CN104862383A

CN104862383A - 用于核酸测序的组合物和方法

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Publication number: CN104862383A
Application number: CN201510087407.7A
Authority: CN
Inventors: K·特拉弗斯; G·奥托; S·特纳; C·海纳; C·马
Original assignee: Pacific Biosciences of California Inc
Current assignee: Pacific Biosciences of California Inc
Priority date: 2008-03-28
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2029-03-27
Also published as: CA2991818C; EP3425060B1; CA2719747A1; BRPI0909212A2; EP4230747A3; CN102084001A; US20180211003A1; US8153375B2; US20120289408A1; US20090298075A1; US20160348167A1; EP2274449A2; CA2991818A1; US8309330B2; US9404146B2; JP2011515102A; CN104862383B; EP2274449B1; US20160321397A1; US20110281768A1

Abstract

用于核酸测序的组合物和方法包含模板构建物，部分或完全连续构建物中包含双链部分，用于通过正义链和反义链中的一条链或两条链的测序来确定丰余序列以及多次重复测定完整构建物的序列。可选的是，其他的序列组分也可以包含在这种模板构建物内。本发明还提供了这些构建物以及这些应用所需的测序组合物的使用和制备方法。

Description

用于核酸测序的组合物和方法

本申请是国际申请PCT/US2009/001926，国际申请日2009年3月27日，中国国家阶段申请号200980115750.0的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求如下美国临时专利申请的权益：美国临时专利申请系列号61/072,160，申请日2008年3月28日，以及美国临时专利申请系列号61/099,696，申请日2008年9月24日，其内容已完整纳入本文作为参考。

本申请还涉及美国临时专利申请系列号61/139,402，申请日2008年12月19日，美国专利申请系列号[未分配]，申请日2009年3月27日(代理人备案系列号01-007701)和美国专利申请系列号[未分配]，申请日2009年3月27日(代理人备案系列号01-005902)，其完整内容已纳入本文作为参考。

有关联邦资助的研究的权利声明

无

发明背景

遗传密码是所有生命构架的蓝图，对遗传密码了解的能力已经在无数领域产生了巨大的进步。从诊断疾病的能力到鉴定进化联系和/或多样性的能力、操作遗传框架开发新材料和组合物的能力，这种了解为我们取得不可胜数的进展开启了大门，这些进展已经使人类获益良多，并且将继续受益。

这些进步就整体而言是涉及阅读遗传密码和/或确定遗传密码特征的技术方面的进步。例如，核酸测序技术的开发使我们能够以逐个碱基的方式确定核酸序列，并将遗传密码定位到整个人类基因组上。其他方面的进展包括以快速阵列为基础的技术，该技术可以使我们更合理地确定患者或其他生物样本的遗传模式。

每一个技术进步都使我们有机会通过与那些先进领域有关的相关或辅助技术进一步提高技术水平。例如，荧光染料化学的进展促进了遗传技术的许多进步，使我们能够对生物反应及其产物进行简单的分析。另外，微流体技术的开发提高了液体和试剂操作的水平，其达到的重复性水平是以前通过更常规的方式所无法达到的。

本发明涉及遗传分析中所用的改良工艺、系统和组合物，这些工艺、系统和组合物可以提高这些分析的精确度并使之更便于使用。

发明概述

本发明提供了改良的核酸模板构建物、组合物、试剂盒和包含这种构建物的系统以及制备和使用这种构建物的方法。

在第一方面，本发明提供了确定模板核酸区段中所含的共有核苷酸序列的方法。该方法包括在一个毗连核酸分子中提供模板核酸区段的正义和反义链。然后利用聚合酶介导的模板依赖的测序方法测定正义和反义链的序列，进而根据正义和反义链的序列确定靶核酸区段的共有序列。

在一个相关方面，本发明提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含具有第一和第二末端的双链核酸区段的模板核酸。第一发卡寡核苷酸在第一末端与模板核酸的两条链相连，第二发卡寡核苷酸在第二末端与模板核酸的两条链相连。然后利用模板指导的聚合酶介导的核酸测序方法测定模板核酸至少一条链的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含具有第一和第二末端的双链核酸区段的模板核酸，其中第一发卡寡核苷酸在第一末端与模板核酸的两条链相连，然后利用模板指导的聚合酶介导的核酸测序方法测定模板核酸的核苷酸序列。

在其他方面，本发明提供了测定核酸区段序列的方法，该方法包括提供一个模板核酸区段。片段包含第一和第二互补核酸链，第一链将连接第一核酸区段3’端的核酸连接到第二核酸区段的5’端，第二链将连接第一核酸链5’端的核酸连接到第二核酸链的3’端。然后模板核酸与引物序列接触，其中引物序列与模板核酸的至少一部分互补。然后通过监测模板依赖的引物延伸反应确定模板核酸的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了测定核酸序列的方法，该方法包括提供一个包含双链区段的模板核酸，其中双链区段包含第一和第二互补链以及至少一个将第一链3’端连接到第二链的5’端的第一单链寡核苷酸区段；以及监测模板依赖的合成反应过程中掺入的核苷酸来测定第一链、连接寡核苷酸区段和第二链的核苷酸序列。

在其他优选方面，在上述一个或多个类似寡核苷酸或发卡寡核苷酸内提供对照序列，如引物识别序列等。

在相关的方面，本发明提供了测定模板核酸区段的共有核酸序列的方法，其中在一个毗连核酸分子内提供模板核酸区段的正义和反义链。毗连核酸分子与引物序列接触和/或形成复合物，其中引物序列与毗连核酸分子的至少一部分互补，在聚合酶、多种核苷酸或核苷酸类似物存在的情况下形成核苷酸合成复合体，其中各个核酸合成复合体被沉淀到底物上，这样就可以通过光学方法测定各个复合体。然后监测和/或检测核酸合成反应中被各个复合体以模板依赖的方式掺入的核苷酸或核苷酸类似物的序列以确定正义和反义链的核酸序列。然后利用或比较正义和反义链的核酸序列以确定模板核酸的共有序列。

本发明还提供了混合样品测定方法。例如，在某些方面，本发明的方法包括从一群不连续核酸样品的每一个样品中制备模板核酸区段，其中模板核酸区段包含核酸样品的双链区段，双链区段的第一链通过连接寡核苷酸与双链区段的第二链连接，其中每一个不连续核酸样品的连接寡核苷酸都具有独特的可鉴定的序列特征。然后将来自于一群不连续核酸样品的模板核酸区段混合在一起，测定混合的模板核酸区段的序列以确定可鉴定的序列特征，根据测序步骤鉴定的至少一部分独特的可鉴定序列特征就可以确定来自于不连续核酸样品的核酸的序列。

本发明还涉及用于上述方法的组合物。在一个方面，本发明提供了包含模板核酸和至少一个第一连接寡核苷酸区段的组合物，其中模板核酸具有包含第一链区段和与第一链区段基本互补的第二链区段的双链核酸区段，第一连接寡核苷酸区段将第一链区段的3’端与第二链区段的5’端连接起来。组合物通常还包含能与模板核酸的至少一部分杂交并启动聚合酶介导的核酸合成的一个或多个引物序列以及聚合酶。

本发明还提供了用于实现本发明方法的模板制备试剂盒。这种试剂盒通常包含第一连接寡核苷酸、与第一连接寡核苷酸的至少一部分互补的引物序列以及用于将第一连接寡核苷酸连接到双链模板第一链的3’端和双链模板第二链的5’端的一种或多种连接试剂。另外，这种试剂盒通常还包含说明书以及可选的用于将连接寡核苷酸连接到待分析样品来源的双链靶核酸区段上的试剂。

本发明还包括用于测定核酸模板序列的系统。系统通常包括反应混合物，该混合物包含含有模板核酸、聚合酶以及与模板序列的至少一部分互补的引物序列的复合物，其中模板序列包含具有正义和反义链的双链区段，以及将正义链的5’端连接到反义链的3’端上的至少一个第一连接寡核苷酸，包含可检测标记基团的至少一个第一核苷酸或核苷酸类似物，以及用于检测第一核苷酸或核苷酸类似物被聚合酶掺入到引物延伸产物内的检测系统，

尽管为了说明对本发明作了相对详细的描述，但是应当理解的是，本发明的各种变体在本发明的范围内也可以实现。

附图简述

图1A以示意图的形式描述了单分子实时测序过程。图1B说明的是通过图1A所示的过程进行序列阅读的典型短片段。

图2说明的是用于本发明的模板构建物的两个典型实施方式。

图3以示意图的形式描述了利用图2所示的构建物进行的丰富或共有序列测序过程。

图4说明的是其他模板构建物及其在测序过程中的应用。

图5以示意图的形式描述了利用本发明的模板构建物进行共有序列测序的全过程。

图6以示意图的形式描述了利用本发明的模板构建物进行测序的另一种方法。

图7以示意图的形式描述了本发明所用的模板构建物的典型装配过程。

图8以示意图的形式描述了模板构建物的另一种装配过程。

图9以示意图的形式描述了本发明的另一种模板制备过程。

图10以示意图的形式描述了本发明的另一种模板制备过程。

图11提供了本发明的一个模板构建物的序列读数。

图12显示的是单核苷酸变体模板构建物的示意图。

图13显示的是反应混合物中变体模板百分数与通过实验呼叫的变体百分数的曲线。

图14显示的是利用本发明的模板构建物对大肠杆菌完整基因组进行序列覆盖的图。

图15显示的是碱基数对大肠杆菌基因组覆盖深度的曲线，其中图A是偏离复制起点的大肠杆菌基因组复位复制子的不正确测序结果，图B是正确结果。

图16显示的是单个毗连模板构建物内测定的大肠杆菌的大重复插入片段的示意图。

发明详述

I.概论

总体来说，本发明涉及用于核酸序列分析，特别是利用模板依赖的合成方法鉴定靶核酸的核苷酸序列进行序列分析的改良方法、系统和组合物。利用模板依赖的合成方法进行核酸序列分析可以在单个碱基或碱基群在模板介导的合成反应过程中被添加时确定它们，例如引物延伸反应，其中碱基的一致性需要与模板序列互补，引物序列可在合成过程中与模板序列杂交。其他这类过程包括连接驱动过程，其中寡核苷酸或多聚核苷酸与待分析模板序列形成复合物，用于鉴定该序列内的核苷酸序列。一般来说，这种过程是核酸聚合酶介导的酶催化过程，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶等或其他酶如连接驱动过程所用的酶，例如连接酶。

利用模板依赖的合成进行序列分析包括几个不同的过程。例如，现在到处都在使用的四色桑格测序方法，其中模板分子群用于制备一群互补片段序列。在存在四种天然核苷酸和一个亚群的染料标记的末端核苷酸如二脱氧核糖核苷酸存在的情况下进行引物延伸，其中每一种类型的末端子(ddATP，ddGTP，ddTTP，ddCTP)包含一种不同的可检测标记物。因此可产生一组同类的片段，其中片段终止于引物之外的序列内的每一个核苷酸上，并且以可以鉴定末端核苷酸的方式被标记。然后根据片段大小对同类片段群进行分离，例如，利用毛细管电泳，连接在不同大小片段上的标记物被鉴定出来后就可以确定末端核苷酸。因此，当标记物的序列通过分离系统的检测器时就可以直接读出合成片段的序列信息，根据互补性也就知道了待测模板的序列新型(参见，例如，美国专利系列号5,171,534，本文已完整纳入作为参考)。

模板依赖的测序方法的其他例子包括通过合成过程测序，其中当每一个核苷酸在被添加到正常延长的引物延伸产物内时就可以被反复确定出来。

焦磷酸测序方法是一种通过鉴定核苷酸掺入的合成过程而进行的测序方法，其对核苷酸掺入的鉴定是通过分析得到的合成混合物中是否存在测序反应副产物即焦磷酸盐而完成的。特别是一种引物/模板/聚合酶复合物只与一种类型的核苷酸接触。如果该核苷酸被掺入，那么聚会反应就会在三磷酸链的α和β磷酸之间裂解三磷酸核苷，释放出焦磷酸。然后利用化学发光的酶报告系统鉴定释放出的焦磷酸，该系统可将焦磷酸和AMP转化成ATP，然后利用可产生可测量光信号的荧光素酶测定ATP。当检测到光信号时说明有碱基掺入，没有光信号则没有碱基掺入。经过合适的洗涤步骤以后，各种碱基与复合物循环接触，顺序鉴定出模板序列内随后的碱基。参见，例如，美国专利系列号6,210,891，本文已完整纳入作为参考)。

