CN1195860C

CN1195860C - 生物学活性多肽的输送

Info

Publication number: CN1195860C
Application number: CNB961984872A
Authority: CN
Inventors: L·斯泰德勒; E·里茂特; J·M·威尔斯; R·W·F·勒·佩吉
Original assignee: Cambridge University Technical Services Ltd CUTS
Current assignee: Intel Rex Duna Alex Tai Co., Timbuktu Fabio
Priority date: 1995-10-20
Filing date: 1996-10-21
Publication date: 2005-04-06
Anticipated expiration: 2016-10-21
Also published as: GB9521568D0; US20030202991A1; CN1202934A; CA2234941C; WO1997014806A2; JP2000508162A; WO1997014806A3; NZ320418A; ES2328751T3; MX9803093A; CA2234941A1; BR9610929A; JP2008067708A; NO981746L; DK0871748T3; DE69637961D1; AU7315496A; NO981746D0; US6605286B2; KR19990064308A

Abstract

输送生物学活性多肽和/或抗原的方法，以及输送工具和含有这种输送工具的药物配制品。

Description

生物学活性多肽的输送

本发明涉及体内输送生物学活性多肽。特别是涉及使用非侵染性细菌，通常是革兰氏阳性菌例如乳球菌，在体内特别是粘膜处提供生物学活性多肽。一个方面，本发明涉及提供一种佐剂效应，借助该效应得以提高针对某种抗原的免疫反应。本发明还提供这些应用所需的核酸构建体及宿主生物体。

只有有限数目的佐剂被批准用于人疫苗中(鉴于大多数活性佐剂如弗氏完全佐剂的毒性或病原性)。在过去20多年里发现了许多参予B细胞和T细胞增殖、分化及活化的多肽。这使人们去研究用这些因子(细胞因子)来加强对疫苗的反应，并向着所需途径引导对特定疫苗之免疫反应的可能性。由于最近免疫学的发现强调了细胞介导的和抗体介导的免疫反应在很大程度上是一种相互排他反应，所以对这一研究的需要愈加突出。不管是抗体生成还是效应T细胞或巨噬细胞被激活都是由给定的抗原、病原体或疫苗引发的细胞因子的特殊排列决定的。其中最重要的是参予对特定抗原或侵染性病原体反应的不同类型辅助T细胞TH1或TH2的功能活性。

因为抗病原因子的保护性免疫通常是因抗体生成(在细胞外病原体、可溶性毒素或死亡的、濒死的或生产性细胞释放到组织液的细胞内病原体)或细胞介导的反应而产生的，将针对疫苗的免疫反应导向抗体生成或T细胞及巨噬细胞活化原则上是十分有利的。为了使疫苗接种的保护性效应持续尽可能长的时间，能够增加免疫反应的幅度、时间和记忆组分也是很重要的。

为此，许多研究人员都将其注意力放在了利用信号蛋白之细胞因子网的一个或多个成员作为疫苗佐剂的可能性上。在考虑到辅助T细胞丢失—并因而其细胞因子释放损失—可能与患有某些类型的遗传性或后天获得性免疫缺陷症的个体不能对特定疫苗发生反应有关时，这种方法可能更为重要。

虽然对将细胞因子用于这些目的付诸了很大关注，但利用细胞因子作为佐剂的成功报导却很有限。在用适用于疫苗的方法施用佐剂细胞因子时遇到了很大困难。这种困难可从使用IL-2作为佐剂进行的研究工作中得以解释。

虽然一般认为IL-2的基本来源是T辅助1细胞，但据信其主要活性包括参予多方面的免疫反应，例如T细胞增殖、其他细胞因子的合成、B细胞生长及免疫球蛋白合成，所以IL-2用作可能的佐剂引起了特别的关注。因此IL-2是一种首先描述为T细胞生长因子的T细胞衍生的细胞因子。现已知道其可刺激T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞及少突胶质细胞的生长与分化。总地说来，许多研究者都报导了IL-2的佐剂活性，发现其佐剂活性依赖于多次注射使用细胞因子或将其掺入到脂质体或油性乳剂中。为了免除这一需要，其他一些研究者则在重组细菌和病毒载体中共表达了IL-2和疫苗抗原，或者以基因工程方法制备了IL-2：抗原融合蛋白质；据称后者显著地提高了融合蛋白抗原成员的免疫原性。

疫苗的其他希望有的特征包括要求尽可能安全、在施用最小剂量之后可有效地发挥作用，并适于通过粘膜表面(即口服、鼻内或阴道内)给药以不必进行皮下注射，以及除全身性免疫反应外还可激活局部的粘膜免疫反应。由于活的、减毒的病原体能够连续增殖，因而已针对使用病毒和细菌的重组疫苗株(例如痘病毒，或沙门菌和结核杆菌)作为外源抗原之输送剂进行许多研究。

我们以前已建立了在非病原性、非定居的、无侵染性的食品级乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中表达异源抗原的系统(参见英国专利GB-2278358B)。我们以前的研究表明，当体外培养时，乳酸乳球菌能够产生并分泌有生物学活性的鼠IL-2(Steidler等.，Applied andEnvironmental Microbiology，April 1995，Vol.66，No.4，pp.1627-1629)。但由于乳酸乳球菌是非侵染性的，即其不是共生菌，而且正常情况下也不定居在动物的粘膜表面上，所以这种能成功地应用于需要在体内生成佐剂细胞因子的疫苗接种中不是显而易见的。我们以前已证明(GB 2278358B)，当积累在乳酸乳球菌胞浆内时，异源性抗原可以是全抗原性的(由此推测细胞被吞噬细胞消化而在体内漏出所致)。

