CN1244429A - 刺猬蛋白药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

包含作为添加剂的锌离子、镁离子、钙离子、硫酸盐离子、环糊精、非离子去污剂和/或阴离子糖类的刺猬蛋白组合物在室温特别稳定。

Description

刺猬蛋白药物组合物及其用途
本发明涉及刺猬蛋白组合物，优选地其药物组合物及其用途。
刺猬(hh)蛋白被认为是在胚胎发生中负责多种结构形成的分泌信号蛋白家族(J.C.Smith，细胞76(1994)193-196，N.Perrimon，细胞80(1995)517-520，C.Chiang等，自然83(1996)407，M.J.Bitgood等，现代生物学6(1996)298-304，A.Vortkamp等，科学273(1996)613，C.J.Lai等，发育121(1995)2349)。在其生物合成过程中，信号序列切除和自动催化切除后得到20kDa的N末端结构域和25kDa C末端结构域。在其天然形式中，N末端结构域是由胆固醇或软脂酰修饰的(J.A.Porter等，科学274(1996)255-259，Pepinski等，生物化学杂志273(1998)14037-14045)。在高等生物形式中，hh家族至少包含三个成员即声波、印度和沙漠hh(shh，ihh，dhh；M.Fietz等，发育(增刊)(1994)43-51)。在原核生物和真核生物中合成刺猬蛋白后，观察到重组合成的刺猬蛋白的活性差异(M.Hynes等，神经元15(1995)35-44和T.Nakamura等，生物化学生物物理研究通讯237(1997)465-469)。
Hynes等比较了用大肠杆菌合成的hh与转化的人胚肾293细胞上清液中的hh活性，发现肾细胞系上清液的hh活性高出4倍。因为从大肠杆菌分离的hh含有50％的带有两个额外N末端氨基酸(Gly-Ser)或缩短5-6个氨基酸或更高聚集状态(例如通过与镍琼脂糖珠结合)的hh形式，所以讨论这种活性增加的原因是由于仅在真核细胞中表达的潜在额外附属因子，翻译后修饰，不同的N末端。
Nakamura等比较了用从大肠杆菌分离的仍含有N末端多聚组氨酸部份的shh融合蛋白转化的鸡胚成纤维细胞上清液中的shh活性。对于激活C3H10T1/2细胞中碱性磷酸酶(AP)，成纤维细胞上清液中shh活性比纯化的大肠杆菌蛋白高出7倍。推测此活性增加是由于诸如例如仅存在于真核细胞上清液中并更强诱导AP的骨形态建成蛋白(BMP)的分子。
Pepinski等(生物化学杂志273(1998)14037-14045)已鉴定了用软脂酸修饰的shh形式。在C3H10T1/2检测中此shh突变体比未修饰形式强30倍。
Kinto等，FEBS Letters，404(1997)319-323描述了分泌hh的成纤维细胞在胶原蛋白上i.m.植入法中诱导异位骨形成。因此，刺猬蛋白具有骨诱导活性。刺猬蛋白也可以刺激软骨细胞的形成(Stott等，1997)。
从Yang等，发育124(1997)4393-4404得知为了体内药学上有效的活性，局部刺猬蛋白高浓度必须在体内作用位点保持至少16小时时间。Yang等所述的载体系统即载有刺猬的色谱介质Affigel CM，Marti等在《自然》375(1995)322-325中所述的Ni琼脂糖或Lopez-Martinez等在《现代生物学》5(1995)791-796中所用的Affigel blue或他们所用的肝素琼脂糖颗粒因为具有免疫原性并能引起炎症反应而更不适于医药应用。
本发明目的是提供稳定的，优选地水性(优选地药物)刺猬蛋白组合物。
通过含有药学有效量的刺猬蛋白和作为添加剂的锌离子、镁离子、钙离子、硫酸盐离子、环糊精、非离子去污剂和/或阴离子糖类如硫酸软骨素或肝素的刺猬蛋白，优选地药物组合物实现此目标。
令人惊奇地证明选自锌离子、镁离子、硫酸盐离子和环糊精、非离子去污剂、阴离子糖类如硫酸软骨素或肝素的一种或几种添加剂能优选地在水溶液中稳定刺猬蛋白(作为药物组合物或以其它形式)。结果，刺猬蛋白活性例如在室温可以长期保留，并且刺猬蛋白组合物在室温可长期保存。根据本发明所述的添加剂也适于稳定刺猬冷冻干燥产品(优选地为批量或药物组合物)，并且也可稳定刺猬制品如植入物、微粒、凝胶等的生产期间及温度升高时(例如37℃)的刺猬蛋白。
