CN1251041A - 精细调节的protegrin - Google Patents

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陈颉
D·A·斯泰恩堡
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Abstract

本发明涉及抗微生物肽,后者涉及天然产生的速效素肽,本发明还涉及在包括预防感染在内的许多方面使用这些肽的方法。

Description

精细调节的PROTEGRIN
1.相关申请的相互参考
本发明的进行由NIH提供基金，许可号为A122839。美国政府在本发明中享有一定的权利。
该申请是1996年8月1日申请的美国序号08/960,921的部分继续申请，后者为1996年5月17日申请的美国序号08/649,811的部分继续申请，美国序号08/649,811为1995年11月22日申请的美国序号08/562,346的部分继续申请，后者为1995年7月7日申请的美国序号08/499,523的部分继续申请，美国序号08/499,523为1995年5月26日申请的美国序号08/451,832的部分继续申请，其要求保护的优先权来自PCT/US94/08305(WO 95/03325)，美国序号08/451,832为1994年5月17日申请的美国序号08/243,879的部分继续申请，后者为1994年1月13日申请的美国序号08/182,483的部分继续申请，而美国序号08/182,483为1993年7月26日申请的美国序号08/093,769的部分继续申请，后者为1993年7月20日申请的美国序号08/093,926的部分继续申请。要求参考美国序号08/960,921、08/649,811和08/562,346，在35 U.S.C.§120下保护利益。这些申请的内容通过引用整个结合到本文中。
2.发明领域
本发明涉及抗微生物肽领域。具体地说，本发明涉及具有广泛抗微生物活性、命名为“protegrin”的短肽。
3.发明背景
动物和植物抗感染的一个防御机制是产生具有抗微生物活性和抗病毒活性的肽。已经从植物和动物组织中分离出各类这些肽。PCT申请WO 95/03325(公布于1995年2月2日)包含这一主题文献的综述。这类肽包括tachyplesin，它为含有四个不变半胱氨酸、具有17-18个氨基酸的肽；防御素、β-防御素和昆虫防御素，它们为稍长的肽，特征为6个不变的半胱氨酸；和已经在植物中发现的抗真菌和抗细菌的肽和蛋白。
原申请提供一类命名为“protegrin”的新抗微生物肽，其代表成员已经从猪的白细胞中分离出来。protegrin肽的性质一般为两亲的，表现出广谱抗微生物活性。因此，这些肽可用作植物和动物的抗细菌剂、抗真菌剂和抗病毒剂。
本发明人在Kokryakov，V.N.等，1993，FEBS Lett 337：231-235(7月发表)的论文中报道了某些本发明protegrin肽的分离。近期的该类出版物描述了存在一个新protegrin，由分离cDNA克隆得出其序列和其前体序列。Zhao，C.等，1994，FEBS Lett 346：285-288。Mirgorodskaya，O.A.等，1993，FEBS Lett 330：339-342发表了公开来自猪中性粒细胞的阳离子肽的另一篇论文。Storici，P.等，1993，Biochem Biophys ResComm 196：1363-1367报道一个DNA序列的回收，该序列编码猪白细胞具有cathelin样前序列的抗微生物肽。据报道，该肽为其中一种下文公开的protegrin。涉及protegrin的其它出版物是Harwig，S.S.L.等，1995，J Peptide Sci 3：207；Zhao，C.等，1995，FEBS Lett 376：130-134；Zhao，C.等，1995，FEBS Lett 368：197-202；Miyakawa，Y.等，1996，Infect Immun 64：926-932；Yasin，B.等，1996，Infect Immun 64：709-713；Qu，X-D.等，1996，Infect Immun 64：1240-1245；Aumelas，A.等，1996，Eur J.Biochem 237：575-583；Mangoni，M.E.等，1996，FEBS Lett 383：93-98；Steinberg等，1996，在第8届葡萄球菌和葡萄球菌感染国际研讨会(8th Intl.Symposium on Staphylococci and Staphylococccal Infection)上提交的“protegrin：速效细菌肽”，Aix les Bains，法国，6月23-26，1996；Steinberg等，1996，在第36届抗微生物剂和化学治疗边缘学科会议(36th Interscience Conference on Antimicrobial Agents andChemotherapy)上提交的“protegrin保护小鼠免受抗生素抗性病原体引起的全身性感染”，新奥尔良，LA，9月15-18，1996；Steinberg等，1996，在第36届抗微生物剂和化学治疗边缘学科会议(36thInterscience Conference on Antimicrobial Agent and Chemotherapy)上提交的“protegrin抗Helicobacter Pylori的体内功效”，新奥尔良，LA，9月15-18，1996。
也已经发现protegrin与内毒素结合，即与得自相信是导致革兰氏阴性脓毒症的革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)成分结合。protegrin也有效地抑制与性传播疾病(诸如沙眼衣原体和淋球萘瑟氏菌)有关的有机体的生长。
本发明涉及一组新的protegrin，它们提供具有广谱活性、而抗性可能性很小的速效杀微生物剂的性质。另外，该类本发明protegrin提供另一种机会，调整对于最有效抑制的微生物或病毒类型的活性范围或发生这种抑制的条件的活性范围。由于缺失四个N-端氨基酸中的至少一个，或缺失某些其它指定残基和/或由于用其它类氨基酸置换某些氨基酸，在这种情况下的protegrin不同于原申请的protegrin。
4.发明概述
在一个方面，本发明涉及含有大约10-30个氨基酸残基的抗微生物肽，其特征为具有两个主要元件的“核心”结构：由形成一个反向平行β-片的两条链支承的回折。一般来说，该分子的β-片区是两亲的，一个表面的特性是净疏水的，另一个表面的特性是净亲水的。这些肽的回折区中至少含有一个碱性氨基酸残基，这些肽在生理pH下的净电荷至少为+1。抗微生物肽可以可选地在N-末端酰化和/或在C-末端酰胺化或酯化，可以含有零、1或2个二硫桥。
在一个说明性实施方案中，本发明提供包含大约10-30个氨基酸残基、并含有以下氨基酸序列的抗微生物肽或其药学上可接受的盐或其N-末端酰化形式或其C-末端酰胺化或酯化形式，：(I)    X1-X2-X3-X4-X5-C6-X7-C8-X9-X10-X11-X12-C13-X14-C15-X16-X17-X18其中：
C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个半胱氨酸状、碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
C6和C15中的每个独立地为一个半胱氨酸状的、碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
X1-X5中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为一个疏水氨基酸或小氨基酸；
X9和X12中的每个独立地存在或不存在；
结合在一起的X9-X12当含于式(I)的氨基酸序列中时，能够实现回折，并且X9-X12中的至少一个必须是碱性氨基酸；
X16-X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
并且其中包含所述抗微生物肽的至少大约15％-50％的氨基酸为碱性氨基酸，使得所述抗微生物肽在生理pH下的净电荷至少为+1。
本发明的肽表现出广谱抗微生物活性，对包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母、真菌和原生动物在内的种类繁多的微生物靶为杀生物剂。因此，这些肽在多种应用中可以用作抗微生物剂。例如，这些肽可以用来使多种材料防腐或消毒，这些材料包括医疗设备、食品、化妆品、接触透镜溶液、药物或其它含营养物的材料。这些肽在植物或动物中也可用于预防或治疗微生物感染或与其相关的疾病。
另一方面，本发明涉及用于生产某些本发明肽的重组材料，以及涉及修饰含有用于生产这些肽的表达系统的植物或动物。
另一方面，本发明涉及含有本发明肽作为活性组分的药物组合物和用于植物的组合物，或含有用于生产这些肽或用于原位表达编码这些肽的核苷酸序列的表达系统的组合物。
又一方面，本发明涉及合成制备本发明肽的方法，涉及这些肽的特异性抗体，以及涉及这些肽作为防腐剂的用途。
再一方面，本发明涉及使用上述肽或其组合物以抑制微生物生长的方法。该方法一般包括将微生物与抗微生物有效量的一种或多种本发明肽或组合物接触。在推荐实施方案中，将细菌与杀菌有效量的肽或组合物接触。
最后一个方面，本发明涉及使用上述肽或其组合物、以预防或治疗植物和动物的微生物感染或与其相关的疾病的方法。该方法一般包括给予植物或动物有效量的一种或多种本发明肽或组合物。这类疾病或感染包括眼部感染(诸如结膜炎和角膜炎)、结膜溃疡、与幽门螺旋菌有关的胃溃疡、性传播疾病(STD)和革兰氏阴性脓毒症。可以用本发明肽治疗或预防的临床相关感染包括由抗多种药物的病原体(诸如抗万古霉素的屎肠球菌、抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌和抗青霉素的肺炎链球菌)引起的全身性感染。
5.附图简述
图1显示编码抗微生物化合物PG-1、PG3和PG-5的前体蛋白的基因组DNA的核苷酸序列和得出的氨基酸序列。
图2显示protegrin基因组DNA的构造。
图3a-3c显示与合成制备的PG-1相比，合成制备的PG-5的抗微生物活性。
图4图示向含抗生素培养基的连续转移对抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)和铜绿色假单孢菌的药物抗性发展中的作用。
图5为protegrinPG-1至PG-5序列的说明；以及
图6为β-片二级肽结构的说明。
6.本发明的详细描述
6.1.定义
本文所用的以下术语具有以下含义：
“二级结构：”本文所用的“二级结构”是指多肽链区段的局部规则结构，包括(但不限于)螺旋(诸如α-螺旋)、延伸链(诸如β-链)和延伸链片(诸如β-片)。
“反向平行β-片：”本文所用的“反向平行β-片”是指多肽链的一种二级结构，特征为在反向平行肽链之间的分子间主链-主链的氢连接。反向平行β-片可以可选地含有一个或两个链间的二硫键。
“两亲反向平行β-片：”本文所用的“两亲反向平行β-片”是指一种反向平行β-片，其中一个表面具有净疏水特性，而另一个表面具有净亲水特性。
“回折：”本文所用的“回折”是指连接反向平行β-片相邻链的特征性二级结构。“回折”通常是2个或4个氨基酸残基肽区段，它逆转多肽链的方向，以便允许单个多肽链适应反向平行β-片的构型。这类肽区段是本领域众所周知的，包括(但不限于)作为说明的3个氨基酸残基的γ-转角(Rose等，1985，Adv.Protein Chem.37：1-109；Wilmer-White等，1987，Trends Biochem.Sci..12：189-192；Wilmot等，1988，J.Mol.Biol.203：221-232；Sibanda等，1989，J.Mol.Biol.206：759-777；Tramontano等，1989，Proteins：Struct.Funct.Genet.6：382-394)和下述4个氨基酸残基的β-转角。
“β-转角：”本文所用的“β-转角”是指一个识别的回折亚类。“β-转角”通常是一种4个氨基酸残基的肽区段，它逆转多肽链的方向，以便允许单个多肽链适应反向平行β-片的二级结构。一般来说，β-转角的两个内部氨基酸残基不参与β-片的氢连接；β-片的氢连接中包括内部残基两端的2个氨基酸残基。术语“β-转角”清楚地包括本领域通常所知的所有类型肽的β-转角，包括(但不限于)I型、II型、III型、I’型、II’型和III’型β-转角(参见Rose等，1985，Adv.Protein Chem.37：1-109；Wilmer-White等，1987，Trends Biochem.Sci..12：189-192；Wilmot等，1988，J.Mol.Biol.203：221-232；Sibanda等，1989，J.Mol.Biol.206：759-777；Tramontano等，1989，Proteins：Struct.Funct.Genet.6：382-394)。
“抗微生物有效量：”本文所用的“抗微生物有效量”是指对靶微生物生物抑制或杀生物的肽(或其组合物)量。更具体地讲，肽的抗微生物有效量是指抑制靶微生物生长或使其致死的肽量。
“治疗有效量：”本文所用的“治疗有效量”是指有效改善植物或动物微生物感染或与其相关疾病的症状，或改善、治疗或预防微生物感染或与其相关疾病的肽(或其组合物)量。
“药学上可接受的盐：”本文所用的“药学上可接受的盐”是指大致保留游离碱抗微生物活性、通过与无机酸反应获得的那些盐。
6.2推荐实施方案的描述
本发明提供具有抗微生物活性的protegrin肽、包含这些肽的组合物、使用这些肽(或其组合物)抑制种类繁多的微生物靶生长或将其杀死的方法，以及使用这些肽(或其组合物)治疗或预防植物和动物微生物感染或与之相关疾病的方法。
本发明的肽表现出广谱抗微生物活性，对种类繁多的微生物靶为抑制生物剂或杀生物剂，这些微生物靶包括(但不限于)革兰氏阳性细菌，诸如李司忒氏菌、枯草杆菌、粪肠球菌(包括万古霉素敏感型(VSEF)菌株和万古霉素抗性(VREF)菌株)、屎肠球菌(包括万古霉素敏感型(VSEF)菌株和万古霉素抗性(VREF)菌株)、金黄色葡萄球菌(包括甲氧苯青霉素敏感型(MSSA)菌株和甲氧苯青霉素抗性(MRSA)菌株)、表皮葡萄球菌(包括甲氧苯青霉素敏感型(MSSE)菌株和甲氧苯青霉素抗性(MRSE)菌株)、唾液葡萄球菌、微小棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、G1组棒状杆菌、G2组棒状杆菌、肺炎链球菌(包括青霉素抗性(PSRP)菌株)、轻型链球菌和血链球菌；革兰氏阴性细菌，包括乙酸钙不动细菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、铜绿色假单孢菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、摩拉克菌属菌种(Moraxella sp.)、脑膜炎萘瑟氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、幽门螺旋菌、猫螺旋菌和空肠弯曲菌；以及原生动物、酵母和某些病毒逆转录病毒菌株。显然，本文所述肽对表现出抗多种药物的临床相关病原体为抑制生物剂或杀生物剂，诸如其中的万古霉素抗性屎肠球菌或粪肠球菌(“VRE”)、青霉素抗性肺炎链球菌(“PRSP”)和甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(“MRSA”)。
本发明的肽(或其组合物)在多种应用中可用作抑制生物剂或杀生物剂。例如，这些肽可以用来使包括医疗器械、食品、药物、接触透镜溶液、化妆品或其它含营养物材料在内的多种材料消毒或防腐。本发明的肽在多种临床背景中，可特别用作抗多种药物的病原体(诸如VRE、MRSA和MSSE)抑制细菌剂或杀菌剂。
本发明的肽或其组合物也可用于预防或治疗植物和动物的微生物感染和相关疾病。这类疾病包括(但不限于)革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌感染、心内膜炎、肺炎和其它呼吸性感染、尿道感染、全身性念珠菌病、口腔粘膜炎等。
本文描述的肽提供显著优于常规抗生素和/或其它抗微生物肽之处。例如，因为本文描述的肽与在动物中天然发现的抗微生物肽有关，因此相信观察到的对常规抗生素相对高的抗性频率在本文描述的肽中观察不到。
某些本发明protegrin，特别是小于18个氨基酸的“小protegrin”形式，其特殊优点在于它们的大小减小。结果，它们的生产成本较低，一般预计提供更好的组织分布，免疫原性也较低。
6.2.1.  肽
概括地说，本发明的protegrin肽包括以下氨基酸序列及其限定的修饰形式：(I)    X1-X2-X3-X4-X5-C6-X7-C8-X9-X10-X11-X12-C13-X14-C15-X16-X17-X18在自然界中可以同时产生的那些肽必定是纯化形式和/或分离形式或合成制备或重组制备的。
在各种情况下，符号Xn表示该肽中特定位置上的一个氨基酸。同样，符号Cn表示表示特定位置上的一个氨基酸，还表示它们在式(I)的氨基酸序列中的位置，该氨基酸序列可以可选地含有能够形成二硫键的氨基酸残基。
由Xn或Cn代表的氨基酸残基可以是遗传编码的L-氨基酸、天然产生的非遗传编码的L-氨基酸、合成L-氨基酸或所有上述氨基酸的D-对映体。本文用于20种遗传编码的L-氨基酸和通常的非编码氨基酸的氨基酸标志法是常规的，如下所示：常用的氨基酸缩写
               单字母    常用
     氨基酸
                符号     缩写丙氨酸               A       Ala精氨酸               R       Arg天冬酰胺             N       Asn天门冬氨酸           D       Asp半胱氨酸             C       Cys谷氨酰胺             Q       Gln谷氨酸               E       Glu甘氨酸               G       Gly组氨酸               H       His异亮氨酸             I       Ile亮氨酸               L       Leu赖氨酸               K       Lys甲硫氨酸             M       Met苯丙氨酸             F       Phe脯氨酸               P       Pro丝氨酸               S       Ser苏氨酸               T       Thr色氨酸               W       Trp酪氨酸               Y       Tyr缬氨酸               V       Val鸟氨酸               O       Orn
                 单字母       常用
       氨基酸
                  符号        缩写β-丙氨酸                        bAla2，3-二氨基                      Dpr丙酸α-氨基异丁酸                    AibN-甲基甘氨酸                    MeGly(肌氨酸)瓜氨酸                           Cit叔丁基丙氨酸                  t-BuA叔丁基甘氨酸                  t-BuGN-甲基异亮氨酸                  MeIle苯基甘氨酸                       Phg环己基丙氨酸                     Cha正亮氨酸                         Nle1-萘基丙氨酸                     1-Nal2-萘基丙氨酸                     2-Nal4-氯苯丙氨酸                     Phe(4-Cl)2-氟苯丙氨酸                     Phe(2-F)3-氟苯丙氨酸                     Phe(3-F)4-氟苯丙氨酸                     Phe(4-F)青霉胺                            Pen1，2，3，4-四氢异喹喔             Tic啉-3-羧酸β-2-噻吩基丙氨酸                 Thi硫氢化甲硫氨酸                    MSO高精氨酸                          HarN-乙酰赖氨酸                     AcLys2，4-二氨基丁酸                   Dbu对氨基苯丙氨酸               Phe(pNH2)N-甲基缬氨酸                     MeVal高半胱氨酸                       hCys高丝氨酸                         hSerε-氨基己酸                      Ahaδ-氨基戊酸                      Ava2，3-二氨基丁酸                  Dab羟脯氨酸                         Hyp对苄基苯丙氨酸                   Pba高苯丙氨酸                       hPheN-甲基苯丙氨酸                   MePhe
本发明的化合物是根据指定种类的氨基酸残基部分定义的肽。氨基酸残基一般可以如下再细分为主要的亚类：
酸性：该残基由于在生理pH下损失H+离子而具有负电荷，该残基被水溶液吸引，以便在肽处于生理pH下的含水介质中含有的肽构型中寻找表面位置。
碱性：该残基由于在生理pH下缔合H+离子而具有正电荷，该残基被水溶液吸引，以便在肽处于生理pH下的含水介质中含有的肽构型中寻找表面位置。
疏水：该残基在生理pH下没有净电荷，该残基被水溶液排斥，以便在肽处于生理pH下的含水介质中含有的肽构型中寻找内部位置。
极性/大氨基酸：该残基在生理pH下没有净电荷，但该残基不足以被水溶液排斥，使得它可能必须在肽处于生理pH下的含水介质中含有的肽构型中寻找表面位置。根据条件和序列中其余的氨基酸，该残基可能或者位于该蛋白质的内部空间，或者位于该蛋白质的表面。
半胱氨酸状：具有能够参与二硫键的侧链的残基。因此，半胱氨酸状氨基酸一般具有至少含有一个巯基(SH)的侧链，诸如半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺等，最好是半胱氨酸。
小的：某些中性氨基酸的侧链即使缺乏极性基团，也不会大到足以提供疏水性。“小”氨基酸是那些氨基酸，当在该侧链上至少有一个极性基团时，具有不多于4个碳，当在该侧链上没有极性基团时，具有不多于3个碳。
基因编码的次级氨基酸脯氨酸(以及脯氨酸状亚氨基酸，诸如3-羟基脯氨酸和4-羟基脯氨酸)由于已知它对肽链二级构型的作用，是一种特殊情况，因此不包括在一组中。