在相关过程中，引物/模板/聚合酶复合物被固定在基质上，复合物与标记的核苷酸接触。复合物的固定可通过引物序列、模板序列和/或聚合酶，可以是共价的或非共价的。一般来说，优选的方面，特别是本发明的优选方面通过聚合酶或引物与基质表面之间的连接物来固定复合物。各种类型的连接物都可用于这种连接，其中包括，例如，提供生物素化的表面组分，利用如生物素-PEG-硅烷连接化学，然后生物素化待固定的分子，随后通过如链亲和素桥连接。其他合成连接化学以及非特异性的蛋白吸附也可用于固定。在其他构型中，核苷酸可以包含或不包含可去除的末端基团。一旦被掺入，标记物就会连接到复合物上，因而可以被检测出来。如果使用包含末端基团的核苷酸，那么带有不同可检测标记物的四种不同核苷酸都与复合物接触。标记的核苷酸的掺入可以使延伸终止，因为存在终止基团，标记物添加到复合物上。然后从掺入的核苷酸上去掉标记物和终止基团，经过适当的洗涤步骤以后，重复这个过程。对于不含终止基团来说，一种类型的标记核苷酸被添加到复合物上以确定该核苷酸是否能被掺入，通过焦磷酸测序。在去除核苷酸上的标记基团并经过合适的洗涤步骤以后，各种不同的核苷酸循环通过同一过程的反应混合物。参见，例如，美国专利系列号6,833,246，本文已完整纳入作为参考。

在另一种通过合成过程进行测序的方法中，不同标记核苷酸的掺入在模板依赖的合成进行时可以实时观察到。更具体地说，在荧光标记的核苷酸被掺入时可以观察到固定的各个引物/模板/聚合酶复合物，因此可以在每个碱基添加时实时鉴定之。在这个过程中，标记物基团连接到在掺入过程中被裂解的核苷酸的部分。例如，通过将标记物基团连接到掺入过程中被去除的磷酸链部分，即核苷多磷酸上的a、β、γ或其他末端磷酸基团，标记物不会被掺入到新生链内，取而代之的是产生出天然DNA。各个分子的观察通常包括将复合物光学禁锢在极小的光照空间内。通过光学禁锢复合物，可以得到一个监测区，随机弥散的核苷酸在其中停留的时间极短，而掺入的核苷酸可以在观察空间内存在较长的时间，因为它们已被掺入。这会产生出与掺入事件相关的特征性信号，信号模式的特征就是被掺入碱基的特征。在相关的方面，相互作用的标记物组分如荧光能量共振转移(FRET)染料对在有聚合酶或复合物的其他部分以及正在掺入的核苷酸存在的情况下提供，这样掺入事件可以将标记组分放到相互作用的近处，结果产生特征性信号，也就是说被掺入的碱基的特征(参见，例如，美国专利系列号6,056,661、6,917,726、7,033,764、7,052,847、7,056,676、7,170,050、7,361,466、7,416,844以及出版的美国专利申请系列号2007-0134128，其全部内容已完整纳入本文作为参考)。

基于这种单分子实时(Single Molecule Real Time(SMRT^TM))过程的一种典型测序过程如图1的示意图所示。如图1A的图I所示，包含聚合酶102、模板序列104和与模板序列104的一部分互补的引物序列106的核酸合成复合体被固定在一个狭窄光学空间(如虚线108所示)内，例如，得自逐渐消失的光域，得自零点模式波导管100的光照，或者在内部总反射荧光显微镜系统或上述其他光学禁锢系统内。

复合体周围的反应混合物包含四种不同的核苷酸(A、G、T和C)，每一种核苷酸用光谱学上可区分的荧光标记物标记，通过其末端磷酸基团连接到核苷酸上。由于光学空间如此之小，核苷酸及其相连的荧光标记物弥散进出光学空间的速度极快，因此只能产生极短的荧光信号(如下文数据示意图中的短脉冲110所示)。当一个特定核苷酸在引物延伸反应中被聚合酶掺入时，与核苷酸相连的荧光标记物可以在光照空间内停留较长时间(如较长脉冲112所示)。一旦掺入以后，荧光标记物就通过聚合酶的作用从碱基上裂解下来，标记物弥散消失。

通过测定具有不同光谱特征的较长脉冲，人们可以实时测定每一个掺入碱基在掺入时的特征。图1B提供了从这个过程读取的序列的短片段的典型曲线，其中含有根据其光谱特征而鉴定出的掺入核苷酸及其上面列出的其各自的脉冲。与掺入无关的短脉冲都很短，镜头难以捕捉到，而掺入产生的脉冲可提供更强的可检测脉冲，如图1B所示。

虽然是以特异性SMRT^TM测序过程的术语描述的，但是应当理解的是，根据本发明的测序组合物，核苷酸或核苷酸类似物也可以通过各种不同的机制来检测，其中包括是否存在通过a、β、γ或其他多个远端磷酸基团连接到核苷酸上的荧光染料标记物。例如，如上所述，核苷酸可能带有活性组分，如能与系统内其他位置的互补成分相互作用的FRET对的一个或两个成员(染料，半导体纳米晶体等)，例如，聚合酶、引物、核苷酸自身或基质上的。同样，这些核苷酸类似物也可以带有其他活性组分，如能改变其他近处组分的信号能力的能量供体或淬灭剂。另外，也可以使用非光学标志物，如高带电部分、磁性粒子等，这些可通过电化学系统检测，例如ChemFET传感器、纳米孔传感器(参见，例如，Clarke等，Nature Nanotechnology，在线出版：2009年2月22日|doi:10.1038/nnano.2009.12)等。另外，本文所描述的核苷多核酸通常包括可通过所用的聚合酶掺入的三、四、五、六或其他长度的磷酸链。这种化合物，其中包括带有可检测标记基团的那些化合物描述于，例如，美国专利系列号7,041,812，其完整内容已纳入本文作为参考。

对于多种方法来说，例如，上述单分子方法，比较理想的是能在单个光学可解析构型中提供核酸合成复合体，这样就可以监测单个复合体的合成反应。在单个可解析构型中提供这种复合体可通过多种机制完成。例如，通过在适于固定的基质表面提供复合体的稀释溶液就可以提供单个光学可解析复合体(参见，例如，Balasubramanian等的欧洲专利系列号No.1105529，本文已完整纳入作为参考)。另外，还可以提供低密度活化表面，复合体可连接其上(参见，例如，已公开的国际专利申请系列号WO 2007/041394，本文已完整纳入作为参考)。这种单个复合体可提供在二维基质上，或者掺入到其他结构内，例如，零点模式波导管或波导管阵列，以便于观察。

II.毗连双链模板

本发明提供了新模板构型以及在模板指导的测序过程中利用这些组合物的方法。虽然这些组合物和方法适用于本文所述的所有模板指导的过程，但是为了便于讨论，主要以优选的单分子、实时测序过程来描述，其中它们可提供多种优势。更具体地说，本发明一般涉及利用改良的模板序列提高测序过程精确度的核酸序列。例如，在至少一个方面，本发明的模板组合物的特征通常是存在双链区段或者内部互补的亚片段对，即，彼此互补。在特殊情况下，模板构建物内所包含的靶核酸区段一般主要由双链区段组成，例如，高于75％甚至高于90％的靶片段是双链的或者是内部互补的。为了便于讨论，这些双链靶片段，无论是完全互补或是大部互补，例如只有突出区，或者其他非互补区如次级环结构等，在本文中被称作互补或基本互补。如果文中需要两条链之间具有完全互补性，那么就要用术语“完全互补”或“完整互补”。

在本发明中，组成双链区段和/或内部互补链的链至少部分是连续的，在优选的方面，全部是连续的。在本文中，两条链部分连续是指两条链至少有一个末端是连接在一起的，完全连续是指两个末端连接在一起，形成一个总体呈环状的链构型，这种连接可以是正义链和反义链末端的直接相连，也可以通过连接寡核苷酸连接。应当理解的是，术语“环状”用于指链构型时仅仅是指不包含末端核苷酸的核酸链，例如，环，并不一定指任何几何构型。

本发明部分连续和完全连续的模板构型的例子在图2A和2B中以示意图的方式作了说明。更具体地说，图2A显示的是部分连续的模板序列，该模板包含由两个互补片段202和204组成的双链部分，例如，该部分代表靶序列或其一部分。如图所示，片段202的3’端通过连接寡核苷酸206连接到片段204的5’端，该寡核苷酸是模板的单链部分，这样就形成了部分连续序列。与之相比，图2B显示的是完全连续的模板序列210。序列21也包含由两个互补片段212和214组成的双链部分。与图2A的部分连续序列一样，片段212的3’端通过第一单链部分内的连接寡核苷酸216连接到片段214的5’端。另外，片段212的5’端通过第二单链部分内的连接寡核苷酸218连接到片段214的3’端，形成了完全连续的或环状模板序列。

在一个典型测序过程中，双链靶核酸如需要了解其信息的核酸被转化成本发明的模板构型。一般来说，这个过程包括将一群较长双链核酸如基因组、质粒或其部分片段化成一群较短的重叠双链靶核酸或核酸区段。然后处理双链区段以提供上述的连接寡核苷酸，下文将有进一步的描述。如本文所述，有许多方法可用于提供连接正义和反义链的连接寡核苷酸。在一个简单的例子中，使用的是外源发卡接头序列，这种序列只是简单地将双链区段的末端连接起来形成这种连接寡核苷酸。一般来说，这种外源发卡接头的较长序列在相对的两端包含两个互补的核酸序列片段，二者被另一段非互补核苷酸分开。结果形成的结构是由单链环将双链干结构连接起来。这种发卡结构的例子已有描述(参见，例如，美国专利系列号6,498,023、6,451,563和7,368,265，本文已完整纳入作为参考)。一般而言，这种结构易于通过常规核酸合成技术合成。其他许多方法利用另外的方式来制备连接寡核苷酸结构，这些将在下文予以描述。

确定了各种靶核酸区段的序列以后，要通过鉴定和排列来自于各种不同重叠片段的序列数据之间的重叠来确定起始靶核酸的序列。

本发明的模板与简单的线性模板序列，甚至其他环状模板序列相比有许多优点(参见，例如，美国专利系列号No.7,302,146有关用于测序的环状模板的讨论，本文已完整纳入作为参考)。更具体地说，与环状模板，本发明的模板构型可进行单分子共有序列测定，其中测定一个给定模板的序列以后可以复制获得的序列信息数据，通过为一个给定模板序列或序列部分提供多个读数，因而与线性模板相比提供了精确度，可用于从给定模板序列中推导出共有序列数据和/或用于这种序列内的特殊碱基定位。在这些模板中，一方面提供了确定共有序列的能力，利用模板整体结构的环状特性，对于完全毗连模板来说可以重复处理同一个分子从而得到共有碱基呼叫和/或共有序列。另外，本发明的模板利用其包含双链区段的优势可通过测定这种序列的正义和反义链来确定共有序列(在部分和完全连续构型中)。虽然本文主要描述的是确定共有序列，但是应当理解的是共有序列测定的水平可扩展到序列内给定碱基位置上的单个碱基水平，当将其放置在序列中时就得到了一个特定序列的共有序列数据。因此，本发明还包括模板序列内单个碱基位置上的共有碱基的判定(calling)(核苷酸鉴定)。

