CN1161612C - 生物传感器及血液成分分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的生物传感器及血液成分分析方法，是在图1所示的具有由单层或多层多孔质性材料构成的试剂保持部位、并使用色谱分析的生物传感器，试剂保持部位的至少一部分或比试剂保持部位更色谱上游侧的至少一部分上载持着细胞收缩剂。在这样构成的生物传感器及血液成分分析方法中，既使将全血作为检测体，也不增加费用，可以简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。

Description

生物传感器及血液成分分析方法
技术领域
本发明涉及一种分析血液成分的生物传感器及血液成分分析方法，特别涉及一种可降低血细胞等的细胞成分的影响的、可以以微量的检测体量简便且迅速地进行高精度地测定的生物传感器及血液成分分析方法。
背景技术
作为诊断人的健康状态的手段广泛地实行着血液的生化学检查。作为血液中的构成成分的代谢产物、蛋白质、脂质、电解质、酶、抗原、抗体等的种类或浓度在全血的状态下进行测定是困难的，通常将离心分离全血所获得的血浆或血清作为检测体进行测定。
可是，离心分离需要劳力和时间，特别是在想紧急处理少数的检体时、或在现场进行检查等时，需要使用离心分离机的离心法不适用。另外，相对由采血所获得的血液量来说由离心分离所获得的血清量或血浆量是少量的。
因此，作为即使将全血作为检测体也不受血细胞等的细胞成分的影响的血液成分分析方法，研究了例如日本特开昭57-53661号公报、及日本特开平8-54387号公报所揭示的那样的使用血细胞分离方法的血液成分分析方法和日本特开平9-196908号公报所揭示的那样的使用血液调整方法的血液成分分析方法，所述血细胞分离方法是使用平均直径为0.2～5μm、密度为0.1～0.5g/cm3的玻璃纤维滤纸使血液渗出来分离血浆和血清的方法，所述血液调整方法是通过在将氨基酸或无机盐的水溶液混合到全血中后滤出血细胞成分，避免血细胞堵塞过滤材料，用更少量的血液获得更大量的血浆或血清成分的方法。
另外还研究了特开平9-72904号公报所揭示的那样的、由载持在试片上的表面活性剂使血液溶血后，再用展开溶液将检测体溶液展开到试片上的方法。
但是，使用规定密度的玻璃纤维滤纸的方法虽然确实提高了血细胞分离效率，但是存在如下的问题：由于想要基本完全分离血细胞要花费相当多的时间而不能进行迅速地测定的问题；为了获得检查所需的检测体量不仅要需要大量的血液，而且由于血液的粘度和血细胞比容值因人而异，因此其分离效率产生个体差异，从而使测定精度非常低的问题。另外，由于需要特别的滤纸，也有成本变高的问题。
另外，在全血中添加了一定浓度的无机盐或氨基酸的水溶液后滤出血细胞成分的方法，虽然省去了离心分离的血细胞分离作业，但是，由于预先在血液中添加液进行处理的作业繁杂，因此不仅简易性低，而且其测定还需要时间。
另外，在预先使血液溶血的方法中，所谓溶血其基本原理是使用表面活性剂或皂甙等的溶血剂破坏血细胞的细胞膜中的脂质双层来粉碎血细胞细胞。若是极微量的血液，则通过在溶血后添加展开溶液也可以在色谱设备上。但是，在不用展开溶液时，由于细胞片被展开层堵塞，因此不可能展开没有展开溶液的采血后的血液检测体。
本发明是为了解决所述那样地问题而做出的，其目的是提供一种一步的生物传感器及血液成分分析方法，该一步的生物传感器及血液成分分析方法即使将全血作为检测体，也不增加费用，不用预先对血液进行任何处理，不需要用于展开检测体溶液的展开溶液，可以简单且迅速地进行高精度的血液成分分析。
技术方案
本发明第1项的生物传感器，是具有由单层或多层的多孔质性材料构成的试剂保持部位的、使用色谱分析的生物传感器，其特征在于，在所述试剂保持部位的至少一部分或从添加被检查溶液的试样添加部到所述试剂保持部位的区域的至少一部分上载持有使细胞成分收缩作用的细胞收缩剂。
在这样构成的生物传感器中，被添加的液体试样中的细胞成分通过与细胞收缩剂接触而收缩，细胞可以高效且即使不加展开溶液也充分地渗透色谱载体上，使流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血或细菌溶液作为检测体也可以不增加费用地、简便且迅速地进行高精度的分析。另外，在此所示的细胞收缩表示利用细胞的膜平衡性质、在可通过细胞膜的物质为高浓度的状态下借助细胞的渗透压的作用使细胞收缩的状态，所谓细胞收缩剂最好是具有借助渗透压的作用使细胞收缩的效果的物质。
本发明第2项是在第1项所记载的生物传感器中，所添加的液体试样是全血。
在这样构成的生物传感器中，不需要预先去除全血中的血细胞成分的操作，不增加费用，可以简便且迅速地进行高精度的分析。
本发明第3项是在第1项所记载的生物传感器中，所添加的液体试样是含有细菌的溶液。
在这样构成的生物传感器中，不需要进行预先除去或破碎细菌溶液中的细胞成分的操作，不增加费用，可以简便且迅速地进行高精度的分析。
本发明第4项是在第1项所记载的生物传感器中，所述细胞收缩剂是无机盐。
在这样构成的生物传感器中，被添加的液体试样中的细胞成分通过与无机盐接触而收缩，细胞可以高效且即使不加展开溶液也充分地渗透色谱载体上，使流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血或细菌溶液作为检测体也可以不增加费用地、简便且迅速地进行高精度的分析。
本发明第5项是在第1项所记载的生物传感器中，所述细胞收缩剂是氨基酸。
