CN1127992A - 改进的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

具有改善的稳定性和对凝聚、颗粒形成和沉淀的抑制作用的多肽药物组合物，所述组合物包含一种多肽药物和poloxamer表面活性剂或poloxamer表面活性剂与聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂的混合物。优选的被稳定的多肽是杀菌/渗透性增强(BPI)蛋白、BPI的生物活性片段、BPI的生物活性类似物以及BPI的生物活性变种。

Description

改进的药物组合物
                      发明背景
本发明总的来说涉及药物组合物，更具体地说涉及用作非肠道药物的改进的蛋白质和多肽药物。近来遗传工程技术发展的进步使多种生物活性多肽可获得足够大的量以用作药物。然而，多肽可通过多种化学和物理方法，包括加热、冷冻及暴露在极端pH下的变性或其它化学降解，形成颗粒并丧失生物活性。
颗粒形成与生物活性的丧失也可由下列原因引起：物理振荡和溶液中多肽分子的相互作用以及在贮存小瓶中液-气界面上多肽分子的相互作用。人们认为多肽分子吸附在气-液界面上，其疏水基团向空气中伸展而亲水基团浸在水相中。一旦在表面这样排布，多肽分子便容易聚集、形成颗粒和沉淀。人们还认为在诸如由于运输或其它过程中发生的振动而导致界面的伸缩过程中，吸附于气-液和固-液界面的多肽发生进一步的构象变化。这种振荡能引起蛋白质缠结、聚集、形成颗粒并最终与其它吸附的蛋白质沉淀。
表面变性引起的颗粒形成在某种程度上能通过贮存小瓶大小的适当选择及减少这些小瓶中的空气体积(顶部空间)来控制。在这点上，部分充满的容器代表振动引起沉淀的最差状况。
颗粒形成还能通过向含有蛋白质的组合物中掺入表面活性剂以降低溶液-空气界面的表面张力来控制。采用表面活性剂和乳化剂的传统的药物稳定方法集中于在表面活性剂分子中同时含有疏水和亲水性分子基团的两亲本质。因此该技术表明，通过选择适当的表面活性剂作为相容剂可制得诸如水包油或油包水型不混溶分子的稳定溶液。用poloxamer188(PLURONIC F-68，BASF Wyandotte Corp.，Parsippany，NJ)对豆油进行的稳定的乳化作用便是一个实例。另一个实例是用聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯80(吐温80，ICI Americas，Inc.，Wilmington，DE)来乳化水溶液中的油溶性维生素A、E和K以通过口服或血管途径给药。由Krantz等人的工作，“糖醇-XXVIII.对吐温80的毒理学、药效学及临床观察”(Bull.of the School ofMed.，U.of MD.，36，48(1951))为将聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯列为一种药物成分奠定了工作基础，其USP/NF要求已发表在美国药典XXII上。
本发明感兴趣的是涉及利用吐温80对基于抗体的产物制剂进行稳定的工作，如Levine等，J.Parenteral Sci.Technol.，45，3，160-165(1991)所述。这项工作揭示了稳定作用所需的表面活性剂的量超过减小表面张力所需的理论上的最小量。此工作进一步表明需要超过理论最小量的过量表面活性剂可能由于：(1)在随机振荡过程中在涌动的界面上保持一个完整的保护层所需的浓度；(2)表面活性剂松散地与蛋白质结合及与容器壁结合。
受规章限制的必要条件使能混入用于注射入人体的非肠道组合物的表面活性剂的类型与特性受到限制。通常公认的具有使用历史并列入美国药典XXII的表面活性剂包括poloxamer和聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯聚合物。但是，它们中任何一种在0.1％或更低浓度下单独使用时，均不能对药物组合物提供完全的稳定作用。增大表面活性剂的浓度会出现毒作用增加的危险、溶血的较早产生以及中性白细胞与血小板的可观察到的变化，而中性白细胞与血小板均参与血液补体的活化。当poloxamer188在有限的剂量下用作血液代用品并在血流中被稀释10倍时，poloxamer188在允许的非肠道溶液中的最高安全浓度为2.7％。类似地，已批准用于非肠道溶液20多年的吐温80在100毫升或更大的溶液体积中的使用浓度很少高于0.1％。Krantz等(见上)鉴定狗在0.1％的聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯浓度下90分钟时出现溶血。新生儿死亡与吐温80的使用浓度高于1％有关。因此，本领域需要能提供改进的蛋白质稳定性的药物组合物，该组合物中只包含那些被认为是安全的并包括在制定规章的权威批准的商用非肠道药中的成分。
                    本发明的概述
本发明涉及多肽的药物组合物并针对下面发现：poloxamer表面活性剂以及它与聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂联合应用提高杀菌/渗透性增强(BPI)蛋白、BPI的生物活性片段、BPI的生物活性类似物以及BPI的生物活性变种(由重组或非重组方式产生)在水溶液中的溶解性/稳定性。本发明特别提供了杀菌/渗透性增强蛋白的增溶/稳定方法，杀菌/渗透性增强蛋白是BPI或其类似物和其变种的生物活性氨端基片段。BPI的氨端基片段，例如那些称做rBPI23或包括BPI的大约头193个至约头199个氨端基氨基酸残基的任何氨端基片段，被认为在水溶液中特别容易失去稳定性。
本发明特别针对下面发现：两种特定类型的表面活性剂的结合与其中任何一种表面活性剂单独使用相比，使药物组合物的蛋白质稳定性有令人吃惊的改进。特别是发现含有poloxamer(聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物)表面活性剂与聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂的混合物的药物组合物可改善蛋白质药剂的稳定性和对凝聚、颗粒形成及沉淀的抑制作用。与任何一种单独使用相比，这两种类型表面活性剂的结合提供了改善的稳定性及对表面变性、凝聚、颗粒形成和沉淀的抑制作用。
