CN104984360A - 轭合方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了使细胞结合剂例如抗体与效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)轭合的方法，由此报道基团或效应基团首先与双官能连接体反应，然后混合物无需纯化而用于与细胞结合剂的轭合反应。本发明描述的方法有利于制备细胞结合剂例如抗体与效应基团或报道基团的稳定连接的轭合物。该轭合方法以高产率提供了高纯度和均一性的轭合物，该轭合物没有链间交联和失活的连接体残基。

Description

轭合方法
本申请是申请日为2010年06月02日和发明名称为“轭合方法”的201080024325.3号发明专利申请的分案申请。
本申请要求2009年6月3日提交的美国临时申请号61/183,774的优先权，其完整公开内容在此明确通过引用并入。
发明领域
本发明涉及使效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂例如抗体或其片段通过双官能连接体轭合的新方法。更具体地，本发明涉及使效应基团(例如，美登木素生物碱)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂(例如抗体或其片段)通过双官能连接体轭合的新方法，使得该过程消除了导致由于分子内或分子间反应而生成的不期望的水解物类或不期望的交联物类生成的步骤。
发明背景
细胞结合剂例如抗体与效应基团例如小细胞毒性剂或细胞毒性蛋白的轭合物在开发抗癌治疗剂方面引起浓厚兴趣(Richart，A.D.和Tolcher，A.W.，2007，Nature Clinical Practice，4，245-25)。这些轭合物由于针对肿瘤细胞的细胞表面上表达的抗原所选择的抗体的高特异性而是肿瘤特异性的。当特异性结合至肿瘤细胞时，抗体-细胞毒性剂轭合物被内化入靶癌细胞并在其中降解，由此释放抑制必要细胞功能例如微管动力学或DNA复制的活性细胞毒性剂，导致癌细胞的杀伤。已经采用各种连接体连接抗体与细胞毒性剂，目的是增强内化时细胞内物质的递送和轭合物的加工，同时保持轭合物在血浆中期望的稳定性。这些连接体包括被设计具有不同程度的空间位阻而影响其分子内硫醇还原动力学的二硫化物连接体、可裂解的肽连接体例如缬氨酸-瓜氨酸连接、和不可裂解连接体例如硫醚连接(Widdison，W.等，J.Med.Chem.，2006，49，4392-4408；Erickson，H.等，Cancer Res.，2006，66，4426-4433)。
细胞结合剂例如抗体与标记或报道基因的轭合物用于癌症患者的肿瘤成像应用、诊断各种疾病的免疫测定应用、使用放射性核素-配体轭合物的癌症疗法、和纯化生物活性剂例如蛋白、肽和寡核苷酸的亲和色谱应用。与细胞结合剂轭合的标记或报道基因包括荧光团和亲和标记例如生物素。
经由不可还原的连接(例如硫醚连接)连接的细胞结合剂例如抗体(Ab)与效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)的常规轭合方法采用两个不同的抗体反应步骤，并必须使用纯化步骤。在第一反应步骤中，抗体与带有两个不同反应性基团(例如，X和Y)的异双官能连接体反应。例如，在一种方法中，抗体的反应性残基(例如赖氨酸氨基残基)与异二双官能试剂的X反应性基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的反应导致在抗体的一个或多个反应性残基(例如赖氨酸氨基残基)处加入具有Y反应性基团的连接体。最初修饰的抗体产物必须在可以发生下一步骤之前从过量连接体或水解连接体试剂纯化。在第二反应步骤中，含有Y反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)的连接体修饰的抗体与含有反应性基团例如硫醇的效应物例如效应基团(C)(例如，细胞毒性剂)反应生成抗体-效应物轭合物，其在额外纯化步骤中再次纯化(参见例如，美国专利5,208,020、5,416,064或5,024,834)。因此，在以上方法中，需要至少两个纯化步骤。
包括两个反应和纯化步骤以轭合抗体与效应基团或报道基团的另一种方法利用抗体中的硫醇残基(通过用硫醇生成试剂例如2-亚胺基硫烷修饰抗体或者通过诱变加入非天然半胱氨酸残基或者通过还原天然二硫键而产生)与含有Y反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)的同双官能连接体Y-L-Y反应。
在抗体或肽中加入反应性基团Y例如马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)的主要缺点是反应性马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)基团与抗体或肽中天然组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基经历分子内或分子间反应(Papini，A.等，Int.J.Pept.Protein Res.，1992，39，348-355；Ueda，T.等，Biochemistry，1985，24，6316-6322)，以及Y马来酰亚胺基团的水性失活。在与效应基团或报道基团C的第二反应之前，抗体中加入的马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)基团Y与抗体中天然组氨酸、赖氨酸或半胱氨酸残基的不期望的分子内或分子间反应以及Y马来酰亚胺基团的水性失活产生交联蛋白或不均一轭合物并降低与效应基团或报道基团C的第二反应的效率。不均一轭合物产物—由于最初加入的基团Y(例如马来酰亚胺基团)与抗体或肽中天然基团(例如组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)的不期望反应或水性失活产生的无活性马来酰亚胺残基而产生的交联蛋白或肽—可能具有比期望的均一轭合产物差的活性和稳定性。
之前已经描述了通过二硫键轭合抗体与含硫醇细胞毒性剂的方法(参见例如，美国专利5,208,020、5,416,064、6,441,163，美国专利公开号2007/0048314 A1)。这些方法包括抗体与异双官能试剂的最初反应，随后与含硫醇细胞毒性剂的第二反应。已经在美国专利6,441,163 B1中描述了可选方法，其中细胞毒性剂的二硫化物连接的反应性酯首先被纯化，然后与抗体反应，但是该方法在抗体反应步骤之前包括从含硫醇基细胞毒性剂开始的额外的反应和纯化步骤。
目前制备细胞结合剂轭合物的方法的其他缺点是需要两个纯化步骤，这两个纯化步骤降低了总产率，并且还使该方法对于放大生产而言变得繁琐和不经济。
鉴于以上所述，本领域需要开发制备细胞结合剂-药物轭合物组合物的改良方法，所述细胞结合剂-药物轭合物组合物具有很高纯度并且其制备不需要繁琐步骤并减少了用户的时间和成本。本发明提供了这种方法。本发明的这些和其他优点以及其他发明特征将根据本文提供的发明描述而变得明显。
发明概述
本发明描述了用于制备式C-L-CBA的不可还原的硫醚连接的轭合物的轭合方法，其中C代表效应分子或报道分子(例如，细胞毒性剂或放射性标记)，L是连接体，CBA是细胞结合剂(例如，抗体或其片段)，通过利用含硫醇细胞毒性剂(例如，美登木素生物碱)与异或同双官能试剂(例如，可裂解或不可裂解的连接体)的直接反应，随后混合未纯化的反应混合物与细胞结合剂(例如，抗体或其片段)，由此通过更有效、高产率且容易放大的工艺产生不可还原的硫醚连接的轭合物。另一个重要的优点是这种轭合方法产生无链间蛋白交联或失活残基(例如，马来酰亚胺或卤代乙酰胺残基)的硫醚连接的不可还原的轭合物。本说明书公开的新方法可用于制备由上式表示的任何轭合物。
具体地，本发明涉及以下各项：
1.一种在溶液中制备纯化的轭合物的方法，其中所述轭合物包括与细胞结合剂连接的效应分子或报道分子，所述方法包括以下步骤：(a)使所述效应分子或报道分子与双官能连接体试剂接触以共价连接所述连接体与所述效应分子或报道分子并由此制备包含具有与之连接的连接体的所述效应分子或报道分子的未纯化的第一混合物，(b)通过所述未纯化的第一混合物与细胞结合剂反应而使所述细胞结合剂与具有与之连接的连接体的所述效应分子或报道分子轭合以制备第二混合物，和(c)使所述第二混合物经受正切流动过滤、透析、凝胶过滤、吸附色谱、选择性沉淀或其组合以由此制备纯化的轭合物。
2.如第1项所述的方法，其中步骤(b)在pH约4至约9的溶液中进行。
3.如第1项所述的方法，其中步骤(b)的第二混合物基本上不含由于分子内或分子间反应而生成的不期望的交联的、水解的物类。
4.如第1项所述的方法，其中所述效应分子是细胞毒性剂。
5.如第4项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱、紫杉烷、CC1065或其类似物。
6.如第4项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱。
7.如第6项所述的方法，其中所述美登木素生物碱包含硫醇基。
8.如第6项所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM1。
9.如第6项所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
10.如第1项所述的方法，其中所述细胞结合剂是干扰素、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、胰岛素、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、运铁蛋白或抗体。
11.如第10项所述的方法，其中所述细胞结合剂是抗体。
12.如第11项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
13.如第11项所述的方法，其中所述抗体是人或人源化单克隆抗体。
14.如第10项所述的方法，其中所述抗体是MY9、抗B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD11、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、CD105、CD138、EphA受体、EphB受体、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、间皮素、cripto、αvβ3、αvβ5、αvβ6整联蛋白或C242。
15.如第13项所述的方法，其中所述人或人源化抗体是My9-6、B4、C242、N901、DS6、EphA2受体、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲司珠单抗、帕妥株单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗或利妥昔单抗。
16.如第1项所述的方法，其中所述连接体是可裂解或不可裂解的连接体。
17.如第1项所述的方法，其中所述报道分子是放射性同位素。
附图简述
图1显示了抗体与美登木素生物碱DM1(或DM4)和马来酰亚胺-PEGn-NHS连接体的反应混合物的轭合。
图2显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有10μg蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1和2含有分子量标志物。泳道3含有通过传统两步方法制备的具有6.1 DM4/Ab的轭合物。泳道4含有通过本发明描述的方法制备并且含有6.2 DM4/Ab的轭合物。
图3显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A.Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物在还原条件下的蛋白LabChip电泳(Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230试剂盒)。泳道1：分子量标记物；泳道2：使用本发明描述的方法合成的Ab-PEG4-Mal-DM4，6.2 D/Ab；泳道3：使用两步轭合方法合成的Ab-PEG4-Mal-DM4，6.1D/Ab；泳道4：未轭合的Ab(每条泳道0.24微克总蛋白)。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记物。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。
图4显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的MS。A.通过传统两步方法制备的具有6.1 DM4/Ab的轭合物的MS。由于轭合物的明显不均一性，MS峰不能良好分辨。B.通过本发明描述的方法制备并含有6.1 DM4/Ab的轭合物的MS。由于轭合物的均一性，MS峰被良好分辨。
图5显示了具有6.7 DM1/抗体的抗CanAg抗体-PEG4-Mal-DM1轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CanAg抗原的COLO205细胞的结合与未修饰抗体对表达CanAg抗原的COLO205细胞的结合。结合使用荧光单位测量。
图6显示了具有6.7 DM1/抗体的抗CanAg抗体-PEG4-Mal-DM1轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CanAg抗原的COLO205细胞的体外细胞毒性。轭合物被添加至COLO205细胞，在与轭合物连续孵育5天之后，使用WST-8测定法测量细胞存活。使用过量未轭合的抗CanAg抗体阻断轭合物对靶癌细胞的结合和细胞毒性来进行对照试验以说明轭合物的特异性。
图7显示抗体与DM1(或DM4)和马来酰亚胺-磺基-NHS连接体的反应混合物的轭合。
图8显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-Mal)-DM1轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有10μg蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1含有分子量标志物。泳道3和5含有通过本发明描述的方法制备并分别含有3.6/Ab和6.2DM4/Ab的轭合物。泳道2和4含有通过传统两步方法制备并分别含有4.0/Ab和5.7DM1/Ab的轭合物。
图9显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-Mal)-DM1轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A.Ab-(磺基-Mal)-DM1轭合物在还原条件下的蛋白LabChip电泳(Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230试剂盒)。泳道1：分子量标记物；泳道2：未轭合的Ab；泳道3：使用两步轭合方法合成的Ab-磺基-Mal-DM1，5.7 D/Ab；泳道4：使用本发明描述的方法合成的Ab-磺基-Mal-DM1，5.6 D/Ab；每孔0.22微克总蛋白。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记物(每孔0.24微克总蛋白)。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。
图10显示了通过本发明描述的方法制备的抗体-(磺基-Mal)-DM1轭合物与通过传统两步轭合方法制备的轭合物的LC-MS比较。A.使用本发明描述的方法制备的具有3.6 DM1/Ab的轭合物的MS显示具有1-6 DM1分离轭合物峰的均一轭合物。B.通过传统两步轭合方法制备的具有4.0 DM1/Ab的轭合物的MS显示对应于轭合物以及具有水解或交联连接体的轭合物(例如具有2 DM1的轭合物，加一个L、两个L和三个3L)的峰，表明不均一的产物。
图11显示了具有5.6 DM1/抗体的抗CanAg抗体-磺基-Mal-DM1轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CanAg抗原的COLO205细胞的结合与未修饰抗体对表达CanAg抗原的COLO205细胞的结合。结合以荧光单位测量。
图12显示了具有5.6 DM4/抗体的抗CanAg抗体-磺基-Mal-DM1轭合物(使用本发明描述的方法制备)对表达CanAg抗原的COLO205细胞的体外细胞毒性。轭合物被添加至COLO205细胞，在与轭合物连续孵育5天之后，使用WST-8测定法测量细胞存活。使用过量未轭合的抗CanAg抗体阻断轭合物对靶癌细胞的结合和细胞毒性来进行对照试验以说明轭合物的特异性。
