CN1046292C - 化学修饰用作血液替代物中氧转运者的血红蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

形成血液替代物基质的血红蛋白通过和由环开放氧化双/三糖如棉子糖来的聚醛发生反应，使之发生交联，从而得到修饰。该反应详见说明书描述。这样形成的四聚体血红蛋白和血红蛋白寡聚物具有预先确定的组成和有益特性。

Description

化学修饰用作血液替代物中氧转运者的血红蛋白的方法

本发明阐述的是血液替代物和它们的制备方法。更明确地说，它阐述的是以血红蛋白为基础的血液替代物，以及通过化学修饰血红蛋白，提高其用作血液替代物适合性的方法。

血红蛋白，作为血液中天然的氧气转运组分，是一种构建血液替代物基质的显而易见的候选物(例如作为水溶液)。试图制备一种满意的血红蛋白溶液来用作血液替代物方面，已经作了大量的科学工作，并已有大量报道。但是，血红蛋白在红血细胞外的化学性质和其在红血细胞内的性质有显著差别(例如，就其氧结合性来说)。通过对血红蛋白进行某种形式的化学修饰、使之更适合用作一种血液替代物的需要早为人们所认识，并且已经进行了大量的研究。

众所周知，血红蛋白是由四个亚单位组成的四聚物；两个a亚单位，每一个亚单位有一个球蛋白肽链，以及两β亚单位，每一亚单位有一个球蛋白肽链。四聚物的分子量大约是64千道尔顿，每一个亚单位的分子量基本上是相同的。四聚物血红蛋白在稀释的水溶液中，极易解离为α-β二聚物，在某些情况下，甚至可以进一步解离为2亚单位单体和β亚单位单体。二聚物和单体的分子量太小，以至于不能在身体的循环系统内保留，它们被肾脏过滤，随尿排出。这钟情况使得这类产品在体内有令人难以接受的短半衰期。另外，非交联的血红蛋白诱导非常显著的肾毒性，需要使这类产品中非交联血红蛋白的浓度降到最小。在亚单位间进行化学键合保证维持四聚物形式(分子内交联)的需要早就被认识到。同时，在两个或多个四聚物单位之间发生联连，形成分子量大于64千道尔顿的血红蛋白寡聚物和多聚物(分子间交联)，在许多情况下，也被认为是非常需要的。

当存在于红血细胞中时，血红蛋白在其分子内的一个特异位点上(称为DPG裂缝或DPG口袋)和一个天然配体二磷酸甘油酸(DPG)结合。当红血细胞膜去除后，DPG从血红蛋白上解离，结果使得血红蛋白分子的空间结构重排，同时使得血红蛋白对氧的结合力讨厌的升高。一种以血红蛋白为基础的令人满意的血液替代物，应该在最大程度上象血红蛋白在天然全血中那样，以相同的方式和在相同的情况下，结合、转运和释放氧气。在过去，通过共价结合DPG类似物如吡哆醛5′磷酸盐PLP到血红蛋白中形成血液替代物的方式阐述了这个问题。

1989年8月15日公布的Hsia的美国专利4,857,636描述了一个基于化学修饰血红蛋白的血液替代物，其中血红蛋白通过和聚醛反应而在分子内发生交联。在Hsia专利中，推荐使用的特异的聚醛是糖类如棉子糖(一种三糖)的环开放氧化产物。据称，该反应通过亚单位球蛋白链之间发生交联，将血红蛋白亚单位结合成四聚物，使四聚物血红蛋白稳定在T构型或R构型，从而控制所生成的四聚物对氧的结合力。该反应据称对通过预先决定量的稳定的四聚物之间发生分子间交联形成血红蛋白寡聚物来说是可控制的。根据Hsia专利，球蛋白链的非位点特异交联在允许使用大摩尔过剩聚醛，从而提高交联的稳定血红蛋白产量方面，是很有益处的。而与之相反的位点特异交联，通常来说，对试剂量的化学计算是必不可少的。