例如，关于图2A所示的部分毗连模板，获得完整序列如片段202、204和206的序列为我们提供了一种通过测定正义链如片段202和反义链如片段204的序列来确定共有序列的方法。除了提供来自于单个模板分子的正义链和反义链序列读数之外，其中单个模板分子的序列可在一个完整过程中测定，连接片段206的存在也为我们提供了一个获得注册序列(registration sequence)的机会，这个注册序列可用于确定一个片段如202何时完成而另一个序列如204何时开始。这种注册序列是排列同一模板序列读出的多个序列数据的基础，例如，同一分子或一个模板群内的同类分子。图3A以示意图的形式描述了测序技术取得的进展。更具体地说，如图所示，起始于，例如启动于部分毗连模板开放末端的测序过程沿着第一或正义链前进，提供了该链的核苷酸序列(A)，如图中所提供的序列读数所示。然后测序过程绕着模板的连接寡核苷酸前进，提供了该片段的核苷酸序列(B)。测序过程进而沿A序列的反义链继续进行，提供了核苷酸序列(A’)，该序列可用于推导出或确定正义链的共有序列，该序列与其反义链一样。如图所示，由于B序列可以是外源提供的，因此也可以提供一个注册序列以指示序列内发生测序反应的点，从而可以从完整模板构建物中获得序列数据，从正义链转换成反义链。

对于本发明所构建的完全连续或环状模板序列来说，获得重复序列读数数据的能力进一步提高，从这些数据中可以装配出共有序列信息。更具体地说，与图2A所示的部分连续序列一样，完全连续序列也提供了正义和反义序列数据。另外，这种模板利用模板环状构型的优点为多次重复测定同一分子的序列提供了可能。再次重述一次，测序过程可绕着完全连续序列进行，从互补序列中重复获得每一个片段的序列数据，以及通过重复测定一个片段来获得该片段内的序列数据。这种序列数据的全部或部分可用于推导出模板及其各个片段的共有序列。这一点在图3B中用示意图作了说明，再次对提供的序列读数作了典型说明。如图所示，在一个末端启动的测序过程，例如，在一个连接寡核苷酸序列内启动，如图2的连接寡核苷酸218，沿着第一或正义链214前进，提供了该链的核苷酸序列A。然后测序过程绕着第一连接寡核苷酸如图2的连接寡核苷酸216前进，提供了模板的该片段的核苷酸序列B。测序过程沿反义链如图2B的片段212继续进行，提供了核苷酸序列A’，该序列又与序列A互补。进而测序过程绕着模板继续前进，提供了其他连接寡核苷酸如图2B的连接寡核苷酸218的核苷酸序列，所描述的测序过程从此处开始，提供了核苷酸序列C。由于模板是环状的，因此这个过程可继续从一个模板中读取出多个重复序列读数，例如，图中显示的第二轮序列数据(A-B-A’-C-A-B-A’)。因此，序列重复既来自于互补序列A和A’，又来自于每一个片段的重复测序。

应当理解的是，在重复测序的环状模板内，能够置换链的聚合酶是特别优选的，如本文其他地方所讨论的，因为它们可以在绕模板的每一循环中置换新生链，使测序持续进行下去。其他方法同样也可用于这种重复测序，其中包括在反应混合物中使用具有5’-3’外切核酸酶活性的酶来消化合成的新生链。

应当理解的是，正如本文其他地方所提示的，一个给定核苷酸序列的重复测序，无论是作为一致序列或是该序列的互补序列，也不论是作为单个序列或者该序列的重复拷贝，例如在连体方向，都提供了装配该序列片段的共有序列的能力。更具体地说，人们可以利用一个给定序列的重复序列读数和/或一个序列及其互补序列的读数来建立该序列片段的共有序列。换言之，序列内的每一个被判定的碱基都可以根据该特定位置上的共有碱基判定来确定，而共有碱基是根据该位置上的多个读数和/或该位置及反义链上其互补位置上的读数确定的。然后装配或比较这多个读数就可以得到一个给定位置上的给定碱基的共有测定结果，因此就可以得到特定序列片段的共有序列。

虽然在本文中，术语“比较”是指比较或装配来自于一个给定序列的多个读数和/或来自于序列正义链和反义链的序列数据，但是应当理解的是，该术语也用于说明和包括为序列该位置的多个读数的特定碱基判定分配共有数据和/或为该片段提供完整共有序列的任何方法。这种方法包括实际的肩并肩比较，根据发生的数目来对重复读数的评定或互补序列的评定以及可选的或其他的信号/碱基评定(calling)度量进行计分，直至从给定位置上碱基的多种指示分配碱基评定的复杂算法。

例如，某些这类方法通常包括可以将碱基来源的数据综合考虑的算法，这些数据来源于该序列位置的其他读数，复制序列读数(来自于相同的或复制的序列片段)或者来自于其相对链的互补碱基。

用于这种数据综合处理的一个类别包括如下步骤：第一步确定来源于一个碱基的信号和来源于该位置上的其他读数或者其互补碱基的信号之间的关系，第二步是对这些数据进行综合处理。用于确定这种关系的方法是本领域熟知的，其中包括用于多序列比对的的直观推断法，用于多个序列比对的优化方法和隐藏的马尔科夫模型(hidden Markov models)，从最宽泛的意义上说，所有这些算法都具有共性，那就是它们都试图在输入读数时排列相应的碱基。这种关系不仅仅限于碱基评定，也可能来自于信号的固有特征，如通道、振幅、宽度或信号相关的其他时间依赖性模式。本领域已知的可用于综合处理联系前碱基的数据的算法包括Plurality、Quality-weighted Plurality、Bayesian方法和学习方法的机器(神经网络，自组织地图)，一般来说，这些算法的共同之处在于它们能将现有的证据分类成共有碱基评定，通常用误差相关可能性来完成。在这类算法中，可以有多种变体，其中包括在这些步骤之前、之后和中间添加有正面影响的其他步骤，如提高结果的质量，减少计算时间。例如，在一个这类方法中，在所述的第二步骤执行期间或之后参考与所述第一步骤内的其他碱基相关的数据用于评价所述的关系产生误差的可能性。单个分子来源的数据之间或者不同分子来源的数据之间都可执行计算关系的步骤。

在综合处理数据的另一种方法中，首先要建立一个序列读数如正义链的共有序列，并且建立另一读数如反义链的另一共有序列。这些序列可通过本领域熟知的方法建立，其中包括用于多序列比对的的直观推断法，用于多个序列比对的优化方法和隐藏的马尔科夫模型，结合共有序列确定算法如Plurality、Quality-weightedPlurality、Bayesian方法和学习方法的机器(神经网络，自组织地图)。然后可通过算法如用于多序列比对的的直观推断法，用于多个序列比对的优化方法和隐藏的马尔科夫模型(hidden Markov models)，结合共有序列确定算法如Plurality、Quality-weighted Plurality、Bayesian方法和学习方法的机器(神经网络，自组织地图)对这些共有序列进行关联和综合处理。

另一类算法可在一个步骤中完成关联和综合处理。这些方法从试图发现与所观察到的读数最有可能的模板的概率模型开始。这种模型属于图形概率模型类，其中包括贝叶斯网络(Bayesian networks)、隐藏的马尔科夫模型、神经网络和条件性随机领域。可以输入这种模型的不仅仅局限于碱基评定(basecall)，还包括各个测序质量、测序背景和原始信号特征的局部或整体测量值。通过这些模型确定共有序列以后再寻找在概率模型系统规定参数下最符合所观察到的读数的模板。一般来说，这种方法会产生一个或多个可能的共有序列，提供计分信息按照每一个序列的可能性进行排序。在本文中为了便于讨论，从一个给定片段的重复序列读数(其中包括正义链和反义链的读数)评定共有序列的方法在本文中通常被称作“比较”。

除了与确定共有序列相关的方面之外，如上所述，本发明的模板结构还有许多显著的优势。例如，对于完全连续构建物来说，这些模板的许多优势来自于其基本的环状结构。例如，由于本发明的完全毗连模板在结构上呈环状，因此可以在模板的任何一点开始启动聚合酶介导的合成过程和测序过程，可以预期的是整个模板的序列都可以被测出，或者至少是可以测出的。与此相反，对于线性模板序列来说，就会面临着错过测定模板上游部分的序列的风险。因此，在采用线性模板是，通常会使用测序起始过程，也被称为“热启动”过程，例如，直到准备好开始合成和收集序列数据时再加入一个关键试剂。

除了无需测序起始过程以外，使用这种环状模板还能够从同一个模板分子的不同部分获得测序数据，这样就不一定要求得到模板的完整序列。例如，在单分子测序过程中或者在使用一群相同模板分子的测序过程中，人们可能获得模板分子的多个亚组的序列信息，每一亚组之间都彼此相关，例如包含在同一模板序列内。有关本发明的这个方面将在下文中参照配对末端测序过程进行更详细地讨论。

例如，由于这些模板的结构，人们可以有效地将任何长度的靶核酸制成环状模板。更具体地说，由于人们能够利用包含自身互补片段的外源连接序列，因此可以有效地环化很短的双链寡核苷酸区段。更具体地说，单链核酸区段的环化通常需要一个至少包含3个核苷酸的序列，有可能添加接头序列等以环化这个片段。一方面，本发明的模板可用于将较短的靶核酸转化成患者模板。更具体地说，等于或短于50、20或者甚至10个碱基的靶序列也很容易转化成环状模板。另外，在利用本发明的模板构建物时也可以进行转化。更具体地说，利用这些构型，人们能够有效地从很大的双链靶序列获得完全连续的或“环状”模板，制备较大的环状核酸没有很多困难。更具体地说，人们可以有效地利用很大的双链插入片段，例如大于100个碱基的双螺旋(核苷酸总数)、大于500个碱基的双螺旋、大于1000个碱基的双螺旋、大于5000个碱基的双螺旋、甚至大于10000个碱基的双螺旋制备模板构建物。

本发明的模板构型无需与单链核酸样品片段合作。例如，在存在双链靶核酸如PCR产物、基因组片段等的情况下，人们可以很容易地将其转化为本发明的模板分子，利用连接片段将一条链的3’端连接到另一条链的5’端，反之亦然。如上所述，相对较小的双链区段，例如，包含50或更少碱基对、20或更少碱基对、甚至10或更少碱基对的双链区段，也可以很容易地掺入到本发明的患者模板内。一般来说，双链区段由于其结构的刚性，其环化需要数百个碱基对的片段。但是，本发明的方法可以将较小的片段制成环状模板。

本发明的模板构型还有另外一个优势，那就是在同一个模板内既有单链部分，也有双链部分。例如，单链连接寡核苷酸不仅可以包含特异性引物识别序列，而且还能够以需要的单链构型提供引物和聚合酶结合位点，这样就可以使引物退火并与聚合酶复合，无需任何变性步骤。虽然可以很容易理解其他双链模板所具有的优势，但是其他单链模板也具有启动优势。更具体地说，在利用能与单链区段高亲和力结合的聚合酶的情况下，如果模板只有相对较小的一部分是单链的话将能更好地控制聚合酶的结合，例如，指导与理想启动位点结合。现在有许多这类聚合酶，其中包括，例如phi29型聚合酶(参见，例如，美国专利系列号5,001,050，5,576,204，本文已完整纳入作为参考)及其衍生物以及其他链置换聚合酶(参见，例如，国际专利申请系列号WO 2007/075987，WO 2007/075873，WO 2007/076057，本文已完整纳入作为参考)。

尽管如上所述，模板的单链部分通常被作为启动位点，但是在某些情况下，启动也可以在模板的双链部分内开始，例如，这样可以使用靶序列特异性的引物。

另外，在其他单链模板缺乏引物结合位点时它们提供了原件的可控性。具体地说，对于大片段靶核酸来说选择引物序列是比较困难的，因为人们通常都想避免随机地多位点启动模板材料。相应的，引物需要一般要经过仔细选择，使其具有高特异性，要求有相当较长的序列。但是，在模板群内提供最少量的单链材料，例如，连接寡核苷酸内的那些部分，以及根据那些序列的知识，在较大靶片段和双链核酸不能用于引物结合时人们可以利用实质更短的引物而保留其对理想启动位点的特异性。另外，人们可以利用经过改造而对模板有较高亲和力的引物，并且无需担心与模板如此高的亲和力会产生较高频率的随机或非特异性启动。具体地说，人们可以选择更紧密结合的引物序列，例如，富含GC的序列，以及利用其结构内包含非天然核苷酸或核苷酸类似物如肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)的引物，试验证明这些引物能与模板发生高亲和力配对。

