CN1141002A - 用于感染或炎症病灶位点造影的标记趋化肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测个体中感染或炎症位点的方法和治疗这种感染或炎症的方法，其中给予该个体诊断或治疗有效量的、在感染或炎症位点显著积累的、可检测标记和治疗学上偶联的趋化肽，所述趋化肽具有通式X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，其中X是氨基保护基，Y是氨基酸残基，Z是间隔序列，n是0或1，W是标记或连接取代基。

Description

用于感染或炎症病灶位点 造影的标记趋化肽
本申请是：
A.1993年5月5日递交的美国申请No.08/056,950的部分继续申请，后者是1989年5月4日递交的美国申请No.07/349,186(现已放弃)的继续申请；和
B.1993年5月3日递交的美国申请No.08/055,312的部分继续申请。
技术领域
本发明涉及趋化肽和它们在检测个体中感染和炎症位点及治疗组织损伤中的应用。
相关技术的描述
对各种形式的组织损伤应答而发生炎症。这种组织损伤可以是由微生物侵入、自身免疫过程、组织或器官同种移植排斥、或诸如热、冷、放射能量、电或化学刺激、或机械创伤的伤害性外部影响造成的。无论其原因和躯体位点，随后的炎症反应是很相似的，由一系列复杂的功能和细胞调节组成，包括微循环、液体运动的变化、及炎症细胞(白细胞)的流入和激活。这种应答方式构成了宿主抗感染的固有防卫机制的重要部分，虽然这带来了由炎症过程自身造成进一步组织损伤的“代价”，但它最终促进了随后的修复过程。
当微生物感染时或受到某种形式的组织损伤后，会合成可溶性化学物质，它们引发炎症的级联反应，包括一系列复杂的过程。炎症位点血流增加，并因毛细血管通透性增加，有液体从血液渗出。在受伤位点的这种液体渗出包括正常时离开毛细血管速度相当慢的血浆蛋白。通过被动或主动过程，白细胞也通过毛细血管进入炎症位点。炎症细胞渗出物起始主要由多形核(PMN)白细胞(也称为中性白细胞或粒细胞)组成。随后，在炎症浸润物中可见单核细胞、淋巴细胞和浆细胞。
感染和炎症位点的鉴别和鉴定对人类医学和兽医中的诊断很重要。在早期局部感染时，常常需要搜寻个体中的“隐藏的炎症位点”，其临床症状无特异性，只是发热和体重减轻。与此相似，在患自身免疫疾病如类风湿性器节炎的病人中，或在排斥组织或器官同种移植物的受体中，确定炎症位点、限定其范围、及在治疗开始后监视其变化的能力对有效的临床医护都很重要。
因而，已付出很大努力并开发了许多技术以确定炎症位点并估计炎症过程的程度，这一点就不足为奇了。这些技术包括传统X-射线技术、CAT扫描、和各种放射核扫描。(Sutton，A Textbookof Radiology and Imaging，3rd Ed.，Churchill Livingston(1980)；Maysey et al，Clinical Nuclear Medicine Ed.，W.B.Sanders(1983))。已使用的放射核扫描技术的例子包括：
1.67Ga(镓)，注射后其与浆蛋白结合并趋于定位在慢性炎症位点；
2.111In(铟)标记的粒细胞，当重新注入宿主时，其在炎症位点累积；
3.放射标记的螯合物，其进入细胞外液中然后在液体聚积点累积；和
4.铊扫描或所谓的首过放射核素血管造影，以估测血流增加的面积。
传统的核医学技术使用下列放射性药物用于感染炎症造影：67Ga柠檬酸盐，111In标记白细胞，99mTc标记的白细胞，和111In标记的人多克隆IgG。虽然这些试剂中每种在特定情况下可产生有用的结果，但仍有相当大的待改进之处。
67Ga柠檬酸盐在机制上可与111In-IgG(Mw：150KD)一起归类为标记蛋白，因为静脉注射后67Ga柠檬酸盐立即转而与血浆中的循环运铁蛋白(MW：100KD)和乳铁蛋白(MW：～100KD)螯合。用标记蛋白进行炎症造影是其在炎症位点的积累率和从正常组织清除的速率不同所造成的(Juweid，M.，et al.，Eur.J.Nucl，Med，19：159-165(1992))。由于从正常组织优先洗出和血液清除的原因，用这些试剂进行损伤检测的最佳时间一般是注射后≥24小时。
Thakur等人广泛分析和讨论了基于中性白细胞体外标记的方法(Sem.Nucl.Med.14：107-117(1984))。在此方法中，个体的中性白细胞用γ发射性放射核素(选择111In核素)标记。这样标记的中性白细胞可用于体内动力学研究和炎症病灶的造影。这一技术的一个缺点是在体外标记前需要取出并分离中性白细胞。
白细胞产生许多介质控制炎症反应的范围和持续时间，并在其表面带有许多受体，可与这些化学介质和存在于炎症液中的其他蛋白结合并反应。这种受体一介质相互作用对控制炎症位点白细胞功能很重要。炎症介质中有趋化因子(也称为化学引诱物)，其具有诱导PMN和巨噬细胞定向迁移和活化的能力(综述和讨论见：Roitt等等，Immunology，Gower Medical Pub.，London(1985))。
111In标记的白细胞已是很成功的造影剂，但需要较长的准备时间和血液操作。研究时间还要进一步延长，因为放射标记细胞注射后需要数小时去定位，因为它们必须先寻找趋化信号，然后迁移到炎症位点。另外，剂量测定法方面的考虑限制了可施用的放射活性量，常导致造影质量差。虽然可使用剂量高得多的99mTc标记白细胞，但放射活性在非靶标器官中的积累限制了其普遍实用性。
通过发展低分子量放射药物可显著降低从注射到损伤检测间的时间，这种放射药物与循环炎症细胞以及已存在于炎症位点的细胞结合。具有这些特征的候选分子包括：IL-8(Baggiolini，M.等，J.Clin.Invest.84(4)：1045-1049(1989))，血小板因子-4(Deuel，T.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)：4584-4587(1981)和肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-MLF)(MW437)(Showell，H.J.等，J.Fxper，Med.143：1154-1169(1976)；Schiffmann，E.等，Proe.Natl Acad.Sci.USA 72：1059-1062(1975)；Williams，L.T.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74：1204-1208(1977))。
For-MLF是一种细菌产物，它通过与白血细胞膜上高亲和力受体结合而引发白细胞趋化性(Williams，L.T.等，Proc.Nat.Acad.Sci USA 74：1204-1208(1977)；Showell，H.J.等，J.Exper.Med.143：1154-1169(1976)；Schiffmann，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：1059-1062(1975))。这些受体既存在于多形核细胞上也存在于单核吞噬细胞上。虽然许多体外结构-活性研究已证明这些小的N-甲酰-甲硫氨酰肽的许多合成类似物结合中性白细胞和巨噬细胞，与此天然肽相比亲和力相等或更强(Niedel.J.等，J.Biol.Chem.255：7063-7066(1980)；O’Flaherty，J.J.等，J.Immunol.120：1326-1332(1978)；Rot，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7967-7971(1987)；Iqbal，M.等，FEBS 165：171-174(1984))，但体内生物分布和生物活性研究相当有限。因为粒细胞与化学引诱物梯度应答；随着额外的受体被表达，受体的亲和力下降，直到细胞到达炎症位点，在那里化学引诱物的浓度最高(Snyderman，R.等，RevInfect.Dis.9：S 562-S569(1987)；Fletcher，M.P.，J.Immunol.128：941-948(1988)；Niedel，J.，等，J.Biol.Chem.10：700-710(1979))。由于For-MLF(MW 437)非常小，其分子结构易于掌握以设计最佳的造影剂。
许多种类的的细菌可产生一类或多类趋化分子，可以是小肽、较大的蛋白，也可以是脂质(Klein，I.，Immunology：The Science ofSelf-Nonself Discrimination，Wiley Interscience，New York(1982))。例如，已知大肠杆菌产生强趋化分子，这些分子含有带封闭氨基的异源性小肽作为其活性成分。已合成了这种肽并显示为多形核白细胞的强化学引诱物。这些趋化肽中最熟知的是For-MLE和一些相关的四肽(Schiffman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：1059-1062(1975)；Schiffman等，美国专利4,427,660(1984))。这些肽的结构功能研究揭示在靶细胞表面存在立体特异性受体(Becker，E.L.Am.J.Pathol.85：385-394(1976))；然后用放射标记甲酰肽作为配体检测这种受体(Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：1204-1208(1977))。
随后，合成了结构为N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys的趋化肽，并显示与人中性白细胞上的受体结合力强，该肽可在Tyr残基上用125I以高比放射活性标记(Niedel等，J.Biol.Chem.254：10700-10706(1979))。
细菌细胞也可诱导宿主细胞产生趋化因子，例如通过激活宿主补体系统的成分，造成局部产生趋化分子，C5a和C5b67。一旦宿主中发生了免疫应答，IgG抗体分子也可作为趋化因子，因为被激活的T淋巴细胞产生的分子可以作为趋化因子。基于炎症细胞类型上存在的适当受体，不同的趋化分子对各种多形核细胞(如，嗜中性白细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞)、肥大细胞、单核细胞/巨噬细胞或淋巴细胞具有选择性。
趋化肽是许多结构-活性研究的焦点，以确定分子负责受体结合和激活的特异特征(Deuel，T.F.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)：4584-4587(1981)；O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.120：1326-1332(1978)；Rot，A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7967-7971(1987)；Iqbal，M.，等，FEBS 165：171-174(1984))。这些研究大部分集中在For-MLF序列中天然氨基酸的取代；但已有关于受体结合和激活EC50值小于或等于天然肽的加长肽和高负电肽的报道(Fischman，A.J，J.Nucl.Med.32：483-491(1991)；Toniolo，C.等，Biochem，23：698-704(1984))。总的看来，这些结构-活性研究的结果得出：虽然N-末端的修饰对受体结合和激活有很大的不利影响，但在C-末端的修饰影响很小(Spisani，S.等，Inflammation 10：363-369(1986))。另外，受体结合与生物活性高度相关(Deuel.T.F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1)：4584-4587(1981)；Schiffmann，E.等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 72：1059-1062(1975))。基于这些资料，已有人提出了一种受体-肽复合物结构模型，其中只有N-末端的4个氨基酸与受体相作用(Freer，R.J.，等，Biochem.21：257-263(1982))。
已证明在C-末端修饰的合成For-MLF类似物与中性白细胞和巨噬细胞结合，与天然肽相比亲和力相等或较高(Deuel，T.F.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)：4584-4587(1981)；Schiffmann，E.，等，Proc.Natl Acad Sci.USA 72：1059-1062(1975)；Niedel.J.等，J.Biol.Chem.255：7063-7066(1980))。这样在C-末端包含标记片移使含得制备了保留受体结合特性的放射标记类似物。
这种感染造影的方法比现用的放射药物有几个理论上的优势。这些小分子与循环粒细胞以及已存在于炎症位点的白细胞结合的能力，可显著减少从注射到损伤检测之间的间隔时间。这种肽的分子量小(＜1000D)，使得与标记蛋白和白细胞相比能更快地扩散到感染和炎症区域。另外，粒细胞的就地放射标记避免了细胞功能的改变(传统标记方法常如此)和血液操作(其对工作人员和病人的固有危险)。
Zoghbi等人(J.Nuc.Med.22：32(1981))用运铁蛋白与肽偶联用111In标记For-MLF，并提示该试剂在选择性标记人中性白细胞上是肯定的。虽然此方法提供了解决标记特异性问题的一种潜在方案，但它没有提出一种克服从个体采取细胞、体外处理它们、然后重输回个体这一复杂状况的方案。
有一篇报导描述了在兔中直接注入125I标记的N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys体内定位无菌脓肿的尝试(Jiang等，Nucl.Med.21：110-113(1982))。虽然达到了有效标记率(脓肿与肌肉之比)，但使用该试剂会导致暂时性中性白细胞减少，然后返弹性中性白细胞增多。作者承认需要进一步开发以避免中性白细胞减少/中性白细胞增多的付作用并使该方法可用于临床。另外，125I不能很好地造影，而且该文献也没有披露或提示较好的造影同位素，如123I、111In或99mTc。
Morgen等人在美国专利4,986,979中公开了一种提高炎症组织位点上标记物集累量的方法。该方法利用了白细胞激活时表面抗原标志的正调节。描述了一种利用含亲和标记物的趋化肽和与白细胞结合的放射核素的造影方法，以及这种提高的造影应用。这些作者没有公开合成拮抗剂的任何合成方法，或公开这种拮抗剂可用于避免中性白细胞减少反应。
虽然上述技术可能提供了有用的信息，它们仍可能造成不可接受的高频假阳性和假阴性结果，需要过多的操作和加工，或伴有不可接受的付作用。因此，本领域中一直公认需要一种更直接、更灵敏、更特异的检测和定位感染或炎症位点的方法，特别是可连续进行以测评治疗的时间响应的技术。
发明简述
基于可检测标记的趋化肽全身性注射到动物体内后在局部感染位点积累这一发现，本发明涉及一种基本非侵入性的感染或炎症位点造影方法。
更具体地讲，本发明涉及一种检测个体中感染或炎症位点的方法，其包括：
a.给予该个体诊断有效量的可检测标记的趋化肽
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为氨基保护基，
Y为氨基酸残基，
Z为间隔序列，
n为0或1，和
W为下式结构的标记或连接取代基
-[K]v-M1
其中：
K为中间功能团，
v为0或1，及
M1是诊断学上可检测的标记物；及
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累；和
b.检测该趋化肽。
在一种优选实施方案中，本发明涉及一种检测个体中感染或炎症位点的方法，其包括
a.给予该个体诊断有效量的可检测标记的趋化肽
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为氨基保护基，
Y为
Figure A9419435200251
其中，R1为苄基，烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，和
R2为-S-
Figure A9419435200252
或-O-
Z为间隔序列，
n为0或1，和
W为下式结构的标记或连接取代基
-[K]v-M1
其中：
K为中间功能团
v为0或1
M1是诊断学上可检测的标记物；及
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累；和
b.检测该趋化肽。
在另一实施方案中，本发明涉及一种可检测标记的趋化肽
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为下式结构的氨基保护基
其中：R3选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4为氧或硫
Y为氨基酸残基，
Z为选自1-6个碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的间隔序列，其中R6为氨基酸残基，m为大于或等于1的整数，
n为0或1，及
W是下式结构的标记或连接取代基
-[K]v-M1
其中K为DTPA、EDTA或HYNIC，
v为1，及
M1是111In或99mTc；且
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累。
本发明范围内还包括含有这种趋化肽的治疗组合物，尽管对这种组合物来说并不总是要求包含可检测片段。更具体地讲，本发明涉及含有下式趋化肽的治疗组合物：
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-[T]α
其中：
X为下式结构的氨基保护基
Figure A9419435200262
其中：R3选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4为氧或硫
Y为氨基酸残基，
Z为选自1-6个碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的间隔序列，其中R6为氨基酸残基，m为大于或等于1的整数，
n为0或1，
T是治疗剂，
α为0或1；
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累。
本发明从而涉及一种检测个体中感染或炎症位点的体内方法。该方法包括给予该个体可检测标记的趋化肽，这种肽在感染或炎症位点显著积累但不在无感染或无炎症位点积累。
本发明还包括其上已连有适当的螯合分子或可检测标记物的各种趋化肽。
附图的简要说明
图1是表示4种与DTPA偶联的趋化肽与人中性白细胞结合试验结果的图。该试验是一种竞争性结合试验，其中[3H]For-MLF被递增浓度的未标记肽所置换。
图2是表示4种与DTPA偶联的趋化肽刺激人中性白细胞产生超氧化物试验结果的图。该试验中包括MLF用于比较。
图3趋化肽类似物刺激的超氧化物产生。人多形核细胞仅与HBSS或与所示浓度的肽37℃保温10分钟，然后测定高铁细胞色素的还原。
超氧化物最大产量的百分数＝E/M×100其中E是在所示浓度肽存在下所产生的超氧化物的量，M是这种肽所产生的超氧化物的最大量。
        For-NleLFK-HYNIC：HP1；For-MLFK-HYNIC：HP2；For-MLFNH(CH2)6NH-HYNIC：HP3；For-MLF-(D)K-HYNIC：HP4.
图4：趋化肽类似物对For-ML[3H]F与人多形核细胞结合的作用。完整的人多形核细胞(8×105)与培养缓冲液或所示浓度的肽在15 nM For-ML[3H]F存在下24℃保温45分钟，然后测定特异性For-ML[3H]F结合。
最大For-ML[3H]F结合的百分数＝E/C×100
其中E是所示浓度的未标记肽存在下的特异性cpm，C是只有缓冲液存在下For-ML[3H]F的特异性cpm。For-NleLFK-HYNIC：HP1；
For-MLFK-HYNIC：HP2；For-MLFNH(CH2)6NH-HYNIC：HP3；For-MLF-
(D)K-HYNIC：HP4.