但是，对Hsia专利揭示的过程和产物进行更深的实验和研究发现：一些反应条件和其它因素的变化，该过程的控制和可重复性以及终产物的本质和组成，可出人意料地得到改善。对于象血液替代物这样准备对有生命动物使用的一种产品，应该有可控制和可重复的组分组成，以便其效果和副作用能得到很好的监测。

本发明的一个目的是提供制备基于血红蛋白的血液替代物的新方法。

本发明进一步的目的是提供血红蛋白和从氧化的、环开放糖类来的聚醛反应的改良方法和条件。

本发明在某种程度上是基于以下的发现：一个双/三糖(该名词在这里是指双糖如三糖)的聚醛产物在和血红蛋白的2,3-二磷酸甘油酸(DPG)裂反应时其有高度的特异性，从而将两个β球蛋白链交联起来，这说明聚醛产物本身有很大的同一性。环开放的、氧化的双/三糖在碱性条件下发生水解。例如，环开放的氧化棉子糖(O-棉子糖)溶液，当储存于pH大于7条件下时，发生显著的碱水解，产生氧化的双糖(如O-蔗糖)和氧化的单糖(如O-半乳糖)，和氧化的三糖混在一起。将储存液的pH值维持在小于7时，可以使O-棉子糖保持稳定，在pH值小于6时更好。

本发明的制备方法，通过将环开放的、氧化的双/三糖溶液(如棉子糖)的pH值保持在5.0-7.0之间，从而制备得到大量的均一聚醛。该产物能和血红蛋白以大约1∶1至4∶1化学计数值(根据双/三糖对血红蛋白四聚物的摩尔比)发生反应，得到大量的交联的稳定血红蛋白产物。在前面提高的Hsia专利中推荐使用大量过量交联剂(20∶1左右)来提高产物的产量证明是不必要的。另外，使用大量过量交联剂所产生的副作用，即对所得到的交联产物组成的性质缺乏控制和重复性差，在很大程度可以避免。通过使用有限的化学计数的交联剂，可以避免形成高分子量的团聚物。

因此，根据本发明的一个方面，在这里提供了一个化学修饰血红蛋白，使之在水溶液中更适合用作一种血液替代物的方法。它包括：

(a)将一个双/三糖置于一个氧化开环反应过程，从而产生聚醛；

(b)调整和维持得到的产物溶液的pH值，使之保持在pH5.0至pH7.0范围之间，防止形成的聚醛发生水解；

(c)将步骤(b)得到的产物，在溶液中，以基于双糖如血红蛋白四聚物的化学计数比率约1∶1至4∶1之间，和血红蛋白发生反应；

(d)还原所形成的希夫碱键，形成仲胺键；

(e)回收所形成的被修饰的血红蛋白。

通过运用本发明所得到的交联产物，其性质和组成不仅是可以控制的和可重复的，而且还有其它益处。该产物几乎不含有没有修饰过的血红蛋白，如果确实有少量的话，可以通过两次过滤的方法很容易地去除。它不含高分子量(大于600,000道尔顿)的血红蛋白团聚物。它含有大约40％的四聚物血红蛋白，少于5％的双聚物血红蛋白，同时有分子量在64,000至500,000之间的未均量的寡聚物。

以前的工作告诉我们，有必要避免血红蛋白在pH值低于7.4条件下交联，担心这样会过量形成高铁血红蛋白。本发明的一个意料之外的益处是：用所提及的交联剂，血红蛋白交联反应可以在pH值范围5.0至7.0的条件下进行，而不会形成过量的高铁血的蛋白。当然在该pH值范围内O-糖类(聚醛)是保持稳定的，因此，在交联反应之前的一个额外的pH调节或类似的步骤，可以省略。