在这样构成的生物传感器中，被添加的液体试样中的细胞成分通过与氨基酸接触而收缩，细胞可以高效且即使不加展开溶液也充分地渗透色谱载体上，使流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血或细菌溶液作为检测体也可以不增加费用地、简便且迅速地进行高精度的分析。
本发明第6项是在第1项所记载的生物传感器中，所述细胞收缩剂是糖类。
在这样构成的生物传感器中，被添加的液体试样中的细胞成分通过与糖类接触而收缩，细胞可以高效且即使不加展开溶液也充分地渗透色谱载体上，使流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血或细菌溶液作为检测体也可以不增加费用地、简便且迅速地进行高精度的分析。
本发明第7项是在第1项所记载的生物传感器中，由自然干燥或风干使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的生物传感器中，细胞收缩剂的变性等少，可以高效地使细胞成分收缩。
本发明第8项是在第1项所记载的生物传感器中，由冷冻干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的生物传感器中，细胞收缩剂的结晶成为极细、容易溶解状态，可以在短时间内使细胞收缩。
本发明第9项是在第1项所记载的生物传感器中，由热干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的生物传感器中，可以短时间使细胞收缩剂干燥，可以使制造工程简易化。
本发明第10项是在第1项所记载的生物传感器中，所述细胞收缩剂的浓度是0.05～5.0M。
本发明第11项是在第1项所记载的生物传感器中，所述生物传感器是一步的免疫色谱分析试片。
在这样构成的生物传感器中，不需要预先处理含有全血等的细胞成分的液体试样，通过利用免疫反应、通过获得相对于测定对象的抗体或抗原可以测定宽领域的测定对象，在使用全血等的含有细胞成分的液体试样时，可以进行简易迅速的测定。在此所说的一步指的是，在其测定操作中不需要含有全血等的细胞成分的液体试样的预处理，只需将液体试样点样在试片上，不需要在点着液体试样前后用与液体试样不同的展开溶液、或进行将B/F分离作为目的的清洗操作等的操作。所谓免疫色谱分析试片指的是在色谱展开载体上利用抗原抗体反应进行液体试样中的被检测物质的检测的传感器。
本发明第12项是在第1项所记载的生物传感器中，所述生物传感器是干式分析要素。
在这样的分析传感器中，由于生物传感器整体是干燥载体，因此可以提供不仅运送容易而且不需要严格的保存环境和保存状态，操作容易、不需选择保存条件即可长期保存的生物传感器。在此所示的干式分析要素是表示构成生物传感器的全部的构件及被载持的试剂是干燥状态。
本发明第13项的血液成分分析方法，血液成分分析方法，是使用具有由单层或多层的多孔质材料构成的试剂保持部位的、利用色谱分析的生物传感器的血液成分分析方法，其中，在所述试剂保持部位的至少一部分或从添加被检查溶液的试样添加部到所述试剂保持部位的区域的至少一部分上载持有使细胞成分收缩作用的细胞收缩剂，通过在所述试样添加部添加了的被检查溶液的渗透，从载持着所述细胞收缩剂的区域溶解所述细胞收缩剂，通过溶解了的细胞收缩剂使被含在被检查溶液中的细胞成分收缩，分离收缩了的细胞成分，进行色谱展开。
在这样构成的血液成分分析方法中，即使不添加展开溶液也可以充分地进行渗透，使流动到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第14项是第13项所记载的血液成分分析方法中，添加的血液试样是全血。
在这样构成的血液成分分析方法中，不需要进行预先除去全血中的血细胞成分的操作，可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第15项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂是无机盐。
在这样构成的血液成分分析方法中，即使不添加展开溶液也能充分地渗透，使流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体，也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第16项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂是氨基酸。
在这样构成的血液成分分析方法中，即使不添加展开溶液也能充分地渗透，使流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体，也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第17项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂是糖类。
在这样构成的血液成分分析方法中，即使不添加展开溶液也能充分地渗透，使流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体，也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第18项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，由自然干燥或风干使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的血液成分分析方法中，因为可以以稳定的状态干燥载持所述细胞收缩剂的载体，因此可以抑制干燥中的细胞收缩剂的变性等。
