CN1150460A - 处理分枝杆菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从任何液体、半固体或外源制备分枝杆菌的方法。所抽提的分枝杆菌样品适于经培养和扩增检测。

Description

处理分枝杆菌的方法
相关申请的交互参考
本申请是1994年10月11日提出的美国申请08/224,592的部分后续申请，而上述申请又是1994年4月5日提出的美国申请08/222,731的部分后续申请。
发明背景A.分枝杆菌和疾病
结核分枝杆菌(MTB)是当今世界上最常见的传染性疾病结核病(TB)的致病因子。世界卫生组织(WHO)报道：17亿人(或大约为全世界人口的三分之一)目前正在或已经受到结核病感染(Kochi，A.Tubercle 72：1-6(1991))。结核病的传染在1991年以全世界新增加8百万病例的速度发生(Sudre，P.et al.，Bull.W.H.O.70：149-159(1992))，且世界卫生组织估计在90年代期间将有8千8百20万人将患结核病，在此期间，每年大约将有3百万人死亡(Morbidity and Mortality Weekly Report 42(No.49)：96l-964(1993))。1992年，在美国，疾病防治和预防中心(CDC)记录有26，673例结核病患者(Morbidity and Mortality Weekly Report 42：696-703(1993))，估计美国有1千万至1千5百万人已受结核病的潜伏感染(Morbidity and Mortality Weekly Report 39(RR-8)：9-12(1990))。
MAC复合体的分枝杆菌(主要为鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)作为人的病原菌的重要性最近由Inderlied，C.B.et.al.，Clin Mi-crobiol.Rer.6：266-310(1993)作过评述。在爱滋病病人中，由于它们作为机会病原菌发生，因而增加了MAC感染。大约有43％的爱滋病病人在发病早期，表现为传播的MAC感染(Nightingale etal.，Jour.Infect.Dis.165：1082-1085(1992))。世界卫生组织估计，目前已有近3百万人患有爱滋病，大约有1千5百万人已经感染了人免疫缺陷病毒(HIV)，到2000年，受感染的人的数量可上升为约4千万(世界卫生组织(ducument WHO/GPA/CNP/EVA 93.1)Global Programme on AIDS(1993))。除了与爱滋病有关的传染外，副结核分枝杆菌，作为鸟分枝杆菌的一个亚种(Thorel，M.F.etal.，Int.J.Syst.Bacteriol.40：254-260(1990))，被认为与Crohn氏病(即一种肠部炎症)有关(Chiodini，R.J.Clin.Micro.Rev.2：90-117(1989))。
分枝杆菌的传染在动物上也是一个问题。副结核分枝杆菌也引起反刍动物的肠炎(Thoen，C.O.et al.，Rer.Infect.Dis.3：960-972(1981))。这更通常地被称为Johne氏病。检测为Johne阳性的牛被剔除并消毁掉。在威斯康辛州，大约三分之一的牧群受到感染(Collins，M.T.，Hoard’s Dairyman Feb 10：113(1991))，1983年的财政损失估计为5千2百万美元(Arnoldi，J.M.et al.，Proceed-ings，3rd Int.Symp.World Assoc. Vet. Lab. Diag. 2：493-494(1983))。在全国范围内，牧群中的发病率一般介于3％至18％之间(Merkal，R.S.et al.，J.Am.Vet.Med.Assoc.190：676-180(1987))。单这一疾病对奶牛工业造成的财政损失每年超过15亿美元(Whitlock，R.Proceedings of the Third International Colloqium onParatuberculosis pp 514-522(1991)；Whitlock，R.et al.，Proceed-ings of the 89th Annual Meeting of the United Stares Animal HealthAssociation，pp 484-490(1985))。
除以上讨论的微生物外，还有多种分枝杆菌也被认为是人类病原菌，包括麻风分枝杆菌，堪萨斯氏分枝杆菌，海分枝杆菌，偶发分枝杆菌复合物以及许多其他分枝杆菌。Wayne，L.G.et al.，Clin.Micro.Rev.5：1-25(1992)综述了与该属微生物有关的种种传染。然而，这些感染的数量和损失在规模上与MTB复合物和MAC感染并不一样。例如，麻风病在这类疾病中可能是最常见的：全世界估计有5千5百万麻风分枝杆菌病例(Nordeen，S.K.et al.，Int.J.Lepr.63：282-287(1993))。总体上认为，这组生物迫使付出巨大的社会代价。B.分枝杆菌的培养和检测
当前的对分枝杆菌感染的实验室诊断方案相对较为缓慢。因这些细菌固有的较慢的生长率，必须延长培养。由于这种较长时间的诊断，对怀疑有感染的个人要进行检疫，否则一般会给社会造成显著的危险。
此外，分枝杆菌感染的实验室确诊对每个病人样品需几种培养物。在样品可被报告为阴性之前，每个样品必须培养长达八个星期(对副结核分枝杆菌则须十六周)。需要对每种可疑样品的多重培养的部分原因是由于有可检测数量的分枝杆菌的周期性脱落，以及由于用来钝化腐生微生物的严厉的化学去污造成传染性有机体的丧失。这些程序的效率较低，常常杀死其试图提取的分枝杆菌。例如，通过用推荐的N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH(NALC/NaOH)程序(Kent，P.T.et al.，“Public Health Mycobacteriology，”in A Guideforthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and HumanService，Centers for Disease Control，(1985)pp.31-46)处理已知可杀死28％-33％的现存的分枝杆菌(Krasnow，I.et al..Am.J.Clin.Path. 45：352-355(1966)；Kubica，G.P.W.et al.，Am.Rev. Resir.Dis.87：775-779(1963))。对培养技术进行补充的现代探针检测的问世(Gonzalez，R.et al.，Diag.Microbiol.Infect.Dis.8：69-78(1987)改进了进行诊断的时间；然而，尚有进行重要改进的余地。
社会重要性和对培养方法的依赖性两者一起揭示出关键是需要一个分枝杆菌检验方案，该方案减少迂回的时间并增加灵敏度。正由Gen-Probe，Inc.(San Diego，CA：Jonas，V.et al.，J.Clin.Micro.31：2410-2416(1993)商业化的等温方案和聚合酶链反应(PCR)都具有检测单个分子的潜力(Higuchi et al.，Nature(Lon-don)332：543-546(1988))。而且，扩增和检测可以在约8小时内完成，这些试剂并不明显地增加费用。如果可获得的话，一种扩增试验将大大增加检测的速度和灵敏度，且可减少分枝杆菌的诊断费用(De Cresce，R.P.et al.，Med. Laboratory Obs. 25：28-33(1993))。这些技术可有力地诊断分枝杆菌侵染，其快捷性将对社会产生巨大的财政影响。
然而，正如这里所描述的，研究人员在努力使这些技术如PCR扩增适应分枝杆菌的检测中已面临过多的问题。尤其是还不可能建立一种以某种方式制备供分析的样品的方案，该方案(a)保证真正阳性结果的扩增试验检测，同时(b)不产生错误的阴性结果。Noord-hoek，G.T.et al.，J.Clin.Micro.32：277-284(1994)的研究也具体地说明研究人员面临的易变性。这些作者描述了七个实验室参加的盲性研究。所有实验室使用相同的扩增系统，但是利用不同的处理和检测方法。这些结果的原始总结(Noordhoek，G.T.et al.，N.Eng.J.Med.329：2036(1993))一致表明：在较低的拷贝数(1000个拷贝)时，相关性变化为2％到90％，平均为54％。由于这些问题，目前尚没有可利用的FDA批准的TB-扩增试剂盒。C.处理分枝杆菌样品的方法
一篇与系统设计，样品处理技术和临床研究相关联的有关分枝杆菌-核酸扩增的参考性科技文献综述揭示出高度可变的结果，该结果阻止了FDA批准TB-扩增试剂盒。
已经使用了两种不同的扩增方案；现有为数众多的PCR系统设计方案和许多临床研究，这些都是针对分枝杆菌传染的，绝大多数是针对结核分枝杆菌的(MTB)。典型地说，样品首先作培养处理，然后再进行扩增。因此，在大多数情况下，供扩增的样品制备可被认为是培养处理方案的延续。
有几种该领域已用这种方法推定的原因。首先，获得临床样本是困难的。已诊断为MTB的患者个体一旦诊断后都开始药物治疗。第二，处理MTB样品需要专有的遏制设施和经过适当培训的技术人员。第三，它是最容易获得“培养相关性”结果的途径；即，扩增的阳性和阴性结果与培养为阳性或阴性的结果的相关性。结果，研究人员已典型地处理供培养的样品，然后使用“进一步”处理供扩增的沉淀的方案。通过这种方式，利用实际的临床标本，遏制也不能被突破，工作流程不被打断，病人的护理也不遭致破坏，与当前的方案的相关性是可行的。以上所述的“进一步”处理涉及多种样品制备和细胞裂解技术。
表1总结了35篇发表的文章，利用来自17个不同国家的样品，评价了临床实验室中扩增技术的效果。表1中的文章是按年代顺序描述的。已作了各种努力以便准确地代表原文的意思。然而，在某些情况下存在模棱两可的解释，某些文章有与众不同的特征。在随后的注释中着重进行了阐明。
核酸扩增结果与培养结果的相关性被选择为比较表1中所示的研究的基础。利用这种观点，该分析揭示出了猜不透的谜：按照表1中概括的方法，用于扩增的样品绝大多数情况下来源于用来接种培养物的“菌蕾”。假设有与培养有关的扩增的灵敏度，一种培养物阳性/扩增阴性(例如，错误的阴性扩增)并没有直观意义。几个作者提出了“正确的相关性”(见表1中注释C)。例如，如果获得几个错误的阴性，可通过对靶DNA作进一步的提纯，稀释抑制剂，对同一样品多次扩增，对同一病人的不同样品多次扩增，或对扩增的样品重新扩增来对结果进行解析；从而得出正确的结果。
这引入了一个有趣的窘境。Jackson，J.B.et al.，J.Clin.Mi-cro.31：3123-3128(1993))成功地提供了HIV-PCR质量保证组(包括11个实验室)。报告的灵敏度说明，所有实验室都具有在106个人细胞背景下可日常鉴定HIV基因组2个拷贝的能力。这里综述的表1的研究强烈地说明TB-扩增技术的灵敏度是相似的。从表1研究的讨论显而易见的是，尽管用于分枝杆菌检测的这些扩增技术的灵敏度预期比培养的或涂片的数量级大，但离期望有一致的偏差。虽然某些反常是由于抑制作用并因此也容易解释，但许多反常现象是“不能解释的”。将会十分清楚的是，即使使用内标物来检测抑制剂，这些不能解释的偏差也是合理平常的，照此给在临床实验室中为检测分枝杆菌的核酸扩增技术的合法性造成一个重大的障碍。例如，当为阳性或怀疑为阳性时，可以重新检查，一般地阴性则不重新检查。由于经常会出现假阴性，实验室无法知道哪些样品为真正的假阴性，哪些样品需要“重新分析”。结果，由于诊断出现了错误的阴性，病人的护理也遭致破坏。因此，为了讨论此处发表的技术的目的，利用了该技术的不正确的数据。这些偏差-假阴性-是余下要讨论的焦点。
表1：文献报导的培养结果与核酸扩增结果的相关性表1中的每一例研究，处理方案都为缩写(见脚注A)，评价的临床样本的数量与相应的培养物和扩增阳性样品(见脚注B)相应的数量一起阐述，并表示出了“未校正的”培养相关性(见脚注C)。选择了35个研究，是因为提出的扩增结果与培养结果之间有明显的可比性。Shankar，P.et al.，Lancet 337：5-7(1991)；de wit，D.et al.，Tu-bercle and Lung Dis.73：262--267(1992)，和Kaneko，K，et al.，Neurology 40：1617-1618(1990)的研究被省略，是因为据此没有明显的可比性。
    作者            A处理方案    B总数培养_/扩增_   C相关性
Brisson-Noel et al.，Lancet ii：1069-1071(1989) SDSP_NaOH/SDS/95°/15′_Org/ppt        35：13/15   100％
Shankar et al.，Laneet 335：423(1990) NALC_NaOH/NaCl/SDS/95°/15′_Org/ppt        D23：8/10   100％
Hermans et al.，J.Clin.Micro.28：1204-1213(1990) _(NaOH/NaHPO4)P_(TE)W_Lz/SDS/PrK_Org/ppt        E17：7/11   100％
Pao et al.，J.Clin.Micro.28：1877-1880(1990) OxAc_NaCl/EDTA_Lz_Phenol/SDS_ppt        284：49/118  (100％)F
_Si_bring et al.，J. Clin. Micro.28：2200-2204(1990) DTT_TE/95°_Sonic        G7：4/3   75％
DE Wit et al.，J.Clin. Micro.28：2437-2441(1990) _PEG_70°/30′_Phenol/SDS_Org/PEG-ppt        H26：14/14   100％
Thierry et al.，J.Clin.Micro.28：2668-2673(1990) (_)NaOH/SDS/95°/15′_Org/ppt        I75：30/35   100％
__Pierre et al.，J. Clin. Micro.29：712-717(1991) (a)SDSP_NaOH/SDS/95°/15′_Org/ppt        J82：24/23  (79.2％)K
                  作者                A处理方案   B总数培养_/扩增_   C相关性
(b)SDSP_(PBS)W_PCRBuf/PrK/NonI_95℃/10′
Del Portillo et al.，J. Clin. Micro.29：2163-2168(1991) _(Water/95°/10′)P_Lz_SDS/PrK_Org/ppt      L30：11/18   100％
__ξBrisson-Noёl et al.，Lancet338：364-366(1991) SDSP_NaOH/SDS/95°/15′_Org/ppt      M446：141/110  (89.4％)N
_Sritharan et al.，Mol. Cell. Probes5：385-395(1991) NALCP_(TEX)W_TEX/95°/30′      O96：74/88  (95.9％)P
Eisenach et al.，Am. Rev. Resp.Dis.144：1160-1162(1991) NALCP_Lz_NaOH/SDS/95°/5′_GuSCN/Si      162：48/53   97.7％
Manjunath et al.，Tubercle 72：21-27(1991) NALC_NaOH/SDS/95°/15′_Org/ppt      117：17/31   100％
_ Cousins et al.，J.Clin. Micro30：255-258(1992) NALCP_(Water)W_Lz_SDS/PrK_TMA/Org/ppt      177：64/92   984％
_VAN DER Giessen et al.，J.Clin.Micro.30：1216-1219(1992) (a)NaOHS_Phenol/CHCl3_Silica_H2O      Q87：30/5&1   16％，3％
              作者              A处理方案    B总数培养_/扩增_    C相关性
(b)NaOHs_Phenol/CHCl3_Silica_H2O(c)IDEXXBUF_Column_Pellet_NaOH_120°/10′       87：30/7&187：30/4&4  23％，3％13％，13％
___Buck et al.，J.Clin.Micro.30：1331-1334(1992) NALCP_2x(Water)W_Sonic_95°/10       R43：25/24   92.0％
__ξ Victor et al.，J.Clin.Micro.30：1514-1517(1992) (a)NALC_PCRBuf_95°/10′(b)NALC_Sucrose_(PBS)W_PBS       S155：131/100155：131/13l   76.3％98.5％
_Soini et al.，J.Clin.Micro.30：2025-2028(1992) NaOH/SDSP_NaOH/SDS/95°/15′_Org/ppt       127：34/25   55.9％
Altamirano et al.，J.Clin.Micro.30：2173-2176(1992) NALCP_Lz/SDS_perCl_Org/ppt       200：44/43   97.7％
_Fauville-Dufaux et al.，Eur.J.Micro. Inf. Dis. 11：797-803(1992) SDS or TriPO4_NaOH/SDS/95°/15′_Org/ppt       T206：92/84   (91.3％)U
                 作者              A处理方案   B总数培养_/扩增_   C相关性
__ Kolk et al.，J.Clin.Micro.30：2567-2575(1992) NALCP_(TX)W_TX/PrK/60°/18hrs_95°/15′      227：45/81   95.6％
__ξ_Shawar et al.，J.Clin.Mi-cro.31：61-65(1993) NALCP_(TEX)W_TEX/95°/30′      384：71/75   78.9％
ζ_ Wilson et al.，J.Clin.Micro.31：776-782(1993) (a)NaOH_(PBS)W_PBS/80°/20′_GuSCN/Si(b)NaOH_(PBS)W_PBS/80°/20′_CHCl3      V171：27/19171：27/26   (66.7％)W(88.9％)
_Folgueira et al.，J.Clin.Micro.31：1019-1021(1993) NALCP_PCRBuf/PrK/NonI_95°/10′      X75：71/75   (90.7％)Y
Koeag_z et al.，J.Clin. Micro. 31：1435-1438(1993) NALCP_3X(TE)W_TE/95°/10′      Z78：29/36   (100％)α
___Forbes et al.，J.Clin.Micro.31：1688-1694(1993) NaOH_PBS/NonI_95°/10′_Son-ic      β173：31/25727：80/75   (80.6％)γ(83.8％)
                   作者            A处理方案   B总数培养_/扩增_  C相关性
__Nolte et al.，J. Clin. Micro. 31：1777-1782(1993) NALCP_TEX_95°/30′     313：123/113  91.1％
__Irula et al.，J.Clin.Micro.31：1811-1814(1993) _Fic/Hyp/PBMC_(TEX)W_ChX/56°/30′_95°/30′     δ243：15/44  80.0％
__ζ_Clarridge et al.，J. Clin. Micro.31：2049-2056(1993) NALCP_(TEX)W_TEX/95°/30′     1,166：218/192 (83.0％)ξ
Miyazaki et al.，J.Clin.Micro.31：2228-2232(1993) DTT_Lz_PrK/SDS_Org/ppt     417：56/92 (96.4％)ξ
__ξJonas et al.，J.Clin. Micro.31：2410-2416(1993) NALC_HCl_GenBuf_Sonic_95°/15′     η758：119/116 (79.8％)θ
_ζ_Abe et al.，J. Clin. Micro. 31：3270-3274(1993) (a)Gen：NALC_PBS/HCl_GenBuf_Sonic_95°/15′(b)PCR：NALC_TEX/GuSCN/Si     135：32/34135：32/32 (90.6％)κ(81.2％)
___Miller et al.，J. Clin. Micro.32：393-397(1994) (a)Gen：NALC_HCl_GenBuf_Sonic_95°/15′     λ750：142/131 (83.9％)μ
                  作者            A处理方案   B总数培养_/扩增_   C相关性
(b)PCR：(NALC)P_PCRBuf_Son-ic_95°/15′     156：142/122   (78.2％)
_ξPfvffer et al.，J. Clin. Micro.32：918-923(1994) (a)NALC_HCl_GenBuf_Sonic_95°/15′(b)SDS_HCl_GenBuf_Sonic_95°/15′     υ515：42/57423：36/50   (92.9％)§(97.2％)
_ Bodmer et al.，J. Clin. Micro.32：1483-1487(1994) SDS_HCl_GenBuf_Sonic_95°/15′ π617：21/21 71.4％
(A)除了Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.28：1208-1213(1990)，DEWit，D.et al.，J.Clin.Micro.28：2437-2441(1990)，Del Portillo，P.et al.，J. Clin. Micro.29：2163-2168(1991)，Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.31：1811-1814(1993)，可能还有Thierry，D.et al.，J．Clin.Micro.28：2668-2673(1990)外，所有的研究都是首先处理培养的样品。一般地，使用所有的样品处理技术都总结于Kent，P.T.et al.，“Public Health Mycobacteri-ology”in A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department ofHealth and Human Services，Centers for Disease Control，1985，pp.31-46。用来描述临床样品处理的符号如下：“NALC”指Kubica，G.P.W.et al.，Am.Rev.Resir.Dis.87：775-779(1963)描述的N-乙酰-L-半胱氨酸/氢氧化钠液氏/清除方案。按照Hirsch，S.R.et al.，J.Lab.Clin.Med.74：346-353(1969)，“DTT”是指利用二硫苏糖醇处理分枝杆菌。“SDS”(十二烷基磺酸钠)是指Eng-baek，H.C.et al.，Scand J. Respir.Dis.48：268-284(1967)的方案。“Fic/Hyp”是指按Boyum(Boyum，A.J.Clin.Lab.Invest.21(Suppl.97)77-109(1968)的方法后供提纯外周血单核细胞(PBMC)的聚蔗糖/泛影纳制剂梯度方案。“NaOH”指作者特定的氢氧化钠清除方案，或者为直接引用作者未陈述清楚的特定的清除方案。“OxAc”指使用草酸(Corper，H.J.et al.，J.Lab.Clin.Med.15：348-369(1930))。“PEG”指作者特定的使用聚乙二醇沉淀。“TriPO4”指Collins，et al.，Organization and Practice in TuberculosisBacteriology，Buttersworth，London，1985的三磷酸方法。处理的样品总是离心产生一个“菌蕾”(沉淀)。用水或磷酸盐缓冲液(PBS)重新悬浮菌蕾，然后取等份样进行培养和涂片。剩余的沉淀然后作扩增处理。附加于处理设计的下标“P”指在作进一步的供扩增处理之前对重新悬浮的沉淀再次离心，它是研究中使用的离心沉淀。附加于处理设计的下标“S”指通过离心澄清上清液，它是研究中使用的上清液。在培养处理之后，几个作者比较了不同的制备供扩增的样品的方案：只包括供实际研究用于制备样品的方案。文章中限定了比较样品制备的那些研究，也讨论了这些发现的结果。使用了下列缓冲液缩写于：“TE”＝Tris/EDTA，“TX”＝Tris/Triton-X100，“TEX”＝Tris/EDTA/Triton-X100和“NonI”＝Tris/Tween20&NP-40。下标“W”指用括号里的缓冲液的洗涤步骤。“GenBuf，”“IDEXXBuf”和“PCRBuf”指分别用Gen-Probe缓冲液或IDEXX缓冲液(其成分未知)或PCR缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl2，0.45％Tween 20，0.45％NP-40)悬浮/重新悬浮样品。“CHCl3，”“HCl”和“perCl”分别指在处理步骤中包括氯仿，盐酸和高氯酸。“PrK”和“LZ”指用蛋白酶K和/或裂解酶对样品进行酶解消化，包括煮沸或在极端温度下处理的任何步骤简化为在规定的时间内95℃。“Org/ppt”指有关有机化合物(包括苯酚，氯仿，和/或异戊醇)或其组合的任何抽提方法，紧接着用乙醇或异丙醇沉淀核酸。在这方面，有许多变化，但是所有方法均与Ma-niatis，T.et al.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory，New York，1982，pp458-463)中的方法相似。“TMA”指用沉淀DNA的季铵或与Baess，I.Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B 82：780-784(1974)的方法相似的多糖。“GuSCN/Si”指按(例如)Boom，R.et al.，J.Clin.Microbiol.28：495-503(1990)描述的在硅存在时用异硫氰酸胍从样品纯化DNA。“Sonic”是指经对样品进行声处理(在有或没有玻璃珠存在时)释放DNA。
(B)在某一指定的研究中，使用的临床样品总数量的后面先是紧接着培养阳性的数量，然后是扩增阳性的数量。该栏中其他的脚注指描述该研究有关的特征。
(C)表示出扩增结果和培养结果之间未校正的相关性(如，扩增阳性样品的数量也是培养阳性，被培养阳性的总数量相除)。几个作者进一步地考查了不一致的结果(如，“假阴性”或“假阳性”)，或结合病人情况来分析，发表了校正的结果。该栏中列出的相关性指未校正的结果。如果发表的结果与该栏目中列出的结果存在偏差，括号中的数量用适当的脚注解释了这种差异。
(D)Shankar，P.et al.，Lancet 335：423(1990)没有明确地阐述用来处理供培养或PCR的样品的方案。然而，Manjunath，N.etal.，(Tubercle 72：21-27(1991))阐明他们发表的文章是Sbankar，P.et al.，Lancet 335：423(1990)研究的最初工作的最终看法。因此，为了讨论的目的，假定处理条件与Manjunath，N.et al，Tuber-cle 72：21-27(1991)的条件一致。
(E)Hermanns，P.W. M.et al.，J. Clin. Micro.28：1204-1213(1990))的研究直接处理供扩增的原始样本(如，样本不作培养处理，沉淀被分开作培养和PCR分析)。
(F)Pao，C.C.et al.，J.Clin.Micro.28：1877-1880(1990)没有给出PCR的未经校正的结果。然而，他们确实认为：“如果最初的结果为阴性，第一次扩增反应混合物的一部分(通常为1/5)可以再扩增32个循环……”因此，最初的可能是假阴性。
(G)在Sj_bring et al.，J.Clin.Micro.28：2200-2204(1990)研究中对应于这一假阴性PCR结果的斜线只产生单一菌落。其他三个培养/PCR阳性样本直接处理进行扩增。
(H)DEWit，D. et al.，Tubercle and Lung Dis.73：262-267(1992)的研究只使用胸膜液体。原始的样本直接通过PEG沉淀，并用于扩增。
(I)Thierry，D.et al.，J.Clin. Micro.28：2668-2673(1990)指出：“DNA从0.2到1ml的原始的或氢氧化钠清除的临床样本中抽提出……”因此，为了讨论的目的，假定样本可以直接用于扩增。
(J)Pierre，C.et al.，J.Clin.Micro.29：712-717(1991)讨论了处理临床样品的两种方法。他们没有明确地阐明哪种方法用于研究。然而，他们确实提出“在某些情况下，样品的一部分……”用第二种非离子溶解方法进行处理。他们同时阐明在这些样品中发现了更多的抑制剂。因此，为了讨论的目的，假定有机抽提是该研究中使用的最初方案。
(K)Pierre，C.et al.，J. Clin.Micro.29：712-717(1991)利用了一个“重新扩增”方案，其中把试管打开，一部分转移到一个新的PCR混合物中重新扩增。用最初的扩增，其结果为79.2％，重新扩增后结果为100％。
(L)Del Portillo，P. et al.，J. Clin. Micro. 29：2163-2168(1991)的研究直接处理痰进行扩增。
(M)Brisson-Noёl，A.et al.，Lancet 338：364-366(1991)检验了514个样本，但只有446个进行了PCR和培养。
(N)Brisson-Noёl，A.et al.，Lancet 338：364-366(1991)使用的系统是针对65Kd蛋白质设计的，可扩增多数分枝杆菌。在141个培养的阳性样本中，130个为MTB，111个为MOTT(非结核病分枝杆菌)。在141个样本中，126个通过PCR扩增为阳性，6个为假阴性，9个含有抑制剂。因此，与培养的相关率为89.4％(126÷141＝0.894)。报道的相关率为97.4％，包括用抑制剂清除样品和对病人的资料进行分析(如临床高度怀疑PCR为阳性/培养阴性的样品)。
(O)Sritharan，V.et al.，Mol Cell.Probes 5：385-395(1991)实际上比较了8种释放供PCR的DNA的不同方法。该研究选择煮沸的方法。
(P)Sritharan，V.et al.，Mol.Cell.Probes 5：385-395(1991)阐述的相关性为100％，代表3个样品的重新扩增，这些样品在第一次PCR时为假阴性。未校正的相关性为96.0％。
(Q)Van der Giessen，J.W.B.et al.，J.Clin.Microbiol.30：1216-1219(1992)比较了设计来检测牛粪中副结核分枝杆菌的3个PCR基本系统(McFadden，J.J.et al..Mol.Microbiol.1：283-291(1987)；Van der Giessen，J.W.B.et al.，J.Med.Microbiol.36：255-263(1992)；Vary，P.H.et al.，J. Clin.Microbiol.28：933-937(1990))。其中之一为得自IDEXX(Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.28：933-937(1990))的商业上已应用的试剂盒。在该研究中，他们分二个不同的批次用所有三种方法检测了87个样品。培养物只检测一次(培养_＝30)，而每个PCR运行二次，因此有二组数值。
(R) Buck，G.E.et al.，J.Clin. Micro. 30：1331-1334(1992)实际上比较了4种不同的释放DNA供PCR分析的方法。所示的声处理的方法被选择用于研究。此外，该研究中所有的样品已知为TB-阳性，所有样品也为涂片阳性。
(S)Victor et al.，J. Clin.Micro.30：1514-1517(1992)分散所有的沉淀，或者直接进行扩增，或者通过蔗糖密度梯度进一步提纯样品。两种方法的结果都可用于讨论。
(T) Fauville-Dufaux et al.，Eur. J. Micro. Inf. Dis. 11：797-803(1992)阐明样本通过用SDS或三磷酸处理。他们没有进一步区分哪种样品通过哪种方法处理。
(U)Fauville-Dufaux et al.，Eur.J. Micro.Inf. Dis. 11：797-803(1992)使用的一对引物是针对85个序列的抗原而设计的。结果，他们的系统能够扩增大多数分枝杆菌种。在206个处理的样品中，92个为培养阳性。在这92个样品中，84个通过PCR最初为阳性(91.3％)。在92个样品中，82个被鉴定为MTB。在这82个样品中，只有74个通过PCR最初鉴定为阳性(90.2％)。而8个非阳性样品看来含有抑制剂，3个样品可以被稀释至可以观察到阳性信号的水平。因此，通过分析，作者阐明82个中的77个(93.9％)可通过PCR作正确的鉴定。作者报道其相关性为93.9％。
(V)Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.31：776-782(1993)比较了2种不同的释放DNA供PCR分析的方法。该研究中对所有的样品均使用两种方法，因此有两个相关性。此外，Wilson. S.M.et al.，J.Clin. Micro.31：776-782(1993)使用套有“一个试管”的方案。
(W) Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.31：776-782(1993)指出GuSCN/Si方法的相关性为75％，氯仿方法的相关性为92％。这代表“病人的结果”。该栏中指出的相关性代表发表的“单个样本”结果的相关性。此外，该研究中所有的样品都重复二次，以消除偏差。
(X) Folgueria，L. et al.，J. Clin. Micro. 31：1019-1021(1993)比较了两种不同的释放DNA供PCR分析的方法。所示的煮沸法被选择用于研究。该研究中所有的样本已知为TB-阳性。
(Y)Folgueria，L.et al.，J. Clin. Micro.31：1019-1021(1993)阐述的培养和PCR之间的相关性为100％，并且代表需要对抑制剂稀释的7个样品。未校正的相关性为90.7％。
(Z)Kocag_Z，T.et al.，J.Clin.Micro.31：1435-1438(1993)比较了两种不同的制备供PCR分析的沉淀的方法。所示的煮沸法被选择用于该研究。
(α)Kocag_T，T.et al.，J.Clin.Micro.31：1435-1438(1983)使用的“金标准”为“临床上高度可疑”。尽管对这一标准阐述的相关性给定为87％，但与培养的相关性为100％。
(β)Forbes，B.A.et al.，J. Clin. Micro. 31：1688-1694(1993)最初测定了173个样品，使PCR尽可能完善。他们然后检测了727个样品。这两个研究的资料可用于讨论。
(γ)Forbes，B.A.et al.，J.Clin. Micro. 31：1688-1694(1993)阐明检测的727个样品的相关性为87.2％。这一灵敏度包括病人的资料与分析型PCR阳性/培养阴性样品相结合。表2中的此项工作表明80个MTB培养阳性，67个被PCR挑选出。因此，未校正的灵敏度为83.8％。
(δ)Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.31：1811-1814(1993)只使用血样做研究。此外，该研究的目的是鉴定与MTB相对的鸟分枝杆菌。
(ε)Clarridge，J.E.et al.，J. Clin. Micro.31：2049-2056(1993)阐述了几个培养相关性数值。培养阳性MTB样本的实际数量被认为是218个，该组内PCR阳性的数量为181个(见表2中的此项参考)。因此，记载的供讨论的未校正的相关性为83.0％
(ξ)MiyaZaki，Y.et al.，J. Clin. Micro. 31：2228-2232(1993)使用一个套用的PCR系统(如，第一次反应的样品实际上被转移至新鲜的PCR混合物中，重新扩增)并鉴定了56个中的54个为培养阳性(96.4％相关性)。然而，有10个样品为培养阴性/涂片阳性/PCR阳性。包括了这10个样品在内，作者阐述的相关性为97.0％(64÷66＝0.970)
(η)Jonas，V.et al.，J.Clin.Micro.31：2410-2416(1993)的研究只使用了Gen-Probe已商业化的专有的扩增方案。
(θ)在Jonas，V.et al..J.Clin.Micro.31：2410-2416(1993)的研究中，其中的119个培养阳性样本中，只有95个被扩增挑选出(79.8％)。有21个样本为培养阴性/扩增阳性。作者认为，这21个样本中只有17个为真正的阳性。包括这17个样本在内的结果表明扩增鉴定的136个中的112个为真正的阳性。这增加了对报道的灵敏度：82.4％。
(ι)在Abe，C.et al.，J.Clin.Micro.31：3270-3274(1993)的研究中，所有的样本被平分，以使得自Gen-Probe方法(Gen)的结果可以与得自KoLk，A.H.J.et al.，J.Clin.Micro.30：2567-2575(1992)描述的PCR系统的结果可以比较。
(κ)Abe，C.et al.，J.Clin.Micro.31：3270-3274(1993)分析了几个不一致的结果，认为Gen-Probe方法的相关性为91.9％，PCR的相关性为84.2％。忽视这些差异的解析给出相关性分别为90.6％和81.3％。Gen-Probe扩增的灵敏度似乎好于PCR获得的灵敏度。
(λ)Miller et al.，J.Clin.Micro.32：393-397(1994)使用的主要扩增方案正由Gen-Probe商业化。然而，他们确实把这些结果与Eisenach et al.，J. Clin.Micro.26：2240-2245(1988)的PCR系统获得的结果进行了比较。虽然按Gen-Probe方法对所有750个样品进行了扩增，但只有那些被认为为阳性的样本(156个)才通过PCR进行扩增。
(μ)Miller et al.，J. Clin.Micro.32：393-397(1994)的研究中，156个样本为“经过培养证明和/或临床诊断[具有]结核病。在这156个样本中，只有142个实际上为培养阳性。利用Gen-Probe方案，156个中的131个(83.9％)样本为阳性。因而，“用用同一处理的沉淀的不同等份样重新检测样本增加到检测出156个中的142个(91.0％)。”以这一方式提出的实际数据几乎不可能确定这一数量是否代表与培养的相关性。156个阳性的PCR扩增最初鉴定出122个(78.2％)样本。重复PCR测定鉴定出了143(92.3％)个样本(PCR的灵敏度似乎勉强比Gen-Probe方法要好)。还有一些涂片阳性的样本，它们最初经两种方法的检测为阴性。所有涂片阳性样本经过重复检测进行鉴定。
(υ)Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.32：918-923(1994)通过两种不同的方法(NALC和SDS)产生沉淀，并用Gen-Probe的方法扩增了所有的沉淀。对每一类方法，样本都是独特的(例如，同一样本通过一种或其他方法但不是两种方法进行处理)。
(ξ)在Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.32：918-923(1994)的研究中，42个NALC样本为培养阳性，39个(92.9％)通过扩增进行了鉴定。36个SDS样本为培养阳性，35个(97.2％)经扩增进行了鉴定。然而，作者解析了扩增阳性/培养阴性结果，并认为NALC沉淀扩增正确地鉴定了49个中的46个为“真正的阳性”(93.9％)，SDS沉淀的扩增正确地鉴定了39个中的38个为“真正的阳性”(97.4％)。
(π)Bodmer et al.，J.Clin.Micro.32：1483-1487(1994)使用Gen-Probe扩增方案。
(_)指示了作者讨论抑制作用或抑制剂是造成假阴性的因素的那些研究。
(_)指示了作者讨论低拷贝数是引起假阴性的因素的那些研究。
(§)指示了作者讨论的统计漏失(dropouts)现象或与统计漏失一致的现象(这将包括“不能解释的”结果)，或讨论由凝块加剧引起的反常结果的可能性的那些研究。
(ψ)指示了观察为培养阳性/涂片阳性/扩增阴性样品的例子的那些研究。D.表1的研究
对表1中发表文献报道的数据研究表明，不管什么系统设计或样品处理技术，在结果方面都变化很大。这些研究确实包括所有可能来源的样品；包括痰，支气管洗涤物，胸膜液，胃气，脑脊椎液，尿，活组织检查物，骨髓，浓肿及渗出液，血，血清，腹膜液及排泄物。使用两种不同的扩增方案：30个研究仅使用PCR，3个研究用Gen-Probe(Jonas，V. et al.，J. Clin. Micro. 31：2410-2416(1993)；Pfyffer et al.，J. Clin. Micro. 32：918-923(1994)；Bodmer et al.，J.Clin.Micro.32：1483-1487(1994)正商业化的等温的、逆转病毒类型的、专有的扩增方案，两个研究比较了两种扩增技术(Abe，C.et al.，J. Clin.Micro.31：3270-3274(1993)；Miller et al.，J.Clin.Micro.32：393-397(1994)。33个研究针对MTB的检测，一个研究是针对鸟分枝杆菌诊断检测(Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.31：1811-1814(1993))，一例研究是试图检测副结核分枝杆菌(Vander Giessen，J.W.B.et al.，J. Clin. Microbiol. 30：1216-1219(1992))。在大多数样本类型中，不管是什么靶标，处理技术或扩增技术，都能发现假阴性结果。
表1中报道的研究样品数量从7个到1,166个样本。与培养的相关性范围为3％到100％。35个研究中的9个(26％)声称100％的相关性。然而，绝大部分，9个中的7个(78％)包含的样品数量不到100个(n＜100)样本。只有两个研究(Manjunath，N.et al.，Tu-bercle 72：21-27(1991)；Pao，C. C. et al.，J. Clin. Micro. 28：1877-1880(1990)使用了100多个样品(然而，Pao，C.C.et al.，J.Clin.Micro.28：1877-1880(1990)可能已经重新扩增以努力证实阴性样品：见表1中的脚注F)。或者，35例研究中的26例(74％)表现了不到100％的相关性。在这一组中，26个中的20个(77％)使用样品的数量大于100(n＞100)。在扩增-培养相关性和样品大小之间似乎有一种相反的相互关系：一般地，研究中包括的样品数愈多，相关性则愈低。
表1中，35例研究中的32例(91％)表现出扩增能够检测培养阴性样本中分枝杆菌DNA的存在(剩下的3个研究中的2个已知仅为阳性样本)。这些32个中的2个比培养阳性的数量大二倍多(Ir-ula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.31：1811-1814(1993)；Pao，C.C.et al.，J.Clin.Micro.28：1877-1880(1990)，非常接近这一数量的三倍(Kolk，A.H.J.et al.，J.Clin.Micro.30：2567-2575(1992)；Manjunath，N. et al.，Tuberck 72：21-27(1991)；MiyaZaki，Y.etal.，J.Clin.Micro.31：2228-2232(1993))。31位作者直接指出(或参考实验事实指出)在理想的体外条件下，他们的系统具有检测10个或低于10个拷贝存在的能力。余下4个的灵敏度范围为15至40个拷贝(Altamirano，M.et al.，J.．Clin.Micro.30：2173-2176(1992)；Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.28：1204-1213(1990)；Pao，C. C.et al.，J.Clin. Micro.28：1877-1880(1990)；Soini，H. et al.，J.Clin. Micro.30：2025-2028(1992))。培养为阴性的样品，通过扩增为阳性，它们更容易比培养阳性-扩增阴性样品得到解释：与培养相反，PCR不需要有生命力的有机体。例如，已知处理是杀死有机体，药物治疗可能已经使生命力受到损害，结合有降低生命活力的低拷贝数可能都有助于前一类样品。不管系统参数如何，扩增相对于培养或涂片都应该具有相对优越的灵敏度。
在35例研究中，使用8个不同的方法处理原来的样本。7个研究通过用N-乙酰-L-半胱氨酸/NaOH(NALC)处理供培养和扩增的样品，6个研究使用十二烷基磺酸钠(SDS)，3个研究使用氢氧化钠(NaOH)，2个研究使用二硫苏糖醇(DTT)；草酸(OxAC)，聚乙二醇(PEG)和聚蔗糖-泛影钠制剂(Fic/Hyp)梯度方法各使用一次。一个研究实际上是比较了由NALC与SDS进行处理(Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.32：918-923(1994)。三个研究避免使用培养沉淀，直接处理供扩增的样品。在获得的100％相关性的9个研究中，3个使用NALC，3个直接处理供扩增的样品，一个研究使用SDS，一个研究使用草酸和一个研究使用PEG。记住这些研究中的7个利用的样品数量不到100(n＜100)，在原来的样品如何处理和理想的相关性之间得不出什么结论。Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.32：918-923(1994)的研究比较了NALC和SDS处理，结论是这两种方法都不优越。
供扩增的处理的沉淀的制备(或直接为样品)分为7个基本类型：(i)16例研究使用了Maniatis，T. et al(“Molecular Cloning ALaboratory Mannual，”Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1982)，pp458-463)描述的有机物抽提和酒精沉淀方法变化的方法；(ii)2个例子使用了Higuchi，R.Amplification 2：1-3(1989)描述的酶解和煮沸方案(Lz/Prk_95°/15′)，6个例子简单地煮沸样品；(iii)10个例子使用了声处理(声的)；(iv)3例使用Boom，R.et al.，J.Clin.Microbiol.28：495-503(1990)描述的离液序列高的试剂和玻璃珠，和2个使用了把DNA结合于硅上的类似的方案；(v)一例使用了蔗糖梯度分级分离(Victor，T.et al.，J.Clin.Micro.30：1514-1517(1992)；(vi)一例使用了de Lamballerie，X.et al.，Res.Microbiol.143：785-790(1992)描述的Chelex-100；和(vii)一例(Van der Giessen，J.W.B.et al.，J.Clin.Microbiol.30：1216-1219(1992))使用了制造商(Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.28：933-937(1990))建议的柱层析方法。总数多于35个是因为Van der Giessen，J.W.B. et al.，J. Clin. Microbiol.30：1216-1219(1992)，Victor，T. et al.，J. Clin. Micro.30：1514-1517(1992)，Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.31：776-782(1993)和Abe，C.et al.，J.Clin.Micro.31：3270-3274(1993)，Miller etal.，J. Clin. Micro.32：393-397(1994)和Pfyffer et al.，J.Clin.Micro.32：918-923(1994)的研究用不止一个方案处理所有样品，并对每种方法进行了分析。声称100％相关性的9个研究中的8个通过有机物抽提/乙醇沉淀方法来分离DNA。然而，也利用有机抽提方法的8个研究相关性的变化为55.9％到98.4％。声称100％相关性的一例研究是通过煮沸法进行处理(Kocag_z，T.et al.，J.Clin.Micro.31：1435-1438(1993))。此外，利用同一方案的6个研究报道的相关性在78.9％和95.9％之间。7个研究实际上是比较了制备供扩增的培养物沉淀的方法。他们的结论有如下不同：Pierre，C.et al.，J.Clin.Micro.29：712-717(1991)选择有机物抽提/乙醇沉淀；Wilson，S.M.et al.，J.Clin.Micro.31：776-782(1993)简单地用氯仿处理；Folgueria，L.et al.，J.Clin.Micro.31：1019-1021(1993)优选酶裂解/煮沸法；Kocag_z，T.et al.，J.Clin.Micro.31：1435-1438(1993)和Sritharan，V.et al..Mol.Cell.Probes 5：385-395(1991)选择简单的煮沸方法；Forbes，B.A.et al.，J.Clin.Micro.31：1688-1694(1993)和Buck，G.E.et al.，J.Clin.Micro.30：1331-1334(1992)确定声处理为最适方法(只有Kocag_z，T.et al.，J.Glin.Micro.31：1435-1438(1993)的研究达到100％相关性)。看来假阴性的发生不仅不依赖于用来制备扩增样品的方案，而且围绕这一问题也有争议。
