并且将溶液冷却到室温。将40mL无水CH2Cl2和2.1mL无水三乙胺(15mmol)加入溶液中。在冰浴中冷却所述溶液并且逐滴加入1.2mL经蒸馏的甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮气下,在室温下,将溶液搅拌整夜,并且通过加入2mL无水乙醇来中止反应。在真空下蒸发所述混合物以移除溶剂(主要是除甲苯之外的溶剂),过滤,再次真空浓缩并且随后在100mL乙醚中沉淀。用数份冷乙醚洗涤滤液并在真空下干燥,得到甲磺酸酯。
将甲磺酸酯(20g,8mmol)溶解于75ml THF中并且将溶液冷却到4℃。向冷却的溶液中加入叠氮化钠(1.56g,24mmol)。在氮气下,将反应加热到回流历时2小时。随后蒸发溶剂并且用CH2Cl2(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机馏分并且用无水MgSO4干燥。将体积缩减到20ml,并通过加入150ml冷的无水乙醚中使产物沉淀。
实例20
(1)N3-C6H4-CO2H→N3-C6H4CH2OH
(2)N3-C6H4CH2OH→Br-CH2-C6H4-N3
(3)mPEG-OH+Br-CH2-C6H4-N3→mPEG-O-CH2-C6H4-N3
可使用美国专利第5,998,595号中所述的方法来制备4-叠氮基苄醇,所述专利是以引用的方式并入本文中。在0℃下将甲烷磺酰氯(2.5g,15.7mmol)和三乙胺(2.8mL,20mmol)加入4-叠氮基苄醇(1.75g,11.0mmol)溶于CH2Cl2中的溶液中,并且将反应液放置到冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中并且加入LiBr(2.0g,23.0mmol)。将反应混合物加热到回流历时1小时并且随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)并在真空下移除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层,用无水Na2SO4干燥并浓缩,得到所需溴化物。
用THF(35mL)中的NaH(12mg,0.5mmol)处理mPEG-OH20kDa(2.0g,0.1mmol,Sunbio)并且向混合物中加入溴化物(3.32g,15mmol)和催化量的KI。将所得混合物加热到回流历时12小时。将水(1.0mL)加入混合物中并在真空下移除溶剂。向残余物中加入CH2Cl2(25mL)并且分离有机层,用无水Na2SO4干燥,并将体积缩减到约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中,产生沉淀物,收集所述沉淀物以得到mPEG-O-CH2-C6H4-N3。
实例21
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H+N3-CH2CH2CO2-NHS→N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
将NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H(MW3,400Da,2.0g)溶解于NaHCO3饱和水溶液(10mL)中并且将溶液冷却到0℃。在强烈搅拌下加入丙酸3-叠氮基-1-N-羟基琥珀酰亚胺酯(5当量)。3小时后,加入20mL H2O并且在室温下再将混合物搅拌45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节到3并且加入NaCl直到浓度为约15重量%。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物,用Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后,通过过滤收集产物并在真空下干燥,得到ω-羧基-叠氮化物PEG衍生物。
实例22
mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
在强烈搅拌下,向如所属领域中已知所制备并冷却到-78℃的乙炔锂(4当量)溶于THF中的溶液中逐滴加入溶解于THF中的mPEG-OMs溶液。3小时后,使反应升温到室温并通过加入1mL丁醇中止反应。随后加入20mL H2O并且在室温下再将混合物搅拌45分钟。用0.5N H2SO4将pH值调节到3并且加入NaCl直到浓度为约15重量%。用CH2Cl2(100mL×3)萃取反应混合物,用Na2SO4干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后,通过过滤收集产物并在真空下干燥,得到1-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
实例23
可使用以下文献中描述的方法将含叠氮基的氨基酸和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白质中:L.Wang等人,(2001),Science 292:498-500;J.W.Chin等人,Science301:964-7(2003);J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society124:9026-9027;J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),Chem Bio Chem11:1135-1137;J.W.Chin等人,(2002),PNAS United States of America99:11020-11024;以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.Comm.,1:1-11。并入氨基酸后,随即在37℃下,在存在2mM PEG衍生物、1mM CuSO4和约1mg铜丝的情况下,用磷酸盐缓冲液(PB)(pH8)中的0.01mM蛋白质进行环加成反应达4小时。
实例24
本实例描述对乙酰基-D,L-苯丙氨酸(pAF)和m-PEG-羟胺衍生物的合成。
使用先前描述于Zhang,Z.,Smith,B.A.C,Wang,L.,Brock,A.,Cho,C.和Schultz,P.G.,Biochemistry,(2003)42,6735-6746中的程序来合成外消旋pAF。
为合成m-PEG-羟胺衍生物,完成以下程序。向在室温(RT)下搅拌1小时的(N-t-Boc-氨氧基)乙酸(0.382g,2.0mmol)和1,3-二异丙基碳化二亚胺(0.16mL,1.0mmol)溶于二氯甲烷(DCM,70mL)中的溶液中加入甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH2,7.5g,0.25mmol,Mt.30K,来自BioVectra)和二异丙基乙胺(0.1mL,0.5mmol)。将反应物在室温下搅拌48小时,并且接着浓缩到约100mL。将混合物逐滴加入冷乙醚(800mL)中。经t-Boc保护的产物沉淀出来并通过过滤收集,用乙醚(3×100mL)洗涤。通过再次溶解于DCM(100mL)中并且在乙醚(800mL)中沉淀两次使其进一步纯化。在真空中干燥产物,得到7.2g(96%),通过NMR和茚三酮试验(Nihydrin test)加以确认。
