CN1166858A - tagA基因以及检测消化性溃疡和胃癌易感性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分离的核酸，该核酸编码幽门螺旋杆菌大约120-128千道尔顿抗原或其抗原的片段。其中该抗原与消化性溃疡有关。本发明也提供在被实验者中检测具120-128千道尔顿抗原幽门螺旋杆菌菌株存在的方法，其中包括用可检出量TagA抗原或本发明中的抗原多肽接触从被实验者中取出的含抗体样品的步骤和检测抗原或片段和抗体的结合。表达TagA抗原菌株的检测是消化性溃疡和胃癌的易感性的指示。同时提供不表达有功能TagA抗原的突变幽门螺旋杆菌。

Description

tagA基因以及检测消化性溃疡和胃癌易感性的方法
发明背景
幽门螺旋杆菌现在之所以被认为是一种重要的人类病原是因为它引起的慢性胃炎是消化性溃疡疾病发作的一种危险因素。同时越来越多的证据表明幽门螺旋杆菌持续感染是胃腺癌发作的危险因子(1，2)，尤其是端胃(3-5)。证据主要来自流行病研究(6-9)，包括成套的病例对照(nested case-control)研究(4，5，10)，而且分子和病理研究支持其生物学合理性(11)。然而，尽管基本上所有的感染者发生胃炎，但是临床幽门螺旋杆菌感染的这一结果只见于少数人中。而且，虽然幽门螺旋杆菌感染普遍见于胃癌病人，但大多数幽门螺旋杆菌感染者从来没有发展为这些肿瘤(12)。于是，鉴别其它能更精确确定幽门螺旋杆菌感染者危险的因素是相当重要的。
幽门螺旋杆菌菌株在遗传水平上高度多样，但大多数表型特征是高度保守的。而且，个体可被不止一种菌株感染(4，15)。于是，分离可能影响胃癌发作危险率的幽门螺旋杆菌菌株具体特征是很重要的。
最近识别出表型均一性的两个例外。首先，大约50％-60％幽门螺旋杆菌菌株在体外产生液泡化的细胞毒素(20，39)，而且，毒素的产生与消化性溃疡有关(40)。第二，是否在还原性十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上产生迁移在约120-128千道尔顿(KDa)间的抗原蛋白存在异质性(20)。最近对这种蛋白(可互换的称为TagA或CagA)的测量表明其分子量高达140KDa(23，41)。尽管毒性由一种87KDa蛋白介导，但毒素自己的产生与抗原120-128KDa蛋白的存在相关(20)。以前的研究已经发现约60-80％幽门螺旋杆菌分离物表达120-128KDa蛋白(20，42)。值得注意的是，血清或粘膜分泌物中抗120-128KDa蛋白的抗体的存在与消化性溃疡的存在相关(18，20)。
直到现在，关于毒素产生、溃疡或胃癌的关系知道得很少。这是因为以前首次看到120-128KDa抗原后不能进一步描述其特征。
以前的研究中，用western印迹观察120-128KDa抗原，但实际上没有显示其它的特征(20)。与western印迹观察抗原的便捷相反，其它的方法如银染(Cover等，1990(20)中图2)不能如此便捷的显示120-128KDa带。该现象解释为抗原与幽门螺旋杆菌其它蛋白相比只以少量存在。最近，Gerstenecker等(43)已报导在幽门螺旋杆菌分离出大约120KDa蛋白，后者与阳性人对照血清反应。但是，实际上还没有进行该抗原的特征(如N-末端序列分析)分析。
尽管纯化困难，本发明仍然提供了基因的克隆和序列并推定的编码120-128KDa蛋白的氨基酸序列。该数据由无需纯化120-128KDa抗原的方法获取。本发明同时提供诊断、治疗和预防的组合物和方法。
免疫印迹研究提示tagA+菌株感染者比那些分离出tagA-的病人具更高的胃炎和上皮细胞损伤程度(18)。感染tagA+幽门螺旋杆菌菌株的病人与未感染者和感染tagA-菌株的病人相比胃活组织检查中IL-1α，IL-1β和IL-8表达加强(19)。发炎和上皮损伤所程度可能参与了胃癌的发病机理(1)。于是，在此意义上研究表达tagA幽门螺旋杆菌菌株的重要性成为必需。
本发明提供一种基于tagA重组片段的新的血清测定方法和测定胃癌易感性的方法，从而满足这些要求。
发明概述
本发明提供一种分离的核酸，该核酸编码幽门螺旋杆菌大约120-128千道尔顿抗原或其抗原的片段。其中抗原与消化性溃疡有关。本发明也提供在被实验者中检测120-128千道尔顿抗原幽门螺旋杆菌菌株存在的方法，其中包括用可检出量tagA抗原或本发明中的抗原多肽接触从被实验者中取出的含抗体样品和检测抗体和片段的反应的步骤。
附图简述
图1显示质粒pMC1、pMC2和pMC3的物理图谱。pMC3下的大箭头表示tagA基因的定位和由缺失突变和免疫印迹测定的转录方向。小箭头表示外切核酸酶III衍生片段序列分析的DNA的链和长度。限制性内切酶切位点：B，BglII；Ba，BamHI；E，EcoRI；H，HindIII；N，NdeI：S，SacI。
图2表明用于幽门螺旋杆菌突变子的构建中的pMc3：Km的限制图谱。自pILL600的Km盒与pMC的NdeI位点连接产生pMC3：Km。箭头指示包含截短的2577bp tagA开放阅读框的开放阅读框。限制性位点是E，EcoRI；B，bglII；H，HindIII；Ba，BamHI；N，NdeI；S，SaI；Sm，SmaI。pMC4表示2.9Kb的pCM3 EcoRI到SacI片段。
图3表示质粒pMC3，pYB2，pUT2的物理图谱。pUT2下的大箭头指示tagA基因的定位和由缺失突变和免疫印迹测定的转录方向。限制性内切酶切位点：B，BglII；Ba，BamHI；E，EcoRI；EV，EcoRV；H，HindIII；N，NdeI：S，SacI：X，XbaI。
图4表示tagA中DNA片段的物理图谱，这些片段用于形成交迭的基因融合。箭头指示转录的方向。已指示出每一产物的大小。清楚的盒状区域表明这些基因具重复的核酸区域并且已测定用于表达该蛋白的免疫原性表位。
发明详述核酸
本发明提供一种分离的核酸，该核酸编码幽门螺旋杆菌大约120-128KDa抗原(TagA)的片段，该抗原与消化性溃疡有关。“分离”是指把它与其它用于临床诊断或科学研究自然有机体的核酸、蛋白质、或其它细胞成分彻底分开。编码120-128千道尔顿抗原的该核酸可以是tagA基因本身，它对表达120-128千道尔顿抗原的幽门螺旋杆菌菌株系是特异的。“特异”是指分离的序列与不表达该抗原的幽门螺旋杆菌菌株的核酸的杂交强度不会显著地高于背景。
这类分离核酸的一个实例是一个3543碱基对的开放阅读框，它含有4821碱基对插入片段(SEQ ID NO：3)的1072位至4614位核苷酸的部分。含全长tagA基因质粒的细胞系以ATCC登记号69273保藏于美国典型培养物保藏中心(1230 Parklawn Drive，Rockville MD 20852)。这种分离的幽门螺旋杆菌特异的核酸可用如聚合酶链式反应、连接酶链式反应和下文要进一步描述的杂交方法检测表达120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌。核酸或由此衍生的片段可位于一个合适的表达载体和宿主中，而且被用于产生在此要描述的全长的TagA蛋白。
编码120-128KDa抗原的抗原片段的核酸的实例是一个截短的2577碱基对的开放阅读框，后者包含3648碱基对插入片段(SEQ IDNO：1)1072位到3648位核苷酸的部分。这一特异的核酸可用于以聚合酶链式反应、连接酶链式反应和杂交方法测定具120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌。作为一个代替的方法，3648碱基对序列可在一个合适宿主的载体中而且可用于产生TagA的抗原片段。
编码120-128KDa抗原的抗原片段的核酸的另一个实施例是包含SEQ ID Nos：1和4(实施例4)的1921位到3648位核苷酸的tagA基因的重组片段(orv220)。这种特异的核酸可用于以聚合酶链式反应、连接酶链式反应和杂交方法测定具120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌菌株。作为一个代替的方法，3648碱基对序列可在一个合适宿主的载体中而且可用于产生TagA的抗原片段。
编码TagA其它抗原片段的核酸可由熟练的技术人员用常规方法和遵循在此描述的获得经典核酸的常规实验获得。另外一些获得一个已知分离核酸的核酸片段的方法，如限制消化，可用于更大的编码序列以获得编码抗原其它片段的核酸。如此获得的核酸可根据在此的实施例进行常规地抗原性、特异性的筛选。
只要维持了该核酸所编码的多肽的抗原性，编码TagA或其衍生的抗原片段的代表性核酸的核苷酸序列变化也被研究。同样，只要存在足以选择或特异性杂交的互补碱基，用作引物或探针的核酸即可有代替物(44)。
编码TagA抗原核酸的另一个实例是由基于遗传密码的简并性而获得的抗原的可替代的编码序列。已有TagA抗原(SEQ ID NO：3)的一种氨基酸序列时，技术人员可测定编码该抗原或抗原片段的核苷酸序列，并能用现有技术制备该核酸。
分离的核酸选择性地在聚合酶链式反应条件下与包括1072位到4618位核苷酸的核酸杂交，后者包含于定义在SEQ ID NO：3中的核酸序列；前者也倍受关注。术语“选择性”在此是指一种核酸在PCR条件下与所示核酸在背景或随机杂交下以可辨水平杂交，但可能与其它核酸在背景或随机杂交下清晰可辨地杂交。选择性杂交核酸可与以上核酸互补。序列相同的程度和杂交序列的长度可因特殊序列的应用目的而选择。若用作引物，本发明的组成包括至少两种选择性与不同区域杂交以扩增所需区域的核酸。在此提供代表性的PCR条件，如现有技术所熟知的一样，并且有PCR试剂和仪器的提供者授教。
分离的核酸与包括SEQ ID NO：3中定义的核苷酸1072到4614的核酸在以下条件下选择性杂交：在6×SSC，0.5％十二烷基磺酸钠，5×Denhardt’t液的缓冲液下68℃杂交16小时。0.5×SSC 60℃洗脱(实施例1，Southern杂交)。同时提供另外一些杂交条件的实例。特异的杂交条件不包括与非指定核酸杂交的核酸。于是，杂交核酸可与以上核酸的全部或片段互补，或具有与片段足够的互补性；它们的杂交可阻止核酸与其它自然伴随的核酸的结合。核酸能与之杂交的序列可基于核苷酸和特殊序列的使用而选择。例如，特异性杂交的核酸可用作探针检测具有与之杂交的核酸的有机体的存在。可替代地，杂交的核酸可编码在此提供的TagA的片段。
同时提供一种核酸，该核酸在严谨条件下与编码幽门螺旋杆菌TagA的核酸杂交并且至少70％和与之杂交的SEQ ID NO：3的核酸的片段和链互补。本发明的杂交核酸至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％和99％互补于与之杂交的范例序列的片段和链。核酸长度至少为18-4000核苷酸之下。于是，核酸可从另一tagA+菌株编码TagA，或可用作引物或探针以探测tagA+幽门螺旋杆菌的存在。
本发明提供这些幽门螺旋杆菌核酸的实例，以致在特异条件下从非特异杂交核酸中识别特异杂交所需的互补程度可清晰地测定每一核酸。根据用途(例如，分别作为引物/探针的编码序列)核酸可为单链或双链。应该明白的是，特异杂交的核酸不会与编码非相关蛋白的核酸杂交。
通过应用常规方法合成全长基因以及更短的核苷酸序列，本领域的技术人员可随意获取本发明的核酸。例如，获取如序列表中核酸的技术在申请中已专门提供。而且，本领域的另外一些方法几乎不进行明显改进就可直接应用。Ferretti等(75)和Wosnick等(76)提出合成已知序列基因的常规方法。更具体地说，Ferretti等详述了从合成的核苷酸合成1057碱基对的牛视紫红质基因。合成的基因与已知基因(第一句，603页)相当。此外，Wosnick等用有效的一步退火/连接方法合成玉米谷胱苷肽转移酶基因。该技术也以100％精确度产生一个完整的合成基因，从而证明了该技术路线的常规性。抗原
本发明中核酸编码的纯化抗原多肽也被关注。在此所用的“纯化的”指抗原几乎不含通常抗原伴随的污染物或细胞成分借此本抗原可以与污染物或成分区别开来。于是，纯化的抗原多肽足以与污染物分离，以致在临床诊断或其它一些实验方法中应用。本发明中纯化的大约120-128KDa全长抗原或抗原片段在此称为“抗原”“TagA抗原”或“cagA抗原”。
特异地，大约130KDa全长TagA抗原多肽(SEQ ID NO：4)由4281碱基对插入片段中的3543碱基对开放阅读框编码，基本由SEQ IDNO：3定义核苷酸中的核苷酸1072-4614编码的氨基酸组成。
大约96KDa TagA抗原片段由3648碱基对克隆插入片段内的2577碱基对的开放阅读框编码，基本由SEQ ID NO：1定义核苷酸中的核苷酸1072-3648编码的氨基酸组成。
另外一个TagA抗原片段由一个开放阅读框编码(orv220)，基本由序列表中SEQ ID NO：1所定义核苷酸中的核苷酸1921-3648编码的氨基酸组成。
应用表位作图的常规技术可选择抗原的一个抗原片段以测定与血清抗体反应的含表位或在动物中能够诱发免疫应答的蛋白区域。一旦选定表位，含表位的多肽可直接合成，或根据标准方法在表达系统中克隆编码多肽的核酸重组产生表位。可替代地，抗原的一个抗原片段可由化学或机械剪切从整个抗原或较大的抗原片段中分离。于是获取的纯化片段可用在此详述的方法测定其抗原性和特异性。抗原片段定义为与抗体反应的抗原氨基酸序列中至少5个连续氨基酸的一段氨基酸序列。
一旦提供了抗原多肽的氨基酸序列，抗原多肽可根据天然抗原的氨基酸序列设计，但在推测的序列中以替代、插入或缺失氨基酸残基的方式修饰。修饰可能包括将抗原重点放在给设计的序列增加额外的特性，比如可溶性。修饰也可能包括其它氨基酸以提供一些另外的特性，例如删/增能形成二硫键的氨基酸以增加生物学寿命、改变酶学活性或改变与胃酸度的相互作用。无论如何，该肽必须具有生物活性，例如，抗原性、免疫原性、特异性等。如此设计的多肽可用在此描述的方法测试其抗原性、免疫原性和特异性。然后用标准的多肽合成技术合成多肽。于是，有可能从TagA的代表性序列中得出相当大量多肽的合成和纯化。测定免疫原性
纯化的抗原多肽可通过测试以确定其免疫原性和特异性。简而言之，制备待试具免疫原性的特异片段的不同浓度并施用于动物，然后测定动物对每一浓度的免疫应答(例，抗体的产生或细胞介导的免疫)。抗原施用量依赖于被实验者，如人或豚鼠，被实验者的状态、被实验者的大小等。然后这样用抗原接种的动物暴露于细菌以测定对特异抗原的疫苗效应。接种动物的测试血清、其它流体或淋巴细胞与其它相近细菌交叉反应可探知片段的特异性。载体和宿主
也提供包括本发明核酸的载体。本发明的载体可在一适于表达核酸编码多肽的宿主中存在。以下的实施例中提供载体和宿主的特别的实施例。
对本领域的技术人员而言，有大量的大肠杆菌表达载体可用于表达抗原。另外一些合适的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌，和其它肠杆菌科，如沙门氏菌，沙雷氏菌和各种假单孢菌种类。这些原核宿主中也可产生表达载体，它们常包含与宿主相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，可存在很多熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或λ噬菌体的启动子系统。启动子通常控制表达，例如，可选择地带有一操纵子序列，并且具核糖体结合位点序列以启动和完成转录和翻译。若为必需，氨基末端甲硫氨酸可由Met密码子5’插入提供并与抗原同阅读框。同时，抗原羧基末端的延长可用标准寡聚核苷酸突变方法去除。
此外，可应用酵母表达。酵母表达系统有如下几个的优点。第一，有证据表明酵母分泌系统产生的蛋白呈现正确的二硫键配对。第二，酵母分泌系统可有效的进行转录后糖基化。啤酒糖酵母前α-因子原引导区(由MFα-1基因编码)通常用于从酵母中指导蛋白分泌(45)。前α-因子原引导区包含一个信号肽和含识别KEX2基因编码的酵母蛋白酶序列的pro-部分。酵母蛋白酶在赖氨酸-精氨酸肽键羧基端切断前体蛋白形成信号序列。编码抗原序列可与前α-因子原引导区按阅读框融合。然后将该构建物置于强的启动子，如乙醇脱氢酶I启动子或糖酵解启动子的控制下。抗原编码序列后随一个翻译终止密码子，后者又为转录终止信号跟随。可替代地，抗原编码序列可与第二个蛋白编码序列，如Sj26或β半乳糖苷酶，融合以便于用亲和层析纯化融合蛋白。在蛋白酶切位点插入以分离融合蛋白成分可被用于在酵母中表达的构建物。
哺乳动物细胞能够在良好的转录后修饰中表达，如折叠和半胱氨酸配对、添加复杂的碳水化合物结构和活性蛋白的分泌。哺乳动物细胞中抗原表达的有效载体其特征在于在强的病毒启动子和多聚腺苷酸化信号中插入编码序列抗原。载体可能含庆大霉素或氨甲蝶呤抗性基因用作选择标记。抗原和免疫反应片段编码序列可用氨甲蝶呤抗性编码载体转导入中国仓鼠卵巢细胞。转化细胞中载体DNA的存在可由Sourthern分析确证，而与抗原编码序列对应的RNA的产生可由Northern分析确证。大量其它合适的能分泌完整的人蛋白宿主细胞系在本领域中已经形成，包括CHO细胞系、Hela细胞、骨髓瘤细胞系、Jurkt细胞系等。这些细胞的表达载体包括表达控制序列，如复制起始点，启动子、增强子和必需的信息处理位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列为免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。根据细胞宿主的类型可用熟知的方法将含目标DNA部分的载体转入宿主细胞。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可能用于其它细胞宿主。
类似于已用于人γ干扰素、组织血纤维溶酶原激活子、凝血因子VIII、乙型肝炎病毒表面抗原、Nexin1蛋白酶和嗜曙红细胞主要碱性蛋白等在哺乳细胞中抗原病毒的替代载体均可使用。而且，载体可包括哺乳细胞(如COS7)插入DNA表达的CMV启动子序列和多聚腺苷酸化信号。
序列可操作地与表达控制序列连接，即定向以保证正确的表达，然后DNA序列可在宿主中表达。这些表达载体无论作为附加体还是宿主染色体DNA的整合部分在宿主有机体中可复制。通常，表达载体可含选择标记，例如四环素抗性或潮霉素抗性，便于推测和/或选择转染有所需DNA序列的细胞(参看，如美国专利4,704,362)。
编码突变的多肽的多聚核苷酸可能包括加速编码序列转录(表达序列)和翻译以致于产生所编码的多肽产物。本领域已经熟知于这些多聚核苷酸的构建。例如，这样的多聚核苷酸可能包括一个启动子、一个转录终止位点(真核表达宿主中的多聚腺苷酸化位点)、一个核糖体结合位点和在真核表达宿主可能有的增强子，以及可选择地载体复制必需的序列。纯化的抗体