两个研究实际上比较了扩增方法：Abe，C.et al.，J.Clin.Mi-cro.31：3270-3274(1993)表明Gen-Probe方法只是勉强地比PCR要好(见表1中脚注κ)，而Miller et al.，J.Clin.Micro.32：393-397(1994)测定的结果却相反(见表1中脚注μ)。显然，两种扩增技术对TB感染的临床诊断并没有赋予显著优点。E.PCR抑制剂
在报道相关性低于100％的文献中，17例研究把扩增“抑制剂”认为是假阴性的起作用的因子(见表1中带有“_”上标的那些作者)。血(Panaccio，M.et al.，Nucl，Acids Res.19：1151(1991)，粪(Allad，A.et al.，J.Clin.Microbiol.28：2659-2667(1990))，痰(Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.28：1204-1213(1990)；Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.31：61-65(1993))和尿(Khan，G.et al.，J.Clin.Pathol.44：360-365(1991))都含有PCR抑制剂。此外，就痰，支气管洗液和气管呼气。这些样品的粘度(粘液含量)与疾病状态之间有直接的关系：结核早期病人有最多的粘痰，这些样品带有扩增抑制剂的可能性最大。Hermans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.28：1204-1213(1990)和Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.31：61-65(1993))指出在有痰存在时，灵敏度分别下降5-20倍和5倍。
在表1中陈述的供处理的42种方法中，只有12个不体现某种形式的缓冲液的相互交换。例如，有机物抽提/沉淀，沉淀带的洗涤或使用离液序列高的试剂(GUSCN/Si)的方案在某些时候都需要缓冲液的相互交换。然而，沉淀的声处理却不需要交换缓冲液。这十二个研究中，没有一个可以获得100％的相关性，在这一组中的九个把抑制剂认为是假阴性的作用因子。抑制剂似乎来源于样品和用于处理的溶液，这两种来源对临床扩增技术的实施提出了明显挑战。F.低拷贝数，统计漏失和“不能解释的”结果
统计漏失，也称为“样品偏斜”，是由于低拷贝数引起的；在一个具有极低拷贝数的样品中，从中取出一些等份，存在着某些等份不含靶标的可能性。这些等份，当被解释为假阴性时，是“真正的扩增阴性”。表1中的8个研究描述了一种可由这类样品偏斜解释的现象(见表1中带有§下标的那些作者的名字)。正如下面讨论的，聚集作用会大大加剧这种现象。
在报道的相关性不到100％的文献中，15个是把“低拷贝数”直接地认为假阴性结果的决定因子(见表1中带有下标_的那些作者)。15个中的6个，加上3个其他的，给出的一些例子中，其阴性扩增样品为培养阳性和涂片阳性(见表1中带有下标ψ的那些作者的名字)。据报道，酸快速染色的检测限为每毫升痰中有7,800至9,500个有机体(Hobby，G.L.et al.，Antimicrob.Ag.Chemother.4：94-104(1973)；Yeager，H.et al.，Amer.Rev.Resp.Dis.95：998-1004(1967))。Clarridge，J.E.et al.，J.Clin.Micro.31：2049-2056(1993)对假阴性作了广泛的分析(见这篇文献的表7)。在详细分析的37个假阴性样品中，26个显示出漏失，而11个为“真正的”PCR阴性。这些37个中的9个为涂片阳性：这些9个中的4个含有抑制剂，3个没有作抑制剂检验，2个发现没有抑制剂。在这最后2个样品中，一个是真正的PCR阴性。Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.31：61-65(1993)也报道培养阳性-涂片阳性-PCR阴性样品没有发现抑制剂。如果样品不含抑制剂，且为涂片/，培养阳性，“低拷贝数”不可能是实际的可能性。Shawar，R.M.etal.，J.Clin.Micro.31：61-65(1993)把这类假阴性称为“不能解释的”。G.离心期间分枝杆菌的分层
分枝杆菌的浮力性质早在1924年就已明确(Andrus，P.M.etal.，Am. Rev.Tuberc.3：99(1924))。从此之后，几例研究着重解决沉淀分枝杆菌的困难(Hanks，J.H.et al.，J.Lab.Clin.Med.23：736-746(1938)；Hata，Jr；D.et al.，Dis.Chest 18：352-362(1950)；Klein，G.C.et al.，Am. J. Clin. Pathol. 22：581-585(1952)；Ratman，S.et al.，J. Clin.Microbiol.23：582-585(1986)；Rickman，T.W.et al.，J.Clin.Microbiol.11：618-620(1980)；和Robinson，L.et al.，J.Lab.Clin.Med.27：84-91(1941)。在几种情况下，培养上清液被认为是标准的实施方法。
虽然几个研究报道了上清液部分含有涂片阳性物质(HanRs，J.H.et al.，J.Lab.Clin. Med.23：736-746(1938)；Rickman，T.W.et al.，J.Clin.Microbiol.11：618-620(1980)，另一个研究指出，所有样本的88.8％和82.4％分别在2000rpm和3000rpm下离心，上清液为培养阳性(Klein，G.C.et al.，Am.J.Clin. Pathol.22：581-585(1952))。事实上，同一研究指出，分别在2,000rpm和3,000rpm下离心的所有样本的2.2％和2.7％中，沉淀为培养阴性而上清液为培养阳性。在当代实验室手册中，还讨论了对上清液部分的分析(Kent，P.T.et al.，“Public Health Mycobacteriology”in AGuide for the level III Laboratory，U.S.Department of Health andHuman Service，Centers for Disease Control，(1985)pp.31-46；Sommers，H.M.et al.，“Mycobacterium，”in：Manual of ClinicalMicrobiology，E.H.Lennetteet al.，eds.，4th ed.，Am.Soc.Mi-crobiol.，Washington，D.C.(1985)，pp.216--248)。
样品数量和相关性之间相反的关系可由浮力现象有效地解释。大量的样品需要成批处理。在成批处理过程中，最早和最后样本检查之间花费的时间要增加。随着这一时间的增加，浮力有大量的时间发生作用。有人认为这种浮力来源是这些有机体的高类脂含量(Silverstolpe，L.Nord.Med 40/48：2220--2222(1948))。H.细胞壁和表面张力对分枝杆菌回收的影响
分枝杆菌细胞壁的性质决定了其生存顽固性。显微照片显示出非常复杂的30-40nm厚的结构(Rastogi，N.et al.，Antimicrob.Agents Chemother.20：666-667(1981))。多达细胞壁干重60％的为类脂(Joklik，W.K.et al.，Zinsser Microbiology 20th edition，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1992)，pp.499)。
分枝杆菌的细胞壁有三个不同的层次：(i)肽葡聚糖，(ii)阿拉伯半乳聚糖，和(iii)糖脂(细胞壁的综述见McNeil，M.R.et al.，Res.Microbiol.142：451-463(1991)。霉菌酸，具有高度的疏水性，主要由碳氢链组成(∑＝C76-C80)，广泛地用于阿拉伯半乳聚糖和糖脂层的构建。在Takayama，K.et al.，“Structure and Synthesis ofLipids，”in：The Mycobacteria：a Source Book，Part A，G.P.Kubicaet al.，eds.，Marcel Dekrer，Inc.New York，NY(1984)，pp.315-344。中评述了霉菌酸的结构和种类分布。
结核分枝杆菌在生长过程中形成“索状”(索状为大量有机体的凝块或聚集物)，在MTB毒性和索状形成体之间存在着直接的关系(Joklik，W.K.et al.，Zinsser Microbiology 20th ed.，Apple ton &Lange，Norwalk，CT(1992)，pp.503)。MAC复合有机体在其细胞壁中具有另外的糖脂(C-mycoside)(Brennan，P.J.Rev.Infect.Dis.11(Supp.2)：s420-s430(1989)中总结了serovars之间的区别)。在培养物中，虽然MTB复合有机体看来可以形成致密的凝块，鸟分枝杆菌却以一种更弥漫的，单个细胞方式生长(Dubos，R.J.et al.，J.Exp.Med.83：409-423(1946))。
Dubos，R.J.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.58：361-362(1945)观察发现，通过加入山梨聚糖单硬脂酸的聚氧亚烷基衍生物(Tween60：CAS_No.9005-67-8)可以改善培养的MTB的标志菌膜生长。这一观察后来被扩展到用来说明其他的类似的衍生物可以使MTB表现为“迅速”、“弥散”和“浸没的”生长特征(Dubos，R.J.etal.，J.Exp.Med.83：409-423(1946))。吐温-80(CAS_No.9005-65-6)被发现在这方面是最有活性的。这些作者认为浸没的生长是由于细胞表面的“可湿性”。术语“可湿性”在上下文中只使用于表面张力上。这些研究的结论是菌膜生长导致了蜡层和水相之间的表面张力以及加入吐温80可减轻这种物理相互作用。
如果表面张力把有机体局限于表面，这与形成菌索结合起来可以解释异常结果：病情很重的病人被具有菌索形成性质的有机体感染。此外，大菌索产生涂片阳性结果，培养物也很快变为阳性。大菌索也将加剧样品偏离因为大菌索以单一拷贝分布，但具有成千上万拷贝的潜力。结果，正如Klein，G.C.et al.，Am.J.C1in.Pathol.22：581-585(1952)所认为的，微生物将很容易地在上清液部分涌出，从而加快了样品偏离现象。此外，菌索化也将使细菌产生分层，以致出现涂片/培养阳性和扩增阴性结果。
如果异常的结果是表面张力和凝聚引起的，那么通过加入非离子去垢剂就可以克服表面张力和凝集作用，这些试剂应改进培养相关性似乎是合乎逻辑的：表1中的5个研究使用非离子去垢剂，在扩增之前洗涤沉淀(Clarridge，J.E.et al.，J.Clin.Micro.31：2049-2056(1993)；Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.31：1811-1814(1993)；Kolk，A.H.J.et al.，J.Clin. Micro.30：2567-2575(1992)，Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.31：61-65(1993)；and Sritharan，V. et al.，Mol.Cell.Probes 5：385-395(1991))。在这一子集中，与培养的相关性范围为78.9％至95.5％。早在1941年，人们即认识到，降低表面张力的因子在通过离心以增加细菌的回收上是无效的(Robinson，L.et al.，J.Lab.Clin.Med.27：84-91(1941)。I.MAC复合有机体独有的问题
在表1的35例研究中，27个使用了MTB扩增和/或检测的特异序列。6个研究使用了属特定引物，但是设计却优选扩增TB复合有机体。只有Irula，J.V.et al.，J.Clin.Micro.31：1811-1814(1993)的研究针对鸟分枝杆菌，只有Van der Giessen，J.W.B.，J.Clin.Microbiol.30：1216-1219(1992)针对副结核分枝杆菌。Irula使用了一种不同的分离技术，使比较很困难。然而，虽然分离出了PBMC，但事实上它们在Tris/EDTA/Triton X-100中要经历一个洗涤步骤：如果在洗涤过程中PBMC具有溶解作用，细菌将与上清液一起可能被弃掉。无论如何，可能预期PBMC分离是一种特别有效的捕获有机体的方法。Van der Giessen的研究比较了三个PCR基本系统(McFadden，J.J.et al.，Mol.Microbiol.1：283-291(1987)；Van der Giessen，J.W.B et al.，J.Med. Microbiol.36：255-263(1992)；Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.28：(1990)，这些系统设计用来检测牛粪中的副结核分枝杆菌(其中之一是IDEXX已商业化的可用的试剂盒(Vary，P.H.et al.，J.Clin.Microbiol.28：933-937(1990))。他们的结果比表1中描述的任何其他的东西要更糟，并且似乎显得是假性降低。这些结果指那些MAC复合有机体，其多余的类脂成分给扩增处理提出一个更加不明确的复杂问题。J.分枝杆菌的内在特性阻碍了扩增技术的开发
显然，有两种主要的假阴性来源。首先，在多种多样的样品类型中有丰富的抑制剂，制备的溶液在改进扩增反应的效率方面也起一定作用。第二类是由于分枝杆菌的内在特性。尽管这些特征的来源似乎很明显，但这些特异反应性对灵敏度的影响是如此的普遍，以致Noordhoek et al.，J.Clin.Micro.32：277-284(1994)认为：“我们将不能推测解释七个实验室中PCR灵敏度的极端差异的可能因素……”
这些有机体的菌索化和浮力性质使它们以一种无效的方式分层，且随上清液一起被倾去。该情形的一个极端的例子造成“不能解释的”结果：培养阳性和涂片阳性的样品面对多次扩增似乎为真正的阴性，但不含抑制剂。显然，这些特征的来源和性质尚待充分的解释。然而，以这些有机体的内在特征为基础的这些现象正是本文描述的方法所解决的问题。
发明概要
认识到目前用于后续分析和培养的分枝杆菌制备方法中的问题，并认识到需要一种快速、便宜但准确的方法用来准备检测分枝杆菌用的生物和非生物的样品，本发明发明人研究了制备这些分枝杆菌样品的提取方法。
这些研究在分枝杆菌的检测的处理方法方面达到了顶点，包括经培养检测，特别是经例如扩增，尤其是核酸扩增方法检测，首次有效克服了本领域认识到的产生假阴性和统计漏失的问题。本发明发明人发现本文称为“类SB-18去垢剂”的两性离子去垢剂令人惊奇和出人意料地分散分枝杆菌。所有类SB-18去垢剂明显破坏这些有机体的浮力性质。对于MTB复合体中的分枝杆菌，其聚集作用强，分散似乎成为提高回收效率主要的动力。对于其它以单个细胞生长的分枝杆菌，例如MAC复合体，提高回收的动力似乎是通过去垢剂的积聚抵消浮力。对于那些既非MTB复合体又非MAC复合体的分枝杆菌，在样品制备方案中，包含这些去垢剂可消除本领域类似的导致假阴性扩增的问题。
发明人还发现，当给分枝杆菌除气时，原先无补偿浮力能力的另外的去垢剂同样可改善回收。推测，除气消除浮力，使表面张力成为限制有机体在培养基表面的唯一剩余因素。若给出适当条件，绝大部分去垢剂具有克服表面张力的能力。尽管这些去垢剂不能消除MTB复合体中的聚集，因而不能消除样品偏差的现象，但是它们确实能通过离心提高收集效率。发明人指出，对于MAC复合有机体和其它主要以单个细胞生长的分枝杆菌，有一种特殊类型的去垢剂与限制除气相结合，可有效地提高回收效率。
本发明的方法一般适用于任何微生物，特别是在其细胞壁中含有分枝菌酸或类分枝菌酸脂类的那些微生物，如包括棒状杆菌(具有含棒状杆菌酸的脂)和诺卡氏菌(具有含诺卡氏菌酸的酯)。本发明的方法也普遍适用于供任何微生物检测的生物样品的处理。
附图简要说明
图1是点杂交(印迹)实验，表明NALC/NaOH样品提取液对PCR的抑制作用。
图2是描述“处理试验”的一个草图：设计用来模拟处理临床样品中分枝杆菌的体外方案。
图2A是点杂交结果，表明当用水为提取液时，如图2所示的体外处理过程中结核分枝杆菌的回收效率。
图3表示向提取液中加入0.1％TritonX-100的效果。
图4是描述“聚集试验”的草图：设计用来估测去垢剂分散结核分枝杆菌能力的方案。
图4A表示试图分散分枝杆菌的点杂交结果。显示了三种有代表性条件下的数据：水、0.1％吐温80和2mM的SB-18。
图5表示在提取液中包含2mM的SB-18时体外处理鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌的效果。
图6表示提取液中用不同的SB-18的离子同系物体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图7表示在提取液中用不同的SB-18系列去垢剂时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图7A表示在提取液中用不同的SB-18系列去垢剂时体外处理鸟分枝杆菌的点杂交结果。
图8表示在提取液中用椰子树羧基甜菜碱(例如，类SB-18去垢剂)体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9表示当提取液中用含有各种电荷组合和结构关系的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9A表示当提取液中用有各种“桥”结构的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9B表示当提取液中用有各种烷基和烷基“连接键”结构的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9C表示当提取液中用具有完全来源于天然油的疏水结构域的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图9D表示当提取液中用具有完全来源于天然油的疏水结构域的甜菜碱时体外处理结核分枝杆菌的点杂交结果。
图10表示可预测的对测定条件的修改可使遭到破坏(compro-mised)或无功能的甜菜碱在体外处理结核分枝杆菌中起作用。
图11是用以研究真空压力在体外处理中作用的实验方案草图。
图11A表示真空压力对体外处理结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的作用。
图12表示在体外处理过程中为使Triton X-100提高回收效率需延长结核分枝杆菌的除气。
图13表示Brij 96，一种SB-18和吐温80的近似十八烷基的非离子结构同系物表现出的类SB-18活性。
图14表示鸟分枝杆菌有限的真空除气揭示了近似十八烷基去垢剂在通过离心改善回收方面有一定程度的功效。
图15描述了用于这些实验中的真空除气装置的设计。
图16是设计用来比较图11所示的SB-18处理方法和NALC/NaOH处理方法的实验方案草图。
图16A提供了按图16的方案时结核分枝杆菌的生长曲线。
图16B提供了图16的样品进行PCR时的扩增结果。
优选实施方案的详细描述
本发明提供了一种制备供微生物检测或培养用的样本的方法。这些微生物具有漂浮(有“浮力”)在液体培养基上，和/或在生长过程中形成菌索或成团的特征。
“样本”是指任何用于检测或培养微生物的材料，特别是分枝杆菌，包括，但不局限于生物样品和非生物样品。
“生物样品”是指取自动物(包括人)或植物的样品。特别重要的动物来源的生物样品包括那些来自反刍动物(如牛或羊类动物)或鱼及鸟类动物。术语生物样品拟包括来自加工或未加工的食品(例如包括蛋、奶酪，牛奶和其它畜牧产品)，植物或细胞培养来源(如单细胞或成纤维细胞培养物)的样品。
“非生物样品”指来自非生物(例如环境来源的土壤、水、锯末和空气)的样品。
“沉淀”指以浓缩分枝杆菌的方式经过处理和/或澄清，并由此可用作以后检测处理的样本。
“洗涤”指把所需要的样品与溶液相接触，所述溶液一般为含近似十八烷基或类SB-18去垢剂溶液。
“分枝菌酸结构”指β-羟基酸在α位被中等长度的α-链取代，这是本领域所熟悉的(Goren，M.B.Bact.Rev.36：33-64C1966本文一并参考)。
“类SB-18去垢剂”指能促进以定性方式物理收集具有分枝杆菌酸结构的微生物供后续检测用的甜菜碱。术语“类SB-18”与“类甜菜碱”同义。本发明中的类SB-18去垢剂能够分散分枝杆菌菌索(和团块)，并且/或者补偿分枝杆菌浮力。分散作用通过增加用于检测的等份中含有微生物的可能性使检测便利。分散菌索的类SB-18去垢剂的烷基链长度大于16个碳原子，18-20个碳原子是优选的。本发明的类SB-18去垢剂，通过在某种程度上补偿自然浮力，尤其是通过促进去垢剂向细胞中运动，也具有有利于分枝杆菌(如象以不成团结块方式生长的MAC有机体)收集的能力。补偿浮力的类SB-18去垢剂最好具有超过12个碳原子的烷基链，优选的是16-20个碳原子。
“类SB-18活性”指有利于破坏菌索(由此使微生物均匀分散到溶液中的能力)，或补偿浮力(从而实质上有利于此类微生物通过离心定量收集)的能力或这两种能力。例如，假若微生物在生长期间成团，例如MTB有机体，用类SB-18去垢剂处理通过补偿浮力和使有机体在整个处理溶液中更加均匀地分散便有利于检测。这种双重功能是去垢剂的“类SB-18活性”。具有这些特性的类SB-18去垢剂的例子包括任何本文描述的具有这些性质的甜菜碱。或者通过举例说明，或者与举例说明的甜菜碱结构相类比，包括具有表2和表3所示的和/或本文描述的结构的类CB、类SB、类HSB、类pB、类StB、类So、类Rev-B、类A、类cAB和类ImB去垢剂。
“除气”是指以一定的时间和温度将样品或沉淀置于真空下，以抵消含诸如分枝菌酸、诺卡氏菌酸或棒状菌酸的分枝杆菌酸结构的微生物的浮力。勿需下列解释的支持，相信除气去除了细胞壁中堵住的CO2，因此去除了这些有机体的某些自然浮力。在40℃-42℃下将样品置于600mmHg下60分钟为优选的，并且当用类SB-18去垢剂时有利于微生物收集；然而，相同温度和真空下延长除气时间将使任何去垢剂有利于检测。
因此，根据本发明的方法，浮力可用三种方式抵消：或在细胞内积聚去垢剂，或通过除气，或二者兼有。有些去垢剂，并非是甜菜碱，在除气存在不存在时均有利于检测。例如，非离子线性去垢剂如Brij96(多氧乙烯10油基醚(C18∶1E10)(CAS_No.9004-98-2)有类似甜菜碱的头部基团的直径。这些“类rod(rod-like)”去垢剂进入细胞空间不受阻(与吐温80相比)，因此能迅速封闭在细胞内，由此补偿浮力。因此，这里“类rod”去垢剂是指本发明的方法中，在不除气条件下，表现类SB-18活性的非离子去垢剂。其它非离子类rod去垢剂预期也将以此方式补偿浮力。其它去垢剂，如十八烷基的离子去垢剂、十八烷基三甲基铵溴化物(TMA-18：CAS_No.1120-02-1)或苄基二甲基十八烷基铵溴化物(BenzDMA-18)比它们的短链同系物更大程度地有利于检测，但只是在除气前提下。勿需下列解释的支持。相信一些去垢剂由于它们的“近似十八烷基”结构而易于在细胞内积聚。
这里用的“类rod”指具有类似的甜菜碱“轴比”的去垢剂分子，这里轴比的定义为：“主轴对次轴的比值…”(MeGraw-Hill Dictio-nary of Scientific and Technical Terms，5th ed.，Parker，S.P.ed.McGraw-Hill，Washington，D.C.(1994)，P.168)主轴指延伸的烷基链(如，疏水结构域：如表2中定义的R1)，次轴指头部基团直径。据定义，主轴与次轴互相垂直。
“近似十八烷基去垢剂”指具有一个类似于类SB-18十八烷基部分的类十八烷基部分，优选地为12-20个碳原子，最优选的为18-20个碳原子的去垢剂分子。其可用在本发明的方法中观察到类SB-18活性，但不需要两性离子功能起作用。它包括，但不限于，表现类SB-18活性的不需要除气的棒状去垢剂或需要除气的阳离子去垢剂。当用于MAC复合有机体时，本发明的方法中近似十八烷基去垢剂很有用；近似十八烷基去垢剂包括类SB-18去垢剂。并非所有近似十八烷基去垢剂都是类SB-18去垢剂，但所有类SB-18去垢剂都是近似十八烷基去垢剂。
“CAS_登记号”或“CAS_No.”指化学文摘社登记号，2540 Olen-tangy River Road，PO BOX 3012，Columbus，Qhio，本文涉及的所有CAS_登记号和结构式见表13。处理供检测的样本
正如这里和最优选方案中所例证的，微生物是分枝杆菌，如这里进一步例证的，本发明对用于后续检测的、外层细胞壁中含有分枝菌酸结构的、成团的微生物样品处理的方法通过分枝杆菌的MTB复合体的处理和检测来例证。如同这里进一步例证的，本发明对用于后续检测的、在外层的细胞壁中含有分枝菌酸和可漂浮的微生物样品的处理方法通过分枝杆菌的MAC复合体的检测来例证。虽然这里特别例证了分枝杆菌属成员，但要知道这里所讲的和本发明的方法对于任何在漂浮和/或成团和/或胞壁中有分枝菌酸结构方面有相似特征的有机体的样品的制备方面都有用。
根据本发明的第一实施方案，通过把样品或沉淀置于含缓冲的类SB-18去垢剂的培养基中，或在不除气时在具有类SB-18活性的近似十八烷基去垢剂(如类rod去垢剂)的培养基中对样品(或者，制备的样品沉淀)进行处理。在微生物不以成团形式生长(例如MAC有机体)的情况下，这一步通过一定程度上补偿自然浮力而有利于收集。在微生物成团生长(例如MTB有机体)情况下，这一步既通过补偿浮力，又通过使有机体更均匀地分散于处理液中而有利于收集。本发明方法的第一实施方案中，无除气步骤，用类SB-18去垢剂解聚成团微生物，尤其是分枝杆菌，特别是MTB复合体。
根据本发明的第二实施方案，通过把样品或沉淀进行除气步骤，例如暴露于真空，对样品(或制备的沉淀)进行处理。在本发明的第二实施方案中，分枝杆菌(如那些MAC复合体)，只是简单除气，然后测定。如下面进一步描述的，洗液成分可能是，但绝不限于，水或水相缓冲液。
根据本发明的第三实施方案，将样品(或制备的沉淀样品)进行除气步骤和含去垢剂洗涤步骤。在第三实施方案中，任何去垢剂，但特别是那些近似十八烷基去垢剂，最优的是类SB-18去垢剂，可以和真空步骤合用；另外，任何去垢剂，但特别是那些近似十八烷基去垢剂，最优的是类SB-18去垢剂，可用于首先的洗涤步骤，根据所需用途，随后或同时进行除气步骤。第三实施方案对于分枝杆菌种类未知样品，或怀疑至少含有一种MTB和MAC复合体的样品特别有用。
与样品或沉淀相接触的液体介质，如洗涤液，除了所需去垢剂外，如果需要可包含其它组分，例如二硫苏糖醇(DTT)和酶(如糖苷酶和DNA酶)，以帮助溶解特定生物物质(如痰)，或帮助去除样品中不理想的特征。DTT和酶(如糖苷酶与DNA酶)是减少生物液体粘度的有用因子。
如果需要，可进行多于一次的洗涤步骤，多步洗涤可以连续依次(一个接一个)或被其它操作步骤隔开。这种多步洗涤步骤可以包含其它试剂。到另外的处理步骤需要加入其它试剂例如进一步清除样品污染的试剂的程度时，可用这种步骤。这样的多步洗涤步骤可含有不同的去垢剂或含有相同的去垢剂。在同一洗涤步骤中联用不同的非类SB-18去垢剂普遍降低单个去垢剂的效力。然而，当达到这些去垢剂与类SB-18或与近似十八烷基去垢剂一定的组合在本发明方法中保持效力的程度时，这种结合可以应用。
在本发明的任一实施方案中，测定分枝杆菌存在用的样品可首先通过需要作为第一处理步骤的任何标准生物学步骤提取，例如，Kent(Kent，P.t.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guidefor the level III laboratory，U.S.Department of Healtn and HumanService，Centers for Disease Contral(1985)，pp.31-46)推荐的步骤之一，特别是实施例2，4和6所示的NALC/NaOH分离步骤。沉淀的一部分首先移出用于培养和涂片。剩余沉淀进一步处理，用任何用于随后检测的实施方案处理，所述实施方案是通过用扩增(核酸或信号)或免疫检测或任何能区分样品中目标分枝杆菌存在的方法检测。然而，正如下面和实施例中讨论的，现在本领域中所用标准技术的处理很可能使样品中的分枝杆菌收集和/或检测遭到破坏。特别当这些分枝杆菌数目低时。因此，应用本发明的方法本身即使在样品中分枝杆菌数目少时实质上也可以定量，当现行不能提供本发明的去垢剂和除气的方案联用时，可能早已使分枝杆菌的回收遭到破坏。也可能以避免低效率回收的方式修改Kent P，t.et al〔上述〕的现行方案，例如通过用合适的试剂中和氢氧化钠或草酸，或Kent P.t.et al〔上述〕描述的任何去垢剂，然后在离心前加入类SB-18或近似十八烷基去垢剂处理；或通过加入适当缓冲的类SB-18或近似十八烷基去垢剂以作为离心前按本发明的方法进一步处理的中和缓中液起作用；或通过离心前对中和的样品简单除气。这些经过修改的方案使得仍然使用现行方法时，类SB-18活性和/或除气提高通过离心的收集效率。
因此，在实施例13例证的高度优选的实施方案中，将一个欲测定分枝杆菌存在的样品用于本发明的方法中，对分枝杆菌直接分离以直接扩增和/培养检测，而不经任何标准的初步方案处理。更确切地说，样品或直接使用，或澄清或者(如必要的话)用本领域中已知的常规分离技术(如离心，过滤，凝胶排阻层析或离子交换层析)纯化固体物和/或抑制剂。如本文所描述的，将样品直接用类SB-18去垢剂洗涤、真空处理来去除浮力或两者兼用。处理细胞能得到有效的收集，沉淀用于所需微生物的检测。
在上面描述的第一实施方案中，将所需量的沉淀或样品在一足够大的容器中处理，容器中内盛含类SB-18去垢剂的洗液，在一定的温度下以足以分枝杆菌均一分布于整个溶液和补偿浮力的搅拌水平处理一段时间。例如，可通过涡旋振荡或一般地使盛有样品的容器保持运动来实现这种搅拌，以重新悬浮沉淀(或悬浮样本)以使去垢剂在下一步处理前有效地破坏微生物并分散为液体。稍微提高温度，例如37℃，有利于解聚而不损害随后的检测方法，且可能是防止类SB-18去垢剂沉淀必要的。微生物分散均匀后，特别是分枝杆菌分散后，可用本领域中已知的技术进行大量收集。(如离心)，检测或进行如下所述的其它测定和分析。
在第二实施方案中，样品或剩余沉淀简单地用水或其他所需介质重新悬浮，不一定需要含去垢剂的介质，并在所需压力和温度下除气一段时间以充分去除溶液中微生物特别是MAC复合有机体的自然浮力倾向。然后按如下所述，收集并检测微生物。
在以上描述的第三实施方案中，除了除气前，除气中或除气后，介质中可用任何去垢剂(尤其是近似十八烷基去垢剂，更特别的是类SB-18去垢剂)来获得分散效果以及补偿浮力外，基本上前两个实施方案结合。除气步骤可在去垢剂洗涤步骤之前，之后，或与去垢剂步骤与除气步骤同时进行。本领域的技术人员应该知道，在目前的技术状况下，同时对样品除气和洗涤具有极大的安全危险性。
第三个实施方案是实施例10的进一步描述。如实施例10所示，当真空处理和去垢剂结合使用时，可用近似十八烷基去垢剂，类SB-18为优选的，SB-18为最优。如实施例10进一步所示，在样品广泛地除气去除大部分自然浮力的条件下，可用任何去垢剂。在此方案中，样品需要或不需澄清或纯化；这些步骤在理想真空-去垢剂处理步骤之前，或在其间或之后进行。如上所述，随后可收集、检测微生物。
因此，为定量回收分枝杆菌，标准样品处理方法(如Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide for the Level IIILaboratory，U.S. Department of Health and Human Service，Centersfor Disease control(1985)pp.31-46.中描述的N-乙酰-L-半胱氨酸/NaOH(NALC)方法)被首先放弃，或按以上的描述进行修改，样本或经去污处理的样品直接(i)用类SB-18去垢剂，优选SB-18洗涤(ii)简单除气，或(iii)根据所要检测的分枝杆菌，结合去垢剂洗涤与真空进行处理。
然而，若想从包括诸如痰，脑脊液和尿等生物液体运用本发明的方法，样品可经第一步处理提供沉淀。例如可用(Kent，P.I.etal.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide for the level III labo-ratory，U.S.Department of Healtn and Human Service，Centers forDisease Contral(1985).pp.31-46本文一并参考)中所述任何方法首先处理，如实施例12中详细阐明的以及下面和以上所述的，其中包括N-乙酰-L-半胱氨酸/NaOH(NALC)步骤。
通过混合液体(如水或其他含所需类SB-18去垢剂的缓冲液)，于允许剧裂振荡(如涡旋振荡)的足够大的容器中进行第二次清洗，如有必要，可用本领域中已熟知的方法(如凝胶层析，离子交换层析或过滤的方法)在第二次洗涤之前、洗涤期间或洗涤之后对沉淀进一步纯化。通过此处理获得的细菌沉淀可用作检测(包括培养检测)分枝杆菌的来源。
在一个优选的实施方案中，样品用包含所需去垢剂(如实施例13和下面例证的SB-18)的溶液，于允许剧裂振荡(如涡旋振荡)的足够大的容器中直接处理，若有必要，用本领域中已知的方法(如凝胶层析，离子交换层析或过滤方法)在直接处理之前，之中或之后对样品进一步纯化。通过此最初处理获得的细菌沉淀可用作检测(包括培养检测)分枝杆菌的来源。
如果掺合适合的去垢剂，(若有必要，向培养基中加入诸如类SB-18或近似十八烷基去垢剂的合适去垢剂)，在处理过程中的适当步骤可包括本领域已知的另外的初次或二次澄清或纯化步骤。正如以上述进一步指出的，当置于去垢剂中和使用除气时，也就是说，当在除气之前，同时或随后置于本文所述的适当去垢剂中时，不必只使用类SB-18去垢剂，可以使用任何去垢剂(特别是那些本文定义和例证的近似十八烷基去垢剂)。
当然，如果样品首先用标准方法(如NALC/NaOH方法)处理(例如实施例12中所示的)，然后(i)用类SB-18去垢剂(SB-18优选)洗涤，(ii)简单除气，或(iii)结合去垢剂洗涤和真空处理以去除浮力，则剩余有机体的回收将提高，由任一标准方法处理引起的损失将可能已经使样品遭到破坏，在这一范围而言，就不必定量了。
在本文描述的任何一种结合使用中，包括本发明方法与标准NALC/NaOH方法的结合，可更有效地收集处理细胞，沉淀即可用于检测其中的目标微生物。
运用本发明可以从样品中以实际上消除因成团或浮力造成的假阴性的方式定量提取分枝杆菌，本发明的方法给出基于检测方法的可靠的结果(如核酸扩增的结果)，并以允许用培养或通过其他方法(如煮沸)的方式裂解这种分枝杆菌的方式提供分枝杆菌。
本发明的方法对任何宿主样本中分枝杆菌的检测均有用。除人外，已知道的其它易感染分枝杆菌的动物例子包括牛、猪、禽、绵羊、山羊、鹿、猴、象、马、狗、猫、貂和各种动物园和水族馆的动物。本发明的方法所用的组织样品一般从肉芽肿瘤灶取样，此病灶多结状，有一纤维囊膜包围的干酪钙化中心。若无大的病灶，优先分析淋巴结。若感染在小肠，肠道变厚部分一般用作样品。
样品可以是生物体液形式，包括例如痰、脑脊液、尿、支气管洗液、胸膜液、胃抽出物、血液、血浆、腹膜液、脓肿和渗出液或其他生物性液体，也可从公共或私人培养收集物及类似场所取得，或特别是从临床或兽医来源取得。可利用液体培养、冷冻悬浮或固体培养基上生长的菌落。一些样品可能是半固体材料和/或需要澄清，例如粪便和全血或培养血。本发明的方法对于外源样本(如鱼或爬行类的鳞)和组织样品均有用。不必从培养物抽提样品，事实上通过核酸或信号扩增对期望的微生物进行直接检测正是本发明的优点。这里要指出的是，本发明的方法处理后分枝杆菌仍可存活(如没有裂解)，因此需要时可进行培养。例如，可首先用本发明的方法处理所有的样品，以提供用于扩增技术检测微生物的最大回收效率，并尽可能在最短时间内作出有关诊断的结论。然后可将阳性样品进一步作培养处理。这一方案显著地减少了诊断时间和提供了适合于培养的存在于样本中的微生物(尤其是分枝杆菌属微生物)。MTB株系中对药物抗性增加的发生率使所有MTB阳性样品对药物敏感性的培养成为必需。因为以一种有生存力的方式有效地回收分枝杆菌是最理想的，本发明的方法有利于诊断和敏感程度的测定。
本发明的方法首次本质上消除了因微生物(如MTB复合体的分枝杆菌)成团引起的假阴性。成团实际上加剧了样品处理过程中成团微生物低效率的分层。事实上，本发明的方法有利于成团微生物均质地分布于所需溶液中，从而通过增加某给定样品的所有等份包含有机体的可能性、促进用本领域中熟知的检测技术(如培养和核酸(DNA或RNA)扩增)进行检测。
此外，本发明的方法克服了水相液体中这些有机体的自然浮力，从而使利用本领域已知的收集技术(如离心)收集这些有机体很便利。自然浮力实际上减少了通过离心有效地收集这些微生物的能力。
因为本发明的方法实质上提高了从样本中回收这些微生物的效率，所以在更先进的方法可以代替诊断的范围内，排除了对长期培养结果的需要；核酸基本扩增技术是这种先进方法的一个例子。然而，本发明的方法不裂解微生物，相反可得到有生存力的有机体，以致不妨碍作为一种检测方法的培养技术。
对本发明的方法以制备检测微生物(如分枝杆菌)存在的样品的方式进行了说明。因此，最终检测的微生物将依赖于本本发明方法结合使用的检测方法。这种检测方法可被设计来检测任何目标微生物，尤其是任何目标分枝杆菌属细菌群体或复合体或分枝杆菌种，最优选的是分枝杆菌复合体，如结核分枝杆菌(MTB)复合体，鸟分枝杆菌(MAC)复合体，MAIS复合体或偶发分枝杆菌复合体，以及生长较快和生长较慢的分枝杆菌，包括特定的和非特定的光产色菌、非光产色菌、暗产色菌，尤其是非洲分枝杆菌、M.asiatieum、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、丁酸分枝杆菌、龟分枝杆菌、M.duvalii、淡黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌、M.haemophilum，胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、鼠麻疯分枝杆菌、M.linda，M.lufu、海分枝杆菌、M.Mal-moense、田鼠分枝杆菌、粘液分枝杆菌、无色分枝杆菌、副结核分枝杆菌、M.peregrinum、草分枝杆菌、红皮分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、M.shimoidei、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、M.szulgai、土分枝杆菌、M.thermoresistable、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、M.vaccae、蟾分枝杆菌，以及它们的血清变型。
堪萨斯氏分枝杆菌，海分枝杆菌、猿分枝杆菌和M.asiaticum为光产色菌的例子，瘰疬分枝杆菌、M.szulgai、蟾分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌和淡黄分枝杆菌为暗产色菌的例子。鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、胃分枝杆菌、M.malmoense，土分枝杆菌和次要分枝杆菌都是非光产色菌的例子。
非洲分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、M.haemophilum、胞内分枝杆菌，堪萨斯氏分枝杆菌、M.malmoense、海分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、副结核分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、M.szulgai、结核分枝杆菌和蟾分枝杆菌都是生长较慢的分枝杆菌种的例子(需7天以上)。龟分枝杆菌、淡黄色分枝杆菌、偶发分枝杆菌、金黄色分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、溃疡分枝杆菌是生长较快的分枝杆菌种的例子。
结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)和田鼠分枝杆菌为MTB复合体的成员，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌为MAC复合体的成员；至少有3种不同的鸟分枝杆菌血清组，并至少有25个血清变型的胞内分枝杆菌。
本发明尤其适用于亲脂的，或具有似蜡荚膜的微生物，该荚膜的特征是在其外层细胞壁中具有象分枝菌酸分子的脂类(如，象棒状杆菌酸，诺卡氏分枝杆菌酸及分枝菌酸。这些都以“分枝菌酸结构”为特征，即，α-位的β-羟酸由一个中等长度的α链替代，如本领域所理解的(Goren，M.B.Bact.Rev.36：33-64(1966)，本文一并参考)。具有棒状菌酸的有机体的一个例子是白喉棒状杆菌；其有诺卡氏菌酸的有机体的一个例子是星状诺卡氏菌，具有分枝菌酸的有机体的一个例子是结核分枝杆菌，这些类似分枝菌酸的分子本文统称为“分枝菌酸组分”如在Lederer，E.Chem.Phys.Lipids 1：294-315(1967)，Lederer，E.Pure Appl.Chem.25：135-165(1971)(本文在此一并参考)也可发现表列的有代表性的分枝菌酸结构(包括某些不饱和的，环丙烷的，甲氧基化的和酮酸)“分枝菌酸结构”是酸一稳定性分子。
疾病和病态检测中具有突出重要性的各种分枝杆菌种类的例子尤其包括结核(结核分枝杆菌复合体)、麻疯(麻疯分枝杆菌(人的麻疯病)和鼠麻疯分枝杆菌(鼠的麻疯病))的致病因子。鸟分枝杆菌复合体为一种重要的鸟类疾病。鸟分枝杆菌也从患分枝杆菌再感染的艾滋病病人中分离出。牛分枝杆菌在兽医方面具有重要性。偶发分枝杆菌为一种从动物和人体的损伤处分离的土壤细菌。胞间分枝杆菌为“机会主义者”，尤其是在感染了艾滋病病毒的病人中可以观察到。副结核分枝杆菌在人的Crohn’s疾病(局部回肠炎)的诊断方面具有重要性，堪萨斯氏分枝杆菌为一种罕见但却具有毁灭性的因子，一般与肺病有关。海分枝杆菌侵染冷血动物和鱼类；它也从人体四肢的表面肉芽瘤上分离到。副结核分枝杆菌是牛的Johne’疾病的致病因子；它生长非常缓慢，必须培养16周才能保证它们是阴性的。溃疡分枝杆菌在人体医学上也具重要性。Wayne，L.G.et al.，Clin.Micro.Rev.5：1-25(1992)讨论许多上述及其他的分枝杆菌，本文一并参考。
检测步骤可利用任何已知的方法检测目标微生物，尤其是目标分枝杆菌，这些检测方法包括，但不局限于，核酸扩增，信号扩增，杂交，培养和免疫试验。在优选实施方案中，检测方法为核酸扩增和/或培养。在最优选的实施方案中，使用聚合酶链反应(PCR)扩增。事实上，类SB-18去垢剂对PCR没有抑制作用以及有机体还有生存活力和可以被培养正是本发明方法的优点。与标准技术相比，NALC/NaOH溶液对PCR具有极大的抑制作用。此外，也充分确认的是，虽然在用NALc/NaOH处理后，有机体还有生活力，但已经知道有28％-33％的分枝杆菌被杀死(Krasnow，I.et al.，Am.J.Clin.Path.45：352-355(1966)；Kubica，G.P.W.et al.，AM.Rev.Resir.Dis.87：775-779(1963)，相比之下，虽然类SB-18的去垢剂可能具有杀菌作用以及某种程度的制菌活性，但当本发明的方法在理想浓度下使用时，分枝杆菌可以不被裂解，且还具有生命力。
鉴定分枝杆菌存在的方法可使用标记方法，如那些常用于核酸检测和/或分枝杆菌细胞抗原的免疫检测的标记方法，包括但不局限于放射性标记(例如，32p、33p、35S，14C和3H)、荧光标记(例如，荧光素，金胺，rhodamin，得克萨斯红，等等)、化学发光标记(例如，acri-dinium酯标记的探针，LUMI-PhOS 530TM，Schaap试剂(4-甲氧基-4-3-(磷酸苯甲)-spirol-〔1，2-dioxetane-3，2′-金刚烷〕，CSPD_(U.S.5,112,960)等等)、比色检测(例如，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，等等)、电发光(例如三羟甲基氨基甲烷(2，2′-二吡啶)钌(II)螯合物(TBR)和蛋白质或酶标记(例如，抗体，碱性磷酸酯酶，辣根过氧化物酶，等)，它们都可以与以上任一试剂类型结合使用。
通过以试剂盒形式提供本发明的方法中使用的试剂可极为方便地使用本发明的方法。这种试剂盒优选地包含合适的缓冲液、盐、类SB-18去垢剂(或其相等物，如与除气结合使用的去垢剂)，如果需要的，还包含适当纯度的水。也可以包括至少一种鉴定试剂，该鉴定试剂的种类依赖于使用的检测试验类型(例如，是否最终使用扩增，免疫检测，等等)；和提供用于微生物检测的核酸(DNA或RNA)的阳性标准，或所需的特定的抗原(蛋白质或其它)或其他的特征物质(如供鉴定微生物脂类的一些组分，尤其是通过气-液相色谱进行鉴定)。特定的试剂盒包括特殊的分枝杆菌鉴定用品，如特殊的核酸探针，抗体或涂片或培养材料。通过检测鉴定试剂的用品可以是试剂盒特异性的，以便试剂盒提供如酶，荧光，放射性或化学发光检测，或任何本领域已熟悉的其他合适的检测方法。在这种试剂盒中，该检测用品一般与去垢剂试剂极为相近，即使分装于不同的容器或包装盒中。
如果使用核酸扩增作为检测方法，已知有许多这种类型的扩增，它们在本发明的方法中均有用。例如，核酸扩增系统的类型(包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，Qβ复制酶扩增，链替换扩增(SDA)和单个引物扩增(SPA))或转录基本扩增系统(XONASBA(核酸序列基本扩增)，SSSR(自我保持序列扩增)，或LAT(连接激活转录)扩增)。信号扩增系统(如分枝DNA(bDNA)信号扩增系统)也有用处。
分枝杆菌属一特异性和序列特异性探针的发展也已被描述(Fries，J.W.U.et al.，Molec.Cell Probes 4：87-105(1990).在不止一种分枝杆菌种内出现某些遗传序列，它们可有利地用来检测任何一个家族的分枝杆菌种的存在。例如，Crawford et al.，U.S.5,183,733描述了结核分枝杆菌(MTB)复合体成员特有的一段重复DNA序列。通过直接杂交分析(如，Southern分析)或在一个扩增试验中使用一段保守序列为引物进行检测。在这里描述的一个新型扩增试验中，使用根据Rogall，T.et al.，Int，J.Sys.Bacteriol.40：323-330(1990)发表的16SrRNA基团序列，用本文描述的一套探针也可以对下列分枝杆菌进行扩增：MTB复合体，鸟分枝杆菌复合体，胞内分枝杆菌，副结核分枝杆菌，堪萨斯氏分枝杆菌，海分枝杆菌，M.szul-gai和胃分枝杆菌。引物是以它们能对下列分枝杆菌组/种提供最佳扩增的方式设计的：结核分枝杆菌(TB复合体：〔MTB〕)，鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌和副结核分枝杆菌(MAC复合体)，堪萨斯氏分枝杆菌和海分枝杆菌。正向引物是根据核苷酸119-114设计的(根据Rogall，T.et al.，Int.J.Sys.Bacteriol.40：323-330(1990)对这些分枝杆菌的16SrRNA基因序列的第二个可变区(V2)的命名)。正向引物序列(TBv2-119)为：5′-AAA CTG GGT CTA ATA CCGGAT AGG A-3′〔SEQ ID No.：1：〕。反向引物是针对第三个可变区(V3)的核苷酸431-453设计的。反向引物序列(TBv3-453)为：5′-CCA CCT ACC GTC AAT CCG AGA-3′〔SEQ ID No.：2：〕。扩增产物为大约335个碱基对(依扩增的种类)。属特异性探针是针对扩增产物的中间部分设计的，并且对所有的分枝杆菌都是相同的。其序列为：5′-GCG GGC iCA TCC CAC ACC GC-3′〔SEQ ID No.：3：〕，MTB种特异性探针是根据扩增产物的一个不同部分设计的，对TB复合体的有机体是特定的，其序列为：5′-GAC CAC GGGATG CAT GTC TTG TG-3′〔SEQ ID No.：4：〕。
另一方面，种特异性探针为已知。例如Mc Fadden et al.，US 5,225,324描述了一个家族的DNA插入序列，该序列可用作鉴定分枝杆菌和区分密切相关的种的探针。US 5,216,143描述了戈特氏分枝杆菌的特异性探针。已经知道副结核分枝杆菌的探针：IS 900插入因子对该种是特定的(Mc Fadden et al.，Mol.Microbiol.1：283-291(1987)。类SB-18活性
在大多数优选的实施方案中，培养基中特别是第二洗涤步骤中优选的去垢剂是类SB-18去垢剂，该去垢剂能够破坏菌索形成，并且最特别的是SB-18(CAS_No.13177-41-8)以足够的量破坏菌索形成，甚至使分支杆菌分散。SB-18优选是由于其纯化形式经济可得。C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)是非常优选的，这是因为在用于本发明的方法中时它能给出可溶性、链长和桥结构的理想的组合。
SB-18(CAS_No.13177-41-8)的化学组成为C23H49NO3S，其化学分子式为CH3(CH2)17N(CH3)2(CH2)3SO3。SB-18的化学名称包括氢氧化二甲基十八烷基(3-磺丙基)铵内盐(Aldrich No.36712-5)、N-十八烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸盐(Sigma No.08004)、3-(N，N-二甲基-硬脂酸基ammonio)丙烷磺酸盐和3-(硬脂酸基-二甲基ammonio)丙烷磺酸盐(FlukaNo.41570)。本发明的方法中最优选的是使用来源于Sigma的SB-18。
在SB系列中仅有一种其它去垢剂在破坏菌索形成上有用：SB-16(CAS_No.2281-11-0；N-十六烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸盐；十六烷基磺基甜菜碱；Sigma H6883)。然而，在相同的浓度下它不如SB-18有效。本文给出的数据表明，大多数十八烷基甜菜碱(如以下限定的其中R1的碳原子数大子16)具有破坏结核分支杆菌成团的能力。