经操作适当的基因元件，我们已提供了核酸构建体(即人工操纵子—协调转录多基因单位)用于在乳酸乳球菌中共表达抗原多肽(其中以破伤风毒素片段C[TTFC]为例)和生物学活性细胞因子多肽(其中以白介素2和白介素6为例)。

其他研究者的实验表明，细胞因子IL-6具有在体内和体外加强鼠抗原特异性抗体反应的能力，我们已能够制备在乳酸乳球菌中表达IL-6的表达单位。IL-6是由淋巴样和非淋巴样细胞分泌的多功能性细胞因子，已知其具有在宿主防御中起关键性作用的多效活性。根据靶细胞的不同，IL-6可发挥生长诱导、生长抑制及分化诱导等方面的活性。这些活性包括T细胞和巨噬细胞的分化和/或激活，促进B细胞的生长(例如可见体外促进B细胞肿瘤细胞系的生长)、B细胞的终末分化(免疫球蛋白分泌)，以及发挥激发肝急性期蛋白质反应的全身性作用。为粘膜免疫目的，最重要的是已显示IL-6可诱导IgA定型B细胞中以高比例分泌IgA。

为了举例说明本发明，分别在组成型表达载体(pTREX1，也称为pEX1)中构建用于共表达IL-2和I1-6的操纵子，从而可由具有前述活性的乳球菌启动子元件(所谓P1)的作用来控制TTFC基因和白介素基因的转录。制备这种构建体，以致在翻译从人工操纵子转录得到的mRNA后，即可在细胞内积聚TTFC抗原。

在将这些细菌制剂经鼻内施用于小鼠时，经基因工程化改造而表达白介素2或白介素6的细菌即可比只表达TTFC的构建体引导产生10倍以上的抗TTFC抗体。因此，在此实验系统中这些白介素都具有显著的佐剂活性。

根据乳酸乳球菌运送外源性抗原的能力或其产生IL-2的能力还不能看出它是体内运送细胞因子的适当载体，用以提供足够的有活性的细胞因子以产生佐剂效应。乳酸乳球菌是非侵染性的和非定居的，这就意味着当使用这些细菌，例如通过粘膜表面向免疫系统输送抗原时，它们很可能由于M(或微褶)细胞(其从相邻于粘膜淋巴组织的粘膜分泌内容物汲取样品)的吞噬作用而进入淋巴组织。微颗粒抗原(如掺入多聚L-丙交酯微颗粒中的破伤风类毒素)以这种方式被动地进入淋巴组织，而李斯特氏菌、沙门氏菌及志贺氏菌等病原菌(或减毒的疫苗)则除了通过M细胞得以进入外，还可通过主动刺激其摄入粘膜上皮细胞而侵染细胞和组织。因前已发现细胞因子作为佐剂的活性需要多次注射或缓释输送(Heath and Playfair(1992)Vaccine 7：427-434)，而且因为细胞因子只在巨噬细胞内才免受蛋白水解消化，并且乳酸乳球菌则仍保持完整或存活，故不能预期表达细胞因子的乳酸乳球菌可表现出如本文所证明的显著的佐剂活性。如果理解到细菌颗粒的死亡和溶解将有利于抗原释放，但阻止很短时间产生细胞因子，则也许能够正确认识这一点。尽管如此，我们的发现表明，由乳酸乳球菌表达IL-2或IL-6确实具有显著的佐剂效应。既使经粘膜途径以外的胃肠道外途径施用表达菌，也将同样适用。

因为乳酸乳球菌是非侵染性的—其确实不是共生菌并且其营养也不依赖于在体内不大可能得到的氨基酸和肽，所以证明分泌细胞因子的乳酸乳球菌菌株能够增加抗体产生这一点是令人惊奇的。因为这些结果首次证明，乳酸乳球菌的重组菌株可用于在体内合成并传送生物学活性分子。特别令人感兴趣的是，这些结果证明了提高粘膜及全身性免疫反应的可行性，因为已显示IL-6是一种能够在IgA定型细胞中诱导高比例IgA分泌的细胞因子。

乳酸乳球菌能够在粘膜上使其生物学活性维持足够长的时间，以传送生物学活性剂量的两种不同的重组细胞因子之一，并因而提高针对异源抗原的免疫反应这一发现证明，对佐剂活性以外的目的传送多肽存有广泛的适用性。

乳酸乳球菌产生并分泌多肽的能力证明，有可能利用这些细菌在体内产生并传送已知在微摩尔、毫微摩尔和微微摩尔浓度水平即有活性的多肽。由于这些多肽的精确使用剂量，并且对同时导入细菌细胞这一要求在兽医应用方面考虑较少，所以这种传送重组多肽的方法在兽医学应用中将是特别有价值的。但既使在人类医学内，细胞因子输出可能被限制在无害细菌细胞的附着部位，并且在免疫反应的最早期可在接近抗原处被利用，这一事实可有利于其在需要生物学活性多肽局部化以避免全身性毒性付作用的环境中的使用，例如利用其佐剂活性。

