CN1205613A - 混合基质植入物和外植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可植入装置,其主体是由不溶胶原纤维组成的基质材料,其中并配置有:(a)多元脊椎动物细胞;以及(b)多元微球体,每种微球体主要由一种或几种下列物质组成:胶原,聚苯乙烯,葡聚糖,聚丙烯酰胺,纤维素,海酸藻钙,胶乳,聚砜,或玻璃。

Description

混合基质植入物 和外植物
本发明的领域是用于体内或体外的医学装置，用以生成和递送医学有用物质。
用于递送医学有用物质的方法能显著影响它们的效力。许多此类物质给药的一般途径是口服，静脉内，或皮下给药。每一方法都有固有的局限，影响了所递送物质的治疗效用。例如，许多以蛋白质为主要成分的药物具有必需在其配方和递送中考虑的短半衰期和低生物利用度的因素。虽然已开发了用于递送医学有用物质的多种装置，包括可携式泵和导管，仍有对改进的递送装置的显著需求。
许多医学有用物质，包括蛋白质，糖蛋白，以及一些肽和非肽激素，用培养的细胞比通过人工合成途径能更有效地产生。合适的细胞典型地在生物反应器中培养，并从中纯化所需的产物，用以通过常规方法，例如口服或静脉注射或皮下注射对病人给药。或者，可以把细胞直接植入入病人体内，产生和递送所需产品。虽然这种方法比只注射该制品有一系列的理论优点，包括利用正常的细胞反馈机制释放生理合适水平的产物的可能性，但也引入了额外的复杂性。其中一点与植入时细胞所需的合适环境有关。需要把植入物中的细胞组织成与包括在植入物中的细胞类型的天然体内环境相容的形式(例如成纤维细胞，天然存在于主要由胶原组成的胞外基质的丰富网络中)。有些情况下还需要保证植入的细胞保持在病人体内的特定部位，从而便于监测并且在不需要时可以除去。
已经研究出的一项用于此目的的技术使用了由一种固体的，单一的胶原凝胶片(一种“胶原基质”)组成的植入装置，细胞包埋于其中(例如，Bell，美国专利No．4，485，096)。在胶原植入物中也可包括其它物质，诸如聚四氟乙烯(PTFE)纤维(Moullier等，自然遗传学分册(Nature Genetics)，4：154，1993；WO 94／24298)以赋予胶原凝胶强度或其它期望特征。
已经发现通过向胶原基质中添加微球体可显著改进胶原基质的功能，从而形成此处称为的“混合基质”。这可以通过在胶原胶凝形成基质前把微球体与细胞以及可溶性胶原混合来完成。如果需要，可在加入未胶凝的胶原溶液前将微球体和细胞共同培养一段时间，使细胞附着到微球体；或者，可基本上同时或以任何所需次序混合三种组分，随后是混合物中的可溶性胶原胶凝，形成由不可溶胶原纤维，细胞和微球体组成的凝胶混合物。此凝胶混合物通过排除液体逐渐变小，形成包括包埋于不可溶胶原纤维网络中的微球体和细胞的固体的，比较有弹性的可植入单位。当微球体也主要由胶原组成时，产生的基质此处称为“混合胶原基质”。
本发明从而包括一种制品或装置，其主体由包括不可溶胶原纤维的基质材料构成，并在主体内配置有：
(a)多元脊椎动物细胞(特别是哺乳动物细胞例如衍生于人，猩猩，小鼠，大鼠，田鼠，豚鼠，兔子，牛，马，猪，山羊，绵羊，或猫的细胞)；以及
(b)多元微球体(或小球)，其中每一种主要含有(即多于50％的干重是)选自下列的一种或多种物质：胶原(优选地是I型胶原)，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纤维素，海藻酸钙，胶乳，聚砜，以及玻璃(例如包被有凝胶诸如胶原的玻璃，以增强细胞附着)。通常每种微球体干重的至少70％，优选地至少80％(最优选地在大约90％和大约100％之间，例如至少95％)是一种或几种上列物质。被描述为基本上由纯化的胶原组成的微球体的商品实例包括ICNCellagenTM球和Cellex Biosciences大孔微球体。微球体优选地具有一致的孔，但也可是光滑的，并且一般具有近似的球形，直径大约0．1到2毫米(例如，在大约0．3和1毫米之间)。当然，任何特定批次或剂型的微球体的形状和大小都会在制造公差范围内变化。制品可以预制成型用于植入动物，例如哺乳动物诸如病人，或者可以设计用于在体外生产细胞产物；例如在一种能从动物分流血液到制品，然后再流回动物血管的体外生物反应器装置中，或者在一种从中可以回收含有所需细胞产物的介质，用于纯化和制备药剂的生物反应器或其它容器中。细胞可以来自从病人移出的一种或几种细胞，并且优选地是含有编码一种或几种医学有用多肽例如一种酶，激素，细胞因子，集落刺激因子，血管生成因子，疫苗抗原，抗体，凝血因子，调节蛋白，转录因子，受体，或结构蛋白的外源DNA的转染细胞。此类多肽例子包括人生长因子(hGH)，因子VIII，因子IX，促红细胞生成素(EPO)，白蛋白，血红蛋白，α-1抗胰蛋白酶，降钙素，葡糖脑苷脂酶，低密度脂蛋白(LDL)受体，IL-2受体，珠蛋白，免疫球蛋白，催化性抗体，白介素，胰岛素，胰岛素样生长因子I(IGF-1)，甲状旁腺素(PTH)，勒帕茄碱(leptin)，干扰素，神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，内皮细胞生长因子，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子，内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)，血管生成素，组织纤溶酶原激活物(t-PA)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。或者，外源DNA可以是激活一种内源基因表达的调节序列(例如，使用以参考文献并入本发明的WO94／12650-PCT／US 93／11704中所述的同源重组)。
通常任何类型的能够附着到胶原和／或微球体，并表现诸如表达医学有用的细胞产物或执行一种基本的结构或代谢功能等期望特性的细胞均可用于本发明的基质中。举例包括脂肪细胞，星形细胞，心肌细胞，软骨细胞，内皮细胞，上皮细胞，成纤维细胞，神经节细胞，腺细胞，胶质细胞，造血细胞，肝细胞，角质形成细胞，成肌细胞，神经细胞，成骨细胞，胰β细胞，肾细胞，平滑肌细胞和横纹肌细胞，以及任何上述细胞的前体。如果需要，在提供的基质中可包括多种类型的细胞。细胞可以克隆或异源群体形式提供。
基质材料中的胶原优选地是I型，但也可是任何其它型胶原。基质材料可选地包括两种或多种型的胶原(例如，选自I，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X，以及XI型)，并且可加入任何能赋予产生的基质期望特征的组分：例如，琼脂糖，藻酸盐，纤连蛋白，层粘连蛋白，透明质酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，硫酸软骨素，硫酸蛋白聚糖，血纤蛋白，弹性蛋白，或肌腱蛋白。上述任何胶原和非胶原组分可来自人或其它动物。还可以在装置中包括胶原或非胶原纤维。此纤维举例可由一种包括尼龙，涤纶，聚四氟乙烯，聚乙醇酸，聚乳酸／聚乙醇酸聚合物混合物，聚苯乙烯，聚氯乙烯共聚物，猫肠，棉花，亚麻，聚酯，或丝的材料制成。