同时也提供纯化的特异与TagA抗原或抗原片段结合的单克隆抗体。抗体可特异结合抗原的唯一表位也可结合其它有机体的表位。术语“结合”指熟知的抗原抗体结合以及其它的与抗原的非随机联系。“特异结合”在此指抗体或其它配体除了与某一特异的如TagA抗原之外基本不与任何抗原交叉反应。抗体可如实施例中描述的方法制备(同时参看harlow和Lane(46))。简而言之，纯化的抗原可用足以诱发免疫应答的剂量和间隔注射动物。多克隆抗体可直接纯化，或动物的脾细胞与某一不死细胞系融合并筛选单克隆抗体分泌物。于是，特异结合抗原的的人多克隆抗体在本发明的范围之内。
特异结合抗原的配体也在关注之列。配体可以是抗体片段或设计为结合TagA抗原某一表位的更小的分子。抗体或配体可连接在底物上或以一个可测的部分标记或均被结合或标记。本发明组合物相关的可测的部分列于诊断方法的描述中，包括荧光、酶学或放射标记。结合于底物的抗原
也提供结合于底物的纯化TagA抗原。抗原也可能结合于纯化的抗体或配体。抗体可能是标准方法和在此描述方法获取的单克隆抗体。血清学检测(诊断)方法
用抗原检测抗体
本发明提供在被实验者中检测具120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌菌株的存在，其中包括以本发明可检测量的TagA或TagA抗原片段接触被实验者的含抗体样品并检测被实验者产生的抗体和TagA或片段的结合反应，结合指示毒性幽门螺旋杆菌菌株的存在或以前感染过毒性幽门螺旋杆菌菌株。有很多常规免疫分析可用于这一检测和诊断方法。实施例见后。
用抗体/配体检测抗原
检测具抗原的幽门螺旋杆菌菌株的方法的实施例如下进行：以一定剂量的特异与抗原反应的纯化抗体接触被实验者的流体或组织样品，然后用抗原与抗体的结合。应该指出的是抗原可以是含抗原的完整细胞，或抗原的片段。如在此讨论的，抗体包括任何结合抗原的配体，例如，完整的抗体、抗体片段或与抗原反应的试剂。本方法的流体样品可能包括任何体液即可能包含抗原或含抗原的细胞，如血、血浆、血清、唾液和尿。体液其它还可能包括痰、粘液、胃液等。
ELISA
免疫分析如免疫荧光分析(IFA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)和免疫印迹可快捷完成本抗原的检测。有原子检测抗原的ELISA法可以是例如，如下所示：(1)将抗体与底物结合；(2)以含抗原的流体或组织样品接触结合的抗体；(3)以结合于可测部分(辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的第二抗体接触结合的抗体；(4)以酶的底物接触如上的抗体；(5)以有色试剂接触如上物质；(6)观察颜色变化。以上的方法可随意改进以检测抗体以及抗原。
竞争性抑制分析
另外用于检测表达tagA幽门螺旋杆菌或以前的幽门螺旋杆菌感染的免疫技术应用单克隆抗体(MAbs)检测与TagA抗原特异反应的抗体。简而言之，被实验者血清或体液与结合于底物(例如，ELISA 96孔板)的抗原反应。彻底洗去多余的血清。标记的(酶联、荧光或放射等)单克隆抗体然后与以前与抗原-血清抗体复合物反应。单克隆抗体结合的抑制量可相对于对照(无病人血清抗体)测量。因为是基于单克隆抗体结合的特异性所以单克隆抗体测试对变异体或菌株是非常特异的。Mabs也可由IFA在细胞中直接检测。
微凝集分析
微凝集测试也被用于检测被实验者中含Tagar幽门螺旋杆菌菌株的存在。简而言之，乳胶珠(或红细胞)以抗原包被并与被实验者的样品混合，从而特异与抗原反应的组织或体液中的抗体交联抗原从而引起凝集。凝集的抗原抗体形成沉淀，肉眼或分光光度计可见。以上测试的改进中，特异与抗原反应的抗体可结合于珠上而且组织或体液中的抗原于是可测。
三明治分析/流式细胞术/免疫沉淀
此外，如经典的三明治分析，抗体可结合于底物并与抗原反应。所以，第二标记抗体结合于表位上，后者不为第一抗体识别从而检测第二抗体。因为本发明提供TagA抗原以检测幽门螺旋杆菌或以前的幽门螺旋杆菌感染，所以其它的血清学方法如流式细胞术和免疫沉淀也可用作检测方法。
在此详述的诊断方法中，抗原可结合于底物并与流体样品如血清、尿、唾液或胃液接触。该样品可直接从病人得到或以纯化形式获得。此法中，抗原特异的抗体(第一抗体)会特异地与结合抗原反应。所以，与可测部分结合或标记的第二抗体可增强第一抗体的检测。通常，第二抗体或其它配体，或与抗原不同表位特异反应或与配体或反应抗体非特异反应将会因其在第一抗体多位点反应的能力而被选择。于是，例如，第二抗体的几个分子可与每一第一抗体反应，使得第一抗体更为可测。
可检测部分
可测部分使得沉淀或颜色变化成为可见检测，通过显微镜的可见检测，或分光光度计的自动检测，放射计数装置等的测定。可测部分的实例包括荧光素和罗丹明(用于荧光显微镜)、辣根过氧化物酶(用于光学或电子显微镜或生化检测)、生物素-链霉亲和素(光学或电显微镜)、碱性磷酸酶(用于颜色变化的生化检测)和放射同位素(用于放射成像术)。例如，所用的方法和部分可由以上列出的或应用于这些标准方法的其它合适的实例中选择(46)。检测疾病或疾病的易感性
消化性溃疡
因为在此提供的TagA抗原与消化性溃疡有关，所以本发明也提供了在被实验者中测定消化性溃疡易感性的方法。该方法可根据以上提出的检测表达TagA抗原幽门螺旋杆菌或检测特异结合于TagA抗原的抗体或检测结合于TagA抗原的特异抗体的方法完成。TagA抗原或TagA特异抗体的存在指示被实验者具易发生消化性溃疡的体质。也应用了以下特异检测tagA+菌株核酸的方法。
胃癌
因为在此提供的TagA蛋白与胃癌有关，所以本发明也提供了在被实验者中测定胃癌易感性的方法。该方法可根据以上提出的检测表达tagA+幽门螺旋杆菌或检测特异结合于TagA抗原的抗体或检测结合于TagA抗原的特异抗体的方法完成。TagA抗原或TagA特异抗体的存在指示被实验者具易发生胃癌的体质。实施例4提供支持人类中的数据和实践该方法的特异程序。也应用了以下描述的检测特异tagA+菌株核酸的方法。治疗方法
提供了用本发明的组合物在被实验者中治疗消化性溃疡的方法。例如，在某一此类方法中给被实验者施用一定量的配体，它特异地在被实验者中与幽门螺旋杆菌约120-128KDa抗原反应(如，抗体或抗体成分)足以结合抗原并改进被实验者临床状况。这种改进源于诱导发炎和细胞损伤中配体干扰抗原的正常功能。配体可以是与抗原特异反应的纯化单克隆抗体、源于非人动物的纯化多克隆抗体或其它与抗原特异反应的试剂。此外细胞毒部分可用标准方法联于抗体或配体。细胞毒部分的实施例包括蓖麻蛋白A链、白喉毒素和放射性同位素。
另外一种在被实验者体内治疗消化性溃疡的方法，它包括给被实验者施用足以与受体反应的幽门螺旋杆菌120-128KDa抗原受体的一定量配体/拮抗剂并阻止120-128KDa抗原与受体的结合。由此还研究了一种受体的拮抗剂。结果是被实验者的临床状况有所改善。可替代地，治疗方法包括给被实验者施用一定量的TagA受体的类似物以达到对TagA抗原的竞争性结合，从而抑制了TagA抗原与其野生型受体的结合。受体定位于存在于胃十二指肠粘膜上的细胞上，例如，上皮细胞，炎症细胞或内皮细胞上。
因为已表明TagA的表达与胃癌有关，所以以上的治疗方法也用于胃癌的治疗和预防。突变有机体
本发明也提供了幽门螺旋杆菌的突变子，其中tagA基因产物无功能。突变子或不表达tagA或表达无功能的TagA抗原。在一个实施例中，如实施例2所描述的，由TagA抗原的编码序列替换突变得到突变的幽门螺旋杆菌菌株。因为本发明提供编码抗原的核酸，所以其它抗原编码序列的突变方法可用于获取如在此描述的突变子。本发明突变幽门螺旋杆菌菌株的实施例定为84-183：M22并以ATCC登记号55359保藏于美国典型培养物保藏中心(1230 Parklawn Drive，Rockville，MD20852)。
例如，可通过在tagA基因中加入核酸或缺失tagA基因的一部分以形成无功能的基因或产生少量不足以感染有机体的基因从而制备另外的同基因突变子。而且，通过提供编码抗原核酸的核苷酸序列，本发明可形成特异的点突变以达到该效果。调控或编码区的缺失、插入或替换突变可阻止转录或产生无功能的转录产物。
构建缺失或插入突变的一种方法是Donnenberg法(47)。缺失一段0.2kb BamHl-NdeI片段并与tagA克隆重新连接产生tagA的缺失。该突变子被克隆入自杀载体pILI570。枯草牙孢杆菌的sacB基因也克隆入自杀载体以提供条件致死表型。构建物通过电穿孔转化入幽门螺旋杆菌，转化子由壮观霉素抗性筛选。含自杀载体和tagA基因突变体的局部二倍体暴露于蔗糖中直接选择经过二次重组的有机体，导致载体的丢失。这些以及其它以下熟知的形成突变的方法可用于在此提供的核酸以获取其它感兴趣的突变。
非同基因突变子也在本发明的范围之内。例如，根据本发明提供子也是tagA-突变子的活减毒幽门螺旋杆菌。例如，据在此和关于recA的美国序列号详述的方法用tagA和recA基因的插入突变构建了一种tagA-recA-突变菌株。例如，据在此详述的关于tagA方法和关于vacA突变子产生的美国申请序列号08/215,928，通过tagA和vacA基因的插入突变构建tagA-vacA-突变菌株。例如，据在此详述的关于tagA和vacA的方法和美国申请序列号08/215,928的方法，通过recA，tagA和vacA基因的插入突变构建recA-tagA-vacA-突变菌株。突变基因的任何一种方法可用于本发明中产生幽门螺旋杆菌突变菌株。这些菌株可被测试免疫原性。疫苗
本发明的抗原、抗原片段或突变幽门螺旋杆菌可用于构建包含免疫原性量的抗原或突变幽门螺旋杆菌和药学上可接受的载体的疫苗。疫苗可以是整个抗原、完整幽门螺旋杆菌、大肠杆菌或其它菌株上的抗原。疫苗可用于防御消化性溃疡或其它幽门螺旋杆菌感染的并发症(包括萎缩性胃炎和胃恶性肿瘤)。
用标准程序可测定抗原的免疫原性量。简而言之，制备不同浓度的特异免疫反应的待试表位，施用于动物并测定每一浓度对动物的免疫应答(例，抗体的产生)。
本发明疫苗中药学上可接受的载体可包括盐水或其它合适的载体(48)。如果基于所用抗原、施用模式和被实验者(48)的标准尺度来选择，佐剂也可是疫苗载体的一部分。施用方法可根据所用的特殊疫苗和施用的被实验者采取口服、舌下服用或注射。
由上可知，疫苗可用于预防或治疗。于是，发明通过给被实验者施用疫苗提供预防或治疗幽门螺旋杆菌感染及相关疾病的方法。核酸检测(诊断)方法
TagA抗原和具TagA幽门螺旋杆菌的存在可由检测抗原特异的核酸的存在而测定。抗原序列的特异性可由与数据库GeneBank中列出的已知序列的计算机化对比确定，用查找与问题中核苷酸相似性的目录序列的计算机程序Word Search或遗传计算机研究组(麦迪逊，WI)的FASTA。
抗原特异的核酸可用核酸扩增技术如聚合酶链式反应或连接酶链式反应检测。可替代地，用直接的杂交或限制性片段长度多态性检测核酸。例如，本发明提供检测具TagA抗原的幽门螺旋杆菌存在的方法，包括用限制性内切酶酶切位点检测核苷酸序列的存在。此外，可以用只与抗原特异核酸杂交的PCR引物。扩增物的存在表明抗原的存在。其它的实施方案中DNA样品的限制片段可用如Sanger ddNTp 7-脱氮-2′-脱氧鸟苷5，三磷酸和Taq聚合酶的方法直接测序并对比已知序列而检测幽门螺旋杆菌。进一步的实施方案中，本发明提供通过以上描述的方法选择性扩增以检测含tagA幽门螺旋杆菌的存在。其它的实施方案中，直接用tagA特异核酸探针杂交唯一序列来检测幽门螺旋杆菌。而且，核苷酸可在用以上描述的方法杂交前扩增。
一旦特异可变的序列表明与消化性溃疡有关，检测这些序列的方法在本领域中便可标准化。用直接探针法检测可变序列或点突变包括寡聚探针的使用，后者可用如合成或缺刻翻译的方法制备。探针可用如放射标记、酶标记、荧光素标记、生物素-亲和素标记等类似的方法作合适的标记以用于在Southern印迹杂交程序的实施例。标记探针可在合适的条件下与例如硝酸纤维素膜上结合的样品DNA反应以使得只有全互补的序列才杂交。退火反应的结果，携带与标记DNA探针互补的DNA序列区域自己也被标记。呈现这种标记的滤膜区然后用如放射自显影的方法观察。例如，标记探针可在合适的条件下与硝酸纤维素膜上结合的样品DNA反应以使得只有全互补的序列将会杂交。对给定的链长度，杂交通常在Ti(探针和其靶序列间形成杂交体的不可逆熔解温度)低5℃下进行。对20聚体推荐杂交温度为58℃。洗脱温度在研究中对某一序列唯一并对每一变异序列需要优化。
替代的探针技术，如连接酶链式反应(LTR)，包括不匹配探针如除了突变点之外与靶全部互补的探针的使用。靶序列然后与全互补的寡聚探针和含一个不匹配的寡聚探针在能区别出二者的条件下杂交。通过控制反应条件，有可能得到只在全互补时的杂交。若存在不匹配则明显降低杂交。
聚合酶链式反应(PCR)是相当有效扩增特异DNA序列的的技术。聚合酶如一种热稳定Taq聚合酶下的变性、引物退火和延伸导致所需DNA序列浓度的指数增加。给定一个突变子的核苷酸序列，合成突变寡聚核苷酸可被制备它互补于目标DNA侧翼序列。每一个寡核苷酸与两条链中的一个互补。DNA高温(95℃)下变性然后在高摩尔寡聚核苷酸过量存在时退火。该寡核苷酸，其方向上3′端相互指向对方，与靶序列的相对的链杂交，并在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下沿着核酸模板引导酶促延伸。终产物变性进行另一轮循环。这种三步循环重复几次，DNA片段的扩增可达一百万倍。所产生的DNA可直接序列分析以定位任何的遗传改变。可替代地，也有可能制备一种寡聚核苷酸只结合于改变的DNA，以致于如果突变存在时，才可能导致DNA的扩增。PCR完成后，直接的可见检测或等位基因特异的寡聚核苷酸杂交可用于检测与点突变相关的疾病。可替代地，可应用称为特异等位基因扩增(PASA)的PCR的改进；这将差示扩增用于有单个碱基不同的等位基因间的快速和可靠的区别。另外的技术，如用RNA聚合酶得到高拷贝数的3SR，也在合适的条件下可用。
在又一种方法中，PCR之后可用限制内切酶消化并随后进行产物的分析。核苷酸取代可导致特异限制内切酶切位点的获得或丢失。限制内切酶切位点的获得或丢失加速了用限制性片段长度多态性(RFLP)分析或在跨越所需序列的PCR产物中检测多态性限制性内切酶位点的存在或缺失从而探测与突变相关的疾病。
对RFLP分析，例如DNA可由血、胃样、唾液、牙片其它体液或感染有tagA的幽门螺旋杆菌的被实验者的粪便或被实验者中分离的幽门螺旋杆菌以及感染非毒幽门螺旋杆菌的被实验者等获得，用限制内切酶消化，而且用琼脂糖凝胶电泳据大小分离。然后用Southern技术与标记探针杂交以用于检测内切酶消化的产物。然后对比Southern印迹的带型。用这一途径，通过测定带的数目和对比该数目与严重疾病不相关的幽门螺旋杆菌菌株的DNA可检测tagA DNA。限制性内切酶可有效用于tagA基因中突变的探测。
类似的通过核苷酸取代在所公开的突变位点额外限制性位点的产生，这可由遗传密码和限制内切酶随识别的核苷酸序列的列表迅速计算出来。
单链构象分析(SSCA)提供相对快捷的检测至少某些实例合适的序列变化的方法。
通常，PCR和LCR引物长度约为20bp且优选的范围为15-25bp。当引物长度相同且约有相同核苷酸组成时可获更好的扩增。PCR条件可包括链的变性通常发生于94℃、引物的延伸在72℃。退火温度随研究的序列而不同。反应时间的实施例为：20分钟变性；2分钟、1分钟、1分钟的退火、延伸、变性循环35次；最后为5分钟的延伸步骤。
特异等位基因PCR扩增(PASA)是检测单碱基突变或多态性的快速方法。PASA(亦为等位基因特异扩增)包括有两个寡聚核苷酸引物的扩增以使其中一个是等位基因特异性的。所需等位基因有效扩增而其它有效等位基因因为一个碱基错配或靠近等位基因特异引物3’端而很少扩增。于是，PASA或相关的PAMSA方法可用于特异扩增本发明的突变序列。这种扩增用于幽门螺旋杆菌分离物或个体所得的标本时，它可作为检测突变存在的方法。
如前所述，连接酶链式反应(LTR)可用于成功地检测单碱基取代。LCR探针可结合或多元使用以同时筛选多个不同的突变。于是，LCR在多个突变可能出现于特异疾病时特别有用。抗原检测试剂盒
本发明提供一个试剂盒用于诊断具TagA抗原的幽门螺旋杆菌菌株的感染。尤其是，该试剂盒可检测特异与抗体或其衍生的免疫活性片段反应的TagA抗原的存在。试剂盒可包括结合于底物的抗体、与抗原反应的第二抗体和检测第二抗体与抗原结合的试剂。这种试剂盒可以是ELISA试剂盒并在需要时包括底物、一抗和二抗和任何其它必需的试剂，如上所述的可检测部分、酶底物和显色反应物等。可替代地，诊断试剂盒可为一个免疫印迹试剂盒通常包含在此描述的成分和试剂。抗体检测试剂盒
本发明的诊断试剂盒可用于检测特异与TagA或其抗原片段反应的一抗的存在。该试剂盒可包括结合于底物的抗原、与抗体反应的二抗，该抗体特异与TagA抗原或检测二抗与一抗结合的试剂反应。这种试剂盒可为ELISA试剂盒并在需要时可包括底物、抗原、一抗和二抗和任何其它必需的试剂，如上所述的可检测部分、酶底物和显色反应物等。可替代地，诊断试剂盒可为一个免疫印迹试剂盒，通常包含在此描述的成分和试剂。核酸检测(诊断)试剂盒
一旦测定了TagA抗原的核苷酸序列，本发明的诊断试剂盒可替代地用于构建检测特异于抗原的核苷酸序列，包括如底物和检测核酸试剂的标准试剂盒。因为幽门螺旋杆菌感染可由检测胃或十二指肠组织和体液如胃液、尿、粪便和唾液中的抗原特异核酸诊断幽门螺旋杆菌感染，所以很明显对一个本领域的技术人员来说用核酸检测法如特异核酸探针、引物或限制片段长度多态性可构建试剂盒。可想而知诊断试剂盒进一步包括一种阳性和阴性对照测试。
本发明中诊断试剂盒的特殊试剂和其它成分可据试剂盒实践中的特异诊断方法由本领域的可行方案选择。此类试剂盒可用于被实验者的组织和体液样品中检测抗原。
以下的实施例用于说明而非限制本发明。虽然它们可能经典地被如此使用，但本领域中的技术人员可替代的使用其它的方法。
实施例1
TagA抗原的克隆和表达菌株和生长条件
