CN1159914A - 油性佐剂疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种油包水型油性佐剂疫苗，包括20至90％重量比的常温下呈液态的油相A)、0.5至30％重量比的乳化剂、和5至75％重量比的含有一种生物学上可接受的有效量抗原的水相D)，该乳化剂由一种非离子表面活性剂B)和一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)组成，该非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态；所述疫苗还可包括可选的组分E)，为0.01至10％重量比的氨基酸或其盐与0.01至10％重量比的分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇。此外，一种水包油包水型油性佐剂疫苗，由作为内相上述油包水型油性佐剂疫苗和一外层水相F)组成，该水相含有0.2至20％重量比的总HLB值不小于10的乳化剂，该乳化剂含有一种总HLB值不小于10的非离子表面活性剂。所述油性佐剂疫苗在较长时间内显示了较高的诱导抗体产生的能力，还具有药物所需的优异的稳定性和安全性。

Description

油性佐剂疫苗及其制备方法
本发明涉及一种油性佐剂疫苗，以及该疫苗的制备方法。
油性佐剂疫苗是已公知的可有效强化免疫性的疫苗。由于弗氏佐剂具有非常有效的免疫强化作用，尤其是和灭活抗原协同使用时，因此，试验中已经将弗氏佐剂作为经典的油性佐剂使用。以弗氏佐剂为代表的油性佐剂含有一种矿物油作为基本成分，具有可靠的免疫强化作用，但也会带来很多问题，如导致严重的接种反应、形成无菌性化脓损害、和接种部位周围的肉芽肿，可产生外部可见的浮肿、肿胀、硬结和坏死。而且怀疑在接种部位有留存的可能，这便妨碍了疫苗的使用。如果家畜中存在这种局部反应，那么家畜就不宜再作食用了。因此必须尽可能地减小这种留存趋势。基于这个原因，使用含有矿物油的油性佐剂的疫苗在接种的部位上有时是受到一定限制的。
有必要提高疫苗的效力和持续时间，以确保防止疾病的发生，或发挥出疫苗的作用。不过，考虑到疫苗是用于人类或兽医用途的实际情况，疫苗的安全性比效力和持续时间更重要。
在这种情况下，为解决上述问题，人们进行了各种研究。例如，日本特许公报(下文作“J.P.KOKOKU”)Hei 6-81731号公开了一种油包水型油基佐剂，其中无水甘露糖醇/油酸酯作表面活性剂，液体石蜡作油性成分。WO91/00107(TOKUHYO Hei 4-506521)公开了一种低粘度的油包水型油基佐剂，所用的油性成分含有一种可代谢的油如植物油，和一种不可代谢的油如矿物油的混合物。进一步地，日本公开特许公报(下文称“J.P.KOKAI”)Hei 6-172216号公开了一种油性佐剂疫苗，该疫苗含有一种植物油作油性成分，含有一种脱水山梨糖醇脂肪酸酯和一种聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯的混合物作表面活性剂成分。J.P.KOKOKU Hei 6-39386公开了一种佐剂活体疫苗，该疫苗的制备方法是将一种活体免疫原和一种含矿物油的水包油型乳剂混合。
不过，上述油性佐剂疫苗都存在不足之外，不仅表现在注射后可观察到的局部反应和在注射部位的留存趋势，还表现在疫苗制剂的稳定性上。
疫苗应当尽可能地有效、安全，因为疫苗是用于人体或兽医用途上的；考虑到疫苗又是一种药物，它也应当尽可能地稳定。
而对于油性佐剂疫苗来说，已知这种疫苗不仅在免疫强化作用方面，而且在药物制剂的稳定性方面，都在相当大程度上受到乳剂类型、所用油性成分以及所结合的表面活性剂种类等的影响。尤其就灭活疫苗来说，制备出一种具有在较长时间内诱导充分免疫保护作用、并有着良好再现性的疫苗来，是非常困难的。
此外，也有人提出了水包油包水型油性佐剂疫苗，以克服常规的油包水型油性佐剂疫苗的缺点，即注射部位的局部反应和留存趋势，但是，任一常规方式仍然受到药物制剂上的长期稳定性问题的困扰，因此，这种疫苗的实际应用还很遥远。
本发明涉及一种油性佐剂疫苗，这种疫苗在常规应用上是受到一定限制的，其原因是所带来的不希望产生的局部反应、留存趋热和药物制剂的不稳定性，而本发明试图解决疫苗的这些常规问题。因此，本发明的目的是提供一种油性佐剂疫苗，该疫苗能在较长时间内保护较高的抗体产生能力，而无需在组成中使用任何免疫强化物质。该疫苗对活体无害，并具有药物制剂的优异稳定性。
为达到上述目的，本发明的发明人进行了大量研究。结果发现了一种油包水型油性佐剂疫苗和一种水包油包水型油性佐剂疫苗，在接种部位表现出优异的局部安全性，在较长时间内表现出较强的诱导抗体产生能力；该油包水型油性佐剂疫苗含有(i)一种常温下呈液态的油性成分、(ii)含有一种特殊的亲脂性非离子表面活性剂和一种聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯的乳化剂、和(iii)含有一种生理学上可接受的有效量的抗原成分的水相；该水包油包水型油性佐剂疫苗由内相和含有一种特殊乳化剂的外层水相组成，该内相由上述油包水型乳剂(即上述油性佐剂)组成。而且，发明人发现，这种即使在低粘度区域稳定性也较高、诱导抗体产生的能力以及保持高水平的抗体产生的能力都很强的油性佐剂疫苗的制备方法步骤为，向常温下呈液态的油性成分中加入含有一种特殊的亲脂性非离子表面活性剂和一种聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯的表面活性剂，和一种凝胶状复合物，该复合物是将特殊的亲脂性非离子表面活性剂与含有氨基酸或其盐及特殊的糖或糖醇的水溶液乳化得到的；然后向所得混合物中加入含有抗原的水相，而形成乳剂。进一步地，发明人发现，有着良好安全性和稳定性的水包油包水型油性佐剂疫苗和同类型的常规疫苗相比，还表现出持久的诱导抗体产生能力，其制备方法是，先按上述方法制备油包水型油性佐剂疫苗，然后把油包水型油性佐剂疫苗加入到一种含有特殊乳化剂的水相中，进行乳化即得。基于上述发现，发明人完成了本发明。
按照本发明的第一种情形，所提供的油包水型油性佐剂疫苗含有20至90％重量比的常温下呈液态的油相A)；0.5至30％重量比的乳化剂、和5至75％重量比的含有一种生理学上可接受的有效量抗原的水相D)组成，该乳化剂由一种非离子表面活性剂B)和一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)组成，该非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态。
按照本发明的另一种情形，所提供的水包油包水型油性佐剂疫苗含有油包水型油性佐剂相和外层水相F)，该油包水型油性佐剂相由30至90％重量比的常温下呈液态油相A)、0.5至30％重量比的乳化剂、和5至65％重量比的含有一种生理学上可接受的有效量抗原的水相D)组成，该乳化剂由一种非离子表面活性剂B)和一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)组成，该非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态；该外层水相中含有0.2至20％重量比的总HLB值不小于10的乳化剂，该乳化剂中含有一种非离子表面活性剂。
按照本发明，油性佐剂疫苗的成分A)是一种常温下呈液态的油性成分，术语“常温”指15至25℃的温度范围。
可用于本发明的常温下呈液态的油性成分选自各种酯型油性基质或非酯型油性基质，它们通常用在食品、药品、化妆品等领域，且在常温下呈液态。常温下呈液态的非酯型油性基质的实例包括轻液体石蜡、角鲨烯、角鲨烷(squalane)和聚丁烯(polybutenes)。另外，常温下呈液态的酯型油性基质的实例包括各种由中链饱和脂肪酸如辛酸、癸酸或长链不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸与醇衍生而来的酯，还包括天然存在的脂肪酸酯，例如液态植物油，有花生油、橄榄油、葵花籽油、红花油和jojoba油(一种不饱和脂肪酸高的植物油)，以及来源于动物的液态油，如橙色粗制油。根据不同情况，它们可单独使用也可结合使用。油酸的酯衍生物和植物油，连同其它油一道，具有很多优点，对氧化作用的稳定性相对较高，对器官-组织的亲和性强，能降低局部的刺激和留存趋势，因此，优选为只从这些可代谢油中选出至少一种作为油性成分。而且，更优选为使用一种含有脂肪酸酯的酯型油性基质，该脂肪酸酯包含不少于85％重量比的顺式-△9-十八碳烯酸和不少于90％重量比的顺式-△9-链烯酸，及一种醇，如甘油、双甘油、丙二醇、乙醇、癸醇、油醇，该醇包含不少于85％重量比的顺式-△9-十八碳烯醇和不少于90％重量比的顺式-△9-链烯醇。另一种选择是，本发明也可以使用上述脂型油和角鲨烯的混合物。
作为构成本发明的油性佐剂疫苗的乳化剂成分之一的成分B)是一种亲脂性非离子表面活性剂，该表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态。所述偏酯可各不相同，这取决于所用醇的种类。例如，如果多元醇是具有三个羟基的甘油，则偏酯主要是其单酯、双酯的混合物，并含有少量的三酯；如果多元醇是具有4个羟基的双甘油或脱水山梨糖醇，则偏酯主要是其单酯、双酯的混合物，并含有少量的三酯和四酯。由于这些偏酯在40℃下呈液态，又都是亲脂性的，因此它们可单独使用，也可任意组合使用。
作为制备偏酯的成分使用的具有至少三个羟基的多元醇的实例包括甘油、双甘油、三甘油、四甘油、六甘油、八甘油、十甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇和脱水山梨糖醇。
用作制备偏酯的脂肪酸的实例为各种已知的脂肪酸，如辛酸、癸酸、月桂酸、油酸和亚油酸，只要它们能与上述多元醇反应生成40℃下呈液态的偏酯即可。在这些脂肪酸中，更优选的脂肪酸包含不少于85％重量比的顺式-△9-十八碳烯酸和不少于90重量比的顺式-△9-链烯酸。
举例来说，特别适宜作为成分B)的偏酯为一油酸甘油酯、脱水山梨糖醇一油酸酯、脱水山梨糖醇二油酸酯、一油酸双甘油酯和二油酸双甘油酯，生成该偏酯的脂肪酸包含不少于85％重量比的顺式-△9-十八碳烯酸和不少于90％重量比的顺式-△9-链烯酸。由于这些偏酯中结合了高纯度的油酸作酰基，因此偏酯对氧化作用的稳定性很强，而这正是作为乳化剂所必需的；由于这些偏酯确保了在表面活性剂分子间的高度定位作用，因此具有优异的乳剂稳定化作用等功能特点。所以，和目前市场上所使用的常规油酸衍生物相比，这些偏酯提高了最终制得的油性佐剂疫苗的稳定性，接种的安全性也得到了实质性提高。
用作本发明的油性佐剂疫苗成分C)的聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯中，羟基脂肪酸甘油三酯的实例为蓖麻油和氢化蓖麻油。在这点上，如果环氧乙烷的平均数量小于20摩尔，这样一种成分C)不会在低粘度区域形成稳定的乳剂，其结果是不能制得令人满意的油性佐剂疫苗。另一方面，如果环氧乙烷的平均数量大于60摩尔，所得乳剂易发生转相，最终也不能制得令人满意的油性佐剂疫苗来。聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯结合在疫苗中的量以制剂的总重量计(油包水型油性佐剂疫苗的总重量)优选为0.5至10％重量比。如果重量小于0.5％，所得乳化的疫苗稳定性会被降低。另一方面，如果重量大于10％，所得乳剂易发生转相，所得疫苗的稳定性也因此会降低。