在混合基质中可含有大量细胞。例如，假定接种细胞数和初始制品体积相当，可制备含有的细胞是只单独用可溶性胶原制备的基质的至少大约两倍(优选地大约3倍)混合基质。在给定时间内，由包埋于给定混合基质中的细胞表达的多肽总量一般显著高于(例如，至少超过50％，优选地至少超过100％，并最优选地至少超过200％)使用相同体积常规胶原基质所获的量。
本发明的混合基质通常由包括下列步骤的方法制备：
制成一种混合物，其中包括(a)多元脊椎动物细胞；(b)多元微球体，每种微球体主要包含一种或多种选自下列的物质：胶原，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纤维素，海藻酸钙，胶乳，聚砜，以及玻璃；和(c)含有可溶性胶原的溶液；
使混合物中的可溶性胶原形成包埋有细胞和微球体的不可溶胶原纤维凝胶；以及
将凝胶暴露于培养条件，使凝胶通过排除液体变小，从而形成制品的主体。一般通过将较酸性的胶原溶液pH升高到5以上，例如通过加入浓缩的缓冲培养基，引起胶凝，于是胶原变成不溶性纤维。当这一步骤在模子中进行时，凝胶会获得模子内部的形状。通常凝胶的收缩会受到混合物中细胞的影响，它们附着于纤维使它收缩成较小的模子形状(例如，当模子是圆柱形状的培养皿时，形成盘状)。基质可在制造后立刻使用，可以培养以增进基质中的细胞数或增强其功能，或者在0℃下长期低温保藏。
可以通过包括提供一种含有可分泌所研究的多肽的细胞的混合基质以及将制品植入到诸如皮下，腹膜内，肾下囊(sub-renal capsular)，腹股沟，肌肉内或鞘内等选择部位的治疗方法，将一种诸如上面列出的医学有效多肽递送到病人。若该多肽可促进伤口愈合(例如，PDGF或IGF-I)，可将基质植入到已存的伤口部位。如上面所讨论，细胞可来自从病人取出的一种或多种细胞，并且优选地用编码多肽的外源DNA在体外转染。或者它们是天然分泌多肽的或执行期望代谢功能的细胞(例如，肝细胞或胰腺β细胞)。
在另一个实施例中，可以通过上述的装置将部分病人血液分流把医学有效多肽施入病人体，这样混合基质中细胞分泌的多肽混入血液。通常，任何该领域技术人员熟知的此类装置可改造以容纳本发明的基质。例如，将血液分流到一个含有包裹本发明基质的选择透性膜的装置会使基质的治疗产物递送到血液中。为此目的可使用一种类似人工胰的装置(Sullivan等，科学(Science)252：718-721，1991)。
本发明混合基质的另一种用途是作为体外生产多肽的一种方法。此方法包括步骤将混合基质放在可使基质中的细胞表达和分泌多肽的条件下；用一种液体与基质接触使细胞将多肽分泌到液体中；以及从液体中获取多肽，例如通过对给定多肽合适的常规纯化技术。在一个实施例中，将基质固定于某表面并用液体洗；或者基质自由浮动在液体中。包埋于混合基质中的细胞在小的空间范围内有高水平的作用。此外，在纯化表达的多肽的第一步(从培养基中除去细胞)使用该基质比使用多数细胞培养的常规方法有效的多。
本发明的其它特点和优点显而易见于权利要求书中，以及下面提供的详细描述。
附图的简要说明
图1是hGH表达质粒pXGH 302的图谱。
图2是本发明一实施例的部分剖视的平面图。
图3表示植入了含有经pXGH 302稳定转染并表达hGH的人皮肤成纤维细胞HF16 5-24细胞的胶原基质或混合胶原基质的裸鼠体内的hGH水平曲线图。
下面给出说明本发明几个实施方案的例子。这些例子仅是为了说明，而不是意味着限制。实施例I
此实施例描述了制备用质粒pXGH 302稳定转染的分泌重组人生长激素(hGH)的人成纤维细胞的克隆细胞株，并将其与本发明混合基质中多孔胶原微球体结合的方法。此基质称为混合胶原基质(HCM)。A．产生表达人生长激素的原代人成纤维细胞
通过酶解离技术从新切割的人包皮分离到成纤维细胞。到铺满时，通过温和胰蛋白酶消化从塑料表面移下原代培养物，稀释并重涂平板以产生用于转染的第二次细胞培养。
如实施例II所述构建质粒pXGH 302，并使用电穿孔法进行转染，此方法中将细胞悬浮于质粒DNA溶液，置于一对相反电荷的电极之间，并用一瞬时电脉冲处理。
在含有G418的培养基中筛选处理的细胞10-14天。将质粒稳定整合到其染色体的细胞表达neo基因并形成抗新霉素类似物G418杀死的克隆。含有一个细胞克隆群体的每个克隆分别经胰蛋白酶消化从组织培养皿上的各自位置除下。那些表达hGH的阳性克隆进一步进行定量测定，并选择出克隆HF 165-24用于进一步使用。
用于制备和转染适于本发明基质使用的细胞的进一步的详细方法由WO93／09222(PCT／US 92／09627)提供，并以参考文献并入本发明。B．制备混合胶原基质
1．制备微球体
从每一个制造商提供的原始瓶中(-每瓶10毫升)将胶原微球体(CellexBiosciences制品目录号#BOO-0015UW)转移到50毫升锥形试管中(每瓶1管)。微球体沉降于管中，并抽出贮存缓冲溶液。将微球体洗涤培养基(含1％小牛血清和1％青霉素／链霉素的DMEM)加到刻度试管的50毫升标志处，微球体沉降后将培养基抽出。重复这一系列洗涤步骤，共4次。用25毫升塑料移液管将微球体转移到250毫升三角瓶，将微球体体积限制在每250毫升三角瓶100毫升，并将三角瓶盖住置于37℃组织培养箱中2-3小时。从培养箱中取出三角瓶，使微球体沉降并抽出洗涤培养基。重复此系列培养和洗涤步骤共3次。
2．制备混合胶原基质
在加入胶原溶液前将细胞和微球体混合。将洗好的微球体加到15毫升刻度锥形试管中至所需体积(体积=基质号×1毫升；参看表1)。测量体积前允许微球体沉降至少10分钟。通过抽出除去过量洗涤培养基。
使用胰蛋白酶消化收获要包埋入基质的细胞并测定细胞数。所需数量的细胞(每种基质细胞数乘以要生产的基质总数)在室温下1500rpm(500×g)离心7分钟。在合适大小的锥形底聚丙烯管中，根据表1制备等体积改进的2×DMEM(含9克／升葡萄糖，4mM L-谷氨酰胺，和22．5mM HEPES的2×DMEM)和小牛血清混合物。(注意：对于体积大于250毫升的，总混合体积应分装到合适大小的管中。)将细胞沉淀重新悬浮于2×DMEM-牛血清混合物中。通过把1-2毫升细胞悬液加到压紧的微球体中然后用10毫升移液管将浓缩的微球体转移到剩余的细胞悬液中，将胶原微球体与细胞悬液混合，随后用移液管轻轻混匀。将混合物置于冰上并如表1所指示加入合适体积的胶原溶液(大鼠尾I型胶原；UBI制品目录号#08-115，稀释至在0．02M乙酸中浓度4．0毫克／毫升)。用10毫升玻璃移液管将试管内容物小心混合(避免产生气泡或泡沫)，直至基质溶液呈现均一。