除了上述优势以外，本发明的部分毗连模板也有许多特殊优势。例如，在某些情况下可以使用部分毗连模板，其中除了包含连接寡核苷酸区段以外，一部分靶片段也可以单链区段的形式存在。根据哪一条链作为单链区段提供，例如，模板的5’或3’端，可以选择不同的方法进行测序，特别是启动方法。例如，在单链部分包含3’末端的构型中，单链部分提供引物结合位点以便于测定模板剩余部分的序列。与此相反，如果模板的5’端未单链部分，那么模板自身就可以提供聚合酶介导的合成所用的引物并进行测序。在其他构型中，可以在其他的完全毗连模板结构内提供间隙或切口(如本文其他地方所述)，从而为聚合酶结合提供启动位点。

图4A、4B和4C用示意图的形式描述了这些构型和合成/测序替代方法。如图4A所示，部分毗连模板400包含双链部分402和单链连接寡核苷酸部分404。一部分靶序列也以单链的形式提供，如片段406.图4B描述的是单链部分位于模板3’端的构型。具体地说，人们可以利用单链区段406作为合成和测序引物如引物408的结合位点。然后测序沿着模板的剩余部分进行，如图中箭头所示。

与此相反，如图4C所示，模板的5’部分是单链区段406.因此，模板的双链部分402作为自身引物使单链部分406得以合成和测序，如图中箭头所示。模板结构内还可以添加其他成分，例如，为了保护3’端免受外切酶的消化，如磷硫酰等。

除了上述全部优势以及与本发明模板构型的正义/反义共有序列测定方面有关的优势以外，本文所述的模板还可用于利用少于4种不同可检测事件掺入四种不同核苷酸的测序过程中。具体地说，许多测序过程要使用四种不同的核苷酸，每一种核苷酸用不同的可检测标记基团进行标记，如荧光标记物。在过去，已经有人建议用少于四种不同标记基团来完成测序操作。例如，一种建议的方法是利用只用两种不同标记物标记的核苷酸，其中一种标记物与一种特定核苷酸相连，而另一种标记物与其他所有核苷酸相连。三种核苷酸上的标记物只在每一个特殊标记的核苷酸之间的相对空间中提供。但是要想得到完整序列信息需要通过模板至少三次，最可能的情况是4次才能为每一个碱基提供特殊标记物。

对于本发明的模板来说，由于模板构建物内存在正义链和反义链，在使用少于4种不同标记事件时一个给定模板只需通过一次就可以提供完整序列信息。具体地说，用同一个标记物标记两个非互补的核苷酸，如A和G，同时用第二种和第三种标记物标记T和C核苷酸，人们就可以通过比较正义链和反义链来鉴定哪一个相同标记的碱基是A，哪一个是G，利用它与另一条链上特异性地确定出的T或C的互补性就可以获得完整序列。同样，只用两种不同的标记物人们就可以获得正义链和反义链的完整靶序列信息。具体来说，人们可以用第一种标记物标记四种核苷酸中的一对，如A和G，用第二种标记物标记另外一对T和C来测定正义链的序列。然后转换标记的构型以测定反义链的序列，例如，第一种标记物标记A和G碱基，第二种标记物连接到G和T碱基上。然后通过比较序列数据就可以准确地鉴定每一个碱基。在实际操作中，可在有第一标记构型的条件下进行测序，然后加入包含第二标记构型的新试剂，例如，在洗涤步骤。应当理解的是，重复测序也能提供获得共有序列数据的能力，如上所述。

III.其他序列

除了每一个模板分子内的共有潜在优势以及上面所描述的其他优势之外，对于许多或所有不同模板依赖的测序过程来说，模板构型还有许多不同的优势，这些测序过程与向模板分子内插入其他序列的可能性有关。

例如，在某些例子中，可以选择和/或看到连接序列作为注册序列以便于在整个模板序列内提供地标，例如，为了比对重复序列数据、为了鉴定共有序列读数的覆盖水平、为了鉴定测序过程中发展成为共有序列的点，例如，完整模板的反义链或重复序列等。

另外，使用这种模板进行这种测序可以为测序过程提供控制机会。例如，尤其是在上述完全连续序列的例子中，人们可以将引物识别序列插入到连接寡核苷酸内以启动多聚化反应。如上所述，利用作为双链区段的形式存在的序列靶部分结合的免疫性可以提高引物序列类型和构型的灵活性。

其他控制序列也可以使用，例如，控制合成起始的序列，如通过杂交的探针或可逆修饰的核苷酸等(参见，例如，美国专利申请系列号2008-0009007，本文已完整纳入作为参考)。其他控制序列可能包含转录因子的结合位点。例如，抑制因子结合区可作为控制序列插入到连接寡核苷酸内，如lac抑制因子识别序列，试验证明，当该识别序列被lac抑制蛋白结合时能够阻断体内和体外的复制。通过添加合适的启动因子如异丙基硫代呋喃半乳糖苷(IPTG)或异乳糖可以重新开始复制。其他DNA结合蛋白识别位点也可以添加到连接寡核苷酸内以控制使用本发明模板的合成进程。其他可控元件包括在连接区内使用非天然碱基(也被称为第五碱基)，这种碱基在合成反应中不能与四种基本核苷多磷酸中的任何一个配对。一旦遇到这种碱基，聚合酶就是停止直到其自身特定互补的碱基被添加到反应混合物中。同样，也可以人工修饰连接寡核苷酸内的中止位点，其中包括“损坏”碱基使复制停止，直到在混合物中添加修复酶再重新开始复制。例如，可以在连接寡核苷酸内加入具有嘧啶二聚体的碱基位置。这种化合物可以使复制复合体中止。加入光裂解酶DNA修复酶以后可以修复这个存在问题的位点，使复制得以进行，测序过程得以继续。

可选的是，还可以将各种其他寡核苷酸探针的识别位点插入到这些连接序列内，例如，标记探针、分子指向标、探针、探针(第三波技术有限公司(Third Wave Technologies,Inc.))等的杂交位点，这些位点可用于提供合成开始的其他指示。另外，能与其他非天然碱基相互作用/互补的非天然碱基也可用作合成和测序的起始位点。

在某些情况下，比较理想的是连接寡核苷酸内包含内切核酸酶识别位点，这种位点可使给定模板序列从合成反应中释放出来，即，使之线性化从而使聚合酶从线性模板上掉下，和/或使模板暴露于外切酶活性，从而通过去除模板来终止合成。这种位点还可以作为控制序列，为那些经过改造而缺乏裂解活性但是依然保留序列特异性结合活性的内切酶提供特异性结合位点

在某些情况下，切口位点如能被切口内切核酸酶识别的位点也可以包含在模板分子的一部分内，特别是模板的双链部分内，例如，在双链区段部分内或者在外源发卡结构的干区。这种切口位点可使双链序列的一条链形成切口，例如，为链置换聚合酶提供启动位点。在本发明的模板中，切口位点可位于，例如，能退火和连接到双链靶片段的发卡接头内。下文所述的其他方法同样可以引入切口位点。另外，切口内切核酸酶可随机使用以阻止靶片段开始启动。许多切口酶及其识别序列都是本领域熟知的，这种酶大都已经商品化，例如新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)。另外，人们可以利用制备模板构建物所用的发夹接头内已有切口的双链区段。这种切口包括双链区段内长度为0到20个核苷酸的间隙，其长度要根据需要而定。

IV.模板结构

除了上面所描述和阐明的本发明模板的基本构型以外，本发明的模板内还可以插入多种其他结构。例如，可以选择完整模板分子的相对尺寸或长度以及组成模板的各种片段的尺寸以使给定的应用达到最佳效果。

一般而言，模板的总体大小是由使用模板的用途决定的。例如，当一个给定模板用于聚合酶介导的测序过程时，在选择模板总体大小时需要考虑特定系统读数长度的限制，例如，为了确保完成整个模板的测序，尤其是对完整模板的丰余测序。例如，当一个给定的聚合酶介导的测序过程有1000个碱基的读数长度时，就需要至少两倍的丰余测序，决定了模板的长度为500个碱基，其中既包括连接寡核苷酸，也包括靶片段。当然，由于起始/完成连接寡核苷酸的序列是已知的，并且与靶序列的读数无关，因此无需获得两倍丰度的该片段，因而可以容忍增加模板的尺寸。对于某种丰余程度的测序来说，约50到500个碱基之间的模板是比较理想的。在其他应用中，如果能获得更长的读数长度或者在非丰余应用中，可以使用长度在约200到50000个碱基的模板。虽然是以特定长度的方式描述的，但是应当理解的是，许多不同的特殊应用可以使用各种不同尺寸的模板。

除了需要考虑读数长度以外，也要考虑特殊应用对完整模板的结构要求。例如，如果测序过程应用纳米结构反应区，那么比较理想的是提供较小的模板分子以确保其快速弥散进出反应区。

根据使用模板的用途的不同，靶序列部分的长度也可以是不同的。例如，在基因组测序应用中，例如从头测序过程或再测序过程，比较理想的是使用较长的靶片段以降低双链的覆盖水平，这是不同片段之间需要的。具体地说，测定长度超过100，优选超过20，更优选超过500、1000，甚至超过10000个核苷酸的模板片段序列的能力对重叠片段装配成基因组有实质益处。具体地说，一致序列部分所需要的重复水平可通过增加各个序列读数的大小而得到实质降低。

除了长读数长度测序应用所具有的优势之外，较长的靶片段也有优势，这表现在能够利用单分子测序过程提供配对末端序列数据。简言之，在许多测序过程中，人们通过读取排列于较大靶片段相对末端的序列能够获得相对较短的序列读数的序列信息。一般来说，这包括测定双链靶片段所有末端处相对较短的一段碱基的序列。我们知道，这两个序列来源于同一个靶分子，另外我们对片段的大小也有全面了解，因此我们可以获得短序列的上下游数据。虽然在短读数长度测序过程中配对末端测序有不同的优势，因为可以从一个给定靶序列得到两组序列信息，但是长读数测序技术依然有用，因为它能够获得超长核酸序列的上下游“航路点”，这个航路点可用于比对序列数据。

在本发明的模板序列中，人们可以很容易地从单个模板的相对末端获得序列数据，即首先从靶序列部分的第一末端获得序列数据。然后为给定的测序系统留下一段合适的时间，使测序过程达到靶序列的另一末端，然后再次开始获取序列数据。因此，我们可以从同一靶序列的配对末端获取测序数据。应当理解的是，上述过程特别适用于测序系统的总体读数长度受数据收集过程影响时，例如，通过复合物的连续光照(参见，例如，美国专利申请系列号2007-0161017，本文已完整纳入作为参考)。另外，人们可以利用模板序列内的反应终止点，如模板一个位置上的可逆结合阻断基团，例如，位于启动合成时不使用的单链部分。举例来说，参照图2B，从原始启动位点开始测序以后，例如，在单链连接寡核苷酸部分216处，测序过程通过正义链214的一个末端，然后可以关闭数据获取，使聚合酶绕模板前进，例如，通过正义链214到达前述的其他单链部分，例如，连接寡核苷酸部分218。在连接寡核苷酸上偶联合成阻断基团就可以控制反义链如链212相对末端测序的起始。从而可以获得完整双链区段的配对末端序列数据。许多合成控制基团都可以使用，其中包括，例如，偶联到单链部分内的一个和多个碱基的核碱基部分的光脆性大基团，这种基团能够抑制聚合酶介导的复制，阻止合成前进的链结合部分，引物内包含的非天然核苷酸(参见本文其他地方所详细描述的)等。

另外，人们可以利用类似模板分子群如PCR产物所用的两个寡核苷酸序列中任意一个上的引物识别位点。然后从两个末端分别测序，就可以从同一双链区段的不同末端获得序列数据，因而可以得到所需的配对末端数据。