因此，本发明提供：

(i)传送一种或多种生物学活性多肽的方法，其包括给予治疗对象表达所说的一种或多种多肽的非侵染性或非致病性细菌；

(ii)传送一种或多种抗原的方法，其包括给予治疗对象表达所说一种或多种抗原的非侵染性或非致病性细菌；以及

(iii)传送一种或多种抗原和/或一种或多种生物学活性多肽的方法，其包括给予治疗对象表达所说的一种或多种抗原及所说的一种或多种异源生物学活性多肽的非侵染性或非致病性细菌。

生物学活性多肽可以是与细菌同源的，或者是异源的，衍生于真核或原核细胞，或衍生于它们的病毒。

根据本发明的另一个方面，提供了表达(i)一种或多种异源生物学活性多肽和(ii)一种或多种抗原的非侵染性或非致病性细菌。

“生物学活性”是指完成生物学功能的能力，并且当指多肽时还意味着该多肽是采取与其天然构型相同或十分相似的稳定构型(“拆迭形式”)。当正确拆迭或基本上正确拆迭，形成适当拆迭的单位，例如α螺旋、β片层、区域、二硫桥等时，多肽便应具有完成其天然功能的能力。一般说来，多肽分子中的功能单位是某某区域。

无论是否引发免疫反应，而仅仅是被抗体或其他受体结合，这种能力是被动的，并且不构成“生物学活性”。任何抗原都具有被抗体结合的能力，但不一定是有生物学活性的。

“异源”多肽是细菌天然没有的多肽，即在自然界或在将编码该多肽的核酸导入细菌或其祖代之前，没有被该细菌表达的多肽。

根据本发明的细菌一般是革兰氏阳性的，并且原则上可以是任何无害的细菌，例如无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)或乳球菌(Lactococcus)。乳球菌，特别是乳酸乳球菌代表了本发明的优选实施方案。这样的细菌是非定居的。

本领域技术人员会理解到，本发明的方法可用于传送某个范围的生物学活性多肽。适当的多肽可包括能够在局部或全身发挥功能的多肽，例如是能够发挥内分泌活性以影响局部或全身代谢的多肽，和/或生物学活性多肽是能够调节免疫造血系统细胞活性的多肽，和/或一种或多种生物学活性多肽是能够影响体内各种正常或赘生细胞之存活性、生长和分化的，或影响对损伤及感染之急性期炎症反应的免疫调节或诱导作用的多肽，和/或一种或多种生物学活性多肽是能够提高或诱导细胞和组织对于由作用于其靶细胞受体的趋化因子介导的感染的抗性，或促进上皮细胞增殖或伤口愈合的多肽，和/或一种或多种生物学活性多肽是调节体内细胞表达或产生某些物质的多肽。

这样的多肽的特定实例包括胰岛素、生长激素、催乳素、降钙素、黄体生成素、甲状旁腺素、促生长素抑制素、甲状腺刺激素、血管活性肠肽、采取反平行4α螺旋束状结构的1类结构细胞因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSF、CNTF、GH、PRL或IFNα/β；常常与细胞表面相关的因子，形成对称的均三聚体且亚单位呈现某些病毒衣壳蛋白质样β胶辊构型的2类结构细胞因子，例如TNF家族的细胞因子，如TNFα、TNFβ、CD40、CD27或FAS配体，IL-1家族的细胞因子、成纤维细胞生长因子家族、血小板衍生的生长因子、转化生长因子β和神经生长因子；包括短链α/β分子的，作为大的跨膜前体分子产生的，各分子至少含有一个在细胞外区域中之EGF区的3类结构细胞因子，如表皮生长因子家族的细胞因子，以在保守半胱氨酸残基周围聚集的氨基酸序列为特征的趋化因子(C-C或C-X-C趋化因子亚类)或胰岛素相关趋化因子；呈现嵌合结构的4类结构细胞因子，如由不同的区域如EGF、免疫球蛋白样区域和kringhe结构区域组成的heregulins或神经调节蛋白。

另外，生物学活性多肽也可以是上述生物学活性多肽的受体或拮抗剂。

细菌从包含在菌体内的核酸表达生物学活性多肽和抗原。核酸可包括一个或多个核酸构建体，在构建体中编码生物学活性多肽的核酸和编码抗原的核酸处于为在细菌中表达所需的适当调节序列的控制下。

可以选择或构建包括待导入细菌中的核酸的适当载体，根据需要所说的载体可包括适当的调节序列，其中包括启动子序列、终止子片段、增强子序列、标志基因及其他序列。载体可以是质粒、病毒如噬菌体或噬菌粒。更详细的描述可参见Sambrook等.，《分子克隆实验室指南》，第二版(Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。在Ausubel等人编著的《分子生物学中的简便实验方法》第二版(Short Probocols inMolecular Biology，2nd edition，John Wiley & Sons，1992)中详细描述了有关核酸操作的技术和方法，例如核酸构建体的制备、诱变、测序、DNA导入细胞和基因表达，及蛋白质分析等。Sambrook等人和Ausubel等人的公开列为本文参考文献。

在一优选实施方案中，生物学活性多肽和抗原的编码序列包含在操纵子中，即进行多顺反子表达的核酸构建体中。在操纵子中，从启动子转录得到包含一个以上编码序列的mRNA，其中每个都具有其自身适当定位的核糖体结合位点上游。因此，可从单一mRNA翻译一个以上的多肽。使用操纵子能够协调生物学活性多肽和抗原的表达。