当然应该理解，在各个残基分子的统计收集中，某些分子会带电荷，某些分子不会，在较大和较小程度上被水溶液吸引或排斥。要符合“带电”的定义，在生理pH下显著百分比的各个分子(至少大约25％)是带电的。分类为极性或非极性所需的吸引和排斥程度是任意的，因此，本发明具体设想的氨基酸分为一类或另一类。没有具体命名的大多数氨基酸可以在已知行为的基础上分类。
氨基酸残基可以进一步再细分类为环状或非环状、芳族或非芳族，参考残基的侧链置换基进行分类，不需加以说明。
某些通常遇到的可能构成本发明肽的非遗传编码氨基酸包括(但不限于)β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸，诸如3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；1-萘基丙氨酸(1-Nal)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；硫氢化甲硫氨酸(MSO)；高精氨酸(Har)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；对氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)；羟脯氨酸(Hyp)；对苄基苯丙氨酸(Pba)；高苯丙氨酸(hPhe)；N-甲基苯丙氨酸(MePhe)；和高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸也适于归入上面定义的分类中。
上述遗传编码和非编码氨基酸的分类总结于下面表1中。应该理解，表1只是为了说明，不是本文所述肽可以包含的详尽的氨基酸残基表。
                      表1
                      氨基酸分类分类            遗传编码的             非遗传编码的疏水的     Y，V，I，L，M，F，W    Phg，1-Nal，2-Nal，Thi，
                             Tic，Phe(4-Cl)，Phe(2-
                             F)，Phe(3-F)，Phe(4-F)，
                             t-BuA，t-BuG，MeIle，
                             Nle，MeVal，Cha，hPhe ，
                             MePhe，Pba酸性       D，E碱性       H，K，R               Dpr，Orn，hArg，Phe (p-
                             NH2)，Dbu，Dab极性/大    Q，N                  Cit，AcLys，MSO小         G，S，A，T            bAla，MeGly，Aib，hSer半胱氨酸状 C                     Pen，hCys
在式(I)的肽中，氨基酸残基Xn和/或Cn之间的符号“-”一般指明主链的链接。因此，符号“-”通常表示酰胺键(-C(O)-NH)。然而应该理解，在所有本发明肽中，一个或多个酰胺键可以可选地用酰胺键以外的键置换。这类键包括(但不限于)-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺式或反式)、-C(O)CH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。
具有这类键的肽和制备这类肽的方法是本领域众所周知的(参见例如Spatola，1983，Vega Data 1(3)(一般综述)；Spatola，1983，“肽主链的修饰”：Chemistry and Biochemistry of Amino Acids Peptides andProteins(Weinstein，ed.)，Marcel Dekker，纽约，第267页(一般综述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1：463-468；Hudson等，1979，Int.J.Prot.Res.14：177-185(-CH2NH-、-CH2CH2-)；Spatola等，1986，Life Sci.38：1243-1249(-CH2S-)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1：307-314(-CH＝CH-，顺式或反式)；Almquist等，1980，J.Med.Chem.23：1392-1398(-COCH2-)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett.23：2533(-COCH2-)；欧洲专利申请EP 45665(1982)CA：97：39405(-CH(OH)CH2-)；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.24：4401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby，1982，Life Sci.31：189-199(-CH2S-)。
一般来说，本发明的肽由大约10-30个氨基酸残基组成。因此，应该理解，尽管式(I)指定包括“核心”肽结构的18个特定氨基酸位置，但本发明的肽可以含有少于或多于18个氨基酸，而不会有害地影响肽抗微生物性质或肽的其它有用性质，在某些情况下甚至增强肽抗微生物性质或肽的其它有用性质。对含有少于18个氨基酸残基的肽而言，正如下面更详细讨论的，在该肽序列中某些特定的氨基酸不存在。对含有多于18个氨基酸残基的肽而言，式(I)所示的氨基酸序列可能在N-末端和/或C-末端含有额外氨基酸残基和肽序列的延伸。应该理解，这类额外的氨基酸残基或肽序列是非干扰性的，因为与天然产生的protegrin相比，它不会显著有害地影响该肽的抗微生物活性。
本发明肽的特征为含有两个主要元件或基元序列的“核心”结构：由形成反向平行β-片的两条链支持的回折区。尽管我们不打算结合理论，但相信式(I)化合物的抗微生物活性部分与这种核心结构有关。
这些肽的β-片区包含一个N-链(残基X1-C8)和C-链(残基C13-X18)。N-链和C-链相互反向平行布置，通过主链-主链的氢连接非共价连接在一起(为了详细描述β-片的结构，读者参看Creighton，1993，Protein Structures and Molecular Properties，W.H.Freeman and Co.，NY，和其中引用的参考文献)。尽管不打算结合理论，但相信包含β-片区的最重要的残基是残基X5-C8和C13-X16。
肽的β-片区最好是两亲的，即β-片的一个表面具有净疏水特性，而另一个表面具有净亲水特性。关于图6描述的β-片结构，L-氨基酸残基的侧链在链内位置(残基n、n+1、n+2等)点以相反方向相互相邻，以便定位于β-片的相反表面。L-氨基酸残基的侧链在链间位置(残基n和c、n+1和c+1等)点以相同方向相互相邻，以便定位于β-片的同一表面。采用这种一般结构的基元序列，通过选择每个残基位置上的氨基酸，获得两亲反向平行β-片，以便产生具有定位于该片一个表面上的疏水侧链和定位于另一表面上亲水侧链的β-片。
当然，应该理解，因为两亲反向平行β-片区的表面仅需要具有净疏水特性或净亲水特性，所以包含一个特定表面的每个侧链不需要是疏水性或亲水性的。表面可以含有不显著改变该表面净特性的侧链。例如，当这些侧链不显著影响该表面净特性时，疏水表面和亲水表面都可以含有小氨基酸侧链。
式(I)肽的β-片区可以含有1-4个半胱氨酸状氨基酸，即指定的C6、C8、C13和C15，它们可以参与链间二硫键。根据形成二硫键的程度，含有至少两个半胱氨酸状氨基酸残基的本发明肽可以是直链形式或环状形式。环状形式是在4个不变半胱氨酸状氨基酸中的所有氨基酸或某些氨基酸中形成二硫键的结果。本发明的环状形式包括所有可能的二硫键形成的置换。直链形式可转变为环状形式，反之亦然。形成二硫键产生环状形式的方法是本领域众所周知的，减少二硫键形成线性化合物的方法也是本领域众所周知的。
天然产生的protegrin(PG-1至PG-5)含有两个二硫键；一个在半胱氨酸C6-C15之间，另一个在半胱氨酸C8-C13之间(Harwig等，1995，J.Peptide Sci.3：207)。因此，在具有两个二硫键的那些实施方案中，最好是C6-C15、C8-C13形式。这类肽命名为“天然”形式。然而，已经发现，仅含有一个二硫键的protegrin形式有活性，并且易于制备。在仅具有一个二硫键的实施方案中，最好是由单独的C6-C15或单独的C8-C13表示的那些二硫键。
含有C6-C15二硫化物作为唯一二硫键的形式一般命名为protegrin的“子弹”形式；其中唯一二硫键为C8-C13的那些形式命名为“风筝”形式。通过在不参与二硫键的位置上用不参与二硫键的氨基酸置换每个半胱氨酸状氨基酸，可以最方便地制备子弹形式和风筝形式，最好是用诸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸等的小氨基酸置换。另一方法是，可以缺乏C8和/或C13。
因为天然肽的线性化形式或“蛇”形式具有有价值活性，因此本发明的肽包括线性化形式，其中用合适的试剂化学稳定巯基(SH)。如本文限定的“SH-稳定化的”形式的本发明肽含有已经与标准试剂反应的巯基，以防止再形成二硫键或半胱氨酸状氨基酸残基被上述其它氨基酸置换的形式。最好所有4个半胱氨酸状氨基酸残基都被置换或SH-稳定化，以便减小形成分子间二硫键的可能性。
β-片中参与链间二硫桥的硫原子不定位于由链间主链-主链氢连接限定的平面上；这些硫原子相对于桥连氨基酸的β-碳成一定角度，以便定位于β-片的一个表面上。因此，二硫键的硫原子影响该β-片一个表面的净亲水性。应该理解，在式(I)的肽中，由下式定义的β-片区特别符合本文所述两亲反向平行片的定义：
Figure A9619963200321
其中C6、C8、C13和C15每个独立地为半胱氨酸状氨基酸，X7和X14每个独立地为疏水氨基酸或小氨基酸，而‖为二硫键。在一个特别推荐实施方案中，C6、C8、C13和C15每个是半胱氨酸，而X7和X14每个独立地为疏水氨基酸。
图6描述的β-片二级结构完全由L-氨基酸组成。本领域技术人员会认识到，用L-氨基酸相应的D-对映体在特定残基位置上置换L-氨基酸，可能破坏两亲反向平行β-片的结构稳定性或两亲性。任何特定的对映体置换破坏结构稳定性或两亲性的程度部分取决于该氨基酸链的大小和该残基在β-片中的位置。式(I)肽的β-片区最好含有L-和D-氨基酸的混合物，它们与含有该片相应的全部D-或全部L-对映体形式相比，不会显著影响β-片区的稳定性或两亲性。大致不影响β-片区稳定性或两亲性的对映体置换对本领域技术人员是显而易见的。
在本发明的一个推荐实施方案中，构成β-片区的疏水氨基酸、碱性氨基酸、极性/大和半胱氨酸状氨基酸或者全部是L-对映体，或者全部为D-对映体。构成β-片区的小氨基酸可以或者是L-对映体，或者是D-对映体。
式(I)肽的回折区(结合在一起的残基X9-X10-X11-X12)连接反向平行β-片的链。因此，该回折区包含一个结构，逆转多肽链的方向，以便允许该肽一个区适应反向平行β-片的二级结构。
该分子的回折区一般包含两个、三个或四个氨基酸残基(可以缺乏X9和/或X12)。本发明肽的重要特征是在该分子的转角区存在正电荷。因此，X9-X12中的一个，最好是X9-X12中的两个必须是碱性氨基酸。这类能够在肽中实现转角的两个、三个和四个氨基酸的区段是众所周知的，对本领域技术人员是显而易见的。
在本发明的一个推荐实施方案中，回折是三个氨基酸残基的γ-转角。实际上，本领域已知的任何γ-转角序列都可以用于本发明的肽中，包括例如在以下文献中描述的那些转角：Rose等，1985，Adv.ProteinChem.37：1-109；Wilmer-White等，1987，Trends Biochem.Sci..12：189-192；Wilmot等，1988，J.Mol.Biol.203：221-232；Sibanda等，1989，J.Mol.Biol.206：759-777；Tramontano等，1989，Proteins：Struct.Funct.Genet.6：382-394。
在另一个推荐实施方案中，回折是四个氨基酸残基的β-转角。在这类结构中，该转角的两个内部氨基酸残基通常不参与反向平行β-片的氢连接；在该内部残基两端的两个氨基酸残基通常包含在β-片的氢连接中。尽管我们不打算结合理论，但相信这种氢连接有助于稳定该分子的β-片区。
许多肽的β-转角的构型和序列是本领域已经详细描述的，作为实例包括(但不限于)I型、I’型、II型、II’型、III型、III’型、IV型、V型、V’型、VIa型、VIb型、VII型和VIII型(参见Richardson，1981，Adv.Protein Chem.34：167-339；Rose等，1985，Adv.Protein Chem.37：1-109；Wilmot等，1988，J.Mol.Biol.203：221-232；Sibanda等，1989，J.Mol.Biol.206：759-777；Tramontano等，1989，Proteins：Struct.Funct.Genet.6：382-394)。所有这些类型肽的β-转角结构和它们的相应序列以及近期发现的肽β-转角结构和序列是本发明特别预期的。
短肽转角的具体构型(诸如β-转角)主要取决于转角中某些氨基酸残基的位置(通常是Gly、Asn或Pro)。I型β-转角一般与X9-X12位置上的任一氨基酸残基相容，只是Pro不在X11位置上。Gly主要在X12位置上，而Pro主要在I型和II型转角的X10位置上。Asp、Asn、Ser和Cys残基通常发生在X9位置上，在此它们的侧链通常与X11残基的NH进行氢连接。
在II型转角中，Gly和Asn最常出现在X11位置上，因为它们最容易适应所需的主链角度。理想的是，I’型转角在X10和X11位置上具有Gly，而II’型转角在X10位置具有Gly。III型转角通常可以具有大多数氨基酸残基，但III’型转角通常需要在X10和X11位置上具有Gly。
VIa型和VIb型转角通常具有顺式肽键和作为内部残基的Pro。关于蛋白质和肽中β-转角的不同类型和序列的综述，读者参看Wilmot等，1988，J.Mol.Biol.203：221-232。
推荐的β-转角序列如下(以X9-X12的顺序列出)：ZZZG；ZZZF；ZZSG；ZZAL；ZGZL；ZFZL；ZPZV；ZPZF；ZGZY；IZGZ；LZZF；YZGZ，其中每个Z独立地为R、K、Dbu或Orn的L-或D-对映体。
其它推荐的β-转角包括X10和/或X11为Tic或Hyp的那些β-转角，因为这些残基已知在肽和蛋白质中实现或诱导β-转角结构。
本发明的肽一般是碱性的，即它们在生理pH下具有净正电荷。尽管我们不打算结合理论，但相信带正电氨基酸残基的存在，特别是在该分子转角区中带正电氨基酸残基的存在对于抗微生物活性是重要的。
应该理解，在诸如肽等结构中各种氨基酸残基的统计收集中，某些氨基酸残基会带正电，某些氨基酸残基带负电，某些氨基酸残基不带电。因此，某些肽具有电荷，而某些肽不具有电荷。为了符合“碱性”的定义，在该肽分子中过量的氨基酸残基在生理pH下带正电。因此，大约15％、但不高于大约50％的氨基酸必须是碱性氨基酸，这些化合物在生理pH下的净电荷必须至少为+1。本发明的肽在生理pH下的净电荷最好至少为+3。
关于少至10个氨基酸的实施方案，仅有一个碱性氨基酸残基；然而，甚至在该短链残基中最好至少两个碱性氨基酸。如果protegrin肽含有多至15个氨基酸残基，那么需要两个碱性残基。最好该序列中至少20％的氨基酸为碱性，特别推荐30％的碱性氨基酸。
本发明肽的氨基末端可以为游离氨基形式，或可以被式RCO-的基团酰化，其中R表示1-25C的烃基，优选1-10C的烃基，更优选1-8C的烃基。该烃基可以是饱和或不饱和的、直链、支链或环状，通常例如是甲基、乙基、异丙基、叔丁基、正戊基、环己基、环己烯-2-基、己烯-3-基、己烯-4-基、辛基、癸基、二十基等，最好是辛基。
另一方法是，该N-末端可以含有芳基，诸如萘等。通过采用诸如1-萘丙氨酸或2-萘丙氨酸的氨基酸作为N-末端氨基酸残基，可以将这类基团方便地加入本发明的肽中。
肽的N-末端也可以置换，以采用溶质特异性的跨膜通道促进它们进入细菌的周质。例如，N-末端可以方便地采用儿茶酚-NHS活化酯用儿茶酚修饰。
本发明肽的C-末端可以为非衍生的羧基形式，或者作为游离酸或可接受的盐，诸如钾、钠、钙、镁或无机离子或有机离子(诸如咖啡因)的其它盐。在某些实施方案中，由于该分子的其余部分带有正电荷，可能排斥相关的阳离子，因此难以制备盐。也可以通过与式ROH的醇形成酯，衍生羧基末端，或可以用式NH3或RNH2或R2NH的胺将羧基末端酰胺化，其中每个R独立地为上述1-25C的烃基，推荐实施方案如上所述。最好是C-末端具有式CONH2的肽的酰氨化形式。
在C-末端和/或N-末端加入亲脂基团有利于使该肽跨入靶微生物的膜内，并渗透到感染位点。最适置换的选择由对该靶微生物脂类含量的评价决定。
因此，在一个说明性实施方案中，本发明提供抗微生物肽或其药学上可接受的盐或N-末端酰化形式或C-末端酰氨化形式或酯化形式，这些抗微生物肽由大约10-30个氨基酸残基组成，含有以下氨基酸序列：(I)    X1-X2-X3-X4-X5-C6-X7-C8-X9-X10-X11-X12-C13-X14-C15-X16-X17-X18其中：
C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个半胱氨酸状的、碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
每个C6和C15独立地为一个半胱氨酸状的、为碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
X1-X5中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为疏水氨基酸或小氨基酸；
X9和X12中的每个独立地存在或不存在；
结合在一起的X9-X12当含于式(I)的氨基酸序列中时，能够实现回折，并且X9-X12中的至少一个必须是碱性氨基酸；
X16-X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
并且其中包含所述抗微生物肽的至少大约15％-50％的氨基酸为碱性氨基酸，使得所述抗微生物肽在生理pH下的净电荷至少为+1。
在一类本文描述的protegrin中，或者在天然产生的protegrin中发现的X5上的疏水氨基酸用碱性氨基酸置换，和/或X1-X4中的至少一个是疏水氨基酸，和/或在天然形式中发现的X1和X4中的至少一个、最好全部四个氨基酸缺失；和/或X5、C8、X9、X12、X13和X16中的一个或多个不存在。通过这些特征和其它特征的适当的操作，可以改变使该类本发明protegrin有效的条件范围。此外，也可以改变它们对其有效的微生物范围。
在另一类中，本发明的肽由大约10-14个氨基酸残基组成，C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个小氨基酸、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
C6和C15中的每个独立地为一个小氨基酸、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
X1-X5中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸或小氨基酸，X1-X5中的任何两个可以是疏水氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为一个疏水氨基酸；
X9和X12中的每个独立地存在或不存在；如果存在，每个独立地为碱性氨基酸或疏水氨基酸；
X10为碱性氨基酸、疏水氨基酸或小氨基酸或脯氨酸；
X16存在和不存在，如果存在，为碱性氨基酸、小氨基酸或疏水氨基酸；
X17和X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸或小氨基酸；
X16-X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，每个独立地为碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大或小氨基酸。
在另一类中，本发明的肽由大约10-18个氨基酸残基组成，C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为小氨基酸、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
C6和C15中的每个独立地为小氨基酸、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
X1-X4中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为碱性氨基酸或小氨基酸，并且X1-X4中的任何一个可以是疏水氨基酸；
X5和X16中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为疏水氨基酸或碱性氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为疏水氨基酸；
X9存在或不存在，如果存在，为碱性氨基酸或疏水氨基酸；
X10为碱性氨基酸或小氨基酸或脯氨酸；
X11为碱性氨基酸或疏水氨基酸；
X12存在或不存在，如果存在，为疏水氨基酸；
X17存在或不存在，如果存在，独立地为小氨基酸；以及
X18存在或不存在，如果存在，为碱性氨基酸。
通过推荐实施方案，可以进一步说明本发明的肽。在本发明的一个推荐实施方案中，在C6、C8、C13和C15位置上的所有半胱氨酸状氨基酸残基都存在，在X9和X12上的半胱氨酸状氨基酸残基也存在。
在另一组推荐实施方案中，X1-X4都不存在。在另一组推荐实施方案中，X1-X4中的至少一个，最好是至少两个是疏水氨基酸，最好为I、V、L、Y、F或W。
在另一组推荐实施方案中，X9-X12含有至少一个疏水氨基酸残基，最好是Phe、Tyr或Trp。
其它推荐实施方案包括以下那些肽，其中X1和X9中的每个独立地选自R、K、Orn、Dab和Har或疏水氨基酸；最好X1为R、K、Har，而X9为R、K、Har或疏水氨基酸，特别是I、V、L、W、F或Y。然而，X1和X9中的每个可以不存在。
在另一类推荐实施方案中，X2和X3中的每个独立地选自G、A、S、T、I、V、L、F、Y和W；更优选X2和X3为G、W、F、Y、L或V；然而，X2和/或X3可以不存在。
在另一组推荐实施方案中，X4选自R、K、H、Orn、Har、Dab、G、A、S、T、F、Y和W；更优选X4为R、K、Orn、Dab、G或W；然而，X4可以不存在。
在另一组推荐实施方案中，X5和X16中的每个独立地选自I、V、L、Nle、W、Y和F，最好为I、V、L、W、F和Y。然而X5和/或X16可以不存在。
在另一组推荐实施方案中，X7和X14中的每个独立地选自I、V、L、W、Y和F；最好X7为I、F、Y或W，而X14为I、V、L、W、Y或F。