用于稳定含有少于或等于2mg/ml蛋白质的溶液时poloxamer表面活性剂成分的重量浓度优选为约0.01％至1％，更优选为0.1％至0.2％。聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂成分的重量浓度优选为约0.0005％至约1％，优选为0.002％。含有0.1％(重量)至0.2％(重量)poloxamer188及0.002％(重量)吐温80的混合物是最优选的。该混合物对防止降解极敏感蛋白质如杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)的颗粒形成特别有用，也可用于增进其它多肽药物的稳定性。此poloxamer和聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂的混合物可单独使用或与其它表面活性剂混合使用。再者，本发明不限于一种poloxamer表面活性剂与一种聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂混合，还包括一种或多种poloxamer表面活性剂与一种或多种聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂混合。
本发明的另一方面涉及下述发现：poloxamer表面活性剂对含有BPI蛋白或其生物活性片段、类似物或变种(由重组或非重组方式产生)的水溶液的组合物的增溶/稳定尤其有用。本发明提供了一种通过将多肽与poloxamer表面活性剂接触来增溶/稳定这种多肽的方法。不必受本发明的一个理论的约束，据信poloxamer表面活性剂稳定BPI蛋白产物不是通过降低水溶液表面张力的机制而是在较高温度下通过稳定伸展的和部分伸展的BPI蛋白质分子并防止这些分子沉淀。
优选的poloxamer表面活性剂的特点是HLB值大于约14，在室温、0.1％浓度的水溶液中测得的表面张力为10-70mN/m，更优选的poloxamer表面活性剂的HLB值为25至35，并且在室温、0.1％浓度的水溶液中测得的表面张力为30至52mN/m最优选的是市售的商品名为PLURONIC F-68的poloxamer188(BASF Wyandotte，Parsippany，N.J.)，其特点是表面张力为50mN/m，HLB值为29。
优选的聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂在室温、浓度为0.1％的水溶液中测得的表面张力为10至70mN/m。更优选的聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂的亲水/亲油平衡(HLB)值约为15，在室温、浓度为0.1％的水溶液中测得的表面张力为40至50mN/m。最优选的是聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯80(脱水山梨醇单-9-十八碳烯酸酯)，市售商品名为吐温80(ICI AmericasInc.，Wilmington，Del.)。
                 附图的简要说明
图1是表示放线菌素-D致敏的小鼠模型随时间变化的存活结果的图。
图2是表示放线菌素-D小鼠模型随BPI剂量变化的存活结果的图。
图3是表示含有或不含有本发明的优选表面活性剂的不同BPI蛋白的浊度的图。
图4是表示含有不同浓度的吐温80(PS80)和poloxamer188(F68)表面活性剂的rBPI21Δcys溶液的表面张力的图。
图5是含有不同浓度poloxamer188(F68)表面活性剂的rRPI21Δcys的一系列差示扫描量热法结果图。
图6是含有不同浓度poloxamer188(F68)的rBPI21Δcys的另一系列差示扫描量热法结果图。
图7是rBPI21Δcys在不同浓度的poloxamer188(F68)表面活性剂存在下的变性和沉淀温度的图。
图8是只含有不同浓度的吐温80(PS80)或同时含有0.1％(重量)poloxamer188(F68)的rBPI21Δcys的一系列差示扫描量热法结果图。
图9是含有两种不同浓度的吐温80(PS80)表面活性剂的rBPI21Δcys的一套差示扫描量热法结果图。
图10是rBPI21Δcys和poloxamer188(F68)的溶液加热到高于变性/伸展温度但低于沉淀温度，然后冷却并重复扫描得到的一套差示扫描量热法结果图。
                   本发明的详细描述
本发明提供了保持多肽药物的稳定性并防止这种生物活性多肽的表面变性的改进的方法和物质。特别指出的是，本发明涉及下述发现：两种特定类型的表面活性剂分子的结合提供了防止多肽药物的表面变性的协同改善作用。本发明还涉及下述发现：poloxamer表面活性剂在BPI相关蛋白的增溶/稳定作用中具有独特的性质。尽管本发明的具体实施方案针对对变性及颗粒形成极其敏感的杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)及其生物活性片段和/或类似物或变种的稳定作用，但本发明的应用通常可扩展到所有蛋白质和多肽药物。可用于本发明的BPI及其活性片段和类似物包括重组产生的蛋白质(如美国专利5,198,541所述)。Theofan等的共有共同未决专利申请U.S.08/064,693(1993年5月19日提交，是1992年5月19日提交的U.S.07/885,911的部分继续申请)提出作为BPI蛋白变种的BPI-免疫球蛋白融合蛋白在氨基末端包含BPI蛋白或其生物活性片段，并保持与BPI蛋白相同的生物活性。特别优选的BPI物质包括根据Theofan等的共有共同未决申请U.S.08/013,801(1993年2月2日提交，题为“稳定的杀菌/渗透性增强蛋白产物和含有该产物的药物组合物”)的方法重组产生的多肽，该专利在此引作参考文献。优选的BPI片段的特征是具有如Gray等，J.Biol.Chem.，264，9505-9509(1989)中所述的成人BPI分子的约1至199或约1至193个氨端基氨基酸残基，只不过第185号残基是谷氨酸而不是如Gray所述的赖氨酸。编码BPI第1至199的氨基酸的DNA的重组表达产物称为rBPI23。编码BPI第1至193的氨基酸的DNA的重组表达产物称为rBPI(1-193)。优选的BPI片段类似物包含如Gray所述的头193个氨基酸残基，但185号残基是谷氨酸而非赖氨酸，132号的半胱氨酸被非半胱氨酸残基(如丙氨酸)代替。此蛋白称为rBPI21Δcys或rBPI(1-193)ala132。
                      实施例1