下文中称“成分E)”的，是本发明的氨基酸或其盐及分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇。在油性佐剂疫苗中混入成分E)，即氨基酸或其盐及分子中具有5个羟基的非还原性糖或糖醇，可进一步提高本发明的乳化疫苗的稳定性。此处所用氨基酸或其盐可选自食品或药品中所通常使用的氨基酸或其盐，它们已载入多种标准中，如“日本药典”、“未列入日本药典中的药物成分标准”、“日本药物赋形剂”。氨基酸的实例为甘氨酸、丙氨酸、盐酸精氨酸、天门冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，优选其中的中性氨基酸。进一步地，氨基酸盐的实例为一价金属盐，如钠和钾盐，以及二价金属盐，如钙和镁盐。在这些氨基酸及其盐中，特别优选为一水合天冬氨酸钠、二水合天冬氨酸钾、一水合谷氨酸钠、一水合谷氨酸钾。这些氨基酸一般为L式，但其异构体如D式或这些同分异构体的混合物DL式，同样也能用在本发明中。
所用上述分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇可选自食品或药品中所通常使用的非还原性糖或糖醇，它们已载入多种标准中，如“日本药典”、“未列入日本药典中的药物成分标准”、“日本药物赋形剂”。本发明特别优选为海藻糖、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇，乳醇(lactitol)。
此处氨基酸或其盐及分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇的适宜用量范围以组成的总重量计(油性佐剂疫苗的总重量)各自为0.01至10％重量比。
油性佐剂疫苗中，油性成分A)与成分D)，即含有抗原的水相的比例选择取决于佐剂的应用、目的，或所选择的抗原的种类。尤其是由于结合使用了一种特殊的油性成分和一种特殊的乳化剂，本发明的油性佐剂疫苗保持了高度稳定性，相应地，油性成分与含抗原水相的比例可在较宽范围内选择。一般来说，该比例的恰当选择是油性成分与水相的重量比例范围在90∶5至20∶75，优选为80∶15至30∶65。
制备佐剂所需上述成分B)即非离子表面活性剂、和成分C)即聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯的总量范围为0.5至30％重量比，优选为3至20％重量比，以制剂的总重量计。这是因为，如果重量小于0.5％重量比，则不能制得任何稳定的乳化系统；如果乳化剂的用量大于30％重量比，会形成在注射局部高反应性的佐剂，不能提供本发明所需的高稳定性油性佐剂疫苗。
按照本发明，油性佐剂疫苗的第一种具体体现形式涉及含有上述油性成分、乳化剂、含抗原水相的油性佐剂疫苗，可由下述方法制备。其方法是，向油性成分A)中加入40℃下呈液态的非离子表面活性剂[成分B)]和聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯[成分C)]，然后，在搅拌下将这些成分混合，再加入含有一种生理学上可接受的有效量抗原的水相[成分D)]，在搅拌下混合得到乳剂。此方法制得的油包水型油性佐剂疫苗具有良好的乳化状况。
本发明的油包水型佐剂疫苗，即使贮存在低温环境中，仍具有低粘度和高稳定性；在无损于安全性的情况下，其制备方法是，向常温下呈液态的油相A)中加入非离子表面活性剂B)、聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)、和成分B)与成分E)的混合产物，该产物是将非离子表面活性剂成分B)与含成分E)的水溶液按重量比为1∶1至1∶20混合、乳化，直至形成固定的凝胶状复合物而得；所述非离子表面活性剂B)是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态；然后将这些成分混合，形成一分散系；向所得分散系中加入含有一种生理学上可接受的有效量抗原的水相D)；在搅拌下混合，使水相乳化。如果在上述制备固定的凝胶状复合物的步骤中，由于搅拌机的原因使成分温度升高了，那么搅拌操作可在冷却下进行，以保持温度在不高于常温的水平；所述固定的凝胶状复合物由成分B)即非离子表面活性剂和含成分E)的水溶液组成，该表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态。
在这点上，成分B)与成分E)的水溶液的最适混合比例的选择取决于存在于成分E)的水溶液中的氨基酸或其盐及非还原性糖或糖醇的种类和浓度。举例来说，如果成分E)的水溶液是含5％wt的一水合L-谷氨酸钠和5％wt的乳醇(lactitol)，那么成分B)与成分E)的水溶液的适宜重量比例应调整为1∶2至1∶10。此外，如果水溶液中含有30％wt的一水合L-谷氨酸钠和20％wt的乳醇(lactitol)，那么成分B)与成分E)的水溶液的适宜重量比例应调整为1∶2至1∶15。在这点上，有必要将水溶液中成分E)的浓度在氨基酸或其盐及非还原性糖或糖醇各自的溶解度范围内调至尽可能高。
按照本发明，油性佐剂疫苗的第二种具体体现形式涉及水包油包水型油性佐剂疫苗，由内相和外层水相组成，内相含有上述油包水型油性佐剂疫苗，外层水相含有至少一种总HLB值(亲水亲油平衡值)不小于10的非离子表面活性剂。
本说明书中，″HLB″值(亲水亲油平衡值)根据W.C.Griffin提出的方程进行测定(参见W.C.Griffin，化妆品学家协会杂志，1949，1，P311)。
用于构成本发明的水包油包水型油性佐剂疫苗外相的总HLB值不小于10的乳化剂，可单独使用，也可任意组合使用，只要总HLB值不小于10。总HLB值不小于10的非离子表面活性剂可选自药物领域的常用品，如聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基(链烯基)醚、聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇，它们的总HLB值不小于10。
其中，总HLB值不小于10的聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯可与用作油性佐剂疫苗成分的聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯相同，如蓖麻油和/或氢化蓖麻油，其环氧乙烷的平均数不小于20，优选为20至60。这是因为，使用环氧乙烷平均数小于20的聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯不能生成在外相中作为内相的油包水型油性佐剂的稳定分散系，也就不能形成良好的水包油包水型油性佐剂疫苗。另一方面，如果超过60，所得内层的油包水型乳剂相容易发生转相，再用它就不能最终制得令人满意的水包油包水型油性佐剂疫苗。
进一步地，总HLB值不小于10的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯可以是聚氧乙烯脱水山梨糖醇不饱和脂肪酸(如油酸)酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇饱和脂肪酸(如月桂酸和辛酸)酯，其平均环氧乙烷数不小于10。特别地，优选使用的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸脂中的脂肪酸包含不少于85％wt的顺式-△9-十八碳烯酸和不少于90％wt的顺式-△9-链烯酸，其环氧乙烷平均数范围为10至40。这是因为，如果平均环氧乙烷数小于10，内相的油包水型油性佐剂不能在外层水相中被稳定地分散，再用它就不能制得令人满意的水包油包水型油性佐剂疫苗。另一方面，如果超过40，内相的油包水型油性佐剂易发生乳剂转相，再用它就不能最终制得令人满意的水包油包水型油性佐剂疫苗。
聚氧乙烯烷基(链烯基)醚可以是已公知的烷基醚型表面活性剂，如聚氧乙烯烷基醚，有聚氧乙烯十二烷基醚和聚氧乙烯十六烷基醚；又如聚氧乙烯链烯基醚，有聚氧乙烯油酰基醚。优选为具有一个12至18碳原子的烷基(链烯基)，且平均环氧乙烷数不小于10，优选为10至40。尤其优选的聚氧乙烯油酰基醚中，油醇包含不少于85％wt的十八碳烷基醇和不少于90％wt的链烯醇，及10至40摩尔的环氧乙烷。在这点上，如果烷基(链烯基)的碳原子数小于12，内相的油包水型油性佐剂易发生转相，再用它就不能制得令人满意的水包油包水型油性佐剂疫苗；如果超过18，内相的油包水型油性佐剂不能在外层水相中被稳定地分散，再用它就不能最终制得令人满意的水包油包水型油性佐剂疫苗。而且，使用环氧乙烷平均数小于10的聚氧乙烯烷基(链烯基)醚不能得到内相的油包水型油性佐剂在外相中的稳定的分散系，因此就不能形成良好的水包油包水型油性佐剂疫苗；另一方面，如果超过40，内相的油包水型油性佐剂易发生转相，再用它就不能最终制得令人满意的水包油包水型油性佐剂疫苗。
此处可用的聚氧乙烯聚氧丙烯甘醇选自那些通常用于药物和化妆品中且HLB值不小于10者。其中，优选为环氧乙烷数(聚合的平均程度)范围为50至200，1，2-环氧丙烷数(聚合的平均程度)范围为5至80，环氧乙烷与1，2-环氧丙烷的摩尔数(聚合的平均程度)之比不小于2∶1。这是因为如果摩尔比小于2∶1，内相的油包水型油性佐剂不能在外层水相中被稳定地分散，再用它就不能制得令人满意的水包油包水型油性佐剂疫苗。
正如上文所解释过的，用在构成本发明的水包油包水型油性佐剂疫苗外相中的乳化剂可以是一种HLB值不小于10的乳化剂，或者是两种或多种乳化剂的混合物，其中至少一种乳化剂是高HLB值的非离子表面活性剂，至少一种乳化剂是低HLB值的非离子表面活性剂，其总HLB值不小于10。在这点上，其中可用的低HLB值的非离子表面活性剂选自那些通常用于药物等领域的非离子表面活性剂，如脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、和单油酸甘油酯。高HLB值的非离子表面活性剂和低HLB值的非离子表面活性剂的混合物的一个实例是HLB值为15.0的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯和HLB值为3.7的脱水山梨糖醇倍半油酸酯。这时，前者与后者混合的重量比例为2∶1，该混合乳化剂的总HLB值约为11.2。
本发明中，如果将上述总HLB值不小于10的乳化剂混合物与一种甘油磷脂组合使用作为混入外相中的乳化剂，就能进一步提高所述水包油包水型油性佐剂疫苗的稳定性。
与总HLB值不小于10的乳化剂混合物组合使用的甘油磷脂可选自各种天然存在的甘油磷脂，有来自大豆的(如大豆卵磷脂和氢化大豆卵磷脂)、来自蛋黄的(如蛋黄磷脂和氢化蛋黄磷脂)、各种高纯度的磷脂(如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)、和溶血磷脂，它们可单独使用或任意组合使用。当将上述总HLB值不小于10的乳化剂混合物与一种甘油磷脂结合使用时，其混合比例(重量)：非离子表面活性剂混合物/甘油磷脂的适宜比例范围为20∶1至1∶2。