在另一组推荐实施方案中，X9为R、K、H、Orn、Dab、Har、I、V、L、Nle、W、Y或F，而X12为I、L、V、W、F或Y；更优选为芳族氨基酸，诸如Y、W或F。
在另一组推荐实施方案中，X10为R、Orn、Dab、G、W或P。
在另一组推荐实施方案中，X11为R、K、Orn、Dab、G、W或P。
在另一组推荐实施方案中，X17最好不存在，但存在时，最好为G、A、S或T；
在另一组推荐实施方案中，X18为最好不存在，但存在时，最好为R、K、H、Orn、Dab或Har。
最好也是当所有四个氨基酸X1-X4都存在时，X1和X4最好为碱性氨基酸，而X2和X3为小氨基酸或疏水氨基酸。X1-X4的推荐实施方案包括R-G-G-R、R-G-W-R、R-L-L-R等。
置换半胱氨酸状残基的碱性氨基酸的推荐实施方案是R、K、H、Orn、Dab和Har，最优选为R、K或Orn。置换半胱氨酸状残基的推荐小氨基酸包括G、A、S和T，最优选为A和T。
特别推荐的本发明肽包括以下肽的天然形式、风筝形式、子弹形式和/或蛇形式： 21形式  R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V
     R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V
     R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
     R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
            R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V
            L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
            R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
            L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V22形式  R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-V
     R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-V
     R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-R
     R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-R
             R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-V
             L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-R
             R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-R
             L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-I-Z-V23形式  R-G-G-G-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V
     R-G-G-G-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V
     R-G-G-G-L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
     R-G-G-G-R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
             R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V
             L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
             R-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-R
             L-Z-Y-Z-R-R-R-F-Z-V-Z-V24形式  R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V
     R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V
     R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R
     R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R
             R-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V
             L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R
             R-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-R
             L-Z-Y-Z-R-G-W-I-Z-F-Z-V25形式  R-G-G-R-L-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V
     R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V
R-G-G-K-L-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-R
R-G-G-R-R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-R
        R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V
        L-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-R
        R-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-R
        L-Z-Y-Z-R-P-R-F-Z-V-Z-V及其N-酰化形式和/或C-酰氨化形式或酯化形式，其中每个Z独立地为疏水氨基酸、小氨基酸或碱性氨基酸或半胱氨酸的；以及上述形式，其中X7为W和/或X12为W，和/或其中X14为W和/或其中X16为W和/或其中X17为G，而X18为R；和/或其中X5、X9、X12和X16中的至少一个不存在。在所有这些实施方案中，Z最好为S、A、T或G，最优选为A或T。
在上述肽中，protegrin的21形式由具有本类特征但在其它方面与protegrin-1(PG-1)相似的化合物组成；22形式含有本类特征但在其它方面与protegrin-2(PG-2)相似的化合物；23-25形式同样与protegrin-3、-4和-5(PG-、PG-4和PG-5)有关(参见图5)。
另一组推荐化合物包括以下肽(所示序列与protegrin PG-1对准)的天然形式、子弹形式、风筝形式和蛇形式及其N-酰化形式和/或C-酰氨化形式或酯化形式：编码           序列PG-1    RGGRLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：1)
       WLCFCRRRFCVCV                 (SEQ ID NO：2)
       FLCFCRRRFCVCV                 (SEQ ID NO：3)
       WYCYCRRRFCVCV                 (SEQ ID NO：4)
       WXCYCRRRFCVCV (X＝Cha)        (SEQ ID NO：5)
       WLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：6)
       WXCYCRRRFCVCVGR (X＝Cha)      (SEQ ID NO：7)
    RLLRLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：8)
    RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)    (SEQ ID NO：9)
      RGVCVCFRRRCYCLW                (SEQ ID NO：10)
      RGVCVCFRRRCYCLW                (SEQ ID NO：11)编码    序列
    VCVCFRRRCYCLW                (SEQ ID NO：12)
    FCVCFRRRCFCLF                (SEQ ID NO：13)
  RGVCVCFRRRCYCRGGR              (SEQ ID NO：14)
  RGVCVCFRRRCYCLRGGR (all D)     (SEQ ID NO：15)
  RGVCVCFRRRCYCLW                (SEQ ID NO：16)
  RGVCVCYRXRCYCLW (X＝MeGly)     (SEQ ID NO：17)
   WLCYCRXZYCVCVGR (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：18)
                   (Z＝D-Arg)
 RGFCVCFRRVCYCLW                 (SEQ ID NO：19)
  WLCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：20)
  WLCYCRRXFCVCVR (X＝D-Arg)      (SEQ ID NO：21)
  WLCYCKKKFCVCVGK                (SEQ ID NO：22)Octyl-WLCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：2 3)
  XLCYCRRRFCVCV (X＝1-Nal)       (SEQ ID NO：24)
  WLC  RGRF  CVR                 (SEQ ID NO：25)
  WLC  RGRF  CFR                 (SEQ ID NO：26)
  WLCY RR   VCVR                 (SEQ ID NO：27)
  WLCYCOOOFCVCV                  (SEQ ID NO：28)
  WLCYCXXXFCVCV (X＝Dab)         (SEQ ID NO：29)
  WLCYCRRRFCVCV (all D)          (SEQ ID NO：30)
HWRLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：31)
KWRLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：32)
OWRLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：33)
XWRLCYCRPKFCVCV (X＝Dab)         (SEQ ID NO：34)
RWHLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：35)
RWKLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：36)
RWOLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：37)
RWXLCYCRPKFCVCV (X＝Dab)         (SEQ ID NO：38)
  WLCYCKXKFCVCVGR(X＝Tic)        (SEQ ID NO：39)
   FCYCKXKFCYCV (X＝Hyp)         (SEQ ID NO：40)
  WLXYXRRRFXVXV (X＝hCys)        (SEQ ID NO：41)
 WOLCYCOXOFCVCVO (X＝Tic)        (SEQ ID NO：42)
  OFCVCVOXOFCVCVO (X＝Tic)       (SEQ ID NO：43)OWOLCYCOXOFCVCV (X＝Tic)          (SEQ ID NO：44)
 OFCVCXOLCYCFO (X＝Tic)          (SEQ ID NO：45)编码    序列
     WLCYCKKKFCVCV              (SEQ ID NO：46)
   OWOLCYCOXOFCVCV (X＝Hyp)     (SEQ ID NO：47)
     WLCYCOXOFCVCVO (X＝Pba)    (SEQ ID NO：48)
     WLCYCOOOFCVCV (all D)      (SEQ ID NO：49)
     XFCYCLRXFCVCVR(X＝D-Arg)   (SEQ ID NO：50)
     WLCYCRRXFCVCVZX            (SEQ ID NO：51)
                     (X＝D-Arg)
                     (Z＝MeGly)PC11      LCYCRRRFCVCVGR            (SEQ ID NO：52)PC12      RCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：53)PC15  RGGRLCYCRRRFCVCR              (SEQ ID NO：54)PC16      RCYCRRRFCVCR              (SEQ ID NO：55)PC17      LCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：56)PC18      LCYARRRFAVCV              (SEQ ID NO：57)PC19      RCYARRRFAVCR              (SEQ ID NO：58)PC20      LAYCRRRFCVAV              (SEQ ID NO：59)PC21      RAYCRRRFCVAR              (SEQ ID NO：60)PC22  RGGRLCY RR  VCV               (SEQ ID NO：61)PC31   GGRLCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：62)PC32   RGRLCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：63)PC33    GRLCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：64)PC34    RRLCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：65)PC35     RLCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：66)PC36     RRCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：67)PC37       CYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：68)PC44  RGGRLCYCRRRFCVC               (SEQ ID NO：69)PC47  RGGRLCY RRRF VCV              (SEQ ID NO：70)PC48  RGWRLCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：7 1)PC37a      CYCRRRFCVCVGR            (SEQ ID NO：72)PC45  RGGRLCYCRRRFCV                (SEQ ID NO：73)PC72      LCYCRRRFCVC               (SEQ ID NO：74)PC64      LCYTRRRFTVCV              (SEQ ID NO：75)PC64a     LTYCRRRFCVTV              (SEQ ID NO：76)PC31a  GGRLCYCRRRFCVCVGR            (SEQ ID NO：77)PC32a  RGRLCYCRRRFCVCVGR            (SEQ ID NO：78)编码         序列PC33a       GRLCYCRRRFCVCVGR   (SEQ ID NO：79)PC34a       RRLCYCRRRFCVCVGR   (SEQ ID NO：80)PC35a        RLCYCRRRFCVCVGR   (SEQ ID NO：81)PC36a        RRCYCRRRFCVCVGR   (SEQ ID NO：82)PC44a     RGGRLCYCRRRFCVCR     (SEQ ID NO：83)PC47a    RGGRLCY RRRF VCVGR    (SEQ ID NO：84)PC48a    RGWRLCYCRRRFCVCVGR    (SEQ ID NO：85)PC54     RGWRLAYCRRRFCVAVGR    (SEQ ID NO：86)PC61         RCYCRRRFCVCV      (SEQ ID NO：87)PC62         LCYCRRRFCVCR      (SEQ ID NO：88)PC63         VCYCFRRFCYCV      (SEQ ID NO：89)PC65         LCYTRPRFTVCV      (SEQ ID NO：90)PC66         LCYTRGRFTVCV      (SEQ ID NO：91)PC67         LCYFRRRFIVCV      (SEQ ID NO：92)PC68         LCYFRPRFIVCV      (SEQ ID NO：93)PC69         LCYTFRPRFVCV      (SEQ ID NO：94)PC70         LCYTFRGRFVCV      (SEQ ID NO：95)PC74          CYCFRRFCVC       (SEQ ID NO：96)PC77         LCYCRRRRCVCV      (SEQ ID NO：97)PC78         LCYCFRRRCVCV      (SEQ ID NO：98)PC79         LCYCRFRRCVCV      (SEQ ID NO：99)PC80         LCYCRRFRCVCV      (SEQ ID NO：100)PC81         LCYCRRFFCVCV      (SEQ ID NO：101)PC82         LCYCRFFRCVCV      (SEQ ID NO：102)PC83         LCYCFFRRCVCV      (SEQ ID NO：103)PC84         LCYCFRRFCVCV      (SEQ ID NO：104)PC85         LCYCFRFRCVCV      (SEQ ID NO：105)PC86         LCYCRFRFCVCV      (SEQ ID NO：106)PC87         LCYCFRFFCVCV      (SEQ ID NO：107)PC88         LCYCFFRFCVCV      (SEQ ID NO：108)PC89         LCYCFFFRCVCV      (SEQ ID NO：109)PC90         LCYCRFFFCVCV      (SEQ ID NO：100)
     RGGRLCY  RR  VCVGR    (SEQ ID NO：111)PC91         YCYCRRRFCVCVGR    (SEQ ID NO：112)编码       序列PC95      ICYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：113)PC96      FCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：114)PC97      WCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：115)PC99      RCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：116)PC109    RLCYTRGRFTVCV                  (SEQ ID NO：117)PC110     LCYTRGRFTVCVR                 (SEQ ID NO：118)PC111    RLCYTRGRFTVCVR                 (SEQ ID NO：119)PC112     LCYCHHHFCVCV                  (SEQ ID NO：120)PC113     LCYTHHHFTVCV                  (SEQ ID NO：121)
   RGGLCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：122)
  RGGRLCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：123)
  RGGGLCYCRRRFCVCVGR                (SEQ ID NO：124)
  RGGGLCYCRRGFCVCFGR                (SEQ ID NO：125)
  RGGGLCYCRRPFCVCVGR                (SEQ ID NO：126)