根据本发明所述的刺猬蛋白水溶液中，添加剂是以相对于刺猬蛋白过量的摩尔量。这种过量是优选地1至1000倍，特别优选地1至100倍。根据本发明所述的水溶液特别适于生产刺猬蛋白和载体物质的组合物。
因此本发明的另一主题是刺猬蛋白水溶液，其特征在于它包含相对于刺猬蛋白过量的摩尔量的根据本发明所述的添加剂。这种溶液优选是缓冲的和/或冷冻干燥的。
根据本发明所述的添加剂的量本身并不关键并在较大范围内变动。合适量依赖于添加剂的药学相容性和在药学上可接受浓度时的稳定作用程度。锌离子是作为稳定剂特别优选的，并且可以方便地例如以每升0.01至100毫摩尔的浓度添加。此浓度对刺猬蛋白有明显的稳定作用。锌离子优选地以药学上相容的剂量添加。
根据本发明，环糊精优选地以硫酸环糊精存在。浓度优选地是重量的1％至20％。低分子量肝素(约3kDa)优选地用作阴离子糖类。低分子量肝素的浓度优选地是每毫升0.5至50毫克，高分子量肝素使用相应的摩尔量。硫酸离子优选地以硫酸锌加入。硫酸盐离子浓度优选地是每升0.01至100毫摩尔。钙离子和镁离子优选地以每升0.01至100毫摩尔浓度使用。非离子去污剂优选地是polyoxysorbate(例如Tween20，Tween80)，优选地以0.01至0.1％(重量/体积)的浓度。
刺猬蛋白优选地存在于生物相容的载体上，在这种情况中载体以活性折叠结构形式结合刺猬蛋白并能以活性形式和延迟方式体内局部释放刺猬蛋白。这些配方特别适于修复骨和软骨缺损，而且也可用于修复神经元损伤或用作系统传送。
在优选实施方案中，组合物及优选地药物组合物包含与生物相容的并可例如用作植入物的亲水载体结合的刺猬蛋白。载体优选地是多聚体。
-作为离子相互作用的结果以带负电载体结合刺猬蛋白，
-刺猬蛋白结合载体时不变性，
-在中性条件下载体每个单体包含至少0.1至1，优选地0.1至2个带负电残基，
-以诸如硫酸、碳酸或磷酸基团的酸性基团形式传递电荷，
-载体平均分子量是至少50,000Da。
结果证明刺猬蛋白与可溶或不溶的带负电多聚体基质结合时，可以在体内可逆并活跃地以延迟方式从载体释放。这样的载体基质是如欧洲专利申请号98104416.7中所述的载体基质。
药学效应优选地理解为对神经细胞、软骨形成和/或软骨诱导和优选地骨形成和/或骨诱导的神经学上作用，如Kinto等在《FEBS Letters》404(1997)319-323中所描述的骨诱导，Miao等在《神经科学杂志》17，(1997)5891-5899中所描述的对神经细胞的作用以及Stott等在《细胞科学杂志》110(1997)2691-2701中所描述的软骨细胞诱导。
需要高浓度的刺猬蛋白溶液以合成用刺猬蛋白以局部应用时表现充分药学功效的方式包裹的载体介质。结果，用刺猬蛋白包裹的药学上适当的载体应优选地包含浓度为每毫升载体中0.1至10毫克及更多的刺猬蛋白。包含浓度为每毫升载体中0.1至10毫克或更多的刺猬蛋白的载体是特别优选的。刺猬蛋白本身极难溶解。然而令人惊奇地证明，刺猬蛋白在含精氨酸或精氨酸离子(优选地硫酸精氨酸)的溶液中处于低浓度(1毫克/毫升或更少)时，溶解性相当大地增加、稳定性增强并且免受氧化作用。因此，本发明的另一主题是浓度为1毫克/毫升和更多的额外包含精氨酸或精氨酸离子并优选地是缓冲液的根据本发明所述的刺猬蛋白水溶液。本发明的另一主题是生产用刺猬蛋白包裹的载体基质的方法，其特征在于载体基质与包含根据本发明所述的添加剂和精氨酸或精氨酸离子，优选地硫酸精氨酸的浓度为每毫升1至10毫克刺猬蛋白的根据本发明所述的刺猬蛋白溶液一起培养并分离以此方式包裹的载体基质。
这样的溶液适于生产含药学上有效浓度的刺猬蛋白的载体基质并适于医药应用。精氨酸或精氨酸离子或硫酸精氨酸的浓度优选为每升10至700毫摩尔，最优选地每升10至500毫摩尔，优选地pH范围为5至8，最优选地pH范围为6至8。
本发明意义内的活性理解为碱性磷酸酶的活性(刺激碱性磷酸酶的表达)，在哺乳动物细胞中由多肽诱导此酶(碱性磷酸酶测试中的活性)。在此方法中，用含胎牛血清的培养基培养小鼠成纤维细胞系。然后加入无菌过滤的样品，大约5天后裂解细胞并通过生色底物(pNP，对硝基苯)的切割测定细胞裂解产物中的碱性磷酸酶(J.Asahina，实验细胞研究222(1996)38-47和T.Nakamura(1997))。