构成本发明的水包油包水型油性佐剂疫苗外相中的乳化剂用量范围以外相总重量计为0.2至20％wt，更优选为0.5至10％wt。这是因为如果乳化剂用量小于0.2％wt，就不能得到任何稳定的水包油包水型乳剂；如果超过20％wt，所得油性佐剂疫苗的粘度增加，使疫苗不利于接种，注射时的安全性有时也会降低。
此外，按照本发明，水包油包水型油性佐剂疫苗中内相的油包水型油性佐剂相与外层水相的混合比例，根据使用目的不同，其适宜范围为2∶1至1∶10，以重量比例表示。
在这样制得的水包油包水型油性佐剂疫苗中，为了能有效地将抗原结合在内层水相中，可以采取下述两步的方法，即首先用含抗原的水相制得油包水型油性佐剂疫苗，然后将所得油包水乳剂作为内相，加入到含有一种特殊的乳化剂的外层水相中，就形成了乳剂。
按照本发明，水包油包水型油性佐剂疫苗例如可按下述方法制备。首先制得按照本发明的含抗原的油包水型油性佐剂疫苗，然后将此油包水型油性佐剂疫苗加入到水相中，再次乳化含抗原的油包水型油性佐剂疫苗；所述的水相含有一种混合的乳化剂，该混合乳化剂含有至少一种非离子表面活性剂，且总HLB值不小于10；或者该水相为混合乳化剂与一种甘油磷脂的组合，所述的混合乳化剂含有至少一种非离子表面活性剂，且总HLB值不小于10。本发明的两步乳化方法制得的水包油包水型油性佐剂疫苗稳定性高，安全性好。
更确切地说，具有更高稳定性、而无损于安全性的水包油包水型油性佐剂疫苗的制备方法是，首先向常温下呈液态的油性成分中加入一种亲脂性非离子表面活性剂(成分B)、一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯(成分C)、和一混合产物，该产物是非离子表面活性剂成分B与含成分E的水溶液按重量比例1∶1至1∶20混合搅拌、直至形成固定的凝胶状复合物而得；所述非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态；将这些加入成分混合，分散；然后向所得分散系中加入含有一种生物学上可接受的有效量抗原的外层水相(成分D)，边搅拌边混合，使水相在油相中乳化，得到稳定性高的油包水型油性佐剂疫苗；然后将此油包水型油性佐剂疫苗加入到一外层水相中，使含抗原的油包水型油性佐剂疫苗在水相中再乳化；该水相含有一混合的乳化剂，该混合乳化剂中含有至少一种非离子表面活性剂，且总HLB值不小于10，或者该水相为混合乳化剂与一种甘油磷脂的组合，该混合乳化剂中含有至少一种非离子表面活性剂，且总HLB值不小于10。
本发明的油包水型油性佐剂疫苗的水相、本发明的水包油包水型油性佐剂疫苗的内层水相、或本发明的水包油包水型油性佐剂疫苗的外层水相可选自常规疫苗中用到的水相，如磷酸盐缓冲溶液、生理盐水溶液、或磷酸盐缓冲盐水。
本发明的水包油包水型油性佐剂疫苗中，由于制备条件等的不同，抗原可以只存在于油包水型乳剂中的内层水相中作为内相，或者因为从内层水中的部分溢漏，抗原存在于两层水相中，即内层水相和外层水相，但是无论如何都不会有损于本发明的油性佐剂疫苗的作用。
本发明中，构成油性佐剂疫苗的油相和内层水相、构成水包油包水型油性佐剂疫苗的外层水相等等当然可以含有各种对疫苗活性没有直接影响的成分，如缓冲系、稳定剂和/或渗透压调节成分，这些都曾用在多种药物中。
进一步地，在制备本发明的油性佐剂疫苗时，可使用一般可进行乳化作用的任何方法，例如，目前常用的乳化器，如均化混合器，一种均化器和CLEARMIX(购自M技术有限公司)，及利用多孔玻璃膜的膜乳化器。
向构成本发明的油性佐剂疫苗的水相中混入的抗原可包括多种种类和多种形式的抗原，例如疫苗制备中常用的灭活细菌细胞和灭活病毒粒子，以及保护性抗原，如附着蛋白质和被膜。不过，既然本发明的油性佐剂疫苗非常稳定，且很容易通过使用一种特殊油性成分和一种特殊乳化剂的组合得到，因此可以使用各种生物学上可接受的有效量抗原。
进一步地，本发明的油性佐剂疫苗当然可以在乳剂中含有各种药物，如抗生素，来代替抗原。
正如上文已经详细讨论过的，通过选择多种成分混入组合物中，本发明中可制备多种药物组合物的注射制剂，如油性佐剂疫苗。例如，兽医用疫苗可通过皮下注射或肌内注射及口服、直肠给药、鼻饲途径诱导免疫强化作用，但是给药途径的选择应取决于每一具体的给药目的。
制备佐剂时，其组成成分，如所用的油性基质、表面活性剂和水相都必须经过灭菌处理。灭菌方法的选择要考虑到这些化合物的特性。
正如上文已经解释过的，按照本发明制备的油性佐剂疫苗存在于一高稳定、高质量的乳剂中。因此，疫苗的稳定性和安全性良好，在确保有效、安全的同时可以对多种生物体给药。
参考下列实施例，将对本发明作更详细地描述，但是本发明并不仅限于这些特例。下列实施例中，除非另外说明，术语“份”指“重量份”。实施例
(油性佐剂疫苗的制备)
下列实施例中用到的每一个油性佐剂疫苗按下述方法制备，考虑到每一具体成分的特性，选择加热或过滤对包括在组成中的全部成分进行除菌处理。而且，全部操作如搅拌、乳化等都在无菌条件下的洁净台中进行。例1：疫苗a
本例中，油酸乙酯(“NOFABLE EO-90”，购自NOF公司，酰基组成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt顺式-△9-链烯酸成分)用作成分A。向12份油性成分中加入1.6份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-992，购自NOF公司，酰基构成：99％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和99％wt顺式-△9-链烯酸成分)和0.4份加热至50℃的聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，充分搅拌，并边搅拌边向上述混合物中逐渐加入6份含抗原的水相(磷酸盐缓冲盐水)，使用CLEARMIX CLM-0.85(购自M技术有限公司)在常温下以8000转/分混合乳化10分钟，得到油包水型性佐剂疫苗a。例2：疫苗b
本例中，成分A为6份精制葵花籽油和6份角鲨烯的混合物。向油性成分中加入1.6份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-902”，购自NOF公司；酰基构成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt 顺式-△9-链烯酸成分)和0.4份加热至50℃的聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，充分搅拌，并边搅拌边向上述混合物中逐渐加入8份含抗原的水相(磷酸盐缓冲盐水)，按照与例1相同的过程使所得混合物混合乳化，得到油包水型油性佐剂疫苗b。例3：疫苗C
本例中，油酸油酰基酯(“NOFABLE OO-9080”，购自NOF公司；酰基构成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt顺式-△9-链烯酸成分)用作成分A。向12份油性成分中加入0.8份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-902”，购自NOF公司；酰基构成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt顺式-△9-链烯酸成分)、0.7份-油酸甘油酯(“NOFABLEGO-901”，购自NOF公司；酰基构成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt顺式-△9-链烯酸成分)和0.5份加热至50℃的聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，充分搅拌，并边搅拌边向上述混合物中逐渐加入8份含抗原的水相(磷酸盐缓冲盐水)，按照与例1相同的过程使所得混合物混合乳化，得到油包水型油性佐剂疫苗C。例4：疫苗X1
本例中，将5份-油酸甘油酯(“NOFABLE GO-901”，购自NOF公司；酰基构成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt顺式-△9-链烯酸成分)用作成分B，将3份-水合L-谷氨酸钠和一份甘露糖醇溶解在6份蒸馏水中作为成分E。将成分B和成分E的水溶液混合，在常温下在CLEARMIX CLM-0.8S(购自M技术有限公司)中以10,000转/分乳化10分钟，得到一凝胶状产物。
然后，将6份油酸油酰基酯(“NOFABLE OO-9080”，购自NOF公司；酰基构成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt顺式-△9-链烯酸成分)与6份角鲨烯的混合物作为成分A，向其中加入1.6份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NOFABLE SO-902”.购自NOF公司；酰基构成：88％wt顺式-△9-十八碳烯酸成分和94％wt顺式-△9-链烯酸成分)成分B和0.4份加热至50℃的聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油成分C，充分搅拌，向所得混合物中加入一份上述凝胶状产物，使前者在油相中分散，边搅拌边向上述混合物中逐渐加入8份含抗原的磷酸盐缓冲盐水的水相，然后使用CLEARMIX CLM-0.8S(购自M技术有限公司)在常温下以8000转/分混合乳化10分钟，得到油包水型油性佐剂疫苗X1。实施例5：疫苗X2
在本实施例中，用6份一油酸双甘油酯[“NOFABLE PG0-9021L”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％顺-△9-链烯酸]作为组分B，将4份L-谷氨酸钠-水合物和1份乳醇(lactitol)溶于7份蒸馏水中，所得水溶液作为组分E，将组分B和组分E的水溶液混合并采用实施例4中相同的方法将其乳化后得到凝胶状产物。
然后，向作为油性成分的6份精制葵花子油和6份油酸乙酯[“NOFABLE EO-90”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％顺-△9-链烯酸]的混合物中加入1.6份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NONION OP-83RAT”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％顺-△9-链烯酸]和0.4份聚氧乙烯(40)氢化的蓖麻油，将它们加热到50℃，并予以充分搅拌，接着将1份前面得到的凝胶状产物加入该混合物中使其分散于油相内，再边搅拌边逐渐加入8份由含有抗原的磷酸盐缓冲液组成的水相，然后将它们混合并采用实施例4中相同的方法进行乳化，从而得到油包水型油性佐剂疫苗X2。实施例6：疫苗X3
在本实施例中，用4份-油酸甘油酯[“NOFABLE GO-991P”，可由NOF公司购得，酰基构成：99重量％的顺-△9-十八烯酸和99重量％顺-△9-链烯酸]和4份二油酸甘油酯[“NOFABLEGO-902P”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％顺-△9-链烯酸]作为组成B，将4份L-天冬氨酸钠-水合物和1份海藻糖溶于11份蒸馏水中，所得水溶液作为组分E，将组分B和组分E混合并采用实施例4中相同的方法将其乳化后得到凝胶状产物。