  RGGGLCYCRPRFCVCVGR                (SEQ ID NO：127)
  RGGRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)     (SEQ ID NO：128)
   RGGLCYCRGRFCVCVGR                (SEQ ID NO：129)
  RGGRLCYCXGRFCVCVGR (X＝Cit)       (SEQ ID NO：130)
  XGGRLCYCRGRFCVCVGR (X＝Cit)       (SEQ ID NO：131)
  RGGRVCYCRGRFCVCVGR                (SEQ ID NO：132)
  RGGGLCYCFPKFCVCVGR                (SEQ ID NO：133)
  RGWGLCYCRPRFCVCVGR                (SEQ ID NO：134)
  RGWRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)     (SEQ ID NO：135)
  RGWRLCYCRGRFCVCVGR                (SEQ ID NO：136)
  RGWRLCYCXPRFCVCVGR (X＝Cit)       (SEQ ID NO：137)
   RWRLCYCRPRFCVCVGR                (SEQ ID NO：138)
  RGWRLCYCRPRFCVCVGR                (SEQ ID NO：139)
  RGWRACYCRPRFCACVGR                (SEQ ID NO：140)
   GWRLCYCRPRFCVCVGR                (SEQ ID NO：141)
   RWRLCYCKGKFCVCVGR                (SEQ ID NO：142)
  RGWRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)     (SEQ ID NO：143)
  GGWRLCYCRGRFCVCVGR                (SEQ ID NO：144)
  RGGWLCYCRGRFCVCVGR                (SEQ ID NO：145)
  RLLRLCYCRXRFCVCVGR  (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：146)编码      序列
     RLLRACYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)   (SEQ ID NO：147)
     RLLRLCYCRRRFCVCVGR              (SEQ ID NO：148)
     RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)     (SEQ ID NO：149)
     RGGRLCYCRXRZCVCWGR (X＝MeGly)   (SEQ ID NO：150)
                        (Z＝Cha)
     RGGRWCVCRXRZCYCVGR (X＝MeGly)   (SEQ ID NO：151)
                        (Z＝Cha)
     RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)     (SEQ ID NO：152)
     RGGRWCVCRGRXCYCVGR (X＝Cha)     (SEQ ID NO：153)
     RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)   (SEQ ID NO：154)
         LCYCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：155)
         LCYCRRCFCVCV                (SEQ ID NO：156)
         LCYCRRRFCVCF                (SEQ ID NO：157)
         LCACRRRACVCV                (SEQ ID NO：158)
         LCYCRXRFCVCV (X＝D-Arg)     (SEQ ID NO：159)
         LCWCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：160)
         WCYCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：161)
         LCYCRRRXCVCV (X＝hPhe)      (SEQ ID NO：162)
         LCYCRRRXCVCV (X＝Phe(4-Cl)) (SEQ ID NO：163)
         XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：164)
         LCYCRRRFCXCV (X＝D-His)     (SEQ ID NO：165)
         LCYCRRRXCVCV (X＝MeGly)     (SEQ ID NO：166)
         LCYCRRRXCVCV (X＝MePhe)     (SEQ ID NO：167)
         LCYCRRRFCXCV (X＝MeVal)     (SEQ ID NO：168)
         LCXCRRRXCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：169)
         LCGCRRRGCVCV                (SEQ ID NO：170)
         LCACRGRACVCV                (SEQ ID NO：171)
        RACYCRPRFCACV                (SEQ ID NO：172)
        RLCYCRPRFCVCF                (SEQ ID NO：173)
        RLCYCRPRFCVCV                (SEQ ID NO：174)
        KLCYCKPKFCVCV                (SEQ ID NO：175)
        RLCACRGRACVCV                (SEQ ID NO：176)
        RLCYCRXRFCVCV (X＝MeGly)     (SEQ ID NO：177)
        RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：178)
        RWCFCRPRFCVCV                (SEQ ID NO：179)编码       序列
      WLCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：180)
      WLCFCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：181)
      FLCFCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：182)
      WLCFCRRRXCVCV (X＝MePhe)   (SEQ ID NO：183)
      WYCYCRRRFCVCV              (SEQ ID NO：184)
      WXCYCRRRFCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：185)
      RXCFCRGRZCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：186)
                    (Z＝MePhe)
      XLCFCRRRZCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：187)
                    (Z＝MePhe)
      RLCYCRPRFCVCVGR            (SEQ ID NO：188)
      WLCYCRRRFCVCVGR            (SEQ ID NO：189)
      WXCYCRRRFCVCVGR (X＝Cha)   (SEQ ID NO：190)
      RLCYCRGPFCVCR              (SEQ ID NO：191)
     RRWCFVCYAGFCYRCR            (SEQ ID NO：192)
      RRCYCRGRFCGCVGR            (SEQ ID NO：193)
     RWRCYCGRRFCGCVGR            (SEQ ID NO：194)
     RARCYCGRRFCGCVGR            (SEQ ID NO：195)
     GWRCYCRGRFCGC               (SEQ ID NO：196)
    RGWACYCRGRFCVC               (SEQ ID NO：197)
      RRCYGRRRFGVCVGR            (SEQ ID NO：198)
   RGWRLCYGRGRFKVC               (SEQ ID NO：199)
   RGWRLCYCRGRFCVC               (SEQ ID NO：200)
        CYCRRRFCVCF              (SEQ ID NO：201)
   RGWRLCYCRXRFCVC (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：202)
   RGWRGCYCRXRFCGC (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：203)
       LCYCRPRFCVCVGR            (SEQ ID NO：204)
       LCYCKPKFCVCVGK            (SEQ ID NO：205)
       LCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：206)
       LCYCRPRFCVCVGRGR          (SEQ ID NO：207)
     RRWCYCRPRFCVCVR             (SEQ ID NO：208)
     WRLCYCRPRFCVCVGR            (SEQ ID NO：209)
     GWLCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：210)
     RWLCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：211)
     RLLCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：212)编码             序列
       RWRLCYCRPRFCVCV                (SEQ ID NO：213)
       RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：214)
                       (Z＝MeGly)
      RGWRLCYCRGRXCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：215)
      RGGRVCYCRGRFCVCV                (SEQ ID NO：216)
          LCYCRXRFCVCV (X＝D-Ala)     (SEQ ID NO：217)
          LCYCKPKFCVCV                (SEQ ID NO：218)
          VCYCRPRFCVCV                (SEQ ID NO：219)
          LCYCRPRFCVCW                (SEQ ID NO：220)
          LCYRRPRFRVCV                (SEQ ID NO：221)
      RGWRLCYCRGRXCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：222)
       RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：223)
                       (Z＝MeGly)
       RXRLCYCRGRFCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：224)
      RGGGLCYARGWIAFCVGR              (SEQ ID NO：225)
      RGGGLCYARGFIAVCFGR              (SEQ ID NO：226)
      RGGGLCYARPRFAVCVGR              (SEQ ID NO：227)
      RGGGLCYTRPRFTVCVGR              (SEQ ID NO：228)
      RGGGLCYARKGFAVCVGR              (SEQ ID NO：229)
      RGGRLCYARRRFAVCVGR              (SEQ ID NO：230)
      RGGGLCYKRGFIKVCFGR              (SEQ ID NO：231)
      RGGGLCYKRGWIKFCVGR              (SEQ ID NO：232)
      RGGGLCYRLPKFRVCVGR              (SEQ ID NO：233)
      RGGGLCYRLPGFRVCVGR              (SEQ ID NO：234)
      RGWRGCYKRGRFKGCVGR              (SEQ ID NO：235)
          LCYKRGRFKVCV                (SEQ ID NO：236)
          ICYRPRFVCVGR                (SEQ ID NO：237)
         WLCYCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：238)
         RLCYCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：240)
      RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR            (SEQ ID NO：241)
      RRRLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：242)
                 6.2.2.  化合物的制备
本文通常命名为“protegrin”的本发明化合物大致上是肽主链，它们可以在N-末端或C-末端进行修饰，也可以含有一个或两个二硫键。这些肽可以首先以非环化形式合成。然后需要时可以用形成二硫键的标准方法，将这些肽转化为环状肽。用于本文protegrin的“环状形式”是指由于在该肽中的半胱氨酸状氨基酸残基之间形成二硫键而含有环状部分的那些形式。如果最好是非环化形式，那么最好稳定含有两个或多个半胱氨酸状残基的任何本发明肽的巯基。
合成本文所述大小的肽的标准方法是已知的。目前最常用的是固相合成技术；实际上，可以购买用于系统构建肽链的自动化设备。溶液相合成也可以采用，它对于大规模的生产有相当大的益处。当采用这些标准技术合成时，在合成中可以使用不由该基因编码的氨基酸和D-对映体。因此，获得本发明化合物的一种非常实用的方法是采用这些标准化学合成技术。
除提供该肽主链之外，可以再采用常规化学技术，衍生N-末端和/或C-末端。本发明的化合物可以可选地在氨基末端含有一个酰基。酰化的方法，或更通常地将N-末端游离氨基酰化的方法一般是本领域已知的；另外，可以将该N-末端氨基酸以酰化形式供给合成。
在羧基末端，该羧基当然可以以盐形式存在；在药物组合物的情况下，这将是药学上可接受的盐。合适的盐包括与无机离子(诸如NH4 +、Na+、K+、Mg++、Ca++等)生成的那些盐以及与有机阳离子(诸如咖啡因和其它高度取代胺的阳离子)生成的盐。然而，当式(I)化合物含有多个碱性残基时，难以生产盐或不可能生成盐。也可以采用式ROH的醇将该羧基末端酯化，其中R为上面限定的烃基。同样，可以将该羧基末端酰氨化，以便具有-CONH2、-CONHR或-CONR2的分子式，其中每个R独立地为上面限定的烃基。用于酯化和酰氨化以及在碱存在下进行中和形成盐的技术都是标准的有机化学技术。
如果在生理条件下制备本发明的肽，那么碱性氨基酸的侧链氨基将为相关酸加成盐的形式。
关于具有C-末端酰胺的线性肽的合成，在ABI 433自动肽合成仪(ABD，Perkin Elmer，Foster City，CA)上，按照生产商的标准操作步骤，采用Fmoc化学，在Fmoc Rink酰胺固相支持体树脂(Bachem)上方便地合成该肽序列。通常于室温下，在10ml苯硫基甲烷/EDT/TFA(1/1/9)中切割2小时。粗切割产物用叔丁基·甲基醚沉淀，过滤并干燥。
需要时，在温和氧化剂存在下进行二硫键的形成。可以使用化学氧化剂，或可以将化合物简单地暴露于空气的氧气中，以实现这些连接。各种方法都是本领域已知的。Tam，J.P.等，Synthesis(1979)955-957；Stewart，J.M.等，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，PierceChemical Company Rockford，IL(1984)；Ahmed A.K.等，J Biol Chem(1975)250：8477-8482和Pennington M.W.等，Peptides 1990，E.Giralt等，ESCOM Leiden，The Netherlands(1991)164-166中已经描述了用于二硫键形成的方法。Kamber，B.等在Helv Chim Acta(1980)63：899-915中描述了另一种选择方法。Albericio在Int J Pept Protein Res(1985)26：92-97中描述了一种在固相支持体上进行的方法。
特别推荐的方法是使用分子氧的溶液氧化。本发明人在此已经使用该方法重折叠酰胺形式或酸形式的合成PG-1、PG-3、对映(enantio)PG-1和两个单二硫化PG-1化合物(C6-C15和C8-C13)。回收率高达65-90％。
在形成二硫键的推荐方法中，将该粗肽溶于DMSO中，将其加入20mM醋酸铵缓冲液pH7中。该肽在该溶液中的最终浓度为1-8mg/ml，pH为7.0-7.2，DMSO的浓度范围为5-20％。该肽溶液于室温下搅拌过夜。
用浓醋酸将该溶液的pH调至pH5，在Prep LC上纯化该样品。加样后，该柱用10％乙腈/H2O(0.1％TFA)洗涤，直至UV吸收降至基线。然后开始梯度。
柱子：Vydac Cat#218TP101522，2.2×25cm，C18肽和蛋白质；UVλ：235nm；流速：10ml/min。
溶剂A为100％0.1％TFA/H2O；溶剂B为100％0.08％TFA/ACN。梯度如下。
        T(min)                 ％B(线性梯度)
          0                       10
          10                      18
          80                      32
          95                      95用分析型HPLC分析收集部分，合并含有所需肽的那些部分。汽提乙腈，冷冻干燥所得的水溶液。用质谱证实含有硫化键的所得酰胺。
如果该肽主链全部由基因编码的氨基酸组成，或如果其某些部分由基因编码的氨基酸组成，那么该肽或相关部分也可以采用重组DNA技术合成。编码本发明肽的DNA本身可以采用市售设备合成；根据该宿主的性质，可以将密码子的选择整合到该合成中。
重组产生形式的protegrin可能需要随后衍生，以修饰N-末端和/或C-末端，根据分离方法，实现上述二硫键的形成。根据用于重组生产的宿主有机体和分离蛋白质的动物来源，可以已经实现这些转化中的一些或全部。
对于重组生产，将编码本发明protegrin的DNA包括在表达系统中，该表达系统将这些编码序列置于合适启动子和与宿主细胞相容的其它控制序列的控制下。可利用的宿主细胞类型包括几乎全部植物界和动物界。因此，本发明的protegrin可以在细菌或酵母(在某种程度上可以以无毒或可折光形式，或利用抗性菌株生产protegrin)中以及动物细胞、昆虫细胞和植物细胞中生产。实际上，修饰的植物细胞可以用来再生含有相关表达系统的植物，使得所得的转基因植物面对这些传染因子能够自我保护。
通过将编码合适信号肽的DNA与编码protegrin的DNA融合，可以以导致从宿主细胞分泌的形式生产本发明的protegrin，或可以在细胞内生产本发明的protegrin。它们也可以作为与另一氨基酸序列的融合蛋白生产，在这些化合物用作抗微生物剂或抗病毒剂之前，该另一氨基酸序列随后可能需要或可能不需要除去。
因此，本发明的protegrin可以以多种形式生产，包括化学合成和重组生产或这些技术的某些组合。
天然产生的protegrin类的任何成员都可以以纯化形式和/或分离形式供应。“纯化和/或分离”是指从肽正常产生的环境中游离的(在这类天然产生的肽情况下)和可以实际使用的形式。因此，“纯化和/或分离”形式是指该肽大致是纯的，即纯度高于90％，优选高于95％，更优选高于99％，或为完全不同的角度，诸如药物制备的角度。
6.2.3.  抗体
本发明protegrin的抗体也可以采用生产多克隆抗血清的标准免疫学技术生产，需要时无限增殖用于单克隆抗体生产源的免疫宿主的抗体产生细胞。生产任一目的物质的抗体的技术是众所周知的。可能必须通过将半抗原与载体偶联以增强该物质的免疫原性，特别是象这里，该物质只是一种短肽。用于此目的合适载体包括在待给予半抗原-载体缀合物的哺乳动物中本身不会产生免疫应答的物质。常用的载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)、白喉毒素、血清白蛋白和轮状病毒的病毒外壳蛋白VP6。用诸如在脱水剂(诸如二环己基碳二亚胺)存在下使该载体与该肽接触，或通过使用接头(诸如可得自Pierce ChemicalCompany，Chicago，IL的那些接头)，实现半抗原与该载体的偶联。