上文获得的经保护产物(7.0g)的Boc脱除是在0℃下在50%TFA/DCM(40mL)中进行1小时并且接着在室温下进行1.5小时。在真空中移除大部分TFA后,通过向残余物中加入二噁烷(1mL)中的4N HCl而使羟胺衍生物的TFA盐转化为盐酸盐。将沉淀物溶解于DCM(50mL)中并且再次在乙醚(800mL)中沉淀。通过过滤收集最终产物(6.8g,97%),用乙醚(3×100mL)洗涤,在真空中干燥,在氮气下贮存。使用相同程序合成其它PEG(5K、20K)羟胺衍生物。
实例25
聚乙二醇化IFNβ的活体内研究
向小鼠或大鼠投与PEG-IFNβ、未经修饰的IFNβ和缓冲溶液。结果将显示,本发明的聚乙二醇化IFNβ与未经修饰的IFNβ相比具有优良的活性和延长的半衰期。类似地,向小鼠或大鼠投与经修饰的IFNβ、未经修饰的IFNβ和缓冲溶液。
药物动力学分析
WO2005/091944描述可用本发明的IFNβ化合物进行的药物动力学研究。通过静脉内或皮下途径向小鼠投与本发明的IFNβ多肽。在给药之前和给药之后的多个时间点对动物采血。采集各样品的血浆并通过放射免疫测定分析。可计算消除半衰期并且在包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽与野生型IFNβ或本发明IFNβ多肽的各种形式之间进行比较。类似地,可向猕猴投与本发明的IFNβ多肽。在给药之前和给药之后的多个时间点对动物采血。采集各样品的血浆并通过放射免疫测定分析。美国专利第6,962,978号(其以引用的方式并入本文中)描述IFNβ在灵长类动物中的药效学和药物动力学研究。
可向诸如多发性硬化的小鼠或大鼠实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)模型等动物疾病模型中投与本发明多肽。可使用诸如常用EAE模型等动物模型确定本发明多肽的功效。在EAE模型中,用源自髓鞘或髓鞘的蛋白质进行免疫从而引发模拟人类多发性硬化的大多数发炎和神经特征的疾病。EAE已用于小鼠、大鼠、兔子和狨猴中(Cannella等人PNAS,95,101005,1998;Zaprianova等人,Morfologiia,112,258,1997;Hassouna等人J.Urology,130,80610,1983;Genain和Hauser J.Mol.Med.75,18797,1997)。其它包括泰勒氏鼠类脑脊髓炎病毒(TMEV)模型(Murray等人,J.Neurosci.18,730614,1998)的模型可用于确定IFNβ多肽的功效。
实例26
包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ的安全性和/或功效的人类临床试验。
目的 为了观测经皮下投与的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类IFNβ的安全性和药物动力学。
患者 在研究中招募18名年龄介于20-40岁之间并且体重介于60-90kg之间的健康志愿者。所述个体应不会具有临床上显著异常的针对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选和B型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有任何以下迹象:高血压;任何原发性血液病史;严重肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢疾病、神经病史;贫血或癫痫病史;已知对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白具有过敏性;含咖啡因的饮料的习惯性和重度消费者;在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血;在进入研究的3个月内曾接触IFNβ;在进入研究的7天内患病;以及研究前身体检查或在进入研究的14天内临床实验室评估时具有显著异常。可对所有个体评估安全性,并且定时采集所有血液采集物用于药物动力学分析。所有研究都是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。
研究设计 其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机性、两个周期的交叉研究。将18名个体随机分配到两个治疗顺序组中的一组中(每组9名个体)。使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ和市售产品(例如或),在大腿上部经两个分开的给药期以皮下团注形式投与IFNβ。投与市售产品的剂量和频率是按照包装标签中所指示来进行。可通过包括其它个体组而在研究中加入使用市售产品的其它剂量、给药频率或所需的其它参数。各给药期由14天的清洗期分隔开。对于两个给药期的每一时期来说,在给药之前至少12小时以及给药后72小时将个体限制在研究中心,但在给药期之间不必如此。如果也存在其它剂量、频率或其它参数,那么也可加入其它个体组来测试聚乙二醇化IFNβ。IFNβ的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ。
血液取样在投与IFNβ之前和之后,通过直接静脉穿刺连续取血。在给药之前约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样品)以及在给药后大致以下时间:30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时,获得静脉血样(5mL)用于测定血清IFNβ浓度。将各血清样品分为两个等分试样。将所有血清样品贮存在-20℃下。以干冰运输血清样品。在第1天初始给药前即刻、第4天早晨、第16天给药前即刻以及第19天早晨进行空腹临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。
生物分析方法 使用ELISA试剂盒来测定血清IFNβ浓度。
安全性测定 在每次给药(第1天和第16天)之前以及在每次给药后6小时、24小时、48小时和72小时即刻记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试与基线相比的变化。另外,评估生命体征测量结果(包括血压)和身体检查结果与研究前相比的变化。