本发明将刺猬蛋白理解为在胚胎发生中负责多种结构形成的分泌信号蛋白。特别优选地使用声波、印度或沙漠hh(Fietz M.等，发育(增刊)(1994)43-5)。优选地使用声波hh蛋白(序列：EMBL数据库号L38518)的加工形式(N末端成熟信号结构域)。刺猬蛋白家族在氨基酸序列上表现明显相似性，因此表达编码与上述声波刺猬蛋白序列80％或更多相似的刺猬蛋白的那些核酸序列也是优选。优选地使用例如欧洲专利申请号98102095.1和98107911.4中所描述的刺猬衍生物。
人声波刺猬前体蛋白包含EMBL数据库中编号L38518下所述序列的氨基酸1-462。氨基酸1至23代表信号肽，氨基酸24至197代表成熟信号结构域，氨基酸32至197代表缩短了8个氨基酸的信号结构域，氨基酸198-462代表自动蛋白水解切割后的自动加工的C末端结构域。
根据本发明所述的组合物包含hh蛋白的药理有效剂量并可局部或系统施用。优选与刺猬家族的其它蛋白或诸如骨形态建成蛋白(BMP)(Wozney等，骨的细胞分子生物学，骨形态建成蛋白及其基因表达(1993)学院出版公司，131-167)或甲状旁腺激素(Karablis等，基因和发育8(1994)277-289)或胰岛素样生长因子(IGF-I或II)或转化生长因子家族(TGF-β，GDF)的骨生长因子结合使用根据本发明所述的蛋白。
根据本发明所述的组合物优选地包含基本上作用为结构物质，优选地也有对细胞的吸附作用的多聚体。例如胶原是这样的结构物质。在这种情况下，优选结构物质以比本发明所述的亲水性生物相容载体更低的浓度存在。
此外，优选组合物的生产添加辅助物如糖(甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖，优选地每毫升20至100毫克)或氨基酸如甘氨酸或精氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸以及抗氧化剂如柠檬酸、硫代甘油、乙酰半胱氨酸、聚乙二醇(重量的1-10％)；去污剂，优选非离子去污剂(优选重量的0.01-0.1％)如多乙氧基醚(二温20，Tween80)或聚氧乙烯；消炎剂；局部麻醉剂；抗生素和/或稳定剂如脂类、脂肪酸和甘油。
在另一优选实施方案中，含舒拉明的根据本发明所述的刺猬蛋白组合物是优选的并且可以方便地使用。
此组合物可以包含其它的药学辅助物。
在优选实施方案中，组合物包含浓度为每毫升0.1-100毫克的刺猬蛋白。
在优选实施方案中，组合物还包含生物相容的药学上可接受的缓冲液，优选pH3至pH10，特别优选pH5至8。令人惊奇地证明根据本发明所述的添加剂也能在酸性范围内有效地稳定刺猬蛋白。为防变性和复合在刺猬蛋白内锌的脱离，此组合物pH值应大于pH4。缓冲液浓度优选为每升1至500毫摩尔，特别是每升5至150毫摩尔，特别优选地每升10至100毫摩尔。在最优选的实施方案中，使用300毫摩尔/升磷酸钾缓冲液，pH6.0或10毫摩尔/升磷酸钾，500毫摩尔/升精氨酸氯化物，pH6.0。
下面实施例和公开进一步阐明本发明，本发明的保护范围来自专利权利要求书。所述方法应理解为例子，这些实施例即使在修改后仍描述本发明的主题。实施例1  各种刺猬蛋白配方的DSC(差异扫描量热术)分析
通过DSC(Nano差异扫描量热术，量热科学公司，Utah，USA)方法于2K/分钟的加热速率分析含有或无稳定剂的多种缓冲液(50mMHEPES-NaOH，pH7.2和150mM精氨酸-Cl，pH7.4)中蛋白浓度约0.5毫克/毫升的刺猬蛋白溶液。使用下列稳定剂：
-醋酸锌(Merck)
-硫酸锌(Merck)
-肝素(低分子量，Sigma)
-硫酸β-环糊精(Aldrich)
-硫酸精氨酸
对于各个配方所确定的过渡温度(Tt)总结于表格中。从数据可看出添加试验中所述的物质可提高过渡温度从而增强刺猬蛋白的稳定性。所测温度值不应理解为绝对值，而且代表各个配方间稳定性的差异。不同配方中刺猬蛋白的过渡温度
配方 Tt[℃]
 50mM Hepes-NaOH，pH7.2  52.0
 50mM Hepes-NaOH，1mM醋酸锌pH7.2  56.8
 50mM Hepes-NaOH，1mM硫酸锌pH7.2  60.6
 150mM精氨酸氯化物，pH7.4  53.5
 150mM精氨酸氯化物，5％(重量/体积)硫酸β-环糊精，pH7.4  55.6
 150mM精氨酸氯化物，20mg/m1肝素，pH7.4  57.8
 150mM硫酸精氨酸pH6.0  63.4
实施例2  37℃时声波刺猬蛋白的稳定性