在另一个实施方案中，生物学活性多肽和抗原的编码序列是同一个核酸载体或不同的载体的一部分，并且各自处于不同启动子的调节控制之下。启动子可以是相同或不同的。

本发明的再一个方面提供包含生物学活性多肽编码序列和抗原编码序列的核酸构建体，其中各个编码序列都处于在非侵染性细菌(如前所述的，其中特别是非共生性和/或非定居性细菌，如乳球菌)中表达所需的启动子的控制下，而不管其是否为操纵子。

本发明所使用的启动子最好是可在细菌中组成性表达的。如使用组成型启动子就可不必使用表达发生所需的诱导子或其他调节信号。启动子最好在细菌宿主细胞仍存活的水平上指导表达，即即使细胞不能继续生长，但仍保留某些代谢活性。这样，表达就很可能是低水平的。例如当表达产物聚积在细胞内时，这一表达水平可使表达产物聚积量少于细胞蛋白质的10％，最好少于5％，例如3％。启动子可以是与所使用的细菌同源的，即见于天然存在的细菌中的。例如在乳球菌中表达时可使用乳球菌启动子。用于乳酸乳球菌(或其他乳球菌)的优选启动子是衍生于乳酸乳球菌染色体的“P1”(Wa-terfield N.R.；Le Page，R.W.F.；Wilson P.W.和Wells J.M.，Gene(待出版))，其序列如下所示：

GATTAAGTCA TCTTACCTCT TTTATTAGTT TTTTCTTATA ATCTAATGAT

AACATTTTTA TAATTAATCT ATAAACCATA TCCCTCTTTG GAATCAAAAT

TTATTATCTA CTCCTTTGTA GATATGTTAT AATACAAGTA TC

核酸构建体可包括分泌信号序列。在一优选实施方案中，编码生物学活性多肽的核酸可提供生物学活性多肽的分泌表达(将编码信号序列的核酸偶联到编码多肽的核酸序列上)。可在保持生物体存活性的培养条件下，体外试验携带核酸的细菌分泌多肽的能力。

适当的分泌信号序列包括任何在革兰氏阳性菌如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌及乳杆菌中有活性的分泌信号序列。这样的序列包括淀粉液化芽孢杆菌的α淀粉酶前导分泌序列或已知在革兰氏阳性和革兰氏阴性宿主中有功能的某些葡萄球菌菌株分泌的葡萄球菌激酶的前导分泌序列(参见“Gene Expression Using Bacillus”，Rapoport(1990)Current Opinion in Biotechnology 1：21-27)，或许多其他芽孢杆菌酶或S层蛋白的前导序列(参见Harwood and Cutting，“Molecular Biologycal Methods for Bacillus”，pp.341-344，John Wi-ley & Co.，1990)。对于乳球菌来说，优选的是称为Usp45的蛋白质的前导序列(SEQ ID NO：2)：

ATG AAA AAA AAG ATT ATC TCA GCT ATT TTA ATG TCT ACA GTG

met lys lys lys ile ile ser ala ile leu met ser thr val

ATA CTT TCT GCT GCA GCC CCG TTG TCA GGT GTT TAC GCT

ile leu ser ala ala ala pro ley ser gly val tyr ala

但抗原最好聚积在细胞内。如上文讨论的，聚积水平应使细菌仍能存活，即保持某些代谢活性，并少于细胞蛋白质的大约10％，最好少于细胞蛋白质的约5％。

原则上抗原可以是能够与免疫系统的受体例如抗体结合的任何蛋白质。在一优选实施方案中，抗原是毒素形式的细菌类毒素或其抗原性片段。为了与编码序列中具有超过G/C的高A/T使用率(60％A/T)的乳球菌有好的表达相容性，抗原可以是编码序列中富含A/T(具有比G/C高的A/T含量)的抗原。例如，抗原可以是得自梭状芽孢杆菌或肺炎球菌或其他葡萄球菌菌种的类毒素(或其抗原性片段)。例如，梭状芽孢杆菌编码序列，常常如来自属于Plas-modium属的重要的人疟原虫基因一样，具有＞70％的A/T碱基对含量。

为了用于提高对抗原即如本文所讨论的抗原肽或多肽的免疫反应，生物学活性多肽最好有细胞因子活性。Callard和Gearing(1994)在“The Cytokine Facts Book”(Academic Press)一书中讨论了细胞因子。优选的有细胞因子活性的多肽是白介素，包括白介素2(IL-2)和白介素6(IL-6)。许多细胞因子都含有二硫桥键，并且都是由天然产生这些因子的细胞分泌的。细菌细胞胞浆的还原性质可望阻止二硫桥键的形成。还不很明确天然分泌的，特别是天然含有二硫桥键的多肽，当留在细菌细胞内时是否是有生物学活性的。

因此，在一个实施方案中，生物学活性多肽是从天然产生它们的细胞中分泌的。

按照本发明，使用细胞因子提高对抗原的免疫反应，对于低免疫原性抗原是特别适宜的。此外，将免疫原施用于粘膜，一般可引发IgA反应。疫苗引发好的(保护水平)粘膜免疫反应的能力是一种理想的特征，因为现已知道sIgA抗体在防止粘膜遭受感染中起到十分重要的作用。例如，已显示与霍乱杆菌结合的sIgA能够防止小鼠的实验性霍乱的发生。有效地中和HIV-1的sIgA可能在对抗这种病毒的感染中起到重要作用，因为病毒进入人体即可造成终生感染。因此还要努力寻找一种可靠的和长期持续的诱导粘膜sIgA反应的方法，因为绝大多数人类病毒和细菌病原体是在定居于粘膜表面后才开始感染的。