数据分析 通过从给药后的每一个值减去通过对给药前30分钟、20分钟和10分钟时采集的三个样品的IFNβ水平取平均值而测定出的平均基线IFNβ浓度而关于给药前基线IFNβ浓度来修正给药后血清浓度值。如果给药前血清IFNβ浓度低于测定的定量水平,那么其不包括在平均值的计算中。由关于基线IFNβ浓度所修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用BIOAVL软件的最新版本,通过利用Digital Equipment CorporationVAX8600计算机系统的不依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数:峰值血清浓度(Cmax);到达峰值血清浓度的时间(tmax);通过使用线性梯形规则计算的从时间零时到最后血液取样时间(AUC0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC);以及根据消除速率常数计算的末期消除半衰期(t1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区域中,通过连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。对于每一次治疗,计算药物动力学参数的平均标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存调配物/未经保存调配物)。
安全性结果 在各治疗组中,不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测试或血压相比无临床显著变化,并且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比也无显著变化。两个治疗组的安全性概况看来应类似。
药物动力学结果 在各时间点,测量所有18名个体在接受包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ后的平均血清IFNβ浓度-时间概况(未关于基线IFNβ水平进行修正)。所有个体都应具有在正常生理学范围内的给药前基线IFNβ浓度。根据关于给药前平均基线IFNβ浓度所修正的血清数据来测定药物动力学参数,并且测定Cmax和tmax。所选的任何临床比较物的平均tmax都比包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ的tmax显著更短。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ的末期半衰期相比,所测试的临床前比较物的末期半衰期的值显著更短。
尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行,但预期将在其它患者群体中出现类似的吸收特征和安全性概况;所述群体例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、预存自体程序中的患者或计划择期手术的患者。
总之,经皮下投与的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ应为安全的,并且被健康男性个体良好耐受。根据不利事件的相对发生率、临床实验值、生命体征和身体检查结果,市售形式的IFNβ与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ的安全性概况应相当。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化IFNβ向患者和医务工作者(health care provider)潜在地提供巨大临床效用。
实例27
灵长类动物试验-确定的干扰素β的PK/PD
关于四种干扰素-β-1b类似物在猕猴中皮下单次投药后进行的14天PK/PD研究目 的:评估猕猴中四种干扰素-β类似物在皮下单次投药后与媒剂对照组和对照组相比的药物动力学和血液学反应。
在研究第A1天开始驯化,后续天数依次编号。给药当天将指定为D1,后续天数依次编号。所使用的测试物品是Rebif(15μg/kg)、M36-30K(3、15和50μg/kg)、M36-40K(3、15和50μg/kg)、F111-30K(3、15和50μg/kg)和F111-40K(3、15和50μg/kg)。所使用的媒剂IFB调配物2007是10mM天冬氨酸、9%海藻糖,pH4.0
所使用的贮存条件是在-60℃或以下,且所使用的操作说明书是SNBL USA SOP中所规定的标准实验室防护措施。
测试或对照物品/媒剂制备:
测试物品在2-8℃下解冻测试物品过夜。通过平缓倒转小瓶5-6次,小心地混合测试物品。不振荡或搅拌溶液。混合后即刻进行稀释程序。
将从主办方(Sponsor)已调配的浓度为0.20mg/mL的储备测试物品制备测试物品给药溶液。通过连续稀释制备测试物品给药溶液。以最终浓度和总体积标记无菌容器且在制备期间放置在冰上。首先加入适当体积的媒剂,随后使用适当型号的移液管向含有先前加入的媒剂的标记小瓶中缓慢加入适当体积的测试物品溶液。不要引入气泡且防止起泡。通过用移液管上下吸取充分混合5到10次。通过倒转容器7-10次充分混合最终溶液。
阳性对照物品:在使用之前,通过平缓倒转小瓶5-6次,小心地混合阳性对照物品。
媒剂:在2-8℃下解冻媒剂溶液过夜。通过平缓倒转小瓶5-6次,小心地混合媒剂。
测试系统:
物种:食蟹猴(Macaca fascicularis)(为特殊使用目的而育种的猕猴(Purpose-bredcynomolgus monkey))是与人类密切相关的物种,有利于系统发育与生理学分析,且是常用于非临床毒性评估的物种。另外,这一物种对测试物品显示药理学反应。
给药历史 | 未处理动物 |
体重范围 | 4.0-6.5公斤 |
年龄 | 3-6年 |
性别 | 雄性 |
供应源 | SNBL USA储备 |
产地 | 中国 |
鉴别方法 | 独特的皮肤纹身和研究指定的动物数目 |
用于驯化的动物数目 | 49只雄性动物 |
用于给药的动物数目 | 42只雄性动物 |
环境条件:
将动物安置在监测温度和湿度的环境中。温度和相对湿对的目标范围分别在18℃与29℃之间和30%与70%之间。60分钟以内目标湿度范围以外的偏离视为偶然的且不会报告。自动照明系统将提供12小时日循环(diurnal cycle)。暗循环(dark cycle)可能因研究或设施相关活动而中断。
同时将动物个别地安置于笼中,所述笼遵照动物福利法(Animal Welfare Act)和实验动物饲养管理和使用手册(The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(国家研究委员会(National Research Council)1996)中阐述的建议。
膳食和喂养:
根据SNBL USA SOP,每天喂养动物两次。根据特定程序的需要(例如在抽取血液用于血清化学、尿收集或当执行包括麻醉的程序之前),可能使动物禁食。按常规分析膳食的污染物且膳食可见于制造商的说明书内。不期望存在含量会干扰研究结果的污染物。食物分析记录将保持在测试设施记录中。
提供新鲜饮用水供所有动物任意取食。按常规分析水的污染物,且按常规将根据SNBL USA SOP提供丰富玩具(enrichment toy)和生育照料(produce treat)。
实验设计
动物选择:
从SNBL USA储备中选择适当数目的动物。由兽医工作人员检查动物的健康且使动物进行血清化学、血液学和凝血筛选。分配49只证实健康的雄性动物用于研究。PE期间,再收集1mL血液,处理获取血清且运往主办方进行病毒筛选。
由主办方判断将42只雄性动物分配给特定研究小组,且其余动物用作备用。
随机化:
使用基于体重的分层随机化方案将动物分配给研究小组。
驯化期:
在给药开始之前,使先前检疫的动物适应研究房间最少14天。收集所有动物(包括备用动物)的驯化数据。评估所有动物的可影响研究执行的行为异常。基于驯化期期间所产生的结果,需要时可用备用动物更换分配的动物。D1后,将从研究中去除备用动物。
