CN1084216A - 靶分子细胞内结合的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种击中不希望的靶分子或靶抗原， 特别是蛋白质的方法。该方法包括细胞内表达能结 合靶的抗体。一种DNA序列被输送到细胞，所说 DNA序列含有足够数量的编码能结合可操作地连 接到启动子(它使抗体在有意义细胞中得以表达)上 之抗原的抗体蛋白质的核苷酸。然后，细胞内表达该 抗体并使之结合到靶上，从而破坏靶的正常作用。

Description

本发明涉及特异性分子，尤其是蛋白质的细胞内结合的方法。更具体地说，本发明涉及对希望的分子特异的抗体的细胞内表达和后来的应用。

各种异常似乎都是特定分子例如蛋白质的不希望的表达的结果。例如，许多肿瘤被认为是细胞内致癌基因如neu，myc，abl等的过度表达的结果，其它恶性肿瘤被认为是表达被改变的受体的结果。某些疾病由病毒蛋白质的不希望的细胞内表达引起。例如，人免疫缺陷病毒（HIV）使用哺乳动物细胞制备包括结构蛋白和调节酶在内的病毒编码的蛋白质。人T-细胞白血病病毒1或2型在被感染个体中作为病毒表达的结果引起肿瘤。这类病毒编码蛋白质能导致病毒粒子的组装，该病毒粒子本身又感染其他细胞。

治疗策略包括开发以不希望的蛋白质为靶的药物，细胞内阻断这类蛋白质例如可溶性CD4的方法，以及使用选择性杀伤表达不希望蛋白质之细胞的药物。

另一种建议的治疗方法是将遗传物质转移到细胞中，例如通过受体介导的基因传递、转核质植入和病毒穿梭载体例如逆转录病毒基因转移。在这种广泛被称作基因治疗的方法中，或者缺乏蛋白质，或者产生机能异常蛋白质的细胞希望通过引入编码正常基因产物的DNA得到修补。

对在直接注射包裹在脂质体[Nicolau，C.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.80：1068（1983）]、免疫脂质体[Wang.C.Y.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.84：7851（1987）]和在脂质体/红血细胞膜杂交体[Kaneda，Y.et  al.，Science  243：375（1989）]中的非感染性，非致癌基因原生质DNA后的体内基因表达已有报道。在直接腹膜内注射[Benvenitsy，N.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.83：9551（1986）：Felgner，P.L.，et  al.，Nature  349：351（1991）]后或在转核植入[Seldon，R.F.等Science  242：714（1987）]后从各种磷酸钙-沉淀基因顺序进行表达已有报道。已在静脉内给药[Wu，G.Y.，et  al.，J.Biol.Chem.263：14621（1988）]后，通过受体介导的基因传递（其中使用asialoorosomucoid/polysine结合物和质粒受体基因之间的复合物以便以仅在肝中进行针对性表达）完成了体内基因针对性表达。据报道逆转录病毒基因转移可给出高效率的感染、稳定的整合和在大多数细胞中表达[Anderson，W.F.，Science  226：401（1984）]。已在ADA缺乏病人（已输注携带ADA基因的肿瘤侵润淋巴细胞）和患晚期黑素瘤的癌症病人（已输注携带肿瘤坏死因子基因的肿瘤侵润淋巴细胞（TIL））中开始进行体内基因治疗[Rosenberg，S.A.etal.，N.Eng.J.Med.323：570（1990），所有这些文献一并列入本文作为参考文献]。

已提出了持续表达病毒抑制剂并导致病毒感染抑制的细胞的基因修饰方法并称作细胞内免疫[Baltimore，D.，Nature  335：395-196（1988）]。为达到该目标，已试验了几种方法，包括使用HIV-1特异性核糖酶[Sarver，N.et  al.，Science  227：1222（1990）]，反意义RNA[Posnansky，M.et  al.，J.Virol.65∶532（1991）]，tar  decoys[Sullenger，B.A.等，Cell  63：601（1990）;Lisziewicz，J.，et  al，Ⅶ  Internat′l.Conf.AIDS  2：28（1991）]，优势阴性突变体和其它[Buonocorel.et  al.，Nature  345：625-628（1990）;Hasseloff，J.et  al.，Nature  334：585-591（1988）;Vanderkrol，A.R.et  al.，BioTechniques6：958-976（1988）;Malim，M.H.et  al.，Cell  58：205-214（1989）;和Tvono，D.等Cell  59：113-120（1989）]。使用这类反意义RNA或核糖酶实施有效基因抑制方案的最大障碍是在转移的细胞中取得编码抑制剂DNA模板的高水平表达的能力，而且由于抑制的竞争性质，对于使用优势阴性突变体来说，这也可能是一个问题。

期望具有一种能用于获得对所希望分子的抑制剂进行高水平表达的方法。

具有一种能特异地以这些不希望的分子为靶和有广泛适用性的方法是合乎需要的。

还期望有一种不向细胞引入细胞毒性化学物质的方法。

具有一种提供以不希望蛋白质为靶的成熟手段的方法也是需要的。

现在我们发现了一种方法，运用该方法人们可以以不希望的分子（有时称作靶分子或靶抗原）尤其是蛋白质为靶。这种方法包括细胞内表达能结合到靶上的抗体。可将含有编码能结合到靶上之抗体部分的足够数目核苷酸的DNA顺序运送到细胞内，其中所说的DNA序列可操作地连接到将允许在目的细胞内表达该抗体的启动子（抗体暗盒上）。此后，抗体即在细胞内被表达并结合到靶上，从而破坏靶的正常作用。在一个优选的实施方案中，抗体暗盒的“抗体基因”将利用编码抗体的重链可变（V_H）和轻链可变（V_L）区的cDNA，该cDNA能在DNA水平上用合适的寡核苷酸作为两个可变区域的桥连接在一起，它在翻译后即形成能够连接到靶如蛋白质上的单个多肽（称作单链可变片段（sFv））。抗体基因不编码可操作的分泌顺序，因而被表达的抗体保留在细胞内。在某些优选的实施方案中，也使用编码细胞内定位前导顺序的核苷酸。

优选的细胞靶是逆转录病毒感染的细胞，例如HIV感染的细胞，而靶是病毒编码的蛋白质。例如，可以使用抗结构蛋白如被膜糖蛋白和gag蛋白和/或抗tat、rev、nef、vpu和/或vpx调节蛋白的抗体。在一个优选的实施方案中，可使用抗体合剂（即抗体的混合物）以击中各种病毒靶蛋白质。其它优选的靶包括致癌基因例如跨膜生长因子受体、受体、生长因子、膜连接的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质等。

附图1显示克隆免疫球蛋白重和轻链基因的可变和恒定区的PCR引物的定位。

附图2是抗被膜糖蛋白F105的广谱中和抗体的Fv、sFv和sFv-KDEL的结构图。每条链的三个补体决定区域（CDRs）用阴影显示。

附图3是显示由表达抗被膜糖蛋白广谱中和抗体之Fab片段的质粒转染的COS-1细胞的脉冲探查的放射自显影。

附图4是显示从细胞溶解物或培养基中免疫沉淀12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶显示之蛋白质的放射自显影。

附图5显示转化之细胞的免疫荧光染色。

附图6A和B是显示用HIV-1糖蛋白共沉淀的聚丙烯酰胺凝胶显示之sFv105（A）或sFv  105-KDEL（B）的放射自显影图。

附图7显示在表达sFV或sFV-KDEL的细胞中合胞体形成的抑制作用。

附图8是显示特异性结合到细胞中HIV-1糖蛋白上的具有定位顺序的单链抗体的放射自显影。

附图9是显示未被无关蛋白质共沉淀的针对特异靶的单链抗体的放射自显影。

附图10是显示细胞内被保留的抗-tat抗体不结合HIV-1糖蛋白的放射自显影。

附图11显示在表达sFV或sFV-KDEL的细胞中感染性HIV-1的产生。

附图12显示在SupT细胞中合胞体形成所致的病毒滴度。

附图13是显示在可诱导启动子或CMV启动子控制下用单链抗体稳定转化的SupT细胞的放射自显影。

附图14显示抗体介导的基因转移的策略。

附图15表示抗体-聚赖氨酸结合物的合成。

附图16是显示在可变tat蛋白质浓度下在supT  HIV感染的细胞中表达SFV  F105的放射自显影。

附图17A-D显示用HIV-1感染并用F105sFV稳定转导的CD4supT细胞中gp120表达的FACS分析。

附图18A-D显示在用sFV  F105转导的HIV-1感染的细胞中的表面CD4表达。

附图19显示用HIV-1感染SupT  svector细胞或SupT  sFV105细胞后合胞体形成研究的结果。

本发明涉及击中特定分子（靶分子），尤其是蛋白质例如不希望的蛋白质靶的方法。该方法包括细胞内表达能结合到特定靶（例如靶蛋白质）上的抗体。其中的抗体最好不含有为其分泌编码的顺序。这种抗体将在细胞内结合到靶上。本文中使用的抗体一词指至少能选择性结合到靶例如蛋白质上的免疫球蛋白的部分。抗体从DNA顺序表达，该DNA顺序含有足够数量的编码能结合靶的抗体部分的核苷酸（本文称作抗体基因）。该基因被可操作地连接到能使抗体在有意义细胞中表达的启动子上。启动子是本领域公知的，很容易根据希望作为靶的细胞类型来选择。而且，使用可诱导启动子（也是本领域公知的）在一些实施例中是优选的。例如，当靶蛋白质的功能是其过度表达的结果时。然后通过“开启启动子”，即可以选择性地获得抗体的表达。抗体基因的全部顺序和启动子在本文中描述为抗体暗盒。该暗盒可用以下所描述的多种方法中任何一种允许基因的细胞内传递的方法运送到细胞内。

该暗盒导致抗体的细胞内表达。然后被表达的抗体能结合到靶抗原上。这使得它具有多方面的应用。

几乎任何种类的生物分子都能用作抗原，例如，中间代谢物、糖、脂、内分泌素、和激素以及大分子例如复合碳水化合物、磷脂、核酸（如RNA和DNA）和蛋白质。熟练技术人员能够制得特异结合到小分子和大分子两者上的抗体。例如，对小分子来说，人们通常在免疫之前将该小分子（有时称作半抗原）连接到大分子（有时称作载体）上。该半抗原-载体复合物用作免疫原。因此，将特异地结合到广泛的靶上的抗体是已知的。优选的靶分子包括蛋白质、RNA、DNA和半抗原。更优选的靶是蛋白质，RNA和DNA。最优选的靶是蛋白质。

已报导大量致癌基因的过度表达与恶性细胞转化有关。例如，已报道在COLO320结肠肉瘤细胞培养物、SKBR3乳腺癌细胞系和肺癌细胞系中myc的扩增。已报道在成神经细胞瘤细胞系和成视网膜细胞瘤中N-myc的扩增。也已报道c-abl，c-myb和其它致癌基因与恶性转化有关。参见ch  12“Human  Oncogenes”PP487-543，RNA  Tumor  Viruses，Molecular  Biology  of  Tumor  Viruses  2nd  Ed.，Weiss，R.et  al.，Ed.（Cold  Spring  Harbor  Laboratory（1985））。

也已报道高水平的各种致癌基因的在肿瘤复发中起作用。例如，已报道了neu/c-erbB-2的水平与人乳腺癌的病因和病程之间的相关关系。参见Paterson  M.C.，et  al.，Cancer  Research  51：556-567（1991）;高水平的myc，int-2和hst-1也与乳腺癌有关。相似地，提高的EGF，EGF-R受体水平也表现出与乳腺癌有关（Grimaux，M.，et  al.，Int.J.Cancer  45：255-262（1990））。还报导了与其它肿瘤有关的这些或其它致癌基因的过度表达。

许多致癌基因表现出与涉及细胞生长的基因有某些同源性。例如，参见下表：

表¹

类别  致癌基因  同源细胞基因

生长因子  sis  PDGF-2

int-2  类FGF

跨膜  erbB  EGF受体

生长因子受体  neu(erbB-2,HER-2)

fms  M-CSF受体

ros,kit和其他

膜相关的酪氨酸激酶  abl

膜相关的鸟嘌呤

核苷酸结合蛋白质 src家庭²

fes,fps³

K-,N-和H-ras

胞浆丝氨酸-

苏氨酸激酶  raf/mil

mos

胞浆激素受体  erbA  甲状腺激素受体

核因子  C-myc

N-myc

L-myc

fos

jun

myb,ets,ski和其他

抗致癌基因  RB

其他  bcl-2

bcl-1

int-1

¹.摘自Druker，B.J.，et al.，N.Eng.J.of mol.321：1383-1392（1989）。PDGF指来源于血小板的生长因子、FGF即成纤维细胞生长因子、EGF即表皮生长因子，M-CSF即单核-巨噬细胞生长因子。

².该家族包括src、fgr、yes、lck、hck、fyn、lyn和tkl。

³.这些致癌基因产物的亚细胞定位不确定。

也报导了针对大多数这些致癌基因的抗体。此外，对于致癌基因（有时称作oncs）的过度表达，一些致癌基因要经受从原致癌基因（编码正常蛋白质的正常基因）到致癌基因（由其编码的蛋白质能导致恶性转化的基因）的突变，所说的致癌基因似乎可导致细胞的恶性变。例如，ras基因在残基12、13、和61位上的ras  p21的密码子上的点突变产生了突变体ras  p21蛋白质，该蛋白质与各种肿瘤有关。对这些ras突变体中的许多突变体特异的抗体是已知的。

相似地，病毒蛋白质的表达会导致引起生病甚至死亡的病变。该病毒可以是RNA或者DNA病毒。例如，一种类型的RNA病毒，逆转录病毒被典型地分为三个亚家族，即oncoviruses、spumaviruses和lentiviruses之一的一部分。受到oncoviruses感染典型地与恶性疾病有关。所编码的病毒蛋白质包括gag、pol和被膜蛋白质。在某些例子中，病毒含有编码能使培养中细胞发生恶性转化之蛋白质的致癌基因。Lentiviruses引起一般较慢的和在一个长的潜伏期后引起慢性衰弱性疾病的感染。基因除编码gag，pol和被膜结构蛋白外，还编码各种调节蛋白质。病毒RNA和/或DNA可利用细胞机制产生病毒编码的蛋白质。

例如，HTLV-1是一种逆转录病毒，它是成人细胞白血病一淋巴瘤（ATLL）的病原因子，后者是一种CD4⁺T细胞的攻击性恶性疾病[Poiesz，B.J.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.77：7415-7419（1980）]。由这种病毒表达的病毒蛋白质可导致细胞的转化。就肿瘤发生来说，tax和rex基因和基因产物显得很重要。因此，它们是靶分子的优选基因。

HIV构成lentiviruses的一个家族，包括HIV-1和HIV-2，它们是免疫缺陷病例如获得性免疫缺陷综合症（AIDS）和相关疾病的病原因子[Barre-Sinoussi，et  al.，Science  220：868-871（1983）;Gallo，et  al.，Science  224：500-503（1984）;Levy，et  al.，Science  225：840-842（1984）;Popovic，et  al.，Science  224：497-500（1984）]。

Epstein-Barr病毒与许多肿瘤相并联，例如在免疫抑制的个体中选择性突发Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌和B-淋巴瘤[Zur  Hausen，H.，Science  254：1167-1173（1991）]。

乙肝病毒与肝细胞癌相关联[Zur  rlausen，同上]。特别是似乎涉及到该病毒的Ⅹ开放读码结构[见上]。因此，以这个区域或这个区域的表达产物为靶的抗体在本发明的方法中是优选的。

乳头状瘤病毒与anogentital癌相关联[见上]。在这些病毒中，似乎涉及E₆和E₇基因并且会是好的靶。

通过细胞内结合到核酸例如DNA前病毒上，可阻止或抑制病毒整合到细胞中。通过结合到病毒RNA上，可以干扰病毒蛋白质的表达。已对抗核苷酸抗体进行了广泛地研究[Van  Es，J.H.，et  al.，J.of  Immun.149：2234-2240（1992）;Brigido，M.M.et  al.，J.of  Immun.150：469-479（1993）;Stollar，B.D.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  83：4469-4473（1986）;Eilat，D.，et  al.，J.of  Immun.141：1745-1753（1988）;Brigido，M.M.，et  al.，J.of  Immu.146：2005-2009（1991）]。而且这些抗体具有相同的基本特性。

可以使用标准技术产生和/或筛选这些抗体，例如使用核酸顺序（例如RNA）筛选含抗体的文库[Tsai，D.E.，et  al.，J.of  Immun，150：1137-1145（1993）;Okano，Y.，et  al.，J.of  Immun.149：1093-1098（1992）;Tsai，D.E.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  89：8864-8868（1992）]。

也可以优先选择和/或设计抗靶并干扰重要核酸结合位点的抗体。例如，灵长类免疫缺陷病毒的TAR成分。该核酸顺序存在于5′LTR中并对TAT有反应性，而导致病毒蛋白质的表达增强。

通过细胞内结合到这些致癌基因和病毒的靶蛋白质上，有可能破坏这种蛋白质的正常功能，从而降低或避免该蛋白质的破坏作用。

例如，结合到将受到进一步处理的蛋白质例如受体蛋白、病毒被膜蛋白如HIV  gp160上，能明显地减少裂解成其活性成分的可能性。又如，衣壳蛋白即HIV衣壳蛋白经加入脂肪酸、十四烷酸后受到共翻译性修饰。似乎十四烷酸参与将衣壳前体蛋白连接到细胞的内表面上。在已被改变以致不能加进这种十四烷酸的HIV前病毒中，该病毒是无感染性的。十四烷基化过程的研究揭示，在从氨基末端起算的2位和从十四烷基化位点算起6-10个氨基酸内的氨基酸残基上需要甘氨酸。因此，在或接近这些位点处结合到蛋白质上的抗体能破坏十四烷基化。