与此相比，对于测序的诊断用途来说，可能仅仅需要提供DNA小片段的序列数据，但是需要在非常准确的测序过程中达到此目的。对于这类用途来说，可以使用较短的靶片段，通过环绕环状小模板多次测序来得到较高水平的丰余度，这种丰余度能提供理想的精确度。因此，在某些情况下，双链靶片段可以很短，例如，从20到100，或者从20到50，或者从20到75个碱基长度。为了达到上述目的，靶片段以碱基计量的长度就说明了双链区段一条链的长度。

虽然不同的应用对模板分子内包含的靶序列部分的长度有不同的影响，但是连接寡核苷酸或模板单链部分的长度和结构都要考虑结构特性和应用的特殊标准，至少部分如此。具体地说，至少要求连接寡核苷酸能够在双链核酸区段一条链的3’末端和另一条链的5’末端之间形成连接环。因此，如果连接寡核苷酸主要作为连接片段来用，例如，不含较大的功能元件，那么连接寡核苷酸的长度通常在约4到100或更多个核苷酸之间，而优选的是约4到20个核苷酸。例如，如果短连接片段是理想的，那么连接寡核苷酸的长度可以为约4到8个核苷酸。

除了上述结构要求以外，如果一个给定的连接寡核苷酸需要提供引物和/或聚合酶结合位点，那么片段必须足够长以便于能容纳理想长度的引物以及形成复合体的聚合酶。相应的，包含引物识别位点的连接寡核苷酸的长度通常大于约20个碱基，优选至少约36个碱基。在某些例子中，比较理想的是单链部分内引物的一侧或双侧能够提供足够的空间，例如，以便于聚合酶结合等。因此，在某些例子中，单链部分的长度基本上都要比上面所提到的长，例如，5、80、100个碱基或更长。

虽然是如上所述，但是在某些例子中，较短的连接寡核苷酸是比较理想的，因为具有较小发卡环的模板显示出更高的效率，整体模板构建物较少，因此系统的测序能力较低，通过连接寡核苷酸的“突出端”实现。相应的，在某些情况下，连接寡核苷酸的长度小于20个碱基，优选小于12个碱基。应当理解的是，如果希望得到最佳的引物结合，但是效率也有提高，那么连接寡核苷酸的长度通常在约20到100个碱基范围内，优选约20到80个碱基。另外，单链模板构建物内还可以使用不对称连接寡核苷酸，例如连接正义和反义链的核苷酸数目不同。这种构建物可通过如下过程制备，例如，用第一种类型的限制性内切酶反复裂解样品片段，然后与裂解位点/突出端互补的第一接头/连接发卡序列退火/连接，再用第二种限制性内切酶处理，随后与第二裂解位点/突出部互补的不同大小的第二发卡接头退火/连接。

V.链置换

如上所述，模板的互补片段可以双链的形式提供，如图2B所示。应当理解的是，在这种情况下，优选在进行模板依赖的测序过程前或期间影响链的分离。例如，在通过掺入过程测序时，优选通过选择和使用链置换聚合酶来完成链的分离。现在已有多种链置换聚合酶，例如Φ29聚合酶和Φ29型聚合酶(参见，例如，美国专利系列号5,001,050，5,576,204，本文已完整纳入作为参考)、Bst聚合酶(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)有售)以及同一申请人的国际专利申请系列号WO 2007/075987、WO 2007/075873、WO 2007/076057所描述的那些聚合酶，本文已完整纳入作为参考。

图5以示意图的形式描述了利用这种模板和链置换酶的合成过程。如图所示，完全毗连模板500与引物序列502和链置换聚合酶504形成复合体并与4种核苷酸506接触，或者在某些优选方面与荧光标记的核苷酸类似物接触。当合成进行时，聚合酶自身的活性可以从另一条链510置换一条互补链508，新生链512的合成继续进行下去。合成一旦结束，例如，绕着模板的一个完整循环，就可以得到一个双链环状序列，由原来的模板500和新合成的或新生的链512组成。由于链置换酶能够继续置换杂合链，例如，新合成的链512，因此说明测序过程可以继续进行，通过模板的多个位点，产生出多个序列用于确定共有序列，通常会得到一个长的连体分子，其中包含与毗连模板500互补的重复区。

另外，在合成前或合成过程中也可以通过其他机制来影响链的分离。例如，可以通过提高反应混合物的温度使模板的双链部分解链，允许引物延伸通过该区域。应当理解的是，对于这种应用来说，比较理想的是使用热稳定的聚合酶，这种酶更能适应解链和继续合成所需的温度。许多热稳定的聚合酶都是本领域熟知的，可用于这种类型的应用，其中包括Taq聚合酶及其变体。

利用热调节起始的合成过程显示在图6的示意图中。如图所示，引物602与模板结构600结合并与非链置换聚合酶604接触。由于模板存在于双链构型中，聚合酶无法置换互补链，因此合成不容易进行。在理想的位点上，双链区段分离使新生链606的合成通过模板600的上述双链部分，例如，通过加热足以使双链区段解链而又不使引物脱离(如ΔC所示)。应当理解的是，引物序列以及连接寡核苷酸的其他部分也可以使用相对较高的解链温度，例如，GC富含序列，这种序列的解链温度高于天然氨基酸平均分布的核酸序列。双链区段一旦形成双螺旋就能阻止原始模板从新杂交，由于有新生链的存在，因而不再需要变性步骤或添加剂。

应当理解的是，在使用非链置换酶时，通常需要在沿模板完成一个完整循环后添加另外的链分离步骤，因为新生链处在阻挡合成继续进行的位置上。引物延伸开始以后，需要另一种激发事件使不同模板测序步骤达到同步。另外，起始激发事件以后，可以将合成反应的温度控制在较高水平以确保合成和测序继续进行而不被打断。

VI.序列比对

如上所述，本发明的另一个优势是模板构型本身就有确定相同或一致模板的共有序列的比对潜能。具体地说，由于连接寡核苷酸是已知的或可知的，在比对这种模板来源的长链序列数据时可以很容易地利用这种预知的序列，例如，作为地标或注册序列。另外，即使不知道连接寡核苷酸的序列，人们也能够通过观察完整序列中不具有序列数据其他位置所有的互补部分的部分推导出其序列。具体地说，作为双链区段的模板的靶序列部分在同一序列数据内包含内部互补，即，既包含正义链又包含反义链。但是，根据靶片段和连接寡核苷酸长度的不同，与靶片段内连接寡核苷酸完全互补的可能性可能低到0.因此，人们可以扫描一个给定模板构建物来源的序列数据，找到不包含序列其他位置所具有的内部互补的部分，假设这就是连接寡核苷酸，从而利用它作为比对标志物。

完整这种比对的一个典型算法是按照如下步骤操作的。首先，利用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)比对方法将完整序列与其自身反向互补序列比对。采用比对质量阈值，这样可以根据与反向互补序列对准的区域和没有对准的区域来注释序列。鉴定序列的重复单位，例如，利用本领域熟知的傅立叶变换方法(Fouriertransform methods)或者利用同一种史密斯-沃特曼算法将序列与其自身而不是反向互补序列进行比对。第一步得到的注释压缩成单个重复单位并对其进行汇总。然后对所有重复单位进行统计以进一步确定序列插入片段。例如，在10个重复单位中，对反向补体的命中率为1或更低的区域被称为“标记序列”，而命中率为2或更高的区域被称为“基因组区域”。精确的阈值可根据需要而定。

但是，如上所述，可选择或制备包含具有有利于其鉴定的可鉴定序列特征的序列的连接寡核苷酸，这既和与其相连的毗连模板序列有关，也和同一样品混合物中存在的其他模板序列相关。具体地说，人们可以利用包含序列标志物如条形码的模板构建物内的连接寡核苷酸来指示一个给定模板样品的复制起点。然后将包含可区别连接寡核苷酸标签的不同模板样品混合在一起，利用一个测序过程进行分析。通过鉴定寡核苷酸标签将不同模板来源的序列数据归于其原始样品制备过程。

具体地说，可对包含不同核酸的样品进行多种不连续样品制备过程。这些不连续样品制备过程用不同的起始材料完成，例如，不同样品(细胞，细胞培养物，患者等)、同一起始材料的不同部分，即根据大小不同而选择出的部分等，或者同一群、细胞培养物等的不同部分。每一个不连续过程得到的模板用模板构建物内独特的、可鉴定的不连续连接寡核苷酸序列进行条形编码。

然后将不同样品混合起来，在统一的测序反应中测序。由于每一轮的测序输出结果都是基于各个分子的，因此可以利用模板分子内包含的编码序列按照其起源来分析测序数据。具体地说，由于一个序列读数来源于一个分子，因此模板插入部分的序列无疑会连接到其附着的接头序列的序列上，该接头序列内包含条形编码序列。相应的，每一个模板序列都可以追溯到其起源，例如，特定的样品、患者等。

VII.毗连模板制备

本发明的模板结构可用多种不同的方法制备。在第一个典型方法中，双链靶片段的一个或两个末端与独立的发卡环相连形成了本发明的模板结构。这种方法是一种简化的模板制备过程，能够减少不希望有的片段的连体化，并且能够轻易地从制备物中清除随机核酸区段。例如，完全互补的双链核酸区段可通过平端与发卡接头序列连接起来。在这种情况下，即使控制哪一个接头与双链区段不同末端连接的能力有所降低，但是使用一种类型的接头依然是比较理想的。这种完全互补的双链区段可利用平端切割酶制备，或者通过使用能产生突出端的限制性内切酶然后填满突出的单链，例如，利用克列诺片段等来制备。

在本文所述的其他方法中，连接过程被用于将一种给定类型的接头可控地连接到双链区段的一个给定末端，这样就可以在连接寡核苷酸内使用可鉴定序列以便于区别模板的两个末端。

图7以示意图的形式描述了这类方法中的一种。图中显示了双链核酸区段，如双链区段700。双链区段可来源于较大靶核酸如基因组DNA、cDNA、DNA连体的片段化和/或扩增产物，如PCR或LCR扩增产物等。然后将发卡接头710连接到双链区段700的两个末端。如图所示，发卡接头710的连接依赖于双链区段700两条链3’末端独特的突出端720的存在。在发卡接头上提供互补突出端722以便于发卡接头710与双链区段700发生特异性的退火和连接。如图所示，突出端是双链区段发生腺苷酸加尾反应的产物，该反应能将一系列腺苷酸添加到每一条链的3’末端。发卡接头两条链的3’末端有一组互补的胸腺嘧啶核苷酸，用于进行特异性退火。但是，在双链区段的末端可以提供多种不同的特异性突出端。例如，可以利用限制性内切酶片段化较大的双链DNA片段，在每一个裂解点留下一个特征性的突出端。然后在发卡接头上提供这个特征性序列的互补序列以便于特异性退火和连接。另外，特异性突出端可分别连接到每一条链的3’端或5’端，用作突出端。除了提供发卡退火的特异性之外，突出端还可以在发卡接头退火和连接前阻止片段的连体化。退火以后，利用标准连接方法将发卡接头连接到片段上。

如上所述，虽然平端连接由于缺少额外的特异性和其他优势而不是优选方案，但是也可用于将发卡接头连接到双链区段的末端。在这种情况下，通过使用过量的发卡接头可以避免模板片段连体化或其他非特异性的连接。另外，以乳化液为基础的反应也可以防止连体化，乳化液内的单个液滴可以制备成只能容纳单个分子的尺寸。

在另一种方法中，模板序列可利用另一种连接方法制备以形成本文所述的模板构型。在某些例子中，这种连接方法可以掺入外源连接片段，例如，不是原始靶序列的一部分，而在其他例子中，原始靶核酸的一部分可用于形成连接寡核苷酸。在利用内部序列作为连接寡核苷酸的例子中，这种序列可来源于单链突出端，或者来源于平端片段的双链部分。