将动物分配到各组且如下表中所指示加以处理:
表6:组分配
注解:总剂量体积(mL)基于最近的体重计算。
测试和对照物品的投药:
基于先前关于猕猴的研究选择组分配表6中所说明的研究剂量以在近似预期人类剂量到高倍预期人类剂量范围内。
投药途径和投药频率:所有组都在背部的夹住肩胛间区域中皮下给药,且这一投药途径与所建议的人类投药途径一致且期望提供适于研究的血清含量和相关药理学活性和药物动力学。频率是一次。
观察和检查:图6-21和这个实例中所包括的所有表所示的数据提供执行这种方案得到的观察和检查结果。A2开始,每天对每一动物进行两次临床观察。第一次观察发生在上午,在打扫房间之前。第二次观察是在上午观察后4小时以后。如果动物的临床观察显示动物病状消退,那么兽医进行评估且通知研究指导者。D1开始,每天评估每一动物的注射部位一次。PK和新喋呤时间点是投药后3、6、12、24、48、72、96、120、144、168、216、264和336小时。PD时间点是投药后第-1天、第2天、第3天、第5天、第9天、第11天和第15天(且-1是投药前)。血液学时间点是第-1天、第2天、第5天、第8天、第11天、第15天;且免疫原性和临床化学时间点是第-1天和第15天。笼边观察(Cageside observation):每天检查和每天两次ISR检查。
体重:
在驯化第一周的期间、给药前一天和研究生命期(in-life portion)结束时,称量各动物。
4.7.实验程序
频率表
研究日 Heme
EDTA(1.3mL) Chem
SST(1.0mL) PK
SST(1.0mL) PD/qPCR
表7:执行数据收集和分析的研究日期
X:所执行的程序
血液收集:
一般血液收集/采样方法和试样处理:
通过静脉穿刺从受约束的有意识动物的外周静脉收集血液。只要有可能,就通过单次抽取收集血液,随后适当分配。根据SNBL USA SOP处理试样(除Paxgene外)以获取血清或血浆。
血液学:
从所有动物/组收集样品体积为1.3mL的血液,加入抗凝血剂EDTA,随后分析样品且使用Advia自动分析仪测定血液学参数。
血液学参数:测量以下参数且与正常范围比较:
(Xybion代码)白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板(PLT)、平均血小板体积(MPV)、网织红细胞百分比(RET%)、绝对网织红细胞数(RETA)和白细胞分类计数(绝对数),包括绝对嗜中性粒细胞(NEUA)、绝对淋巴细胞数(LYMA)、绝对单核细胞数(MONA)、绝对嗜酸性粒细胞数(EOSA)和绝对嗜碱性粒细胞数(BASA)。
血清化学测量:
对于血清化学测量,对所有动物/组进行这些测量且测量需要空腹过夜和样品体积为1mL的血液。虽然不使用抗凝血剂,但使用血清分离管且使用Olympus自动分析仪测定化学参数。参数包括:(Xybion代码)白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、钙(Ca)、总胆固醇(TCho)、肌酸激酶(CK)、肌酸酐(CRN)、γ谷氨酰转氨酶(GGT)、葡萄糖(GLU)、无机磷(IP)、总蛋白(TP)、三酸甘油酯(TRIG)、血液尿素氮(BUN)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白比率(A/G)、氯化物(Cl)、钾(K)和钠(Na)。
试样处理和贮存:将血清分成两个近似相等的体积且各自转移到Matrix品牌小瓶中且贮存在-20℃或以下。
以表7中所列的频率对所有动物/组进行药效和定量聚合酶链反应,且使用SNBLUSA标准操作程序进行收集。样品体积约2.5mL血液,于抗凝血剂PAXgene管中,处理并贮存在-15℃到-25℃下。
灵长类动物试验的数据:
表8:剂量异速增加尺度规律-REBIF
剂量异速增加尺度规律Rebif-每次注射0.044mg,约等于0.003mg/kg
物种 | 体重(kg) | 估算总剂量(mg) | 剂量(mg/kg) | 剂量(mg/m2) | 估算BSA(m2) |
人类 | 65.00 | 0.07 | 0.00 | 0.04 | 1.710 |
小鼠 | 0.02 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.007 |
仓鼠 | 0.03 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.009 |
大鼠 | 0.15 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.025 |
天竺鼠 | 1.00 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.089 |
兔 | 2.00 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.159 |
猫 | 2.50 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.197 |
猴 | 4.00 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.297 |
狗 | 8.00 | 0.01 | 0.00 | 0.02 | 0.448 |
物种 | 体重(kg) | 估算总剂量(mg) | 剂量(mg/kg) | 剂量(mg/m2) | 估算BSA(m2) |
人类 | 65.00 | 0.07 | 0.00 | 0.04 | 1.710 |
小鼠 | 0.02 | 0.00 | 0.01 | 0.04 | 0.007 |
仓鼠 | 0.03 | 0.00 | 0.01 | 0.04 | 0.009 |
大鼠 | 0.15 | 0.00 | 0.01 | 0.04 | 0.025 |
天竺鼠 | 1.00 | 0.00 | 0.00 | 0.04 | 0.089 |
兔 | 2.00 | 0.01 | 0.00 | 0.04 | 0.159 |
猫 | 2.50 | 0.01 | 0.00 | 0.04 | 0.197 |
猴 | 4.00 | 0.01 | 0.00 | 0.04 | 0.297 |
狗 | 8.00 | 0.02 | 0.00 | 0.04 | 0.448 |
表9:剂量异速增加尺度规律-BETASERON
剂量异速增加尺度规律-Betaseron每次注射0.25mg,约等于0.013mg/kg
物种 | 体重(kg) | 估算总剂量(mg) | 剂量(mg/kg) | 剂量(mg/m2) | 估算BSA(m2) |
人类 | 60.00 | 0.24 | 0.00 | 0.15 | 1.622 |
小鼠 | 0.02 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.007 |
仓鼠 | 0.03 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.009 |
大鼠 | 0.15 | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.025 |
