CN105403698A - 采用内部校正系统的诊断性试验试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用侧流测定设备和多种测定试剂来检测测试样品中的测试分析物的诊断性试验试剂盒。所述测定试剂包括能够生成指示测试样品中测试分析物的存在或数量的检测信号的检测探针。为了进一步提高检测精度，还使用了能够生成指示校正分析物的存在或数量的校正信号的校正探针。可以利用校正信号来校正检测信号。

Description

采用内部校正系统的诊断性试验试剂盒
本申请是2006年1月19日申请的PCT国际申请PCT/US2006/002252于2007年9月27日进入中国国家阶段的、申请号为200680010107.8且发明名称为“采用内部校正系统的诊断性试验试剂盒”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
测定中普遍采用了各种分析程序和设备，用以确定测试样品中可能存在的分析物是否存在和/或浓度。例如，免疫测定法利用免疫系统机制，其中为响应作为有机体病原性或外源性抗原的存在而产生了抗体。这些抗体和抗原，即免疫反应物能够彼此结合，由此引起能够用来确定生物样品中特定抗原的存在或浓度的高度特异性反应机制。
有数种公知的免疫测定法，这些方法利用由可检测的成分标记的免疫反应物，从而能够对分析物进行分析检测。例如，“夹心型”测定形式一般涉及使测试样品与检测探针混合，这些探针与对分析物具有特异性的结合成员(例如抗体)缀合，从而在分析物与缀合探针之间形成配合物。然后使这些配合物与固定在检测区内的受体材料(例如抗体)相接触。分析物/探针缀合配合物与固定的受体材料之间发生结合，从而将可检测出来以指示分析物存在的“夹心”配合物定位。这项技术可用于获得定量或半定量的结果。这些夹心型测定的一些实例在Grubb等人的U.S.4,168,146和Tom等人的U.S.4,366,241中有所描述。另一种技术是“竞争型”测定。在竞争性测定中，标记探针通常是与分析物相同或类似的分子缀合。因此，标记探针与目标分析物竞争存在的受体材料。竞争性测定法通常用于检测诸如半抗原之类的分析物，每种半抗原是单价的并且仅能够结合一个抗体分子。竞争性免疫测定设备的实例在Deutsch等人的U.S.4,235,601、Liotta的U.S.4,442,204和Buechler等人的U.S.5,208,535中有所记载。
这些测定法中的许多都依赖于校正来提供有效和有意义的结果，特别是对于半定量和定量检测而言。在外部校正系统中，通常从含有一组已知量分析物的标准样品获得标准曲线，然后将从样品获得的结果与标准曲线进行比较，以便求出样品中分析物的存在和/或数量。外部校正方法相对容易设计和实施简便。然而，其经常受到环境和批次差异的影响，因此是不可靠的。
因而开发出一些内部校正系统来克服这些问题。例如，Selmer等人的U.S.5,387,503中记载了一种内部校正技术，其涉及混合已知体积的样品和预定量的校正分析物，并将所述混合物与固相载体相接触。所述固相载体含有能够在第一离散区域选择性地结合测试分析物的试剂和能够在第二离散区域选择性地结合校正分析物的试剂。同样将针对测试分析物的标记试剂和针对校正分析物的类似标记试剂的混合物施加于所述固相载体。通过比较分别与测试分析物和校正分析物相结合的标记试剂水平，确定样品中测试分析物的量。遗憾的是，这种内部校正技术不易结合到侧流(lateralflow)设备中，这种侧流设备涉及利用色谱法对分析物进行非均相分离。此外，其对预混合测定试剂的需要很繁琐和过于复杂，特别是对于最终使用者并非受训过的医务专家或技术人员的采样现场即时分析(point－of－care)应用而言。
因此，目前需要一种准确而相对廉价、简单并易于使用的用于侧流测定的精确内部校正系统。
发明内容
根据本发明的一种实施方案，公开了一种用于检测测试样品中测试分析物的存在或数量的诊断性试验试剂盒(diagnostictestkit)。这种诊断性试验试剂盒包括含有多孔膜的侧流测定设备。所述多孔膜限定出检测区和校正区。第一受体材料固定在检测区内而第二受体材料固定在校正区内。除了该侧流测定设备，所述诊断性试验试剂盒还包括多种测定试剂，其中的一种或多种设置在所述侧流测定设备上。所述测定试剂包括校正分析物、检测探针和校正探针。所述检测探针与第一特异性结合成员缀合，该第一特异性结合成员经构造以优先与测试分析物、第一受体材料或其组合相结合。所述校正探针与第二特异性结合成员缀合，该第二特异性结合成员经构造以优先与校正分析物、第二受体材料或其组合相结合。
根据本发明的另一种实施方案，公开了一种利用侧流设备来定量或半定量地检测测试分析物的方法。所述设备包括与检测探针和校正探针相连通的多孔膜，所述检测探针与第一特异性结合成员相缀合，所述校正探针与第二特异性结合成员相缀合。所述多孔膜还限定出检测区和校正区。该方法包括将所述侧流设备与校正分析物相接触；将所述侧流设备与测试样品相接触；测量检测区产生的检测信号的强度；以及测量校正区产生的校正信号的强度。测试分析物的量与用校正信号强度校正后的检测信号的强度成比例。
根据本发明的另一种实施方案，公开了一种利用侧流设备来定量或半定量地检测测试分析物的方法。所述设备包括多孔膜，其与校正分析物、缀合有第一特异性结合成员的检测探针、以及缀合有第二特异性结合成员的校正探针相连通。所述多孔膜还限定出检测区和校正区。该方法包括将所述侧流设备与测试样品相接触；测量检测区产生的检测信号的强度；以及测量校正区产生的校正信号的强度。测试分析物的量与用校正信号强度校正后的检测信号的强度成比例。
以下更详细地论述本发明的其它特征和方面。
附图简要说明
针对本领域的普通技术人员，本发明的全面和可实施的内容，包括其最佳方式，都参照附图在说明书的剩余成员进行了更加具体的阐述，其中：
图1是本发明的侧流测定设备的一个实施方案的透视图；
图2是可以根据本发明使用的夹心测定形式的一个实施方案的示意图；
图3是可以根据本发明使用的间接测定形式的一个实施方案的示意图；以及
图4是可以根据本发明使用的竞争性测定形式的一个实施方案的示意图。
附图标记在本说明书和附图中的重复使用意味着其代表本发明的相同或类似特征或元件。
代表性实施方案详述
定义