类似地，结合到具有明显外部区域的蛋白质上能掩蔽该蛋白质的作用。

在另一个实施方案中，通过连接到功能障碍受体蛋白上，人们能够阻断可引起细胞功能障碍（例如恶性转化）的不希望的相互作用。

例如，许多蛋白质例如表面受体、跨膜蛋白质等通过内质网（有时称作ER）-高尔基体被加工。这类蛋白质的例子包括neu，被膜糖蛋白例如灵长类Lentiviruses，如HIV-1或HIV-2的被膜糖蛋白。可使用能被运送到细胞这一区域并对特定蛋白质特异的抗体，破坏这种蛋白质的功能而不破坏其他细胞功能。例如由sis和int-2产生的PDFD-12和类FGF因子通过ER。这些因子与许多癌症有关。因此，除了以受体为靶外，还可以使用针对它们的抗体破坏这些生长因子的功能。

生长因子也可以由许多其它恶性肿瘤细胞例如类癌瘤综合症肿瘤的细胞表达，并且这些因子可以是另一种靶。

也可以使用这种方法破坏在某一特定时间不需要的功能。例如，MHC  Ⅰ类和Ⅱ类分子在免疫系统抗原识别中是重要的[Teyton，L.，et  al.，The  New  Biologist  4：441-447（1992）;Cox，J.H.，et  al.，Science  247：715-718（1990）;Peters，P.J.，et  al.，Nature  349：669-676（1991）;Hackett，Nature  349：655-656（1991）]。然而，这种免疫识别，特别是从MHC  Ⅱ类分子的免疫识别会导致例如器官移植物中的问题[Schreiner，G.F.，et  al.，Science  240：1032-1033（1988）]。因此，通过以Ⅱ类分子为靶目标，你可以下调宿主免疫反应。最好在这些分子之加工途径中的不同点上描准这些分子。最好使用抗体基因的可诱导性启动子。

因此，在考虑到特殊的靶之后，技术人员可设计出这一方法的许多变化方式。

例如，HIV-1被膜基因指导称为gp160的前体多聚糖蛋白的合成。可加入能进入内质网的多个N-连接糖来修饰这种蛋白质[Allan，J.S.，et  al.，Science  228：1091-1094（1985）;Robey，W.G.，Science  228：593-595（1985）;DiMarzo-Veronese，F.，et  al.，Science  229：1402-1405（1985）;Willey，R.L.，Cell  Biol.85：9580-9584（1988）]。然后，糖基化被膜蛋白前体在高尔基体内被裂解以产生由外糖蛋白、gp120和跨膜蛋白、gp41组成的成熟被膜蛋白质[Willey，Cell  Biol.Supra;Stein，B.S.，et  al.，J.Biol.Chem.265：2640-2649（1990）;Earl，P.L.，et  al.，J.Virol.65：2047-2055（1991）]。该被膜糖蛋白复合物被固定到病毒粒子被膜上并由gp41通过非共价相互作用感染细胞膜[DiMarzo-Veronese，Science  Supra，Gelderblom，H.R.et  al.，Lancet11：1016-1017（1985）]。在gp120外糖蛋白与CD4受体结合后，病毒与宿主细胞膜融合使病毒进入细胞[Stein，B.S.，Cell  49：659-668（1987）]。gp120/gp41复合物的融合基因区被认为存在于gp41的氨基末端，因为这一区域表现出与其它病毒蛋白质的融合基因区域有顺序同源性[Gallaher，W.R.，Cell  50：327-328（1987）;Gonzalez-Scarano，F.，AIDS  Res.Hum.Retrovir.3：245-252（1987），还因为这一区域的突变将灭活病毒并阻止病毒融合[Kowalski，M.，et  al.，Science237：1351-1355（1987）;KoWalski  M.，et  al.，J.Virol  65：281-291（1991）;McCune，J.M.，et  al.，Cell  53：55-67（1988）]。

当经过加工的gp120和gp41被运输到细胞表面并作为病毒粒子（有时称作病毒颗粒）的一部分被分泌时，该未被裂解的gp160即被输送到溶酶体内进行降解。所说裂解过程通常是相对效率低的。因此，使用使细胞内抗体结合到在内质网腔中新合成的gp160上并抑制它向高尔基体运输的方法可在很大程度上降低被裂解为gp120和gp41的蛋白质的量。因此，所产生的病毒颗粒在其表面上大大减少了gp120和gp41的量。这种颗粒被认为是非感染性的。有关HIV-1gp160/120/41蛋白质的这一讨论对其它被膜蛋白质和经过加工的蛋白质也是有代表性的。在本公开的基础上，本发明使用的技术也可以是已知技术。

此外，免疫缺陷病毒被膜蛋白质还涉及到了疾病的其他方面[DeRossi，A.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.83：4297-4301（1986）]。

例如，细胞培养物的HIV感染一般都引起急性和/或慢性感染。在两种情况下，病毒通过在细胞膜上接芽而产生并逐渐释放。急性感染以细胞致病作用为典型特征，这一点为细胞空胞形成和合胞体形成及后来的细胞溶解所证实[Laurent-Crawford，Virol  185：829-839（1991）。在组织培养中，HIV-1的细胞致病作用包括多核巨大细胞（合胞体）形成和单个细胞溶解[Popovic，M.，Science  224：497-500（1984）;Somasundarin，M.，et  al.，J.Virol  61：3114-3119（1987）]。合胞体形成是由在感染细胞表面上表达的HIV-1被膜蛋白单独介导的[Sodroski，J.，et  al.Nature  322：470-474（1986）;Lifson，J.D.，et  al.，Nature  323：725-728（1986）]。被膜蛋白结合到存在于相邻细胞上的CD4受体上，然后经相似于病毒进入时产生的融合反应，并生的细胞膜融合从而形成异核体。

单细胞溶解也取决于由被膜糖蛋白诱导的有效膜融合，因在gp41氨基末端的某些突变会产生为合胞体形成和单个细胞溶解而减毒的复制感受态病毒[Kowalski，M.L.，et  al.，J.Virol.65，supra（1991）]。也报道了影响gp160前体加工的gp120中的氨基酸变化可减少单个细胞溶解[Stevenson，M.，et  al，J.Virol  64：3792-3803（1990）]，并且单个细胞溶解需要在被感染细胞中有足够高水平的不依赖于病毒蛋白表达或病毒DNA水平的CD4表达[De  Rossi，A.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sco.USA.supra]。

此外，在解释相关的免疫缺陷感染之个体时许多其他个体也涉及到HIV被膜糖蛋白。Siliciano，R.F.等人[Cell 54：561-575（1988）]已证明在严格依赖CD4介导的T细胞摄入gp120的过程中，在gp120存在下CD4⁺gp120特异性克隆的亚群出现细胞溶解活性并溶解末被感染的自体CD4⁺T细胞。因为gp120可从感染细胞中排出，所以在AIDS病人中这种CD4依赖性自溶机制可归于CD4⁺T细胞的极度耗竭。Kion，T.A.等人[Science 253：1138-1140（1991）]和Hoffman，G.W.等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3060-3064（1991）已证明在HIV-1感染中可形成自家免疫个体基因型网络，该网络导致杀伤CD4⁺T细胞之自家免疫抗体的形成。由于gp120和Ⅱ类MFIC分子之间的顺序同源性而发展了这种自家免疫机制[Young，J.A.T，Nature 333：215（1988）]。已证明了gp120对CD4⁺T细胞增殖而造成免疫刺激的免疫抑制作用[Hoxie，J.A.，et al.，Science 234：1123-1127（1986）;Diamond，D.C.，et al.，J.Immunol.141：3715-3717（1988）;Gurley，R.J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1993-1987（1989）;Crise，B.，et al.，J.Virol.66：2296-2301（1992）]。这些研究提示，免疫缺陷病例如HIV-1感染可以影响大组织相容性复合物Ⅱ限制的非CD4⁺T细胞丧失依赖性抗原识别。在啮齿动物神经元中，已显示gp120引起细胞内钙和神经毒性的增加[Dreyer，E.B.，et al.，Science 248：364-367（1990）]，这一现象可能是由核的核酸内切酶激活介导的作用。此外，也已提到激活作用诱导的T细胞死亡或apoptosis可发生在体内并且是导致AIDS之CD4⁺T细胞进行性耗竭的原因[Groux，H.，et al.，J.Exp.Med.175：331-340（1992）;Meyaard，L.，et al.，Science 257：217-219（1992）]。在体外和体内，可溶性gp120能与末感染细胞上的CD4受体相互作用，导致未完成的细胞激活并且因而引发apoptosis[Mcconkey，D.J.，et al.，Immunol.Today 11：120-121（1990）;Pinching.A.J.，et al.，Immunol.Today 11：256-259（1990）;Newell，M.K.，et al.，Nature347：286-289（1988）]。有人指出被膜糖蛋白能用作仅与T细胞抗原受体之可变β区域结合的超抗原，从而诱导强刺激作用并扩充该T细胞，接着引起细胞耗竭和无反应性[Pantaleo，G.，et al.，N.Eng.J.of Med.238：327-335（1993）。因此，可以通过减少gp120的量而减轻和推迟与AIDS有关的作用。

如将在本文中详细讨论的，我们已经建立了针对其靶的抗体例如针对被膜糖蛋白的抗体的细胞内表达方法，在细胞内产生结合于靶例如衣壳糖蛋白上的抗体，并阻止进一步加工。本方法是高度特异的，并且对细胞功能无不利影响。因此，包含消除蛋白质之结合抗体能力的单点突变的突变被膜糖蛋白通常在固有表达该蛋白质的细胞中受到加工。相似地，抗其他蛋白质的单链抗体将不影响对被膜蛋白质的加工。因此，本方法学允许使用抗特定蛋白质的特异性抗体，并导致适应特异疾病的加工过程。此外，本发明学可用于预防。甚至可以有处在启动子控制下的抗体，该启动子将被靶（例如HIV  LTR）特异地激活，从而只有当靶存在时才启动抗体表达。其它类型的可诱导性启动子是本领域公知的，并可在本公开的基础上选择和使用之。

本发明抗体的使用不影响其它蛋白质的加工。例如，针对HIV被膜糖蛋白的抗体不结合其它被膜糖蛋白并且不阻止这一蛋白质的加工。例如，无关被膜糖蛋白（例如Bungavirus被膜糖蛋白）的加工将不受影响。我们已显示，用本发明的方法例如通过将针对被膜蛋白的抗体的细胞内输送到被膜蛋白上以产生能在构成上表达该抗体的细胞，导致与来源于亲代细胞的病毒相比，该细胞所产生之病毒颗粒的活性降低1，000-10，000倍。

许多其它位点也可以是靶目标。例如以膜受体的胞浆侧作为靶。通过胞浆尾部发生信号转导[Luttrell，L.M.et  al.，Science  259：1453-1457（1993）;Epstein，R.J.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci  USA  89：10435-10439（1992）]。例如可使用neu/erbB-2受体或G蛋白质受体，以环结构和胞浆尾部为靶目标，从而阻止这种信号转导。例如，最好使用针对被激活之受体例如磷酸化氨基酸的抗体。这样即可减少靶受体库。

抗体将特异地结合到靶例如某种蛋白质上，并能有效地与也将与蛋白质形成复合物的其它分子竞争。为了确保本发明的抗体能成功地与其它分子竞争，它们必须保留抗该靶之完整抗体的至少约75%的结合效率，即具有恒定和可变区域。优选的是，具有至少85%的完整抗体的结合效率。更优选的是具有至少90%的完整抗体结合效率。最优选的是具有至少95%的结合效率。

我们已经研究出一种方法，该方法广泛运用于宽范围的靶分子，包括蛋白质、RNA、DNA、半抗原、磷脂、碳水化合物等，这些将在下面讨论。

靶分子可存在于宽范围的宿主中，例如，动物，鸟类和植物。优选地，该靶是动物，包括人。更优选地，动物种是具有工业重要性的，如家禽、猪、牛、奶牛、绵羊等。最优选地，所说的动物种是人。

尽管抗体具有识别几乎无数外来分子的能力，但本质上抗体只是识别细胞外部结构[Winter，G.，et  al.，Nature  349：293（1991）]。一旦被合成，抗体就被分泌到周围的液体中或继续固定到外细胞膜上[Klein，Immunology，Blackwell  Scientific  Publications，Cambridge，MA（1990）]。我们已经发现了一种表达抗体的方法，该抗体保留特异性结合细胞内靶的能力。

这样，对特定靶的特异性即可利用其免疫系统获得。人们利用靶或其抗原部分或半抗原-载体复合物产生抗体，这可用常规技术来完成。

例如可通过在链的氨基末端的可变重（V_H）和可变轻（V_L）区域的相互作用形成抗原结合或可变区。含有完整结合位点的最小片段为F_V并且是V_H和V_L区的杂二聚体。然而，获得无完整结合位点的结合是可能的。例如，可以仅使用重链结合区获得抗原结合（dAbs，也称为单区域抗体）。如前所述，在本发明中，可以使用编码该抗体片段的基因，与亲代抗体相比只要它保留是弱的结合能力即可。优选的是，至少使用V_H和V_L杂二聚体（F_V）。用X射线结晶分析法确定抗体片段的三维结构已使人们认识到可变区每一个均被折迭成由九股紧密堆集的β片层组成的特征性结构。V_H和V_L区的顺序有所变化，但该结构仍被保持[Depreval，C.，et al.，J.Mol.Biol.102：657（1976）;Padian，E.A.，O.Rev.Biophys.10：35（1977）]。分析抗体一级顺序数据已表明存在两类可变区顺序：高可变顺序和骨架顺序[Kabat，E.A.，et al.，Sequences of protein of Immunological Interests，4th ed，U.S.Dept.Health and Human Services（1987）]。骨架顺序负责V_H和V_L区的正确β片层折迭和使两个区域在一起发生链内相互作用。每一可变区含有三个看上去象环状的高可变顺序。可变区的六个高可变顺序（V_H区3个，V_L区3个）形成抗原结合位点。它被称作互补性决定区域（CDR）。

通过克隆有意义V_H和V_L链的可变区基因，有可能在细菌中表达这些蛋白质并迅速试验它们的功能。一种方法是使用杂交瘤mRNA或脾mRNA作为对这些基因进行PCR扩增的模板[Huse，et al.，Science 246：1276（1989）]。因此，能迅速地筛选抗体以保证它对抗原具有足够的结合亲和性。该结合亲合性（Kd）应至少约为10^-7l/M，最好至少约为10^-8l/M。

附图1显示免疫球蛋白基因和PCR引物的定位。显示轻和重链免疫球蛋白基因有注明的V.D.和J片段和恒定区。图中也描绘了CDR区。PCR扩增的引物可以是如所示对F_V和Fab基因两者进行扩增的RNA或基因组DNA。

在一个优选实施方案中，编码轻链和重链的基因可编码用以制得单链抗体（sFv）的接头。即使在细胞内有时能遇到的还原条件下，该sFv仍会适当地折迭。该sFv一般包括带有顺序V_H-接头-V_L或V_L-接头-V_H的单一肽。选择接头以使重链和轻链以其合适的构象方向结合在一起。如参见Huston，J.S.，et al.，Methods in Enzym.203：46-121（1991），该文献被并入本文作为参考。因此，该接头应能跨越其融合点到可变区之间的3.5nm距离而不扭曲天然Fv构象。构成接头的氨基酸残基必须能跨越这一距离并必需是5个氨基酸或更大。所选用的氨基酸还需被选择以使该接头是亲水的，因而它不会被包裹在抗体内。优选的接头长度应至少约为10个残基，更优选的接头长度应是15个残基。接头不能太短，但也不能太长，因为太长会引起对结合位点的立体化学干扰。因此，它较好是25个残基或更少。接头（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）₃（SEQ ID NO：1）是优选的接头，因它具有足够的揉曲性而可广泛适用于许多抗体。其它接头包括：Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser（SEQ ID NO：2），Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr（SEQ ID NO：3），Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser The Gln（SEQ ID NO：4），Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp（SEQ ID NO：5），Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly（SEQ ID NO：6），Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser Leu Asp（SEQ ID NO：7），和Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp（SEQ ID NO：8）。另外，虽然可使用任何序列并通过诱变使接头中氨基酸随机化，但是可取15-mer接头，例如所说的（（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）₃（SEQ ID NO：1），然后用噬菌体展开载体释出带有不同接头的抗体并筛选所产生的高亲和性单链抗体。

所说基因最好不编码可变链的正常前导顺序。可取的是抗体不编码前导顺序。编码抗体结合部分的核苷酸最好不编码抗体的分泌顺序（即导致抗体从细胞中分泌的顺序）。恒定区中可以含有这样的顺序。较好也不使用编码抗体之全部恒定区的核苷酸。所说基因最好编码恒定区的6个以下氨基酸。

如上所讨论的，可使用常规免疫技术，由免疫系统产生结合到特异分子例如靶蛋白质上的抗体。例如使用蛋白质或其免疫原片段或基于这种蛋白质化学合成的肽。如果需要，可将任何这些序列连接到钥孔血蓝素（KLH）上并用于提高在动物（例如鼠、兔、大鼠和仓鼠）体内的抗体产量。此后，杀死动物，取得其脾脏。使用常规融合技术形成杂交瘤细胞后产生单克隆抗体，参见Kohler，G.，et  al.，Nature  256：495（1975）。该方法一般包括融合抗体生成细胞（即脾细胞）和永生细胞系（例如骨髓瘤细胞）以产生杂交细胞。