图13显示抗体与DM1(或DM4)和磺基-NHS SMCC连接体的反应混合物的轭合。
图14显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(SMCC)-DM1轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有10μg总蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1含有分子量标志物，泳道2含有未轭合的Ab，泳道3含有通过传统两步方法制备的具有3.1 DM1/Ab的轭合物，泳道4含有通过本发明描述的方法制备的具有3.1 DM1/Ab的轭合物。
图15显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(SMCC)-DM1轭合物与使用传统两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A.Ab-SMCC-DM1轭合物在还原条件下的蛋白LabChip电泳(Agilent2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230试剂盒)。泳道1：分子量标记物；泳道2：使用本专利描述的方法合成的Ab-SMCC-DM1，3.1 D/Ab；泳道3：未轭合的Ab；泳道4：使用两步轭合方法合成的Ab-SMCC-DM1，3.1 D/Ab；(每个泳道含有0.24微克总蛋白)。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记物。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。
图16显示了通过本发明描述的方法制备的抗体-(SMCC)-DM1轭合物与通过传统两步轭合方法制备的轭合物的LC-MS比较。A.通过连续两步方法制备的具有3.1 DM1/Ab的轭合物的MS。由于水解和交联的连接体片段的存在，每个主要轭合物峰具有伴随的侧峰。B.通过本发明描述的方法制备的具有3.1 DM1/Ab的轭合物的MS。由于轭合物的均一性，MS峰被良好分辨。
图17显示了所提出的通过传统两步方法轭合期间链间交联和马来酰亚胺失活的机制。
图18显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-Mal)-DM4轭合物的非还原SDS-PAGE以及在抗体轭合反应之前使用4-马来酰亚胺丁酸猝灭游离DM4硫醇(在初始DM4+NHS-磺基-Mal异双官能试剂偶联反应之后)。每个样品含有10μg蛋白；凝胶用考马斯蓝染色。泳道1和5含有分子量标志物。泳道2含有单独的Ab。泳道3含有通过本发明描述的方法制备的轭合物，未添加4-马来酰亚胺丁酸。泳道4含有通过本发明描述的方法制备的轭合物，在初始DM4+NHS-磺基-Mal异双官能试剂之后(在抗体轭合步骤之前)添加4-马来酰亚胺丁酸。
图19显示了使用DM1(或DM4)和SPDB连接体的反应混合物制备二硫化物连接的抗体轭合物。
图20显示通过抗体与DM1(或DM4)和SPDB和NHS-PEG4-Mal连接体两者的未纯化反应混合物轭合而制备具有二硫化物和不可裂解的PEG4-Mal连接体的抗体-美登木素生物碱轭合物。
图21显示具有二硫化物和不可裂解的PEG4-Mal连接体的抗体-美登木素生物碱轭合物(通过抗体与DM1或DM4与SPDB和NHS-PEG4-Mal连接体两者的未纯化反应混合物轭合而制备)的MS。
图22显示抗体与DM1(或DM4)和SMCC连接体的反应混合物的轭合。
图23显示通过本发明描述的方法使用SMCC制备的抗体-SMCC-DM1轭合物的MS，所述轭合物含有平均3.1 DM1/抗体。
图24显示使用DM1(或DM4)和SSNPB连接体的反应混合物制备二硫化物连接的抗体轭合物。
图25显示抗体与DM1(或DM4)和具有脂肪族线性碳链的异双官能连接体的反应混合物的轭合。
发明详述
现在详细参考本发明的某些实施方案，其实例以所附结构和式描述。虽然结合所列举的实施方案描述了本发明，但要理解，它们不是要将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明预期涵盖权利要求书限定的本发明范围内可能包括的所有替代、修改和等同物。本领域技术人员将知道可用于实施本发明的与本文描述的那些类似或等同的许多方法和材料。
本发明描述了使含硫醇的效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂(例如，抗体)轭合的新方法，其中含硫醇的效应物或报道分子首先与双官能连接体试剂在有机、水性或有机/水性混合溶剂中反应，随后未纯化的反应混合物与细胞结合剂在有机、水性或有机/水性混合溶剂中反应。
图例缩写
以下方案和实施例的描述中使用的缩写是：
C＝效应基团或报道基团(例如，细胞毒性剂或放射性标记)
L＝连接体(例如，可裂解或不可裂解的连接体)
X＝胺反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)、磺基-NHS酯、对硝基苯酚酯、四氟磺酸苯基酯、1-羟基-2-硝基-苯-4-磺酸酯)
Y＝马来酰亚胺或卤代乙酰胺(碘乙酰胺、溴乙酰胺)
Yb是反应性混合二硫基(例如，2-吡啶基二硫基、4-吡啶基二硫基、2-硝基-吡啶基二硫基、5-硝基-吡啶基二硫基、2-羧基-5-硝基-吡啶基二硫基)
X'＝酰胺键
Y'＝硫醚(R-S-R')或硒醚(R-Se-R')键
Yb'＝二硫(R-S-S-R')键
在本发明的一个实施方案中，描述了用于制备细胞结合剂与效应分子或报道分子的硫醚连接的轭合物的方法，该方法包括以下步骤：a)使式X-L-Y的异双官能连接体与含硫醚的效应分子或报道分子C(例如，美登木素生物碱或放射性核素)在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性混合反应混合物中接触，产生式X-L-Y'-C的中间产物；b)使反应混合物无需纯化与细胞结合剂例如抗体(Ab)混合产生式Ab-(X'-L-Y'-C)m的轭合物，其中L是具有1-10个碳原子的取代或未取代的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基、简单或取代的芳基单元(取代基选自烷基、烷氧基、卤素、硝基、氟代、羧基、磺酸酯、磷酸酯、氨基、羰基、哌啶基)或含有聚乙二醇的单元(优选1-500个PEG间隔物、更优选1-24个PEG间隔物或更优选2-8个PEG间隔物)；X和Y是胺或硫醇反应性基团例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和马来酰亚胺或卤代乙酰胺；Ab是抗体；m是1-20的整数；X'是与抗体反应时修饰的X位点(例如，酰胺键)；Y'是与例如效应基团或报道基团的细胞毒性剂或放射性标记反应时修饰的Y位点(例如，硫醚键)；和c)通过正切流动过滤、透析或色谱(例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。优选地，Y是选自马来酰亚胺或卤代乙酰胺的硫醇反应性基团。优选地，L是具有1-6个碳或2-8个PEG间隔物的直链或支链烷基。优选地，C是选自美登木素生物碱、CC-1065类似物、紫杉烷、DNA结合剂的细胞毒性剂，并且更优选地，它是美登木素生物碱。
式1和2中表示的反应工序：
X-L-Y+C→X-L-Y'-C  (1)
Ab+X-L-Y'-C(从反应1未纯化)→Ab-(X'-L-Y'-C)m (2)
不涉及中间产物X-L-Y'–C的任何纯化，并且因此提供了将之与抗体直接混合(未纯化的中间产物被添加至抗体，或者抗体被添加至未纯化的中间产物)的优势，从而使该方法有利于轭合，因为这不需要繁琐的纯化步骤。重要的是，与通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物中发现的链间蛋白交联和失活马来酰亚胺残基不同，该方法产生没有链间蛋白交联或失活马来酰亚胺残基的均一轭合物。
反应1可以高浓度的异双官能连接体、X-L-Y和效应基团或报道基团C在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性反应混合物中进行，导致比通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物的水性溶液中较低浓度时更快的反应速率。
反应1中产生的中间产物X-L-Y'-C可以未纯化的低温冷冻状态在适当低pH(例如，pH～4-6)的水性溶剂、有机溶剂或混合的有机/水性混合物中或者以冻干状态保存延长的时段，并且可以在后来与抗体溶液混合以在约4-9的较高pH值下进行最终的轭合反应，由此增加该反应工序的方便性。中间产物可以在与细胞结合剂混合之前按需要用有机溶剂或水性缓冲液或有机溶剂与水性缓冲液的混合物稀释。在本文结合数值使用的术语"约"应该被理解为指所有此类数值，包括来自其的所有数值和小的变化。中间产物X-L-Y'-C与抗体的反应可以在以下pH值下进行：约4至约pH9、优选约5至8.7的pH范围、更优选约6.5至约8.5的pH范围、例如pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4和8.5、其中的pH范围或其小变化。用于抗体与中间产物X-L-Y'-C在约6.5至约8.5的优选pH范围下反应的缓冲液是pKa值在该pH范围附近的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液。这些优选的缓冲液不应该具有伯氨基或仲氨基或者可以与连接体X(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应的其他反应性基团。
在第一反应中使用比异双官能连接体X-L-Y化学计量或略微过量的C以保证在向抗体添加未纯化混合物之前所有Y基团(例如马来酰亚胺)被反应。可以进行用猝灭试剂(例如4-马来酰亚胺丁酸、3-马来酰亚胺丙酸或N-乙基马来酰亚胺或碘乙酰胺或碘乙酰胺丙酸)的任选额外处理以保证任何未反应的C在与抗体混合之前被猝灭以最小化硫醇-二硫化物与天然抗体二硫基的任何不希望的交换反应。在用极性带电硫醇猝灭试剂(例如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸)猝灭时，过量的未反应的C被转化成极性带电加合物，其可以容易地与共价连接的轭合物分离。任选地，最终反应混合物在纯化之前与亲核物质例如含氨基的亲核物质(例如，赖氨酸、牛磺酸、羟胺)反应以猝灭任何未反应的连接体(X-L-Y'-C)。
用于抗体与美登木素生物碱(DMx)和异双官能连接体的未纯化的初始反应混合物反应的可选方法包括将DMx和异双官能连接体的初始反应混合物与抗体在低pH(pH～5)下混合(在DMx-连接体反应结束时)，随后添加缓冲剂或碱以增加pH至约6.5-8.5以进行轭合反应。
该新方法用于制备抗体与细胞毒性美登木素生物碱药物的轭合物。基于还原SDS-PAGE、蛋白LabChip电泳和质谱对轭合物的鉴定，使用在反应工序1-2中列出的该方法制备的抗体-美登木素生物碱轭合物出乎意料地在均一性方面远优于通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物。包括反应工序1-2的本发明描述的轭合方法不需要任何中间纯化步骤，并因此显著比传统两步方法更方便。
在本发明的第二个实施方案中，描述了用于制备细胞结合剂与效应分子或报道分子的硫醚连接轭合物的方法，该方法包括以下步骤：a)使式Y-L-Y的同双官能连接体与含硫醇或胺的效应基团或报道基团C(例如细胞毒性剂)在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性混合反应混合物中接触以产生Y-L-Y'-C，b)反应混合物无需纯化与例如抗体在水性溶液或水性/有机混合物中混合产生式Ab-(X'-L-Y'-C)m的轭合物，其中L如上文定义；Y是硫醇或胺反应性基团例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺，或N-羟基亚磺酰亚胺或磺基N-羟基亚磺酰亚胺；Ab是抗体；m是1至20的整数；Y'是与抗体反应时修饰的Y位点(例如，硫醚键或酰胺键)或与细胞毒性剂或效应基团或报道基团反应时修饰的Y位点(例如，硫醚键或酰胺键)，和c)通过正切流动过滤、透析或色谱(例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。式3和4中表示的反应工序：
Y-L-Y+C→Y-L-Y'-C  (3)
Ab+Y-L-Y'-C(从反应3未纯化)→Ab-(Y'-L-Y'-C)m  (4)
不涉及中间产物Y-L-Y'-C的任何纯化，并因此是有利的轭合方法。
在第三个实施方案中，描述了用于制备细胞结合剂与效应分子或报道分子的二硫化物连接的轭合物的方法，该方法包括以下步骤：a)使式X-L-Yb的异双官能连接体与效应基团或报道基团C(例如细胞毒性剂)在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性混合反应混合物中接触以产生中间产物X-L-Yb'-C；b)使反应混合物无需纯化与抗体在水性溶液或水性/有机混合物中混合产生式Ab-(X'-L-Yb'-C)m的轭合物，其中L如上文定义；Yb是反应性二硫化物例如吡啶基二硫化物或硝基吡啶基二硫化物；X是胺反应性基团例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或磺基N-羟基琥珀酰亚胺酯；Ab是抗体；m是1至20的整数；X'是与抗体反应时修饰的X位点(例如酰胺键)；Yb是与细胞毒性剂或效应基团或报道基团反应时修饰的Yb位点(二硫化物)；和c)通过正切流动过滤、透析或色谱(例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。反应工序以式5和6表示：
X-L-Yb+C→X-L-Yb'-C  (5)
Ab+X-L-Yb'-C(从反应5未纯化)→Ab-(X-L-Yb'-C)m  (6)
在第四个实施方案中，描述了通过两个类型的连接体—不可裂解的(硫醚键)和可裂解的(二硫键)—制备抗体与效应基团或报道基团轭合物的方法，该方法包括以下步骤：a)使X-L-Y和X-L-Yb连接体与细胞毒性剂C接触以产生式X-L-Y'-C和X-L-Yb'-C的中间化合物，b)如反应式7-9所示使反应混合物无需纯化与抗体顺序或同时混合：
X-L-Y+C→X-L-Y'-C  (7)
X-L-Yb+C→X-L-Yb'-C  (8)
Ab+X-L-Y'-C+X-L-Yb'-C(从反应7-8未纯化)→Ab-(X'-L-Y'-C)m(X'-L-Yb'-C)m'  (9)
以提供轭合物Ab-(X'-L-Y'-C)m(X'-L-Yb'-C)m'，其中X、L、Y'、C、Yb'和m的定义如上文给出，并且m'是1至20的整数；和c)通过正切流动过滤、透析或色谱(例如，凝胶过滤、离子交换色谱、疏水相互作用色谱)或其组合纯化轭合物。这两个连接体效应中间体(X-L-Y'-C和X-L-Yb'-C)无需纯化以不同顺序(首先X-L-Y'-C、然后X-L-Yb'-C，或者首先X-L-Yb'-C、然后X-L-Y'-C，或者同时)和不同比例与抗体混合。
反应1、3、5和7-8可以高浓度双官能连接体(X-L-Y、X-L-Yb或Y-L-Y)和效应基团或报道基团C在水性溶剂、有机溶剂或有机/水性反应混合物中进行，导致比通过传统两步反应和纯化工序制备的轭合物的水性溶液中较低浓度时更快的反应速率，其中试剂溶解度是限制性的。
在反应1、3、5和7-8中产生的中间产物X-L-Y'-C或Y-L-Y'-C或X-L-Yb'-C可以未纯化的低温冷冻状态在适当低pH的水性溶剂、有机溶剂或混合的有机/水性混合物中或者以冻干状态保存延长的时段，并且可以在后来与抗体溶液混合以进行最终的轭合反应，由此增加该反应工序的方便性。
在第一反应中使用比异双官能连接体X-L-Y或Y-L-Y或X-L-Yb化学计量或略微过量的C以保证在向抗体添加未纯化混合物之前所有Y基团(例如马来酰亚胺)被反应。可以进行用猝灭试剂(例如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸或N-乙基马来酰亚胺或碘乙酰胺或碘乙酸)的任选额外处理以保证任何未反应的基团(例如硫醇)在添加至抗体之前被猝灭以最小化硫醇-二硫化物与天然抗体二硫基的任何不希望的交换反应。在C与双官能连接体初始反应之后，用带电极性硫醇猝灭试剂猝灭过量的C，使过量C转化成高极性的水溶性加合物，其容易通过凝胶过滤、透析或TFF与共价连接的轭合物分离。最终轭合产物不含有任何非共价连接的C。任选地，最终反应混合物2、4、6和9在纯化之前用亲核物质例如含氨基的亲核物质(例如，赖氨酸、牛磺酸、羟胺)处理以猝灭任何未反应的连接体(X-L-Y'-C、Y-L-Y'-C或X-L-Yb'-C)。