本发明第19项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，由冷冻干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的血液成分分析方法中，细胞收缩剂的结晶极细成为容易溶解的状态，可以在短时间内使细胞成分收缩。
本发明第20项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，由热干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的血液成分分析方法中，载持细胞收缩剂的载体的干燥时间短，可以短时间使细胞收缩剂干燥，可以使制造工程简易化。
本发明第21项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂的浓度是0.05～0.3M。
在这样构成的血液成分分析方法中，可以使细胞成分收缩为最适当的大小，其结果可以提高细胞成分分离效率。
本发明第22项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，所述生物传感器是一步的免疫色谱分析试片。
在这样构成的血液成分分析方法中，由于不需要为了除去全血的细胞成分而预先进行离心分离等的预处理，通过利用免疫反应、通过获得相对于测定对象的抗体或抗原而可以测定广泛范围的测定对象，即使使用全血也可以以微量的血液量进行简易迅速的测定。
本发明第23项是在第13项所记载的血液成分分析方法中，所述生物传感器是干式分析要素。
在这样构成的血液成分分析方法中，由于生物传感器整体是干燥载体不仅运送容易，而且不需要严格的保存环境和保存状态，可以提供操作容易的血液成分分析方法。
根据本发明第24项的血液成分分析方法，血液成分分析方法，生物传感器具有由单层或多层的多孔质性材料构成的试剂保持部位，并利用色谱分析，在使用这样的生物分析传感器的血液成分分析方法中，在所述试剂保持部位的至少一部分或从添加被检查溶液的试样添加部到所述试剂保持部位的区域的至少一部分上载持有使细胞成分收缩作用的细胞收缩剂，通过在所述试样添加部添加了的被检查溶液的渗透，从载持着所述细胞收缩剂的区域溶解所述细胞收缩剂，通过溶解了的细胞收缩剂使被含在被检查溶液中的细胞成分收缩，在混合了收缩了的细胞成分的状态下进行色谱展开。
在这样的构成的血液成分分析方法中，不会堵塞色谱载体上，效率高，且即使不添加展开溶液也可充分地渗透，流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体，也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第25项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，添加的血液试样是全血。
在这样的构成的血液成分分析方法中，不需要进行预先除去全血中的血细胞成分的作业，可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第26项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂是无机盐。
在这样的构成的血液成分分析方法中，不会堵塞色谱载体上，效率高，且即使不添加展开溶液也可充分地渗透，流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体，也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第27项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂是氨基酸。
在这样的构成的血液成分分析方法中，不会堵塞色谱载体上，效率高，且即使不添加展开溶液也可充分地渗透，流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体，也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第28项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂是糖类。
在这样的构成的血液成分分析方法中，不会堵塞色谱载体上，效率高，且即使不添加展开溶液也可充分地渗透，流到色谱下游侧的液体量增加，即使将全血作为检测体，也可以不需花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
本发明第29项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，由自然干燥或风干使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的血液成分分析方法中，因为可以以稳定的状态干燥载持所述细胞收缩剂的载体，因此可以抑制干燥中的细胞收缩剂的变性等。
本发明第30项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，由冷冻干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的血液成分分析方法中，细胞收缩剂的结晶极细成为容易溶解的状态，可以在短时间内使细胞成分收缩。
本发明第31项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，由热干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