某些去垢剂不具有使破坏菌索形成和分散MTB复合有机体达到满意程度的能力。试验并发现不具有解散MTB复合物能力的去垢剂的其它化合物包括：SB-10(CAS_No.15163-36-7)、SB-12(CAS_No.14933-08-5)、SB-14(CAS_No.14933-09-6)、癸酸(CAS_No.334-48-5)、十二烷酸(CAS_No.143-07-7)、十二烷基硫酸钠(SDS CAS_No.151-21-2)、亚苄基konium氯化物(Be-bzAlk：CAS_No.8001-54-5)、混合的烷基三甲基溴化物(mT-MA)、十二烷基三甲基溴化物(TMA-12：CAS_No.1119-94-4)、十四烷基三甲基溴化物(TMA-14：CAS_No.1119-97-7)、十八烷基三甲基铵溴化物(TMA-18：CAS_No.1120-02-1)、脱氧胆酸(CAS_No.302-95-4)、苄基二甲基十二烷基铵溴化物(BenDMA-12：CAS_No.7281-04-1)、苄基二甲基十四烷基铵溴化物(BenD-MA-14：CAS_No.139-08-2)、苄基二甲基十八烷基铵溴化物(BenzDMA-18)、吐温20(CAS_No.9005-64-5)、吐温60(CAS_No.9005-67-8)、吐温80(CAS_No.9005-65-6)、TritonX-100(CAS_No.9002-93-1)、NP-40(CAS_No.127087-87-0)、Brij35(CAS_No.9002-92-0)、Brij99(CAS_No.9004-98-2)、Span20(CAS_No.1338-39-2)、Span60(CAS_No.1338-41-6)、Span80(CAS_No.1338-43-8)、Synperonic F/68，聚乙二醇1450(CAS_No.25322-68-3)、Ficoll 400,000(CAS_No.26873-85-8)、聚乙烯吡咯烷酮360000(CAS_No.9003-39-8)、甲酰胺(CAS_No.75-12-7)和二甲基甲酰胺(CAS_No.68-12-2)。
某些去垢剂虽然不能破坏菌索形成，但显得有利于收集。例如，所有SB-系列去垢剂(特别是SB-12、SB-14、SB-16和SB-18，并且尤其是SB-18)表现出可等效地用于不成团的有机体(如鸟分支杆菌)。因此除了SB-18(CAS_No.13177-41-8)外，SB系列中抵销浮力由此经重力方法促进收集的其它去垢剂包括：SB-16(CAS_No.2281-11-0；N-十六烷基-N，N-二甲基-3-ammo-nio-1-丙烷磺酸盐；十六烷基磺基甜菜碱；Sigma H 6883)；SB-14(CAS_No.14933-09-6；N-十四烷基-N，N-二甲基-3-am-monio-1-丙烷磺酸盐；十四烷基磺基甜菜碱；Sigma T 7763)；SB-12(CAS_No.14933-08-5；N-十二烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸盐；十二烷基磺基甜菜碱；Sigma D 4516)。
两性离子SB-系列去垢剂具有被丙基基团分开的季氮和磺酸盐基团，各自具有长链烷基部分：SB-12、SB-14、SB-16和SB-18各自具有结合到季氮上的十二烷基、十四烷基、十六烷基和十八烷基。尽管SB-18去垢剂在破坏菌索形成上最有效，但是全部SB-系列的去垢剂表现出在经离心促进结核分支杆菌的收集上有某种程度的效果。此外，SB-系列去垢剂在促进不产生菌索的那些微生物(如鸟分支杆菌)的收集上表现出相等的效力。如以下的描述，勿须这种解释的支持，相信这些两性离子去垢剂具有促进去垢剂向细菌细胞运动的特征。这一积累的净效果补偿有机体的天然浮力达到足以使其能经离心分离的程度。
按照本发明，在使用去垢剂的那些实施方案中，不论是使用有利于菌索分散的类SB-18去垢剂，还是使用有利于离心收集细菌的类SB-18去垢剂，最终的结果是相同的。按照本发明，将分支杆菌置入有利于其后续检测的环境中(均匀分布在整个样品中或有利于收集和浓缩)。
这一功能二元性本文称为“SB-18活性”。因此，这里使用的SB-18活性指类SB-18去垢剂在处理成团生长的生物体时促进菌索分裂(并由此使微生物在溶液中均匀分散)的能力，或类SB-18去垢剂或近似十八烷基去垢剂因补偿浮力有利于经离心基本上定量收集所述微生物的能力，或者类SB-18去垢剂的这两种能力。
类-甜菜碱去垢剂
本发明的研究表明，具有下列性质的类似SB-18的化合物在无除气步骤时改善回收上都是有潜能的：(1)仅季胺(十八烷基，阳离子去垢剂，例如三甲基十八烷基铵溴化物(TMA-18：CAS_No.1120-02-1))和苄基二甲基十八烷基铵溴化物(BenzDMA-18)；(2)仅硫酸盐部分(十八烷基，阴离子去垢剂十八烷基硫酸钠(SOS)：CAS_No.1120-04-3)；(3)仅两性离子官能团(3-[(3-胆酰氨基丙基)-二甲基ammonio]-1-丙烷-磺酸(CHAPS)：CAS_No.75621-03-3)。这说明烷基部分和两性离子官能团之间的关系有利于SB-18活性。
SB-系列去垢剂也称作磺基甜菜碱，是称作甜菜碱的两性离子去垢剂大类的一个亚类。甜菜碱是特别的含有与阴电荷中心分开的阳电荷中心的两性离子分子。表2给出了大多数普通类别的甜菜碱(n-烷基甜菜碱)的一般结构，表3描述了其几种普通的结构变体。勿须任何理论的支持，相信两性离子官能团产生赋予这一类分子类SB-18活性的两极运动。无论如何，本发明的研究表明在本发明中使用甜菜碱时，甜菜碱结构变体产生可预期的结果。
表2给出了n-烷基甜菜碱的一般性描述。如这一描述中从头到尾所使用的，“R1”代表去垢剂的疏水部分。它是典型的烷基部分，可以是少至8个碳原子的脂肪链到超过22个碳原子的长链。烷基部分优选地含有12-20个碳原子，更优选地含有16-18个碳原子。烷基链可以是烯化不饱和的，支链的，和/或由例如羟基、酯、羧基官能团以及其它基团取代的。
“α”可以存在可以不存在，取决于“n”是否等于0或1。如果n＝0，则α不存在，如果n＝1，则α存在。当α存在时，它连接R1与阳电荷中心。这一连接基可以是亚甲基。更普遍的一种这样的连接基是酰氨基丙基(-(COO-NH-CH2CH2CH2-)。其它，例如醚键(-O-)、羰基键(-CO-)或羟甲基键(-CH(OH)-)键也是已知的。然而，其它基团肯定是可能的，例如胺。
“R2”和“R3”分别选自由氢和烷基组成的组，优选地是1-4个碳原子的低级烷基(例如，甲基、乙基、丙基、丁基)或其异构体，最优选的是甲基；然而，如实施例9和10所讨论的，增加这些烷基的体积(如，如果可能的话，使其延长或带支链)会损害功能。
“β”代表阳电荷中心。在大多数情况下，β是季氮(-N_-)，然而，鏻(-P_-)、锍(-S_-)和其它部分是可能的。应注意到，在大多数情况下β是季氮，这需要R2和R3存在，然而，对其它阳离子，可以不需要R2和R3存在。
“R4”是分开带电体的桥，该桥可以是亚烷基(如，m≥1)，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚戊基和亚己基桥是已知的。R4的组成和结构不限于亚烷基的：掺入羟基、苄基，或其中R4是支链的例子也是普遍的。R4的其它修饰(如掺入胺)也是可能的，并预期有相似的功能。
阴电荷中心“γ”得自宽范围的各种基团，包括磺酸基((-SO3 _、硫酸基(-OSO3 _)、羧酸基((-COO_)、和磷酸基(-OPO_3)部分。掺入这些基团的组合在文献中已有广泛研究。其它可能性包括但不限于亚磷酸基(-PO3 _)和次磷酸基(-PO2 _)基团。也有其中有机基团(如，-CH2CH3)连接到γ上的例子。如可以预料的，当作为一类去垢剂的甜菜碱具有异常特征时，交换各种部分在化学和物理性质上产生有趣的可预料的变化，且其在本发明的方法中的使用受到关注。
表2：n-烷基甜菜碱的结构
示出了n-烷基甜菜碱的通式结构。R1是疏水烷基链，α是连接R1与阳离子β的“连接基”，在需要时，R2和R3修饰阳离子。R4是连接阳离子和阴离子γ的“桥”
Figure A9519318900901
   R1 C8-C22
    α -CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，-(CO)-
    n 0 or 1
   β -N_-，-P_-，-S_-
   R2 -H，-CH3，-C2H5，-C3H7，-C4H9
   R3 -H，-CH3，-C2H5，-C3H7，-C4H9
R4 -CH2-，-C2H4-，-C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12-，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(QH)CH2-，-CmH2m-1(OH)-，其中m≥1
   γ -SO3 _，-OSO3 _，-COO_，-OPO3 _，-PO3 _，-PO2 _-
可从各种来源(如，CalBiochem，LaJolla，CA；Digma，St.Louis，Mo；Fluka，Ronkonkoma，NY；和Aldrich，Milwaukee，WI)获得磺丙基甜菜碱。几种已成功地在本发明的方法中试验并表现出类SB-18活性。这些包括：C12-磺丙基甜菜碱(SB-12：CAS_No.14933-08-5)、C14-磺丙基甜菜碱(SB-14：CAS_No.14933-09-6)、C16-磺丙基甜菜碱(SB-16：CAS_No.2281-11-0)、C18-磺丙基甜菜碱(SB-18：CAS_No.13177-41-8)。几种使用的其它甜菜碱已成功地由常规方法合成，或按本文的描述获得样品。这些包括：C18-磺丁基甜菜碱(CAS_No.22313-73-1)、C16-羟丙基磺基甜菜碱(CAS_No.7425-12-9)、和3-丁氧基-2-羟基羟丙基磺基甜菜碱(CAS_No.108797-84-8)。也试验了其烷基链得自天然油的几种磺基甜菜碱。这些包括：椰子树酰氨丙基羟磺基甜菜碱(CAS_No.68139-30-0)、牛脂酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱、eruc酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱。
由于其高的可溶性，广泛研究的大多数是羟基甜菜碱(γ＝COO_)。几种羧基甜菜碱已在本发明的方法中试验并表现出类SB-18活性。这些包括：C16-羧甲基甜菜碱(CAS_No.693-33-4)、C18-羧乙基甜菜碱(CAS_No.30612-73-8)、C18∶1-羧甲基甜菜碱(CAS_No.871-37-4)和C18-酰氨丙基羧甲基甜菜碱(CAS_No.6179-44-8)。也试验了其烷基链得自天然油的几种羧基甜菜碱。这些包括：椰子树酰氨丙基羧甲基甜菜碱(CAS_No.61789-37-9和CAS_No.61789-40-0)、椰子树羧甲基甜菜碱(CAS_No.68424-94-2)、蓖麻毒酰氨丙基羧甲基甜菜碱(CAS_No.71850-81-2)和牛脂双羟乙基甘氨酸酯(CAS_No70750-46-8)。也试验了几种没有给出CAS登记号的羧基甜菜碱。这些包括：二十二烷基羧甲基甜菜碱(被认为是C22-链)、小麦胚芽油-酰氨丙基羧甲基甜菜碱(Schercotaine WOAB：Scher Chemicals，Inc.，Clifton，NJ)、巴巴苏羧甲基甜菜碱(ChembetaineS：Chemron Corp.，Paso Raso Rob-les，CA)和canol酰氨基丙基甜菜碱(Hetain CLA：Heterene，Inc.，Patterson，NJ)。
由于甜菜碱的不同性质，有几种仅在特定的条件下才起作用：二十二烷基羧甲基甜菜碱是C22-链，仅在盐浓度最小时起作用；C16-羟丙基磺基甜菜碱需要碘化钾的存在。两种另外的甜菜碱被常规合成，代表甜菜碱的两个其它类别。这些也被成功的使用，包括C16-酰氨丙基硫酸根合甜菜碱(CAS_No.58930-11-3)和C18-二氧磷基乙基甜菜碱(CAS_No.126712-89-8)，分别代表硫酸基和磷酸基的用途。
因此，代表这些分子的宽范围结构选择的25种甜菜碱已被试验了有利于经例如离心收集分支杆菌的效力。具有链长少于16个碳原子的那些表现出主要经补偿浮力而不破坏成团起作用，而具有链长大于18个碳原子的那些的大多数表现出经破坏菌索以及抵销浮力起作用。所有这些均表现出在本发明的方法中有用。两性离子和烷基链一起赋予甜菜碱独一无二的特征。因此，任何具有“类甜菜碱”结构的分子预期能表现出类SB-18活性。
已知存在许多以上结构组合的合成路线。在本发明的方法中有用的类SB-18去垢剂种类并不限于列举的种类，因为这一组在本发明的方法中的行为是可预料的。下表给出了另外的说明，该表给出了市售的或合成路线已知的并且在本发明的方法中有用的甜菜碱的例子。
甜菜碱的大多数例子以季氮为阳离子(β)。经假定阳离子是季N，N-二甲基ammonio，并且然后先基于使用的阴离子(γ)分成亚类，最容易列出这一去垢剂大家族的成员。各亚类先基于桥结构(R4)，再基于连接基(α)，再基于烷基链长(R1)可以进一步细分。然后容易列出未落在这些不连续类别的其它组合。再次指出，可合理的推断所有这些在本发明的方法中会起作用。
有亚甲基桥(“羧甲基甜菜碱”：R4＝-CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的羧基甜菜碱的例子是C10(CAS_No.2644-45-3)、C11(CAS_No.2956-38-9)、C12(CAS_No.683-10-3)、C13(CAS_No.23609-76-9)、C14(CAS_No.2601-33-4)、C15(CAS_No.23609-77-0)、C16(CAS_No.693-33-4)和C18(CAS_No.820-66-6)。有为N，N-二乙基(R3＝R4＝-CH2CH3)的羧甲基甜菜碱(CAS_No.6232-16-2)的例子和烷基具有双键(CAS_No.871-37-4)的例子。在这一亚类中有几个其中α是酰氨丙基的羧甲基甜菜碱的例子，包括：C12-酰氨基(CAS_63No.4292-10-8)、C14-酰氨基(CAS_63No.59272-84-3)、C16-酰氨基(CAS_63No.32954-43-1)、C18-酰氨基(CAS_63No.6179-44-8)。C18-酰氨基(CAS_63No.6179-44-8)结构不确定，因其烷基是“异”型，这表明它有某种不确定形式的支链。有几个其中烷基链来源于椰子油的酰氨丙基羧甲基甜菜碱，其不同是由于制备方法的不同。这一类别的两个例子包括CAS_登记号61789-39-7和61789-40-0。椰子树羧甲基甜菜碱的一个例子是CAS_No.68424-94-2。其它的天然油羧甲基衍生物包括：蓖麻毒酰氨丙基羧甲基甜菜碱(CAS_No.71850-46-8)、牛脂双羟乙基甘氨酸酯(CAS_No.70750-46-8)。也试验了几种没有给出CAS登记号的羧甲基甜菜碱。这些包括：小麦胚芽油-酰氨丙基羧甲基甜菜碱(Schercotaine WOAB：Scher Chemicals，Inc.，Clifton，NJ)、巴巴苏酰氨丙基羧甲基甜菜碱(Croda，Inc.，Parsippany，NJ)、大豆酰氨丙基羧甲基甜菜碱(Chembetaine S：Chemron Corp.，Paso Raso Rob-les，CA)和canol酰氨基丙基甜菜碱(Hetain CLA：Heterene，Inc.，Patterson，NJ)。有几个其中酰胺连接基中的氮是季氮(如，连接基(α)是羰基)的例子。这些包括C11(CAS_No66451-67-0)、C15(CAS_No.66511-6-99-2)和C17(CAS_No.66451-68-1)。有乙基桥(“羧乙基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的羧基甜菜碱的例子包括C12(CAS_No.16527-85-8)、C13(CAS_No.132621-79-5)、C14CAS_No.69725-38-3)、C16(CAS_No.42416-43-3)和C18(CAS_No.30612-73-8)。在合适的条件下，其中R和R为氢原子的羧乙基甜菜碱的例子是CAS_No.1462-54-0(C12-β丙氨酸)。有丙基桥(“羧丙基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的羧基甜菜碱的例子包括C11(CAS_No.150147-53-8)、C12(CAS_No.15163-30-1)、C14(CAS_No.146959-90-2)、C15(CAS_No.146959-91-3)、C16(CAS_No.71695-32-4)和C18(CAS_No.78195-27-4)。有丁基桥(“羧丁基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)的羧基甜菜碱的例子是C12(CAS_No.120139-51-7)。有戊基桥(“羧戊基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)的两个羧基甜菜碱的例子是C12(CAS_No.76392-97-7)和C16(CAS_No.73565-98-7)。有己基桥(“羧己基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)的两个羧基甜菜碱的例子是C12(CAS_No.132621-80-8)。有几个其中苄基用作桥功能基(R4＝-CH2-C6H4 -)的例子。有两个C12的例子，一个的羧基功能基在4位或对位(CAS_No.71695-31-3)，一个的羧基功能基在2位或邻位(CAS_No.71695-34-6)。有两个C16的例子，一个的羧基功能基在4位或对位(CAS_No.71695-33-5)，一个的羧基功能基在2位或邻位(CAS_No.71695-35-7)。因此“类羧基甜菜碱”(“类CB”)应包括(如表2所示)以羧基为阴离子(γ＝-COO_)的类SB-18甜菜碱结构，并且应包括(如以上所定义的)R1、α、R2、R3、β和R4的所有可能的组合。
甜菜碱的第二主要亚类是磺基甜菜碱(γ＝SO3 _)。有甲基桥(磺甲基甜菜碱”：R4＝-CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的磺基甜菜碱的例子包括C12(CAS_No.52667-78-4)、C16(CAS_No.69775-75-3)和C18(CAS_No.36051-36-2)。有乙基桥(“磺乙基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的磺基甜菜碱的例子包括C12(CAS_No.24020-67-5)、C14(CAS_No.58930-04-4)和C16(CAS_No.58930-05-5)。C16-酰氨基(CAS_No.58930-06-6)是以酰氨丙基功能基连接烷基链和季氮的磺乙基甜菜碱的例子。有丙基桥(“磺丙基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的磺基甜菜碱的例子包括C8(CAS_No.15178-76-4)、C10(CAS_No.15163-36-7)、C12(CAS_No.14933-08-5)、C14(CAS_No.14933-09-6)、C15(CAS_No.67030-70-7)、C16(CAS_No.2281-11-0)和C18(CAS_No.13177-41-8)。有为N，N二丙基(R3＝R4＝-CH2CH2CH3)的C12(CAS_No.15163-34-5)的例子。有至少两个其中α是酰氨丙基的Cn-磺丙基甜菜碱的例子，包括C12-酰氨基(CAS_No.52562-28-4)和C16-酰氨基(CAS_No.52562-29-5)。有几个未确定结构的其中的桥是异丙基(-C3H6-)的磺丙基甜菜碱的例子，包括C12(CAS_No.59942-40-4)、C14(CAS_No.59942-41-5)和C16(CAS_No.59942-42-6)。也有有异丙基桥和酰氨丙基连接基的C16-酰氨基(CAS_No.63663-13-8)的例子。有丁基桥(“磺丁基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的磺基甜菜碱的例子，包括C12(CAS_No.64463-49-6)、C16(CAS_No.58930-07-7)和C18(CAS_No.22313-73-1)。有为1，3-二甲基-3-磺丁基的C12(CAS_No.35489-44-2)例子。有其中α是酰氨丙基的例子：C-酰氨基(CAS_No.58930-08-8)的例子。有“磺己基甜菜碱”(R4＝-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)的例子：C16(CAS_No.132621-81-9)。有几个其中苄基作为桥功能基(R4＝-CH2-C6H4-)的例子，包括C12(CAS_No.65180-40-7)、C14(CAS_No.65180-41-8)、C16(CAS_No.65180-42-9)和C18(CAS_No.65180-43-0)，其中磺酸基在4位或邻位上。还有几个其中经酰氨丙基连接烷基链与季氮的例子：C12(CAS_No.65180-44-1)、C14(CAS_No.65180-45-2)、C16(CAS_No.65180-46-3)、C18(CAS_No.65180-47-4)。因此“类磺基甜菜碱”(“类SB”)应包括(如表2所示)以磺基为阴离子(γ＝-SO3 _)的类SB-18甜菜碱结构，并且应包括(如以上所定义的)R1、α、R2、R3、β和R4的所有可能的组合。
磺基甜菜碱的一个大的亚类是羟丙磺基甜菜碱(HBS)，区别对待它们是由于其明显不同的特征，可合理地预期所有的成员均显示类SB-18活性。由于其较低的可溶性，这些去垢剂还未被广泛研究。大多数这类甜菜碱具有2-羟丙基桥(R4＝-CH2CH(OH)CH2-)，包括直链烷基的：C10(CAS_No.34135-76-7)、C12(CAS_No.13197-76-7)、C14(CAS_No.13177-42-9)、C15(CAS_No.71502-45-9)、C16(CAS_No.7425-12-9)和C18(CAS_No.19223-56-4)；以及有酰氨丙基连接基的那些：C12-酰氨基(CAS_No.19223-55-3)、C14-酰氨基(CAS_No.63663-10-5)、C16-酰氨基(CAS_No.63663-11-6)和C18-酰氨基(CAS_No.63663-12-7)。也有几个其中的烷基不是简单的直链的C14的例子：(CAS_No.56505-82-9)和(CAS_No.71497-51-3)。因此“类羟磺基甜菜碱”(“类HSB”)应包括(如表2所示)以磺基为阴离子(γ＝-SO3 _)的有羟丙基桥(R4＝-CmH2m-1(OH)-)的那些类SB-18甜菜碱结构，并且应包括(如以上所定义的)R1、α、R2、R3、和β的所有可能的组合。
这一去垢剂家族的第三亚类(也是非常清楚确定特征的一类)是二氧磷基甜菜碱。有乙基桥(“二氧磷乙基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的二氧磷基甜菜碱(γ＝-OPO3 _)的例子，包括：C10(CAS_No.134842-83-4)、C11(CAS_No.134842-84-5)、C12(CAS_No.126712-86-5)、C14(CAS_No.126712-87-6)、C16(CAS_No.126712-88-7)、C17(CAS_No.145578-49-0)和C18(CAS_No.126712-89-8)。有两个其中烷基具有双键的二氧磷乙基甜菜碱的例子：C18∶1(CAS_No.134590-60-6和CAS_No.148716-30-7)。有几个其中R3和R4部分明显变化的C16二氧磷乙基甜菜碱的例子，包括：N，N-二乙基(CAS_No.126712-90-1)、N，N-二丙基(CAS_No.126712-91-2)、N，N-二丁基(CAS_No.126712-92-3)、N-乙基-N-丙基(CAS_No.126712-93-4)、N-甲基-N-乙基(CAS_No.134842-85-6)和N-乙基-N-丁基(CAS_No.126712-94-5)。有丙基桥(“二氧磷丙基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2-)的二氧磷基甜菜碱的例子是C16二氧磷丙基甜菜碱(CAS_No.89367-17-9)。有丁基桥(“二氧磷丁基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2CH2-)的二氧磷基甜菜碱的例子是C16-二氧磷丁基甜菜碱(CAS_No.134842-86-7)。有己基桥(“二氧磷己基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)的二氧磷基甜菜碱的例子是C16-二氧磷己基甜菜碱(CAS_No.134842-87-8)。有几个n-羟烷基二氧磷乙基甜菜碱(如，它们有羟基连接基)的几个例子，包括：C12(CAS_No.124951-53-3)、C14(CAS_No.124951-54-4)、C16(CAS_No.124951-57-7)。有酰氨丙基连接基的羟丙基二氧磷基甜菜碱的例子：C12-酰氨基(CAS_No.73602-79-6)和C18-酰氨基(CAS_No.144077-12-3)。有几个以羟丙基与醚功能基一起作为连接基的二氧磷乙基甜菜碱的例子：C10(CAS_No.128506-41-2)、C12(CAS_No.128506-42-3)、C14(CAS_No.128506-46-7)。Gallot，B.et al.，J.Colloid Interface Sci.121：514-512描述了一系列乙基用于修饰阴离子(如，-OPO3 _-(C2H5))的二氧磷基甜菜碱。这些结构以及其中γ是亚磷酸基或次磷酸基的例子也可以合理地预期在本发明的方法中具有活性。因此“类二氧磷基甜菜碱”(“类PB”)应包括(如表2所示)以磷酸基、次磷酸基或亚磷酸基阴离子(γ＝-OPOx _其中X＝1、2或3)的类SB-18甜菜碱结构，并且应包括(如以上所定义的)R1、α、B2、R3、β和R4的所有可能的组合。
甜菜碱的第四亚类包括那些以硫酸基(-OSO3 _)为阴离子的那些。与类HSB的例子一样，但这些分子溶解性更低，于是，对其研究得也不多。然而，也可合理地预期它们能表现出类SB-18活性。有乙基桥(“磺乙基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的例子包括C10(CAS_No.92764-24-4)、C14(CAS_No.58930-09-9)和C16(CAS_No.58930-10-2)。有丙基桥(“磺丙基甜菜碱”：R4＝-CH2H2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的的例子包括C10(CAS_No.92764-22-2)、C12(CAS_No.15163-35-6)、C14(CAS_No.58930-12-4)和C16(CAS_No.34236-95-8)。有丁基桥(“磺丁基甜菜碱”：R4＝-CH2CH2CH2CH2-)和亚甲基连接基(α＝-CH2-)，并且仅单独变化烷基链长的例子包括C12(CAS_No.58930-14-6)、和C16(CAS_No.58930-15-7)。有几个有酰氨丙基连接基的硫酸基的例子：C16-酰氨丙基硫酸根合乙基甜菜碱(CAS_No.58930-11-3)、C16酰氨丙基硫酸根合丙基甜菜碱(CAS_No.58930-13-5)、C13酰氨丙基硫酸根合丁基甜菜碱(CAS_No.144077-11-2)和C16酰氨丙基硫酸根合丁基甜菜碱(CAS_No.58930-16-8)。因此，“类硫酸根合甜菜碱”(“类StB”)应包括(如表2所示)以硫酸基为阴离子(γ＝-OSO3 _)的类SB-18甜菜碱结构，并且应包括(如以上所定义的)R1、α、R2、R3、β和R4的所有可能的组合。
类磷鎓甜菜碱(β＝-P_-)已由Gaertner，V.R.et al.(US 2,828,332)描述。基于其中的数据和假设，“类磷鎓甜菜碱”(“类PhB”)包括(如表2所示)具有磷鎓阳离子的所有可能的类SB-18甜菜碱组合和(如以上所定义的)R1、α、γ、R2、R3和R4的所有可能的组合。
类似磷鎓甜菜碱，“类锍甜菜碱”包含有类SB-18的含义，是其中(如表2所示)β＝-S_-的那些，包括(如以上所定义的)R1、α、γ、R2、R3和R4的所有可能的组合。
表3列出了几种其它值得注意的类甜菜碱结构，包括“反向(re-vers)甜菜碱”(RevB)、类胺氧化物(AOx)去垢剂、c-烷基甜菜碱(cAB)和咪唑啉-甜菜碱衍生物(ImB)。用表2的术语很容易描述它们，也许从烷基(R1)的解析可最方便地考虑各种结构：烷基可以结合到阳离子(β)、阴离子(γ)或桥(R4)上，所有的均被认为是类甜菜碱结构。例如，在n-烷基甜菜碱的情况下，疏水区(R1)共价连接到阳离子上，而在反向甜菜碱的情况下，烷基连接到阴离子(-γ-)上，并且在c-烷基的情况下，烷基连接到桥(R4)上。
反向甜菜碱的相反电荷在这种情况下是阴离子(-[β]_-)经桥(-R4-)连接到阴离子上，这一点与n-烷基甜菜碱相似。一般该阳离子(-[β]_-)是季氨，R2和R3在这一位置连接上。
c-烷基甜菜碱在结构上明显的一点是烷基共价连接到桥(R4)上，而不是阳离子(-[β]_-)或阴离子(-γ_-)上。
在胺氧化物的情况下，n-烷基甜菜碱结构被保持；然而，按季氮的定义β是氧化物，按定义γ是氧化物。可方便地认为桥是最小化的：R4是简单的共价N-O键。有其它类似胺氧化物的类氧化物结构，如磷鎓氧化物(例如可合理地预期它们在本发明的方法中能起作用)。
两性离子咪唑啉-型去垢剂也是明显的两性甜菜碱。在这种情况下，阳性电荷中心不是基团，而是咪唑啉，其中的共振结构产生阳离子。经典的桥结构被保持，烷基可以连接到环上的任何位点。
表3：其它的类甜菜碱结构
提供了其它的甜菜碱结构。保持用表2的术语描述这些结构。
Figure A9519318900991
由于对表3的结构研究有一定的限度，因此它们没有受到象n-烷基甜菜碱一样的重视，仅代表甜菜碱中结构多样性的一小部分。不过，以上几类的代表已用于本发明的方法中。Kurosaki，T.et al.，Chern.Soc.Japan 11：1297-1301(1990)描述了使用的反向甜菜碱的例子，烷基2-羟基-3-三甲基ammonio丙基磷酸酯(C16-AHTMAP：(CAS_No.99485-86-6)，它作为赠品从KaoChemical(Japan)获得。使用的胺氧化物，Ammonyx MO(十四烷基二甲基胺氧化物：CAS_No.3332-27-2)作为样品从Stepan Com-pany，Northfield，IL获得。使用的c-烷基甜菜碱，Darvan NS(c-癸基甜菜碱(CAS_No.96-55-9)和c-十六烷基甜菜碱(CAS_No.95-56-0)的混合物)作为样品从R.T.Vanderbilt，Norwalk，CT.获得。
已研究了几组反身甜菜碱。有几种最初由Kurosaki，T.et.al.，Chem.Soc.Japan 11：1297-1301(1990)描述的烷基2-羟基-3-三甲基ammonio丙基磷酸酯(Cn-AHTMAP)的例子，可合理地预期所有这些在本发明的方法中均能起作用，包括C12(CAS_No.99485-91-3)、C14(CAS_No.132630-63-8)、C16(CAS_No.99485-86-6)和C18(CAS_No.99485-87-8)。Zimmer，R.E.等(US,3,506,393)描述了几种非常有趣的反向甜菜碱的合成，可合理地预期所有这些在本发明的方法中均能起作用，包括下列例子：铵阳离子(β＝-N_(CH3)3)与次磷酸基阴离子(γ＝-PO2 _-)结合在一起：CR(CAS_No.29557-49-1)、铵阳离子(β＝-N_(CH3)3)与亚磷酸基阴离子(γ＝-PO3 _-)结合在一起：C12(CAS_No.32020-41-0)、锍阳离子(β＝-S_-)与次磷酸基阴离子(γ＝-PO2 _-)结合在一起：C12(CAS_No.32020-40-9)、锍阳离子(β＝-S_-)与亚磷酸基阴离子(γ＝-PO2 _-)结合在一起C10(CAS_No.232020-42-1)和锍阳离子(β＝-S_-)与磷酸基阴离子(γ＝-OPO3 _-)结合在一起：C10(CAS_No.32020-43-2)。因此，“类反向甜菜碱”(“类RevB”)(如表3所示)应包括(如表2所示和以上所定义的)R1、α、β、R2、R3、γ和R4的所有可能的组合。
可合理地预期在本发明的方法中能起作用的N，N-二甲基胺氧化物的例子包括：C12(CAS_No.1643-20-5)、C14(CAS_No.3332-27-2)、C16(CAS_No.7128-91-8)、C18(CAS_No.2571-88-2)、和C22(CAS_No.26483-35-2)。有酰氨丙基连接基的胺氧化物的例子是C18∶1-酰氨基(CAS_No.14351-50-9)。其中R1得自天然油的那些例子包括：椰子树酰氨丙基(CAS_No.68155-09-9)和巴巴苏酰氨丙基(CAS_No.124046-26-0)。因此，“类胺氧化物”(“类A0”)(如表3所示)应被定义为其中γ＝0_且R是共价β-0键的那些，并包括(如表2所示和以上所定义的)R1、α、β、R2和R3的所有可能的组合。
可合理地预期在本发明的方法中能起作用的c-烷基甜菜碱的例子包括：C10(CAS_No.96-55-9)、C12(CAS_No.686-83-9)、C14(CAS_No.16545-85-0)、C16(CAS_ No.95-56-0)和C18(CAS_No.686-84-0)。因此，“类c-烷基甜菜碱”(“类cAB”)(如表3所示)应被定义为其中R1连接到R4上的那些，并包括(如表2所示和以上所定义的)α、β、γ、R1、R2、R3、和R4的所有可能的组合。
咪唑啉甜菜碱的例子是其中R4得自椰子油(CAS_No.68334-21-4)的一种。因此，可合理地预期所有“类咪唑啉甜菜碱”(“类ImB”)结构在本发明的方法中能起作用，并应被定义为其中β(按定义)是咪唑啉功能基的那些结构，并包括(如表2所示和以上所定义的)α、γ、R1、R2、R3、和R4的所有可能的组合。
因此，本文所使用的“类甜菜碱”指表2和3所描述的那些结构，包括，例如，具有类SB-18活性的类CB、类SB、类HSB、类PB、类StB、类PhB、类SoB、类RevB、类AO、类cAB和类ImB。应当指出，就Gollot，B.et al.，J.Colloid Interface Sci.121：514-521(1988)的例子来说，不改变类SB-18活性的对γ的修饰也应包括在这一定义内。此外，在相同的分子中掺入多个电荷(如，两个或多个电荷，其中电荷的至少两个符号相反，产生两极运动，其行为与本文所述的甜菜碱一致)，并具有类SB-18活性的渗入物也被认为是类甜菜碱。类甜菜碱去垢剂的使用
类甜菜碱的特征取决于烷基链长、电荷组成、和桥结构。较长的烷基链(例如C16-C20是优选的，这是由于其破坏菌索形成的能力和其更易隐退(seqestered)的表观能力。然而，这些长链烷基的有限的溶解性会障碍在本发明的方法中有效地使用这些甜菜碱。由于这些阴离子给出的增加的可溶性，二氧磷基甜菜碱、羧基甜菜碱或磺基甜菜碱是优选的。然而，羧基甜菜碱和磺基甜菜碱更容易合成。羧基甜菜碱具有与离子去垢剂更相关的特征，而磺基甜菜碱表现出与非离子更相关的行为特征。直链桥是优选的，丙基功能基是最优选的，这是由于(1)它容许去垢剂盐析，和(2)它是最小的制菌结构。亚甲基桥最差，这是由于它表现出非盐析行为。亚甲基连接基是优选的。然而，因酰氨丙基连接基显得不影响全部的类SB-18活性，它们的确显得增强非离子行为。因此，对用于本发明的方法中的类SB-18去垢剂的选择可以依所需用途、用于检测的系统、所需制菌活性的程度来变化。例如，当目标是检测不成团的有机体(如，副结核分支杆菌)时，与分散和离子功能有关的那些特征就不是必需的。在这些情况下，可以使用具有短链和更多非离子特征的甜菜碱。另一种情况，当目的是检测成团生物体(如，结核分支杆菌)时，离子行为和长链是必需的。因烷基链长和桥长表现为制菌活性的重要决定因素，故可以改变类甜菜碱结构以有利于扩增检测。例如，当这里的离子使用PCR为优选的检测方法时，如以上的讨论，本发明的方法可以有利于经其它扩增方法检测。对PCR最理想的甜菜碱预期可以使用，当对其它方法不一定是最佳的，所述方法包括，例如，连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或转录扩增(NASBA、3SR或LAT)。此后包括有关对类甜菜碱结构和功能方面的理解，以就SB-18去垢剂的修饰指导技术人员，为给定的用途获得最佳甜菜碱。考虑到以上各个方面，预期C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)为各种用途以及PCR给出可溶性、链长和桥结构的理想组合，因而，使用这些化合物的本发明的方法是非常优选的实施方案。用常规技术(如JP79100920号申请和JP81251394号申请所述的方法)合成CAS_No.78195-27-4。
SB-18浓度低于2μM显得不能分散，浓度在2μM和2mM之间最有用，这大概是由于临界胶束浓度(CMC)。由于不可溶性，在SB-18浓度大于2mM很多时保持在溶液中是困难的。如技术人员所理解的，这些浓度将随所使用的去垢剂而变化。例如，短链需要超过CMC的更高的浓度，但KraHt温度是较少考虑的问题。不论如何，应使用超过CMC浓度10-1000倍的浓度的去垢剂，试验温度和类SB-18去垢剂Krafft温度之间的关系必须小心地结合起来考虑。当使用类SB-18去垢剂时，有必要使用含电解质的培养基(10mM-100mM盐)，并温热溶液，例如，温热至37-42℃，但不低于37℃，并完成所有步骤(例如，离心，37℃以上，以保持去垢剂为胶束形式)。按以下讨论变化本发明的方法中使用的类SB-18去垢剂可以消除对类SB-18去垢剂保持温热的需要。例如，以不溶解细胞的浓度(一般低于2mM)使用C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)消除SB-18赋子的严格的温度特征。
一般来说，超过50℃的温度似乎有利于溶解。然而，因为只有在细菌细胞是完整的时，本发明的方法才能给出改善经离心的回收效力的优点，所以应避免加热温度超过50℃。
含有洗涤溶液的去垢剂的pH值应保持在5以上，但在9以下。pH值在5以下，类SB-18去垢剂可能开始表现出异常行为，pH值在9以上，类SB-18去垢剂可能表现为阴离子去垢剂并盐析。然而可以使类SB-18去垢剂表现出类SB-18活性的任何pH值都是可接受的。这种包含洗涤剂的洗涤时间为至少60分钟，以使去垢剂积累。高达18小时的培养仅给出超过60分钟培养结果的边际(marganal)。甜菜碱作为去垢剂
一般认为有三类去垢剂：离子的(包括阴离子的和阳离子的)、非离子的和两性的(Kirk-Othmer Ebcyclopedia of Chemical Technol-ngy，3rd ed.vol.22，John Wiley&Sons，New York(1983)，p.332-387)。甜菜碱所属的去垢剂的其它类别不是一律可接受的。由于共存正式的荷电体，某些类型的甜菜碱为“两性的”，而Laugh-lin，R.G.Langmuir 7：842-847(1991)却认为这些分子是非离子去垢剂的亚类。明确的是甜菜碱具有某些特定的特征，这使甜菜碱归属于明显不同于非离子去垢剂和离子去垢剂的类别。甜菜碱的的行为在某些方面类似于离子去垢剂，在其它方面类似于非离子去垢剂。事实上，依据结构，可使相同的分子的行为在一定的条件下类似离子去垢剂，在其它条件下，类似非离子去垢剂。
一般基于其物理性质和在温度(X-轴)对浓度(Y-轴)的曲线上的相行为描述去垢剂。最简单地说，对纯的去垢剂认为存在三相：单体相、固相和胶束相。各种去垢剂可以基于引起给定相存在的系统参数进行描述。系统参数的变化引起相之间的转化，然后进一步确定行为特征。下列一般性信息是从下列文献总结出来的：
    Shinoda，K.，Nakagawa，T.，Tamamushi，B.，and Isemura，T.eds.
Colloidal Surfactants，Academic Press，New York(1963)；Schick，M.J.ed.，
Surfactant Science Series，vol.I；Nonionic Surfactants，Marcel Dekker，New
York(1967)；Jungermann，E.ed.，Surfactant Science Series，vol.4；Cationic
Surfactants，Marcel Dekker，New York(1970)；Bluestein，B.R.and Hilton，
C.L.，eds.，Surfactant Science Series，vol.12：Amphoteric Surfactants，Marcel
Dekker，New York(1982)；Gloxhuber，C.and Kunstler，K.eds.，Anionic
Surfactants，Marcel Dekker，New York(1992).
例如，所有去垢剂在水溶液中有某种程度的可溶性。在低浓度时，仅存在单体，随着浓度的提高，相转化开始发生，当温度足够高时，胶束开始形成。在这些条件下，多数情况是进一步增加浓度仅使胶束浓度增加。发生这一转化的浓度称为“临界胶束浓度”(CMC)。
只要系统高于临界温度，在所有温度下CMC出现实质上相同的浓度。为了这一讨论的目的，可以直观地认为CMC平行于以上所述的X-轴。如果系统低于这一临界温度，不论浓度是多少，在单体相和固相之间出现平衡。随着浓度的提高，如果系统高于CMC，则实质上出现固相和胶束相之间的平衡。这一称作Krafft温度(krafft，J.et al.，Ber.28：2566-2573(1895))的这一温度一般指水合结晶的熔点，不论浓度多少都基本上是相同的。为了这一讨论的目的，可以直观地认为Krafft温度平行于Y-轴。
CMC和Krafft温度相交的点称为Krafft点。这一图表的实质是(分子量和聚集数)大小的特征形成的胶束的概冒。使用这一基本框架(温度、浓度和溶剂系统，包括变化电解质和电解质的浓度)，上世纪化学家已确定了单相和不同化学结构的胶束行为。以下讨论集中在临床相关条件(如，水溶液)上，并描述被认为总的来说在SB-18和类SB-18去垢剂功能中是重要的那些特征，也是指导希望优化给定用途(如，经扩增方法而不是PCR检测)的类甜菜碱去垢剂的技术人员的一部分。
去垢剂的CMC随着烷基链长的增加而降低，但非离子去垢剂的CMC一般比相等链长的离子类似物的低102倍。这表明非离子去垢剂可溶性较差。然而，这一差别强烈地取决于所使用的非离子部分的种类和数量。例如，Hsiao，L.et al.，J.Phys.Chem.60：657-660(1956)指出，随着聚氧乙烯部分数目的增加，聚氧乙烯苯基醚增加。Tokiwa，F.et al.，Bull.Chem.Soc.Japan 35：1737-1739(1954)和Schick，M.J.et al.，Phys.Chem.66：1326--1333(1962)指出，胶束重量和聚集数也随聚氧乙烯单位的增加而增加。另一方面，离子去垢剂的CMC与不同的离子去垢剂的仅有小的不同。Shinoda(Shinoda K.，Colloidal surfactants，Academic Press，New York(1963)pp.54-55)搜集了几种离子类似物的数据说明这些小的差别。
相反，甜菜碱的CMC取决于电荷分开的距离以及特定离子组的性质。例如，Lattes，A.et al.，Surfactants Soln.11：127-1139(1991)指出，随着桥长从甲基向乙基、丙基的变化，在水中羧基甜菜碱系列的CMC增加。Weers，J.G.et al.，Langmuir 7：854-867(1991)通过说明相反的倾向反对这一观点。Weers，J.G. et al.，Langmuir 7：854-867(1991)进一步指出：(1)磺基甜菜碱系列的CMC从丙基向丁基变化时首先是增加，从丁基向己基变化时然后是降低，(2)羧基甜菜碱的CMC低于相应的磺基甜菜碱。有趣的是，Nandakumar T.N.et al.，J.Oil Tech. Assoc.India 11：31-34(1979)的数据与Weers，J.G.et al.，Langmuir 7：854-867(1991)的后一观点相矛盾：羧基甜菜碱的CMC高于相应的磺基甜菜碱。通过将C16羧乙基甜菜碱(8.3×10-5M：Lattes，A.et al.，Surfac-tants Soln.11：127-1139(1991)与C16-二氧磷乙基甜菜碱(4×10-5M：Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：149-183(1990)和C16-磺乙基甜菜碱(不可溶，Weers，J.G.et al.，Lang-muir 7：854-867(1991)Parris，N.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.53：97-100(1976)也报道了C16-磺乙基甜菜碱的Krafft点＞90℃)的CMC值进行比较可以看出CMC对阴离子部分的依赖性。明显地，与离子去垢剂比较，甜菜碱的表面活性和离子功能出现复杂的关系。事实上，矛盾的结果可能是由于这些分子对系统条件的极端敏感性。
以下方程式(Kevens，H.B.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.30：74-80(1953))描述了与链长有关的CMC的变化，其中A是同系物系列的常数，B是用于表示相同系列CMC对链长(m)的依赖性的第二常数：
               Log10C＝A-Bm
Shinoda(Shinoda，K.In：Colloidal Surfactants，Academic Press，New York(1963)pp.42-44)编辑了各种去垢剂的B值。一般来说，离子去垢剂的B值在log2(即，0.3)范围内，非离子去垢剂的在log3(即，0.5)范围内。Beckett，A.H.et al.，J.Pharm.Pharmacol.15：422-431(19630；Molyneux，P.et.al.，Trans.Faraday Soc.61：1043-1052(1965)和Lattes，A.et al.，Surfactants Soln.11：127-1139(1991)报道羧基甜菜碱同系物系列的B值约为log3的函数。Weers，J.G.et al.，Langmuir 7：854-867(1991)报道磺丙基甜菜碱系列的B值为0.48。
明显地，甜菜碱表现为阴离子，意思是CMC表现出比相应的离子同系物对烷基链长更强的依赖性。例如，甜菜碱的CMC在每增加两个碳时呈对数函数降低(这一点在Nandakumar T.N.et al.，J.oil Tech. Assoc.India 11：31-34(1979)的数据中可明显看出，Herrmann，K.W.J. Colloid Inter.Sci.22：352-359(1966)图式了离子去垢剂和甜菜碱之间的比较)。然而，如以上所讨论的，这一趋势在某种程度上受桥长和离子官能度的影响。例如，Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：394-399(1990)的烷基羟基-二氧磷乙基甜菜碱系列与Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：149-153(1990)的烷基-二氧磷乙基甜菜碱系列不表现出相同程度的依赖性。这些作者报道的B值分别为0.1025和0.025，说明甚至比其离子同系物对烷基链长有更低的依赖性。Tsubone，K.etal.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：149-153(1990)说明了二氧磷基甜菜碱的这一差别。这些结果表明在酸-碱特征和产生的两极运动之间存在一种关系。此外，显示了行为、结构和组成之间的复合关系。
对温度变化的反应也许是区分离子和非离子去垢剂最大的区别特征。例如,温度的增加引起离子去垢剂CMC的增加，而引起非离子去垢剂CMC的降低。Kuriyana，K.Kolloid-Z 180：55-64(1961)的工作比较了十二烷基硫酸钠和甲氧基-聚氧乙烯壬基醚，以清楚说明这一观点。甜菜碱遵循的规则是pH依赖性。Tsubone等已说明羟烷基-二氧磷基甜菜碱(Tsubone，K.et al.，J.Am.OilChem.Soc.67：149-153(1990)和二氧磷乙基甜菜碱(Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：149-153(1990)在pH11.0时表现为离子去垢剂，在pH6.0时表现为非离子去垢剂。在pH2.0时温度不影响CMC。因此，这表明，在低pH时某些甜菜碱行为不规则，在高pH时所有甜菜碱表现为阴离子去垢剂，有趣的是在中等pH时(此时存在两性离子)，甜菜碱表现为非离子形式：CMC随温度的增加而降低。
基于以上的讨论，可以预测胶束重量和聚集数对温度的反应。随温度的增加，离子去垢剂的胶束重量和聚集数略有降低(Naka-gawa，T.et al.，In：Colloidal Surfactants，AcadeMmic Predd，NewYork(1963)pp.123-126)。另一方面，非离子去垢剂的胶束重量和聚集数随温度的增加最后呈指数增加(参见Balmbra，R.R.et al.，Trans.Faraday Soc.58：1661-1667(1962)和Kuriyama，K.Kol-loid-Z 180：55-64(1961))。这一行为是非离子去垢剂的特征，并形成所称的浊点和上会溶质温度。
浊点是在出现混浊时观察到的，被认为是由非离子去垢剂的亲水部分的脱水作用由此导致溶解性还原而产生，应当注意，与Krafft温度相反，浊点不是很确定的温度。实质上仍存在胶束；然而随温度的增加胶束重量和聚集数逐渐增加。Nilsson，P.et al.，J.Phys.Chem.88：6357-6362(1984)已描述了磺基甜菜碱中的类似现象。这些相同的作者说明磺基甜菜碱在非常低的程度上表现出这一行为，而羧基甜菜碱简直缺乏这一行为。事实上，Bhatia，A.et al.，Colloids and Surfaces 69：2770292(1993)说明C18-羧甲基甜菜碱的胶束重量和聚集数随温度的增加而降低，这是离子去垢剂典型的反应。这些结果说明甜菜碱的离子/非离子行为可以通过适当地改变电荷(如，两极运动)来选择。
对存在电解质的反应的CMC的变化也能区分这些去垢剂。例如，电解质浓度的增加仅引起非离子去垢剂CMC的小的增加(Shin-oda，K.et al.，Bull.Chem.Soc.Japan 34：237-241(1961))。另一方面，当电解质的浓度出现类似的变化时，离子去垢剂表现出CMC的明显降低(Schwuger，V.M.J.Kolloid-Z 233：979-985(1969)。净结果是离子去垢剂的“盐析”。换句话说，当反离子的溶解性提高时，烷基部分的溶解性降低。因此，必须提高温度以提供烷基链混合所需的热能。这一现象也称作Krafft点提高(参见：例如Tattar，H.V.et al.，J.Phys.Chem.43：1173-1179(1940)；Tartar，H.V.etal.，J.Am.Chem.Soc.61：539-544(1939)；Nakayama，H.etal.，Bull.Chem.Soc.Japan 40：1797-1799(1967)；and Tsujii，K.et al.J.Phys.Chem.84：2287-2291(1980)for examples.)