抗体与DMx和双官能连接体的未纯化初始反应混合物的反应的可选方法包括将DMx和异双官能连接体的初始反应混合物与抗体在低pH(pH～5)下混合(在DMx-连接体反应结束时)，随后添加缓冲剂或碱以增加pH至约6.5-8.5以进行轭合反应。
通过将衍生自两种或多种不同效应物的两种或多种连接体-效应物中间体无需纯化地顺序或同时添加至抗体，超过一种类型效应物的多个拷贝可以与抗体轭合。
效应基团
术语效应基团或效应分子可互换使用并且本文使用的术语"效应基团"或"效应分子"意思是包括细胞毒性剂。在某些方面，可能希望效应基团或效应分子通过各种长度的间隔臂连接以降低潜在位阻。超过一种效应子的多个拷贝可以通过向抗体顺序或同时添加未纯化的衍生自两个或多个不同效应子的两个或多个连接体-效应物中间体而轭合至抗体。
可用于本发明的细胞毒性剂包括化疗剂或化疗剂的结构类似物。"化疗剂"是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，例如硫化三环氮丙基磷和环磷酰胺(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯例如白消安、英丙舒凡和嗪消安；氮丙啶例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；氮丙啶和甲基三聚氰胺，包括六甲基蜜胺、三亚乙基蜜胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；己酸配质(特别是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成的类似托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；cryptophycin(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇；pancratistatin；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌氮芥、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸甲氧氮芥、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如亚硝基脲氮芥、氯脲菌素、福替目丁、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素，特别是加利车霉素γ1和加利车霉素θI，参见例如Angew Chem Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团及相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团chromomophores)、aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素；色霉素、放线菌素D、道诺红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉代-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、nitomycins、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲喋呤、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；pyrimnidine类似物，例如盐酸环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、5氟脱氧尿苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、表硫雄醇、环戊缩环硫雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比山群；edatraxate；defofamine；地美可辛；地吖醌；elfomithine；醋酸羟哔咔唑；环氧聚微管素；环氧甘醚；环氧甘醚；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，例如美登素和安丝菌素；丙米腙；米托蒽醌；单哌潘生丁；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡喃阿霉素；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；丙亚胺；根霉素；西佐喃；诸螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)；氨基甲酸乙酯；长春花碱酰胺；氮烯唑胺；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；环磷酰胺；硫化三环氮丙基磷；紫杉烷，例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，NJ.)和多烯紫杉醇(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；表鬼臼毒素(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；表鬼臼毒噻吩糖苷；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；和以上任何的药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如三苯氧胺、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，例如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、leuprolide和戈舍瑞林；siRNA和以上任何的药学可接受的盐、酸或衍生物。可用于本发明的其他化疗剂公开于美国公开号20080171040或美国公开号20080305044，并通过引用整体并入。
在一个优选实施方案中，化学治疗性细胞毒性剂基本上是小分子细胞毒性剂。"小分子药物"在本文广泛用于指可以具有例如100至1500、更适合120至1200、优选200至1000的分子量且通常具有小于约1000的分子量的有机化合物、无机化合物或有机金属化合物。本发明的小分子细胞毒性剂包括具有小于约1000分子量的寡肽和其他生物分子。小分子细胞毒性剂在本领域被良好表征，例如在WO05058367A2、欧洲专利申请号85901495和8590319中，以及在美国专利号4,956,303及其他中，其通过引用整体并入。
优选的小分子细胞毒性剂是允许连接至细胞结合剂的那些。本发明包括已知的细胞毒性剂以及可以变成已知的那些。特别优选的小分子细胞毒性剂包括细胞毒性剂。
细胞毒性剂可以是导致细胞死亡或诱导细胞死亡或以某种方式降低细胞存活的任何化合物，其中每种细胞毒性剂包括硫醇部分。
优选的细胞毒性剂是美登木素生物碱化合物、紫杉烷化合物、CC-1065化合物、道诺红霉素化合物和阿霉素化合物、吡咯并苯并二氮卓二聚体、加利车霉素、auristatin及其类似物和衍生物，其中的一些在下文描述。
不一定是小分子的其他细胞毒性剂例如siRNA也包括在本发明范围内。例如，siRNA可以通过常用于修饰寡核苷酸的方法连接至本发明的交联剂(参见例如美国专利公开20050107325和20070213292)。因此，以其3'或5'-亚磷酰胺形式的siRNA与带有羟基官能团的交联剂的一端反应而在siRNA和交联剂之间产生酯键。类似地，siRNA亚磷酰胺与带有末端氨基的交联剂反应导致交联剂与siRNA通过胺连接。siRNA详细描述于美国专利公开号：20070275465、20070213292、20070185050、20070161595、20070054279、20060287260、20060035254、20060008822、20050288244、20050176667，其在此通过引用整体并入。
美登木素生物碱
可用于本发明的美登木素生物碱是本领域公知的，并且可以根据已知方法从天然来源分离或根据已知方法合成制备。
适合的美登木素生物碱的实例包括美登醇和美登醇类似物。适合的美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳族环的那些和具有其他位置修饰的那些。
具有修饰的芳族环的适合的美登醇类似物的具体实例包括：
(1)C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(通过LAH还原美登木素P2来制备)；
(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌或放线菌脱甲基或者使用LAH脱氯来制备)；和
(3)C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰基氯酰化来制备)。
具有其他位置修饰的适合的美登醇类似物的具体实例包括：
(1)C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5反应来制备)；
(2)C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH20R)(美国专利号4,331,598)；
(3)C-14-羟基甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4,450,254)(从诺卡菌制备)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)(通过链霉菌转化美登醇来制备)；
(5)C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(从滑桃树分离)；
(6)C-18-N-脱甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348)(通过链霉菌对美登醇脱甲基来制备)；和
(7)4,5-脱氧(美国专利号4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。
用于本发明的含硫醇美登木素生物碱的合成完全公开于美国专利号5,208,020、5,416,064和美国专利申请号20040235840。
预期在C-3位置、C-14位置、C-15位置或C-20位置具有硫醇部分的美登木素生物碱都是有用的。C-3位置是优选的，并且美登醇的C-3位置是特别优选的。N-甲基-丙氨酸-含C-3硫醇部分的美登木素生物碱和N-甲基-半胱氨酸-含C-3硫醇部分的美登木素生物碱和每一种的类似物也是优选的。
用于本发明的N-甲基-丙氨酸-含C-3硫醇部分的美登木素生物碱衍生物的具体实例由式M1、M2、M3、M6和M7表示。
其中：
l是1至10的整数；且May是美登木素生物碱。
其中：
R1和R2是H、CH3或CH2CH3，并且可以相同或不同；
m是0、1、2或3；且
May是美登木素生物碱。
其中：
n是3至8的整数；并且
May是美登木素生物碱。
其中：
l是1、2或3；
Y0是Cl或H；且
X3是H或CH3。
其中：
R1、R2、R3、R4是H、CH3或CH2CH3，并且可以相同或不同；
m是0、1、2或3；并且
May是美登木素生物碱。
用于本发明的N-甲基-半胱氨酸-含C-3硫醇部分的美登木素生物碱衍生物的具体实例由式M4和M5表示。
其中：
o是1、2或3；
p是0至10的整数；并且May是美登木素生物碱。
其中：
o是1、2或3；
q是0至10的整数；
Y0是Cl或H；并且
X3是H或CH3。
优选的美登木素生物碱是公开于美国专利号5,208,020；5,416,064；6,333.410；6,441,163；6,716,821；RE39,151和7,276,497的那些。
紫杉烷
根据本发明的细胞毒性剂也可以是紫杉烷。
可用于本发明的紫杉烷已经被修饰为含有硫醇部分。用于本发明的一些紫杉烷具有以下所示的式T1：
优选的紫杉烷是公开于美国专利号6,340,701；6,372,738；6.436,931；6,596,757；6,706,708；7,008,942；7,217,819和7,276,499中的那些。
CC-1065类似物
根据本发明的细胞毒性剂也可以是CC-1065类似物。
根据本发明，CC-1065类似物含有A亚基和B或B-C亚基。优选的CC-1065类似物是公开于美国专利号5,475,092；5,595,499；5,846,545；6,534,660；6,586,618；6,756,397和7,049,316的那些。
道诺红霉素/阿霉素类似物
根据本发明的细胞毒性剂也可以是道诺红霉素类似物或阿霉素类似物。
本发明的道诺红霉素和阿霉素类似物可以被修饰为含有硫醇部分。具有硫醇部分的本发明的修饰的阿霉素/道诺红霉素类似物描述于WO 01/38318。修饰的阿霉素/道诺红霉素可以根据已知方法合成(参见例如，美国专利号5,146,064)。
Auristatin包括auristatin E、auristatin EB(AEB)、auristatinEFP(AEFP)、单甲基auristatin E(MMAE)并且描述于美国专利号5,635,483，Int.J.Oncol.15：367-72(1999)；Molecular CancerTherapeutics，第3卷，第8期，pp.921-932(2004)；美国专利申请号11/134826，美国专利公开号20060074008，2006022925。
根据本发明的细胞毒性剂包括本领域已知的吡咯并苯并二氮卓二聚体(美国专利号7,049,311；7,067,511；6,951,853；7,189,710；6,884,799；6,660,856)。
类似物和衍生物
细胞毒性剂领域技术人员容易理解，本文描述的细胞毒性剂的每一种可以如下方式修饰：得到的化合物依然保留起始化合物的特异性和/或活性。技术人员还理解，这些化合物的许多可以替代本文描述的细胞毒性剂来使用。因此，本发明的细胞毒性剂包括本文描述的化合物的类似物和衍生物。
报道基团
术语报道基团或报道分子可互换使用并且本文使用的术语"报道基团"或"报道分子"指为诊断或治疗目的通过试剂的特异性亲和部分递送给特定物质或细胞的物质；实例有放射性同位素、顺磁造影剂和抗癌剂。各种标记或报道基团用于癌症患者的肿瘤成像应用，诊断各种疾病的免疫测定应用，使用放射性核素-配体轭合物的癌症疗法，和用于纯化生物活性剂例如蛋白、肽和寡核苷酸的亲和色谱应用。与细胞结合剂轭合的标记或报道基团包括荧光团和亲和标记例如生物素。这种报道基团可参考美国公开号2007/0092940。包括例如生物素或荧光素的报道基团还可以连接至PEG轭合物部分。许多适合的报道基团是本领域已知的，例如美国专利号4,152,411和Hirschfeld美国专利号4,166,105、美国专利号5,223,242、美国专利号5,501,952、美国公开20090136940，并且通过引用整体并入。
连接体
轭合物可通过体外方法制备。为了连接药物与细胞结合剂，使用了连接基团。适合的连接基团是本领域公知的并且包括不可裂解或可裂解的连接体。不可裂解的连接体是能够以稳定共价方式连接细胞毒性剂与细胞结合剂的任何化学部分。不可裂解的连接体基本上耐受酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。不可裂解的连接体的实例包括具有用于与药物、报道基团或细胞结合剂反应的N-琥珀酰亚胺酯、N-硫代琥珀酰亚胺酯部分、基于马来酰亚胺基-或卤代乙酰基部分的连接体。包含基于马来酰亚胺基-部分的交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、SMCC的"长链"类似物(LC-SMCC)N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺己酸酯)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基癸酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含基于卤代乙酰基部分的交联试剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
形成不可裂解连接体的缺少硫原子的其他交联试剂也可用于本发明。这种连接体可衍生自基于二羧酸的部分。适合的基于二羧酸的部分包括但不限于以下所示通式的α,ω-二羧酸：
HOOC-Xl-Yn-Zm-COOH
其中X是具有2至20个碳原子的直链或支链烷基、烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原子的取代或未取代的芳族基团或者其中杂原子选自N、O或S的取代或未取代的杂环基，并且其中l、m和n各自为0或1，条件是l、m和n不同时为0。