为产生基质，根据表1列出的每培养皿的总体积，用一移液管(10或25毫升容积)将合适体积的胶原／细胞／微球体／培养基混合物加到无菌培养皿中。(将混合物填入培养皿时要不时地用移液管搅拌以防止细胞或微球体沉降。)将填好的培养皿放在37℃、5％二氧化碳，相对湿度98％的组织培养箱中并在大约24小时内勿动，在此期间内容物胶凝且凝胶在各方向的大小减小以形成发明的混合基质，其大小为未胶凝混合物直径的50％和体积的10％。
图2中图示了本发明的混合基质的一个实施例。基质10含有收缩的胶原凝胶主体12，其中包埋有脊椎动物细胞14和微球体16。为了此图中的清楚，将细胞以点的形式与微球体分开。实际上，大多数细胞预期会附着到微球体上，并且基本上比图中所示要小。表1HCM制品所需的培养基，微球体，及胶原体积
培养皿大小 基质号   改进的2×DMEM   血清   微球体   胶原溶液   总体积
  60毫米60毫米100毫米100毫米150毫米150毫米     112112112     1毫升12毫升2.5毫升30毫升7.5毫升90毫升 1毫升12毫升2.5毫升30毫升7.5毫升90毫升   1毫升12毫升2.5毫升30毫升7.5毫升90毫升   1毫升12毫升2.5毫升30毫升7.5毫升90毫升   4毫升48毫升10毫升120毫升30毫升360毫升
实施例II
通过将人体HPRT序列(Edwards等，基因组(Genomics)，6：593-608，1990；Genbank入口HUMHPRTB)中位置11，960-18，869的并包括HPRT基因外显子2和3的6．9kb Hind III片段亚克隆到pTZ18R(Pharmacia P-LBiochemicals，Inc．)的HindIII位点构建了pXGH302。将产生的克隆从HPRT基因片段的外显子3中的单一XhoI位点切割，并插入来自pMC1Neo(Stratagene)的含有neo基因的1．1kb SalI-XhoI片段，破坏了外显子3的编码序列。选择了neo转录方向与HPRT相反的一个取向并命名为pE3neo。
为了组合hGH基因，HPRT序列，和neo基因到同一质粒中，用EcoRI将pXGH5(Selden等，分子细胞生物学(Mol．Cell．Biol．)6：3173-3179，1986)消化，并分离到4．0kb的含有hGH基因和相连的小鼠金属硫蛋白-I(mMT-I)启动子的片段。用来自大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段将ExoRI突出端补平。用XhoI消化pE3Neo，它在neo片段和HPRT外显子3接头处(外显子3插入物的3′接头)切断。用来自大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段补平线性质粒的XhoI突出端，并将产生的片段连接到4．0kb的钝末端的mMT／hGH片段。通过对mMT-I／hGH片段单拷贝插入的限制性酶切分析筛选来源于连接混合物的细菌克隆。一个亚克隆，其中的hGH基因与neo基因转录方向相同，命名为pXGH 302。质粒pXGH 302的图谱示于图1。在此图中，注释了hGH编码区和控制hGH表达的小鼠金属硫蛋白-I启动子(mMT-I)的位置和方向。标示了基本启动子元件(TATA)，转录起始位点(CAP)，及翻译起始位点(ATG)的位置。如图所示，neo基因转录由多瘤病毒(polyoma)增强子／单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因启动子控制。HPRT表示来自人次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因座的序列的位置。质粒pXGH 302使用了携带T7 RNA聚合酶启动子和f1复制起点的质粒pUC18(Yanisch-Perron等，基因(Gene)33：103-119，1985)衍生物pTZ18R(Pharmacia P-L Biochemicals，Inc．)的骨架。实施例III
本实施例说明了制造一种混合胶原基质的一种方法，其中在形成混合胶原基质以前将如上所述制备的转染细胞与微球体一起预培养。这种“预培养”混合胶原基质称为PCHCM。A．细胞和微球体的预培养
按照以下方法，将胰蛋白酶消化的转染细胞接种到洗过的胶原微球体，比率为每毫升微球体2×106细胞(例如10×106细胞接种到5毫升微球体)：
1．将体积为微球体二倍的生长培养基细胞悬液加到125毫升三角瓶中。限制是每瓶10毫升微球体。
2．移出1-2毫升此悬液并加到预先测定有5毫升(堆积体积)微球体的15毫升管中。
3．将细胞悬液／微球体转移回到125毫升三角瓶中。
4．将三角瓶放入组织培养箱并每小时轻微旋动近5秒钟共4-5小时。将生长培养基加至三角瓶50毫升刻度，并将细胞和微球体无扰动培养过夜。
接种后20-24小时，通过下面的方法测定附着到胶原微球体的细胞数目：
1．称量一支5毫升圆底聚苯乙烯试管的重量。
2．从三角瓶中取出少量微球体样品(0．1-0．2毫升)并加到已称重试管中。
3．从微球体样品中吸出培养基并称量试管加样品的重量。通过从试管加样品重量中减去试管重量计算样品重量。
4．向微球体样品中加入1毫升基质消化酶[在有Ca2+和Mg2+的PBS中的1-2毫克／毫升胶原酶IA(Sigma制品目录#9891)]并通过轻敲试管侧面轻轻混匀。
5．用石蜡膜封试管并置于37℃水浴1小时，通过以15分钟间隔用巴氏吸管吸取促进微球体的分解。
6．温育1小时后，使用5毫升玻璃吸管猛烈吸取进一步分离细胞。(注意：如果仍然存在团块，则向试管中加入所加胶原酶溶液体积1／10的10×胰蛋白酶-EDTA溶液，并继续温育10分钟。
7．用血球计数器进行细胞计数。
8．使用下面的公式计算每毫升微球体的细胞密度，假定这些微球体50％的湿堆积体积为间隙：细胞总数／毫升微球体=1000毫克／(样品毫克重量)×(样品中细胞数)×0．5
将细胞／微球体混合物从125毫升三角瓶转移到250毫升旋转瓶中(BellcoMicrocarrier旋转瓶，250毫升，具#1965-60001型涡轮轴)，将生长培养基加至150毫升刻度线，并将旋转瓶放入组织培养箱中的磁搅拌板上(设为50rpm)。通过使微球体沉降到瓶底，吸出“用过的”培养基至瓶上50毫升刻度线，并将新鲜培养基加入至200毫升刻度线方法用新鲜培养基向培养物补料，第二天进行一次并在此后每星期补料3次。可如上所述测定期望时间点的每毫米微球体细胞密度。B．制备预培养混合胶原基质(PCHCM)
使用下面的方法制备PCHCM：
1．当达到期望的每微升微球体细胞密度时(由细胞计数确定)，从旋转瓶中移取含有细胞的微球体。
2．按照概述于上的制备HCM的方法制备基质，并做以下改动：
i．细胞不经胰蛋白酶消化。
ii．将培养的含细胞的微球体加到15毫升刻度锥形试管中，至所需堆积体积(体积=基质号×0．5毫升)。