制备抗体的另一种方法是使用体外免疫技术，例如使用脾脏细胞，如小鼠脾细胞培养物，注射抗原，然后筛选所产生的抗该抗原的抗体。用这种方法尽管可制得约1μg/ml，但只需使用少至0.1μg的抗原。为进行体外免疫接种，收获脾细胞例如小鼠脾细胞，并在培养基中以所需量（例如1×10⁷个细胞/ml）加上抗原（浓度通常在1μg/ml左右）一起保温。然后根据滤膜免疫噬斑检测的结果向细胞培养物中加入几种佐剂之一。这些佐剂包括N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-谷氨酰胺[Boss，Methods in Enzgmology 121：27-33（1986）]。鼠伤寒沙门氏菌促细胞分裂剂[Technical Bulletin，Ribi Immunochem.Res.Inc.，Hamiton，Montana]或者T细胞条件培养基可用常规技术产生[参见Borreback.Mol.Immunol.21：841-845（1984）;Borrebaeck，C.A.K.，J.Immunol.136：3710-3715（1986）]或者从商业途径获得，例如从Hannah  Bilogics，Inc.或者Ribi  Immunochem.Research  Inc.获得。脾细胞与抗原一起保温4天后收获之。然后在例如微量滴定板中的抗原-硝化纤维素膜（如从Millipore  Corp.购得的）上保温体外免疫之小鼠脾细胞的单细胞悬液。使用抗体的标记物例如辣根过氧化物酶标记的第二抗体，例如兔抗小鼠IgA，IgG和IgM检测所产生的抗体。在检测被分泌的抗体异型中，可使用生物素化的兔抗小鼠重链特异抗体（例如从Zymed  Lab.，Inc.获得的），然后使用辣根过氧化物酶-抗生物素蛋白试剂（例如从Vector  Lab获得的）。

促酶反应的可溶性产物在膜上可作为蓝色噬斑被看到。例如使用放大25倍的显微镜记数这些噬斑。微滤膜噬斑的消化纤维素膜很容易吸收各种抗原，而且最好选择用于洗涤步骤的过滤单位，因为它有利于噬斑点检测。

然后，可用常规技术筛选抗体以找出有意义的抗体。培养并诱导含有有意义抗体的培养物，使其上清液通过滤膜如0.45微米滤膜），然后过柱例如抗原亲和柱或抗tag肽柱。使用小凝胶过滤技术试验结合亲和性。如参见Niedel，J.，Biol.Chem.256：9295（1981）。

也可以运用第二种检测法如使用偶连有例如抗兔IgG之磁性珠的放射免疫试验，从被兔抗tag肽抗体结合的¹²⁵Ⅰ标记抗原中分离出游离的¹²⁵Ⅰ标记抗原。另一种优选的方法是使用例如基于生物传感器的分析系统（如从Pharmacia Biosensor AB获得的“BIAcore”）测定“开启”速率和“关闭”速率[参见，Nature  361：186-187（1993）]。

该后一技术最好在体内免疫时使用，因为体内方法一般每支小鼠每次须注射约50μg抗原，并且对体内方法来说通常在初次免疫之后有两次加强免疫。

另外，可以使用针对靶蛋白质的已知抗体。因此，人们能获得针对希望的靶蛋白的抗体。然后按下述方法合成至少针对抗体之抗原结合部分的基因。优选的基因将不含有正常的单一肽序列。在某些优选的实施方案中，它还将编码细胞内定位顺序，例如编码内质网，核、核仁等的定位顺序。如果想在ER正常抗体分泌系统（例如内质网，高尔基体）中表达，就需要使用一个引导顺序。为在特定位置保留这些抗体，可使用某一定位顺序例如KDEL顺序。在某些实施方案中，抗体基因最好不编码功能性分泌顺序。

可基于本说明书采用公知的技术制备抗体基因。

使用这些抗体中的任何一种，可以构建V_H和V_L基因。例如，从已用上述体外免疫技术或常规体内免疫法免疫的脾细胞和已产生的或商业上购得的杂交瘤细胞系产生V_H和V_L文库。也可以使用商业上获得的V_H和V_L文库。一种方法包括使用脾细胞以获得mRNA，然后借助cDNA进行基因合成。可使用简并性N末端V区引物和J区引物或V_H家族特异性引物（如小鼠-12，人-7），以PCR技术扩增可变区，从而合成cDNA。

例如，可以克隆针对HIV-1被膜糖蛋白广谱中和性抗体（例如F105）的V_H和V_L区的基因[Olshevsky，et al.，J.Virol.64：5701-5707;Thali et al.，J.Virol.65：6188-6193（1991）;Posner，et  al.，J.Immunol，146：4325-4332（1991）]，并测定其碱基顺序。可按照已知方法使用Oligo  dT引动和Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶合成第一股cDNA。然后用该第一股cDNA完成PCR反应。应使用典型的PCR条件，例如25到30次循环以扩增免疫球蛋白基因的cDNA。然后完成DNA顺序分析[Sanger，et  al.，PNAS  USA  79：5463-5467（1977）]。

重链引物对包括正向V_H引物和反向J_H引物，每一引物均含有方便的克隆限制性位点。可以使用例如基于免疫球蛋白的Kabat数据[Kabat，et al.，supra]分析在七个不同的人V_H家族中发现的氨基酸和密码子的分布。为此，设计了35碱基对的通用5′V_H引物。例如可以使用引物TTTGCGGCCGCTCAGGTGCA（G/A）CGTCTCGAGTC（T/C）GG（SEQ ID NO：9），该引物简并了两个位置上的两种不同的核苷酸，并将退火到FR1顺序的5′末端上。为克隆已扩增的DNA可引入一个限制性位点例如5′NotⅠ位点（左边下方划线者），该限制性位点被定位在V_H基因第一个密码子的5′端。同样也可以引入第二个限制性位点例如内在XhoⅠ位点（右边划下线者）。

同样，可设计一66碱基对J_H区寡核苷酸以反向引导重链可变区基因的3′末端。例如，AGATCCGCCGCCACCGGCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGAGGTGACCGTGACC（A/G）（G/T）GGT（SEQ ID NO：10）。该引物另外还含有一个编码接头例如（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）₃（SEQ ID NO：1）交换接头的45核苷酸顺序。依据6个人J_H区小基因的核苷酸顺序，该引物含有两个在每一位置上具有两个核苷酸的简并位置。可使用限制性位点，例如可将一个BspEⅠ位点（左侧划下线者）引入交换接头用以与重迭的顺向V_kappa引物进行粘性末端连接。也为进一步的接头交换步骤而引入一个内部BsTEU位点（右侧划下线者）。

使用45核苷酸交换接头的类似策略是在设计中掺入69核苷酸入V_kappa引物。有四个人Kappa基因家族。将退火到FR1顺序之5′末端上的5′Kappa引物GGTGGCGGTGGCTCCGGAGGTGGTGGGAGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTC（G/C）（T/A）（A/C）TGACCCAGTCTCCA（SEQ ID NO：11）在3个位置上是简并的（各有2个核苷酸）。交换接头部分可含有一个用反向引物进行粘性末端克隆所需的BspEⅠ位点，但也可使用其它限制性位点。也可引入一种内部SacⅠ位点（右侧划下线者）以允许完成进一步的接头交换过程。

所设计的反向47核苷酸C_kappa引物（Kabat位置109-113）GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTAACGCGTTGGTGCAGCCACAGT（SEQ ID NO：12）应互补于Kappa链恒定区（Kabat位置109-113）。该引物将退火到Kappa恒定区的5′最末端上。该引物含有处在两个终止密码子前面的内部MluⅠ位点（右侧划下线者）。此外可在串联排列的终止密码子之后引入多个限制性位点，例如BamHⅠ XhoⅠ/XboⅠ（左侧划下线者）。也可设计一个相似的反向核苷酸C-kappa引物例如59核苷酸引物，该引物将含有一个特定细胞内位点的信号，例如羧基末端内质网保留信号Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu（SEQ ID NO：13）（SEKDEL），GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTACAGCTCGTCCTTTCGCTTGGTGCAGCCACAGT（SEQ ID NO：14）。可在串联排列的终止密码子后引入相似的多个限制性位点（BamHⅠ XhoⅠ/XboⅠ）。

在测定了重和Kappa链基因的一级核苷酸顺序并确定了微生物系基因之后，可基于V_H71-4微生物系基因的前导顺序设计PCR引物。例如V_H71-4前导引物TTTACCATGGAACATCTGTGGTTC（SEQ ID NO：15）含有一个5′NcoⅠ位点（划下线都）。该前导引物（P-L）与第二种J_H引物一起用于PCR扩增实验。35碱基对J_H区寡核苷酸设计成含有为在重链可变基因的3′端进行反向引导所需的相同顺序，即TTAGCGCGCTGAGGTGACCGTGACC（A/G）（G/T）GGT（SEQ ID NO：16）。这一引物含有两个简并位置，每一位置上具有两个核苷酸。在决定J区最后氨基酸之密码子3′侧和其相邻位置上的BssHⅡ位点（左侧划下线者）可使V_H基因的3′末端得以方便地克隆。还引入一个内部BstEⅡ位点（右侧划下线者）。用该序列扩增V_L顺序。然后将经P-L（前导引物）和P-CK引物（反向CK引物）扩增的片段克隆到表达载体例如pRc/CMV（Invitrogen）中，并且所得到的重组物含有一种信号肽，V_H链内接头和处于启动子例如CMV启动子控制下的V_L顺序。熟练技术人员能容易地选择出将在所选择的细胞系统例如哺乳动物细胞，更好是人细胞中表达该基因的其它启动子。

可基于本说明书公开的技术用许多已知方法中的任何一种方法制备这一单链抗体。例如，分别用NotⅠ/BspEⅠ和BspEⅠ/XbaⅠ消化V_H/J_HH-ⅠCL和ⅠCL-V_kappa/kappa PCR片段并克隆到使用SURE细菌（Strategy）作为宿主的质粒例如pSL1180（Pharmacia）中。所形成的sFV是经过限制酶消化的，并且该NotⅠ/BglⅡ片段被克隆到位在pET表达载体内pelB信号肽3′侧的NotⅠ/BamHⅠ位点中。然后将所形成的质粒转化到合适的宿主如BL21（DE3）中。适当时间例如在24°用0.2mM IPTG诱导后2到4小时得到质粒片段。并试验它结合其靶的能力，例如gp120结合活性。试验可用常规方法，例如使用gp120（American  Biotechnology，Inc.）包被的ELISA板（Dynatech  Labs）进行ELISA试验和用碱性磷酸酶偶联的亲和柱纯化的羊抗人Kappa链抗体以检测之。用可溶性CD4封闭sFv结合的gp120使其吸附到gp120亲和柱（Affi-Gel，Bio  Rad，Inc.）上并从该柱上洗脱之。

使用V_H71-4前导顺序和J_H-BssH引物PCR扩增含有前导肽和重排之重链基因的无内含子片段。将该片段修成平头并以向前方向克隆到质粒（如pSL1180）中的EcoRV位点上。之后，得到NcoⅠ/BstEⅠⅠ片段，与用NcoⅠ/SpHⅠ消化的pSL1180结合并以三片段连接方式再与例如来自pSL1180之F105sFV的BstBⅠⅠ/SphⅠ片段相连接，以产生V_H71-4/SCA。可使用已修成平头并以向前方向克隆到pSL1180中EcoRV位点上的ICL-V_kappa-SEKDEL PCR产物来构建含有羧基末端SEKDEL顺序的V_H71-4/SCA。该片段经BspEⅠ/XbaⅠ消化后被除去，并以三部分连接方式与NcoⅠ/XbaⅠ消化的pSL1180和V_H71-4/SCA中NcoⅠ/BspEⅠ片段连接，以产生V_H71-4/KDEL。在克隆到pRC/CMV（Iavitrogen）中之前，将一个EcoRⅠ到HindⅢ的转化接头引入到含有两单链抗体的EcoRⅠ消化的pSL1180中。接着得到来自单链抗体的HindⅢ/XbaⅠ片段并将其克隆到经HindⅢ/XBaⅠ消化的pRC/CMV中，以产生pRC/SCA和pRC/KDEL。

参见附图2，它是一个广谱中性抗体F105的FV、sFv和sFv-KDEL结构图。每一链的三个互补决定区（CDRs）被涂以阴影。

可用类似的策略制备实际上的任何其它抗体，例如合用mRNA纯化、单股cDNA合成和使用如上文讨论之V_H和J_H简并引物的PCR扩增技术从抗tat免疫的脾细胞和抗-tat杂交瘤细胞系获得约含350bp的产物。使用与上述用于重链者相同的技术，用上文讨论的V_kappa和J_kappa简并引物从抗tat免疫的脾细胞和抗-tat杂交瘤细胞系获得320bp V_kapa基因产物。一旦获得，则V_H和V_L区即可被用于构建sFv、FV或Fab片段。

优选的靶是受到一般在其中制造蛋白质的内质网加工的。

然而还有预期有更高度细胞内特异性的例子。例如以继后被加工的核蛋白质、RNA、DNA或细胞蛋白质或核酸为靶。例如，病毒编码蛋白质例如Lentiviruses结构蛋白质一般是在胞浆中表达的，而调节蛋白则可在或接近核处表达。因此，最好使用这些靶的定位顺序。我们的抗体可在细胞内输送，在其中表达并结合到靶蛋白质上。

定位序列被分成路线信号、分类信号、保留或抢救信号以及膜拓扑结构-终止转移信号[Pugsley，A.P.，Protein  Targeting，Academic  Press，Inc.（1989）]。例如，为了将抗体导入特异位置，可以使用特异定位序列。例如，内质网的信号：Lys  Asp  Glu  Leu（SEQ  ID  NO：17）[Munro，et  al.，Cell  48：899-907（1987）]Asp  Asp  Glu  Leu（SEQ  ID  NO：18），Asp  Glu  Glu  Leu（SEQ  ID  NO：19），Gln  Glu  Asp  Leu（SEQ  ID  NO：20）and  Arg  Asp  Glu  Leu（SEQ  ID  NO：21）[Hangejorden，et  al.，J.Biol，Chem.266：6015（1991）;细胞核的信号：Pro  Lys  Lys  Lys  Arg  Lys  Val（SEQ  ID  NO：22）[Lanford，et  al，Cell  46：575（1986）]Pro  Gln  LysLys  Ile  Lys  Ser（SEQ  ID  NO：23）[Stanton，L.W.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci  U.S.A.83：1772（1986）;Gln  Pro  Lys  Lys  Pro（SEQ  ID  NO：24）[Harlow，et  al.，Mol.Cell  Biol.5：1605  1985]，Arg  Lys  Lys  Arg（SEQ  ID  NO：56）;核仁的信号：and  Arg  Lys  Lys  Arg  Arg  Gln  Arg  Arg  Arg  Ala  His  Gln（SEQ  ID  NO：25），[Seomi，et  al.，J.Virology  64：1803（1990）]，Arg  Gln  Ala  Arg  Arg  Asn  Arg  Arg  Arg  Arg  Trp  Arg  Gln  Arg  Arg（SEQ  ID  NO：26）[Kubota，et  al.，Biochem.and  Biophy，Res.Comm.162：963（1989）]，Met  Pro  Leu  Thr  Arg  Arg  Arg  Pro  Ala  Ala  Ser  Gln  Ala  Leu  Ala  Pro  Pro  Thr  Pro（SEQ  ID  NO：27）[Siomi，et  al.，Cell  55：197（1988）];细胞浆质间隙区的信号：Met  Asp  Asp  Gln  Arg  Asp  Leu  Ile  Ser  Asn  Asn  Glu  Glu  Leu  Pro（SEQ  ID  NO：28），[Bakke，et  al.，Cell  63：707-716（1990）]。有关以脂质体为靶的内容参见Letourneur，et  al.，cell  69：1183（1992）。可使用十四烷基顺序将抗体导向胞浆质膜上。表1给出了已知N-十四酰蛋白质的序列和它们的亚细胞定位。此外，如下表1所示，可使用十四酰化顺序将抗体导向不同的亚细胞定位例如核区域。也可使用十四烷基化顺序将抗体导入细胞器，例如线粒体和高尔基体。可使用顺序Met  Leu  Phe  Asn  Leu  Arg  Xaa  Xaa  Leu  Asn  Asn  Ala  Ala  Phe  Arg  His  Gly  His  Asn  Phe  Met  Val  Arg  Asn  Phe  Arg  Crs  Gly  Gln  Pro  Leu  Xaa（ID  NO：29）将抗体导入到线粒体基质（Pugsley，文献同上）。有关蛋白质在高尔基体上的定位可参见Tang，et  al.，J.Bio.Chem.，207：10122。例如，已知tat定位于被感染细胞的亚核和亚核仁区。因此，tat抗体最好以细胞的核和/或核仁区为靶。因为该抗体是在胞浆中合成的，所以它不具有前导顺序。为了以核和/或核仁区为靶目标，它确实需要一个定位顺序。优选的核击靶顺序是SV₄₀，优选的核仁靶向区域是tat核仁信号。就病毒如HIV来说，在胞浆中被作为靶目标最好是结构蛋白例如衣壳和gag，在核和核仁区中被作为靶目标的最好是调节蛋白如tat和rev。可使用rev核仁顺序Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg（SEQ ID NO：26）[Kubota，文献同上]以rev作为靶目标。在核或核仁中最好也搜寻例如HTLV-1或HTLV-2的tax。如果可能的话，最好是使用靶蛋白质的定位信号将抗体导向所需要的位置。例如，最好使用具有核仁定位信号的HIV-1 tat蛋白质。

我们的实验已经表明，通过使用定位序列，可以使抗体在它们通常不出现的细胞内区域中得以表达和/或保留。例如，表达后我们在ER中保留了tat抗体。同样，我们也已在胞浆中表达了抗HIV被膜抗体和抗tat抗体。

为了证明单链抗体可以在它们通常不出现的细胞内区域被表达，我们已在胞浆中表达了抗体。例如，使用胞浆表达的抗体，该抗体已在3′末端被修饰以使之包括附加定位信号。例如，为在核中表达或在核中易位所需的SV₄₀核定位信号。例如，重新扩增了通常在ER中表达的，含有被退火到抗体骨架1区域上之新的5′引物的F105单链抗体。