大多数常用的非离子去垢剂具有低于0℃的Krafft点，因此不表现出这一行为。然而，随着亲水部分缩短，某些非离子去垢剂不显示出较低的会溶质边界。Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.65：979-981(1976)指出Brij56(十六烷基-聚氧乙烯氧化物(CE)：(CAS_No.9004-95-9)和Brij76(十八烷基-聚氧乙烯氧化物(CE)：(CAS_No.9004-00-9)可以盐析。然而，应当指出，Schott，H.et al.，J.Pharm.SCi.65：979-981(1976)观察到的盐析远不如Tartar，H.V.et al.，J.Phys.Chem.43：1173-1179(1940)观察到的显著。盐析非离子去垢剂的能力符合下列次序：SCN_＞I_＞NO3 _＞Cl_(阴离子)，Na_＞K_＞Li_(阳离子)(Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.65：979-981(1976))。
降低浊点的能力符合相反的次序(Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.64：658-664(1975)。事实上。Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.65：979-981(1976)指出，某些钠和钾的硝酸盐可以导致浊点和Krafft温度重叠(如，Brij56：十六烷基-聚氧乙烯氧化物(C16E10))从而引起“无定型胶”的形成。在电解质存在下这类去垢剂和其它去垢剂之间甜菜碱的行为也许最不相同。Tsujii，K.et al.，J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978)指出添加电解质C16和C18磺丙基甜菜碱可被“盐溶”(如，水合晶体的熔点降低)。Tsujii K.et al.，Yuka-gaku 30：495-499(1981)后来指出，这一现象直接与中间桥的长短有关：如果桥长大于4-5_，则甜菜碱是“盐溶型”的，而如果中间桥的长小于4_，则甜菜碱是“盐析型”的。Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.64：658-664(1975)指出，某些非离子去垢剂在提高浊点时可被盐溶。例如，在2M HCl溶液中Brij96(油基-聚氧乙烯氧化物(C18∶1E10)：(CAS_No.9004-08-2)的浊点提高到11.4℃。然而，这些温度的不同与甜菜碱观察到的相比是小的。例如，TsujiiK.et al.，J.Phys.Chem. 82：1610-1614(1978)指出SB-18的Krafft点在2mM去垢剂时在纯水中是73.4℃，在1M NaCl中是33.6℃(Δ＝39.8℃)。Tsujii，K.et al.，Yukagaku 30：495-499(1981)假设盐溶现象取决于两性离子头部基团和溶许这种现象发生的最小距离对离子的协调。
甜菜碱盐析的程度(对那些盐析型)比非离子去垢剂的盐析行为更显著，但不如从同系物离子观察到的显著(例如，比较Tsujii，K.et al.，J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978)的数据和Tsujii，K.et al.，Yukagaku 30：495-499(1981)的数据)。在不同盐存在下甜菜碱的盐溶行为符合经典的“感胶离子序”(Tsujii K.et al.，JPhys.chem.82：1610-1614(1978)。这就是说，某些离子在降低Krafft点上比其它离子有效。例如，Tsujii，K.et al.，J.phys.Chem.82：1610-1614(1978)指出，盐溶SB-18的能力符合下列次序：SCN_＞I_＞NO3 _＞Cl_(阴离子)，K_≈NH4 _＞Na_(阳离子)。然而，这一次序确实与盐析行为相反。例如，盐析C18-羧甲基甜菜碱的效果符合下列次序：SCN_＞I_＞NO3 _＞Cl_(Tsujii，K.et al.，Yukagaku 30：495-499(1981))。这与Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.65：979-981(1976)有关非离子行为的讨论相一致。
基于盐溶和盐析行为可以预测胶束重量和聚集数随电解质变化的变化。随着电解质浓度的增加，离子去垢剂的胶束重量和聚集数增力(Shinoda，K.，In：Colloidal Surfactants，Academic Press，NewYork(1963)pp.20-21综述了这方面的许多工作)。Becher(Bech-er，P.，In：Surfactant Seience Series，vol.4：Nonionic Detergents，Marcel Dekker，New York(1967)pp.500-504)综述了电解质对非离子去垢剂的胶束重量和聚集数的作用，并且得出结论，除了少数例外以外，大多数这些常数不受电解质浓度变化的影响。但是，已知电解质降低非离子去垢剂的浊点(Nakagawa，T，et al.，Colloidal Sur-factants，Academic Press，New York(1963)pp.129-135)。有趣的是注意到电解质对两种类型的去垢剂的作用是类似的，但相反：电解质提高两种去垢剂的Krafft温度(例如，晶体的熔点升高)，降低非离子去垢剂的浊点(例如，发生相分离的温度降低)。Bhatia，A.etal.，Colloidsand Surfaces 69：277-292(1993)指出，C18-羧甲基甜菜碱的胶束重量和聚集数随Na_离子浓度的增加而增加，但这种反应不如离子去垢剂中观察到的显著。
Shinoda，K.Conoidal Surfactants，Academic Press，New York(1963)pp.76-78综述了许多工作，说明离子和非离子去垢剂两者一般都是pH非依赖性的。这就是说，假定离子强度相同，这些去垢剂的相行为在不同的pH条件下是相同的(例如，如以上讨论的，任何与pH相关的变化一般能归结于离子强度的变化)。
然而，甜菜碱的行为对pH有极大的依赖性。Nandakumar T.N.et al.，J.Oil Tech.Assoc.India 11：31-34(1979)指出羧甲基甜菜碱和磺基甜菜碱的几个与表面活性有关的参数是pH依赖性的。Tsubon等已阐明羟烷基-二氧磷基甜菜碱(Tsubon，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：394-399(1990)和二氧磷基甜菜碱(Tsubon，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：394-399(1990)在不同pH值时也表现出相反的特征。然而，必须明白，即使是那些盐溶的去垢剂，高pH(例如甜菜碱用作离子去垢剂)和高盐结合将产生甜菜碱的盐溶。Tsubon，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：149-153(1990)指出Cn-羧基甜菜碱较低的pKa值落在4.7-4.9的范围内，较高的pKa值落在8.8-9.8的范围内。Weer，J.G.etal.，Langmuir 7：854-867(1991)阐述了具有各种桥长程度的C12-羧基甜菜碱的较低的pKa值。随着桥长的增加，较低pKa增大。因此，在使用甜菜碱时，系统pH是要考虑的重要因素。总之，对甜菜碱中采用的电荷的组合以及桥长和结构二者pH依赖性或许会发生。在碱性很强的条件下使用本发明方法的甜菜碱是不行的(例如，在pH14时甜菜碱沉淀)，而在酸性很强的条件下使用本发明方法的甜菜碱却似乎没有相同的限制。
有关桥结构和其修饰还有另外一点，它涉及这些分子的使用。Parris，N.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.53：60--63(1976)比较了磺丙基甜菜碱和相应的羟丙基甜菜碱的Krafft温度，并说明进行这一修饰显著提高Krafft点。产生“异”形的桥支链甚至具有更显著的效果(Parris，N.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.53：60-63(1976))。因此，对桥结构和系统电解质的选择可以影响这些分子进一步在本发明方法中的应用。
甜菜碱独有的特征似乎是由相反电荷的结构排列产生的两极运动(Laughlin，R.G.Langmuir 7：842-847(1991))。人们相信这种排列给出以产生几种有用的水相属性的方式调节水/离子结构。表3描述了各种明显的类甜菜碱结构，表3的讨论列出了这类分子的许多例子。它们包括“反向甜菜碱”、类胺氧化物去垢剂、c-烷基甜菜碱和咪唑啉甜菜碱衍生物。由于这些分子中固有的由类甜菜碱结构产生的强烈的两极运动，可以预计反向甜菜碱、类胺氧化物去垢剂、c-烷基甜菜碱和咪唑啉甜菜碱衍生物在本发明的方法中具有类似的用途。这些分子的性质在以下有关本文所述甜菜碱的性质中讨论。
Zimmer，R.E.(U.S.3,560,393)描述了各种掺入了磷酸基、亚磷酸基、次磷酸基以及铵和锍功能基的反向甜菜碱的合成。Kurosaki，T.et.al.，Chem.Soc.Japan 11：1297-1301(1990)确定了烷基2-羟基-3-三己基ammonio丙基磷酸酯(Cn-AHTMAP)类型的反向甜菜碱的特征。Cn-AHTMAP化合物表现出具有类似于相应的甜菜碱的CMC值和0.368的B-值，表明CMC对烷基链长的依赖性比非离子去垢剂更接近离子去垢剂。然而，需再次指出，Tsubone等(Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem. Soc.67：394-399(1990)和Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：394-399(1990))的二氧磷基甜菜碱系列的B-值在特征上比相应的离子去垢剂显得更具离子性。可惜不存在反向甜菜碱pH依赖性的数据。
胺氧化物(AO)在电荷结构上非常类似甜菜碱；而桥被最小化为共价键N-O键。在分析中间桥长度和盐溶/盐析行为的关系中，Tsujii，K.et al.，Yukagaku 30：495-499(1981)的研究中也包括C18-AO。这些作者指出C18-AO行为平行于羧甲基甜菜碱行为，但Krafft点提高更多。C18-AO(Tsujii，K.et al.，Yukagaku 30：495-499(1981))的盐析行为和N，N，N-三甲基十八烷基铵氯化物(Tsujii，K.et al.，Phys.Chem.82：1610-1614(1978)的盐析行为的比较说明，前者的行为比相应的阳离子去垢剂更类似甜菜碱。人们可以推测，类甜类碱结构的所有重要的两极运动特征在胺氧化物中是功能性的。Fumikatsu，T.et al.，Phys.Chem.70：3437--3441(1966)对胺氧化物的进一步研究说明这类去垢剂的相行为是pH依赖性的，Hermann，K.W.J.Colloid Inter.Sci.22：352-359(1966)指出，CMC值、B-值和胶束性质比相应的离子去垢剂与甜菜碱更密切相关。Hermann，K.W.J.Colloid Inter.Sci.22：352-359(1966)的数据甚至说明胺氧化物比相应的甜菜碱更具有非离子性。McCutcheon’s，Volume 1：Emulsifiers&Detergents，North Ameri-can Edition，MC Publishing，Gen Rock，NJ，p.290将胺氧化物列为不同的类别。
有关c-烷基甜菜碱性质的大量信息出现在Tori和其合作者的一系列论文中(Tori，K.et al.，Kolloid-Z.Z.Polymere 187：44-51(1963)；Tori，K.et al.，Kolloid-Z.Z.Polymere 188：47-52(1963)；Tori，K.et al.，Kolloid-Z.Z.Polymere 189：50-55(1963)；Tori，K.et al.，Kolloid-Z.Z.Polymerer 191：42-48(1963)；and Tori，K.et al.，Kolloid-Z.Z.Polymere 191：48-52(1963))。
这里再一次地看出，这些分子的相行为与表2中讨论的n-烷基甜菜碱的类似。例如，如预期的，盐析行为类似短桥甜菜碱(盐析不如离子同系物中观察到的显著)(Tori，K.et al.，Kollkid-Z.Z.Polymere189：50-55(1963))。此外，c-烷基甜菜碱的CMC值随温度的提高而降低(非离子去垢剂的标志行为)。此外，Molyneux，P.et al.，Trans.Faraday Soc.61：1043-1052(1965)将其CMC对n-烷基甜菜碱的烷基链长数据(用类似于Beckett，A.H.et al.，J.Pharm.Pharmacol.15：422-431(1963)的n-烷基甜菜碱数据)作图，与Tori，K.et al.，Kollkid-Z.Z.Polymere 189：50-55(1963)的c-烷基甜菜碱数据比较，并指出n-烷基甜菜碱和c-烷基甜菜碱的B-值如所预期的是相同的。而c-烷基甜菜碱还未达到与n-烷基甜菜碱相同的流行程度，它们是市售的：c-烷基甜菜碱类中可见的品种仅是n-烷基甜菜碱类的一部分。
在临床试验(如，含水的、含溶液的电解质)中以功能形式(如以胶束形式)提供去垢剂的能力在本发明的方法中似乎是甜菜碱功能的一个重要方面。因此，可以看出电荷(如，COO_vs.SO3 _)和桥结构(如，-CH2-vs.-(CH2)3--CH2CH(OH)CH2-)的选择在产生甜菜碱行为中起着重要的作用。然而，盐溶(盐析)现象仅在去垢剂的Krafft温度超过(低于)系统温度时才相关。例如，如果系统温度是40℃，SB-18的Krafft温度是88℃(Parris，N.et al.，J.Am.Oil Tech.Soc.53：97-100(1976))，加入10mM NaCl后，Krafft温度变成37.5℃(Tsujii，K.et al.，J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978)，接着SB-18有效地盐溶。另一方面，如果系统温度是40℃，Krafft温度(如十二烷基磺酸钠的Krafft温度)是31.5℃(Tar-tar，H.V.et al.，J.Am.Chem.Soc.61：539-544(1939))，加入8mM NaCl后，Krafft温度变成34℃(Tartar，H.V.et al.，J.Am.Chem.Soc.43：1173-1179(1940))，此时十二烷基磺酸钠技术性盐析，对本文描述的实施例无效。此外，十四烷基磺酸钠的同类温度分别为39.5℃(Tartar，H.V.et al.，J.Am.Chem.Soc.61：539-544(1939))和43℃(Tartar，H.V.et al.，J.Am.Chem.Soc.43：1173-1179(1940))。很明显，在这一实施例所描述的条件下，十四烷基磺酸钠会是非功能性的。Tartar，H.V.et al.，J.Am.Chem.Soc.61：539-544(1939)也报道了十八烷基磺酸钠的所述临界温度在水中为57℃。考虑到这一点，应当强调，当在本发明的方法中使用SB-18作为去垢剂时，保持系统温度超过37℃是至关重要的。因此，必须将完成处理的温度和方法中使用的类SB-18去垢剂的Krafft温度结合起来仔细考虑。
明显的结论是，甜菜碱独特的特征使得在临床试验中可采用更长的烷基链(它具有有吸引力的加溶特征)。用作增溶剂的甜菜碱
增溶即是把在水状介质中不溶的或溶解很少的分子转变成溶解状态分子的作用(Nakagawa，T.，In：Nonionic Detergents，(1967)pp.558-603)。理论上讲，增溶通过三种模式之一起作用。首先，增溶剂可以渗入到分子团的内部(如，非极性的化合物)。第二，在某种程度上既为极性又为非极性的亲水脂分子可能以类似于其他去垢剂分子的方式与分子团相联系(例如，非极性部分渗入到分子团的核心内，而极性部分与分子团的表面相连)。第三个机制是用那些子有机溶剂和水中都不溶解的化合物而产生的。二甲基邻苯为一个经典的例子(McBain，J.W.et al.，J.Am.Chem.Soc.70：3838-3840(1948)).在该模式中，提出了分子被吸附于分子团的表面。因此，直观上增溶行为依赖于去垢剂和增溶剂的性质。
McBain，J.W.et al.，J.Bhys.Chem.55：655-662(1951)通过月桂酸钾，十二烷胺氢氯化物，和Triton X-100比较了n-己烷，环己烷，环己烯，和苯的增溶作用，并认为离子去垢剂最大强度地增加环己烷的溶解度，而Triton X-100最大强度地增加苯的溶解度。当在功能水平上分析时，离子去垢剂和非离子去垢剂如预期的一样表现不同。
Weers，J.G.et al.，Langmuir 7：854-867(1991)把阴离子去垢剂(SDS：CAS_No.151-21-3)，阳离子去垢剂(C12-三甲基铵溴化物：CAS_No.1119-94-4)，非离子去垢剂(C12-乙烯氧化物(C12E6)：CAS_No.3055-96-7)与C12-羧甲基甜菜碱(CAS_No.683-10-3)和C12-磺丙基甜菜碱(CAS_No.14933-08-5)甜菜碱相比较提供了唯一的控制性增溶研究。“油蓝A”被用作增溶剂。这些作者表明了以下列顺序增加的增溶能力：阴离子＜阳离子＜羧基甜菜碱＜磺基甜菜碱＜非离子。
根据以上McBain，J.W.et al.，J.Phys.Chem.研究工作的讨论，假定油蓝A为熔化的多环碳水化合物(一个蒽的衍生物：1，4-双(1-甲基乙基)-9，10-蒽二酮(CAS_No.14233-37-5)，预期将有这种等级的增溶能力。磺基甜菜碱比羧基甜菜碱对油蓝A的增溶作用更强。这与上述描述相对于磺基甜菜碱的羧基甜菜碱的行为的讨论是一致的：当与磺基甜菜碱相比时羧基甜菜甜似乎倾向于离子行为；或者，当与羧基甜菜碱相比较时，磺基甜菜碱则倾向于非离子去垢剂。
烷基链长度与增溶能力直接相关。例如，C18-去垢剂相对于C12-去垢剂，具有很好的增溶特性，甚至是相对于其他类型中的C12-去垢剂：Weers，J.G.et al.，Langmuir 7：854-867(1991)也表明随着烷基链长度的增加，“最大加成浓度”呈指数级增加。例如，当C12-乙烯氧化物(C12E6)比C12-磺丙基甜菜碱对油蓝A的增溶作用稍大一些时，C14-磺丙基甜菜碱对油蓝A的增溶作用是C12-乙烯氧化物(C12E6)的4至5倍多(Weer，J.G.et al.，Langmuir 7：854-867(1991))。
去垢性的概念是增溶现象研究内固有的。最适去垢性需要具有表面活性性质的复杂的混合物(Harris，J.C.，In：Surfactant ScienceSeries，voll：Nonionic Detergents，(1964)pp.683-732评论了这些性质。)去垢性的一个关键方面是一旦某种东西被溶解，它必须以一种分散形式被维持。
甜菜碱具有极好的分散特性(Weil，J.K.et al.，J.Am.OilChem.Soc.53：757-761(1976))。Fernley，G.W.et al.，J.Am.OilChem.Soc.55：98-103(1978)对甜菜碱用作清洁剂进行了评论，并把它们与烷基磺酸去垢剂进行了有益的比较。然而，本发明方法中的增溶剂是与分枝杆菌细胞壁相关的脂类和脂蛋白。
分枝杆菌的细胞壁结构(参见：Mc Neil，M.R.et al.，Res Mi-crobiol.142：451-463(1991)的综述，主要由脂类脂蛋白和分枝菌酸组成，其壁极厚且具疏水性。当注视分枝菌酸时，每个分枝菌酸具有几种大约C14-20(Σ＝C76-C80)的链，并且细胞壁单位是作为一个二分枝菌酸被分离出的(Noll，H.et al.，Biochim.Biophys.Acta20：299-309(1956))。假设分枝菌酸的结构，增溶作用的第二个模式预期是可以使用的(如，非极性部分被隔绝在分子团的核心内，而极性部分与分子团的表面相连)。根据以上讨论，预计离子去垢剂将是比非离子去垢剂更好的分枝菌酸的增溶剂。因此，必须剥去周围部分相联的细胞壁成分，并保持在溶液中以便分散结核分枝杆菌。Young，D.B.et al.，Res Microbiol.142：55-65(1991))表明TritonX-100(CAS_No.9002-93-1)可以去掉结核分枝杆菌的脂蛋白，然而，图3说明该去垢剂不能分散细菌。因此，长链甜菜碱比TrtionX-100预期将是分枝菌酸更好的增溶剂。假使分枝菌酸具有庞大的体积及复杂的结构，把它们保存在溶液中也将是成问题的。换句话说，当与S-18相比较时，SB-12除了是一个相对较差的增溶剂外，也不能把分枝菌酸维持在分散状态。例如，Bhatia，A.et al.，Colloids and Surfaces 69：277-292(1993)详细比较了C12，C16和C18-羧甲基甜菜碱的分子团结构。C12-甜菜碱分子团的水动力半径为19±2_，而C16和C18-甜菜碱的分子团结构为杆状且依赖于表面活性剂和电解质的浓度而变化：在1.0M NaCl中于25℃时，C16-甜菜碱分子团的持久长度为600±100_，而在0.01M NaCl中于40.3℃时，C18-甜菜碱分子团的持久长度为1400±200_。考虑到C12-甜菜碱延伸的链长度为23_(Bhatia，A.et al.，Colloids andSurfaces 69：277-292(1993)，且进一步考虑到分枝菌酸的疏水性质，较短链的表面活性剂不能简单地保持增溶的分枝菌酸于溶液中的可能性将解释较短的SB-系列去垢剂不能分散结核分枝杆菌。概要：用作去垢剂的甜菜碱
甜菜碱具有独特的性质，该特性把它们置于到一类性质截然不同的去垢剂类型中，但该类型似乎介于离子和非离子类型之间。其行为非常复杂且依赖于桥的结构和两性离子种类。在某些情况下，甜菜碱的表现象离子去垢剂，在其他情况下，甜菜碱的表现又象非离子去垢剂。因此，阴离子和桥长度的选择对其实用性有深刻的影响。
例如，总的溶解度特征与主要基团的亲水性直接相关。主要基团又反过来依赖于阴离子。由于不同阴离子主要基团的亲水性遵循该顺序：SO4 _＜SO3 _《CO2 _(Laughlin，R.G.，In Advances in Liq-uid Crystals，Brown，G.H.，ed.Academic Press，New York(1978)pp.41-148)，预期羧基甜菜碱比磺基甜菜碱可溶性性更大，而磺酰甜菜碱又比硫酸根合甜菜碱的可溶性更大。Nandakumar T.N.etal.，J.Oil Tech.Assoc.India 11：31-34(1979)和Weers，J.G.etal.，Langmuir 7：854-867(1991)的数据把具有不同烷基链长度的羧基甜菜碱与类似链长度的磺酰甜菜碱的的Krafft温度进行了比较，明确地表明了这种情况。对Parris，N.et al.，J.Am.Tech.Soc.53：97-100(1976)的数据进行考查，其中把磺基甜菜碱与硫酸根合甜菜碱作相似的比较，证实了这一结论。包括桥的长度的数据表明具有单个亚甲基桥的那些甜菜碱将被盐析出，与离子行为表现相似；而具有较长的桥的甜菜碱将被盐溶。例如，羧丙基甜菜碱比类似烷基链长的羧甲基甜菜碱预期有更大的可溶性。还有，Tsujii，K.et al.，YuKaKagu 30：495-499(1981)也表明前者为盐析，而后者为盐溶。向桥上引进一些基团似乎干扰了甜菜碱的可溶性，从而使有吸引力的特征被破坏：羟丙基和“异”甜菜碱具有不太理想的特征(Parris，N.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.53：60-63(1976))。较短的桥可能已经扩大了操作上的pH范围(werr，J.G.et al.，Lang-muir 7：854-867(1991))。羧基甜菜碱和磺基甜菜碱具有与非离子去垢剂相似的B-值，而二氧磷基甜菜碱的B-值与离子去垢剂相似。硫酸根合甜菜碱表现了一种更高的会溶质温度，而羧基甜菜碱的分子团的分子量和聚集数量实际上随着温度的增加而减少，与离子的行为表现相似。然而，在考虑到烷基结构时，所有的去垢剂预期表现完全相同。例如，在烷基链中引入结构的改变，假若它们是一个或几个双健，象羟基，酯基，酰氨基或醚基的极性基团，或如引入环丙烷的其他的修饰都将预期在性质上产生合理的变化。假使在结构上有较宽的变化，与类甜菜碱结构已知的物理特征一起，在本发明的方法中设计一个供使用的具有理想特征的甜菜碱已成为可能。例如，羧基甜菜碱尽管对pH有较高程度的依赖性，但它产生更多可溶的甜菜碱，因此将允许使用较长的烷基链。此外，倾向于离子行为的羧基甜菜碱将预期在甜菜碱中是分枝菌酸更好的增溶剂。桥必须长于4-5_，因此，丙基将是最低限度的。Hodge，D.J.et al.，Langmuir7：878-884(1991)报道了具有20℃的Krafft总的C20-羧己基甜菜碱。C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)预期将具有最适的特征。
总之，需要较长的烷基链分散结核分枝杆菌，且这些分子必须在生理相关条件下(如，约100-150mM的电解质浓度)起作用。在本发明的方法中，甜菜碱比离子去垢剂具有的明显优势正在于：甜菜碱是盐溶的，离子去垢剂是盐析的。尽管对甜菜碱优于离子去垢剂的解释更具有推测性，但总体说来，甜菜碱比非离子去垢剂是分枝菌酸和涉及菌索形成的其他脂类的更好的增溶剂。
虽然这些争论实事上确实对SB-18为什么是聚集试验中唯一起作用的去垢剂提出了解释，但它们没有完全地解释SB-18的双作用模式：即为什么SB-18也促进鸟分枝杆菌的回收(其中聚集并不是一个难题)。下面将讨论这一问题。分枝杆菌的浮力
分枝杆菌对脂类的合成是一个非常复杂且又广泛的主题，具有很多种特异性的独特之处(综述参见：Bloch，K.Adv.Enzymol.45：1-84(1977)，MinniKin，D.E.，in：The Biology of the Mycobacteri-a，C.Ratledge et al.，eds.，vol.1，Academic Press，New York，1982，pp.95-184；Ratledge，C.in：The Biology of the Mycobacteri-a，C.Ratledge et al.，eds.，vol.1，Academic Ptess，New York，1982.pp.53-92 and Takayama，K.et al.，in：The Mycobacteria asource book，Part A.，G.P.Kubica et al.，eds.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1984，pp.315-344)。然而，大体上约有60％的细胞壁为脂类，并且细胞壁中约有50％的脂类为分枝菌酸形式(JoKlik，W.k.et al.，Zinsser Microbiology，20th Cdition，Appelton&Lange，Nor walk，CT，1992，pp.81 and 499)。
分枝菌酸赋予这类微生物独特的性质(参见Ratledge，in：TheBiology of the Mycobacteria，C.Ratledge et al.，vol.1，AcadmicPress，New York，1982，pp.53-92和尤其是pp65-84页对分枝菌酸的合成作了详细的描述)。
分枝菌酸合成的结果是由于合成分析菌酸活体内产生大量的CO2。例如，通过丙二酰CoA途径含有80个碳原子的分枝菌酸残基的合成将产生大约80个CO2分子。
这里有几个要点。首先，在活体内，分枝杆菌的细胞壁比其体外的要厚(Rastogi，N.et al.，Antimicrob.Agents Chemother.20：666-677(1981))。第二，分枝杆菌细胞干重(在油酸，吐温80或BSA不存在条件下生长)的大约18％，为脂类(Stinson，M.W.etal.，Am.Rev.Resp.Dis.104：717-727，(1971))，在活体内细胞壁的大约60％为复杂的脂类，其中的50％为分枝菌酸(Joklik，W.K.et al.，Zinsser Microbiology，20th edition，Appelton&Lange，Nor-walk，CT，1992，pp.81，499 and 503)，因此，在细胞壁合成过程中分枝菌酸产生大量的CO2本质上，在含有油酸，吐温80和BSA的富集培养基中生长的纯效果将使脂类的合成减少，从而实质上减少了CO2的产生。最后，在离心中未处理的细胞具有浮力的事实表明任何涉及分离气体的浮力理论使消除经典的“气体空泡”成为一种可能。这使发明者产生这种想法：微生物可通过简单地除气以减少或消去浮力。例如，如以下描述的，在真空下稍微温热分枝杆菌(菌索因子融点(MP)＝43℃-45℃(Noll，H.et al.，Biochim.Biophys.Acta 20：299-309(1956))，即可能除去影响浮力的足够多的潜伏的CO2。MAC复合有机体的制备
对于某些象那些MAC复合体的微生物，一个进一步的处理步骤，即在大约600mmHg的真空下，于一个升高的温度，如40℃和充分的时间内培养是必需的。为了分散的目的，对MAC有机体样品置于含去垢剂的洗涤溶液中没有最低时间限制，因为效果几乎是瞬间产生的，但一般60分钟为优选，它使得去垢剂积累以使浮力被抵消。把样品置于洗液中超过60分钟被认为只有勉强的优势。这种真空除气步骤的时间应该至少为20分钟，60分钟为优选。当使用类SB-18去垢剂时，多达几小时的培养比60分钟的培养只能提供稍微的改善。然而，多达几小时的培养允许使用多数去垢剂。把MAC有机体置于含去垢剂的洗液中可与除气步骤同时进行，然而，使用这一方案时可能有操作上安全考虑。除气步骤的温度应该在30℃至50℃之间，优选地为40℃到42℃。低于30℃的温度可能不利于对MAC有机体的蜡质衣壳的软化；高于50℃的温度明显地促进了有机体的裂解。所以，由于生存力是本文描述的方法的主要优点，而且因为只有当细菌细胞是完整的时，该方法才赋予通过离心提高回收效率方面的优点，对本文描述的多数微生物处理温度不应该超过50℃，但是如果该温度并不裂解正在检测的特异种类，则可以使用高于50℃以上的温度。然而，这可以用来提供期望的结果。例如，在规定的处理条件下可选择一个已知可裂解某种微生物的温度，但在同样规定的处理条件下，已知该温度不能裂解第二种微生物。在这种例子中，本发明的方法将选择性地浓缩没有裂解的微生物。
勿需下列解释的支持，相信观察到的MTB复合体和MAC复合体之间的差异是由于其各自的生长特性引起的。在MAC复合有机体中，这些有机体主要以单细胞生长，类SB-18的去垢剂有三种效果：(1)用多数去垢剂时观察到的总表面张力被破坏的效果，(2)观察到的对MTB复合有机体的分散效果(虽然只有相对较小的强制性)和(3)能被跨膜运输和于细胞中积累的能力。
Weir，M.P.et al.，Am.Rev.Res.Dis.，106：450-457(1972)已表明分枝杆菌非常有效地主动积累脂类，例如油酸。Schaefer，W.B.et al.，J.Bacteriol.90：1438-1447(1965)证实在2小时内可观察到脂类的积累，在24小时内可观察到非常明显的脂质体的形成。与以前的认识相反(Silverstolpe，L.，Nord.Med.40/48：2220-2222(1948)；Daris，B.D.et al.，Microbiology，Harper&Row，New York(1973)，p.847)，脂类积累的后果可能以足以部分抵消自然浮力的有效方式改变细胞的部分比容。
勿需以下解释的支持，相信真空除气步骤可有效地去除潜伏性气体(如CO2)，它是因微生物自然代谢形成的，但又某种程度地潜伏在其外层蜡质的细胞壁中。权威性的理论是基于该观察：即在不添加去垢剂时可观察到勉强的但又辨别得出的对回收率的提高，如果对有机体进行广泛的除气处理，则可使用任何去垢剂。通过结合去垢剂与除气处理克服浮力，发现可进一步通过重力方法(如本文讨论的离心)促进收集。
当有机体被彻底地除气时，可以利用不同于类SB-18、类rod或近似十八烷基去垢剂，这一事实表明MAC复合有机体的自然浮力最可能源于潜伏性气体。勿需下列解释的支持，相信一旦MAC复合有机体的自然浮力被完全消除，表面张力便是唯一剩余的使微生物漂浮的因素。因为大多数去垢剂是表面张力的去除剂，通过离心可以迫使许多其他的去垢剂提高回收率。然而，在真空下延长温育使有机体的生存力遭到破坏。
真空压力较方便的为600mmHg，因为一般商业上可利用的经济的真空泵属于此类。但是，熟练的技术人员可以使用任何压力或方法，该方法可足以获得显示微生物对含类十八烷基成分的去垢剂的易感性的理想结果。用去垢剂(如SB-18)洗涤后，若有必要经过一次除气步骤之后，通过本领域中已知的方法(如离心)对样品中的微生物进行收集和溶解，若有必要，可作进一步的分析，如通过扩增检测核酸。并非所有的检测方法都需要对微生物进行溶解。例如，通过培养检测或用免疫试验对膜的抗原检测不需要细胞溶解。因为本发明的方法并不见有溶解作用，在用本发明的任何一种去垢剂处理后通过诸如扩增技术或培养可以检测在外层膜中具有分枝菌酸的微生物，尤其是分枝杆菌。去污剂的积累
勿需以下解释的支持，去垢剂的积累解释了类SB-18活性的一面。为了重申除气假说的基础，如果在吐温80(CAS_ No.9005-65-6)/油酸(CAS_No.112-80-l存在时培养分枝杆菌导致浸没生长(Dubos，R.J.Exp.Biol.Med.58：361-362(1945))，并且在吐温80/油酸存在时分枝杆菌的生长导致脂质体的形成(Schaefer，W.B.et al.，J.Bacterid.90：1438-1447(1965))，那么人们可以得出结论：与以前的认识相反(Silverstolpe.L.，Nord.Med.40/48：2220-2222(1948)；Davies，B.D.et al.，Microbiology，Harper&Row，New York(1973)，p.847)，脂质体的形成与浸没生长有关，并且可以想象甚至是其浸没生长的原因。而且，该结论必定是：对这些有机体自然浮力来源的解释直到现在才得以承认。可相信的是，与吐温80/油酸相类似的甜菜碱以这种方式出现在细胞中：即它们退隐到细胞内，并且以此改变了细胞的部分比容，部分地抵消了这些有机体的自然浮力，从而通过离心提高回收率。甜菜碱长期以来一直用作去垢剂(Gomi，T.，JP 8895298 A2；JP 6395298)、抗腐蚀剂(Nemcova，J.etal.，CS 202494.B)和洗牙水剂(Oshino，K.et al.，JP 92134025 A2；JP04134025)的商业抗细菌制剂中的成分的事实表明它们的确进入微生物细胞内。龟分枝杆菌细胞壁的通透性比大肠杆菌低1,000X到10,000X(Jarlier，V.et al.，J.Bacteriol.172：1418-1423(1990))，这-事实表明甜菜碱性质的某些方面使这些化合物优先隐退。
一个分子为了进入一个微生物细胞，它必须首先通过细壁(外层膜)，然后再通过细胞膜(内层膜)。Nikaido，H.et al.，Microbiol.Rev.49：1-32(1985)评述了微生物细胞的通透性，Connell，N.D.et al.，In Tuberculosis：Pathogenesis，Protoction，and Control，B.R.Bloom，ed.，American Society for Microbiology，Washigton，D.C.(1994)pp.333-352评述了分枝杆菌细胞的通透性。一般地，一个分子有三种方式穿过外层膜。首先是通过“亲水途径”通常涉及孔蛋白；第二是通过“疏水途径”，经常涉及通过疏水结构域的扩散作用，第三被称为“自我-促进途径”，或通过因子破坏细胞壁以允许分子自身进入细胞(从Hancock，R.E.W.Ann.Rev.Microbiol.38：237-264(1984)总结)。一旦穿过细胞壁，则载体介导的运输是穿过内膜最普通的方式。两个普通类型的载体一介导的运输是：“促进扩散”和“主动运输”。两者都使用特定的蛋白质复合体，具有某种程度的底物特异性和Michaelis-Menten特征。某些是能量依赖型，而其他则依赖于电化学梯度。总之，分枝杆菌的细胞壁展示了一个屏障的极端例子，该屏障必须为分子与胞外介质的交换提供某种机制。
在本发明的方法中必须记住正在讨论的时间框架。例如，大多数检查一个特定化合物的杀菌或制菌活性的研究是在上述分子存在时在延长的时间期限内(如，天数)培养细菌。记录在这一时间期限内的生长情况并报道功效。在本发明的方法中讨论的时间框架限于几小时。因此，牵涉到诸如疏水途径或自我-促进途径的机制似乎是不合理的。
因此，甜菜碱穿过外层膜的途径应该主要使用亲水途径(如，孔蛋白)。孔蛋白“……是产生非特异性的，开着的，充满水的，容许小分子穿过膜的扩散的通道的一些蛋白质。”(引自：Connell，N.D.etal，.In：Tuberculosis：Pathogenesis，Protection，and Control，B.R.Bloom，ed.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994)pp.336)。Trias，J.V.et al，.Science 258：1479-1481(1992)报道了龟分枝杆菌的孔蛋白为59KD的蛋白质，它可产生直径约为2.2nm的小孔，及介于2,000到3,000道尔顿的排斥极限。SB-18(CAS_No.13177-41-8)的分子量为419.7道尔顿。此外，Tsubone，K.，J.Am Oil Chem.Soc.67：149-153(1990)，和Tsubone，K.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：394-399(1990)分别研究了几个N-烷基-二氧磷乙基甜菜碱和几个2-羟烷基-二氧磷乙基甜菜碱，分别报道了C16-甜菜碱和C18-甜菜碱每个分子占有的面积为0.475nm2和0.761nm2。因此，甜菜碱头部基团的横截面直径分别为约7.8_和9.8_。Bhatia，A.et al.，Colloids surf.69：277-292(1993)测到的C18-羧基甜菜碱(CAS_No.820-66-6)头部基团的面积为180_，该主要基团的直径为7.7_。为了比较，SDS(CAS_No.151-21-3)头部基团的直径与7.5_相似(Shino-da，K.J.Phys.Chem.59：432-435(1955))。非离子去垢剂，例如吐温80(油酰聚氧乙烯(n＝20)山梨聚糖：CAS_No.9005-65-6)预期将有很大的头部基团直径，因此可能在空间上被阻止轻易地通过孔蛋白。为了支持这一看法，Wayne，L.G.et al.，Am.Rev.Re-sp.Dis.90：588-597(1964)表明某些分枝杆菌具有水解吐温80的能力，那些不能水解吐温的分枝杆菌，通过加入这种去垢剂不能刺激其生长。这说明在吸收之前必须去掉头部基团。
本文表明了使用某些非离子去垢剂可提高回收率。例如，虽然吐温80的主要基团太大此改不能通过孔蛋白，但其他的去污剂，如在本发明的方法中有用的线性脂肪酸的多氧聚乙烯醚(例，“Brij”化合物)被相信以这种方式出现：即可通过细胞和在本发明的方法中起作用。Hsiao，L.et al.，J.Phys.Chem.60：657-660(1956)表明每个聚氧乙烯苯基醚分子的面积与甜菜碱的面积为同一数量级(例如，平均为9.5POE单位的C9-将具有55_2的面积)。这里正要说明的是，Brij96(油酰-聚氧乙烯醚(C18∶1E10)；CAS_No.9004-98-2)虽然在分散结核分枝杆菌的结块方面效率相对较低，但在抵消浮力方面却具有类SB-18活性。勿需下列解释的支持，Brij96之类的非离子去垢剂由于其相似的化学形态，在本发明的方法中具有功能。也就是说，Brij96与类SB-18的去垢剂相似，因为它具有同样的“类rod”特性，在空间上不妨碍它进入细胞。因此，本文使用的“类rod”指在本发明的方法中在不除气的情况下显示类SB-18活性的非离子去垢剂。类rod去污剂将具有相似的“轴比”。按McGraw-HillDictionary of Scientific and Technical Terms，5th ed.，ParKer，S.P.，ed.McGraw-Hill，Washington，D.C.(1994)，p.168的定义，轴比为：“主轴与次轴的比例……”例如，Bhatia，A.et al.，Colloidsand Surfaces 69：277-292(1993)测得C12-羧甲基甜菜碱延伸的链长(例如，主轴)为23_，羧甲基甜菜碱头部基团的体积为大约180_3。假设头部基团为一个球面，头部基团的直径(如，次轴)将大约为7.7_。按定义，主轴与次轴重直。因此，C12-羧甲基甜菜碱(CAS_No.683-10-3)的轴比大约为3(23÷7.7＝2.99)。Tsub-one，K.J.Am Oil.Chem.Soc.67：394-399(1990)报道2-羟烷基二氧磷乙基甜菜碱占据的头部基团的面积为0.761nm2。这些甜菜碱的次轴为9.8_，C12-甜菜碱(CAS_No.124591-53-3)轴比值为2.3。因此，甜菜碱轴比将预期从1.5(对主轴(R1)含有8个碳原子的去垢剂)到大约6(对疏水结构域近似为22个碳原子的去垢剂)。类rod去污剂将包括具有一个烷基链长8-22个碳原子优选为12-20个碳原子，最优选为16-18个碳原子的所有电中性去垢剂，在不除气时它们均表现出类SB-18活性。近似十八烷基去垢剂
已经发现，某些去污剂虽然在分散MTB结块方面无效，但一旦对有机体进行除气通过离心便可进一步提高MAC的回收。例如，经过以上讨论的真空处理后，可使用许多其他的去垢剂，尤其是那些在结构上近似十八烷基的去污剂。也就是说，在除气之后，SB-16和SB-18变得更为有效地促进回收。例如，溴化三甲基十八烷基-铵(TMA-18：CAS_No.1120-02-1)和氯化苯甲基二甲基十八烷基铵(Benz DMA-18)现在发现在进行除气处理后用本发明的方法在提高收集方面具有某种程度的功效。吐温80(CAS_No.9005-65-6)和Span 80(CAS_ No.1338-43-8)之类的非离子十八烷基去垢剂，在除气之后也发现表现同样的现象。一旦去除潜伏的气体，近似十八烷基的分子便通过改变上述讨论的细胞的部分比容促进收集。
因此，本文使用的“近似十八烷基”是指具有与类SB-18十八烷基部分相似的一个类十八烷基部分，并且不需要两性离子功能的存在即可产生效果的去垢剂分子。近似十八烷基去垢剂当应用于MAC复合体时在本发明的方法中有用。并非所有的近似十八烷基去污剂都为类SB-18去垢剂，但所有的类SB-18去污剂都为近似十八烷基去垢剂。类SB-18去污剂是那些当应用于MTB复合体时在本发明的方法中有用处的去垢剂(即，在不需要除气时)。
阴离子去垢剂(如十二烷基硫酸钠(SDS：CAS_No.151-21-3)或十八烷硫酸钠(SOS)：CAS_No.1120-04-3)或阴离子的烷基-三甲基铵盐(如，TMA-12(CAS_No.1119-94-4)和TMA-18(CAS_No.1120-02-1)不能以类似于SB-18的方式起作用可作如下解释。长链离子去垢剂的Krafft点将使SOS和TMA-18处于一种微晶体的形式，从而不能迅速吸收加以利用。通过检查Weir，M.P.et al.，Amer.Rev.Res.Dis.106：450-457(1972)的方法将支持这一观点：在使用之前，BSA被用来乳化油酸(CAS_No.112-80-1)。乳化作用允许油酸以一种可吸收的方式出现(如，溶液中)。排除溶液中阴离子去垢剂的解释在于分枝杆菌孔蛋白为阳离子选择性这一事实。换句话说，在排除阴离子化合物孔蛋白的进口处，通道具有空间上占据的阴离子氨基酸(Trias，J.V.et al.，Science 258：1479-1481(1992)。Jarlier，V.et al.，J.Bacteriol，172：1418-1423(1990)表明头孢霉素利用亲水途径进入细胞，而且，阴离子头孢霉素比那些“没有净电荷”的孔蛋白扩散进入细胞要慢得多。妨碍阳离子去垢剂穿过外层膜的运动似乎是由于这一事实：即Trias，J.V.et al.，J.Biol.Chem.268：6234-6240(1993)的孔蛋白是电压依赖性的。阳离子去垢剂的积累将简单地关闭该通道。
一旦穿过外层膜，甜菜碱通过主动运输跨过内膜。Schaefer，W.B.et al.，J.Bacteriol.90：1438-1447(1965)研究了堪萨斯氏分枝杆菌，Weir，M.P.et al.，Amer.Rev.Res.Dis.106：450-457(1972)研究了耻垢分枝杆菌，表明油酸的吸收是迅速且依赖能量的。此外，Weir，M.P.et al.，Amer.Rev.Res.Dis.106：450-457(1972)进一步表明包含的机制在某种程度上具有立体特异性。McCarthy，C.Infect.Immun.4：199-204(1971)研究了鸟分枝杆菌并报道78nmol的棕榈酸(CAS_No.57-10-3)在30分钟内可被1mg的细胞隐退。然而，存在有种特异属性。Schaefer，W.B.etal.，J.Bacteriol.90：1438-1447(1965)阐明MTB复合有机体“……在培养基中与吐温或油酸一起并不表现同样明显的形态或浊度变化。”Cella，J.A.et al.，J.Am.Chem.Soc.74：2061-2062(1952)认为：C16-C18四价铵盐提供最好的杀菌活性，以及Tsubone，K.et al.，J.Pharm.Sci.80：441-444(1991)明确地表示C16-二氧磷基乙基甜菜碱(CAS_No.126712-88-7)对上述活性是最理想的长度(在试验条件下，C18同系物被报道为云雾状)。两位作者表明短链化合物为效果相对较差的抗微生物制剂。Tsubone，K.et al.，J.Pharm.Sci.80：441-444(1991)也表明对活性的极端种依赖性。结论是脂类运输物质对较长链的脂类表现出较高的特异活性，该活性在穿越(微生物)种类方面显示较大的变化。无论如何，有两个主要屏障，妨碍进入细胞。在本发明的方法中甜菜碱具有的优势是它们在结构上以一种理想的方式出现在细胞中。
在类SB-18活性中若包括此途径，可能有另外的pH及温度依赖因素。例如，McCarthy，C.Infect.Immun.4：199-204(1971)表明鸟分枝杆菌的脂类运输物质为pH和温度依赖型：在38℃和pH6.5时运输最为合适。而在处理期间改变pH和降低温度将分别在SB-18的化学结构和相结构方面产生负向后果，这些参数也可能限制积累类SB-18去垢剂的能力。例如，Tsujii，K.et al.，J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978)表明必须把10mM NaCl中的SB-18保持在37.5℃以上以便维持分子团结构。Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：149-153(1990)表明Cn-二氧磷基乙基甜菜碱较低的pKa属于4.7到4.9的范围，而较高的pKa则为8.8到9.8的范围。Weers，J.G.et al.，Langmuir 7：854-867(1991)已经测定C12-羧基甜菜碱较宽范围的较低的pKa值，并且表明依赖于桥结构。在这些pH范围内保证试验条件使得甜菜碱起去垢剂的作用(如，维持分子团的形式，从而产生分枝菌酸及参与菌索形成的脂类的增溶作用。)在可辨别的程度上，利用温和的酸性缓冲液(如pH5.7)的实验并不防止结核分枝杆菌的收集。然而，该结果可能具有种特异性。因此，为了检测大量的有机体，使用本发明方法中的甜菜碱获得最大的利益，应该把pH保持在5.0以上，但不能大于8.0，然而，允许类SB-18去垢剂显示出类SB-18活性的任何pH都是可接受的。
为什么短链去污剂在本文描述的试验中表现出较低活性的原因实际上更大程度地是由于烷基链长度和抗菌活性之间的关系这一事实。Tsubone，K.J.Pharm.Sci.80：441-444(1991)最有趣的发现是：在试验的九个有机体中(真菌和细菌)，痤疮丙酸杆菌和变异链球菌这一组受二氧磷基甜菜碱的影响最大。在九个有机体中，痤疮丙酸杆菌与分枝杆菌的关系最为密切。事实上，在165rRNA基因序列的该区域中，正向引物序列(TBv2-119〔SEQ ID No.：1：〕)与痤疮丙酸杆菌完全同源。结论是要么甜菜碱被有效地隐退，要么是其结构特别有效，或者是兼而有之。
现在已对本发明作了一般性描述，通过参照说明方式的下列实施例可更容易地理解本发明，但这些实施例无意于限制本发明。
                      实施例
                      实施例1
                     材料和方法
I.SB-18洗涤缓冲液的配制
SB-18洗涤缓冲液(每500毫升)
A.加入25ml的20×SB-18盐(见下面)到约475ml的水中(或每100ml的洗涤缓冲液5ml)，高压灭菌(20分钟/液体循环)。
B.从高压灭菌锅中取出瓶子，立即加入5ml的100×SB-18(或每100ml的洗涤冲液加1ml的100×SB-18)。涡旋混合并置于40℃下。
C.把瓶子贮藏于40℃下直至使用(使用之前，瓶子可以保存几天)。
D.选择：使用之前立即融化1.25M DTT至室温，每500ml的SB-18洗涤缓冲液加入2ml的1.25M DTT(终浓度：每100ml的洗涤缓中液5mM或400μl 1.25M DTT)。涡旋混合容器。重要的是当加入DTT时不能是冷的。注意：若出现沉淀请勿使用。
E.按以下实施例的描述使用。
F.使用之后，弃去残余物。
在该方法的任一环节，如果洗涤缓冲液中出现沉淀，则不要使用。此外，在使用之前或使用过程中，溶液应该总是保持温热。在这些条件下SB-18的Krafft温度大约为37℃(Tsujii，k.et al.，)Jour.Phys.Chem.82：1610-1614(1978)。因此，溶液必须保持在这一温度之上以避免出现结晶和保证稳定的分子团的形成。
II. SB-18洗涤缓冲液组成
该配方将配制10升的洗涤缓冲液。这足以处理400个样品，每个样品25ml。下文的实施例使用下面限定的缓冲液，然而，如同实施例9和12所描述的，该缓冲液可加以修改以适合被使用的特定类SB-18去垢剂(实施例9：图10)以及特定的所需的处理方法(实施例12：表11)。
(A)20xSB-18洗盐
                      体积    浓度    终浓度1M磷酸氢钠pH8.0         40ml    200mM   10mM
5M氯化钠              12ml    300mM   15mM
*〔D，L〕苯丙氨酸     1.32g   40mM    2mM
加水至200ml，混合。
过滤灭菌，分成二等份，每份100ml。室温下保存。该溶液可每周或每月配制并保存。
*注意：氨基酸(如苯丙氨酸)的使用是选择性的。然而，氨基酸应该于pH7.0下灭菌。因此，如果使用氨基酸，20X贮存液的pH应该减少至pH7.0。
(B)100XSB-18贮存液
(SB-18)可以，先用1∶1的异丙醇：水溶解很方便地加入)
A将50ml异丙醇∶水溶液(1∶1；见下面)转移至一个有刻度的量筒中。
B称出3.358克的SB-18(N-十八酰基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸酯；Sigma Catalog No.0 8004)，置于量筒于，轻轻涡流(Vortex)。让溶液静置20分钟，轻轻涡流约5分钟
C.再加一些异丙醇∶水溶液至大约75ml，轻轻涡流。SB-18溶解(总共约30分钟)后，使终体积至100ml，到置混匀。
D.把溶液转移至一个灭菌的Nalgene瓶中。
E.该溶液可于室温下保存数月。
(C)1.25M DTT
把7.71克的二硫苏糖醇(154.2g/mol)用水溶解为40ml。快速地等分为2ml的部分。贮存于-20℃下。
III. SB-18洗涤缓冲液试剂
(A)1M NaHPO4
                        pH7.0*      pH8.0*
   磷酸二氢钠           70.38克     11.72克
具有138g/mol的单碱基
   磷酸氢二钠           69.58克     129.92克
具有142g/mol的双碱基
蒸馏水至1升。
过滤灭菌，等份为250ml，贮存于室温下。
注意：1M NaHPO4缓冲液在室温下任一定时间会发生沉淀，为长期贮存，最好是配制大量体积的稀释的，20X的缓冲液
*注意：pH最好为8.0，除非氨基酸与SB-18一起结合使用，那么pH最好为7.0。
(B)5M NaCl
氯化钠(58.44g/mole)  292.2克
加水至1升。过滤灭菌分成100ml的等份，置于室温下保存。
(C)1∶1异丙醇∶水
50ml的异丙醇与50ml的水混合。(IV)2X溶解缓冲液
10X Taq缓冲液                   8ml
0.45％Tween 20                  180μl
0.45％NP-40                     180μl
200μg/ml蛋白酶K                160μl(50mg/ml贮存液)
加水至40ml。
(A)10X Taq缓冲液
                      体积      浓度      终浓度1M Tris 8.9               50ml      500mM     50mM4M氯化钾                  2.5ml     100mM     10mM
加水到100ml。消毒过滤，等分为9ml的部分，于-20℃下保存。
(B)蛋白酶K(50mg/ml)
蛋白酶K：10ml水中加入500mg。
等分成在0.5ml小离心管中的175μl部分，保存于-20℃下。
(C)1M Tris-Hcl pH8.9
Tris碱(121.1g/mole)            9.472克
Tris-盐酸(157.6g/mole)         3.438克
加水至100毫升，过滤灭菌，等分样：每份25ml，4℃下保存
(D)4M氯化钾
氯化钾(74.55g/mole)            29.82克
加水至100ml，灭菌过滤：等分样每份15ml，室温下保存。
V.用于举证性方案的材料来源
     项目             制造商        分类号
     材料
1.5ml螺旋盖试管      Sarstedt     72.692/005
2ml螺旋盖试管        Sarstedt     72.694/006
SB-18成分
SB-18                  Sigma         O8004
异丙醇(4升)            S/P         3035-4NY
二硫苏糖醇           Gibco/BRL     15508-013
NaH2PO4单            Sigma         S9638
Na2HPO4双            Sigma         S9763
   NaCl                Sigma         S7853PCR and 2X溶解缓冲液成分
Tris碱                 Sigma         T6791
Tris盐酸               Sigma         T6666
KCl                    Sigma         P3911
Tween20                Sigma         P1379
NP-40                  Sigma         N0896
dU-dNTP’s：         Boehringer
  dATP                              1051 440
  dCTP                              1051 458
  dGTP                              1051 466
  dUTP                              1420 47050mM MgCl2           Gibco/BRL      18067-017尿嘧啶DNA糖苷裂解酶     Gibco/BRL      18054-015
蛋白酶K              Gibco/BRL      25530-031Taq DNA聚合酶         Perkin Elmer    N808-0105VI.水对大体积，包括SB-18洗涤溶液，使用Nilli-Q纯化的水。
对于较小的体积，使用Gibco1/BRL水
              1升             15230-022
              100毫升         15230-014
“较小”的体积包括需要制备的那些：
a. 50X SB-18洗盐，包括：
       1M NaHPO4和5M NaCl
b. 100K SB-18贮存液，包括：
        异丙醇∶水(1∶1)
c. 1.25M二硫苏糖醇
d. 2X裂解缓冲液，包括：
       10X Taq缓冲液，1M Tris-盐酸pH8.9，4M KCl和蛋白酶K(50mg/ml)。
VII.处理供培养的临床样品
所有的临床样品都送到我们的实验室做常规培养。所有的临床样品用N-乙酰基-L-半胱氨酸/NaOH方法(Kent，P.T.et al.，”Public Heahh Mycobacteriology”in A Guide for the Level III Labora-tory，U.S.Department of Health and  Human Services，Centres forDisease Control，1985，pp.31-46)处理。用1ml的灭菌水重新悬浮细菌沉淀，取出一部分于BACTEC 12B培养基(Becton Dickinson，Towson，MD)上接种，于Lowenstein-Jensen琼脂(Becton Dickinson，Towson，MD)上培养，并作涂片分析(Kent，P.T.et al.，”PublicHealth Mycobacteriology”in A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Service. Centers for Disease Con-trol，1985，pp.57-70)，剩下的沉淀或者冻存于-20℃下或者按以下描述供PCR作进一步处理。所有阳性BACTEC培养物道述Gen-Probe培养试验(GenProbe，San Diego，CA)或标准的生化分析(Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide forthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Ser-vice，Centres for Disease Control，1985，pp.71-157)鉴定。
VIII.沉淀的直接扩增
表4：200μl的沉淀直接转移至一个含200μl的20X溶解缓冲液(40mM Tris-HCl，〔pH8.3〕，100mM KCl，0.45％吐温20，0.45％NP-40和200μg/ml的蛋白酶K)的螺旋盖离心管中。样品于60℃下温育60分钟，然后煮沸15分钟。然后取50μl做PCR扩增。
IX.沉淀洗涤
沉淀按以下描述用不同的溶液洗涤。表5：以下有三种洗涤条件：(i)水洗：向沉淀中加入25ml的无菌水，涡流振荡，然后立即于4℃下以3500xg离心20分钟。(ii)二硫苏糖醇(DTT)洗涤：向沉淀中加入25ml的10mM KHPO4(磷酸钾缓冲液，KHPO4和K2HPO4的混合物)，pH8.0与5mM DTT，涡流振荡，室温下温育20分钟，然后于4℃下以7410xg离心20分钟。(iii)吐温20/NP-40洗涤：向沉淀中加入25ml的10mM KHPO4(pH8.0)和5mM的DTT及0.05％的吐温20和0.05％的NP-40，涡流振荡，于室温下振荡培养20分钟，然后于4℃下以7410xg离心20分钟。在所有情况下，轻轻地从离心管中倒出上清液，再加入200μl的无菌水重新悬浮沉淀。然后再把200μl转移至一个含200μl的2X溶解缓冲液的带螺旋盖的离心管中。样品于60℃下培养60分钟，然后煮沸15分钟。在取出50μl用于扩增之前，所有的试管在12,000xg下离心1分钟。
表6：把25ml的10mM NaHPO4(pH7.0)，45mM的NaCl，5mM的二硫苏糖醇和200μM或者2mM的N-十八酰基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸酯(SB-18〔Sigma Cat.No.O 8004〕)加入至沉淀中，涡流振荡，于37℃下振荡培养60分钟(140rpm)，然后于37℃下以7410xg离心20分钟。轻轻弃去试管中的上清液，加入200μl的无菌水重新悬浮沉淀。然后把200μl转移至含200μl的2X溶解缓冲液的带有螺旋盖的离心管中。样品于60℃下培养60分钟，然后煮沸30分钟。在取出50μl做扩增之前所有的离心管于12,000g下离心1分钟。
表9：把25ml的10mM的NaHPO4(pH7.0)，15mM的NaCl，5mM的二硫苏糖醇和2mM SB-18加入到沉淀中，涡流振荡，于37℃下振荡培养(140rpm)60分钟。然后松开盖子，把试管置于预热至40℃的真空炉中。然后施加600mm Hg的真空60分钟。从真空炉中移出所有的试管，盖紧盖子，然后于37℃下以7410xg离心20分钟。移出试管中的上清液，加入200μl的无菌水重新悬浮沉淀。然后把200μl转移至含200μl的2X溶解缓冲液的带螺旋盖的离心管中。样品于60℃下培养60分钟，然后煮沸15分钟。在取出50μl进行扩增之前，所有的试管于12,000xg下离心1分钟。为了最终证实，所有样品作二份扩增。
X. PCR系统
发展的PCR系统是独特的，是根据Rogall，T.et al.，Int.J.Sys.Bacteriol.40：323-330(1990)发表的16S rRNA基因序列设计的。设计引物以便使它们具有提供以下组/种的分枝杆菌最适扩增的能力：结核分枝杆菌(TB复合物：〔MTB〕)，鸟分枝杆菌-胞间分枝杆菌和副结核分枝杆菌(MAC复合体)，堪萨斯氏分枝杆菌和海分枝杆菌。正向引物是针对这些分枝杆菌的16SrRNA基因序列的第2可变区(V2)的119-144个核苷酸(按照Rogall，T.et al.，Int.J.Sys.Bacteriol.40：323-330(1990)的分类)设计的。正向引物序列(TBv2-119)为：5′-AAA CTG GGT CTA ATA CCG GAT AGGA-3′〔SEQ ID No：1：〕。反向引物悬针对第三个可变区(V3)的431-453核苷酸设计的。反向引物序列(TBv3-453)为：5′-CCACCT ACC GTC AAT CCG AGA-3′〔SEQ ID No.：2：〕。扩增产物约为335个碱基对(取决于扩增的种类)属特异性探针是针对扩增产物的中央部分设计的，对所有的分枝杆菌都是共有的。其序列为：5′-GCG GGC iCA TCC CAC ACC GC-3′〔SEQID No：3：〕MTB一种特异性探针是针对扩增产物的独特部分设计的，是TB复合有机体所特有的。其序列为：5′-GAC CAC GGG ATG CAT GTCTTG TG-3′〔SEQ ID No：4：〕。
扩增方案用9600热循环器(Perkin Elmer，Norwalk，CT)和在所有反应中(Longo，M.C.et al.，Gene93：125-128(1990)结合尿嘧啶DNA糖基化酶(glycosylase)(UDG)〔Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD〕灭活方法。每l00μl反应物含200μM终浓度的dATP/dCTP/dGTP和400μMdUTP(dU-dNTP’s：Boehringer，In-dianapolis，IN)、3.0mM MgCl2、25pmol各引物(带2.5单位的TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT))。缓冲液的终浓度为50mM Tris-HCl(pH8.9)、10mMKCl、0.225％的吐温20和0.225％的NP-40。也结合Ampliwax(Perkin Elmer，Norwalk，CT)使效率达到最佳。按如下进行反应：将25μl(在1X缓中液中含有2.5单位的Taq酶，0.25单位的UDG，dU-dNTP’s和25pmol的TBv2-119)置于具有Ampliwax珠子的0.2ml离心管中，加热至80℃5分钟，然后冷却。接着把25μl(在1X缓冲液中含有MgCl2，0.75单位的UDG和25pmol的TBv3-453)置于Ampliwax之上。在样品中加入50μl体积的1XPCR缓冲液。循环轮廓为：45℃5分钟，94℃7分钟，然后是40个循环：94℃20秒，61℃1秒和72℃10秒；接着于72℃下均热处理(Soak file)。在热循环之后，反应物于-20℃下冷冻。
用CloneAmp系统(Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD)克隆了一个阳性扩增对照。根据制造商的说明对TBv2-119和TBv3-453进行稍加修改。将生长于斜面上的一个结核分支杆菌菌落ATCC#27294(ATCC，Rock Ville，MD)置于200μl的PCR裂解缓冲液中，并煮沸30分钟。取出10μl，按以上描述的方法进行扩增(只是用200μMdTTP代替400μM dUTP，并且在反应中不加UDG酶)。按照制造商的方法(Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD)把产物克隆至DH5α细胞中。质粒(POL 332)由Applied Tech-nologies，Inc.(Ellicot city，MD)提纯，并用循环测序试剂盒(LifeTechnologies，Inc.Gaithersburg，MD)进行测序以证实同源性。通过A260读数来确定提纯的质粒的量，并稀释用作阳性扩增对照。所有进行所有包括含有该质粒的20和100个拷贝的重复反应物的扩增。此外，每次也扩增重复的阴性对照。该质粒在每次印迹实验中也作为杂交对照。
XI.检测
从-20℃下取出扩增的样品，通过加入100μl的2X-变性溶液(1M NaOH/2M NaCl)制备印迹实验的样品。将反应试管再放回热循环器中，并加热至60℃15分钟。所有的探针按照厂商的说明(Clontech，Palo Alto，CA)用γ-〔32P〕ATP和多聚核苷酸激酶进行5′-末端标记。样品于Nytran Plus(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上进行点印迹，并按厂商的推荐进行探针杂交。简言之，滤纸于80℃下烘烤1小时，并于10X Denhardt’s，6X SSPE，1％SDS和100μg/ml变性鲱鱼精DNA中、42℃下预杂交3小时。滤纸然后置于6X SSPE和3％SDS及5′-32P-标汇的探针中，于61℃(属探针〔SEQ ID No：3：〕)或65℃(TB-特异探针〔SEQID No：4：〕)下培养过夜。滤纸于室温下在6X SSPE中洗涤3次，每次10分钟，然后，再将属探针〔SEQ ID No：3：〕于1X SSPE，61℃下洗涤3分钟或者再将TB-特异探针〔SEQ ID No：4：〕于1X SSPE，65℃下洗涤3分钟。然后将滤膜进行放射自显影。滤膜通过在0.1％SDS中煮沸15分钟剥去，必要时再用探针杂交一次。
XII. PCR的最佳化
阳性对照是用作优化系统的手段。为了使系统最佳化，对Mg-Cl2浓度，核苷酸的浓度和扩增的各个方面以及退火温度都要进行检查。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色和点印迹及杂交进行分析。以上描述的扩增条件日常可扩增20个拷贝至检测水平。我们已经注意到Carmody，M.W.et al.，Biotechniques15：692-699(1993)描述的相同的现象。表面上看，凝胶上看到的dU-PCR产物的量似乎比杂交估测的量要大(当与已知的印迹的dT-质粒的量相比时)。我们已试图用Loewy，Z.G.et al.，J.Clin.Micro.32：135-138(1994)描述的“UDG热一起始”法，但没有见到相同的信号加强。
XIII.点杂交的组织
如上所描述的，PCR反应物经变性，以二维排列共价地固定一个尼龙膜上。利用一个点杂交多用装置(”The Convertible，”LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)来完成二维排列，该装置的构造是标准的96孔式(如宽8个孔、长12个孔)。
图2A和16B的底排，或者图3、4A、5、6、7、7A、8、9、9A、9B、9C、9D、10、11A、12和13或图14的第一列描述了杂交和扩增对照的结果。杂交对照是那些标有“108、109和1010”的孔，并在图2A，16A中的同一排和图3、4A、5、6、7、7A、8、9、9A、9B、9C、9D、10、11A、12、13和14中的同一列上，杂交对照为重复点样。质粒pOL332的指定的拷贝数被用作杂交对照，并且可以在斑点之间进行比较，以估测曝光度(exposure)。
类似地，扩增对照由含有“0、20和100”的pOL332质粒的起始拷贝的重复反应组成，可使用于估计一个给定的扩增运行效率的实验中。扩增对照于图2A、16A中的同一排，及图3、4A、5、6、7、7A、8、9、9A、9B、9C、9D、10、11A、12、13和14中的同一列重复点样。
绝大部分实验使用在实验开始时被假定为相同的多个重复。这些重复样品被标记为“a”、“b”、“c”、“d”等等，并按照横跨标记的括号说明以至少二次重复的方式扩增。每个实验孔按照括号的说明以至少重复二次的方式表示出来。几个实验只是简单地比较“试验条件”，而很多实验使用几个内对照：“试验负对照”，“试验正对照”和“试验输入对照”。试验输入对照(也称为“直接输入”或“直接等分”)代表一个给定实验中等分的最大拷贝数量(如，最大强度的园点)。这一系列与试验对照或试验条件的比较代表处理效率。试验负对照(水)实际上表示低效率的回收，试验正对照(2mM SB-18)实际上表示高效率的回收。试验负对照，试验正对照和试验输入对照与各种试验条件的比较得出一个关于修改是否可以提高回收效率的结论。
XIV.不一致结果的解析
在经验工作期间，被发现为培养阳性但为PCR阴性的所有样品都要对抑制进行检查。在这些情况下，1000个拷贝的阳性对照被加入到不一致的样品中以检查扩增的抑制作用。在证实期间，有几种情形存在，其中同一样品的重复扩增产生不同的结果(如一个为阳性，一个为阴性)。这些样品以重复的方式重新进行扩增，并以与Jackson et al.，J.Clin.Microbiol.31：3123-3128(1993)描述的相类似的方式对结果进行解析：如果第二次反应中至少有一个为阳性，那么样品被认为为阳性。
XV. PCR的特异性
为了检查用上述引物和探针的系统的特异性，对三类有机体检查其被扩增的能力。
根据引物的互补性，这三类有机体如下：(i)应该选择性地扩增的那些有机体，(ii)可以扩增，但由于引物序列的微小错配而减少效率的那些有机体，(iii)因引物中的序列丢失而不应该扩增的那些有机体。下面的美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockxlle，MD)的菌株被用来检查第一类有机体：结核分枝杆菌(ATCC#27294)、鸟分枝杆菌(ATCC#25291)、胞间分枝杆菌(ATCC#13950)、堪萨斯氏分枝杆菌(ATCC#12478)、副结核分枝杆菌(ATCC#19698)、海分枝杆菌(ATCC#927)、M.szulgai(ATCC#35799)和胃分枝杆菌(ATCC#15754)。下列ATCC菌株被用来检查第二类有机体：蟾分枝杆菌(ATCC#19250)、戈特氏分枝杆菌(ATCC#14470)、M.mal-moense(ATCC#29571)、土分枝杆菌(ATCC#15755)和无色分枝杆菌(ATCC#19530)。下列ATCC菌株被用来检查第三类有机体：代表不应该扩增的生长很快的分枝杆菌的偶发分枝杆菌(ATCC#6841)；不相关的，但又类似的有机体包括痤疮丙酸杆菌(ATCC#6919)，干燥棒状杆菌(ATCC#373)，和Rhodococus equi(ATCC#6939)；在痰和支气管样品中大量发现的其他有机体(Murray，P.R.et al.，in：Manual of Clinical Microbiology，5th edition，A.Balows.etal.，eds.，Am.Soc.Microbiol.Washington，DC.，1991，pp，488-490)以Prevotella melaninognica(ATCC#25845)和大消化链球菌(ATCC#15794)为代表。所有分枝杆菌在使用之前于斜面上生长。所有其他的有机体以ATCC建议的方法生长。