iii．将空白微球体加到15毫升刻度锥形试管中至所需堆积体积(体积=基质号×0．5毫升)。
3．如上面实施例I所述制备改进的2×DMEM和牛血清混合物。将空白微球体(50％总微球体体积)和含细胞的微球体(50％总微球体体积)加到改进的2×DMEM／牛血清混合物中(参看下面表2)。将微球体／DMEM／牛血清混合物置于冰上并按照表2中的说明加入合适体积的胶原溶液(大鼠尾I型胶原；UBI制品目录#08-115，稀释至0．02M乙酸中浓度4．0毫克／毫升)。使用10毫升玻璃吸管小心混合试管内容物(避免产生气泡或泡沫)，至基质呈现均一。表2用于产生PCHCM的培养基，微球体，及胶原体积
培养皿大小 基质号   改进的2×DMEM 血清     微球体 胶原溶液 总体积
  空白 培养的
60毫米60毫米100毫米100毫米150毫米150毫米     112112112     1毫升12毫升2.5毫升30毫升7.5毫升90毫升 1毫升12毫升2.5毫升30毫升7.5毫升90毫升 0.5毫升6毫升1.25毫升1 5毫升3.75毫升45毫升 0.5毫升6毫升1.25毫升15毫升3.75毫升45毫升 1毫升12毫升2.5毫升30毫升7.5毫升90毫升 4毫升48毫升10毫升120毫升30毫升360毫升
实施例IVA．通过使用下面的方法在第一天，及其后每星期2到3次补加基质保持培养物中的混合基质(HCM或PCHCM)：
1．小心吸出培养基
2．考虑用于每种基质的培养皿大小，添加所需适当体积生长培养基(每60毫米培养皿5-7毫升，每100毫米培养皿10-15毫升，每150毫米培养皿30-40毫升)。培养基中可补充2-磷酸抗坏血酸和／或TGF-β(例如，10-50微克／毫升2-磷酸抗坏血酸和／或1-10纳克／毫升TGF-β)。B．可使用下面的方法测量混合胶原基质的直径：
1．将含有要测量基质的培养皿放到暗背景上的米尺上。
2．记录所需直径(厘米)：例如，头2个星期每天测一次，两星期后隔天一次，及在实验持续期间定量细胞时测量。C．可如下所述从混合胶原基质回收和定量细胞：
1．混合胶原基质的酶消化
a．制备胶原酶IA的PBS溶液(对HCM和PCHCM是1．0毫克／毫升，对补充有2-磷酸抗坏血酸和／或TGF-β的HCM或PCHCM是2．0毫克／毫升)。
b．将胶原溶液分装到15毫升锥形离心管中，对用1-5×106细胞接种的基质是1毫升体积以及对用每份基质多于5×106细胞接种的基质是5毫升体积。制备同需要计数基质数相同的胶原酶试管。
c．用平头镊子将每份基质从其培养皿中取出，并小心地用吸水纸巾(如果计数后将把细胞丢弃)或无菌吸水垫吸去基质上多余的液体。
d．将每份基质分别放入含胶原酶的试管，盖紧，并固定到组织培养箱中设为40rpm的定轨摇床上。
e．将基质培养1小时或至消化完全。为了加速消化，以5分钟间隔用吸管破碎基质。
2．细胞计数
a．使用离心管侧面的刻度测量每一消化的细胞悬液总体积。
b．为了测定细胞存活力，移出0．1毫升细胞悬液并在1．5毫升微离心管中加入0．1毫升0．08％台盼蓝。轻敲小管混匀。
c．用血球计数器计数活细胞和死细胞。如果需要，在加入台盼蓝前用PBS进一步稀释细胞悬液。计算细胞总数，考虑到步骤2a中测量的总体积。实施例V
本实施例描述的实验是改变混合胶原基质中用质粒pXGH 302稳定转染的人成纤维细胞克隆的接种密度，以确定HCM可支持的细胞密度。还监测了每一HCM的hGH产生。
使用3种接种密度(ID)的称为HF 165-24的稳定转染的表达hGH的新生儿包皮成纤维细胞克隆产生了混合胶原基质。密度为每HCM 5，10和20×106细胞。对于每一ID，9HCM产生于60毫米培养皿中。在50毫升锥形试管中用于每一ID的混合基质产生培养基包括9毫升改进2×DMEM，9毫升小牛血清，9毫升胶原微球体，及9毫升4毫克／毫升的可溶性大鼠尾胶原。
汇集从单层培养收获的HF 165-24以提供充足用于9HCM的每个ID：5×106细胞乘以9HCM=共45×106细胞；10×106细胞乘以9HCM=共90×106细胞；20×106细胞乘以9HCM=共180×106细胞。用于每ID的汇集细胞在1500rpm离心7分钟，吸去上清液，将沉淀重悬于9毫升改进2×DMEM和9毫升小牛血清中并转移到50毫升管。将在15毫升刻度试管中预先测量的9毫升胶原微球体加到细胞／2×DMEM／小牛血清混合物中并用10毫升吸管轻吸混合。然后将此混合物置于冰上，加入9毫升冰冷大鼠尾I型胶原溶液(4毫克／毫升)并用10毫升吸管混合产生均一溶液。将4毫升混合液加到每个浓度各9个60毫米培养皿中。将培养皿放置到组织培养箱无扰动培养24小时。24小时培养后，小心吸出每皿中的培养基，并以每皿5毫升用生长培养基(DMEM，10％小牛血清，及1％青霉素／链霉素)向HCM重新补料。为了向每片基质提供更大体积生长培养基，在第三天用平头镊子将HCM从60毫米培养皿转移至100毫米培养皿，并在每皿中加入10毫升生长培养基。在第六天，从每片HCM中抽去培养基，用5毫升Hank′s平衡盐溶液(HBSS)清洗基质然后吸出，并在每皿中加入10毫升生长培养基。记录将生长培养基加到HCM的时间，以便在下一天(第七天)取24小时培养基样品。在第13天和第20天重复清洗和补料步骤以提供第14天和第21天的培养基样品。如下说明测定培养基样品中的hGH。还在第10天和第17天不进行清洗步骤条件下对HCM补料。
在第7，14和21天取培养基样品后，如实施例IV所述消化每ID 3片HCM用于细胞计数。如下面的实施例XII所述用放射免疫分析(NicholsInstitute)24小时培养基样品测定指示时间点HCM产生的hGH。表3总结了每ID三重HCM细胞数，以及在第7天(n=9)，14天(n=6)，和21天(n=3)每ID由HCM产生的hGH。数值以平均值+／-标准偏差提供。如表所示，如上所述制备的HCM在第14和21天的测量平衡密度大约是每片基质7-10×106细胞。在测定的3个ID水平中，完全成形基质中在第21天的每细胞hGH产量是近似的。表3包埋于混合基质中的HF 165-24的接种密度为了细胞密度和hGH产
    生的最优化
  HCMID24小时/基质     第7天细胞数106细胞 微克hGH/ 微克hGH/24小时/
    5×10610×10620×106   5,331,000±279,3479,853,833±858,63413,226,000±1,234,410  683±138716±137689±130     130±2073±650±6
    HCMID     第14天细胞数  微克hGH/24小时/基质     微克hGH/24小时/106细胞
    5×10610×10620×106   6,534,00±344,5259,631,000±875,82010,360,000±706,541  853±2321037±277840±280     133±23108±1281±16.