本文公开的不可裂解连接体的许多详细描述于美国专利公开号20050169933。
可裂解的连接体是在温和条件下可裂解的连接体，所述温和条件即其中细胞毒性剂活性不受影响的条件。许多已知的连接体属于该类别并且在下文描述。
酸不稳定连接体是在酸性pH下可裂解的连接体。例如，某些细胞内区室例如内体和溶酶体具有酸性pH(pH 4-5)并且提供适合裂解酸不稳定连接体的条件。
光不稳定连接体用于体表和许多光可及的体腔内。而且，红外光可穿透组织。
一些连接体可被肽酶裂解。仅某些肽容易在细胞内或细胞外裂解，参见例如Trouet等，79 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，626-629(1982)，Umemoto等43 Int.J.Cancer，677-684(1989)和lysosomal-hydrolasecleavable valine-citrulline linkage(溶酶体水解酶可裂解的缬氨酸-瓜氨酸连接)(美国专利6,214,345 B1)。而且肽由α-氨基酸和肽键构成，肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸与另一氨基酸的α-氨基之间的酰胺键。认为其他酰胺键例如羧酸和赖氨酸的ε氨基之间的键不是肽键并且是不可裂解的。
一些连接体可被酯酶裂解。同样，仅某些酯可被细胞内或细胞外存在的酯酶裂解。酯是羧酸与醇缩合而成的。简单的酯是用简单的醇例如脂肪醇和小的环状和小芳族醇产生的。例如，本发明人发现没有在美登素的C-3处裂解酯的酯酶，因为酯的醇组分美登醇是非常大且复杂的。
优选的可裂解连接体分子包括例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(参见例如，Carlsson等，Biochem.J，173：723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)(参见例如美国专利4,563,304)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)(参见例如，CAS登记号341498-08-6)和其他反应性交联剂，例如描述于美国专利6,913,748中的那些，其在此通过引用并入。
可用于本发明的其他连接体包括带电连接体或亲水连接体，分别描述于美国专利申请号12/433,604和12/433,668，其在此通过引用并入。
细胞结合剂
本发明使用的细胞结合剂是蛋白(例如，免疫球蛋白和非免疫球蛋白)，其与癌细胞上的靶抗原特异性结合。这些细胞结合剂包括：
-抗体，包括：
-表面处理抗体(resurfaced antibody)(美国专利号5,639,641)；
-人源化或完全人抗体(人源化或完全人抗体选自但不限于huMy9-6、huB4、huC242、huN901、DS6、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲司珠单抗、比伐珠单抗、西罗珠单抗和利妥昔单抗(参见例如，美国专利号5,639,641、5,665,357和7,342,110、国际专利申请WO 02/16,401、美国公开号20060045877、美国公开号20060127407、美国公开号20050118183、Pedersen等，(1994)J.Mol.Biol.235，959-973、Roguska等，(1994)Proceedings of the National Academy ofSciences，第91卷，969-973、Colomer等，Cancer Invest.，19：49-56(2001)、Heider等，Eur.J.Cancer，31A：2385-2391(1995)、Welt等，J.Clin.Oncol.，12：1193-1203(1994)和Maloney等，Blood，90：2188-2195(1997))；和
-抗体片段，例如sFv、Fab、Fab'和F(ab')2，其优先结合靶细胞(Parham，J.Immunol.131：2895-2902(1983)；Spring等，J.Immunol.113：470-478(1974)；Nisonoff等，Arch.Biochem.Biophys.89：230-244(1960))；
其他细胞结合剂包括其他细胞结合蛋白和多肽，示例如下但不限于此：
-锚蛋白重复蛋白(DARPins；Zahnd等，J.Biol.Chem.，281，46，35167-35175，(2006)；Binz，H.K.，Amstutz，P.&Pluckthun，A.(2005)Nature Biotechnology，23，1257-1268)或锚蛋白样重复蛋白或合成肽，描述于例如美国公开号20070238667；美国专利号7,101,675；WO/2007/147213；WO/2007/062466)；
-干扰素(例如α、β、γ)；
-淋巴因子例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6；
-激素，例如胰岛素、TRH(促甲状腺激素释放激素)、MSH(黑素细胞刺激激素)、类固醇激素例如雄激素和雌激素；和
-生长因子和集落刺激因子，例如EGF、TGF-α、IGF-1、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess，Immunology Today 5：155-158(1984))。
当细胞结合剂是抗体时，它结合多肽抗原并且可以是跨膜分子(例如受体)或配体例如生长因子。示例性抗原包括分子例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降血钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，例如vmc因子、IX因子、组织因子(TF)和von Willebrands因子；抗凝血因子，例如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原活化因子，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原活化因子(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；耻骨松弛激素A-链；耻骨松弛激素B-链；耻骨松弛激素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经元营养因子，例如骨源性神经元营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，例如NGF-β.；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形成蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如，HIV包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM、异二聚体人整联蛋白受体的α-V亚基；肿瘤相关抗原，例如HER2、HER3或HER4受体；和上列多肽的任何一个的片段。
本发明涵盖的抗体的优选抗原包括CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD46；ErbB受体家族成员，例如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，例如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD 18或抗CD11b抗体)；生长因子，例如VEGF；组织因子(TF)；TGF-β.；α干扰素(α-IFN)；白介素，例如IL-8；IgE；血型抗原Apo2、死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。这里最优选的靶是IGF-IR、CanAg、EGF-R、EphA2、MUC1、MUC 16、VEGF、TF、CD 19、CD20、CD22、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、CRIPTO(在大部分人乳腺癌细胞中以升高的水平产生的蛋白)、αv/β3整联蛋白、αv/β5整联蛋白、TGF-β、CD11a、CD 18、Apo2和C24。
单克隆抗体技术允许产生单克隆抗体形式的特异性细胞结合剂。本领域特别公知的是通过用感兴趣的抗原例如完整靶细胞、从靶细胞分离的抗原、完整病毒、减毒的完整病毒和病毒蛋白例如病毒外壳蛋白免疫接种小鼠、大鼠、仓鼠或任何其他哺乳动物来产生单克隆抗体的技术。还可以使用致敏的人细胞。产生单克隆抗体的另一方法是使用sFv(单链可变区)、特别是人sFv的噬菌体文库(参见例如，Griffiths等，美国专利号5,885,793；McCafferty等，WO 92/01047；Liming等，WO 99/06587.)。
适合的细胞结合剂的选择是根据待靶向的特定细胞群的选择问题，但一般而言，如果适当的一种是可获得的，则优先结合靶细胞的单克隆抗体及其片段是优选的。
例如，单克隆抗体My9是对急性髓细胞样白血病(AML)细胞上存在的CD33抗原特异性的鼠IgG2a抗体(Roy等Blood 77：2404-2412(1991))并且可用于治疗AML患者。类似地，单克隆抗体抗B4是鼠IgG1，其结合B细胞上的CD 19抗原(Nadler等，J.Immunol.131：244-250(1983))并且当靶细胞是表达该抗原的B细胞或患病细胞例如非霍奇金淋巴瘤或慢性成淋巴细胞白血病时可以被使用。类似地，抗体N901是结合小细胞肺癌细胞和神经内分泌来源的其他肿瘤细胞上存在的CD56的鼠单克隆IgG1抗体(Roy等J Nat.Cancer Inst.88：1136-1145(1996))、结合CanAg抗原的huC242抗体、结合HER2/neu的曲司珠单抗、和结合EGF受体的抗EGF受体抗体。
纯化方法
本发明轭合物，即最终产物，被纯化以除去任何未反应或未轭合的效应分子或报道分子或未反应的连接体或未轭合的水解的连接体。纯化方法可以是正切流动过滤(还称为交叉流过滤的TFF、超滤或渗滤)、凝胶过滤、吸附色谱、选择性沉淀或其组合。吸附色谱方法包括离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、疏水反应色谱(HIC)、疏水电荷诱导色谱(HCIC)、混合型离子交换色谱、固定化金属亲和色谱(IMAC)、染料配体色谱、亲和色谱和反相色谱。例如，式2中描述的轭合物Ab-(X'-L-Y'-C)m从未反应的C或未反应的/水解的连接体X-L-Y或X-L-Y'-C纯化。类似地，式4、6和9中描述的轭合物被纯化。这种纯化方法是本领域技术人员已知的，并且可以参见例如美国公开号2007/0048314。
轭合物中不期望的水解的连接体或蛋白交联
利用蛋白与具有反应性马来酰亚胺或卤代乙酰胺残基的异双官能连接体的初始反应的传统轭合方法具有两个主要缺点：(i)由于在与效应分子或报道分子反应之前抗体中加入的连接体的水性失活，轭合产物可能由水解的连接体组成；和(ii)由于马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)基团与蛋白或肽中的天然组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基反应，轭合物的链间或链内交联(A.Papini等，Int.J.Pept.Protein Res.，1992，39，348-355；T.Ueda等，Biochemistry，1985，24，6316-6322)。抗体中的这种链间交联将导致重链和轻链之间或两条重链之间各种不可还原的共价连接，这在还原SDS-PAGE分析中是明显的，因为存在比预期重链和轻链条带更高分子量的条带。抗体中这种链间或链内交联也可以通过MS显示，因为存在不同于抗体加连接的报道基团或效应基团的预期质量峰的异常质量峰。不同于传统轭合方法，本申请中描述的方法导致具有高均一性而无明显链间交联或水解连接体的轭合物。
本文和以下实施例中引用的所有参考文献明确通过引用整体并入。
实施例
仅示例性的以下实施例不是要限制本发明。
实施例1.对比传统两步方法，通过本方法使用异双官能连接体马来酰亚胺-PEGn-NHS轭合抗体与细胞毒性剂DM1/DM4(图1)。
在N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中制备浓度为30-60mM的DM1[N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素]或DM4[N2’-脱乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素](DMx)硫醇和马来酰亚胺-PEGn-NHS双官能连接体的储液。连接体与DMx硫醇在含有至多50％v/v 200mM琥珀酸盐缓冲液，2mM EDTA，pH 5.0的DMA中混合在一起而得到1.6：1的DMx：连接体摩尔比和等于15mM的DMx终浓度。混合后，使反应混合物静置1-4h，然后小份反应混合物被稀释10倍并在302-320nm下测量吸光度以确定任何剩余的未反应的马来酰亚胺的存在，使用马来酰亚胺的消光系数(ε)，302nm＝620M-1cm-1和ε320nm～450M-1cm-1。(后来对小份冷冻的反应混合物进行额外的反相HPLC分析并在302nm和252nm监测吸光度以证实在反应混合物添加至抗体时，连接体马来酰亚胺完全消失和期望的连接体-DMx试剂的形成)。当通过UV确定不再存在马来酰亚胺时，将小份反应混合物无需纯化而添加至抗体的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)溶液中，最终轭合条件为4mg/ml Ab，90％磷酸盐缓冲液/10％DMA，pH 7.5。允许轭合反应在室温下进行2h。使用在pH 7.5磷酸盐缓冲液中平衡的G25凝胶过滤柱或使用正切流动过滤(TFF)，使Ab-DMx轭合物从过量小分子DMx和连接体反应物纯化。轭合物在pH 7.5缓冲液中4℃下进一步保持2天，以允许非共价连接或通过不稳定键连接至抗体的任何DMx物类解离。然后将轭合物透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，然后经0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DMx数目(平均)。
使用几种不同的反应条件用于DMx硫醇与异双官能马来酰亚胺-PEG4-NHS试剂的初始反应：50％DMA/50％水性200mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.0，2mM EDTA(v/v)；或60％DMA/40％200mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.0，2mM EDTA(v/v)；或100％DMA，每摩尔DM4硫醇1.5摩尔当量的有机碱(例如，N,N'-二异丙基乙胺、DIPEA或4-甲基吗啉)。
在一系列实验中，DMx与马来酰亚胺-PEG4-NHS连接体(购自Pierce Endogen)的摩尔当量为1.2-2.4，并且反应时间是30min。对纯化轭合物测量的DMx/Ab数目被测量为增加当量的DMx/抗体的函数。1.2-2.0当量DM1/连接体的条件产生具有相似DMx/Ab载量的轭合物，表明DMx硫醇在连接体的NHS酯侧不期望的反应不是重要问题。最终轭合物中存在的交联的量也通过还原SDS PAGE分析，显示交联污染物的存在随着增加的DM1/连接体比率而显著降低。
在最初DMx和异双官能连接体反应完成之后(在反应混合物添加至抗体之前)引入使用马来酰亚胺或卤代乙酰胺试剂(例如马来酰亚胺丁酸或马来酰亚胺丙酸或N-乙基马来酰亚胺或碘乙酰胺或碘乙酸)的一个任选猝灭步骤，以猝灭过量DMx硫醇基，以防止DMx硫醇与抗体的任何不期望的反应。
抗体与未纯化的DMx和异双官能连接体的初始反应混合物反应的可选方法包括在低pH(pH～5)下混合DMx和异双官能连接体的初始反应混合物与抗体(在DMx-连接体反应完成时)，随后添加缓冲液或碱以增加pH至6.5-8.5以进行轭合反应。