然后将发明免疫原形式的protegrin注射到合适哺乳动物宿主中，监测血清中抗体的效价。然而应该注意，protegrin的某些形式由于它们对抗原加工的抗性，需要在能够产生抗体前进行修饰。例如，含有两个二硫桥的天然形式的PG-1当不与较大载体偶联而给予时，无免疫原性，甚至在有效佐剂存在下并通过戊二醛偶联或与KLH偶联时免疫原性也差。申请人相信，这是由于它对白细胞丝氨酸蛋白酶(人PMN弹性蛋白酶和组织蛋白酶G)的攻击以及对类似几种巨噬细胞组织蛋白酶的天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶)的攻击有抗性。因此缺乏免疫原性可能是加工为线性形式的抗性的结果，其中该线性形式可以适应提呈细胞的抗原提呈袋。通过切割二硫键，可以增强这些形式的protegrin的免疫原性。然而，可以采用Huang，W等，Mol Immunol(1994)15：1191-1199最近报道的MAPS技术，增强该免疫原性。
当效价足够高时，可以收获多克隆抗血清。另一方法是，可以收获该宿主的抗体产生细胞(诸如脾细胞或外周血淋巴细胞)，并将其无限增殖。然后，将无限增殖细胞作为单个集落克隆，筛选所需单克隆抗体的产生。
也可利用重组技术生产抗体，因此，本发明的抗体包括可以用遗传工程技术生产的那些抗体。例如，可以采用标准方法生产单链形式(诸如Fv形式)的抗体、嵌合抗体和模拟特定物种(诸如人)抗体的修饰抗体。因此，通过分离或修饰编码所需抗体的基因并通过在重组宿主细胞(诸如CHO细胞)中表达生产这些抗体，可以制备本发明的抗体。
当然，本发明的抗体可用于测定protegrin的量或其存在的免疫分析。这类分析是含有本发明protegrin的组合物的质量控制生产中的基础。另外，抗体可以用来评价protegrin重组生产的效率以及筛选文库protegrin编码基因存在的表达效率。
6.2.4.  含有protegrin的组合物及其使用方法
本发明的protegrin有效地灭活种类繁多的微生物和病毒靶，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、酵母、原生动物和某种病毒菌株。因为本发明的protegrin具有广谱活性，它们可以用作防腐剂以及在治疗和预防方面使用。
它们是革兰氏阳性细菌的杀菌剂，这些革兰氏阳性细菌包括主要的病原体，诸如金黄色葡萄球菌，包括MRSA(甲氧苯青霉素抗性型)和MSSA(甲氧苯青霉素敏感型菌株)、屎肠球菌和粪肠球菌(包括VREF或万古霉素抗性屎肠球菌)和VSEF或万古霉素敏感型粪肠球菌)。这些是医院背景中非常常见的病原体。为合适靶的其它革兰氏阳性细菌包括李司忒氏菌、肺炎链球菌(包括PRSP，青霉素抗性形式)、轻型链球菌、血链球菌、表皮葡萄球菌(包括甲氧苯青霉素敏感型菌株MSSE)、唾液葡萄球菌、微小棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌G1组和G2组以及枯草杆菌。PRSP也是一种广泛传播的危害健康的病原体。
在protegrin有效抵抗的革兰氏阴性细菌中，有大肠杆菌、铜绿色假单孢菌、肺炎杆菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙酸钙不动细菌、肺炎棒状杆菌和脑膜炎萘瑟氏菌，以及包括在上述属内的其它物种。例如淋病萘瑟氏菌与性传播疾病(STD)有关，沙眼衣原体也是这样。在革兰氏阴性有机体中也有胃病原体幽门螺旋菌、猫螺旋菌和空肠弯曲菌。
除革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌之外，本发明的protegrin也对分支杆菌细菌，诸如结核分支杆菌和食结核分支杆菌(包括MAC)；真菌，诸如白假丝酵母和相关病原体近平滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、热带假丝酵母和变近无毛假丝酵母(Candida glabrata)以及黑曲霉的生长和感染有效。在protegrin有效抵抗的病毒中有I型和II型单纯疱疹病毒和人免疫缺陷性病毒(HIV)。
上述列出的不是详尽的，而是代表性的。
如上所述，protegrin也可以用于消毒组合物中和用作诸如食品、化妆品、药物等材料或其它含有机体营养物材料的防腐剂。protegrin或者以单一的protegrin、与几种其它protegrin的混合物供应，或者与其它抗微生物剂混合供应，供这些方面之用。一般来说，当这些protegrin为该方面的防腐剂时，它们的存在量相对低，低于总组合物的5％(重量)，更优选低于1％，再更优选低于0.1％。
本发明的肽在抗微生物分析和测定测试化合物与内毒素(诸如脂多糖)的结合能力的分析中也可用作标准。
本发明的protegrin可以配制为药物组合物或兽医组合物，用作治疗动物对象的抗微生物剂或抗病毒剂。根据待治疗的对象、给药模式和所需治疗类型--例如预防、治疗，将protegrin配制为与这些参数一致的形式。在Remington的Pharmaceutical Sciences，最新版，Mack出版公司，Easton，PA中可发现这类技术的概述。
protegrin可以用于治疗处理和预防处理动物对象；“治疗”一种感染是指或者预防其发生、减轻症状、抑制微生物在对象中生长和对该对象有益而对微生物不利的其它任何作用。因此，“治疗(treating)”或“处理(treament)”既具有预防方面，也具有治疗方面。
protegrin作为可用于治疗性传播疾病的药物组合物中的活性组分特别有吸引力，这些性传播疾病包括由沙眼衣原体、梅毒密螺旋体、淋病萘瑟氏菌、阴道毛滴虫、2型单纯疱疹病毒和HIV引起的那些疾病。最好是典型的制剂，包括乳膏、软膏、油、粉末、凝胶等。合适的典型赋形剂是本领域众所周知的，本领域技术人员可以为特殊用途修改赋形剂。
概括地说，本发明的protegrin可以单独使用和与其它抗生素联合使用，供STD的治疗和预防之用，这些抗生素诸如红霉素、四环素、大环内酯(例如azithromycin)和头孢菌素。根据给药模式，将protegrin配制为合适的组合物，以允许温和地传递到感染区。protegrin可以以含有一个或两个二硫桥的形式使用，或可以为线性形式。另外，使用含有所有D-氨基酸的对映体形式可以提供的优点诸如，对含有L-氨基酸的protegrin随其抗性较低的那些蛋白酶(诸如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)有抗性。
本发明的protegrin可以单独给药或作为几种protegrin的混合物或与其它药物活性组分联合给药。可以以适于全身性给药或表面给药或局部给药的方式制备制剂。全身性制剂包括设计用于注射(例如肌内注射、静脉注射、腹腔注射或皮下注射)的那些制剂，或可以制备用于经眼给药、经粘膜给药或口服的制剂。该制剂一般包括稀释液，以及在某些情况下包括佐剂、缓冲液、防腐剂等。protegrin可以也在脂质体组合物中或作为微型乳剂给药。
如果口服，那么应该使用合适的肠溶衣，保护本发明的protegrin在消化道中免受降解。可以通过利用D-构型的氨基酸在某种程度上避免降解，因此提供对蛋白酶的抗性。protegrin相对酸稳定，然而仍可能需要某种程度的肠溶衣。
本发明的protegrin保留对通常用于眼部护理产品的硼酸盐溶液中的抗微生物活性。也已经表明，当在硼酸盐缓冲盐水中存在或缺乏溶菌酶的情况下测试对大肠杆菌的抗微生物活性时，溶菌酶的存在增强PG-3的效力。当将PG-3高压灭菌并获得游离酸形式和酰胺的相似方式时，该作用更显著。因此，protegrin可以在这类组合物中用作防腐剂或用作治疗眼部感染(诸如结膜炎和角膜溃疡)的抗微生物剂。
特别重要的是，protegrin在包括相对高的盐和存在血清的生理条件下保留其活性。另外，与protegrin对微生物的毒性相比，它们对于高等生物细胞的细胞毒性非常低。在下面实施例描述的中这些性质使得它们特别适于体内用途和治疗用途。
如实施例将表明的，通过适当地选择本发明protegrin类成员，可以使抗微生物活性适应使它相对于特定靶微生物的效力最大化。本文所用的“微生物”用来不仅包括酵母、细菌和其它单细胞生物，而且包括病毒。例如与PG-1相比，PC-19在某些条件下特别有效。也可以选择具体protegrin，以在具体方面(诸如低盐或生理盐、存在人血清)或条件(模仿在血液和组织液中发现的条件)中具有优势。
本发明的protegrin也可以用于植物和植物的环境中，以防止这些植物中病毒和微生物诱导的疾病。适用于该用途的组合物通常含有一种稀释液以及一种铺展剂或有益于该植物或该环境的其它辅助成份(argeement)。
因此，本发明的protegrin可以用于其中需要抗微生物作用和/或抗病毒作用的任何方面。该用途可以是完全体外使用，或可以将肽给予有机体。
另外，通过给予适于生产本发明protegrin的表达系统，可以原位产生抗微生物活性或抗病毒活性。可以采用已知技术，将这类表达系统供给植物和动物对象。例如在动物中，基于pox的表达载体可以用来原位产生这些肽。同样，可以用表达载体转化植物，然后再生为能够自己生产这些肽的整个植株。
在标准分析中，protegrin也能够使得自革兰氏阴性细菌的内毒素(即脂多糖(LPS))失活。因此，protegrin可以在需要使LPS失活的任何情况下使用。一个这种情况是治疗或减轻革兰氏阴性脓毒症。
6.2.5  与抗微生物活性/抗病毒活性相关的条件
上面已经陈述了，本文所用的“抗微生物”活性是指抑制常规微生物和病毒，尽管偶尔具体指出“抗微生物”和“抗病毒”。
protegrin特别有用的性质是它们在血清存在下的活性。与防御素不同，protegrin能够在血清存在下发挥其抗微生物作用。
可以设计测试抗微生物活性的培养基，以模拟某些具体条件。标准缓冲液培养基A培养基使用具有以下组成的底层琼脂：0.3mg/ml胰胨豆胨粉、1％w/v琼脂糖和10mM磷酸钠缓冲液(最终pH为7.4)。在本文中该培养基命名为“A培养基”或者“标准体外条件”。
其余的所有培养基都含有这些相同组分。然而，另外：
第二种培养基含有100mM NaCl，以便模拟血液和组织液中的盐浓度。在本文中该培养基命名为“B培养基”或“盐培养基”。
第三种培养基添加2.5％正常人血清；然而，它的离子强度低，因此不模拟体液。在本文中该培养基命名为“C培养基”或“含血清培养基”。
第四种培养基含有80％RPMI-1640，一种标准组织培养基，它含有在血液和组织液中发现的主要离子和氨基酸。另外，它含有2.5％正常人血清。在本文中该培养基命名为“D培养基”或“生理培养基”。
在实施例中提供用于测试抗微生物性质的其它培养基。
6.2.6  具体说明
已经发现本发明的某些protegrin特别有效地治疗某些适应症。例如，在治疗传染因子为金黄色葡萄球菌，特别是甲氧苯青霉素抗性菌株的微生物感染时，申请人已经发现具有下式的酰胺特别有效：
RGWRLCYCRPRFCVCVGR           (SEQ ID NO：139)
GWRLCYCRPRFCVCVGR            (SEQ ID NO：141)
XCYCRRRFCVCVGR (X＝Cha)      (SEQ ID NO：164)
WLCYCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：180)也推荐游离酸形式的WLCYCRRRFCVCV(SEQ ID NO：180)。
在治疗假单孢菌细菌感染中，申请人已经发现以下酰胺是有效的：
RGGRLCYCRRRFCVCVGR      (SEQ ID NO：1)
RGGRLCYCRPRFCVCVGR      (SEQ ID NO：239)
RGGGLCYTRPRFTVCVGR      (SEQ ID NO：228)游离酸形式的肽RLCYCRRRFCVCV(SEQ ID NO：66)也是有效的。
最后，在治疗由幽门螺旋菌引起的感染时，申请人已经发现酰胺形式的以下化合物特别有效：   WLCYCRRRFCVCV                  (SEQ ID NO：180)RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)         (SEQ ID NO：178)RGGRLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：1)RGWGLCYCRPRFCVCVGR               (SEQ ID NO：134)RLCYCRPRFCVCVGR                (SEQ ID NO：138)RGWRLCYCRGRFCVCVGR               (SEQ ID NO：136)RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR              (SEQ ID NO：241)RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)      (SEQ ID NO：149)GWRLCYCRPRFCVCVGR               (SEQ ID NO：139)RLCYCRRRFCVCV                  (SEQ ID NO：66)WLCYCXXXFCVCV (X＝Dab)         (SEQ ID NO：29)OWRLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：33)RWOLCYCRPKFCVCV                  (SEQ ID NO：37)RRCYCRRRFCVCVGR                 (SEQ ID NO：82)XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)          (SEQ ID NO：164)游离酸形式和对映(全部为D)形式的肽RRRLCYCRRRFCVCVGR(SEQ ID NO：240)也是有效的。
6.3    有效剂量
本发明的肽或其组合物一般以有效量使用，以达到预期的目的。当然，应该理解，该用量取决于具体应用。
例如，将抗微生物有效量的肽或其组合物用于或加入待消毒或待防腐材料，用作消毒剂或防腐剂。抗微生物有效量是指抑制靶微生物群体生长或对其致死的肽或组合物的量。尽管实际抗微生物有效量取决于具体应用，但一般将相对低量的这些肽或其组合物加入或用于待消毒或待防腐材料，用作消毒剂或防腐剂。该肽通常占该消毒剂溶液或待防腐材料的大约5％(重量)以下，优选低于1％(重量)，更优选低于大约0.1％(重量)。普通技术人员能够确定具体肽用于具体应用的抗微生物有效量，而不用过度地采用例如实施例中提供的体外分析进行实验。
为了用来治疗或抑制微生物感染或相关疾病，给予或应用治疗有效量的本发明的肽和其组合物。治疗有效量是指有效地最大减轻症状或减轻、治疗或预防微生物感染或相关疾病的量。本领域技术人员能够很好地确定治疗有效量，尤其是本文提供的详细说明书进行确定。
同消毒剂或防腐剂的情况一样，对于表面给药以治疗或预防细菌、酵母、真菌或其它感染，可以采用例如实施例中提供的体外分析，确定治疗有效剂量。当该感染可见时或甚至当该感染不可见时，可以应用治疗。普通技术人员能够确定治疗局部感染的治疗有效量，而不用过度的实验。
关于全身性给药，最初可以由体外分析估计治疗有效剂量。例如，一种剂量可以以动物模式配制，以达到循环肽浓度范围，后者包括在细胞培养物中测定的IC50(即对50％细胞培养物致死的测试化合物浓度)、在细胞培养物中测定的MIC(即抑制生长的最低浓度)或在细胞培养物中测定的IC100(即对100％细胞培养物致死的肽浓度)。这种资料可以用来更精确地确定人类中的有用剂量。
初始剂量也可以由体内数据估计，例如动物模式，采用本领域众所周知的技术。在动物数据的基础上，本领域技术人员能够容易地优化对人类的给药。
可以分别调整剂量的量和间隔，以提供足以维持治疗作用的活性肽的血浆浓度。一般病人的注射给药剂量范围为大约0.1-5mg/kg/天，最好为大约0.5-1mg/kg/天。通过每天给予多个剂量，可以达到治疗有效血清浓度。
在局部给药或选择性摄取的情况下，肽的有效局部浓度与血浆浓度无关。本领域技术人员能够优化治疗有效局部剂量，而不用过多的实验。
当然，肽的给药量取决于待治疗对象、对象的体重、痛苦严重性、给药方式和开处方医师的判断。
当可检测出感染时，或甚至当检测不到感染时，可以间断地重复抗微生物治疗。可以单独提供该治疗，或与其它药物(诸如抗生素或其它抗微生物肽)联合提供治疗。
6.4  毒性
本文所述肽的治疗有效剂量最好提供治疗益处，而不引起实际的毒性。
可以用细胞培养物或实验动物中的标准药学方法，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)，确定本文所述肽的毒性。在毒性作用与治疗作用之间的剂量比为治疗指数。最好使用表现出高治疗指数的化合物。由这些细胞培养物分析和动物研究获得的数据可以用于配制用于人类的无毒剂量范围。本文所述肽的剂量最好在循环浓度的范围内，后者包括毒性小或无毒的有效剂量。根据所用的剂量形式和使用的给药途径，可以在该范围内改变该剂量。各个医师根据病人的病情，可以选择实际的制剂、给药途径和剂量。(参见例如Fingl等，1975，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第1章，第1页)。概述
因此，protegrin代表一类特别有用的化合物，因为它们具有以下性质：
1)它们对靶微生物系统具有广谱抗微生物作用，这些靶微生物系统包括病毒(包括逆转录病毒)、细菌、真菌、酵母和原生动物。
2)在生理条件(即生理盐水和存在血清)下其抗微生物活性有效。
3)它们对高等生物细胞的毒性比对微生物的毒性低得多。
4)它们可以以非免疫原形式制备，因此扩大了它们可以给予的物种数。
5)它们可以制备为对某些蛋白酶具有抗性的形式，表明它们甚至在溶菌酶中也是抗微生物剂。
6)它们可以在氨基酸序列中进行修饰，以便优化对靶的特异性。
7)它们可以进行结构修饰，以便适应待表现抗微生物活性的条件。
以下实施例是为了说明本发明，但不限制本发明。实施例1：PG-1、PG-2和PG-3的分离和活性
如上面引用的PCT/US94/08305中所述，从猪白细胞中分离出三种抗微生物肽，它们具有在C-末端酰氨化的以下氨基酸序列：
PG-1：RGGRLCYCRRRFCVCVGR
PG-2：RGGRLCYCRRRFCICV
PG-3：RGGGLCYCRRRFCVCVGR，
测试这些具体protegrin的抗微生物活性。
表明PG-1和PG-3对大肠杆菌ML-35P比对人中性粒细胞肽HNP-1更有效，仅比兔防御素NP-1的效力稍低。PG-1和PG-3对李司忒氏菌EGD菌株和白假丝酵母也有效。一般来说，这些肽在重量基础上，大约与兔防御素NP-1一样有效，比HNP-1更有效。在所有情况下，PG-2对测试的三种生物也有效，但活性不如其它两种肽。
也已经表明，PG-1直接抑制金黄色葡萄球菌和肺炎杆菌270的生长。用作对照的HNP-1对金黄色葡萄球菌的效力较低，对肺炎杆菌几乎完全无效。
也已经对各种其它生物测试了protegrin，protegrin表现出广谱活性。除它们抑制与STD相关的微生物生长或感染的效力外，除以上测试的那些微生物外，protegrin对以下微生物表现出强活性：铜绿色假单孢菌、肺炎杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、荚膜组织胞浆菌、鸟结核分支杆菌胞内变种和结核分支杆菌。protegrin对嗜盐弧菌仅表现出中等活性，对霍乱弧菌和博氏疏螺旋体无活性。
上述三种protegrin在多种反应条件下保留其活性，这些条件包括存在100mM NaCl和存在90％的胎牛血清。
在包括等渗溶液和适用于眼部护理产品的硼酸盐溶液在内的有用生理条件下，protegrin保留多种抗微生物性质。
在100mM NaCl存在下，PG-1和PG-3对白假丝酵母和大肠杆菌分别保留其活性。NP-1或HNP-1都没有该性质。尽管NP-1和NHP-2在90％的胎牛血清中丧失它们抑制白假丝酵母的能力，但PG-3保留抑制作用。
当改变反应条件时，protegrin表现出不同的活性模式。在仅含有10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4和胰胨豆胨的1∶100稀释液两种都在存在或缺乏2.5％正常人血清的情况下)的底层凝胶中，测试合成PG-1对大肠杆菌ML-35(血清敏感型)的活性，2.5％正常人血清低于大肠杆菌该菌株的裂解浓度。在血清存在下，最低杀菌浓度从大约1.0μg/ml降至大约0.1μg/ml。在组织蛋白酶G的线性片段或防御素HNP-1中都观察不到该类型的作用。
同样，使用白假丝酵母作为靶生物，用具有或不具有10％正常人血清的10mM磷酸钠制备底层。最低杀真菌浓度由缺乏血清时的大约1.3μg/ml降至存在血清时的0.14μg/ml。该浓度的血清本身不影响白假丝酵母。使用李司忒氏菌作为靶生物获得相似的结果。
protegrinPG-1和PG-3在pH 2.0下与0.5ug/ml胃蛋白酶一起保温4小时，然后中和。评价对白假丝酵母、大肠杆菌和李司忒氏菌的残留抗微生物活性，发现抗微生物活性完全保留。相似的实验表明，这些化合物甚至当在适于蛋白酶解活性的pH 7.0-8.0下暴露于高浓度的人白细胞弹性蛋白酶或人白细胞组织蛋白酶G时，也不被它们降解。另外，将合成的PG-3酰胺和合成PG-3酸高压灭菌，测试对大肠杆菌、李司忒氏菌和白假丝酵母的抗微生物活性，在所有情况下都保留全部抗微生物活性。通过存在二硫键增强这些化合物对蛋白酶降解和对高压灭菌的稳定性是可能的。
也测试protegrin结合革兰氏阴性细菌大肠杆菌0.55B5菌株的脂多糖(LPS)的能力。
酰胺形式和非酰胺形式的合成和天然的PG-1、PG-2和PG-3都能够在低至2.5μg/0.2ml的浓度下结合LPS。nPG-1和nPG-2在稍低浓度下有效。protegrin实际上比NP或HNP测试化合物更有效，在这些对照中最有效的是NP-3a，其肽的主要序列与protegrin的序列最相似。
通过提高LPS的浓度，可以克服胶凝的抑制，因此与LPS的相互作用是缺乏胶凝的主要原因，而不是干扰胶凝酶级联。
采用还原剂将二硫键转化为巯基，然后通过用碘乙酰胺烷基化进行稳定，将nPG-1和nPG-3转化为线性形式。
在抑制内毒素分析中的胶凝中和在结合内毒素中，protegrin的线性化形式等于环状形式。
测试的线性化形式和环状形式的protegrin都继续表现出抗微生物活性，尽管这些肽作为抗微生物剂的效力取决于靶生物的性质和测试条件。
用或不用100mM NaCl测定浓度范围为20-125μg/ml的环状和线性化PG-1和PG-3对大肠杆菌ML-35P的抗微生物活性。在缓冲液单独存在下线性形式比环状形式的有效性稍强；另一方面，在等渗条件下，环状形式比线性形式的有效性稍强。
对于李司忒氏菌，在缺乏盐的情况下，环状形式和线性化形式的protegrin都表现出强抗微生物活性，两种形式在测试的浓度范围(20-125μg/ml)下大约同等有效。在100mM NaCl中，环状形式保留强抗微生物活性，具有稍大的浓度依赖性。线性化似乎适当地降低活性，尽管高浓度仍能够表现出抗微生物作用。