幽门螺旋杆菌菌株84-183(ATCC53726)用于克隆TagA抗原的基因。分离于人类的32菌株幽门螺旋杆菌分离物，包括以前用于表明抗原的菌株，用于评估基因的保守性及与毒素产生的相互关系(表1)。贮存培养物保持于-70℃Brucella肉汤(BBL微生物系统，Cockeysville，MD)添加有15％甘油。在微厌氧空气中(由CampyPak-Plus(BBL)37℃48小时产生)幽门螺旋杆菌培养于Brucella添加有5％胎牛血清的肉汤中。转化和蛋白表达中，大肠杆菌XL-1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)、HB101(ATCC 33694)、DH5α(Stratagene，La Jolla，CA)培养于Luria-Bertoli(LB)培养基37℃摇动。添加于培养基的氨苄青霉素终浓度为100μg/ml。化学试剂和酶
异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)以57μg/ml使用，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-GAL；终浓度为40μg/ml)自Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN)。限制酶，T4 DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶大(Klenow)片段和SequenaseTM自Promega和美国生化试剂公司(Cleveland，OH)。〔α-32P〕dATP(650Ci/mmol)自ICN放射化学公司(Irvine，CA)。遗传技术和核苷酸序列分析
为了从幽门螺旋杆菌84-183获取染色体，该菌株在含5％胎牛血清的brucella肉汤中培养48小时，沉淀细胞，重悬于含100mM NaCl的100mM Tris-HCl(pH7.2)中。用1％SDS的100mM Tris-HCl(pH8.8)裂解细胞。氯仿苯酚提取后，染色体DNA沉淀于100％乙醇。质粒用Bimbiom和Doly(49)的快速碱裂解法提取而纯化在800mMNaCl和6.5％聚乙二醇存在下沉淀完成。所有其它的标准分子遗传学技术包括顺序缺失均如所述进行(50)。用以前描述的双链DNA模板和双脱氧链终止法在两条链上明确测定核苷酸序列(51)。寡核苷酸引物由Vanderbilt大学DNA核心实验室用Milligen 7500 DNA合成仪根据生产商合成。核苷酸序列由DNA-Star程序(DNA Star，Inc.，Madison，WI)比较和分析；待试的启动子和Shine-Dagarno序列由一致的序列对比识别。
幽门螺旋杆菌基因组文库的构建
84-183菌株染色体DNA由超声剪切而产生的片段在0.7％低熔点琼脂糖上电泳。2-10kb大小的片段被切下来，用T4DNA聚合酶处理以产生平末端，然后连接到磷酸化的EcoRI八聚体接头上(新英格兰，Beverly，MA)。据生产商中的方案，DNA用EcoRI消化然后连到λZapII载体的EcoRI臂上。加连接混合物于Gigapack IIa包装混合物中(Stratagene)并于XLl-blue(λZapII)细胞或Y1088(λgt11)细胞上测效价。扩增的噬菌体文库用幽门螺旋杆菌感染者吸附血清或噬菌斑杂交筛选。幽门螺旋杆菌特异基因的克隆
强烈识别120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌感染者中分离的血清用不产生120-128KDa带的幽门螺旋杆菌菌株吸附以及大肠杆菌细胞吸附以减少非特异反应的可能性，然后用于筛选扩增λZapII噬菌体文库的基因库(53)。该库包括约4×104个插入。扩增的噬菌体文库用在42℃2.5小时生长于XLl Blue细胞的约105噬菌斑筛选，在10mM IPTG浸润过的硝酸纤维素滤膜上平展，37℃孵育2小时。滤膜用吸附血清筛选以检测9个反应性克隆。然后对阳性噬菌斑进行噬菌斑纯化，而且裂解物由这些感染大肠杆菌细胞制备。裂解物与吸附血清免疫印迹，然后保存表达重组蛋白的克隆。通过与人吸附血清的免疫印迹，每一XLl-Blue裂解物分别对应于质粒pMC1、pCM2或pCM3迁移在约75、85或96KDa带间的强烈免疫反应。
三个代表性的克隆中，含克隆DNA插入的pBluescript质粒如详述的(54)通过辅助噬菌体和新鲜的转化的XL-1Blue细胞的共转染而被切割下来。质粒纯化后，产生限制酶切图谱和用于进一步研究特征的质粒。平行的研究中，四个克隆用相同的方法从幽门螺旋杆菌84-183DNA的λgt11文库获取，用基于已知侧翼λgt11序列制成的引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增四个阳性克隆之一的DNA插入片段。来自四个阳性噬菌斑的重组噬菌菌化DNA被纯化，并且每个含有一个0.6kb的插入。两个克隆(λYB1、λYB2)裂解物的免疫印迹分析表明与吸附的人抗血清反应的相似大小130KDa带。为测定130KDa蛋白是否由重组噬菌体作为融合蛋白而合成，由λYB1制备的细胞裂解物专一于用β-半乳糖苷酶特异抗血清的免疫印迹分析。交叉反应指示重组克隆包含有λgt11β-半乳糖苷酶大(116KDa)片段和幽门螺旋杆菌开放阅读框。我们克隆λYB2插入片段于pUC19，但重组体(pYB1)不表达任何蛋白。凝胶电泳和免疫印迹分析
携带重组体λgt11，λZapII或pBluescript大肠杆菌的裂解物用SDS-PAGE和吸附的人血清的免疫印迹分析。不连续十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰铵凝胶电泳(PAGE)如以前描述过的用4.5％浓缩胶和7.0％分离胶完成。含3μg蛋白的样品加于每一胶道。电泳后，固定凝胶并用改进的Oakley等(56)银染法分析。浓缩培养物的含蛋白上清在样品缓冲液中稀释并在Mini-PROTEIN II板装置中铺于聚丙烯酰胺的表面。电泳后，蛋白用1安培电印迹1小时转移到硝酸纤维素纸上。封闭非特异性结合后，硝酸纤维素纸于1∶100血清样品稀释液在室温下孵育1小时。羊抗人IgG的碱性磷酸酶偶联物(Tago，Inc.，Burlingame，Calif.)以1∶2,000稀释用作二抗。Sourthern杂交
幽门螺旋杆菌或C.jejuni染色体DNA用HindIII或EcoRI和BamHI消化而且产生的片段在0.04M Tris-醋酸-2mM EDTA缓冲液(pH8.2)的0.7％琼脂糖凝胶电泳。所有杂交条件和方法如前所述(50)。用随机六聚物通过引物延展放射标记探针(57)。杂交在含6×SSC(1×SSC为0.15M Nacl，0.015％M柠檬酸钠)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)，5x Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液为0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白)和100ug/ml鲑鱼精子DNA的缓冲液中进行68℃16小时。印迹在60℃0.5×SSC中洗脱并对XAR-2X-光胶片曝光(Eastman Kodak，Rochester，NY)。克隆杂交
幽门螺旋杆菌菌株生长于胰蛋白酶解酪蛋白大豆血琼脂板(BBL)并将影印的拷贝转移至硝酸纤维素纸。每张纸放置于0.2M NaOH/1.5MNaCl饱和的3mm Whatman纸上。3分钟后，硝酸纤维素纸转移至饱和有0.4M Tris-HCl(pH7.6)2×SSC的3mm Whatman纸上3分钟，然后在2×SSC3分钟。克隆印迹硝酸纤维素纸在80℃真空烤箱中90分钟并与放射标记pMC3杂交(50)。细胞毒素产生
幽门螺旋杆菌肉汤培养基上清通过0.2μm滤器超滤后浓缩30倍，与HeLa细胞孵育。简而言之，幽门螺旋杆菌菌株在含5％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)的brucella肉汤(BBL，微生物系统，Cckeysville，MD)上37℃培养，添加10mM氯化铵以增加细胞毒素的有效在活力。肉汤培养基在微厌氧空气中于100rpm旋转振荡器孵育72小时。培养物3,000xg离心15分钟，无细胞上清贮于-70℃。融化后，上清用30-KDa超滤膜浓缩30倍，滞留物用0.22-μm-孔径大小滤器无菌过滤。这些浓缩的培养物上清(CCSs)与HeLa细胞(来自AllisonO’Brien，Uniformed Services University of the Health Sciences，Bethesda，Md.)在从1∶10到1∶320的两倍稀释物中孵育(39)，除了毒性分析在96孔板的100μl总体积中进行(Falcon，Becton Dickinson及Co.，Lincoln Park，N.J.)。
HeLa细胞的液泡化用中性红吸收分析法定量。简而言之，0.5％纯化级中性红(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)的贮液在0.9％生理盐水和Whatman No.1滤纸过滤下制备。染色液在每次实验前用在含10％胎牛血清的Eagle培养基中以1∶10稀释贮液。于测试样品孵育24小时后，去除漫过HeLa细胞的培养基并用100μl的染色液每孔4分钟。细胞用每孔150μl0.9％盐水洗两次。加入100μl酸化酒精除去细胞中的中性红(58)。用MR700酶联免疫吸附分析仪(Dynatech，Alexandria，VA.)测定孔540nm的光密度(OD)。所有的分析重复三次。所有的实验中，含只与培养基孵育细胞的孔的平均OD值小于0.130(平均值0.101±0.007)；背景OD从实验孔的OD值中去除而产生净OD。在测试的32菌株幽门螺旋杆菌中，15个产生了液泡化的细胞毒素，如本分析所测定的(表3)。作pBulescript插入片段的图谱
EcoRI消化后，质粒pMC1，pMC2和pMC3发现各自有约2.5，2.7，3.6kb的DNA插入片段。重组质粒的限制性内切酶分析在所有三个质粒中识别出一个保守的1.2kb HindIII消化片段(图1)。如此，进一步的研究集中于pMC3，它含有最大的插入片段。核酸外切酶III消化产生的缺失突变分析识别出起始和开放阅读框(ORF)的大致定位(图1，大箭头)。pMC3和pYB1的序列分析
为测定pMC3 3.6kb插入片段的序列，用外切核酸酶III(图1)产生一系列顺序缺失的质粒(50)。总共，3648bp的整个pMC3插入片段的用两种标准测定序列(SEQ ID NO：1)。每行的右边标有核苷酸的数目。SEQ ID NO：1编码残基数859处的氨基酸是克隆过程中的假象并非tagA基因的部分。SEQ ID NO：2提供SEQ ID NO：1中核苷酸序列推算出的氨基酸序列。
一个长的开放阅读框始于核苷酸1072并延续至插入片段的末端。相反起始方向的两个其它开放阅读框在645碱基对和264碱基对开始。推测的氨基酸标在核苷酸下。也标明了潜在的核糖体结合位点(Shine-Delgarno序列；SD)和待试的启动子元件(-35和-10序列)。在任何六个可能的阅读框中只发现一个超过300碱基的单个ORF。该ORF编码TagA抗原的859氨基酸，产生一个分子量96，022(SEQ ID NO：2)的预测中的蛋白。该ORF推断的转录方向也与用缺失突变子测定一致。然而，不存在翻译终止信号，标明pCM3的ORF被截短。截短的片段富含碱性氨基酸(表2)而且预测等电点为8.0。一个潜在的核糖体结合位点(AGGAG)终止于ORF上游6碱基对。翻译起始位点上游的112bp序列呈现启动子序列TATAGT，类似于Pribnow通用启动子TATNATN(Hawley McClure)。该推定的类似于一个σ-70启动子的-10区与-35区，ATGCCA，有关，后者与对应的通用序列TTGACA(52)共用6个碱基的4个。推断的截短多肽的氨基酸组成见于表2。
两个更小的ORF各自在相反的方向延伸，它们的序列也已识别(SEQ ID NO：1)。第一个编码一个79个氨基酸的多肽，始于碱基对645处而且不是以明显的Shine Delgarno或推定的启动子序列启动。第二个ORF始于碱基对264处并在插入片段末端之前编码88个氨基酸。该截短的ORF由Shine Dalgarno序列启动。翻译起始位点上游90碱基对序列TTTGAT类似于-10通用启动子位点，随后有序列TTGTCA，后者与-35通用序列(52)6个碱基中的5个共用。
pYB 1的0.6kb插入片段用已知λgt11侧翼序列的正向和反向引物和实验推断插入片段序列的额外引物一起测序。620bp pYB1序列的前464碱基与pMC3末端重叠，但ORF仍然继续。截短重组TagA抗原的血清学识别
除了提到的例子，识别幽门螺旋杆菌菌株84-183TagA抗原的幽门螺旋杆菌感染者的血清识别重组多肽。基于此，我们研究了6个未感染幽门螺旋杆菌者和14个感染者(7个识别84-183菌株的120-128KDa抗原，而7个不识别)。用转化过pMC3大肠杆菌XL1-Blue的裂解物并免疫印迹，人血清IgG对96KDa抗原明显识别。总而言之，7种识别天然120-128KDa带的4种血清也强烈识别重组蛋白而13种测试为不识别120-128带(p＝0.007，Fisher’s精确检验，两尾)也不识别重组蛋白。如果考虑pMC3带的弱反应，那么7种识别120-128KDa带的血清和13种非识别血清的3种与重组蛋白反应(p＝0.003，Fisher’s精确检验，两尾)。于是，pMC产生的重组蛋白可用于血清学分析以检测幽门螺旋杆菌120-128KDa抗原的抗体。tagA基因的保守性
为了测定是否其它幽门螺旋杆菌菌株具有tagA基因或同源序列，用pMC3作为探针考虑杂交研究了32个菌株(表3)。19个菌株(59.3％)获得阳性信号。这些菌株的所有细胞的SDS-PAGE和免疫印迹指示32菌株的19(59.3％)表达120-128KDa的带。免疫印迹和克隆杂交完全吻合；所有19个表达蛋白的幽门螺旋杆菌菌株具有一个基因同源盒，相对于13个不表达蛋白的菌株(p＜0.001，Fisher’s精确检验，一尾)。此外，所有产生液泡毒素的15个菌株同时表明与pMC3杂交和120-128KDa带的存在(表3)。
为获取tagA基因限制性片段长度多态性的信息以及是否在每一细菌染色体中存在多同源基因，制备4个幽门螺旋杆菌菌株的基因组并用pMC3作探针进行Southern杂交。两个表达120-128KDa蛋白并具阳性克隆杂交的菌株现在表明与大约迁移在1.2kb的HindIII限制片段强烈杂交，而且在3.0和3.3kb间有弱的带。对第三个表明表型并具阳性克隆杂交的菌株而言，探针在Southern分析中与约1.1kb的带强烈杂交。迁移小于0.5kb与探针微弱杂交的带存在于所有三个菌株中。不表达120-128KDa蛋白且考虑杂交阴性的幽门螺旋杆菌菌株以及用于对照的C.jejuni菌株在Southern分析中没有杂交，没有弱带。pMC3与EcoRI和BamHI消化的84-183和60190菌株的染色体DNA杂交也呈现多态，与其它限制酶的异质性相符。这些研究指示尽管TagA的对应物存在于其它幽门螺旋杆菌菌株，但是在基因内或侧翼序列中存在异质性。
本实施例提供的幽门螺旋杆菌染色体DNA的克隆片段包括表明重要幽门螺旋杆菌抗原基因的大部分。PMC3包含编码TagA抗原的证据可总结如下：(i)蛋白和基因所有的幽门螺旋杆菌菌株中均不存在；(ii)只有表达120-128KDa蛋白的菌株才与pCM3杂交而不表达蛋白则不杂交；(iii)识别120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌感染者的血清比对照血清明显更经常地识别重组tagA产物。
tagA的部分序列和两种其它ORF不同于87KDa毒素的N末端或3内部序列。该发现与早期的观察一致：120-128KDa和87KDa蛋白在抗原性上不相关(41)。截短基因的推断产物的对比表明与已知蛋白几乎没有同源性。
tagA基因或同源物存在于所研究的大约60％幽门螺旋杆菌的分离物中，但在其它分离物中缺乏。如Southern分析指示的，虽然只测试了少量菌株仍有关于限制片段多态性的证据。同源物的缺乏与不表达120-128KDa的抗原带极为相关。于是，缺乏该带的表型不是因为转录或表达的缺乏而是并发基因的缺乏。
含至少截短tagA基因的染色体DNA的存在与细胞毒素产生高度相关。少数具tagA基因的菌株不产生可测量的细胞毒素。这种现象可能反映细胞培养基分析对检测毒素的亚最适敏感性，或可能指示非tagA抗原的因子与毒素活性相关。
如免疫印迹研究所表明的，pCM3产物是良好的用于检测tagA抗原的人血清抗体的诊断试剂。这种重组蛋白的应用可快捷提供足够抗原以辅助免疫分析来检测感染产生天然120-128KDa蛋白的幽门螺旋杆菌菌株的病人，pMC3产物的异源性抗体可用于检测产生TagA抗原的菌株。已知pMC3 DNA序列可允许产生寡聚核苷酸的构建物以用作杂交探针及PCR的引物。因为某一菌株的并相关基因型这种技术也用于感染的快速检测。缺失突变子的产生可阐述该基因的作用并提供治疗制剂或疫苗候选物。在此详述这种诊断方法和突变子。
表1