然后，向作为油性成分的8份油酸癸酯[“NOFABLE DO-99”，可由NOF公司购得；酰基构成：99重量％的顺-△9-十八烯酸和99重量％的顺-△9-链烯酸]和4份角鲨烯的混合物中加入0.8份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-992”，可由NOF公司购得；酰基构成：99重量％的顺-△9-十八烯酸和99重量％的顺-△9-链烯酸]、1.2份-油酸甘油酯[“NOFABLE GO-991”，可由NOF公司购得；酰基构成：99重量％的顺-△9-十八烯酸和99重量％的顺-△9-链烯酸]和0.4份聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，将它们加热到50℃，并予以充分搅拌，接着，将1份前面得到的凝胶状产物加入该混合物中使其分散于油相内，再边搅拌边逐渐加入10份由含有抗原的磷酸盐缓冲液组成的水相，然后将它们混合并采用实施例4中相同的方法进行乳化，从而得到油包水型油性佐剂疫苗X3。实施例7：疫苗d
在本实施例中，用油酸乙酯[“NOFABLE EO-99”，可由NOF公司购得；酰基构成：99重量％的顺-△9-十八烯酸和99重量％的顺-△9-链烯酸]作为组分A。向12份该油性成分中加入1.7份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，将它们加热到50℃，并予以充分搅拌，再边搅拌边逐渐加入8份含有抗原的水相(磷酸盐缓冲液)，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，从而得到油包水型油性佐剂疫苗。
然后用0.4份聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇(HLB值为16.0)作为表面活性剂，将其加入并均匀溶解于10份磷酸盐缓冲液中，接着，边搅拌边逐渐加入10份前面得到的油包水型油性佐剂，然后将它们混合并在常温和8,000rpm的条件下，用CLEARMIX CLM-0.8S(可由MTECHNIQUE Co.Ltd.购得)使其乳化5分钟，从而得到水包油包水型油性佐剂疫苗d。实施例8：疫苗e
在本实施例中，用6份精制jojoba油(一种不饱和脂肪酸高的植物油)和6份角鲨烯的混合物作为组分A。向该油性成分中加入1.6份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NONION OP-83RAT”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸]和0.4份聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，将它们加热到50℃，并予以充分搅拌，再边搅拌边逐渐加入8份含有抗原的水相(磷酸盐缓冲液)，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，从而得到油包水型油性佐剂疫苗。
然后用0.2份聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇-油酸酯(“NONIONOT-221”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸；HLB：15.8)作为表面活性剂，将其加入并均匀溶解于10份磷酸盐缓冲液中，接着边搅拌边逐渐加入10份前面得到的油包水型油性佐剂，然后将它们混合并采用实施例7中相同的方法进行乳化，从而得到水包油包水型油性佐剂疫苗e。实施例9：疫苗f
在本实施例中，把由6份油酸油酯[“NOFABLE OO-9080”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]和6份三油酸甘油酯[“NOFABLE GO-993”，可由NOF公司购得；酰基构成：99重量％的顺-△9-十八烯酸和99重量％的顺-△9-链烯酸)组成的混合物用作组分A。向该油性成分中加入0.9份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]、0.8份-油酸甘油酯[“NOFABLEGO-991”，可由NOF公司购得；酰基构成：99重量％的顺-△9-十八烯酸和99重量％的顺-△9-链烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，将它们加热到50℃，并予以充分搅拌，再边搅拌边逐渐加入8份含有抗原的水相(磷酸盐缓冲液)，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，从而得到油包水型油性佐剂疫苗。
然后用0.14份聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油(HLB值为14.8)和0.06份氢化大豆卵磷脂(“COATSOME NC-21”，可由NOF公司购得)作为表面活性剂，将其加入并均匀溶解于10份磷酸盐缓冲液中，再边搅拌边逐渐加入10份前面得到的油包水型油性佐剂，然后将它们混合并采实施例7中相同的方法进行乳化，从而得到水包油包水型油性佐剂疫苗f。实施例10：疫苗X4
在本实施例中，用5份-油酸甘油酯[“NOFABLE GO-901”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]作为组分B，将3份L-谷氨酸钠-水合物和1份甘露糖醇溶于6份蒸馏水中，所得水溶液作为组分E，将组分B和组分E混合并采用实施例4中相同的方法将其乳化，则得到凝胶状产物。
然后，向作为油性成分的12份油酸乙酯[“NOFABLE EO-90”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％顺-△9-链烯酸]中加入1.7份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，将它们加热到50℃，并予以充分搅拌，接着将1份前面得到的凝胶状产物加入该混合物中使其分散于油相内，再边搅拌边逐渐加入8份由含有抗原的磷酸盐缓冲液组成的水相，然后将它们混合并采用实施例4中相同的方法进行乳化，从而得到油包水型油性佐剂疫苗。
然后用0.4份聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)甘醇(HLB值为16.0)作为表面活性剂，将其加入并均匀溶解于10份磷酸盐缓冲液中，再边搅拌边逐渐加入10份前面得到的油包水型油性佐剂疫苗，然后将它们混合并在常温和8,000rpm的条件下，用CLEARMIX CLM-0.8S(可由MTECHNIQUE Co.Ltd.购得)使其乳化5分钟，从而得到水包油包水型油性佐剂疫苗X4。实施例11：疫苗X5
在本实施例中，用6份脱水山梨糖醇-油酸酯[“NOFABLE SO-901”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]作为组分B，将4份L-谷氨酸钠-水合物和1份乳醇(lactitol)溶于7份蒸馏水中，所得水溶液作为组分E。将组分B和组分E混合并采用实施例4中相同的方法将其乳化，得到凝胶状产物。
然后，以10份精制葵花子油和2份角鲨烷组成的混合物作为油性成分，向其中加入1.7份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLE SO-902”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]和0.3份聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，将它们加热到50℃，并予以充分搅拌，接着将1份前面得到的凝胶状产物加入该混合物中使其分散于油相内，再边搅拌边逐渐加入8份由含有抗原的磷酸盐缓冲液组成的水相，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，从而得到油包水型油性佐剂疫苗。
然后，用0.14份聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇-油酸酯(“NONION OT-221”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸；HLB：15.8)和0.06份氢化的大豆卵磷脂(“COATSOME NC-21”，可由NOF公司购得)作为表面活性剂，将它们加入并均匀溶解于10份磷酸盐缓冲液中，再边搅拌边逐渐加入10份前面得到的油包水型油性佐剂疫苗，然后将它们混合并采用实施例7中相同的方法进行乳化，从而得到水包油包水型油性佐剂疫苗X5。对比例1：疫苗g
向作为油性成分的轻液体石蜡(“CRYSTOL52”，可由ESSO公司购得)中加入0.8份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONIONOP-83RAT”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和83重量％的顺-△9-链烯酸]和0.2份降氧乙烯(20)脱水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)，接着边充分搅拌边逐渐加入3份含有抗原的水相(磷酸盐缓冲液)，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，得到用作对比的油包水型油性佐剂疫苗g。
对比例2：疫苗h
由6份油酸油酰基酯(“NOFABLE OO-9080”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸)和6份角鲨烷组成的混合物作为组分A，向其中加入1.6份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONI ON OP-83RAT”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)0.4份聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)，然后加以充分搅拌，再边搅拌边逐渐加入8份含有抗原的水相(磷酸盐缓冲液)，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，从而得到用作对比的油包水型油性佐剂疫苗h。对比例3：疫苗i
由6份油酸油酰酯(“NOFABLE OO-9080”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸)和6份角鲨烷组成的混合物作为组分A，向其中加入1.6份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONI ON OP-83RAT”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)和0.4份聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)然后加以充分搅拌，再边搅拌边逐渐加入8份含有抗原的水相(磷酸盐缓冲液)，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，得到油包水型油性佐剂疫苗。