抗体-PEG4-Mal-DM1或DM4轭合物通过传统两步轭合方法制备，与本发明描述的轭合方法相比较。在pH 7.5磷酸盐缓冲液(50mM磷酸钾、50mM氯化钠、2mM EDTA，pH 7.5)和5％DMA中浓度为8mg/ml的人源化抗体用过量异双官能马来酰亚胺-PEG4-NHS连接体试剂(购自Pierce Endogen)修饰。25℃下2h后，修饰的抗体通过G25色谱凝胶纯化以除去过量的未反应的未加入的连接体。通过在280nm下UV吸光度测定纯化的Ab的回收。在修饰的Ab中连接的马来酰亚胺基团的数目使用小份修饰的抗体测定，通过添加已知量的硫醇(例如2-巯基乙醇)，所述硫醇以超过马来酰亚胺的量添加以与修饰抗体中的马来酰亚胺残基反应并然后通过Ellman测定法使用DTNB试剂分析剩余硫醇(硫醇TNB在412nm的消光系数＝14150M-1cm-1；Riddles，P.W.等，Methods Enzymol.，1983，91，49-60；Singh，R.，Bioconjugate Chem.，1994，5，348-351)。修饰Ab与DM1或DM4硫醇的轭合以反应混合物中Ab浓度为2.5mg/ml下进行，所述反应混合物由95％磷酸盐缓冲液pH 7.5(50mM磷酸钾，50mM氯化钠，2mM EDTA，pH 7.5)和5％DMA组成。Ab上每摩尔连接的马来酰亚胺添加1.7摩尔当量的过量DM1或DM4硫醇。在25℃反应过夜之后，轭合物使用0.22μm滤器无菌过滤并通过在磷酸盐缓冲液pH7.5(50mM磷酸钾，50mM氯化钠，2mM EDTA，pH 7.5)中平衡的G25柱从过量未反应的DM1或DM4凝胶纯化。纯化的轭合物在磷酸盐缓冲液pH 7.5(50mM磷酸钾，50mM氯化钠，2mM EDTA，pH 7.5)中4℃保持2天以允许非共价连接或通过不稳定键连接至抗体的任何DM1或DM4物类解离。随后在组氨酸/甘氨酸缓冲液pH5.5(130mM甘氨酸/10mM组氨酸，pH 5.5)中将轭合物透析2天，并使用0.22μm滤器无菌过滤。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DM1/DM4和Ab的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DM1或DM4分子数目。
使用具有4-12％Bis Tris Gel的NuPage电泳系统(Invitrogen)对轭合物和抗体样品进行还原SDS PAGE。热变性和还原样品以10μg/泳道加载。使用本发明描述的方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE仅显示作为主要条带的预期的重链和轻链条带(分别是50kDa和25kDa)(图2)。相反，通过传统两步轭合方法制备的轭合物显示分子量为75、100、125和150kDa的不期望的交联条带，推测分别对应于链间交联物类HL、H2、H2L和H2L2(图2)。
通过本发明描述的方法制备的抗体-PEG4-Mal-DM4轭合物的蛋白LabChip电泳分析(在还原条件下)显示百分比为58％和30％(总蛋白)的预期重链和轻链条带，分别类似于未轭合抗体的65％和30％(图3)。相反，使用传统两步轭合方法制备的轭合物显示分别仅16％和8％的重链和轻链条带，并且范围94-169kDa的较高分子量的主要条带推测是由于链间交联。基于定量蛋白LabChip分析，通过本申请描述的方法制备的轭合物高度优于使用传统两步方法制备的轭合物(图3)。
通过本发明描述的方法制备的轭合物的MS分析显示有关每个抗体分子带有增加数目的美登木素生物碱分子的分离的DMx-抗体轭合物峰(图4)。相反，使用传统两步方法制备获得的轭合物的MS几乎未分辨，表明轭合物制品的不均一性，推测是由于交联或失活的马来酰亚胺连接体。因此，基于MS，使用本发明描述的方法制备的轭合物优于通过传统两步方法合成的轭合物。
通过本发明描述的方法制备的抗CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1轭合物的结合通过流式细胞术测量，使用表达抗原的COLO205细胞，并且发现类似于未轭合抗体的结合，表明轭合对抗体结合没有不利影响(图5)。通过本发明描述的方法制备的抗CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1轭合物的细胞毒性活性使用表达CanAg抗原的COLO205结肠癌细胞在体外测量(图6)。表达抗原的癌细胞以大约1000细胞/孔涂布于96孔板的含有胎牛血清的细胞培养基并暴露于各种浓度的Ab-DMx轭合物。暴露于轭合物5天后，保留在每个孔中的活细胞使用WST-8测定法(Dojindo Molecular Technologies)测量。如图6所示，使用该方法制备的抗CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1轭合物在低浓度下对表达CanAg抗原的COLO205结肠癌细胞高度有效。通过本发明描述的方法制备的抗CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1轭合物的细胞毒性特异性针对COLO205细胞，因为这可以通过添加过量的未轭合抗体来阻遏。
实施例2.对比传统连续两步方法，通过本方法使用马来酰亚胺-磺基-NHS连接体轭合抗体与DM1/DM4(图7)。
在N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中制备浓度为30-60mM的DMx硫醇和马来酰亚胺-磺基-NHS异双官能连接体的储液。连接体与DMx硫醇在含有40％v/v 200mM琥珀酸盐缓冲液，2mM EDTA，pH 5.0的DMA中混合在一起而得到1.6的DMx：连接体比率和等于15mM的DMx终浓度。混合后，使反应静置1-4h，然后小份反应混合物被稀释10倍并在302-320nm下测量吸光度以评估反应完成和马来酰亚胺的存在。(后来对小份冷冻的反应混合物进行额外的反相HPLC分析并在302nm和252nm监测吸光度以证实在反应混合物添加至抗体时，连接体马来酰亚胺完全消失和期望的连接体-DMx试剂的形成)。当通过UV确定不再存在马来酰亚胺时，将小份反应混合物添加至抗体在磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中的混合物，最终轭合条件为4mg/ml Ab，90％磷酸盐缓冲液/10％DMA，pH 7.5。允许轭合反应在室温下进行2h。使用在pH 7.5磷酸盐缓冲液中平衡的G25凝胶过滤柱或通过正切流动过滤，使Ab-DMx轭合物从过量未反应的DMx和未轭合的连接体产品纯化。轭合物在pH 7.5缓冲液中4℃下保持2天，以允许非共价连接或通过不稳定键连接至抗体的任何DMx物类解离。然后将轭合物透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，然后经0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DMx分子数目(平均)。
为了比较，使用常规两步轭合方法制备Ab-磺基-Mal-DMx轭合物。在pH 7.5磷酸盐缓冲液/5％DMA缓冲液中浓度为8mg/ml的抗体(Ab)用过量异双官能马来酰亚胺磺基-NHS连接体修饰。允许反应在20℃下进行2h，然后修饰的Ab使用G25色谱与过量的未反应连接体纯化分离。通过在280nm下UV吸光度测定纯化的Ab的回收。在修饰的Ab中连接的马来酰亚胺基团的数目使用小份修饰的抗体测定，通过添加已知量的硫醇(例如2-巯基乙醇)，所述硫醇以超过马来酰亚胺的量添加以与修饰抗体中的马来酰亚胺残基反应并然后通过Ellman测定法使用DTNB试剂分析剩余硫醇(硫醇TNB在412nm的消光系数＝14150M-1cm-1；Riddles，P.W.等，Methods Enzymol.，1983，91，49-60；Singh，R.，Bioconjugate Chem.，1994，5，348-351)。修饰的Ab与DMx的轭合以95％pH 7.5磷酸盐缓冲液/5％DMA(v/v)中抗体浓度为2.5mg/ml下进行，抗体中每摩尔连接的马来酰亚胺添加1.7摩尔当量的DMx硫醇。反应在18℃进行8-24h，轭合物通过使用G25尺寸排阻色谱与过量未反应的DMx分离。纯化后，轭合物在pH 7.5缓冲液中4℃保持2天以允许非共价连接或通过不稳定键连接至抗体的任何DMx物类解离。然后轭合物被透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，然后通过0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DMx分子数目。
使用具有4-12％Bis Tris Gel和NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液的NuPage电泳系统(Invitrogen)，使用轭合物和抗体样品(10μg/泳道)进行还原SDS PAGE(图8)。凝胶上分子量为75、125和150kDa的条带指示链间交联物类(分别是HL、H2L和H2L2)。Ab-磺基-Mal-DM1轭合物与～4 DM1/Ab(分别为通过本方法的泳道3和通过传统两步轭合方法的泳道2)和～6 DM1/Ab(分别为通过本方法的泳道5和通过传统两步轭合方法的泳道4)的比较清楚显示，通过本发明描述的方法制备的轭合物(泳道3和5)与通过传统两步方法制备的轭合物(泳道2和4)相比具有小得多比例的高分子量交联物类。
通过本发明描述的方法制备的抗体-磺基-Mal-DM1轭合物的蛋白LabChip电泳分析(在还原条件下)显示百分比为70％和28％(总蛋白)的重链和轻链主要条带，分别类似于未轭合抗体的70％和30％(图9)。相反，使用传统两步方法制备的轭合物显示分别仅53％和23％的重链和轻链条带，并且范围99-152 kDa的较高分子量的主要条带推测是由于链间交联。基于定量蛋白LabChip分析，通过本申请描述的方法制备的轭合物在缺少链间交联方面高度优于使用传统两步方法制备的轭合物(图9)。
通过尺寸排阻LC/MS分析比较通过本发明描述的方法和通过传统两步方法制备的具有相似药物载荷的Ab-磺基-mal-DM1轭合物(图10)。通过本发明描述的方法制备的轭合物显示仅含有质量等于Ab-(连接体-DMx)n的预期峰分布的预期MS谱。在使用传统两步方法制备的轭合物的情况下，谱中主要峰除了预期的Ab-(连接体-DMx)n部分，都含有一个或多个水解或交联的连接体片段。传统两步反应顺序中链间交联或马来酰亚胺水性失活的推测机制示于图17，由此通过抗体与异双官能连接体的初始反应而加入的马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)残基可以与分子内(或分子间)组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基反应，导致链间交联，或者初始加入的马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)残基可以被失活(例如通过水解马来酰亚胺环裂解或通过水性添加至马来酰亚胺)并因此对于与含硫醇的效应基团或报道基团的快速反应不可用。因此，LC-MS分析清楚显示，本发明描述的方法有利于产生均一轭合物，具有很少或没有与抗体连接的水解或交联的连接体片段。
通过本发明描述的方法制备的抗CanAg Ab-磺基-Mal-DM1(每个抗体分子负载5.6个美登木素生物碱(平均))的结合使用表达抗原的COLO205细胞通过流式细胞术来测量，并且发现类似于未轭合抗体的结合，表明轭合不影响抗体与靶抗原的结合(图11)。通过本发明描述的方法制备的抗CanAg Ab-磺基-Mal-DM1轭合物的细胞毒性活性使用表达CanAg抗原的COLO205结肠癌细胞在体外测量(图12)。表达抗原的癌细胞以大约1000细胞/孔涂布于96孔板的含有胎牛血清的细胞培养基并暴露于各种浓度的Ab-DMx轭合物。暴露于轭合物5天后，保留的活细胞使用WST-8测定法(Dojindo MolecularTechnologies)测量。如图12所示，使用该方法制备的抗抗CanAg Ab-磺基-Mal-DM1轭合物在低浓度下对表达CanAg抗原的COLO205结肠癌细胞高度有效。该轭合物的细胞毒性是特异性的，因为这可以用过量未轭合的抗体的竞争来阻遏。
使用本发明描述方法轭合的可选方法包括在初始DMx和异双官能连接体反应完成之后(在反应混合物添加至抗体之前)使用马来酰亚胺或卤代乙酰胺试剂(例如4-马来酰亚胺丁酸或3-马来酰亚胺丙酸或N-乙基马来酰亚胺或碘乙酰胺或碘乙酸)的猝灭步骤以猝灭过量DMx硫醇基，以防止DMx硫醇与抗体的任何不期望的反应。在具体实施例中，在初始DMx和异双官能连接体反应完成之后(在反应混合物添加至抗体之前)，添加4-马来酰亚胺丁酸以猝灭过量DMx硫醇基，以防止轭合反应期间DMx硫醇与抗体的任何不期望的反应。向含有过量DM4(3mM)的DM4和磺基-Mal-NHS异双官能试剂的反应混合物，在预期的DM4硫醇偶联至异双官能试剂的马来酰亚胺基团完成时，在室温下向反应混合物添加两倍摩尔过量的4-马来酰亚胺丁酸(6mM)持续20分钟以猝灭从最初偶联反应剩余的DM4。无需纯化反应混合物，小份与抗体的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的溶液混合，最终轭合条件为4mg/ml Ab，90％水性磷酸盐缓冲液/10％DMA，pH 7.5。允许轭合反应在室温下进行2h。使用在pH 7.5磷酸盐缓冲液中平衡的G25凝胶过滤柱使抗体-DM4轭合物从过量的小分子DM4和连接体反应物纯化。轭合物在pH 7.5缓冲液中4℃下进一步保持2天，以允许非共价连接或通过不稳定键连接至抗体的任何DMx物类解离。然后将轭合物透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，并经0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DM4分子平均数目。使用具有4-12％Bis Tris Gel的NuPage电泳系统(Invitrogen)，通过非还原SDS PAGE分析轭合物样品。热变性样品以10μg/泳道加载。使用本发明描述的方法制备的轭合物(未猝灭)的非还原SDS-PAGE显示轻链条带(～25kDa)和半抗体条带(重链-轻链；～75kDa)的证据(图18)。另一方面，使用本发明描述的方法制备的、用4-马来酰亚胺丁酸处理(以加帽过量DMx硫醇)的轭合物具有显著更低量的这些不期望的条带(以相当于未修饰的抗体样品的水平)。通过硫醇猝灭剂例如4-马来酰亚胺丁酸猝灭初始DMx和异双官能反应混合物(在与抗体轭合之前)的另一优点在于在抗体轭合反应期间没有"游离的"DMx(DM1或DM4)物类，并且因此纯化后的最终轭合物不含有"游离的"或未轭合的DMx物类。DMx与4-马来酰亚胺丁酸(或其他极性硫醇猝灭试剂)的加合物比DMx更溶于水，并且因此可以更容易与共价连接的抗体-DMx轭合物分离。
实施例3.使用磺基-NHS-SMCC连接体轭合抗体与美登木素生物碱(DM1/DM4)(图13)
在DMA中制备浓度为30-60mM的DM1或DM4硫醇(DMx)和具有磺基-NHS基团的磺基-SMCC异双官能连接体(购自PierceEndogen；图13)的储液。连接体与DM1或DMx硫醇在含有40％v/v200mM水性琥珀酸盐缓冲液，2mM EDTA，pH 5.0的DMA中混合在一起而得到1.6：1的DM1或DM4(DMx)：连接体比率和6mM的DMx终浓度。混合后，使反应在室温静置1-4h，然后小份反应混合物被稀释10倍以在302-320nm下测量吸光度以评估是否所有的马来酰亚胺已经反应。(后来对小份冷冻的反应混合物进行额外的反相HPLC分析并在302nm和252nm监测以证实在反应混合物添加至抗体时，连接体马来酰亚胺完全消失和期望的磺基-NHS-连接体-Mal-DMx试剂的形成)。当通过UV确定不再存在马来酰亚胺时，将小份反应添加至抗体在磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中的水溶液，最终轭合条件为4mg/ml Ab，90％磷酸盐缓冲液(水性)/10％DMA(v/v)，pH 7.5。允许轭合反应在室温下进行2h。使用在pH 7.5磷酸盐缓冲液(水性)中平衡的G25凝胶过滤柱，使Ab-DMx轭合物从过量未反应的试剂和过量DMx纯化。轭合物在pH 7.5缓冲液中4℃下保持2天，以允许非共价连接或通过不稳定键连接至Ab的任何DMx物类解离。然后将轭合物透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，然后经0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DMx分子数目。