因此，本发明中可特别优先利用那些得自有利增加IgA反应的低免疫原性的抗原，例如曼森氏裂体吸虫的P28免疫原(谷胱甘肽-S-转移酶)。

为了产生本发明的细菌，须将核酸导入细菌宿主细胞内。因此，本发明的再一个方面是提供包括将上文讨论的核酸导入到非侵染性细菌内的方法，所说的细菌较好是革兰氏阳性菌，最好是非共生、非定居的细菌(例如乳球菌)。可利用任何一种适用技术进行导入。就细菌细胞来说，适用技术可包括氯化钙转化法、电穿孔及使用噬菌体转化。

导入之后，例如可在适于基因表达的条件下培养宿主细胞，以引起或充许从该核酸开始表达。在适于表达生物学活性肽的条件下培养细胞，并可利用抗原进一步证实细菌含有编码核酸，并且能够产生所编码的材料。

另一个方面，本发明提供体内运送生物学活性剂量的多肽的方法，该方法包括给个体施用包含表达外源生物学活性多肽的核酸的非侵染性细菌。如上文讨论的，优选的细菌包括乳球菌例如乳酸乳球菌，且优选的给药途径可以是粘膜用药。

虽然以前已显示有可能在这些细菌中以生物学活性形式表达异源多肽，但这只是在有最佳化细菌存活率和生长的培养条件下于体外完成的。在体内，例如在粘膜上，细菌是处于一个预期不会支持其生长或存活的环境中。因此令人惊奇的是，这些细菌能够以足够发挥多肽产生物学活性的量运送多肽，并产生可检测的生物学效应。

在一优选实施方案中，生物学活性多肽具有细胞因子活性并且细菌也可以表达某种抗原。特别是可以运送白介素如IL-2和IL-6。

利用本发明的方法和本文所述的非侵染性或非病原性细菌可提供使本领域技术人员操纵例如个体免疫反应的各种治疗方法。因此，在其他一些方面本发明提供：

(i)调节细胞或组织的存活性、生长、分化、效应物功能或对感染的敏感性的方法，该方法包括给个体施用如本文限定的非侵染性或非病原性细菌；

(ii)增强抗肿瘤细胞或定居在粘膜表面或相邻或远距离组织上的感染的免疫反应的方法，其包括给个体施用如本文限定的非侵染性或非病原性细菌；

(iii)调整抗病原感染因子的免疫反应类型(抗体还是细胞介导的)的方法，其包括给个体施用如本文限定的非侵染性或非病原性细菌；

(iv)调制炎性或肿瘤细胞侵润正常组织的方法，其包括给个体施用如本文限定的非侵染性或非病原性细菌；

(v)控制肿瘤细胞生长速率，侵入速率或存活性的方法，其包括给个体施用如本文限定的非侵染性或非病原性细菌；

(vi)诱导肿瘤细胞编程性细胞死亡的方法，其包括给个体施用如本文限定的非侵染性或非病原性细菌；

(vii)下调免疫反应的方法，其包括给个体施用表达生物学活性多肽的非侵染性或非病原性细菌；以及

(viii)治疗变应性自身免疫或其他免疫调节异常性疾病状态的方法，其包括给个体施用表达生物学活性多肽的非侵染性或非病原性细菌。

换句话说，当由一种细菌表达细胞因子和抗原时，本发明的一个方面是提供提高对抗原的免疫反应的方法，该方法包括给个体施用含有表达有细胞因子活性的多肽和抗原之核酸的非侵染性细菌。

就增强免疫反应如抗体反应来说，最好使免疫反应提高到足以保护个体继后免受病原体中抗原攻击的水平。例如，如果抗原是细菌类毒素或毒素片段，在按照本发明施用细菌后的抗体反应水平，可使个体如在受到产生该毒素的细菌感染后免于产生细菌毒素攻击的病理后果。

在某些情况下，最好除全身反应外，还由于在粘膜上产生提高的免疫反应(即IgA反应)而优选在粘膜表面施用细菌。

可将细菌加在营养培养基，即含有延迟(至少在体外)细菌代谢活性的物质的培养基中施用之。这样的物质可在细胞不生长的情况下维持其存活。这样物质可包括能源如葡萄糖、氨基酸等。

给予细菌的个体可以是人或动物，例如非人哺乳动物。可经口、鼻、阴道或肛门等途径常规给药。在有些情况下粘膜给药并不是优选的，可通过本领域技术人员已知的其他适当方式，如经胃肠道外途径(i/v、i/p、s/c、i/m)施用细菌。

在治疗应用方面，即向个体体内运送多肽的生物效应对该个体有利的情况下，最好施用“治疗上有效的量”，这个量应足以对病人有利。这种益处可以是至少减轻至少一种症状。在预防应用方面，这个量可以是足以例如通过提高免疫反应来降低继后病原攻击对个体产生的有害影响。给药的真正剂量、频率和时间按排将取决于给药目的，即根据攻击的性质和严重程度而寻求的生物学效应，并且是常规最佳化的要点。包括预防性疫苗接种在内的治疗处方，例如决定用药剂量，则是一般从业者和其他临床医生的责任。