天竺鼠 | 1.00 | 0.00 | 0.00 | 0.04 | 0.089 |
兔 | 2.00 | 0.01 | 0.00 | 0.05 | 0.159 |
猫 | 2.50 | 0.01 | 0.00 | 0.05 | 0.197 |
猴 | 3.00 | 0.01 | 0.00 | 0.05 | 0.245 |
狗 | 8.00 | 0.03 | 0.00 | 0.07 | 0.448 |
物种 | 体重(kg) | 估算总剂量(mg) | 剂量(mg/kg) | 剂量(mg/m2) | 估算BSA(m2) |
人类 | 60.00 | 0.24 | 0.00 | 0.15 | 1.622 |
小鼠 | 0.02 | 0.00 | 0.05 | 0.15 | 0.007 |
仓鼠 | 0.03 | 0.00 | 0.04 | 0.15 | 0.009 |
大鼠 | 0.15 | 0.00 | 0.03 | 0.15 | 0.025 |
天竺鼠 | 1.00 | 0.01 | 0.01 | 0.15 | 0.089 |
兔 | 2.00 | 0.02 | 0.01 | 0.15 | 0.159 |
猫 | 2.50 | 0.03 | 0.01 | 0.15 | 0.197 |
猴 | 3.00 | 0.04 | 0.01 | 0.15 | 0.245 |
狗 | 8.00 | 0.07 | 0.01 | 0.15 | 0.448 |
基于销售产品的目前治疗剂量并且就体表面积加以调整,Betaseron=32MIU/mg;Rebif=270MIU/mg和Avonex=200MIU/mg。
表10:干扰素β变异体数据
表11:干扰素β变异体血液学数据
表12:干扰素β红细胞压积数据
*使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和弗朗尼事后检验(Bonferonni post hoc),显著不同(p>0.05)
处理后第8天,MCHC差异是31.5±0.8g/dL(媒剂对照)对33.9±0.9g/dL(Rebif)
第8天,所有组的平均值是32.6±0.6g/dL。历史参考范围是30.3±1.11g/dL
3μg/kg Rebif(相等人类剂量)的AUC=13.6ng*hr/mL,每周投药三次=40.8ng*hr/mL,且3μg/kg单次剂量的M36-40K的AUC等于每周投药的Rebif的AUC的19倍。
关于白细胞,在Rebif、M36-30K(15和50μg/kg剂量)、M36-40K(15和50μg/kg剂量)、F111-30K(50μg/kg剂量)和F111-40K(3和50μg/kg剂量)中存在相当显著的嗜中性粒细胞减少,然而第-1天时范围是1.92到5.66(10^3/μL),来自SNBL的历史范围是5.37±2.75(10^3/μL),且截止处理后第15天,所有组都回到给药前水平(且截止处理后第5天,大部分已回到给药前水平)。
关于临床化学,与对照值无显著差异且一个组中存在血清ALT含量增加的趋势。从处理后第-1天到第15天,F111-30K在所有组中都具有增加,然而所有组中都存在极大标准偏差,且来自SNBL的历史范围是36±12U/L[F111-30K(3μg/kg剂量):36到49U/L;F111-30K(15μg/kg剂量):34到60U/L;F111-30K(50μg/kg剂量):32到57U/L],且肝功能测量中无其它相关变化。
实例28
目的
以下方法用于利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)评估未聚乙二醇化和40K聚乙二醇化的干扰素-β(PEG-IFB)的相对纯度和可能的化学降解(即,氧化)和工艺相关杂质。
原理
RP-HPLC是基于相对疏水性分离分子的技术。使样品通过与烃链共价键结的二氧化硅固定相。相关分子被固定相延滯,且用梯度流动相洗提。色谱洗提时间为特定分子所特有。这种方法基于与例如氧化等结构修饰相关的疏水性和滞留特性的细微差异来分离IFB和PEG-IFB与同种型。
范围
这一方法支持IFB和PEG-IFB的鉴别和纯度评估。使用这一技术可观察一些部分降解的产物和工艺相关杂质。使用这一方法可观察到仅部分分辨出某些蛋氨酸氧化位点和可能的脱酰胺化。
极限
额定注射量=10μg
用额定量的50-150%的注射量实现线性
1.材料和设备:
可调型P20、P200、P1000Pipetman或等价物。
一次性P20、P200和P1000移液管吸头(pipet tip)。
HPLC小瓶和盖子(Alltech100μl螺旋盖型聚丙烯小瓶#12962、特富龙内衬盖(TFEliner cap)#73048、开孔螺旋盖#73044或等价物)
洁净的1L和2L玻璃瓶
柱-Agilent Zorbax300SB-C3,4.6×150mm,3.5微米,(P.N.863973-909)
能够执行线性梯度的高压液相色谱仪(例如配备有真空除气器、四元泵、恒温自动进样器、恒温柱室、二极管阵列检测器(DAD)和Chemstation色谱软件的Agilent1100HPLC)
2.试剂
a.Milli-Q质量的水或等价物
b.除非另作说明,否则固体化学品是分析级或以上,且溶剂是HPLC级或以上。除非另外指出,否则试剂的贮存和程序性步骤在室温下发生。
c.Ambrx化学品的实例:
i.Fisher A998的HPLC级乙腈或等价物
ii.Halocarbon UN2699的生物级三氟乙酸或等价物
d.流动相A:0.1%(v/v)TFA水溶液
e.流动相B:0.1%(v/v)TFA乙腈溶液
样品
a.注射足够体积的样品溶液来加载10μg蛋白质。
程序
a.可设定仪器为以下条件
i.柱:Agilent Zorbax300SB-C3,4.6×150mm,3.5微米,
ii.自动进样器温度:4℃
iii.流速:1.0mL/min
iv.泵设置:
时间(min) | %A | %B |
0 | 65 | 35 |
2 | 65 | 35 |
10.5 | 54 | 46 |
17 | 51.4 | 48.6 |
26 | 45 | 55 |
31 | 30 | 70 |
32 | 65 | 35 |
37 | 65 | 35 |
注射器设置:
注射:标准注射
注射体积:变化
抽取速率:100μl/min
注射速率:100μl/min
针洗涤:20μl H2O
停止时间:根据泵而定
DAD信号:
峰宽:>0.1min
狭缝:4nm
停止时间:根据泵而定
柱恒温器:温度:25℃
积分结果:取决于分析软件
b.新柱应该用至少10柱体积(CV)HPLC级蒸馏水冲洗以去除运输溶剂。
c.清洁程序:依序用10CV以上HPLC级水和10-15CV100%甲醇冲洗柱。
d.贮存程序:贮存柱于100%甲醇中。
e.操作程序:用10-15柱体积100%流动相A使柱平衡。
f.注射测试物品和运行HPLC程序。
数据分析
a.滞留时间(使用A214)
记录测试物品的滞留时间:
b.纯度
计算测试物品的纯度:
(主峰的积分面积/所有峰的积分面积)×100%
所产生的色谱图的实例和由这一程序所得的纯度提供于图24-28中。
应了解,本文中所述的实例和实施例仅出于说明的目的,且将提示给所属领域的技术人员根据其作出的各种修饰和变化且所述修饰和变化包括在本申请案的精神和权限和附加权利要求书的范围内。本申请案中所引用的所有公开案、专利、专利申请案和/或其它文献出于所有目的以全文引用的方式并入本文中,引用的程度就如同已个別地将各个公开案、专利案、专利申请案和/或其它文献出于所有目的以引用的方式并入一般。