附图的简短介绍：

图1是棉子糖发生氧化开环反应形成六醛，以及随后缩醛化合物化学平衡的图解显示；

图2是聚醛和血红蛋白化学反应以及随后的化学还原步骤的图解显示：

图3是以下描述的例1的产物的HPLC分析曲线；

图4是以下描述的例3的反应动力学图解显示；

图5是以下例4非修饰血红蛋白C4球蛋白链的色谱图，显示的是血红素、β链以及α链；

图6是和图5相似的色谱图，显示的是例4交联血红蛋白C4球蛋白链的分析结构。

本发明推荐使用的双/三糖是三糖棉子糖，本发明将进一步阐述，为了清楚起见，特引推荐使用棉子糖。但是，必须认识到，这只是一种推荐的双/三糖的选择，因此本发明不应解释为是具有限制性的。其它合适的三糖有：菜子糖、甘露三糖、半乳三糖、龙胆三糖、松三糖、O-α-D-吡喃半乳糖基-(1-6′)-甘露二糖、麦芽三糖和纤维三糖。合适的二糖有：蔗糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、松二糖、菜子二糖、半乳二糖、龙胆二糖、土冉糖和甘露二糖。本发明不应被解释为只限于使用特别提到的双/三糖。

通过在溶液中和一种强氧化剂如高碘酸盐(例如高碘酸钠或者高碘酸钾)发生反应，棉子糖被氧化开环，氧化反应在非常低的pH条件下进行。氧化反应完成后，通过加入合适的缓冲剂，将溶液的pH值调整到5.0-7.0范围之间，最好是在6.0-6.5范围之间。在pH值调整过程中形成的、可能干扰随后和血红蛋白反应的盐类，最好在这个时期内通过例如结晶、混合床离子交换、凝胶渗透色谱、逆向渗透等方法去除。磷酸缓冲液是很有效的，但是应该避免使用，因为溶液中剩余的磷酸能够干扰随后的交联反应。所得到的产物，可以在pH值缓冲到大约6.0左右的水溶液中储存备用。合适的缓冲液是那些能够将pH值缓冲在6-7之间的缓冲液，包括：MES(2-〔N-吗啉代〕乙烷磺酸)，BIS-TRIS(双〔2-羟乙基〕亚氨基-三〔羟甲基〕甲烷P；ADA(N-〔2-乙酰氨基〕-2-亚氨基二乙酸)；ACES(2-〔(2-氨基-2-氧代乙基)-氨基〕乙烷磺酸)；PIPES(哌嗪-N,N′-双〔2-乙烷磺酸〕)；MOPS(3-〔N-吗啉代〕丙烷磺酸)；TES(N-三〔羟甲基〕-甲基-2-氨基乙烷磺概)；HEPES(N-〔2-羟乙基〕哌嗪-N′-〔2-乙烷磺酸〕)。本发明强烈推荐使用BIS-TRIS和BIS-TRLS丙烷。

为提高反应效率起见，也最好在棉子糖反应溶液中避免使用磷酸缓冲液。在随后血红蛋白和开环棉子糖聚醛产物交联过程中，交联剂在DPG结合位点上发生特异的反应，但是磷酸盐也可以在这样的位点上发生反应，因此，避免使用磷酸盐也就避免了各种物质之间的竞争反应，结果会使产量提高，反应加快，同时对所得到化学产物进行更好地控制。

附图的图1显示了这个反应的化学过程。如果PH值没有得到很好地控制的话，O-棉子糖可能部分水解，形成一种O-蔗糖和O-半乳糖的混合物，在某些情况下，水解形成更小的氧化的片段。这样得到的一种二醛和四醛混合物不仅是我们所不希望得到的(因为它具有不均一性和不可重复性)，而且，由于它对血红蛋白的反应性低，因此要求使用的量很大，以便使产物的产量提高。在本发明的范围内，O-蔗糖和血红蛋白的交联反应是有效如有用的，但是反应进行得较慢，同时反应的特异性和在O-棉子糖的情况下有所不同。