因此，它不含有前导肽，但含有在5′末端上之额外的蛋氨酸作为起始密码子的强的启动开始信号。该引物在5′末端具有HIND  Ⅲ位点，然后是含有Met起始密码子的NcoⅠ位点。该引物的顺序是（SEQ ID NO：57）TTT-AAG-CTT-ACC-ATG-GCC-CAG-GTG-CAG-CTG-CAG-GAG-TCG-GG，并编码（SEQ ID NO：58）Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly。除了那个蛋氨酸（它正在NcoⅠ位点的中间），还有一个附加氨基酸Ala。在用于细菌表达的信号肽的羧基末端，有一个Ala-Met-Ala裂解位点。该裂解位点进入胞浆内正好发生在第二个Ala之后和骨架的第一个氨基酸之前。这样即存在一个可被使用和修饰并可在许多情形下使用的通用引物。例如，其中一种能用合适的核酸内切酶切割而以NcoⅠ位点开始并可将其克隆到细菌表达载体中。相同的引物可被再次用于扩增或得到仍具有HIND Ⅲ位点的扩增材料并用HIND Ⅲ消化之。因此，可具有一个带额外蛋氨酸并在其5′末端有Ala的单链抗体，可将其克隆到载体，例如pRC/CMV表达载体中。用脂感染法（lipofection）转染、用S³⁵蛋氨酸进行放射标记并用抗kappa抗体进行免疫沉淀。我们使用该技术并得以在胞浆中表达抗被膜抗体。可利用这一基本策略并修饰该抗体，使之也具有将表达的抗体转移到所希望的靶上的定位信号。例如，使用一单链抗体（例如tat）并且在其5′末端用一个引物重新扩增之，所说的引物退火到可变区的骨架1区域上，并且具有用于蛋氨酸残基的起始密码子和用于克隆的HIND Ⅲ位点。然后重新扩增该抗体基因，以进行克隆并在pRC/CMV中表达之。此外，进一步修饰该抗体，以使之除了可使用该新的5′引物进行胞浆表达外，该C-末端还含有SV40核定位信号。因此可被在胞浆中表达该抗体，而且我们还使用了例如SV40核定位信号，并运输到核中。

我们已使用了这两种类型的抗体以及两个阴性对照。阴性对照包括从同一骨髓瘤扩增的不同的Kappa链。我们已制得了各种能在胞浆中表达的抗-tat单链抗体构建物。从产生抗tat单克隆抗体的骨髓瘤细胞系得到两种含有不同kappa链的不同单链抗体，并用SV40核定位顺序扩增之。因此，我们制备了在胞浆中表达的有或没核定位信号的单链抗体。为了表明抗体的特异性，还使用了不正确的轻链。已在真核细胞中表达了该抗体的所有四种类型。在这些实验中，将四种不同质粒转染到cos细胞中，并在有或没有共表达tat表达质粒的情况下完成这些实验。在将配体或gp120结合到其上之前KDEL被膜抗体是不稳定的，因此，我们证实在胞浆中可以发生相同的情况。表达的所有四种抗体可带有和没有tat定位。用合并的兔抗小鼠免疫球蛋白免疫沉淀那些放射标记的cos细胞的溶胞产物，并进行放射自显影，结果显示，在有tat蛋白质存在时比没有tat存在时对抗体有更强的免疫沉淀作用。

只要定位信号在抗体中暴露并且其位置不破坏抗体的结合能力，该信号即可以定位在抗体上的任何位置。例如，只要能满足上述条件，它可被置于sFv抗体的羧基或氨基末端上，甚至可在重和轻链之间的接头上。

表1

氨基末端  亚细胞  蛋白质  参考文献

顺序¹定位^a

GCVCSSNP PM_p56^USTRATCXMarchildon,H.A.,et

SEQ ID NO:  al.Proc.Natl.Acad.

30  Sci.USA81:7679-82

(1984)

Voronova,A.F.,et al.

Mol.Cell.Biol4:2705-

13(1984)

GQTVTTPL  PM  Mul.V gag  Henderson,L.E.,et al.

SEQ ID NO:  Proc.Natl.Acad.Sci.

31  USA80:339-43(1983)

GQELSQHE  PM  M-PMV gag  Rhee,S.S.,et al.J.

SEQ ID NO:  Virol.61:1045-53(1987)

32

Schultz,A.,et al.J.

Virol.46:355-61(1983)

GNSPSYNP  PM  BLV gag  Schultz,A.,et al.J.

SEQ ID NO:  Virol.133:431-37

33  (1984)

GVSGSKGQ  PM  MMTV gag  Schultz,A.,et al.J.

SEQ ID NO:  Virol.,supra

34

GQTITTPL  PM  FCL. V gag  Schultz,A.,et al.J.

SEQ ID NO:  Virol.,supra

35

GQTLTTPL  PM  BaEV gag  Schultz,A.,et al.J.

SEQ ID NO:  Virol.,supra

36

GQIFSRSA  PM  HTLV-I gag  Ootsurama,Y.,et al.

SEQ ID NO:  Jpn J.Cancer Res.

37  76:1132-35(1985)

GQIHGLSP  PM  HTLV-II gag  Ootsuyama,Y.,et al.

SEQ ID NO:  supra

38

GARASVLS  PM  HIV(HTLV-III)  Ratner,L.,et al.

39  gag  Nature313:277-84(1985)

GCTLSAEE  PM  牛脑Go  Schultz,A.M.,et al.

SEQ ID NO:  α-亚单位  Biochem.Biophys.Res.

40  Commun.146:1234-39

(1987)

GQNLSTSN  ER  乙肝病毒  Persing,D.H.,et al.

SEQ ID NO:  pre-S1  J.Virol.61:1672-77

41  (1987)

Persing,D.H.,et al.

Science 234:1388-92

(1986)

GAALTIXV  N  多瘤病毒  Streuli,C.H.,et al.

SEQ ID NO:  VP2  Nature326:619-22(1987)

42

GAALTLXG  N  SV40病毒  Streuli,C.H.,et al.

SEQ ID NO:  VP2  supra

43

GAQVSSQK  S,ER  脊髓灰质炎  Chow,M.,et al.Nature.

SEQ ID NO:  病毒VP4  327:482-86(1987)

44

Paul,A.V.,et al.

Proc.Natl.Acad.Sci.

USA84:7827-31(1987)

GAQLSRNT  S,ER  牛肠道病毒  Paul,A.V.,et al.

SEQ ID NO:  VP4  supra

45

GNAAAAKK  G,S,N,C  cAMP-依赖性  Carr,S.A.,et al.,

SEQ ID NO:  激酶  Proc.Natl.Acad.Sci.

46  USA79:6128-31(1982).

GNEASYPL  S,C  calcincurin B  Aitken,A.,et al.

SEQ ID NO:  FEBS Lett.150:314-18

47  (1982)

GSSKSKPK PM,C P60^SFCSchultz,A.M.,et al.,

SEQ ID NO:  Science227:427-29

48  (1985)

a.缩写词：PM，原生质膜;G，高尔基;N，核;C，细胞骨架;S，胞浆（可溶性的）;M，膜

¹.为有便于阅读，表中使用了标准的单字母氨基酸密码，顺序表中给出了使用三字母密码的氨基酸顺序。

为将这些抗体保留在细胞中，表达的抗体最好不含整个恒定区。我们认为正是在此区域中存在特定的帮助抗体内细胞内分泌的顺序。例如，我们已构建了抗被膜糖蛋白的广谱中和抗体，该抗体只含有并不能大量从细胞内分泌的6个氨基酸的恒定区，而分泌抗此蛋白质的未改变的Fab抗体。这种类型的去除该序列的设计很容易在选择和删除编码此抗体的核苷酸中得以完成。虽然本实施例中讨论了广谱中和抗体，但所采用的抗体并不一定是广谱中和的。不一定需要中和作用，但要求抗体能结合到靶上。因此，抗体最好能寻找到保守的并且可接近的分子上的抗原决定基。

此外，当分泌信号被保留时，使用内质网的细胞内保留顺序如KDEL，可保持大多数在细胞内表达的抗体。

我们已发现，表达的sFv抗体将还结合到BiP蛋白质上，它可帮助所得的抗体靶复合物保留在细胞内。

在某些实施方案中，可以采用不保留在细胞中的抗体。例如，可使用抗被膜糖蛋白如F150Fab的Fab。该Fab会结合到位于分泌它们的细胞内和外各种位置上的被膜糖蛋白上。因此，如果靶分子，即本实施例中的被膜糖蛋白并不都结合在一个位置上，即可使用这种可分泌的抗体击中多个位置上的蛋白质。已发现，使用细胞如由F105Fab抗体基因稳定转化的COS细胞，能够获得F105  Fab的基本表达。这些细胞系以约1-3μg/ml的量分泌Fab。采用不同的强化因子和启动子时本行业熟练技术人员可按需要变化此量。如前所述，分泌的Fab可以击中处于不同细胞内位置上的靶分子。此外，Fab也可以击中可能已从细胞中逸出的（细胞外的）靶分子。例如，也可击中正在被加工的被膜蛋白，从而大大降低被加工蛋白质的量，它还可结合到游离病毒粒子上的gp120上并阻止它感染另一CD4受体或未受感染的细胞。例如，已在HIV感染的COS细胞中使用这些F105  Fab抑制了合胞体形成。

作为本文中使用的术语“抗体的基因”可包括重链和轻链区的基因。此外，该基因可操作地连接到启动子或导致共表达的启动子上。允许在哺乳动物细胞中表达的启动子是已知的且包括CMV（一种病毒LTR如鲁斯氏肉瘤病毒LTR），HIV-LTR，HIV-ILTR，SV40早期启动子，大肠杆菌lac  UV5启动子和单纯疱tk病毒启动子。此DNA顺序被描述为抗体暗盒。

可借助任何已知的方法将抗体暗盒输送到细胞内。如参见Miller，A.D.，Nature 357：455-460（1992）;Anderson，W.F.，Science 256：808-813（1992）;Wu，et el.，J.of Biol.Chem.263：14621-14624（1988）。例如可以使用许多技术将含有上述基因如aFv基因的暗盒导向作为靶的特定靶细胞。在下面的讨论中，将讨论编码HIV抗体的sFv基因，该基因可优先引入CD4⁺T细胞。然后，已描述的技术也可容易地用来将抗体基因引入其它细胞，特别是人细胞。例如，采用哺乳动物表达载体，如疱疹病毒载体、腺病毒载体或痘病毒载体、反转录病毒载体以及结合到抗体上的质粒等。可用这些载体以本领域熟练技术人员熟知的标准技术转导细胞。最好使用HIV病毒载体将此暗盒引入细胞中，此暗盒在包装HIV顺序中存在缺陷，但它将优先以HIV敏感细胞为靶目标。此外，可使用在所需靶细胞上有区别地表达该基因的启动子。例如，当靶是HIV感染的细胞时使用HIV-LTR作为启动子。在这种情况下，与感染的细胞相比细胞中的HIV病毒蛋白质如tat可导致抗体表达的增强。

抗体的细胞内表达使其能结合到靶上。这样就破坏了靶（例如蛋白质）的功能，包括不希望有的功能。例如，表达抗被膜糖蛋白之广谱中和抗体的sFv可以细胞内阻断HIV-1糖蛋白的运输并干扰HIV-1糖蛋白与CD4分子的相互作用，以及裂解该蛋白质。我们已克隆出没有任何靶信号的sFv和带有内质网保留信号（KDEL）的sFv抗体。然后将它们细胞内插入到哺乳动物细胞中，例如使用哺乳动物细胞表达载体，但对该抗体构建物来源来说，反转录病毒载体是优选的。另一实例中，使用特异于neu的抗体（它以乳腺组织为靶）可帮助将neu蛋白保留在细胞内。

这些抗体的表达不应伤害细胞。事实上，如果不存在“配基”靶抗体，则可设计抗体而使之降解。例如，带有KDEL保留顺序的抗被膜糖蛋白抗体可在合成之后马上被降解，除非有HIV-1被膜糖蛋白存在以形成抗体-配体复合体。相反，表达的抗被膜糖蛋白的单链抗体不带保留信号则并未被相似地降解，而可在放射标记后在被转染的细胞内检出与抗人免疫球蛋白K链或重链的多克隆抗体形成的免疫沉淀物。在两种情况下，转化的细胞表现出具有正常形态和生长率（如参见图4），它显示经新霉素选择而确认的转化的COS细胞，表达单链抗体或带KDEL序列的单链抗体，从而使之保留在内质网中。该抗体结合到HIV-1gp160蛋白质上并可与抗K或抗gp120共沉淀。即使在4小时追踪样本中也几乎测不到sFv转化细胞的gp120。而在载体转化的细胞中则可测到gp120部分，且在sFvKDEL转化的细胞中可测到较少量的gp120（参见图5）。因此，显示表达的sFv抗体结合到蛋白质gp160上而阻止gp160蛋白质受到进一步的加工。在一优选的实施方案中，还向这种细胞释放了抗gp41抗体，以击中任何gp160蛋白质并裂解之。

另一个策略是在可诱导启动子控制下表达抗体。优选的启动子是可由靶诱导的启动子。例如，可使用病毒LTR如HIV  LTR作为启动子。HIV病毒产生蛋白质，例如tat，该蛋白质可“开启”启动子。

如上所述，虽然没有靶存在时，sFv-KDEL产物可迅速被降解，但当有HIV-1糖蛋白存在时便似乎不能被迅速降解。因此，放射标记和免疫沉淀之后，可在聚丙烯酰胺凝胶上看到sFv-KDEL带。虽然检测到一小部分gp120，但该蛋白质也与HIV-1糖蛋白共沉淀，这提示可能由于新合成的抗体在结合到配基上之前迅速降解而未能完全阻断糖蛋白的运输。对转化细胞中的sFv-KDEL进行免疫荧光染色，共表达HIV-1糖蛋白显示为内质网染色图型，提示抗体在结合到其配基上之后变得稳定并保留在内质网中。

靶蛋白质的存在还帮助抗体折迭成正确的构象状态。这些如前所述的抗体-配基复合物防止靶体以其典型的方式工作。例如，由HIV-1 gp120/41介导的细胞致病融合在细胞内受到抑制。这可用HIV-1糖蛋白表达体pSⅧenv和sFv或sFv-KDEL质粒DNA（以1∶5的比例）共转染CD4⁺Hella细胞或用pSⅧ转染转化的细胞显示出来。具有细胞内抗体的细胞显示明显减少了合胞体的形成，而在用不表达抗体的载体转化或转染的细胞中却未观察到明显减少合胞体形成，从而表明即使sFv-gp120复合物能够到达细胞表面，细胞内抗体仍将通过阻遏HIV_L糖蛋白向质粒膜的运输和/或相邻细胞上HIV糖蛋白与CD4分子的相互作用来抑制细胞致病融合。

再者，这些含细胞内抗体的细胞很少产生传染性HIV-1颗粒。用传染性HIV-1原病毒DNA转染表达细胞内抗体的细胞并可用此转染之细胞的上清液感染CD4人淋巴细胞SupTI。与载体转化的细胞相比，在这样的细胞中观察到显著减慢的感染动力学，虽然从所有这些细胞的上清液观察到可比量的P24活性，这或许表明在没有HIV-1糖蛋白存在时仍可产生非传染性HIV-1颗粒。

这一结果证明可以借助本方法，使用细胞内表达的抗体如基因工程改造的单链抗体去干扰病毒感染如HIV-1感染，并可通过使抗体结合到机能障碍或不期望的基因产物上，来减小不希望有的影响。采用同样的基本策略，将能够干扰其它病毒和代谢性疾病例如由DNA病毒（如单纯疱疹）和RNA病毒（如HTLV-1和2）引起的感染。该方法能用于对抗持久的和/或对其它治疗形式不敏感的病毒。

本方法适于即使是对同一种疾病进行广泛的探讨。例如，抗逆转录酶抗体可干扰蛋白质的模板结合功能[DeVico，A.L.，et  al.J.of  Biol.Che.266：6774-6779（1991）]。抗该蛋白质的抗体是已知的并包括结合在p66组分C末端部分中之序列上的C2003[文献同上]。该抗体还可结合到HIV-2上[DeVico，A.L.AIDS  Res  &  H.Retro  5：51-60（1989）]。可从患者血清中和按上述方法克隆的抗体中筛选这样的抗体。

另一方法是以病毒中的关键性核酸顺序如TAR成分为靶目标。对tat有反应性的tat成分位于信使病毒RNA的5′端。结合到此tar成分上的tat已显示可导致对体外tar抑制转译作用的去阻遏。此外，tar成分增加转录作用，启动作用并可作为转录延伸的抗衰减因子。通过引导抗体抗tar顺序，可抑制tat结合并将显著地降低转录效力。这样会最终导致抑制或减少病毒产生。可使用类似的方法来产生抗rev反应性成分（RRE）的抗体。rev控制病毒结构蛋白质包括衣壳蛋白、复制酶及被膜糖蛋白的合成。该rev蛋白质通过控制细胞质积聚RNA来控制病毒粒子蛋白质表达。无rev活性存在时，小的多切接病毒RNA积聚;有rev时，则有全长度和部分切接的被膜糖蛋白信使RNA的积聚。抗RRE抗体可抑制rev结合到RRE上，并因此抑制rev的主要生物学效应。总的来说，rev蛋白质可借助于调节制造衣壳蛋白、复制酶，和被膜糖蛋白之信使RNA的积聚来调节它们的合成和生产。结构蛋白质信使RNA需要rev蛋白质结合到称作RRE的折迭RNA结构上以从细胞核内易位到细胞质中。用抗rev抗体抑制rev结合会防止病毒由被感染的细胞表达。可以使用基于本公开的已知技术合成这样的TAR或RRE抗体。例如，可以用抗体筛选RNA库以获取所需的抗体。