表6:引用的序列
序列号 | 序列名称 |
1 | 具有C17S取代的IFNβ的氨基酸序列 |
2 | 具有C17S取代的IFNβ的核苷酸序列(优化的5′端) |
3 | 无C17S取代的IFNβ的氨基酸序列 |
4 | 具有N末端序列而无C17S取代的氨基酸序列 |
Claims (102)
1.一种IFNβ多肽,其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
4.根据权利要求3所述的IFNβ多肽,其中所述多肽是与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述多肽是与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它IFNβ多肽连接。
6.根据权利要求5所述的IFNβ多肽,其中所述双官能连接子或聚合物是与第二多肽连接。
7.根据权利要求6所述的IFNβ多肽,其中所述第二多肽是IFNβ多肽。
8.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
9.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物是与所述IFNβ多肽中存在的非天然编码氨基酸连接。
10.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在所述蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
11.根据权利要求10所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
12.根据权利要求10所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
13.根据权利要求10所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
14.根据权利要求10所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基15、42、80、108、111、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
15.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由SEQID NO:4的前导序列或信号序列中的残基组成的群组的位置处经取代。
16.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在所述蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
17.根据权利要求16所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
18.根据权利要求16所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
19.根据权利要求16所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
20.根据权利要求16所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基15、42、80、108、111、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
21.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由SEQID NO:4的前导序列或信号序列中的残基组成的群组的位置处经取代。
22.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个或一个以上调节所述IFNβ多肽对IFN受体的亲和性的氨基酸取代、添加或缺失。
23.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个或一个以上增加所述IFNβ多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
24.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβA多肽包含一个或一个以上增加所述IFNβ多肽在重组宿主细胞中的表达或所述IFNβ多肽的活体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
25.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个或一个以上增加所述IFNβ多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
26.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸可与不与所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。
27.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
28.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
29.根据权利要求28所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;R2为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基;并且R3为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基,并且R4为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
30.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
31.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
32.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
33.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
34.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
35.根据权利要求34所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
36.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
37.根据权利要求36所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构:
其中n为0-10;R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基;X为O、N、S或不存在;m为0-10;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基,并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。
38.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
39.根据权利要求38所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。
40.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其是通过使包含含羰基的氨基酸的IFNβ多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。
41.根据权利要求40所述的IFNβ多肽,其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基是通过酰胺键联与所述水溶性聚合物连接。
42.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含包括氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。
43.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其是通过使包含含炔的氨基酸的IFNβ多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制备。
44.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其是通过使包含含叠氮基的氨基酸的IFNβ多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。
45.根据权利要求27所述的IFNβ多肽,其中所述叠氮基或炔基是通过酰胺键联与水溶性聚合物连接。
46.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物是分枝或多臂聚合物。
47.根据权利要求46所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物的各支链具有介于约1kDa与约100kDa之间的分子量。
48.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述多肽为IFNβ拮抗剂。
49.根据权利要求48所述的IFNβ多肽,其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
50.根据权利要求49所述的IFNβ多肽,其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚乙二醇组成的群组的部分。
51.根据权利要求48所述的IFNβ多肽,其中所述多肽阻止IFN受体的活化。
52.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
53.根据权利要求3所述的IFNβ多肽,其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过糖部分与所述多肽连接。
54.一种分离核酸,其包含在严格条件下与SEQ ID NO:2或编码SEQ ID NO:3或4的多核苷酸序列杂交的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。
55.根据权利要求54所述的分离核酸,其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。
56.一种制备根据权利要求3所述的IFNβ多肽的方法,所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离IFNβ多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚乙二醇组成的群组的部分。
58.根据权利要求56所述的方法,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
59.根据权利要求56所述的方法,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分,并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
60.根据权利要求59所述的方法,其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分是通过酰胺键联与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。
61.根据权利要求56所述的方法,其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分,并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
62.根据权利要求56所述的方法,其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分,并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
63.根据权利要求58所述的方法,其中所述叠氮部分或炔部分是通过酰胺键联与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
64.根据权利要求57所述的方法,其中所述聚乙二醇部分具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的平均分子量。
65.根据权利要求57所述的方法,其中所述聚乙二醇部分是分枝或多臂聚合物。
66.一种组合物,其包含根据权利要求1所述的IFNβ多肽和医药学上可接受的载剂。
67.根据权利要求66所述的组合物,其中所述非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。
68.一种细胞,其包含根据权利要求54所述的核酸。
69.根据权利要求68所述的细胞,其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
70.一种制备包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽的方法,所述方法包含在允许所述包含非天然编码氨基酸的IFNβ多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上包含选择密码子的编码IFNβ多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞;以及纯化所述IFNβ多肽。