                本研究中所用的幽门螺旋杆菌菌株菌株名称分离的地点  120-128KDa抗原的表达a液泡细胞毒素活性的表达bTx30a    得克萨斯   -                   -84-183   得克萨斯   +                   +60190    英格兰     +                   +87-29    科罗拉多   +                   +86-313   科罗拉多   -                   -87-199   科罗拉多   +                   +86-385   科罗拉多   -                   -87-33    科罗拉多   +                   +87-81    科罗拉多   +                   +87-91    科罗拉多   +                   +87-90    科罗拉多   -                   -87-226   科罗拉多   +                   -87-225   科罗拉多   -                   -87-230   科罗拉多   -                   -87-75    科罗拉多   -                   -87-203   科罗拉多   -                   -87-6     科罗拉多   +                   -86-338   科罗拉多   -                   -86-63    纽约       +                   -86-86    纽约       +                   +86-332   明尼苏达   +                   +92-18    田纳西     +                   +92-19    田纳西     +                   +92-20    纳西       -                   -92-21    纳西       +                   +92-22    田纳西     +                   -92-23    田纳西     -                   -92-24    田纳西     -                   -92-25    田纳西     +                   +92-26    田纳西     +                   +92-27    纳西       +                   +92-28    纳西       -                   +a用免疫印迹检测的方法用人血清识别细胞裂解物中120-128KDa带(20)。b如在HeLa细胞中检测的方法检测液泡化的细胞毒素所产生(59)。
表2从pMC3推测的截短的859氨基酸TagA多肽的氨基酸组成氨基酸    残基数    859个氨基酸的百分数Ala        60       7.0Cys        2        0.2Asp        62       7.2Asn        82       9.5Glu        59       6.9Gln        48       5.6Phe        44       5.1Gly        54       6.3His        12       1.4Ile        50       5.8Lys        101      11.8Leu        67       7.8Met        12       1.4Pro        24       2.8Arg        22       2.6Ser        63       7.3Thr        30       3.5Val        47       5.5Trp        4        0.4Tyr        16       1.9
表3人32种幽门螺旋杆菌分离物中用免疫印迹、用与pMC3的杂交检测
     120-128KDa的存在与细胞毒素产生的相关性
     菌株特征免疫印迹中120-128  pMC3与幽门螺旋杆菌  细胞培养物分析中菌株数目Kda带的存在a      克隆的杂交b   的毒素产生c
+               +           +           15
-               -           -           13
+               +           -           4
-               -           +           0
-               +           -           0
+               -           -           0
+               -           +           0
-               +           +           0a用免疫印迹检测的方法用人血清识别细胞裂解物中120-128KDa带(20)。b在克隆印迹中pMC3与裂解的幽门螺旋杆菌细胞杂交(50)。c如在HeLa细胞培养物中检测的方法检测液泡化的细胞毒素所产生(59)。
实施例2
幽门螺旋杆菌tagA阴性菌株的构建和特征细菌菌株、载体和生长条件
用于本研究幽门螺旋杆菌84-183(ATCC 53726)来自Vanderbilt大学弯曲杆菌/螺旋杆菌实验室的培养中心并因其深入的特征描述而被选择。贮存培养物在添加有15％甘油的Brucella肉汤(BBL微生物系统，Cockeysville)中-70℃保存。幽门螺旋杆菌菌株在添加5％胎牛血清或含萘啶酮酸、50mg/升)、万古霉素(10mg/升)、多粘菌素B(5000U/升)、三甲氧苄二氨嘧啶(5mg/升)的血琼脂平板微厌氧条件下37℃48小时。用于转化的大肠杆菌DH5α(Stragene，La Jolla，CA)生长于LB培养基中。如上所述，pCM3含在pBluescript上3.5kb插入片段的截短tagA基因。质粒pILL600(60)用作C.coli卡那霉素(Km)抗性基因的来源。化学试剂和酶
氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)在终浓度用于任何必需的时候。限制内切酶、T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶大片段(Klenow)购自Progma和美国生物化学公司(Cleveland，OH)。α-32P-dATP(650Ci/mmol)自ICN放射化学公司(Irvine，CA)。遗传技术
染色体DNA如上制备。质粒通过Bimboim和Doly的程序分离(49)。所有其它标准的遗传技术如上所述(50)。用于杂交实验探针的DNA片段是用凝胶纯化的。将Km盒导入幽门螺旋杆菌菌株84-183
大肠杆菌卡那霉素抗性基因插入pMC3唯一的NdeI位点以产生pMC3：Km(图2)。该构建物直接用电穿孔转导入幽门螺旋杆菌菌株84-183。简而言之，幽门螺旋杆菌细胞在血琼脂板上生长48小时后收获，在电穿孔缓冲液(15％甘油5％蔗糖)中洗三次并悬浮于200μl缓冲液中。pMC3：Km质粒DNA由Bimboim和Doly快速(小量制备)碱性裂解法制备并加入细胞中在冰上培养5分钟。细胞和基因转移到基因脉冲仪的0.2cm电穿孔小池中，如上所述发出高压脉冲(25F，2.5kv，200Ω)(61)。电穿孔之后，细胞悬浮于400μl的LB培养基并涂布于血琼脂板。在微厌氧条件下培养24小时，然后收获细胞，接手中在含50μg/ml卡那霉素的血琼脂板上微厌氧培养48小时。
所说克隆载体不能在幽门螺旋杆菌中复制而且含卡那霉素培养基的选择产生抗性重组子。大约1010幽门螺旋杆菌cfu中，用500ng质粒DNA可获3000转化子(10-7)。克隆杂交
电穿孔所获的50个卡那霉素抗性转化子在血琼脂板生长而且这些克隆的影印拷贝转移到硝酸纤维素膜上。每一膜置于0.2M NaOH/1.5MNaCl饱和的3mM Whatman纸上。3分钟后，膜转移到3mM Whatman上，用0.4M Tris-HCl(pH7.6)/2×SSC饱和3分钟，然后在2×SSC上饱和3分钟。克隆印迹膜在真空泵80℃干燥90分钟并与放射标记的pBluescript或Km抗性基因杂交，如上所述。克隆印迹在0.5×SSC 60℃清洗并对XAR-2X光片曝光(Eastman Kodak，Rochester，NY)。凝胶电泳和免疫印迹分析
携带pBluescript、pMC3或pMC3：Km大肠杆菌或幽门螺旋杆菌细胞的裂解物制备后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。野生型和突变子1、21、22全细胞提取物的免疫印迹如以上用1∶300吸附人血清的稀释物的方法，而且如上所述用1∶2000羊抗人免疫球蛋白碱性磷酸酶偶联物作为二抗。这些研究表明同基因的突变子1、21、和22没有抗原性tagA基因产物。Southern杂交
进行了野生型幽门螺旋杆菌菌株84-183和卡那霉素抗性转化子M21和M22的Southern杂交。幽门螺旋杆菌染色体DNA用HindIII或BamHI和SacI消化而且所产生的片段在0.7％琼脂糖凝胶上电泳并转移到尼龙膜上。探针是pMC4或pILI600的凝胶纯化DNA片段并用以上的随机六聚核苷酸引物延伸放射标记。DNA然后转移到尼龙膜并与32P标记pMC4或1.3kb Km盒在高严谨条件下杂交。杂交在6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt’s溶液和100μg鲑鱼精子DNA的溶液中进行并将印迹在60℃0.5×SSC/0.1％SDS中洗30分钟。转化子的基因型特征
为提供tagA基因在转化子菌株中被断裂的证据，野生型菌株和幽门螺旋杆菌突变子21和22分离的DNA用限制内切酶HindIII或BamHI和SacI消化。消化DNA在琼脂糖凝胶上分离后，DNA转移到尼龙膜上并与作为tagA探针的pCM4杂交。该探针大约与野生型菌株中20和1.0kb的BamHI-SacI片段杂交，1.0kb BamHI-SacI片段丢失而在两个突变菌株其它带未变化时发现新的2.3kb杂交片段。类似的，一个1.2kb HindIII片段丢失而且因为卡那霉素抗性基因插入获得一个2.2kb片段。卡那霉素基因探针在突变子21和22菌株中只与2.3kb BamHI-SacI和2.2kb Hind III片段杂交，从而说明tagA基因发生置换。于是，84-183菌株的tagA基因因Km基因的插入而被突变。细胞毒素产生
细胞毒素的产生如上所述而且结果见于表4。结果表明完整TagA抗原和完整TagA基因不为液泡的发生所需。
表4
野生型和tagA-突变型H.pylori的细胞毒素产量上清稀释倍            光密度a数
    84-183        M1            M22           87-203b1∶5    0.21±0.04    0.26±0.04    0.23±0.05    0±0.021∶10   0.16±0.02    0.20±0.03    0.13±0.02    0.01±0.011∶20   0.13±0.01    0.15±0.02    0.10±0.02    0.01±0.011∶40   0.09±0.02    0.06±0.01    0.06±0.02    0.01±01∶80   0.03±0.01    0.04±0       0.02±0.01    0.01±01∶160  -0.01±0.02   -0.01±0.01   -0.01±0.02   -0.02±0.02a净光密度测定为细胞毒素诱导液泡的中性红方法，如以上所述(59)b87-203是已知不产细胞毒素的菌株
实施例3
全长tagA基因和基因产物
全长基因的克隆和测序
为了分离全长基因，我们用pYB1中的一个0.6kb的片段作为探针筛选幽门螺旋杆菌84-183的λZapII基因文库。纯化五个阳性噬斑而且包含克隆的DNA插入片段的pBluescript质粒用助噬菌体的共感染切除。五个阳性克隆都含有2至3kb的插入片段(数据未列出)。其中一个克隆被命名为pYB2，它包含一个2.7kb的插入片段，我们选择它作进一步研究并做出酶切图谱(图3)。利用外切核酸酶III，从任意一端开始对pYB2的2.7kb插入片段进行一系列成套的(nested)缺失。应用pYB2的重叠缺失克隆，我们确定出了两条链中1969bp的序列。正如我们所料，该序列(SEQ ID NO：3，从第2864个核苷酸开始)的前785个碱基与pMC3的末端重叠。从来自于pMC3、pYB1、pYB2的全部核苷酸序列所有可能的阅读框的翻译中，发现一个3543个核苷酸的开放阅读框，它起始于第1072位的ATG，终止于第4615位的TAA。该序列编码的蛋白质含有1181个氨基酸残基(SEQ ID NO：4)，推断的多肽其分子量为131517道尔顿。第4642至第4674的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)可能导致mRNA形成茎环结构，从而可能是一个翻译终止位点(△G＝-14.4kcal)。
TagA多肽与其它蛋白质的同源性
检索Swiss.Prot第21版和NBRF-PIR蛋白质数据库没有发现与TagA抗原全长(SEQ ID NO：4)非常同源的蛋白质。与其最具同源性的蛋白质是叶绿体H+转运ATP合成酶(62，63)和钠通道蛋白(74)。二者与TagA抗原具有相同氨基酸的比例分别为16.8％和17.3％，在第1至482和第123至1182残基二者具有保守氨基酸的比例分别为50％和42.6％。比较pMC3所包含另外两个开放阅读框的氨基酸序列与蛋白质数据库，没有发现显著的同源性。
TagA碱性氨基酸的含量(141个赖氨酸，占总量的11.9％；117个精氨酸，占总量的9.9％全长TagA基因)非常高，与所预测的该肽链的等电点(8.89)一致。亲水性作图表明推测的蛋白质具有显著的亲水性。有趣的是，该蛋白的一级结构存在相同氨基酸多聚序列，特别是多聚精氨酸(SEQ ID NO：4，在3705位)。在检索中比较这一富含精氨酸的区域和各种蛋白质序列数据库，发现它和来自酵母的序列(64，65，66，67，68，69，70)以及疟原虫属(71)的核苷酸结合蛋白具有很高的同源性。多聚精氨酸还发现于其它蛋白质，如，克鲁韦氏酵母乳变种Lac9基因用于DNA结合调控的产物(72)和啤酒糖酵母的钾转运蛋白(TRK1)(73)。全长TagA基因的构建
为了构建全长TagA基因，我们利用pMC3和pYB2都有的单一SacI限制性位点(图3)。首先，把pMC3的3.6kb TagA片段克隆到pUC19载体上，并受lacZ启动子的控制，构建出pTU1。然后，把来自pYB2的2.6kb SacI片段克隆到SacI消化的pTU1上。选择具有正确方向的克隆，命名为pTU2。具有同样性质的克隆(pEM3)构建在pGEM3z载体上，在根据布达佩斯条约的规定保藏于ATCC，登记号69273。包含pTU2或pEM3的大肠杆菌表达出具有免疫活性的幽门螺旋杆菌128KDa蛋白质。用Western印迹检测TagA重组蛋白的人血清学反应
为了确定人血清是否与全长TagA重组蛋白发生反应，将含有pEM3细胞的溶胞产物用7％丙烯酰胺凝胶电泳，然后电印迹到硝酸纤维素滤纸上。取10个受幽门螺旋杆菌感染的人体和10个未受感染人体的血清，按1∶100稀释，检测与重组蛋白的反应性。7个受幽门螺旋杆菌感染人体的血清识别TagA蛋白，而未受感染人体血清10个中只有1个有此反应(p＝0.01，单尾fisher精确检验)。因此，全长重组蛋白是评价人体对幽门螺旋杆菌反应的有用抗原。
实施例4
与患胃腺癌的危险增高有关的含TagA的幽门螺旋杆菌菌株
该实施例是一种血清学试验，用以确定Helicobacter pylori感染是否由TagA+菌株导致。在这一血清IgG试验中，利用orv220，发现TagA一个重组片段的特异性为94.4％，对临床人群的敏感度为92.5％。
本实施例还表明幽门螺旋杆菌感染与胃癌危险性有关。血清样品采自夏威夷一支由日本和美国男人组成的人群。采取103个受幽门螺旋杆菌感染并最终患胃癌(采取血清样品后13年内)的男人血清，作为对照，还采取103个在此期间未患癌症的男人血清。TagA血清抗体与观察期内患胃癌危险性增加1.9倍(0.9-4.0，p＝0.08)有关。在75个胃远端患有肠类胃癌的男人中，机率(OR)  为2.3(1.0-5.2，p＝0.056)。较小的年龄(小于72岁)和肿瘤诊断晚期与TagA阳性显著相关。
以下结果表明存在重组TagA产物的血清抗体可以准确确定感染性幽门螺旋杆菌菌菌株的TagA状况，并且由TagA+菌菌株导致的感染与患胃癌的危险性增高有关，特别是与患影响远端胃的肠类胃癌的危险性增高有关。选择验证试验的病人
为了确定TagA血清学试验的应用性，选取181个幽门螺旋杆菌状况已经确定(9，22-24)的人血清进行试验。未感染人体(n＝115)是指那些经过内窥镜检查和活组织检查没有在快速脲酶测试或组织检查中呈现幽门螺旋杆菌感染者。所有的病人在血清IgG对幽门螺旋杆菌的标准化酶联免疫吸附分析(ELISA)中呈阴性血清学反应(25)。115个非感染病人随机分为一个参照组(n＝35)和一个测试组(n＝80)。感染病人在培养的活组织检查物中获得幽门螺旋杆菌的病人；这66个病人包括十二指肠溃疡(n＝14)、胃溃疡(n＝6)、单独的胃炎(n＝36)或其它的诊断。对每一个病人，评估单独的分离物以用如前所述的基因特异探针克隆杂交测定TagA的状态(6，24)。见于杂交分析，36个病人为tagA+菌株感染，30个病人为TagA-感染。所有的血清在用前贮于-20℃。选择病人作癌症研究
本研究所有的病人为日本-夏威夷研究人群的一部分。从1968到1989的21年里，已识别出109例病理学确证的胃癌，而且以前的血清测试指示他们中的103例在六十年代初次递交血清时感染有幽门螺旋杆菌(5)。103个与这些病例匹配的对照中，83个感染有幽门螺旋杆菌，根据以前的标准识别出3个进一步的对照(5)。测定幽门螺旋杆菌菌株是否存在的血清学技术用于编号的样品中，并且从阳性中，对20个未匹配病例中的每一个随机选择一个幽门螺旋杆菌感染的对照。总之，本研究由103个发作为胃癌的幽门螺旋杆菌感染者和他们的103个匹配的感染有幽门螺旋杆菌但在研究期间没有发作为胃癌的对照组成。重组TagA抗原的制备
克隆于pMC3的TagA的碱基含1921-3648的一个1.7kb的片段亚克隆于pET15b(Novagen，Madison WI)的T7启动子下游的BamHI位点。该质粒(pORV220)用于转化大肠杆菌宿主菌株BL21，一个含lacUV5启动子控制下的T7RNA聚合酶的λDE3溶原体(26)。溶原体的生长培养物中加入IPTG以诱导T7聚合酶转录重组质粒的靶DNA。融合蛋白由600个残基组成(24载体+576个插入片段)，而且预计分子量为66.4KDa。用镍螯合的树脂从诱导肉汤培养的裂解物纯化蛋白，并用咪唑洗脱，如述(27)。血清学方法
幽门螺旋杆菌血清IgG抗体的存在用如前所述的Pyloristat试剂盒(Biowhittaker，Walkersville，MD)的ELISA测定(5)。对TagA ELISA而言，最佳的抗原浓度、病人血清浓度和抗人IgG偶联物由棋盘滴定测定。对orv220，最佳的抗原浓度为5μg/ml并且在96孔板每孔如100μl。人血清最佳稀释度为1∶100，辣根过氧化物酶偶联的羊抗人IgG以1∶4000的稀释使用。血清学方法的其它细节详细地在类似的分析中描述(23，25)。