在本实施例中，用不同的表面活性剂体系进行试验以确定它们用于多肽药物(rBPI23)表面稳定的效果。预备浓度为1mg/ml的rBPI23在柠檬酸盐缓冲盐水(0.02M柠檬酸、0.15M氯化钠、pH5.0)中的溶液。然后加入不同的表面活性剂以确定它们作为稳定剂的效用。
根据试验，将其特征是含约1至约199个成人BPI分子的头199个氨基酸(按1993年2月2日提交的Theofan等的美国专利申请08/013,801的方法制备)的rBPI23[BR-1]在封口的无菌6ml模制玻璃小瓶中(总容量8.4ml，Wheaton)以所要求的缓冲液制剂的形式手加至5ml。待试验的小瓶在一个水平摇床(S/P rotor V)上水平放置并用带子固定在摇床上，然后在室温下以150rpm的速度振荡。分别在0、2-4、及18小时用装有21号标准针的1ml注射器吸取150μl样品加入生物安全小室中。通过离子交换HPLC测定法测定可溶性rBPI23的起始、过程中和终了浓度，并记录溶液浊度的目测结果。结果示于下面表1中，其中通过振荡试验后目测来确定可接受的稳定性。
含有表面活性剂的蛋白质制剂的试验表明用octoxynol-9(TRITON X-100，Rohm & Haas)、laureth-4(BRIJ30，ICIAmericas)、poloxamer403(PLURONIC P123，BASF Wyandotte)和telomere B与聚乙二醇的单醚(ZONYL FSO-100，E.I.DuPontde Nemours)效果较好。虽然这些表面活性剂能将表面张力减至低水平，但由于可疑的毒作用及未知的生物相容性，它们不包括在批准的非肠道药物中。
表1示出的其它表面活性剂的试验表明，产生低于35mN/m表面张力的表面活性剂能在0.1％表面活性剂浓度下稳定rBPI。本实施例进一步表明，吐温80和poloxamer188(PLURONIC F-68)在所用的振荡试验条件下均不能单独使蛋白质制剂稳定。然而，加入吐温80确实能使BRIJ30的浑浊液澄清，BRIJ30在没有其它加溶剂的帮助下不易溶于水。
                                                        表1
实验编号 所用的表面活性剂  在室温0.1％浓度下于水(w)或缓冲液(b)1中的表面张力(mN/m) 配制的缓冲液中表面活性剂的浓度      目测结果      由HPLC测得的rBPI23浓度(mg/ml) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
1  ZONYLFSO-100  17(w) 0.100％ ---- 透明 0.96  ----  1.00 稳定
2  PS-80  41(b) 0.100％ ---- 浑浊 1.11  ----  0.02 不稳定
3  BRIJ30  27.5(b) 0.500％ 浑浊 浑浊 1.08  ----  1.14 单用BRIJ30是浑浊的
4  TRITONX-100  32(b) 0.100％ 透明 透明 1.00  1.01  0.98 稳定
5  PLURP123  34.3(w) 0.100％ 透明 透明 1.08  1.08  1.08 稳定
6  BRIJ30/PS-80 ---- 0.1％/0.125％ 透明 透明 1.19  1.21  1.17 稳定
                                                      表1
实验编号 所用的表面活性剂  在室温0.1％浓度下于水(w)或缓冲液(b)1中的表面张力(mN/m) 配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果      由HPLC测得的rBPI23浓度(mg/ml) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
7  PLURF-68  46(b)  0.100％ 透明 雾浊  1.23  1.22  0.95 勉强稳定，微雾浊，微粒。
8  PLURF-68  44(b)  0.200％ 透明 雾浊  ----  ----  1.04 勉强稳定，微雾浊，少许微粒。
                                                     表1
实验编号 所用的表面活性剂  在室温0.1％浓度下于水(w)或缓冲液(b)1中的表面张力(mN/m) 配制的缓冲液中表面活性剂的浓度      目测结果       由HPLC测得的rBPI23浓度(mg/ml) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
 9  PLURF-68/PS-80  47(b) 0.1％/0.001％ 透明  透明 1.14  1.09 稳定，晶体纯净，有少许微粒。
带上标w的表面张力是从表面活性剂制造厂得到的。带上标b的表面张力是用
Wilhelny盘方法经实验测得的。
                      实施例2
在本实施例中，按照实施例1的方法单用或混用不同的表面活性剂来稳定rBPI23样品，进行其它比较。结果示于下面表2中，其中可接受的稳定性通过振荡试验后目测确定。这些结果，特别是实验52至58的结果表明了poloxamer188与吐温80合用以稳定rBPI23组合物的出人意料的效用，在所使用的浓度下任何一种表面活性剂均不能单独在实验条件下等效地稳定实验物质。实验表明两种表面活性剂不同浓度的混合均可产生协同作用，但对于浓度为1mg/ml的rBPI23的优选组合是在柠檬酸盐缓冲盐水(0.02M柠檬酸、0.015M NaCl，pH5.0)中含有0.1％(重量)poloxamer188及0.001％(重量)吐温80。低于0.001％浓度的吐温80在振荡18小时后马上产生浑浊，但经离子交换HPLC MA7C柱(Bio-Rad，Hercules，CA)测定只有少量蛋白质损失。然而出现浑浊是不合格的并说明稳定性降低。用浓度为0.005％或更高的吐温80实验，振荡18小时后均具有很好的稳定性，且通过HPLC分析几乎没有出现蛋白质损失。然而，这些较高浓度的吐温80在4℃长期贮存时以及在环境室温或更高的恶劣温度下稳定性降低。
                                            表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果       HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