正如本文所用的，术语“分析物”通常是指待检测的物质。例如，分析物可包括抗原性物质、半抗原、抗体以及这些物质的组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括那些为了治疗目的而施用的药物和那些为了违法目的而施用的药物)、药物中间体或副产物、细菌、病毒颗粒以及任何上述物质的代谢物或抗体。一些分析物的具体实例包括铁蛋白；肌酸激酶MB(CK－MB)；地高辛；苯妥英；苯巴比妥；卡马西平；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼定；促黄体生成激素(LH)；促卵泡激素(FSH)；雌二醇、黄体酮；C－反应蛋白；脂笼蛋白(lipocalins)；IgE抗体；细胞因子；维生素B2微球蛋白；糖化血红蛋白(Gly.Hb)；氢化可的松；毛地黄毒苷；N－乙酰普鲁卡因酰胺(NAPA)；普鲁卡因酰胺；风疹抗体，例如风疹－IgG和风疹IgM；弓形体病抗体，例如弓形体病IgG(Toxo－IgG)和弓形体病IgM(Toxo－IgM)；睾酮；水杨酸盐；对乙酰氨基酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝核心抗原的抗体，例如抗－乙肝核心抗原IgG和IgM(抗－HBC)；人免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人T－细胞白血病病毒1和2(HTLV)；乙肝e抗原(HBeAg)；乙肝e抗原的抗体(抗－HBe)；流感病毒；促甲状腺素(TSH)；甲状腺素(T4)；全三碘甲状腺原氨酸(全T3)；游离三碘甲状腺原氨酸(游离T3)；癌胚抗原(CEA)；脂蛋白，胆固醇，和甘油三酯；以及α－胎儿球蛋白(AFP)。滥用药物和受控物质包括但不限于安非他明；甲基安非他明；巴比妥酸盐，例如异戊巴比妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥和巴比妥；苯二氮杂类，例如利眠宁和安定；大麻素类，例如印度大麻和大麻；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鸦片制剂，例如海洛因、吗啡、可待因、二氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、氧可酮、氧吗啡酮和鸦片；苯环利定；以及丙氧吩。其它可能的分析物在Everhart等人的U.S.6,436,651和Tom等人的U.S.4,366,241中有所记载。
本文所用术语“测试样品”通常是指被怀疑含有分析物的生物材料。测试样品可以来自任何生物源，例如生理流体，包括血液、组织液、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、乳液、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液、阴道液、月经、羊膜液、精液等等。除了生理流体，也可以使用其它的液体样品，例如用于实施环境或食品测定的水、食品等。此外，怀疑含有分析物的固体材料也可用作测试样品。测试样品可以从生物源获得后直接使用，或者在预处理后使用以改良样品的特性。例如预处理可包括用血液制备血浆、稀释粘稠液等等。预处理方法还包括过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰成分的灭活、以及添加试剂、溶菌等等。而且，有益的是，将固体测试样品改变成液态介质或者释放分析物。
详细说明
现在详细参照本发明的多个不同实施方案，其中的一个或多个实例在以下列出。每个实例都是为了解释本发明，而对本发明没有限定作用。事实上，对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下能够对本发明作出多种修改和变型。例如，作为一种实施方案的一成员而阐述或描述的特征可用在另一种实施方案上，从而产生又一种实施方案。因而，本发明意在覆盖这样的修改和变型，即它们在所附的权利要求书及其等同方式的范围内。
总体上，本发明涉及诊断性试验试剂盒，其中采用了侧流测定设备以及用于检测样品内测试分析物的多个测定试剂。所述测定试剂包括能够产生表明测试样品中测试分析物存在与否或者数量的检测信号的检测探针。为了进一步提高检测的准确度，还使用了能够产生表明校正分析物存在与否或者数量的校正信号的校正探针。所述校正信号可以用来校正所述检测信号。
校正分析物通常或者对于测试样品是异源性的或者以恒定的浓度存在，这样就较容易区分测试分析物和校正分析物。而且，通常还希望校正分析物表现出类似于测试分析物的与pH值、温度、盐浓度等条件相关的降解性质(或者随时间的活性损失)。以这种方式，校正分析物在相同的反应条件和存放时间下表现行为相似，使得校正分析物的校正曲线与测试分析物的校正曲线基本上相似。如果需要的话，例如，校正分析物可以是与测试分析物相同的蛋白质家族的成员。在一种实施方案中，测试分析物为C反应蛋白(“CRP”)，它是一种与肺炎链球菌的体细胞C多糖形成沉淀的球蛋白。CRP属于“五聚环蛋白(pentraxin)”蛋白质家族，它们是寡聚血浆蛋白质，是具有五个非共价连接的亚成员的五角环状对称结构。“五聚环蛋白”家族有两个常见分支，即“CRP样”蛋白和血清淀粉样P(“SAP”)蛋白。与胆碱磷酸结合的蛋白质被认为是CRP样的，而与碳水化合物成员结合的蛋白质被认为是SAP样的。因此，在CRP作为测试分析物的实施方案中，所选择的校正分析物可以是五聚环蛋白家族的成员，甚至更希望是与胆碱磷酸结合的五聚环蛋白。这种胆碱磷酸结合的五聚环蛋白的一些实例包括但不限于五聚环蛋白3(“PTX3”)、神经元五聚环蛋白1、以及神经元五聚环蛋白2。参见例如，Arteriosclerosis，ThrombosisandVascularBiology：ProductionoftheLongPentraxinPTX3inAdvancedAtheroscleroticPlaques；MichaelS.Rolphet.al；2002；22：e10。然而，校正分析物并非必须是与测试分析物相同家族的成员。事实上，许多应用需要较低水平的校正准确度，因此可以采用较廉价和更容易获得的校正分析物。在一种实施方案中，例如，针对CRP的校正分析物可以是选自非五聚环蛋白家族(例如，二聚体、三聚体等)的蛋白质，例如白蛋白、牛血清蛋白(BSA)、β－酪蛋白或者hCG，所有这些被认为具有类似于CRP的降解曲线。
如上面所述，在本发明中采用检测和校正探针来分别检测测试分析物和校正分析物。校正探针通常含有与检测探针相同种类的可检测物质。任何能够产生在视觉上或通过仪器设备可测得的信号的物质都可用作检测或校正探针。合适的可检测物质可包括，例如发光化合物(例如荧光、磷光等等)；放射性化合物；可见化合物(例如有色染料或金属物质，如金)；脂质体或其它含有信号生成物质的囊泡；酶和/或底物等等。其它合适的可检测物质记载于Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。如果可检测物质是有色的，则理想的电磁辐射是互补波长的光。例如，蓝色的检测探针强烈地吸收红光。