本发明所述过程中优先选用的血红蛋白是人血红蛋白，其从红血细胞中得来。但是，本发明也可应用于其它种类的血红蛋白来形成血液替代物基质，例如动物血红蛋白，特别是牛血红蛋白，羊血红蛋白，以及其它类似的血红蛋白。对形成一种对病人使用的血液替代物基质来说，人血红蛋白是目前最优的选择。

本发明中使用的血红蛋白可根据标准的已知技术来提取和制备。裂解血红细胞，通过离心、过滤和类似的标准技术去除形成的细胞碎片和基质。最好是使用一种血红蛋白重量比浓度在2-14％之间血红蛋白溶液，以便产生一种具有最适合需要的组成和特性结合的产物。血红蛋白的浓度应该在实际允许的情况下达到最高，以避免终产物的毒性。最终的纯化适合用色谱法进行。

天然状态下，血红蛋白可以严紧(T)构象，也就是通常所说的脱氧血红蛋白，或者以松驰(R)构象，即通常所说的氧合血红蛋白状态存在。脱氧血红蛋白的氧结合性质是更适合人们需要的，因为这种构象被认为是血红蛋白在血液血红细胞中天然存在的构象。因此本发明最好作用于脱氧血红蛋白，和从棉子糖开环得来的聚醛发生交联反应可以将血红蛋白稳定在T构型上。但是，如果有人因为某些原因而选择从R构型血红蛋白开始，那么基于本发明的交联反应在整个过程中将血红蛋白稳定在R均型上。

血红蛋白脱氧形成脱氧血红蛋白最好是在和交联剂发生反应之前进行。根据已知技术，将血红蛋白溶液用一种非氧产生气体例如氯气来处理而完成脱氧。以前的工艺过程，包括前面提及的Hisa专利所描述的，使用一种如连二亚硫酸钠的还原剂来去除最后少量的氧合血红蛋白。根据本发明，这种技术不是最优的，因为发现连二亚硫酸残基的存在抑制O-棉子糖介导的四聚物血红蛋白的寡聚结合。因此最好是用一种氮气流连续处理。随后用合适的方法排除气体，这个过程应持续足够长的时间，以便完全转化为脱氧血红蛋白。

脱氧血红蛋白水溶液和所形成的聚醛交联剂的反应在水溶液中进行，温度范围为4-40℃，反应时间为2-96小时，最好是24小时左右。反应溶液最好是用一种bis-tris缓冲体系将pH值缓冲到不超过7.5，最好是在5.0-7.0之间，以避免六醛的水解和分解。聚醛对血红蛋白的摩尔比，象前面所提到的那样，基于O-棉子糖对四聚物血红蛋白的比率范围为1∶1至4∶1，最好是在化学计量为2.5∶1至3.5∶1之间。脱氧血红蛋白的浓度为1-15％(重量/体积)，最好是在5-10％(重量/体积)之间。

血红蛋白和六醛发生反应，血红蛋白链上的胺基和交联剂上的醛基反应，结果形成一种希夫碱键，这是一种可逆键。结合产物形成一种非交联血红蛋白的交联血红蛋白的化学平衡。附图中图2图解了这个过程。这种键需要被还原为一种稳定的，不可逆的伯胺键，以完成血红蛋白的交联，以便使之达到成为血液替代物的目的。还原剂最好是在交联反应基本完成之后加入到反应混合物之中。原有工艺，例如前面所提到的Hsia专利，推荐使用硼氢化钠作为还原剂，根据本发明的特点，选用甲硼烷二甲胺作为还原剂。这和原有工艺相比，可以避免气态氮的产生，具有很大的益处。当使用硼氢化钠时，会产生气态氮，从而给该过程的控制和总体掌握带来困难。在这个方面来说，使用甲硼烷二甲胺是一个显著的改进。其它水溶性甲硼烷低烷胺包括但不局限于：甲硼烷叔丁胺、甲硼烷氨、甲硼烷二甲胺、甲硼烷三甲胺以及甲硼烷三乙胺，这些都可以使用。另外一种可以使用但不被推荐的还原剂是氰基硼氢化钠。