1  ZONYLFSO-100  0.100％ ---- 透明 0.96  ----  1.00 稳定
2  PS-80  0.100％ ---- 浑浊 1.11  ----  0.02 不稳定
3  葡萄糖硫酸盐  1mg/mL ---- 浑浊 ----  ----  0.00 不稳定
4  甘油  10.0％ ---- 浑浊 0.86  ----  0.02 不稳定
5  HSA  5.0％ ---- 浑浊 0.92  ----  0.00 不稳定
6  对照：5ml填充体积  ---- ---- 浑浊 1.13  ----  0.03 不稳定
7  对照：8.4ml(充满)填充体积  ---- ---- 透明 1.13  ----  1.04 稳定，一点沉淀
                                           表2
实验编号 所用的表面活性剂 配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果      HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
8  对照：5ml(部分)填充体积 ---- 浑浊 浑浊  1.16  0.21  0.00 不稳定
9  TRITONX-100  0.500％ 透明 透明  1.04  0.99  1.11 稳定
10  PS-80  0.500％ 透明 浑浊  1.12  0.95  0.59 不稳定
11  PLURONICP123  0.500％ 透明 透明  1.15  ----  1.13 稳定
12  BRIJ30  0.500％ 浑浊 浑浊  1.08  ----  1.14 单用BRIJ30是浑浊的
13  TRITONX-100  0.100％ 透明 透明  1.00  1.01  0.98 稳定
                                          表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果            HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
14  TRITONX-100  0.010％ 微雾浊 浑浊  0.96  0.84  0.04 不稳定
15  PLURONICP123  0.100％ 透明 透明  1.08  1.08  1.08 稳定
16 PLURONICP123 0.100％ 透明 透明 1.23 1.26 0.94 稳定
17  PLURONICP123  0.050％ 透明 微雾浊  1.21  1.18  1.11 不稳定
18  PLURONICP123  0.010％ 浑浊 浑浊  1.14  0.00  0.00 不稳定
19  BRIJ30/PS-80  0.1％/0.125％ 透明 透明  1.19  1.21  1.17 稳定
20  BRIJ30/PS-80  0.075％/0.094％ 透明 透明  1.22  1.20  1.18 稳定
                                          表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果           HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr Ohr 3-4hr 18hr
21  BRIJ30/PS-80  0.03％/0.038％ 微雾浊 浑浊  1.20  1.05  0.41 不稳定
22  BRIJ30/PS-80  0.01％/0.013％ 浑浊 浑浊  1.14  0.48  0.00 不稳定
23  PLURONICF68  0.100％ 透明 微雾浊  1.23  1.22  0.95 勉强稳定
24  PLURONICF68  0.100％ 透明 微雾浊  ----  ----  1.00 勉强稳定
25  PLURONICF68  0.150％ 透明 微雾浊  ----  ----  1.06 勉强稳定
26  PLURONICF68  0.200％ 透明 微雾浊  ----  ----  1.04 勉强稳定
                                          表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果         HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
27  PLURONICF68  0.300％ 透明 微雾浊  ----  ----  1.10 勉强稳定
28  PLURONICF68  0.500％ 透明 微雾浊  ----  ----  1.08 勉强稳定
29  PLURONICP123  0.070％ 透明 透明  1.06  1.08  0.97 勉强稳定
30  BRIJ30/PS-80  0.05％/0.063％ 透明 透明  1.04  1.01  1.01 稳定
31  PLUR F68/PS-80  0.1％/0.1％ 透明 透明  1.05  1.06  1.10 稳定
32  PLUR F68/BRIJ30  0.1％/0.03％ 透明 透明  1.05  1.05  1.03 稳定
33  PLUR F68/BRIJ30  0.1％/0.01％ 透明 透明  1.06  1.04  1.05 稳定
                                          表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果          HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
34  PLURONICF88  0.100％ 浑浊 浑浊  1.07  0.87  0.56 不稳定
35  PLURONICF98  0.100％ 浑浊 浑浊  1.04  0.77  0.39 不稳定
36  PLURONICF108  0.100％ 透明 浑浊  1.04  0.87  0.55 不稳定
37  PLURONICF127  0.100％ 透明 透明  1.06  1.04  0.98 勉强稳定