图5：肽浓度对放射化学产率(％)和比活性(mCi/Mole)的影响。显示了对于For-MLF-(D)K-HYNIC的数据。用所有受试肽得到了相似的结果。
图6：大肠杆菌感染的大鼠中99mTc标记肽的靶标-本底比(T/B)。感染肌肉中％ID/g除以对侧正常肌肉中的相应值计算得到数据。均在注射前24小时建立感染。每个数据点是5-6只动物的均值±均值的标准误(SEM)。
图7：注射99mTc-标记趋化肽类似物后，大肠杆菌股部感染兔的代表性γ照相图象。该图象是在注射大约1mCi的99mTc-标记HP2 17小时后得到的，在注射前24小时产生感染。
图8：注射99mTc-标记HP2 17小时后大肠杆菌股部感染的兔中的生物分布。数据用平均百分注射剂量/g组织表示。误差棒是指SEM。注射99mTc-标记HP2前24小时产生感染。
图9：大肠杆菌感染的兔中注射99mTc标记HP4 17小时后的靶标-本底比(T/B)。感染肌肉或脓中％ID/g除以对侧正常肌肉中的相应值计算得到数据。均在注射前24小时建立感染。对于感染肌肉，数据中包括6只动物的28个标本。对于脓，数据中包括6只动物的6个标本。
图10：表示了4个HP3制剂注射后4个时间点上血液、肺、肝、脾、肾和消化道中百分注射剂量/克。
图11：这是下文实施例85中试验方法的流程示意图。在-15和-5分钟及注射后0.25、0.5、1、3、5、10和20分钟采取用于血液学测定的血样。
图12：ForNle LFNleYK-DTPA对猴外周白血细胞水平的影响。总的外周白血细胞计数以基线水平的百分数表示。使用4个剂量的肽(ng/kg)。P：注射肽；V：注射载体。
图13：注射99mTc-标记的For-Met-Leu-Phe-NH-(CH2)6-NH-HYNIC 3和12小时后股部感染的雌性Rhesus猴的γ照相图象。所有的图象均对最亮的照片(pixel)标准化。
图14：99mTc-HP和111In标记的白细胞共同注射后6和18小时大肠杆菌股部深处感染兔的γ照相图象。99mTc图像对99mTc窗中的111In光子矫正。所有的图像都对早期99mTc-HP图像中的总计数标准化。注射前24小时建立感染。
图15：注射后3、6和18小时闪烁照相的ROI分析所得99mTc-HP和111In-白血细胞的靶标-本底比。每个数据点是6只动物的均值±SEM。所有动物均在注射放射示踪剂之前24小时被感染。
图16：注射后18小时在切出的组织标本上通过直接放射活性测定法测得的99mTc-HP和111In-白血细胞的靶标-本底比。小圈代表99mTc-HP的所有值(6只动物的30个标本)，大圈表示均值±SEM。小方块代表111In-白血细胞的所有值(6只动物的30标个)，大方块表示均值±SEM。所有动物均在注射前24小时感染。
图17：注射后18小时在切出的组织标本上通过直接放射活性测定法测得的99mTc-HP和111In-白血细胞的脓与正常肌肉之比。每个数据点是6只动物的均值±SEM。所有动物均在注射前24小时感染。
优选实施方案的描述
“炎症”和“炎症位点”用于指个体中由于组织损伤(无论其原因或病因)所发生的状况和其位置。这种组织损伤可以是由微生物侵入、自体免疫过程、组织或器官同种移植排斥、或伤害性外部影响因素如热、冷、放射能量、电或化学刺激、或机械创伤所造成的。无论其起因和身体位点，随后的炎症反应是相当相似的。由一系列复杂的功能和细胞调节所组成，包括微循环、液体运动的改变以及炎症细胞(白细胞)的流出和激活。
“感染”一词指细菌、病毒、真菌、原生动物和其他微生物的侵入。
“个体”一词包括动物如哺乳动物，尤其是人。
“激动剂”一词这里指与一种受体结合并刺激该受体功能的趋化肽。
“拮抗剂”一词这里指阻止对受体刺激的趋化肽。作为拮抗剂的趋化肽对细胞受体具有亲和力，并通过与之结合阻止细胞的应答。
“诊断有效”一词用于描述剂量，是指所给予的可检测标记趋化肽的量足以使得能够检测感染或炎症位点，即高于背景信号。
一般说来，可检测标记趋化肽的诊断剂量将根据如患者年龄、状态、性别和患病程度、禁忌症和其他变量而变化，将由有关医生来调节。剂量可在约0.01微克/公斤到约2000微克/公斤之间变化，优选为约0.1微克/公斤到1000微克/公斤。
“末端修饰的趋化肽”一词是指包括担不限于具有以下通式结构的分子：
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为氨基保护基，
Y为氨基酸残基，
Z为间隔序列，
n为0或1，和
W为标记或连接取代基。
在上述通式结构中，X是氨基保护基，即保护氨基的基团，可以是本领域技术人员已知可用于此目的的许多基团中的任何一个。下述流程图说明几种向趋化肽上加入氨基保护基的有用的合成路线。    Met-Leu-Phe的N-末端衍生化
a.1.RNCO，Et3N，DMF；2H3O+
b.1.ROCOCl，Et3N，DMF；2H3O+
c.1.RCOCl，Et3N，DMF；2H3O+
d.1.RSO2Cl.Et3N，DMF；2H3O+
e.盐酸1，1-吡唑-1-甲酰胺Et3N，DMF；2H3O+
f.RNCS，Et3N，DMF；2H3O+
g.1.(RO)2POCl.Et3N，DMF；2H3O+
h.2，5-二甲氧基四氢呋喃NaOAc，AcOH
一般而言，但考虑趋化肽(CP)上的氨基保护基即N-末端保护基时，将此片段看作一个单一的单元更准确，而不是看作一个被“隔离基团”与CP分隔开的“庞大”的基团。保护基团的这两个部分可能都与受体通过立体、静电和疏水作用而作用。因此保护基的组成作为一个整体将最终决定CP的活性。这一概念例如被以下事实所支持，观察到氨基甲酸正丁基酯保护的CP比相应的正丁基脲保护的CP活性低近10倍。这两个保护基具有相同的脂肪侧链，但是键角、旋转度和静电特征不同。
当将CP的N一保护从氨基甲酸酯(尿烷)换成脲时，N-末端的整体形状可能就会改变，脲的键角不同，旋转自由度明显小(羰基-N键比羰基-O键旋转度小)。这些因素可能对CP-受体的总体匹配性有些影响。
引入脲将改变CP N-末端的静电特征。这些静电差异可导致受体中氢键作用的改变。
脲的整体大小与氨基甲酸酯的大小没有明显区别。但可能存在的例外是脲的受阻旋转可能将其锁定到一种特异的构象，这种构象对其与受体的匹配有显著影响。这更多的涉及形态而不是整体大小。
也许在CP N-末端装配脲保护基的最合理的原因是脲在较宽范围的条件下比氨基甲酸酯更稳定。因此其在高酸性条件下的稳定性允许在C-末端连接片段上进行更宽范围的化学转化。
本发明范围内还包括其他相关的氨基保护基，如含有杂原子的脲-硫脲、磺酰胺、膦酰胺、胍和磺酰脲。
文献中公开了许多其他氨基保护基，如叔丁氧羰基、乙酰基、苄氧羰基、甲酰基、硫代甲酰基、氰基脒和甲氧羰基。
用异丁氧羰基和烷基(C3-C6支链和环状)氨基甲酰基保护氨基末端也可产生有效的趋化肽(它们可以是激动剂或拮抗剂)。
以下列出了适用于趋化肽的一些氨基保护基。这些保护基的合成方法参见“Protecting Groups In Organic synthesis”JohnWiley&Sons：New York，1981；第6章。
a.氨基甲酸酯：
氨基甲酸环丙基甲基酯
氨基甲酸1-甲基-1-环丙基甲基酯
氨基甲酸二异丙基甲基酯
氨基甲酸2-甲硫基乙基酯
氨基甲酸1，1-二甲基丙炔基酯
氨基甲酸叔戊基酯
氨基甲酸环戊基酯
氨基甲酸环己基酯
氨基甲酸9-芴基甲基酯
氨基甲酸1-金刚烷基酯
氨基甲酸1，1-二甲基-2-2-三氯乙基酯
氨基甲酸2，2，2-三氯乙基酯
氨基甲酸1-甲基-1-苯乙基酯
氨基甲酸2，4-二氨苄基酯
b.羧酰胺及其相应的硫代羧酰胺
噻吩甲酰胺
金刚烷基甲酰胺
4-溴丁酰基甲酰胺
肉桂基甲酰胺
烟酰基甲酰胺
c.脲、其相应的硫脲和氰基胍衍生物
苄基脲
2，4-二氟苯基脲
1-萘基脲
苯基脲
二苯基脲
丙基脲
杂合脲
d.磺酰胺
苯磺酰胺
二甲氧苯磺酰胺
甲苯磺酰胺
苄磺酰胺
三氟甲磺酰胺
e.膦酰胺
苯膦酰胺
二甲氧苯膦酰胺
甲苯膦酰胺
苄膦酰胺
三氟甲膦酰胺
在本发明的一个优选实施方案中，X是其中R3选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4是硫属原子，优选氧或硫。
当R3是烷基时，优选1-6个碳原子的烷基，更优选3-6个碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及己基或其异构体，如异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、2-乙基丁基等。最优选异丁基和叔丁基。
当R3是链烯基时，优选2-6个碳原子的链烯基，更优选2-4个碳原子的链烯基，即乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基及己烯基或其异构体，如异丙烯基、异丁烯基、仲丁烯基、叔丁烯基、新戊烯基、2-乙基丁烯基等。
当R3是炔基时，优选2-6个碳原子的炔基，更优选2-4个碳原子的炔基，即乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基及己炔基或其异构体，如异丙炔基、异丁炔基、仲丁炔基、叔丁炔基、新戊炔基、2-乙基丁炔基等。
当R3是烷氧基时，优选1-6个碳原子的烷氧基，更优选3-6个碳原子的烷氧基，即甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基及己氧基或其异构体。
当R3是芳烷氧基时，优选苄氧基，即Φ-CH2-O-，其中苯基(Φ)可被取代或不取代。
当R3是氨基时，优选-N(H)R5，其中R5选自氢、烷基、环烷基和芳基。
当R5是烷基时，优选1-4个碳原子的烷基，更优选3-4个碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基或其异构体，如异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
当R5是环烷基或芳基时，优选环戊基、环己基、金刚烷基、苯基或联苯基，更优选环己基或苯基，其可以被取代或不取代。
在上述通式中Y是氨基酸残基，可以是可用于该目的的任何这种残基。在本发明的一种优选实施方案中，Y是其中R1是苄基、烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，及
R2为
-S-，
Figure A9419435200372
或-O-
当R1是烷基时，优选1-6个碳原子的烷基，即甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或其异构体，如异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、2-乙基丁基等。R1是烷基时更优选3-4个碳原子的烷基。
在本发明的另一优选实施方案中，Y是4-氨基四氢吡喃-4-羧酸(Thp)。用Thp产生的类似物是对人中性白细胞的化学引诱剂，但不刺激超氧化物的产生。合成并测试的肽是甲酰基-Thp-Leu-Phe-OMe。
在上述通式中Z是任何有用长度的间隔序列。根据n是0或1，它可以存在也可以不存在。当n是1时，Z存在并优选为脂肪二胺或[R6]m，其中R6是氨基酸残基。m是大于或等于1的整数，优选1-3的整数。Z还可以是脂肪二胺和[R6]m的结合。
当Z是脂肪二胺时，优选1-6个碳原子的脂肪二胺，如甲二胺、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺和己二胺。当Z是脂肪二胺时，更优选4-6个碳原子的脂肪二胺，如丁二胺(也称cadaverine)、戊二胺(也称putrescine，以下称为Pu)和己二胺。
当Z为[R6]m时，根据m的值不同，可有一个或多个氨基酸残基。当存在两个或多个残基时，它们可相同或不同。组成间隔序列的氨基酸可以是本领域技术人员所熟知的任何氨基酸，可以是必须的或非必须的。例如，R6可为下列氨基酸之一或其组合：精氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸。在实施本发明中用作间隔序列的优选氨基酸残基是下列氨基酸或其组合：正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
如上所述，W是标记或连接取代基。W代表用于对本发明的实施中所用趋化肽进行可检测标记的片段。“可检测标记”一词指在趋化肽上连接上诊断学上可检测的标记物。
本领域中已知许多不同的标记物和标记方法。可用于本发明的标记物类别的实例包括放射性同位素、顺磁性同位素、和可通过正电子发射体层成象(PET)造影的化合物。本领域技术人员将明了可与本发明趋化肽结合的其他适宜标记物，或利用常规试验能够确定这种标记物。而且，这些标记物与趋化肽的结合可利用本领域技术人员公知的标准技术来进行。
对进行体内诊断造影，可利用的检测仪器类型是选择给定放射核素的主要因素。所选择的放射核素必须具有可被给定类型的仪器检测的衰变类型。一般讲，用于诊断造影的任何常规显影方法都可用于本发明。
选择体内诊断放射核素的另一重要因素是其半衰期要足够长使得靶组织达最大吸收时仍可被检测，但又要足够短使宿主的有害幅射达到最小。在一优选实施方案中，用于体内造影的放射核素不发射颗粒，但产生大量的140-200KeV范围的光子，这容易被常规的γ照相机检测。
为了进行体内诊断，放射核素可直接与起化肽连接，或通过一中间功能团间接连接。常用于将金属离子放射同位素与趋化肽连接的中间功能团是螯合剂，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)(Hnatowich，D.J.，Int.J.Appl.Radiat.Isot.，33：327-332，(1982))和乙二胺四乙酸(EDTA)。用于连接Tc与肽的其他常用螯合基团包括(1)二肪配体，(2)官能化cyclams，(3)N2S2配件，和(4)N3S配件。
或者，可将反应活性硫醇通过(5)亚氨基硫杂戊环与赖氨酸残基结合，或可将硫醇残基用含一个或多个Cys残基的氨基酸序列与肽结合
可与趋化肽结合的金属离子的实例为99mTc、123I、131I、97Ru、67Cu、67Ga、125I、68Ga、72As、89Zr和201Tl。优选99mTc和111In。
111In标记的趋化肽是用于大鼠中感染病灶位点外部造影的有效试剂(Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32：483-491(1991))。但肽的生物半衰期短，降低了111In(t1/2：67.9h)造影的实用性。由于其物理半衰期短、比活性高、造影性能极佳、造价低及有广泛供应，99mTc是标记趋化肽的理想放射核素。虽然已有许多技术用于99mTc标记，但肼基烟酰胺基团(HYNIC)的效果尤其肯定。肼基烟酸的活性琥珀酰亚胺酯(SHNH)已成功地用于衍生蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基。这些结合物与具有Tc(V)氧代核的简单配合物如99mTc-葡庚酸盐一起保温就可造成定量标记(Abrams，M.J.等，J.Nucl.Med.31：2022-2028(1990))。
用99mTc对大分子的标记方法可分成三大类：直接标记、双功能团螯合物、和预成螯合物。现今优选的利用HYNIC(SHNH)接头的标记方法是利用辅助配体，例如高锝酸根离子在螯合前体存在下还原以形成易变的99mTc-前体配合物(这里称为“辅助配体”)，后者再与双官能修饰CP的金属结合基团反应形成99mTc-CP结合物。如上所述，99mTc-葡庚糖酸盐辅助配体可用于已用SHNH基团修饰的蛋白的放射标记(Schwartz，D.A.，等，Bioconjugate Chem.2：333-336(1991))。但这要求60分钟保温及比活性大于25mCi/mg，以使放射标记率大于90％。多羟基氨基酸tricine可用作99mTc标记SHNH修饰的多肽和蛋白的更有效和易得的标记前体。
Tricine，即三(羟甲基)甲基甘氨酸，和其类似物可与氯化亚锡还原剂一起配制成PH6-8的水溶液，以自发形成99mTc前体。在ITLC-SG条上进行“Tc-tricine”辅助配体的形成分析，与99mTc-葡庚糖酸盐的分析相似，用盐水在原点进行TcSn胶体定量，用甲基乙基酮在溶剂前沿进行高锝酸根的定量。在与99mTc-葡庚糖酸盐的相似条件下，“Tc-tricine”溶液(36mg/ml前体，50μg/ml氯化亚锡，PH6.0)在室温数分钟内放射标记SHNH修饰的IgG达90％以上。另外，与Tc-葡庚糖酸盐相比，“Tc-tricine”溶液可以大于150mCi/mg蛋白的比活性达到＞90％的IgG-SHNH放射标记。在SHNH修饰的小分子如CP的标记中，应用高比活性的定量放射标记更加重要。
可按以下总步骤标记HYNIC修饰的肽：
拌搅下向新制备的Sn/tricine溶液(72mg/ml tricine，PH7.0-7.2，100μg/ml SnCl2·2H2O)中加入等体积的发生剂洗出的99mTcO4 -(30mCi/ml)。用1×8cm的ITLC-SG检测条测定99mTc-tricine的产生，用盐水或甲基乙基酮洗脱剂分别测定胶体或高锝酸根。将99mTc-tricine立即加入肽溶液中。通过将1mg肽溶解在600μL乙酸并加入400μL微酸性水，静量30分钟使腙脱保护，用PH5.2乙酸缓冲液将肽按1∶10稀释，可制得1mg/ml的肽溶液，如iboc MLF-HYNIC腙。通过100μL 99mTc-tricine与15μL溶液混合制备99mTc-肽结合物。保温1小时后，用1×8cmITLC-SG检测条以25％w/w NaCl溶液作为洗脱剂测定99mTc-肽的生成百分率，其中99mTc-肽留在原点，而所有其他成分被洗脱至溶剂前沿。
适合的趋化肽的实例包括但不限于：
N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPA
N-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPA
N-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPA
N-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA
N-苄氧羰基-Met-Leu-Phe-甲酯
IBOC-L-甲硫氨酰(亚砜)-L-Leu-L-Phe-L-赖氨酰胺
IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-赖氨酰胺
N-For-L-甲硫氨酰(亚砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys
N-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys
N-异丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸
异丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-Lys
N-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶剂化物
N-For-甲硫氨酰-亚砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-三甲基乙酰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
异丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys
异丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC
异丙基脲-Met-Leu-Phe-正丙基二胺-Asp-SHNH HBr
异丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr
异丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr
N-苯基脲-Met-Leu-Phe
异丙基脲-Met-Leu-Phe-丙二胺-SHNH
N-正丁基硫脲-Met-Leu-Phe
N-正丁基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe
N-异丙基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOH
iBOC-Met-Leu-Phe-COOH
iBOC-Met-Leu-Phe[酰氨基(丙基酰氨基)羧基[(丙基)羧基)]-(酰氨基丙醇SPNH)酯
N-异丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸
N-正丙基脲-Met-Leu-Phe
N-叔丁基脲-Met-Leu-Phe
N-正丁基脲-Met-Leu-Phe
iBOC-Met-Leu-Phe-(酰氨基乙氧基乙基[3-酰氨基]-6-丙烯醛腙)-吡啶
N-iBOC-Met-Leu-Phe-SPNH-硫代酯
N-异丙基脲-Met-Leu-Phe
N-iBOC-Met-Leu-Phe-丙二胺-SPNH
环己基脲-Met-Leu-Phe-COOH
N-正丁基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯
N-iBOC-Met-Leu-Phe-甲酯
N-甲基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯
N-金刚烷基脲-Met-Leu-Phe
N-肉桂酰基-Met-Leu-Phe
对甲苯基脲-Met-Leu-Phe
间甲苯基脲-Met-Leu-Phe
N-肉桂酰基-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe。
除确定和鉴定病灶性感染和炎症位点外，本发明的方法可用于监视个体中的炎症过程。例如，通过测量炎症位点大小或数目的增大或减小，可能确定旨在改善感染或炎症过程的其他起因的、或针对炎症过程自身的具体治疗方案是否有效。
在另一实施方案中，本发明用于诊断该位点炎症的特异根本原因。在此方法中，首先给予怀疑有炎症点的个体以诊断有效量的趋化肽(如前所述)，然后进行放射照相造影，以确定该位点的存在和其位置。
用于实施本发明的趋化肽可为激动剂或拮抗剂。在某些情况下，根据其所用浓度所给予的肽可是这两者。
肽iBOC-MLFK和iBOC-MLFK-DTPA拮抗ForMLF刺激的中性白细胞释放自由基，以及被激活的中性白细胞体内与血管内皮细胞的粘附。用111In接头DTPA对C-末端的修饰仍保留了拮抗活性。这些肽不表现任何激动活性。
通过比较激动肽甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酷氨酰-赖氨酸-DTPA(For-Nle FNle YK-DTPA)和拮抗肽iBoc-MLFK-DTPA进行体内造影研究。111In标的肽迅速定位在感染位点。γ照相图象和组织生物分布都证实了这种定位。这两种肽的主要区别在于激动肽定位于诸如肺、脾和骨髓的区域中、指示细胞活化和着边，而拮抗肽却并非如此。激动肽引起白血细胞计数的暂时性下降(中性白细胞减少)，而拮抗肽没有显著影响。这些结果是激动剂-拮抗剂的合理结果。激动肽显示在5小时内靶标-本底比一直增加，而拮抗肽在1小时时最有效。这提示较高的结合亲和力(如与激动肽)可造成靶标-本底比提高，并在治疗学上有利。这些结果很有用，还因为以前不清楚拮抗剂是否能显示造影能力。这种能力对本领域技术人员不是显而易见的，因为结合和造影有可能要求借助激动剂来激活。结果发现并非如此。
拮抗肽t-Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe抑制中性白细胞介导的溶酶体酶释放。另外，其他的尿烷N-末端封闭基团并不能将肽转化为拮抗剂，反而转化为激动剂(甲氧羰基和苄氧羰基)。N-末端iBoc保护基也适于拮抗肽，在C-末端赖氨酸处被DTPA修饰的iBoc肽保持适当的生物活性。
本发明通过显示拮抗剂iBoc-MLFK抑制与疾病相关的中性白细胞与内皮粘附和释放自由基的功能发展了本领域。该肽还在体内定位患病位点。另外，它在发挥这些作用时并不改变白血细胞的数目。这些结果与粘附反应封闭性拮抗肽和其他潜在拮抗剂的应用相一致，即作为感染/炎症疾病的治疗和诊断剂。
肽骨架的修饰
用其他化合物替代上述通式结构中的一个Leu或Phe残基也在本发明范围之内。
a.亮氨酸
用二丙基甘氨酸(Dpg)替代亮氨酸残基，生成的类似物是对人中性白细胞的化学引诱物。所制备并测试的肽是甲酰-Met-Dpg-Phe-OH。
用1-氨基环己烷羧酸(Acc6)替代亮氨酸残基，生成的类似物是兔中性白细胞中溶菌酶释放的强诱导剂。所合成并测试的肽是甲酰-Met-Acc6-Phe-OH。
b.苯丙氨酸
用z-脱氢苯丙氨酸替代苯丙氨酸残基，生成的类似物刺激兔中性白细胞产生超氧化物。所合成并测试的化合物是甲酰-Met-Leu-z-Phe-OMe。
以下列出了制备用于骨架修饰的替代氨基酸的参考文献：
a)4-氨基四氢硫代吡喃-4-羧酸(替代甲硫氨酸)公开于Torrini等，Indian Journal of Peptide Protoin Research 38：495-504(1991)；
b)二丙基甘氨酸和1-氨基环己烷羧酸(替代亮氨酸)公开于Dentino等，The Journal of Biological Chemistry 28：18460-18468(1991)；
c)z-脱氢苯丙氨酸(替代苯丙氨酸)用Chauhan等，Tetrahedron 44：2359-2366(1985)中描述的方法制备；
d)2-氨基二氢茚酮-2-羧酸(替代苯丙氨酸)公开于Gavuzzo等，Indian Journal of Peptide Protein Research 37：268-276(1991)；和
e)苯胺基甘氨酸(替代苯丙氨酸)按Krahs等，EuropeanJournal of Medicinal Chemistry 27：19-26(1992)中描述的方法制备。
在本发明的另一方案中，趋化肽可被“治疗学结合”并用于输送治疗剂至感染或炎症位点。“治疗学结合”一词指趋化肽与治疗剂结合。以此方式使用的治疗剂针对炎症的根本病因，如感染生物或肿瘤，或针对炎症过程自身的成分。用于治疗炎症的药剂实例有甾类和非甾类抗炎药。许多非甾类抗炎药抑制前列腺素的合成。
可用于按本发明方法与趋化肽偶联的其他治疗剂有药物、放射性同位素、植物血凝素、毒素、和抗微生物药。服用的治疗剂量是治疗有效的量，本领域技术人员容易确定。该剂量还取决于受体的年龄、健康和体重、共同治疗(如果有的话)的种类、治疗频率、目标效应的性质，如抗炎效应或抗菌效应。
植物血凝素是常源自植物的与碳水化合物结合的蛋白质。许多植物血凝素还能使细胞凝集并刺激-些淋巴细胞。蓖麻蛋白是已用于治疗学的一种毒性植物血凝素，通过将负责毒性的α-链与抗体分子结合，以达到位点特异性运送毒性效应。在本发明的一种实施方案中，蓖麻蛋白α-链与趋化肽结合。
毒素是由植物、动物和微生物产生的有毒物质，在足够剂量下可能是致命的。白喉毒素是由白喉棒状杆菌产生的一种蛋白，由可分离的α-和β-亚单位组成。该毒性成分可与趋化肽结合，用于向感染或炎症反应位点上特异性输送。
为治疗目的可与趋化肽结合的按本发明方法使用的放射性同位素的例子有：125I、131I、90Y、67Cu、217Bi、211At、212Pb、47Sc、186Re、188Re、105Rh、153Sm和109Pd。
可用于实施本发明的抗微生物药是能抑制感染性微生物如细菌、病毒、真菌和寄生虫的物质(Goodman，A.G.等，1985，同上)，可以是本领域技术人员已知的任何这种物质。
能与按本发明方法使用的趋化肽或特异抗体偶联的其他治疗剂也是已知的，或本领域技术人员易于确定。
用于胃肠外给药的造影趋化肽的或治疗学上结合的趋化肽的制剂，包括无菌水或非水溶液、悬液和乳液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液(包括盐水和缓冲液)，包括氯化钠、Ringer葡萄糖、葡萄糖加氯化钠、乳酸化Ringer液、或固定油的胃肠外载体。静脉内载体包括液体和营养补充物、电解质补充物，如基于Ringer葡萄糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。总体上，见Remington’s Pharmaceutical Science，16th ed.，Mac Eds.1980.
本发明的造影趋化肽或治疗学上结合的趋化肽的制剂，可用能达到其预期目的的任何方法给药。例如，可经胃肠外给药，包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内、经皮或颊内途径。可以替代地或同时使用口服给药。用于造影的可检测标记趋化肽的优选给药途径是静脉途径。该趋化肽可一次全部给药，或逐渐灌注(优选静脉内)，使用蠕动工具以完成该逐渐灌注。
本发明可用于检测躯体广泛部位的感染或炎症，包括但不限于肌肉、血管壁、腹部、骨盆、骨、关节或肺。
本发明可用于诊断任何数量的微生物感染，或诊断由这种感染或由创伤、自体免疫过程或肿瘤引起的炎症。
本发明还可用作提高感染或炎症治疗的效力和其响应的工具。
以上公开内容一般性地描述了本发明。参照以下具体实施例可获得更全面的理解，本文提供这些实施例只用于说明目的，而无意于限制本发明，除非特别说明。
实施例1
试验性细菌感染的病灶点造影
用本领域熟知的标准固相方法合成了趋化肽N-甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.15：2149-2154(1963))；Stewart，J.M.，和Young，J.D.，Solid PhasePaptide Synthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))。利用环形酸酐，用DTPA修饰C-末端赖氨酸的ε-氨基。原肽和DTPA衍生物的EC50几乎相同，约为10-9M，表明用DTPA衍生化不影响肽的生物活性。(所有受试肽都得到了类似结果)。这一结果是非常令人惊异的，因为人们预期引入高负电DTPA基团将会明显改变这种小肽的性质。这种肽易于用111In放射标记。六只Sprague-Dawley大鼠通过在左侧股部注射108活大肠杆菌进行试验感染。感染后24小时注射约100μCi的标记肽(5-10μg)。连续的γ照相图象表明：1小时时放射活性的分布在感染位点发生峰积(靶标-本底比约为4.0)。2小时时，活性水平的强度已下降，24小时时几乎分辨不出损伤部位。
这些结果确立了这种新试剂在感染动物模型中对炎症位点造影的实用性。
实施例2
白细胞结合的生物分布和趋化肽的生物活性
白细胞结合：通过竞争性结合试验测试4种与DTPA偶联的趋化肽与人中性白细胞的结合，其中〔3H〕For-MLF被递增浓度的未标记肽所置换(Babior，B.M.等，J.Clin.Invest.52：741(1973))。结果示于图1中。试验中包括3种未DTPA衍生化的肽作为对比。
产生SOD：试验4种与DTPA偶联的趋化肽刺激人中性白细胞产生超氧化物(Pike，M.C.等，Methods in Enzymol.162：236(1988))。这些结果示于图2中。为比较目的，试验中还包括MLF。
体内中性白细胞减少：以大于标准造影剂量大约10倍的剂量，将两种DTPA偶联趋化肽给予大鼠。在注射前5分钟和注射后1，2，5，10，15和30分钟(通过尾静脉)采集外周血。在所有实验动物中，没有显著诱发中性白细胞减少。
实施例3-5
下列实施例3-5说明异丁氧羰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-N-二亚乙基三胺五乙酰-赖氨酸(iBoc-MLFK-DTPA)是定位于体内感染病灶点的ForMLF激活中性白细胞的拮抗剂。发生定位而不改变白血细胞数量。
实施例3
分离的人中性白细胞(2.5×105)与1μMiBoc-MLFK-DTPA预培养10分钟，然后在2.8μM氨基苯二酰肼(luminol)存在下用10nM For MLF刺激，氨基苯二酰肼作为自由基依赖性化学发光的增敏剂。在这些试验条件下反应被完全抑制。随后的研究表明这些抑制是剂量依赖性的，IC50为0.2μM。
实施例4
在病灶性感染的兔模型中比较了肽拮抗剂iBoc-MLFK-DTPA与肽激动剂甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-赖氨酸-DTPA(ForNleLFNleYK-DTPA)。在每只兔(2-3kg)的后肢用大肠杆菌诱发病灶性感染，其步骤见实施例100B。24小时后，一组兔(n＝3)接受拮抗肽iBoc-MLFK-DTPA，而第二组接受激动肽For Nle LFNle-YK-DTPA。这些肽均用111In放射标记达比活性为约400μCi/μg肽。每只兔用氯氨酮-Xylazine麻醉，并经边缘耳静脉注射100μCi或0.25μg肽。在5，15，30和60分钟时测定下列参数：白细胞数、整体图像，及在60分钟时处死动物以确定组织生物分布。激动肽诱发暂性白细胞数降低，而拮抗肽没有。在注射激动剂或拮抗剂10分钟时就可检测到病灶性感染位点。生物分布显示与拮抗肽相比，激动肽较多聚积在脾和肝中。两种肽都迅速在肾中积累。拮抗剂的血浓度略高些，这可能提示这种肽的生物半衰期较长。感染肌肉比率范围为4∶1到7∶1，表明在感染肌肉部位显著的吸收。激动肽的靶-本底比在5小时内升高，而拮抗肽比率在1小时时最高。以上表明拮抗性趋化肽能够迅速定位于病灶性感染位点，从而具有感染或炎症位点诊断造影的实用性。另外，这些资料提示拮抗肽在涉及这种特异受体的疾病治疗中的潜在用途。
实施例5
在中性白细胞-内皮细胞粘附试验中测评未偶联的肽iBoc-MLFK。在此试验中，用5-羧基荧光素二乙酸盐标记的中性白细胞(5×105)加至含汇合的人脐静脉内皮细胞的48孔板上。以10μM的浓度加入iBoc-MLFK肽，10分钟后用30μM ForMLF刺激中性白细胞。温育25分钟后洗去未结合的中性白细胞，测定粘附百分比。这种肽在此浓度下抑制粘附达66％。随后测试了0.1-3.0μM间的浓度。这种肽剂量依赖性地抑制中性白细胞与内皮细胞的粘附，IC50约为14μM。对粘附的抑制将减少白细胞如中性白细胞向患病点的侵润，从而限制与炎症有关的组织损害。这些资料提供了支持用肽拮抗剂治疗活化白细胞有关疾病的进一步证据。
实施例6-98
用本发明范围内的其他趋化肽重复实施例5的步骤。结果示于表I中。在此表中，MPO是髓超氧化物酶试验，“-”指在30μM时无作用，“+”指在30μM时有阳性作用，“N.T.”指未测定。
                                                    表I
                                              细胞生物活性数据
实施例 序列 结合EC50，μM 自由基激动剂EC50，μM 自由基拮抗剂IC50，μM MPO释放EC50，μM 粘附激动剂EC50，μM 粘附拮抗剂IC50，μM
    6 N(N-甲苯磺酰脲)-MLF .45  -  2.5   -  3.1
    7 N-金刚烷基脲-MLF .87  -  1.8   - .68
    8 Leu-Ala-SHNH-Boc ＞100  -  -   -
    9 tBoc-Phe-Leu-Phe 5.6  -  7.1  5-17
    10 N(N-异丙基脲)-FLF .61  -  3.1  6.7 N＝2
    11 FMOC-亮氨酸 7.8  -  15.5  20
    12 N(氨基甲酸乙烯酯)-MLF ＜10e-12 .015  - .006   -
    13 N-丙基硫脲-MLF 2.0  -  5.6  12.6
    14 苯基硫脲-MLF .4  -  5.7  5.1
    15 FMOC-MLF .48  -  5.1  25.8
    16 tBoc-M(D)LF ＞80  -  -
    17 tBoc-MAc(5)cF 8.8  -  48  6.5 N＝2
    18 异丙基脲-FLFLF-Lys-Lys-SHNH 15.7  -  29.5
    19 甲酰-MLF-Lys-SHNH 4e-12N＝1 .05   -
                                                           表I(续)
                                                      细胞生物活性数据
实施例 序列 结合EC50，μM 自由基激动剂EC50，μM 自由基拮抗剂IC50，μM MPO释放EC50，μM 粘附激动剂EC50，μM 粘附拮抗剂IC50，μM
    20 N-N-异丙基脲-FLFLF  .59 -  2.6
    21 糠酸-MLF  1.8 -  17.5 7.4 N＝1
    22 异丙基脲M-Ac5c-F  13.5 -  5.1-50 20.2
    23 N-肉桂酰-MLF  .04 .005  75.5  .004 -
    24 N-N-异丙基脲-M-L-六氢-F  .31 -  5.6  - 3.7
    25 吡咯-M-L-F  1.7 -  9 6.2
26 Hynic ＞100 ＞100 - - N.T.
    27 N-丁基脲-MLF-Lys-SHNH  .11 .17  N.T.  .039 -
    28 异丙基脲-MLF-Lys-SHNH  8.5 ＞100  -  2.2  1.5 ＞30
    29 异丙基脲-MLF-Lys-Asp-SHNH  4 ＞100  -  .25  .73 ＞30
    30 N-异丙基脲-MLF-丙二胺-SHNH  9 ＞100  -  2.2  - ＞30
    31 异丙基脲-MLF-正丙基二胺-Asp-SHNH  4.5  2  -  .4  1.1 ＞30
溶解度问题
                                                        表I(续)
                                                    细胞生物活性数据
实施例 序列 结合EC50，μM 自由基激动剂EC50，μM 自由基拮抗剂IC50，μM MPO释放EC50，μM 粘附激动剂EC50，μM 粘附拮抗剂IC50，μM
    32 异丙基脲-MLF-Lys-SHNHBoc  .03  .12  N.T. .013  -
    33 异丙基脲-FLFLF-Lys-SHNH  2.5  -  14.5 -  7.82
    34 N(N-苯基脲)-ML-六-F  .02  -  1.9 +N＝1  -
35 环己基脲-MLF-Lys-SHNH 1.9 ＞100 - 2.2 N.T.