在一些实施方案中，可检测物质可以是能产生光学可检测信号的发光化合物。例如，合适的荧光分子可包括但不限于，荧光素、铕螯合物、藻胆蛋白、罗丹明，以及其衍生物和类似物。其它合适的荧光化合物有半导体纳米晶体，通常称作“量子点”。例如，所述纳米晶体可包含通式为CdX的核心，其中X为Se、Te、和S等等。纳米晶体还可以由通式为YZ的包被壳所钝化，其中Y是Cd或者Zn，Z是S或Se。其它合适的半导体纳米晶体实例还可以记载于Barbera－Guillem等人的U.S.6,261,779和Dapprich的U.S.6,585,939中，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。
此外，合适的磷光化合物可包括一种或多种金属的金属配合物，例如钌、锇、铼、铱、铑、铂、铟、钯、钼、锝、铜、铁、铬、钨、锌等等。尤其优选的是钌、铼、锇、铂和钯。金属配合物可包含一个或多个有助于该配合物在含水或非含水环境中溶解的配体。例如，配体的一些合适实例包括但不限于，吡啶、吡嗪、异烟酰胺、咪唑、联吡啶、三联吡啶、菲咯啉；联吡啶并吩嗪；卟啉、卟吩以及其衍生物。所述配体可以例如，由烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧酸根、甲醛(carboxaldehyde)、酰胺、氰基、氨基、羟基、亚氨基、羟基羰基、氨基羰基、脒、胍、酰脲基、含硫基团、含磷基团、N－羟基－琥珀酰亚胺的羧酸酯所取代。
卟啉和卟吩金属配合物具有用亚甲桥偶联在一起的吡咯基，从而与金属螯合的内部孔洞形成环状结构。这些分子中的许多在室温下在合适溶剂(例如水)中以及无氧环境下表现出强烈的磷光性质。能够表现出磷光性质的一些合适卟啉配合物包括但不限于，铂(II)粪卟啉－I和III，钯(II)粪卟啉，钌粪卟啉，锌(II)－粪卟啉－I，及其衍生物等等。类似地，能够表现出磷光性质的一些合适卟吩配合物包括但不限于，四－meso－氟苯基卟吩铂(II)和四－meso－氟苯基卟吩钯(II)。还有其它合适的卟啉和/或卟吩配合物记载于Schmidt等人的U.S.4,614,723；Hendrix的U.S.5,464,741；Soini的U.S.5,518,883；Ewart等人的U.S.5,922,537；Sagner等人的U.S.6,004,530；以及Ponomarev等人的U.S.6,582,930中，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。
还可以利用联吡啶金属配合物作为磷光化合物。合适的联吡啶配合物的一些实例包括但不限于，二[(4,4’－甲氧基)－2,2’－联吡啶]2－[3－(4－甲基－2,2’－联吡啶－4－基)丙基]－1,3－二氧戊环钌(II)；二(2,2’联吡啶)[4－(丁－1－醛)4’－甲基－2,2’－联吡啶]钌(II)；二(2,2’联吡啶)[4－(4’－甲基－2,2’－联吡啶－4’－基)－丁酸]钌(II)；三(2,2’联吡啶)钌(II)；(2,2’－联吡啶)[二－二(1,2－二苯基膦基)亚乙基]2－[3－(4－甲基－2,2’－联吡啶－4’－基)丙基]－1,3－二氧戊环锇(II)；二(2,2’－联吡啶)[4－(4’－甲基－2,2’－联吡啶)－丁胺]钌(II)；二(2,2’联吡啶)[1－溴－4(4’－甲基－2,2’－联吡啶－4－基)－丁烷]钌(II)；二(2,2’－联吡啶)马来酰亚氨基己酸；4－甲基－2,2’－联吡啶－4’－丁酰胺钌(II)等等。可表现出磷光性质的其它合适的金属配合物还记载于Richter等人的U.S.6,613,583；Massey等人的U.S.6,468,741；Meade等人的U.S.6,444,423；Massey等人的U.S.6,362,011；Bard等人的U.S.5,731,147；以及Massey等人的U.S.5,591,581中，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。
在一些情况下，发光化合物可能具有较长的发光寿命和较大的“斯托克司频移”。术语“斯托克司频移”通常定义为，发光辐射的谱线或波段移向比激发线或波段更长的发射波长。较大的斯托克司频移使得发光化合物的激发波长保持远离其发射波长，并且由于激发和发射波长之间的较大差异使得较容易从发射信号中去除反射的激发辐射，因而是人们所希望的。而且，大斯托克司频移还使得来自样品中的发光分子和/或蛋白质或胶体的光散射的干扰降到最低，这些蛋白质或者胶体存在于一些体液(例如血液)中。此外，大斯托克司频移还使得对用来消除背景干扰的昂贵、高精度滤光片的需要最小化。例如，在一些实施方案中，发光化合物具有大于大约50纳米的斯托克司频移，在一些实施方案中大于大约100纳米，而在一些实施方案中为大约100到大约350纳米。
例如，具有大斯托克司频移的示例性荧光化合物包括钐(Sm(III))、镝(Dy(III))、铕(Eu(III))和铽(Tb(III))的镧系螯合物。在螯合物以相当短的波长激发之后所述螯合物可表现出强烈的红移、窄带、长寿命发光。通常，由于发色团位于分子中的镧系元素附近，所以螯合物具有强烈的紫外发射波带。由发色团激发之后，激发能量可以从激发的发色团传递到镧系元素上。之后是该镧系元素的荧光发射特性。例如，与荧光素仅为大约28纳米相比，铕螯合物的斯托克司频移在大约250到大约350纳米。同样，与其它荧光标记的大约1到大约100纳秒的寿命相比，铕螯合物的荧光寿命很长，其寿命大约为100到大约1000微秒。此外，这些螯合物具有窄发射波谱，通常在大约50％的发射处带宽小于大约10纳米。一种合适的铕螯合物是N－(对异硫氰酸根合苄基)二亚乙基三胺四乙酸－Eu+3。
此外，本发明中还可以使用在水溶液或悬液中惰性、稳定并且具有固有荧光的镧系元素螯合物，从而无需囊泡形成试剂，它们通常用来保护在水溶液或悬液中具有有限溶解度并存在猝灭问题的螯合物。这种螯合物的一个实例是4－[2－(4－异硫氰酸根合苯基)乙炔基]－2,6－二([N,N－二(羧甲基)氨基]甲基)吡啶[参见：Lovgren，T.等；Clin.Chem.42，1196－1201(1996)]。一些镧系元素螯合物还表现出特别高的信噪比。例如，一种此螯合物是四配位基β－二酮化物－铕螯合物[参见：Yuan，J.和Matsumoto，K.；Anal.Chem.70，596－601(1998)]。除了上述荧光标记之外，适用于本发明的其它标记记载于Mullinax等人的U.S.6,030,840；Davidson的U.S.5,585,279；Singer等人的U.S.5,573,909；Wieder等的U.S.6,242,268；Hemmila等的U.S.5,637,509，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。