38  PLUR F68/BRIJ30  0.075％/0.01％ 透明 透明  1.12  ----  1.11 稳定
39  PLUR F68/BRIJ30  0.05％/0.01％ 透明 透明  1.12  ----  1.09 稳定
                                          表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果          HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
40  PLUR F68/BRIJ30  0.025％/0.01％ 透明 透明  1.10  ----  1.04 稳定
41  PLUR F68/BRIJ30  0.01％/0.01％ 浑浊 浑浊  1.07  ----  0.64 不稳定
42  PLURONICF127  0.100％ 透明 透明  1.12  ----  0.93 勉强稳定
43  PLURONICF127  0.075％ 透明 透明  1.10  ----  0.61 不稳定
44  PLURONICF127  0.050％ 透明 微雾浊  1.09  ----  0.20 不稳定
45  PLURONICF127  0.025％ 微雾浊 浑浊  1.07  ----  0.00 不稳定
46  PLURONICF127  0.010％ 浑浊 浑浊  1.06  ----  0.00 不稳定
                                          表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度     目测结果        HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
47  PLUR F68/BRIJ30  0.05％/0.01％ 透明 透明  1.04  ----  1.01 稳定
48  PLUR F68/BRIJ30  0.05％/0.008％ 透明 透明  1.01  ----  1.01 稳定
49  PLUR F68/BRIJ30  0.05％/0.005％ 透明 透明  1.00  ----  1.03 稳定
50  PLUR F68/BRIJ30  0.03％/0.008％ 透明 透明  1.06  ----  0.99 勉强稳定
51  PLUR F68/BRIJ30  0.03％/0.005％ 透明 浑浊  1.01  ----  0.79 不稳定
52  PLUR F68/PS-80  0.1％/0.05％ 透明 透明  1.14  ----  1.11 稳定少许微粒
                                           表2
实验编号 所用的表面活性剂  配制的缓冲液中表面活性剂的浓度      目测结果           HPLC测得的浓度(mg/mL) 目测的稳定性结果
3-4hr 18hr 0hr 3-4hr 18hr
53  PLUR F68/PS-80  0.1％/0.01％ 透明 透明  1.14  ----  1.11 稳定少许微粒
54  PLUR F68/PS-80  0.1％/0.005％ 透明 透明  1.15  ----  1.10 稳定少许微粒
55  PLUR F68/PS-80  0.1％/0.001％ 透明 透明  1.14  ----  1.09 稳定少许微粒
56  PLUR F68/PS-80  0.1％/0.0005％ 透明 浑浊  1.12  1.09  1.02 不稳定
57  PLUR F68/PS-80  0.1％/0.0001％ 微雾浊 浑浊  1.09  1.09  1.02 不稳定
58  PLUR F68/PS-80  0.05％/0.001％ 透明 浑浊  1.08  1.00  0.72 不稳定
                      实施例3
在本实施例中，研究比较配合和不配合本发明的优选制剂的rBPI23在根据Pieroni等，Proc.Soc.Exp.Biol.& Med.，133，790(1970)的放线菌素-D致敏的小鼠模型中的效力。据此实施例，ICR小鼠由静脉注射放线菌素-D(800μg/kg)。然后15只小鼠为一组的各组小鼠均立即分别注射不同剂量的在柠檬酸盐缓冲盐水(0.2M柠檬酸盐、0.15M NaCl，pH5.0)中浓度为1mg/ml的rBPI23[BR-1]，该rBPI23[BR-1]的特征是具有成人BPI分子的约1到199个起始199个氨基酸(按Theofan等，1993年2月2日提交的美国专利申请08/013,801所述方法制备)。小鼠注射剂量为0.03、0.1、1.0和3.0mg/kg。作为对照，给一些动物注射含或不含poloxamer和聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂的缓冲液制剂。在7天内记录死亡情况。
结果见图1和2。图l表示在缓冲液及3.0mg/kg rBPI23处理组中，实验中每天存活的小鼠数。两个缓冲液组(含或不含poloxamer和聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂)的总死亡率是80％。相比而言，在赋形剂存在下的rBPI23比缓冲液或不含赋形剂的rBPI23更有效。图2归纳了第7天时不同剂量组的数据(最后存活数)。从0.1mg/kg剂量开始，与优选表面活性剂制剂配合的rBPI23比不加赋形剂的rBPI23对LPS的致死作用具有显著增强的保护作用(P＜0.05或更好)。
                       实施例4
在此实施例中，实验测定含或不含本发明优选的表面活性剂制剂的不同含rBPI的药物组合物的浊度。在本文中，浊度指药物组合物伸展(即丧失蛋白质三维结构)和/或形成颗粒(单个蛋白质间相互作用形成较大的(＞10μm)颗粒)的倾向。被测药物组合物含有rBPI(1-199)ala132、rBPI(1-193)ala132、或各种rBPI23样品(按1993年2月2日提交的共有共同未决的美国专利申请08/013,801制备)，它们溶于柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠/150mM氯化钠，pH5.0)或含0.1％poloxamer 188和0.002％吐温80的柠檬酸盐缓冲液中。