    36 甲酰-MLF-Lys-SHNH  .17  .35  -
    37 iBoc-MLF-SPNH  0.15-5  -  10-30 N.T.  ＞30
    38 iBoc-MLF-O-SPNH  0.15-5  -  5-6 .4pH5 +(可变)  ＞30
    39 iBoc-MLF-S-SPNH  0.6-22  -  3-3.5 N.T.  ＞30
    40 iBoc-MLF-可裂解偶联  0.12  +  ＞10 1.6  -
    41 iBoc-MLFK  20  -  10 -  16
    42 iBoc-MLFK-DTpA  4.5  - -
    43 三甲基乙酰-MLFK  ＞10  -  N.T. N.T.  -
    44 N-氨基甲酰-MLFK  ＞10  10  N.T. N.T.  -
    45 For-M(O2)-LFK  1  +  N.T. 0.6  -
    46 For-M(O)-LFK  5-10  +  N.T. 2  -
                                                        表I(续)
                                                   细胞生物活性数据
实施例 序列 结合EC50，μM 自由基激动剂EC50，μM 自由基拮抗剂IC50，μM MPO释放EC50，μM 粘附激动剂EC50，μM 粘附拮抗剂IC50，μM
    47  tBoc-Nle-LFK -  - N.T. N.T. -
    48  For(D)M-LFK -  - N.T. N.T. -
    49  iBoc-Nle-LFK ？- - N.T. N.T. -
    50  iBoc-M(O)-LFK ？-  - N.T. N.T. -
    51  MeOCO-MLF-COOMe 2.4  3.8 N.T. + 7.6
    52  nBoc-MLF-COOMe 3  5.8 N.T. + 4.5
    53  iBoc-MLF-COOMe 7.5  - N.T. - 7
    54  iBoc-MLF-OH 0.3  - - 6.3
    55  CBZ-MLF-COOMe ＞10  - N.T. N.T. -
    56  tBoc-MLF 3  - 15 N.T. 3.9
    57  tBoc-NleLF 3  - 15 N.T. 2.5
    58  tBoc-F(D)LF(D)LF 5  N.T. N.T. - 1.3
    59  ForMLF 0.025-0.06 .007
    60  ForMLFK 0.007 .014
    61 异丙基脲-MLF A3多聚体 1.2  - 6.7 N＝1 +(可变) -
溶解度问题
                                                              表I(续)
                                                          细胞生物活性数据
实施例 序列 结合EC50，μM 自由基激动剂EC50，μM  自由基拮抗剂IC50，μM MPO释放EC50，μM 粘附激动剂EC50，μM 粘附拮抗剂IC50，μM
    62 异丙基脲-MLF A2多聚体  .4  3  90 N＝1  .333  -
    63 N-甲基脲-MLF  3.4  -  4.8 N＝1  -  6.3
    64 N-乙基脲-MLF  1.2  -  9 N＝1  -  2.5
    65 N-丁基脲-MLF  0.34  -  0.58  +(可变)  -
    66 N-异丁基脲-MLF  1.5  -  3.5  N.T.  21.5
    67 N-叔丁基脲-MLF  3.3  -  1.8  N.T.  9.4
    68 N-N-丁基硫脲-MLF  .5  -  5.0  -  4.4
    69 N-丁基脲-FLFLF  0.2  -  0.63  -  2.2
    70 N-丙基脲-MLF  2.5  -  2.8  N.T.  13
    71 N-异丙基脲-MLF  2.25  5.4  N.T.  15.4
    72 N-异丙基脲-MLF  0.25  -  0.48  -  1.6.44
    73 N-异丙基脲-MLF  16.8  ＞100  100 N＝1  -  ＞30
    74 异丙基脲-MLF-正丙基二胺乙酸盐  2.3  -  30 N＝1  -
    75 环己基脲-MLF  -  -  -  N.T.  -
    76 N-苯基脲-MLF  .05/.02  .15/.15  -/-  .02/.05  -
                                                           表I(续)
                                                      细胞生物活性数据
实施例 序列 结合EC50，μM 自由基激动剂EC50，μM 自由基拮抗剂IC50μM  MPO释放EC50，μM 粘附激动剂EC50，μM 粘附拮抗剂IC50，μM
    77  N-苄基脲-MLF  .8  -  2.6 N＝1 - 12.6
    78  N-苯甲酰-MLF  2.4  -  32 N＝1 - 8.8
    79  正丁基酰胺-MLF  .12-7variable -  20 N＝1 - 9.6
    80  甲磺酰-MLF  24  -  70 N＝1 - ＞100
    81  正丁磺酰胺-MLF  1.9  -  12 N＝1 - 1.8
    82  苯基磺酰胺-MLF  2.1  -  7 N＝1 - 8.6 N＝2
    83  异丁酰胺M(s＝O)LF  30.3  - ＞100 N＝1 - ＞100
    84  异丁酰胺-MLF  2.0  -  3.6 - 6.1
    85  N-N-4-氯苯基脲-MLF  7e-6 N＝1  ＜.01  - ＜.001 N＝1 -
    86  对甲氧基苄基脲-MLF  ＜.01N＝1  .01  - + -
    87  对甲苯基脲-MLF  ＜.01  7e-4 N＝1  - .003 -
    88  间甲苯基脲-MLF  .09  -  1.2 - 4.5
    89  N(N-苯磺酰脲)-MLF  1.5  -  9.5 ＞100 N＝2
    90  4-羧基-2-氧代-噻唑烷-MLF  21.7  -  44 ＞100 N＝2
    91  4-羧基-噻唑烷-MLF  5.5  -  26 ＞30 N＝2
                                                           表I(续)
                                                      细胞生物活性数据
实施例 序列 结合EC50，μM 自由基激动剂EC50，μM 自由基拮抗剂IC50，μM MPO释放EC50，μM 粘附激动剂EC50，μM 粘附拮抗剂IC50，μM
    92  4-羧基-2-硫代-噻唑烷-MLF  1.6 10/＞100  - +N＝1  -
    93  1-萘甲酰胺-MLF  .65 -  2.6  11.6
    94  N(N-异丙基脲-FLFLF-丙二胺-SPNH  .42 -  5.0 -N＝1  -
    95  N-肉桂酰-FLFLF  .002 -  .038  1.5
    96  N-N-烯丙基脲-MLF  .26 ＞100  4.9 N＝4 .064 N＝2  -
    97  N(胍)-MLF  5.9 -  -     溶解度问题
    98  N-氢化脲-MLF  1.9 2.9  - .62 N＝1  -
实施例99
在以下实施例中，按常规液相方法(Bodansky，M.和Bodansky，A.，1984，“The Practice of Peptide Synthesis”，SpringerVerlag，New York)合成了Met-Leu-Phe盐酸盐。异氰酸酯有供应时从Aldrich获得。没有供应的异氰酸酯通过适宜的胺与从Aldrich获得的triphos(二(2-联苯基膦基乙基)苯基膦)的标准反应而制得。所有的1HNMR谱在Bruker 30 MHz仪上在DMSOd6中测得，并相对TMS内标报告。
游离氨基肽与适当的异氰酸酯反应易于制得良好收率的N-末端脲保护的肽。以下描述N-正丁基-N’-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸-脲的合成举例。将1.0g Met-Leu-Phe盐酸盐(2.2mMol)悬浮在10ml无水DMF中，并加入2.2当量(0.70ml，5.0mMol)无水三乙胺，然后加入1.25当量(0.31ml，2.8m Mol)异氰酸正丁酯。室温搅拌反应混合物16小时，然后在旋转蒸发器上除去DMF。将残余物溶解在1ml甲醇中，快速搅拌下加入15ml 1NHCl。过滤生成的白色固体(0.81g，71％)，用水洗，真空干燥过夜。FABMS；C25H40N4O5S，测定值：509(M＋1)。
       1H NMR(MeOH，d6)：δ8.12(d，J＝8Hz.，1H)，8.01(d，J＝8Hz.，1H)，7.21(m，5H)，4.62(m，1H)，4.30(m，1H)，4.25(m，1H)，3.17(m，4H)，2.45(t，J＝7Hz，2H)，1.95(m，1H)，1.77(m，2H)，1.40(m，6H)，92(m，9H)。
实施例100
该实施例证明99mTc标记的趋化肽类似物是用于感染病灶点外部造影的有效试剂。
合成了4种肼基烟酰胺(HYNIC)衍生化的趋化肽类似物，For-Nle LFK-HYNIC(HP1)，For-MLFK-HYNIC(HP2)、For-MLFNH(CH2)6NH-HYNIC(HP3)和For-MLF-(D)K-HYNIC(HP4)，并评价其体外生物活性和受体结合。
材料和方法
肽合成和鉴定
按Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32：483-491(1991)中所述的标准固相技术(Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.15：2149-2154(1963)；Stewart，J.M.，和Youg.J.D.，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))合成并纯化了N-甲酰(For)-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-赖氨酸-NH2，N-For-甲硫氨酸-亮氨酰一苯丙氨酰-赖氨酸，N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-二氨基己基酰胺，和N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-D-赖氨酸-NH2。所有试剂均为从商业渠道得到的最高级别。如以下对HP3所描述的方法，对这些化合物进行烟酰肼偶联。
向186mg N-For-Met-Leu-Phe-二氨基己基酰胺中加入2ml二甲基甲酰胺(DMF)和60μl二异丙基乙基胺，然后加入1ml DMF中的154mg琥珀酰亚胺基-6-t-Boc-肼基吡啶-3-羧酸(Abrams，M.J.，等，J.Nucl.Med.31：2022-2028(1990)。混合物变黄，肽在短时间内溶解。2小时后向反应混合物中加入乙醚-石油醚，并弃去上层。向油状残条物中加入水使得形成固体。用5％碳酸氢钠、水和乙酸乙酯洗涤固体，得重183mg的产物。将粗产物与含0.1ml对甲苯酚的5ml三氟乙酸(TFA)一起于20℃搅拌15分钟，除去t-Boc保护基。用TFA处理时间延长则形成的付产物增加。经旋转器发除去TFA，向残余物中加入乙醚使脱保护肽沉淀。在2.5×50cm Whatman ODS-3柱上用0.1％TFA中乙腈梯度洗膜进行反相HPLC纯化产物。合并含主成分的流份，除去溶剂产生目标产物。用UV和质谱以及氨基酸分析来鉴定肽。
细胞制备
在3％葡聚糖(Pharmacia，Nutley，NJ)中沉降，然后经Lymphoprep(Organon Teknika，Durham，NC)梯度离心分离人外周血多形核白细胞(PMN)。用Wright染色标本的光学显微镜法估测，细胞制剂含有＞95％PMN。
For-MLF受体结合试验
N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-MLF)、N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(For-NleLF)和N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙酰-正亮氨酰-酪氨酰-赖氨酸(For-Nle LF Nle YK)从Sigma(St.Louls，MO)获得。For-ML[3H]F(60 Ci/mmol)从Hew England Nuclear(Boston，MA)获得。以总体积0.15ml及在各种浓度的衍生化肽和15nM ForML[3H]F(Deuel，T.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1)：4584-4587(1981)；Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32：483-491(1991)；Pike M.C.，等，Methods Enzymol.162：236-245(1988))存在和不存在下，8×105分离的人PMN(从健康自愿者获得)在含1.7mMKH2PO4、8.0mM Na2HPO4、0.117M NaCl、0.15mM CaCl2、0.5mM MgCl2和1.0mM PMSF PH7.4的磷酸盐缓冲的盐水(培养缓冲液)中于24℃45培养分钟。培养后将细胞滤至玻璃纤维盘(Whatman GF/C；Whatman，Inc.，Clifton，NJ)上，然后用20ml冰冷培养缓冲液洗涤。将此滤膜置于含10ml Safety-Solve(Research Products International Corp.，Mt.Prospect，IC)的闪烁管中，并用液体闪烁光度法测定放射活性。特异结合定义为总结合减去非特异性结合。非特异结合是在10μM未标记For-MLF存在下残余结合的放射活性量。非特异性结合为总结合的约10％。
为了确定99mTc放射标记对结合亲合力的影响，以0.15ml总体积在各种浓度的For-Nle LF Nle YK或相应的未标记肽和固定量的99mTc标记肽存在或不存在下，将分离的人PMN(2×106细胞)在HBS/BSA中于40℃培养60分钟。培养后，混合好的等份(0.1ml)细胞悬液在0.4ml微量离心管中用0.2ml HBSS/BSA∶Lymphoprep(1∶1)覆盖，并于15000rpm将内容物离心4分钟(Microfhge E，Beckman，Columbia，MD)。在液氮中冷冻各管并分离细胞层。通过γ计数测定放射活性。非特异性结合是在5μM未标记For-NleLFNleYK或相应的未标记肽存在下的残余结合放射活性。非特异结合为总结合的约10％。
超氧化物产生的试验
佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和细胞松驰素B从Sigma(St，Louis，MO)获得。通过用消光系数29.5/mmol/L/cm监视高铁细胞色素C的超氧化物歧化酶可抑制性还原来测定超氧化物的释放。简言之，分离的人中性白细胞用Hank氏平衡盐溶液(HBSS)(GIBCO，Grand Island，NY)培养。在10μM细胞松驰素B+/-超氧化物歧化酶(50μg/ml)存在下，只用HBSS或含有lnM到1μM递增浓度的肽(HP1，HP2，HP3，HP4，For-NleLF，For-MLF或For-NleLFNleYK)时于37℃培养10分钟。用分光光度法测定高铗细胞色素C的还原。
HYNIC衍生的趋化肽的99mTc标记
99mTc高锝酸盐(99Mo/99mTc发生剂和葡庚糖酸亚锡(Glucoscan)从New England Nuclear(Boston，MA)获得。99mTc-葡庚糖酸盐用于提供放射标记肼基烟酰胺结合肽所必需的Tc(V)氧代。向此冷干试剂盒中加入约2.5ml 0.9％NaCl中的99mTc高锝酸盐。最终放射活性浓度为5-10mCi/ml，产物的放化纯度通过即时薄层硅胶层析(ITLC-sg)来测定，用丙酮和0.9％NaCl作为流动相溶剂。
使用下列步骤用99mTc放射标记趋化肽。将约0.2mg肽溶于50μl二甲基亚砜中；用0.1M PH5.2的乙酸盐稀释至终浓度0.1mg/ml。将0.5ml肽溶液置于一清洁的玻璃瓶中，加入0.5ml99mTc-葡庚糖酸盐。将此混合物快速涡旋，室温下静置1小时。在三种溶剂系统中进行ITLC-sg测定放化纯度：丙酮，0.9NaCl和丙酮∶水(9∶1)。
还用两种系统进行反相HPLC分析了99mTc标记的肽类似物。系统A使用Beckman C18反相柱(5μ，4.5×46mm，Beckman，Columbia，MD)，洗脱条件：溶剂A：50mH乙酸盐中5％乙腈，PH5.2；溶剂B：50mM乙酸盐中50％乙腈，PH5.2；梯度：20分钟内由0％B到100％B；流速：2mL/分。系统B使用VydacC18反相柱)300A，5μ，4.5mm×25cm，Vydac)，洗脱条件：溶剂A：水中0.1％三氟乙酸；溶剂B：丙酮中0.1％三氟乙酸；梯度：10分钟内由0％B到100％B；流速：2mL/分。用Milton-Roy/LDC流过式分光光度计监测紫外吸收，用Beckman170(Backman，Columbia MD)监测放射活性。用一种双通道积分仪(Waters Model 746 Data Module，Waters，Marlboro，M4)记录并分析了来自两种检测器的输出信号。
比活性的最大化
为了避免与药理剂量趋化肽类似物相关的中性白细胞减少，将99mTc标记趋化肽的比活性最大化，以使99mTc的造影剂量即最终所服用的肽明显低于已知的活化EC50浓度(～20nM)。