可检测物质，例如如上所述，可以单独使用或者与颗粒(有时称为“珠”或“微珠”)联合使用。例如，可以使用天然形成的颗粒，例如胞核、支原体、质粒、质体、哺乳动物细胞(例如红细胞影)、单细胞微生物(例如细菌)、多糖(例如琼脂糖)等等。此外，也可以利用合成颗粒。例如，在一种实施方案中，采用了标记有荧光或有色染料的乳胶微粒。尽管本发明中可以使用任何合成颗粒，但所述颗粒典型地是由以下物质构成：聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸－乙烯基三聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯－马来酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基嘧啶、聚二乙烯苯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、丙烯腈、氯乙烯－丙烯酸酯等等，或者其醛、羧基、氨基、羟基、或者酰肼衍生物。其它合适的颗粒记载于Jou等人的U.S.5,670,381和Tarcha等人的U.S.5,252,459中。市场上可买到的合适荧光颗粒的实例包括MolecularProbes,Inc.出售的商品名为“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)的荧光羧化微球，以及同样由MolecularProbes,Inc.出售的“TexasRed”，和5－、6－羧基四甲基罗丹明。此外，市场上可买到的合适的有色乳胶微粒实例包括Bang’sLaboratory,Inc.出售的羧化乳胶微珠。本发明中也可以采用金属颗粒(例如金颗粒)。
当使用时，颗粒的形状一般可以变化。在一种特别的实施方案中，例如，所述颗粒是球状的。然而，应当明白的是本发明也可以构思其它的形状，例如板状、棒状、盘状、条状、管状、不规则形状等等。此外，颗粒的大小也可以有所不同。例如，颗粒的平均尺寸(例如直径)范围可以在大约0.1纳米到大约1000微米，在一些实施方案中，大约0.1纳米到大约100微米，而在一些实施方案中，在大约1纳米到大约10微米。
通常希望以一些方式改变检测和校正探针使其更容易与各自的分析物或受体材料结合。在这种情况下，探针可以通过粘附于其上的某种特异性结合成员改性以形成缀合探针。特异性结合成员通常称为特异性结合对的一员，即两个不同分子，其中一个分子化学和/或物理结合到第二个分子上。特异性结合成员的选择通常依赖于目标测试分析物和相应的校正分析物。为保证独立的测定性能，通常希望检测探针而不是校正探针与不同的特异性结合对的成员缀合。在这种方式下，缀合的校正探针优先地与校正分析物(夹心和间接测定形式)或者针对校正分析物的特异性结合成员(竞争测定形式)结合。然而，缀合的校正探针通常不与测试分析物或针对测试分析物的特异性结合成员相结合。这样，可以同时进行针对测试分析物和校正分析物的测定，而不用担心有实质性的交叉反应，从而使校正分析物测定可用于校正测试抗原。并且，与校正分析物和待测分析物之间的关系类似，通常希望在有关pH值、温度、盐浓度、存放时间等的条件下，所述特异性结合成员表现出类似的降解情况。
可用于本发明的合适免疫反应性特异性结合成员的一些实例包括，但不限于，抗原、半抗原、适配体、抗体(初级或次级)，和其配合物，包括那些通过重组DNA方法或肽合成形成的物质。抗体可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白或其混合物或片断，也可以是抗体和其它特异性结合成员的混合物。这些抗体的制备细节和其用作特异性结合成员的适用性是本领域技术人员公知的。其它常见的特异性结合对包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白(或其衍生物)，生物素和链霉抗生物素蛋白，碳水化合物和凝集素，互补核苷酸序列(包括在DNA杂交测定中用来检测靶核酸序列的探针和捕获核酸序列)，互补肽序列，包括通过重组方法所形成的那些，效应物和受体分子，激素和激素结合蛋白，酶辅因子和酶，酶抑制因子和酶等等。此外，特异性结合对可包括原特异性结合成员的类似物。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即，分析物－类似物，只要其具有至少一个与分析物相同的抗原决定基即可。
特异性结合成员通常可以利用任何各种公知的技术与探针相连。例如，利用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基、环氧基和其它反应性或连接官能团，以及残余自由基和自由基阳离子，可以实现蛋白质的偶联反应，从而可以实现特异性结合成员与检测探针(例如，颗粒)的共价连接。表面官能团还可以作为官能化共聚单体被引入，因为所述探针表面可能含有较高表面浓度的极性基团。此外，尽管所述探针通常在合成后，例如与聚(苯硫酚)合成后进行了功能化，但所述探针也可以直接与蛋白共价连接而无需进一步修饰。例如，在一种实施方案中，缀合的第一步是使用碳二亚胺活化探针表面的羧基。在第二步中，活化的羧酸基团与抗体的氨基反应形成酰胺键。所述活化和/或抗体偶联过程可以在缓冲液中进行，例如磷酸盐缓冲盐液(PBS)(例如，pH值7.2)或2－(N－吗啉代)乙烷磺酸(MES)(例如，pH值5.3)。然后将得到的探针与乙醇胺接触，例如，用以阻断任何残余的活性位点。总之，该过程形成了缀合的探针，其中抗体与所述探针共价连接。除了共价连接外，本发明中还可以采用其它的连接技术，例如物理吸附。
无论其采用何种方式形成，所述检测探针和校正探针通常在测试样品应用之前设置在测定设备上。所述探针预先应用到测定设备具有多种好处。例如，预先应用无需之后的使用者将反应物进行处理和与待测样品或稀释液混合。这在使用者通常不是训练有素的技术人员或医务专家的采样现场即时分析中尤为有用。在一些实施方案中，例如，所述检测和校正探针设置在测试样品应用位置的下游。通过这种方式，测试样品能够根据应用与所述探针混合和选择性地重悬。或者，所述探针可以设置在测试样品应用位置的上游。例如，可以采用稀释剂来重悬所述探针以进行测定。类似地，校正分析物也可以在应用所述测试样品之前设置在所述测定设备上。尽管具体的位置可能有所不同，但通常希望所述校正分析物在检测探针和校正探针的上游应用。通过这种方式，校正分析物在接触校正探针之前能够容易地与测试样品混合，从而增强它们之间的结合。校正分析物也可以在应用到所述测定设备之前与测试样品混合。这样，在进行测定之前，所述校正分析物与测试分析物处于基本上相同的条件下。这可以进一步优化校正精度。