71.一种调节IFNβ多肽的血清半衰期或循环时间的方法,所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述IFNβ多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
72.一种由具有SEQ ID NO:2中所示的序列或编码SEQ ID NO:3或4所示的多肽的多核苷酸编码的IFNβ多肽,其中所述多核苷酸包含选择密码子,并且其中所述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。
73.根据权利要求72所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
74.根据权利要求73所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
75.根据权利要求72所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由以下残基组成的群组的位置处经取代:位置1(即,在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167(即,在所述蛋白质的羧基末端)和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
76.根据权利要求75所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111、8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
77.根据权利要求75所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基28、36、76、80、107、108、111和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
78.根据权利要求75所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基8、15、19、36、42、46、48、49、80、108、111、113、155和其任何组合(SEQ IDNO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
79.根据权利要求75所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基15、42、80、108、111、155和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
80.根据权利要求72所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由SEQID NO:4的前导序列或信号序列中的残基组成的群组的位置处经取代。
81.根据权利要求72所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
82.根据权利要求74所述的IFNβ多肽,其中所述聚乙二醇部分具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。
83.根据权利要求74所述的IFNβ多肽,其中所述聚乙二醇部分是分枝或多臂聚合物。
84.根据权利要求83所述的IFNβ多肽,其中所述聚乙二醇部分具有介于约1kDa与约100kDa之间的分子量。
85.一种组合物,其包含根据权利要求72所述的IFNβ多肽和医药学上可接受的载剂。
86.一种IFNβ多肽,其包含一个或一个以上增加所述IFNβ多肽在重组宿主细胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。
87.一种IFNβ多肽,其包含通过共价键与所述IFNβ多肽在单一氨基酸处连接的水溶性聚合物。
88.根据权利要求87所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
89.根据权利要求87所述的IFNβ多肽,其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的氨基酸是非天然编码氨基酸。
90.根据权利要求10所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是与聚乙二醇分子连接。
91.一种IFNβ多肽,其包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子,其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与所述多肽连接。
92.根据权利要求91所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽是经单聚乙二醇化。
93.一种IFNβ多肽,其包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子,其中所述非天然编码氨基酸是经核糖体并入所述多肽中的预选位点处。
94.根据权利要求93所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个所述连接子、聚合物或生物活性分子。
95.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个或一个以上调节所述IFNβ多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
96.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个或一个以上调节所述IFNβ多肽的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。
97.一种调节IFNβ多肽的免疫原性的方法,所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述IFNβ多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。
98.根据权利要求1或4所述的IFNβ多肽,其中所述多肽还包含天然编码氨基酸取代。
99.根据权利要求1或4所述的IFNβ多肽,其中所述非天然编码氨基酸是在选自由残基36和F111和其任何组合(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)组成的群组的位置处经取代。
100.根据权利要求1或4所述的IFN多肽,其中所述多肽还包含C17S天然氨基酸取代(SEQ ID NO:1或在SEQ ID NO:3、4中的相应氨基酸)。
101.根据权利要求1所述的IFNβ多肽,其中所述IFNβ多肽包含一个或一个以上增强所述IFNβ多肽的抗病毒活性的氨基酸取代、添加或缺失。
102.根据权利要求4所述的IFNβ多肽,其中所述水溶性聚合物是通过肟键与所述多肽连接。
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