还原交联过程中形成的希夫键以及还原没有反应的醛基在水溶液中进行，温度范围为2-25℃，反应时间2-36小时，最好是24小时。反应混合物的pH值缓冲到5-8，最好是在6.5-7.0之间。还原剂对亚胺基和醛基总和的摩尔比率为2∶1至5∶1，最好是在2.5∶1至3.5∶1之间，这是根据还原剂对加入到初始交联反应中的醛基的化学计量值来确定的。

通过和二甲胺甲硼烷发生反应使交联产物稳定的过程完成之后，该产物用一氧化碳处理，形成一种血红蛋白的保护复合物，从而达到贮存的目的。一氧化碳处理可以在反应温度下，方便地将一氧化碳气体通到所形成的反应溶液中。处理完后，最好是将混合物进行两次合适的过滤，以除去残余的还原剂和其它残余试利。残余缓冲液可通过凝胶渗透色谱法去除。如果需要去除非交联血红蛋白残基，可加入氯化镁分解非交联的四聚物血红蛋白，随后通过两次过滤去除残基。所得到的物质可在无菌条件下贮存备用。

最优的，特异实施例的详细阐述。

本发明将通过以下具体的，非限制性的实施例来进一步阐述。实施例1高碘酸盐氧化的棉于糖的制备

将棉子糖(76克，0.128摩尔)加入到无菌水(1升)中所形成的溶液在冰浴上冷却到4至10℃，然后逐份加入固体偏碘酸钠(181克)，通过调整加入速率以及在冰浴上冷却，使温度保持在15℃以下。偏高碘酸钠加入完毕之后，将溶液保持在10-15℃，搅拌2-24小时，使氧化反应完全。然后将溶液冷却到4℃，通过控制加入二硫化钠中合过剩的高碘酸盐。溶液的pH值用10N的氢氧化钠(100毫升)来调节，加入固体的BIS-Tris(终浓度为20mM)，这样pH被精确地调整到5.0。将溶液在4℃下放置16-24小时，使之部分脱盐，诱导形成结晶和清亮上清液。上清液里含有氧化的棉子糖。将上清液倒出、过滤。仔细地将溶液的终pH值调整到5.7+/-0.1。

前述过程所得到的产物在pH6.0条件下贮存21小时之后进行的HPLC分析见图3。代表环开放糖类产物，即六醛D-棉子糖单峰的存在清晰可见，说明产物具有均一性，同时说明不存在碱水解产物。在色谱上的另外一个显著的峰属于盐类和甲酸，它们都很容易被去除。

O-棉子糖通过用a)离子交换混合床树脂b)分子大小排阻色谱法或者c)逆向渗透脱盐来进一步纯化。实施例2通过混合床离子交换色谱法纯化O-棉子糖

向O-棉子糖溶液(20毫升，pH5.65中逐滴加入6N盐酸，将pH值调到1.6，然后通过30毫升Biozad AG501-8(D)分析级混合床树脂。收集洗脱液，将纯化的样品冷冻干燥形成一种固体的、白色晶状物。实施例3用O-棉子糖控制交关血红蛋白，然后用二甲胺甲硼烷还原的修正方法

将溶于pH值为6.5的50mM Bis-Tris缓中液的纯化血红蛋白(80％W/V)溶液30毫升在润湿氮气流下转变成脱氧血红蛋白，作用时间大约为4-6小时，室温，同时不断搅拌。将环开放的氧化棉子糖(112.5微摩尔)进行脱气处理，然后加入到脱氧血红蛋白中引起交聚及寡聚化反应。24小时后，加入3M的乙酸钠至终浓度为30mM，然后用2.25毫摩尔溶于1.3毫升脱气水中的二甲胺甲硼烷进行还原。还原反应进行过夜。