在这样构成的血液成分分析方法中，载持细胞收缩剂的载体的干燥时间短，可以抑制干燥中的细胞收缩剂的变性。
本发明第32项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，所述细胞收缩剂的浓度是0.1～5.0M。
在这样构成的血液成分分析方法中，可以使细胞成分收缩为最适当的大小，其结果可以在载体上不堵塞地使全血渗透。
本发明第33项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，所述生物传感器是一步的免疫色谱分析试片。
在这样构成的血液成分分析方法中，由于不需要为了除去全血的细胞成分而预先进行离心分离等的预处理，通过利用免疫反应、通过获得相对于测定对象的抗体或抗原而可以测定广泛范围的测定对象，即在使用含有全血等的细胞成分的液体试样时，可以提供可进行简易迅速的测定的血液成分分析方法。
本发明第34项是在第24项所记载的血液成分分析方法中，所述生物传感器是干式分析要素。
在这样构成的血液成分分析方法中，由于生物传感器整体是干燥载体不仅运送容易，而且不需要严格的保存环境和保存状态，可以提供操作容易的血液成分分析方法。
附图的简要说明
图1是表示本发明的实施方式1的使用了色谱分析的横型生物传感器的图。
图2是表示本发明的实施方式1的横型传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的图。
图3是本发明的实施方式2的使用了色谱分析的纵型生物传感器的分解立体图。
图4是从试样添加部侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的立体图。
图5是从吸水部侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的立体图。
图6是表示本发明的实施方式2的纵型传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的立体图。
图7是从收缩剂保持部位侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的立体图。
图8是从吸水部侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的立体图。
图9是表示本发明的实施例1的横型传感器的、与收缩剂浓度的变化对应的反应层上的溶液渗透速度的图。
图10是表示本发明的实施例2的纵型传感器的、与收缩剂浓度的变化对应的向反应层的血细胞附着率的图。
实施本发明的最佳形式
以下，参照附图说明本发明的实施方式。在此所示的实施方式只是一例，本发明不限定于该实施方式。
(实施方式1)
图1是表示本发明的实施方式1的使用了色谱分析的横型生物传感器的图。
如图1所示，本实施方式1的生物传感器在由塑料等构成的载体支承体1的上部形成着试样添加部2、收缩剂保持部位8、标记试剂保持部位3、反应层4、特异性蛋白质固定化部5、吸水部6。所述试样添加部2由吸收性大的无纺布或玻璃纤维滤纸等构成，用于添加或涂敷液体试样。所述收缩剂保持部位8将具有使细胞成分收缩的作用的细胞收缩剂可溶解地保持在无纺布或玻璃纤维滤纸上。所述标记试剂保持部位3将与分析对象物进行某些反应的标记试剂可溶解地保持在无纺布或玻璃纤维滤纸上。所述反应层4由硝化纤维素构成。所述特异性蛋白质固定化部5将特异性蛋白质固定化于反应层4的区域上。所述吸水部6最终性地吸收液体试液。
收缩剂保持部位8所保持的细胞收缩剂例如指的是无机盐、氨基酸及糖类等。此处的无机盐指的是指氯化钠或氯化钾、磷酸钠等的包括盐的无机化合物。另外，此处的氨基酸指的是指甘氨酸或谷氨酸等的在同一分子内具有羧基和氨基的化合物，也包括脯氨酸或羟基脯氨酸那样的亚氨基酸。另外，此处的糖类指的是葡萄糖或蔗糖、海藻糖等的糖质或、山梨醇等的糖醇。
另外，所谓分析对象物和标记试剂的某些反应指的是诸如抗原抗体反应的配基和配体的特异性结合反应、或酶反应等的任意的特异性反应。
另外，标记试剂保持部位3所保持的标记试剂指的是金胶体等的金属溶胶、非金属溶胶、染料溶胶、着色粒子、色素、酶、蛋白质等。
以下对使用了本实施例1的生物传感器的血液成分分析方法进行说明。
首先将全血或细菌溶液等的含有细胞成分的液体试样添加到试样添加部2上，当该添加的液体试样到达收缩剂保持部位8时，被保持在收缩剂保持部位8中的收缩剂由于液体试样的渗透而被溶解，使细胞成分收缩。由此，液体试样即使在内含细胞成分的状态下也不会引起堵塞而向色谱下游侧渗透。
接着，内含收缩的细胞成分的液体试样到达标记试剂保持部位3时，保持在标记试剂保持部位3上的标记试剂由于液体试样的渗透而被溶解，渗透到反应层4。
然后，在反应层4的区域上的特异性蛋白质固定化部5处，进行与从标记试剂保持部位3溶出的标记试剂的反应，这时，如果在液体试样中存在分析对象物，则在特异性蛋白质固定化部5上呈现某种显色反应。
最终，液体试样被吸水部6吸收，反应结束。
这样，按照本实施方式1的生物传感器及血液成分分析方法，由于保持在收缩剂保持部位的细胞收缩剂使液体试样中的细胞成分收缩，因此即使在含有细胞成分的状态下，液体试样也不会产生堵塞而渗透到色谱下游侧，即使将全血或细菌溶液作为检测体，也可以不预先预处理检测体地展开检测体，有需要用于将检测体溶液向色谱下游方向展开的展开溶液，因此可以不花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