然后用0.14份聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油(HLB：14.8)和0.06份氢化大豆卵磷脂(“COATSOME NC-21”，可由NOF公司购得)作为表面活性剂，将其加入并均匀分散于10份磷酸盐缓冲液中，再边搅拌边逐渐加入10份前面得到的油包水型油性佐剂，然后将它们混合并采用实施例7中相同的方法进行乳化，从而得到用作对比的水包油包水型油性佐剂疫苗i。对比例4：疫苗Y1
用实施例4中相同的方法，将5份脱水山梨糖醇-油酸酯[“NOFABLE SO-901”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]和将4份乳醇(lactitol)溶于6份蒸馏水中后得到的水溶液进行乳化，得到凝胶状产物。
然后，向12份三油酸甘油酯[“NOFABLE GO-903”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]中加入1份脱水山梨糖醇倍半油酸酯[“NOFABLESO-902”，可由NOF公司购得；酰基构成：88重量％的顺-△9-十八烯酸和94重量％的顺-△9-链烯酸]和0.5份聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)，再加以充分搅拌，并加入1份前面得到的凝胶状产物；使其分散于油相内，然后再边搅拌边逐渐加入6份由含有抗原的磷酸盐缓冲液组成的水相，将它们混合并采用实施例4中相同的方法进行乳化，从而得到用作对比的油包水型油性佐剂疫苗Y1。对比例5：疫苗Y2
向作为油性成分的6份轻液体石蜡(“CRYSTOL 52”可由ESSO公司购得)中加入0.8份脱水山梨糖醇倍半油酸酯(“NONI ONOP-83RAT”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)和0.2份聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇-油酸酯(“NONI ON OT-221”，可由NOF公司购得；酰基构成：55重量％的顺-△9-十八烯酸和78重量％的顺-△9-链烯酸)，接着再边充分搅拌边逐渐加入3份由含有抗原的磷酸盐缓冲液组成的水相，然后将它们混合并采用实施例1中相同的方法进行乳化，得到油包水型油性佐剂疫苗。
然后用0.2份聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油(HLB：14.8)作为表面活性剂，将其加入并均匀分散于10份磷酸盐缓冲液中，接着再边搅拌边逐渐加入10份前面得到的油包水型油性佐剂疫苗，然后将它们混合并采用实施例10中相同的方法进行乳化，从而得到作为对比的水包油包水型油性佐剂疫苗Y2。免疫接种试验
用含有不同抗原的特异性油性佐剂疫苗进行免疫接种试验。在个体疫苗的识别中，以实施例或对比例公开的成分为基础制备的疫苗，都有相对应的、附着在特异性疫苗上的记号来指示。试验例1：用于传染性猪放线杆菌病的灭活疫苗
将放线杆菌胸膜肺炎NG-22菌株(血清型2)接种到培养基上，在37℃下，进行通气-旋动培养，所得培养基用福尔马林灭活，再通过离心收集细菌细胞并进行洗涤。收集到的这些细胞即作为抗原。再以1010CFU/剂量(CFU：集落形成单位)的浓度(在灭活前)将抗原分散于磷酸盐缓冲液中，所得分散系即为含有抗原的水相。
以1ml/只的量将疫苗a、c或X2、或者以2ml/只的量将疫苗d、f或X4对免疫组(每组包括5只4周大的SPF(无特定病原体)小猪)的小猪进行肌肉注射，每四周注射一次，共注射2次。对于免疫对照组(每组包括5只4周大的SPF小猪)的小猪，则以1ml/只的量将疫苗g或h、或者以2ml/只的量将疫苗i或Y2对其进行肌肉注射，每四周注射一次，共注射2次。此外，未经免疫的空白对照组也包括5只小猪，并将它们与免疫组或免疫对照组的小猪安置在一起。观察每只小猪的临床症状，包括在每次免疫接种后观察其注射部位2周，在整个试验期间，间隔一定时间即收集每只小猪的血清，并通过补体结合(CF)试验来测定抗体效价。从最初疫苗注射起，16周后，通过尸体解剖来检查注射部位所形成的结节的大小及分布，并以损伤情况为基础记录检查结果(无损伤：0；～严重损伤；3)，然后再对每组中的5只动物求平均值。
关于安全性的结果列于表1中。在临床症状上，免疫组没有出现发热，也没有显示任何不正常现象。免疫对照组则观察到了体温的短暂升高，但很快降下来了。从最初免疫注射起16周后进行的尸检中，免疫组没有观察到任何特别的损伤，但免疫对照组则观察到了结节，这有可能是由注射物质引起的。
        表1：关于传染性猪放线杆菌病的灭活
                    疫苗的安全性试验组   疫苗    最初免疫接种后     加强剂量后    损伤情况
              C.S.1) B.T.2)  C.S.1) B.T.2)  评分免疫组   疫苗a     0/53)  0/53)    0/5    0/5       0
     疫苗c     0/5     0/5       0/5    0/5       0
     疫苗d     0/5     0/5       0/5    0/5       0
     疫苗f     0/5     0/5       0/5    0/5       0
     疫苗X2    0/5     0/5       0/5    0/5       0
     疫苗X4    0/5     0/5       0/5    0/5       0免疫对   疫苗g     5/5     5/5       5/5    5/5       3照组     疫苗h     3/5     3/5       3/5    3/5       2
     疫苗i     5/5     5/5       4/5    5/5       1
     疫苗Y2    5/5     5/5       5/5    5/5       2空白对   --        0/5     0/5       0/5    0/5       0照组1)临床症状    2)体温3)(出现任何不正常现象的试验动物数)/(试验动物总数)。
疫苗功效的观察结果总结在表2-1和表2-2中。注射了疫苗a、c或X2的免疫组，从疫苗注射起4周后，CF-抗体效价开始升高，从疫苗注射起8周后，观察到良好的抗体应答(1：128到1：256)，这与注射了疫苗g的免疫对照组观察到的结果几乎相同，但明显高于注射了疫苗h的免疫对照组观察到的结果。本发明中的水包油包水型油性佐剂疫苗d、f和X4可以良好的乳剂形式存在，并显示出与前面提到的油包水乳剂型油性佐剂疫苗几乎同样好的抗体应答。上述制备的用于免疫对照组的疫苗i和Y2以不稳定的乳剂形式存在，注射后所显示出的抗体应答明显低于注射了疫苗d和f的组。
上述结果清楚地表明，本发明的油性佐剂疫苗即使只包含一种可代谢的油，也能显示出与含有不可代谢的矿物油的疫苗大致相同的免疫增强作用，并且，与含有矿物油的疫苗相比，本发明的油性佐剂疫苗具有极好的局部反应能力。
此外，这些结果也表明，按照本发明的方法制备的油性佐剂疫苗即使只含有一种可代谢的油，其稳定性也较高，并且这些疫苗在长时间内所显示的免疫作用，与惯用的仅含有不可代谢的矿物油的油性佐剂疫苗所达到的效果基本相同，且与惯用的仅含矿物油的疫苗相比，本发明的油性佐剂疫苗有极好的局部反应能力。
 表2-1：用于传染性猪放线杆菌病的灭活
        疫苗的功效试验组  疫苗      注射后经过的时间(周)
              0     4     6     8免疫组  疫苗a   ＜41) 14    56    147
    疫苗c   ＜4    18    111   169
    疫苗d   ＜4    12    42    84
    疫苗f   ＜4    11    37    74免疫对  疫苗g   ＜4    37    97    111照组    疫苗h   ＜4   ＜4     4     4
    疫苗i   ＜4   ＜4     4   ＜4空白对  --      ＜4   ＜4   ＜4   ＜4照组1)最高稀释显示≥50％固定的倒数的几何均数，用App(2型)。
     表2-2：用于传染性猪放线杆菌病的灭活疫苗的功效试验组  疫苗       注射后经过的时间(周)
              0     4     6     8     12    16免疫组  疫苗X2  ＜41) 24    147   169   147    74
    疫苗X4  ＜4    32    111    97    97    42免疫对  疫苗g   ＜4    37    97    111    128   84照组
    疫苗Y2  ＜4   ＜4     4     4    ＜4   ＜4空白对  --      ＜4   ＜4   ＜4   ＜4    ＜4   ＜4照组1)最高稀释显示≥50％固定的倒数的几何均数，用App(2型)。试验例2：用于日本脑炎的灭活疫苗
将日本脑炎病毒(JEV)Nakayama菌株接种到小鼠脑内并加以培养，当病毒增殖到极点时即收获该小鼠的脑。将其制成脑匀浆并通过离心沉淀，所得上清液用福尔马林灭活。该上清液即用作抗原。加入了福尔马林的磷酸盐缓冲液作为水相，其所含病毒在灭活之前已调整到106.0LD50/剂量。以1ml/只的量将疫苗b、或者以2ml/只的量将疫苗e对免疫组(每组包括5只10周大的SPF小猪)的小猪进行肌肉注射。以1ml/只的量将疫苗g肌肉注射到免疫对照组(每组包括5只10周大的SPF小猪)的每只小猪体内。此外，未经免疫的空白对照组包括5只小猪，它们与免疫组或免疫对照组的小猪安置在一起。观察每只小猪的临床症状，包括在每次免疫接种后观察其注射部位2周，在整个试验期间，每间隔一定时间即采集每只小猪的血清，并通过血凝抑制(HI)试验来测定抗体效价。从最初疫苗注射起16周后，通过尸体解剖来检查注射部位所形成的结节的大小及分布，并记录其损伤情况(无损伤：0；～严重损伤：3)，然后再对每组中的5只小猪求平均值。
关于安全性的结果列于表3中。在临床症状上，免疫组和免疫对照组均未出现发热，也未显示其它任何不正常现象。在免疫注射16周后进行的尸检中，免疫组没有观察到任何特别的损伤，但免疫对照组则观察到了结节，这有可能是由注射物质引起的。
       表3：用于日本脑炎的灭活疫苗的可靠性试验组  疫苗      结果      损伤情况
           C.S.1)   B.T.2)  评分免疫组  疫苗b   0/53)    0/53)   0
    疫苗e   0/5       0/5      0免疫对  疫苗g   0/5       0/5      2.6照组空白对  --      0/5       0/5      0照组1)临床症状    2)体温3)(出现任何不正常现象的试验动物数)/(试验动物总数)。