PCR产物通过琼脂糖电泳和溴化乙锭染色以及斑点印迹和杂交分析。所有第一类有机体以相同的效率扩增。根据与引物的互补性，第二类有机体分为两个亚种群。戈特氏分枝杆菌(正向引物中一个错配和反向引物中二个错配)只以较高的拷贝数扩增。M.mal-moense(只在正向引物中有一个错配)以降低的效率扩增。在第二个亚种群中，土分枝杆菌，无色分枝杆菌和蟾分枝杆菌，每个都有许多引物错配，将不会扩增。第三类有机体都不会扩增，即使在高拷贝数水平上也是如此。
                       实施例2
在PCR缓冲液中直接煮沸样品是不充分的
最初，为了更好地以一种可顺从扩增的形式回收分枝杆菌，尝试了按Victor，T.et a1.，J.Clin.Microbiol.30：1514-1517(1992)描述的直接煮沸沉淀法。76个冰冻的NALC/NAOH沉淀直接置于PCR缓冲液中并进行煮沸(表4)。如上所述，为了直接对沉淀进行扩增，把200μl的沉淀直接转移到含200μl的2X溶解缓中液(40mMTris-HCl〔pH8.3〕，100mM KCl，0.45％的吐温20，0.45％的NP-40和200μg/ml的蛋白酶K)的螺旋盖离心管中。样品于60℃下培养60分钟，然后煮沸15分钟。然后移出50μl的等份通过PCR扩增。
表4：当直接对NALC/NaOH沉淀扩增时PCR与培养的相关性
示出了NALC/NaOH沉淀的直接PCR扩增结果。按以上描述，在处理扩增之前移出沉淀并让沉淀生长于BACTEC12B培养瓶中。所有阳性MTB或MAC培养物用Gen-Probe培养试验法(Gen-Probe，San Diego，CA)进行鉴定。所有其他的培养物通过生化分析(Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide forthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Ser-vice，Centers for Disease Control，1985，pp.71-157)进行鉴定。
条件 # 种类   相关性   ％相关性 总PCR阳性
 培养 PCR
 沉淀  76   MTB复合体   25   1   20％     5
  MAC复合体   2   0   0％
    其他   1   -    -
所有5个样品均来自同一病人。
如表4所示，当直接使用沉淀时，7个培养阳性样品只有1可通过扩增检测(14.3％)。在每种情况下，从培养物中可能扩增有机物，表明引物对这些分离物是起作用的。由于用NALC/NaOH抽提，每个假阴性被确定为是对PCR测定抑制的结果。
                          实施例3
                       扩增抑制作用
我们实验室一般使用3％的氢氧化钠处理临床样品(Kent，P.T.，”Public Health Mycobacteriology，”in A Guide for the level IIILaboratory，U.S.Department of Health and Human Service，Centersfor Disease Control，(1985)pp.31-46)。3％的贮存液中的NaOH的浓度(如，OH_)为0.75M，pH为14。3％的贮存液的总Na_浓度(包括1.45％的柠檬酸钠)为0.8M。为了检查由于盐浓度(如，Na_)或pH(如，OH-浓度)产生的潜在的PCR抑制作用，进行了如图1所示的实验。5ml的NALC/NaOH(0.5％NALC，1.45％柠檬酸钠和3％的NaOH)用45ml的水稀释10倍。稀释成分的终浓度为3.1mM NALC，5.6mM柠檬酸钠和75mM NaOH。然后把不同用量的稀释的NALC/NaOH转移至含有200μl的2X溶解缓冲液的1.5ml的离心管中。把大约1000个拷贝的POL332阳性对照质粒加入至每个混合物中，并把所有的体积用水调整至终体积400μl。所有的试管于95℃下培养15分钟，然后对50μ1的每个样品重复二次扩增。图1表示出扩增的结果(见实施例1的第XIII节对数据的解释)百分率表示最终扩增反应试管中NALC/NaOH的量。例如，25％意指把25μl的NALC/NaOH溶液(3.1mM NALC，5.6mM柠檬酸钠和75mM的NaOH)置于100μl的终体积的扩增反应物中。同时扩增0，20和100个拷贝的拷贝对照，也对108，109和1010个拷贝的杂交对照进行点印迹。
图1所示的结果表明，稀释的NALC/NaOH溶液在最终扩增混合物中一定要以大于10的系数进一步稀释才能使PCR反应有效运行。因此，加入的盐或OH_一定小于约50mM才能使扩增有效运行，由于PCR对pH的变化更加灵敏(相对于盐的微小的增加)，似乎抑制作用是由于pH的改变。假使有样品密度变异性，通过简单的倾去上清液，实际上也不可能去除所有的NALC/NaOH。这些资料证实了当NALC/NaOH用作第一步处理样品时对沉淀作进一步处理是必要的。Noordhoek，G.T.et al.，J.Clin.Micro.32：277-284(1994)的数据进一步证实了这一结论：在该研究中工作极其糟糕的两个实验室并没有进一步纯化NALC/NaOH沉淀。
                       实施例4
用水和DTT增加第二个洗涤步骤的作用
1.水洗
为了理想地处理大量样品以减少每个样品的成本和增加效率，检查了第二个洗涤步骤(2°-洗涤)以进一步去除抑制剂(如NALC/NaOH)的适用性(表5)。
扩增条件如同上述材料和方法中描述的一样。
最初，只是用水简单地洗涤以冲洗管底物(沉淀)。向沉淀中加入25ml的无菌水，涡旋振荡，然后立即于4℃下以3,500xg离心20分钟。倾去试管中的上清，加入200μl的无菌水重新悬浮沉淀。把200μl的悬浮液再转移至含200μl的2X的溶解缓冲液的螺旋盖离心管中。样品于60℃下培养60分钟，然后再煮沸15分钟。在取出50μl的等份进行扩增之前，所有离心管以12,000xg离心一分钟。
在结合这一水洗步骤之后，相关性提高至33％(表5：21个培养阳性中7个为PCR阳性〔n＝407〕)。同上面一样，可以从培养物中扩增有机体；然而，同上面相反的是，抑制似乎不是主要问题，因为几个样品经重复扩增后均为阴性。而且，鸟分枝杆菌似乎也是一个重要问题。总的看来，尽管相关性较低，但这些结果与表1中讨论中的绝大多数研究是一致的。在表1中报道的不到100％的相关性的33个方法中，21个包括某种形式的缓冲液交换步骤。剩下的12个不包括缓冲液交换步骤，9个涉及抑制剂问题。
II. DTT洗涤
Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.31：61-65(1993)和Her-mans，P.W.M.et al.，J.Clin.Micro.28：1204-1213(1990)已经表明痰可抑制PCR。推测可能是酸性粘多糖具有抑制作用(Ochert，A.S.et al.，PCR Methodsand Applications 3：365-368(1994)。或者说，痰的“粘性”性质也可能影响扩增效率。Buck，G.E.et al.，J.Clin.Micro.30：1331-1334(1992)特别地把这种粘性称为是假阴性的一个起作用的因子。这种状况(即与疾病状态成正比的一种状况)的某些极端例子在初步的研究中也被观察到。因此，在试图克服这一问题的尝试中，对2°-洗涤的成分作了改变以便它使痰进一步液化。
为了使痰更好地液化，在洗涤步骤中包括了10mM KHPO4，pH8.0和5mM的二硫苏糖纯(DTT)，与Hirsch，S.R.et al.，J.Lab.Clin.Med.74：346-353(1969)的方案相类似，并在离心过程中按Ratnam，S.et al.，J.Clin.Microbiol.23：582-585(1986)和Rickman，T.W.et al.，J.Clin.Microbiol.11：618-620(1980)推荐增加RCF。向沉淀中加入25ml的10mM KHPO4(pH8.0)与5mM DTT，涡旋振荡，于室温下温育20分钟，然后于4℃下以7,410xg离心20分钟。在所有情况下，倾去管中的上清液，再加入200μl的无菌水重新悬浮沉淀带。然后再把200μl转移至含200μl的2X溶解缓冲液的螺旋盖离心管中。样品于60℃下培养60分钟，然后煮沸15分钟。在取出50μl的等份扩增之前,所有的离心管于12,000xg下离心1分钟。
如表5所示，用这些条件洗涤175个随机样品。样品的稠度似乎有明显的提高，相关性也有提高，此时可达60％(10个培养阳性中有6个PCR阳性)。如前面一样，只有一个例外(见表5中的脚注C)，从培养物(或从斜面)是可以扩增有机物的，只有一个假阴性归因子抑制作用。然而，在同一样品的重复中再次观察到了“统计漏失”。
虽然洗涤沉淀似乎可减轻抑制作用，在某种程度上，明显的假阴性不完全因为抑制作用：在这些条件下，样品偏差似乎是造成假阴性的主要问题。
表5：使用各种洗涤条件的PCR与培养的相关性。
通过洗涤沉淀得到的各种试验条件及其与培养的PCR相关性的结果如表所示。所有的样品首先通过NALC/NaOH步骤处理(Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide forthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Ser-vice，Centers for Disease Control，1985，pp.31-46)。在洗涤之前移出沉淀，并生长于BACTEC12B培养瓶中。所有的MTB，MAC或堪萨斯氏分枝杆菌培养物用Gen-Probe培养试验(Gen-Probe，SanDiego，CA)鉴定。所有其他的培养物通过生化分析鉴定(Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide for the Level IIILaboratory，U.S.Department of Health and Human Service，Centersfor Disease Control，1985，pp.1-157)。条件表示通过洗涤进一步处理沉淀。使用三种不同的附属洗涤条件，如同材料和方法中描述的一样：(i)水，(ii)10mM KHPO4(pH8.0)和5mM的二硫苏糖醇，和(iii)含有0.05％的吐温20和0.05％的NP-40的10mM的KHPO4(pH8.0)和5mM的二硫苏糖醇。
条件 # 种类      相关性 ％相关性   总PCR阳性
 培养物   PCR
2°-水洗涤  407    MTB复合体     1    1    100％    32
MAC复合休 20 6 a30％
     其他     3    -
2°-DTT洗涤  175    MTB复合体     4    3     b75％    10
   MAC复合体     c5    2     d50％
堪萨斯氏分枝杆菌 e2 1 50％
     其他     4    -
 2°吐温  20/NP-40洗涤  359    MTB复合体     5    4     f80％    20
MAC复合体 21 9 g43％
     其他     10    -       -
累积的2°-洗涤结果 941 MTB复合体     10     8    80％    62
MAC复合体     46     17    37％
    堪萨斯氏分枝杆菌 2 1 50％
    其他     3     -    -
a 假阴性是由于低拷贝数和抑制作用。b 1个假阴性是由于抑制作用。c 从培养物中重复扩增这些种类的任意一种的尝试未能成功。d 2个假阴性是由于低拷贝数。e 其中之一为BACTEC阴性，在斜面上只产生一个菌落(如，低拷贝数)。f 1个假阴性是由于抑制作用。g 12个假阴性是由于低拷贝数。
                            实施例5
离心过程中分枝杆菌的分层
在以上描述的实验中，调查了在洗涤步骤过程中分枝杆菌是否被丢失的问题。图2描述了用来摹拟处理的试验的实验设计(此后称为“处理试验”)。在这些实验中，把生长于斜面上的结核分枝杆菌作为来源。
首先把少量的细菌转移至5ml的10mM KHPO4(pH8.0)中，涡旋振荡以产生细菌贮存液。然后把贮存液稀释2×103倍，并把20μl的稀释液转移至15ml的2°-洗涤缓冲液中。对总数为6个样品来说，这种转移需重复5次以上。同时，从2×103倍的稀释液中直接取出6个20μl的等份，加和至6个等分供直接扩增的含有380μl的溶解缓冲液中。后面的这些等份(此后称为“直接”“直接输入”或“直接等份”对照)在一给定的实验中作为总靶子输入对照。含有洗涤缓冲液的离心管然后进行离心(4℃下7410xg离心20分钟)。离心之后，把上清液的等份(200μl)置200μl的2X的溶解缓冲液中。然后弃去上清液，沉淀用200μl的水重新悬浮，并把200μl的重新悬浮的沉淀于200μl的2X溶解缓冲液混合。每个系列的50μl等份重复4次做PCR。
该实验中的输入估计约为10,000个拷贝。因此，直接等份应该代表约1,000个拷贝的扩增。如果有机体被溶解或均一地分布于上清中，扩增反应将含有约20个拷贝。沉淀的扩增据推测代表了通过离心重获细菌的效率。结果表示于图2A中(见实施例1第XIII节的对数据的解释)。
在图2A中，如上面材料和方法描述的，PCR产物经变性，印迹，探针杂交和放射自显影。6个不同的“样品”以a、b、c、d、e和f表示，并且应该是一致的。对一个给定的样品，上清液和沉淀的四次重复扩增表示于同一条线(行)上(1，2，3和4)。相应于一个给定样品的直接输入等份的的四次重复扩增也用同一行表示。0、20和100个拷贝的拷贝对照同时扩增。也对108、109和1010个拷贝的杂交对照进行印迹。结果(图2A)表明：某些沉淀为阴性，某些上清液部分为阳性两个部分显示出样品偏差。
对上述结果的一个可能的解释是分枝杆菌被溶解了。渗透性地裂解这些有机体并非平常。Thacore，H.et al.，Rev.Infect.Dis.3：960-972(1981)和Sato，H.et al.，Can.J.Microbiol.12：255-261(1966)报道：需要特别的措施产生MTB的原生质球和“形骸细胞”。或者，Thacore，H.et al.，Proc.Soc.Exptl.Med.114：43-47(1963)表明：在EDTA存在时生长的细胞粘附于烧瓶壁上。然而，这很容易通过向培养基中加入溶菌酶来克服。正确的解释可能是由于因浮力使分枝杆菌分层。按Klein，G.C.et al.，Am.J.Clin.Pathol.22：581-585(1952)的结果，图2A的观察是不足为奇的；在2,000rpm和3,000rpm下离心的所有样品中，沉淀和上清液都为培养阳性的分别为88.8％和82.4％；在2,000rpm和3,000rpm离心的所有样品中，沉淀为培养阴性但上清液为培养阳性的分别为2.7％和2.2％。
                          实施例6
细胞壁对分枝杆菌回收的影响
Dubos，R.J.et al.，J.Exp.Med.83：409-423(1946)认为：在吐温80(CAS_No.9005-65-6)存在时的浸没生长是由于细胞表面的“潮湿化”。如果表面张力导致异常的结果，可通过加入非离子去污剂克服表面张力，那么这些试剂应该提高培养相关性似乎是合乎逻辑的。然而，正如下面所表示的，情况并非如此。
Young，D.B.et al.，Res.Microbiol.142：55-65(1991)已经证实：通过在非离子去垢剂Triton X-l00(CAS_No.9002-93-1)中培养可以剥去周围相联的脂蛋白。因此，在PCR中常用作添加剂的非离子去垢剂吐温20(CAS_No.9005-64-5)和NP-40包括在试图影响分枝杆菌细胞的表面张力(或粘性)的附属洗涤步骤中(表5)。
NALC/NaOH处理的沉淀用吐温20/NP-40洗涤液洗涤：把25ml的10mM KHPO4(pH8.0)和5mM DTT及0.05％吐温20或0.05％的NP-40一起加入至沉淀中，涡旋振荡，于室温下振荡培养20分钟，然后于4℃下以7，410xg离心20分钟。在所有情况下，弃去离心管中的上清液，加入200μl的无菌水重新悬浮沉淀。然后再把200μl转移至含有200μl的2X的裂解缓冲液的旋螺盖离心管中。样品于60℃下培养60分钟，然后煮沸15分钟。在取出50μl的等份扩增之前，所有的离心管于12,000xg下离心1分钟。
如表5所示，在359个扩增的样品中，对MTB复合体(5个样品)或MAC复合体(21个样品)，26个为培养阳性。MTB只从4个样品中扩增出(80％)，MAC从9个样品中扩增出(43％)。而且，在几乎为一个的假阴性中表示出缺乏抑制作用；有机体可以从培养中扩增，发现统计漏失支配着假阴性。
因此，表5所示的积累的洗涤结果，获得了80％的MTB培养相关性(即使只有相对较少数量的MTB分离物〔n＝10〕)。通过这一方案分离MAC复合有机体能力的结果具有明显的不同：培养相关性为37％(n＝46)。表1所示的技术也反映出这种二分情况。
为了进一步支持这一发现，在0.1％的Triton X-100(CAS_No.9002-93-1)存在时用结核分枝杆菌重复了图2中概括的处理实验。图3表示该实验的结果。除了2°-洗涤缓冲液包含水或10mM的Tris-HCl，pH8.0，并补充有0.1％的Triton X-100和5mM的DTT外，在该实验中使用了图2中描述的处理试验。此外，只取4个等份且离心管于室温下振荡培养20分钟。4个等份的两次重复扩增以a、b、c和d表示，且应该是一致的。在适当标记的线上表示出直接等份的二次重复扩增。0、20和100个拷贝的拷贝对照同时扩增。108，109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
图3中表示的结果与上述数据一致(表5)：对非离子去垢剂并不预期可以提高回收的效率。事实上，观察到被认为是由于凝块的大量变异。注意该印迹(图3)相对于其他印迹的过度曝光。这对观察这些结果是必需的。
与这些结果一致的结论是：虽然必须采取另外的措施进一步减少样品的抑制剂，但简单地“潮湿化”细胞似乎并不能完全解决问题。这进一步地由表1中所示的5个研究事实得到证明：即于扩增之前用非离子去污剂洗涤沉淀(Clarridge，J.E.et al.，J.Clin.Micro 31：2049-2056(1993)；Kolk，A.H.Jet al.，J.Clin.Micro.30：2567-2575(1992)；Irula，J.V.et al.，J.Clino Micro. 31：1811-1814(1993)；Kolk，A.H.J.et al.，J.Clin.Micro.30：2567-2575(1992)；Shawar，R.M.et al.，J.Clin.Micro.31：61-65(1993)和Sritharan，V.et al.，Mol.Cell.Probes 5：385-395(1991))，没有一个获得100％的培养相关性。Robinson，L.et al.，J.Lab.Clin.Med.27：84-91(1941)早些年报道：减轻表面张力的因子在通过离心增加回收方面是无效的。如果，与Dubos的建议相反(Dubos，R.J.Exp.Biol.Med.58：361-362(1945)；Dubos，R.J.et al.，J.Exp.Biol.Med.83：409-423(1946))，吐温80，油酸和BSA通过一个活体内过程影响表皮生长，与补偿表面张力相反的话，那么结块将还预期存在于这里描述的实验中(图3)。基于本文(表5)和本领域(表1)陈述的结果，在洗涤缓冲液中包含这些非离子去垢剂并没有获得好处。
                        实施例7
                分枝杆菌的聚集和分散
虽然表面(外周)相关的脂质成份正由上述实验中的Triton-X100去除掉，但细胞还是聚集。作为下一步，通过分散试图开始尝试提高回收。图4详述了一个试验的实验设计(此后称为“聚集试验”)，该试验被发明用来估计不同的去垢剂分散MTB成团的能力。该试验基于聚集于加剧样品偏差的事实：如果团块被分散的话，多重等份将只产生相似的扩增结果，更为明确的是，如果这些等份均一地分布于整个溶液中，同一样品的每个等份将只具有相同数量的有机体。在低拷贝数时，预期这种情况将最为明显。理论上，结块的分散应该提高准确的诊断的可能性，即使在相对较低的拷贝数水平时，因为所有的等份将具有更高的包含靶子的可能性。
对去垢剂分散分枝杆菌(图4)进行估测的设计方案的实施，利用生长于斜面上的结核分枝杆菌作为这些实施中的来源，首先把少量的细胞转移至5ml的10mM的KHPO4(pH8.0)中，涡旋振荡以产生细菌贮存液，然后通过把10μl的贮存液转移至20ml的2°-洗涤缓冲液中，把贮存液稀释2×103倍。改变2°-洗涤缓冲液的各个方面，包括去垢剂及其浓度、使用的缓冲液及其离子强度和pH、培养时间、培养温度和增加或减少搅拌。培养之后，把20μl转移至25ml的标准缓冲液中(10mM KHPO4 pH8.0，0.05％吐温20，0.05％的NP-40和5mM的DTT)。对总数为4个样品来说该转移要重复3次以上。同时，4个20μl的等份直接从2×103倍稀释液中取出，加入至供直接扩增的含有380μl的4个不同的离心管中。后面这些等份(此后称为“直接”，“直接输入”或“直接等份”对照)作为一个给定实验的总输入对照。含有标准化缓冲液的离心管于4℃以7，410xg离心20分钟。在所有情况下，倾去离心管中的上清液，加入200μl的无菌水重新悬浮沉淀。立即取出200μl的等份，置于200μl的2X裂解缓冲液中。所有的离心管按材料和方法中描述的方法准备PCR。每个系列的50μl等份可进行重复二次PCR，补偿稀释和使输入标准化。
对图4A所示的数据，按材料和方法中描述的对每个试验的PCR产物进行变性、印迹、探针杂交和放射自显影。对每一条件的四种不同“样品”的二次重复扩增以a、b、c和d表示，并且应该是相同的。每种条件的直接等份的二次重复扩增表示于适当的标记线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照。也地108、109和1010个拷贝的杂交对照进行印迹。
图4A表示对没有去垢剂(如水)、10mM Tris-HCl pH8.0中的0.1％吐温80和10mM的NaHPO4，15mM NaCl中的2mM的N-十八烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸酯(SB-18：CAS_No.13177-41-8)进行比较时的代表性结果。在等份至标准缓冲液中之前，所有离心管于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。在检测这些化合物，在该试验中一致表现有明显活性的唯一的去污剂为磺丙基甜菜碱，SB-18。SB-16(CAS_No.2281-11-0)表示出某些分散活性：尽管不一致，但SB-16看起来也起作用。其他的去垢剂，以及长度不到16个烷基碳(SB-10(CAS_No.15163-36-7)，(SB-12(CAS_No.14933-08-5)和SB-14(CAS_No.14933-09-6))的磺丙基甜菜碱系列的其他去污剂在解聚MTB成团方面是无效的。MTB成团的分散改进了即使在低拷贝数时所有等份将含有靶子的可能性。
通过抗酸性涂片证实分散理论的尝试没有成功。显然，包含任何去垢剂显著地使加热固定细胞至玻片上的能力遭到破坏。
                      实施例8
通过离心SB-18加快了分枝杆菌的分离
通过使用图2中描述的处理试验，把上述结果进行延伸。在去垢剂分裂成团的功效和处理试验的回收之间有直接的相关性。图5表示了在2mM SB-18存在和不存在时使用鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌的一个代表性结果。对图5所示的实验，仿效了图2中描述的图解说明。2°-洗涤缓冲液含有10mM的NaHPO4 pH7.0，15mM的NaCl，2mM的SB-18，2mM苯丙氨酸和5mM的二硫苏糖醇，并且与水进行了比较。此外，离心管于37℃下振荡培养60分钟(140rpm)。四个等份的重复扩增以a、b、c和d表示，且应该是相同的。对应于一个给定种类的直接等份的二次重复扩增表示于合适标记的线上。同时扩增0、20、100个拷贝的拷贝对照。对108、109和1010个拷贝的杂交对照进行印迹。
选择这一印迹是因为结核分枝杆菌的特征凝块和鸟分枝杆菌的更加扩散的分布特征可以清楚地得到辨别。此外，关于这张印迹图上见到的凝块，观察到苯丙氨酸虽然可以提高对MAC有机体的回收，但却使SB-18分散活性的功效遭到破坏。无论如何，用两种有机体照例地观察到在回收方面有重要改进。
表6描述了用补充有2mM的SB-18的一种洗涤缓冲液处理NALC-NaOH沉淀的结果。
表6
当SB-18包含于洗涤缓冲液中时
PCR与培养的相关性
如同材料和方法中描述的，对2°-洗涤缓冲液中包含SB-18的结果进行了描述。用来洗涤这一系列样品的缓冲液的组成为10mM的NaHPO4(pH7.0)，45mMNaCl，5mM的二硫苏糖醇和200μM或者2mM的SB-18。沉淀于洗涤之前移出，生长于BACTEC12B培养瓶中。所有阳性的MTB，MAC或堪萨斯氏分枝杆菌培养物用Gen-Probe培养试验(Gen-Probe，San Diego，CA)鉴定。所有其他的有机体通过生化分析(Kent，P.T.et，al.，”PublicHealth Mycobacterology”in A Guide for the Level III Loboratory.U.S.Departement of Health and Human Serrices，Centers for DiseaseControl，1985，pp.71-157)鉴定。沉淀于37℃振荡(140rpm)洗涤60分钟。在沉淀洗涤之后，样品经离心和按材料和方法描述的进一步作PCR处理。
条件 # 种类      相关性 相关性  总PCR阳性
  培养   PCR
 2°SB-18洗涤 754     MTB复合体     5     5   100％    143
MAC复合体 23 15 65％
 堪萨斯分枝杆菌     1     1   100％
      其他     16     3     -
在754个用含SB-18缓中液洗涤的样品中，23个样品为鸟分枝杆菌培养阳性，5个样品为结核分枝杆菌培养阳性，1个为堪萨斯分枝杆菌结养阳性。与培养的相关性如下：鸟分枝杆菌，65％；结核分枝杆菌，100％；堪萨斯氏分枝杆菌，100％。尽管培养阳性样品的实际数量较低，但显然在总体相关性方面有明显的改进。在最初筛选中遗漏的8个鸟分枝杆菌样品中，对差异的解析表明5个样品是由于低拷贝数(多次扩增看起来为阳性和阴性)，1个被证实是抑制剂存在的结果，2个为“不能解释的”(多次扩增都为阴性，但排除了抑制剂的存在)。此外，与培养阳性的戈特氏分枝杆菌样品的相关性开始出现。当只引入高拷贝数时才能在体外观察到阳性的戈特氏分枝杆菌扩增的事实被看作为进一步的证据：回收的总效率有显著的提高。
虽然为实验目的从临床样品和斜面上分离鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌的能力再一次被提高，但有几例值得讨论的来自体外研究的观察。首先，在输入方面从实验到实验的差异，非常难于获得有意义的结果。在非常低的拷贝数输入水平上，用那些不影响MTB聚集的去垢剂可观察到引人注目的样品偏差，解释几乎是不可能的。在较高的输入拷贝数上，观察不到有意义的差异，因为所有反应的扩增已经进行到线性阶段。在这两个极端之间需要仔细地平衡，并且证明这是很难做到的。经推测，估计需要100到1000个拷贝数之间可获得有意义的结果。不到100个拷贝数在离心样品中产生剧烈的样品偏差，大于1000个拷贝产生保证含有细胞的相对均一的溶液，不管处理溶液的性质如何。第二个观察提出了期望的相对差异。例如，用简单的水或非离子去垢剂洗涤，有80％的与MTB培养的相关性(表5)。获得的启示是：只要勉强改进(约20％)即可取得100％的鸟分枝杆菌相关性，另一方面，需要二倍以上的效率才能获得100％的相关性。按照紧接着上面注意到的第一个观察，这一看法使增加的有意义的数据更加复杂化。无论如何，在描述的这些条件下获得了明显的改进，并说明损失比原先想象的实际上要大。对MAC有机体“不能解释的”结果只能由在处理过程中产生近似数量的损失得到合理的解释。第三个观察是分离结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌能力的差异：两个有机体在活体内和活体外都有不同的行为表现，MTB因加入SB-18表现出更明显的改进(图5)。而且，MAC有机体以单个细胞方式生长的事实说明SB-18的功能作用机制不仅仅是通过扩散。
试图改进试验的尝试已集中于混合添加剂。而混合去垢剂似乎是反产生性的，并且与Linfied W.M.et al.，J.Am.Oil.Chem.Soc.40：114-117(1963)的发现一致，把氨基酸混合至缓冲液中可以不过分地改善回收的密度，但却使分散MTB的能力遭到破坏。可能的是氨基酸简单地被主动地隔绝，从而在某些程度上使分枝杆菌的自然浮力遭到破坏。无论如何，所有经验数据表明，某些输入材料还在被丢失。
                          实施例9
                  在分离分枝杆菌中使用甜菜碱
SB-18(CAS_No.13177-41-8)和SB-16(CAS_No.2281-11-0)(虽然在更小的程度上)是唯一的在上述检测的在聚集试验方面起作用的去垢剂(图4A表示用SB-18的结果)。而且，图5的结果表明，SB-18作用的机制并不是简单地一种扩散作用。进行了一系列实验试图阐明SB-18的一些特征，这些特征有利于改进检测(图6-9D)。
图6中所示的结果是根据图2中所示的处理试验的一种修改，使用了SB-18的几种离子同系物：十八烷基硫酸钠(SOS：CAS_No.1120-04-3)，溴化三甲基十八烷铵(TMA-18：CAS_No.1120-02-1)和3-〔(3-胆酸氨丙基)-二甲基ammonio〕-1-丙烷磺酸盐(CHAPS：CAS_No.75621-03-3)。SOS和TMA-18分别为阴离子和阳离子十八烷基去污剂，CHAPS是一种两性离子胆汁盐，具有(N，N-二甲基氨基)丙烷磺酸盐部分。所有的洗涤缓冲液含有10mM的NaHPO4 pH8.0和15mM的NaCl，清水对照除外。对每一系列设置4个重复离心管，并补充2mM的SB-18，200μM SOS，2mM TMA-18或2mM CHAPS。2mM的SOS溶液产生抑制PCR反应的一种白色沉淀。因此，使用一种200μM的溶液。所有离心管接种200μl的结核分枝杆菌细菌贮存液，离心之前于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。4个重复的重复扩增以a、b、c和d表示，并且应该是相同的。直接等份的重复扩增表示于适当标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照。也对108、109、和1010个拷贝的杂交对照进行印迹。
结果表明SB-18是这一试验系列内能有效地起作用的唯一的去垢剂。重复实验已经导致下列结论：(a)SOS，除了十分昂贵之外，在使用的一些条件下可产生沉淀，和(b)虽然TMA-18和CHAPS似乎比SOS或清水对照作用更好，但两者都不能产生用SB-18经常看到的信号。
图7和7A所示的结果是根据图2所示的处理试验修改，并使用SB-系列的去垢剂(SB-12，SB-14SB-16和SB-18分别用于结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌)获得的。这些同类物只是烷基链的长度不同。除清水对照以外所有的20-洗涤缓冲液含有10mM的NaH-PO4pH8.0，15mM的NaCl和5mM的二硫苏糖醇。对每个系列处理4个重复离心管，所有的离心管用适当的去垢剂补充至2mM的终浓度。所用的离心管用20μl的结核分枝杆菌细菌贮存液(图7)或20μl的鸟分枝杆菌细菌贮存液(图7A)接种。所有的离心管在离心之前于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。对每个去污剂系列的4个重复的2次重复扩增以a，b，c和d表示，并且应该是一致的。直接等份的二次重复扩增表示于合适标记的线上。同时对0、20和100个拷贝的拷贝对照进行扩增，108、109、和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
如图7所示，SB-18和SB-16似乎产生相同的强度和一致分布的结果。或者，SB-14虽然在通过离心有利于回收结核分枝杆菌方面表现出极好的前途，但产生的结果具有因细菌凝块而产生的非均一分布的特征。SB-12，虽然其表现比水要好，但不如具有较高烷基链长度的同系物好。关于图7A的结果，从便利于鸟分枝杆菌的回收方面来说，这一系列的去污剂似乎起着相对同样的作用。这些结果相当典型，当使用结核分枝杆菌时除外，SB-16比SB-18一般产生较小均一性的结果。
在完成了产生图3的实验后，应该看到的是细菌凝块还是一个重要关心的问题。如实施例7中所讨论的，追求的研究线路是瞄准减轻这一现象。在随机筛选去垢剂的过程中，最先发现了本发明方法中的SB-18的实用性，并且根据其分散结核分枝杆菌结块的能力进行鉴定。所有SB-系列去污剂有利于收集结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的事实，结合鸟分枝杆菌作为单一细胞(如，不需要分散)生长的事实，表明SB系列的去污剂具有允许它的在本发明的方法中行使功能的共同点。不同的是：除了长链SB-同类物能够分散菌素外，所有类SB-18去垢剂以某种到目前为止尚未明确的方式，其有有利于回收这类有机体的能力。因此，这些数据说明SB-18作用的两种方式的机制。发明者在下面说明SB-18的这种双模式属性是如何延伸到其他的分子中的。
SB-系列去垢剂，也称磺丙基甜菜碱，是一个较大的，广泛类型的也称为甜菜碱的两性离子去垢剂的集合。SB-系列的两性离子去垢剂通过常规来源(如，Aldrich，Milwaukee，WI.；CalBiochem，LaJolla，CA；Fluka，Ronkonkoma，NY；和Sigma，St.Louis)可以得到。有很多同类结构的制造商，4种不同的样品最初从3个不同的制造商获得：Henkel公司(Hoboken，NJ)提供了”Velvetex AB-45”和”Velvetes BK-35”；Inolex化学公司(Philadelphia，PA)提供了”Lex-aine_C”；Goldschmidt化学公司(Hopewell，VA)提供了”TEGO_甜菜碱L5351”。Velvetex AB-45(CAS_No.68424-94-2)是一种椰子树羧甲基甜菜碱(R1＝椰子油，α＝-CH2-，R2，R3＝-CH3，R4＝-CH2-，β＝N_和γ＝-COO-：结构式见表2)；Velvetex BK-35(CAS_Number 61787-40-0)、Lexaine_C(CAS_Number 61789-39-7)和TEGO_甜菜碱L 5351(CAS_Number“专卖药”)，都为椰子树酰氨丙基羧甲基甜菜碱(α＝-C(O)NHC3H6-)。椰子油具有复杂的组成部分；然而，在甜菜碱的合成中使用这种油使R1由以下烷基链的混合物组成：45.4％的月桂烷基(C12)，18.0％的豆蔻烷基(C14)，10.5％的棕榈烷基(C16)，2.3％的硬脂烷基(C18)，0.4％的花生烷基(C20)，7.4％的油酸基(C18∶1)和5.4％的其他组成(油的组成成分由CRC Hand book of  Chemistry and Physics，55th ed.CRCPress，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193)汇编。
图8所示的结果是根据图2所示的处理试验修改，并使用商业上可以买到的、以上描述的甜菜碱制备物(Velvetex AB-45，Vel-vetex BK-35，Lexaine_C和TEGO甜菜碱L5351获得的。2mM的SB-18用作正对照，水用作负对照。所有的洗涤缓冲液含有10mM的NaHPO4，pH8.0和15mM的NaCl，清水对照除外。对每个系列准备4个重复的离心管，并补充适当的椰子甜菜碱去污剂至终浓度10mM。所有的离心管用20μl的结核分枝杆菌细胞贮存液接种。在离心之前，所有的离心管于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。对每个去污剂系列，4个重复的2次重复扩增分别以a、b、c和d表示，并且应该是相同的。直接等份的重复扩增表示于适当标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照。对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
显然，在通过离心，提高收集这些有机体的能力方面，这些商业制备液表现出某种程度的“类SB-18活性”。就烷基部分的组成和图7中提出的结果来说，按照演绎推理，这些制备物将预期，并确定以一种介于SB-12，SB-14和SB-16之间的直接方式表现出其行为。例如，它们提高回收率，但在分散这些有机体方面只具备有限的能力。应该注意的是，由于三种试剂据报道具有相同的结构(Vel-vetex BK-35、Lexaine_C和TEGO_甜菜碱L 5351)，它们将预期，并且确实起相同的作用。(注意二种具有不同的CAS_登记号。)所有三种试剂确定具有相同的作用效率的事实表明其表现不依赖于制造商。此外，即使这些制备物不纯，它们在该试验中也起作用。
下面对其他来源的类似甜菜碱的分子进行考查。提出这些分子的背景以便对检验多种同源结构的结果更好地进行讨论。甜菜碱方面的背景
甜菜碱为两性离子去垢剂分子，该分子本质上的一个正电负中心与一个负电荷中心分开。烷基可与阳离子，阴离子或隔离电荷的桥相连。表2给出最常见类型的甜菜碱的一般结构式，表2的讨论给出了很多例子。表3给出了有关甜菜碱的几种结构变化，表3的讨论给出了这些亚类的几个实例。阳离子，在绝大多数情况下为四价的氮。阴离子表现出较高程度的变化。例如，羧基甜菜碱，二氧磷基甜菜碱和磺基甜菜碱的ammonio形式在商业上很容易弄到。
除了上面提到的来源外，1994年版的”McCutcheon’s，CMc-Cutcheon’s，Volume1：Emulsifiers&Detergents，North AmericanEdition，MC Publishing，Glen Rock，NJ.P.290-291)列出了商业上可以买到的“甜菜碱衍生物”。目前存在有关甜菜碱的大量的科技信息，技术专门知识和生产能力。
本文陈述的结果表明，结构和行为特性的结合促进了甜菜碱在本发明的方法中起作用。对这类两性离子去垢剂显示的多样性和独特的性质(表2和表3)来说，对代表广泛结构变化的大量的甜菜碱进行考查，以估计这类同系物改善结核分枝杆菌收集的能力。表7总结了这些结构，来源和用来产生图9至9D的结果的甜菜碱的CAS_登记号。表7
    商品名       制造商             结构Structure   CAS_登记号
  图9：电荷组合
DeTaine PB   DeForest   十六烷基羧甲基甜菜碱(-COO_)   693-33-4
Custon ECOCHEM   C16酰氨丙基硫酸根合乙基甜菜碱(-OSO3 _) 58930-11-3
Custom   ECOCHEM   C18二氧磷乙基甜菜碱(-OPO3 _)   1267120-89-8
Custom KAO Chemical   C16-AHTMAP：“反向甜菜碱”(-N_(CH3)3) 99485-86-6
  图9A：桥结构
Ammonyx MO   Stepan   十四烷基二甲基胺氧化物(-O_)   3332-27-2
Custom   ECOCHEM   C18-羧乙基甜菜碱   30612-73-8
Custom   ECOCHEM   C18-磺丁基甜菜碱   22313-73-1
Custom   ECOCHEM   C16-羟丙基磺基甜菜碱   7425-12-9
Dravan NS R.T.Vanderbilt   C-癸基甜菜碱和C-十六烷基甜菜碱 95-56-0
  图9B：烷基和烷基连接基
    商品名     制造商           结构Structure    CAS_登记号
Velvetex AB-45 Henkel 椰子树羧甲基甜菜碱 68424-94-2
Miratainc ASC Rhone-Poulenc 烷基醚羟丙基磺基甜菜碱 108797-84-8
Schercotaine LAB Scher 异十八烷酰酰氨丙基羧甲基甜菜碱 6179-44-8
Velvetex OLB-50 Henkel 油基羧甲基甜菜碱 871-37-4
Incronam B-40 Croda 二十二烷基羧甲基甜菜碱 84082-44-0
图9C：天然油
TEGO Betaine L5351 Goldschmidt 椰子树酰氨丙基羧甲基甜菜碱 “Proprietary”
Crosultainc C-50 Croda 椰子树酰氨丙基羟丙基磺基甜菜碱 68139-30-0
Incronam BA-30 Croda 巴巴苏酰氨丙基羧甲基甜菜碱       -
Rewoteric AM-R40 Sherex Ricin酰氨丙基羧甲基甜菜碱   71850-81-2
Schercotaine WOAB Scher 小麦胚芽油酰氨基     未指定
图9D：天然油
Chembetaine S Chemron 大豆酰氨丙基羧甲基甜菜碱        -
Hetaine CLA Heterene Canol酰氨丙基甜菜碱        -
    商品名     制造商        结构Strueture     CAS_登记号
Crosultaine T-30 Croda 牛脂酰氨丙基羟丙基磺基甜菜碱          -
Rewoteric TEG Sherex 牛脂甘氨酸脂     70750-46-8
Crosultaine E-30 Croda Eruc酰氨丙基羟丙基甜菜碱          -
甜菜碱电荷结构考查
图6、7、7A和8的比较以及甜菜碱方面的讨论，表明并不是磺酸基，4价二甲基胺和十八烷基链独特的结合促进了类SB-18活性。相反的是，正是一个阴离子被一个阳离子分开以及两个离子共价连接于同一分子中的事实。图9所示的实验目的是检查通过类SB-18分子中相反电荷的共同存在创造的偶极矩的作用。图9所示的结果是根据图2所示的处理试验的一种修改的方法获得的，且使用了几种基于电荷和电荷结构变化的甜菜碱。两个分子从商业途径中得到，有三种是定做合成的。SB-18对照(CAS_No.13177-41-8为C18-磺丙基甜菜碱，从Sigma，St.Louis购买。SB-18使一个四价的二甲基胺与一个磺酸基(-SO3 _)组合。DeTaine PB(CAS_No.693-33-4)为羧甲基甜菜碱，是从DeForest，Inc.BocaRaton，FL.获得的样品。三个定做合成的中的二个承包给E-cochem，Inc.of Chaska，MN(所有化学特性鉴定由Ecochem.完成)。第一个定做的甜菜碱，C16-酰氨丙基硫酸根合乙基甜菜碱(CAS_No.58930-11-3)，使一个四价的二甲基胺与一个硫酸基(-OSO3 _)组合。C16-酰氨丙基硫酸根合乙基甜菜碱(C16-AmStB)是按照Parris N.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.53：97-100(1976)方法合成的。第二个定做的甜菜碱，C18-二氧磷乙基甜菜碱(CAS_No.126712-89-8)，使一个四价的二甲基胺与一个磷酸基(-OPO3 _)组合。C18-二氧磷乙基甜菜碱是按照Tsubone，K.et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.67：145-153(1990)的方法合成的。三个定做的甜菜碱中的第三个，C16-烷基-2-羟基-3-三甲基ammonio丙基磷酸酯(C16-AHTMAP：CAS_No.99485-86-6)属于表3描述的“反向甜菜碱”一类。C16-AHTMAP使一个四价的三甲基胺(γ＝-N_(CH3)3)与一个磷酸基(-OPO3 _)组合，然而，该分子唯一的特征是烷基与阴离子相连接。C16-AHTMAP由Kao Institute forFundamental Research，Tochigi，Japan惠赠，是按照Kurosaki，T.etal.，Chem.Soc.Japanll：1297-1301(1990)的方法合成的。C16-AHTMAP化合物的结构由Ecochem of Chaska，MN.证实。SB-18被认为为阳性对照，水被用作阴性对照。所有的洗涤缓中液含有10mM的NaHPO4，pH8.0和15mMNaCl，清水对照和C16-AmStB除外，C16-AmStB用1mMTris-HCl，pH8.0分散。对每个系列准备四个重复的离心管，并用合适的去垢剂把终浓度补充至2mM，C16-AmStB除外(它以200μM的终浓度使用)。所用离心管接种20μl的结核分枝杆菌细菌贮存液。然后，离心之前所有离心管于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。对每个去垢剂系列，四个重复的两次重复扩增以a、b、c和d表示，且应该是一致的。直接等份的两次重复扩增表示于适当标记的线上。同时对0、20和100个拷贝的拷贝对照进行扩增，对108、109和1010个拷贝的杂交对照进行印迹。
如图9所示，在该试验中，所有试验的去垢剂工作都一样好。根据本文陈述的争论，反向甜菜碱以类似于SB-18的方式起作用的事实表明所有类甜菜碱分子具有类SB-18活性。这一共同点的基础被认为是相反电荷紧密邻近的共同存在，由此创造一个具有较大偶极矩的电中和分子。Laughlin，R.G.Langmuir 7：842-847(1991)最佳地总结了这种结合的结果：“两性离子功能基团具有在非离子类型的亲水基团中发现的最大的极性”。这里描述的试验中不同的离子基团可以交换使用的事实识别出头部基团的极性度，作为这些去垢剂的区别特征。例如，聚氧乙烯基团产生的极性度，虽然是电中和的并与SB-18的ammonio一丙烷磺酸酯部分具有大致相同的分子大小，但比较起来却无关紧要。通过比较Brij 76(CAS_No.9005-00-9)和具有十八烷基磺酸钠的SB-18的CMC和Krafft点，用例证说明了这一点。Brij 76(十八烷酰-乙烯氧化物(C18E10))有约3×10-5M的CMC(由：Schott，H.et al.，J.Phar.Sci.64：658-664(1975)根据油基当量估计)，45.5℃的Krafft点和64℃的浊点(Schott，H.et al.，J.Phar.Sci.65：979-981(1976))。SB-18具有大约2×10-6M的CMC(Nandakumar，T.N.et al.，J.Oil Tech.As-soc.India 11：31-34(1979)，在纯水中具有89℃的Krafft点，在10mM NaCl中具有37.5℃的Krafft点(Tsujii，K.et al.，J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978))。十八烷基磺酸钠在浓度为7.5×10-4M时，临界温度为57℃(Tartar，H.V.et al.，J.Am.Chem.Soc.61：539-544(1939))。SB-18是较不容易溶解的(如，最低的CMC)，但在盐存在时具有最低的Krafft温度(如，水合晶体最低的熔解温度)。显然，CMC，Krafft温度和极性之间的相互关系是复杂的；，然而，两性离子在电解质存在时结构水的显著的能力似乎是起作用的关键。因此，参看表2和表3以及考查列出的阳离子和阴离子时，可以想象大量的另外的离子，组合它们可以产生发明方法中的功能性甜菜碱。甜菜碱桥结构的考查
图9陈述的结果表明甜菜碱结构的重要特征是相反电荷的存在。这些数据，与甜菜碱桥结构的重要性相结合，也表明在桥结构和烷基链范围内允许实验中胶胶分子团的形成，甜菜碱将显示出类SB-18活性。图9中使用的结构的考查表明DeTaine PB具有甲基桥，硫酸根合乙基甜菜碱和二氧磷乙基甜菜碱具有乙基桥，SB-18具有丙基桥，C16-AHTMAP具有羟丙基桥。图9A所示的结果显示出另外的桥结构和电荷组合。
图9A所示的结构是根据图2所示的处理试验的修改的方法获得的，且利用了基于分离电荷的桥结构变化的几种甜菜碱。两个分子从商业途径获得，三个是通过定做合成的。Ammonyx MO(CAS_No.3332-27-2)是一种C14-二甲基胺氧化物(桥为一个No键：N_-O_)，是从Stepan Company，Northfield，IL.获得的样品。还应该注意的是：Ammonyx MO在图9中讨论的偶极矩结构上被认为有别的变化。Daryan NS为如表3中描述的一种烷基甜菜碱(烷基结合到桥上)，是从R.T.Vanderbilt，Norwalk，CT.获得的样品。制造商声明Darvan NS为一种C-癸基甜菜碱(CAS_No.96-55-9)和C-十六烷基甜菜碱(CASRNo.95-56-0)的混合物，对每一种的比例未作说明。三种定做合成承包给Ecochem，Inc.of Chaska，MN(所有的化学特征由Ecochem进行鉴定)。
第一个定做的甜菜碱，C18-羧乙基甜菜碱(CAS_No.30612-73-8)，具有一个乙基桥(R4＝-CH2CH2-)，是按照Weers，J.G.etal.，Langmuir 7：854-867(1991)方法合成的。第二个定做的甜菜碱，C16-磺丁基甜菜碱(CAS_No.22313-73-1)，具有一个丁基桥，是按照Parris，N.et al.，J.Am.Oil.Chem.Soc.53：97-100(1976)的方法合成的。第三个定做的甜菜碱，C16-羟丙基磺基甜菜碱(CAS_No.7425-12-9)，具有一个2-羟丙基桥(R4＝-CH2CH(OH)CH2-)是按照Parris，N.，et al.，J.Am.Oil Chem.Soc.53：60-63(1976)的方法合成的。2mM的SB-18用作正对照，水用作负对照。所有的洗涤缓中液含有10mM的NaHPO4(磷酸钠缓冲液，一种NaHPO4和Na2HP4的混合物)，pH8.0和15mM的NaCl，清水对照除外。对每个系列准备四个重复的离心管，并补充适当的去垢剂使终浓度至2mM，Daryan NS除外，该去垢剂的浓度调到10mM的终浓度。所有的离心管用20μl的结核分枝杆菌细菌贮存液接种。所有的离心管在离心之前于37℃振荡(140rpm)培养60分钟。每个去垢剂系列的四个重复的二次重复扩增以a、b、c和d表示，且应该是一致的。直接等份的二次重复扩增表示于合适标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照，对108，109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
另外，除了C16-羟丙基磺基甜菜碱外，所有试验的化合物在本发明的方法中起作用。特别地，所有试验的化合物均表现出类SB-18活性。有趣的是，Daryan NS，一种C10和C16甜菜碱的混合物，只是勉强地起作用。虽然其每个甜菜碱的比例尚不清楚，但DarvanNS为一种特别稀的液体，甚至稀薄得象椰子树衍生物，表明它具有很高浓度的C10衍生物。无论如何，C-烷基表现出某种程度的类SB-18活性。用胺氧化物的另外的实验表明这种结构具有极佳的功效，虽然总是可以观察到细菌成团。不幸的是，与临床条件下增加AO链的长度可能是不容许的。例如，C18-AO的Krafft温度接近43℃，具有盐析型的性质(Tsujii，K.et al.，YuKagaku30：495-499(1981))。此外，如图9所预计的一样，胺氧化物提供了偶极矩结构变异的另外的例子。总之，C18-羧乙基甜菜碱和C18-磺丁基甜菜碱都有类似SB-18的行为：用这两种甜菜碱的几个处理实验常常产生相当一致的结果。
C16-羟丙基磺基甜菜碱不能通过离心促进细菌的回收可以通过加入NaHPO4之后去垢剂沉淀的事实来解释。根据有关甜菜碱桥结构与各种离子相互作用的信息，技术人员可以改进系统参数，以便可以使用C16-羟丙基磺基甜菜碱。例如，如果一个4～5A的电荷间距为允许盐溶的最小的电荷间的距离(丙基距离约为5.5A(Tsujii K.etal.，YuKagaku 30：495-499(1981))，盐溶行为的加快遵循该趋势：对阴离子为SCN_＞I_＞NO3 _＞Cl_，对阳离子为K_ ≈NH4 _＞Na_(Tsujii，K.et al.，J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978))，那么人们可以改进缓冲液组成以促进对C16-羟丙基磺基甜菜碱的利用。图10中提出了和讨论了这些实验结果。
这些数据使得人们同意Laughlin，R.G.Langmuir 7：842-847(1991)的观点，即甜菜碱的功效绝大部分对桥的结构比电荷结构有更大程度的依赖性。换句话说，桥使得在系统条件下可以形成胶束。似乎正是同一分子中电荷的共同存在才促进了本发明的方法中的这些去垢剂的使用。因此，桥结构的重要性似乎主要是在试验条件内允许给定去垢剂大量呈现的功能。例如，如果在给定试验温度、电解质和电解质浓度下，桥容许胶束形成，那么甜菜碱将显示类SB-18活性。烷基和烷基键对甜菜碱功能的考查
对用于产生图9和9A的结果的实验中的结构进行更仔细的考查发现本发明的方法中使用了一种复杂排列的烷基结构。例如，C10、C14、C16和C18直链烃是这些例子中疏水结构域(R1)的基础。此外，硫酸根合甜菜碱使用了一个酰氨丙基连接键共价地把烷基与四价氮结合起来。其含义是甜菜碱的功能甚至更少地依赖于烷基结构，也就是说，在电荷、桥结构和烷基结构相结合容许本试验内胶束形成的限度内，甜菜碱将显示类SB-18活性。为了进一步举例说明这一观点，试验了几种其他的甜菜碱，图9B所示的结果是根据图2所示的处理试验的一种修改方法获得的，并且使用了基于烷基结构，组成和与四价氮的连接键的变化的几种甜菜碱。所用5个分子都是从商业途径获得。Velvetex AB-45(CAS_No.68424-94-2)利用椰子油作为烷基键的来源(上面已给出椰子油的组成成分)，是从Henkel Corporation，Emery Group Cospha，Hoboken，NJ.获得的样品。Velvetex AB-45烷基键为烷基链的简单延伸。MirataineASC(CAS_No.108797-84-8)利用3-丁基-2-羟基功能基作为把烷基部分与四价氮相键合的连接部分，是从Rhone-Poulenc，Surfactants&Specialty Division，Cranberry，NJ.获得的样品。CAS_登记号信息表明其结构为：“1-丙烷铵，3-丁氧基-2-羟基-N-(-2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-，内盐。”这种液体的粘性表明近似十二烷基的烷基与丁氧基相连接，其具体的结构尚不清楚。SchercotaineIAB(CAS_No.6179-44-8)利用酰氨丙基排列把烷基部分与四价氮连接起来，是从Scher Chemical，Inc.Clifton，NJ.作为样品获得的。制造商阐明烷基是一个“异硬酯酰”，表明该分子可能以某种未确定的方式产生枝链。然而，CAS_登记号信息说明烷基结构为“十八烷基”。Velvetex OLB-50(CAS_No.871-37-4)使用一个油基(C18∶1)作为烷基链(例如，引入一个双键)，它作为样品是从Henkel Corporation，Emery Group Cospha，Hoboken，NJ.获得的。Incronam B-40是-个特别长的烷基链(C22)，作为样品是从Crada，Inc.，Parsippany，NJ.获得的。没有给出Incronam B-40CAS_登记号；然而，在美国以外由同一制造商销售的一个类似的产品具有相同的商品名，其活性成分被列为“bethanamido”，其CAS_登记号为84082-44-0。CAS_登记号信息说明烷基组成为一种C8-C22的混合物。两者都以糊状物的形式销售，表明以特别长的烷基链为主。只有通过以10∶1的异戊醇∶水混合物溶解一部分糊状物才能产生Incronam B-40去垢剂贮存液。2mM的SB-18用作正对照，水用作负对照。所有洗涤缓冲液含有10mM的NaHPO4，pH8.0和15mM的NaCl，清水对照除外。对每个系列准备四个重复的离心管，并用适当的去垢剂把终浓度补充至2mM，Ineronam B-40除外，其终浓度调至200μM，在这些条件下，去垢剂出现絮状沉淀。所有的离心管用20μl的结核分枝杆菌细菌贮存液接种。所有的离心管在离心之前于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。对每个去垢剂系列，四个重复的二次重复扩增以a、b、c和d表示，并且应该是相同的。直接等份的二次重复扩增表示于合适的标记线上。同时扩增0、20和100拷贝的拷贝对照，对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
另外，所有这些甜菜碱，降了Incronam B-40外，均表现出类SB-18活性。在这些实验中，Velvetex AB-45产生的结果比图8中所见到的结果稍微一致一些。Mirataine ASC，其链的长度尚不清楚，为一种非常稀的的液体，似乎不能分散分枝杆菌。由于细菌成团，用较短链的甜菜碱才能典型地看到这些结果。Schercotaine IAB和Velvetex OLB-50都为十八烷基去垢剂，前者为一个饱和链，后者为一个不饱和链。这两种甜菜碱产生用SB-18时通常见到的结果：用这些甜菜碱处理产生相当一致的结果，用未提纯的样品可观察到稍多的变异。明显的结论是，在烷基部分在系统条件下容许胶束形成的范围内，似乎正是同一分子中电荷的共同存在促进了本发明方法中这些去垢剂的使用。Incronam B-40，与C16-羟丙基磺基甜菜碱(图9A)相似，一旦加入到NaHPO4中即产生沉淀，因此，并不期望表现出相同程度的功效。根据有关甜菜碱结构与各种电解质相互作用的信息，Incronam B-40预计将比C16-羟丙基磺基甜菜碱存在一个更加困难的问题。例如，如果4～5的电荷间距为容许盐溶的最小电荷间距离(甲基距离将约为3.1A(Tsujii，K.et al.Yuka-gaku 30：495-499(1981))，盐析行为的加剧遵从下列趋势：对阴离子为SCN_＞I_＞NO3 _＞Cl_，对阳离子为K_≈NH4 _＞Na_(Tsujii，K.etal.J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978))，那么在改进缓冲液的组成以努力促进Incronam B-40的使用方面，人们将受到限制。换句话说，人们将被局限于简单地把电解质减少到最小，大体上与离子去垢剂相似的情况。图10中陈述和讨论了进行这一研究努力的结果。来源于天然油的甜菜碱
绝大多数商业上可购得的甜菜碱来源于天然油，主要是椰子油。根据图8、9、9A和9B的结果，这些甜菜碱也应该在本发明的方法中起作用。图9C和9D所示的结果使用了几种不同的甜菜碱，所有的烷基一律来源于天然油。烷基长度，烷基结构，烷基混合物，四价氮的连接基，桥的结构以及阴离子部分在这些结构中有所不同。本质上，这些甜菜碱给进一步研究甜菜碱分析的各方面的相互关系提供了独特的机会。首先将描述每个实验，接着再通过两个图来讨论。
图9C中所示的结果是根据图2中所示的处理方法的修改方法获得的。并且使用了完全来源于天然油的几个甜菜碱。所有5种分子都来源于商业途径。TEGO Betaine L535 1(CAS_No.”Propri-etary”)为一种羧甲基甜菜碱，它利用椰子油作为烷基链的来源与一个酰氨丙基键相结合。TEGO Betaine L5351作为样品从HenkelCorporation，Emery Group Cospha，Hoboken，NJ.获得。来源于Cocosnucifera的椰子油为一种复杂的脂肪酸混合物，具有如下组成：45.4％的月桂基(C12)，18.0％的豆蔻基(C14)，10.5％的棕榈基(C16)，2.3％的硬脂基(C18)，0.4％的花生酯基(C20)，7.4％的油基(C18∶1)和5.4％的其他组成(油的组成成分由CRC Handbook of Chemistry andPhysics，55th ed.CRC Press，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193汇编)。Crosultaine C-50(CAS_No.68139-30-0)为一种磺基甜菜碱，它利用羟丙基桥和椰子油作为烷基链的来源，与一个酰氨丙基键相结合。Crosultaine C-50是从Croda，Inc.，Parsippany，NJ.作为样品获得的。Incronam BA-30(没有说明CAS_No.)为一种羧甲基甜菜碱，它可能利用“巴巴苏油”作为疏水结构域的基础，与一个酰氨丙基键相结合。Incronam BA-30作为样品是从Croda，Inc.，Par-sippany，NJ.获得的。来源于Attalea funifera的巴巴苏油是一种复杂的脂肪酸混合物，具有以下组成：44.1％的月桂基(C12)，15.4％的豆蔻基(C14)，8.5％的棕榈基(C16)，2.7％的硬脂基(C18)，0.2％的花生酯基，16.1％的油基(C18∶1)，1.4％的亚油酸基(C18∶2)和11.6％的其他成分(油的组成成分由CRC Handbook of Chemistry and Physics，55th ed.CRS Press，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193)汇编。Rewoteric AM-R40(CAS_No.71850-81-2)为一种羧甲基甜菜碱，它可能用蓖麻油作为烷基链的来源，并与一个氨胺键结合。Re-woteric AM-R40作为样品是从Sherex Chemical Company，Dublin，OH获得的。来源于Ricinus communis的蓖麻油为一种复杂的脂肪酸混合物，但主要由蓖麻酸(87％)，和油酸(7.4％)和亚油酸(3.1％)组成(油的组成成分由CRC Handbook of Chemistry and Physics，55th ed.CRC Press，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193汇编)。蓖麻酸，或12-羟基-9-十八烯酸(顺式)，为一个不饱和的-C18链，其结构为：C6H13CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7COOH。亚油酸，或9，12-十八碳二烯酸，也是一个不饱和-C18链，具有以下结构：CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7COOH。SchercotaineWOAB(CAS_No.“未指定”)可能是一种羧甲基甜菜碱，它用麦胚油作为烷基链的来源并与一个氨胺丙基键相结合。SchercotaineWOAB作为样品从Scher Chemicals，Inc.，Clifton，NJ.获得。来源于Triticum aestivum的麦胚油是一种复杂的脂肪酸混合物，但主要由亚油酸(52.3％)，油酸(28.1％)和亚麻酸(3.6％)组成。大约16％的剩余部分为月桂酸，豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸和花生酸的混合物(油的组成成分由CRC Handbook of Chemistry and Physics，55th ed.CRC Press，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193汇编)。亚麻酸，或9，12，15-十八碳三烯酸(顺式，顺式，顺式)也是另一种不饱和-C18链，其结构为：CH3〔CH2CH＝CH〕3(CH2)7COOH。2mM的SB-18作为正对照，水用作负对照。所有的洗涤缓冲液含有10mM的NaHPO4，pH8.0和15mM的NaCl，清水对照除外。对每个系列准备四个重复的试管。Incronam BA-30，Rewoteric AM-R40，和Schercotaine WOAB加入至各自的洗涤缓冲液中至终浓度为2mM，TEGO，Betaine L5351和Crosultaine C-50调至终浓度为10mM。加到磷酸钠缓冲液中时这些去垢剂都不产生沉淀。所有的离心管用20μl的结核分枝杆菌细菌贮存液接种。所有的离心管在离心之前于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。对每个去垢剂系列的四个重复的二次重复扩增以a、b、c和d表示，且应该是完全一致的。直接等份的二次重复扩增表示于适当标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照。对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
图9D中所示的结果是根据图2中所示的处理试验的修改方法获得的，使用了几种完全来源于天然油的甜菜碱。这些结构依烷基长度，烷基结构，烷基混合物，四价氮的连接基，桥的结构及阴离子部分不同而不同。所有5种分子均来源于商业途径。Chembetaine S(CAS_No.未阐明)为一个羧甲基甜菜碱，它利用大豆油作为烷基链的来源，并与一个酰氨键相结合。Chembetaine S是作为样品从Chemron Corporation，Paso Robles，CA.获得的。来源于Glycine soja的大豆油为一种复杂的脂肪酸混合物，但主要由亚油酸(50.7％)，油酸(28.9％)和棕榈酸(9.8％)组成。其他成分包括：亚麻酸(6.5％)，硬脂酸(2.4％)和花生酸(0.9％)(油的组成成分由CRC Handbookof Chemistry and Physics，55th ed.CRC Press，Cleveland，OH(1974).D-192-193汇编)。Hetaine CLA为结构不明的一种甜菜碱，它利用canola油为烷基链来源，与一个酰氨键相结合。Hetaine CLA是作为样品从Heterene，Inc.Paterson，NJ.获得的。“canola油”的组成尚不清楚。Crosultaine T-30(没有给定CAS_No.)为一种磺基甜菜碱，它具有一个羟基丙基桥和作为烷基链来源的动物脂，与一个酰氨链相结合。Crosultaine T-30是作为样品从Croda，Inc.，Parsip-pany，NJ.获得的。动物脂典型地来源于牛肉(Bovis taurus)或羊肉(Ovis aries)。来源于牛肉的脂具有以下组成成分：49.6％的油酸、27.4％棕榈酸、14.1％的硬脂酸、6.3％的豆蔻酸和2.5％的亚油酸。来源于羊肉的脂具有以下组成成分：36.0％的油酸，24.6％的棕榈酸，30.5％的硬脂酸，4.6％的豆蔻酸和4.3％的亚油酸(油的组成成分从CRC Handbook of Chemistry and Physics，55th ed.CRC Press，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193汇编)。用于生产CrosultaineT-30的动物脂来源尚不清楚。Rewoteric TEG(CAS No.70750-46-8)为一种双-羟乙基甘氨酸酯它具有作为烷基来源的动物脂。Rewoteric TEG是作为样品从Sherex Chemical Compan，Dublin，OH获得的。用于生产Rewoteric TEG的动物脂来源尚不清楚。Crosul-taine E-30(未给定CAS_No.)为一种磺基甜菜碱，它利用一个羟丙基桥和油菜籽油作为烷基链的来源，与一个酰氨键相结合。Crosul-taine E-30是作为样品从Croda Inc.Parsippany，NJ.获得的。来源于Brassica campestris的油菜籽为一种复杂的脂肪酸混合物，但主要由50％的erucic酸，32％的油酸和15％的亚油酸组成(油的组成成分从CRC Handbook of Chemistry and Physics，55th ed.CRC Press，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193汇编)。erucic酸，或顺-13-廿二烯酸，具有一个不饱和的-C20链，其结构为：CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)11COOH。
最初，Hetaine CLA，Crosultaine T-30，和Crosultaine E-30在加入至NaHPO4中时都出现沉淀(终浓度：2mM的去污剂)。因此，对一些条件进行改变，使用50mM的Tris-HCl pH8.0.2mM的SB-18用作正对照(在典型的10mM NaHPO4，pH8.0，15mM NaCl缓冲液中)，水用作负对照。去污剂洗涤缓冲液含有50mMTris-HCl pH8.0，清水对照除外。对每个系列准备四个重复的离心管。将Chembetaine S和Rewoteric TEG分别加入至各自的洗涤缓冲液中，至终浓度为2mM，Hetaine CLA，Crosultaine T-30和CrosultaineE-30的终浓度调至200μM。在Tris缓冲液中，Hetaine CLA和Crosultaine E-30似乎较浑浊，而Crosultaine T-30却保持清澈，然而，在其中的一个实验中最终离心出现沉淀(未表示出)。所有的离心管用20μl的结核分枝杆菌细菌贮存液接种。所有的离心管在离心之前于37℃下振荡培养(140rpm)60分钟。对每个去垢剂系列的四个重复的二次重复扩增用a、b、c和d表示，且应该是相同的。直接等份的二次重复扩增表示于适当标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照，对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
图9C和9D中描述的甜菜碱被选择来考查有关在本发明方法中的功效方面，烷基部分的混合物，复合烷基结构，不同的电荷组合和不同的键合的效果。正如用图9B得出的结论，烷基结构的改进对本发明的方法影响很小，在这些结构容许在主要系统参数下胶束形成的范围内。换句话说，如果电荷，桥结构和烷基可组合到形成胶束的程度的话，那么甜菜碱将可通过离心增加结核分枝杆菌的回收。动物脂，椰子，巴巴苏，油菜籽和麦胚油提供了一个广谱的复杂的饱和和不饱和烷基的混合物，蓖麻油利用一个羟基化的烷基。除Re-woteric TEG外，疏水部分通过一个酰氨基团与四价的氮相连接，且作为一个基团，这些结构用于连接羧甲基或羟丙基磺基部分。基于有关相对于甜菜碱功效的桥结构信息，亚甲基桥和羟丙基桥都有降低利用本文描述的试验中的较长烷基链的能力。然而，通过使用酰氨丙基链在某种程度克服了降低的溶解度。
TEGO Betaine L5351和Crosultaine C-50在该实验中产生比典型地看到的(图9C)结果更加一致的结果。Incronam BA-30，另外一种主要由短链组成的油，产生更有成团特征的扩增格式，但在改善回收率方面总的来说还是显示出类SB-18活性(图9C)。这里用Rewoteric AM-R40和Scherotaine WOAB表示的结果相当典型：这里也观察到因细菌成团产生的扩增格式。另外一种去垢剂，主要为十八烷基，典型地表现出比预期的更多的细菌团块，该去污剂即为ChembetaineS。人们由结果推测这些十八烷基去污剂预期都有类似的行为表现。例如，SB-18，C18-羧乙基甜菜碱和C18-横丁基甜菜碱(图9A)，Velvetex OLB-50和Schercotaine IAB(图9B)，Re-woteric AM-R40和Scherocotaine WOAB(图9C)，和ChembetaineS，Crosultaine T-30，Rewoteric TEG和Crosultaine E-30(图9D)都主要由饱和或不饱和类十八烷基的链组成。虽然所有的都比短链在改善收集方面作用更好，但在减轻细菌成块方面这些长链的作用却都有不同。或许通过使用各种链长的混合物增加去垢剂的复杂性，或包括双链或其他的象羟基一样的功能基，使溶解与菌索有关的霉菌酸和类脂的能力遭到破坏。或者，许多这些商业制备物是未经过提纯的，或许这一因素影响总的功效。