另外，本实施方式1的生物传感器也可以是省去其试样添加部而在反应层上直接添加试剂的构造。
图2表示本发明的实施方式1的横型传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的图。
通过如图2所示地使收缩剂保持部位兼作试样添加部，可以降低构件数量及工序数量。
另外，所述实施方式1的生物传感器是由多个构件构成的，但是不限定于此，也可以由在由硝化纤维素等多孔性材料构成的反应层上形成收缩剂保持区域、标记试剂保持区域、特异性蛋白质固定化部的单层构件构成，该收缩剂保持区域可溶解地保持收缩剂，该标记试剂保持区域可溶解地保持标记试剂，该特异性蛋白质固定化部使特异性的蛋白质固定化。
另外，本发明的生物传感器也可以是干式分析要素，在此所示的干式分析要素指的是构成生物传感器的所有的构件及被载持的试剂是干燥状态。通过这样地使试片成为干燥状态，由于生物传感器整体是干燥载体，不仅搬运容易，而且不需要严格的保存环境和保存状态，操作容易，可以进行不要求保存条件的长期保存。
另外，本发明的生物传感器也可以是具有一步的免疫色谱分析试片的生物传感器。此处所示的一步指的是这样的操作，即，在其测定操作中，不需要对全血等的含有细胞成分的液体试样进行预处理，只要将液体试样点样在试片上即可，在点样液体试样前后不需要在试片上使用与液体试样不同的展开溶液或进行清洗操作。所谓免疫色谱分析试片指的是在进行色谱展开的载体上利用抗原抗体反应进行液体试样中的被检测物质的检测的传感器。这样，通过将试片构成为一步的免疫色谱分析试片，不需要预先预处理全血等的含有细胞成分的液体试样，通过利用免疫反应，通过获得相对于测定对象的抗体或抗原，可以测定广泛范围的测定对象，在使用了全血等的含有细胞成分的液体试样的情况下，可以进行简易迅速的测定。
(实施方式2)
图3是本发明的实施方式2的使用了色谱分析的纵型生物传感器的分解立体图。
如图3所示，本实施方式2的生物传感器通过层合试样添加部12、收缩剂保持部位18、标记试剂保持部位13、反应层14、特异性蛋白质固定化部15、吸水部16、结果确认窗19而构成。所述试样添加部12由吸收性大的无纺布或玻璃纤维滤纸等构成，用于添加或涂敷液体试样。所述收缩剂保持部位18将具有使细胞成分收缩的作用的细胞收缩剂可溶解地保持在无纺布或玻璃纤维滤纸上。所述标记试剂保持部位13将与分析对象物进行某些反应的标记试剂可溶解地保持在无纺布或玻璃纤维滤纸上。所述反应层14由硝化纤维素构成。所述特异性蛋白质固定化部15将特异性蛋白质固定化于反应层14的区域上。所述吸水部16最终性地吸收液体试液。所述结果确认窗19用于观看反应层14上的结果。
收缩剂保持部位18所保持的细胞收缩剂例如指的是无机盐、氨基酸及糖类等。此处的无机盐指的是指氯化钠或氯化钾、磷酸钠等的包括盐的无机化合物。另外，此处的氨基酸指的是指甘氨酸或谷氨酸等的在同一分子内具有羧基和氨基的化合物，也包括脯氨酸或羟基脯氨酸那样的亚氨基酸。另外，此处的糖类指的是葡萄糖或蔗糖、海藻糖等的糖质或、山梨醇等的糖醇。
另外，所谓分析对象物和标记试剂的某些反应指的是诸如抗原抗体反应的配基和配体的特异性结合反应、或酶反应等的任意的特异性反应。
另外，标记试剂保持部位13所保持的标记试剂指的是金胶体等的金属溶胶、非金属溶胶、染料溶胶、着色粒子、色素、酶、蛋白质等。
图4是从试样添加部侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的立体图。图5是从吸水部侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的立体图。
以下对使用了本实施方式2的生物传感器的血液成分分析方法进行说明。
首先将全血或细菌溶液等的含有细胞成分的液体试样添加到试样添加部12中，当该添加的液体试样到达收缩剂保持部位18时，被保持在收缩剂保持部位18中的收缩剂由于液体试样的渗透而被溶解，使细胞成分收缩。
接着，内含收缩的细胞成分的液体试样到达标记试剂保持部位13时，保持在标记试剂保持部位13上的标记试剂由于液体试样的渗透而被溶解，收缩的细胞成分被标记试剂保持部位13中的无纺布或玻璃纤维滤纸的纤维纠缠而被分离。由此，液体成分迅速地渗透到反应层14。
然后，在反应层14的区域上的特异性蛋白质固定化部15处，进行与从标记试剂保持部位13溶解出的标记试剂的反应，这时，如果在液体试样中存在分析对象物，则在特异性蛋白质固定化部15上呈现某种呈色反应。
最终，液体试样被吸水部16吸收，反应结束。
这样，按照本实施方式2的生物传感器及血液成分分析方法，由于保持在收缩剂保持部位的细胞收缩剂使液体试样中的细胞成分收缩，因此被层合在下部的构件的纤维纠缠而被分离，液体成分迅速地渗透到反应层，即使将全血或细菌溶液作为检测体，也可以不花费费用地、简便且迅速地进行高精度的血液成分分析。
另外，本实施方式2的生物传感器也可以是省去其试样添加部而在反应层上直接添加试样的构造。
图6是表示本发明的实施方式2的纵型传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的立体图，图7是从收缩剂保持部位侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的立体图，图8是从吸水部侧看到的本发明的实施方式2的纵型生物传感器的省去了试样添加部而使收缩剂保持部位兼作试样添加部的立体图。
如图6～图8所示，通过使收缩保持部位兼作试样添加部，可以减少构件数及工序数。