反应的进程用HPLC进行监测，结果见图4。峰1来自存在于混合物中的血红蛋白二聚物亚单位(32千道尔顿)，很显然，它们的量很少。峰2来自四聚物交联血红蛋白(64千道尔顿)，它们约占产物混合物的40％。峰3表示的是二聚体血红蛋白(128千道尔顿)。峰4来自平均分子量约为380千道尔顿的寡聚血红蛋白单位。值得注意的是，产物混合物中不含分子量超过600千道尔顿的组分。实施例4交联步骤特异性的证明

为了监测交联反应的进程，在有乙酸钠存在的情况，于交联反应进行1小时、2.5小时以及23小时后，用二甲胺甲硼烷还原O-棉子糖：血红蛋白(Hb)溶液。在Superdex(pharmacia)渗透凝胶上，用制备性分子大小排阻色谱法分离稳定的、交联的64KD(千道尔顿)组分，以0.5M的氯化镁作为流动相。

氯化镁溶液的作用是将非交联的四聚体血红蛋白解离成为α、β单体(32千道尔顿)。氯化镁不解离交联的血红蛋白。通过这种方法，交联血红蛋白可以和非交联血红蛋白分开，从而达到分析的目的。

交联64KD血红蛋白的血红素和球蛋白链用330埃孔C4多孔层实心球柱(250×4.6毫升用于分析、250×10毫米用于制备；分离组，Hespenia CA)，通过反相HPLC进行分离。展开剂含有0.1％的三氟乙酸以及从38％至60％的多种浓度梯度的乙腈，用于进行分离。在220nm下监测洗脱液，用冷冻干燥法回收球蛋白链。

用相似的方法，分离非交联的非修饰血红蛋白的血红素和球蛋白链。

附图中的图5显示的是非修饰血红蛋白的反相球蛋白链色谱，图6显示的是修饰的、交联血红蛋白的反相球蛋白链色谱。峰1代表血红素，峰2代表非修饰的β球蛋白链，峰3代表的是非修饰的α球蛋白链，峰4代表的主要是修饰的β双体，峰5代表的是修饰后的α双体，这对于那些热悉血红蛋白分析的人来说是很容易辩认的，同时也容易从相关文献中推断出来。通过比较图5和图6，可以很容易地看到：基于本发明的交联反应特异地发生在β双体上，即血红蛋白四聚体单位的β链上。

为了查明修饰(交联)的特异位点，将图5峰(组分)2，图6峰(组分)3、峰(组分)4所代表的球蛋白链用胰蛋白酶进行酶水解，随后进行肽段分析。如以下所示。球蛋白链的酶水解

将分离的球蛋白链溶于8M的尿素中(以提高其对水解的敏感性)，然后在室温下放置2-4小时。然后用pH值为8.5的碳酸氢铵缓冲液稀释成2M的尿素。加入胰蛋白酶(2％的总蛋白)，在室温下酶解18-20小时。然后在沸水中将胰蛋白酶水解产物加热2分钟，用80nM的碳酸氢铵缓冲液稀释成1M的尿素；随后在室温下用内蛋白酶Glu-C(1％的总蛋白)水解18至72小时。在加入HPLC柱之前，将水解产物进行离心或者过滤。肽分析

在多孔层实心球柱(25×0.46,The Separations Group,Hesperia,CA)上，通过反相HPLC方法分离肽段。用0.1％的三氟乙酸以及在100分钟内从0％开始一直到100％结束的乙腈浓度梯度的展开剂进行分离。在220nm监测洗脱液，以便检测肽段。

胰蛋白酶特异地在含有游离伯氨基的赖氨酸残基处切开蛋白链。它和伯氨基的反应是非常特异的，在血红蛋白中，这种氨基只能来自赖氨酸残基或者末端氨基酸基。血红蛋白球蛋白链的氨基酸序列是已知的。因此，对图5组分2和图6组分4用反相HPLC进行胰蛋白酶水解的肽分析，可以发现交联反应特异地发生在β链上的82位赖氨酸残基上，所有的82位赖氨酸残基在组分4样品中都丢失。同时交联反应还发生在β链的末端缬氨酸上，在组分4中，有一半的该缬氨酸在该位丢失。