参见图1，现在将更详细地描述一种侧流测定设备20的实施方案，其可以与根据本发明的内部校正系统结合使用。如图所示，设备20包含任选地由刚性材料21支撑着的多孔膜23。通常，多孔膜23可以由测试样品能够通过的任何各种材料制成。例如，用来形成多孔膜23的材料可包括但不限于，天然的、合成的、或者天然存在并被合成改性的材料，例如多糖(例如，纤维素材料，如纸和纤维素衍生物，像醋酸纤维素和硝基纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；氧化硅；无机材料，如去活氧化铝、硅藻土、MgSO4或其它均匀分散在多孔聚合物基质中的无机细碎材料，其中所述聚合物例如氯乙烯、氯乙烯－丙烯共聚物和氯乙烯－醋酸乙烯酯共聚物；布，包括天然存在的(例如棉)和合成的(例如尼龙或人造纤维)；多孔凝胶，例如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺等等。在一种特别的实施方案中，所述多孔膜23是由硝基纤维素和/或聚酯砜材料制成的。应当理解，术语“硝基纤维素”是指纤维素的硝酸酯，其可以是单独的硝基纤维素，或者是硝酸与其它酸，例如具有1－7个碳原子的脂族羧酸的混合酯。
多孔膜23的尺寸和形状通常可以有所不同，如本领域技术人员很容易得知的那样。例如，多孔膜条带的长度可以从大约10到大约100毫米，在一些实施方案中为大约20到大约80毫米，而在一些实施方案中，为大约40到大约60毫米。膜条带的宽度范围也可以在大约0.5到大约20毫米，在一些实施方案中，为大约1到大约15毫米，而在一些实施方案中，为大约2到大约10毫米。同样，膜条带厚度通常足够小以允许基于透过的检测。例如，所述膜条带的厚度可以小于大约500微米，在一些实施方案中，小于大约250微米，而在一些实施方案中，小于大约150微米。
如上所述，载体21承载着多孔膜23。例如，如图1所示，载体21可以设置成直接邻接多孔膜23，或者可以在多孔膜23和载体21之间设置一个或更多中间层。无论怎样，载体21通常都可由能够承载多孔膜23的任何材料构成。载体21可以由可透光的材料形成，例如透明的或光漫射的(例如半透明)材料。而且，通常希望载体21是不透液的，这样液体流过膜23时不会漏过载体21。合适的载体材料的实例包括但不限于，玻璃；聚合材料，例如聚苯乙烯，聚丙烯，聚酯(例如，膜)，聚丁二烯，聚氯乙烯，聚酰胺，聚碳酸酯，环氧化物，甲基丙烯酸酯，和聚密胺(polymelamine)等等。为了使多孔膜23具有足够的结构化背衬，通常将载体21选择成具有特定的最小厚度。同样，载体21的厚度通常也不会大到负面影响其光学属性。因而，例如，载体21的厚度范围可以在大约100到大约5000微米，在一些实施方案中，为大约150到大约2000微米，而在一些实施方案中，为大约250到大约1000微米。例如一种适合的膜条带，厚度大约为125微米，可以购自MilliporeCorp.ofBedford，Massachusetts，名为“SHF180UB25”。
正如本领域所公知，多孔膜23可以浇注在载体21上，其中可以将得到的叠层冲切成预期的大小和形状。或者，所述多孔膜23可以仅利用诸如粘合剂之类的方式层压到载体21上。在一些实施方案中，是将硝基纤维素或尼龙多孔膜粘贴在膜上。粘合剂用于将多孔膜粘结到膜上，例如压力敏感型粘合剂。这类层压结构能够从MilliporeCorp.ofBedford，Massachusetts买到。还有其它合适的层压测定设备结构的实例记载于Durley，III等人美国专利US5,075,077中，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。
设备20还可以包含吸收垫28。所述吸收垫28通常接收已经通过整个多孔膜23的流体。正如本领域内所公知，吸收垫28可以帮助促进毛细作用和流体流过膜23。
为了在测试样品中启动分析物的检测，使用者可以直接将测试样品加到所述多孔膜23的一成员，通过其样品然后沿着图1中箭头L所示的方向移动。或者，可以先将测试样品加到与多孔膜23流体连通的样品垫24上。可以用来形成样品垫24的一些适宜材料包括但不限于，硝基纤维素素、纤维素、多孔聚乙烯垫和玻璃纤维滤纸。如果需要的话，样品垫24还可以含有以扩散或非扩散的形式附着于其上的一种或多种测定预处理试剂。例如，在一种实施方案中，可以将校正分析物设置在样品垫24上以便其与应用于其上时的测试样品相接触。
在图示的实施方案中，测试样品从样品垫24移动到设置成与该样品垫24一端连通的缀合垫22上。缀合垫22由能够通过测试样品的材料制成。例如，在一种实施方案中，缀合垫22由玻璃纤维制成。虽然仅示出一个缀合垫22，但是应该理解，本发明中也可以使用多个缀合垫。在本发明的一个特别实施方案中，检测和校正探针(未示出)被应用于所述缀合垫22。应用之后，使探针干燥以防止其在上面移动。缀合垫22提供了用于沉积探针的基质，以使它们在重新水合时可以自由地迁移。更具体来说，当液体测试样品接触探针时，它们重新水合并发生重悬和/或重新溶解。当然，应当明白的是，所述探针也可以应用到测定设备20的其它不同位置，例如直接应用到膜23上，只要它们在与测试样品接触后能够被其重新水合。
再参见图1，多孔膜23也限定了经构造用以进行测定的不同区域。例如，多孔膜23限定了含有第一受体材料的检测区31，该第一受体材料能够与通过了膜23长度的缀合检测探针(或其配合物)相结合。所述第一受体材料固定在多孔膜23上，其可以选自与上述特异性结合成员相同的材料，包括，例如，抗原；半抗原；抗体结合蛋白，例如蛋白A，蛋白G，或蛋白A/G；中性抗生物素蛋白(一种脱糖基化抗生物素蛋白衍生物)，抗生物素蛋白(66000道尔顿的高度阳离子型糖蛋白)，链抗生物素蛋白(52800道尔顿的非糖基化蛋白)，或者captavidin(一种硝化抗生物素蛋白衍生物)；初级或次级抗体，及其衍生物或片段。在一些实施方案中，第一受体材料是对在测试样品中的抗原有特异性的抗体。例如，在夹心型测定形式中，所述第一受体材料可以用作针对分析物和缀合检测探针之间形成的配合物的固定结合位点。尤其是，分析物例如抗体、抗原等，通常具有两个或多个结合位点(即，抗原决定基)。在到达检测区31时，这些结合位点之一被缀合探针的特异性结合成员所占据。然而，分析物的自由结合位点可以结合到固定的第一受体材料上。在与所述固定的受体材料结合时，所述配合探针便形成了一种新的三元夹心配合物。
测定设备20还包括校正区32。在该实施方案中，校正区32形成于多孔膜23上，并设置在检测区31的下游。然而，可替代地，校正区32也可以设置在检测区31的上游。校正区32具有第二受体材料，其能够与通过了膜23长度的缀合校正探针(或其配合物)相结合。第二受体材料可以是用于缀合所述校正探针的特异性结合对的成员。在这种方式下，第二受体材料优先与校正探针(或其配合物)结合。例如，当校正分析物为抗原时，第二受体材料可以是抗体(例如，夹心或竞争性测定形式)或抗原(例如，间接测定形式)。而且，如上所述，通常希望第一和第二受体材料表现出相似的与pH值、温度、盐浓度、存放时间等条件相关的降解行为。