在任何一个事件中，双链核酸区段相邻3’和5’末端的共价连接，无论是来自于原来的靶片段还是产生于附着的或连接的外源连接寡核苷酸，都可以利用如模板非依赖性的dsDNA末端(TIDE)连接过程完成，例如，利用环化连接酶系统。一般来说，这个过程需要每一个片段的5’末端存在磷酸基团以便于环化连接酶起作用。可以通过酶催化反应在片段上添加5’磷酸，例如，使用T4多聚核苷酸激酶等。另外，如果双链区段是合成的或者是从另一个模板制备的，而不是来自于较大核酸的片段化，那么磷酸化的5’末端可在合成过程中产生，例如，在用于扩增原始靶序列的引物序列上，作为固相合成的起始建筑单元等。

图8以示意图的形式描述了连接双链区段3’和5’末端的典型过程。如图所示，靶序列的双链区段800是由链802和804组成的。在双链区段802和804上分别含有突出端806和808。这种突出端可通过多种方法添加到片段上，例如，利用标准的加尾技术，如用末端转移酶处理添加多聚腺苷酸尾巴、将接头序列连接到包含这种突出端的靶片段上等。另外，虽然图中显示的是将序列添加到双链区段上，但是应当理解的是，这种突出端也可以在片段化过程中提供，例如，作为限制性内切酶消化大片段核酸而产生的突出端。

如图所示，5’磷酸基团810被连接到每一条链上以便于TIDE连接和闭合两条相邻的链。用具有合适闭合活性的连接酶如环化连接酶ssDNA连接酶(震源生物技术(Epicentre Biotechnologies)，麦迪逊，威斯康辛州)、T4RNA连接酶等处理以后，双链的两个末端闭合形成了本发明的完全毗连模板序列812。

虽然利用商品化的环化连接酶系统可以成功地将含5’核酸的核苷酸连接到双链核酸区段的3’羟基上，但是也可以对这个方法进行其他修饰(添加5’磷酸，存在MnCl₂、ATP，以及在60℃的反应温度持续1小时以上)。通过PAGE监测发现，得到的分子耐受外切酶的消化(外切酶I和外切酶III)，说明得到的分子两端是闭合的。

为上述过程提供突出端的另一种方法是在扩增过程中使用阻断引物对来制备保留突出端的双链核酸区段。具体地说，利用扩增引物对扩增双链DNA的一个片段，例如，它们可以在靶片段互补链的相对末端启动合成进行反向平行的扩增。引物对的构型与靶片段部分互补，在其序列内包含一个或多个非天然核苷酸(在本文中被称为“第五碱基”)。引物序列内包含第五碱基将会阻止靶序列延引物序列延伸，因为扩增混合物中没有其互补核苷酸，因此在得到的双链产物中包含单链突出端。同样，扩增重复多个循环就可以得到大量的扩增产物，大多数或者几乎所有的扩增产物都是相同的，双链产物的两条链都保留了突出端。然后这些双链区段可用于本文所述的模板制备过程。

图9的示意图描述了上述过程的一个例子。如图所示，双链靶核酸区段900被引物902和904反向平行启动(I区)。如图所示，每个引物都包含与靶序列900的链互补的第一部分906、包含一个或多个非天然核苷酸或底物碱基的第二部分908以及与靶片段900不互补的第三部分910。虽然图中显示的是非互补的，但这不是该方法是否具有可操作性的关键。在某些情况下，例如，使用互补的第三部分910可以使引物与靶片段具有更高的亲和力，因为引物中有两个片段是与待测片段互补的，这样与非靶区结合的可能性就会降低，第五碱基部分不会对第一和第三部分与靶片段的杂交产生过度干扰。在缺少第五碱基的互补核苷酸的标准扩增程序如PCR中使引物延伸。

如II区中的箭头所示，引物沿每一个扩增产物的延伸都会终止在相同位置，即，互补链上与第五碱基互补的位置。经过多轮扩增以后(III区)，扩增产物基本上由包含突出端的互补链组成，这个突出端包含含有第五碱基的部分(第二部分908)和引物的第三部分(910)，这些产物能退火形成双链核酸912。

双链核酸912的每一个片段其5’端都有突出端，利用上述连接过程(以及IV区所示)处理双链核酸912以制备本发明的毗连模板914。

应当理解的是，引物序列可分别合成，其构型中可包含连接过程所需的和/或理想的那些功能基团。例如，可以合成这种引物使其包含TIDE连接过程所用的5’磷酸基团。另外，也可以合成这种引物使其包含，例如，在第三部分910内，测序启动位点，例如，不同于906部分的扩增启动位点的启动位点，或者其他功能序列，如本文其他地方所述的。另外，存在第五碱基部分，例如，所产生的模板构建物的连接寡核苷酸部分内的一个或多个非天然碱基，可以在靶序列的双链区段之外提供另一种指示序列和/或控制序列或序列事件。另外，910区还可以是部分自身互补的，形成干-环结构，5’末端靠近被阻断的延伸链的3’末端。这有可能用作多种T4连接酶介导的标准方法的底物，例如，如上所述。

例如，在缺乏第五碱基的互补核苷酸的情况下可以启动测序反应。由于这是非天然碱基，因此其缺乏不会对序列靶部分的整体测序结果产生影响。但是，如果在反应中不添加这个互补核苷酸，那么合成就会被抑制，测序过程也会中止，直到混合物中添加了第五碱基的互补碱基，这为系统提供了一种热启动能力。另外，作为非天然碱基，完整模板构建物的这一部分可以为测序过程和进程提供一个内部检查点，只要其结构不会干扰对模板内天然碱基的序列分析就可以。例如，可以在序列混合物中添加第五碱基的互补核苷酸而不是序列中四种添加碱基的互补核苷酸，第五碱基的这种互补核苷酸可携带完全不同的可检测标记物。与这种标记物相关的因碱基掺入而产生的信号出现时则说明过程已经接近开始处理靶核酸的一条链。同样，它还可以起到时钟功能，用于确定测序过程沿完全毗连模板前进的时程。虽然是以“第五碱基”为术语进行描述的，但是应当理解的是，这个术语包含一组能在模板结构提供多个控制元件的非天然碱基。例如，模板结构内可包含两个不同的非天然碱基或第五碱基以调节测序过程，只是它们处于不同的位点，例如，使测序过程具有可控的启动和可控的终止/起始，例如在测定反义链的序列前。例如，可以添加第一非天然碱基的互补核苷酸以启动测序过程。一旦遇到第二非天然碱基，例如在第一发卡结构转弯处，所有反应内的测序过程都会停止，直到向反应混合物中添加该第二碱基的互补核苷酸以后。这将使各种测序反应再次同步，和/或提供控制对侧链的测序的能力，提供本文其他地方所述的配对末端测序构型。

图10描述了一个制备部分或完全毗连模板构建物的相似或相关过程。具体地说，如图所示，第一扩增引物序列1000包含第一和第二互补片段1002和1004，二者由连接寡核苷酸1006相连，如本文其他地方所述。另外，在完整扩增引物的3’末端有单链靶启动片段1008。在某些例子中，靶启动片段1008可以是经过特殊选择的以便于在临近待测序列位置处或其内启动。在其他优选的方面，靶启动片段可在一个给定基因组或其他大片段DNA序列内随机启动以确保在制备用于测序的模板文库时能够达到最佳覆盖。例如，在随机启动的情况下，靶启动片段1008可由相对较小的寡核苷酸组成，如六聚体、七聚体、八聚体等。为了能够更特异地启动，靶启动片段通常包含较大的片段，如靶启动片段内的16、20或更多个核苷酸。另外，这种片段通常包含与待测靶序列临近的已知序列片段互补的序列。

如图10所示，第一扩增引物1000变性后可与靶核酸区段1010杂交。在某些情况下，引物1000的构型可在这样的条件下变性，即，该条件还能使其与靶序列1010退火。在其他情况下，引物的结构允许其杂交和启动靶片段1010，即使引物处于其发卡结构内，例如，没有变性。

例如，如图所示，在步骤A中，反应混合物被加热到适合第一扩增引物1000变性的温度，例如37℃，使引物与靶片段1010退火。如图所示，然后对靶片段1010进行等温扩增(步骤A和B)以制备更多的包含附着在其每一个末端上的第一扩增引物的发夹结构的可扩增靶片段(步骤C中的片段1012)。值得注意的是，虽然图10中是以单线的方式描述的，但是应当理解的是，为了便于讨论，用于描述靶片段1010和可扩增靶片段1012的单线代表互补核酸的正义链和反义链中的任何一个或两个。

对这个片段进行几何扩增，例如，PCR，利用与初始扩增引物序列1000互补的第二扩增引物1014，例如，与1002、1004、1006、甚至1008或其互补序列中的一个或多个互补的引物，得到扩增产物，例如，互补的模板片段1016和1018。扩增出片段1012以后(步骤E)，扩增产物内原来的第一扩增引物片段或者部分重叠的等温或PCR扩增引物片段或其互补序列如1016退火后在扩增产物的两个末端形成发卡结构(步骤E)，形成了部分双链的部分毗连核酸区段1020。然后通过使部分双链区段自身启动向3’延伸将这些部分双链区段1020转化(步骤F和G)成完全连续片段1022，例如，利用非链置换核酸聚合酶如克列诺片段，然后通过连接酶处理使产生的3’末端连接到5’末端上。连接以后，用外切酶处理扩增混合物以去除不是完全连续的所有核酸区段，例如，没有连接的或没有延伸完全的片段。

虽然本发明的构建物主要或者优选直接作为模板如测序模板来描述的，但是应当理解的是，这些结构也可以用作制备模板的中间结构，以提供与这种构建物一致的序列丰余度。例如，本文所述的环状结构的核酸区段可用作滚环复制的模板以制备连体分子，这种连体分子包含环状核酸内所携带的原始双链区段正义链和反义链的重复拷贝。这些复制出的产物可直接作为模板分子用于模板依赖的测序过程，如本文其他地方所述(也可参见美国专利系列号7,476,503，本文已完整纳入作为参考)。同样，也可以利用上述方法通过复制过程制备环状构建物的多个拷贝(参见，例如，美国专利申请系列号61/072,160，本文已完整纳入作为参考)。

用于制备本发明的模板构建物的双链核酸区段的制备可通过多种方式完成。例如，通过已知的片段化方法如下文所述的方法将待分析样品来源的核酸区段化成双链区段。另外，也可以通过双向扩增较大序列内的待测序列片段从样品核酸区段的靶区域制备双链模板。具体地说，可以利用待测序列区两侧的序列特异性PCR引物扩增引物结合的区，如通过单独的反向扩增或者结合初始线性扩增过程。得到的扩增产物包含目的双链序列区，然后通过其他过程制备本发明的模板构建物。

如上所述，利用本文所述的方法制备的本发明的模板核酸，例如，用于单分子测序反应中，可来源于基因组DNA。基因组DNA可通过三个步骤从任何资源中制备：细胞裂解、去蛋白化和回收DNA。这些步骤能够符合应用的要求，能够达到需要的DNA产量、纯度和分子量以及资源的量和历史。有关基因组DNA分离的详细描述可参见Berger和Kimmel，“分子克隆技术指南”《酶学方法》(Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)第152卷，学术出版社(Academic Press，Inc.)，圣地亚哥，加州(Berger)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第3版)，1-3卷，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港，纽约，2000(“Sambrook”)；《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编辑，《新编实验指南》(Current Protocols)，GPA公司(Greene PublishingAssociates，Inc.)和约翰威利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)之间的临时合作(“Ausubel”))；Kaufman等，(2003)《生物学和医学中的分子和细胞方法手册》(Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine)，第二版，Ceske(编辑)，CRC出版社(CRC Press)(Kaufman)；以及《核酸方法学手册》(The Nucleic Acid Protocols Handbook)，Ralph Rapley(编辑)(2000)冷泉港，Humana出版社(Rapley)。另外，许多商品化的试剂盒也可用于从细胞中纯化基因组DNA，其中包括Promega的Wizard^TM基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNA Purification Kit)、BioRad的Aqua Pure^TM基因组DNA分离试剂盒(Aqua Pure^TM Genomic DNA Isolation Kit)、Invitrogen的Easy-DNA^TM试剂盒(Easy-DNA^TM Kit)；以及Qiagen的DnEasy^TM组织试剂盒(DnEasy^TM Tissue Kit)。另外，靶核酸区段也可以通过靶向捕获方法获取，其中靶核酸首先以单链区段的形式被捕获在微阵列或其他捕获技术上，然后通过扩增捕获的材料来制备双链样品材料。下列文献中描述了许多这样的捕获方法，例如，Hodges E等，Nat.Genet.2007年11月4日；Olson M.，Nature Methods 2007年11月，4(11):891-2；Albert TJ等，Nature Methods 2007年11月，4(11):903-5以及Okou DT等，Nature Methods 2007年11月，4(11):907-9。