当在10mM磷酸盐缓冲液单独存在下测试时，在以上浓度范围内，这些protegrin的所有形式都以依赖于剂量的方式对白假丝酵母有效，尽管线性化肽的效力稍低。尽管在100mM NaCl中环化形式保留大约相同水平的抗微生物作用，但线性化形式的活性大大减小，使得在低于100μg/ml protegrin的浓度下，实际上见不到抗微生物作用。在130μg/ml的较高浓度下，观察到中等抗微生物作用。
因此，根据靶微生物和所用的条件，环化和线性化形式的PG-1和PG-3都具有抗微生物活性。
接触透镜溶液通常用硼酸盐缓冲生理盐水配制，此外可以含有或不含有EDTA。测试合成PG-3酰胺和合成PG酸形式的protegrin，其中底层凝胶含有25mM硼酸盐缓冲液pH 7.4、1％(v/v)胰胨豆胨粉(0.3μg/ml TSB粉)和1％琼脂糖。或者包括加入100mM NaCl、1mMEDTA，或者包括加入其组合物。用作对照的其它测试化合物是防御素NP-1和溶菌酶。测定剂量反应曲线。
尽管这些protegrin在25mM硼酸盐缓冲盐水中的活性比在25mM磷酸盐缓冲液中的活性稍低，但通过加入生理盐水增强该抗微生物活性，用1mMEDTA适度地增强该活性。
用白假丝酵母和李司忒氏菌的测试表明，protegrin在通常与适用于眼部护理产品的条件相关的条件下，能够发挥其抗微生物活性。实施例2：cDNA克隆的回收
如上面引用的WO 95/03325中所述，从猪白细胞中制备编码PG-1、PG-2、PG-3和PG-4的cDNA，在公布申请的图7中提出了编码这些protegrin的DNA序列。实施例3：编码PG-1、PG-3和PG-5的基因组DNA的回收
从猪的白细胞中，用QIAGEN血液DNA试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)纯化高分子量的基因组DNA。为了扩增protegrin(PG)基因，采用基因组DNA作为模板进行PCR。
有义引物(5’-GTCGGAATTCATGGAGACCCAGAG(A或G)GCCAG-3’)相当于实施例2的PG cDNA的5’区，提供一个EcoRI限制位点。反义引物(5’-GTCGTCTAGA(C                          或G)GTTTCACAAGAATTTATTT-3’)与PG cDNA的3’端互补，恰好在poly(A)尾的前面，提供一个XbaI限制位点。在含有200ng纯化猪基因组DNA、25pmole每种引物、1μg 10mM dNTP、5μg10×PCR缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2、20mM MgSO4、1％Triton X-100、1％BSA)和2.5单位克隆的PfuDNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)的50μl总体积中进行反应。进行30个循环，每个循环于94℃下变性1分钟、于55℃下引物退火1分钟、于72℃引物延伸2分钟，最后的延伸步骤是于72℃下10分钟。
扩增的PCR产物用EcoRI和XbaI酶解，从琼脂糖凝胶上切下，纯化并连接到已经用EcoRI和XbaI酶解并纯化的pBluescript KS+载体(Stratagene，La Jolla，Ca)中。用双脱氧法，采用测序酶2.0版试剂盒(United States Biochemical，Cleveland，OH)、pBluescript通用引物和基于PG基因组和cDNA序列的特异性寡聚物引物对DNA的双链进行测序。采用PC-Gene程序(Intelligenetics，Palo Alto，CA)进行DNA序列的计算机分析。
通过与同protegrincDNA序列的nt 403-429互补的protegrin特异性寡核苷酸探针杂交，证实大约1.85 kb的PCR产物与protegrin相关。然后将该PCR产物亚克隆到pBluescript载体中，使重组质粒经过DNA纯化和测序。三种不同protegrin的基因序列鉴定为PG-1、PG-3和PG-5。核苷酸序列和得出的氨基酸序列示于图1中。
protegrincDNA和基因的比较揭示，protegrin基因的编码区由被三个内含子中断的四个外显子组成(图2)。第一个外显子含有protegrin前原肽的5’非编码区和前66个氨基酸的密码子，包括一个29个残基的信号肽和前37个cathelin残基。II和III外显子相对小，分别仅有108 bp和72 bp，它们一起含有接下去的60个cathelin残基。最后两个cathelin残基在IV外显子上，随后是protegrin序列。外显子-内含子剪接位点序列示于表1中，与共有标准一致：所有内含子都结束于AG双联体上，前面为8-12个碱基的富含T/C伸长，尽管所有内含子都以GT开始，后面主要接A/GA/GG序列。
                             表1
                 PG-1基因的外显子-内含子结构外显子   大小    5′剪接供体     内含子   大小   3′剪接受体1      ？+198  AAGGCCgtgagtcg      1     405    ttgaccagGACGAG2       108    AACGGGgtgaggct      2     152    ccttCCagCGGGTG3       72     AATGAGgtgagtgg      3     596    ggtcacagGTTCAA4       313
高度保守的cathelin区包括I-IV外显子，而IV外显子含有成熟protegrin肽的全部序列，后接一个酰氨化共有序列、一个3’未翻译区和推定的多腺苷酸化位点。三个内含子的大小为152-596 bp。如果protegrin基因能够反映其它cathelin状基因的特征，那么会发现除高度保守的cathelin区的最后两个残基外，cathelin相关肽的第三个内含子全部与在IV外显子中编码的可变抗微生物肽分离。这样一种布置会适于涉及多样化IV外显子与前三个内含子联合，特化含cathelin前原区的重组机制。
因此，天然产生的protegrin家族至少含有5个成员。图5显示迄今在猪白细胞中发现的5个protegrin的氨基酸序列的比较。在1-3、5-9、13和15-16位置中有完全同源性。
protegrin基因对EMBL/GenBank的同源性检索没有鉴定出显著的同源基因。更具体地讲，protegrin的基因结构和核苷酸序列与防御素非常不同，后者在骨髓防御素基因中含有三个外显子，在肠防御素基因中含有两个外显子。正如所预期的，该检索产生相应于cathelin相关的牛、猪和兔白细胞肽的大家族cDNA。
为了进一步评价protegrin相关基因，我们用32P-标记的protegrincDNA筛选了在EMBL-3 SP6/T7中的大约2.3×105个克隆的猪基因组文库，鉴定出45个杂交克隆。
由Clontech(Palo Alto，CA)购得在EMBL3 SP6/T7噬菌体中的猪肝基因组文库。将大肠杆菌K803菌株用作宿主，将来自噬菌斑的DNA转移到尼龙膜(DuPont，Boston，MA)上。滤膜用32P-标记的猪691 PG-3cDNA杂交。将滤膜洗涤几次，最后于60℃下在0.1×SSC和0.1％SDS中洗涤，附加增感屏于-70℃下用X光片进行曝光。阳性克隆于低密度下再进行两轮空斑纯化。
由杂交克隆纯化的DNA用各种限制性核酸内切酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)酶解，在0.8％琼脂糖凝胶上分级分离，并转移到GeneScreen Plus膜上(DuPont，Boston，MA)。杂交探针用32P标记，探针包括猪PG-3 cDNA和与PG-1、PG-2和PG-3 cDNA的nt 403-429互补的5’标记protegrin特异性寡核苷酸。关于cDNA探针，进行文库筛选的杂交和洗涤条件。关于寡核苷酸探针，于42℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤膜。
通过与protegrincDNA和与protegrincDNA序列的nt 403-429互补的protegrin特异性寡核苷酸杂交，用从阳性克隆纯化的DNA进行Southern印迹分析。尽管所有克隆与全部cDNA探针杂交，但它们中仅有一半与protegrin特异性探针杂交。猪prophenin的特异性寡核苷酸探针-另一种得自猪白细胞的cathelin相关抗微生物肽，与几个非protegrin克隆杂交。这些结果证实a)与cathelin同源的保守原区(proregion)存在于成熟抗微生物肽的同一基因中，不是由转录后事件加上的，以及b)protegrin占猪cathelin相关基因的大约一半。
制备对应于PG-5氨基酸序列的合成肽，测试它对大肠杆菌、李司忒氏菌和白假丝酵母的抗微生物活性。将这些结果与用合成制备的PG-1获得的结果比较。结果示于图3a-3c中。如这些图示结果所示，PG-5对所有三种测试生物的抗微生物活性比得上PG-1。实施例4：对映PG-1的制备
采用标准固相技术，制备具有PG-1氨基酸序列、但其中每个氨基酸都为D形式的protegrin。在缺乏和存在蛋白酶的情况下，而其它条件如用于琼脂糖凝胶中径向扩散分析所述，测试该形式的protegrin对大肠杆菌、李司忒氏菌和白假丝酵母和其它微生物的活性，其它条件一般如Lehrer，R.I.等，JImmunol Meth(1991)137：167-173所述。结果表明，天然PG-1和对映PG-1在缺乏蛋白酶的情况下在抑制大肠杆菌生产方面同样有效。胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶都不抑制对映PG-1的抗微生物活性。在这些蛋白酶解酶的存在下，不利地影响天然PG-1抑制李司忒氏菌生长的能力，尽管在缺乏这些蛋白酶的情况下，PG-1的活性比得上对映PG-1。
采用相似的技术，合成对映形式的PG-2、PG-3、PG-4和PG-5。同样，制备本文提出的具体化合物的对映形式。实施例5：protegrin对STD病原体的活性
正如WO 95/03325中所报道的，测试PG-1对导致与性传播疾病(STD)相关感染的多种生物的活性。PG-1对HIV-1、沙眼衣原体、梅毒密螺旋体、淋病萘瑟氏菌具有高活性，对阴道毛滴虫和2型单纯疱疹具有中等活性。PG-1对1型单纯疱疹似乎无活性，然而另一种protegrin-酰胺形式的RGGLVYVRGRFCVCVGR对1型单纯疱疹病毒有活性。实施例6：抗逆转录病毒的活性
如WO 95/03325中提出的，采用Miles，S.A.等，Blood(1991)78：3200-3208所述方法，合成的和天然的PG-1和天然PG-2对HIV的各种菌株都表现出抗病毒活性。
protegrin对其它逆转录病毒表现出相似活性。实施例7：修饰protegrin的制备：风筝形式和子弹形式
采用常规Fmoc化学合成所有Z都是丙氨酸的风筝形式和子弹形式的PG-1。通过将等重量的二硫苏糖醇(DTT)加入已经以10mg肽/ml溶于含有6摩尔盐酸胍、0.5摩尔Tris缓冲液和2mM EDTA pH 8.05的溶液中的合成肽中，还原该粗合成肽，并于52℃在氮气下保温2小时。使该混合物通过0.45μm的滤器，用1/20(v/v)的冰醋酸酸化，用C-18柱进行常规RP-HPLC纯化。HPLC纯化的还原合成子弹和风筝PG-1通过在加速真空中真空离心进行部分浓缩，在周围空气中，在0.1 M Tris pH 7.7中，在低浓度(0.1mg肽/ml)下，让其于室温下折叠24小时，以使链间二硫键的形成最少。然后将混合物浓缩，用HOAC酸化至5％的最终浓度，然后进行RP-HPLC纯化。
通过AU-PAGE、分析型HPLC和FAB质谱证实成品子弹和风筝PG-1的纯度。AU-PAGE表明，在各种情况下成品都为单一的条带。在两种情况下观察到的MH+质谱值都为2093。实施例8：风筝和子弹形式的抗微生物活性
采用Lehrer，R.I.等，JImmunol Meth(1991)137：167-173中公布的径向扩散分析，测试实施例7中制备的风筝型和子弹型PG-1化合物的抗微生物活性，只是底层琼脂含有10mM磷酸钠缓冲液，最终pH为7.4。如实施例1所述，在底层琼脂中也使用0.3mg/ml胰胨豆胨粉和1％琼脂糖。在某些情况下，将100mM NaCl或RPMI加上2.5％正常人血清(NHS)加入该琼脂中。
在第一组测定中，测试子弹形式和风筝形式的PG-1在这三组条件下对李司忒氏菌、屎肠球菌或金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。
采用标准实验条件，子弹形式和风筝形式对这三种细菌大致同等有效。然而，当将100mMNaCl加入该琼脂中时，风筝形式的活性似乎比子弹形式稍低，在这些条件下，除金黄色葡萄球菌外，子弹形式似乎对所有三种菌株都具有稍强的抗微生物活性。同样，当加入RPMI加2.5％NHS时，子弹形式也比风筝形式更有效。在这些条件下，风筝形式对屎肠球菌的活性明显较低。
也测试这些形式的PG-1对大肠杆菌、肺炎杆菌和铜绿色假单孢菌的活性。在标准条件下，所有三种微生物都被风筝形式和子弹形式抑制。在100mM NaCl和RPMI加NHS下也保持该抗微生物活性。实施例9：蛇形式PG-1的合成
采用Synpep Inc.，Dublin，CA的标准方法，完成所有Z都为丙氨酸的蛇形式PG-1，如所预期的，FAB质谱中的MH+值为2031.3。通过RP-HPLC将蛇形式纯化为均一性。实施例10：蛇型PG-1的抗微生物活性
采用实施例8中提出的关于子弹形式和风筝形式PG-1的同样条件，测试蛇型PG-1对同样六种生物的活性。在这种情况下，将天然的双二硫化形式的PG-1(天然)用作对照。尽管在标准条件下，蛇形式对李司忒氏菌、屎肠球菌和金黄色葡萄球菌表现出的活性稍高，但在100mM NaCl或RPMI加上NHS的存在下，它的效力明显低于天然形式。当实验生物为大肠杆菌、肺炎杆菌和铜绿色假单孢菌时，模式相同。实施例11：具有较高碱性的小protegrin和protegrin的制备
制备一系列protegrin，包括子弹形式和风筝形式，其中X5和X16中的一个或两个与疏水氨基酸相反，为碱性氨基酸，和/或其中X1-X4不存在。总结制备的肽并将其与PG-1的氨基酸序列进行比较，如表2所示。
                  表2
         选择的小protegrin的序列
编码           序列                       质量
PG-1          RGGRLCYCRRRFCVCVGR         2154.04
PC-11             LCYCRRRFCVCVGR         1730.11
PC-12             RCYCRRRFCVCVGR         1773.14
PC-13         RGGRLCYCRRRFCVCV           1943.35
PC-14         RGGRLCYCRRRFCICV           1957.38
PC-15         RGGRLCYCRRRFCVCR           2000.41
PC-16             RCYCRRRFCVCR           1616.96
PC-17             LCYCRRRFCVCV           1516.87
PC-18             LCYARRRFAVCV           1454.77
PC-19             RCYARRRFAVCR           1554.85
PC-20             LAYCRRRFCVAV           1454.77
PC-21             RAYCRRRFCVAR           1554.85
PC-22        RGGRLCY  RR  VCVGR*        1648.97
PC-31a        GGRLCYCRRRFCVCVGR          1999.40
PC-32a        RGRLCYCRRRFCVCVGR          2098.54
PC-33a         GRLCYCRRRFCVCVGR          1942.35
PC-34a          RRLCYCRRRFCVCVGR         2041.49
PC-35a           RLCYCRRRFCVCVGR         1885.30
PC-36a           RRCYCRRRFCVCVGR         1928.33
PC-37a             CYCRRRFCVCVGR         1615.95
PC-44a        RGGRLCYCRRRFCVCR*         2000.41
PC-45         RGGRLCYCRRRFCVC            1843.22
PC-46         RGGRLCYCRRRFCVC*          1844.22
PC-47a        RGGRLCY RRRF VCVGR         1951.33
PC-48         RGWRLCYCRRRFCVCVGR         2284.75表2中的星号(*)表示C-末端游离酸；其它都是C-末端酰胺。
采用上述径向扩散分析，使用对数中期的生物测试protegrin同族(congener)，只是用白假丝酵母的分析使用过夜培养物。如上所述，所有底层琼脂都含有0.3mg/ml胰胨豆胨粉、1％w/v琼脂糖和10mM磷酸钠缓冲液pH 7.4，用4×106细菌或真菌CFU/10ml接种。标准底层琼脂-A培养基如上所述；B培养基相同，只是也含有100mMNaCl；C培养基含有标准培养基加上2.5％正常人血清；而D培养基含有80％RPMI-1640加上2.5％正常人血清。
将试验肽以500μg/gl溶于0.01％乙酸中，在相同溶剂中或者以2倍稀释度或者以半对数稀释度(半对数稀释度为500μg/ml、250、78、25、7.8、2.5、0.78、0.25和0.078μg/ml)，制备系列稀释液。
每天制备足以用于一天实验的量的稀释液；为了进行试验，将5μg体积的溶液加入细菌底层凝胶的预先钻好的孔(直径为3mm)中。3小时后，注入上层凝胶(2×常规trypticase大豆琼脂)。过夜培养后，区带大小测定为非常接近0.1mm。采用sigma作图程序，将澄清单位中的区带(10单位＝1mm直径)对肽浓度的log10作图。X截距相当于最低抗微生物浓度，通过最小均方回归分析进行测定。在计算中仅包括没有表现出澄清的最高肽浓度。
通过最小抗微生物浓度(按μg/ml计)和对分子量更正的相对摩尔效力提供结果。
在最初的实验中，与PG-1比较，测试PC-11和PC-12。结果示于表3和表4中。
                 表3
       最低抗微生物浓度(μg/ml)系列1稀释液
                     10mM磷酸盐缓冲液            10mM缓冲液+100mM NaCl
生物                 protegrin  PC-11  PC-12       protegrin    PC-11    PC-12
                     PG-1                           PG-1大肠杆菌ML-35p           5.3       2.3     3.8           2.8        1.3      1.9李司忒氏菌EGD            5.8       4.8     5.1           3.6        3.7      5.5白假丝酵母820            6.1       7.1     4.3           7.9        11.6     20.5金黄色葡萄球菌930918-3  7.0±0.54  3.7     3.3         4.5±0.26    3.3      3.9MRSA 30371               n.t.      n.t.    n.t.        4.0±0.18    3.2      3.1MRSA 28841               n.t.      n.t.    n.t.        3.1±0.03    2.1      2.6
表4相对摩尔效力(PG＝1.00)
                      10mM磷酸盐缓冲液           缓冲液+100mM NaCl
生物                  PC-11          PC-12       PC-11         PC-12大肠杆菌ML-35p            1.85          1.15         1.73          1.65李司忒氏菌EGD             0.97          0.99         0.78          0.80白假丝酵母820             0.69          0.71         0.55          0.47金黄色葡萄球菌930918-3    1.52          1.75         1.09          0.95MRSA 30371                n.t.          n.t.         1.00          1.06MRSA 28841                n.t.          n.t.         1.19          0.98如表4所示，与PG-1相比，缩短形式的protegrin对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌更有效些，对其余测试的生物同样有效，白假丝酵母除外，其效力为同一数量级。
表5和表6表示实施方案PC-15的最低抗微生物浓度和相对摩尔效力，在此X16为碱性氨基酸。在这些表中所示的PV-13与PG-1相同，只是它缺乏X17和X18。如这些表所示，用碱性氨基酸置换X16一般增强对大多数生物的效力，但改变对加入盐的反应。
                  表5
         最低抗微生物浓度(μg/ml)系列1稀释液               10mM磷酸盐缓冲液                10mM缓冲液+100mM NaCl