为了比较，使用常规两步轭合方法制备Ab-SMCC-DMx轭合物。在95％pH 6.5磷酸盐缓冲液/5％DMA缓冲液中浓度为8mg/ml的抗体(Ab)用过量的具有磺基-NHS基团的磺基-SMCC连接体(购自PierceEndogen)修饰。允许反应在25℃下进行2h，然后修饰的Ab使用G25色谱与过量的未反应连接体纯化分离。通过在280nm下UV吸光度测定纯化的Ab的回收。在修饰的Ab中连接的马来酰亚胺基团的数目使用小份修饰的抗体测定，通过添加已知量的硫醇(例如2-巯基乙醇)，所述硫醇以超过马来酰亚胺的量添加以与修饰抗体中的马来酰亚胺残基反应并然后通过Ellman测定法使用DTNB试剂分析剩余硫醇(硫醇TNB在412nm的消光系数＝14150M-1cm-1；Riddles，P.W.等，Methods Enzymol.，1983，91，49-60；Singh，R.，Bioconjugate Chem.，1994，5，348-351)。修饰的Ab与DM1或DM4的轭合以在95％pH6.5磷酸盐缓冲液/5％DMA(v/v)中抗体浓度为2.5mg/ml下进行，Ab中每摩尔连接的马来酰亚胺添加1.7摩尔当量的DM1或DM4硫醇。反应在18℃进行8-24h，轭合物通过G25色谱与过量未反应的DM1(或DM4)分离。纯化后，轭合物在pH 6.5缓冲液中4℃保持2天以允许任何弱连接的DM1/DM4物类水解。然后轭合物被透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，然后通过0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DM1/DM4和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DM1/DM4分子数目。
使用具有4-12％Bis Tris Mini Gel和NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液的NuPage电泳系统(Invitrogen)对轭合物和抗体样品(10μg/泳道)进行还原SDS PAGE(图14)。凝胶上分子量为75、125和150kDa的条带指示链间交联物类(分别是HL、H2L和H2L2)。Ab-SMCC-DM1轭合物与3.1 D/Ab(分别为通过本方法的泳道4和通过传统两步方法的泳道3)的比较清楚显示，通过本发明描述的方法制备的轭合物(泳道4)与通过传统两步方法制备的轭合物(泳道3)相比具有少得多的高分子量交联物类。
通过本发明描述的方法制备的抗体-SMCC-DM1轭合物的蛋白LabChip电泳分析(在还原条件下)显示百分比为67％和30％(总蛋白)的重链和轻链主要条带，分别类似于未轭合抗体的68％和30％(图15)。相反，使用传统两步方法制备的轭合物显示分别仅54％和24％的重链和轻链条带，并且范围96-148kDa的较高分子量的主要条带推测是由于链间交联。基于定量蛋白LabChip分析，通过本申请描述的方法制备的轭合物在缺少链间交联方面高度优于使用传统两步方法制备的轭合物(图15)。
通过尺寸排阻LC/MS分析比较通过本发明描述的方法和通过传统两步方法制备的具有相似药物载荷的Ab-SMCC-DM1轭合物(图16)。通过本发明描述的方法制备的轭合物显示仅含有质量等于Ab-(连接体-DMx)n的预期峰分布的预期MS谱。在使用传统两步方法制备的轭合物的情况下，谱显示异质物类混合物，包括预期的Ab-(连接体-DMx)n物类和含有失活的马来酰亚胺和交联连接体片段的其他物类。传统两步反应顺序中链间交联或马来酰亚胺失活的推测机制示于图17，由此通过抗体与异双官能连接体的初始反应而加入的马来酰亚胺(或卤代乙酰胺残基)可以与分子内(或分子间)组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基反应，导致链间交联，或者初始加入的马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)残基可以在与含硫醇的DM1或DM4(DMx)物质反应步骤之前通过水解或水合马来酰亚胺残基而失活。因此，LC-MS分析清楚显示，本发明描述的方法有利于产生均一轭合物，具有很少或没有与抗体连接的失活的马来酰亚胺或交联的连接体片段。
实施例4.通过本方法使用可裂解的二硫化物连接体轭合抗体与DM1/DM4(DMx)(图19)。
在DMA中制备浓度为30-60mM的DM1或DM4硫醇(DMx)和异双官能连接体4-(2-吡啶基二硫基)丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)的储液。连接体与DMx硫醇在含有多达40％v/v 200mM水性琥珀酸盐缓冲液，2mM EDTA，pH 5.0的DMA中混合在一起而得到1.6：1的DM1或DM4(DMx)：连接体比率和8mM的DMx终浓度。混合后，使反应在室温静置1h，然后小份反应添加至抗体在磷酸缓冲液(pH 7.5)中的水溶液，最终轭合条件为4mg/ml Ab，90％磷酸盐缓冲液(水性)/10％DMA，pH 7.5。允许轭合反应在室温下进行2h。使用在pH 7.5磷酸盐缓冲液(水性)中平衡的G25凝胶过滤柱，使Ab-DMx轭合物从过量未反应的试剂和过量DMx纯化。轭合物在pH7.5缓冲液中4℃下保持2天，以允许非共价连接或通过不稳定键连接至Ab的任何DMx物类解离。然后将轭合物透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，然后经0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DMx分子数目。
实施例5.通过本方法使用二硫化物连接体和不可裂解连接体制备抗体-DM1/DM4(Ab-DMx)轭合物(图20)。
在N,N-二甲基乙酰胺(DMA)中制备浓度为30-80mM的DM1或DM4硫醇(DMx)和NHS-PEGn-马来酰亚胺异双官能连接体的储液。NHS-PEG4-马来酰亚胺连接体和DMx硫醇在含有40％v/v 200mM琥珀酸盐缓冲液，2mM EDTA，pH 5.0的DMA中混合在一起而得到1.6：1的DMx：连接体摩尔比和等于8.0mM的DMx终浓度。使反应混合物在室温继续反应2h。在单独的平行反应中，SPDB连接体和DMx硫醇混合在一起并以相似方式反应至用于NHS-PEG4-马来酰亚胺反应的条件持续1h的反应时间。在反应完成之后不纯化，合并等体积的PEG4-Mal-DM4混合物和SPDB-DM4混合物。将未纯化的小份合并的反应混合物添加至抗体在磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中的溶液，最终轭合条件为4mg/ml Ab，90％磷酸盐缓冲液(水性)/10％DMA(v/v)，pH 7.5。允许轭合反应在室温下进行2h。使用在pH 7.5磷酸盐缓冲液(水性)中平衡的G25凝胶过滤柱，使Ab-DMx轭合物从过量未反应的试剂和过量DMx纯化。轭合物在pH 7.5缓冲液中4℃下保持2天，以允许非共价连接或通过不稳定键连接至Ab的DMx物类解离。然后将轭合物透析过夜进入pH 5.5组氨酸/甘氨酸缓冲液，然后经0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DMx分子数目。
通过比较DTT(二硫苏糖醇)处理轭合物以还原二硫键之前和之后的DMx/抗体(D/A)比率，对通过本发明描述的方法制备的Ab-(混合的SPDB和PEG4-Mal连接体)-DMx轭合物测试以测定Ab中可裂解与不可裂解连接体的加入百分比。为了维持DTT还原期间的pH为7.5，轭合物首先被透析进入250mM HEPES缓冲液pH 7.5。然后通过在37℃下与25mM DTT反应20min来还原轭合物。在DTT反应之后，使用在250mM HEPES缓冲液pH 7.5中平衡的G25凝胶过滤柱从反应混合物分离释放的DMx和DTT。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DMx和抗体的已知消光系数来测量纯化产物中每个Ab分子的DMx分子平均数目。DTT处理的轭合物的D/A与非DTT处理的轭合物的D/A之间的比率用于计算通过不可裂解键连接至Ab的DMx的百分比。两个其他样品Ab-SPDB-DM4和Ab-PEG4-Mal-DM4轭合物用DTT处理，分别作为阳性对照和阴性对照。通过比较DTT处理之前和之后的D/A比率，对照不可裂解的Ab-PEG4-Mal-DM4轭合物显示，发现几乎所有结合的连接体如预期是不可裂解的(93％)。通过本发明描述的方法制备的含有不可裂解的连接体和二硫化物连接体的Ab-(混合的SPDB和PEG4Mal连接体)-DMx轭合物相对于完全由可裂解连接体组成的Ab-SPDB-DMx轭合物的DMx损失量具有少41％的通过DTT处理裂解的DMx。这说明，通过本发明描述的方法制备的Ab-(混合的SPDB和PEG4-Mal)-DMx轭合物由大约40％不可裂解的连接体和60％可裂解的连接体构成。通过改变不可裂解的连接体试剂和可裂解的连接体试剂的初始比率，抗体与美登木素生物碱或其他效应物的轭合物可以用不同比率的不可裂解的连接体和可裂解的连接体制备。图21显示了上述脱糖基轭合物的质谱，其包括具有通过二硫化物连接体(SPDB)和不可裂解的连接体(PEG)二者连接的每个抗体分子平均3.5个美登木素生物碱分子的抗体。MS显示带有可裂解和不可裂解连接体的单独轭合物物类(图21)。例如，称为D2-PEG-SPDB的轭合物峰带有一个二硫化物连接的美登木素生物碱分子和一个不可裂解的硫醚连接的美登木素生物碱分子；称为D3-PEG-2SPDB的轭合物峰带有两个二硫化物连接的美登木素生物碱分子和一个不可裂解的硫醚连接的美登木素生物碱分子；称为D3-2PEG-SPDB的轭合物峰带有一个二硫化物连接的美登木素生物碱分子和两个不可裂解的硫醚连接的美登木素生物碱分子。
实施例6.使用SMCC连接体轭合抗体与美登木素生物碱(图22)。
在DMA中制备浓度为30-60mM的DM1硫醇和SMCC异双官能连接体(Pierce)的储液。连接体和DM1硫醇在含有多达50％v/v 200mM水性琥珀酸盐缓冲液，2mM EDTA，pH 5.0的DMA中混合在一起而得到1.4：1摩尔当量的DM1：连接体比率和等于1至6mM的DM1终浓度。混合后，使反应在室温静置4h，然后小份反应混合物被稀释10倍以在302-320nm下测量吸光度以评估是否所有的马来酰亚胺已经与硫醇反应。当通过UV确定不再存在马来酰亚胺时，将小份反应添加至抗体在磷酸盐缓冲液(pH 7.5-8.5)中的水溶液，最终轭合条件为2.5mg/ml Ab，70-80％磷酸盐缓冲液(水性)/30-20％DMA(v/v)。允许轭合反应在室温下进行3h。使用在pH 7.4磷酸盐缓冲液(水性)中平衡的G25凝胶过滤柱，使Ab-DM1轭合物从过量未反应或水解的试剂和过量DM1纯化。然后将轭合物透析过夜进入pH 7.4磷酸盐缓冲液(水性)并然后经0.22μm滤器过滤以最终储存。通过测定轭合物在252和280nm下的吸光度并使用在这两个波长下DM1和抗体的已知消光系数来测量最终轭合物中每个Ab分子的DM1分子数目。类似地，可以制备抗体与DM4硫醇和SMCC的轭合物。使用SMCC连接体的抗体与DM1或DM4的这些轭合物含有硫醚不可裂解的连接体。
通过本发明描述的方法制备的Ab-SMCC-DM1轭合物通过脱糖基化轭合物的MS分析来鉴定(图23)。通过本发明描述的方法制备的轭合物显示含有质量等于Ab-(连接体-DM1)n的预期峰分布的预期MS谱。
实施例7.使用含有异双官能二硫化物的连接体(SSNPB，SPP)轭合抗体与美登木素生物碱。
通过类似于针对实施例4中SPDB连接体描述的方法类似的方法，含有异双官能连接体SSNPB(N-硫代琥珀酰亚胺基-4-(5-硝基-2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和SPP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)的二硫化物可用于制备二硫化物连接的抗体-美登木素生物碱轭合物。使用SPDB(图19)制备的二硫化物连接的轭合物的结构与用SSNPB(图24)制备的轭合物的结构相同。使用SPDB制备的二硫化物连接的轭合物的MS显示质量值对应于连接至抗体的美登木素生物碱分子的不同数目的离散峰。
实施例8.抗体与含有具有线性烷基碳链的不可裂解的连接体的美登木素生物碱的轭合。
类似于实施例6中针对SMCC连接体描述的方法，使用美登木素生物碱和具有线性烷基碳链的异双官能连接体的反应混合物制备含有具有线性烷基碳链的不可裂解连接体的轭合物。例如，如图26所示，人源化抗体与DM1的轭合物使用BMPS(N-[β-马来酰亚胺基丙氧基琥珀酰亚胺酯)或GMBS((N-[γ-马来酰亚胺基丁氧基]琥珀酰亚胺酯)连接体制备。在60％DMA/40％(v/v)200mM琥珀酸盐缓冲液，pH5中含有BMPS或GMBS(8mM)和DM1硫醇(10.4mM)的初始反应混合物显示当在15分钟检测时马来酰亚胺部分完全反应(基于在302-320nm下马来酰亚胺吸光度的衰退)。以30分钟间隔分两部分将反应混合物添加至80％EPPS水性缓冲液，pH 8.1中2.5mg/ml的人源化抗体溶液，该溶液含有20％DMA(v/v)，总连接体以与抗体8摩尔当量添加。轭合物混合物在4h后凝胶过滤并经受2轮透析。DM1/抗体比率为3.8和5.1的轭合物以71-75％回收和高单体％(96.2-97.6％)制备。用GMBS或BMPS制备的这些轭合物通过HISEP HPLC分析显示没有未轭合的游离药物。如图25所示，含有具有线性烷基链的不可裂解连接体的类似轭合物可以使用AMAS(N-[β-马来酰亚胺基乙酰氧基]琥珀酰亚胺酯)或EMCS(N-[β-马来酰亚胺基己酰氧基]琥珀酰亚胺酯)或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS，磺基-EMCS)制备。表1显示了通过本发明描述方法制备的选定轭合物的单体％，通过尺寸排阻色谱分析全部显示高单体％。为了比较，还显示了通过传统两步轭合方法(通过抗体与异双官能连接体初始反应，随后与美登素类硫醇反应)制备的轭合物的单体％。
表1.通过本申请描述的方法与通过传统两步轭合方法制备的选定轭合物的单体％。
轭合物 D/A 轭合方法 ％单体
Ab-PEG4-Mal-DM1 6.6 本发明 99.0
Ab-PEG4-Mal-DM1 6.8 两步 98.0
Ab-磺基-Mal-DM1 3.6 本发明 99.0
Ab-磺基-Mal-DM1 4.0 两步 96.7
Ab-SMCC-DM1 4.0 本发明 98.6
Ab-SMCC-DM1 3.8 两步 97.0
Ab-PEG4-Mal-DM4 6.2 本发明 96.9
Ab-PEG4-Mal-DM4 6.1 两步 84.5
Ab-SPDB-DM4 4.1 本发明 99.4
Ab-SPDB-DM4 3.9 两步，一罐 95.7

Claims (10)

1.一种在溶液中制备纯化的轭合物的方法，其中所述轭合物包括与细胞结合剂连接的效应分子或报道分子，所述方法包括以下步骤：(a)使所述效应分子或报道分子与双官能连接体试剂接触以共价连接所述连接体与所述效应分子或报道分子并由此制备包含具有与之连接的连接体的所述效应分子或报道分子的未纯化的第一混合物，(b)通过所述未纯化的第一混合物与细胞结合剂反应而使所述细胞结合剂与具有与之连接的连接体的所述效应分子或报道分子轭合以制备第二混合物，和(c)使所述第二混合物经受正切流动过滤、透析、凝胶过滤、吸附色谱、选择性沉淀或其组合以由此制备纯化的轭合物。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)在pH约4至约9的溶液中进行。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的第二混合物基本上不含由于分子内或分子间反应而生成的不期望的交联的、水解的物类。
4.权利要求1所述的方法，其中所述效应分子是细胞毒性剂。
5.权利要求4所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱、紫杉烷、CC1065或其类似物。
6.权利要求4所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱。
7.权利要求6所述的方法，其中所述美登木素生物碱包含硫醇基。
8.权利要求6所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM1。
9.权利要求6所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
10.权利要求1所述的方法，其中所述细胞结合剂是干扰素、白介素2(IL-2)、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、胰岛素、EGF、TGF-α、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、GM-CSF、运铁蛋白或抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021143573A1 (zh) * 2020-01-15 2021-07-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
RS52470B (en) 2005-08-24 2013-02-28 Immunogen Inc. PROCEDURE FOR PREPARATION OF PURE CONJUGATED MEDICINES
UY32560A (es) * 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