所述实施方式1及实施方式2的生物传感器中使用着由硝化纤维素或无纺布、或玻璃纤维滤纸那样的任意的多孔质性载体构成的色谱分析材料，一般，由这样的材料构成的色谱传感器使用例如抗原抗体反应那样的任意的特异性反应所产生的测定原理，分析检测出某特定物质，具有定性或定量的功能。在此，在所述实施方式1及2中将使用标记物的抗原抗体反应作为例子进行了说明，但不限定于此，只要是向酶那样地在反应前后产生某种变化使用什么都可以。
另外，本发明的生物传感器也可以是干式分析要素，在此所示的干式分析要素指的是构成生物传感器的所有的构件及被载持的试剂是干燥状态。通过这样地使试片成为干燥状态，由于生物传感器整体是干燥载体，不仅搬运容易，而且不需要严格的保存环境和保存状态，操作容易，可以进行不要求保存条件的长期保存。
另外，本发明的生物传感器也可以是具有一步的免疫色谱分析试片的生物传感器。此处所示的一步指的是这样的操作，即，在其测定操作中，不需要对全血等的含有细胞成分的液体试样进行预处理，只要将液体试样点样在试片上即可，在点样液体试样前后不需要在试片上使用与液体试样不同的展开溶液或进行清洗操作。所谓免疫色谱分析试片指的是在进行色谱展开的载体上利用抗原抗体反应进行液体试样中的被检测物质的检测的传感器。这样，通过将试片构成为一步的免疫色谱分析试片，不需要预先预处理全血等的含有细胞成分的液体试样，通过利用免疫反应，通过获得相对于测定对象的抗体或抗原，可以测定广泛范围的测定对象，在使用了全血等的含有细胞成分的液体试样的情况下，可以进行简易迅速的测定。
(实施例)
由以下的实施例进一步详细说明实施本发明的方法。另外，本发明不受以下的实施例任何制约。
实施例1
(利用了频分析的横型生物传感器的全血中hCG的定性)
制造在硝化纤维素膜中包括抗hCG-β抗体固定化线、及hCG-α抗体和金胶体的复合体的宽带的免疫生物传感器。该生物传感器是图1所示那样的形状的横型生物传感器，它是如下地制造的。
a)生物传感器的调制
准备用磷酸缓冲溶液稀释而调整了浓度的抗hCG-β抗体溶液。将该溶液用溶液排出装置涂敷在硝化纤维素膜上。由此，在硝化纤维素膜上获得检测用的抗体固定化线。在将该硝化纤维素膜干燥后，浸渍到含有1％脱脂乳的Tris-HCl缓冲溶液中进行30分钟缓慢的振摇。在30分钟后，将膜转移到Tris-HCl缓冲溶液中，在缓慢地振摇10分钟后，用另外的Tris-HCl缓冲溶液槽在缓慢地振摇10分钟，进行膜的清洗。在进行了两次清洗后，将膜从液槽中取出，在室温下使其干燥。
金胶体通过在0.01％氯金酸的回流中的100℃溶液添加1％柠檬酸溶液进行调制。再继续回流30分钟后，在室温下放置冷却。用0.2M的碳酸钾溶液调为pH9的所述金胶体溶液中添加抗hCG-α抗体并搅拌数分钟后，添加pH9的10％BSA(牛血清白蛋白)溶液并进行搅拌使最终浓度达到1％，由此调成了抗体—金胶体复合体(标记抗体)。通过在4℃、20000G状态下50分钟离心分离所述标记抗体溶液，分离标记抗体，在将其悬浊在清洗缓冲液(1％BSA·磷酸缓冲液)后，进行所述离心分离，清洗并分离标记。在将该标记抗体用清洗缓冲液悬浊并用0.8μm的过滤器过滤后，调制为当初的金胶态溶液量的1/10，并在4℃下储藏。
在将所述标记抗体溶液装入溶液排除装置并涂敷在与抗hCG-β抗体固定化干燥膜上的抗体固定化位置相分离的位置上后，使膜干燥。由此，在固定化膜上获得标记试剂保持部位。
将调制为0.15M的氯化钾水溶液每单位面积0.1ml点着在无纺布上后，立即用液氮冻结，进行冷冻干燥。由此获得了含浸着氯化钾的收缩剂保持构件。
将含有这样地被调制的标记试剂保持部位的抗体固化膜贴在载体支承体上作为收缩剂保持构件和试样添加部的无纺布，将玻璃纤维滤纸作为吸水部，切断为0.5cm宽度的细片，制成生物传感器。
b)试样的调制
添加了作为抗凝剂的肝素的人的血液调制为血细胞比容45％。通过在该血液中添加已知浓度的hCG，调制成各种各样的已知浓度的hCG溶液。
c)生物传感器上的显色状况的测定
在生物传感器上的试样添加部上添加150μl左右的含有hCG的全血，并向吸水部方向进行展开处理，使抗原抗体反应而进行抗体固定化部处的显色反应。目视并确认自向该生物传感器添加试样起5分钟后的呈色状况。再测定经过生物传感器上的反应层2cm浸透到色谱下游侧所需要的时间。
图9是表示本发明的实施例1的横型生物传感器的收缩剂浓度变化所带来的反应层上的溶液浸透速度的图。具体地讲，是表示将KCl浓度变更为0.01M、0.1M、0.15M、5M，将载持了各浓度的KCl溶液的收缩剂保持部位3组装入传感器，添加了血细胞比容45％的血液时的血液浸透反应层2cm所需要的时间，在完全不含KCl时，浸透需要大约1小时，但是当KCl浓度变增大到0.01M、0.1M、0.15M、5M时，浸透时间缩短。
从以上的结果可知，设在本实施例的横型生物传感器上的保持细胞收缩剂的区域与反应层上的浸透速度的缩短有很大的关系。
通过将细胞收缩剂的浓度设定为0.1M～0.5M，可以将细胞成分收缩为最适当的大小，结果全血不会堵塞在载体上而迅速地浸透。
另外，在本实施例1中，由于由冷冻干燥使载持着细胞收缩剂的载体(在本实施例中是氯化钾水溶液)干燥，因此，细胞收缩剂的结晶极细而成为容易溶解的状态，可以短时间使细胞成分收缩。
另外，在本实施例中，是由冷冻干燥使载持着细胞收缩剂的载体干燥的，但也不限定于此，也可以由自然干燥或风干使其干燥。由此，细胞收缩剂的变性等变少，可以高效率地使细胞成分收缩。另外，也可以由热干燥使载持细胞收缩剂的载体干燥。由此，可以短时间使细胞收缩剂干燥，可以实现制造工程的简易化。
另外，本实施例的生物传感器使用硝化纤维素或玻璃纤维滤纸那样的由任意的多孔制性载体构成的色谱分析材料，一般由这样的材料构成的生物传感器例如具有用抗原抗体反应那样的任意的特异性测定原理分析检测某特定物质进行定性或定量的功能。在此，在本实施例1中，将使用了标记物的抗原抗体反应作为例子进行了说明，但不限定于此，只要向酶那样地在反应的前后产生某些变化的物质什么都可以使用。