  HCM ID   第21天细胞数   微克hGH/24小时/基质     微克hGH/24小时/106细胞
    5×10610×10620×106     6,916,167±608,3529,884,833±1,475,32710,207,750±2,833,250     730±1291004±279872±333     105±10101±2083±10
实施例VI
“常规”胶原基质(CM)不含胶原微球体。为了比较CM和HCM，用另加的可溶性胶原代替HCM中由微球体占去的体积制备了CM，给出每片CM中的比率为1份2×DMEM，1份小牛血清，及2份可溶性胶原。如下所述评价CM与HCM的直接比较。
使用了用质粒pXGH 302稳定转化的人成纤维细胞克隆，命名为HF165-24。制出了每片两个ID(每片基质1×106和5×106细胞)的每种类型各9片基质。对CM和HCM，将9×106细胞(用于1×106ID)和45×106细胞(用于5×106ID)重悬于50毫升管中的9毫升2×DMEM+9毫升小牛血清中。对于CM，向每ID组加入9毫升胶原微球和9毫升大鼠尾I型胶原溶液(4毫克／毫升)，并根据实施例I制成HCM。将基质保持在最初的60毫米培养皿并补加5毫升体积的生长培养基。如实施例V所述在第7，14和30天测定每份基质细胞数及hGH产量。表4中总结了两种类型基质在两种密度达到的最高细胞密度(在第14天测定)和hGH产量。如表中所示，与不含微球体的常规胶原基质相比，每份混合型基质提供更高的细胞密度以及实际的hGH产量。表4：“常规”胶原基质(CM)与混合胶原基质(HCM)的由包埋HF165-24
细胞产生的最高细胞密度和hGH的比较
基质类型   ID   最高细胞密度   每份基质最高hGH产量
 CMCMHCMHCM     1×1065×1061×1065×106     2.1×1063.3×1066.2×10610.3×106     290微克299微克983微克1221微克
实施例VII
本实施例描述了预培养的混合胶原基质(PCHCM)的制备和检测。以下面的方式，将用质粒pXGH302稳定转染的人成纤维细胞克隆的细胞(HF165-24)以每毫升微球体2×106细胞的比率接种到胶原微球体：从收获的单层细胞培养获得在40毫升生长培养基中的48×106细胞悬液。向每一个含6毫升堆积的胶原微球体的4支15毫升刻度试管中加入5毫升此悬液，并将每一细胞／微球体混合物转移到125毫升三角瓶。再向125毫升三角瓶中的细胞／微球体混合物中加入5毫升细胞悬液，使每瓶中达到终悬液为12×106细胞和6毫升微球体及10毫升生长培养基(共4瓶)。将三角瓶放入组织培养箱4小时，每小时轻轻旋转约5分钟。4小时后，将生长培养基加到每一三角瓶至50毫升标记，并无扰动地将三角瓶放置24小时。在24小时，将微球体从每一三角瓶转移到250毫升旋转瓶，将生长培养基加至每旋转瓶的150毫升标记，并将瓶放入组织培养箱中设为50rpm的磁搅拌板上。第二天，将生长培养基加至每旋转瓶的200毫升标记，并每星期3次通过吸出培养基至50毫升标记并将新鲜培养基加至200毫升标记向瓶中补料。
在旋转瓶培养的第15天，测定每毫升微球体的细胞密度。从每瓶中移出少量微球体样品(～0．1-0．2毫升)放入预先称重的5毫升聚苯乙烯管。从每管中吸出多余的培养基，并将含有微球体样品的试管称重。将1毫升2毫克／毫升的胶原酶IA的PBS溶液加至每一管，用石蜡膜封口并置于37℃水浴。以15分钟间隔，轻敲含微球体的管以分散团块。1小时后，用5毫升玻璃吸管猛烈吸取进一步分离细胞。为进一步分解团块，加入10×胰蛋白酶：EDTA至胶原酶溶液中终胰蛋白酶浓度1X，并将管再温育10分钟。用PBS 1∶2稀释分离的细胞悬液并加至血球计数器槽中用于细胞计数。使用下面的公式计算每毫升微球体中细胞密度：总细胞数／毫升微球体=1000毫克／(毫克样品重量)×(样品中细胞数)×0．5此公式假定1)湿胶原具有确定比重1．0，从而微球体样品中胶原克重量与毫升胶原体积相等，以及2)微球体的湿堆积体积一半是间隙体积。本实验每毫升微球体(n=4)平均细胞数为19．2×106。从每一瓶中移出微球体并移入15毫升刻度试管。使用每毫升微球体含19．2×106细胞的总体积为6毫升的微球体来产生混合胶原基质。
在100毫升无菌瓶中，用10毫升玻璃吸管将12毫升改进的2×DMEM，12毫升小牛血清，6毫升空白胶原微球体，及6毫升预培养的微球体小心混合。将此混合物置于冰上，加入12毫升冰冷大鼠尾I型胶原并用10毫升玻璃吸管小心混合。向12个60毫米培养皿中每个加入4毫升此混合物，并将培养皿置于37℃无扰动放置24小时。
由于每份基质包括0．5毫升含有19．2×106细胞／毫升的微球体，每份基质最终细胞数为9．6×106。24小时后，通过吸出培养基并加入5毫升生长培养基向这些预培养的混合胶原基质(PCHCM)补料。在第4，7，11，14，18和20天用6毫升生长培养基向PCHCM补料。在第7，14和20天，加入培养基前还用4毫升HBSS清洗PCHCM，并记录加入培养基的时间。在第8，15，和21天，取24小时培养基样品用于检测hGH产生，并按下述消化PCHCM获得细胞计数：向每一15毫升管中加入6毫升在PBS中的2毫克／毫升胶原酶IA溶液。用平头镊子从培养皿中取出PCHCM并在转移到胶原酶溶液中之前用吸水纸吸干。将含有PCHCM和胶原酶溶液的管固定到组织培养箱中定轨摇床上，将速度设为40rpm，使PCHCM消化2小时。培养2小时后，用5毫升玻璃吸管猛烈吸取把PCHCM解离出单细胞。如果有团块存在，则认为需要进一步的解离，加入10×胰蛋白酶：EDTA溶液(0．5％胰蛋白酶，5．3mMEDTA)至胶原酶中终胰蛋白酶浓度为1X。然后再培养试管10分钟。记录每管体积，并将细胞悬液2-5倍稀释于PBS中，放入血球计数器槽获得细胞计数。如实施例VIII所述在指定时间点用放射免疫分析测定24小时培养基样品测出PCHCM的hGH产生。表5总结了每一时间点三重PCHCM的细胞数，以及在第8天(n=12)，15天(n=9)，和21天(n=6)PCHCM的hGH产生。数值以平均值±标准偏差形式提供。如表5所示，这些PCHCM比实施例V和VI中描述的HCM(表3和4)支持更高密度的细胞。在研究期间每份基质和每个细胞的hGH产生速率相近。表5：在培养过程中，在胶原微球体中预培养并包埋入胶原的HF165-24
形成PCHCM：细胞数和hGH产量
    天     细胞数   微克hGH/24小时/基质   微克hGH/24小时/106细胞