可以按照本发明单独或与其他治疗联合，同时或相继施用含有细菌的组合物。

本发明还提供含有如本文公开的细菌的药物组合物。在一个实施方案中，这样的药物组合物最好是适于施用于粘膜的。

按照本发明使用的本发明药物组合物除含有细菌外，还可含有医药上可接受的赋形剂、载体、缓中剂、稳定剂及本领域技术人员已知的其他材料。这些材料应是无毒的，并且不干扰活性成分的效果。载体或其他材料的确切性质可取决于给药途径。为了静脉内、皮内或皮下注射，或在患部注射，可利用无热原的并且有适当的pH、等渗性和稳定性的胃肠道外可接受的含水溶液。本领域相关技术人员能够制备适当的溶液。必要时其中可包含防腐剂、稳定剂、缓中剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。如上所述，按照本发明施用的含有细菌的药物可包含一种或多种营养物质，如葡萄糖、氨基酸等能源。

在另一个方面，本发明提供制造药物的方法，其包括将所公开的细菌与适于施用于个体的载体配制在一起。在一个实施方案中，药物适于施用于个体的粘膜。

本发明还提供表达异源生物学活性多肽并且还可能表达抗原的细菌作为药物的应用，即用于以外科或治疗法治疗包括预防(疫苗接种)人或动物体的方法中。如上文公开的，细菌可以是革兰氏阳性菌，最好是非共生的和/或非定居的，并且适当的例子包括乳球菌。该方法最好包括施用于个体的粘膜，例如用于提高个体的免疫反应。

本发明的再一个方面提供如所公开的细菌在制造施用于个体的组合物，即药物组合物或药物中的应用。最好是施用于个体的粘膜上并可提高个体体内的免疫反应，如对细菌表达的抗原的免疫反应。

可从本公开中清楚地了解本发明各个方面的实施方案，并且本领域技术人员会理解到，可对本发明进行种种改动。可进一步了解本发明的其他方面和实施方案。下文参照附图描述按照本发明的实施方案获得对抗原的保护水平免疫反应的非限制性实验实例。

图1显示质粒构建的流程。可使用所得到的质粒pTTI2在生物体如乳酸乳球菌中表达TTFC和IL-2，并使用所得到的质粒pTTI6表达TTFC和IL-6 。

图2a显示载体pEX1(也称为pTREX1)，其中可在多克隆位点(MCS)插入某种基因，例如包括抗原(如TTFC)和生物学活性多肽(如细胞因子IL-2和IL-6)之编码序列的操纵子构建体。

图2b显示pEX1(pTREX1)一个区域的放大图解，其中显示当插入到基因MCS(多克隆位点)时为基因(包括多(二)顺反子编码序列)表达而可操纵地定位的P1启动子、SD序列(SD)和转录终止子序列。

图3显示用表达破伤风毒素片段C(TTFC)与鼠细胞因子IL-2或IL-6的重组乳酸乳球菌鼻内接种的一组六只小鼠的TTFC特异性血清IgG滴度。

所有上文提到的文献都列为本文参考文献。

实施例1

为了获得TTFC和mIL2或mIL6的同时表达，我们选择构建驱动两个顺反子的操纵子。我们使用组成性表达的载体。总地说来，我们试图在顺反子SD序列之前紧接一个XbaI位点，并在终止子密码子之后紧接一个SpeI位点。以这种方式，可以很容易地交换多顺反子，并以各种组合按所需排列安排之，因为XbaI和SpeI产生同样的粘端。我们以前已借助T7启动子-T7基因10核糖体结合位点-完成了mIL2和mIL6的表达，所以我们选择使用存在于g10核糖体结合位点中的XbaI位点。就这种安排来说，我们知道SD序列是明确定位的。我们选择将TTFC顺反子放在白介素的前面。

质粒的构建

图1描绘了质粒的构建。对携带mIL2和mIL6的质粒进行定点诱变，以得到紧接在终止密码子之后的额外SpeI位点。使用含有USP45前导分泌序列和TTFC之融合体的质粒作为模板对所需的各个TTFC序列进行PCR扩增。

对驱动细胞内TTFC产生的操纵子来说，扩增作为平端SpeI/BamHI片段的基因并克隆到载体pTREX1中，用SphI切割，修成平端并再次用BamHI切割。所得质粒称为pT1TT。从该质粒中分离3′末端150bp的SpeI TTFC片段并克隆到pL2MIL2A和pL2MIL6A的XbaI位点中。所得质粒称为p3TTIL2和p3TTIL6。我们使用存在于TTFC之3′末端的KpnI限制性位点重新构建TTFC，并将p3TTIL2和p3TTIL6中的KpnI-SpeI片段与pTITT中的适当的KpnI-PvuII和SpeI-PvuII片段连接，从而得到所需的操纵子。所得到质粒称为pTT12和pTT16。

蛋白质的表达

用抗体检测法检测蛋白质的表达。为此，将所研究的不同菌株的菌落点在硝酸纤维素膜上，放在含有适当抗体的GM17(difco)固体琼脂板上。将平板保温过夜并在含有2.5％脱脂奶粉的PBS中封闭。用兔抗TTFC或兔抗MIL2展现平板上的表达产物。实验显示所有含TTFC基因的构建体中都有清晰的TTFC表达。另外就pT-TI2和pTTAI2来说，还检测了IL2和TTFC的共表达。因为TTFC单位和mil6之间的接合与TTFC和mil2之间的接合完合相同，故可推测LL6同样能与TTFC很好地共表达。