分析样品以测定在pH7.0、随温度升高的不同时间它们对混浊的抑制作用。分析前，所有样品均在pH7.0的50mM磷酸钾中稀释到0.1mg/ml。浊度测定方法如下：将样品置于石英比色皿中，用配有与循环水浴相连的可控温比色皿座的岛津UV-160紫外-可见分光光度仪测定。在57℃使比色皿座平衡后，测定280nm处的吸光度以确定样品已稀释到适当浓度。随后，一小时内每两分钟测一次样品在350nm处的吸光度，以测定吸光度随时间的变化。
图3的结果表明浊度以较低速度变化(即随时间变化吸光度增加较慢)，表示抗颗粒形成的稳定性提高。如图3所示，加入优选的表面活性剂制剂使所有被测组合物的稳定性(抑制颗粒形成)提高。另外，rBPI(1-199)ala132和rBPI(1-193)ala132与野生型组合物[rBPI23]相比显示出大大改善的颗粒形成抑制性。
                      实施例5
在本实施例中，测定BPI蛋白产物rBPI21Δcys溶液中聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯和poloxamer表面活性剂或两者的组合物的表面张力，测定方法按Krüss Digital Tensiometer KIOST UsersManual，第四章：Measuring with the Plate所述的方法进行。表面张力的降低表示表面活性剂的表面活性的增强，这通常被认为是表面活性剂稳定蛋白质的机制。这些实验表明poloxamer表面活性剂通过不同的和出乎意料的机理提供有利的结果。
特别地，未配制的2mg/ml rBPI21Δcys(lot30216)溶液用含20mM柠檬酸钠、150mM氯化钠、pH5.0的缓冲液稀释为1mg/ml溶液。将15ml该溶液放入一个带有小搅拌棒的50ml玻璃烧杯中。将表面活性剂poloxamer188、吐温80或两者的混合物逐渐加入至0.10％。在每次表面张力测定以前，铂板在气体燃烧器的还原区(蓝焰)上方加热，直至该板刚开始发红。将铂板加热10到15秒，同时不断转动板然后重新吊到仪器上。每次加入表面活性剂都用磁搅拌器轻轻混合，并且使溶液在平衡在4.6℃的恒温器上放置2分钟。五分钟后读出表面张力值。
该实验的第一部分评价表面活性剂单独在缓冲液中的表面活性。用柠檬酸盐缓冲液(20mM柠檬酸钠、150mM氯化钠、pH5.0)作基准，不断增加表面活性剂。图4是表示表面张力随表面活性剂浓度变化的图，相应数据示于表3中。空心方块代表含不同浓度poloxamer188的柠檬酸盐缓冲液，实心圆圈代表含不同浓度吐温80的相同缓冲液。柠檬酸盐缓冲液本身在4.6℃的表面张力为75mN/m，与水近似。随着表面活性剂浓度的增加，缓冲液的表面张力降低。含0.10％poloxamer188的溶液的表面张力为55mN/m。此外，含0.10％吐温80的溶液的表面张力为45mN/m。表面张力的降低表示表面活性剂表面活性的升高，即表面张力越低，表面活性越高。结果表明吐温80比poloxamer188表面活性高。
在本实验的第二部分中，评价在表面活性剂存在下rBPI21Δcys的表面活性。结果表明在pH5.0的柠檬酸盐盐水缓冲液中浓度为1mg/ml的rBPI21Δcys在4.6℃的表面张力约为54mN/m，是表面活性的。只加入吐温80(PS80)至0.0005％不能改变rBPI21Δcys溶液的表面张力(图4中实心三角)。当吐温80浓度超过0.0005％时，rBPI21Δcys的表面张力的变化与仅含PS80的缓冲液(无BPI)的变化相同，其中溶液的表面张力随PS80浓度的逐渐增加而降低。对于只含PS80的缓冲液，当PS80浓度从0.0005％增高时，表面张力可达到54mN/m。这些结果表明，当PS80浓度小于0.0005％时，溶液的表面活性受rBPI21Δcys控制。另一方面，当PS80浓度大于0.0005％时，溶液的表面活性受吐温80调节。只向rBPI21Δcys中加入poloxamer188(F68)至0.10％并不显著改变rBPI21Δcys溶液的表面活性(图4，空心三角)。
                                                                                   表3
       1％F68       2缓冲液+F68(mN/m)       3％PS80      4缓冲液+PS80(mN/m)          5％F68          6ΔCys+F68(mN/m)      7％PS80         8ΔCys+0.1％F68+PS80(mN/m)           9％PS80      10ΔCys+PS80(mN/m)
    1  0.00000  75.4  0.00000  75.1  0.00000  54.2  0.00000  53.7  0.00000  54.9
    2  0.00001  74.9  0.00001  66.8  0.00001  54.7  0.00001  53.4  0.00001  55.0
    3  0.00003  74.3  0.00002  60.0  0.00002  54.2  0.00002  53.3  0.00002  53.2
    4  0.00005  68.2  0.00003  60.0  0.00003  54.9  0.00003  53.9  0.00003  53.3
    5  0.00007  65.9  0.00005  60.0  0.00004  54.8  0.00004  53.9  0.00004  52.8
    6  0.00010  64.0  0.00007  57.4  0.00005  55.0  0.00005  53.5  0.00005  52.4
    7  0.00013  65.8  0.00010  56.6  0.00006  55.2  0.00006  53.5  0.00006  53.3
    8  0.00015  65.4  0.00015  57.2  0.00007  55.4  0.00007  53.4  0.00007  53.6
    9  0.00017  66.5  0.00020  56.7  0.00008  54.8  0.00008  53.8  0.00008  53.8
    10  0.00020  65.7  0.00050  55.6  0.00009  55.0  0.00010  53.4  0.00009  53.2