检测区31和校正区32可以分别具有任意数量的不同检测区域，使得使用者可以更好地确定测试样品中分析物的浓度。每个区域可以包含相同的受体材料，或者可以包含不同的受体材料。例如，所述区可以包括两个或多个不同的区域(如线、点等)。所述区域可以设置成基本上垂直于测试样品流动通过测定设备20方向的线条形式。同样，在一些实施方案中，所述区域可以设置成基本上平行于测试样品流动通过测定设备20方向的线条形式。
当希望半定量或定量测定测试样品中分析物的浓度时，可以将检测区31处所生成的检测信号强度“Is”与校正区32处所生成的校正信号强度“Ic”相比较。例如，在一些实施方案中(例如，夹心测定形式)，分析物的量与Is与Ic之比成正比。在另一些实施方案中(例如，竞争性和间接测定形式)，超出预定基础量的分析物的量与Is与Ic之比成反比。基于该比例所在的范围，可以测定出分析物的大致浓度范围。如果希望的话，可以针对已知的分析物浓度范围绘制Is与Ic之比与分析物浓度关系的曲线图，从而形成校正曲线。为了测定未知待测样品中超出预定基础量的分析物的量，则可以根据校正曲线将信号比转换成分析物的浓度。应当注意的是，也可以绘制Is与Ic之间的替代性数学关系与分析物浓度关系的曲线，从而形成校正曲线。例如，在一种实施方案中，可以绘制Is/(Is+Ic)值与分析物浓度的关系曲线，从而形成校正曲线。不管怎样，可以在几乎相同的条件下同时进行校正和样品测试，从而提供可靠并且灵敏度较高的定量或半定量结果。
如果需要的话，在一些实施方案中可以使用光学读取设备来测量检测区31和/或校正区32处的探针强度。此光学读取设备的实际构造和结构通常可以有所不同，本领域技术人员很容易理解。例如，可以利用的光学检测技术包括但不限于，发光(例如荧光、磷光等)，吸光度(例如荧光或非荧光)，衍射等等。例如，在Kaylor等人的公开号为2003/0119202的美国专利申请中描述了一种适合的反射分光光度计，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。在另一种实施方案中，可以使用反射模式分光荧光计来检测显出荧光的探针的存在。例如，在Song等人的公开号为2004/0043502的美国专利申请中描述了适合的分光荧光计和相关的检测技术，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。同样地，透射模式检测系统也可以用来检测所述检测探针的存在。
典型地，光学读取设备包含能够发射电磁辐射的照明源和能够记录信号(例如，透射或反射光，发射的荧光或磷光等)的检测器。照明源可以是本领域中公知的能够提供电磁辐射的任何设备，例如在可见或接近可见光(例如，红外或紫外光)范围内的光。例如，可以用于本发明的合适照明源包括但不限于，发光二极管(LED)，闪光灯，冷阴极荧光灯，电致发光灯等等。所述照明可以是多路复合的和/或准直的。在一些情况下，所述照明可以进行脉冲调制以减小任何背景干扰。此外，照明可以是连续的或可以结合连续波(CW)和脉冲照明，其中将多个照明光束进行了多路复合(例如，脉冲光束与CW光束相复合)，从而允许在CW源引起的信号与脉冲光源引起的信号之间允许信号区别。例如，在一些实施方案中，用LED(例如，砷化铝镓红光二极管，或磷化镓绿光二极管，磷砷化镓绿光二极管，或者铟镓氮化物紫/蓝/紫外(UV)光二级管)作为脉冲照明源。适用于本发明的一种市场上可买到的合适UVLED激发二极管实例是ModelNSHU55OE(NichiaCorporation)，它在10毫安(3.5－3.9伏)的正向电流下发出750到1000微瓦的光能形成光束，其半峰值全宽为10度，峰值波长为370－375纳米，光谱半宽为12纳米。
在一些情况下，照明源可以向所述测定设备提供漫射照明。例如，可以仅采用多点光源(例如LED)阵列来提供相对漫射的照明。能够以相对廉价的方式提供漫射照明的另一种特别符合需要的照明源是电致发光(EL)设备。EL设备通常是一种采用夹在电极之间的发光材料(例如磷光颗粒)的电容结构，至少一个所述电极是透明的以使得光漏出。在所述电极之间施加电压可在发光材料之中生成变化的电场，其能引起发光材料发光。
检测器通常可以是本领域已知的能够感测信号的任何设备。例如，所述检测器可以是设置成空间分辨的电子成像检测器。这种电子成像检测器的一些实例包括高速线性电荷耦合(CCD)设备，电荷注入设备(CID)，互补金属氧化物半导体(CMOS)设备等等。这些成像检测器例如，通常是电子光传感器的二维阵列，尽管也可以使用线性成像检测器(例如，线性CCD检测器)，其包括单线的检测器像素或者光传感器，例如用于扫描图像的那些。每个阵列都包括一套已知的唯一位置，其可以称为“地址”。在成像检测器中的每个地址都被覆盖一域(例如，通常成方形或矩形的区域)的传感器所占据。这个区域通常称为“像素”或“像素区”。例如，检测器像素可以是CCD、CID或CMOS传感器，或者其它可检测或测量光的任何设备或传感器。检测器像素的大小可以有很大不同，在一些情况下其直径或长度可以小到0.2微米。
在另一些实施方案中，检测器可以是缺乏空间分辨能力的光传感器。例如，这种光传感器的实例可包括光电倍增设备，光电二极管，例如雪崩光电二极管或硅光电二极管等等。有时硅光电二极管很有优势，因为其廉价、灵敏、能够高速工作(上升时间短/高带宽)，并且容易集成到大多数其它的半导体技术和单片电路中。此外，硅光电二极管物理尺寸小，这使得其很容易结合到与基于膜的设备一起使用的系统中。如果使用硅光电二极管，则发射信号的波长范围可以在其灵敏度，即400到1100纳米的范围内。
根据本发明，检测和校正可以自动和/或手动进行。例如，可以任选地采用微处理器来将检测器的信号强度转换成表明分析物浓度的定量或半定量结果，所述微处理器可包括存储能力，以使使用者能够重新调用最后的几个结果。本领域技术人员应当知道，可以采用任何合适的计算机可读存储设备，例如RAM，ROM，EPROM，EEPROM，闪存卡，数字视频盘，Bernoulli磁带等等。如果需要的话，可以将结果利用液晶(LCD)或LED显示器传送给使用者。