在前次洗出后5小时洗脱99mTc发生剂以使99mTc的比例减至最小而保持99mTc洗出液＞300mCi。用发生剂动力学方程结合所用99Mo/99mTc发生剂的已知历史计算Tc的质量和99Tc与99mTc的相对比例。如上所述制备99mTc-葡庚糖酸盐(Tc-GH)。将180μg趋化肽(MW：720)溶解在50μl DMSO中，用0.1M乙酸盐缓冲液(PH5.2)稀释至终浓度100μg/ml。肽溶液等份用乙酸盐缓冲液进行系列稀释，得到2-80μg/ml范围的浓度。将0.5ml99mTc-GH加入等体积的肽/乙酸盐缓冲液中开始肽标记。快速涡旋此溶液，室温下保温1小时。用三种独立溶剂系统进行ITLC-sg测定肽标记的程度：丙酮，0.9％NaCl，和丙酮∶水(9∶1)。用下述关系计算放射标记肽的比活性：(％RCY×存在的mCi)/(肽的μMol数×100)。
体内研究
在动物体内进行了三种研究：A)为了确定放射标记肽类似物在健康动物中的体内分布，对每种类似物进行了生物分布研究；B)为了测定放射标记肽类似物定位于炎症病灶位点的能力，在大肠杆菌感染的大鼠中进行了组织放射活性测定；及C)为评价放射标记肽的感染造影特性，对大肠杆感染的兔进行了γ照相。
A.正常大鼠中的生物分布
给由24只重约150g的正常雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Burlington MA)组成的各组动物注射约5μCi每种99mTc标记的肽，在5，30，60和120分钟时测定生物分布(同一时间点上在6只动物中测评每种肽)。将血液、心脏、肺、肝、、脾、胃、肾、胃肠道、骨骼肌、睾丸和骨标本称重，并用一种井型γ计数器(LKB model#1282，Wallac Oy，芬兰)测定放射活性。为了校正放射衰变，所注射剂量的等份样品也同时计数。结果以每克中所注射剂量的百分数表示。
B.对感染大鼠的研究
一种大肠杆菌的单一临床分离物用于产生病灶性感染。细菌在胰胨大豆琼脂板上37℃培养过夜，单一菌落用无菌0.9％NaCl稀释以产生含约2×109细菌/ml的浑浊悬液。重约150g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Breeding Laboratories，Burlington MA)用氯氨酮麻醉，并在其左后股部肌肉注射0.1ml含约2×108细菌的悬液。
接种细菌24小时后，给经注射股部肿大的动物通过侧尾静脉注射约5μCi(3pMol)的99mTc标记肽。注射后30和120分钟，将5只动物的各组断颈处死。如上所述取组织标本，测定放射活性并计算结果。
C.感染兔的造影
为了确定使用放射标记趋化肽在对这些试剂的中性白细胞减少效应敏感的动物中进行感染定位的可行性，在大肠杆菌病灶性感染的兔中进行了造影研究。重2-3kg的6只雄性新西兰白兔用氯氨酮和xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉，并且在后股肌肉中注射1.0ml约2×109大肠杆菌的悬液。接种后24小时，给经注射股部肿大的兔通过侧耳静脉注射600-1000μCi HPLC纯化的99mTc标记HP2(比活性＞10000mCi/μMol，如上所述经HPLC与未标记肽分离)。用氯氨酮和xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉动物，并在注射后0到3小时和16-17小时用大视野γ照相机(TechnicareOmega 500，Solon，Ohio)获取系列闪烁图象，所述照相机装有高分辨平行孔准直仪并与专用计算机联机(Technicare 560，Solon，Ohio)。在预置的5分钟/视域(View)内记录图象，集中15％的窗以包括99mTc的140KeV光峰。为了表征标记肽的定位，进行有义区(region-of-interest，ROI)分析，以时间的函数比较感染股与对侧正常股的肌肉。
在获得最后的图象以后，注射过量戊巴比妥处死动物，将血液、心脏、肺、肝、脾、肾、胃、肠、丸、骨、骨髓、正常骨骼肌、感染骨骼肌和脓标本称重，并按如上所述测定放射活性。为了校正放射衰变，所注射剂量的等份也同时计数。结果以每克中所注射剂量的百分数表示。为了测定循环中与细胞结合的活性量，离心血液并分离细胞和血液。用0.9％NaCl清洗细胞，测定细胞和上清中的残余活性。为了测定在感染位点与细胞结合的活性量。用0.9％NaCl洗脓两次，测定细胞中和可溶部分中的残留放射活性。
统计方法
通过利用线性模型的方差分析(ANOVA)评价造影和生物分布研究的结果，其中器官和时间作为分类变量；％ID/g或％ID/器官＝器官＋时间＋器官×时间。用Duncan的新复极差法(Duncan，D.B.，Biometrics 11：1-42(1955))进行post-hoc肽浓度比较。每个F值的第一个下标是第一分类变量的自由度数(n－1)、第二个分类变量的自由度数(m－1)、或其交互作用的自由度数(n－1)×(m－1)。第二个下标是剩余自由度的数目(观察总数－n×m)。所有结果以均值±SEM表示。
结果
肽合成
均以良好收率和纯度制备了4种HYNIC衍生化的趋化肽类似物。紫外分析显示：所有4种肽在268nm和315nm处有最大吸收，这是HYNIC基团的特征。质谱和氨基酸分析结果与预期偶联肽产物一致。
趋化肽类似物的生物活性
超氧化物产生试验的结果于示图3中。表II中给出了产生50％最大响应的肽浓度(EC50)。肽HP2，HP3和HP4具有与For-MLF相同的效力(100nM)或更高的效力。HP1的效力至少低一个数量级。因此，对产生超氧化物的效力顺序是HP2＞HP3＞HP4＞＞HP1。
           表II趋化肽类似物的超氧化物产生和结合EC50肽             超氧化物   结合亲
              产生    和力
              nM      nMHP1               500     40HP2                12     0.18HP3                40     0.12HP4                60     0.35For-MLF           100     20For-NleLF         320     300For-NleLFNleYK    100     1
定义为所产生超氧化物阴离子(O2 -)的最大量的肽效力，所有受试肽都相似，在2.07-3.80mol O2 -/106细胞/10分钟范围内。所有肽的效力均低于佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(一种PMN氧化性爆发的无关激活剂)效力，它在0.1μM浓度时产生22.9nmol O2 -/106细胞/10分钟的响应。
趋化肽类似物与化学引诱物受体的结合
图4显示HYNIC衍生化趋化肽类似物抑制For-ML[3H]F与完整人PMN的结合，其效力水平与对产生超氧化物阴离子的效力水平相似。表II中给出了对For-ML[3H]F与人PMN结合产生50％抑制所需要的肽浓度(EC50)。肽HP2，HP3和HP4的EC50值与六肽For-MeLFNleYK的相似。虽然HP1与化学引诱物受体的亲和力比此系列中其他HYNLC衍生化肽的低约100倍，但仅低于For-MLF的效力1倍。三肽For-NleLF的效力比六肽和For-MLF低100倍以上。因此，与化学引诱物受体的亲和力顺序为HP3＞HP2＞HP4＞＞HP1。99mTc-HP2的EC50＜10nM。
为了确定99mTc标记对受体结合的影响，用上文描述的试验条件测定未标记HYNIC-肽置换99mTc标记肽的能力。这些试验的结果证明：取代50％99mTc肽与中性白细胞的结合所要求的未标记肽浓度比用For-ML[3H]F作为示踪剂时大大约10倍。如果放射标记物中每个Tc-葡庚糖酸盐含有一个以上肽单位并且结合是协作性的，则这种结合亲和力的提高可得到解释。
用99mTc放射标记
在用于监测放射标记的溶剂系统中，99mTc标记肽和99mTc-葡庚糖酸盐在即时薄层层析-硅胶条上的Rf值为：0.9％NaCl-99mTc-肽＝0.0，99mTc-葡庚糖酸盐＝1.0；丙酮-99mTc-肽＝1.0，99mTc-葡庚糖酸盐＝0.0；丙酮∶水(9∶1)-99mTc-肽＝1.0，99mTc-葡庚糖酸盐＝0.0。与仅用丙酮时相比，第三种系统峰尾最小，得到99mTc-肽的窄带。所有99mTc-肽制备物的ITLC证明：保温1小时后90％以上的放射活性与肽相连。用HPLC系统A分析标记肽，显示99mTc-葡庚糖酸盐、99mTc-HP1、99mTc-HP2、99mTc-HP3和99mTc-HP4的主要放射性峰的保留时间分别为0.3-0.5、14.37、11.25、15.11、和12.96分钟。比活性的最大化
99Mo/99mTc发生剂洗脱得总活性456mCi。Tc总量为3.4mMol，99Tc与99mTc之比为1.53∶1，计算99mTc的比活为134000mCi/μmol。如上所述制备99mTc-葡庚糖酸盐(Tc-GH)；制备时最终放射浓度＞150mCi/ml。用丙酮和0.9％NaCl进行即时薄层层析测得99mTc-GH的放化纯度为＞95％。
趋化肽激动剂类似物的药理效力要求高比活放射标记，以减少存在于注射液中的肽的绝对量。理想的情况是不需要纯化即可达到这种比活水平。图5综合了肽浓度对标记产率的影响。从这些数据可清楚地看出：反应混合物的最终肽浓度对放化产率有显著影响；肽浓度低于10μg/ml时得到的标记产率差。当结果相对于反应混合物中肽-Tc摩尔比表示时，显然当该比率升高时，放化产率(％)升高而比活下降。
用此方法可能达到＞10,000mCi/mol的比活，但放化产率降至显著低于10μg/ml的肽浓度。当肽浓度＜10μg/ml时需要纯化步骤除去来结合的99mTc。可用反相Sep-Paks去除未反应的99mTc葡庚糖酸盐和99mTcO4 -。经HPLC(用系统B)除去未反应肽可使比活性进一步提高。因为相应于99mTc-肽、未标记肽和99mTc-葡庚糖酸盐的峰在此HPLC系统中分辨良好，可分离无载体放射标记肽。在此情形下，放射标记肽的比活仅受99mTc发生剂洗脱液比活的限制。99mTc趋化肽在正常大鼠中的生物分布
4种99mTc标记趋化肽类似物的生物分布示于表III中。在所有体内试验中，所有动物耐受了放射标记趋化肽类似物的静脉给药，而无明显的不良影响。除肾、胃和胃肠道以外，所有肽的组织浓度随时间而下降。
                 表III
  99mTc标记的趋化肽类似物的生物分布％L.D./g
              (均值±SEM)器官    时间     HP1          HP2           HP3           HP4
    (分)血液    5    1.17±0.070   1.18±0.056   1.01±0.056   0.78±0.046
    30   0.82±0.019   0.67±0.036   0.55±0.017   0.48±0.052
    60   0.67±0.016   0.57±0.033   0.47±0.035   0.36±0.012
    120  0.52±0.010   0.48±0.015   0.39±0.015   0.31±0.010心      5    0.75±0.045   0.50±0.019   0.72±0.089   0.42±0.027
    30   0.50±0.010   0.32±0.016   0.27±0.021   0.22±0.024
    60   0.40±0.012   0.28±0.018   0.29±0.026   0.20±0.013
    120  0.37±0.028   0.26±0.013   0.25±0.024   0.16±0.012肺      5    1.54±0.122   0.85±0.043   10.65±1.473  1.11±0.099
    30   0.63±0.043   0.78±0.032   8.45±0.818   0.61±0.071
    60   0.64±0.039   0.46±0.030   5.10±0.449   0.49±0.026
    120  0.46±0.026   0.50±0.025   2.44±0.435   0.37±0.027肝      5    0.76±0.056   0.99±0.023   5.72±0.467   0.74±0.091
    30   0.53±0.012   0.62±0.019   4.81±0.205   0.52±0.022
    60   0.45±0.012   0.50±0.022   4.60±0.101   0.51±0.010
    120  0.43±0.016   0.58±0.026   4.75±0.175   0.46±0.016脾      5    0.34±0.014   0.35±0.023   2.27±0.281   0.35±0.041
    30   0.30±0.012   0.39±0.045   2.28±0.231   0.27±0.017
    60   0.26±0.006   0.25±0.013   3.11±0.191   0.32±0.017
    120  0.25±0.007   0.29±0.020   3.01±0.220   0.27±0.009
                  表III(续)器官    时间      HP1           HP2            HP3           HP4
    (分)肾      5     3.08±0.092   3.30±0.173    1.90±0.199   3.67±0.436
    30    5.13±0.282   4.82±0.246    1.68±0.064   5.22±0.139
    60    5.16±0.115   4.36±0.213    1.63±0.057   5.36±0.178
    120   5.68±0.143   4.17±0.121    1.60±0.030   4.74±0.201胃      5     0.17±0.024   0.10±0.004    0.38±0.053   0.19±0.011
    30    0.12±0.012   0.15±0.010    0.56±0.029   0.09±0.023
    60    0.15±0.013   0.10±0.005    0.51±0.034   0.15±0.017
    120   0.16±0.015   0.11±0.011    0.39±0.008   0.15±0.012胃肠道  5     0.20±0.013   0.25±0.012    0.33±0.038   0.16±0.005
    30    0.32±0.026   0.64±0.074    0.64±0.046   0.32±0.039
    60    0.23±0.020   0.64±0.089    0.70±0.050   0.39±0.030
    120   0.32±0.028   0.72±0.055    0.81±0.047   0.41±0.035睾为    5     0.15±0.010   0.12±0.008    0.12±0.011   0.19±0.006
    30    0.14±0.005   0.11±0.003    0.11±0.006   0.14±0.015
    60    0.13±0.005   0.10±0.006    0.11±0.004   0.13±0.008
    120   0.14±0.003   0.10±0.003    0.10±0.005   0.11±0.004肌肉    5     0.32±0.013   0.25±0.020    0.23±0.015   0.27±0.017
    30    0.22±0.004   0.17±0.018    0.10±0.005   0.17±0.013
    60    0.19±0.008   0.14±0.016    0.12±0.012   0.15±0.009
    120   0.20±0.012   0.15±0.014    0.10±0.007   0.12±0.006骨      5     0.55±0.026   0.39±0.011    0.39±0.023   0.37±0.038
    30    0.41±0.009   0.32±0.013    0.26±0.017   0.37±0.019
    60    0.33±0.007   0.30±0.020    0.28±0.023   0.34±0.009
    120   0.32±0.011   0.28±0.012    0.24±0.017   0.28±0.009
在血液中，方差分析显示肽(F3，70＝56.79，p＜0.0001)和时间(F3，70＝252.01，p＜0.0001)的显著性主要影响；但肽与时间的交互作用不显著。血中肽浓度的顺序为：HP1＞HP2＞HP3＞HP4(p＜0.01)。在心组织中，方差分析显示肽(F3，64＝44.36，p＜0.0001)和时间(F3，64＝98.06，p＜0.0001)的显著性主要影响，及显著的肽与时间交互作用(F9，64＝36.9，p＜0.001)。在肺中，方差分析显示肽(F3,6570＝183.25，p＜0.0001)和时间(F3，65＝24.56，p＜0.0001)的显著性主要影响，及显著的肽与时间交互作用(F9，13.80，p＜0.0001)。肽浓度的顺序为：HP3＞＞HP1＝HP4＝HP2(p＜0.01)。在肝中，方差分析显示肽(F3，65＝1000,00，p＜0.0001)和时间(F3，65＝12.80，p＜0.0001)的显著性主要影响；但肽与时间的交互作用不显著。在肝中，肽浓度的顺序为：HP3＞＞HP1＝HP4＞HP2(p＜0.01)。在脾中，方差分析显示肽(F，633＝431.00，p＜0.0001)的显著性主要影响，及显著的肽与时间的交互作用(F9，63＝4.64，p＜0.0001)。在此器官中，时间的主要影响不显著。肽浓度的顺序为：HP3＞＞HP2＝HP4＝HP1(p＜0.01)。在肾中，方差分析显示肽(F3，69＝291.58，p＜0.0001)和时间(F3，69＝40.14，p＜0.0001)的显著性主要影响，及显著性肽与时间的交互作用(F9，69＝10.94，p＜0.0001)。肽浓度的顺序是：HP4＝HP1＞HP2＞HP3(p＜0.01)。在胃中，方差分析显示肽(F3，53＝202.98，p＜0.0001)和时间(F3，53＝5.56，p＜0.005)的显著性主要影响，及显著的肽与时间的交互作用(F9，53＝5.56，p＜0.0001)。肽浓度的顺序是：HP3＞HP4＝HP2(p＜0.01)。在胃肠道中，方差分析显示肽(F3，62＝66.30，p＜0.0001)和时间(F3，62＝36.32，p＜0.0001)的显著性主要影响，及显著的肽与时间交互作用(F9，67＝477，p＜0.001)。肽浓度的顺序为：HP4＝HP1＞HP3＝HP2(p＜0.01)。在骨骼肌中，方差分析显示肽(F3，59＝48.70，p＜0.0001)和时间(F3，59＝97.69，p＜0.0001)的显著主要影响；但肽与时间交互作用不显著。肽浓度的顺序为：HP1＞HP2＝HP4＞HP3(p＜0.01)。在骨中，方差分析显示肽(F3，68＝30.15，p＜0.0001)和时间(F3，68＝52.84，p＜0.0001)的显著性主要影响，及显著的肽与时间交互作用(F3，68＝5.15，p＜0.0001)。肽浓度的顺序为：HP1＞HP4＝HP2＝HP3(p＜0.01)。99mTc趋化肽在感染大鼠肌肉中的定位