曾提出肿瘤形成和转移依赖于血管形成（即形成新的毛细血管）[Folkman，et  al.，Origins  of  Human  Cancer：A  Comprehensive  Review，Cold  Spring  Ha-bor  Laboratory  Press（1991）]。例如，已发现人黑素瘤产生几种具有血管形成活性的蛋白质，包括成纤维细胞生长因子（bFGF），转化生长因子α（TGFα），和转化生长因子β[Herlyn，et  al.，Lab.Invest.56：461（1987）]。采用这些蛋白质作为细胞内抗体的靶，可限制肿瘤的形成和转移。

曾提出ras  p21蛋白的12，13或61位上的变化可导致肿瘤形成。使用此突变蛋白质作为细胞内抗体（它可以区分开致癌ras和原ras）的靶可限制肿瘤形成。具有这种特异结合能力的抗体是本领域已知的。

最好采用“合剂”方法（即抗体混合物）处理不期望的病毒蛋白质，从而一次击中各种病毒蛋白并使突变体更难以演化而产生能够避开抗体的功能性蛋白质。例如，优选至少抗被膜糖蛋白和tat的抗体“合剂”。其他“合剂”包括抗逆转录酶，TAR，RRE等的抗体。此类“合剂”可以一起或以共感染方式给药。对于同一细胞内区域靶目标较好不多于约3种蛋白质，最好是不多于约两种。例如，以内质网上的gp160和gp41作为靶。只要另一细胞内靶是在不同的细胞区域，即细胞核对内质网，它也可作为靶而对抗体的产生没有不利影响。一种优选的抗体合剂应是抗至少一种结构病毒蛋白质如衣壳或被膜的抗体和一种抗调节蛋白质如HIV  rev，tat，HTLV-1或tax或抗核酸顺序如TAR或RRE的抗体。

另一种优选的合剂是抗相同靶体，但在各不同细胞内位置上的抗体。为此可使用不同的定位顺序。因此，如果某些靶不是以一个位置结合到抗体上，则可例如在进一步的加工中，使抗体击中随后的靶位置。例如，对于被膜糖蛋白来说，可以使用定位顺序在其加工途径中的许多点上击中蛋白质。此外，可使用多种抗体以击中分子的不同抗原决定基。例如，使用一种抗体击中被膜糖蛋白的CD4结合区，而另一抗体击中gp41的融合原区域。

对HIV编码的蛋白质，优选的载体是具有至少两种抗衣壳或被膜蛋白的抗体和至少一种抗调节蛋白质的抗体。例如，抗gp160，gp41，tat和rev抗体。另一种合剂包括抗病毒mRNA和其编码的蛋白质两者的抗体。

其它优选的HIV编码的靶蛋白是nef，vpr和HIV-1的vpu，以及HIV-2的vpx。更优选的是nef和vpu。例如，存在于细胞浆内以及连在胞浆膜内表面上的nef蛋白质。该蛋白质通过将十四酸加到氨基末端的次末端甘氨酸残基上而受到共转译修饰。已发现vpr蛋白质被掺入到衣壳病毒中。vpu蛋白质位于细胞的胞浆内并可与亚细胞细胞器相连。抗上述蛋白的抗体可按本文描述的方法制备。另外，本领域熟练技术人员可基于本公开通过选择合适的定位顺序，确定上述特定靶蛋白质。

因此，使用上述方法学，可以治疗患有由特定蛋白质的表达或过度表达引起之疾病的哺乳动物，特别是人。可以使用此方法治疗病毒和代谢性疾病。可以治疗受病毒如HIV、HTLV-1、HTLV-2、疱疹病毒感染的患者。同样，可以治疗患有由高含量的一种多各种蛋白质，一种改变的蛋白质或其组合引起的恶性肿瘤或对恶性细胞转化敏感的患者。例如，可以用特定结合到抗原上的抗体击中至少一种抗原。在允许细胞内表达的条件下向对表达不希望存在的靶抗原敏感的细胞释放有效量的能表达抗体的基因。此方法可用于预防目的以防止或使这种细胞更难于受不希望的抗原的有害影响，例如，通过防止对蛋白质的加工，通过这些蛋白质与其它蛋白质的相互作用，以及通过整合病毒进入宿主细胞等。有许多靶存在时，优选的靶是由内网加工的蛋白质。可以采用如上所述的基因治疗技术来实现任何一种抗体基因的细胞内释放。抗体可以是上述的任一种抗体。本文讨论利用该系统向病毒感染的哺乳动物，例如感染HIV病毒的人体内释放抗体基因。但应当明确的是，根据本公开这种方法也很容易为其它系统，例如带有恶性转化之细胞的个体所接受。

HIV可感染CD4阳性人淋巴细胞和其它免疫细胞。用结合到至少一种HIV编码的靶分子（例如，蛋白质）上的抗体击中这些细胞，有可能治疗受病毒感染的个体，减慢和/或延缓传染的扩增或为预防目的处理这些细胞使之难以成为被感染的细胞。

可使用任何已知的基因治疗技术向CD4阳性淋巴细胞释放基因。例如，利用细胞特异性基因转移机制，该机制是以受体介导的内吞作用携带RNA或DNA分子进入细胞内[如参见Wu  &  Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432（1987）]。将作为配基的蛋白质耦联到聚-L-赖氨酸上，然后通过强静电相互作用与RNA或DNA（基因）结合形成可溶性复合物。由此可释放基因（即RNA或DNA）到感兴趣的细胞如CD4细胞内。例如，以抗gp120或CD4的抗体作为配基，可以特异地击中这些细胞。的确，这种体内基因转移方法除了作为载体将治疗基因送到HIV感染的细胞中或是受HIV感染的细胞外，还可保持其中和活性。已发现，在与细胞表面上表达的gp120或CD4结合之后抗体的内在化是高度有效的。

用试剂如琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP）修饰后，用于击中这些细胞的抗体可通过双硫键连接而偶联到聚赖氨酸上形成抗体-聚赖氨酸结合物。抗体-聚赖氨酸结合物与载送抗体暗盒的部分混合以产生抗体-聚赖氨酸-基因复合物，其中所说的抗体暗盒即是含有可偶联到启动子如质粒或载体上的抗体的DNA顺序（图14）。优选具有平均链长约为60至500个赖氨酸单体的聚赖氨酸。更优选具有平均链长约为90至450个赖氨酸单体的聚赖氨酸。

如前所述，与抗体的连接可用SPDP完成。首先将二硫代吡啶基团借助SPDP引入抗体或聚赖氨酸中，然后可将聚赖氨酸上的该基团还原得到游离硫氢基化合物，它与如上所述修饰的抗体混合后，反应得到所需的二硫键结合物。这些结合物可由常规技术如用阳离子交换层析法纯化。例如使用Pharmacia  Mono  S柱，HR10/10（如参见图15）。然后在允许结合的条件下将这些结合物与抗体暗盒混合。例如在25℃下保温1小时。然后通过具有所需的分子量限制度的膜对0.15M盐水透析24小时。这类膜可从例如Spectrum  Medical  Industries，Los  Angeles，California得到。

为了处理作为靶的细胞，可借助注入哺乳动物宿主内的被转导细胞将这些载体在体外引入该细胞或可将载体注入哺乳动物宿主如人体内，在其中它将与CD4细胞结合并然后被摄入。为增加基因在体内表达的效力，抗体暗盒可以是游离基因（episomal）之哺乳动物表达载体的一部分。例如，含人Pappova病毒（BK）复制原点和哺乳动物细胞中染色体外复制所需之BK大T抗原的载体，含Epstein-Barr（EB）病毒复制原点和允许高拷贝游离基因复制之核抗原（EBNA-1）的载体。也可使用其它哺乳动物表达载体如疱疹病毒表达载体，或痘病毒表达载体。可从许多来源如Invitrogen  Corp.得到这些载体。借助标准技术将抗体暗盒插入表达载体中，例如使用限定性核酸内切酶并将其插入到这些哺乳动物表达载体的特定位点中。可将这些表达载体与抗体-聚赖氨酸结合物混合并可按本文所述方法制得含抗体暗盒复合物的抗体-聚赖氨酸-表达载体。可注入足够量的这些载体以获得血清浓度在约0.05μg/ml至20μg/ml之间的抗体结合物。较好是约为0.1μg/ml至10μg/ml。最好是约为0.5μg/ml至10μg/ml。

这些载体可通过各种给药方法中的任一种方法给药，例如胃肠道外注射包括（肌肉内（I.M），腹膜内（I.P）、静脉内（I.V）、皮内（I.C）或皮下（S.C）注射，以及经口或其它已知的给药途径给药。其中非胃肠道外注射一般是优选的。

这些材料可以任何方便的方式给药，例如，它可与惰性载体如蔗糖、乳糖或淀粉混合。它可以被制成片剂、胶囊和丸剂。对于胃肠道外给药来说，典型的是将其制成含医药学上可接受的胃肠道外给药载体如生理盐水的无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳液以注射给药。

下列实施例进一步举例说明本发明。这些实施例旨在帮助理解本发明而不构成对本发明的限制。

实施例

A.抗被膜糖蛋白之广谱中和抗性的构建和表达

1.cDNA合成和PCR扩增F105免疫球蛋白基因

使用HMMA2.11TG/0细胞系与EBR转化体融合以得到F105杂交瘤，一种非分泌人-小鼠骨髓瘤类似物[Posner，et  al.，J.Immunol.146：4325-4332（1991）]。按照已公开的方法[Gusler.et  al.，Gene  25：263-269（1983）]，在25μl反应混合物中用Oligo（dT）引导和Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶从5μg总RNA合成第一股cDNA。取5-10%的第一股cDNA用于进行PCR反应。用于PCR的温度为：解链94℃，1分钟;引物退火52℃，2分钟;引物延长72℃，2分钟。除退火和延长之间采用2分钟转折（ramp）时间外，均采用1分钟转折时间。进行25-30次热循环。使用溴乙锭染色的2%琼脂糖凝胶分离PCR片段。切下适当的带，清洗掉基因（Bio101，La  Jolla，CA），用Klenow片段修复，用限制性内切酶消化并用于克隆。对每个PCR片段的至少三个不同的转化体使用正向和反向测序引物进行顺序测定。用Sanger的方法进行DNA顺序分析[Sanger，et  al.，J.Mol.Biol.183：161-178（1980）]。

2.PCR引物设计

重链引物对由正向V_H引物和反向V_H引物组成，它们各含有用于克隆的方便的限定性位点。用免疫球蛋白的Kabat数据库分析见于6个不同人V_H家族的氨基酸和密码子[Kabat，et al.，文献同前]。根据此分析结果设计35碱基对通用的5′V_H引物TTTGCGGCCGCTCAGGTGCA（G/A）CTGCTCGAGTTC（T/C）GG（SEQ ID NO：9），它在两个位置简并2种不同的核苷酸并将其退火到FR1顺序的5′末端上。已引入5′NotⅠ位点（左侧划下线部分）以便克隆扩增的DNA并使之定位于V_H基因之第一个密码子的5′侧。也已引入了内部XhoⅠ位点（右侧划下线部分）。

同样，已设计了66碱基对J_H区寡核苷酸用于重链可变区基因之3′端的反向引导，AGATCCGCCGCCACCGCTCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGAGGTGACCGTGACCC（A/G）（G/T）GGT（SEQ ID NO：10）。该引物另外还含有编码（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）₃（SEQ ID NO：1）链间接头的45核苷酸顺序。根据这6个人J_H区小基因的核苷酸顺序，该引物含有两个在种位置带两个核苷酸的简并位置。在链内接头中引入BspEⅠ位点（左侧划下线部分）以便与重叠V_kappa引物进行粘性末端连接。还引入了内部BstEⅡ位点（右侧划下线部分），用于进一步的接头交换试验。

相似的策略是使用45核苷酸链内接头，将其掺入到69核苷酸之人V_kappa引物的设计中。有四个人V_kappa基因家族。5′V_kappa引物GGTGGCGGTGGCTCCGGAGGTGGTGGGAGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTC（G/C）（T/A）G（A/C）TGACCCAGTCTCCA（SEQ ID NO：11）退火到FR1序列的5′端上，它在三个位置上有简并（各2个核苷酸）。链内接头部分包含BspEⅠ位点以便与反向J_H引物进行粘性末端克隆。也已引入了内部SacⅠ位点（右划线部分），用于进一步的接头交换试验。

设计出反向47核苷酸的C_kappa引物（Kabat位置109-113）GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTAACGCAACGCGTTGGTGCAGCCACAGT（SEQ ID NO：12），该引物互补于Kappa链的恒定区（Kabat位置109-113）（Kabat）。该引物将退火到Kappa恒定区的最5′末端。该引物含有内部MluⅠ位点（右侧划下线者）用于加工两个中止密码子。此外在串联中止密码子之后引入多个限制性位点（BamHⅠ/XhoⅠ/XbaⅠ）（左侧划下线部分）。还设计了类似的含羧基末端内质网保留信号Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu（SEQ ID NO：13）（SEKDEL）的反向59核苷酸C_kappa引物GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTTGGTGCAGCCACAGT（SEQ ID NO：14）。类似的多限制性位点（BamHⅠ/XhoⅠ/XbaⅠ）（划下线部分）在串联中止密码子之后引入。

测定F105重链和Kappa链基因的一级核苷酸顺序并鉴定基因系基因之后，基于V_H71-4（Lee，et al.，J.Mol.Biol.195：761-768（1981））菌系基因的前导顺序设计PCR引物。V_H71-4前导引物TTTACCATGGAACATCTGTGGTTC（SEQ ID NO：15）含5′NcoⅠ位点（划下线部分）。此前导引物用于与第二个J_H引物结合以进行PCR扩增实验。设计35碱基对J_H区寡核苷酸使之包含有用于在重链可变基因的3′末端进行反向引导的相同顺序，即TTAGCGCGCTGAGGTGACCGTGACC（A/G）（G/T）GGT（SEQ ID NO：16）。该引物含有两个各位置上带两个核苷酸的简并位置。BssHⅡ位点（左侧划下线者）作为3′端并紧接在确定J区域之最后氨基酸的密码子上，以便于克隆V_H基因的3′末端。还已引入了内部BstEⅡ位点（右侧划下线者）。

3.F105单链抗体的构建和细菌表达

为了构建细胞表达用的原始F105 sFv，分别用NotⅠ/BspEI和BspEi/XbaⅠ消化V_H/J_H-ⅠCL和ICLV_kappa/C_kappaPCR片段，并克隆到用SURE细胞（Stratagenem，La Jolla，Ca）作宿主的质粒pSL1180（Pharmacia LKB，Biotech.Inc.，Piscataway，N.J.）中。用限制性内切酶消化所得的F105sFv并将NotⅠ/BamHⅡ片段克隆到pET表达载体中的位于3′至pelB信号肽间的NotⅠ/BamHⅠ位点中。将所得的pETpelB F105sFv质粒转化到BL21（DE3）宿主中。该sFv105蛋白质被抗人重和轻kappa链的抗血清识别。如使用ELISA检测法（其中gp120固定在塑料表面上）所确定的，该蛋白质结合到纯化的gp120上。在24°用0.2mMIPTG诱导24小时后得到周质部分，并使用gp120（American Biotechnology，Inc）包被的ELISA板（Dynatech Labs，Inc.，Chantilly，VA）和用碱性磷酸酶偶联的亲合柱纯化的羊抗人Kappa链抗体（Fisher Scientific）以ELISA法检测gp120结合活性。F105sFv结合的gp120被可溶性CD4阻断，由此显示CD4具竞争性，可吸收到gp120亲合柱上并可从该柱上（Affi-Gel，BioRad.Inc.）洗脱下来。

4.有或没有内质网保留信号的F105单链抗体的构建和真核表达

用V_H71-4前导顺序和J_H/BssHⅡ引物来PCR扩增含前导肽和重排链基因的无内含子片段。将该片段以正向平端克隆到pSL1180的EcoRV位点中。随后，获得NcoⅠ/BstEⅡ片段，并与来自pSL1180的F105sFv的BstEⅡ/SphⅠ自然结合，以三片段连接方式与NcoⅠ/SpHⅠ消化的pSL1180连接以产生V_H71-4/SCA。为构建含羧基末端SEKDEL顺序的V_H71-4SCA，将ⅠCL-V_kappa-SEKDEL PCR产物以正向平端克隆到pSL1180的EcoRV位点上。用BspEⅠ/XbaⅠ消化去除该片段，并与V_H71-4/SCA的NcoⅠ/BspEⅠ片段结合，再以三片段连接方式连接到NcoⅠ/XbaⅠ消化的pSL1180上以产生V_H71-4/KDEL。在克隆到pRC/CMV（Invitrogen）中之前，将使EcoRV转化为HindⅢ的接头引入含有两个单链抗体的EcoRⅠ消化的pSL1180中。之后，获得来自两单链抗体的HindⅢ/XbaⅠ片段并克隆到HindⅢ/XbaⅠ消化的pRC/CMV中以产生pRC/SCA和pRC/KDEL。

参见附图2，它是Fv、sFv和sFv-KDEL结构图。各链的三个互补决定区（CDR）为划斜线部分。

5.其它被膜抗体的构建和表达

采用相同的基本方法生产和表达抗被膜糖蛋白的其他两种广谱中和单链抗体。这些PCR引物对V_H为正向引导，对V_kappa为反向引导，并且其结果是现在J_H的24个氨基酸，V_kappa的24个核苷酸和24个碱基对的链内接头已被扩增。

一种这样的抗体是由抗gp120上的CD4增强抗原决定基的1.7b人单克隆抗体衍生的单链抗体。基因分析已确定该1.7b单克隆抗体的重排重链是由V_H1236菌系基因衍生的。使用抗V_H1236前导肽之前导顺序的重链引物。用此引物，（SEQ ID NO：59）TTT-AAG-CTT-ACC-ATG-GAC-TGG-ACC-TGG-AGG与3′末端的平端化的重链J_H引物（SEQ ID NO：60）TGA-GGT-GAC-CGT-GAC-CAG-GGT结合，以扩增包括其前导顺序的重排的重链。以相似方法扩增kappa链。我们使用上述的重叠延伸法，组装了抗gp120上CD4增强位点的单链抗体。