SG10201810743WA (en) 2009-06-03 2018-12-28 Immunogen Inc Conjugation methods
WO2012066581A1 (en) * 2010-11-19 2012-05-24 Venus Remedies Limited Novel conjugates for targeted drug delivery
EA201991268A3 (ru) 2011-03-29 2020-01-31 Иммуноджен, Инк. Получение конъюгатов "майтансиноид-антитело" одностадийным способом
SG195172A1 (en) 2011-06-21 2013-12-30 Immunogen Inc Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
GB2508782A (en) * 2011-08-31 2014-06-11 Nikolai Vladimirovich Bovin Facile laboratory method for localising biomolecules to the surface of cells and viruses
WO2013090590A1 (en) * 2011-12-13 2013-06-20 Immunogen, Inc. Use of n-hydroxysuccinimide to improve conjugate stability
CA2884873C (en) 2012-09-26 2021-11-23 Immunogen, Inc. Improved methods for the acylation of maytansinol
WO2014055893A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of an ion exchange membrane to remove impurities from cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014055842A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
NZ707091A (en) 2012-10-04 2018-12-21 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014082080A2 (en) * 2012-11-26 2014-05-30 Callidus Biopharma, Inc. Methods for coupling targeting peptides onto recombinant lysosomal enzymes for improved treatments of lysosomal storage diseases
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
JP6423804B2 (ja) 2013-02-28 2018-11-14 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤及び細胞毒性剤を含む複合体
WO2014134483A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CA2903772A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CA2910945A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
CN104232576B (zh) 2013-06-14 2018-07-17 加思葆（北京）医药科技有限公司 蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
WO2015073721A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting egfr and/or her2 and uses thereof
CA2931356A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
RU2685728C2 (ru) * 2014-01-29 2019-04-23 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Конъюгат лиганд - цитотоксическое лекарственное средство, способ его получения и его применения
US10973920B2 (en) 2014-06-30 2021-04-13 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
US10238748B2 (en) 2014-08-12 2019-03-26 Novartis Ag Anti-CDH6 antibody drug conjugates
GB201416960D0 (en) * 2014-09-25 2014-11-12 Antikor Biopharma Ltd Biological materials and uses thereof
GB201419184D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
RU2711930C2 (ru) * 2014-11-19 2020-01-23 Иммуноджен, Инк. Способ получения конъюгатов агента, связывающегося с клетками, и цитотоксического агента
SG11201704487XA (en) 2014-12-04 2017-06-29 Celgene Corp Biomolecule conjugates
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
US10449258B2 (en) * 2015-06-09 2019-10-22 Xdcexplorer (Shanghai) Co., Ltd. Antibody drug conjugate, intermediate, preparation method, pharmaceutical composition and uses thereof
US20190194315A1 (en) 2015-06-17 2019-06-27 Novartis Ag Antibody drug conjugates
RU2018116846A (ru) 2015-10-08 2019-11-08 Займворкс Инк. Антигенсвязывающие полипептидные конструкции, содержащие легкие цепи каппа и лямбда, и их применения
CN106606784B (zh) * 2015-10-19 2020-01-21 泰州迈博太科药业有限公司 一种靶向表达egfr肿瘤细胞的前抗体偶联药物及其应用
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
MX2019004690A (es) 2016-10-19 2019-09-27 Invenra Inc Constructos de anticuerpos.
RU2644280C1 (ru) * 2016-12-12 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Способ получения противоопухолевого коньюгата на основе человеческого сывороточного альбумина, содержащего терапевтические и контрастирующий агенты
JP2020506716A (ja) 2016-12-22 2020-03-05 ウニヴェルシタ・デリ・ストゥディ・マニャ・グレチア・カタンツァーロ Ｃｄ４３の固有のシアログリコシル化がん関連エピトープを標的化するモノクローナル抗体
TWI783957B (zh) 2016-12-23 2022-11-21 美商伊繆諾金公司 靶向adam9之免疫共軛物及其使用方法
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
CA3064966A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Zymeworks Inc. Stabilized chimeric fabs
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
KR20200108843A (ko) 2018-01-12 2020-09-21 이뮤노젠 아이엔씨 항체 약물 접합, 정제, 및 제제화 방법
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
CA3102349A1 (en) 2018-06-05 2019-12-12 King's College London Btnl3/8 targeting constructs for delivery of payloads to the gastrointestinal system
WO2020022363A1 (ja) 2018-07-25 2020-01-30 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの効果的な製造方法
SG11202110249SA (en) * 2019-03-18 2021-10-28 Univ Columbia Non-hydrolyzable, non-cleavable, stable linkers for precision therapeutics and uses thereof
WO2020205465A1 (en) * 2019-03-29 2020-10-08 Purdue Research Foundation Ph-dependent composition matters useful for study and diagnosis of alzheimer's disease
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
CN114341162A (zh) 2019-07-10 2022-04-12 赛博克萨2公司 作为治疗剂的细胞毒素的肽缀合物
KR20220051332A (ko) 2019-07-10 2022-04-26 싸이브렉사 3, 인크. 치료제로서의 미세소관 표적화제의 펩티드 접합체
WO2021031930A1 (zh) * 2019-08-19 2021-02-25 沈阳药科大学 抗体的突变体及其应用
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
US11878986B2 (en) 2020-06-22 2024-01-23 National Health Research Institutes Poly heterocyclic conjugates and their pharmaceutical uses
CN117279664A (zh) 2021-04-10 2023-12-22 普方生物制药美国公司 Folr1结合剂、其偶联物及其使用方法
EP4326768A1 (en) 2021-04-23 2024-02-28 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
WO2023092099A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1665532A (zh) * 2002-05-02 2005-09-07 惠氏控股公司 加利车霉素衍生物－载体缀合物
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
CN101186613A (zh) * 2003-05-20 2008-05-28 伊缪诺金公司 含有新的美登素类的改进的细胞毒剂
CN101267841A (zh) * 2005-08-24 2008-09-17 免疫原公司 制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法

Family Cites Families (186)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4166105A (en) 1973-07-30 1979-08-28 Block Engineering, Inc. Dye tagged reagent
SE430062B (sv) 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4152411A (en) 1977-07-27 1979-05-01 Akzona Incorporated High specific activity labeled substances
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4664911A (en) 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
DE3587294T2 (de) 1985-01-22 1993-09-30 Saint Gobain Vitrage Verfahren zur Herstellung einer dünnen Metalloxidbeschichtung auf einem Substrat, insbesondere Glas und deren Verwendung als Verglasung.
US5223242A (en) 1985-11-05 1993-06-29 The General Hospital Corporation Negatively charged specific affinity reagents
GB8600582D0 (en) 1986-01-10 1986-02-19 Ca Minister Nat Defence Purifying biological materials
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0247730A3 (en) 1986-04-28 1989-04-12 Antibody Technology Limited Antibodies, their preparation and use and products containing them
US4859449A (en) * 1987-09-14 1989-08-22 Center For Molecular Medicine And Immunology Modified antibodies for enhanced hepatocyte clearance
US5241078A (en) 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
JP2818827B2 (ja) 1988-06-24 1998-10-30 サンヨーファイン株式会社 鉄補給飲料
US5024834A (en) 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5714149A (en) * 1989-02-10 1998-02-03 Celltech Therapeutics Limited Crosslinked antibodies and processes for their preparation
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
FR2656555B1 (fr) 1989-12-29 1994-10-28 Serimer Systeme mecanique de guidage automatique d'une ou plusieurs torches d'une unite de soudage a l'arc.