可利用本文所述的方法制备的核酸，例如，用于高通量测序系统中，还可以来源于cDNA，例如，从真核对象或者真核对象特殊组织的mRNA中制备的cDNA。通过测得来源于cDNA文库的核酸模板的序列而得到的数据，例如，使用高通量测序系统，可用于鉴定，例如，目的基因的新型剪接变体，或者用于比较，例如，目的基因剪接异构体的差异表达，例如，不同组织类型之间、对同一类型的组织进行的不同处理之间或者同一类型的组织的不同发育阶段之间的差异表达。

一般来说，利用，例如，Sambrook和Ausubel描述的方法几乎可以从任何资源中分离mRNA。分离出的mRNA的产量和质量受如下因素影响，例如，提取RNA之前组织是如何储存的，提取RNA期间通过何种方式破碎组织，或者从中提取RNA的组织的类型。相应地可以优化RNA分离方法。现在有许多商品化的mRNA分离试剂盒，例如，mRNA-ONLY^TM原核mRNA分离试剂盒和mRNA-ONLY^TM真核mRNA分离试剂盒(mRNA-ONLY^TMProkaryotic mRNA Isolation Kit and themRNA-ONLY^TMEukaryotic mRNA Isolation Kit)(Epicentre Biotechnologies)、FastTrack 2.0mRNA分离试剂盒(FastTrack 2.0mRNA Isolation Kit)(Invitrogen)以及Easy-mRNA试剂盒(Easy-mRNA Kit)(BioChain)。另外，各种物种如牛、小鼠和人以及组织如脑、血液和心脏的mRNA已经成为商品，例如，BioChain(Hayward，CA)、Ambion(Austin，TX)以及Clontech(Mountainview，CA)。

回收了纯化的mRNA以后就可以利用反转录酶从mRNA模板制备cDNA。从mRNA制备cDNA的方法和方案，例如，从原核细胞以及生物细胞中收获的mRNA，可见于《cDNA文库方案》(cDNA Library Protocols)，I.G.Cowell等编辑，HumanaPress，New Jersey，1997，Sambrook和Ausubel的描述。另外，有许多商品化的试剂盒可用于制备cDNA，其中包括Cells-to-cDNA^TMII试剂盒(Cells-to-cDNA^TMIIKit)(Ambion)、RETROscript^TM试剂盒(RETROscript^TMKit)(Ambion)、CloneMiner^TMcDNA文库构建试剂盒(CloneMiner^TMcDNA Library ConstructionKit)(Invitrogen)以及通用cDNA合成系统(UniversalcDNA Synthesis System)(Promega)。许多公司如Agencourt Bioscience和Clontech都提供cDNA合成服务。

在本文所述的本发明的某些实施方式中，核酸区段制备自基因组DNA或cDNA。现有多种方法可用于从基因组DNA、cDNA或DNA连体制备核酸区段。其中包括而不限于机械方法，如超声破碎、机械剪切、雾化、水剪切等；化学方法，如用羟自由基、Cu(II):硫醇组合物、叠氮盐等处理；酶学方法，如外切酶消化、限制性内切酶消化等；以及电化学裂解。这些方法在Sambrook和Ausubel中有更详细的描述。

VIII.试剂盒和系统

除了上述模板组合物以及制备和使用这种组合物的方法以外，本发明还提供了这种方法和组合物的实施方式。

例如，在某些实施方式中，本发明提供了用于制备和使用本发明的模板构建物的试剂盒。第一种典型的试剂盒提供了用于制备本发明的模板构建物的材料和方法，如本文其他地方所述。因此，试剂盒通常包括制备本文所述的模板构建物所需的那些材料，例如上述各种模板制备过程所用的模板构建物。应当理解的是，根据模板构建物的特性以及所用的方法的不同，试剂盒的内容物也是可以变化的。例如，如果使用与双链核酸区段末端相连的发卡接头，本发明的试剂盒通常包含这种发卡接头以及合适的连接酶和用于将这种接头连接到双链核酸游离末端上的方法，以及用于在连接前处理双链区段末端的任何处理酶，例如，为了提高突出或平端核酸。如上所述，这种接头可包含突出片段以便于连接到双链区段的互补突出末端上。这些突出末端可以是在双链区段上添加已知序列的结果，例如，来自于限制性内切酶裂解、加尾过程等，可选的是，制备具有这些特征的模板所需的试剂也可以包含在试剂盒内，或者另外购买。

在其他实施方式中，这些试剂盒包含引物或其他序列接头或序列延伸试剂，用于提供突出端，这些突出端可用于提供双链核酸区段两条链之间的连接寡核苷酸。在某些情况下，这些试剂盒可包含为连接寡核苷酸提供5’磷酸基团所需的酶系统，或者提供已经预加上这种5’磷酸基团的扩增引物。这种引物还可包含上述第五碱基构型，用于控制扩增进程以及在测序过程中使用得到的模板。

第二种典型的试剂盒所提供的材料和方法不仅可用于制备本发明的模板构建物，而且还可用于在对靶核酸序列进行序列分析时使用这种模板。因此，除了上述材料和方法以外，这种试剂盒还包括用于这种测序过程的试剂，如用于启动测序过程的引物序列、聚合酶，以及在优选例子中，提供光束缚核酸合成复合物所需的底物。在特别优选的方面，这种底物通常包含一个或多个阵列的零模式波导管。这种波导管阵列还要经过进一步的表面处理以使合成复合体局域化在这种零模式波导管的光照空间内，例如，已公开的国际专利申请号WO 2007/123763所描述的，本文已完整纳入作为参考。另外，可选的是这种试剂盒还可以包含用于测序的核苷酸组合物，其中包括，例如包含荧光的或其他可检测标记基团的标记核苷酸，这些标记基团被连接到核苷多核酸构建物的除α磷酸之外的其他磷酸基团上。本领域熟知的其他多种类型的标记的和非标记的核苷酸也可以包含在试剂盒中。

本发明还提供了配合本发明的模板构建物一起使用的系统，用于分析靶核酸分子。具体地说，这种系统通常包括本文所述的试剂系统以及用于检测那些试剂系统所产生的序列信息的分析系统。例如，根据所用的测序过程性质的不同，测序系统可包含为了配合商品化核酸测序系统的使用而提供或销售的系统组分，如Illumina,Inc.的基因组分析系统(Genome Analyzer System)、454Life Science的GS FLX系统(GS FLX System)或者生命科技公司(Life Technologies,Inc.)的ABI 3730系统(ABI 3730System)。

在优选的方面，这种系统包括能够解析各个测序复合体产生的荧光信号的荧光显微镜。在特别优选的方面，这种系统包括反应区的阵列，例如，零模式波导管阵列，由系统来提供光信号，用于检测其中产生的荧光信号，配合每一个ZMW内执行的测序反应。

本发明的系统通常还包括与系统的检测部分可操控地连接的信息处理器或计算机，用于储存系统产生的信号数据(例如，测序反应在掺入标记的核苷酸时经过系统的光照可以产生荧光信号，说明有这种掺入发生)，这些数据可得自检测器对计算机可读取介质如硬盘、CD、DVD或其他光学介质、闪存等的读取。为了本发明的这个方面，需要提供这种可操控连接以使检测系统检测到的数据转移到处理器内进行随后的分析和转化。可操控连接可通过大家熟知的各种计算机网络或连接方法实现，例如，USB连接、无线连接/WAN或LAN连接，或者能够实现数据高速转移的其他连接方式。一般来说，计算机还包括软件，用于分析原始信号数据、鉴定与掺入事件可能相关的信号脉冲以及鉴定测序反应中掺入的碱基，以便于将原始信号数据转化成用户可以解释的序列数据(参见，例如，已公开的美国专利申请系列号2009-0024331，本文已完整纳入作为参考)。

有关典型系统的详细描述可参见，例如，美国专利申请系列号11/901,273，申请日2007年9月14日和美国专利申请系列号12/134,186，申请日2008年6月5日，本文已完整纳入作为参考。

IX.实施例

本文所述的模板构建物可应用于下文详细描述的各种测序用途中。

实施例1：模板构建和测序

本发明的模板构建物可用于通过掺入进行测序的过程中。具体地说，对模板进行单分子实时(SMRT^TM)测序，其中可监测引物序列的聚合酶介导的模板依赖的延伸，因为标记的核苷酸类似物被掺入到新生链内。

模板构建物:

利用引物5’-GTACGGGTCTCACCCGGGGATCCTCTAGAATCGAT-3’和5’-CCTAAGGTCTCGGAAGCTACTAGTCCTCAGCAAGCTT-3’从质粒克隆中扩DNA双链片段。得到的产物用Zymo-25PCR纯化试剂盒(Zymo-25PCR purificationkit)纯化。通过在限制性内切酶BsaI(NEB)存在的条件下孵育过夜在PCR产物的每一个末端制备突出端。消化后的产物用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen PCRpurification kit)纯化，然后连接到合成的发卡寡核苷酸上：5’-CGGGCTCGGAACGAAAGTTCCGAG-3’和5’-CTTCGGTCGCCAGATTAGAAAATCAGTCACGTCTAGATGCAGTCAGGTTCTTAAATCCTAGTTCCTTGGCGACC-3’。在存在T4DNA连接酶(NEB)的条件下，使消化后的PCR产物与2倍过量的各种发卡寡核苷酸在23℃下孵育1小时完成连接。在存在外切酶III的条件下，在37℃孵育反应混合物1小时以去除未连接的产物。终产物用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen PCR Purification Kit)纯化，然后与等摩尔的测序引物5’-CTGACTGCATCTAGACGTGACTGA-3’退火。最终的模板构建物包含一个244个核苷酸的双螺旋区段，总长度为546个核苷酸(其中包括连接/发卡片段)。

SMRT^TM测序反应在如下条件下进行：2nM DNA聚合酶；100nM模板；500nMA647-dA6P、500nM A660-dC6P、500nM A568-dG6P和500nM A555-dT6P；0.5mMTrolox；4mM PCA(原儿茶酸)；以及0.5X PCD(原儿茶酸3,4-双加氧酶)。

测序反应在包含3000个不连续ZMW核的零模式波导管阵列上进行。利用能够提供靶向光照模式的高倍共聚焦荧光显微镜观察反应，例如，每一个核有一个独立的点(参见，例如，美国专利申请系列号12/151,979，申请日2008年5月9日，本文已完整纳入作为参考)。EMCCD每5分钟检测一次各个ZMW发出的荧光信号，然后对这些信号进行脉冲识别和碱基评定处理(参见，例如，已公开的美国专利申请系列号2009-0024331，本文已完整纳入作为参考)。图11描述的是一种测序轨迹，其中显示了模板构建物上700个碱基的序列数据，提供了154个碱基的共有信息。

实施例2：单分子共有测序

利用本发明的模板构建物评价单分子共有序列测序的准确度。制备总共包含162个核苷酸的完全毗连SMRTbell^TM模板。在制备毗连模板时使用两个发卡序列。第一个发卡序列包含一个54nt的环，这个环由8nt的干闭合，另外还包含一个4nt的突出端用于和寡核苷酸插入片段的突出端相连。第二个发卡序列包含一个4nt的环，由一个8nt的干闭合，还有一个4nt的突出端用于连接。在单分子测序系统中，这个模板的每一条链都被测序多次。得到的模板进行上述SMRT^TM测序，这种测序过程可对单分子构型的模板进行重复多次测序。可以预期的是，单个模板分子的各个重复序列读数随着多重读数的增加其准确度也会升高。具体地说，每一个重复序列读数或“环”都会提高重复测定单个模板分子的序列而产生的准确度，仅仅环绕模板进行几次完整测序后就可以接近最大值。