99mTc标记肽类似物在正常和感染股部肌肉中的组织浓度(％ID/g)示于表IV中。
             表IV
99mTc标记的趋化肽在正常和感染的
      大鼠肌肉中的组织浓度
       (％ID/克组织±SEM)
  时间                             肽组织  (分)     HP1         HP2         HP3         HP4正常  30   0.16±0.009 0.11±0.003 0.05±0.009 0.13±0.007
  120  0.10±0.006 0.07±0.004 0.05±0.005 0.13±01025感染  30   0.39±0.013 0.28±0.013 0.11±0.007 0.42±0.049
  120  0.21±0.008 0.16±0.007 0.10±0.004 0.32±0.019
方差分析显示肽(F3，25＝56.51，p＜0.0001)和时间(F3，25＝59.45，p＜0.0001)的显著性主要影响，及显著的肽与时间交互作用(F3，25＝6.74，p＜0.005)。在正常肌肉中，HP1(p＜0.01)和HP2(p＜0.05)的浓度随着时间降低，而HP3和HP4的浓度保持不变。在注射后30分钟，正常肌肉中HP1的浓度大于(p＜0.01)其他肽，HP2的浓度大于(p＜0.01)其他肽，HP2的浓度大于(p＜0.01)HP3。在120分钟时，正常组织中HP4的浓度大于(p＜0.01)HP2和HP3；HP1的浓度大于(p＜0.01)HP3。
在感染的肌肉中，HP1(p＜0.01)、HP2(p＜0.01)和HP4(p＜0.05)的浓度随时间降低，HP3的浓度(其在两个时间点时的积累水平都是最低的)保持不变。在注射后30分钟，HP1和HP4的浓度大于(p＜0.01)HP2和HP3的浓度；HP2的浓度大于(p＜0.01)HP3。在120分钟时，HP4的浓度大于(p＜0.01)HP1、HP2和HP3；HP1的浓度大于(p＜0.01)HP3。
靶标-本底比(T/B)(每克感染肌肉的％ID/每克正常肌肉的％ID)示于图6中。方差分析显示肽的显著性主要影响(F3，22＝5.87，p＜0.005)。但时间的主要影响和肽与时间交互作用无显著性。HP4的T/B比显著大于HP2(p＜0.05)，HP1(p＜0.01)、和HP3(p＜0.01)。因此，证明在注射后的两个时间点上，HP4不但在感染组织中绝对浓度最高，而且T/B比也最高。相反，HP3在感染组织中绝对浓度最低，而且T/B比最低。兔中感染病灶位点的造影
在兔体内，注射后立即在肺、肝和脾中检测到高水平的99mTc-HP4。肺活性随时间降低，注射后1-3小时在感染股中观察到放射活性的病灶集累。注射后4小时，T/B比为约4∶1。注射后16小时(图7)，整体损伤的平均T/B比增至10∶1，病灶区＞20∶1。另外在随后(＞4小时)的时间点注意到一些肠部积累。注射后16小时，测得与细胞结合的残余循环放射活性百分比为约25％。相反，对脓的分级分离表明约90％的放射活性与白细胞结合。
通过直接组织计数测得，注射后17小时的组织浓度(％ID/g)综合在图8中。最高浓度为脾＞肺＞肝＝肾(p＜0.01)。T/B比率(每克感染肌肉或脓的％ID/每克对侧正常肌肉的％ID)示于图9中。脓和感染肌肉的平均T/B比率分别为25.78∶1(最大48.54∶1，最小8.84∶1)和14.17∶1(最大25.64∶1，最小4.78∶1)。
                  讨论
以上表明用99mTc-葡庚颢酸盐作为Tc-(V)氧代核来源，HYNIC衍生化趋化肽类似物容易以高活性被99mTc标记。而且，99mTc标记肽是用于股深部感染的试验模型中感染病灶点外部造影的有效试剂。
合成的4种HYNIC肽中，三种(HP2，HP3和HP4)与受体结合的EC50与六肽For-NleLFNleYK的相似，而HP1为For-MLF的约2倍。所有HYNlC偶联肽与For-MLF相比，与化学引诱物受体的亲和力增强。受体结合效力的顺序为HP3＞HP2＞HP4＞For-NleLFNleYK＞For-MLF＞HP1＞For-NleLF。用Nle代替For-MLF中的Met造成受体结合亲和力下降10-15倍。但在C-末端进一步用-Lys-HYNlC衍生化使受体结合增强。
HP2、HP3和HP4的产超氧化物EC50比六肽和For-MLF提高2-8倍。For-NleLF显示比For-MLF的效力低3倍。与HP1较For-NleLF对受体结合提高的效应不同，与For-MLF和For-NleLFNle YK相比，它的产超氧化物EC50值提高了5倍。
当按照所建议的肽受体相互作用模型解释时，这些资料提示在第4个氨基酸残基上的HYNlC衍生化造成构象紊乱，从而影响受体结合和超氧化物的产生。最令人惊异的发现是在2位Nle取代Met的效应，它造成受体结合EC50比For-MLF提高15倍以上，比六肽提高300倍，而活化的EC50提高10倍以上。这一结果特别重要，因为以前报道的趋化肽类似物中这一取代的影响很小。4位由D-Lys取代L-Lys造成受体结合EC50提高2倍、活化EC50提高5倍也支持这一假说。在这一位置用1，6-二氨基己烷代替L-Lys只造成结合EC50的微小增加和活化EC50的3-4倍升高。用99mTc标记HYNIC偶联的肽造成亲和力明显提高。99mTc-HYNIC-肽结合分析试验的结果证明：置换99mTc肽与中性白细胞结合的50％所需要的未标记肽浓度比使用For ML[3H]F作为示踪剂时的高大约210倍。如果放射标记物中每个Tc-葡庚糖酸盐含有一个以上肽单位并且结合有协同性，则可解释这种结合亲和力的提高。据报导四聚趋化肽类似物中也有类似的结合增强作用(Krau，J.L.，等，Biochem.Biophys.Res.Comm.124：945-949(1984))。这些结果还证明C-末端对于衍生化的坚定性。
这些观察提示，除作为极好的感染造影放射药物，HYNIC肽还可作为进一步阐明伴有For-MLF与其受体结合的分子作用的模型化合物。
在获得HYNIC衍生化趋化肽类似物的最大比活性时，主要集中在放射核素源中的操作上，即99Mo/99mTc放射核素发生剂的洗出。获得高比活性99mTcO4 -的一个潜在问题是长寿99Tc(基态，t1/2～105年)的建立。因为99Tc是87％的99Mo衰变和100％99mTc蜕变的结果而直接产生的，总是存在一定量的载体在标记反应中参与竞争。比活性＞10000mCi/μmol的99mTc标记趋化肽类似物易于制备，但需要用Sep-Pak分离标记肽与其他99mTc种类。如果除优化99mTc源以外还优化了放射标记肽的层析纯化条件，则可达到更高的比活性。在HPLC系统中，相应于99mTc标记肽、未标记肽和99mTc葡庚糖酸盐的峰分辨良好，可分离无载体放射标记肽。在这些情形下，放射标记肽的比活仅限于99mTc发生剂的比活。因此，基于99mTc的理论比活，99mTc标记HYNIC衍生化的趋化肽类似物的最大比活为约500,000mCi/μmol。虽然按常规方法达到这一比活水平是不可能的，但制备具有与用于标记的99mTc-葡庚糖酸盐相似比活的放射标记肽应该是可能的。因为基于常规方法可以制得比活＞10,000mCi/μMol的99mTc-葡庚糖酸盐，如果应用HPLC纯化，这一比活水平的肽是可能的。
因为HYNIC葡庚糖酸盐配体只能占领锝配位区的两个点，标记产物很可能含有另外的基团。据信葡庚簋酸盐作为“共同配体”而发挥这种作用。由于趋化肽的分子量小，用于锝标记的共同配体可能对这些分子的生物分布产生重要影响。为了评价这些可能性，测定了用不同的共同配体-葡糖二酸盐、葡庚糖酸盐、甘露糖和葡糖胺-标记的99mTc标记HP2和HP3的生物分布。以不同配体放射标记的步骤与使用葡庚糖酸盐的方法相同。HPLC分析放射标记肽，均显示等一峰。
图10显示了注射后4个时间点这4种HP3制剂在血、肺、肝、脾、肾和胃肠道中的注射剂量百分数/克。虽然在大部分组织中检测到了生物分布的小差异，最显著的差异见于肺(葡糖二酸盐，葡庚糖酸盐＞甘露醇＞＞葡糖胺)；肝(葡糖二酸盐，葡庚糖酸盐，甘露醇＞＞葡糖胺)；肾(甘露醇＞葡糖二酸盐，葡庚糖酸盐，葡糖胺)；脾(葡糖二酸盐＞＞葡庚糖酸盐，甘露醇＞＞葡糖胺)；及胃肠道中(葡糖二酸盐，葡糖胺＞＞葡庚糖酸盐＞＞甘露醇)。用HP2得到了相似结果。
已有几种用放射标记趋化肽进行感染造影的努力(Fischman，A.J.，J.Nucl.Med.32：483-491(1991)；McAfee，J.G.等，Semin.Nucl.Med.14：83-106(1984)；Thakur，M.L.等，Semin，Nucl.Med.14：107-117(1984)，Zogbhi，S.S.，等，J.Nucl.Med.22：P32(1981))。但进行这些研究时存在的放射标记方法产生低比活的试剂，造影需要药理量的肽。已显示这些肽剂量在兔中产生严重的暂时性中性白细胞减少症(O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.118：1586-1589(1977))。利用本发明的标记技术，可完全消除这些潜在的不利影响。在兔这种对趋化肽的中性白细胞减少效应高度敏感的物种中，HPLC纯化的99mTc HP4在注射后1小时内定位于大肠杆菌感染的病灶位点，并在15小时达到最大T/B比。
HYNIC放射标记方法提供了一种制备极高比活99mTc标记肽和蛋白的独特而有效的工具。
达到这样的高比活后，应该可以在显著低于中性白细胞减少反应EC50的肽浓度下进行造影试验。例如利用SEP-PAK纯化肽(～10,000mCi/μmol)，注射20mCi的试量，其含约2nMol肽。对于70kg的对象而言，这代表注射剂量低于30pMol/kg。基于Rhesus猴中的研究，这一肽量远低于诱发显著中性白细胞减少的剂量。利用HPLC纯化物，安全系数应提高约10倍。
                   实施例101
本实施例证明放射标记的激动趋化肽类似物可作为猴中炎症位点造影的有效试剂。利用高比活的放射标记可避免这些试剂的中性白细胞减少效应。
在非人灵长类动物中测评了趋化肽类似物的体内生物活性、生物分布和炎症造影特性。在正常Rhesus猴中测定了剂量依赖性中性白细胞减少反应。99mTc标记的肼基烟酰胺(HYNIC)衍生化趋化肽类似物用于在猴中研究生物分布和炎症造影。
在正常动物中的研究表明肽在动物中诱发明显的剂量依赖性中性白细胞减少。注射后几乎立即发生中性白细胞数减少，然后迅速返回基线。检测到了对区别WBC计数、血压、脉频、或呼吸频率的显著影响。在最低测试肽剂量下，中性白细胞的减少很小。以良好的收率和纯度制备了HYNIC衍生化肽，生物活性与原肽相似，以20000mCi/μmol的比活方便地标记。当将约0.5mCi(＜2.0ng/kg)的放射标记肽注入带有无菌炎症病灶点的猴中时，观察到其生物分布模式与放射标记WBC相似，未检测到中性白细胞减少。注射后3小时时，炎症位点很明显，T/B比为约3∶1。材料
N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(For-MLF)、N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-赖氨酸(ForNleLFNleYK)、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和细胞松驰素B得自Sigma(St.Louis.Mo)。ForML[3H]F(60Ci/mmol)和99mTc(99Mo/99mTc-发生剂)得自NeW England Nuclear-(Boston，MA)。Hank’s平衡盐溶液(HBSS)得自GIBCO(Grand Island，NY)。肽合成和鉴定
如以前的描述(Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32：483-491(1991)，用标准固相技术(Merrifield，R.B.JAm.Chem.Soc.15：2149-2154(1963)；Stewart，J.M等，Solid Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman&Company，San Francisco，CA(1969))，合成并纯化了N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-赖氨酸和N-甲酰-正亮氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-正亮氨酰-酪氨酰-赖氨酰-DTPA。烟酰基肿衍生化趋化肽类似物N-甲酰-met-leu-phe-lys-HYNIC按如下方法制备。
将含60μl二异丙基乙基胺的1.0ml二甲基甲酰胺(DMF)中的琥珀酰亚胺基-6-t-Boc-肼基吡啶-3-羧酸(154mg，mMol)，加至2ml DMF中的N-For-Mer-Leu-Phe-Lys(186mg，mMol)中。肽迅速溶解，2小时后加入乙醚-石油醚。弃去上层，向残余物中加水形成固体。用5％碳酸氢钠、水和乙酸乙酯洗涤该固体。得183mg粗产品。将粗产品与5ml含0.1ml对甲苯酚的三氟乙酸(TFA)于20℃搅拌15分钟，除去保护基。旋转蒸发除去TFA，加入乙醚沉淀脱保护的肽。在2.5×50cm WhatmanODS-3柱上用乙腈对0.1％TFA的梯度洗脱，反相HPLC纯化产物。合并含主成分的流份，除去溶剂得目标产物。
用TLC、HPLC、UV光度法、质谱法和氨基酸分析测定终产物的化学纯度。如Pike，M.C.和Snyderman，R.，MethodsEnzymol，162：236-245(1988)；Pike，M.C.等，Blood 67：909-913(1986)；和Fischman，A.J.等，J.Nucl.Med.32：483-491(1991)中描述的方法，测定与人PMN上化学引诱物受体结合的EC50和产超氧化物的EC50。99mTc放射标记
为了避免施用药理剂量趋化肽类似物带来的中性白细胞减少效应，在产生最大比活的条件下用99mTcyt放射标记HYNIC衍生物。通过获得高比活造影剂量的99mTc，肽的注射量大大低于EC50(～20nM)。
在前一次洗出后5小时对99Mo/99mTc发生剂洗出，以产生约500mCi的总活性。按Lamson等人J.Nucl.Med.7：639-641(1975)的方法计算Tc的量和99Tc与99mTc的相对比例。在典型的洗出中，Tc的总量为约3nMol，99Tc与99mTc比为约1.5∶1，99mTc的比活性＞100,000mCi/μmol。从葡庚糖酸亚锡(Glucoscan，DuPont)制备99mTc-葡庚糖酸盐(Tc-GH)，以提供用于放射标记肼基烟酰胺偶联肽的Tc(V)氧代(Pike，M.C.等人，Blood 67：909-913(1986))。将约2.5ml盐水中的99mTc-高锝酸根加入冷干试剂盒中，在制备时的放射活性终浓度为150mCi/ml。以丙酮和盐水作为流动相溶剂通过即时薄层硅酸层析(ITLC-sg)测得产物的放化纯度大于95％。
将约180μg趋化肽For-Met-Leu-Phe-NH-(CH2)6-NH-HYNIC(MW：720)溶解在50μl DMSO中，用PH5.2的0.1N乙酸盐缓冲液稀释至终浓度为10μg/ml。将1.5ml肽溶液置于一干净玻璃小瓶中，再加入0.5ml99mTc-葡庚糖酸盐。快速涡旋混合物，室温静置1小时。以三种独立的溶剂系统通过ITLC-sg监视肽标记的程度：丙酮、盐水和丙酮∶水(9∶1)。在一C18柱(5μ，4.5×46mm，Beckman，Columbia，MD)上的线性梯度洗脱进行反相HPLC纯化99mTc标记的肽。洗脱条件为：溶剂A-50mM乙酸盐中5％乙腈，PH5.2；溶剂B-50mM乙酸盐中50％乙腈，PH5.2；梯度：20分钟内0％到100％B；流速：2mL/分。用下述关系计算放射标记肽的比活：(回收百分率×存在的mCi)/(肽的mMol数×100)。动物模型
以4种剂量的溶于0.2ml无热原盐水中的ForNleLFNleYK-DTPA(10000；1000；100和10ng/kg)在每只重10kg的4只雄性Rhesus猴中进行实验。用所有4种肽剂量处理每只动物，每个剂量水平间休息期为一周。用氯氨酮/xylazine麻醉动物，80分钟内采集一系列0.5ml静脉血样。每个试验包括4次注射：载体、肽、肽、载体。在第一次注射前15和5分钟和注射后0.25、0.5、1、3、5、10和20分钟抽取基线血样。收集20分钟的血样后马上进行下次注射。在整个试验过程中监视血压、脉博、和呼吸频率。测定每一样品中白血细胞计数(CBC)、区别白血细胞计数、红血细胞计数、和叠积细胞体积。另外，监视动物的活动和表情、摄食和体重。该试验方法的图解式概要示于图11中。
两只重约10kg的成年雌性Rhesus猴用于造影试验。因为这些动物以前已用于其他放射药物的造影试验，它们在诱导麻醉当中已在右后股部经受了许多次肌肉注射。这些注射造成显著程度的无菌炎症。造影
在轻度氨氨酮麻醉下(5.5mg/kg)，通过一腿静脉给动物注射约0.5mCi99mTc标记肽(＜2.0ng/kg)。在注射放射标记肽后5分钟、30分钟、1小时和19小时，用氯氨酮/xylaxine(15.0和1.5mg/kg)麻醉动物，用大提野γ照相机获取全身闪烁照相图象，所述照相机装有平行孔高分辨低能准直仪，并与专用计算机系统联机(Technicare Gemini 700，Technicare 560，Solon，OH)。所有的图象是15％的窗集中在140KeV的99mTc光峰条件下以10cm/分的扫描速度获得的。注射前5分钟和注射后1、3，5和15分钟采集0.5ml血样，测定CBC。
拉近有义区(ROI)：整个动物、心血池、肺、肝、脾、肾、肠、骨、正常肌肉和发炎肌肉；计算计数密度(CPM/片)。结果以组织-血池比、注射剂量百分数/克(％ID/g)和靶标-本底比(致炎股/对侧股之比)表示。统计方法：