生物            PG-1    PC-13     PG-2    PC-15     PG-1    PC-13   PG-2   PC-15大肠杆菌ML-35p      6.1     3.4       4.7     3.7       3.4      2.3    2.9    1.5李司忒氏菌EGD       6.5     4.6       5.2     2.8       4.0      2.7    3.2    2.4白假丝酵母820       5.5     4.0       4.8     2.6       7.5      10.2   10.1   8.8屎肠球菌            10.7    6.6       10.8    4.3       2.6      3.4    4.0    6.2(临床分离物)VREF CDC21          n.t.    n.t.      n.t.    n.t.      3.1      4.6     3.6    5.6(粪肠球菌)VREF 94.132         n.t.    n.t.      n.t.    n.t.      3.0      2.0     2.3    0.8(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌      6.0     6.1       7.5     5.3       4.7      3.4     3.6    5.7930918-3MRSA 30371          n.t.    n.t.      n.t.    n.t.      4.1      3.4     3.6    4.4MRSA 28841          n.t.    n.t.      n.t.     n.t.     3.2      2.6     2.1    2.3
               表6
      相对摩尔效力(PG-1＝1.00)
                     10mM磷酸盐缓冲液          10mM缓冲液+100mM NaCl
生物               PC-13    PG-2    PC-15       PC-13    PG-2    PC-15大肠杆菌ML-35p         1.62     1.18    1.53        1.33     1.06     2.1李司忒氏菌EGD          1.27     1.14    2.15        1.33     1.14     1.55白假丝酵母820          1.24     1.04    1.96        0.66     0.67     0.79屎肠球菌               0.89     0.90    2.31        0.69     0.59     0.39(临床分离物)VREF CDC21             n.t.     n.t.    n.t.        0.61     0.78     0.51(粪肠球菌)VREF 94.132            n.t.     n.t.    n.t.        1.35     1.18     3.48(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌930918-3 0.89     0.75    1.05        1.25     1.19     0.77MRSA 30371             n.t.     n.t.    n.t.        1.09     1.03     0.86MRSA 28841             n.t.     n.t.    n.t.        1.11     1.38     0.85
表7-10表示PC-16和PC-17的结果，PC-16和PC-17都缺乏X1-X4；PC-16在X5和X16位置上也含有碱性氨基酸。表8和表10涉及最低抗微生物浓度，不同处仅在于已经改变稀释方法。在表8和表9中，使用2倍稀释度，而表10-11中，使用半对数稀释度。这些表中的数据表明，与PG-1相比的效力随靶生物和测试条件而变化。如表9所示，例如在盐存在下，PC-17(和PC-16)相比而言比PG-1的活性低得最多；如表11所示，血清的存在也产生问题，尤其是对于PC-16。
                   表7
           最低抗微生物浓度(μg/ml)系列1稀释液              10mM磷酸盐缓冲液       缓冲液+100mM NaCl
生物               PG-1   PC-16   PC-17   PG-1    PC-16   PC-17大肠杆菌ML-35p         4.4     1.1    2.0     3.0     0.9     2.7李司忒氏菌EGD          4.0     1.1    2.2     2.6     4.1     5.0白假丝酵母820          5.2     1.9    5.5     8.0     29.3    32.6屎肠球菌               6.6     3.4    4.8     3.3     3.8     5.7VREF，CDC21            n.t.    n.t.   n.t.    4.1     16.7    6.4(粪肠球菌)VREF，94.132           n.t.    n.t.   n.t.     3.3    1.2     3.7(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌         7.6     3.8    5.2      4.7     27.5* 6.4930918-3MRSA 30371             n.t.    n.t.   n.t.     4.3     12.3* 5.7MRSA 28841             n.t.    n.t.    n.t.    3.1     3.5*  4.0
                  表8
         相对摩尔效力(PG＝1.00)系列1稀释液             10mM磷酸盐缓冲液      缓冲液+100mM NaCl
生物                PC-16      PC-17     PC-16      PC-17大肠杆菌ML-35p          3.00       1.55      2.50       0.78李司忒氏菌EGD           2.73       1.28      0.48       0.37白假丝酵母820           2.05       0.67      0.20       0.17屎肠球菌                1.46       0.97      0.65       0.41VREF，CDC21             n.t.       n.t.      0.18       0.45(粪肠球菌)VREF，94.132            n.t.       n.t.      2.06       0.63(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌930918-3                       0.13*     0.13MRSA 30371              n.t.       n.t.      0.26*     0.26MRSA 28841              n.t.       n.t.      0.66*     0.55
                   表9
         最低抗微生物浓度(μg/ml)系列2稀释液             缓冲液+100mMNaCl           RPMI+2.5％NHS
生物             PG-1    PC-16    PC-17   PG-1    PC-16    PC-17大肠杆菌ML-35p       1.4     0.59*    1.0    0.36    0.49     0.42李司忒氏菌EGD        0.7     1.5       0.7    0.35    0.61     0.42白假丝酵母820        8.6     25.5      10.5   7.1     24.1*   29.8*屎肠球菌             1.2     10.0      0.63   0.42    31.1     0.40VREF，CDC21          1.5     11.3      1.6    0.5     28.4     0.90(粪肠球菌)VREF，94.132         0.67    0.44      0.56   0.37    8.8      0.39(屎肠球菌)铜绿色假单孢菌       1.3     0.41      1.2    0.96    8.8      0.80MR 2330铜绿色假单孢菌       1.4     1.2       1.1    0.81    2.8      0.83SBI-N铜绿色假单孢菌       1.3     0.80      0.60   1.1     8.9      0.88MR 3007铜绿色假单孢菌       1.4     0.85      0.59   0.91    3.9      0.81MR 2133金黄色葡萄球菌       3.3     ＞250     3.9    0.44    0.82*   0.35930918-3MRSA 30371           1.5     ＞250     1.6    0.32    1.0*    0.30MRSA 28841           1.3     7.9*     1.6    0.6     9.5      0.20
                 表10
           相对摩尔效力(PG＝1.00)系列2稀释液             缓冲液+100mMNaCl     RPMI+2.5％NHS
生物                 PC-16     PC-17     PC-16    PC-17大肠杆菌ML-35p           1.78      0.99      0.35     0.60李司忒氏菌EGD            0.35      0.70      0.43     0.59白假丝酵母820            0.25      0.58      0.22     0.17屎肠球菌                 0.09      1.34      0.01     0.74VREF，CDC21              0.10      0.66      0.01     0.39(粪肠球菌)VREF，94.132             1.14      0.84      0.03     0.67(屎肠球菌)铜绿色假单孢菌MR 2330    2.38      0.76      0.08     0.85铜绿色假单孢菌SBI-N      0.88      0.90      0.22     0.69铜绿色假单孢菌MR 3007    1.22      1.53      0.09     0.88铜绿色假单孢菌MR 2133    1.24      1.67      0.18     0.79金黄色葡萄球菌930918-3   ＜0.03    0.60      0.40     0.89MRSA 30371               ＜0.03    0.66      0.24     0.75MRSA 28841               0.12      0.57      0.05     2.11
表11-14表示风筝形式的本发明protegrin的结果。此外，显然有反应的靶生物范围和获得反应的条件范围是可变的。一般来说，较多阳离子的形式PC-19比仅缺乏X1-X4的未修饰形式的效力低。在生理条件下，PC-19大致无活性。
                    表11
           最低抗微生物浓度(μg/ml)系列1稀释液             10mM磷酸盐缓冲液      缓冲液+100mMNaCl
 生物          PG-1    PC-18    PC-19   PG-1    PC-18    PC-19屎肠球菌           7.7     1.7      17.7    4.2     2.9     ＞250VREF，CDC21        n.t.    n.t.     n.t.    4.6     5.3     ＞250(粪肠球菌)VREF 94.132        n.t.    n.t.     n.t.    3.6     1.4     5.6(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌     7.3     3.9      7.3     5.0     2.1     10.4930918-3MRSA 30371         n.t.    n.t.     n.t.    4.1     6.5     68.6MRSA 28841         n.t.    n.t.     n.t.    3.6     3.9     17.4
                    表12
            相对摩尔效力(PG＝1.00)系列1稀释液             10mM磷酸盐缓冲液     缓冲液+100mMNaCl
  生物              PC-18      PC-19    PC-18      PC-19屎肠球菌                3.06       0.31     0.98       0.01VREF，CDC21             n.t.       n.t.     0.59       0.01(粪肠球菌)VREF 94.132             n.t.       n.t.     1.74       0.46(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌930918-3  1.26       0.72     1.61       0.35MRSA 30371              n.t.       n.t.     0.43       0.04MRSA 28841              n.t.       n.t.     0.62       0.15
                  表13
            最低抗微生物浓度(μg/ml)系列2稀释液                10mM缓冲液+100mM NaCl       RPMI+2.5％NHS
   生物              PG-1    PC-18    PC-19    PG-1    PC-18    PC-19屎肠球菌                 1.5     3.2      ＞250            2.9      ＞250VREF，CDC21              1.4     3.4      ＞250            10.0     ＞250(粪肠球菌)VREF 94.132              0.61    0.50     2.9       0.30   1.2      30.2(屎肠球菌)铜绿色假单孢菌           1.3     1.1      3.0       0.7    3.0      29.2MR 2330铜绿色假单孢菌           1.3     1.2      2.1       0.85   4.6      ＞250SBI-N铜绿色假单孢菌           1.3     1.1      1.1       0.72   3.89     ＞250MR 3007铜绿色假单孢菌           1.2     2.4      2.5       0.9    3.9      ＞250MR 2133
             表14
    相对摩尔效力(PG-1＝1.00)系列2稀释液         10mM缓冲液+100mM NaCl    RPMI+2.5％NHS
  生物              PC-18      PC-19     PC-18    PC-19屎肠球菌                0.32       ＜0.01    0.98     0.01VREF，CDC21 (粪肠球菌)  0.28       ＜0.01    0.03     ＜0.01VREF 94.132 (屎肠球菌)  0.81       0.15      0.17     ＜0.01铜绿色假单孢菌MR 2330   0.8        0.31      0.16     0.02铜绿色假单孢菌SBI-N     0.73       0.45      0.12     ＜0.01铜绿色假单孢菌MR 3007   0.80       0.85      0.13     ＜0.01铜绿色假单孢菌MR 2133   0.34       0.35      0.16     ＜0.01
表15和表16提供用风筝形式的本发明protegrin获得的结果。在高盐或血清条件下，较多阳离子的形式一般比PG-1的效力低。然而，它们对大肠杆菌的效力相同。
                     表15
           最低抗微生物浓度(μg/ml)系列1稀释液             10mM磷酸盐缓冲液      缓冲液+100mM NaC1     缓冲液+2.5％NHS
  生物            PG-1   PC-20   PC-21   PG-1   PC-20   PC-21   PG-1   PC-20   PC-21大肠杆菌ML-35p        4.6    0.75    0.36    2.0    1.9     1.8      0.34   0.27    0.28李司忒氏菌EGD         4.8    3.3     1.4     3.4    21.7    36.3     1.3    5.5     5.6白假丝酵母820         6.1    5.3     8.5     6.8    67.5    ＞250    8.1    30.1     59.7屎肠球菌              6.7    6.7     18.0    3.9    69.0    ＞250VREF，CDC21           n.t.   n.t.    n.t.    4.9    ＞250   ＞250(粪肠球菌)VREF 94.132           n.t.   n.t.    n.t.    2.5    3.3     28.3(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌       10.3    5.8     7.2     5.1    30.3    64.6*930918-3MRSA 30371           n.t.    n.t.    n.t.    4.2    29.9    64.6*MRSA 28841           n.t.    n.t.    n.t.    3.3    8.4     8.4
                   表16
            相对摩尔效力(PG-1＝1.00)系列1稀释液              10mM磷酸盐缓冲液     缓冲液+100mM    缓冲液+2.5％
                                               NaCl             NHS生物                   PC-20   PC-21    PC-20    PC-21    PC-20   PC-21大肠杆菌ML-35p            4.14    9.21     0.71     0.8      4.50    0.88李司忒氏菌EGD             0.98    2.47     0.09     0.07     0.16    0.17白假丝酵母820             0.78    0.52     0.07     ＜0.02   0.18    0.10屎肠球菌                  0.68    0.27     0.03     0.01VREF，CDC21               n.t.    n.t.     0.01     0.01(粪肠球菌)VREF 94.132               n.t.    n.t.     0.20     0.06(屎肠球菌)金黄色葡萄球菌930918-3    1.20    1.03     0.11     ＜0.06MRSA 30371                n.t.    n.t.     0.09     ＜0.05MRSA 28841                n.t.    n.t.     0.26     0.28实施例12：PG-1对淋病萘瑟氏菌活性所需的最小生物活性构型
采用Lehrer等，1991，J Immunol Methods 137：167的径向扩散分析，测定淋病萘瑟氏菌对protegrinPG-1的变异体的敏感性。用Kokryakov，V.N.等，(FEBS Lett(1993)327：231-236)的方法纯化猪白细胞的天然protegrinPG-1。用F-moc化学合成制备所有其它protegrin，通过反相HPLC进行纯化。
测试以下淋病萘瑟氏菌菌株：FA19(sac-1，sac-3；血清抗性[SacR])、JS-1(血清抗性；sac-1，sac-3；[SacR])和F62(sac-1+，sac-3；血清敏感型[Sacs])，这些菌株已经由Cannon等(Infect Immun(1981)32：547-552)和Judd，R.C.(Infect Immun(1982)37：632-641)进行了描述。菌株FA628(sac-1+，sac-3)和FA899(sac-1，sac-3+)为FA19的Sacs转化体(Shafer，W.M.等，Infect Immun(1982)35：764-769)。菌株FA5101和WS1为菌株FA19的pycin抗性突变体，它产生缩短的LOS(Lucas，C.E.等，Molec Microbiol(1995)16：1001-1009)。将细菌在NGTM培养基上划线，在5％CO2/室内空气中于37℃培养过夜，并且每天传代。将这些平板的细菌置于25ml GC肉汤中，于37℃震荡培养3小时，获得对数中期淋病萘瑟氏菌。
按先前Qu，X.D.等的径向扩散分析所述方法，制备底层和上层凝胶。将肽溶于0.01％乙酸中，并在0.01％乙酸中进行系列稀释，测试5ml的等份。这些平板在注入上层凝胶之前，在CO2培养箱中于37℃培养3小时，以允许肽扩散到底层。在过夜培养后，由Qu等所述曲线的X截距确定最低抑制浓度。每个菌株都表现出protegrin敏感性(表17-19)。
                表17
         对淋病萘瑟氏菌的活性
                         氨基酸               最低抑制浓度