或许图9C和9D中试验的最有趣的组合是Hetaine CLA，Cro-sultaine T-30和Crosultaine E-30提供的那些组合。“canola油”，如果Hetaine CLA的制造商是指玉米油，那么来源于玉米的玉米油为一种复杂的脂肪酸混合物，但主要由油酸(49.6％)，亚油酸(34.3％)和棕榈酸(10.2％)组成(油的组成成分编自CRC Handbook ofChemistry and Physics，55th ed.  CRC Press，Cleveland，OH(1974)pp.D-192-193)。Velvetex OLB-50(油基羧甲基甜菜碱)可以毫无问题地起作用的事实表明，Hetaine CLA烷基混合物(其粘度较大)稍微有些不同，可能包含能增加非离子特性的一些基团(如，羟丙基磺基甜菜碱)。由于Rewoteric TEG在毫无刺激因素下起作用(例如，它们都利用牛脂)，因此Crosultaine T-30提出的小的溶解性问题的事实是针对阴离子的可溶性(-coo_对-SO3 _)和桥的羟基化作用的性质而言的。Crosuhaine E-30也许是最极端的一种甜菜碱：它主要由不饱和C20和C18部分组成，并且它利用一个具有磺酸基阴离子(-SO3 _)的羟丙基桥。
然而，图9D最有趣的一面是用Hetaine CLA和Crosultaine E-30时出现似乎是混沌的溶液(如，浊点)。与C16-羟丙基磺基甜菜碱(图9A)相反，这两种甜菜碱均在本发明的方法中起作用。这些结果不是自相矛盾的。相反，浊点被认为是由非离子的亲水部分的脱水作用造成的，和因为浊点与KraHt温度相比，并不是充分明确定义的温度，当观察到浑浊现象时分子态胶团还能存在。总之，在浑浊开始出现时，分子团的重量和聚集数随温度增加而逐渐增加，当温度进一步增加时，最终出现相分离(Nakagawa，T.et al.，In：ColloidalSurfactants，Academic Press，New York(1963)pp.121-135)。因此，由于Hetaine CLA和Crosultaine E-30并不经过相分离过程，预期它们将在处理试验中起作用。
Nilsson，p.et al.，J.Phrs.Chem.88：6357-6362(1984)已经观察到了磺基甜菜碱的浊点，Faulkner，P.G.et al.，Langmuirs：924-926(1986)描述了磺基甜菜碱中桥的羟基化作用时发生的变化。这些结果有趣的一点是一种甜菜碱，C16-羟丙基磺基甜菜碱，其表现象一个离子去垢剂，在磷酸缓冲液中出现盐析；而一种不同的但又非常紧密相关的甜菜碱，Crosultaine E-30(一个C20∶1-，C18∶l-和C18∶2-酰氨丙基羟丙基磺基甜菜碱)，其表现象一个非离子去垢剂和出现浑浊(为该讨论的目的，Hetaine CLA的结构尚不清楚)。除了对与酰氨键，羟丙基桥，和烷基链长度相互作用有关的甜菜碱结构提出了几个非常有趣的例子外，这些观察资料提出了加入电解质后可预测的反应。例如，C16-羟丙基磺基甜菜碱与一个不同的离子(如碘化钾(KI)而不是NaHPO4)一起时其溶解度应该增加，这是由于Krafft点升高的效果(Tsujii，K.et al.J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978)；Tsujii，K.et al.，Yukagaku：30：495-499(1981))，而加入同一离子预期会加剧Hetaine CLA和Crosultaine E-30的浊点(Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.64：658-664(1975))Scott，H.etal.，J.Pharm.Sci.65：979-981(1976))。事实上，正如预计的一样，加入100mM的碘化钾提供了一种清澈的C16-羟丙基磺基甜菜碱溶液，但对Crosultaine E-30和Hetaine HLA却使浑浊度变得更糟。因此，后两种去垢剂的使用需要把盐浓度减少至最低。总之，酰氨丙基的功能似乎增加了非离子特性。例如，通过增加去垢剂的亲水部分增加酰氨丙基部分总的头部基团类似于Hsiao，L.et al.，J.Phys.Chem.60：657-660(1956)讨论的增加聚氧乙烯基团数量。
然而，使用这里所述的商业样品的主要问题之一是其各自的纯度。例如，SB-18(Sigma，St.Louis，MO)是以提纯的内盐提供的，其说明的纯度为98％。Incronam B-40，Hetaine CLA，Crosultaine T-30和CrosultaineE-30都是以反应产物的粗制混合物提供的。制造商说明的这每一种原料的活性物质百分率分别为：44％-48％；38％-42％，30％-34％；和30％-34％。此外，每种原料注明的盐(Na-Cl)含量分别为：4.2％-4.6％，5％；2.4％-4.0％；和2.5％-4.0％。由于所注明的含量的缺陷，试图产生2mM的这些去垢剂的任何一种溶液时也会产生一种于NaCl中为3-4mM的溶液，该溶液在某些情况下，将产生一种不能使用的溶液
图10考查了不同的试验参数，为便利地使用C16-羟丙基磺基甜菜碱，Incronam B-40，Hetaine CLA，Crosultaine T-30和Crosul-taine E-30对基进行改进。试验条件改变如下：C16-羟丙基磺基甜菜碱和Crosultaine T-30缓冲液由10mM的Tris-HCL pH8.0和50mM KI组成。每种在2mM的去垢剂浓度时为清澈的溶液。In-cronam B-40，Hetaine CLA和Crosultaine E-30缓冲液仅为200μM Tris-HCL pH8.0。每种去垢剂在200μM时为清澈溶液。每种缓中液也平衡至37℃。SB-18对照使用10mM的Tris-HCLpH8.0和50mM KI缓冲液。对每个系列设置四个重复的离心管。所有的离心管用200μl的结核分枝杆菌细菌贮存液接种。所有的离心管在离心之前于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。每个去垢剂系列的四个重复的二次重复以a，b，c，和d表示，并且应该是一致的。直接等份的二次重复扩增表示于适当标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照，对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
尽管Hetaine CLA，Crosultaine T-30，和Crosultaine E-30在最初的条件下能起作用(图9D)，但Incronam B-40和C16-羟丙基磺基甜菜碱在其功能方面遭到了严重的破坏。该实验表明的是，根据甜菜碱的物理性质，对试验条件作预测性的修改以容许使用一个不至于没有功能的化合物。此外，本实验说明了呈现去垢剂功能的重要性(如，在胶束相中)。结论
鉴于，C12-C16烷基链使得更好地分离所有的分枝杆菌，C18-C22烷基链也能使菌素化的分枝杆菌遭到破坏。二甲基，四价氮，与一个羧基阴离子(-COO-)相结合以一种经济有效的方式产生最高程度的可溶性。最优选的桥结构为一个最少为三个碳原子(如，丙基桥)的直链烷基(如，不经修饰的)。尽管酰氨丙基连接基的效果难于辩别，该链只简单地需要一个疏水结构域的延伸。C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)结合了可溶性，桥结构和离子性质的最理想的特征，同时还可相对简单地合成(JPAPPl.No.79100920〔54-100920〕；JP8125139)。
对本文使用的C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)来说，以下方法(由Dr.Lafayette D.Foland at the Clorox Technical Cen-ter，Pleasanton，CA提供通讯)被用于制备该化合物：
(1)在氩气下，将1当量(0.1摩尔或29.7克)的N，N-二甲基十八烷基胺(297克/摩尔：CAS_No.124-28-7)加至1.1当量(0.11摩尔或19.9克)的溴丁酸乙酯(195克/摩尔：CAS_No.2969-81-5)中形成纯净的溶液。
(2)把烧瓶置于50℃-60℃的油浴中，搅拌溶液(于氩气下)过夜。形成大的白色块状物。〔泣意：这是一个相当放热的反应。加快该反应重要的是调节温度不致于分解中间产物。〕
(3)向反应产物中直接加入600ml的异丙醇，并立即加入150克的活化的阴离子交换树脂AG-1-x8(Bio-Kad No.140-1422)，或具有氢氧化物反荷离子的相当的阴离子交换树脂，如AmberliteIRA-400OH(Sigma IRA-440C)至烧瓶中，搅拌悬浮液过夜。〔注意：通过用1升5％的NaOH与150克的树脂相混合活化(或重新活化)阴离子交换树脂。使用之前，用5升的蒸馏水洗涤柱子中的树脂。可以大量减少树脂的量，这可以用常规的方法测定。〕
(4)通过过滤去掉阴离子交换树脂。
(5)在一个Rotovap上去掉溶剂，并把产生的固体置于一高压真空管中过夜。
(6)按如下方法两次重复结晶原料如下：
把干燥的甜菜碱置于400ml的酯中，并使之沸腾。向烧瓶中滴加甲醇至物质刚好溶解为止。把烧瓶冷却至室温(白色晶体几乎马上开始形成)。把烧瓶置于0-4℃下过夜。通过过滤移出结晶物质并置于高压真空管中过夜。〔注意：从阴离子交换树脂上稀放的物质相当纯，如果只需95％的纯度，那么只需一次重复结晶，或可能不需重复结晶。也应注意的是，双质子无极性溶剂也可以代替醚。〕
该方法将产生约20克的纯化的C18-羧丙基甜菜碱(大约50％的产率)。N，N-二甲基十八烷胺可从AKZO，Inc.(No，ArmeenDM 18D)，American Tokyo Kasei，InC.(No.D1609)和Pfaltz&Bauer，InC.(No.D42680)买到。溴丁酸甲酯可从Aldrich(No.16，711-8)和Huka(No.16540).弄到。注意溴丁酸乙酯可以代替Kazuo(JP8125139)专利使用的碘丁酸甲酯使用；类似地，Sigma的Amberlite IRA-400OH阴离子交换树脂也可代替Bio-rad的AG1-x8使用。具有412克/摩尔的中间产物将有2.4m摩尔/克。按照Sigma的目录号，Amberlite树脂具有4meq/克的能力。一般地，一次重复结晶以减少盐浓度即足够。
注意，C18一羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)特别具有制菌作用，本发明试验中该化合物的浓度大于2mM即可导致不理想的细菌裂解效果。
因此，试验条件的重要方面为温度、pH、离子强度和特异电解质。例如，一般地，pH大于5.0，但小于9.0，对许多甜菜碱保持两性离子是绝对必需的。对正在使用的特异的类SB-18去垢剂，处理温度必须保持在其krafft温度以上。例如，SB-18的处理温度必须保持在37℃或以上(Tsujii)K.etal.，J.Phys.Chem.82：1610-1614(1978)，而C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)的处理温度则必须维持在仅仅为25℃的温度(Tsujii，K.et al.，Yukakayu30：495-499(1981))。离子强度与使用的离子相互关联。例如，为了使氯化钠的盐溶增加到最大，比当使用象碘化钾的盐时需要更高的浓度。
当考虑选择PCR扩增为检测方法时，氯化钾虽然不是很理想，但也是满意的，并且在相对于扩增反应条件的实用浓度下产生必需的效果。
这些结果说明甜菜碱结构和试验设计选择的符合逻辑的结合是可能的，并且可象技术人期望的那样使之尽可能完善。SB-18是目前即将在商业上可得到的一种提纯形式的，最有效的甜菜碱，虽然在早些时候已注意到，象C18-羧丙基甜菜碱(CAS_No.78195-27-4)容易在实验室或通过一个定做合成的商业提供商合成。
图6、7和7A、8、9直到9D和10积累的数据表明：(1)SB-18在列出的同类离子去垢剂中是独特的，因为它有利于分枝杆菌的分散和通过离心对其进行收集(图6)；(2)磺丙基甜菜碱在促进对两类分枝杆菌的回收方面都具有某种程度的功效(图7和7A)；(3)大量的类似的“象甜菜碱”的去垢剂在本发明的方法中都显示出“类SB-18活性”，这些特征遵循可预测的行为表现型式(图8，9，9A，9B，9C和9D)；(4)通过修改系统参数，根据对这类分子的行为的理解，在本发明中肯定起作用的甜菜碱可以以一种使得它们显示类SB-18活性的方式提供(图10)。
最后，电荷分离引起的偶极矩的极性促进了在临床试验中对一个去垢剂分子的功能性描述。更重要的是，在菌素化的分枝杆菌的分散方面，产生的偶极允许较长链烷基部分在合溶液的水的电解质中使用。其结果是能够利用在临床实验室中极为平凡的反应条件下具有较大的溶解能力的去垢剂。然而，如以前所阐明的，分散这些有机体的能力并不能充分解释短链分子可促进不成团的有机体的收集的能力。下面的实施例将有助于更好地理解另外一半答案。
                       实施例10
排除结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌里的气体
可论证的是，这类有机体的细胞壁的疏水性质直接决定着菌膜的生长。大量发表的参考文献和Dubos，R.J.Exp.Biol.Med.58：361-362(1945)说明吐温80因“潮湿化”的结果使得“迅速的”、“弥散的”和“浸没生长”。然而，图4A和表6的结果说明，不管表面张力和细菌成团是否直接与菌膜生长有关，但事实为吐温80减轻这些现象的机制不同于SB-18。因为鸟分枝杆菌以一种更为分散的形式生长，且表现为很少成团，人们期待MTB将更加明显地受到图5中描述的实验的影响。还有，其含义是吐温80必定在活体内起作而引发浸没生长。无论如何，似乎合乎逻辑的是，在不存在表面张力时，浸没生长和浮力的本质必定以某种方式紧密相关。
Silverstolpe，Lo Nord.Med.40/48：2220-2222(1948)测定了结核细菌的比重范围从1.07到0.79，平均不到1.00。Silverstople，L.Nord.Med.40/48：2220-2222(1948)认为：“BakteriernasJ_mf_relsevis laga specifika vikt kan f_rklaras av deras fetthelt…”从文字上翻译为：“细菌相对较低的比重可由其脂肪含量得到解释…”正是细胞壁中实际的脂类量对其较低的比重起决定作用，这一概念在本领域中已被接受。在1973年的一本普通微生物教材中，作者说明：“…细胞壁中极为丰富的脂类(60％的细胞干重)说明了这些有机体疏水性质的原因，这有助于在水相培养基将生长过程中细菌彼此粘附生长，并漂浮于表面…”(Davis，B.D.et al.，Microbiology，Harper&Row，New York，1973，P.837)。然而，按照本发明，脂的含量并非对分枝杆菌的低比重起决定作用。
按照技术性推理方式推测起来，细胞中的部分特定体积补偿了剩余组成成分的部分的特定的体积，使细胞漂浮。这表明在不存在表面张力时，鸟分枝杆菌细胞壁中另外的脂类成分。直接对离心过程中增加的回收困难起决定作用(表1)。虽然这似乎是可能的，Stinson，M.W.et al.，Am.Rev.Resp.Dis.104：717-727(1971)表明在甘油含量方面，培养的脂类占细胞干重的17.7％，当在吐温存在时，脂的含量增加到34.1％。由于吐温80允许浸没生长，这一假说对浮力不可能是一个合理的解释：脂类的含量增加了几乎两倍而细胞还似非而可能是地浸没入水中。
Schaefer，W.B.et al.，J.Bacteriol.90：1438-1447(1965)在多年以前通过发表显微照片表明在油酰一BSA或吐温80包含的培养其中分枝杆菌脂质体的产生说明了这种不一致。Weir，M.P.et al.，Amer.Rev.Res.Dis.106：450-457(1972)和McCarthy，C.Infect.Immun.4：199-204(1971)也对在培养条件下迅速吸收油酸的特征进行了描述。似乎缺乏支持浮力和总的脂类含量之间有一种关系的假设的必需证据。事实上，从这些发现的比较将客观上导致人们得出结论：也许脂质的积累正在某种程度上促进浸没生长。
上述评论导致人们猜测，在吐温80(CAS_No.9005-65-6)存在时的浸没生长一定是由于细胞结构的某些其他变化造成的。Yamori，S.et al.，Microbiol.Immunol.35：921-926(1991)的报道证实：当向含有吐温80的培养基中加入OADC时(油酸，BSA，右旋糖，过氧化氢酶和氯化钠)，细胞壁发生显著的变化。这些作者认为，由于细胞壁的变化，药物敏感性也发生变化(如，细胞壁变得更有渗透性)此外，Rastogi，N.et al.，Antimicrob.Agents.Chemother.20：666-677(1981)在十年前已表明：当细胞经过培养时，细胞壁明显地变薄，在含有油酸，BSA&吐温80的浓缩培养其中生长特征也进-步发生变化。综合来看，这些观察意味着虽然表面张力可能卷入了菌膜的生长过程中，但表面张力和脂的组成都不能充分解释“浮力”或“低比重。”相反，细胞壁结构的变化一定与浸没生长有关。因此，必定有其他的可能性，例如，(i)这些脂类插入到细胞壁的过程，(ii)掺合之后结构的形成，或(iii)两者都兼有。
总之，有两种途径，脂类对局限于表面的生长起决定作用。如同Dubos，R.J.Exp.Biol.Med.58：361-362(1945)暗示的，首先是表面张力。第二种理论(来源于Silverstolpe，L.Nord.Med.40/48：2220-2222的工作)依赖于这些有机体的脂类的“部分特定体积”。
如本文所描述的，按照本发明，可以相信：在表面张力或部分特定脂类体积不存在时，对专性需氧微生物分枝杆菌保持浮力最有效的方法是通过分离作为一种细胞壁构建的副产品产生的一些气体(如CO2)。对丙二酰CoA途径合成的每个分枝菌酸残基，约产生80个CO2分子。一个与分枝杆菌密切相关的有机体，薛曼纳氏丙酸杆菌CO2的产生在瑞士干酪中形成一些眼点(如，一些孔)(Sherman，Jom.J.Bacteriol.6：379-392(1921)).在分子水平上，可以把细胞壁简单地想象为在凝固的分枝菌酸和糖脂的迷路网联内具有潜伏的CO2大分子囊。由于菌素因子(α，α-D-海藻糖的6，6′-二霉菌酸酯)的熔化温度为43℃-45℃(Noll，H.et al.，Biochim.Biophys.Aeta20：299-309(1956))，细胞壁的蜡质稠度可以起作用，隐藏大分子气囊。可以相信，把缓冲液置于真空下可使溶解的CO2从缓冲液中去除，以致于产生一个浓度梯度。这反过来又使潜伏在细胞壁中的CO2溶解到缓冲液中。这一方法预期效率较低，在菌索存在时该过程甚至效率更低。
图11表示总的处理方案的最终结构轮廓。图11A表示在SB-18存在和不存在时对结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌除气的结果。
对图11A提出的数据，图2所示的图解是按图11所述修改的。洗涤缓冲液含有水或10mM的NaHPO4，pH7.0，15mM的NaCl，2mM的SB-18，2mM的苯丙氨酸和5mM的二硫苏糖醇。此外，离心管着先于37℃下振荡培养60分钟，然后直接离心或离心之前置于真空(600mmHg)下60分钟。在除气之前，松开螺旋盖。该实验中对鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌进行检测。四个等份的二次重复扩增以a、b、c和d表示，且应该是一致的。对应于一个给定种类的直接等份的二次重复扩增表示于适当标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝的拷贝对照，也对108、109和1010个拷贝的杂交对照进行印迹。
显然，表面张力和浮力在解释供扩增的处理过程中这些有机体的行为方面起着重要作用。即使在没有任何添加的去垢剂存在时，当把有机体置于真空下时一般有较高的回收率(见在没有加入去垢剂时用真空除气在水中对MAC的回收)。大量的实验已得出这一结论：虽然表面张力和潜伏的气体都牵涉到结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌，但结核分枝杆菌的主要特征是主表面张力，鸟分枝杆菌的主要特征是潜伏的气体。也就是说，虽然SB-18提高了这两类分枝杆菌的回收，但MTB更明显地受去垢剂的影响，而MAC与MTB相比，在更高程度上受除气的影响。此外，由于SB-18可分散有机体这一事实，在这些条件下给MTB除气可能更加有效。
如果潜伏气体的假说是正确的话，那么延长除气应该确实容许任何一种去垢剂提高对结核分枝杆菌的回收。例如，由于围绕MTB假阴性的问题包括成团，表面张力和浮力，如果浮力在某种程度上通过除气可以被补偿的话，那么只剩下成团和表面张力了。由于多数去垢剂在给定的合适条件下可以克服表面张力，则只剩下样品偏差了。图12考查了这一点。
对图12中提出的数据，是按照图11的描述再次使用了图2中所示的图解。洗涤缓冲液含有水，或者于10mM Tris-HCl，pH8.0中的0.1％Triton X-100(CAS_No.9002-93-1)，或者10mM的NaHPO4，pH7.0，15mM NaCl，2mMSB-18(CAS_No.13177-41-8)和5mM的二硫苏糖醇。此外，对每个条件设置三套离心管。接种之后，所有的离心管首先于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。一套离心管直接离心，其余二套离心管对三种条件的每一种都进行真空(600mmHg)处理。一套离心管在离心以前于40℃下真空处理60分钟，最后一套试管在离心之前于40℃下真空处理4小时(除气之前松开盖子)。该实验中只检测结核分枝杆菌。四个等份的二次重复扩增以a、b、c和d表示。直接等份的两次重复扩增表示于合适标记的线上。同时扩增0、20、100个拷贝的拷贝对照，对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
显然，延长除气提高了通过离心回收这些有机体的能力。在这些条件下包括任何一种去垢剂，尽管没有打乱菌素的形成，但在一定程度上减少了表面张力，以致于通过离心增加了回收集。应该注意的是，在那些打乱菌索形成的去垢剂存在时除气预期将更为有效。具有类SB-18活性的其他去垢剂
下面的研究考查了其他去垢剂(甜菜碱类似物)，是否以一种把它们隐退到细胞内的方式出现在细胞中，并以此改变细胞的部分特定体积以部分地抵消这些有机体的自然浮力，从而通过离心增加回收率。
例如，假设甜菜碱穿过外层膜采用亲水途径(Connell，N.D.etal.，In：Tuberculosis：Pathogenesis，Protection，and Control，B.R.Bloom，ed.，American Society for Microbiology，Washinton，D.C.(1994)pp.333-352)，甜菜碱穿过内层膜采用脂类运输物(Schaefer，W.B.et al.，J.Bacteriol.90：1438-1447(1965)；Weir，M.p.et al.，Amer.Rev.Res.Dis.106：450-457(1972)和McCarthy，C.Infect.Immun.4：199-204(1971)，那么人们可能使用一类具有相似特征的非离子去垢剂，如可使主要基团的体积减少至最小的一种近似十八烷基去垢剂。虽然吐温80的头部基团太庞大以致于不能通过膜蛋白，其他的去垢剂，如线形的聚氧乙烯酯的脂肪酸(如“Brij”化合物)可能以某种方式出现以容许穿过细胞，并在本发明的方法中起作用。
Hsiao，L.et al.，J.Phys.Chem.60：657-660(1956)表明每个分子的聚氧乙烯丙基酯的面积与甜菜碱的面积为同一级别(如平均为9.5POE单位的C9-将有55A2的面积)。图13把处理试验中的SB-18与Brij96(油基-聚氧乙烯酯(C18∶1E10)和吐温80(油基-聚氧乙烯酯山梨聚糖(n＝20))进行了比较。
图13的实验仿照图2中概括的处理方法，使用了2mM的SB-18，1％的Brij96((CASRNo.9004-78-2)和溶于10mM的NaH-PO4pH8.0中的1％的吐温80，15mM NaCL。水用作负对照。对每个系列准备四个重复试管。所有的离心管用20μl的结核分枝杆菌细菌贮存液接种，在离心之前于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟。对每个去污剂四个重复的二次重复扩增以a、b、c和d表示，且应该是相同的。直接等份的两次重复扩增表示于适当标记的线上。同时扩增0，20和100个拷贝的拷贝对照，对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
在许多与图13中描述的相类似的实验中使用Brij 96表现出可比较的结果。在补偿浮力方面Brij 96显示出类SB-18活性，然而，正如所预料的，Brij 96在结核分枝杆菌的分散方面具有有限的能力。无论如何，这里描述的吐温80的结果(图13)与图4A的结果一致：吐温80既不能提高这些有机体的回收，也不能分散这些有机体。在支持Brij 96可进入细胞的假说方面，Dubos，R.J.et al.，J.Exptl.Med.83：409-423(1946)表明Brij 96的同系物可用来刺激培养物的生长。不幸的是，Dubos报道，发现这些化合物在有血清和其他的蛋白质存在时形成沉淀。利用线形的多氧乙烯聚合体沉淀蛋白质的功效在某些时候为已知的(见：Yamamoto，K.R.et al.，Virology 40：734(1970)作为一个例子)。这也限制了这些去垢剂对临床样品的处理的实用性。
使用这些非离子去污剂更进一步的问题是具有非常窄的使用范围。例如，根据这里的观察，较长的烷基链是最理想的，较长的烷基链降低溶解度。Brij96具有2℃以下的Krafft点的54℃的浊点，而Brij96(硬脂酰-聚氧乙烯酯(C18E10)：CAS_No.9005-00-9)具有大约46℃的Krafft点和64℃浊点(Schott，H，et al.，J.Pharm.Sci.64：658-664(1975)；Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.65：979-981(1986))。Brij 72(硬脂酰-聚氧乙烯酯(C18E2)：CAS_No.9005-00-9)和Brij92(油基-聚氧乙烯酯(C18∶1E2)：CAS_No.9004-98-2)在这些试验条件下均不溶。增加可溶性需要增加POE单位的数量。由于POE单位的数量增加，头部基团的面积也增加(Hsiao，L.et al.，J.Phys.Chem.60：657-660(1956))。
此外，在这狭窄的范围内，非离子去垢剂的行为表现也很异常。例如，Schott，H.et al.，J.Pharm.Sci.65：979-981(1976)表明某些硝酸钠和硝酸钾盐使Brij56(鲸蜡-聚氧乙烯酯(C16E10)：CAS_No.9004-95-9)的浊点和Krafft温度有部分重叠，从而形成一种“非结晶的凝胶”。Brij56具有32.5℃的Kfafft点和67℃的浊点(Schott，H.et al.，Pharm.Sci.65：979-981(1976))。还有，甜菜碱的优势似乎与该事实有关：即在临床条件下长链烷基能可靠地用于分散任何菌索和补偿浮力。
图14证明，一旦这些有机体任有限的真空除气处理，某些类型的去垢剂应具有较高的通过离心促进收集的倾向。图14表示对图11所示的试验改进时的一个代表性结果。把用水和2mM的SB-18(10mM NaHPO4pH7.0，15mM的NaCl，2mM SB-18，2mM的苯丙氨酸和5mM的DTT)与相同的磷酸钠缓中液(10mM的NaHPO4pH7.0，15mM NaCl，和5mM的DTT)中的几种不同的去垢剂进行了比较。使用了两个系列的四价氨去垢剂来检查化学结构和烷基链长度。第一种系列的去垢剂为长链烷基-三甲基铵盐。它们包括(a)溴化十二烷基三甲基铵(TMA-12：CAS_No.1119-94-4)，(b)混合的溴化烷基-三甲基铵(mTMA：mTMA主要为十四烷基(C14)同系物，存在有某些C12和C16同系物，(c)溴化十八烷基三甲基铵(TMA-18：CAS_No.1120-02-1)。使用的第二种系列的去污剂为长链烷基-苯甲基二甲基铵盐。它们包括：(d)亚苄基konium氯化物(BenzALK(CAS_No.8001-54-5))：BenzALK主要为C12同系物，也存在某些C14和C16；(e)氯化苯甲基二甲基十四烷铵(BenzD-MA-14：CAS_No.139-08-2)；和(f)氯化苯甲基二甲基硬脂酰铵(Benz DMA-18)。每种去垢剂以类似于描述SB-18的方法配制(实施例1)，并加入到缓冲液中，终浓度为2mM。离心管首先于37℃下振荡培养(140rpm)60分钟，然后在600mm的Hg的真空下于40℃培养60分钟。三个等份的二次重复扩增以a、b和c表示，并且应该是一致的。直接输入等份的二次重复扩增表示于合适标记的线上。同时扩增0、20和100个拷贝对照，对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
按照这里给出的数据，虽然所有的去垢剂看来都增加功效，但近似十八烷基去垢剂，能更主动地被隐退，一旦除气补偿浮力时，通过离心才能勉强更好地提高细胞的回收率。类似的实验表明非离子十八烷基去垢剂  吐温80和Span80，虽然以前既不能提高对未作除气处理的有机体的回收，也不能分散分枝杆菌的细胞，却产生了类似于图14中观察到的结果(已知吐温80含有少量的水解的去垢剂，Span80仅仅是硬酯酸的山梨聚糖酯)。
因此，对分枝杆菌的除所揭示出一类“近似十八烷基“去垢剂(也称为“类近似于十八烷基”去垢剂)，这类去垢剂包括类SB-18去垢剂，并象类SB-18的去垢剂一样使用，现被更有效地用来收集微生物。由于MAC复合有机体主要以羊细胞生长，图14的实验中使用的去垢剂很容易破坏表面张力和分散细胞。可以相信的是，这些去垢剂因其近似十八烷基的性质，可更有效地跨膜运输，并且如上面所讨论的那样于中积累。
因此，较长的烷基链长度有两种原因显示出重要性。首先，较长链使扩散更为便利，其次较长的链能更主动地被隐退。长链去垢剂，因其溶解性较小，需要特别的条件发挥功能。例如，离子去垢剂需要最小量的电解质，非离子去垢剂需要较大的头部基团。临床样品需要在含有溶液的电解质内处理，去垢剂向细菌细胞的主动运输需要使头部基团减少到最小。甜菜碱在其中存在的优势是：它们在含有溶液的电解质中可以更有效地发挥作用，并且它们可把头部基团的体积减少至最小。概括地说，甜菜碱对促进迅速诊断分枝结核杆菌的侵杂似乎提供了一种独特的机会，因为在临床条件下长链烷基能可靠地用于分散任何菌索和补偿浮力。
对本文描述的方法与甜菜碱设计有关的另外的特征源自Tsub-one，K.et al.，J.Pharm.Sci.80：441-444(1991)的工作。这些作者表明抗微生物活性的工效依赖于烷基链的长度，桥的长度以及R2和R3(表2中定义的R2和R3)的长度。例如，在多数情况下，C16似乎是理想的链的长度(C18-二氧磷乙基甜菜碱明显地出现沉淀)，R2和R3位置上的甲基基团因其空间效应传递最高水平的抗微生物活性，C2桥显示出最高水平的抗微生物活性，而C3则表现出最低水平的活性。在远于C3的桥的长度的增加在抗微生物活性方面表现出稳定的增加。在后面一篇文章中，作者表明这些现象与螯合二价阳离子的能力相关(Tsbone，K.J.Pharm.Sci.80：1051-1054(1991))。
总之，因为正是其性质，组合和带电种类的空间关系使甜菜碱显得很独特，正是离子的特定组合造成甜菜碱的族内变化；根据以上讨论，人们可以为甜菜碱设计理想的特征。例如，较长的烷基链长度将被更有效地隐退，并能减少与菌索有关的问题。把桥保持为一个丙基基团将把制菌活性减少到最小。把R2和R3基团减少最小至甲基基团以避免空间阻碍。然而，用一丙基桥(如，SB-18为一个磺丙基甜菜碱)把制菌活性减少到最小的想法马上出现了生存力的问题。SB-18处理的分枝杆菌的生存力
关于结核分枝杆菌，该方案产生有生存力的有机体。表8表示出原始的BACTEC培养数据，比较了未处理的分枝杆菌(A和B)；在没有其他处理的PCR溶解缓冲液中培养的细胞(C和D)；在溶解缓冲液中培养的，并在60℃下处理1小时并然后在95℃下处理15分钟的细胞(E和F)；经SB-18的方案处理的细胞(G和H)对14CO2的释放。
表8：说明SB-18处理的分枝结核杆菌细胞是有生存力的初步数据
如图2中概括的，对处理的结核分枝杆菌初步的培养结果进行了描述。数值代表按BACTECA60TB计数器(Becton Dickinson，Sparks，MD)记录的一个给定样品释放的14CO2数。每个样品在一个6个星期的时间期间作定期检查。培养物于2月6日接种。四批BACTEC 12-B培养物(其中每批二个重复)，用20μl的细菌贮存液接种：未处理的分枝杆菌(A和B)；于PCR溶解缓冲液中培养，未作其他处理的细胞(C和D)，或于60℃下处理1小时，接着的在95℃下处理15分钟的细胞(E和F)；按图2中描述的SB-18方案处理的细胞(G和H)。每个重复样品培养二次，用1或2标记。大于15的计数被认为阳性。培养被记录为阳性时，用“+”作为记号，并结束那个培养物的分析。
                                                    表8
样品              第1周            第二周     3     4     5     6
   2/18    2/21   2/23   2/25   3/2   2/28    3/5   3/12   3/19   3/26
阳性对照    A-1    11    138     +    +     +    +     +    +     +     +
   A-2     9    108     +    +     +    +     +    +     +     +
   B-1     6     72     +    +     +    +     +    +     +     +
   B-2     6     84     +    +     +    +     +    +     +     +
2X溶解缓冲液和未处理    C-1     2     20     +    +     +    +     +    +     +     +
   C-2     3     38     +    +     +    +     +    +     +     +
   D-1     2     18     +    +     +    +     +    +     +     +
   D-2     2     15     36    +     +    +     +    +     +     +
2X溶解缓冲液和60℃/60′95℃/15′    E-1     0      0     4    4     0    0     3    4     6     0
   E-2     0      0     4    4     0    0     4    4     3     0
   F-1     0      0     4    4     0    0     4    4     3     0
   F-2     0      0     4    4     3    0     5    4     4     0
                                                     表8
样品              第1周             第二周     3     4      5     6
  2/18    2/21   2/23   2/25    3/2   2/28    3/5   3/12    3/19   3/26
    SB-18处理     G-1     3     35     +     +     +     +     +     +     +     +
    G-2     3     43     +     +     +     +     +     +     +     +
    H-1     16     231     +     +     +     +     +     +     +     +
    H-2     4     97     +     +     +     +     +     +     +     +
鉴于SB-18方案产生有生存力的有机体，及延长除气增加任何去垢剂在通过离心促进收集方面的功效，因为分枝杆菌为专性需氧微生物，所以延长时间的除气预期将破坏生存力。
表9表示了把SB-18处理与NALC/NaOH沉淀的除气结合处理的结果。
在洗涤缓冲液中用SB-18和对洗涤的沉淀进行真空除气处理时PCR与培养的相关性
描述了除在2°-洗涤缓冲液中中使用SB-18之外，还进行真空除气步骤的结果。所有的样品首先按NALC/NaOH方法进行处理(Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide forthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Ser-vice，Centers for Disease Control(1985)，pp31-46)。在洗涤之前移出沉淀，并让其生长于BACTEC 12B培养瓶中。所有阳性MTB，MAC或堪萨斯氏分枝杆菌培养物用Gen-Probe培养试验(Gen-Probe San Diego，CA)鉴定。所有其他的有机体通过生化分析(Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide forthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Ser-vice，Centers for Disease Control(1985)，pp.71-157)鉴定。用来洗涤系列样品中的MALC/NaOH沉淀的缓冲液的组成为10mMNaH-PO4，pH8.0，15mM NaCl，5mM的二硫苏糖醇和2mM的SB-18。沉淀于37℃下振荡(140rpm)洗涤60分钟。沉淀洗涤之后，样品于40℃置于600mm Hg的真空下处理60分钟。然后将样品经离心(37℃下5000xg离心20分钟)，并按材料和方法中的描述进一步作PCR处理。
条件 # 种类     相关性    ％相关性   总PCR阳性
培养物   PCR
   SB-18洗涤-真空除气 504 复合体     4    3   75％ 55
复合体     13    9   70％
堪萨斯氏分枝杆菌     4    4  100％
其他     4    -    -
在于37℃下用SB-18洗涤的，于40℃在600mmHg下除气处理的和二次重复扩增的504个样品中，13个样品为MAC复合体培养阳性，4个为MTB复合体培养阳性和4个为堪萨斯氏分枝杆菌培养阳性。对结果的分析表明9个MAC培养-阳性样品为PCR阳性(70％)；3个MTB培养-阳性样品为PCR阳性(75％)；所有堪萨氏分枝杆菌培养阳性样品为PCR阳性(100％)。剩下的3个MAC样品含有抑制剂，一个为不能解释的。剩下的MTB样品经分析显示出统计漏失(如：抵拷贝数)。三个MAC培养/PCR阳性样品显示出与统计漏失一致的特征(如：重复扩增中其中的一个为阴性和一个为阳性)。那些看起来显示样品偏差的样品也需要通过这种方法于培养基中延长培养以供检测。
此处正确的结论是，这些有缺陷的结果并非是用SB-18/除气方法处理带来的固有的结果。相反，上面陈述的所有数据，与样品首先通过MALC/NaOH处理过一事实结合起来表明，在被SB-18/除气方法处理之前样品的完整性也显著地遭到破坏。MAC样品还表现出统计漏失和不能解释的结果的事实进一步表明：只要使用目前的方案作为最先处理样品的方法就可能出现这些有缺陷的结果。安全提示
由于在真空除气之前必须松开样品离心管的盖子，如果发生意外的话将会产生大量的烟雾。因此，要采用下列准则以保证实验人员的的安全。首先，用一次连续的去垢剂洗涤，真空除气方法得到所有的数据。这仅仅是为了安全原因：由于除气步骤需要把盖子松开，去污剂洗条步骤需要振荡，同时完成这二步可能使盖子脱离开离心管和使人员暴露于样品下。第二，图15所示的装置安装在一个片流罩上。技术人员应该保证片流罩中的气流不能被真空炉冲出。第三，从真空炉排出的所有空气通过两套滤器以去除去灰尘携带的微粒。第一个滤器为0.2μl注射器类型的滤器(Gelman，Ann Arbor，Michigan)，可安装进真空管中。该滤器是通过一小段真空管固定于真空炉上。用软管夹钳固定滤器以排除偶然松开的可能性。每月取出注射器滤器灭菌和处理。第二个滤器为0.3μl的HEPA-CAP滤器(What man，Clifton，NJ)，也安装于真空管中。该滤器不需软管夹钳即与注射器滤器相连，以便在必要时可以拆开、清除污垢及存放。HEPA-CAP滤器每季度更换一次。最后，真空炉与罩同时进行除垢处理。
实施例11
SB-18除气方案优于NALC/NaOH处理
对图2的图解进行改进以便通过培养和扩增对未处理的分枝结核杆菌，用SB-18和除气处理的分枝结核杆菌与经过NALC/NaOH处理的结核分枝杆菌直接进行比较。图16所示的试验表示了必要的修改。表10给出了三种条件下每一种BACTEC 12B培养物(Becton Dickinson，Sparks，MD)释放14CO2量的原始数据。图16A中对该数据进行了作图，图16B给出的是当处理样品和用来接种培养物的同一样品的等份通过PCR扩增时的一些扩增结果。
在该实验中遵循图16的方案。从一个斜面上刮出结核分枝杆菌并悬浮于水中。对细胞作进一步稀释以产生细菌贮存液，然后用来接种所有的样品。对每个处理方案设置两套离心管，每套由6个重复组成。SB-18处理溶液由15ml的10mM NaHPO4，pH8.0，15mM的NaCl，2mM的SB-18和5mM二硫苏糖醇组成。向每个SB-18离心管中加入20μl的处理溶液，然后所有的离心管先于37℃下振荡(140rpm)培养60分钟，然后于40℃置于真空(600mmHg)下60分钟(放气之前松开盖子)。然后对离心管离心(于37℃下5000xg离心20分钟)，并倾去上清液。在该套离心管的每个重复中放置5ml的NALC/NaOH(Kent，P.T.et al.，”PublicHealth Mycobacteriology”in A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Sevice.Centers for DiseaseControl(1985)，pp.31-46)，并加入20μl的细菌贮存液。MALC/NaOH离心管于室温下培养15分钟，并稀释至45ml，然后离心(4℃下3000xg离心20分钟)，再倾去上清液。所有的沉淀用300μl的蒸馏水重新悬浮。对产生的6个阳性对照样品检测生存力和最大扩增信号强度。通过简单把20μl的细菌贮存液与280μl的无菌水相混合得到输入对照。然后平分所有的样品供培养和扩大增分析。这是通过下列方式完成的：用25μl重复的等份接种BACTEC 12B培养基，向该样品的一个200μl等份中加入200μl的2X的溶解缓冲液。在BACTEC 460 TB计数器上常规定地检查培养瓶的14CO2释放量。按材料和方法中的描述实施扩增。每套的6个样品的二次重复扩增以a、b、c、d、e和f表示，且应该是一致的(图16B)。同时扩增0，20和100个拷贝的拷贝对照。对108、109和1010个拷贝的杂交对照也进行印迹。
主要有两点待说明，并且关于这一数据有几个次要的观察结果待说明。第一点是：所有SB-18处理的培养变为阳性，第二是：并非单个的NALC/NaOH培养物变为阳性。虽然已知NALC/NaOH破坏分枝杆菌的生存力(Krasnow，I.et al.，An.J.Clin.Path.45：352-355(1966)；Kubica，G.P.w.et al.，Am. Rev.Resir.Dis.87：775-799(1963))，但扩增结果证实(图16B)：正如预料的一样，事实上正在产生大量微生物的损失。在某些情况下，这些损失是定量的。由于表9中描述的临床数据是使用的NALC/NaOH处理的沉淀，应该清楚的是在SB-18洗涤和除气之前样品遭受破坏的程度并非微不足道的。
第一个次要的观察结果是，阳性对照几乎需要两个星期才超过阈值(15cpm)。表8中阳性的对照和SB-18处理的细胞到5天时即为阳性，通过与表8的数据相比较说明本实验中使用的是极低的拷贝数。第二，表10的数据表明SB-18处理的细胞(在出现阳性的时间方面)大约落后对照细胞的一个星期。对此有三种解释：(a)如实施例10所讨论的，SB-18预期具有某种制菌活性；(b)阳性对照代表真正的，最大输入，而对处理的细胞无疑产生损失(具有低拷贝数时，加剧了这一影响)；最后，(c)倾去上清液的离心管未作进一步处理(如，在所有情况下，加入水样品的体积都大于300μl)，产生一种稀释作用。虽然尚未测定制菌作用的程度，但是SB-18也不是明显地具有杀菌作用(如果事实上确有制菌作用的话)。关于上面的“C”，对该实验进行重复，并把上清液转移至一个离心管中作进一步的处理以使制菌作用和稀释作用减少至最小。在本实验中，SB-18和对照结果是难以区分的，12个NALC/NaOH培养物中的2个为阳性。
不可避免的结论是，以上对结核分枝杆菌攻侵染诊断的缺陷根植于本领域中目前正在使用的处理方案中。Small，P.M，etal.，NewEngl.J.Med.330：1730-1709(1994)，和Allard，D.etal.，New Engl.J.Med.330：1710-1716(1994)通过发表表明美国大于1/3的TB侵染是由于最近的感染的限制片段长度多态性(RFLP)的研究改变了医学团体的看法，(Hamburg，M.A.et al.，New Engl.J.Med.330：1750-1751(1994))。以前，估计90％的侵染为潜伏的和非活动性的病灶引起的。在这些实施例中提出的数据(尤其是实施例11)强烈地指明，由于生长缓慢、浮力、聚集作用、有缺陷的处理方案和缺乏可靠的和灵敏的诊断试验结合在一起、尚不能确定因潜伏侵染或最近感染的真正病例的百分率。
在假阴性结果的两上主要根源(抑制剂和低拷贝数)中，本发明的方法尤其解决了后一问题。去垢剂打乱了菌索及在某种程度上抵消了浮力，并且除气进一步减少了浮力。结果，表现出这些特征的有机体现在可更有效地被收集检测。更进一步地，因为本发明的方法提高了有效地收集和提取样品中少量的微生物，因此，当必需处理低拷数时增加了检测试验的功效。
实施例12和13作为另外的例子提出了如何把类SB-18的去垢剂实际地应用于生物和其他样品上。由于临床必须遵循推荐的由疾病防治中心发表的准则(Kent，P.T.et al.，”Public Health My-cobacteriology，”inA Guide for the Level III Laboratory.U.S.Depart-ment of Heath and Human Service，Centers for Disease Control，(1985)pp.31-46)，因此给出了实施例12。鉴于本文给出的结果，给出了实施例13，表明必须放弃目前的方法以便在临床实验室中可靠地使用基于扩增的技术。表10：SB-18处理与NALC/NaOH处理的比较
描述了图16中概括的处理实验的培养结果。数值表示通过BACTEC 460 TB计数器(Becton Dickinson，Sparks，MD)记录的一个指定样品释放的14CO2量。在一个8周的期间内对每个样品作定期检查(“以培养天数计”)。介绍了三套培养物，每套6个重复：“输入”代表阳性对照组(样品A-F)；“SB-18”代表按本发明方法和图11中概括的方法处理的结核分枝杆菌(样品G-L)；和“NALC”代表按疾病防治中心推荐的方法(Kdnt，P.T.et al.，”Public Health My-cobacteriology”in A Guidefor the Level III Laboratory，U.S.Depart-mentof Health and Human Service，Centers for Disease Control，1985，pp.31-46)处理的结核分枝杆菌(样品M-R)。每个样品重复二次培养(标以1或2)。15以上的计数被视为阳性。大于999的读数超出刻度，以“+”标记。对某一指定的天数的数据进行平均，并于图16A中作图。
表10：SB-18处理与NALC/NaOH处理的比较
样品                                                                                   培养天数
    2     5   7   9   12    13   16     19    22    26    30    33    37   42    47   50   55   58
输入   A1     0     4   4   2   14    13   53     86    95    160    240    301    489   936    999   +   +   +
  A2     1     5   4   2   18    15   60     99    119    244    382    405    578   839    999   +   +   +
  B1     1     4   4   2   21    18   72     125    156    493    999    +    +   +    +   +   +   +
  B2     0     4   4   2   18    15   63     111    172    445    656    598    811   999    +   +   +   +
C1 0 5 2 2 20 18 69 101 123 282 481 496 862 999 + + + +
  C2     1     4   5   2   21    18   69     105    119    222    344    408    915   999    +   +   +   +
  D1     0     0   5   2   16    14   57      82    92    152    191    203    312   502    999   +   +   +
  D2     0     0   4   3   15    12   52      76    87    173    289    323    615   999    +   +   +   +
  E1     1     0   5   2   21    18   74     103    146    638    999    +    +   +    +   +   +   +
  E2     0     0   4   2   12    11   45      64    79    145    295    373    592   833    999   +   +   +
  F1     0     0   4   3   25    20   87     130    151    279    461    556    753   999    +   +   +   +
  F2     1     0   4   3   25    24   96     144    183    424    772    796    659   999    +   +   +   +
     平均     0     2   4   2   19    16   66     102    127    305    510    538    715   925    999   999   999   999
样品                                                                            培养天数
   2    5   7     9   12   13   16    19   22     26   30   33   37   42   47   50   55   58
SB-18     G1    0    4   3     0   6   1   10    15   17     29   37   37   53   84   261   331   757   999
    G2    0    4   4     0   8   3   18    49   98     266   449   515   840   999   +   +   +   +
    H1    0    4   5     2   18   10   41    68   90     230   460   609   941   999   +   +   +   +
    H2    0    4   4     1   18   8   42    69   90     173   233   240   321   501   999   +   +   +
    I1    1    3   4     0   5   0   11    15   16     21   26   25   36   45   98   105   267   614
    I2    0    3   4     0   7   2   20    30   33     51   72   80   118   154   398   532   999   +
    J1    0    4   4     0   6   2   13    20   21     39   101   182   450   999   +   +   +   +
    J2    0    4   4     0   7   1   12    19   21     40   78   107   182   464   999   +   +   +
    K1    0    4   3     0   7   2   12    19   19     32   90   158   281   638   999   +   +   +
    K2    0    3   5     0   5   2   10    15   16     22   29   29   38   49   89   68   107   131
    L1    1    4   3     0   6   1   10    13   15     20   26   27   40   48   102   83   122   147
    L2    0    4   3     0   3   2   18    34   56     112   143   135   169   295   687   772   999    +
        平均    0    4   4     0   8   3   18    31   41     86    145   179   289   440   636   657   770   823
样品                                                                           培养天数
    2   5   7     9   12    13   16   19   22   26   30   33   37   42   47    50   55   58
NALC   M1     0   4   4     0    0     0    3    3    3   4    3   3    2    0    5    2    4   4
  M2     1   4   3     0    0     0    3    4    3   3    3   3    3    1    3    0    4   4
  N1     0   4   3     0    0     0    4    2    3   3    3   4    3    0    3    0    3   3
  N2     0   4   3     0    0     0    3    3    4   3    2   4    3    0    4    0    3   3
  O1     0   4   4     0    0     0    3    3    3   3    3   3    3    0    3    0    3   4
  O2     1   5   3     1    0     0    3    4    4   3    4   3    3    0    3    0    2   4
  P1     0   4   4     0    0     0    4    3    3   3    4   3    3    0    2    0    3   4
  P2     0   4   4     0    0     0    3    3    3   3    3   3    4    0    4    0    3   4
  Q1     0   4   4     0    0     0    3    3    3   3    4   4    3    0    2    0    3   3
  Q2     0   4   4     0    0     0    3    4    4   3    3   3    3    0    2    0    3   3
  R1     0   4   3     0    0     0    4    3    3   3    3   4    2    0    3    0    3   4
  R2     1   5   4     0    0     0    3    3    3   3    3   3    3    0    4    0    0   3
     平均     0   4   4     0    0     0    3    3    3   3    3   3    3    0    3    0    3   4
                       实施例12
从事先经标准方法处理的临床样品制备用于扩增的分枝杆菌的方法
鉴于临床实验室必须遵循推荐的、疾病防治中心发表的准则(Kent，P.T.et al.，”Public Heath Mycobacteriology”，in A Guide forthe Level III Laboratory.U.S.Department of Health and Human Ser-vice，Centers for Disease Control，(1985)pp.31-46)，给出了这一实施例。
下面的方法解决了上面提到的问题，尤其适用于通过用任何标准方法从临床样品(例如，包括痰，脑脊髓液(CSF)和尿)中得到的沉淀供扩增的分枝杆菌的制备。下列方法对包括但不局限于结核分杆菌复合体，鸟分枝杆菌复合体和堪萨斯氏分枝杆菌的分枝杆菌的制备特别有用。如表11中所看到的，必须仔细地监测洗涤缓冲液的pH以便在本发明的方法中获得类SB-18活性。
1.用NALC/NaOH分离方法，或任何由Kent推荐的方法(Kent，P.T.et al.，”Public Health Mycobacteriology”in A Guide forthe Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Ser-vicer，Centers for Disease Control，185，pp.31-46)首先从临床样品中提取分枝杆菌。
2.移出供培养和涂片检测的沉淀。
3.若有必要，在下一步骤之前可进一步对沉淀进行澄清或提纯。通过本领域中熟知的技术(例如，包括离心，凝胶排阻层析和过滤。对所需的体液进行这种澄清处理。
(a)视用途继续进行步骤4，5或6。
(b)为了与PCR结合使用描述了步骤8-15。对这些步骤可进行改进，以便产生的处理沉淀可与上面描述的任一种检测方法结合使用。
4. SB-18去垢剂洗涤：
(i)向剩下的沉淀中引入SB-18次级洗涤缓冲液把体积调至约25ml。注意：次级缓冲液应该倒入用于处理原始样本的同样的50ml的锥形管中(如，不换试管)。(虽然本文常指50ml的锥形管，技术人员当然可以使用适合于理想功能任意大小的合适的容器)。
(ii)在即将进行下一步之前，涡旋振荡以重新悬浮沉淀，并于37℃下培养60分钟(140rpm或者强度足以打散培养物以让它们分散到液体中)。37℃的温度有利于分散，并对防止去垢剂沉淀的是必需的。
(iii)继续进行步骤7。
5.真空除气：
(i)向剩下的沉淀中，用水或任何其他所需的缓冲液把体积调至大约25ml。注意：水应该倒入用于处理原始样本的同样的50ml的锥形管中(如，不换试管)。
(ii)在大约600mmHg的真空下于40℃培养60分钟(此步骤的管盖应该是松开的)。
(iii)继续进行步骤7。
6.SB-18去污剂洗涤和真空除气：
(i)向剩下的沉淀中引入SB-18次级洗涤缓冲液把体积调至大约25ml。注意：次级洗涤缓冲液应该倒入用于处理原始样本的同样的50ml锥形管中(如，不换试管)。
(ii)欲进行下一步之前，涡旋振荡以重新悬浮沉淀，并于37℃下培养60分钟(140rpm或强度足够打散培养物以使它的分散到液体中)。37℃温度有利于分散并对防止去垢剂产生是必需的。
(iii)在大约600mm Hg的真空下于40℃培养60分钟(此步骤的管盖应该是松开的)。
(iv)继续进行步骤7。
7.于37℃下离心试管20分钟。注意：在这些例子中，使用IECModel PR 7000M医用离心机。使用该离心机最大速度/g-力，5，200rpm/7410xg。
8.试管离心时，把200μl的2X溶解缓冲液等份至适当数量的标记的1.5ml的螺旋盖离心管中(把离心管置于4℃下)。
9.离心以后，倾去上清液，注意不要把沉淀倒出。尽可能完全地到去上清液。
10.向沉淀中加入200μl的水。
11.通过涡旋振荡重新悬浮沉淀。
12.把200μl的样品转移到合适标记的1.5ml的螺旋盖的、含有200μl的2X溶解缓冲液的小离心管中(来源于上面的步骤8)。
13.涡旋振荡，并让试管于60℃下培养60分钟。
14.涡旋振荡，并让试管于95℃下培养30分钟。
15.涡旋振荡，并立即进行PCR，或于-20℃保存。在从扩增液中取出一个等份之前，离心管应经历一个迅速的离心步骤。监测SB-18洗涤缓冲液的注意事项：
实施例10和11表明洗涤缓冲液的pH应该被监测以便获得最大的类SB-18活性。表11检查了加入稀释的NALC/NaOH后两种不同的SB-18洗涤缓冲液的pH值。如果遵循实施例12的方法，洗涤缓冲液必定具有象50mM Rris-HCl一样的较高的缓冲强度。
表11：向SB-18缓冲液中加入NALC/NaOH
下表表示的是加入各种稀释量的NALC/NaOH后SB-18洗涤缓冲液的pH。使用了三种不同浓度的NALC/NaOH(2％、3％或4％)。这三个代表了用于临床实验室中处理供分枝杆菌检测的样品最普通的NALC/NaOH浓度(Kent，P.T.etal.，”Public Health My-cobacterial”，in A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Depart-ment of Health and Human Service，Canters for Disease Control，(1985)pp.31-46)。这些百分率是指加入到实际样品中溶液的NaOH百分比。在实际样品处理过程中和短暂的温育清除样品污垢后，在离心前用水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)对溶液进一步稀释。为了本实验的目的，和为了模拟临床处理，把5ml的每种NALC/NaOH溶液加入至一个50ml的锥形管中，然后立即用45ml的水稀释。然后把各种量(如，1ml、2ml、3ml、4ml或5ml)的稀释的NALC/NaOH溶液加入至25ml的：(A)10mM的NaHPO4，pH8.0，15mM的NaCl；或(B)50mM的Tris-HCl pH8.0，50mM的KCl中，并记录pH。
表11：向SB-18缓冲液中加入NALC/NaOH
  (A)25mls的10mM NaHPO4，pH8.0，15mM NaCl
    Neet     1ml     2ml     3ml     4ml    5ml
2％NaOH     8.24     9.94     10.66     10.92     11.08    11.21
3％NaOH     8.20     10.30     10.87     11.11     11.27    11.39
4％NaOH     8.24     10.60     11.06     11.23     11.40    11.53
  (B)25mls的10mM NaHPO4，pH8.0，15mM KCl
    Neet     1ml     2ml    3ml    4ml    5ml
2％NaOH     7.70     7.70     7.74    7.83    7.89    7.93
3％NaOH     7.70     7.74     7.82    7.88    7.97    8.04
4％NaOH     7.70     7.71     7.81    7.91    8.03    8.14
                 实施例13
用SB-18或以除气为主要处理步骤制备用于培养、
      涂片或扩增的分枝杆菌的方法
鉴于本文提供的结果给出这一实施例，说明为了基于用于临床实验室可靠的技术的扩增，必须放弃当前的方法学。
以下方法解决了以上提到的问题，并且在从未经任何标准方法处理过的样品(但该样品直接用本发明的方法处理)中直接分离用于培养、涂片或扩增的分枝杆菌上特别有用。这一方法可以用于从临床样品(包括，例如，痰、脑脊髓液(CSF)和尿)中分离分枝杆菌，并且在制备分枝杆菌(包括但不限于结核分枝杆菌复合物、鸟分枝杆菌复合物和M.Kansasii)上特别有用。在一方法可以用于从半固体物质分离分枝杆菌(包括但不限于从母牛粪分离副结核分枝杆菌，从鸟粪分离鸟分枝杆菌或从土壤分离其它分枝杆菌)。此外，可以从生物体液(例如奶和全血)分离其它分枝杆菌。这一方法可用于从环境源(例如水)分离分枝杆菌(包括但不限于M.gordonae)。这一方法可用于从任何外源(例如从鱼鳞和爬虫介壳、两栖动物皮肤样品，或其它组织样品、人等)分离分枝杆菌(包括但不限于结核分枝杆菌复合物(MTB)、鸟分枝杆菌复合物(MAC)、海分枝杆菌、M.fortuitum和M.chelonae)。
注：(a)步骤1-4说明如何使用首先经任何标准方法处理过的样品而不是经本发明的方法处理过的样品。(b)步骤11-14描述了与PCR结合使用的方法，这些步骤可被改进以便形成的处理过的沉淀可以与以上所述的检测方法结合使用。(c)根据用途可以从步骤1、2、3或4开始。(d)在开始这些步骤之前或任何步骤之前需要澄清或纯化或者需要二者的任何样品可以用本领域公知的方法(包括，例如离心、凝胶排阻色谱、和/或离子交换色谱、和/或过滤)进行澄清或纯化。所使用的澄清和/或过滤方法由技术人员考虑，取决于用途。本文包括了说明这一点的步骤4。1.SB-18去垢剂洗涤：
(i)向样本(1-2克或1-2毫升)中加入约25毫升SB-18洗涤缓冲液。注：所述洗涤缓冲液应倒入具有原始样本的50毫升锥瓶中。
(ii)涡旋以悬浮样品，并在37℃下培养60分钟(140rpm或强度足以分裂培养物到液体中)。37℃温度有利于分散，也是保持去垢剂不沉淀所必需的。
(iii)进行步骤5。2.真空除气：
(i)将约1-2克样品或1-2毫升液体样品悬浮到50毫升锥形管中的6毫升无菌水或任何其它所需缓冲液中(水样品应置入所研究的培养基的表面)。
(ii)在约600mmHg真空下于40℃培养60分钟(这一步骤中管盖应松开)
(iii)进行步骤5。3.SB-18去垢剂和真空除气：
(i)向样本(1-2克或1-2毫升)中加入约25毫升SB-18洗涤缓冲液。注：所述洗涤缓冲液应倒入具有原始样本的50毫升锥瓶中。
(ii)涡旋以悬浮样品，并在37℃下培养60分钟(140rpm或强度足以分裂培养物到液体中)。37℃温度有利于分散，也是保持去垢剂不沉淀所必需的。
(iii)在约600mmHg真空下于40℃培养60分钟(这一步骤中管盖应松开)
(iii)进行步骤5。
4.澄清和/或纯化后SB-18洗涤(真空除气可有可无)：
(i)将约1-2克样品或1-2毫升液体样品悬浮到50毫升锥形管中的6毫升无菌水中。
(ii)涡旋样品并使其置入室温下10分钟。
(iii)将1.25X SB-18第二洗涤缓冲液充加到管中，并于37℃贮存。
(iv)经于25℃在2700rpm(2,000Xg)下离心10分钟，或在任何澄清样品(不需进一步从上清液组份处理分枝杆菌)所需的力下澄清样品(如果样品中无可见的颗粒，则该步骤是可有无的)。
(v)从离心机取出并于室温下静置10分钟。
(vi)直接经G-50柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)从每一样品小心取出部分或大多数上清液组份至含有1.25XSB-18洗涤缓冲液的适当标记的50毫升锥形管中。移去所需体积但留下最接近沉淀部分。转移尽可能少的沉淀。
(vii)涡旋以混合内含物，然后在37℃下振荡培养60分钟。松开管盖并在约600mmHg真空下于40℃培养60分钟(这一步骤是可有可无的)。
(iv)进行步骤5。
5.在37℃下离心锥形管20分钟。注：在这一实施例中，使用IEC Model PR7000M临床离心机。使用这一离心机的最大速度/g-力速率5200rpm/7400Xg。
6.离心时，等分200μl 2X溶解缓冲液到合适数量的标记的1.5毫升螺旋盖离心管中(在4℃下保存该管)。7.离心后，移出上清液，小心不要移动沉淀。尽可能完全地移出。
8.向沉淀上加入200μl水。
9.经涡旋重新悬浮沉淀。
10.如果需要，移出100μl等分样。通常有100到200μl上清液保留在锥形瓶瓶底。向沉淀中加入多于200μl的水通常是不需要的：对培养、涂片和扩增有足够液体。注：用于涂片分析，必须尽量除去去垢剂。
11.将200μl样本转移到合适标记的1.5毫升含有200μl 2X溶解缓冲液的螺旋盖离心管中(从以上步骤6)。
12.涡旋并在60℃下培养60分钟。
13.涡旋并在95℃下培养60分钟。
14.涡旋并立即完成PCR，或在-20℃下保存。在移取用于扩增的等分样前，锥形管应进行快速离心步骤。
NALC/NaOH和SB-18处理的临床样品的比较
表12比较了已由NALC/NaOH和SB-18两者处理的13个样品。使用的样品是临床实验室弃掉的，其中一部分已用NALC/NaOH处理。这些样品的起始体积超过Kent，P.T.等(“PublicHealth Mycobacteriology，”in A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Service，Centers for DiseaseControl，(1985)pp，31-46)建议的最大推荐体积。因此，使用原始样本的残余物(该残余物在用NALC/NaOH沉淀接种培养物后弃掉)。一般是保留1毫升用于SB-18处理。用两种方法，培养物1、10、12和13为阳性。培养物1的SB-18样品不含有抗酸物质，使这一培养物生长后产生假单胞菌菌株。培养物10、12和13的两种方法的样品都含有抗酸物质。扩增SB-18沉淀，样品4、10、12和13为PCR阳性。样品1含有抑制剂，样品4得自过去诊断为结核分枝杆菌感染的病人。假定该病人接受过药物治疗。样品4为涂片阴性。表12的结果(尽管非常有限)说明可以用SB-18处理样品并扩增来估测分枝杆菌DNA的存在。此外，SB-18具有某些的杀菌和制菌活性。然而，假单胞菌也是完全不能渗透的(Jarlier，V.etal.，J.Bacterol.172：1418-1423(1990))，在培养SB-18处理的样品时是要考虑的问题。必须注意到SB-18样品10、12和13(代表明显较少的物质)更快地产生培养阳性样品。