参见图2，现在将更详细地描述一种利用夹心测定形式来检测测试抗原A(例如CRP)是否存在的方法实施方案。首先，将校正抗原A*(例如，PTX3)预先应用到样品垫24上，并将缀合检测探针41和缀合校正探针43预先应用到缀合垫22上。例如，在一种实施方案中，检测探针41是与CRP抗体(例如，CRPIgG1)缀合的染色颗粒，校正探针43是与PTX3抗体缀合的染色颗粒，所述PTX3抗体不会与其它五聚环蛋白家族成员(例如，鼠PTX3抗体(MNB4克隆))发生交叉反应。为了启动测定，将含有测试抗原A的测试样品应用于样品垫22上，在此处其与校正抗原A*混合。测试抗原A和校正抗原A*沿着方向“L”移动到缀合垫22上，在此处它们与检测探针41和校正探针43混合。测试抗原A与检测探针41结合形成分析物/探针配合物49，而校正抗原A*与校正探针43结合形成分析物/探针配合物50。然后所述配合物49和50移动到检测区31，在该区域内固定有第一受体材料51。例如，第一受体材料可以是不同于缀合检测探针抗体(例如，抗CRPIgG2)的CRP抗体，或者是与缀合到检测探针上的抗体相同的CRP抗体。配合物49与固定受体材料51上的可用结合位点结合。接着剩余配合物50移动到校正区32，在该区域内固定有第二受体材料53。例如，第二受体材料可以是与缀合校正探针抗体(例如，鼠PTX3抗体的不同克隆)相同或不同的PTX3抗体。配合物50与固定受体材料53上的可用结合位点结合。然后测量检测区31处捕获的由检测探针41产生的信号强度和在校正区32处捕获的由校正探针43产生的信号强度。参见图3，现在将更加详细地描述利用间接测定形式来检测测试抗原A是否存在的方法的另一种实施方案。在该实施方案中，检测探针41与针对测试抗原A的抗体缀合，而校正探针43与针对校正抗原A*的抗体缀合。此外，第一受体材料51性质上类似于测试抗原A，而第二受体材料53性质上类似于校正抗原A*。以这种方式，测试抗原A和第一受体材料51竞争缀合检测探针41上的可用结合位点，而校正抗原A*和第二受体材料53竞争缀合校正探针43上的可用结合位点。
同样，参见图4，现在将更加详细地描述利用竞争测定形式来检测测试抗原A是否存在的方法的另一种实施方案。在该实施方案中，检测探针41与性质上类似于测试抗原A的抗原缀合，而校正探针43与性质上类似于校正抗原A*的抗原缀合。此外，第一受体材料51是针对测试抗原A的抗体，第二受体材料53是针对校正抗原A*的抗体。以这种方式，测试抗原A和缀合检测探针41竞争第一受体材料51上的可用结合位点，而校正抗原A*和缀合校正探针43竞争第二受体材料53上的可用结合位点。
尽管上面描述了设备构造的各种实施方案，但应当明白，本发明的设备通常可以具有任何需要的构造，并且无需包含所有的上述部件。例如，在Lambotte等人的U.S.5,395,754；Jou等人的U.S.5,670,381；Malick等人的U.S.6,194,220中描述了各种其它的设备构造，本文出于所有目的而引入它们的全文作为参考。
参考下面的实施例可以更好地理解本发明。
实施例1
证实了制备根据本发明的侧流测试设备的能力。将长度大约30厘米的硝基纤维素多孔膜(HF120，购自Millipore，Inc.)层压到载体卡片上。将C反应蛋白的单克隆抗体固定在该多孔膜上形成检测区。所述抗体来自BioPacific，Inc.(目录号#A58040136P)，浓度为1毫克每毫升。将β－HCG的单克隆抗体(1毫克每毫升)也固定在所述多孔膜上形成校正区。将纤维素芯吸垫(MilliporeCo.)与所述膜的一端(靠近校正区的)一起进行层压。然后将膜样品在37℃的温度下干燥1小时。
将36微升缀合有抗CRP单克隆抗体(BiosPacific，Inc.，目录号#A58110228P)的金颗粒，100微升缀合有抗α－hCG单克隆抗体的金颗粒，500毫升蔗糖水溶液(20％)和1200微升水混合形成颗粒悬液。缀合有抗CRP单克隆抗体的金颗粒的颗粒尺寸为40纳米，光密度为50.2，购自BritishBiocellInternational。缀合有抗α－hCG单克隆抗体的金颗粒颗粒尺寸为40纳米，光密度为10.1，购自BritishBiocellInternational，Inc.。然后将所述颗粒悬液加载到30厘米长的玻璃纤维缀合垫(Millipore，Co.)上。之后在37℃干燥所述玻璃纤维垫2小时制成缀合垫。接着将该缀合垫层压到所述多孔膜的另一端(靠近检测区的)。将纤维素芯吸垫(MilliporeCo.)样品垫进一步层压到所述缀合垫上。将层压后的整个卡片切割成4毫米宽的侧流测定设备。
实施例2
证实了根据本发明检测CRP的能力。如实施例1所述制备五个侧流设备(样品1－5)。将含有60微升CRP(90纳克每毫升)和60微升β－hCG(50纳克每毫升)的混合溶液施加到五个侧流设备的每个的样品垫上。在室温下显影30分钟后，用反射分光光度计测量检测区和校正区的色密度。每个区域的色强度列于下表1中。
表1：色强度数据
样品 检测区强度(Id) 检测区强度(Ic) Id/Ic
1 88.285 95.279 0.92659
2 93.554 98.322 0.95115
3 91.850 98.873 0.92897
4 94.286 101.544 0.92852
5 92.580 99.990 0.92589
Id的平均值、标准偏差和％CV(变化系数，或标准偏差与平均值的比)分别为92.111、2.33127和2.531。另一方面，Id/Ic的平均值、标准偏差和％CV分别为0.9323、0.01081和1.1159。因此，如上所示，经校正的信号强度比未经校正的信号强度的标准偏差和％CV低得多。
实施例3
证实了根据本发明检测CRP的能力。如实施例1所述制备十五个侧流设备(样品1－15)并分成三组。第一组存放在室温下，第二组在65℃下加热40分钟，第三组在65℃下加热210分钟。将含有在具有1％20(ICIAmericas)的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的60微升CRP(100纳克每毫升)和60微升β－hCG(50纳克每毫升)的混合溶液施加到十五个侧流设备的每个的样品垫上。在室温下显影30分钟后，用反射分光光度计测量检测区和校正区的色密度。每组色强度列于下表2－4中。
表2：第一组的色强度数据
样品 检测区强度(Id) 检测区强度(Ic) Id/Ic
1 94.303 99.106 0.95154
2 93.980 97.933 0.95964
3 94.719 97.618 0.97030
4 90.332 95.088 0.94998
5 93.343 96.032 0.97200
Id的平均值、标准偏差和％CV分别为93.3354、1.75261和1.878。另一方面，Id/Ic的平均值、标准偏差和％CV分别为0.96069、0.01024和1.066。
表3：第二组的色强度数据
样品 检测区强度(Id) 检测区强度(Ic) Id/Ic
1 90.9110 94.189 0.96520
2 90.4130 94.266 0.95913
3 90.4860 93.614 0.96659
4 90.4399 96.666 0.97655
5 85.2780 88.978 0.95842
Id的平均值、标准偏差和％CV分别为90.2974、3.25741和3.607。另一方面，Id/Ic的平均值、标准偏差和％CV分别为0.96517、0.00732和0.758。
表4：第三组的色强度数据
样品 检测区强度(Id) 检测区强度(Ic) Id/Ic