于37℃在各种配方中温育人声波刺猬蛋白。样品在规定时间内取出并用rpHPLC方法分析。配方A：PBS(10毫摩尔/升磷酸钾，150毫摩尔/升氯化钠pH7.4)
时间[小时] 回收[％] 氧化shh[％] 天然shh[％]
 0  100  -  78
 1  104  -  44
 5  173  -  68
 24  134  71  29
 48  140  76  24
 72  142  84  16
 96  39  79  21
 168  31  79  21
配方B：150mM精氨酸-Cl，0.01％Tween 80，pH6.0
时间[小时] 回收[％] 氧化shh[％] 天然shh[％]
 0  100  -  79
 1  100  -  75
 5  93  -  81
 24  108  40  60
 48  139  45  55
 72  144  58  42
 96  124  76  24
 168  118  86  14
很明显配方B中hshh比配方A中的更稳定。含精氨酸的配方中shh的氧化明显更慢并且由于防止了温度诱导的hshh聚集而使回收更高。实施例3  37℃时疏水修饰的shh的稳定性
37℃在各种配方中温育人的疏水修饰的声波刺猬蛋白(根据EP 98116 733.1制备的软脂酰shh)。样品在不同时间取出并用rpHDLC方法分析。配方A：PBS(10mmol/L磷酸钾，150mmol/L氯化钠，pH7.4)
时间[小时] 回收[％] 天然shh[％]
 0  100  91
 1  81  80
 5  -  84
 24  74  70
 48  25  47
 72  31  40
 96  4  0
 168  4  0
配方B：150mM精氨酸-Cl，0.01％Tween 80，pH6.0
时间[小时] 回收[％] 天然shh[％]
 0  100  89
 1  114  89
 5  107  89
 24  -  84
 48  132  85
 72  129  78
 96  111  73
 168  88  66
很明显配方B中hshh比配方A更稳定。因为防止了温度诱导的hshh聚集而使回收更高。
参考文献目录
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Claims (17)

1.刺猬蛋白组合物，包含药学有效量的刺猬蛋白和作为添加剂的锌离子、硫酸盐离子、镁离子、钙离子、精氨酸或精氨酸离子、环糊精、非离子去污剂和/或阴离子糖类。
2.如权利要求1中所述的组合物，其中此组合物包含硫酸锌。
3.如权利要求1中所述的组合物，其中此组合物包含硫酸环糊精。
4.如权利要求1中所述的组合物，其中此组合物包含精氨酸或精氨酸离子。
5.如权利要求4中所述的组合物，其中此组合物包含硫酸精氨酸。
6.如权利要求1或2中所述的组合物，其中此组合物包含浓度为每升0.01至100毫摩尔的锌离子。
7.如权利要求1至6中所述的组合物，其中刺猬蛋白与生物相容的亲水性载体结合。
8.如权利要求1至7中所述的组合物，其中亲水性载体是多聚体。
9.如权利要求1至8中所述的组合物，其中药物组合物包含浓度为每毫升0.1至100毫克的刺猬蛋白。
10.如权利要求1至9中所述的组合物，其中组合物缓冲在pH3至10的范围之间。
11.如权利要求1至10中所述的组合物，其中刺猬蛋白与生物相容的载体结合。
12.生产包含刺猬蛋白的组合物的方法，其中药学剂量的刺猬蛋白以及作为添加剂的锌离子、镁离子、钙离子、硫酸盐离子、环糊精、非离子去污剂、精氨酸、精氨酸离子和/或阴离子糖类用作此药剂的必需成分。
13.如权利要求12中所述的方法，其中使用浓度为每毫升0.1至100毫克的刺猬蛋白。
14.人体内延迟释放刺猬蛋白的方法，其中在人体内局部施用如权利要求1至11中所述的药学上可接受的组合物中的刺猬蛋白。
15.如权利要求14中所述的方法，其中刺猬蛋白以每毫升0.1至100毫克的浓度施用。
16.刺猬蛋白的水性组合物，其中此组合物以相对于刺猬蛋白过量的摩尔数包含选自锌离子、镁离子、钙离子、硫酸盐离子、环糊精、非离子去污剂、精氨酸、精氨酸离子或阴离子糖类的一个或几个添加剂。
17.如权利要求1至11中所述的组合物或如权利要求16中所述的水性组合物的冷冻干燥产品。
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