    11  0.00023  66.0  0.00070  55.3  0.00010  54.9  0.00020  53.5  0.00010  53.5
    12  0.00027  64.4  0.00100  54.2  0.00030  55.3  0.00030  53.2  0.00020  53.2
    13  0.00030  63.8  0.00300  52.7  0.00050  54.5  0.00050  52.3  0.00030  53.0
    14  0.00033  64.1  0.00700  49.2  0.00070  55.5  0.00070  51.5  0.00050  52.0
    15  0.00037  63.1  0.01000  48.3  0.00100  54.9  0.00100  51.0  0.00070  51.2
    16  0.00040  64.2  0.03000  46.5  0.00500  54.9  0.00200  50.6  0.00100  50.5
    17  0.00043  61.8  0.07000  45.3  0.01000  55.4  0.00500  50.1  0.00130  50.4
                                                                      表3
       1％F68       2缓冲液+F68(mN/m)      3％PS80       4缓冲液+PS80(mN/m)       5％F68         6ΔCys+F68(mN/m)       7％PS80     8ΔCys+0.1％F68+PS80(mN/m)      9％PS80     10ΔCys+PS80(mN/m)
    18  0.00047  62.4  0.10000  45.4  0.05000  53.6  0.01000  48.6  0.00170  49.8
    19  0.00050  63.1  0.10000  53.7  0.05000  45.6  0.00200  48.8
    20  0.00060  61.6  0.10000  45.0  0.00500  47.7
    21  0.00070  62.5  0.01000  46.7
    22  0.00080  62.0  0.05000  45.4
    23  0.00100  61.7  0.10000  45.0
    24  0.00300  61.2
    25  0.00500  59.3
    26  0.00700  58.9
    27  0.01000  58.4
    28  0.03000  56.6
    29  0.07000  56.1
    30  0.10000  55.1
                     实施例6
用差示扫描量热法(DSC)分析蛋白质样品以研究蛋白质的伸展(或变性)。DSC分析的原料与用于表面张力测定的原料相同。用不同浓度的表面活性剂poloxamer188、吐温80或两者的混合物配制一系列rBPI21Δcys溶液，并用缓冲液(20mM柠檬酸钠、150mM氯化钠、pH5.0)稀释至rBPI21Δcys终浓度为1mg/ml。用与上述rBPI21Δcys溶液相同浓度的表面活性剂配制一系列缓冲溶液作为DSC的空白。将每种溶液过滤并装入2ml无菌塑料小瓶中。将样品放入4℃冷盒直到用于DSC分析。
当溶液的温度以每分钟1℃的速度渐渐从室温升至约90℃时，评估rBPI21Δcys的行为。当温度升高时，发生两个事件。第一是伸展反应，它是吸热的，在扫描图上表现为向上的峰。第二是沉淀，它是放热的，在扫描图上表现为向下的峰。在图5、6和8-10的扫描图中，每次扫描都进行补偿以便于数据分析。在不含表面活性剂的rBPI21Δcys溶液中(图5，扫描图1)，紧接65℃的蛋白质伸展发生第二个事件，在66-67℃的蛋白质沉淀。
在0.001％至0.01％的低浓度poloxamer188(PLURONIC F68)存在下，伸展与沉淀事件与不含表面活性剂的rBPI21Δcys溶液相似(图5，扫描图2-5)，即随着rBPI21Δcys的伸展，立即发生沉淀。当poloxamer188的浓度超过0.05％时，在65℃下仍发生rBPI21Δcys的伸展，但直到温度升至85℃才出现沉淀(图5，扫描线6)。图6表明，poloxamer188浓度为0.01％至0.05％时，伸展的BPI的延迟沉淀逐渐转移。这些结果表明，当poloxamer188浓度高于0.01％时，伸展的rBPI21Δcys能够被稳定化并且沉淀的产生延迟了。变性和沉淀温度随表面活性剂(poloxamer188)浓度的变化图见图7。poloxamer188的作用似乎是将rBPI21Δcys的沉淀延迟到较高温度，而不是稳定其天然结构，因为Tm(变性温度)和ΔH(变性能)均未改变。
同样，分析配有浓度至1％的吐温80的rBPI21Δcys。等温线与不含表面活性剂的rBPI21Δcys溶液相似(图8：扫描图1和8-13，图9：扫描图11、12)。吐温80不能在较高温度下使rBPI21Δcys保持在溶液中。因而只有po1oxamer188对伸展的rBPI21Δcys具有稳定作用。
混合poloxamer188和吐温80的两种制剂，即0.1％F68/0.001％PS80和0.1％F68/0.002％PS80，与含有0.05％和0.1％PLURONIC F68的rBPI21Δcys的扫描图相同，在65℃展开，在85℃沉淀(图8：扫描图14、15)。
除了测定rBPI21Δcys的熔融行为外，将含有0.05％和0.10％poloxamer188的rBPI21Δcys重新扫描以确定伸展是否为可逆过程。先将rBPI21Δcys溶液的温度升至75℃(变性/伸展后、但沉淀前的温度)，然后冷却以重新扫描。图10表明在rBPI21Δcys中加入poloxamer188不能使伸展可逆。图线A5，1和A6，1表示扫描到75℃，而图线A5，2和A6，2表示将体系从75℃冷却后重新扫描。如果伸展是一个可逆过程，那么就会得到6和7扫描线。
上述实验结果表明单用poloxamer表面活性剂能稳定溶液中的BPI相关多肽并延迟沉淀的产生，其机制似乎不涉及调节水溶液的表面张力。这个性质是poloxamer独有的，因为其它表面活性剂如吐温80不影响沉淀现象并且确实涉及水溶液的表面张力的调节。