此外，我们使用了抗DP-35菌系基因之前导顺序的前导引物。该重排的菌系基因被用于制得抗gp120上CD4结合位点的单克隆抗体21H。

使用21H前导引物与J_H引物结合。用J_H平端引物（SEQ ID NO：61）TTT-AAG-CTT-ACC-ATG-GAG-TTT-GGG-CTG-AGC-TGG扩增21H单克隆抗体的重排重链。此外，使用适当设计的λ轻链引物扩增该21H单克隆抗体的重排轻链。将两种纯化的PCR产物与适宜的链间接头一起用于重叠延伸。上述接头已被修饰以含有用于组装在真核细胞中表达之21H单链抗体的λ序列。（SEQ ID NO：62）CTG-CGT-CAA-CAC-AGA-CTG-AGA-TCC-GCC是用于扩增21Hλ链的正向引物。（SEQ ID NO：63）CGA-GGG-GGY-RGC-CTT-GGG-CTG是抗最接近之恒定λ区的反向引物，即21Hλ链的3′引物。（SEQ ID NO：64）TTT-TCT-AGA-TCY-TMT-GAA-CTG-ACT-CAG是用于再扩增F105的链间接头的引物，以便用λ可变区置换其中的Kappa可变区。

换言之，如前面的实施例中所示，置入前导肽，前导引物和平端J_H引物以扩增在一个末端具有前导肽而在另一末端有J_H平头片段的重排重链。该前导肽具有HINDⅢ位点。

用5′末端上的引物（SEQ ID NO：65）GGA-ACC-CTG-GTC-ACG-GTC-ACC-TCA和3′末端上的引物（SEQ ID NO：66）TGG-AGA-CTG-CGT-CAT-CTC-GAG-TTC制成带有链间接头的重排重链。1.7b例中用该重排重链与Kappa链结合，以产生带有前导顺序的单链抗体。用于1.7b的引物是（SEQ ID NO：67）GAA-CTC-GAG-WTG-ACG-CAG-TCT-CCA（将其退火到V_kappa区上）和（SEQ ID NO：68）GG-GTC-TAG-ACT-CGA-GGA-TCC-TTA-TTA-ACG-CGT-TGG-TGC-AGC-CAC-AGT（将其退火到Kappa链的紧接恒定区部分）。

将三片段加在一起并经重叠伸延组装后，单链抗体便在5′末端具有HINDⅢ克隆位点并在3′末端具有XbaⅠ克隆位点。按照制造商介绍的方法使用适当的限制性内切酶消化PCR组装的片段，然后将其直接克隆到质粒如pRC/CMV中。

6.突变抗体的构建和表达

采用上述广谱中和抗体之一，可产生突变抗体。可以采用标准诱变技术制得编码重链之可变区如CDR3区中不同氨基酸的cDNA。

先将含免疫球蛋白重链前导肽的F105单链抗体克隆到上述pSL1180克隆载体中。按下述方法学制备这种置换CDR3的抗体。由于抗体已被克隆到NcoⅠ/SphⅠ位点中，故需要除去一些外加的DNA。因此，用SpeⅠ和NheⅠ消化该载体以去除NotⅠ位点。自身连接后，选择出此外加DNA已经筛选而被去除了的集落。所得质粒含有带前导肽的F105单链抗体，该前导肽在相反方向上带有两个接在重链CDR3区侧翼的独特的限制性位点。在CDR3的5′末端存在有独特的EagⅠ位点（SEQ  ID  NO：69）ACG-GCC-GTG-TAT-TAC  TGT-GCG  CGA，并在重链CDR3的3′末端存在BstEⅡ位点（SEQ  ID  NO：70）TGG  GGC  CAG  GGA  ACC-CYG-GTC  ACS  GTN  WCC。用EagⅠ和BstEⅡ消化载体并在其中克隆CDR3区的文库。用PVU2消化所得的转化体并根据PVU2消化后电泳图形的改变将突变抗体与野生型区别开。重链CDR3中存在独特的PVU2位点，因此在突变抗体中此位点被破坏。这样，此电泳图形将不同于含有野生型CDR3（其包含PVU2位点）的野生型抗体。

为了构建合成的COR3而使用3个引物。5′引物含有EagⅠ位点（SEQ  ID  NO：71）（GC-ACA-CTA-ATA-CAC。3′引物含有BstEⅡ位点（SEQ  ID  NO：72）GT-GAC-CGT-GAC-CGG-GGT）。CDR3包括NNSX15的简并顺序，其中N为任意一种核苷酸且S为C或G。这样就最大程度地减少了终止密码子的数量并得以在15个位置上表达所有20种氨基酸，即（SEQ  ID  NO：73）G-GCC-GTG-TAT-TAC-TGT-GCG-CGA-NNS-TGG-GGC-CAG-GGA-ACC-CCG-GTC。用激酶活化这三个肽并按上述方法退火之后，所得产物肽具有侧接CDR3于骨架核苷酸上并含有开放限制性位点的双股顺序。CDR3本身仍是单股的。使细菌聚合酶能够充填入缺口（参见Cwirla，S.E.，et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：6378：6382（1990））。

可以实现这一目的的另一方法是PCR扩增，我们使用两个短的聚合物作为退火聚合物而制得的同样的寡聚体，扩增之后使之成为跨越CDR3的长寡核苷酸，可用EAGⅠ和BstEⅡ消化该大的寡核苷酸，然后使用标准分子生物技术连接之。

经PVU2消化而产生独特的CDR3突变体。然后经HINDⅢ-XbaⅠ消化除去整个抗体暗盒连同克隆位点。然后对这些突变体进行凝胶纯化，洗下基因并克隆到已用HINDⅢ和XbaⅠ消化的pRC/CMV中。再按前述方法将这些产物质粒经脂转染作用转染到COS细胞中。然后筛选对被膜糖蛋白具有不同结合亲和力的突变体。

采用上述技术，产生6种突变的sFv105抗体，其中重链的CDR3中的氨基酸已被随机氨基酸取代。

这6种突变体中的一种定名为R，其具有编码（SEQ  ID  NO：74）Leu-Thr-Leu-Ile-Ser-Ser-Arg-Leu-Arg-Leu-Ile-Ala-Val-Arg-Met的CDR3区域。

这6种突变体不能结合到HIV-1被膜蛋白质上。

7.抗被膜糖蛋白之Fab中和抗体的构建

还生产出能在COS-1细胞中产生高滴度人Fab片段的真核表达载体。该载体是以上述的pRC/CMV载体为基础，但其中Fd重链和轻链被串联克隆并且各链处在不同的CMV启动子控制之下。载体还含有为稳定地转染所需的新霉素基因。图3显示用表达F105重（H）和轻（L）链之Fab片段的质粒转染的COS-1细胞的脉冲追踪。图3中，前3个泳道为细胞溶胞产物，而第二组3条泳道是来自细胞培养基。每组均保温2、3和4小时。用³⁵S-Met标记30分钟后，在指定的保温时间收集细胞溶胞产物（l）和培养基（M）并用抗人IgG和抗人Kappa链抗体的混合物获得放射免疫沉淀物。图3所示的脉冲追踪实验表明，在细胞内已发现高含量的F105的Fab片段，此外，Fab片段还主动地分泌到培养基中。来自F105Fab转染的COS-1细胞的细胞溶胞产物和培养物上清液在ELISA测定中与gp120结合，并且可以用抗IgG重链（图3中FabH）或抗Kappa链抗体（图3中FabK）很容易地免疫沉淀重和轻链。

B.抗Tat单链抗体的构建和表达

采用相同的一般方法学表达抗其他抗原的单链抗体。按下述方法产生抗HIV-1  Tat蛋白质的单链抗体：

1.重链引物

5′正向V_H引物由具有下列顺序的55碱基对的寡核苷酸组成：CCC TCT AGA CAT ATG TGA ATT CCA TGG CCC AGG T C/G A/C A A/G CTG CAG C/G AGTC A/T GG（SEQ ID NO：49）。

在5′末端开始的反向小鼠J_H引物具有下示的顺序：GGGGCGC CTG A/C GGAGACGGTGACC A/G A/T GGT CCC T G/T C/G GCC CCAG（SEQ ID NO：50）。

2.小鼠Kappa链引物

为了PCR扩增小鼠Kappa链（其含有生产单链抗体所需的链内接头），制得下列V_kappa引物：TTTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT G/C A A/C/T ATTCAGCTGACC/A CA G/A T/A CTCCA（SEQ ID NO：51）。

为与上述正向V_kappa引物连接之用，生产两个不同的反向C_kappa引物。其中之一是具有下示顺序的44核苷酸引物：GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGTTGGTGCAGCATC（SEQ ID NO：52）。此引物由Kabat位置110退火至115。

用第二个反向C_kappa引物扩增在其3′末端含有SV40核定位信号的C_kappa链。该引物具下示顺序：GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTAAACCTTACGTTTCTTCTTCGGCGGAGTTACAGTTGGTGCAGCATC（SEQ ID NO：53）。

此引物由Kabat位置110退火至115，其后是具有下列氨基酸顺序的SV40核定位信号：

Thr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val（SEQ  ID  NO：54）。

PCR扩增

在25μg反应混合物中用2-3μg从抗-tat-Ⅲ杂交瘤分离的总RNA借助随机引物退火产生cDNA。将5-10%的单股cDNA与V_H引物和V₁引物结合并如实施例1中所述进行PCR。PCR反应的退火温度为56℃。

为了PCR扩增轻链，将含链内接头的V_kappa引物与C_kappa引物单独合并，或与含SV40核定位信号的C_kappa引物合并。此反应的退火温度为56℃。

为了扩增轻和重链，进行30次PCR。在2%低熔点琼脂糖凝胶上凝胶纯化这些PCR产物。由于先前对Kappa链顺序的分析显示有一个内部BstE-Ⅱ位点，因此必需完成多步克隆程序。首先，将重链PCR产物用Klenow激酶处理以修补末端并确保产生平头末端。然后用XbaⅠ消化重链片段。同样，用Klenow激酶处理有和没有SV40核定位信号的两个不同的Kappa链构建物，接着用XhoⅠ消化。将等摩尔量的这两种片段与已用XbaⅠ和XhoⅠ消化的PSK⁺载体混合。这样即可在极5′和3′末端进行粘性末端克隆，并平端克隆在两PCR产物之间。

成功地克隆重和轻链之后，用BstE-Ⅱ消化质粒DNA并回收约120碱基对BstE-Ⅱ片段，然后再克隆到同样的载体中。这需要去除在平端位点多出来的核苷酸。获得几种克隆并使用上述的V_H，V_kappa引物或V_kappa，C_kappa引物经PCR扩增确定BstE-Ⅱ片段的方向。

为克隆到真核表达载体pRc/CMV（Invitrogen）中，从PSK⁺载体获得XbaⅡ/ApaⅠ片段并克隆到已用同样的限制性内切酶消化的PCR-CMV载体中。为确定从这一构建体获得的抗tat单链抗体的生物学活性，用新的3′引物再次扩增该单链抗体以克隆到P-10-1噬菌质体载体中。连同原V_H引物，使用一新的反向C_kappa引物（ATT AGC GGC CGC TAC AGT TGG TGC AGC ATC（SEQ ID NO：55）。

利用脂染作用（lypofection）将PRC-CMV抗tat单链抗体转染到COS细胞中。发现单链抗体。

第二种抗tat  sFv，它除具有ER定位前导顺序之外与上述tat抗体相同，其构建方法如下：

按已述方法克隆小鼠抗HIV-1 tat杂交瘤细胞系之V_H和V_L区的基因并且进行DNA顺序测定。如上面所述的，用具有附加限制性内切酶位点的重链前导引物（P-L），（SEQ ID NO：75）5′-TTTAAGCTTACCATGAACTTCGGGCTC-3′，和相对于重链可变区之3′末端的反向引物（P-J），（SEQ ID NO：76）5′TG（A/C）GGAGACGGGTGACC（A/G）（A/T）GGTCCCT-3′，通过聚合酶链反应扩增前导顺序和重排的重链顺序。用相对于V_L之5′末端顺序的V_L引物（P-K），（SEQ ID NO：77）5′-GAGCTCGTGCTCAC（C/A）CA（G/A）（T/A）CTCCA-3′，和相对于带有中止密码子之Kappa链恒定区开始端的反向CK引物（P-CK），（SEQ ID NO：78）：5′-GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGTTGGTGCAGCATC-3′来扩增V_L顺序。用完全互补于（P-J）和（P-K）引物并含有内部的链间接头顺序（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）₃的引物扩增93gp链间接头。凝胶纯化三个片段并用Clackson，T.等人的方法[Nature352：624（1991）]经重叠延伸产生抗tat sFv。将组装的抗tat sFv信号顺序克隆到pRC/CMV中并进一步确定该DNA顺序[Sanger，F.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463（1977）]。

C.细胞内抗体抑制功能

1.在哺乳动物细胞中表达抗体的能力

如下所述经瞬间转染COS-1细胞和在构成上表达CD4蛋白质的Hella细胞系（即Hela-CD4）[Madden，P.J.，et  al.，Cell  47：333-348（1986）];McDougel.J.S.，et  al.，J.Immunol.137：2937-2944（1986）]。来确定这些蛋白质在哺乳动物细胞中表达的能力。结果发现大量的sFv105蛋白被抗人重和轻链抗体沉淀，在瞬时表达试验中只检测到很少的sFv105-KDEL蛋白质。

用两种质粒转染COS-1细胞，接着选择对新霉素有抗性的集落得到在构成上表达sFv105和sFv105-KDEL蛋白质的细胞（COS  sFv105和COS  sFv105-KDEL）。

按Chen，S.Y.等人在J.Virol 65：5902-5909（1991）中所述的方法，采用脂染素（lipafectin）（BRL Corp），用10μgpCMV-sFv或pCMV-sFv-KDEL或含有新霉素抗性基因的载体质粒DNA转染35mm平皿中的COS-1细胞。转染两小时后，向细胞中加入1.5ml添加有10%胎牛血清的Dulbecco修饰的Eagle培养基并保温48小时。在含500μg/mlG418（BRL）和10%胎牛血清的DMEM中选择转化的细胞。然后在6孔平板上生长转化的细胞并在0.5ml含100μCi³⁵S-胱氨酸的无胱氨酸培养基中保温30分钟以代谢标记之。洗涤细胞并在含10mM未标记胱氨酸的DMEM中保温。将蛋白质从细胞溶胞产物或培养基中免疫沉淀出来并进行电泳分析（参见图4）。将这些细胞脉冲标记30分钟，示踪并用抗人免疫球蛋白κ链抗体从细胞溶胞物或培养物中免疫沉淀出来。在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白质并经放射自显影观察之（Laemmli，U.K.，Nature 227：680-684（1970）。蛋白质标志物的位置示于图中。泳道1，CMV-COS-1细胞，追踪60分钟。泳道2-5样品由COSsFv105细胞溶胞物免疫沉淀。泳道6-9样品由sFv105-COS的培养基沉淀。泳道2和6追踪30分钟。泳道3和7追踪60分钟。泳道4和8追踪120分钟。泳道5和7追踪360分钟。

在15mm直径用含95%乙醇和5%乙酸在20℃保持5分钟固定的盖玻片上完成对sFv或载体转化之细胞的免疫荧光染色（参见图5A-D）。用抗人κ链抗体着染单用sFv105（A）或单用载体（D）转染的细胞或按Helseth，E.M.等人在J.Virol.64：2416-2420（1990）中描述的方法与10μgHIV-1糖蛋白表达质粒pSVⅢ  env共转染的sFv-KDEL转化细胞，然后加荧光素（FITC）结合的抗兔IgG一起保温。对于ER染色，用抗BIP抗体，接着用抗小鼠IgG-FITC（C）与载体转化的细胞一起保温。加入抗Bip抗体在37℃将载体转化的细胞保温30分钟。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗细胞后，加抗兔IgG-FITC或抗小鼠IgG-FITC保温。最后一次洗细胞后，固定细胞并在带荧光镜片的Nikkon显微镜上放大1100倍观察之。

因此，可确定sFv105蛋白质在细胞内的定位。该抗体着染整个胞浆内的管状网络，特别是ER中的蛋白质（图5A）。这一图形与采用抗ER固有蛋白质免疫球蛋白重链结合的蛋白质（BP）[Wu，G.E.，et  al.，Cell  33：77-83（1983）;Bole，D.G.，et  al.，J.Cell.Biol.102：1558-1566（1986）;Dul，J.L.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：8135-8139（1990）;Knittler，M.R.，et  al.，The  EMBO  J.11：1573-1581（1992）]在亲代细胞中测得的图形相同（图5C）。

2.抗被膜糖蛋白抗体抑制被膜蛋白质生物合成和活性的能力

用高水平表达被膜蛋白质的载体转染COS  sFv105和COS  sFv105-KDEL细胞，测定构成上表达sFv105或sFv105-KDEL蛋白质的细胞系抑制HIV-1被膜蛋白质生物合成和活性的能力。脉冲追踪分析后，免疫沉淀被膜蛋白质显示，4小时追踪期间，大部分的gp160从亲本细胞系的gp120中分出（图6）。虽然在亲本和COS  sFv105细胞中制得相似量的gp160，但4小时追踪后只检出有很小量的gp120（图6）。CDS  sFv105细胞中存在的gp160蛋白质可用抗人Kappa链抗体共沉淀。该抗体不沉淀亲本COS-1细胞系中制得的gp160蛋白质。抗HIV-1被膜糖蛋白的抗体也共沉淀在表达gp160的细胞中的sFv105蛋白质（图6）。