用于免疫接种的细胞的制备

从新鲜的过夜培养物中培养用于免疫接种的细菌菌株，将其以1ml过夜培养物对15ml的比例稀释到含有红霉素(5μg/ml)的新鲜GM17培养基中，并于30℃培养。当600nm光密度为0.5至1.0时收获细胞。在原培养物体积1/10的0.5％酪蛋白氨基酸、0.2M碳酸氢钠、0.5％葡萄糖溶液中洗涤细胞，然后以原培养物体积的1/200体积重新悬浮之，并检测细菌细胞浓度。然后将细胞稀释到上述溶液中，以得到每次免疫接种的所需数目的细胞。

免疫接种

经吸入“Metofane”轻度麻醉小鼠，使用自动吸移管向每个鼻孔内滴入加在0.5％酪蛋白水解物、0.2M碳酸氢钠和0.5％葡萄糖的溶液中的10μl细菌悬液。密切观察动物的呼吸困难情况，直到从麻醉状态完全恢复为止。

结果

结果如表1和图4中所示。细菌能够表达白介素2或白介素6，比只表达TTFC的细菌多引发10倍以上的抗TTFC抗体生成。

细菌毒素的一个规律是，抗体滴度一旦超过阀值，就达到了保护效果。见于接种含pEX-TTFC/IL-2和pEX-TTFC/IL-6细菌的小鼠的抗体滴度水平，远远超过继后保护动物对抗破伤风毒素攻击的阈值水平(见图4，免疫接种后35天的滴度)。

实验实例的总结

分别在组成性表达载体(pTREX1)中构建共表达抗原多肽(破伤风毒素片段C-TTFC)和生物学活性多肽(白介素2，白介素6)的人工操纵子。从而使TTFC基因和白介素基因的转录受到先前已限定活性的乳杆菌启动子元件的控制。制备构建体，以便在翻译从人工操纵子转录的mRNA后，可在细胞内积聚TTFC抗原。分泌信号序列被可操纵地在接到白介素上。当给小鼠鼻内施用这些细菌的制剂时，经工程改造而表达白介素2或白介素6的细菌，要比只表达TTFC的构建体引发约10倍以上的抗TTFC抗体。因此，这些白介素在实验系统中具有明显的佐剂活性。

乳酸乳球菌是非共生细菌(与乳杆菌的相关菌种不同，后者定居在鸟类的嗉囊内并存在于许多哺乳动物的肠道中)，并且其营养也取决于在体内不可能得到的氨基酸和肽的供应，所以证明乳酸乳球菌的表达细胞因子的菌株仍能提高抗体生成这一事实是令人惊奇的。这些结果首次证明可使用非侵染性的、非定居的细菌如乳酸乳球菌的重组菌株体内合成并运送生物学活性分子。

表1

该表中，用“TT/9”表示以1×10⁹个细菌的剂量用表达TTFC的细菌进行接种，“TT/8”表示1×10⁸个细菌的剂量等。“TT IL-2/9”和“TT IL-6/9”表示以1×10⁹个细菌的剂量，分别用表达TTFC和IL-2，以及TTFC和IL-6的细菌进行接种，“TT IL-2/8”表示以1×10⁸个细菌的剂量，以下类推。图中给出小鼠个体的ELISA滴度。

表1

免疫反应数据-第35天

三次鼻内免疫接种后采血测得的终点滴度数据

TT/9 TT/8 TT/7 TT/6

10000 50 50 50

11000 60 50 50

10000 50 50 75

9000 50 50 50

4500 50 50 70

600 110 55 250

均值 7516.7 61.7 50.8 90.8

标准差 4089.2 24.0 2.0 78.8

TT IL-2/9 TT IL-2/8 TT IL-2/7 TT IL-2/6

14000 50 50 50

30000 50 50 150

100000 50 50 50

100000 105 150 50

120000 50 80 50

100000 100 50 50

均值 77333.0 67.5 71.7 66.7

标准差 43848.0 27.2 40.2 40.8

TT IL-6/9 TT IL-6/8 TT IL-6/7 TT IL-6/6

80000 200 50 50

170000 300 50 50

190000 200 100 50

100000 10000 50 50

50000 750 50 50

80000 260 400 50

均值 111670.0 1951.7 116.7 50.0

标准差 55648.0 3948.3 140.2 0.0

对照组

pEX1/9 pEX1/8 pEX1/7 pEX1/6 初始

75 75 55 75 60

75 50 75 55 60

50 55 75 75 55

55 50 55 50 55

75 55 75 50 50

60 55 70 50 60

均值 65.0 56.7 67.5 59.2 56.7

标准差 11.4 0.9 1.0 12.4 4.1

Claims

1.含有非侵染性或非病原性细菌的药物配制品，其中所述细菌包含至少一个核酸序列，该核酸序列处在组成型启动子的控制之下，并编码与所述细菌异源的生物学活性多肽。

2.如权利要求1所限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽是抗原。

3.如权利要求1或2中限定的药物配制品，其中所述异源多肽衍生于真核细胞或真核细胞的病毒。

4.如权利要求1或2中限定的药物配制品，其中所述异源多肽衍生于原核细胞或原核细胞的病毒。

5.如权利要求1或2中限定的药物配制品，其中细菌是革兰氏阳性菌。

6.如权利要求5中限定的药物配制品，其中革兰氏阳性细菌是无害李斯特氏菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、格氏链球菌、乳球菌菌种或乳杆菌菌种。