                      实施例7
在实验室中通过调节水平摇床的速度来模拟装运过程中rBPI21Δcys沉淀的速率。在5个水陆装运(surface shipping)循环中，约70％的未配制的(不含表面活性剂)rBPI21Δcys沉淀。通过改变平板摇床的速度(rpm)，进行振荡实验使70％-90％进行振荡试验的未配制的rBPI21Δcys沉淀。当未配制的产品在摇床上在110rpm或更小的速度下于4℃振荡18小时时，rBPI21Δcys不沉淀。在140rpm下振荡(而不是如实施例1和2中的150rpm)最近似地模拟了在五个水陆运输循环中发生的摇动。140rpm和150rpm下小瓶中液体的流体动力学的变化有很大不同。含有不同浓度的表面活性剂混合物的组合物均进行140rpm振荡实验，得到的结果示于表4中。经测定防止沉淀的最佳表面活性剂浓度是0.2％poloxamer188与0.002％吐温80和0.15％poloxamer188与0.005％吐温80。
                                     表4在4℃、140rpm下rBPI21Δcys的振荡试验小结
    Poloxamer188(％)     PS80(％)  目测结果(见注)     经MA7C HPLC测得的浓度(mg/ml)前        后        损失(％)
    0.005     5     2.14     1.54     28
    0.075     0.010     4     2.10     1.56     26
    0.020     1     2.14     1.68     21
    0.002     5     2.24     1.85     17
    0.005     4     2.14     1.85     14
    0.100     0.010     1     2.10     1.87     11
    0.020     1     2.13     1.94     9
    0.002     3     2.19     1.92     12
    0.005     2     2.08     1.95     6
    0.150     0.010     1     2.19     1.94     11
    0.020     1     2.06     1.96     5
    0.002     2     2.19     1.98     10
0.200 0.005 1 2.19 1.95 11
                                         表4在4℃、140rpm下rBPI21Δcys的振荡试验小结
    Poloxamer188(％)     PS80(％)     目测结果(见注)     经MA7C HPLC测得的浓度(mg/ml)前        后        损失(％)
0.005 5 2.14 1.54 28
    0.010     1     2.22     1.95     12
注：目测评分如下：
1.透明
2.透明，带有少量颗粒
3.微雾浊
4.雾浊
5.浑浊
基于上述数据，2mg/ml rBPI21Δcys在4℃贮存的优选配方是含有5mM柠檬酸盐、150mM NaCl、pH5.0，0.2％poloxamer188和0.002％吐温80。2mg/ml rBPI21Δcys在4℃贮存的另一个配方是含有5mM柠檬酸盐、150mM NaCl、pH5.0，0.15％poloxamer188和0.005％吐温80。
总的来说，凝聚/沉淀是蛋白质不稳定的主要原因之一并可在蛋白质于气一液界面伸展并暴露疏水区域时发生。如果不加保护，通过暴露的疏水结构区域间相互作用蛋白质自缔合，导致凝聚和/或沉淀。使用本发明的表面活性剂和表面活性剂混合物，可通过两种方式稳定蛋白质。第一，在气-液界面上暴露的疏水区被poloxamer表面活性剂遮蔽。第二，通过聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂对溶液表面活性的常规调节获得附加的稳定作用。
对本领域技术人员来说，可对上述发明作出许多改进和变动。因此，只能由所附权利要求对其加以限制。

Claims (12)

1.含有BPI蛋白或其生物活性片段、类似物或变种以及聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂和poloxamer表面活性剂的药物组合物。
2.权利要求1的药物组合物，其中poloxamer表面活性剂的特征是HLB值大于约14，在室温和0.1％浓度下测得的表面张力为10至70mN/m。
3.权利要求1的药物组合物，其中poloxamer表面活性剂是poloxamer188。
4.权利要求1的药物组合物，其中聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂的特征是HLB值大于约10，在室温和0.1％浓度下测得的表面张力为10至70mN/m。
5.权利要求1的药物组合物，其中聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂是吐温80。
6.权利要求1的药物组合物，其中poloxamer表面活性剂的重量浓度为约0.01％至约1％。
7.权利要求1的药物组合物，其中聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂的重量浓度为约0.0005％至约1％。
8.含有BPI蛋白的生物活性氨端基片段或其类似物或变种以及聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯表面活性剂和poloxamer表面活性剂的药物组合物。
9.含有BPI蛋白或其生物活性片段、类似物或变种以及poloxamer表面活性剂的药物组合物。
10.权利要求9的药物组合物，其中，poloxamer表面活性剂的特征是HLB值大于约14，在室温和0.1％浓度下测得的表面张力为10至70mN/m。
11.权利要求9的药物组合物，其中poloxamer表面活性剂是poloxamer188。
12.含有BPI蛋白的生物活性氨端基片段或其类似物或变种以及poloxamer表面活性剂的药物组合物。
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