另外，作为试样添加部作为例子举出了将由将无纺布或玻璃纤维滤纸作为吸水部的多个多孔制型载体构成的试片，但是，也可以去掉无纺布和玻璃纤维滤纸，而做成为具有固定化在多孔质载体上的抗体固定化部和可溶出的那样地保持标记试剂的标记试剂保持部位、可溶出地保持细胞收缩剂的收缩剂保持部位的单层的构造。
实施例2
(利用了色谱分析的纵型生物传感器的全血中hCG的定性)
制造由含有抗hCG-β抗体固定化区域的硝化纤维素薄膜、含有由抗hCG-α抗体和金胶体的复合体构成的标记物的标记试剂保持部位、含有使被添加的血液中的血细胞收缩的血液收缩剂保持部位构成的生物传感器。该生物传感器是图3所示那样的形状的纵型生物传感器。该生物传感器如下地制造。
a)生物传感器的调制
作为试样添加部，准备了玻璃纤维滤纸100(Advantec制)。
收缩剂保持部位，制备NaCl水溶液，将140μl的该水溶液点着在玻璃纤维滤纸GA100(Advantec制)上，立即用液氮冻结，然后进行冷冻干燥。由此调制收缩保持部位。
金胶体，是通过在0.01％氯化金酸的回流中的100℃溶液添加1％柠檬酸溶液进行调制。再持续回流30分钟后，在室温下放置冷却。由0.2M的碳酸钾溶液调制为pH9的所述金胶体溶液中添加抗hCG-α抗体并搅拌数分钟后，添加pH9的10％BSA(牛血清白蛋白)溶液并进行搅拌使最终浓度达到1％，由此调成了抗体—金胶体复合体(标记抗体)。通过在4℃、20000G状态下50分钟离心分离所述标记抗体溶液，分离标记抗体，在将其悬浊在清洗缓冲液(1％BSA·磷酸缓冲液)后，进行所述离心分离，清洗并分离标记。在将该标记抗体用清洗缓冲液悬浊并用0.8μm的过滤器过滤后，调制为当初的金胶体溶液量的1/10，并在4℃下储藏。
将该金胶体溶液点样在玻璃纤维滤纸GA100(Advantec制)上，立即用液氮冻结，然后进行冷冻干燥。由此调制成标记试剂保持部位。
准备用磷酸缓冲液稀释进行了浓度调整的抗hCG-β抗体溶液。用溶液吐出装置将该抗体溶液涂敷在硝化纤维素膜上。由此在硝化纤维素膜上获得检测用的抗体固定体区域。在将该硝化纤维素膜干燥后，浸渍到含有1％脱脂乳的Tris-HCl缓冲溶液中进行30分钟缓慢的振摇。在30分钟后，将膜移动到Tris-HCl缓冲溶液中，在缓慢地振摇10分钟后，在另外的Tris-HCl缓冲溶液槽再缓慢地振摇10分钟，进行膜的清洗。在进行了两次清洗后，将膜从液槽中取出，在室温下使其干燥，做成具特异性蛋白质固定化部的反应层。
吸水部准备了设有可以判定反应层的结果的结果确认窗的玻璃纤维滤纸GA200(Advantec制)。
如图3所示地层叠这样调制的构件，覆盖上壳体而形成生物传感器。
b)试样的调制
添加了作为抗凝固剂的肝素的人的血液调制为血细胞比容45％。通过在该血液中添加已知浓度的hCG，调制成各种各样的已知浓度的hCG溶液。
c)测定
在如上所述地组装的分析装置的试样添加部中添加200μl的含有hCG的血液，并向层合的生物传感器的下部方向展开处理，使抗原抗体反应进行抗体固定化部中的呈色反应。从处于生物传感器下部的结果确认窗目视从向该生物传感器添加试样起3分钟后的显色状况来进行确认。在分解测定结束了的生物传感器，确认血细胞向反应层的附着状况。
图10是表示本发明的实施例2的纵型生物传感器的收缩计浓度变化所带来的朝向反应层的血细胞附着率的图。具体地讲，是表示将NaCl浓度变更为0.05M、0.15M、0.20M、0.25M、0.30M、0.35M，将载持了各浓度的NaCl溶液的收缩剂保持部位3组装入传感器，确认添加了血细胞比容45％的血液时的血细胞到达反应层的次数的几率。在完全不含有NaCl时，看到了血细胞以100％的比例附在反应层上，但是，随着NaCl的浓度从0.05M增加，血细胞向反应层的附着率渐渐地降低，在0.35M时血细胞完全不附着。
从以上的结果可知，设在本实施例2的横型传感器上的保持细胞收缩剂的区域非常有助于提高检测体中的细胞成分的分离效率。
通过将细胞收缩剂的浓度设定为0.05M～0.3M，可以将细胞成分收缩为最适当的大小，结果在载体上不会堵塞全血而迅速地浸透。
另外，在本实施例1中，由于由冷冻干燥使载持着细胞收缩剂的载体(在本实施例中是氯化钠水溶液)干燥，因此，细胞收缩剂的结晶极细而成为容易溶解的状态，可以短时间使细胞成分收缩。
另外，在本实施例2中，是由冷冻干燥使载持着细胞收缩剂的载体干燥的，但也不限定于此，也可以由自然干燥或风干使其干燥。由此，细胞收缩剂的变性等变少，可以高效率地使细胞成分收缩。另外，也可以由热干燥使载持细胞收缩剂的载体干燥。由此，可以短时间使细胞收缩剂干燥，可以实现制造工程的简易化。
另外，本实施例2的生物传感器，将金胶体作为标记物使用，但也可以将酶标记在固定化抗体上，将可以产生由酶反应引起的呈色反应的试剂作为标记试剂使用。
另外，本实施例2的生物传感器使用硝化纤维素或玻璃纤维滤纸那样的由任意的多孔制性载体构成的色谱分析材料，一般由这样的材料构成的生物传感器例如具有用抗原抗体反应那样的任意的特异性测定原理分析检测某特定物质进行定性或定量的功能。在此，在本实施例2中，将使用了标记物的抗原抗体反应作为例子进行了说明，但不限定于此，只要向酶那样地在反应的前后产生某些变化的物质什么都可以使用。
产业上的可利用性
所述的本发明的生物传感器及血液成分分析方法，即使将全血作为检测体，也不会增加费用，不需要预先对血液进行任何处理，不需要用于展开检测体溶液的展开溶液，可以简便且迅速地进行高精度的血液成分分析，特别适合于一步的生物传感器及血液成分分析方法。