关于疫苗功效的观察结果总地在表4中。注射了疫苗b的免疫组，从疫苗注射起4周后，HI-抗体效价开始升高；8周后，观察到良好的抗体应答(1∶80到1∶160)，这与注射了疫苗g的免疫对照组观察到的结果几乎相同。本发明中的水包油包水型油性佐剂疫苗e能以良好的乳剂形式存在，即使单独注射也能提高HI-抗体效价，并且显示出与上面提到的油包水乳剂型油性佐剂疫苗大致相同的抗体应答。
     表4：用于日本脑炎的灭活疫苗的功效试验组    疫苗    注射后经过的时间(周)
                0     4     6     8免疫组  疫苗b    ＜101) 61    80    139
    疫苗e    ＜10    92    92     92免疫对  疫苗g    ＜10    70    92     92照组空白对  ---      ＜10  ＜10  ＜10   ＜10照组1)血凝抑制试验几何均数效价的倒数
上述结果清楚地表明，即使用JEV作为抗原时，本发明的油性佐剂疫苗所显示的免疫作用，也与含不可代谢的油的疫苗所显示的作用几乎相同，并且与后者相比，前者具有极好的局部反应能力。试验例3：用于新城病(ND)的灭活疫苗
将新城病病毒Ishii菌株接种(105.0EID50/卵)到10天大的胚胎卵的尿囊腔中，在37℃下培养4天，收集尿囊液。该尿囊液用福尔马林水溶液灭活后，用作抗原。用磷酸盐缓冲液作为水相，其中加入了福尔马林，且它所含的病毒在灭活之前调整到108.0EID50/剂。
对于免疫组(每组包括10只5周大的SPF小鸡)，用0.5ml/只的量肌肉注射疫苗a或b，或者以1ml/只的量肌肉注射疫苗d或e；对于其他免疫组(每组包括20只5周大的SPF小鸡)，以0.5ml/只的量肌肉注射疫苗X1或X2，或者以1.5ml/只的量肌肉注射疫苗X5。对于免疫对照组(每组包括10只5周大的SPF小鸡)，以0.5ml/只的量肌肉注射疫苗g，或者以1ml/只的量肌肉注射疫苗i；对于其它免疫对照组(每组包括20只5周大的SPF小鸡)，以0.5ml/只的量肌肉注射疫苗Y2。此外，未经免疫的空白对照组，每组包括10只或20只小鸡，它们分别与包括10只或20只小鸡的免疫组安置在一起。
对于注射了疫苗a、b、d和e的组，观察其中每只小鸡的临床症状，包括在免疫接种后观察其注射部位10周，从免疫接种起10周后，采集每只小鸡的血清并测定其HI-抗体效价。从免疫接种起10周后，通过尸体解剖(每组解剖5只)来检查其注射部位，由此检定残留物的残留程度及其分布，并记录为损伤情况(无损伤：0；～严重损伤：3)，然后对每组求平均值。每组中剩下的5只小鸡再进一步肌肉注射ND病毒Sato菌株，注射量为104MLD/只(MLD：最小致死量)，注射后观察其临床症状2周，同时在注射2周后采集血样，测定血样的HI抗体效价，从而检定该动物是否感染了ND病毒。
对于注射了疫苗X1、X2、X5和Y2的组，观察每只小鸡的临床症状，包括在免疫接种后观察注射部位20周，采集每只小鸡的血清并测定其HI抗体效价。从免疫接种起10周后，通过尸体解剖(每组解剖10只小鸡)检查注射部位的残留物的残留程度及分布，并记录为损伤情况(无损伤：0；～严重损伤：3)，然后再对每组求平均值。从注射起20周后，每组中剩下的10只小鸡再进一步肌肉注射ND病毒Sato菌株，注射量为104MLD/只，(MLD：最小致死量)，注射后观察其临床症状2周，同时在注射2周后采集血样，测定血样的HI抗体效价，从而检定该动物是否感染了ND病毒。
关于安全性的结果列于表5-1和表5-2中。注射了疫苗g、i和Y2的免疫对照组的小鸡，注射后立即出现了短暂的跛行。另一方面，在整个试验期间，注射了本发明的疫苗的免疫组，没有出现任何不正常现象。从免疫接种起10周后进行的尸检中，注射了疫苗b的5只小鸡，其中有2只观察到少量的油状物质；注射了疫苗X2的5只小鸡，其中有3只观察到少量的油状物质，其它免疫组则没有观察到任何损伤。然而，注射了疫苗g、i和Y2的所有免疫对照组，则观察到了从介质到强列残留物的存在。
    表5-1：用于新城病的灭活疫苗的安全性试验组  疫苗        注射后经过的时间             损伤情况
              0      2     3     4     6     10  评分免疫组  疫苗a   0/101) 0/10  0/10  0/10  0/10  0/10    0
    疫苗b   0/10    0/10  0/10  0/10  0/10  0/10  0.4
    疫苗d   0/10    0/10  0/10  0/10  0/10  0/10    0
    疫苗e   0/10    0/10  0/10  0/10  0/10  0/10    0免疫对  疫苗g   6/10    0/10  0/10  0/10  0/10  0/10  2.2照组
    疫苗i   4/10    0/10  0/10  0/10  0/10  0/10  1.8空白对  --      0/10    0/10  0/10  0/10  0/10  0/10    0照组1)(出现任何不正常现象的动物数)/(参加试验动物数)
    表5-2：用于新城病的灭活疫苗的安全性试验组  疫苗               注射后经过的时间
              0      2     3     4     6     8    12免疫组  疫苗X1  0/201) 0/20  0/20  0/20  0/20  0/20 0/10
    疫苗X2  0/20    0/20  0/20  0/20  0/20  0/20 0/10
    疫苗X5  0/20    0/20  0/20  0/20  0/20  0/20 0/10免疫对  疫苗Y2  9/20    0/20  0/20  0/20  0/20  0/20 0/10照组空白对  --      0/20    0/20  0/20  0/20  0/20  0/20 0/10照组1)(出现任何不正常现象的动物数)/(参加试验动物数)
            表5-2(续)：试验组    注射后经过的时间    损伤情况
        16        20        评分免疫组     0/10      0/10         0
       0/10      0/10        0.6
       0/10      0/10         0免疫对     0/10      0/10        1.8照组空白对     0/10      0/10         0照组
对疫苗功效的观察结果总结于表6-1和表6-2中。将注射了油包水型油性佐剂疫苗a、b、X1和X2的免疫组观察到的结果，与注射了疫苗g的免疫对照组观察的结果进行对比，二者之间没有任何不同，因此认为它们的功效是相同的。另一方面，将注射了水包油包水型油性佐剂疫苗d、e和X5的免疫组观察的结果，与注射了疫苗i和Y2的免疫对照组观察的结果进行对比，后者的HI-抗体效价明显低于前者。
上述结果清楚地表明，本发明的油性佐剂疫苗即使仅包含一种可代谢的油，它所显示的免疫作用也与含有不可代谢的矿物油的疫苗的作用基本相同，且与含矿物油的油性佐剂疫苗相比，本发明的油性佐剂疫苗有非常好的局部反应能力。
此外，这些结果也表明，按照本发明的方法制备的油性佐剂疫苗具有高稳定性，它们所显示的免疫作用，与惯用的仅含不可代谢的矿物油的油性佐剂疫苗所达到的效果基本相同，且与惯用的油性佐剂疫苗相比，本发明的油性佐剂疫苗有极好的局部反应能力。此外，上述结果也证明，本发明的水包油包水型油性佐剂疫苗同样具有高稳定性，在长时间内显示出极好的功效，同时也有极好的局部反应能力。
     表6-1：  用于新城病的灭活疫苗的功效试验组  疫苗   注射后经过的时间(周) 存活率
                0周    10周     (％)2)免疫组  疫苗a      ＜51)  520       100
    疫苗b      ＜5     453       100
    疫苗d      ＜5     422       100
    疫苗e      ＜5     394       100免疫对  疫苗g      ＜5     597       100照组
    疫苗i      ＜5     171       100空白对  --         ＜5    ＜5        0照组1)HI几何均数效价的倒数2)(允许无症状的动物数)/(试验动物总数)
    表6-2：用于新城病的灭活疫苗的功效试验组  疫苗    注射后经过的时间(周)     存活率
              0     10    15    20   (％)2)免疫组  疫苗X1  ＜51) 557    520   453   100
    疫苗X2  ＜5    640    485   520   100
    疫苗X5  ＜5    597    422   368   100免疫对  疫苗Y2  ＜5    171      8   ＜5   100照组空白对  --      ＜5    ＜5    ＜5   ＜5    0照组1)HI几何均数效价的倒数2)(允许无症状的动物数)/(试验动物总数)试验例4：用于牛短暂热的灭活疫苗
将牛短暂热(BEF)病毒YHL菌株接种到由Hmlu-1细胞构成的该细胞的单层，将MDI(感染复数)调节至0.01，然后在37℃下经过60分钟，使该病毒吸附到此单层上，再将它加到培养基上，在34℃下培养3天，并将上清液用福尔马林灭活。用加有福尔马林的磷酸盐缓冲液作为水相，它所含的病毒在灭活之前已被调整到106.0TCID50/剂。
对免疫组(每组包括两头体重约150kg的牛)的牛，以1ml/牛的量肌肉注射疫苗a、X1或X3，或者以3ml/牛的量肌肉注射疫菌d；对免疫对照组(每组包括两头体重为150kg的牛)的牛，则以1ml/牛的量肌肉注射疫苗g或Y1。此外，未经免疫的空白对照组也包括两头牛，并将它们与免疫组或免疫对照组的牛安置在一起。观察每头牛的临床症状，包括在免疫接种后，观察注射部位及体温2周。此外，从免疫注射后，每间隔一定时间即采集每头牛的血清，用来检测中和抗体效价。从免疫注射起20周后，通过尸体解剖来检查注射部位。
关于安全性的结果列于表7中。在临床症状和体温方面，免疫组和免疫对照组均未出现任何不正常现象。对免疫注射部位进行的尸检中，仅在免疫对照组观察到了疫苗残留物。
       表7：  用于牛短暂热的灭活疫苗的安全性试验组  疫苗         结果      损伤情况
           C.S.1)   B.T.2) 评分免疫组  疫苗a   0/23)   0/23)   0
    疫苗b   0/2      0/2      0
    疫苗X1  0/23)   0/23)   0
    疫苗X3  0/2      0/2      0免疫对  疫苗g   0/2      0/2      1照组
    疫苗Y1  0/2      0/2      0空白对  ---     0/2      0/2      0照组1)临床症状；    2)体温3)(出现任何不正常现象的动物数)/(试验动物总数)
对疫苗功效的观察结果总结于表8-1和表8-2中。从免疫接种起4周后，免疫组的抗体效价开始升高，抗体效价出现的变化与免疫对照组观察的结果相同。注射了疫苗X1和X3的免疫组显示的抗体效价的变化优于注射了疫苗Y1的免疫对照组的观察结果，并且这种趋势一直保持到接种后20周。