用10μg pSVⅢ env质粒DNA和2μg表达tat的pSVⅢtat（参见Helseth，E.M.，J.Virol.64，文献同上）转染转化的细胞，用³⁵S-胱氨酸脉冲标记30分钟并追踪4小时。用抗κ抗体或多克隆羊或兔抗gp120血清（AIDS Research and Reference Program）免疫沉淀细胞溶胞物。如上所述，在11%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上以电泳法分离蛋白质并按上述方法经放射自显影显示之（参见图6）。图6A显示用多克隆羊抗gp120血清免疫沉淀的细胞溶胞物;图6B显示用兔抗gp120血清免疫沉淀的细胞溶胞物。图6A：泳道1，使用抗κ和抗gp120免疫沉淀自HIV-1模拟转染的sFv105-COS-1。泳道2-4，沉淀自被膜转染的sFv105-COS-1。泳道2，被抗gp120沉淀的。泳道3，被抗κ链抗体沉淀的。泳道4，由抗κ和抗gp120抗体（AIDS Research and Reference Program）沉淀的。图6B，泳道1，用抗κ2链和抗gp120蛋白质抗体免疫沉淀自模拟转染的COS-1。泳道2-3，沉淀自被膜转染的sFv1-5-KDEL。泳道2，由抗gp120抗体沉淀的。泳道3，由抗链抗体沉淀的。泳道4，用抗κ链和抗gp120抗体从105-KDEL细胞中沉淀的。

在COS  sFv105-KDEL细胞中，gp160被加工成gp120的过程受到部分抑制（图8）。图8由聚丙烯酰胺凝胶的放射自显影显示在细胞中sFv105-KDEL特异结合到HIV-1糖蛋白上，表明sFv105-KDEL蛋白质与HIV-1糖蛋白共沉淀。泳道1显示用抗gp120和抗appa链抗血清混合物沉淀的模拟转染之COS-1细胞的溶胞物。泳道2-3显示用被膜表达质粒pSVⅢ  ENV转染之COS、sFv105-KDEL细胞的溶胞物。泳道2是用抗gp120抗血清沉淀的。泳道3是用抗κappa链抗血清沉淀的。泳道4显示用抗gp120和抗κappa链抗血清的混合物沉淀的COS  sFv105-KDEL细胞的溶胞物。gp160的存在增加了由抗人κappa链抗体沉淀之sFv105-KDEL蛋白质的量。抗κappa链抗体也沉淀COS  sFv105-KDEL细胞中存在的gp160蛋白质。表达gp160的抗血清类似于COS  sFv105细胞中sFv105蛋白质的分布（图5B）。最后，sFv105-KDEL通过结合gp160而稳定化。

用抗ER  chaperone蛋白质（BiP）的抗血清进行共免疫沉淀实验。用抗BiP蛋白质的抗血清沉淀sFv105蛋白质。虽然已知免疫球蛋白重链和轻链结合到BiP上[Wu，F.E.et  al.Cell  33：77-83（1983）;Bole，D.G.，et  al.，J.Cell.Biol.102：1558-1566（1986）;Dul，J.L.et  al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87：8135-8139（1990）;Knittler，M.R.，et  al.，The  EMBO  J.11：1573-1581（1992）]，但进行的几个附加试验排除了由于sFv105抗体的非特异活性而抑制gp160加工的可能性。

对表达能结合sFv105之单链抗体的细胞抑制env蛋白突变体加工的能力进行了测定。为此目的，用表达被膜蛋白突变体的质粒转染COS sFv105细胞，所述的被膜蛋白质中370位上的谷氨酸已被谷氨酰胺替代。曾显示该突变体消除可检测的sFv105亲本抗体与被膜蛋白质的结合[Thali，M.C.，et al.，J.Virol.66：5635-5641（1992）]。也用下列材料转染COS sFv105细胞以检测sFv105结合HIV-1被膜蛋白质的特异性：Punta Tora病毒（一种Bunyavirus）的被膜蛋白质或流感A病毒（一种鸟疱疹病毒）WSN毒株的血细胞凝集素。曾显示这两种病毒蛋白质在ER和高尔基体中被加工（Chen，S.Y.et al.，J.Virol.66：5902-5909（1991）;Hughey，P.G.，et al.，J.Virol.66：5542-5552（1992）]。Punta Toro或流感病毒蛋白质都不能用显示共沉淀sFv105HIV-1gp160复合体的抗人Kappa链抗体沉淀。图9，泳道1和2显示与阻断亲本被膜蛋白质在COS sFv105细胞中的加工相反，突变体gp160被膜蛋白被正常地加工成gp120。因此，图9显示sFv105不与无关蛋白质共沉淀。将COS sFv105细胞用10μg突变HIV-1糖蛋白表达体370E/D（它不被F105结合[Thali，M.C.，et al.，J.Vriol.66，同上]）转染后，用³⁵S-胱氨酸脉冲标记30分钟，然后追踪4小时。用抗HIV-1糖蛋白（泳道1）或抗Kappa链抗体（泳道2）免疫沉淀蛋白质。用5M.O.I编码T7聚合酶的牛痘病毒转染COS sFv105细胞2小时，然后用10μg质粒DNA PTV-G1-G2（该质粒DNA含有在T7启动子控制下的Punta Toro病毒的G1和G2糖蛋白的基因[Chen.S.Y.，et al.J.Virol.65，文献同上]），或用质粒T7-HA（该质粒含有在T7启动子控制下的流感A病毒WSN毒株的HA基因[Chen，文献同上]）感染之。然后将细胞用³⁵S-胱氨酸脉冲标记30分钟并追踪4小时。泳道3和4，用抗PTV糖蛋白（Chen，同上）（泳道3）或抗Kappa链（泳道4）抗体免疫沉淀的PTV  G1-G2转染之细胞的溶胞物。图9也显示Punta  Toro被膜蛋白质的加工不受sFv抗体表达的影响（泳道3-6）。

也对其它的不结合gp160的单链抗体干扰被膜蛋白质加工的能力作了检测。使用两种不同的单链抗体。一种这样的抗体是由识别HIV-1tat蛋白质的小鼠单克隆抗体衍生的单链抗体。该抗tat单链抗体已从tat抗体的正常细胞内靶改变成具有以ER为靶的前导顺序。在瞬时表达试验中此抗体还稳定地存留在COS细胞内而不分泌到培养基中。在COS细胞中gp160加工成gp120不受表达HIV-1糖蛋白的质粒与表达抗tat sFv的质粒一起共转染的影响。再者，沉淀抗tat sFv的抗免疫球蛋白抗血清并不共沉淀HIV-1被膜蛋白质（参见图10）。图10显示，细胞内存留的抗tat sFv不结合HIV-1糖蛋白。用10μg pSVⅢenv和10μg pRC/CMV-sFv tat质粒DNA共转染COS细胞，用³⁵S-胱氨酸脉冲标记30分钟并追踪4小时。用抗小鼠免疫球蛋白抗血清（泳道1）或羊抗gp120（泳道2）免疫沉淀蛋白质并用SDS-PAGE分析之。使用了所产生的6种sFv105突变体，这些突变体中重链CDR3区内的所有氨基酸均被随机氨基酸取代并且不与该蛋白质结合。gp160在CDS细胞内加工成gp120不受表达这些突变体蛋白质的质粒共转染的影响。抗免疫球蛋白抗血清并不共沉淀HIV-1被膜蛋白质。

根据检测用被膜基因转染的细胞诱导CD4⁺细胞合胞体形成的能力来确定sFv105和sFv105-KDEL蛋白质抑制被膜蛋白之功能的能力。一组试验中，用表达功能性被膜糖蛋白的质粒转染亲本COS载体细胞以及COS sFv105和COSsFv105-KDEL细胞。转染后两天，将细胞以约1比10的比例与人CD4⁺T细胞系，SupT1混合。SupT1对被膜介导的融合敏感。在表达sFv105或sFv105-KDEL蛋白质的细胞中，被膜介导的合胞体形成的程度减小80-90%（图7）。如经代谢标记并沉淀转染的培养物所测定的，所有三种细胞系中制得的gp160的量相似。用表达功能性被膜蛋白的质粒和第二种表达sFv105或sFv105-KDEL蛋白质的质粒一起共转染Hella CD4⁺细胞系之后，也观察到合胞体形成减少（图7）。相反，当用第二种表达抗tat sFv的质粒时，合胞体形成无明显减少（图7）。

用3μg psFⅢ env和15μg载体或pCMV-sFv或pCMV-sFv-KDEL共转染CD4⁺Hella细胞。转染后的30小时内计数合胞体数。用3μg pSⅧ env转染已转化的细胞，并将细胞保温48小时，然后在PBS中洗细胞并加50mM EDTA在37℃下保温40分钟。从平皿中去除细胞，用PBS洗，并用2ml添加有10%胎牛血清的DMEM再悬浮之。然后向细胞中加入约2×10⁶个SupT1淋巴细胞并在37℃保温12小时，再计数合胞体数。为测定转化的细胞产生的感染性HIV-1，用5μg感染性pSⅧBDNA转染COS、COS sFv105和COS sFv105-KDEL细胞。转染第4天收集细胞的上清液，用1ml上清液接种约2×10⁶个SupT1细胞并保温12小时。然后用DMEM洗细胞两次，12小时后置于添加10%胎牛血清的RPMI中。收集SupT1细胞的上清液并使用对HIV-1p24衣壳抗原蛋白质敏感的放射免疫检测血清（Du Pont-NEN Inc.）按厂商说明检测病毒颗粒的产生。图7显示CD4⁺Hella细胞和表达sFv或sFv-KDEL的转化COS细胞中合胞体形成显著减少。图中显示了在CD4⁺Hella细胞或用pSⅧ Enc转染的载体转化之细胞中观察到的合胞体数量的百分比。

为检测sFv105蛋白质抑制感染性病毒产生的能力，用含有整个病毒基因组拷贝的质粒转染COS载体、COS  sFv105和COS  sFv105-KDEL细胞[Fisher，A.G.，et  al.，Nature  316：262-265（1985），Helseth，E.M.et  al.，J.Virol.64：2416-2420（1990）]。感染后4天，用培养物上清液中的病毒初次感染敏感的指示物细胞系SupT1。所有三种被感染的细胞系的上清液都显示含有相似量的病毒衣壳蛋白，p24。曾显示，在没有被膜糖蛋白合成以及存在有加工缺陷之被膜时，衣壳蛋白可释放到细胞上清液内并因此而保留在ER中[McCune，J.M.et  al.，Cell  53：55-67（1988）;Ratner，L.N.，et  al.，AIDS  Research  and  Human  Retroviruses.7：287-294（1991）]。

图11显示，由来自转染的COS  sFv105或COS  sFv105-KDEL细胞上清液发动的SupT1细胞中的病毒复制，相对于由含有sFv105顺序之外之载体的对照COS-1细胞系产生的病毒发动的复制要延迟5天。图11显示由感染的SupT1细胞产生的病毒产率。感染性pSⅧB  DNA是HXBc2毒株的传染性HIV-1原病毒DNA[Fisher，A.G.et  al.Nature315：262-265（1985）]。用5μg含HXBc2毒株之感染性HIV-1原病毒DNA的pSⅧB质粒DNA转染sFv105或sFv105-KDEL或载体转化的细胞。转染4天后，用SupT1细胞接种来自被转染之细胞的上清液并保温16小时，然后洗细胞，并置于新鲜的培养基中，根据培养基中的gag  p24活性监测病毒衣壳p24蛋白质的浓度。从转染之细胞上清液检测的培养基的量分别为1.2ng/ml（载体-COS），1.0ng/ml（COS  sFv105），和1.4ng/ml（COS-sFv105-KDEL）。图11中的符号代表使用由只含载体的COS对照细胞系（○），构成上表达sFv105蛋白质的COS细胞系（□），以及表达sFv105-KDEL蛋白质的COS细胞系（△）收获的上清液所获得的结果。

当使用上清液的系列稀释液感染SupT1细胞时，合胞体形成减少10³倍以上（图12）。图12显示，SupT1细胞中合胞体形成导致的病毒滴度。用4μg含有HXBc2毒株之感染性HIV-1原病毒DNA的pSⅧB质粒DNA转染已转化的COS载体和COS-sFv105细胞[Ratner，文献同上]。转染48小时后，收集来自被转染细胞的上清液并用连续稀释液感染SupT1细胞16小时，然后洗细胞。8小时后，计数合胞体。数据为合胞体阳性孔数/计数的孔数。各孔计数5个高倍视野（HPF）。对稀释液来说，5个HPF计数中有一或多个合胞体即定为（+）。由COS sFv105细胞产生的病毒复制的延迟和感染性滴度的降低是由于相对于由对照细胞系产生的病毒来说上述病毒的低传染性所致。这些试验结果表明细胞可产生在细胞内具有功能活性的抗体。该抗体被稳定地表达并保留在内质网上且对细胞无毒性。该抗体在细胞内结合到被膜蛋白质上并抑制此主要病毒蛋白质的突变和功能。由表达单链抗体的细胞产生的HIV-1颗粒的传染性已显著降低。

4.细胞内抗体的可诱导性表达

我们克隆了在HIV-15′LTR控制下的F105 sFv并在SupT细胞中建立稳定的细胞系。由图13泳道1可以看出，用表达质粒pSⅧ tat转染稳定的F105sFv LTR SupT细胞之后表达了F105sFv。图13显示用pLTR F105 sFv（泳道1）或pRC/CMV F105 sFv（泳道2）稳定地转化的Sup细胞细胞。再用pSⅧ tat转染SupT LTR F105 sFv细胞。两种细胞都用³⁵S-Cys标记3小时并制备细胞溶胞产物。用抗人Kappa抗血清进行放射免疫沉淀，接着进行15%SDS-PAGE。没有tat蛋白表达时未见到F105sFv。图13中使CMV启动子的泳道2显示，该表达中所用的启动子和细胞是相互依赖的。筛选出许多克隆，但最终并未产生可测到的抗体。使用Jurkat细胞也给出类似的结果。

用不同浓度的tat蛋白质诱导用在HIV-1  LTR控制下之F105sFv稳定转化的上述SupT细胞。图16显示，用少至0.1μg  tat蛋白质即可诱导表达F105sFv。泳道1显示使用10μg  tat蛋白质;泳道2为1μg  tat蛋白质;泳道3为0.5μg蛋白质;泳道4为0.1μg蛋白质;泳道5为0μg蛋白质。图中给出的标志指示sFv105的位置。转化的SupT细胞保留其正常形态和复制率，并可被转导以高水平地表达F105sFv。

按上述方法用HIV-1感染SupT细胞。然后按上述方法用pLTR  F105  sFv稳定地转导之。图17为SupT细胞的FACS分析结果。图17A为阴性对照，显示未被感染的SupT1细胞。图17B为未被转导的SupT  HIV感染的阳性对照细胞。图17C为SupT  HIV-LTR-sFv105转导的HIV感染之SupT细胞的FACS分析结果，图17D为用含有sFv105抗体基因以外之HIV-LTR的载体模拟转染的HIV感染SupT细胞。

图17B-D显示使用20M.O.I  HIV-1的HXB2毒株感染8天后得到的FITC-抗gp120（ABT  Inc）进行的gp120表面染色。如由分析结果看出的，图17D显示SupT细胞染色的一般图形与阳性对照相同（图17B）。相反，用本发明抗体转导的HIV感染之细胞则显示出与阴性对照相似的本底着染（图17A），从而表明表面gp120表达在SupT sFv105细胞中显著减少。

图18A-D着眼于这类细胞中的表面CD4表达。图18A显示阴性对照中的本底染色，而图18B显示使用20M.O.I  HIV-1的HXB2毒株感染8天后得到的FITC-抗gp120（ABT，Inc）进行的gp120表面染色（阳性对照）。图18D显示，在经受如此感染8天后，用HIV-LTR载体模拟转染的SupT  HIV感染的细胞上，CD4的表达显著下调。相反，图18C显示，用在HIV-LTR控制下的sFv105转导的SupT  HIV感染之细胞表面CD4的表达在感染8天后几乎是正常的。因此，这些试验证明，表面CD4的表达在根据本发明的以HIV蛋白质为靶的细胞中未显著下调。实验进一步提示，可以用本发明方法破坏CD4-gp160的细胞内复合体（已知它是在ER中形成）。

图19显示在表达F105sFv的感染CD4  SupT  HIV的细胞中HIV病毒抑制作用的细胞致病效应。（θ）线表示模拟转染的SupT细胞。（△）为阳性对照，显示SupT细胞在上述条件下已被HIV感染。（□）表示SupT细胞已在上述条件下感染并按上述方法在HIV-LTR的控制下用sFv105抗体转导。该图显示按上述方法用20M.O.I.HIV-1的HXBC2毒株感染SupT载体细胞或SupT  sFv105细胞后合胞体形成的结果。感染后11天，在SupT  sFv105细胞中实际上没有合胞体形成。相反，SupT细胞中，4-5天后可见合胞体形成达到峰值。这些实验与上面讨论的缺乏gp120的表面表达相符，提示细胞内抗体的存在可导致对gp120之细胞致病作用的抗性。

整个说明书内引用的参考文献均列入本文作为参考。

已详细地借助其优选实施方案描述了本发明。然而，可以理解，本领域熟练技术人员在考虑本公开之后，可以做出修改和改进而不背离本发明的精神和范围。

序列一览表

(1)一般资料

(i)申请人:MARASCO,WAYNE

HASELTINE,WILLIAM

(ii)发明名称:蛋白质细胞内结合的方法

(iii)序列数:78

(iv)通讯地址:

(A)联系人:DAVIDG.CONLIN;DIKE,BRONSTEIN,

1ROBERTS&CUSHMAN

(B)街道:130WATER STREET

(C)城市:BOSTON

(D)州:MASSACHUSETTS

(E)国家:US

(F)邮编:02109

(v)计算机可读形式:

(A)磁盘类型:Floppy disk

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(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS

(D)软件:PatentIn Release#1.0,Version#1.25

(vi)目前申请资料

(A)申请号:US

(B)申请日:

(C)分类号:

(viii)代理人:

(A)姓名:EISENSTEIN,RONALD I.