通过以前的工作，可以知道血红蛋白β链的82位赖氨酸定位于血红蛋白的2,3-二磷酸甘油酸结合位点上。因此，根据本发明的方法，采用β链82位赖氨酸、在DPG结合位点上进行的交联反应的特异性得到证明和建立。实施例5高碘酸盐氧化的蔗糖的制备

用溶于50毫升无菌水中的3.8克(11.1毫摩尔)蔗糖和10.4克固体偏高碘酸钠，用例1描述的制备高碘酸盐氧化的棉子糖的方法进行制备。实施例6用O-蔗糖控制血红蛋白交联以及随后用甲硼烷二甲胺进行还原

取溶于pH值为6.5的50mM Bis-Tnis缓冲液中的纯化血红蛋白(8％W/V)溶液30毫升，在润湿氮气流下约4-6小时，将其转变成脱氧血红蛋白。温度条件为室温，同时不断搅拌。将环开放的氧化蔗糖(115毫摩尔)进行脱气处理，然后加入到脱氧血红蛋白中引起交联反应。24小时后，加入3M的乙酸钠至终浓度为30mM。然后用溶于0.8毫升脱气水中的11.4毫摩尔的甲硼烷二甲胺进行还原。还原反应进行过夜。

Claims (15)

1．一种化学修饰血红蛋白，使之在水溶液中更适合用作血液替代物的氧转运者的方法，它包括：

(a)将一种双/三糖进行氧化开环处理，以便形成一种聚醛；

(b)将产物溶液的pH值调整和维持在5.0至7.0之间，以防止所形成的聚醛大量水解；

(c)将步骤(b)所得到的产物在溶液中和血红蛋白进行反应，基于双/三糖对血红蛋白四聚体的反应化学计量比率为1∶1至4∶1；

(d)将所形成的希夫碱键还原为仲胺键；

(e)回收所形成的修饰血红蛋白。

2．权利要求1的方法，其中血红蛋白为人血红蛋白。

3．权利要求1的方法，其中血红蛋白的初始构型为T构型，通过和聚醛反应，将其稳定在T构型上。

4．权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，双/三糖对血红蛋白四聚体的化学计量值为2.5∶1至3.5∶1。

5．权利要求1的方法，其中还原形成伯胺键的还原反应是用甲硼烷二甲胺来完成的。

6．权利要求1的方法，其中双/三糖为一种双糖。

7．权利要求6的方法，其中双糖为蔗糖。

8．权利要求1方法中的双/三糖是一种三糖。

9．权利要求8方法中的三糖为棉子糖。

10．任何前述权利要求方法中的血红蛋白为脱氧血红蛋白。

11．权利要求10的方法包括通过将溶液中血红蛋白用可使血红蛋白完全脱氧的非氧产生气体处理使血红蛋白脱氧而形成脱氧血红蛋白的步骤。

12．权利要求11的方法，其中棉子糖的氧化开环是在酸性条件下，通过和高碘酸钠或高碘酸钾反应来完成的。

13．权利要求12的方法，其中反应产物溶液随后用选自MES,BIS-TRIS；ADA；ACES；PIPES；MOPSO；BIS-TRIS PRO PANE；BES；MOPS；TES和HEPES的缓冲液将其pH值缓冲到5.0-7.0，然后维持该pH范围以备后面使用。

14．权利要求13的方法，其中的缓冲液为双-三缓冲体系。

15．化学修饰交联的血红蛋白组合物，其含有40％的四聚体血红蛋白单位，0至5％的二聚体血红蛋白单位和分子量在64,000至500,000道尔顿之间的寡聚血红蛋白单位的混合物，该混合物不含分子量超过600,000道尔顿的多聚血红蛋白单位，混合物中四聚体和寡聚血红蛋白单位在DPG结合位点的82-赖氨酸位的β-珠蛋白链之间产生化学交联。

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