表12：直接用SB-18处理临床样本
比较显示13个用NALC/NaOH和SB-18两种方案处理的临床样本的培养数据。具体地说，NALC/NaOH方法是按照Kent，P.T.et al”Public Health Mycobacteriology，”in A Guide for the level IIILaboratory，U.S.Department of Health and Human Service，Centersfor Disease Control，(1985)pp，31-46的方法(终浓度3％)，SB-18方法是以上描述的方法，并从步骤3开始。然后按步骤5到14中指出的继续。按照Kent，P.T.et al“Public Health Mycobacterio-logy，”in A Guide for the level III Laboratory，U.S.Department ofHealth and Human Service，Centers for Disease Control，(1985)pp，71-157的方法检查NALC/NaOH样本的抗酸物质。使用的样品是临床实验室弃掉的，其中一部分已用NALC/NaOH处理。数字代表由BACTEC 460TB计数器(Becton Dickinson，Sparks，MD)记录的给定样品释放的14CO2计数。在一定时间期限内常规检测各培养物。超过15的值被认为是阳性。按照Kent，P.T.et al“PublicHealth Mycobacteriology，”in A Guide for the level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Service，Centers for DiseaseControl，(1985)pp，71-157的方法检测阳性培养物的抗酸物质。一旦样品表现出抗酸阳性，即终止培养，以“+”表示。ND表示样品不到7周时间。
表12 NALC/NaOH和SB-18处理的临床样品的比较
  #   方  法           周  1             周  2   周  3   周  4   周  5 周  6 周  7
1 SB-18     5   200     +     +     +     +     +     +     +    +    +
NALC     5     0     0     15     999     +     +     +     +    +    +
2 SB-18     5     3     0     3     0     0     3     4     0    0    0
NALC     5     0     0     3     0     0     3     0     0    3    0
3 SB-18     5     3     0     3     0     0     4     3     0    0    0
NALC     5     0     0     3     0     0     2     3     0    3    0
4 SB-18     4     3     0     3     0     0     3     3     0    0    0
NALC     4     0     0     3     0     0     4     3     0    0    0
5 SB-18     1     5     4     3     0     0     0     0     0    3   ND
NALC     1     5     3     3     0     0     0     0     0    3   ND
6 SB-18     2     4     3     2     0     0     0     0     0    4   ND
NALC     1     4     3     2     0     0     0     0     0    3   ND
7 SB-18     6     0     4     3     0     0     0     4     4    3   ND
NALC     0     4     3     4     0     0     0     0     3    4   ND
  #   方  法             周  1            周  2   周  3   周  4 周  5 周  6 周  7
8 SB-18     6     0     0     3     0     0     0     3    3    3   ND
NALC     5     0     3     3     0     0     0     0    3    3   ND
9 SB-18     5     0     0     4     0     0     0     4    2    3   ND
NALC     0     0     3     3     0     0     0     0    2    3   ND
10 SB-18     5     0     0     66     +     +     +     +    +    +    +
NALC     5     0     5     14     874     +     +     +    +    +    +
11 SB-18     1     0     0     3     1     0     3     0    0    0   ND
NALC     1     0     0     3     0     0     3     0    0    0   ND
12 SB-18     1     0     3     12     16     47     506     +    +    +    +
NALC     1     0     0     3     3     83     +     +    +    +    +
13 SB-18     2     7   372     +     +     +     +     +    +    +    +
NALC     1     3   173     +     +     +     +     +    +    +    +
                 实施例14
     从全血定量分离鸟分枝杆菌复合物的方法
将1毫升全血加入到10毫升含有类SB-18或近似十八烷基去垢剂的缓冲液中，涡旋混合该溶液。
注：全血应从ACD(酸-柠檬酸盐-葡萄糖)收集管(Becton-Dickinson)取出，收集管应充分混合。
注：对使用CB-18(CAS No.78195-27-4)来说，这一方案已经优选。使用的缓冲液是20mMTris-HClpH8.2，2mM NaCl和1mMCB-18。CB-18的较高浓度(例如，2mM)似乎有利于溶解这些有机体。对所使用的各类SB-18或近似十八烷基去垢剂来说，应当优化这一方案的改进。(2)在37℃下振荡(140rmp)培养60分钟。(3)松开盖子并转移到真空炉中。在600mmHg下于42℃培养60分钟。(4)盖紧盖子并于30℃在3500xg下离心20分钟。
注：当进行15ml锥形管的离心时应当小心。首先应使用合适的旋转适配器。其次由于有破裂的可能性，不应使用聚苯乙烯管，而应使用聚丙烯管。(5)滗析管并加入500μl含有相同类SB-18或近似十八烷基去垢剂的洗涤缓冲液，再悬浮沉淀。[注：一般形成小凝胶状沉淀，不要试图从管中移去所有的上清液]。(6)用可任意使用的转移吸量管将重新悬浮的沉淀转移到1.5ml螺旋盖离心管中。(7)将离心管放入离心机中，在室温下于最大速度离心10分钟(这一步骤的温度依方案中使用的去垢剂变化)。(8)吸出上清液，将300μl无菌水加到样本中。(9)重新悬浮沉淀，将200μl转移到2×溶解缓冲液中用于扩增。按实施例1的描述处理扩增样本并检测。(10)将剩余沉淀转移到BACTEC 12B培养瓶(Becton-Dickinsn)中供分析用。
                 实施例15
            改进的草酸清除方法
当采用实施例13的方案时，潜在的假单胞菌污染是最大的问题。如果这是一个问题，可以通过用草酸消化或用草酸预消化污染的唾液消除假单胞菌。这种消除方案如下所述。这一方案改进了Kent et al.“Pblic Health Mycobacteriology”in A Guide for the LevelIII Laboratory，U.S.Department of Heath and Human Service，Cen-ters for Disease Control(1985)，pp.31-46第43-44页上描述的草酸方案。(1)将0.5-2ml原始样本或2ml污染培养物置入50ml圆锥管中，(2)向样本或污染培养物中加入等量的5％草酸(乙二酸，CAS_No6153-56-6)。
5％草酸：100ml水中5g草酸二水合物(126.01g/mol)。(3)在室温下培养15分钟。(4)向混合物中加入1/10体积的“NaOH中和溶液”，并立即涡旋。例如，如果2ml草酸加到样本中，然后向样本中加入200μlNaOH中和溶液。
NaOH中和溶液：100ml水中31.76g氢氧化钠(40g/ml)(终浓度：7.94M)。(5)向样本中加入含有类SB-18或近似十八烷基去垢剂至终体积约25ml。(6)在35℃下振荡(140rpm)培养60分钟。(7)松开盖子并转移到真空炉中。在600mmHg下于42℃培养60分钟。(8)盖紧盖子并于37℃在5000xg下离心20分钟。(9)滗析管并将300μl无菌水加到样本中。(10)再悬浮沉淀并将200μl转移到2倍体积的溶解缓冲液中用于扩增。扩增和检测样本的处理方法如实施例1所述。(11)将剩余沉淀转移到BACTEC12B培养瓶(Becton-dickinsn)中供分析用。
                 实施例16
除了以下微生物通过检测其遗传物质或检测指示该微生物存在的抗原来检测外，采用实施例12、13、14或15任一之方法。所述微生物是所需的非分枝杆菌微生物，或所需的分枝杆菌组或复合物或分枝杆菌种，或分枝杆菌复合物(例如结核分枝杆菌(MTB)复合物、鸟分枝杆菌(MAC)复合物、MAIS复合物和偶发分枝杆菌复合物)以及快速生长和慢速生长的分枝杆菌(包括特定的和非特定的光产色菌(photochromogens)、非光产色菌、暗产色菌，特别是非洲分枝杆菌、M.asiaticum、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、丁酸分枝杆菌、龟分枝杆菌、M.duvalii、淡黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌、M.haemophilum、胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、鼠麻疯分枝杆菌、M.linda、M.lufu、海分枝杆菌、M.malmoense、田鼠分枝杆菌、粘液分枝杆菌、无色分枝杆菌、副结核分枝杆菌、M.peregrinum、草分枝杆菌、红皮分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、M.shimoidei、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、M.szul-gai、土分枝杆菌、M.thermoresistable、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、M.vaccae、蟾分枝杆菌)。
                 实施例17
除了去垢剂是表2和3限定的类SB-18去垢剂而不是SB-18外，采用实施例12-16任一所述的方法。
                 实施例18
除了去垢剂是近似十八烷基去垢剂而不是SB-18外，采用实施例12-16任一所述的方法。
                 实施例19
除了在处理步骤中使用至少两种不同的近似十八烷基去垢剂外，采用实施例12-16任一所述的方法。
                 实施例20
表13列出了本文涉及的登记号、对应于登记号的化学名称和结构式。
                 表13
CAS_登记号   名称和结构式1.  57-10-3        棕榈酸
             HO2C-(CH2)14-Me2.  68-12-2        二甲基甲酰胺和N，N-二甲基甲酰胺
Figure A9519318902121
3.  75-12-7        甲酰胺
               H2N-CH＝O4.  95-56-0        c-十六烷基甜菜碱和1-羧基-N，N，
               N-三甲基-1-十七烷铵，内盐5.  96-55-9        c-癸基甜菜碱和1-羧基-N，N，N-三
               甲基-1-十一烷铵，内盐6.  112-80-1       油酸和(z)-9-十八烯酸7.  139-08-2       苯基DMA-14-Cl1和氯化苄基二甲基十
               四烷铵
Figure A9519318902124
8.  143-07-7       十二烷酸
               HO2C-(CH2)10-Me
CAS_登记号   名称和结构式9.  151-21-3       SDS和十二烷基硫酸钠和单十二烷基硫酸
               酯钠盐
                   HO3SO-(CH2)11-Me
                          *Na10. 302-95-4       脱氧胆酸和12-α-二羟基-3-α-5-
               β-胆烷-24-酸单钠盐11. 334-48-5       癸酸
               HO2C-(CH2)8-Me12. 683-10-3       N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十二烷
               铵，内盐
Figure A9519318902132
13. 686-83-9       1-羧基-N，N，N-三甲基-1-十三烷
               铵，内盐14. 686-84-0       1-羧基-N，N，N-三甲基-1-十九烷
               铵，内盐
CAS_登记号   名称和结构式15. 693-33-4       N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷
               铵，内盐
Figure A9519318902142
16. 820-66-6       N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十八烷
               铵，内盐17. 871-37-4       油基羧甲基甜菜碱和N-(羧甲基)-N，
               N-二甲基-9-十八烯-1铵，内盐18. 1119-94-4      TMA-12.Br-和溴化N，N，N-三甲基-
               十二烷铵
                   Me3 +N-(CH2)11-Me
                          *Br*19. 1119-97-7      TMA-14.Br和溴化N，N，N-三甲基-
               1-十四烷铵
                   Me3 +N-(CH2)13-Me
                          *Br*
CAS_登记号    名称和结构式20. 1120-02-1       TMA-18.Br和溴化N，N，N-三甲基-
                1-十八烷铵
                   Me3 +N-(CH2)17-Me
                          *Br*21. 1120-04-3       SOS和十八烷基硫酸钠
                   HO3SO-(CH2)17-Me
                          *Na22. 1338-39-2       山梨糖醇酯类20和十二烷酸脱水山梨糖
                醇酯23. 1338-41-6       山梨糖醇酯类60和十八烷酸脱水山梨糖
                醇酯
Figure A9519318902152
24. 1338-43-8       山梨糖醇酯类80和(z)-单-9-十八烯酸
                脱水山梨糖醇酯
Figure A9519318902153
CAS_登记号   名称和结构式25. 1462-54-0      N-十二烷基-β-丙氨酸
               Me-(CH2)11-NH-CH2-CH2-CO2H26. 1643-20-5      二甲基月桂基胺氧化物和N，N-二甲基
               1-十二烷胺N-氧化物
Figure A9519318902161
27. 2281-11-0      SB-16和C16-磺丙基甜菜碱和N，N-二
               甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内
               盐
Figure A9519318902162
28. 2571-88-2      N，N-二甲基-1-十八烷铵N-氧化物
Figure A9519318902163
29. 2601-33-4      N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十四烷
               铵，内盐
CAS_登记号   名称和结构式
Figure A9519318902171
30. 2644-45-3      N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-癸铵，
               内盐
Figure A9519318902172
31. 2956-38-9      N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十一烷
               铵，内盐32. 3055-96-7      6-月桂基醚和3、6、9、12、15、18-六氧三
               十烷-1-醇
HO-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-(CH2)11-Me33. 3332-27-2      十四烷基二甲基胺氧化物和N，N-二甲基
               -1-十四烷胺N-氧化物
Figure A9519318902174
34. 4292-10-8      N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-
               氧代十二烷基)氨基)-1-丙铵，内盐
CAS_登记号    名称和结构式35. 6179-44-8       异硬脂基酰氨丙基羧甲基甜菜碱和N-
                (羧甲基)-N，N-二甲基-3(1-氧代十
                八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902181
36. 6232-16-2       N-(羧甲基)-N，N-二乙基-1-十二烷
                铵，内盐
Figure A9519318902182
37. 7128-91-8       N，N-二甲基-1-十六烷胺N-氧化物38. 7281-04-1       苯基DMA-12.Br和溴化N-十二烷基-
                N，N-二甲基苯甲铵39. 7425-12-9       C16-羟丙基磺基甜菜碱和N-(2-羟基-
                3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷
                铵，内盐40. 8001-54-5       苯基Alk-Cl-和氯化烷基二甲基苄胺
N/A
CAS_登记号    名称和结构式41.9002-92-0       Brij35和α-十二烷基-ω-羟基-聚(氧
                -1，2-亚乙基(ethanediyl))
Figure A9519318902191
                    Brij35：n＝2342.9002-93-1        Triton X-100和α-〔4-(1，1，3，3-四甲
                基丁基)苯基〕-ω-羟基聚(氧-1，2-亚
                乙基)
                    TritionX-100：n＝2343.9003-39-8        聚乙烯吡咯烷酮360,000和1-乙烯基-
                2-吡咯烷酮同聚物
Figure A9519318902193
44.9004-95-9       Brij 52和Brij 56和Brij 58和α-十六烷基
                -ω-羟基-聚(氧-1，2-亚乙基)
Figure A9519318902194
                    Brij 52：n＝2
                    Brij 56：n＝10
                    Brij 58：n＝2045.9004-98-2       Brij 92和Brij 96和Brij 99和(z)-9-十
               八烯-1-醇与聚氧乙烯的单醚
CAS_登记号   名称和结构式
Figure A9519318902201
           Brij 92：n＝2
           Brij 96：n＝10
           Brij 99：n＝2046.9005-00-9    Brij 72和Brij 76和Brij 78和α-十八烷基
            -ω-羟基-聚(氧-1，2-亚乙基)
          Brij 72：n＝2
          Brij 76：n＝10
          Brij 78：n＝2047.9005-64-5    Tween 20和聚(氧-1，2-亚乙基)单十二
            烷酸脱水山梨糖醇酯衍生物(n＝20)
N/A48.9005-65-6
            Tween 80和(z)-聚(氧-1，2-亚乙基)单
            -9-十八烯酸脱水山梨糖醇酯衍生物(n
            ＝20)
N/A49.9005-67-8    Tween 60和聚(氧-1，2-亚乙基)单十八
            烷酸脱水山梨糖醇酯衍生物(n＝20)
N/A50.13177-41-8   SB-18和C18-磺丙基甜菜碱和N，N-二
            甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内
            盐
CAS_登记号   名称和结构式51. 13177-42-9     N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲
               基-1-十四烷铵，内盐
Figure A9519318902212
52. 13197-76-7     N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲
               基-1-十二烷铵，内盐53. 14233-37-5     1，4-双(1-甲基乙基)氨基)-9，10-蒽
               醌
Figure A9519318902214
54. 1435 1-50-9    N，N-二甲基-9-十八烯-1胺N-氧化
               物
Figure A9519318902215
55. 14933-08-5     SB-12和C12-磺丙基甜菜碱和N，N-二
               甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵，内
               盐
Figure A9519318902216
CAS_登记号  名称和结构式56. 14933-09-6    SB-14和C14-磺丙基甜菜碱和N，N-二
              甲基-N-(3-磺丙基)-1-十四烷铵，内
              盐
57. 15163-30-1    N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十
              二烷铵，内盐58. 15163-34-5    氢氧化十二烷基二丙基(3-磺丙基)-铵，
              内盐59. 15163-35-6    N，N-二甲基-N-(3-磺氧)丙基)-1-
              十二烷基，内盐
Figure A9519318902224
60. 15163-36-7    N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-癸
              铵，内盐
Figure A9519318902225
61. 15178-76-4    N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-辛
              铵，内盐
CAS_登记号   名称和结构式
Figure A9519318902231
62. 16527-85-8     N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十
               二烷铵，内盐63. 16545-85-0     1-羧基-N，N，N-三甲基-1-十五烷
               铵，内盐64. 19223-55-3     2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-
               氧代二十烷基)氨基)丙基)-3-磺基-
               1-丙铵，内盐65. 19223-56-4     N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲
               基-1-十八烷铵，内盐66. 22313-73-1     N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十
               八烷铵，内盐
Figure A9519318902236
CAS_登记号   名称和结构式67. 23609-76-9     N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十三烷
               铵，内盐
Figure A9519318902241
68. 23609-77-0     N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十五烷
               铵，内盐
Figure A9519318902242
69. 24020-67-5     N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十
               二烷铵，内盐
Figure A9519318902243
70. 25322-68-3     PEG1450和α-氢-ω-羟基-聚(氧-1，
               2-亚乙基)
               PEG 1450：n＝2471. 26483-35-2
               N，N-二甲基-1-二十二烷胺N-氧化
               物
CAS_登记号    名称和结构式72. 26873-85-8      Ficoll 400,000和β-D-呋喃果糖基-α-
                D-吡喃葡萄糖苷与(氯甲基)环氧乙烷的
                聚合物
Figure A9519318902251
73. 29557-49-1      氢氧化(2-(十二烷基羟氧膦基)乙基)三
                甲基铵，内盐
Figure A9519318902252
74. 30612-73-8      N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十
                八烷铵，内盐
Figure A9519318902253
75. 32020-40-9      氢氧化(2-(十二烷基羟氧膦基)乙基)二
                甲基-锍，内盐
Figure A9519318902254
76. 32020-41-0      氢氧化(3-羟丙基)三甲基-铵，氢癸基磷
                酸盐，内盐77. 32020-42-1      氢氧化(2-羟乙基)二甲基-锍，氢癸基磷
                酸盐，内盐
CAS_登记号   名称和结构式
Figure A9519318902261
78. 32020-43-2     氢氧化二乙基(2-羟乙基)-锍，癸基氢磷
               酸盐，内盐79. 32954-43-1     N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-
               氧代十六烷基)氨基)-1-丙铵，内盐80. 34135-76-7     N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲
               基-1-癸铵，内盐
Figure A9519318902264
81. 34236-95-8     N，N-二甲基-N((3-磺氧)丙基-1-十
               六烷铵，内盐
Figure A9519318902265
82. 35489-44-2     N-(1，3-二甲基-3-磺丁基)-N，N-
               二甲基-1-十二烷铵，内盐
Figure A9519318902266
83. 36051-36-2     N，N-二甲基-N(磺甲基)-1-十八烷
               铵，内盐
CAS_登记号    名称和结构式
Figure A9519318902271
84. 42416-43-3      N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十
                六烷铵，内盐85. 52562-28-4      N，N-二甲基-N-(3-((氧代十二烷基)
                氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐86. 52562-29-5      N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷
                基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902274
87. 52667-78-4      N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十二烷
                铵，内盐
Figure A9519318902275
88. 56505-82-9      N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲
                基-2-十四烷铵，内盐89. 58930-04-4      N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十
                四烷铵，内盐
CAS_登记号   名称和结构式90. 58930-05-5     N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十
               六烷铵，内盐
Figure A9519318902282
91. 58930-06-6     N，N-二甲基-3((1-氧代十六烷基)氨
               基)-N-(2-磺乙基)-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902283
92. 58930-07-7     N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十
               六烷铵，内盐
Figure A9519318902284
93. 58930-08-8     N，N-二甲基-N-(3-((氧代十六烷基)
               氨基)丙基)-4-磺基-1-丁铵，内盐
Figure A9519318902285
94. 58930-09-9     N，N-二甲基-N-(2-(磺氧)乙基)-
               1-十四烷铵，内盐
Figure A9519318902286
95. 58930-10-2     N，N-二甲基-N-(2-(磺氧)乙基)-
               1-十六烷铵，内盐
CAS_登记号   名称和结构式
Figure A9519318902291
96. 58930-11-3     N，N-二甲基-3-((1-氧代十六烷基)
               氨基)-N-(2-磺氧)乙基)-1-丙铵，内
               盐
Figure A9519318902292
97. 58930-12-4     N，N-二甲基-N-((3-磺氧)丙基)-
               1-十四烷铵，内盐
Figure A9519318902293
98. 58930-13-5     N，N-二甲基-3-((1-氧代十六烷基)
               氨基)-N-(3-(磺氧)丙基)-1-丙铵，
               内盐
Figure A9519318902294
99. 58930-14-6     N，N-二甲基-N-(4-(磺氧)丁基)-
               1-十二烷铵，内盐
Figure A9519318902295
100. 58930-15-7    N，N-二甲基-N-(4-(磺氧)丁基)-
               1-十六烷铵，内盐
Figure A9519318902296
 CAS_登记号   名称和结构式101. 58930-16-8     N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷
                基)氨基)丙基)-4-(磺氧)-丁铵，内盐
Figure A9519318902301
102. 59272-84-3     N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-
                氧代十四烷基)氨基)-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902302
103. 59942-40-4     N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-
                1-十二烷铵，内盐
 N/A104. 59942-41-5     N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-
                1-十四烷铵，内盐
 N/A105. 59942-42-6     N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-
                1-十六烷铵，内盐
 N/A106. 61789-37-9     椰子树酰氨基丙基(cocoamidopropyl)羧甲
                基甜菜碱
 N/A107. 61789-39-7     3-氨基-N-(羧甲基)-N，N-二甲基-
                1-丙铵，N-椰子树酰基(coco acyl)衍生
                物，氯化物，钠盐
 N/A108. 61789-40-0     3-氨基-N-(羧甲基)-N，N-二甲基-
                1-丙铵，N-椰子树酰基衍生物，内盐
 N/A
 CAS_登记号   名称和结构式109. 63663-10-5     2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-
                氧代十四烷基)氨基)丙基)-3-磺基-
                1-丙铵，内盐
Figure A9519318902311
110. 63663-11-6     2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-
                氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-
                1-丙铵，内盐
Figure A9519318902312
111. 63663-12-7     2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-〔(1-
                氧代十八烷基)氨基)丙基〕-3-磺基-
                1-丙铵，内盐112. 63663-13-8     N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷
                基)氨基)丙基)-2-磺基-1-丙铵，内盐113. 64463-49-6     N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十
                二烷基，内盐
Figure A9519318902315
114. 65180-40-7     N-十二烷基-N，N-二甲基-4-磺基苯
                甲铵，内盐
 CAS_登记号115. 65180-41-8    N，N-二甲基-4-磺基-N-十四烷基苯
Figure A9519318902322
116. 65180-42-9    N-十六烷基-N，N-二甲基-4-磺基-
Figure A9519318902323
117. 65180-43-0    N，N-二甲基-N-十八烷基-4-磺基-
Figure A9519318902324
118. 65180-44-1    N，N-二甲基-N-(3-(1-氧代十二烷
               基)氨基)丙基)-4-磺基苯甲铵，内盐
Figure A9519318902325
119. 65180-45-2    N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十四烷
               基)氨基)丙基)-4-磺基苯甲铵，内盐
Figure A9519318902326
120. 65180-46-3    N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷
               基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐
 CAS_登记号   名称和结构式
Figure A9519318902331
121. 65180-47-4     N，N-二甲基-N-(3-(1-氧代十八烷
                基)氨基)丙基)-4-磺基苯甲铵，内盐122. 66451-67-0     N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-氧代-
                1-十二烷铵，内盐
Figure A9519318902333
123. 66451-68-1     N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-氧代-
                1-十八烷铵，内盐
Figure A9519318902334
124. 66516-99-2     N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-氧代-
                1-十六烷铵，内盐
Figure A9519318902335
125. 67030-70-0     N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十
                五烷铵，内盐
 CAS_登记号   名称和结构式126. 68139-30-0     椰子树酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱和N-
                (3-氨丙基)-2-羟基-N，N-二甲基-
                3-磺基1-丙铵N-椰子树酰酰基衍生
                物，内盐
 N/A127. 68155-09-9     椰子树酰氨丙基二甲基胺氧化物
 N/A128. 68334-21-4     1-(羧甲基)-4，5-二氢-1-(羟乙
                基)-2-去甲椰子树烷基(norcoco
                alkyl)-咪唑啉，内盐
 N/A129. 68424-94-2     椰子树羧甲基甜菜碱
 N/A130. 69725-38-3     N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十
                四烷铵，内盐131. 69775-75-3     N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十六烷
                铵，内盐
Figure A9519318902341
132. 70750-46-8     牛脂(tallow)双羟乙基甘氨酸酯或双(羟乙
                基)牛脂烷基甜菜碱
 N/A133. 71497-51-3     N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲
                基-1-十四烷铵，内盐
                Me-(CH2)12-Me＝D1
 CAS_登记号   名称和结构式134. 71502-45-9     N-(2-羟-3-磺丙基)-N，N-二甲基
                -1-十五烷铵，内盐135. 71695-31-3     4-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-
Figure A9519318902353
136. 71695-32-4     N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十
                六烷铵，内盐137. 71695-33-5     4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-138. 71695-34-6     4-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基苯
Figure A9519318902356
139. 71695-35-7     2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-
                苯甲铵，内盐
 CAS_登记号   名称和结构式
Figure A9519318902361
140. 71850-98-7     蓖麻毒酰氨基丙基(ricinamidoprobyl)羧甲
                基甜菜碱和N-(羧甲基)-3-((12-羟
                基-1-氧代-9-十八烷基)氨基)-N，
                N-二甲基-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902362
141. 73565-98-7     N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十
                六烷铵，内盐142. 73602-79-6     2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-
                氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-(膦酰氧
                基)-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902364
143. 75621-03-3     CHAPS和N，N-二甲基-N-(3-磺丙
                基)-3-〔〔(3α，5β，7α，12α)-3-7-12-
                三羟基-24-氧代胆烷-24-基〕丁氨
                基〕-1-丙铵，内盐
 CAS_登记号
Figure A9519318902371
144. 76392-97-7    N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十
               二烷铵，内盐145. 78195-27-4    N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十
               八烷铵，内盐146. 84082-44-0    山萮基羧甲基甜菜碱和3-氨基-N-(羧
               甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵-N(8-
               22酰基衍生物，内盐
 N/A147. 89367-17-9    N，N-二甲基-N-(3-(膦酰氧基)丙
               基)-1-十六烷铵，内盐148. 92764-22-2    N，N-二甲基-N-(3-(磺氧基)丙基)-
               1-癸铵，内盐
Figure A9519318902375
149. 92764-24-4    N，N-二甲基-N-(2-(磺氧基)乙基)-
               1-癸铵，内盐
  CAS_登记号   名称和结构式150. 99485-86-6      3-(((十六烷氧基)羟基氧膦基)氧)-2-
                 羟基-N，N，N-三甲基-1-丙铵，内盐151. 99485-87-7      2-羟基-3(羟基(十八烷氧基)氧膦基)
                 氧)-N，N，N-三甲基-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902383
152. 99485-91-3      3-(((十二烷氧基)羟基氧膦基)氧)-2-
                 羟基-N，N，N-三甲基丙铵，内盐
Figure A9519318902384
153. 108797-84-8     3-丁氧基-2-羟基-N-(2-羟基-3-
                 磺丙基)-N，N-二甲基-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902385
154. 120139-51-7     N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十
                 二烷铵，内盐155. 124046-26-0     巴巴苏酰氨丙基二甲基胺氧化物
 N/A
 CAS_登记号   名称和结构式156. 124591-53-3    2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-膦酰氧
                基)乙基)-1-十二烷铵，内盐157. 124591-54-4    2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰
                氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐
Figure A9519318902392
158. 124591-57-7    2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-膦酰氧
                基)乙基)-1-十六烷铵，内盐
Figure A9519318902393
159. 126712-86-5    N，N-二甲基-N-(2-膦酰氧基)乙
                基)-1-十二烷铵，内盐
Figure A9519318902394
160. 126712-87-6    N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                基)-1-十四烷铵，内盐161. 126712-88-7    N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                基)-1-十六烷铵，内盐
 CAS_登记号   名称和结构式162. 126712-89-8     N，N-二甲基-N-(2-膦酰氧基)乙
                 基)-1-十八烷铵，内盐163. 126712-90-1     N，N-二乙基-N-(2-膦酰氧基)-1-
                 十六烷铵，内盐
Figure A9519318902403
164. 126712-91-2     N-(2-膦酰氧基)乙基)-N-二丙基-
                 1-十六烷铵，内盐165. 126712-92-3     N，N-二丁基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                 基)-1-十六烷铵，内盐
Figure A9519318902405
166. 126712-93-4     N-乙基-N-(2-膦酰氧基)乙基)-N-
                 丙基-1-十六烷铵，内盐
Figure A9519318902406
167. 126712-94-5     N-丁基-N-乙基-N-(2-(膦酰氧基)
                 乙基)-1-十六烷铵，内盐
  CAS_登记号   名称和结构式168. 127087-87-0     NP.40和α(4-王基苯基)-ω-羟基-聚
                 (氧-1，2-亚乙基)支链
 N/A169. 128506-41-2     3-(癸氧基)-2-羟基-N，N-二甲基-
                 N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，内盐170. 128506-42-3     3-(十二烷氧基)-2-羟基-N，N-二甲
                 基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，
                 内盐
Figure A9519318902413
171. 128506-46-7     -2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦
                 酰氧基)乙基)-3-(十四烷氧基)-1-丙
                 铵，内盐
Figure A9519318902414
172. 132621-79-5     N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十
                 三烷铵，内盐
Figure A9519318902415
 CAS_登记号   名称和结构式173. 132621-80-8    N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十
                二烷铵，内盐
Figure A9519318902421
174. 132621-81-9    N，N-二甲基-N-(6-磺己基)-1-十
                六烷铵，内盐
Figure A9519318902422
175. 132630-63-8    2-羟基-3-(羟基(十四烷氧基)氧膦基)
                氧)-N，N，N-三甲基-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902423
176. 134590-60-6    N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                基)-十八烯-1-铵，内盐
Figure A9519318902424
177. 134842-83-4    N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                基)-1-癸铵，内盐178. 134842-84-5    N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                基)-1-十一烷铵，内盐
Figure A9519318902426
 CAS_登记号   名称和结构式179. 134842-85-6    N-乙基-N-甲基-N-(2-(膦酰氧基)
                乙基)-1-十六烷铵，内盐
Figure A9519318902431
180. 134842-86-7    N，N-二甲基-N-(4-膦酰氧基)丁
                基)-1-十六烷铵，内盐181. 134842-87-8    N，N-二甲基-N-(6-膦酰氧基)己
                基)-1-十六烷铵，内盐
Figure A9519318902433
182. 144077-11-2    N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十三烷
                基)氨基)丙基)-4-(磺氧基)-1-丁铵，
                内盐
Figure A9519318902434
183. 144077-12-3    2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-
                氧代十八烷基)氨基)丙基)-3-(磺酰氧
                基)-1-丙铵，内盐
Figure A9519318902435
184. 145578-49-0    N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                基)-1-十七烷铵，内盐
 CAS_登记号   名称和结构式185. 146959-90-2    N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十
                四烷铵，内盐
Figure A9519318902442
186. 146959-91-3    N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十
                五烷铵，内盐
Figure A9519318902443
187. 148716-30-7    N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙
                基)-9-十八烯-1-铵，内盐
Figure A9519318902444
188. 150147-53-8    N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十
                一烷铵，内盐
                        序列表(1)一般信息：
   (I)申请人：Corning Clinical Laboratories，Inc.(II)发明名称：产生分枝杆菌的方法(III)序列数；4(IV)通讯地址：
  (A)联系人：Sterne，Kessler，Goldstein & Fox
  (B)街：1100 New York Avenue
  (C)城市：Washington
  (D)州：DC
  (E)国家：U.S.A
  (F)邮编：20005-3934(V)计算机可读形式
  (A)介质类型：Floppy disk
  (B)计算机：IBM PC compatible
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：Patentin Release#1.0，Version#1.25(VI)目前的申请信息：
  (A)申请号：(待定)
  (B)申请日：(待定)
  (C)分类号：(xii)在先申请信息：
  (A)申请号：US08/399,564
  (B)申请日：23-FEB-1995
  (C)分类号：(xii)在先申请信息：
  (A)申请号：US08/322,864
  (B)申请日：11-OCT-1994
  (C)分类号：(xii)在先申请信息：
  (A)申请号：US 08/223,592
  (B)申请日：07-APR-1994
  (C)分类号：(vii)在先申请信息：
  (A)申请号：08/221,731
  (B)申请日：05-APR-1994
  (C)分类号：(xiii)律师代理人信息：
  (A)姓名：Cimbala，Michele，A.
  (B)登记号：33,851
  (C)证书/证件号：1453.0030003/MAC
  (ix)电讯信息：
  (A)电话：(202)371-2600
  (B)传真：(202)371-2540
  (C)电报：248636 SSK(2)SEQ ID NO：1信息(i)序列特征：
 (A)长度：25个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：双链
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQID NO：1：AAACTGGGTC TAATACCGGA TAGGA(2)SEQ ID NO：2信息(i)序列特征：
 (A)长度：21个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
CCACCTACCG TCAATCCCGAG A(2)SEQ ID NO：3信息(i)序列特征：
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性(ix)特征：
  (A)名称/关键词：修饰碱基
  (B)位置：7
  (D)其它信息：/标记＝修饰碱基
              /注＝“7位上的核苷酸是肌苷(inosine)”(xi)序列描述：SEQ：IDNO：3：GCGGGCNCAT CCCACACCGC(2)SEQ ID NO：4信息(i)序列特征：
 (A)长度：23个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：双链
 (D)拓扑结构：线性(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GACCACGGGA TGCATGTCTT GTG

Claims (65)

1、一种制备用于检测至少一种可疑存在于样本中的微生物的样本的方法，该方法包括：
(a)将所说样本的样品置于包含类SB-18或类rod去垢剂的组合物中；和
(b)检测所说的微生物，其中所说的微生物在其外膜中包含类霉菌酸结构。
2、权利要求1的，其中所说的类SB-18去垢剂选自由类CB、类SB、类HSB、类PB、类StB、类PhB、类So、类Rev-B、类AO、类cAB、类LmB去垢剂和类Brij96组成的组。
3、权利要求2的方法，其中所说的类SB和类HSB去垢剂具有以下结构：
Figure A9519318900021
其中R1是C8-C22；
α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是0或1；
β是-N_-，P_-，S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4，-C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-其中m是≥1；并且γ是-SO3 _。
4、权利要求3的方法，其中所说的类SB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.52667-78-4)、N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.69775-75-3)、N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.36051-36-2)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.24020-67-5)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.58930-04-4)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-05-5)、N，N-二甲基-3-((1-氧代十六烷基)氨基)-N-(2-磺乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.58930-06-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-辛铵，内盐(CAS_No.15178-76-4)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-癸铵，内盐(CAS_No.15163-36-7)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.14933-08-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.14933-09-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.67030-70-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)、氢氧化十二烷基丙基(3-磺丙基)-铵，内盐(CAS_No.151163-34-5)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CASNo.52562-28-4)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-29-5)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.59942-40-4)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.59942-41-5)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.59942-42-6)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-2-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-13-8)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.64463-49-6)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-07-7)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.22313-73-1)、N-(1，3-甲基-3-二甲基-3-磺丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.35489-44-2)、N，N-二甲基-N-(3-((氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-1-丁铵，内盐(CAS_No.58930-08-8)、N，N-二甲基-N-(6-磺己基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.132621-81-9)、N-十二烷基-N，N-二甲基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-40-7)、N，N-二甲基-4-磺基-N-十四烷基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-41-8)、N-十二烷基-N，N-二甲基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-42-9)、N，N-二甲基-N-十八烷基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-43-0)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-44-1)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十四烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-45-2)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-46-3)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-47-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-癸铵，内盐(CAS_No.34135-76-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.13197-76-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.56505-82-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.71502-45-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.7425-12-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.19223-56-4)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.19223-55-3)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十四烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-10-5)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-11-6)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-12-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.13177-42-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.71497-51-3)、椰子树酰氨丙基羟磺基甜菜碱(CAS_No.68139-30-0)、烷基醚羟丙磺基甜菜碱(CAS_No.108797-84-8)、牛脂酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱、eruc酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱和canol酰氨丙基甜菜碱。
5、权利要求4的方法，其中所说的类SB-18去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.24020-67-5)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.58930-04-4)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-05-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.14933-08-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.14933-09-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.67030-70-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-28-4)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-29-5)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.64463-49-6)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-07-7)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.22313-73-1)、N，N-二甲基-N-(3-((氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-1-丁铵，内盐(CAS_No.58930-08-8)、