Claims (34)

1.生物传感器，是具有由单层或多层的多孔质性材料构成的试剂保持部位的、使用色谱分析的生物传感器，其特征在于，在所述试剂保持部位的至少一部分或从添加被检查溶液的试样添加部到所述试剂保持部位的区域的至少一部分上载持有使细胞成分收缩作用的细胞收缩剂。
2.如权利要求1所述的生物传感器，所添加的液体试样是全血。
3.如权利要求1所述的生物传感器，所添加的液体试样是含有细菌的溶液。
4.如权利要求1所述的生物传感器，所述细胞收缩剂是无机盐。
5.如权利要求1所述的生物传感器，所述细胞收缩剂是氨基酸。
6.如权利要求1所述的生物传感器，所述细胞收缩剂是糖类。
7.如权利要求1所述的生物传感器，由自然干燥或风干使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
8.如权利要求1所述的生物传感器，由冷冻干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
9.如权利要求1所述的生物传感器，由热干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
10.如权利要求1所述的生物传感器，所述细胞收缩剂的浓度是0.05～5.0M。
11.如权利要求1所述的生物传感器，所述生物传感器是一步的免疫色谱分析试片。
12.如权利要求1所述的生物传感器，所述生物传感器是干式分析要素。
13.血液成分分析方法，是使用具有由单层或多层的多孔质材料构成的试剂保持部位的、利用色谱分析的生物传感器的血液成分分析方法，其中，在所述试剂保持部位的至少一部分或从添加被检查溶液的试样添加部到所述试剂保持部位的区域的至少一部分上载持有使细胞成分收缩作用的细胞收缩剂，通过在所述试样添加部添加了的被检查溶液的渗透，从载持着所述细胞收缩剂的区域溶解所述细胞收缩剂，通过溶解了的细胞收缩剂使被含在被检查溶液中的细胞成分收缩，分离收缩了的细胞成分，进行色谱展开。
14.如权利要求13所述的血液成分分析方法，添加的血液试样是全血。
15.如权利要求13所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂是无机盐。
16.如权利要求13所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂是氨基酸。
17.如权利要求13所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂是糖类。
18.如权利要求1 3所述的血液成分分析方法，由自然干燥或风干使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
19.如权利要求13所述的血液成分分析方法，由冷冻干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
20.如权利要求13所述的血液成分分析方法，由热干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
21.如权利要求13所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂的浓度是0.05～0.3M。
22.如权利要求13所述的血液成分分析方法，所述生物传感器是一步的免疫色谱分析试片。
23.如权利要求13所述的血液成分分析方法，所述生物传感器是干式分析要素。
24.血液成分分析方法，生物传感器具有由单层或多层的多孔质性材料构成的试剂保持部位，并利用色谱分析，在使用这样的生物分析传感器的血液成分分析方法中，在所述试剂保持部位的至少一部分或从添加被检查溶液的试样添加部到所述试剂保持部位的区域的至少一部分上载持有使细胞成分收缩作用的细胞收缩剂，通过在所述试样添加部添加了的被检查溶液的渗透，从载持着所述细胞收缩剂的区域溶解所述细胞收缩剂，通过溶解了的细胞收缩剂使被含在被检查溶液中的细胞成分收缩，在混合了收缩了的细胞成分的状态下进行色谱展开。
25.如权利要求24所述的血液成分分析方法，添加的血液试剂是全血。
26.如权利要求24所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂是无机盐。
27.如权利要求24所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂是氨基酸。
28.如权利要求24所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂是糖类。
29.如权利要求24所述的血液成分分析方法，由自然干燥或风干使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
30.如权利要求24所述的血液成分分析方法，由冷冻干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
31.如权利要求24所述的血液成分分析方法，由热干燥使载持所述细胞收缩剂的载体干燥。
32.如权利要求24所述的血液成分分析方法，所述细胞收缩剂的浓度是0.1～5.0M。
33.如权利要求24所述的血液成分分析方法，所述生物传感器是一步的免疫色谱分析试片。
34.如权利要求24所述的血液成分分析方法，所述生物传感器是干式分析要素。
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