1 89.270 93.359 0.95620
2 87.707 91.698 0.95968
3 90.181 92.496 0.97497
4 84.396 89.233 0.94579
5 87.677 91.019 0.96328
Id的平均值、标准偏差和％CV分别为87.842、2.204和2.509。另一方面，Id/Ic的平均值、标准偏差和％CV分别为0.95935、0.01074和1.12。
实施例4
证实了根据本发明制备侧流测定设备的能力。将长度大约30厘米的硝基纤维素多孔膜(HF120，购自Millipore，Inc.)层压到载体卡片上。将C反应蛋白的单克隆抗体固定在该多孔膜上形成检测区。所述抗体来自BiosPacific，Inc.(目录号#A58040136P)，浓度为1毫克每毫升。将β－HCG的单克隆抗体(1毫克每毫升)也固定在所述多孔膜上形成校正区。将纤维素芯吸垫(MilliporeCo.)与所述膜的一端(靠近校正区的)一起进行层压。然后将膜样品在37℃的温度下干燥1小时。
将36微升缀合有抗CRP单克隆抗体(BiosPacific，Inc.，目录号#A58110228P)的金颗粒，100微升缀合有抗α－hCG单克隆抗体的金颗粒，500毫升蔗糖水溶液(20％)和1400微升水混合形成颗粒悬液。缀合有抗CRP单克隆抗体的金颗粒颗粒尺寸为40纳米，光密度为50.2，购自BritishBiocellInternational。缀合有抗α－hCG单克隆抗体的金颗粒颗粒尺寸为40纳米，光密度为10.1，购自BritishBiocellInternational。然后将所述颗粒悬液加载到30厘米长的玻璃纤维缀合垫(Millipore，Co.)上。之后在37℃干燥所述玻璃纤维垫2小时制成缀合垫。接着将该缀合垫层压到所述多孔膜的另一端(靠近检测区的)。将纤维素芯吸垫(MilliporeCo.)样品垫进一步层压到所述缀合垫上。将层压后的整个卡片切割成4毫米宽的侧流测定设备。
实施例5
证实了根据本发明检测CRP的能力。如实施例4所述制备十五个侧流设备(样品1－15)并分成三组。第一组存放在室温下，第二组在65℃下加热40分钟，第三组在65℃下加热210分钟。将含有在20毫摩具有1％20(ICIAmericas)的Hepes缓冲液(pH值7.51)中的60微升CRP(100纳克每毫升)和60微升β－hCG(50纳克每毫升)的混合溶液施加到第一组的样品垫上。将含有在20毫摩具有1％20(ICIAmericas)的Hepes缓冲液(pH值8.0)中的60微升CRP(100纳克每毫升)和60微升β－hCG(50纳克每毫升)的混合溶液施加到第二组的样品垫上。将含有60微升CRP(100纳克每毫升)和60微升β－hCG(50纳克每毫升)在20毫摩具有1％20(ICIAmericas)的Hepes缓冲液(pH值8.5)中的混合溶液施加到第三组的样品垫上。
在室温下显影30分钟后，用反射分光光度计测量检测区和校正区的色密度。每组的统计学数据列于下表5中。
表5：统计学数据
如上所示，在pH值范围内检测区经校正的数据比未经校正的数据的标准偏差和％CV低得多。
尽管已经就本发明的具体实施方案详细描述了本发明，但本领域技术人员应该理解，在领会上述内容之后，很容易构思这些实施方案的替换形式、变型方式和等同方式。因此，本发明的范围应当由所附权利要求书及其等同方式来确定。

Claims (14)

1.一种用于检测测试样品中测试分析物的存在或数量的诊断性试验试剂盒，所述诊断性试验试剂盒包括：
含有多孔膜的侧流测定设备，所述多孔膜限定出检测区和校正区，其中第一受体材料固定在检测区内而第二受体材料固定在校正区内；
多种测定试剂，其中所述测定试剂包括设置在所述侧流设备上的校正分析物，所述测定试剂还包括设置在侧流设备上的检测区上游的检测探针和设置在侧流设备上的校正区上游的校正探针，所述检测探针与第一特异性结合成员缀合，该第一特异性结合成员经构造以优先与测试分析物结合以形成夹心配合物，所述校正探针与第二特异性结合成员缀合，该第二特异性结合成员经构造以优先与校正分析物结合以形成夹心配合物；其中所述测试分析物和校正分析物均为五聚环蛋白；所述检测探针和校正探针在测试样品应用之前设置在测定设备上，并且所述校正分析物在检测探针和校正探针的上游应用，其中所述检测区能够产生检测信号并且所述校正区能够产生校正信号，通过校正信号的强度校正的所述检测信号的强度与测试样品中测试分析物的浓度直接成正比。
2.权利要求1所述的诊断性试验试剂盒，其中所述第一特异性结合成员、第二特异性结合成员、第一受体材料和第二受体材料是免疫反应性结合成员。
3.权利要求1所述的诊断性试验试剂盒，其中所述测试分析物是C反应蛋白。
4.权利要求1所述的诊断性试验试剂盒，其中所述校正分析物是胆碱磷酸结合性五聚环蛋白。
5.权利要求1到4中任意一项的诊断性试验试剂盒，其中所述第一特异性结合成员经构造以与所述测试分析物结合，而第二特异性结合成员经构造以与所述校正分析物结合。
6.权利要求5所述的诊断性试验试剂盒，其中所述第一受体材料经构造以与所述测试分析物结合形成夹心配合物，而所述第二受体材料经构造以与所述校正分析物结合形成夹心配合物。
7.权利要求5所述的诊断性试验试剂盒，其中所述第一受体材料和测试分析物经构造以竞争结合所述第一特异性结合成员，而所述第二受体材料和校正分析物经构造以竞争结合所述第二特异性结合成员。
8.权利要求1到4中任意一项的诊断性试验试剂盒，其中所述第一特异性结合成员和测试分析物经构造以竞争结合所述第一受体材料，而所述第二特异性结合成员和校正分析物经构造以竞争结合所述第二受体材料。
9.上述权利要求中任意一项的诊断性试验试剂盒，其中所述校正区位于所述检测区的下游。
10.上述权利要求中任意一项的所述的诊断性试验试剂盒，其中所述侧流测定设备进一步包括与所述多孔膜流体连通的缀合垫，其中一种或多种所述测定试剂设置在所述缀合垫上。
11.权利要求10所述的诊断性试验试剂盒，其中所述检测探针和校正探针设置在所述缀合垫上。
12.权利要求10或11所述的诊断性试验试剂盒，进一步包括设置在所述缀合垫上游并且限定了测试样品施加位点的样品垫，其中所述校正分析物设置在所述样品垫上。
13.一种利用上述任一项权利要求所述的诊断性试验试剂盒来定量或半定量地检测测试样品中的测试分析物的方法，所述方法包括：
i)将所述侧流设备与测试样品相接触；
ii)测定检测区产生的检测信号的强度；以及
iii)测定校正区产生的校正信号的强度，其中所述测试分析物的量与用校正信号强度校正后的检测信号的强度直接成比例。
14.权利要求13的方法，进一步包括通过绘制多个预定分析物浓度下的检测信号强度与校正信号强度之比关系图来形成校正曲线。
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