    81521   13,732,000±1,786,56512,573,000±1,547,13313,706,000±497,073   1264±1551317±1661254±135     94±1097±1485±10
实施例VIII
使用制造商建议的条件，利用夹层(sandwich)放射免疫测定法(AllegrohGH测定，Nichols研究所，目录号40-2205)定量测定hGH监测hGH的表达。
为了测定hGH产生速率，在收获用于传代的细胞24小时前更换培养基。在传代中，取出一份培养基用于hGH检测，然后收获细胞，计数，并重新接种。在计数收获的细胞后计算hGH水平，并表示为微克hGH／24小时／106细胞。实施例IX
本实施例说明如实施例I所述制备的混合胶原基质(HCM)，以及如实施例VI所述制备的常规胶原基质(CM)的体内植入。
为了进行基质的皮下植入，向小鼠[M．musculus strains N：NIH(S)-nu／nu(nude；Taconic Farms，Germantown，NY)腹膜内注射0．0175毫升／克体重剂量的三溴乙醇(2％w／v 2，2，2-三溴乙醇和2％v／v2-甲基，2-丁醇)。将麻醉的鼠侧躺放置，并用酒精和Betadine预处理好皮肤。在动物体左肋横切出0．5厘米到1厘米的切口。通过快速解剖扩大皮下空间至得到比要植入的基质大小稍大的一区域。将基质水平放入皮下空间并用Millipore镊子展平。使用不锈钢医用书钉将切口钉合。
将小鼠放入含有methoxyflurane(Pittman-Moore)的大烧杯中直到轻微麻醉，通过反循环放血(retroorbital bleed)收集血液。用上述商品化夹心放射免疫测定确定血清hGH水平。测定如建议所述进行，只是使用来自未处理小鼠的血清为对照以获得用于产生标准曲线的校正的每分钟计数(cpm)。
使用表达hGH的HF165-24细胞按照实施例I和VI所述制备用于植入裸鼠的CM和HCM。在第一个实验中(实验1，表6和7)，制备了每一类型13份基质。以每份基质5×106HF165-24细胞的接种密度(ID)制成HCM，并以每份基质2×106HF165-24细胞的ID制成常规胶原基质(CM)。使用较少的细胞接种CM是因为这些基质不象HCM(参看实施例V和VI)那样支持高细胞密度。在随后的实验中(实验2和3，表6和7)，只测定了HCM基质(实验2和3中各13种)。基质保存于初始的60毫米培养皿中并用5毫升生长培养基补料。培养13天后，所有的培养皿均用新鲜生长培养基补料；24小时后消化每组三重基质用于细胞计数，并将来自每组所有13份基质的培养基样品用于hGH检测。
对于实验1，在植入时CM中的平均细胞数是2．4×106细胞／基质，而HCM中的平均细胞数是7．4×106细胞／基质(表6)。每份基质的细胞数与后面用于实验2和3制备的HCM(分别为每份基质8．9×106和9．2×106细胞)相近。表6总结了细胞数(n=3)，每份基质体外hGH产量(n=13)，以及每组体外实验的特定产出速率(微克／106细胞／24小时；n=3)。数值以平均值±标准偏差形式提供。如表6中所示，在移植当天HCM比CM支持更高的细胞密度和产生更高水平的hGH。表6：在植入当天每份胶原基质和混合胶原基质中HF165-24细胞密度及
体外hGH产量
  实验号   植入当天细胞数   微克hGH/24小时/基质   微克hGH/24小时/106细胞
  1/CM1/HCM2/HCM3/HCM   2.4±0.1×1067.4±1.6×1068.9±1.5×1069.2±0.9×106     241±33983±2391399±1771279±115     98±8109±16170±27137±19
在实验1中将每种类型八份基质植入到裸鼠，在实验2和3中各有五份HCM植入入裸鼠。植入后以规律间隔测定血清hGH水平。结果显示于表7和图3。在实验1中，植入后186天内植入HCM的动物比植入CM的动物保持明显更高的血清hGH水平。在实验2和3中用HCM植入的动物呈现相似的高血清hGH水平。表7：通过植入含转染的人皮肤成纤维细胞的胶原混合基质的hGH体内递送
血清hGH值(纳克／毫升±标准误)
    实验3植入后天数     实验1     实验2
    CMn=8     HCMn=8     HCMn=5     HCMn=5
    71415212829354255567085123154186   2.4±0.41.0±0.10.8±0.10.7±0.10.4±0.10.6±0.10.4±0.10.3±0.00.4±0.10.5±0.10.5±0.10.6±0.1   6.8±0.64.2±0.43.7±0.44.8±1.03.0±0.72.3±0.32.7±0.51.2±0.21.4±0.21.2±0.31.0±0.31.0±0.5   13.2±2.08.5±1.35.0±0.47.1±2.33.2±0.32.9±0.72.0±0.31.7±0.4   16.5±2.18.3±2.05.8±1.63.6±1.02.4±0.62.3±0.61.6±0.30.9±0.4
实施例X
本发明的混合基质可如下制成，用于植入到人体：
通过任何描述于实施例I-IV中的方法，从组织培养皿中收获所需细胞，一般是来自病人的稳定转染的自体细胞，并处理用于产生HCM或PCHCM。通过使用大的或小的基质，向病人植入不同数目的基质，和／或在构建基质时使用每细胞表达不同水平产物的细胞，可以改变特定病人的用药剂量(即，基质产生的生理有效量的治疗产物)。病人体内所产生的治疗产物的产量还可通过将基质中的细胞暴露于能改变治疗基因表达的药物学或生理学信号而得以变化。例如，如果治疗基因在糖皮质激素效应启动子控制下，则在体内将细胞暴露于诸如地塞米松的一种药物(通过能保证药物到达植入物的给药方式)将会改变治疗基因的表达。
一般地，植入在60毫米培养皿中形成的，每份基质含有10×106数量级细胞的多个小基质(直径大约1-2厘米)。因此，使用10小份基质可植入大约100百万个细胞。使用具有显著的高细胞密度基质(通过并入例如2-磷酸抗坏血酸产生)可使特定病人需要更少量的基质。或者，可以用较大的培养皿为模子(直径＞150毫米)产生较大的基质，直接用于植入或者切成小片植入。
植入之前，可将基质贮存或浸入生长培养基或任何其它可使细胞保持存活的溶液中。或者，将基质在合适的冷冻培养基中冷冻低温保藏，在植入前可以洗掉。
可将基质植入到多个部位，包括但不限于，皮下，腹膜内，脾内，intraomental，腹股沟，鞘内，心室内，及肌肉内等部位，以及淋巴结内或脂肪组织内。在合适部位进行外科切口，插入基质，缝口伤口。实施例XI