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2048078A1 (en) 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
SE470006B (sv) 1991-09-26 1993-10-25 Corline Systems Ab Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5501952A (en) 1992-07-17 1996-03-26 Aprogenex, Inc. Analogues of reporter groups as background reducers in hybridization assays
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
AU5908296A (en) 1995-05-31 1996-12-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for targeted delivery of effector m olecules
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US6340461B1 (en) * 1996-12-17 2002-01-22 David Stephen Terman Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6462070B1 (en) 1997-03-06 2002-10-08 The General Hospital Corporation Photosensitizer conjugates for pathogen targeting
US6371975B2 (en) 1998-11-06 2002-04-16 Neomend, Inc. Compositions, systems, and methods for creating in situ, chemically cross-linked, mechanical barriers
PT1012280E (pt) 1997-06-11 2005-02-28 Borean Pharma As Modulo de trimerizacao
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5958677A (en) 1997-07-28 1999-09-28 The New York Blood Center, Inc. Method for purifying viral nucleic acids
JP2002501721A (ja) 1997-08-01 2002-01-22 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト 多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定するための新規方法およびファージ
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
EP1027061B1 (en) 1997-10-03 2005-05-25 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Imine-forming polysaccharides, preparation thereof and the use thereof as adjuvants and immunostimulants
US6121236A (en) 1998-03-24 2000-09-19 The Children's Medical Center Corporation Multivalent ligands which modulate angiogenesis
WO1999055715A2 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
US5981564A (en) 1998-07-01 1999-11-09 Universite Laval Water-soluble derivatives of paclitaxel, method for producing same and uses thereof
US7067109B1 (en) 1998-07-13 2006-06-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment kits comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
AU757510C (en) 1998-08-27 2003-09-11 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines
AUPQ014799A0 (en) 1999-05-04 1999-05-27 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
DK1242401T3 (da) 1999-11-24 2007-05-07 Immunogen Inc Cytotoksiske midler, der omfatter taxaner, og den terapeutiske anvendelse deraf
DK1242438T3 (da) 1999-12-29 2007-02-12 Immunogen Inc Cytotoksiske midler omfattende modificerede doxorubiciner og daunorubiciner og deres terapeutiske anvendelse
CA2398136A1 (en) 2000-02-08 2001-08-16 The Penn State Research Foundation Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US6632979B2 (en) * 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
IL157142A0 (en) 2001-01-29 2004-02-08 Idec Pharma Corp Modified antibodies and methods of use
WO2002098885A1 (en) 2001-02-07 2002-12-12 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified psma ligands and uses related thereto
EP1610751A4 (en) * 2001-04-26 2006-05-24 Univ Texas AGENTE / LIGAND CONJUGATED THERAPEUTIC COMPOSITIONS, METHODS OF SYNTHESIS AND USE THEREOF
CA2446806A1 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cd26 monoclonal antibodies as therapy for diseases associated with cells expressing cd26
EP1258255A1 (en) 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
JP4619651B2 (ja) 2001-06-01 2011-01-26 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 前立腺特異的膜抗原に対する修飾抗体およびその使用
US6576802B2 (en) 2001-06-04 2003-06-10 Shell Oil Company One-step production of 1, 3-propanediol from ethylene oxide and syngas with a catalyst with a phospholanoalkane ligand
EP1455817B1 (en) 2001-12-11 2008-12-31 Merck & Co., Inc. Staphylococcus aureus exopolysaccharide and process
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
US20050031627A1 (en) 2002-01-03 2005-02-10 Mazzola Gregory J Methods for preparing immunoconjugates
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US6660856B2 (en) 2002-03-08 2003-12-09 Kaohsiung Medical University Synthesis of pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine analogues
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US20060234226A1 (en) 2002-04-26 2006-10-19 Fahner Robert L Non-affinity purification of proteins
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
JP2005530845A (ja) 2002-06-21 2005-10-13 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション 抗体を濃縮するための緩衝化処方物およびその使用方法
ES2544527T3 (es) 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
US6913748B2 (en) 2002-08-16 2005-07-05 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
AU2003273413A1 (en) 2002-10-08 2004-05-04 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DK3299463T3 (da) 2002-10-30 2020-12-07 Nuevolution As Enzymatisk kodning
HUE026914T2 (en) 2002-11-07 2016-08-29 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and a method of treating acute myeloid leukemia
ATE421967T1 (de) 2003-03-31 2009-02-15 Council Scient Ind Res Nichtvernetzende pyrroloä2,1-cüä1, 4übenzodiazepine als potentielle antitumor- agentien und ihre herstellung
EP2664672A1 (en) 2003-04-17 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US8088387B2 (en) * 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
KR101424624B1 (ko) 2003-05-14 2014-07-31 이뮤노젠 아이엔씨 약물 콘쥬게이트 조성물
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US7595306B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Method of treating neurodegenerative disease
DK3604537T3 (da) 2003-06-13 2022-02-28 Alnylam Europe Ag Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme
EP3037105B1 (en) 2003-06-27 2021-03-17 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
US20050074425A1 (en) 2003-07-02 2005-04-07 Polycord, Inc. Method for delivering polymerized therapeutic agent compositions and compositions thereof
CA2542886A1 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Neelima M. Bhat Enhanced b cell cytotoxicity of cdim binding antibody
WO2005058367A2 (en) 2003-12-16 2005-06-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Pegylated small molecules
US20050175619A1 (en) 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
US20110064754A1 (en) 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
EP1610818A4 (en) 2004-03-03 2007-09-19 Millennium Pharm Inc MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF
US7189710B2 (en) 2004-03-30 2007-03-13 Council Of Scientific And Industrial Research C2-fluoro pyrrolo [2,1−c][1,4]benzodiazepine dimers
US6951853B1 (en) 2004-03-30 2005-10-04 Council Of Scientific And Industrial Research Process for preparing pyrrolo[2, 1-c] [1,4] benzodiazepine hybrids
JP2008505853A (ja) 2004-04-13 2008-02-28 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 細胞傷害性薬剤としての非天然のリボヌクレアーゼ複合体
CA2562685C (en) 2004-04-27 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
US7674778B2 (en) 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
US20060073528A1 (en) 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
US7691962B2 (en) * 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
NZ550934A (en) 2004-05-19 2010-05-28 Medarex Inc Chemical linkers and conjugates thereof
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
EP1789553B1 (en) 2004-06-30 2014-03-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
WO2006093526A2 (en) 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
JP4193771B2 (ja) 2004-07-27 2008-12-10 セイコーエプソン株式会社 階調電圧発生回路及び駆動回路
AU2005330637B2 (en) 2004-08-04 2012-09-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
AU2004224925C1 (en) 2004-08-30 2011-07-21 Biotest Ag Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
GT200500283A (es) * 2004-10-08 2006-05-08 Inmunoterapia de desordenes autoinmunes
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
JP5421532B2 (ja) 2004-12-09 2014-02-19 セントカー・インコーポレーテツド 抗インテグリン免疫コンジュゲート、方法および使用
US7408030B2 (en) 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
CA2597407C (en) 2005-02-11 2013-09-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
US20110166319A1 (en) 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
BRPI0608175A2 (pt) 2005-04-15 2009-11-10 Immunogen Inc método de eliminação de população de células heterogêneas ou mistas em tumores, assim como compostos maitansinóides
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
EP2471555A3 (en) 2005-07-15 2012-10-17 Angiochem Inc. Use of aprotinin polypeptides as carriers in pharmaceutical conjugates
EA014513B1 (ru) 2005-08-03 2010-12-30 Иммьюноджен, Инк. Композиция иммуноконъюгата
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
WO2007034495A2 (en) 2005-09-22 2007-03-29 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Dextran and arabinogalactan conjugates of therapeutically active compounds
AU2006294554B2 (en) * 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
CA2629815C (en) 2005-11-14 2014-08-12 University Of Southern California Integrin-binding small molecules
JP5102772B2 (ja) 2005-11-29 2012-12-19 ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー デミボディ：二量体化活性化治療剤
EP1996612A4 (en) 2006-03-03 2010-10-20 Univ Kingston COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
US7964415B2 (en) 2006-04-26 2011-06-21 Cardiogenics Inc. Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof
RS53168B (en) * 2006-05-30 2014-06-30 Genentech Inc. Antibodies and Immunoconjugates and Their Use
WO2007147213A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
JP5622390B2 (ja) 2006-07-18 2014-11-12 サノフイ 癌治療用対ｅｐｈａ２アンタゴニスト抗体
US20080213349A1 (en) 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
ES2435779T3 (es) 2007-07-19 2013-12-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico
US8084589B2 (en) 2007-08-31 2011-12-27 University Of Massachusetts Phosphoramidite nucleoside analogs
JP5769616B2 (ja) 2008-04-30 2015-08-26 イミュノジェン・インコーポレーテッド クロスリンカーおよびそれらの使用
RU2487877C2 (ru) * 2008-04-30 2013-07-20 Иммьюноджен, Инк. Высокоэффективные конъюгаты и гидрофильные сшивающие агенты (линкеры)
GB0811743D0 (en) 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
CN102215820A (zh) 2008-11-17 2011-10-12 安龙制药公司 用于核酸输送系统的可释放融合脂质
EP3100745B1 (en) 2009-02-05 2018-04-18 Immunogen, Inc. Novel benzodiazepine derivatives
SG10201810743WA (en) 2009-06-03 2018-12-28 Immunogen Inc Conjugation methods
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
TWI504408B (zh) 2010-02-24 2015-10-21 Immunogen Inc 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
KR20110103182A (ko) 2010-03-12 2011-09-20 삼성전자주식회사 입체 영상 표시 장치
US20120149732A1 (en) 2010-12-14 2012-06-14 Alexander Chucholowski Multifunctional linkers and methods for the use thereof
KR20140010067A (ko) 2011-02-15 2014-01-23 이뮤노젠 아이엔씨 컨쥬게이트의 제조방법
EA201991268A3 (ru) 2011-03-29 2020-01-31 Иммуноджен, Инк. Получение конъюгатов "майтансиноид-антитело" одностадийным способом
US20120259100A1 (en) 2011-03-29 2012-10-11 Immunogen, Inc. Process for manufacturing conjugates of improved homogeneity
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
KR20200039843A (ko) 2011-04-01 2020-04-16 이뮤노젠 아이엔씨 Folr1 암 치료의 효능을 증가시키기 위한 방법
US20130071482A1 (en) 2011-09-20 2013-03-21 The University Of Kentucky Research Foundation Block copolymer cross-linked nanoassemblies as modular delivery vehicles
WO2013090590A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Immunogen, Inc. Use of n-hydroxysuccinimide to improve conjugate stability
NZ707091A (en) 2012-10-04 2018-12-21 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014055893A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of an ion exchange membrane to remove impurities from cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014055842A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
ES2722924T3 (es) 2012-12-05 2019-08-20 Univ Heidelberg Ruprecht Karls Conjugados de proteínas y péptidos multivalentes de penetración celular y sus usos

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
CN1665532A (zh) * 2002-05-02 2005-09-07 惠氏控股公司 加利车霉素衍生物－载体缀合物
CN101186613A (zh) * 2003-05-20 2008-05-28 伊缪诺金公司 含有新的美登素类的改进的细胞毒剂
CN101267841A (zh) * 2005-08-24 2008-09-17 免疫原公司 制备美登木素生物碱抗体缀合物的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021143573A1 (zh) * 2020-01-15 2021-07-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用

Also Published As

Publication number Publication date
IL242589B (en) 2018-11-29
RU2595424C2 (ru) 2016-08-27
WO2010141566A1 (en) 2010-12-09
US20230105468A1 (en) 2023-04-06
PL2437790T3 (pl) 2019-09-30
US9771432B2 (en) 2017-09-26
CA2761959A1 (en) 2010-12-09
IL259869A (en) 2018-07-31
SG176068A1 (en) 2011-12-29
EP2437790B1 (en) 2019-02-20
SI2437790T1 (sl) 2019-07-31
ME03479B (me) 2020-01-20
EP2437790A4 (en) 2015-06-24
JP6114783B2 (ja) 2017-04-12
US9376500B2 (en) 2016-06-28
KR20190015590A (ko) 2019-02-13
US20190263935A1 (en) 2019-08-29
TR201907573T4 (tr) 2019-06-21
IL216583A0 (en) 2012-02-29
US11498979B2 (en) 2022-11-15
MX2011012794A (es) 2012-05-08
AU2010256659A1 (en) 2011-12-01
IL300840A (en) 2023-04-01
AU2010256659B2 (en) 2015-01-29
IL286056A (en) 2021-10-31
IL269580A (en) 2019-11-28
CN102448500A (zh) 2012-05-09
BRPI1010620A2 (pt) 2016-03-15
EP2437790A1 (en) 2012-04-11
JP2016006071A (ja) 2016-01-14
ES2726945T3 (es) 2019-10-10
KR20200090974A (ko) 2020-07-29
RU2765240C2 (ru) 2022-01-27
JP7262507B2 (ja) 2023-04-21
KR102139019B1 (ko) 2020-07-28
IL269580B (en) 2020-06-30
US20170002096A1 (en) 2017-01-05
US20110003969A1 (en) 2011-01-06
RU2016130501A3 (zh) 2020-01-29
US10815309B2 (en) 2020-10-27
EP3480202A1 (en) 2019-05-08
IL274599B (en) 2021-09-30
IL286056B1 (en) 2023-04-01
US8624003B2 (en) 2014-01-07
KR20220144827A (ko) 2022-10-27
CY1121992T1 (el) 2020-10-14
LT2437790T (lt) 2019-06-10
HRP20190898T1 (hr) 2019-08-09
JP2021113210A (ja) 2021-08-05
BRPI1010620B1 (pt) 2021-05-04
SG10201810743WA (en) 2018-12-28
JP6873184B2 (ja) 2021-05-19
JP2012528874A (ja) 2012-11-15
MX349210B (es) 2017-07-18
RS58810B1 (sr) 2019-07-31
US10233257B2 (en) 2019-03-19
KR102444399B1 (ko) 2022-09-16
US20210163625A1 (en) 2021-06-03
US20180079828A1 (en) 2018-03-22
KR20120088549A (ko) 2012-08-08
RU2011153288A (ru) 2013-07-20
US20140179906A1 (en) 2014-06-26
HUE043645T2 (hu) 2019-08-28
JP5784592B2 (ja) 2015-09-24
BRPI1010620B8 (pt) 2021-05-25
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