这种分子丰余性测序可用于鉴定单个核苷酸变体，例如，SNP。制备两个SMRTbell^TM模板，二者之间只有一个核苷酸是不同的(图中显示为“T”等位基因和“A”等位基因)。图12显示的是这两个模板，其中A区显示的是T等位基因，在突变碱基处以箭头标出，B区显示的是A等位基因。以已知的比例混合这两种模板，比例从0％‘A’:100％‘T’到100％‘A’:0％‘T’。对每一种混合进行单分子测序反应。过滤得到的序列数据，挑选出包含6种或以上读数的插入序列，然后用于分析各个分子上的多态性位置的共有评定。图13显示的是评定的多态性比例与预期比例的比较。

实施例3：利用毗连模板构建物测定大肠杆菌的基因组序列

大肠杆菌菌株MG1655购自ATCC，用LB培养基培养。利用Qiagen的高分子量基因组DNA纯化试剂盒从细胞培养物中提取DNA。利用喷雾器剪切基因组DNA，制备成500-1500bp的片段。然后用Qiagen PCR纯化柱回收DNA片段。利用包含T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶和dNTP的反应对片段化的DNA进行末端修复。纯化以后使经过末端修复的DNA与Taq DNA聚合酶和dATP共孵育，以使单个A核苷酸添加到每一个片段上。加尾后的DNA与发卡寡核苷酸连接形成最终的SMRTbell^TM模板。模板的两个末端都添加发卡结构。这种发卡结构包含一个54nt的单链环，由一个8bp的干闭合，在其3’末端还有一个T核苷酸，使其能够与添加A尾巴的插入片段相连。

一个末端或另一个末端没有与发卡结构相连的，或者由于连接不完全而包含缺口的样品材料的片段使用外切酶III和外切酶VII去除。连接产物通过乙醇沉淀进行浓缩，然后加到ChromSpin 1000柱内以去除不含插入片段或包含短插入片段的所有模板。ChromaSpin柱的洗脱物用Qiagen PCR纯化柱纯化，通过测定260nm处的吸光度值进行定量。模板与等摩尔的引物退火，然后进行测序。

在固定到ZMW阵列芯片上以前，60nM SMRTbell^TMDNA文库与10nM经过修饰的包含生物素化融合蛋白标签的Phi29聚合酶(N62D，E375Y，K512Y，T368F)(参见，例如，美国专利申请系列号61/072,645，申请日2008年3月31日，本文已完整纳入作为参考)在如下缓冲组合物中共孵育，37℃孵育1小时：50mMMOPS，pH 7.5，75mM乙酸钾，0.05％Tween-20，5mM DTT，500nMALEXA568-O-dG6P，500nM ALEXA555-O-dT6P，500nM ALEXA647-O-dA6P，500nM Cy5.5-O-dC6P，1mM氯化钙。在即将固定时，混合物用同一种缓冲组合物稀释10倍，将8μl混合物上载到ZMW芯片上，其表面固定有链亲和素。在室温下孵育1小时完成固定。在测序前，从ZMW芯片上去除固定混合物。然后用8μl下列缓冲液洗涤芯片5次：50mM ACES pH 7.1，120mM乙酸钾，0.1mM氯化钙，120mM DTT。洗涤完成后再用如下组合物洗涤两次：50mM ACES pH 7.1，120mM乙酸钾，0.1mM氯化钙，250nM ALEXA568-O-dG6P，250nM ALEXA555-O-dT6P，250nM ALEXA647-O-dA6P，250nM Cy5.5-O-dC6P和120nM DTT。洗涤后在芯片上留下4μl这种核苷酸混合物，然后将芯片放置到上述测序系统中。如上所述，通过添加终浓度为0.5mM的MnOAc使反应实时启动。为每个ZMW芯片拍摄3个9分钟的影片用于采集测序数据，如上所述。经过测序的片段与K12MG1665参考序列比对。

总之，大肠杆菌基因组测序后得到38X的覆盖深度，其中可以清楚地看到99.3％的基因组被覆盖。大约4.5Mbp有相对较高的覆盖率(即，大于20X的覆盖，准确率约为99.99992％，相当于Q61的序列准确率得分。对于整个基因组来说，序列准确率为99.9996％，约等于Q54的质量得分。

图14描述的大肠杆菌序列的覆盖图。图中的点经过了已知伪像的校正，这些伪像与远离复制起点而减少的大肠杆菌复制有关。从图中可以看出，覆盖水平高度统一，平均覆盖水平为38X。以碱基数对覆盖水平作直方图，数据显示出与最大理论覆盖相似的分布(参见图15，A区)。另外，当校正了远离复制起点的复制中的偏差时，人们可以看到实际观察到的序列覆盖(图15，B区，柱)开始接近最大理论序列覆盖水平，这是基于泊松统计而得出的(虚线所示)。

实施例4：大插入片段测序

从传统意义上说，基因组材料的大片段重复序列是难以测序和装配成完整基因组的，因为大多数测序平台都有读数长度限制(对于焦磷酸测序平台和传统毛细管系统来说，从数十个碱基到数百个碱基)，无法跨越这些重复区，因此在将这些数据装配成基因组时会产生错读，在确定一个给定序列读数应该适合哪个位置时产生歧义。如果使用SMRT^TM测序方法，由于其具有较长的读数长度，因此在单个读数中更容易跨越整个大片段重复序列，因此会减少短读数系统遇到的错读。

包含一个2.56kb重复序列的大肠杆菌菌株MG1655的一部分基因组序列通过本文所述的单分子过程测序。图16以示意图的形式描述了包含这个片段的大肠杆菌基因组的一部分。基因组序列上的重复片段以灰色条表示。这个重复序列两侧的与引物结合的序列以基因组序列下面的箭头表示。得到的PCR产物用T4DNA聚合酶进行磷酸化，然后用Qiagen PCR纯化柱进行纯化。在dATP存在的条件下利用Taq DNA聚合酶将单个腺苷酸添加上，然后用T4DNA连接酶连接到发卡寡核苷酸上。未连接的材料用ExoIII和ExoVII去除。SMRTbell^TM模板通过乙醇沉淀进行浓缩，通过ChromaSpin 1000柱，然后用Qiagen MinElute柱进行纯化。

然后利用SMRT^TM测序过程对模板进行测序。得到了跨越主要部分的序列读数，至少在一种情况下，可以得到完整的3kb片段(约3.2kb的读数)。由于单个序列读数跨越了大插入片段，因此可以明显减少与这种重复相关的错读。

虽然为了说明的目的而对本发明作了某种程度的详细描述，但是应当理解的是，在本发明的范围内，本领域的技术人员熟知的或理解的各种变体也可以实现。虽然在某种程度上没有被清楚地纳入本文中，但是本说明书参考的所有已公开的参考文献和专利文献都已完整纳入本文作为参考。

Claims

1.一种测序方法，包括：

提供线性双链核酸分子，其中线性双链部分包含双链核酸区段的正向链和反向链，所述正向链与所述反向链彼此互补；

将正向链的3'端与反向链的5'端连接，由此形成测序模板，所述正向链的3'端与所述反向链的5'端通过连接寡核苷酸相连；

对所述测序模板进行单分子测序，由此获得所述测序模板的序列数据，所述序列数据包含所述测序模板的正向链序列和反向链序列；

通过分析所述序列数据确定所述线性双链核酸分子的序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述提供步骤包括将核酸样品片段化从而生成线性双链分子。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述线性双链分子的至少一个末端选自：平端、5’-突出端和3’-突出端。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述线性双链分子包含至少500碱基对。

5.如权利要求2所述的方法，其中，所述核酸样品是基因组DNA、cDNA或DNA连体分子。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接部分包括将所述连接寡核苷酸连接至正向链的3'端和反向链的5'端。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述单分子测序包括采用电化学系统。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述单分子测序包括采用纳米孔传感器。

9.如权利要求1所述的方法，其中，所述单分子测序包括依序检测所述正向链和所述反向链中的核苷酸从而生成所述序列数据。

10.如权利要求1所述的方法，其中，所述单分子测序包括采用合成技术测序。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述合成技术测序包括检测聚合酶介导的模板依赖性测序导入的每个核苷酸的掺入。

12.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接寡核苷酸是包含双链部分的发卡寡核苷酸或茎环寡核苷酸，所述双链部分与所述正向链的3'端和所述反向链的5'端相连。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述连接寡核苷酸包含以下至少其一：注册序列、条形码和引物结合位点。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述测序模板以与别区分的形式固定化。

15.一种组合物，包含；

模板核酸，所述模板核酸包含：

(i)样品核酸的双链核酸片段，所述双链核酸片段包含第一链和与之互补的第二链；

(ii)将所述第一链的3'端与所述第二链的5'端相连的寡核苷酸区段，聚合酶与所述模板核酸结合形成复合物，所述复合物以与别区分的形式固定化。

16.一种对核酸模板进行测序的系统，包含；

反应混合物，所述混合物包含；

复合物，所述复合物包含核酸模板和酶，其中，所述核酸模板包含具有正义链和反义链的双链片段，以及在所述双链片段一端将所述正义链与所述反义链相连的连接寡核苷酸，所述复合物以光学上可与别区分的形式固定化；

检测系统，所述系统依序鉴定所述核酸模板中的核苷酸，所述检测系统包含荧光检测器或纳米孔传感器；和

处理器，所述处理器与所述检测系统可操作地连接，所述处理器包含机器执行的指令组，用于将检测系统传输给处理器的信号数据转化成用户可解读的核酸序列信息。

17.一种测序双链核酸分子的测序方法，该方法包括；

(a)将核酸样品片段化从而提供双链核酸分子，所述双链核酸分子包含(i)第一链和(ii)与之互补的第二链；

(b)将发卡环连接到所述双链核酸分子的第一端，从而将所述第一链和所述第二链在所述第一端共价连接；

(c)采用实时单分子测序鉴定所述第一链和所述第二链的各个核苷酸；

(d)对步骤(c)鉴定的各个核苷酸进行分析从而得出所述双链核酸分子的序列。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述实时单分子测序包括聚合酶介导的模板指导的测序。

19.如权利要求17所述的方法，其中，所述实时单分子测序包括采用电化学系统。

20.如权利要求17所述的方法，其中，所述实时单分子测序包括纳米孔传感器。

21.如权利要求17所述的方法，其中，所述双链核酸分子包含基因组DNA、cDNA或连体DNA。

22.如权利要求17所述的方法，其中，所述双链核酸分子包含至少500碱基对。

23.如权利要求17所述的方法，其中，所述发卡环包含以下至少其一：注册序列、条形码和引物结合位点。

24.如权利要求23所述的方法，其中，所述注册序列用于第一链读取值与第二链读取值的排列比对。

25.如权利要求23所述的方法，其中，所述注册序列用于鉴别所述实时单分子测序中步骤(c)鉴定的各核苷酸是来自第一链还是来自第二链。

26.如权利要求17所述的方法，其中，所述发卡环包含条形码序列。

27.如权利要求17所述的方法，所述双链核酸分子的第二端包含单链区段。

28.如权利要求27所述的方法，所述单链区段是所述实时单分子测序的起点。

29.如权利要求17所述的方法，其中，所述鉴定步骤包括实时单分子测序期间将所述第一链与所述第二链分离。

30.如权利要求29所述的方法，其中，所述分离是酶介导的。

31.如权利要求29所述的方法，其中，所述分离是链置换聚合酶介导的。

32.如权利要求17所述的方法，其中，所述分析包括比较第一链和第二链的读取值以确定双链核酸分子的共有序列。

33.如权利要求32所述的方法，其中，所述比较包括：其一，确定来自第一链内某碱基的第一信号与来自第二链内互补碱基的第二信号之间的关联。

34.如权利要求32所述的方法，其中，所述比较包括：将第一链的测序读取值与所述第二链的测序读取值排列比对。

35.如权利要求34所述的方法，其中，所述排列比对用算法进行。

36.如权利要求17所述的方法，其中，所述分析步骤包括对所述双链核酸分子的单分子共有序列进行汇编。