6、权利要求5的方法，其中所说的类SB-18去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)、
7、权利要求6的方法，其中所说的类SB-18去垢剂是N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)。
8、权利要求6的方法，其中所说的类SB-18去垢剂是N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)。
9、权利要求2的方法，其中所说的类CB去垢剂具有以下结构：
Figure A9519318900071
其中R1是C8-C22；α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是0或1；
β是-N_-，P_-，或S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4，-C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-其中m是≥1；并且γ＝-COO_。
10、权利要求9的方法，其中所说的类CB去垢剂选自由以下物质组成的组：N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.693-33-4)、椰子树羧甲基甜菜碱(CAS_No.68424-94-2)、N-(羧甲基)-N，N-二甲基-9-十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.871-37-4)、N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-氧代十八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.6179-44-8)、3-氨基-N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵-N-C8-C22酰基衍生物，内盐(CAS_No.84082-44-0)、N-(羧甲基)-3-((12-羟基-1-氧代-9-十八烷基)氨基-N，N-二甲基-1-丙铵，内盐(CAS_No.71850-81-2)、椰子树酰氨丙基羧甲基甜菜碱((CAS_No.61789-37-9和CAS_No.61789-40-0)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.16527-85-8)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS_No.132621-79-5)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.69725-38-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.42416-43-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.30612-73-8)、N-十二烷铵-β-丙氨酸，(CAS_No.1462-54-0)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.150147-53-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.15163-30-1)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.146959-90-2)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.146959-91-3)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.71695-32-4)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)、N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.120139-51-7)、N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.76392-97-7)、N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.73565-98-7)、N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.132621-80-8)、4-羧基-N-十二烷基N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-31-3)、2-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-34-6)、4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-33-5)、2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.1695-33-7)、牛脂甘氨酸酯(CAS_No.70750-46-8)、大豆酰氨丙基羧甲基甜菜和巴巴苏酰氨丙基羧甲基甜菜碱。
11.权利要求10的方法，其中所说的类CB去垢剂选自由以下物质组成的组：N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.16527-85-8)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS_No.132621-79-5)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.69725-38-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.42416-43-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.30612-73-8)、N-(3-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.150147-53-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.15163-30-1)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.146959-90-2)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.146959-91-3)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.71695-32-4)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)和N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.120139-51-7)。
12、权利要求11的方法，其中所说的类CB去垢剂是N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)。
13、权利要求2的方法，其中所说的类SB和类HSB去垢具有以下结构：
Figure A9519318900111
其中R1是C8-C22；
α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是0或1；
β是-N_-，P_-或S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4，-C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-其中m是≥1；并且γ是-POx _其中x＝1，2或3。
14、权利要求2的方法，其中所说的类PB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-癸铵，内盐(CAS_No.134842-83-4)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.134842-84-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.126712-86-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.126712-87-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-88-7)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十七烷铵，内盐(CAS_No.145578-49-0)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.126712-89-8)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.134590-60-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-9-十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.148716-30-7)、N，N-二乙基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-90-1)、N-(2-(膦酰氧基)乙基)-N，N-二丙基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-91-2)、N，N-二丁基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-92-3)、N-乙基-N-(2-膦酰氧基)乙基)-N-丙基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-93-4)、N-乙基-N-甲基-N-(2-膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-85-6)、N，N-二甲基-N-(3-(膦酰氧基)丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.89367-17-9)、N，N-二甲基-N-(4-(膦酰氧基)丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-86-7)、N，N-二甲基-N-(6-(膦酰氧基)己基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-87-8)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.124591-53-3)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.124591-54-4)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.124591-57-7)、N-丁基-N-乙基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-94-5)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-(膦酰氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.73602-79-6)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-3-(膦酰氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.144077-12-3)、3-(癸氧基)-2-羧基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-41-2)、3-(十二烷氧基)-2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-42-3)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-3-(十四烷氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-46-7)。
15、权利要求14的方法，其中所说的类PB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.126712-86-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.126712-87-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-88-7)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十七烷铵，内盐(CAS_No.145578-49-0)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.126712-89-8)、N，N-二甲基-N-(3-(膦酰氧基)丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.89367-17-9)和N，N-二甲基-N-(4-(膦酰氧基)丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-86-7)。
16、权利要求1的方法，其中至少一种所说的微生物是分枝杆菌属的成员。
17、权利要求16的方法，其中所说的分枝杆菌选自由下列微生物组成的组的一个或多个成员：结核分枝杆菌(MTB)复合物、鸟分枝杆菌(MAC)复合物、MAIS复合物、偶发分枝杆菌复合物、光产色菌、非光产色菌、暗产色菌、非洲分枝杆菌、M.asiaticum、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、丁酸分枝杆菌、龟分枝杆菌、M.duvalii、淡黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌、M.haemophilum、胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、鼠麻疯分枝杆菌、M.linda、M.1ufu、海分枝杆菌、M.malmoense、田鼠分枝杆菌、粘液分枝杆菌、无色分枝杆菌、副结核分枝杆菌、M.peregrinum、草分枝杆菌、红皮分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、M.shi-moidei、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、M.szulgai、土分枝杆菌、M.ther-moresistable、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、M.vac-cae、蟾分枝杆菌和它们的血清变型。
18、权利要求17的方法，其中所说的分枝杆菌选自由结核分枝杆菌(MTB)复合物和鸟分枝杆菌(MAC)复合物组成的组。
19、权利要求18的方法，其中所说的分枝杆菌是结核分枝杆菌(MTB)复合物的成员。
20、权利要求17的方法，其中所说的分枝杆菌选自由下列微生物组成的组：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌和海分枝杆菌。
21、一种制备用于检测至少一种可疑存在于样本中的微生物的样本的方法，该方法包括：
(a)将所说样本的样品置于足以改变所说样品中至少一种所说的微生物的浮力的真空压力下，其中所说的微生物在其外膜中包含类霉菌结构。和
(b)根据所说浮力的变化检测所说的微生物。
22、权利要求21的方法，其中所说的方法还包括至少一个洗涤步骤，在该步骤中使所说生物与近似十八烷基去垢剂接触。
23、权利要求22的方法，其中所说的洗涤步骤在真空步骤之后和/或与之同时进行。
24、权利要求23的方法，其中所说的去垢剂选自由类SB-18和类rod去垢组成的组。
25、权利要求24的方法，其中所说的去垢剂是类SB-18去垢剂。
26、权利要求25的方法，其中所说的类SB-18去垢剂选自由类CB、类SB、类HSB、类PB、类StB、类PhB、类So、类Rev-B、类AO、类cAB、类ImB去垢剂组成的组。
27、权利要求26的方法，其中所说的类SB和类HSB去垢剂具有以下结构：
Figure A9519318900151
其中R1是C8-C22；
α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是0或1；
β是-N_-，P_-或S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4，-C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-其中m是≥1；并且γ是-SO3 _。
28、权利要求27的方法，其中所说的类SB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.52667-78-4)、N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.69775-75-3)、N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.36051-36-2)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.24020-67-5)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.58930-04-4)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-05-5)、N，N-二甲基-3-((1-氧代十六烷基)氨基)-N-(2-磺乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.58930-06-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-辛铵，内盐(CAS_No.15178-76-4)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-癸铵，内盐(CAS_No.15163-36-7)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.14933-08-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.14933-09-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.67030-70-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)、氢氧化十二烷基丙基(3-磺丙基)-铵，内盐(CAS_No.15163-34-5)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-28-4)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-29-5)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.59942-40-4)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.59942-41-5)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.59942-42-6)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-2-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-13-8)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.64463-49-6)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-07-7)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.22313-73-1)、N-(1，3-甲基-3-二甲基-3-磺丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.35489-44-2)、N，N-二甲基-N-(3-((氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-1-丁铵，内盐(CAS_No.58930-08-8)、N，N-二甲基-N-(6-磺己基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.132621-81-9)、N-十二烷基-N，N-二甲基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-40-7)、N，N-二甲基-4-磺基-N-十四烷基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-41-8)、N-十二烷基-N，N-二甲基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-42-9)、N，N-二甲基-N-十八烷基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-43-0)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-44-1)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十四烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-45-2)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-46-3)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-47-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-癸铵，内盐(CAS_No.34135-76-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.13197-76-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.56505-82-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.71502-45-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.7425-12-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.19223-56-4)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.19223-55-3)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十四烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-10-5)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-11-6)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-12-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.13177-42-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.71497-51-3)、椰子树酰氨丙基羟磺基甜菜碱(CAS_No.68139-30-0)、烷基醚羟丙磺基甜菜碱(CAS_No.108797-84-8)、牛脂酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱、
eruc酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱和canol酰氨丙基甜菜碱。
29、权利要求28的方法，其中所说的类SB-18去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.24020-67-5)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.58930-04-4)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.5893-0-05-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.14933-08-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.14933-09-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.67030-70-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-28-4)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-29-5)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.64463-49-6)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-07-7)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.22313-73-1)、N，N-二甲基-N-(3-((氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-1-丁铵，内盐(CAS_No.58930-08-8)、
30、权利要求29的方法，其中所说的类SB-18去垢剂选自由SB-16(N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0))和SB-18(N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8))组成的组。
31、权利要求30的方法，其中所说的类SB-18去垢剂是N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)。
32、权利要求30的方法，其中所说的类SB-18去垢剂是N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)。
33、权利要求26的方法，其中所说的类CB去垢剂具有以下结构：
Figure A9519318900201
其中R1是C8-C22；α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是0或1；
β是-N_-，-P_-，或-S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C31H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4-，-C3H6-，-C4H8，-C5H10-，-C6H12-，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-其中m是≥1；并且γ是-COO_.
34、权利要求33的方法，其中所说的类CB去垢剂选自由以下物质组成的组：N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.693-33-4)、
椰子树羧甲基甜菜碱(CAS_No.68424-94-2)、N-(羧甲基)-N，N-二甲基-9-十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.871-37-4)、N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-氧代十八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.6179-44-8)、3-氨基-N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵-N-C8-C22酰基衍生物，内盐(CAS_No.84082-44-0)、N-(羧甲基)-3-((12-羟基-1-氧代-9-十八烷基)氨基-N，N-二甲基-1-丙铵，内盐(CAS_No.71850-81-2)、椰子树酰氨丙羧甲基甜菜碱(CAS_No.61789-37-9)和(CAS_No.61789-40-0)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.16527-85-8)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS_No.132621-79-5)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.69725-38-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.42416-43-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.30612-73-8)、N-十二烷基-β-丙氨酸(CAS_No.1462-54-0)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.150147-53-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.15163-30-1)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.146959-90-2)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.146959-91-3)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.71695-32-4)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)、N-(3-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.120139-51-7)、N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.76392-97-7)、N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.73565-98-7)、N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.132621-80-8)、4-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-31-3)、2-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-34-6)、4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-33-5)、2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.1695-33-7)、牛脂甘氨酸酯(CAS_No.70750-46-8)、大豆酰氨丙基羧甲基甜菜碱和巴巴苏酰氨丙基羧甲基甜菜碱。
35、权利要求34的方法，基中所说的类CB去垢剂选自由以下物质组成的组：N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.16527-85-8)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS_No.132621-79-5)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.69725-38-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.42416-43-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.30612-73-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.150147-53-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.15163-30-1)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.146959-90-2)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.146959-91-3)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.71695-32-4)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No78195-27-4)和N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.120139-51-7)。
36、权利要求35的方法，其中所说的类CB去垢剂是N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)。
37、权利要求26的方法，其中所说的类SB和类HSB去垢剂具有以下结构：
Figure A9519318900241
其中R1是C8-C22；
α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是0或1；
β是-N_-，-P_-，或-S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4，-C3H6-，-C4H8，-C5H10-，-C6H12-，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-其中m是≥1；并且γ是-POX _其中X＝1，2或3。
38、权利要求37的方法，其中所说的类PB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-癸铵，内盐(CAS_No.134842-83-4)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.134842-84-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.126712-86-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.126712-87-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-88-7)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十七烷铵，内盐(CAS_No.145578-49-0)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.126712-89-8)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.13459-60-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-9-十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.148716-30-7)、N，N-二乙基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-90-1)、N-(2-(膦酰氧基)乙基)-N，N-二丙基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-91-2)、N，N-二丁基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-92-3)、N-乙基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-N-丙基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-93-4)、N-乙基-N-甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-85-6)、N，N-二甲基-N-(3-(膦酰氧基)丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.89367-17-9)、N，N-二甲基-N-(4-(膦酰氧基)丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-86-7)、N，N-二甲基-N-(6-(膦酰氧基)己基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-87-8)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.124591-53-3)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.124591-54-4)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.124591-57-7)、N-丁基-N-乙基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-94-5)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-(膦酰氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.73602-79-6)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-3-(膦酰氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.144077-12-3)、3-(癸氧基)-2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-41-2)、3-(十二烷氧基)-2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-42-3)和2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-3-(十四烷氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-46-7)。
39、权利要求38的方法，基中所说的类PB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.126712-86-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.126712-87-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-88-7)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十七烷铵，内盐(CAS_No.145578-49-0)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.126712-89-8)、N，N-二甲基-N-(3-(膦酰氧基)丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.89367-17-9)和N，N-二甲基-N-(4-(膦酰氧基)丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS○No.134842-86-7)。
40、权利要求21的方法，其中至少一种所说的微生物是分枝杆菌属的成员。
41、权利要求40的方法，其中所说的分枝杆菌选自由下列微生物组成的组的一个或多个成员：结核分枝杆菌(MTB)复合物、鸟分枝杆菌(MAC)复合物、MAIS复合物、偶发分枝杆菌复合物、光产色菌、非光产色菌、暗产色菌、非洲分枝杆菌、M.asiaticum、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、丁酸分枝杆菌、龟分枝杆菌、M.duvalii、淡黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌、M.haemophilum、胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、鼠麻疯分枝杆菌、M.linda、M.lufu、海分枝杆菌、M.malmoense、田鼠分枝杆菌、粘液分枝杆菌、无色分枝杆菌、副结核分枝杆菌、M.peregrinum、草分枝杆菌、红皮分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、M.shi-moidei、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、M.szulgai、土分枝杆菌、M.ther-moresistable、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、M.vac-cae、蟾分枝杆菌和它们的血清变型。
42、权利要求41的方法，其中所说的分枝杆菌选自由结核分枝杆菌(MTB)复合物和鸟分枝杆菌(MAC)复合物组成的组。
43、权利要求42的方法，其中所说的分枝杆菌是结核分枝杆菌(MTB)复合物的成员。
44、权利要求41的方法，其中所说的分枝杆菌选自由下列微生物组成的组：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌和海分枝杆菌。
45、一种处理用于检测微生物的样本的试剂盒，所说试剂盒包含密切相关和/或接近的近似十八烷基去垢剂以及检测微生物的方法。
46、权利要求45的试剂盒，其中所说的去垢剂选自由类SB-18和类rod去垢剂组成的组。
47、权利要求46的试剂盒，其中所说的去垢剂是类SB-18去垢剂。
48、权利要求47的试剂盒，其中所说的类SB-18去垢剂选自由类CB、类SB、类HSB、类PB、类StB、类PhB、类So、类Rev-B、类AO、类cAB、类ImB去垢剂组成的组。
49、权利要求48的试剂盒，其中所说的类SB和类HSB去垢剂具有以下结构：
Figure A9519318900281
其中R1是C12-C22；
α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是0或1；
β是-N_-，-P_-，或-S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4-，-C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12-，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-，其中m是≥1；并且γ是-SO3 _。
50、权利要求49的试剂盒，其中所说的类SB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.52667-78-4)、N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.69775-75-3)、N，N-二甲基-N-(磺甲基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.36051-36-2)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.24020-67-5)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.58930-04-4)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-05-5)、N，N-二甲基-3-((1-氧代十六烷基)氨基)-N-(2-磺乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.58930-06-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-辛铵，内盐(CAS_No.15178-76-4)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-癸铵，内盐(CAS_No.15163-36-7)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.14933-08-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.14933-09-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.67030-70-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)、氢氧化十二烷基丙基(3-磺丙基)-铵，内盐(CAS_No.15163-34-5)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-28-4)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-29-5)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.59942-40-4)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.59942-41-5)、N，N-二甲基-N-(甲基-2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.59942-42-6)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-2-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-13-8)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.64463-49-6)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-07-7)、N，N-二甲基-N-(4-磺丁基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.22313-73-1)、N-(1，3-甲基-3-二甲基-3-磺丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.35489-44-2)、N，N-二甲基-N-(3-((氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-1-丁铵，内盐(CAS_No.58930-08-8)、N，N-二甲基-N-(6-磺己基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.132621-81-9)、N-十二烷基-N，N-二甲基-4-磺基一苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-40-7)、N，N-二甲基-4-磺基-N-十四烷基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-41-8)、N-十二烷基-N，N-二甲基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-42-9)、N，N-二甲基-N-十八烷基-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-43-0)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-44-1)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十四烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-45-2)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-46-3)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-4-磺基-苯甲铵，内盐(CAS_No.65180-47-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-癸铵，内盐(CAS_No.34135-76-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.13197-76-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.56505-82-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.71502-45-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.7425-12-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.19223-56-4)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.19223-55-3)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十四烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-10-5)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-11-6)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.63663-12-7)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.13177-42-9)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.71497-51-3)、椰子树酰氨丙基羟磺基甜菜碱(CAS_No.68139-30-0)、烷基醚羟丙磺基甜菜碱(CAS_No.108797-84-8)、牛脂酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱、eruc酰氨丙基羟丙磺基甜菜碱和canol酰氨丙基甜菜碱。
51、权利要求50的试剂盒，其中所说的类SB-18去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.24020-67-5)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.58930-04-4)、N，N-二甲基-N-(2-磺乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.58930-05-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.14933-08-5)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.14933-09-6)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.67030-70-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-28-4)、N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十六烷基)氨基)丙基)-3-磺基-1-丙铵，内盐(CAS_No.52562-29-5)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十二烷铵)，内盐(CAS_No.64463-49-6)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十六烷铵)，内盐(CAS_No.58930-07-7)、N，N-二甲基-N-(4-丁基)-1-十八烷铵)，内盐(CAS_No.22313-73-1)和N，N-二甲基-N-(3-((氧代十六烷基)氨基)丙基)-4-磺基-1-丁铵，内盐(CAS_No.58930-08-8)
52、权利要求51的试剂盒，其中所说的类SB-18去垢剂选自由N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)和N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)组成的组。
53、权利要求52的试剂盒，其中所说的类SB-18去垢剂是N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.2281-11-0)。
54、权利要求52的试剂盒，其中所说的类SB-18去垢剂是N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.13177-41-8)。
55、权利要求48的试剂盒，其中所说的类CB去垢剂具有以下结构：
其中R1是C8-C22；
α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是O或1；
β是-N_-，-P_-，或-S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2，-C2-H4-，-C3H6-，-C4H8-，，-C5H10-，，-C6H12-，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-，其中m是≥1；并且γ是-COO_.
56、权利要求55的试剂盒，其中所说的类CB去垢剂选自由以下物质组成的组：N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.693-33-4)、椰子树羧甲基甜菜碱(内盐(CAS_No.68424-94-2)N-(羧甲基)-N，N-二甲基-9-十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.871-37-4)、N-(羧甲基)-N，N-二甲基-3-((1-氧代十八烷基)氨基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.6179-44-8)、3-氨基-N-(羧甲基)-N，N-二甲基-1-丙铵-N-C8-C22酰基衍生物，内盐(CAS_No.84082-44-0)、N-(羧甲基)-3-((12-羟基-1-氧代-9-十八烷基)氨基-N，N-甲基-1-丙铵)，内盐(CAS_No.71850-81-2)、椰子树酰氨丙基羧甲基甜菜碱(CAS_No.61789-37-9)和CAS_No.61789-40-0)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.16527-85-8)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS_No.132621-79-5)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.69725-38-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.42416-43-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.30612-73-8)、N-十二烷基-β-丙氨酸(CAS_No.1462-54-0)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.150147-53-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.15163-30-1)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.146959-90-2)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.146959-91-3)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.71695-32-4)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)、N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.120139-51-7)、N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.76392-97-7)、N-(5-羧戊基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.73565-98-7)、N-(6-羧己基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.132621-80-8)，4-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-31-3)、2-羧基-N-十二烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.76195-34-6)、4-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No.71695-33-5)、2-羧基-N-十六烷基-N，N-二甲基-1-苯甲铵，内盐(CAS_No1695-33-7)、牛脂甘氨酸酯(CAS_No70750-46-8)、大豆酰氨丙基羧甲基甜菜碱和巴巴苏酰氨丙基羧甲基甜菜碱。
57、权利要求56的试剂盒，其中所说的类CB去垢剂选自由以下物质组成的组：N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.16527-85-8)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十三烷铵，内盐(CAS_No132621-79-5)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.69725-38-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.42416-43-3)、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.30612-73-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.150147-53-8)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.15163-30-1)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.146959-90-2)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十五烷铵，内盐(CAS_No.146959-91-3)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.71695-32-4)、N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)和
N-(4-羧丁基)-N，N-二甲基-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.120139-51-7)，
58、权利要求57的试剂盒，其中所说的类CB去垢剂是N-(3-羧丙基)-N，N-二甲基-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.78195-27-4)。
59、权利要求48的试剂盒，其中所说的类SB和类HSB去垢剂具有以下结构：
Figure A9519318900371
其中R1是C8-C22；
α是-CH2-，-CH(OH)-，-(CO)-NH-CH2CH2CH2-，-O-，或-C(O)-；
n是O或1；
β是-N_-，-P_-，或-S_-；
R2是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R3是-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，或-C4H9；
R4是-CH2-，-C2H4-，-C3H6-，-C4H8-，-C5H10-，-C6H12-，-CH2-C6H4-，-CmH2m-，-CH(OH)CH2CH2-，-CH2CH(OH)CH2-，或-CmH2m-1(OH)-其中m是≥1；并且γ是-POX _其中X是1，2或3.
60、权利要求59的试剂盒，其中所说的类PB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-癸铵，内盐(CAS_No.134842-83-4)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十一烷铵，内盐(CAS_No.134842-84-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.126712-86-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.126712-87-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-88-7)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十七烷铵，内盐(CAS_No.145578-49-0)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.126712-89-8)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.134590-60-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-9-十八烯-1-铵，内盐(CAS_No.148716-30-7)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-90-1)、N-(2-(膦酰氧基)乙基)-N，N-二丙基-1-十六烷铵，，内盐(CAS_No.126712-91-2)、N，N-二丁基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-92-3)、N-乙基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-N-丙基-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-93-4)、N-乙基-N-甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-85-6)、N，N-二甲基-N-(3-(膦酰氧基)丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.89367-17-9)、N，N-二甲基-N-(4-(膦酰氧基)丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-86-7)、N，N-二甲基-N-(6-(膦酰氧基)己基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-87-8)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.124591-53-3)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.124591-54-4)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.124591-57-7)、N-丁基-N-乙基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-94-5)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十二烷基)氨基)丙基)-3-(膦酰氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.73602-79-6)、2-羟基-N，N-二甲基-N-(3-((1-氧代十八烷基)氨基)丙基)-3-(膦酰氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.144077-12-3)、3-(癸氧基)-2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-41-2)、3-(十二烷氧基)-2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-42-3)和2-羟基-N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-3-(十四烷氧基)-1-丙铵，内盐(CAS_No.128506-46-7)。
61、权利要求60的方法，其中所说的类PB去垢剂选自由以下物质组成的组：N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十二烷铵，内盐(CAS_No.126712-86-5)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十四烷铵，内盐(CAS_No.126712-87-6)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.126712-88-7)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十七烷铵，内盐(CAS_No.145578-49-0)、N，N-二甲基-N-(2-(膦酰氧基)乙基)-1-十八烷铵，内盐(CAS_No.126712-89-8)、N，N-二甲基-N-(3-(膦酰氧基)丙基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.89367-17-9)和N，N-二甲基-N-(4-(膦酰氧基)丁基)-1-十六烷铵，内盐(CAS_No.134842-86-7)。
62、权利要求45的试剂盒，其中所说的分枝杆菌选自由下列微生物组成的组的一个或多个成员：结核分枝杆菌(MTB)复合物、鸟分枝杆菌(MAC)复合物、MAIS复合物、偶发分枝杆菌复合物、光产色菌、非光产色菌、暗产色菌、非洲分枝杆菌、M.asiaticum、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌(BCG)、丁酸分枝杆菌、龟分枝杆菌、M.duvalii、淡黄分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈特氏分枝杆菌、M.haemophilum、胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌、麻疯分枝杆菌、鼠麻疯分枝杆菌、M.linda、M.lufu、海分枝杆菌、M.malmoense、田鼠分枝杆菌、粘液分枝杆菌、无色分枝杆菌、副结核分枝杆菌、M.peregrinum、草分枝杆菌、红皮分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、M.shi-moidei、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、M.szulgai、土分枝杆菌、M.ther-moresistable、次要分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、M.vac-cae、蟾分枝杆菌和它们的血清变型。
63、权利要求62的试剂盒，其中所说的分枝杆菌选自由结核分枝杆菌(MTB)复合物和鸟分枝杆菌(MAC)复合物组成的组。
64、权利要求63的试剂盒，其中所说的分枝杆菌是结核分枝杆菌(MTB)复合物的成员。
65、权利要求62的试剂盒，其中所说的分枝杆菌选自由下列微生物组成的组：其中所说的分枝杆菌选自由下列微生物组成的组：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯氏分枝杆菌和海分枝杆菌。
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