(B)登记号:30628

(C)文件号:41956

(ix)联系电话:

(A)TELEPHONE:(617)523-3400

(B)TELEFAX:(617)523-6400

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GGGTCTAGAC TCGAGGATCC TTATTAACGC GTTGGTGCAG CCACAGT   47

(2)SEQ ID NO:13的资料

(i)序列特征:

(A)长度:6个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:13:

Ser  Glu  Lys  Asp  Glu  Leu

1  5

(2)SEQ ID NO:14的资料

(i)序列特征:

(A)长度:59个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:14:

(2)SEQ ID NO:15的资料

(i)序列特征:

(A)长度:24个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:15:

TTTACCATGG  AACATCTGTG  GTTC  24

(2)SEQ ID NO:16的资料

(i)序列特征:

(A)长度:30个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:16:

TTAGCGCGCT  GAGGTGACCG  TGACCRKGGT  30

(2)SEQ ID NO:17的资料

(i)序列特征:

(A)长度:4个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:17:

Lys  Asp  Glu  Leu

1

(2)SEQ ID NO:18的资料

(i)序列特征:

(A)长度:4个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:18:

Asp  Asp  Glu  Leu

1

(2)SEQ ID NO:19的资料

(i)序列特征:

(A)长度:4个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:19:

Asp  Glu  Glu  Leu

1

(2)SEQ ID NO:20的资料

(i)序列特征:

(A)长度:4个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:20:

Gln  Glu  Asp  Leu

1

(2)SEQ ID NO:21的资料

(i)序列特征:

(A)长度:4个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:21:

Arg  Asp  Glu  Leu

1

(2)SEQ ID NO:22的资料

(i)序列特征:

(A)长度:7个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:22:

Pro  Lys  Lys  Lys  Arg  Lys  Val

1  5

(2)SEQ ID NO:23的资料

(i)序列特征:

(A)长度:7个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:23:

Pro  Gln  Lys  Lys  Ile  Lys  Ser

1  5

(2)SEQ ID NO:24的资料

(i)序列特征:

(A)长度:6个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:24:

Gly  Pro  Lys  Lys  Lys  Pro

1  5

(2)SEQ ID NO:25的资料

(i)序列特征:

(A)长度:12个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:25:

Arg  Lys  Lys  Arg  Arg  Gln  Arg  Arg  Arg  Ala  His  Gln

1  5  10

(2)SEQ ID NO:26的资料

(i)序列特征:

(A)长度:16个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:26:

Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln

1  5  10  15

Arg

(2)SEQ ID NO:27的资料

(i)序列特征:

(A)长度:19个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:27:

Met Pro Leu Thr Arg Arg Arg Pro Ala Ala Ser Gln Ala Leu Ala

1  5  10  15

Pro  Pro  Ter  Pro

(2)SEQ ID NO:28的资料

(i)序列特征:

(A)长度:15个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:28:

Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro

1  5  10  15

(2)SEQ ID NO:29的资料

(i)序列特征:

(A)长度:32个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:29:

Met Leu Phe Asn Leu Arg Xaa Xaa Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg

1  5  10  15

His Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Gys Gly Gln Pro

20  25  30

Leu  Xaa

(2)SEQ ID NO:30的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:30:

Gly  Cys  Val  Cys  Ser  Ser  Asn  Pro

1  5

(2)SEQ ID NO:31的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:31:

Gly  Gln  Thr  Val  Thr  Thr  Pro  Leu

1  5

(2)SEQ ID NO:32的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:32:

Gly  Gln  Gln  Leu  Ser  Gln  His  Glu

1  5

(2)SEQ ID NO:33的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:33:

Gly  Asn  Ser  Pro  Ser  Tyr  Asn  Pro

1  5

(2)SEQ ID NO:34的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:34:

Gly  Val  Ser  Gly  Ser  Lys  Gly  Gln

1  5

(2)SEQ ID NO:35的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:35:

Gly  Gln  Thr  Ile  Ter  Thr  Pro  Leu

1  5

(2)SEQ ID NO:36的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:36:

Gly  Gln  Thr  Ile  Thr  Thr  Pro  Leu

1  5

(2)SEQ ID NO:37的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:37:

Gly  Gln  Ile  Phe  Ser  Arg  Ser  Ala

1  5

(2)SEQ ID NO:38的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:38:

Gly  Gln  Ile  His  Gly  Leu  Ser  Pro

1  5

(2)SEQ ID NO:39的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:39:

Gly  Ala  Arg  Ala  Ser  Val  Leu  Ser

1  5

(2)SEQ ID NO:40的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:40:

Gly  Cys  Thr  Leu  Ser  Ala  Glu  Glu

1  5

(2)SEQ ID NO:41的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:41:

Gly  Gln  Asn  Leu  Ser  Thr  Ser  Asn

1  5

(2)SEQ ID NO:42的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:42:

Gly  Ala  Ala  Leu  Thr  Ile  Leu  Val

1  5

(2)SEQ ID NO:43的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:43:

Gly  Ala  Ala  Leu  Thr  Leu  Leu  Gly

1  5

(2)SEQ ID NO:44的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:44:

Gly  Ala  Gln  Val  Ser  Ser  Gln  Lys

1  5

(2)SEQ ID NO:45的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:45:

Gly  Ala  Gln  Leu  Ser  Arg  Asn  Thr

1  5

(2)SEQ ID NO:46的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:46:

Gly  Asn  Ala  Ala  Ala  Ala  Lys  Lys

1  5

(2)SEQ ID NO:47的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:47:

Gly  Asn  Glu  Ala  Ser  Tyr  Pro  Leu

1  5

(2)SEQ ID NO:48的资料

(i)序列特征:

(A)长度:8个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:48:

Gly  Ser  Ser  Lys  Ser  Lys  Pro  Lys

1  5

(2)SEQ ID NO:49的资料

(i)序列特征:

(A)长度:55个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:49:

CCCTCTAGAC ATATGTGAAT TCCACCATGG CCCAGGTSMA RCTGCAGCAG TCAGG55

(2)SEQ ID NO:50的资料

(i)序列特征:

(A)长度:43个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:50:

GGGGCGCGCT  GMGGAGACGG  TGACCRWGGT  CCCTKSGCCC  CAG  43

(2)SEQ ID NO:51的资料

(i)序列特征:

(A)长度:89个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:51:

GATCTSAHAT  TCAGCTGACM  CARWCTCCA  89

(2)SEQ ID NO:52的资料

(i)序列特征:

(A)长度:44个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:52:

GGGTCTAGAC  TCGAGGATCC  TTATTA  TACA  GTTGGTGCAG  CATC  44

(2)SEQ ID NO:53的资料

(i)序列特征:

(A)长度:71个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:53:

GGTGCAGCAT  C  71

(2)SEQ ID NO:54的资料

(i)序列特征:

(A)长度:10个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:54:

Thr  Pro  Pro  Lys  Lys  Lys  Lys  Arg  Lys  Val

1  5  10

(2)SEQ ID NO:55的资料

(i)序列特征:

(A)长度:30个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:55:

ATTAGCGGCC  GCTACAGTTG  GTGCAGCATC  30

(2)SEQ ID NO:56的资料

(i)序列特征:

(A)长度:4个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:56:

Arg  Lys  Lys  Arg

1

(2)SEQ ID NO:57的资料

(i)序列特征:

(A)长度:41个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:57:

TTTAAGCTTA  CCATGGCCCA  GGTGCAGCTG  CAGGAGTCGG  G  41

(2)SEQ ID NO:58的资料

(i)序列特征:

(A)长度:10个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:58:

Met  Ala  Gln  Val  Gln  Leu  Gln  Glu  Ser  Gly

1  5  10

(2)SEQ ID NO:59的资料

(i)序列特征:

(A)长度:30个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:59:

TTTAAGCTTA  CCATGGACTG  GACCTGGAGG  30

(2)SEQ ID NO:60的资料

(i)序列特征:

(A)长度:21个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:60:

TGAGGTGACC  GTGACCAGGG  T  21

(2)SEQ ID NO:61的资料

(i)序列特征:

(A)长度:33个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:61:

TTTAAGCTTA  CCATGGAGTT  TGGGCTGAGC  TGG  33

(2)SEQ ID NO:62的资料

(i)序列特征:

(A)长度:27个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:62:

CTGCGTCAAC  ACAGACTGAG  ATCCGCC  27

(2)SEQ ID NO:63的资料

(i)序列特征:

(A)长度:21个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:63:

CGAGGGGGYR  GCCTTGGGCT  G  21

(2)SEQ ID NO:64的资料

(i)序列特征:

(A)长度:27个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:64:

TTTTCTAGAT  CYTMTGAACT  GACTCAG  27

(2)SEQ ID NO:65的资料

(i)序列特征:

(A)长度:24个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:65:

GGAACCCTGG  TCACGGTCAC  CTCA  24

(2)SEQ ID NO:66的资料

(i)序列特征:

(A)长度:24个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:66:

TGGAGACTGC  GTCATCTCGA  GTTC  24

(2)SEQ ID NO:67的资料

(i)序列特征:

(A)长度:24个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:67:

GAACTCGAGW  TGACGCAGTC  TCCA  24

(2)SEQ ID NO:68的资料

(i)序列特征:

(A)长度:48个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:68:

GGGTCTAGAC  TCGAGGATCC  TTATTAACGC  GTTGGTGCAG  CCACAGT 47

(2)SEQ ID NO:69的资料

(i)序列特征:

(A)长度:24个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:69:

ACGGCCGTGT  ATTACTGTGC  GCGA  24

(2)SEQ ID NO:70的资料

(i)序列特征:

(A)长度:30个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:70:

TGGGGCCAGG  GAACCCYGGT  CACSGTNWCC  30

(2)SEQ ID NO:71的资料

(i)序列特征:

(A)长度:15个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:71:

CGCACAGTAA  TACAC  15

(2)SEQ ID NO:72的资料

(i)序列特征:

(A)长度:17个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:72:

GTGACCGTGA  CCGGGGT  17

(2)SEQ ID NO:73的资料

(i)序列特征:

(A)长度:46个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:73:

GGCCGTGTAT  TACTGTGCGC  GANNSTGGGG  CCAGGGAACC  CCGGTC  46

(2)SEQ ID NO:74的资料

(i)序列特征:

(A)长度:15个氨基酸

(B)类型:氨基酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:74:

Leu Thr Leu Ile Ser Ser Arg Leu Arg Leu Ile Ala Val Arg Met

1  5  10  15

(2)SEQ ID NO:75的资料

(i)序列特征:

(A)长度:27个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:75:

TTTAAGCTTA  CCATGAACTT  CGGGCTC  27

(2)SEQ ID NO:76的资料

(i)序列特征:

(A)长度:28个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:76:

TGMGGAGAC  GGTGACCRWGGTCCCT  28

(2)SEQ ID NO:77的资料

(i)序列特征:

(A)长度:27个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:77:

GAGCTCGTGC  TCACMCAR  WCTCCA  27

(2)SEQ ID NO:78的资料

(i)序列特征:

(A)长度:44个碱基对

(B)类型:核酸

(C)股型:单股

(D)拓扑结构:线性

(xi)序列描述:SEQ ID NO:78:

GGGTCTAGAC  TCGAGGATCC  TTATTATACA  GTTGGTGCAG  CATC  44

Claims (50)

1、一种细胞内结合特异性抗原(靶抗原)的方法，该方法包括

(a)细胞内输送含有可操作地连接到能结合靶抗原之抗体基因上的启动子的核苷酸顺序，并

(b)细胞内表达能够结合靶抗原的抗体。

2、权利要求1的方法，其中能结合靶抗原的抗体是单链可变片段。

3、权利要求1的方法，其中能结合靶抗原的抗体是单区域重链。

4、权利要求1的方法，其中能结合靶抗原的抗体是Fab。

5、权利要求1的方法，其中靶抗原选自于由中间代谢物、糖、脂、自体有效物质、激素、复合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白质组成的一组抗原。

6、权利要求1的方法，其中靶抗原是半抗原、RNA顺序、DNA顺序或蛋白质。

7、权利要求6的方法，其中靶抗原是蛋白质。

8、权利要求1的方法，其中靶抗原是其表达将引起恶性细胞转化的蛋白质。

9、权利要求8的方法，其中靶抗原引起恶性转化是该蛋白质过度表达的结果。

10、权利要求8的方法，其中靶抗原是HTLV-1蛋白质。

11、权利要求6的方法，其中靶抗原是半抗原。

12、权利要求1的方法，其中靶抗原是病毒编码的蛋白质。

13、权利要求12的方法，其中病毒编码的蛋白质是HIV病毒编码的蛋白质。

14、权利要求12的方法，其中抗体是能结合被膜糖蛋白或衣壳蛋白质的抗原。

15、权利要求13的方法，其中抗体是能够结合被膜糖蛋白的。

16、权利要求15的方法，其中靶抗原是被膜gp160。

17、权利要求1的方法，其中靶抗原是HIV前病毒。

18、权利要求15的方法，其中靶抗原是被膜gp41。

19、权利要求6的方法，其中靶抗原是TAR成分或RRE顺序。

20、权利要求1的方法，其中使用抗一种以上靶抗原的抗体。

21、权利要求20的方法，其中靶抗原是病毒编码的蛋白质，且抗体是抗至少两种不同病毒编码的蛋白质的抗体。

22、权利要求21的方法，其中病毒编码的蛋白质是HIV编码的蛋白质，且抗体是抗至少一种结构蛋白质和至少一种调节蛋白质的。

23、权利要求22的方法，其中结构蛋白质是被膜糖蛋白，其中调节蛋白质是tat或rev蛋白质。

24、权利要求23的方法，其中被膜蛋白是gp160。

25、权利要求24的方法，其中还包括一种抗HIV  gp41的抗体。

26、权利要求12的方法，其中抗体是抗参予十四烷基化之衣壳蛋白质的那个部分的抗体。

27、权利要求13的方法，其中抗体是抗tat蛋白质的。

28、权利要求1的方法，其中抗体基因还编码细胞内定位顺序。

29、权利要求28的方法，其中针对相对的靶使用一种以上的抗体，其中的抗体具有不同的细胞内定位顺序并且击中在不同的细胞内定位上的抗原。

30、权利要求29的方法，其中靶抗原是病毒编码的抗原。

31、权利要求30的方法，其中病毒编码的抗原是HIV编码的抗原。

32、权利要求31的方法，其中HIV编码的抗原是被膜糖蛋白。

33、权利要求12的方法，其中抗体基因还编码细胞内定位顺序。

34、权利要求33的方法，其中用于结构蛋白质的定位顺序是胞浆定位顺序。

35、权利要求33的方法，其中病毒的蛋白质选自于包括HIV  tat、HIV  rev、HTLV-1tax、HTLV-1rev、HTLV-2tax和HTLV-2rex的一组病毒蛋白质，且其中的定位顺序是核定位顺序。

36、权利要求13的方法，其中抗体是针对参予十四烷基化之衣壳蛋白的那个部分的。

37、权利要求12的方法，其中病毒编码的蛋白质是DNA病毒编码的蛋白质。

38、权利要求12的方法，其中病毒编码的蛋白质是RNA病毒编码的蛋白质。

39、一种含有编码能结合可操作地连接到启动子上之特异性抗原的抗体之基因的DNA载体，其中的抗体基因不编码分泌信号顺序。

40、权利要求39的DNA载体，其中编码单链可变片段的基因包括编码V_H的DNA顺序，编码接头的DNA顺序和编码V_L的DNA顺序。

41、权利要求40的DNA载体，其中抗体基因还包括编码定位顺序的DNA顺序。

42、权利要求41的DNA载体，其中定位顺序是对内质网特异的，所说的顺序选自于由SEQ  ID  NO：17、SEQ  ID  NO：18、SEQ  ID  NO：19、SEQ  ID  NO：21和SEQ  ID  NO：22组成的一组中。

43、权利要求41的DNA载体，其中定位顺序是对核区域特异的，所说的顺序选自于由SEQ  ID  NO：24、SEQ  ID  NO：25、SEQ  ID  NO：26和SEQ  ID  NO：27组成的一组中。

44、权利要求41的DNA载体，其中定位顺序是对原生质膜特异的，所说的顺序选自于由SEQ  ID  NO：30、SEQ  ID  NO：31、SEQ  ID  NO：32、SEQ  ID  NO：33、SEQ  ID  NO：34、SEQ  ID  NO：35、SEQ  ID  NO：36、SEQ  ID  NO：37、SEQ  ID  NO：38、SEQ  ID  NO：39、SEQ  ID  NO：40、SEQ  ID  NO：41、SEQ  ID  NO：42、SEQ  ID  NO：43、SEQ  ID  NO：44、SEQ  ID  NO：45、SEQ  ID  NO：46、SEQ  ID  NO：47、和SEQ  ID  NO：48组成的一组中。

45、一种含有可操作地连接到编码抗HIV被膜糖蛋白之广谱中和抗体的V_H和V_LDNA顺序上的启动子的DNA载体，所说的顺序借助编码SEQ ID NO：1的寡核苷酸载体连接，它在转译后形成一单链可变片段。

46、权利要求45的DNA载体，它还包括编码SEQ ID NO：13 3′到编码V_L之DNA顺序的DNA顺序。

47、一种含有可操作地连接到编码能结合tat之抗体的V_H和V_LDNA顺序的启动子的DNA载体，所说顺序借助编码SEQ ID NO：1的寡核苷酸连接，它在转译后形成一单链可变片段。

48、权利要求47的DNA载体，它还包括编码SEQ ID NO：54 3′到编码V_L之DNA顺序的DNA顺序。

49、一种被权利要求39的载体构成上转化的细胞系。

50、一种被权利要求47的载体构成上转化的细胞系。

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