按Duncan的新复极差法(Duncan，D.B.，Biometrics 11：1-42(1955))进行方差分析，统计评价造影研究的结果。
                 结果
制备的HNIC衍生化肽有极好的收率和化学纯度。终产物在TLC和HYPLC上显示单一带(峰)。紫外分析显示在268和315nm处有最大吸收。质谱给出m/z671的峰。氨基酸分析与预期产物一(Met-1.00，Leu-1.00，Phe-0.97，Lys-1.00)。HPLC纯化后放射标记肽的比活性＞20000mCi/μmol。与人PMN上化学引诱物受体结合及超氧化物产生的体外分析，得出EC50分别为2.0和20nM。
图12显示For NleLFNleYK-DTPA在猴中诱发明显的剂量依赖性中性白细胞减少反应。在两个最高肽剂量(10000和1000ng/kg)下，注射后白细胞计数几乎马上降至对照的约40％，在第二次注射肽时返回到对照的60-80％。第二次注射肽以后，白细胞计数降至对照的40-50％。在最高剂量下，在第二次注射载体时白细胞计数返回到对照的80％，在研究结束时(第一次注射载体后80分钟)达到对照的90％。在1000ng/kg剂量下，第二次注射载体时白细胞计数返回到对照的90％，在实验结束时返回到基线。在100ng/kg剂量下，白细胞计数在注射后几乎立即降至对照的约70％，在第二次注射肽时回到基线。在第二次注射载体时白细胞水平返回到基线。在最低肽剂量下(10ng/kg)，白细胞减少程度小，每次注射肽后3分钟内返回基线。
在注射任何剂量的肽以后没有动物显出明显的病态。检测对区别WBC计数、血压、脉频、或呼吸频率的显著影响。
图13表示注射约1.0mCi99mTc标记肽后3小时和15小时猴的代表性正前位(Ant)和正后位(Post)图象在较早的图象中，在肺、肝、脾和骨中有高放射性浓度，与同白细胞的结合相一致。高水平放射活性还集中在肾和膀胱中。在肌肉和胃肠道中检测到较低的浓度。另外，在此时炎症位点已清楚可辨(T/B～3∶1)。在此肽剂量下对WBC水平没有显著影响。
在较晚的造影时间下，肺活性下降，但在其他器官中的放射活性分布还保持相对恒定。注射后15小时，放射活性在炎症位点的集累明显减少。在其他动物中在两个造影时间下也观察到了相似的生物分布模式。讨论
本实施例证实：如在兔中一样(O’Flaherty，J.T.等，J.Immunol.118：1586-1589(1977))，激动趋化肽在猴中诱发显著性暂时中性白细胞减少。但在低于10ng/kg肽剂量下，此效应不明显。如通过肺活性随时间降低而注意到的那样，在开始时可能发生少量的中性白细胞激活。当向带有轻度无菌炎症损伤的猴注入标记的HYNIC衍生化趋化肽时，生物分布模式与放射标记白细胞的分布严格平行，注射后三小时易检测到炎症病灶，靶标-本底比为约3∶1。以很高的比活(＞20,000mCi/μmol)放射标记，放射药物造影剂量中肽的总量可降至中性白细胞减少的阈值；比活为20,000mCi/μmol时，在10kg动物中注射0.5mCi相当于肽剂量小于2ng/kg。假设血液体积为体重的8％、血细胞比容为50％，该肽剂量相当于起始循环浓度为60pM，这低于受体激活的EC50 2个数量级。正如所料，这一肽剂量对外周白细胞水平没有影响。
本实施例证实放射标记趋化肽类似物是对中性白细胞减少效应敏感的动物中炎症造影的有效试剂。当在兔中研究这些肽的感染造影特征时得到了相似的结果(Babich，J.W.等，(送交出版))。
虽然在注射后3小时无菌感染位点是很明显的，但在注射后12小时靶标-本底比大大降低。这明显不同于带有大肠杆菌感染病灶位点的兔中的结果，后者为注射后3小时T/B比为约3∶1，在12小时时增至20∶1。这种差异的可能解释包括损伤强度的差异和细菌感染和无菌炎症的差别。如果进一步研究证实损伤动力学中的这种差异，可大大提高这些试剂的实用性，因为可能区别感染和无菌炎症。实施例102
本实施例中，对99mTc-标记激动趋化肽的感染定位特征与传统的111In标记白细胞在急性细菌感染动物模型中进行比较和对比。选择兔是因为已知它们对趋化肽的中性白细胞减少效应敏感。
在大肠杆菌感染的兔中比较了99mTc标记的甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-赖氨酰-肼烟酰胺(99mTc-HP)与111In标白细胞(111In-WBC)的生物分布和感染造影特性。给6只动物的各组注射1mCi99mTc-HP＋0.05mCi111In-WBC，在注射后3-6小时和18小时进行系列闪烁照相。在获得最后的图象后，处死动物并测定生物分布。
在所有造影时间，99mTc-HP和111In-WBC的生物分布相似，用两种放射药物都清楚显现了感染位点。注射后3、6和18小时的靶标(感染肌肉)与本底(对侧正常肌肉)之比(T/B)分别为：对99mTc-HP：3.38±0.46，3.80±0.37及10.875±1.44；对111In-WBC：1.71±0.04，1.81±0.26，及3.79±0.83。T/B的平均比率(99mTc-HP与111In-WBC之比)为2.99±1.88，没有小于1的值。从直接组织采样计算的T/B，99mTc-HP的显著高于111In-WBC的(33.6∶1对8.1∶1，p＜0.01)。这些差异主要是由于99mTc-HP在感染肌肉中绝对积累增加(0.102％I.D./g对0.021％ID./g，p＜0.01)，而不是由于在正常骨骼肌中的积累差异。
这些结果提示：很可能由于在感染位点绝对积累增高的结果，99mTc-HP产生的靶标-本底比大于或等于111In-WBC所能达到的。
                    材料和方法
所有无机盐来自Fisher Scientific Co.。ITLC-硅胶层析条得自Gelman Laboratories(Ann Arbor，MI)。111In-喔星得自Amersham Inc.(Arling ton Heights，IL)。葡庚糖酸亚锡试剂盒(Glucoscan)和99Mo/99mTc发生剂得自杜邦放射药物分部(Billerica，MA)。所有其他试剂是可从商业途径得到的最高级别的。肽合成
用标准固相技术合成并纯化N-For-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰-赖氨酸。按Babich，J.W.等人在J.Nucl.Med.33：910(1990)中描述的方法制备该肽与烟酰肼的偶联物N-For-Met-Leu-Phe-(N-ε-HYNIC)Lys(HP)。在一2.5×50cm Whatman OBS-3柱上用0.1％TFA中乙腈梯度洗脱，经反相HPLC纯化产物。合并含主成分的流份，除去溶剂得到目标产物。用UV、质谱和氨基酸分析鉴定此肽。HYNIC衍生化趋化肽的99mTc标记
99mTc-葡庚糖酸盐用于提供放射标记肼基烟酰胺(Abrams，M.J.等，J.Nucl.Med.31：2022-2028(1990))结合肽所必需的Tc(V)氧代。向此冷干试剂盒中加入约2.5ml 0.9％NaCl中的99mTc高锝酸盐。最终放射活性浓度为100mCi/ml，产物的放化纯度通过即时薄层硅酸层析(ITLC-sg)来测定，用丙酮和0.9％NaCl作为流动相溶剂。
使用下列步骤用99mTc放射标记趋化肽。将5μl 1mg/ml肽溶液转至一清洁的玻璃瓶中。向此肽溶液中加入500μl PH5.2的0.1M乙酸盐缓冲液，再加入500μl 99mTc-葡庚糖酸盐。将此混合物快速涡旋，室温下静置1小时。用C18反相柱(300，5μ，45mm×25cm，Vydac)和下列洗脱条件下的HPLC测定放化纯度：溶剂A：水中0.1％三氟乙酸；溶剂B：乙腈中0.1％三氟乙酸；梯度：10分钟内由0％B到100％B；流速：2ml/分。用Milton-Roy/LDC(Boca Raton，FL)流过式分光光度计监测紫外吸收，用Beckman 170(Backman，Columbia MD)监测放射活性。用一种双通道积分仪(Waters Model 746 Data Module，Waters，Marlboro M4)记录并分析了来自两种检测器的输出信号。
用如上所述用HPLC系统分离99mTc-HP和未标记HP，制备99mTc-HP注射溶液。温和加热肽溶液并在N2流下干燥。将残余物溶解在等渗注射用盐水中。HPLC分析注射液样品。111In标记的白细胞
从按如下所述进行了感染的供体兔采血，50ml肝素化全血用hetastarch(Hespan，DuPont，Wilmington，DE)1∶1稀释。按McAfee.J.G.等在J.Nucl.Med.21：1059-1068 (1980)和McAfee.J.G等人在Semin.Nucl.Med.14：83-106(1984)中描述的方法制备111In标记白细胞，但做如下改变。沉降兔血液45分钟分离富白细胞血浆(LRP)。将LRP以450×g离心5分钟，将WBC层重悬于10ml盐水中，静置60分钟。吸出上清液，将细胞重悬于5ml盐水中。搅拌下滴加500μCi111In-喔星，将混合物于37℃保温60分钟，间歇搅拌。沉降细胞，将沉积物重悬于贫血小板血浆(PPP)中，450×g离心5分钟，重悬于注射用PPP中。从标记介质中分离并用PPP洗一次后，以仍保持与细胞结合的活性占开始加入细胞层的111In-喔星活性的百分比计算细胞标记效率。感染模型
在所有研究中使用重2.2-3.0kg的雄性新西兰大白兔。来自单一临床分离物的大肠杆菌在胰胨大豆琼脂板上生长过夜，单个菌落用无菌标准盐水稀释以产生约1×1011菌体/0.5ml(用分光光度计测定)的浑浊悬液。将0.5ml细菌悬液接种物注入兔左股肌肉深部。
接种后24小时，给因感染股部肿大的兔通过边缘耳静脉注射放射药物。给六只动物注射1mCi99mTc-HP(＞5000mCi/μMol)和0.05mCi111In标记白细胞的混合物。造影
注射放射试剂后3、6和18小时，用氯氨酮/xylazine(15.0和1.5mg/kg)麻醉动物，用装有平行孔中等能量准直仪并与专用计算机系统联机的大视野γ照相机(Technicare Gemini 700，Technicare 560，Solon，Ohio)进行正前位整体闪烁照相。用双光子模式，15％窗集中在140KeV光峰(99mTc)和247KeV光峰(111In)，同时获得111In和99mTc图象。注射后3和6小时，以预置时间5分钟/视域获得2套图象。注射后18小时，每视域的造影时间延长至10分钟。将有义区(ROI)拉向感染区和对侧正常肌肉(本底)。结果以靶标-本底比表示(感染股/对侧股)。直接组织采样法
获得最后的图象后，注射过量戊巴比妥钠处死动物，测定生物分布。将血液、心、肺、肝、脾、肾、肾上腺、胃、胃肠道、睾丸、骨、骨髓、正常肌肉、感染肌肉和脓标本称重，并用井型γ计数器(LKB modle#1282，Wallac Oy，芬兰)测定放射活性。为了校正放射衰变并能计算每个器官中以占所给剂量的份数表示的放射活性浓度，对注射剂量的等份同时计数。结果以每克中注射剂量的百分数(％I.D./g)、感染与正常肌肉之比和脓与正常肌肉之比表示。
为了确定循环和感染位点上放射活性的性质，将血液和脓样品在Lymphoprep中梯度离心分级分离。血浆在一G-100柱(1.0×25cm)上用PH7.4 PBS洗脱进一步分级分离。用111In-IgG、111In-F(ab’)2、125I-人白蛋白及99mTc-DTPA在此柱上做标准曲线。
Phantom研究
进行Phantom研究是为了计算111In的174KeV光子在99mTc窗中的交叉量和99mTc的140KeV光子在111In窗中的交叉量。简言之，给动物注射时，作为注射物的111In和99mTc样品以相同的比率与250ml盐水在标准输液袋中充分混合。将Phantom置于离造影台5cm处，并在两个窗中获得图像。从拉至每个袋周围的有义区(ROI)中计算交叉因子并用于校正99mTc和111In图象。统计方法
按Duncan的新复极差法(Duncan，D.B.，Biometrics.11：1-42(1955))进行方差分析(ANOVA)，评价造影和生物分布研究的结果。对于造影数据，使用线性模型的双因素方差分析，其中“注射后时间”和“放射药物”(99mTc-HP或111In-WBC)是分类变量，T/B＝时间＋放射药物＋时间×放射药物。对于生物分布数据，使用线性模型双因素方差分析，其中器官和放射药物是分类变量：％I.D./g＝器官＋放射药物＋器官×放射药物。另外，用线性回归法比较了111In-WBC和99mTc-HP的靶标-本底比。所有结果以均值±SEM表示。
                  结果肽合成
制备肼基烟酰胺衍生化趋化肽的收率和纯度良好。UV分析显示在268和315nm处有最大吸收。质谱和氨基酸分析(Met-1.00，Leu-1.00，Phe-0.97，Lys-1.00)与预期偶联肽产物一致。放射药物
ITLC和HPLC分析证明保温1小时后大于90％的放射活性与肽结合。未纯化99mTc-HP的比活经计算大于3000mCi/μMol。利用上文描述的纯化步骤，比活性提高到＞10,000mCi/μMol。
用于这些试验的111In-白细胞标记方法造成纯化前标记效率约为70％，最终放化纯度＞95％。Phantom研究
Phantom研究表明注射放射药物后3小时，在99mTc窗中检测到的光子5％归因于111In。注射后18小时，在99mTc窗中检测到的光子17％归因于111In。在这两个造影时间下，在111In窗中检测到的光子2％归因于99mTc。所有造影数据均对这些掠夺(pillover)效应做了校正。造影
图14显示共同注射99mTc-HP和111In-WBC后6和18小时，有代表性的交叉校正的兔正前位造影图象。在这两个造影时间点，两种放射药物的总体生物分布几乎相同。在肺、肝、脾和肾中检到两种试剂浓度都高。而在肌肉和胃肠道中两种示踪剂的浓度都低。
从造影数据可明显看出，注射后6和18小时两点上99mTc-HP以显著程度定位于感染位点。两种试剂的T/B比随时间显著增加(p＜0.01)。在两个造影时间点上，99mTc-HP的T/B比显著大于(p＜0.01)111In-WBC的。两种放射药物的靶标-本底比列于图15中。注射后6小时，99mTc-HP的T/B与111In-WBC注射后18小时的相当。两种T/B值(99mTc-HP与111In-WBC之比)的平均比率为2.99±1.88，没有低于1的值。直接组织采样
注射后18小时，用直接组织放射活性测定法测定的99mTc-HP和111In-标记WBC(％I.D./g)的生物分布示于表V中。
         表V99mTc和111In-WBC在兔体内的生物分布
  (％I.D./g，均值±SEM)器官     99mTc-HP       111In-WBC’s血      0.037/±0.003     0.127±0.029
    0.043±0.005      0.024±0.004肺      0.192±0.037      0.120±0.007肝      0.207±0.013      0.148±0.020脾      0.601±0.025      2.080±0.237肾      0.136±0.021      0.086±0.016肾上腺  0.103±0.018      0.139±0.026胃      0.050±0.008      0.013±0.003胃肠道  0.047±0.005      0.018±0.004睾丸    0.018±0.001      0.028±0.003肌肉    0.003±0.001      0.004±0.001骨髓    0.159±0.013      0.358±0.107骨      0.033±0.004      0.039±0.007感染肌肉0.101±0.008      0.024±0.002脓      0.188±0.034      0.035±0.008
在此时，在几种组织中发现这两种示踪剂浓度的显著性差异。99mTc-HP在感染肌肉(p＜0.01)、脓(p＜0.01)、心脏(p＜0.05)、肝(p＜0.05)、胃(p＜0.01)和胃肠道(p＜0.01)中积累较多。而发现111In-WBC在血液(p＜0.05)、脾(p＜0.01)和睾丸(p＜0.01)中有较高水平。在正常骨骼肌、骨、骨髓、肺、肾上腺或肾中没有显著差异。
血液的分级分离结果显示：在两个时间点，只有25％的循环99mTc放射活性与白细胞结合，而85％以上的111In放射活性与白细胞结合。两种放射粒素与红血细胞的结合均很小(＜2％)。相反，脓的分级分离证明：对99mTc和111In两种者都有约90％的放射活性与WBC结合。血浆柱层析表明：未与WBC结合的95％以上99mTc放射活性以150000的表现子分量(IgG部分)被洗脱；在游离肽洗脱位置上没有检测到放射活性。柱上放射活性大于90％。
图16显示在注射后18小时切下的组织样品上以直接放射活性测定法测得的，99mTc-HP和111In-WBC的感染肌肉与正常肌肉之比的图。99mTc-HP的感染肌肉与正常肌肉平均比率显著高于111In-WBC的(33.0∶1对8.1∶1，p＜0.01)。这一差异是由于99mTc-HP(0.102％I.D./g)与111In-WBC(0.024％I.D./g)相比在感染肌肉中绝对积累的增加造成的，而不定由在正常骨骼肌中的积累差所致(99mTc-HP和111In-WBC分别为0.003％I.D./g对0.004％I.D./g)。线性回归没有显示99mTc-HP和111In-WBC积累间显著相关(r2＝0.076)。
注射后18小时以直接放射活性测定法测得的、脓与对侧正常肌肉的比率综合在图17中。脓与正常肌肉平均比率，对99mTc-HP为61.8±11.05，而对111In-WBC为9.32±2.50(p＜0.01)。99mTc-HP(0.188±0.034％I.D./g)与111In-WBC(0.035±0.008％I.D./g)相比在脓中积累较多，这是99mTc-HP的T/B较高的主要原因。
                 讨论
本实施例证明对兔中细菌感染造影，99mTc标记趋化肽比111In-WBC优越。99mTc标记趋化肽在感染肌肉和脓中的绝对积累水平(％I.D./g)比111In-WBC的高。另外，99mTc-HP的靶标-本底比在所有造影时间点都较大。99mTc-HP注射后6小时的T/B比与111In-WBC注射后18小时的相当，这表明99mTc-标记趋化肽提供了一种用于感染造影的迅速的替代方法。因为在正常肌肉中的积累不显著，99mTc-HP比111In-WBC的T/B比提高主要是由于99mTc-HP在感染位点的浓度更高。
在对本发明进行了全面描述后，本领域技术人员将认识到可用许多等价参数、浓度和条件实施本发明，而不脱离本发明的精神，也不需要过多的试验。
虽然已结合其具体实施方案描述了本发明，但应认识到它还可以进一步变化。本申请意在包括总体上采用了本发明的原则而且包含了在与本发明相关的领域中已知或常规实施的可应用于如下所附权利要求范围内列出的以上必要特征的本公开内容以外内容的本发明任何变化、应用或改写。