    表8-1：用于牛短暂热的灭活疫苗的功效试验组    疫苗    注射后经过的时间(周)
               0     4     6     8免疫组  疫苗a    ＜21) 16    32    32
             ＜2    32    64    64
    疫苗d    ＜2    32    32    32
             ＜2    64    32    32免疫对  疫苗g    ＜2    32    64    32照组
             ＜2    32    64    64空白对  ---      ＜2   ＜2   ＜2   ＜2照组
    ---      ＜2   ＜2   ＜2   ＜21)BEF中和抗体效价
    表8-2：  用于牛短暂热的灭活疫苗的功效试验组  疫苗                 注射后经过的时间
              0     4     6     8    12   16    20免疫组  疫苗X1  ＜21)  8    16    32    32   32    32
    疫苗X1  ＜2    32    32    64    64   64    64
    疫苗X3  ＜2    32    32    32    32   32    32
    疫苗X3  ＜2    32    64    64    64   32    32免疫对  疫苗Y1  ＜2     8     8     4     4    4     4照组
    疫苗Y1  ＜2    16     8     8     8    8     8空白对  --      ＜2   ＜2   ＜2   ＜2   ＜2  ＜2   ＜2照组
            ＜2   ＜2   ＜2   ＜2   ＜2  ＜2   ＜21)BEF中和抗体效价
上述结果清楚地表明，即使本发明的油性佐剂疫苗仅包含一种可代谢的油时，它所显示的免疫作用也与含不可代谢的矿物油的疫苗的作用基本相同，且与含矿物油的佐剂疫苗相比，本发明的油性佐剂疫苗有相当好的局部反应能力。
上述结果也证明，按照本发明的方法制备的油性佐剂疫苗具有高稳定性，显示的免疫作用长久，且具有极好的局部反应能力。稳定性
将实施例4-6、7-11以及对比例4-5中制得的油性佐剂疫苗，按照下述方法操作后，立即观察它们的稳定性，结果总结于表9中。试验例5：油包水型佐剂疫苗
将每种油包水型油性佐剂疫苗(5ml)放入容积为15ml的、带顶盖的聚丙烯Spitz管(无菌)内，随即在不同温度条件下观察其稳定性。分别于1天、3个月及12个月后用肉眼观察三次，然后再用相差显微镜(放大率：×1000)(每种5个可见区)观察每种样品，所得结果以下列判断标准为基础进行记录：
◎：无(或极少)相分离，滴液大小无(或极小)变化
○：油相仅轻微分离，和/或滴液大小有轻微变化
△：水相分离，和/或滴液部分“损坏*”
×：油相、水相均分离，和/或清楚地观察到滴液“损坏*”××：清楚地观察到相分离，和/或相内几乎不含抗原*)“损坏”是指乳剂中的小滴液自发的结合形成大滴液(融合)。试验例6：水包油包水型油性佐剂疫苗
将每种水包油包水型油性佐剂疫苗(10ml)放入20ml的、带顶盖的玻璃螺旋管(无菌)中，随即在不同温度条件下观察其稳定性。分别于1天、3个月和12个月后肉眼观察三次，然后再用相差显微镜(放大率：×1000)(每种5可见区)观察每种样品，所得结果以下列判断标准为基础进行记录：
◎：无(或极少)相分离，滴液大小无(或极小)变化
○：滴液大小有轻微变化，但仍保持水包油包水形式。
△：清楚地观察到滴液融合，但仍保持水包油包水形式。
×：清楚地观察到滴液“损伤”，以至于水包油包水型结构保存不再良好××：水包油包水型结构几乎已被破坏，清楚地观察到相分离※“损伤”是指乳剂中的小液滴自发的结合形成大滴液(融合)。
   表9：油性佐剂疫苗的稳定性疫苗    在4℃下保存(月)     在室温下保存(月)No.    1(天)    3     12   1(天)    3     12X1      ◎     ◎     ◎    ◎     ◎     ◎X2      ◎     ◎     ◎    ◎     ◎     ◎X3      ◎     ◎     ◎    ◎     ◎     ◎X4      ◎     ◎     ◎    ◎     ◎     ◎X5      ◎     ◎     ◎    ◎     ◎     ◎Y1      ◎     ○     △    ◎     ○     ×Y2      ○     ×     ××  ○     ×     ××
列于表1-9中的结果清楚地表明，本发明制备的油性佐剂疫苗具有极好的安全性和诱导抗体产生的能力；按照下述方法制备的油性佐剂疫苗具有低粘滞性和极好的长期稳定性和持续不断地诱导抗体产生的能力，该方法包括以下步骤：将聚氧乙烯羟基脂肪酸甘油三酯和由本发明中的组分B和E的水溶液组成的凝胶状物质加入到油性成分中，将这些原料混合后，再加入含有生物学上可接受的、有效量的抗原的水相，使水相乳化于油相中。包括以下几个步骤的方法则可制备出安全性和抗体产生能力极佳的水包油包水型油性佐剂疫苗：将前面制得的油包水型油性佐剂疫苗加入到含有本发明的混合乳化剂的水相中，使该疫苗再次乳化到水相中。
发明效果
正如上面详细叙述的那样，本发明能制备出有用的油性佐剂疫苗，在不使用任何免疫刺激剂，如植物血凝素等药物的情况下，该疫苗也能在较长时间内显示出诱导抗体产生的良好能力，并具有药物所必需的出色的稳定性和安全性。

Claims (11)

1.一种油包水型油性佐剂疫苗，由20至90％重量比的常温下呈液态的油相A)、0.5至30％重量比的乳化剂和5至75％重量比的含有一种生物学上可接受的有效量抗原的水相D)组成，该乳化剂含有一种非离子表面活性剂B)和一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)，该非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态。
2.一种油包水型油性佐剂疫苗，含有20至90％重量比的常温下呈液态的油相A)、0.5至30％重量比的乳化剂、E)0.01至10％重量比的氨基酸或其盐及0.01至10％重量比的分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇、和5至75％重量比的含有一种生物学上可接受的有效量抗原的水相D)组成，所说的乳化剂含有一种非离子表面活性剂B)和一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)，该非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态。
3.一种水包油包水型油性佐剂疫苗，由油包水型油性佐剂相和外层水相F)组成，该油包水型油性佐剂相由30至90％重量比的常温下呈液态的油相A)、0.5至30％重量比的乳化剂和5至65％重量比的含有一种生物学上可接受的有效量抗原的水相D)组成，所说的乳化剂含有一种非离子表面活性剂B)和一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)，该非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来，在40℃下呈液态；该外层水相F)中含有0.2至20％重量比的乳化剂，该乳化剂中含有一种非离子表面活性剂，该乳化剂的总HLB值不小于10。
4.一种水包油包水型油性佐剂疫苗，由油包水型油性佐剂相和外层水相F)组成，该油包水型油性佐剂相含有30至90％重量比的常温下呈液态的油相A)、0.5至30％重量比的乳化剂E)0.01至10％重量比的氨基酸或其盐及0.01至10％重量比的分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇、和5至65％重量比的含有一种生物学上可接受的有效量抗原的水相D)组成，所说的乳化剂含有一种非离子表面活性剂B)和一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)，该非离子表面活性剂是由一种具有三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来，在40℃下呈液态；该外层水相中含有0.2至20％重量比的总HLB值不小于10的乳化剂，该乳化剂中含有一种非离子表面活性剂。
5.根据权利要求1至4中任一项权利要求的油性佐剂疫苗，所述常温下呈液态的油相A)是一种脂肪酸酯。
6.根据权利要求1至4中任一项权利要求的油性佐剂疫苗，所述常温下呈液态的油相A)是一种脂肪酸酯与角鲨烯的混合物。
7.根据权利要求1至4中任一项权利要求的油性佐剂疫苗，所述常温下呈液态的油相A)是一种脂肪酸和一种醇的酯，该脂肪酸包含不少于85％重量比的顺式-△9-十八碳烯酸和不少于90％重量比的顺式-△9-链烯酸。
8.根据权利要求1至4中任一项权利要求的油性佐剂疫苗，所述组成非离子表面活性剂B)的脂肪酸包含不少于85％重量比的顺式-△9-十八碳烯酸和不少于90重量比的顺式-△9-链烯酸。
9.根据权利要求3或4的油性佐剂疫苗，所述外层水相F)含有0.2至20％重量比的一种乳化剂和一种甘油磷脂的混合物，所说的乳化剂含有一种非离子表面活性剂，且总HLB值不小于10。
10.一种如权利要求2所述的油包水型油性佐剂疫苗的制备方法，其步骤包括，向常温下呈液态的油相A)中加入一种非离子表面活性剂B)、一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)、和非离子表面活性剂B)与含有成分E)的水溶液按重量比例1∶1至1∶20混合乳化产物，该成分E)为氨基酸或其盐和分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇，所述非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态；然后加入含有一种生物学上可接受的有效量抗原的水相D)，以使水相在油相中乳化。
11.一种如权利要求4所述的水包油包水型油性佐剂疫苗的制备方法，其步骤包括，向常温下呈液态的油相A)中加入一种非离子表面活性剂B)、一种聚氧乙烯(20至60摩尔)羟基脂肪酸甘油三酯C)、和非离子表面活性剂B)与含有成分E)的水溶液按重量比例1∶1至1∶20的混合乳化产物，该成分E)为氨基酸或其盐和分子中具有至少5个羟基的非还原性糖或糖醇，所述非离子表面活性剂是由一种具有至少三个羟基的多元醇和一种脂肪酸衍生而来的偏酯，在40℃下呈液态；然后加入含有一种生物学上可接受的有效量抗原的水相D)，以形成油包水型油性佐剂疫苗；将此油包水型油性佐剂疫苗加入到含有0.2至20％重量比乳化剂的水相F)中，以使油包水型油性佐剂疫苗在水相中乳化，所述乳化剂含有一种非离子表面活性剂，且总HLB值不小于10。