统计分析
配对样品的t-检验用于平均值的比较，而McNemar检验用于病人和对照被实验者间各种特征的分布的比较。基于TagA分析的结果，胃癌随机概率(OR)源于条件对数回归方法(29)。危险取对数的线性趋势测试通过应用分组TagA测试结果(编号为1，2，3或4血分数)由条件对数回归模型得出。所有的条件对数回归用重复最大似然法(iterativemaxium  Likelihood)和比率风险回归模型的特异应用取得合适度(30)。胃癌相关于tagA+菌株的分布风险的评估基于Walter(31)的方法。构建接收机工作特征(ROC)曲线以总结敏感性和特异性的评估(32)。
应用orv220的TagA血清学诊断精确性
以前的TagA血清学研究应用从大肠杆菌细胞裂解物纯化的重组抗原(21)。因为该抗原的纯化繁琐和冗长，重叠tagA基因片段在代替的原核表达系统中作为一个融合蛋白表达。最初的研究指示ovr220表达基于在此研究的TagA片段的几个候选蛋白中最好的一个。截短的蛋白与用pEM3转化大肠杆菌菌株纯化的抗原对比，后者编码完整的tagAORF。用线性回归分析，41个病人(19个感染者和22个未感染者)的血清IgG结果在用两种不同的抗原中紧密相关(r＝0.96，p＜0.001)。用未感染者平均值的同一阈值+2SD，orv200抗原给出22个未感染者中21(95％)的阴性结果；例外的呈微弱阳性。19个幽门螺旋杆菌感染者，orv220的结果完全相同于pEM3抗原的结果(12个阳性和7个阴性)。于是，与orv220编码的66 4KDa TagA片段的血清活性与更大TagA片段检测的结果几乎相同。
为建立分析方法，36个已知未感染幽门螺旋杆菌者用作参考，多次运行后，建立起基于平均值加标准方差间隔的阈值。同时，测试来自80个未感染者的第二组的血清，36个已知感染有tagA+菌株，而且30个幽门螺旋杆菌菌株为tagA-。不意外的是，未感染者的光密度值几乎相同于参考组。与此相反，感染有tagA+菌株的人的值显著更高(学生T-检验，p＜0.001，一尾)。在其分离物只有tagA-菌株的人的血清中，观察到双峰分布。对27种血清，其值类似于未感染者的两个组中的值，但对三种血清其值高出许多而且类似于感染有tagA+菌株的人。
为建立一个用于诊断分析的阈值，测定几个光密度比值限度(cut-off)的精确性(图5)。总之，当以94.4％的敏感性和92.5％的特异性用35个未感染病人(参照)+3个标准偏差间隔时可获最高的精确性。这种类型的阈值用于将来的研究中。在接收机工作特征(ROC)曲线基础上，用orv220有高水平的tagA的分辨。抗体水平稳定性的评估
为测定TagA产物血清抗体是否在慢性幽门螺旋杆菌感染中持续存在，36个流行病患者的配对血清样品为以前研究临床并且评估了与幽门螺旋杆菌相关的流行病特征。通常，7.59年获得的样品分开，而且标准幽门螺旋杆菌ELISA的值与TagA ELISA的值对比。
36个参加者中，没有阳性到阴性抗体成相互的血清转换。第一和第二血清的平均光密度值高度相似(0.217比0.249；p＝0.3，配对t-检验；表6)  。tagA阳性与胃癌的正相关
已开发了一种用TagA或其抗原片段检测感染有具TagA幽门螺旋杆菌菌株的人的分析方法，该发明表明tagA+的感染与胃癌发作的风险相关。从早期的日本-美国病人的研究中，103个在21年观察期中发作为胃癌，在胃癌诊断的13年前基于从他们血清中分析发现他们为幽门螺旋杆菌感染。每一病例匹配于同一对中的对照，对照同岁并也为幽门螺旋杆菌感染；103个发作为胃癌的幽门螺旋杆菌感染者的特征和他们的年龄匹配对照见于表7。有关人口统计和实验值的方面两组类似。
对该人群，TagA血清抗体的存在(即，感染有tagA阳性幽门螺旋杆菌菌株)与胃癌发作危险的增加有关(OR＝1.9，p＝0.08)(表8)。一项分析在101个远端胃癌的病例中而且他们的对照表示高度类似的值，如所预期的(OR＝1.8，p＝0.11)。当远端胃癌的病例与癌症的组织类型相符时，与肠类型有最强的相关(OR＝2.3，p＝0.056)而不弥散型(OR＝1.0，p＝1.0)；有3个人组织学类模式不可测。TagA ELISA的阳性在获取血清和诊断为癌症的间隔中并非血清转换的结果，也不是癌症发作危险中TagA抗体作为一个因子反应的范围。幽门螺旋杆菌感染者的人群中，tagA的存在与胃癌28％的危险性(95％C.I.＝0-57％)相关。TagA的IgG抗体水平和保守的幽门螺旋杆菌来源的IgG水平没有相关性。
病人诊断为胃癌的年龄相符于TagA抗体分析。对52个小于72岁诊断为胃癌的人，TagA血清阳性相关于胃癌危险性的3倍的增加。与此相反，诊断时大于或等于72岁的51个人，相关性不明显(OR＝1.3，95％C.I.＝0.5-3.5)。TagA血清阳性相关于晚期肿瘤(3或4)发作的危险，OR＝2.6，95％C.I.＝1.1-6.2；p＝0.03，但不是早期肿瘤(1或2)(OR＝1.0)。当被实验者根据出生顺序或亲族大小相符时，相关于TagA血清阳性胃癌发作的危险性不增加。
尽管以上OR值的一些用保守两尾显著性分析时统计学上不显著，用一尾分析指示，所有的癌症和肠类癌症的相关性达到统计显著性(分别为p＝0.04和0.028)。而且，两组间危险性非检测的不同、分析中完美精确性的缺乏和病人间对该感染应答的差异可能有助于解释显著性的缺乏。多重感染
同时感染有两种幽门螺旋杆菌菌株的频率在10-13％(14，15)，而且同时也观察三种不同菌株的感染(33)。最初的验证研究中，每个病人只取单个克隆，于是没有机会检测多重感染。然而，仅有tagA-菌株感染的30个中的3个(10％)具对TagA高水平血清应答提示这些病人共感染有tagA+菌株。由于只有同时感染有tagA-指征菌株和第二tagA+菌株的结合可表明克隆测试和血清分析的二歧结果，该数据提示多重感染的频率可能基本上高于以前报导的频率，后者基于少量的活组织检查(4，15)。
本实施例进一步支持幽门螺旋杆菌感染的非损伤分析的应用，因为它们表明实际上取样全部胃的一切分析。与此相反，基于活组织检查的技术只取样胃粘膜的一小部分(＜＜1％)。因为TagA为免疫主导抗原(17)，血清学分析有潜力检测tagA+有机体的感染，既使与tagA-相比数量少。
与侵袭力更强的肿瘤(诊断时更小的年龄及更高的时期)的相关性以及数据与提出的假说的相符合表明效果的确如大量TagA生物学的事实支持的一样。首先，tagA+菌株的感染与上皮细胞损伤的增强有关(18，19)表面胃上皮细胞所损伤促进或可能启动癌症的发生。第二，cagA+菌株的感染与更高程度的胃发炎(8，19)和促炎病细胞因子如IL-1和IL-8的表达增强有关(19，35)。这可能归因于上皮的损伤。第三，大多数tagA+菌株也表达液泡化细胞毒素活性(16，17)。以血清中和抗体评估的细胞毒素的表达可能与胃癌相关(36)。最后，肠类胃癌比弥散型更高度地与炎症和萎缩性胃炎相关。
已表明与保存幽门螺旋杆菌菌株应答的高滴度抗体与胃癌的危险相关(5，8)。这种现象的一个解释是高水平抗体为炎症程度的标志，活跃的炎症反应被认为时癌症发生的前导事件(1)。胃癌与抗TagA抗体水平严格相关性的缺乏可能反映过度匹配，因为只有感染有幽门螺旋杆菌菌株的人才被选择，它们全都有一定程度的炎症。任何情况下，其显著性必须为TagA阳性存在于78％的未发作为癌症的幽门螺旋杆菌感染对照的事实所校正。于是，tagA+的感染即不是必需也非足够诱发癌症，但却是参与这一过程的一个因子。
某菌株中tagA的存在可能是邻近基因或与炎症或癌发过程相关的特殊表型的一个标志。但是，该实施例表明特殊幽门螺旋杆菌菌株与胃癌的不同的危险性相关。总结
在感染有tagA+菌株的人中，血清学活性存在宽范围，但与未感染者的活性基本上不交迭。这些年来抗微生物治疗缺乏的结果的稳定性，进一步指示本TagA分析方法的用处。
已提供检测幽门螺旋杆菌tagA+菌株感染的精确分析，本发明也能测定tagA+菌株的感染为胃癌发作的危险因子。与感染tagA-菌株相比，tagA+菌株的感染在考察的21年里几乎加倍了胃癌发作的危险，而且对发作为肠类肿瘤的病人效应更为显著。
已提供纯化的TagA或TagA的抗原片段，并表明TagA菌株的感染指示易发生胃癌的易感性，并且能够进一步应用本发明的发现。
表5
应用orv220的TagA ELISA的诊断值分组被实验者的数目    大于阈值的数目(％)*
                1SD       2SD       3SD       4SD未感染        80    12(15％)  9(11.3)   6(7.5％)  3(3.8％)感染tagA-菌株30    9(30％)   6(20％)   5(16.7％) 4(13.3％)感染tagA+菌株36    36(100％) 3597.2％) 3494.4％) 31(86.1％)*阈值定义为平均值加参照组35个人光密度值的标准方差的间隔，参照组已知未被幽门螺旋杆菌感染。
表6
36个被实验者血清抗体对幽门螺旋杆菌抗原的稳定性
血清IgG对所示抗原的应答血清样品    保存的幽门螺旋杆菌抗原**    Tag+首次取样     3260                 0.217±0.30随后取样*   2913                 0.249±0.35*随后样品在首次取样平均7.59±1.0年后获取。**抗体水平用5个幽门螺旋杆菌菌株超声物所交互几何平均效价表示。+  抗体用平均值±SD光密度值表示。
表7
获取血清时感染有幽门螺旋杆菌胃癌和对照被实验者的特征特征                    病人          对照         P-值
                    (n＝103)      (n＝103)考察的平均年龄(年)      58.8          58.7         0.18出生于美国(％)          83            83           0.83已婚(％)                93            95           0.72使用酒精(％)            65            73           0.27平均体重指数            23.5          24.0         0.33平均舒张血压(mm Hg)     81.6          82.1         0.74平均血清胆固醇(mmol/l)  5.7           5.6          0.74平均血糖(mmol/l)        9.3           9.2          0.92
表8
感染tagA+幽门螺旋杆菌菌株和胃癌相关的概率胃癌类型    匹配对状况a  总数    机率        95％信度间b
        (病人/对照)
   +/++/-   -/+     -/-所有    69  21  11  2     103      1.9         (0.9-4.0)远端型  68  20  11  2     101      1.8         (0.9-3.8)肠型    48  18  8   1     75       2.3         (1.0-5.2)弥散型  18  2   2   1     23       1.0         (0.1-7.1)a +/+，病人和其匹配的对照表现对TagA的血清型应答。+/-，病人表现对TagA的血清型应答，而对照没有。-/+，对照表现对TagA的血清型应答，而病人没有。-/-，病人和对照均不表现对TagA的血清型应答。b 两尾分析
本申请中参考了各种文献。这些出版物的公开内容在此引入作为文献以更完全地描述本发明涉及的领域。参考文献1.Blaser MJ，Parsonnet J.临床调查杂志(J Clin Invest)94：4-8，1994.2.Correa P.新英格兰医学杂志(N Engl J Med)325：1170-1171，1991.3.Talley等国立癌症研究所杂志(J Nat Cancer Instit)83：1734-1739，1991.4.Parsonnet等新英格兰医学杂志(N Engl J Med)325：1127-1131，1991.5.Nomura等新英格兰医学杂志(N Engl J Med)325：1132-1136，1991.6.Forman等国际癌症杂志46：608-611，1990.7.EUROGAST研究组柳叶刀，341：1359-1362，1993.8.Asaka等癌症73：2691-2694，1994.9.Sipponen等Scand J Gastroneterol Suppl(斯勘德维亚胃肠学杂志增刊)196：S3-S6，1993.10.Forman等生化杂志(MMJ)302：1302-1305，1991.11.Correa P. 癌症研究52：6735-6740，1992.12.Taylor DN，Blaster MJ流行病学回顾13：42-59，1991.13.Akopyanz等核酸研究20：5137-5142，1992.14.Fujimoto等临床微生物杂志32：331-334，1994.15.Prewett等胃肠学102：829-833，1992.16.Tummuru等感染免疫61：1799-1809，1993.17.Cocacci等美国国家科学院烷刊90：5791-5795，1993.18.Crabtree等柳叶刀338：332-335，1991.19.Peek等胃肠学1994；(印刷中)20.Cover等感染免疫58：603-610，1990.21.Cover等“作为溃疡幽门螺旋杆菌菌株标记的120-128KDa细胞毒素相关蛋白”摘要见于美国胃肠学会年会，新奥耳良，路易斯安纳，五月，1994.22.Dooly等新英格兰医学杂志321：1562-1566，1989.23.Cover等临床调查杂志90：913-918，1992.24.Peeka RM，Jr.临床微生物杂志1994.25.Perez-Perez等国际医学年鉴109：11-17，1988.26.Studier等分子生物学杂志189：113-130，1986.27.Baier等生物技术17：94-99，1994.28.Parsonnet等胃肠学102：41-46，1992.29.Breslow等癌症研究国际机构247-276，1980.30.Harrell FE，Jr PHGLM方法，在Joyner SP(编辑)：SUGI补无文库用户手册。Cary，NC，SAS研究院；1983：267-294.31.Walter S.国际流行病杂志7：175-182，1978.32.ROC33.Fox等美国微生物学会华盛顿特区34.Worth等慢性病杂志23：389-397，1970.35.Crabtree等临床病理学杂志47：61-66，1994.36.Hirai等癌症国际杂志56：56-60，1994.37.Sipponen P，Lauren：斯勘德维亚胃肠杂志29：336-340，1994.38.Sipponen等胃肠肝杂志6：244-248，1991.39.Leuk等医学微生物杂志26：93-99，198840.Figura等临床微生物杂志27：225-226，1988.41.Cover和Blaser生物化学杂志267：10570-10575，1992.42.Apel等Zbl.Bakt.Hyg.A.268：217-276，1988.43.Gerstenecker等欧洲临床微生物感染疾病杂志11(7)：595-601，1992.44.Kunkel等酶学方法1987：154：367，198745.Brake等1984.46.HarlOw和Lane，抗体；实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1988.47.Donnenberg和Kaper感染免疫学4310-4317，1991.48.Arnon，R.(编辑)合成疫苗I：83-92，CRC出版社，Baca Raton，Florida，1987.49.Birnboim和Doly核酸研究7：1513-1523，1979.50.Sambrook等分子克隆：实验室手册，1989.51.Sanger等美国国家科学院院刊71：1342-1346.32，1977.52.Hawley和McClure核酸研究11：2237-2255，1983.53.Blaser和Gotschlich生物化学杂志16：7583-7600，1988.54.Short等核酸研究16：7583-7600，1988.55.Blaser等感染免疫42：276-284，198356.Oakley等生化年鉴105：361-363，1980.57.Feinnerg和Bogelstein生化年鉴132：6-13，1983.58.Montefliort等临床微生物杂志26：231-235，1988.59.Cover等感染免疫59：1264-1270，1991.60.Labigne-Roussel等细菌学杂志170：1704，1988.61.Ferrero等细菌学杂志174：4212，1992.62.Hiratsuka等分子基因遗传217：185-194，198463.Rodermel等Bogorad遗传116：127-139，198764.Forsburg和Guarente基因和发育(Genes Dev)3：1166-1178，198965.Hudspeth等细胞30：617-626，1982.66.Ju等分子细胞生物学10：5226-5234，1990.67.O’Hara等核酸研究16：10133-10170，1988.68.Rhode等基因和发育(Genes Dev)3：1936-1939，198969.Tanaka等分子细胞生物学9：757-769，1988.70.Toda等；基因和发育(Genes Dev)2：517-527，1988.71.Stahl等核酸研究14：3089-3102，1986.72.Salmeron和Johnston核酸研究14：7767-7781，1986.73.Gaber等分子细胞生物学8：2848-2859，1989.74.Trimmer等Neutrol 3：33-49，1989.75.Ferretti等国家科学院院刊82：599-603，198676.Wosnick等基因76：153-160，1989序列
(1)一般信息
  (i)申请人：COVER，TIMOTHY L.