Claims (73)

1.一种检测个体中感染或炎症位点的方法，其包括：
a.给予该个体诊断有效量的可检测标记的趋化肽
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为氨基保护基，
Y为氨基酸残基，
Z为间隔序列，
n为0或1，和
W为下式结构的标记或连接取代基
-[K]v-M1
其中：
K为中间功能团，
v为0或1，
M1是诊断学上可检测的标记；及
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累；和
b.检测该趋化肽。
2.一种检测个体中感染或炎症位点的方法，其包括
a.给予该个体诊断有效量的可检测标记的趋化肽
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为氨基保护基，
Y为
Figure A9419435200031
其中，R1为苄基，烷基或-CH2-CH2-R2-CH3，和R2为或-O-
Z为间隔序列，
n为0或1，和
W为下式结构的标记或连接取代基
-[K]v-M1
其中：
K为中间功能团，
v为0或1，
M1是诊断学上可检测的标记；及
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累；和
b.检测该趋化肽。
3.权利要求1的方法，其中X是选自氨基甲酸酯、羧酰胺、硫代羧酰胺、脲、硫脲和它们相应的氰基胍衍生物、磺酰胺和膦酰胺的氨基保护基。
4.权利要求1的方法，其中X是
其中R3选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4是硫属原子。
5.权利要求4的方法，其中R4是氧或硫。
6.权利要求2的方法，其中R1是-CH2-CH2-R2-CH3。
7.权利要求6的方法，其中可检测标记的趋化肽是
             X-Met-Leu-Phe-[Z]n-W。
8.权利要求7的方法，其中甲硫氨酸残基被4-氨基四氢硫代吡喃-4-羧酸取代。
9.权利要求7的方法，其中亮氨酸残基被二丙基甘氨酸取代。
10.权利要求7的方法，其中亮氨酸残基被1-氨基环己基羧酸取代。
11.权利要求7的方法，其中苯丙氨酸残基被z-脱氢苯丙羧酸取代。
12.权利要求7的方法，其中苯丙氨酸残基被2-氨基茚酮-2-羧酸取代。
13.权利要求7的方法，其中苯丙氨酸残基被苯胺基丙氨酸取代。
14.权利要求1的方法，其中n是1，Z是[R6]m，其中R6是氨基酸残基，m是大于或等于1的整数。
15.权利要求14的方法，其中m为1，R6选自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
16.权利要求14的方法，其中m等于或大于2，每个R6独立地选自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
17.权利要求1的方法，其中可检测标记的趋化肽选自下组：
N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPA
N-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPA
N-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPA
N-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPA
N-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA
N-苄氧羰基-Met-Leu-Phe-甲酯
IBOC-L-甲硫氨酰(亚砜)-L-Leu-L-Phe-L-赖氨酰胺
IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-赖氨酰胺
N-For-L-甲硫氨酰(亚砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys
N-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys
N-异丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸
异丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-Lys
N-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶剂化物
N-For-甲硫氨酰-亚砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-三甲基乙酰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
异丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物
N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys
异丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC
异丙基脲-Met-Leu-Phe-正丙基二胺-Asp-SHNH HBr
异丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr
异丙基脲-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr
N-苯基脲-Met-Leu-Phe
异丙基脲-Met-Leu-Phe-丙二胺-SHNH
N-正丁基硫脲-Met-Leu-Phe
N-正丁基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe
N-异丙基脲-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOH
iBOC-Met-Leu-Phe-COOH
iBOC-Met-Leu-Phe[酰氨基(丙基酰氨基)羧基[(丙基)羧基)]-(酰氨基丙醇SPNH)酯
N-异丁基脲-Met-Leu-Phe-羧酸
N-正丙基脲-Met-Leu-Phe
N-叔丁基脲-Met-Leu-Phe
N-正丁基脲-Met-Leu-Phe
iBOC-Met-Leu-Phe-(酰氨基乙氧基乙基[3-酰氨基]-6-丙烯醛腙)-吡啶
N-iBOC-Met-Leu-Phe-SPNH-硫代酯
N-异丙基脲-Met-Leu-Phe
N-iBOC-Met-Leu-Phe-丙二胺-SPNH
环己基脲-Met-Leu-Phe-COOH
N-正丁基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯
N-iBOC-Met-Leu-Phe-甲酯
N-甲基氨基甲酸-Met-Leu-Phe-甲酯
N-金刚烷基脲-Met-Leu-Phe
N-肉桂酰基-Met-Leu-Phe
对甲苯基脲-Met-Leu-Phe
间甲苯基脲-Met-Leu-Phe
N-肉桂酰基-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe。
18.权利要求1的方法，其中M1包括放射性同位素。
19.权利要求18的方法，其中M1是111In或99mTc。
20.权利要求1的方法，其中M1包括顺磁性同位素或可通过PET造影的化合物。
21.权利要求18的方法，其中经胃肠外给药。
22.权利要求20的方法，其中经胃肠外给药。
23.权利要求21的方法，其中胃肠外给药途径包括真皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉注射。
24.权利要求22的方法，其中胃肠外给药途径包括真皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉注射。
25.权利要求23的方法，其中给药方法是逐渐灌注。
26.权利要求24的方法，其中给药方法是逐渐灌注。
27.权利要求25的方法，其中逐渐灌注是利用蠕动工具通过静脉途径进行。
28.权利要求26的方法，其中逐渐灌注是利用蠕动工具通过静脉途径进行。
29.权利要求29的方法，其中个体是人。
30.权利要求1的方法，其中v是1，K是DTPA、EDTA或HYNIC。
31.权利要求30的方法，其中M1包括放射性同位素。
32.权利要求31的方法，其中M1是111In或99mTc。
33.权利要求30的方法，其中M1包括顺磁性同位素或可通过PET造影的化合物。
34.权利要求30的方法，其中K是HYNIC。
35.权利要求34的方法，其中W还包括L，其中L是辅助配体。
36.权利要求35的方法，其中辅助配体包括葡庚糖酸盐、tricine或另一个肽单元。
37.权利要求36的方法，其中另一个肽单元是
              X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，
其中W是下式结构的标记或连接取代基。
        -[K]v-M1，
其中K是HYNIC，v是1，M1是诊断学上可检测的标记物。
38.一种检测个体中感染或炎症位点的方法，其包括：
a..给予所述个体诊断有效量的下式可检测标记的趋化肽
       X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为下式结构的氨基保护基
Figure A9419435200091
其中：R3选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4为氧或硫
Y为Met、Phe或Nle，
Z为选自1-6个碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的间隔序列，其中R6为氨基酸残基，m为1-3的整数，
n为0或1，及
W是下式结构的标记或连接取代基
-[K]v-M1
其中K为DTPA、EDTA或HYNIC，
v为1，及
M1是111In或99mTc；且
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累；和
b.检测所述趋化肽。
39.权利要求38的方法，其中Y是Met。
40.权利要求39的方法，其中甲硫氨酸残基被4-氨基四氢硫代吡喃-4-羧酸取代。
41.权利要求39的方法，其中亮氨酸残基被二丙基甘氨酸取代。
42.权利要求39的方法，其中亮氨酸残基被1-氨基环己基羧酸取代。
43.权利要求39的方法，其中苯丙氨酸残基被z-脱氢苯丙羧酸取代。
44.权利要求39的方法，其中苯丙氨酸残基被2-氨基茚酮-2-羧酸取代。
45.权利要求39的方法，其中苯丙胺酸残基被苯胺基丙氨酸取代。
46.权利要求38的方法，其中n是1，Z是[R6]m。
47.权利要求46的方法，其中m为1，R6选自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
48.权利要求46的方法，其中m为2，每个R6独立地选自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
49.权利要求46的方法，其中m为3，每个R6独立地选自正亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。
50.权利要求49的方法，其中K是HYNIC。
51.权利要求50的方法，其中W还包括L，其中L是辅助配体。
52.权利要求51的方法，其中辅助配体包括葡庚糖酸盐、tricine或另一个肽单元。
53.权利要求52的方法，其中另一个肽单元是
              X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，
其中W是下式结构的标记或连接取代基。
       -[K]v-M1，
其中K是HYNIC，v是1，M1是诊断学上可检测的标记物。
54.权利要求38的方法，其中经胃肠外给药。
55.权利要求54的方法，其中胃肠外给药途径包括真皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉注射。
56.权利要求55的方法，其中给药方法是逐渐灌注。
57.权利要求56的方法，其中逐渐灌注是利用蠕动工具通过静脉途径进行。
58.权利要求38的方法，其中个体是人。
59.一种可检测标记的趋化肽
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W
其中：
X为下式结构的氨基保护基
Figure A9419435200111
其中：R3选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4为氧或硫
Y为氨基酸残基，
Z为选自1-6个碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的间隔序列，其中R6为氨基酸残基，m为大于或等于1的整数，
n为0或1，及
W是下式结构的标记或连接取代基
-[K]v-M1
其中K为DTPA、EDTA或HYNIC，
v为1，及
M1是111In或99mTc；且
其中该趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累。
60.权利要求59的肽，其中Y是Met、Phe或Nle。
61.权利要求60的方法，其中K是HYNIC。
62.权利要求61的方法，其中W还包括L，其中L是辅助配体。
63.权利要求62的方法，其中辅助配体包括葡庚糖酸盐、tricine或另一个肽单元。
64.权利要求63的方法，其中另一个肽单元是
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-W，
其中W是下式结构的标记或连接取代基。
           -[K]v-M1，
其中K是HYNIC，v是1，M1是诊断学上可检测的标记物。
65.一种适于胃肠外给药的权利要求59趋化肽的药物制剂。
66.选自下组的趋化肽
N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA，
N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPA，
N-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPA，
N-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA，
N-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPA，
N-For-Met-Leu-Phe-D-Lys(NH2)-DTPA，
N-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-DTPA，
IBOC-L-甲硫氨酰(亚砜)-L-Leu-L-Phe-L-赖氨酰胺，
IBOC-正亮氨酰-L-Leu-L-Phe-L-赖氨酰胺，
N-For-L-甲硫氨酰(亚砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys，
N-For-L-甲硫氨酰(砜)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys，
N-异丁基脲-Met-leu-Phe-羧酸，
异丁氧羰基-Met-Leu-Phe-N-DTPA-Lys，
N-For-(D)-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物，
t-BOC-Nle-Leu-Phe-Lys溶剂化物，
N-For-甲硫氨酰-亚砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物，
N-For-甲硫氨酰-砜-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物，
N-氨基甲酰-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物，
N-三甲基乙酰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物，
异丁氧羰基-Met-Leu-Phe-Lys酰胺溶剂化物，
N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Nε-DTPA-Lys，
N-金刚烷基脲-Met-Leu-Phe
N-肉桂酰基-Met-Leu-Phe
对甲苯基脲-Met-Leu-Phe
间甲苯基脲-Met-Leu-Phe
N-肉桂酰基-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe
其中所述趋化肽用诊断学上可检测的标记物标记，而且所述趋化肽能够在个体的感染或炎症位点积累，而在无感染或炎症的所述位点不显著积累。
67.权利要求66的方法，其中可检测标记物是放射性同位素。
68.权利要求67的方法，其中放射性同位素是111In或99mTc。
69.权利要求66的方法，其中可检测标记物是顺磁性同位素或可通过PET造影的化合物。
70.含有下式趋化肽的治疗组合物
X-Y-Leu-Phe-[Z]n-[T]α
其中：
X为下式结构的氨基保护基
Figure A9419435200141
其中：R3选自氢、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳烷氧基和氨基，R4为氧或硫
Y为氨基酸残基，
Z为选自1-6个碳原子的脂肪二胺、[R6]m和其混合物的间隔序列，其中R6为氨基酸残基，m为大于或等于1的整数，
n为0或1，
T是治疗剂，
α为0或1；
其中趋化肽在感染或炎症位点显著积累，而在无感染或炎症的位点不显著积累。
71.权利要求70的治疗组合物，其中α为1，T选自药物、植物血凝素、毒素、抗微生物和下式结构的片段：
          -[K]v-[M2]μ
其中：
K为中间功能团，
v为0或1
M2是治疗性放射同位素，及
μ是0或1
72.权利要求71的治疗组合物，其中v为0。
73.权利要求72的治疗组合物，其中M2选自125I、131I、90Y、67Cu、217Bi、211At、212Pb、47Sc、186Re、188Re、105Rh、153Sm和109Pd。
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