使用保持于本发明混合基质中的细胞，可将许多静态的或灌流的大规模体外培养系统改造成用于制造蛋白。此选择在纯化目标蛋白前的补料和培养物收获的必需步骤中提供不同程度的便利。有几种描述于下。
1．在通常的培养皿板上形成和成熟混合胶原基质(HCM)后(例如，10-25天培养后)，将一些HCM无菌转移到无菌Microcarrier旋转瓶(250-100毫升容积)。这些HCM在能使每份基质中活细胞密度最大的条件下制成和保存。一般地，每一毫升基质体积需要5到20毫升培养基。制成的蛋白生产培养基含有少量不确定成分(例如血清)，并可能包括附加因子以达到每细胞的蛋白产出最大化。将旋转瓶放到一个37°±1℃，5％±1％二氧化碳潮湿培养箱中设为30-70rpm的磁力搅拌平台上。1到3天后，将瓶转移到100级生物安全室中，并在不扰动沉降的基质情况下无菌取出含有表达的蛋白的生产培养基。将等体积的新鲜蛋白生产培养基加入瓶中，并将瓶放回培养箱的搅拌台。
2．上面(1)中所述的基质可无菌转移到有可控搅拌涡轮轴的1-5升生物反应器中(例如，Brunswick)。生产培养基水平由生物反应器的控制系统设定。培养基收获和补充控制在无菌封闭环形系统内以减少污染。
3．对于大体积HCM生产，基质由其组成成分形成并在组织培养滚瓶中胶凝。将滚瓶静态竖直培养至基质的收缩造成自由漂浮结构(3-5天)。然后补充生长培养基，向瓶中充5％二氧化碳气体并放置于37℃培养箱的滚动装置中。每2-3天补充生长培养基直到HCM成熟(共培养10-25天)，此时将HCM暴露于蛋白生产培养基。1-3天后，将滚瓶转移到100级生物安全室中并在不扰动基质条件下无菌吸出含有表达的蛋白的生产培养基。将等体积新鲜蛋白生产培养基加到瓶中，将瓶放回滚动装置。
4．可将HCM的组分通过可封的孔无菌引入无菌透气聚四氟乙烯(TeflonTM)袋中。组分在袋中胶凝并采取其形状和构象。将袋培养于37°±1℃，5％±1％二氧化碳潮湿培养箱中。当HCM收缩并减小体积时，将生长培养基调节来补偿。培养基收获和补充通过设在袋中的无菌-连接管道系统完成。使用有口培养箱和长管可设计循环的收获／补料泵系统，从而消除在一个生产循环中从培养箱取出袋的需要。
5．可将大量体积的HCM组份无菌引入到定制的热成型盘中。最简单的形状是设计具有气体交换能力以用于二氧化碳培养箱的开盖矩形盘。其它设计包括具有口与培养基贮池相连以控制补料和培养物收获的封闭环系统，类似于一个生物反应器室。
其它实施例
本发明的混合基质适于递送广谱的细胞产物，不仅包括hGH，而且包括因子VIII，因子IX，(促)细胞生成素(EPO)，白蛋白，血红蛋白，α-1抗胰蛋白酶，降钙素，葡糖脑苷脂酶，低密度脂蛋白(LDL)受体，IL-2受体，球蛋白，免疫球蛋白，催化性抗体，白介素，胰岛素，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，甲状旁腺素(PTH)，leptin，干扰素，神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性FGF(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，内皮细胞生长因子，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子，内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)，血管生成素，组织纤溶酶原激活物(t-PA)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，以及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。例如，包埋于基质中的可以是胰腺β细胞，它作为对血糖升高的反应能天然分泌胰岛素，从而可以补充糖尿病或前糖尿病人的不充分胰岛素反应。或者，可以是遗传工程化的任何类型细胞以在病人体内表达和分泌高水平的所需多肽，例如凝血因子。此构建可在组成型激活启动子，或在一种合适的生理或药物调节启动子控制下。
基质的胶原凝胶部分可全部由不可溶胶原纤维组成，或者可含有除胶原以外的其它成分：例如，琼脂糖；藻酸盐；一种糖胺聚糖诸如透明质酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，或硫酸软骨素；一种硫酸蛋白聚糖；纤连蛋白；层粘连蛋白；弹性蛋白；血纤蛋白；或肌腱蛋白。这些组分(特别是那些可在动物组织胞外基质中发现的)赋予本发明混合基质的结构稳定性，和／或提供细胞在基质中和在植入部位宿主组织中的额外的附着能力。通过胶凝前将它们与胶原溶液混合而并入到基质中。
其它可能的添加剂包括细胞因子和／或生长因子，它们对优化细胞的维持或促进与宿主组织的有益相互作用(例如，血管形成)是有用的，包括bFGF，aFGF，内皮细胞生长因子，PDGF，内皮细胞刺激血管形成因子(ESAF)，白(细胞)三烯C4，前列腺素(例如，PGE1，PGE2)，IGF-1，GCSF，血管生成素，TGF-α，TGF-β，抗坏血酸，EGF，以及制癌蛋白M。这些添加剂可在胶凝前与胶原溶液混合，也可通过将它们引入到微球体间隙，或通过将它们包括在浸浴基质的培养基中而并入基质。或者，可基因工程化细胞以表达所需产物。例如，可以使用一段编码血管生成因子的DNA和一段编码第二个，治疗蛋白的DNA，或者使用编码连接于合适表达控制序列的两种类型蛋白的单一载体转染基质中的细胞。
凝胶中使用的胶原可以是任何合适的型(例如I-XI型)，或是任何两种或多种的混合物。可在胶原胶凝前将纤维放入模子，从而使它们成为基质的必要部分并赋予基质坚固性和便于处理。一般地，纤维主要由胶原(例如猫肠)或非胶原材料诸如尼龙，绦纶，聚四氟乙烯(Gore-TexTM或TeflonTM)，聚乙醇酸，聚乳酸／聚乙醇酸混合物(VicrylTM)，聚苯乙烯，聚氯乙烯共聚物，纤维素(例如棉或亚麻)，聚酯，人造丝，或丝等制成。纤维可织成网或布，或以单独的线使用。
除了上面的实施例中所述的I型胶原微球体，还可使用主要含有另一种类型的胶原，聚苯乙烯，葡聚糖(例如，CytodexTM，Pharmacia)，聚丙烯酰胺，纤维素，海藻酸钙，胶乳，聚砜，玻璃(用一种物质，诸如胶原包被以增强细胞附着)，或胶原与任何上述物质的组合的微球体。这类微球体已商品化或可以用常规方法制备，然后灭菌用于本发明的混合基质。
其它实施方案在下面的权利要求书中。

Claims (38)

1．一种制品，包括含有不可溶胶原纤维的基质材料主体并在其中配置有
(a)多元脊椎动物细胞；以及