           BLASTER，MARTIN J.
           HARRY KLEANTHOU S
           TUMMURE，MURALIK.R.
  (ii)发明题目：tagA基因以及检测消化性溃疡和胃癌易感性的方法
  (iii)序列数：4
  (iv)联系地址：
     (A)地址：NEEDLE&ROSENBERG，P.C.
     (B)街区：127樱桃树街，Suite 1200
     (C)城市：亚特兰大
     (D)州：佐治亚
     (E)国家：USA
     (F)邮区：30303
     (v)计算机可读方式：
     (A)介质类型：软盘
     (B)计算机：IBM PC兼容
     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
     (D)软件：Pantent In Release#1.0，版本#1.25
  (vi)当前申请数据：
     (A)申请号：
     (B)提交日期：
     (C)分类：
  (viii)委托代理人信息：
     (A)姓名：SPRATT，GWENDOLYN D.
     (B)注册号：36，016
     (C)参考/存档号：2200.030
  (ix)通讯联系信息：
     (A)电话：404/688-0770
     (B)传真：404/688-9880
(2)SEQ ID NO：1的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：3648碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：DNA(基因组的)
  (vi)最初来源：
    (A)有机体：幽门螺旋杆菌
  (ix)特征：
    (A)名称/键：CDS
    (B)位置：1072..3648
  (xi)序列描述：SED ID NO：1：ATGGGCTGCG CGTAACGAAA AACAGTCGCT TGACCTCTTT TGATGTCATC AGAGATTTTC         60CAAATATCCG CTATACCTTT GACTCCTAGA GCGCAACCAC CTACGATCGC TAGAACAGAA         120ATGATCTGAA CCACCAAAGT TTTAGTCTCA GTAATGCCTG ATGCAGGACT GTCGAAAGCC         180ATTAAAGGAT TGGCTGCTAT CGCTAGCCCT AAAGTTACTA CAACTTTCTT GTAGCTGTCA         240GTGATTCTTG TAAAAAATTT CATGCGTTTC CTTTCAAATT GAAATCAATC GTTTGAGTAT         300ATCAAAAAAA AGTATTTTTA TACTATTCAT ACAAGCGCTA CTTTATAATT TAAATCAAAA         360CCGACGCTTT TGTTTGACAA CTGATATAAT TTAGGAACAA TAAACCTACT TGTCCCAACC         420ATTTTTCTTT CTCAAGTCAT CGTAGAATTG TAGATCTTTA GGATCTTTGA TGTATTTTTT         480AATCGTCTCA GGTTGAAACC TAAAAACAAG CAGAAACAAA CCCAAGCTGA TCAGAGTGAG         540AATAAAGCTC CATTTTAAGC AACTCCATAA ACCACTAAAG AAACTTTTTT TGAGACTCTC         600TTTGAAAATC TGTCCTATTG ATTTGTTTTC CATTTTGTTT CCCATGCGGA TCACAAACGC         660TTAATTACAA ATACATACTA TAATAAGTAT GGCACACACA AACCAAACCA TTTTTAGAAC         720GCTTCATGCA CTCACCTTGC TCCTAACCAT TTCTCCAACC ATTCTTTAGCG TTGCATTTGA        780TTTCTTCAAA AAGGCTCATT TCTTAGTTTC TTTTATTCTT AAAATTTTTC CATTCTAGCA         840AATTTTTGTT AATTGTGGGT AAAAATGTGA ATCGTTCCTA GCTTTTAGAC GCTTGCAACG         900ATCGGACTTT TTTCAATATT AATGAAAAAA TGCCAAATAT TCTAAATATT GTGGTATAGT         960GATAACGTTC AAAGACACGA ATTGCATACT CAAAGTGTGT AGTAGTTTTT AGCGGTCTTT         1020GATACCAATA AGATACCGAT AGGTATGAAA CTAGGTATAG AAGGAGAAAC A ATG ACT          1077
                                                     Met Thr
                                                       1AAC GAA ACT ATT GAC CAA CAA CCA CAA ACC GAA GCG GCT TTT AAC CCG           1125Asn Glu Thr Ile Asp Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Ala Phe Asn Pro
      5                  10                  15CAG CAA TTT ATC AAT AAT CTT CAA GTA GCT TTT CTT AAA GTT GAT AAC           1173Gln Gln Phe Ile Asn Asn Leu Gln Val Ala Phe Leu Lys Val Asp Asn
 20                  25                  30GCT GTC GCT TCA TAC GAT CCT GAT CAA AAA CCA ATC GTT GAT AAG AAC        1221Ala Val Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Gln Lys Pro Ile Val Asp Lys Asn35                  40                  45                  50GAT AGG GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG GGA ATC TCG CAA TTA AGG GAA        1269Asp Arg Asp Asn Arg Gln Ala Phe Glu Gly Ile Ser Gln Leu Arg Glu
            55                   60                  65GAA TAC TCC AAT AAA GCG ATC AAA AAT CCT ACC AAA AAG AAT CAG TAT        1317Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Ile Lys Asn Pro Thr Lys Lys Asn Gln Tyr
         70                  75                  80TTT TCA GAC TTT ATC AAT AAG AGC AAT GAT TTA ATC AAC AAA GAC AAT        1365Phe Ser Asp Phe Ile Asn Lys Ser Asn Asp Leu Ile Asn Lys Asp Asn
     85                  90                  95CTC ATT GTC GTG GAA TCT TCC ACA AAG AGC TTT CAG AAA TTT GGG GAT        1413Leu Ile Val Val Glu Ser Ser Thr Lys Ser Phe Gln Lys Phe Gly Asp
100                 105                 110CAG CGT TAC CGA ATT TTC ACA AGT TGG GTG TCC CAT CAA AAC GAT CCG        1461Gln Arg Tyr Arg Ile Phe Thr Ser Trp Val Ser His Gln Asn Asp Pro115                 120                 125                 130TCT AAA ATC AAC ACC CGA TGC ATC CGA AAT TTT ATG GAA CAT ACC ATA        1509Ser Lys Ile Asn Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile
            135                 140                 145CAA CCC CCT ATC CCT GAT GAC AAA GAA AAA GCA GAG TTT TTG AAA TCT        1557Gln Pro Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser
        150                 155                 160GCC AAA CAA TCT TTT GCA GGA ATC ATC ATA GGG AAT CAA ATC CGA ACG        1605Ala Lys Gln Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gln Ile Arg Thr
    165                 170                 175GAT CAA AAA TTC ATG GGC GTG TTT GAT GAA TCC TTG AAA GAA AGG CAA        1653Asp Gln Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu Lys Glu Arg Gln
180                 185                 190GAA GCA GAA AAA AAT GGA GGG CCT ACT GGT GGG GAT TGG TTG GAT ATT        1701Glu Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly Gly Asp Trp Leu Asp Ile195                 200                 205                 210TTT TTA TCA TTT ATA TTT GAC AAA AAA CAA TCT TCT GAT GTC AAA GAA        1749Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys Lys Gln Ser Ser Asp Val Lys Glu
            215                 220                 225GCA ATC AAT CAA GAA CCA CTT CCT CAT GTC CAA CCA GAT ATA GCC ACT        1797Ala Ile Asn Gln Glu Pro Leu Pro His Val Gln Pro Asp Ile Ala Thr
        230                 235                 240AGC ACC ACT CAC ATA CAA GGC TTA CCG CCT GAA TCT AGG GAT TTG CTT        1845Ser Thr Thr His Ile Gln Gly Leu Pro Pro Glu Ser Arg Asp Leu Leu
    245                 250                 255GAT GAA AGG GGT AAT TTT TCT AAA TTC ACT CTT GGC GAT ATG GAA ATG        1893Asp Glu Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met Glu Met
260                 265                 270TTA GAT GTT GAG GGC GTC GCC GAC ATG GAT CCC AAT TAC AAG TTC AAT        1941Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Tyr Lys Phe Asn275                 280                 285                 290CAA TTA TTG ATT CAC AAT AAC ACT CTG TCT TCT GTG TTA ATG GGG AGT        1989Gln Leu Leu Ile His Asn Asn Thr Leu Ser Ser Val Leu Met Gly Ser
            295                 300                 305CAT GAT GGC ATA GAA CCT GAA AAA GTT TCA TTA TTG TAT GCG GGC AAT        2037His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser Leu Leu Tyr Ala Gly Asn
        310                 315                 320GGT GGT TTT GGA GCC AAG CAC GAT TGG AAC GCC ACC GTT GGT TAT AAA        2085Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys
    325                 330                 335GAC CAA CAA GGT AAC AAT GTG GCT ACA ATA ATT AAT GTG CAT ATG AAA        2133Asp Gln Gln Gly Asn Asn Val Ala Thr Ile Ile Asn Val His Met Lys
 340                345                 350AAC GGC AGT GGC TTA GTC ATA GCA GGT GGT GAG AAA GGG ATT AAC AAC        2181Asn Gly Ser Gly Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn355                 360                 365                 370CCT AGT TTT TAT CTC TAC AAA GAA GAC CAA CTC ACA GGC TCA CAA CGA        2229Pro Ser Phe Tyr Leu Tyr Lys Glu Asp Gln Leu Thr Gly Ser Gln Arg
            375                 380                 385GCA TTG AGT CAA GAA GAG ATC CAA AAC AAA ATA GAT TTC ATG GAA TTT        2277Ala Leu Ser Gln Glu Glu Ile Gln Asn Lys Ile Asp Phe Met Glu Phe
        390                 395                 400CTT GCA CAA AAC AAT GCT AAA TTA GAC AGC TTG AGC GAG AAA GAG AAA        2325Leu Ala Gln Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Glu Lys
    405                 410                 415GAA AAA TTC CGA AAT GAG ATT AAG GAT TTC CAA AAA GAC TCT AAG CCT        2373Glu Lys Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe Gln Lys Asp Ser Lys Pro
420                 425                 430TAT TTA GAC GCC CTA GGG AAT GAT CGT ATT GCT TTT GTT TCT AAA AAA        2421Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp Arg Ile Ala Phe Val Ser Lys Lys435                 440                 445                 450GAC CCA AAA CAT TCA GCT TTA ATT ACT GAG TTT AAT AAG GGG GAT TTG        2469Asp Pro Lys His Ser Ala Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp Leu
            455                 460                 465AGC TAC ACT CTC AAA GTT ATG GGA AAA AAG CAG ATA AAG GCT TTA GAT        2517Ser Tyr Thr Leu Lys Val Met Gly Lys Lys Gln Ile Lys Ala Leu Asp
        470                 475                 480AGG GAG AAA AAT GTC ACT CTT CAA GGT AAC CTA AAA CAT GAT GGC GTG        2565Arg Glu Lys Asn Val Thr Leu Gln Gly Asn Leu Lys His Asp Gly Val
    485                 490                 495ATG TTT GTT AAT TAT TCT AAT TTC AAA TAC ACC AAC GCC TCC AAG AGT        2613Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn Ala Sar Lys Ser
500                 505                 510CCC AAT AAG GGT GTA GGC GTT ACG AAT GGC GTT TCC CAT TTA GAA GCA        2661Pro Asn Lys Gly Val Gly Val Thr Asn Gly Val Ser His Leu Glu Ala515                 520                 525                 530GGC TTT AGC AAG GTG GCT GTC TTT AAT TTG CCT AAT TTA AAT AAT CTC        2709Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu Pro Asn Leu Asn Asn Leu
            535                 540                 545GCT ATC ACT AGT GTC GTA AGG CGG GAT TTA GAG GAT AAA CTA ATC GCT        2757Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg Asp Leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala
        550                 555                 560AAA GGA TTG TCC CCA CAA GAA GCT AAT AAG CTT GTC AAA GAT TTT TTG        2805Lys Gly Leu Ser Pro Gln Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu
    565                 570                 575AGT AGC AAC AAA GAA TTG GTT GGA AAA GCT TTA AAC TTCT AAT AAA GCT       2853Ser Ser Asn Lys Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Pne Asn Lys Ala
580                 585                 590GTA GCT GAA GCT AAA AAC ACA GGC AAC TAT GAC GAG GTG AAA CGA GCT        2901Val Ala Glu Ala Lys Asn Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys Arg Ala595                 600                 605                 610CAG AAA GAT CTT GAA AAA TCT CTA AAG AAA CGA GAG CAT TTG GAG AAA        2949Gln Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu Glu Lys
            615                 620                 625GAT GTA GCG AAA AAT TTG GAG AGC AAA AGC GGC AAC AAA AAT AAA ATG        2997Asp Val Ala Lys Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn Lys Asn Lys Met
        630                 635                 640GAA GCA AAA GCT CAA GCT AAC AGC CAA AAA GAT GAG ATT TTT GCG TTG        3045Glu Ala Lys Ala Gln Ala Asn Ser Gln Lys Asp Glu Ile Phe Ala Leu
    645                 650                 655ATC AAT AAA GAG GCT AAT AGA GAC GCA AGA GCA ATC GCT TAC GCT CAA        3093Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Gln
660                 665                 670AAT CTT AAA GGC ATC AAA AGG GAA TTG TCT GAT AAA CTT GAA AAT ATC        3141Asn Leu Lys Gly Ile Lys Arg Glu Leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn Ile675                 680                 685                 690AAC AAG GAT TTG AAA GAC TTT AGT AAA TCT TTT GAT GGA TTC AAA AAT        3189Asn Lys Asp Leu Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe Lys Asn
            695                 700                 705GGC AAA AAT AAG GAT TTC AGC AAG GCA GAA GAA ACG CTA AAA GCC CTT        3237Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys Ala Leu
        710                 715                 720AAA GGC TCG GTG AAA GAT TTA GGT ATC AAT CCG GAA TGG ATT TCA AAA        3285Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp Ile Ser Lys
    725                 730                 735GTT GAA AAC CTT AAT GCA GCT TTG AAT GAA TTC AAA AAT GGC AAA AAT        3333Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys Asn Gly Lys Asn
740                 745                 750AAG GAT TTC AGC AAG GTA ACG CAA GCA AAA AGC GAC CAA GAA AAT TCC        3381Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gln Ala Lys Ser Asp Gln Glu Asn Ser755                 760                 765                770ATT AAA GAT GTG ATC ATC AAT CAA AAG ATA ACG GAT AAA GTT GAT GAA        3429Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gln Lys Ile Thr Asp Lys Val Asp Glu
            775                 780                 785CTC AAT CAA GCG GTA TCA GTG GCT AAA ATA GCG TGC GAT TTC AGT GGG       3477Leu Asn Gln Ala Val Ser Val Ala Lys Ile Ala Cys Asp Phe Ser Gly
        790                 795                 800GTA GAG CAA GCG TTA GCC GAT CTC AAA AAT TTC TCA AAG GAG CAA TTG       3525Val Glu Gln Ala Leu Ala Asp Leu Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gln Leu
    805                 810                 815GCT CAA CAA GCT CAA AAA AAT GAA AGT TTC AAT GTT GGA AAA TCT GAA       3573Ala Gln Gln Ala Gln Lys Asn Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu
820                 825                 830ATA TAC CAA TCC GTT AAG AAT GGT GTG AAC GGA ACC CTA GTC GGT AAT       3621Ile Tyr Gln Ser Val Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val Gly Asn835                 840                 845                 850GGG TTA TCT GGA ATA GAG GCC ACA GGGGly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Gly
            855
(2)SEQ ID NO：2的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：859氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
  (ii)分子类型：蛋白质
  (xi)序列描述：SED ID NO：2：Met Thr Asn Glu Thr Ile Asp Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Ala Phe1               5                  10                  15Asn Pro Gln Gln Phe Ile Asn Asn Leu Gln Val Ala Phe Leu Lys Val
         20                  25                  30Asp Asn Ala Val Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Gln Lys Pro Ile Val Asp
        35               40                  45Lys Asn Asp Arg Asp Asn Arg Gln Ala Phe Glu Gly Ile Ser Gln Leu
 50                  55                  60Arg Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Ile Lys Asn Pro Thr Lys Lys Asn65                  70                  75                  80Gln Tyr Phe Ser Asp Phe Ile Asn Lys Ser Asn Asp Leu Ile Asn Lys
             85                  90                  95Asp Asn Leu Ile Val ValGlu Ser Ser Thr Lys Ser Phe Gln Lys Phe
        100                105                 110Gly Asp Gln Arg Tyr Arg Ile Phe Thr Ser Trp Val Ser His Gln Asn
    115                 120                 125Asp Pro Ser Lys Ile Asn Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His
130                 135                 140Thr Ile Gln Pro Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu145                 150                 155                 160Lys Ser Ala Lys Gln Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gln Ile
           165                  170                 175Arg Thr Asp Gln Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu Lys Glu
        180                 185                 190Arg Gln Glu AIa Glu Lys Asn Gly Gly proThr Gly Gly Asp Trp LeuAsp Ile Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys Lys Gln Ser Ser Asp Val
210                 215                 220Lys Glu Ala Ile Asn Gln Glu Pro Leu Pro His Val Gln Pro Asp Ile225                 230                 235                 240Ala Thr Ser Thr Thr His Ile Gln Gly Leu Pro Pro Glu Sar Arg Asp
            245                 250                 255Leu Leu Asp Glu Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met
        260                 265                 270Glu Met Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Tyr Lys
    275                 280                 285Phe Asn Gln Leu Leu Ile His Asn Asn Thr Leu Ser Ser Val Leu Met
290                 295                 300Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser Leu Leu Tyr Ala305                 310                 315                 320Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp Trp Asn Ala Thr Val Gly
            325                 330                 335Tyr Lys Asp Gln Gln Gly Asn Asn Val Ala Thr Ile Ile Asn Val His
        340                 345                 350Met Lys Asn Gly Ser Gly Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile
    355                 360                 365Asn Asn Pro Ser Phe Tyr Leu Tyr Lys Glu Asp Gln Leu Thr Gly Ser
370                 375                 380Gln Arg Ala Leu Ser Gln Glu Glu Ile Gln Asn Lys Ile Asp Phe Met385                 390                 395                 400Glu Phe Leu Ala Gln Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys
             405                410                 415Glu Lys Glu Lys Phe Arg ASn Glu Ile Lys Asp Phe Gln Lys Asp Ser
        420                 425                 430Lys Pro Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp Arg Ile Ala Phe Val Ser
    435                 440                 445Lys Lys Asp Pro Lys His Ser Ala Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly
450                 455                 460Asp Leu Ser Tyr Thr Leu Lys Val Met Gly Lys Lys Gln Ile Lys Ala465                 470                 475                 480Leu Asp Arg Glu Lys Asn Val Thr Leu Gln Gly Asn Leu Lys His Asp
            485                 490                 495Gly Val Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn Ala Ser
        500                 505                 510Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val Thr Asn Gly Val Ser His Leu
     515                520                 525Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu Pro Asn Leu Asn
530                 535                 540Asn Leu Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg Asp Leu Glu Asp Lys Leu545                 550                 555                 560Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gln Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp
            565                 570                 575Phe Leu Ser Ser Asn Lys Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn
        580                 585                 590Lys Ala Val Ala Glu Ala Lys Asn Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys
    595                 600                 605Arg Ala Gln Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu
610                 615                 620Glu Lys Asp Val Ala Lys Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn Lys Asn625                 630                 635                 640Lys Met Glu Ala Lys Ala Gln Ala Asn Ser Gln Lys Asp Glu Ile Phe
            645                 650                 655Ala Leu Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp Ala Arg Ala Ile Ala Tyr
        660                 665                 670Ala Gln Asn Leu Lys Gly Ile Lys Arg Glu Leu Ser Asp Lys Leu Glu
    675                 680                 685Asn Ile Asn Lys Asp Leu Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe
690                 695                 700Lys Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys705                 710                 715                 720Ala Leu Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp Ile
            725                 730                 735Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys Asn Gly
       740                  745                 750Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gln Ala Lys Ser Asp Gln Glu
    755                 760                 765Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gln Lys Ile Thr Asp Lys Val
770                 775                 780Asp Glu Leu Asn Gln Ala Val Ser Val Ala Lys Ile Ala Cys Asp Phe785                 790                 795                 800Ser Gly Val Glu GLn Ala Leu Ala Asp Leu Lys Asn phe Ser Lys Glu
             805                810                 815Gln Leu Ala Gln Gln Ala Gln Lys Asn Glu Ser phe Asn Val Gly Lys
        820                 825                 830Ser Glu Ile Tyr Gln Ser Val Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val
    835                 840                845Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Gly
850                 855
(2)SEQ ID NO：3的信息：
 (i)序列特征：
   (A)长度：482 1碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑学：线性
 (ii)分子类型：DNA(基因组的)
 (ix)特征：
   (A)名称/键：CDS
   (B)位置：1072..4614
 (xi)序列描述：SED ID NO：3：
ATGGGCTGCG CGTAACGAAA AACAGTCGCT TGACCTCTTT TGATGTCATC AGAGATTTTC    60
CAAATATCCG CTATACCTTT GACTCCTAGA GCGCAACCAC CTACGATCGC TAGAACAGAA    120
ATGATCTGAA CCACCAAAGT TTTAGTCTCA GTAATGCCTG ATGCAGGACT GTCGAAAGCC    180
ATTAAAGGAT TGGCTGCTAT CGCTAGCCCT AAAGTTACTA CAACTTTCTT GTAGCTGTCA    240
GTGATTCTTG TAAAAAATTT CATGCGTTTC CTTTCAAATT GAAATCAATC GTTTGAGTAT    300
ATCAAAAAAA AGTATTTTTA TACTATTCAT ACAAGCGCTA CTTTATAATT TAAATCAAAA    360
CCGACGCTTT TGTTTGACAA CTGATATAAT TTAGGAACAA TAAACCTACT TGTCCCAACC    420
ATTTTTCTTT CTCAAGTCAT CGTAGAATTG TAGATCTTTA GGATCTTTGA TGTATTTTTT    480
AATCGTCTCA GGTTGAAACC TAAAAACAAG CAGAAACAAA CCCAAGCTGA TCAGAGTGAG    540
AATAAAGCTC CATTTTAAGC AACTCCATAA ACCACTAAAG AAACTTTTTT TGAGACTCTC    600
TTTGAAAATC TGTCCTATTG ATTTGTTTTC CATTTTGTTT CCCATGCGGA TCACAAACGC    660TTAATTACAA ATACATACTA TAATAAGTAT GGCACACACA AACCAAACCA TTTTTAGAAC       720GCTTCATGCA CTCACCTTGC TCCTAACCAT TTCTCCAACC ATCTTTAGCG TTGCATTTGA       780TTTCTTCAAA AAGGCTCATT TCTTAGTTTC TTTTATTCTT AAAATTTTTC CATTCTAGCA       840AATTTTTGTT AATTGTGGGT AAAAATGTGA ATCGTTCCTA GCTTTTAGAC GCTTGCAACG       900ATCGGACTTT TTTCAATATT AATGAAAAAA TGCCAAATAT TCTAAATATT GTGGTATAGT       960GATAACGTTC AAAGACACGA ATTGCATACT CAAAGTGTGT AGTAGTTTTT AGCGGTCTTT      1020GATACCAATA AGATACCGAT AGGTATGAAA CTAGGTATAG AAGGAGAAAC A ATG ACT       1077
                                                     Met Thr
                                                       1AAC GAA ACT ATT GAC CAA CAA CCA CAA ACC GAA GCG GCT TTT AAC CCG        1125Asn Glu Thr Ile Asp Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Ala Phe Asn Pro
      5                  10                  15CAG CAA TTT ATC AAT AAT CTT CAA GTA GCT TTT CTT AAA GTT GAT AAC        1173Gln Gln Phe Ile Asn Asn Leu Gln Val Ala Phe Leu Lys Val Asp Asn
 20                  25                  30GCT GTC GCT TCA TAC GAT CCT GAT CAA AAA CCA ATC GTT GAT AAG AAC        1221Ala Val Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Gln Lys Pro Ile Val Asp Lys Asn35                  40                  45                  50GAT AGG GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG GGA ATC TCG CAA TTA AGG GAA        1269Asp Arg Asp Asn Arg Gln Ala Phe Glu Gly Ile Ser Gln Leu Arg Glu
             55                  60                  65GAA TAC TCC AAT AAA GCG ATC AAA AAT CCT ACC AAA AAG AAT CAG TAT        1317Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Ile Lys Asn Pro Thr Lys Lys Asn Gln Tyr
         70                  75                  80TTT TCA GAC TTT ATC AAT AAG AGC AAT GAT TTA ATC AAC AAA GAC AAT        1365Phe Ser Asp Phe Ile Asn Lys Ser Asn Asp Leu Ile Asn Lys Asp Asn
     85                  90                  95CTC ATT GTC GTG GAA TCT TCC ACA AAG AGC TTT CAG AAA TTT GGG GAT        1413Leu Ile Val Val Glu Ser Ser Thr Lys Ser Phe Gln Lys Phe Gly Asp
100                 105                 110CAG CGT TAC CGA ATT TTC ACA AGT TGG GTG TCC CAT CAA AAC GAT CCG        1461Gln Arg Tyr Arg Ile Phe Thr Ser Trp Val Ser His Gln Asn Asp Pro115                 120                 125                 130TCT AAA ATC AAC ACC CGA TGC ATC CGA AAT TTT ATG GAA CAT ACC ATA        1509Ser Lys Ile Asn Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile
            135                 140                 145CAA CCC CCT ATC CCT GAT GAC AAA GAA AAA GCA GAG TTT TTG AAA TCT        1557Gln Pro Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser
        150                 155                 160GCC AAA CAA TCT TTT GCA GGA ATC ATC ATA GGG AAT CAA ATC CGA ACG       1605Ala Lys Gln Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gln Ile Arg Thr
    165                 170                 175GAT CAA AAA TTC ATG GGC GTG TTT GAT GAA TCC TTG AAA GAA AGG CAA       1653Asp Gln Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu Lys Glu Arg Gln
180                 185                 190GAA GCA GAA AAA AAT GGA GGG CCT ACT GGT GGG GAT TGG TTG GAT ATT       1701Glu Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly Gly Asp Trp Leu Asp Ile195                 200                 205                 210TTT TTA TCA TTT ATA TTT GAC AAA AAA CAA TCT TCT GAT GTC AAA GAA       1749Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys Lys Gln Ser Ser Asp Val Lys Glu
            215                 220                 225GCA ATC AAT CAA GAA CCA CTT CCT CAT GTC CAA CCA GAT ATA GCC ACT       1797Ala Ile Asn Gln Glu Pro Leu Pro His Val Gln Pro Asp Ile Ala Thr
        230                 235                 240AGC ACC ACT CAC ATA CAA GGC TTA CCG CCT GAA TCT AGG GAT TTG CTT       1845Ser Thr Thr His Ile Gln Gly Leu Pro Pro Glu Ser Arg Asp Leu Leu
    245                 250                 255GAT GAA AGG GGT AAT TTT TCT AAA TTC ACT CTT GGC GAT ATG GAA ATG       1893Asp Glu Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met Glu Met
260                 265                 270TTA GAT GTT GAG GGC GTC GCC GAC ATG GAT CCC AAT TAC AAG TTC AAT       1941Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Tyr Lys Phe Asn275                 280                 285                 290CAA TTA TTG ATT CAC AAT AAC ACT CTG TCT TCT GTG TTA ATG GGG AGT       1989Gln Leu Leu Ile His Asn Asn Thr Leu Ser Ser Val Leu Met Gly Ser
            295                 300                 305CAT GAT GGC ATA GAA CCT GAA AAA GTT TCA TTA TTG TAT GCG GGC AAT       2037His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser Leu Leu Tyr Ala Gly Asn
        310                 315                 320GGT GGT TTT GGA GCC AAG CAC GAT TGG AAC GCC ACC GTT GGT TAT AAA       2085Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys
    325                 330                 335GAC CAA CAA GGT AAC AAT GTG GCT ACA ATA ATT AAT GTG CAT ATG AAA       2133Asp Gln Gln Gly Asn Asn Val Ala Thr Ile Ile Asn Val His Met Lys
 340                345                 350AAC GGC AGT GGC TTA GTC ATA GCA GGT GGT GAG AAA GGG ATT AAC AAC       2181ASn Gly Ser Gly Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn355                 360                 365                  370CCT AGT TTT TAT CTC TAC AAA GAA GAC CAA CTC ACA GGC TCA CAA CGA       2229Pro Ser Phe Tyr Leu Tyr Lys Glu Asp Gln Leu Thr Gly Ser Gln Arg
            375                 380                 385GCA TTG AGT CAA GAA GAG ATC CAA AAC AAA ATA GAT TTC ATG GAA TTT        2277Ala Leu Ser Gln Glu Glu Ile Gln Asn Lys Ile Asp Phe Met Glu Phe
        390                 395                 400CTT GCA CAA AAC AAT GCT AAA TTA GAC AGC TTG AGC GAG AAA GAG AAA        2325Leu Ala Gln Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Glu Lys
    405                 410                 415GAA AAA TTC CGA AAT GAG ATT AAG GAT TTC CAA AAA GAC TCT AAG CCT       2373Glu Lys Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe Gln Lys Asp Ser Lys Pro
420                 425                 430TAT TTA GAC GCC CTA GGG AAT GAT CGT ATT GCT TTT GTT TCT AAA AAA       2421Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp Arg Ile Ala Phe Val Ser Lys Lys435                 440                 445                 450GAC CCA AAA CAT TCA GCT TTA ATT ACT GAG TTT AAT AAG GGG GAT TTG       2469Asp Pro Lys His Ser Ala Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp Leu
            455                 460                 465AGC TAC ACT CTC AAA GTT ATG GGA AAA AAG CAG ATA AAG GCT TTA GAT       2517Ser Tyr Thr Leu Lys Val Met Gly Lys Lys Gln Ile Lys Ala Leu Asp
        470                 475                 480AGG GAG AAA AAT GTC ACT CTT CAA GGT AAC CTA AAA CAT GAT GGC GTG       2565Arg Glu Lys Asn Val Thr Leu Gln Gly Asn Leu Lys His Asp Gly Val
    485                 490                 495ATG TTT GTT AAT TAT TCT AAT TTC AAA TAC ACC AAC GCC TCC AAG AGT       2613Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn Ala Ser Lys Ser
500                 505                 510CCC AAT AAG GGT GTA GGC GTT ACG AAT GGC GTT TCC CAT TTA GAA GCA       2661Pro Asn Lys Gly Val Gly Val Thr Asn Gly Val Ser His Leu Glu Ala515                 520                 525                 530GGC TTT AGC AAG GTG GCT GTC TTT AAT TTG CCT AAT TTA AAT AAT CTC       2709Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu Pro Asn Leu Asn Asn Leu
            535                 540                 545GCT ATC ACT AGT GTC GTA AGG CGG GAT TTA GAG GAT AAA CTA ATC GCT       2757Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg Asp Leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala
        550                 555                 560AAA GGA TTG TCC CCA CAA GAA GCT AAT AAG CTT GTC AAA GAT TTT TTG       2805Lys Gly Leu Ser Pro Gln Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu
    565                 570                 575AGT AGC AAC AAA GAA TTG GTT GGA AAA GCT TTA AAC TTC AAT AAA GCT       2853Ser Ser Asn Lys Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn Lys Ala
580                 585                 590GTA GCT GAA GCT AAA AAC ACA GGC AAC TAT GAC GAG GTG AAA CGA GCT       2901Val Ala Glu Ala Lys Asn Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys Arg Ala595                 600                 605                 610CAG AAA GAT CTT GAA AAA TCT CTA AAG AAA CGA GAG CAT TTG GAG AAG       2949Gln Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu Glu Lys
            615                 620                 625GAT GTA GCG AAA AAT TTG GAG AGC AAA AGC GGC AAC AAA AAT AAA ATG       2997Asp Val Ala Lys Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn Lys Asn Lys Met
        630                 635                 640GAA GCA AAA GCT CAA GCT AAC AGC CAA AAA GAT GAG ATT TTT GCG TTG       3045Glu Ala Lys Ala Gln Ala Asn Ser Gln Lys Asp Glu Ile Phe Ala Leu
    645                 650                 655ATC AAT AAA GAG GCT AAT AGA GAC GCA AGA GCA ATC GCT TAC GCT CAA       3093Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Gln
660                 665                 670AAT CTT AAA GGC ATC AAA AGG GAA TTG TCT GAT AAA CTT GAA AAT ATC       3141Asn Leu Lys Gly Ile Lys Arg Glu Leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn Ile675                 680                 685                 690AAC AAG GAT TTG AAA GAC TTT AGT AAA TCT TTT GAT GGA TTC AAA AAT       3189Asn Lys Asp Leu Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe Lys Asn
            695                 700                 705GGC AAA AAT AAG GAT TTC AGC AAG GCA GAA GAA ACG CTA AAA GCC CTT       3237Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys Ala Leu
        710                 715                 720AAA GGC TCG GTG AAA GAT TTA GGT ATC AAT CCG GAA TGG ATT TCA AAA       3285Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp Ile Ser Lys
    725                 730                 735GTT GAA AAC CTT AAT GCA GCT TTG AAT GAA TTC AAA AAT GGC AAA AAT       3333Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys Asn Gly Lys Asn
740                 745                 750AAG GAT TTC AGC AAG GTA ACG CAA GCA AAA AGC GAC CAA GAA AAT TCC       3381Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gln Ala Lys Ser Asp Gln Glu Asn Ser755                 760                 765                  770ATT AAA GAT GTG ATC ATC AAT CAA AAG ATA ACG GAT AAA GTT GAT GAA       3429Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gln Lys Ile Thr Asp Lys Val Asp Glu
            775                 780                 785CTC AAT CAA GCG GTA TCA GTG GCT AAA ATA GCG TGC GAT TTC AGT GGG       3477Leu Asn Gln Ala Val Ser Val Ala Lys Ile Ala Cys Asp Phe Ser Gly
        790                 795                 800GTA GAG CAA GCG TTA GCC GAT CTC AAA AAT TTC TCA AAG GAG CAA TTG        3525Val Glu Gln Ala Leu Ala Asp Leu Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gln Leu
    805                 810                 815GCT CAA CAA GCT CAA AAA AAT GAA AGT TTC AAT GTT GGA AAA TCT GAA        3573Ala Gln Gln Ala Gln Lys Asn Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu
820                 825                 830ATA TAC CAA TCC GTT AAG AAT GGT GTG AAC GGA ACC CTA GTC GGT AAT        3621Ile Tyr Gln Ser Val Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val Gly Asn835                 840                 845                 850GGG TTA TCT GGA ATA GAG GCC ACA GCT CTC GCC AAA AAT TTT TCG GAT        3669Gly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Ala Leu Ala Lys Asn Phe Ser Asp
            855                 860                 865ATC AAG AAA GAA TTG AAT GAG AAA TTT AAA AAT TTC AAT AAC AAT AAC        3717Ile Lys Lys Glu Leu Asn Glu Lys Phe Lys Asn Phe Asn Asn Asn Asn
        870                 875                 880AAT AAT GGT CTC AAA AAC GGC GGA GAA CCC ATT TAT GCT CAA GTT AAT        3765Asn Asn Gly Leu Lys Asn Gly Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gln Val Asn
    885                 890                 895AAA AAG AAA ACA GGA CAA GTA GCT AGC CCT GAA GAA CCC ATT TAT GCT        3813Lys Lys Lys Thr Gly Gln Val Ala Ser Pro Glu Glu Pro Ile Tyr Ala
900                 905                 910CAA GTT GCT AAA AAG GTA ACT AAA AAA ATT GAC CAA CTC AAT CAA GCA        3861Gln Val Ala Lys Lys Val Thr Lys Lys Ile Asp Gln Leu Asn Gln Ala915                 920                 925                 930GCG ACA AGT GGT TTC GGT GGT GTA GGG CAA GCG GGC TTC CCT TTG AAA        3909Ala Thr Ser Gly Phe Gly Gly Val Gly Gln Ala Gly Phe Pro Leu Lys
            935                 940                 945AGG CAT GAT AAA GTT GAA GAT CTC AGT AAG GTA GGG CGA TCA GTT AGC        3957Arg His Asp Lys Val Glu Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser Val Ser
        950                 955                 960CCT GAA CCC ATT TAT GCT ACA ATT GAT GAT CTC GGT GGG TCT TTC CCT        4005Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly Ser Phe Pro
    965                 970                 975TTG AAA AGG CAT GAT AAA GTT GAT GAT CTC AGT AAG GTA GGG CTT TCA        4053Leu Lys Arg His Asp Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys Val Gly Leu Ser
980                 985                 990AGG AAT CAA GAA TTG ACT CAG AAA ATT GAC AAT CTC AGT CAA GCG GTA        4101Arg Asn Gln Glu Leu Thr Gln Lys Ile Asp Asn Leu Ser Gln Ala Val995                 1000                1005                1010TCA GAA GCT AAA GCA GGT TTT TTT GGC AAT CTA GAA CAA ACG ATA GAC       4149Ser Glu Ala Lys Ala Gly Phe Phe Gly Asn Leu Glu Gln Thr Ile Asp
            1015                1020                1025AAG CTC AAA GAT TTT ACA AAA AAC AAT CCT GTG AAT CTA TGG GCT GAA        4197Lys Leu Lys Asp Phe Thr Lys Asn Asn Pro Val Asn Leu Trp Ala Glu
        1030                1035                1040AGC GCA AAA AAA GTG CCT GCT AGT TTG TCA GCG AAA CTA GAC AAT TAC        4245Ser Ala Lys Lys Val Pro Ala Ser Leu Ser Ala Lys Leu Asp Asn Tyr
    1045                1050                1055GCT ACT AAC AGC CAC ACA CGC ATT AAT AGC AAT ATC CAA AAT GGA GCG        4293Ala Thr Asn Ser His Thr Arg Ile Asn Ser Asn Ile Gln Asn Gly Ala
1060                1065                1070ATC AAT GAA AAA GCG ACC GGC ACT GAA CGG CAA AAA AAC CCT GAG TGG        4341Ile Asn Glu Lys Ala Thr Gly Thr Glu Arg Gln Lys Asn Pro Glu Trp1075               1080                 1085                1090CTC AAA CTC GTG AAT GAT AAG ATC GTT GCG CAT AAT GTG GGA AGC GTT        4389Leu Lys Leu Val Asn Asp Lys Ile Val Ala His Asn Val Gly Ser Val
            1095                1100                1105CCT TTG TCA GAG TAT GAT AAC ATT GGA TTC AGC CAA AAG AAT ATG AAG        4437Pro Leu Ser Glu Tyr Asp Asn Ile Gly Phe Ser Gln Lys Asn Met Lys
        1110                1115                1120GAT TAT TCT GAT TCG TTC AAG TTT TCC ACC AAG TTG AAC AAT GCC GTA        4485Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Phe Ser Thr Lys Leu Asn Asn Ala Val
    1125                1130                1135AAA GAC ATT AAG TCT GGC TTT ACG CAA TTT TTA GCC AAT GCA TTT TCT        4533Lys Asp Ile Lys Ser Gly Phe Thr Gln Phe Leu Ala Asn Ala Phe Ser
1140                1145                1150ACA GGA TAT TAC TCC ATG GCG AGA GAA AAT GCG GAG CAT GGA ATC AAA        4581Thr Gly Tyr Tyr Ser Met Ala Arg Glu Asn Ala Glu His Gly Ile Lys1155                1160                1165                1170AAT GCT AAT ACA AAA GGT GGT TTC CAA AAA TCT TAAAGGATTA AGGAACACCA      4634Asn Ala Asn Thr Lys Gly Gly Phe Gln Lys Ser
            1175                1180AAAACGCAAA AACCACCTTG CTAAAAGCAA GGGGTTTTTT AACTTAAAAT ATCCCGACAG      4694ACACTAACGA AAGGCTTTGT TCTTTAAAGT CTGCATAGAT ATTTCCTACC CCAAAAAGAC      4754TTAACCCTTT GCTTAAAATT AAATTTGATT GTGCTAGTGG GTTCGTGCTT TATAGTGCGG      4814AATTGGG                                                                4821
2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
  (A)长度：1181氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SED ID NO：4：Met Thr Asn Glu Thr Ile Asp Gln Gln Pro Gln Thr Glu Ala Ala Phe1               5                  10                  15Asn Pro Gln Gln Phe Ile Asn Asn Leu Gln Val Ala Phe Leu Lys Val
         20                  25                  30Asp Asn Ala Val Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Gln Lys Pro Ile Val Asp
     35                  40                  45Lys Asn Asp Arg Asp Asn Arg Gln Ala Phe Glu Gly Ile Ser Gln Leu
 50                  55                  60Arg Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Ile Lys Asn Pro Thr Lys Lys Asn65                  70                  75                  80Gln Tyr Phe Ser Asp Phe Ile Asn Lys Ser Asn Asp Leu Ile Asn Lys
             85                  90                  95Asp Asn Leu Ile Val Val Glu Ser Ser Thr Lys Ser Phe Gln Lys Phe
        100                 105                 110Gly Asp Gln Arg Tyr Arg Ile Phe Thr Ser Trp Val Ser His Gln Asn
    115                 120                 125Asp Pro Ser Lys Ile Asn Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His
130                 135                 140Thr Ile Gln Pro Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu145                     150             155                 160Lys Ser Ala Lys Gln Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gln Ile
                165             170                 175Arg Thr Asp Gln Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu Lys Glu
            180             185                 190Arg Gln Glu Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly Gly Asp Trp Leu
        195             200                 205Asp Ile Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys Lys Gln Ser Ser Asp Val
    210             215                 220Lys Glu Ala Ile Asn Gln Glu proLeu Pro His Val Gln Pro Asp Ile
225             230                235                 240Ala Thr Ser Thr Thr His Ile Gln Gly Leu Pro Pro Glu Ser Arg Asp
            245                 250                 255Leu Leu Asp Glu Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met
        260                 265                 270Glu Met Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Tyr Lys
    275                 280                 285Phe Asn Gln Leu Leu Ile His Asn Asn Thr Leu Ser Ser Val Leu Met
290                 295                 300Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser Leu Leu Tyr Ala305                 310                 315                 320Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp Trp Asn Ala Thr Val Gly
            325                 330                 335Tyr Lys Asp Gln Gln Gly Asn Asn Val Ala Thr Ile Ile Asn Val His
        340                 345                 350Met Lys Asn Gly Ser Gly Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile
    355                 360                 365Asn Asn Pro Ser Phe Tyr Leu Tyr Lys Glu Asp Gln Leu Thr Gly Ser
370                 375                 380Gln Arg Ala Leu Ser Gln Glu Glu Ile Gln Asn Lys Ile Asp Phe Met385                 390                 395                 400Glu Phe Leu Ala Gln Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys
            405                 410                 415Glu Lys Glu Lys Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe Gln Lys Asp Ser
        420                 425                 430Lys Pro Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp Arg Ile Ala Phe Val Ser
    435                 440                 445Lys Lys Asp Pro Lys His Ser Ala Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly
450                 455                 460Asp Leu Ser Tyr Thr Leu Lys Val Met Gly Lys Lys Gln Ile Lys Ala465                 470                 475                 480Leu Asp Arg Glu Lys Asn Val Thr Leu Gln Gly Asn Leu Lys His Asp
            485                 490                 495Gly Val Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn Ala Ser
        500                 505                 510Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val Thr Asn Gly Val Ser His Leu
    515                 520                 525Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu Pro Asn Leu Asn
530                 535                 540Asn Leu Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg Asp Leu Glu Asp Lys Leu545                 550                 555                 560Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gln Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp
            565                 570                 575Phe Leu Ser Ser Asn Lys Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn
        580                 585                 590Lys Ala Val Ala Glu Ala Lys Asn Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys
    595                 600                605Arg Ala Gln Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu
610                 615                 620Glu Lys Asp Val Ala Lys Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn Lys Asn625                 630                 635                 640Lys Met Glu Ala Lys Ala Gln Ala Asn Ser Gln Lys Asp Glu Ile Phe
            645                 650                 655Ala Leu Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp Ala Arg Ala Ile Ala Tyr
        660                665                  670Ala Gln Asn Leu Lys Gly Ile Lys Arg Glu Leu Ser Asp Lys Leu Glu
    675                 680                 685Asn Ile Asn Lys Asp Leu Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe
690                 695                 700Lys Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys705                 710                 715                     720Ala Leu Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp Ile
           725                 730                 735Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys Asn Gly
        740                 745                 750Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gln Ala Lys Ser Asp Gln Glu
    755                 760                 765Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gln Lys Ile Thr Asp Lys Val
770                 775                 780Asp Glu Leu Asn Gln Ala Val Ser Val Ala Lys Ile Ala Cys Asp Phe785                 790                 795             800Ser Gly Val Glu Gln Ala Leu Ala Asp Leu Lys Asn Phe Ser Lys Glu
            805                 810             815Gln Leu Ala Gln Gln Ala Gln Lys Asn Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys
        820                 825             830Ser Glu Ile Tyr Gln Ser Val Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val
    835                 840                 845Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Ala Leu Ala Lys Asn Phe
850                 855                 860Ser Asp Ile Lys Lys Glu Leu Asn Glu Lys Phe Lys Asn Phe Asn Asn865                870                  875                 880Asn Asn Asn Asn Gly Leu Lys Asn Gly Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gln
            885                 890                 895Val Asn Lys Lys Lys Thr Gly Gln Val Ala Ser Pro Glu Glu Pro Ile
        900                 905                 910Tyr Ala Gln Val Ala Lys Lys Val Thr Lys Lys Ile Asp Gln Leu Asn
    915                 920                 925Gln Ala Ala Thr Ser Gly Phe Gly Gly Val Gly Gln Ala Gly Phe Pro
930                 935                 940Leu Lys Arg His Asp Lys Val Glu Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser945                 950                955                  960Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly Ser
            965                 970                 975Phe Pro Leu Lys Arg His Asp Lys Val Asp Asp Leu Ser Lys Val Gly
        980                 985                 990Leu Ser Arg Asn Gln Glu Leu Thr Gln Lys Ile Asp Asn Leu Ser Gln
    995                 1000                1005Ala Val Ser Glu Ala Lys Ala Gly Phe Phe Gly Asn Leu Glu Gln Thr
1010                1015                1020Ile Asp Lys Leu Lys Asp Phe Thr Lys Asn Asn Pro Val Asn Leu Trp1025                1030                1035                1040Ala Glu Ser Ala Lys Lys Val Pro Ala Ser Leu Ser Ala Lys Leu Asp
            1045                1050                1055Asn Tyr Ala Thr Asn Ser His Thr Arg Ile Asn Ser Asn Ile Gln Asn
        1060                1065                1070Gly Ala Ile Asn Glu Lys Ala Thr Gly Thr Glu Arg Gln Lys Asn Pro
    1075                1080                1085Glu Trp Leu Lys Leu Val Asn Asp Lys Ile Val Ala His Asn Val Gly
1090                1095                1100Ser Val Pro Leu Ser Glu Tyr Asp Asn Ile Gly Phe Ser Gln Lys Asn1105                1l10                1115                1120Met Lys Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Phe Ser Thr Lys Leu Asn Asn
            1125                1130                1135Ala Val Lys Asp Ile Lys Ser Gly Phe Thr Gln Phe Leu Ala Asn Ala
        1140                1145                1150Phe Ser Thr Gly Tyr Tyr Ser Met Ala Arg Glu Asn Ala Glu His Gly
    1155                1160                1165Ile Lys Asn Ala Asn Thr Lys Gly Gly Phe Gln Lys Ser
1170                1175                1180

Claims (26)

1.一种分离的核酸，它编码幽门螺旋杆菌约120-128千道尔顿抗原或其抗原片段，其中该抗原与消化性溃疡有关。
2.一种含权利要求1核酸的载体。
3.存在适于表达该核酸所编码多肽的宿主中的权利要求2的载体。
4.权利要求1的核酸，它包含序列SEQ ID NO：1中定义的核苷酸序列1072-4614核苷酸。
5.权利要求1的核酸，它包含序列SEQ ID NO：1中定义的核苷酸序列1072-3648核苷酸。
6.权利要求1的核酸，它包含序列SEQ ID NO：1中定义的核苷酸序列1921-3648核苷酸。
7.一种分离的核酸，它选择性与权利要求4的核酸在聚合酶链式反应下杂交。
8.一种分离的核酸，它与权利要求4中的核酸在如下条件下杂交：含6×SSC，0.5％十二烷基磺酸钠，5×Denhardt’s溶液的缓冲液中68℃16小时，在0.5×SSC60℃漂洗。
9.一种纯化的由权利要求1中的核酸编码的抗原多肽。
10.权利要求9中的抗原多肽，其中多肽基本上由序列表中序列SEQID NO：1中定义的核苷酸序列1072-4614核苷酸编码的氨基酸组成。
11.权利要求9中的抗原多肽，其中多肽基本上由序列表中序列SEQID NO：1中定义的核苷酸序列1072-3648核苷酸编码的氨基酸组成。
12.权利要求9中的抗原多肽，其中多肽基本上由序列表中序列SEQID NO：1中定义的核苷酸序列1921-3648核苷酸编码的氨基酸组成。
13.在被实验者中检测具120-128KDa抗原幽门螺旋杆菌菌株存在的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与权利要求10中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，反应指示幽门螺旋杆菌的存在。
14.在被实验者中检测具120-128KDa抗原幽门螺旋杆菌菌株存在的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与权利要求10中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，反应指示幽门螺旋杆菌的存在。
15.在被实验者中检测具120-128KDa抗原幽门螺旋杆菌菌株存在的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与权利要求12可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，反应指示幽门螺旋杆菌的存在。
16.在被实验者中测定胃溃疡易感性的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与权利要求10中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，结合指示被实验者易胃溃疡的体质。
17.在被实验者测定胃溃疡易感性的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与可测量权利要求11中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，结合指示被实验者易患胃溃疡。
18.在被实验者中测定胃溃疡易感性的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与可测量权利要求12中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，结合指示被实验者易患胃溃疡。
19.在被实验者中测定胃癌易感性的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与可测量权利要求10中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，结合指示被实验者易患胃癌。
20.在被实验者测定胃癌易感性的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与可测量权利要求11中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，结合指示被实验者易患胃癌的体质。
21.在被实验者测定胃癌易感性的方法，它包括步骤：
  a.将来自被实验者中的含抗体的样品与可测量权利要求12中可检测量的多肽接触；
  b.检测多肽和抗体的结合，结合指示被实验者易患胃癌。
22.在被实验者检测与胃溃疡相关幽门螺旋杆菌存在的方法，它包括检测权利要求1的核酸的存在。
23.存在于药学上可接受的载体中的权利要求9中的多肽。
24.一种突变幽门螺旋杆菌菌株，其中权利要求1中核酸的产物已无功能。
25.权利要求24中的幽门螺旋杆菌菌株，其中幽门螺旋杆菌菌株以保藏号55359保藏于美国典型培养物保藏中心。
26.存在于药学上可接受的载体中的权利要求24中的突变幽门螺旋杆菌菌株。
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