7.如权利要求6中限定的药物配制品，其中革兰氏阳性菌是乳酸乳球菌。

8.如权利要求5中限定的药物配制品，其中细菌是革兰氏阳性病原性细菌的减毒菌株。

9.如权利要求8中限定的药物配制品，其中细菌是单核细胞增生李斯特氏菌。

10.如权利要求1限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽能够发挥影响局部或全身代谢的内分泌活性。

11.如权利要求1限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽能够调节免疫造血系统细胞的活性。

12.如权利要求1限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽能够影响体内各种正常或赘生细胞之存活性、生长及分化，或影响对损伤和感染的急性期炎性反应的免疫调节或诱导。

13.如权利要求1限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽能够提高或诱导细胞和组织对作用于靶细胞受体的趋化因子介导的感染之抗性或促进上皮细胞增殖或促进伤口愈合。

14.如权利要求1限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽调节体内细胞对物质的表达或生产。

15.如权利要求1、2和10-14中任何一项所限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽是胰岛素、生长激素、催乳素、降钙素、黄体生成素、甲状旁腺激素、促生长素抑制素、甲状腺刺激激素或血管活性肠肽。

16.如权利要求1、2、和10-14中任何一项限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽是采取反平行4α螺旋束结构的1类结构细胞因子。

17.如权利要求16限定的药物配制品，其中所述1类结构细胞因子是IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、M-GSF、SCF、IFN-γ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、GNTF、GH、PRL或IFNα/β。

18.如权利要求1、2和10-14中任何一项限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽是与细胞表面相关联的，形成对称性均三聚体的，并且亚单位采取β胶辊构象的2类结构细胞因子。

19.如权利要求18的药物配制品，其中2类结构细胞因子选自TNF家族的细胞因子，IL-1家族的细胞因子、成纤维细胞生长因子家族、血小板衍生的生长因子、转化生长因子β或神经生长因子。

20.如权利要求1、2和10-14中任何一项所限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽是3类结构的包括短链α/β分子的细胞因子，其是作为在细胞外区域中各自至少含有一个EGF区的大的跨膜前体分子产生的。

21.如权利要求20的药物配制品，其中所述3类结构细胞因子是表皮生长因子家族的细胞因子，趋化因子或胰岛素相关的细胞因子。

22.如权利要求1、2和10-14中任何一项所限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽是展现嵌合结构的4类结构细胞因子。

23.如权利要求22的药物配制品，其中4类结构细胞因子选自由选自EGF、免疫球蛋白样和kringle区域的不同区域组成的heregulin或神经调节蛋白。

24.如权利要求1、2和10-14中任何一项所限定的药物配制品，其中所述生物学活性多肽是生物学活性多肽的受体或拮抗剂。

25.非侵染性或非病原性细菌在制备疫苗中的用途，其特征在于，所述细菌包含至少一个核酸序列，该核酸序列处在组成型启动子的控制之下，并编码与所述细菌异源的多肽，所述异源多肽是抗原。

26.权利要求25的用途，其中所述异源多肽衍生于真核细胞或真核细胞的病毒。

27.权利要求25的用途，其中所述异源多肽衍生于原核细胞或原核细胞的病毒。

28.权利要求25的用途，其中细菌是革兰氏阳性菌。

29.权利要求28的用途，其中革兰氏阳性细菌是无害李斯特氏菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、格氏链球菌、乳球菌菌种或乳杆菌菌种。

30.权利要求29的用途，其中革兰氏阳性菌是乳酸乳球菌。

31.权利要求28的用途，其中细菌是革兰氏阳性病原性细菌的减毒菌株。

32.权利要求31的用途，其中细菌是单核细胞增生李斯特氏菌。

33.非侵染性或非病原性细菌在制备药物中的用途，其中，所述细菌包含至少一个核酸序列，该核酸序列处在组成型启动子的控制之下，并编码与所述细菌异源的生物学活性多肽，

而且，所述药物用于治疗下列疾病或疾病状态之一：感染、炎症、变应性自身免疫疾病状态、肿瘤、免疫调节障碍性疾病状态、内分泌紊乱、全身代谢紊乱、免疫造血障碍、赘生物、损伤、免疫调节障碍、急性期炎性疾病和伤口愈合。

34.权利要求33的用途，其中所述生物学活性多肽是抗原。

35.权利要求33的用途，其中所述异源多肽衍生于真核细胞或真核细胞的病毒。

36.权利要求33的用途，其中所述异源多肽衍生于原核细胞或原核细胞的病毒。

37.权利要求33的用途，其中细菌是革兰氏阳性菌。

38.权利要求37的用途，其中革兰氏阳性细菌是无害李斯特氏菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、格氏链球菌、乳球菌菌种或乳杆菌菌种。

39.权利要求38的用途，其中革兰氏阳性菌是乳酸乳球菌。

40.权利要求37的用途，其中细菌是革兰氏阳性病原性细菌的减毒菌株。

41.权利要求40的用途，其中细菌是单核细胞增生李斯特氏菌。