(b)多元微球体，其中每种微球体主要含有选自下面所列的一种或多种物质：胶原，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纤维素，海藻酸钙，胶乳，聚砜，以及玻璃。
2．根据权利要求1所述的制品，其中的细胞选自：脂肪细胞，星形细胞，心肌细胞，软骨细胞，内皮细胞，上皮细胞，成纤维细胞，神经节细胞，腺细胞，胶质细胞，造血细胞，肝细胞，角质形成细胞，成肌细胞，神经细胞，成骨细胞，胰腺β细胞，肾细胞，平滑肌细胞，横纹肌细胞，及其前体。
3．根据权利要求1所述的制品，其中的细胞是人细胞。
4．根据权利要求1所述的制品，其中的细胞是含有编码一种医学有用多肽的外源DNA的转染细胞。
5．根据权利要求1所述的制品，其中的细胞是转染细胞，并且含有的外源DNA包括一段调节序列，其能够激活一个编码医学有用多肽的内源基因的表达。
6．根据权利要求4所述的制品，其中的多肽选自：酶，激素，细胞因子，集落刺激因子，疫苗抗原，抗体，凝血因子，调节蛋白，转录因子，受体及结构蛋白。
7．根据权利要求4所述的制品，其中的多肽是一种血管生成因子。
8．根据权利要求4所述的制品，其中的多肽选自：人生长激素，因子VIII，因子IX，促红细胞生成素，及胰岛素。
9．根据权利要求5所述的制品，其中的多肽选自：人生长激素，因子VIII，因子IX，促红细胞生成素，及胰岛素。
10．根据权利要求4所述的制品，其中的多肽选自：α-1抗胰蛋白酶，降钙素，葡糖脑苷脂酶，低密度脂蛋白(LDL)受体，IL-2受体，珠蛋白，免疫球蛋白，催化性抗体，白介素，胰岛素样生长因子1(IGF-1)，甲状旁腺素(PTH)，勒帕茄碱，干扰素，神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性FGF(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，内皮细胞生长因子，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子，内皮细胞刺激血管生成因子(ESAF)，血管生成素，组织纤溶酶原激活物(t-PA)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，以及粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
11．根据权利要求1所述的制品，其中的微球体是I型胶原珠。
12．根据权利要求1所述的制品，其中大多数微球体的直径在大约0．1和大约2毫米之间。
13．根据权利要求1所述的制品，其中基质材料中的胶原是I型。
14．根据权利要求13所述的制品，其中的基质材料另外包括选自第二型的胶原，琼脂糖，藻酸盐，纤连蛋白，层粘连蛋白，透明质酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，硫酸蛋白聚糖，血纤蛋白，弹性蛋白，及肌腱蛋白的一种物质。
15．根据权利要求1所述的制品，其中的非胶原纤维配置在主体中。
16．根据权利要求15所述的制品，其中的纤维包含选自尼龙，涤纶，聚四氟乙烯，聚乙醇酸，聚乳酸／聚乙醇酸混合物，聚苯乙烯，聚氯乙烯共聚物，胶原，猫肠，棉花，亚麻，聚酯，和丝的一种材料。
17．根据权利要求1所述的制品，其中制品配置在哺乳动物体内。
18．根据权利要求1所述的制品，使成形以植入入病人。
19．根据权利要求18所述的制品，其中的细胞来源于从病人取出的一种或多种细胞。
20．根据权利要求18所述的制品，其中的细胞由一个克隆群体组成。
21．根据权利要求18所述的制品，其中的细胞是含有编码一种医学有用多肽的外源DNA的转染细胞。
22．根据权利要求18所述的制品，其中的细胞是转染细胞，并且含有的外源DNA包括一段调节序列，其能够激活一个编码医学有用多肽的内源基因的表达。
23．根据权利要求11所述的制品，其中的细胞是转染的人细胞且基质材料中的胶原是I型。
24．制备权利要求1所述的制品的方法，包括
制成一种混合物包括(a)多元脊椎动物细胞；(b)多元微球体，其中每种微球体主要含有一种或多种选自包括胶原，聚苯乙烯，葡聚糖，聚丙烯酰胺，纤维素，海藻酸钙，乳胶，聚砜，和玻璃的物质；以及(c)含有可溶性胶原的溶液；
使混合物中的可溶性胶原形成含有细胞和微球体的凝胶；以及
将凝胶暴露于使凝胶收缩的培养条件，从而形成制品的主体。
25．根据权利要求24所述的方法，其中的微球体是多孔胶原珠。
26．根据权利要求24所述的方法，其中的溶液另外含有选自包括第二种型的胶原，琼脂糖，藻酸盐，纤连蛋白，层粘连蛋白，透明质酸，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素，硫酸蛋白聚糖，血纤蛋白，弹性蛋白，和肌腱蛋白的一种物质。
27．根据权利要求24所述的方法，其中的溶液是可溶性胶原的酸性水溶液，通过提高溶液的pH进行胶凝。
28．根据权利要求24所述的方法，其中的胶凝步骤在模子中发生，从而，在收缩步骤之前，凝胶是模子的形状。
29．根据权利要求24所述的方法，其中的细胞和微球体在与溶液混合之前一起培养。
30．将一种医学有用肽向需要的病人给药的方法，它包括
提供根据权利要求18所述的制品，其中的细胞分泌该多肽；以及
将制品植入病人。
31．根据权利要求30所述的方法，其中的细胞来源于从病人取出的一种或多种细胞，并已在体外用编码多肽的外源DNA转染。
32．根据权利要求30所述的方法，其中的植入在病人的皮下部位进行。
33．根据权利要求30所述的方法，其中的植入在病人的腹膜内，肾下囊，腹股沟，肌肉内，心室内，或鞘内部位进行。
34．根据权利要求30所述的方法，其中的多肽能促进伤口愈合，并且植入在病人的已存伤口的部位进行。
35．将一种医学有用肽向需要的病人给药的方法，它包括
提供一种体外装置包括(a)根据权利要求1所述的制品，其中的细胞分泌该多肽；和(b)从病人血管分流血液到装置然后回流到病人血管的设备；以及
将病人的部分血液分流过该装置并回流到病人血流中，从而将多肽与血液混合。
36．一种生产多肽的方法，包括
在细胞表达和分泌该多肽的条件下，提供权利要求1的制品；
用一种液体与制品接触从而使细胞将多肽分泌到液体中；以及
从液体中获取多肽。
37．一种保存细胞的方法，包括提供根据权利要求1所述的制品，以及将制品贮存在0℃温度以下。
38．一种体外装置，包括
根据权利要求1所述的制品；以及
一种从动物分流血液到该制品然后回流到动物血管的设备。
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