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TW (1) TW410158B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1320924C (zh) * 2005-01-07 2007-06-13 邢为藩 一种自乳化疫苗佐剂及其制备方法
CN1327898C (zh) * 2001-04-11 2007-07-25 耶达研究及发展有限公司 用作抗原载体的抗炎性脂肪醇和脂肪酸酯
WO2008000137A1 (fr) * 2006-06-20 2008-01-03 Schweitzer Co., Ltd. Préparation orale encapsulée destinée à des animaux aquatiques, son procédé de préparation et son utilisation
CN101111258B (zh) * 2005-01-19 2011-07-06 大日本住友制药株式会社 稀释用乳化组合物及癌疫苗组合物
CN103223164A (zh) * 2013-04-15 2013-07-31 华南农业大学 一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法
CN108578688A (zh) * 2018-04-03 2018-09-28 武汉轻工大学 多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9626865D0 (en) * 1996-12-24 1997-02-12 Cyanamid Websters Pty Limited Veterinary vaccines
IS4518A (is) * 1997-07-09 1999-01-10 Lyfjathroun Hf, The Icelandic Bio Pharmaceutical Group Nýtt lyfjaform fyrir bóluefni
EP1023083A4 (en) * 1997-10-17 2006-06-14 Wyeth Corp VETERINARY VACCINES
US6225289B1 (en) * 1998-12-10 2001-05-01 Genvec, Inc. Methods and compositions for preserving adenoviral vectors
AU769539B2 (en) 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
JP2001131087A (ja) * 1999-11-05 2001-05-15 Chemo Sero Therapeut Res Inst オイルアジュバントワクチン
EP1104767A1 (en) 1999-11-30 2001-06-06 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mono- and disaccharide derivatives containing both fatty acid ester and sulfate ester groups
DE50012404D1 (de) * 2000-08-11 2006-05-11 Lohmann Animal Health Gmbh W/o Emulsion Adjuvanszuzammensetzungen für Impstoffen
DE10113284A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Heinrich Exner Adjuvans-Emulsion und Verfahren zu deren Verwendung
AU2002333194B2 (en) * 2001-08-16 2006-05-04 Lyfjathroun H.F., Biopharmaceuticals A method of producing antibodies ex-vivo
UY27412A1 (es) * 2002-08-12 2003-06-30 Carlson Internat Inc Un nuevo producto para el combate de garrapatas y el proceso para la prepaacinn.
CU23476A1 (es) * 2004-01-29 2009-12-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Formulación adyuvante conteniendo una emulsión oleosa con aceite de jojoba
FR2878746B1 (fr) * 2004-12-02 2007-02-23 Vetoquinol Sa Sa Nouvelle composition pharmaceutique utilisable dans le domaine des vaccins
DK1909830T3 (da) * 2005-08-02 2011-12-19 Novartis Vaccines & Diagnostic Formindskelse af interferens mellem olieholdige adjuvanser og antigener indeholdende overfladeaktivt middel
JP2009509970A (ja) * 2005-09-22 2009-03-12 プロサイ インコーポレイテッド 酵母突然変異体において産生されるグリコシル化ポリペプチドおよびその使用方法
JP5135852B2 (ja) * 2007-03-30 2013-02-06 日油株式会社 可溶化用組成物
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
KR20150033703A (ko) 2012-06-27 2015-04-01 오르반 바이오테크 엘엘씨 당뇨병 치료를 위한 ctla4 융합 단백질
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
JP6789631B2 (ja) 2015-12-22 2020-11-25 ロレアル Ｓｐｆ及びレオロジーを改善するための高内相エマルション組成物

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2313078A1 (fr) * 1975-02-07 1976-12-31 Anvar Composition a base d'huile vegetale metabolisable et d'eau, utilisable notamment pour la constitution de preparations adjuvantes, ces preparations adjuvantes et leur procede d'obtention
US4933179A (en) * 1983-08-22 1990-06-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Feline leukemia virus antigen vaccines
US4606918A (en) * 1983-08-22 1986-08-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
JPS60199833A (ja) * 1984-03-26 1985-10-09 Meiji Milk Prod Co Ltd 医薬品、化粧品等用ｗ／ｏ／ｗ型複合エマルジヨンの製造法
JPH0647533B2 (ja) * 1984-08-10 1994-06-22 裕 水島 ４−ビフエニリル酢酸系化合物含有脂肪乳剤
SE8505047L (sv) * 1985-10-25 1987-04-26 Nutritional Int Res Inst Fettemulsion
FR2649013B1 (fr) * 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
FR2649012B1 (fr) * 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
AU668509B2 (en) * 1991-04-19 1996-05-09 Affinity Biotech, Inc. Convertible microemulsion formulations
JP2913229B2 (ja) * 1991-10-21 1999-06-28 塩野義製薬株式会社 油性アジュバントワクチン製剤
JPH0681731A (ja) * 1992-03-31 1994-03-22 Frontier Maaketeingu:Kk 内燃機関等の燃焼用空気の改質装置
JP3095537B2 (ja) 1992-07-27 2000-10-03 松下電工株式会社 汚水処理装置
JPH06172216A (ja) 1992-12-04 1994-06-21 Norin Suisanshiyou Kachiku Eisei Shikenjo 乳液状オイルアジュバント
FR2702373B1 (fr) * 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1327898C (zh) * 2001-04-11 2007-07-25 耶达研究及发展有限公司 用作抗原载体的抗炎性脂肪醇和脂肪酸酯
CN1320924C (zh) * 2005-01-07 2007-06-13 邢为藩 一种自乳化疫苗佐剂及其制备方法
CN101111258B (zh) * 2005-01-19 2011-07-06 大日本住友制药株式会社 稀释用乳化组合物及癌疫苗组合物
WO2008000137A1 (fr) * 2006-06-20 2008-01-03 Schweitzer Co., Ltd. Préparation orale encapsulée destinée à des animaux aquatiques, son procédé de préparation et son utilisation
CN103223164A (zh) * 2013-04-15 2013-07-31 华南农业大学 一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法
CN103223164B (zh) * 2013-04-15 2014-08-20 华南农业大学 一种水包油包水型佐剂疫苗及其制备方法
CN108578688A (zh) * 2018-04-03 2018-09-28 武汉轻工大学 多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法
CN108578688B (zh) * 2018-04-03 2022-02-11 武汉轻工大学 多重纳米乳疫苗佐剂的制备方法

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