                                                (μg/ml)protegrin        序列           n       F62        JS-1         FA19PG-1     RGGRLCYCRRRFCVCVGR    18    1.3±0.1    1.2±0.1     1.9±0.1PC-13    RGGRLCYCRRRFCVCV--    16    0.6±0.2    1.4±0.04    2.3±0.8PC-11    ----LCYCRRRFCVCVGR    14    1.0±0.1    1.6±0.3     2.8±0.1PC-17    ----LCYCRRRFCVCV--    12    0.6±0.1    1.3±0.2     1.7±0.1PC-37    -----CYCRRRFCVCVGR    13    4.2±1.1    1.8±0.2     10.7±0.5PC-45    RGGRLCYCRRRFCVC---    15    1.1±0.3    2.9±0.03    7.6±2.1PC-71    -----CYCRRRFCVCV--    11    4.5±0.8    4.7±1.0     16.1±0.9PC-72    ----LCYCRRRFCVC---    11    2.7±0.2    2.3±0.8     12.8±0.0PC-73    -----CYCRRRFCVC---    10    29.8±1.5   48.3±22.5   104.4±7.4PC-8    RGGRLAYARRRFAVAVGR     18    21.4±5.8   46.0±7.0    431±13PC-9    RGGRLAYCRRRFCVAVGR     18    1.0±0.3    1.1±0.2     7.3±2.3PC-10   RGGRLCYARRRFAVCVGR     18    0.7±0.1    0.8±0.1     1.6±0.0PC-18   ----LCYARRRFAVCV--     12    0.7±0.1    2.1±0.4     8.3±2.0PC-64   ----LCYTRRRFTVCV--     12    0.7±0.1    1.4±0.2     4.5±0.3PC-20   ----LAYCRRRFCVAV--     12    1.1±0.2    8.5±2.5     32.4±5.7PC-64a  ----LTYCRRRFCVTV--     12    0.7±0.1    0.7±0.1     2.1±0.1
表中的所有肽都是C-末端酰胺。
protegrinPC-13、PC-11和PC17证明，氨基酸残基X1-X4和X17-X18可以从PG-1中缺失，而不损失抑制活性(表17)。
测定PG-1的两个分子内二硫键对淋病萘瑟氏菌抑制的影响。消除两个二硫键(protegrinPC-8)减低对所有测试菌株的抑制作用(表17)。相反，缺乏cys8:cys13二硫键的protegrinPC-10提高对F62、JS-1和FA19菌株的活性。缺乏cys6:cys15二硫键的PG-1变异体(PC-9)保留对F62和JS-1菌株的全部活性，对FA19菌种表现出的活性降低3.8倍。具有单个二硫键的PG-1缩短的12-mer变异体也表现出有效抑制活性(参见表18中的protegrinPC-18、PC-64、PC-20和PC-64a)。
也测定protegrin变异体对由血清抗性FA19菌株衍生的两个血清敏感型菌株FA828(sac-1+)和FA899(sac-3+)的抑制活性。PG-1对野生型血清抗性FA19菌株和血清敏感型衍生菌株FA628和FA899(表18)表现出相似的活性。血清敏感型菌株对PC-8比血清抗性菌株敏感2-4倍。具有一个二硫键的变异体PC-9和PC-10保留强抑制活性。
                   表18
   protegrin对血清敏感型淋病萘瑟氏菌菌株的作用
         氨基酸                最低抑制浓度    (μg/ml)protegrin      n         FA19         FA628          FA899PG-1          18       2.1±0.1      1.6±0.1       1.6±0.1PC-8          18       420.8±24.2   150.9±14.0    263.5±10.3PC-9          18       11.2±1.8     4.0±0.1       3.9±0.2PC-10         18       1.7±0.1      1.2±0.1       1.3±0.1
因为LOS缩短提高淋病萘瑟氏菌对人PMN抗微生物肽的敏感性(Shafer，W.M.等，1986，J Infect Dis 86：910-917)，因此测试protegrinPG-1、PC-8、PC-9和PC-10对LOS变异体FA5101、WS-1和野生型菌株FA19和活性(表19)。LOS缩短导致提高淋病萘瑟氏菌对线性化protegrinPC-8的敏感性，但对PG-1或PG-10敏感性的作用小。
                  表19
      protegrin对淋病萘瑟氏菌LOS变异体的作用
       氨基酸               最低抑制浓度    (μg/ml)protegrin    n       FA19           FA5101         WS1PG-1        18     2.1±0.1      1.5±0.2        1.4±0.2PC-8        18     420.8±24.2   23.1±9.3       29.7±12.8PC-9        18     11.2±-1.8    2.7±0.4        2.6±0.7PC-10       18     1.7±0.1      1.2±0.1        1.1±0.1实施例13：用protegrin处理的淋病萘瑟氏菌的电子显微镜检查
测定用50μg/ml PG-1或缩短的衍生物PC-17处理淋病萘瑟氏菌的作用。用PG-1处理60分钟后细菌的透射电子显微镜检查揭示，中心形成空泡和联合膜的电子致密结构。用PC-1或PC-17处理的细菌的扫描电子显微镜检查揭示出直径大约为100nm的表面损伤。实施例14：唾液对抗微生物活性的影响
采用Lehrer等，1991，J.Immunol.Meth.137：167的径向扩散分析，只是底层琼脂中的培养基含有10mM pH 6.5磷酸盐缓冲液、100mM NaCl、1％TSB、1％琼脂。上层培养基含有10mM磷酸盐缓冲液pH 6.5、100mM NaCl、2×TSB、1％琼脂。由在0.01％乙酸(AA)中构成的10×原液稀释这些肽，原液或者具有10mM乙酸盐缓冲液pH5或者具有唾液。
按产生可检测透明区带或MCZ所需的最低浓度给出结果，MCZ即为当肽浓度对该区带直径作图时外推至X轴的值。结果示于表20中。
                   表20
      稀释剂对MCZ(μg/ml)对大肠杆菌004的影响序列                           乙酸盐       唾液
                          缓冲液RGGRLCYCRRRFCVCVGR             0.48          1.14RGGGLCYARGWIAFCVGR             4.16          38.30RGGGLCYKRGWIKFCVGR             2.71          0.56RGWGLCYCRPRFCVCVGR             0.39          12.60RGGRLCYCRRRFCVCVGR*           0.59          1.45
LCYCRRRFCVCF               4.14          6.11RLCYCRPRFCVCV               3.36          6.83
LCYCRGRFCVCVGR             2.37          5.68RLCYCRPRFCVCVGR               1.60          6.86RWRLCYCRPRFCVCV               1.04          39.00RGWRACYCRPRFCACVGR             0.71          1.84GWRLCYCRPRFCVCVGR             0.86          47.50RLCACRGRACVCV               13.70         9.76WLCYCRRRFCVCV*             5.05          36.00RLCYCRXRFCVCV (X＝MeGly)    2.43          2.54RLCYCRPRFCVCVGR*           3.65          12.80RGGGLCYCRPRFCVCVGR*           3.51          11.90
                            表20
         稀释剂对MCZ(μg/ml)对大肠杆菌004的影响序列               乙酸盐     唾液
               缓冲液RRCYCRRRFCVCVGR    3.02       8.07用*注释的肽为酸形式；其它都为酰胺形式。
在唾液存在下，大量的测试肽表现出相同活性，或甚至提高活性。实施例15：其它protegrin的抗微生物活性
以下实施例提供测定抗微生物活性的分析，用来测试下文所述的本发明其它肽。在以下分析中使用以下试剂、原液和培养物。
微生物：分别由Robert Lehrer博士(UCLA，也参见Lehrer等，1988，J.Immunol.Methods 108：153)和Gray Schoolnik博士(Stanford)处获得大肠杆菌ML-35p和万古霉素抗性屎肠球菌(VRE)。铜绿色假单孢菌(ATCC 9027)、白假丝酵母(ATCC 1023)和甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(ATCC 33591)得自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD。
来自其它来源的微生物(诸如临床分离物)可以与本文所述分析中的上述微生物互换使用。
培养基和试剂：
Trypticase大豆琼脂(TSA；Becton-Dickinson，Cockeysville，MD，BBL#4311768)：将40g溶于1升去离子水中，于121℃高压灭菌20分钟。
胰胨豆胨(TSB；Becton-Dickinson，Cockeysville，MD，BBL#4311768)：将30g溶于1升去离子水中，于121℃高压灭菌20分钟，于室温下贮存。
2×胰胨豆胨(2×TSB)：将60g溶于1升去离子水中，于121℃高压灭菌20分钟，于室温下贮存。
甘油(20％v/v)：将20ml甘油与80ml去离子水混合，用0.20μ滤器过滤灭菌，并于室温下贮存。
一碱价磷酸盐缓冲液(100mM)：将13.7g磷酸二氢钠(Fisher#S368-500)溶于1升去离子水中。用0.20μ滤器过滤灭菌，并于室温下贮存。
二碱价磷酸盐缓冲液(100mM)：将14.2g磷酸氢二钠(Fisher#S374-500)溶于1升去离子水中。用0.45μ滤器过滤灭菌，并于室温下贮存。
磷酸盐缓冲盐水(PBS；10mM磷酸盐，100mM NaCl，pH 7.4)：将15ml二碱价磷酸盐缓冲液(100mM)、5ml一碱价磷酸盐缓冲液(100mM)、4ml NaCl(5M)和176ml去离子水混合。必要时调节pH，用0.45μ滤器过滤灭菌，并于室温下贮存。
磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)：将40ml二碱价磷酸盐缓冲液(100mM)与160ml一碱价磷酸盐缓冲液(100mM)混合。必要时调节pH，用0.45μ滤器过滤灭菌，并于室温下贮存。
液体测试培养基(LTM)：无菌混合以下无菌组分：10ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)、1.0ml TSB、2ml NaCl(5M)和87ml去离子水。于室温下贮存。
乙酸(0.01％v/v)：将10μl乙酸与100ml无菌去离子水混合。
琼脂糖：将1g琼脂糖(Sigma#S6013)混入80ml去离子水中，于121℃高压灭菌20分钟。
琼脂糖底层培养基：将10ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)、1.0ml TSB、2ml NaCl(5M)和7ml去离子水与80ml软化(50℃)琼脂糖混合。
2×TBS琼脂糖上层培养基：将60g TBS和10g琼脂糖溶于1升去离子水中，每瓶100ml等份，于121℃高压灭菌20分钟，于室温下贮存。
微生物斜面的制备：将每种菌株培养在TSA上。采用一次性无菌接种环将分离的菌落转移到TSB(无菌50ml锥形瓶中10ml)中，该锥形瓶于37℃(细菌)或30℃(酵母)震荡(200 RPM)培养16-18小时。
肉汤培养物用20％无菌甘油按1∶1稀释，按1.0ml等份于-80℃贮存。关于每天的接种物，用无菌接种环将液体由解冻的小瓶转移，然后涂布在TSA斜面表面上。将螺旋盖试管培养过夜，于4℃贮存多至1个月。
接种物的制备：
1.除去试管的盖子，使无菌接种环轻轻接触TSA斜面上密集生长区。
2.接种10ml TSB(50ml烧瓶)，该烧瓶以200 RPM在震荡的37℃(细菌)或30℃(酵母)水浴中培养18小时(过夜)。
3.在比色杯中，用TSB以1∶20稀释50μl过夜培养物，采用TSB作为参比，在600nm(A600)下测定吸收。稀释培养物的A600应该为0.1-0.4。
4.在250ml锥形瓶中，用TSB以1∶1000(细菌)或1∶100(酵母)稀释50μl过夜培养物。
5.该锥瓶在以200 RPM震荡的37℃(细菌)或30℃(酵母)水浴中培养大约2-3小时，直至到达对数期，即直至该培养物的A600为0.200-0.400，而不用进一步稀释。
6.将25ml对数期培养物转移至无菌离心管中，于4℃以2000rpm离心10分钟。倾去上清液，加入25ml无菌PBS，通过涡旋混合再悬浮沉淀。
7.悬浮液于4℃下以2000rpm离心10分钟。倾去上清液，用5ml无菌PBS再悬浮沉淀。
8.测定未稀释悬浮液的A600。如果吸收高于0.5，那么用无菌PBS稀释，直至吸收为0.100-0.500。
9.通过在盐水(0.87％)中制备10倍系列稀释液，并将100μl104、105和106倍稀释液涂布在TSA平板上，每个平板一种稀释液，测定每毫升悬浮液的菌落形成单位数(CFU/ml)。培养过夜，对菌落计数，并测定CFU/ml(精确的测定需要每个平板大约30-300个菌落)。
关于报道的菌株，测定了A600＝0.2的悬浮液的CFU/ml，报道在下表中：
悬浮液的CFU/ml(A600＝0.2)菌株                     CFU/ml大肠杆菌                8.0×107铜绿色假单孢菌          7.8×107MRSA                    2.0×107VRE                     3.8×107白假丝酵母              9.7×105
肽原液的制备：
1.称量大约1.0mg的每种待测试肽，加入无菌聚丙烯冷冻小瓶(1.8ml)中。
2.加入足够的乙酸(0.01％)，制备浓度为1280μg/ml的原液。将原液分配到几个小瓶中，每个小瓶100μl，将这些等份于-80℃密闭贮存。
6.5  径向扩散(MCZ)分析
MCZ分析使用最小量的测试材料，测定微生物对抗微生物化合物的敏感性。细胞生长至大约对数中期，再悬浮于基本营养物缓冲的琼脂糖中。该凝胶中采用琼脂糖(非琼脂)，以避免抗微生物肽和标准琼脂中的多阳离子组分之间的静电作用。肽径向扩散到小孔的凝胶，生长抑制区带的直径与溶液中肽的浓度成正比(Lehrer等，1988，J.Immunol.Methods 108：153；Lehrer等，1991，J.Immunol.Methods 137：167)。
MCZ分析平板的制备：
1.对于每个待注入的陪替氏平板，将10ml软化(50℃)琼脂糖底层培养基分配到一个无菌聚丙烯管(15ml)中。每管加入4×106CFU的所需菌株。通过将试管倒置3次均匀混合。将融合琼脂糖立刻注入陪替氏培养皿中。
2.当琼脂糖固化后，使用无菌插管(内径为3mm)，在琼脂糖中钻16个孔(4×4均匀间隔的格子)。用巴斯德吸管除去填料，在侧臂端口连接真空的烧瓶中捕获琼脂糖。
3.由该肽原液，用乙酸(0.01％)作为稀释剂，制备系列2倍稀释液(从128μg/ml至0.06μg/ml)，对于低于50μg/ml的肽浓度，使用含有人血清白蛋白(HSA；0.1％v/v)的醋酸钠(10mM，pH 5)作为稀释剂。
4.将5μl每种稀释液分配到琼脂糖孔中，每孔一种系列稀释液。
5.将稀释剂分配到孔中作为阴性对照，将protegrin-1(美国专利5,464,823；32μg/ml、8μg/ml和2μg/ml)分配到孔中作为阳性对照。
6.平板于37℃(细菌)或30℃(酵母)培养3小时。
7.将2×TSB琼脂糖上层培养基(10ml)分配到每个平板表面上，让该琼脂固化，平板于37℃(细菌)或30℃(酵母)倒置培养16-18小时。
8.检查平板，测定(按mm计)生长抑制区带(每孔周围的透明区)的直径。
9.将生长抑制区带的直径(Y轴)对该孔中肽浓度(X轴)作图，采用线性回归分析获得最适线。该最适线的X截距为每个肽浓度生长抑制区带(MCZ)的最低浓度。
6.6微肉汤稀释(MCB)分析
微肉汤稀释法适应大量样品，比MCZ分析更适用于自动化，数据分析是直接而简单的。该分析中的关键步骤是在最小干扰肽生物学活性的特定基本营养缓冲液系统中，将微生物和肽混合。另外，在肽稀释剂中存在0.1％(w/v)人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)，使该容器中肽的吸收最小化。
MCB分析平板的制备：
1.无菌96孔微量滴定板的每个孔分配100μl LTM中的对数期细胞(MCB-5为4×105CFU/ml；MCB-3为4×103CFU/ml)。
2.由该肽原液，用乙酸(0.01％)作为稀释剂，制备系列2倍稀释液(从1280μg/ml至0.625μg/ml)，或对于低于50μg/ml的肽浓度，使用含有HSA或BSA(0.1％w/v)的醋酸钠(10mM，pH 5)作为稀释剂。
3.将三份每种系列2倍稀释液的等份(11μl)分配到微量滴定板的孔中。
4.该平板于37℃(细菌)或30℃(酵母)培养3小时。
5.将100μl 2×TSB加入每孔中，混合，于37℃(细菌)或30℃(酵母)再培养16-18小时。
6.检查平板，评价每孔的浊度(细胞生长)。MRSA通常沉淀出，在孔底形成沉淀。可以通过将微量滴定板置于架子上，用斜镜检查孔底，评价MRSA。
7.在肉汤培养基(MCB)中抑制生长的最低浓度定义为抑制所有可见生长的肽最低浓度。如果三份样品中每份的MCB值不同，通过将三个样品的结果平均，获得MCB。
8.通过在TSA平板上将每孔的50μl等份于37℃(细菌)或30#℃(酵母)培养24小时(对于倒平板，24孔板每孔中的1.5ml TSA使交叉污染最小化)，测定表现出至少99.9％杀生物活性(由起始接种物至少降低103)的最低浓度。
6.7  修改的NCCLS最低抑制浓度(MIC)分析
国际临床标准委员会(NCCLS)要求在Mueller-Hinton肉汤(“MHB”)中，以512μg/ml制备作为原液的测试化合物。将原液在培养基中进行系列稀释(2倍)，将每种系列稀释液以1∶1加入含有1×106CFU/ml细菌的培养基中(National Committee in Clinical LaboratoryStandards，1994年12月，“抗微生物敏感性测试的性能标准”，NCCLSDocument M100-S5第14卷，第16期；Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Test for Bacteria that Grow Aerobically，第3版，核准标准M7-M3，国际临床标准委员会，Villanova，PA)。
已经发现，本发明肽在高于128μg/ml的浓度下在MHB中沉淀。因此，按照NCCLS的操作步骤导致系列2倍稀释液含有的肽低于计算值，错误地产生高MIC值。
为了克服该问题，以下修改的NCCLS分析是测定本发明肽的MIC的推荐方法。在该方法中，通过在适用于肽并且对微生物不表现有害作用的缓冲液(0.01％v/v乙酸，0.1％w/v HSA)中制备浓缩的(10×)测试肽原液，并且将该原液以1∶10稀释到含有微生物的MHB中，避免沉淀。
MIC分析平板的制备：
1.在Meuller-Hinton肉汤(MHB；Becton-Dickinson，Cockysville，MD，BB2#11443)中制备新鲜的测试生物的过夜培养物。
2.用新鲜的MHB将该培养物稀释为大约4×105 CFU/ml，将100μl等份分配到无菌96孔微量滴定板中的每个孔中。
3.由该肽原液，用乙酸(0.01％)作为稀释剂，制备系列2倍稀释液(从1280μg/ml至0.625μg/ml)，或对于低于50μg/ml的肽浓度，使用含有人血清白蛋白(HSA；0.1％w/v)的醋酸钠(10mM，pH 5)作为稀释剂。
4.将三份每种系列2倍稀释液的等份(11μl)分配到微量滴定板的孔中。
5.该平板于37℃(细菌)或30℃(酵母)培养3小时，不用通气。
6.检查平板，评价每孔的浊度(细胞生长)。MRSA通常沉淀出来，在孔底形成沉淀。可以通过将微量滴定板置于架子上，并用斜镜检查孔底，评价MRSA。
7.最低抑制浓度(MIC)定义为抑制所有可见生长的最低肽浓度。如果三份样品中每份的MIC值不同，通过将三个样品的结果平均，获得MIC。
8.通过将每孔的50μl等份在TSA平板上于37℃(细菌)或30℃(酵母)培养24小时，测定表现出100％杀生物活性的最低浓度(对于倒平板，24孔板每孔中的1.5ml TSA使交叉污染最小化)。
6.8  杀菌动力学分析
采用以下分析测定肽杀死靶微生物的速率，以及确定一种肽是否为杀菌剂还是抑制细菌剂。
分析
1.96孔微量滴定板的每孔分配200μl LTM中的对数期细胞(4×105 CFU/ml)。
2.当时间T＝0分钟时，将22μl 1280μg/ml的肽加入Al孔中，通过研制3次进行混合。
3.等30秒，将22μl第二浓度的肽加入下一个孔(A2)中，通过研制3次进行混合。
4.重复该方法，每次肽的加入错开30秒，直至已经加入所有浓度的肽。通常为原液肽的4倍系列稀释液(即每孔加入以1∶10稀释的1280μg/ml、80μg/ml、20μg/ml和5μg/ml肽)产生好的比较杀死曲线。将0.22μl 0.01％乙酸加入一个孔中作为对照。
5.当时间T＝15分钟时，通过研制3次均匀混合Al，将20μl转移至空的无菌陪替氏培养皿(100mm×15mm)中。
6.迅速加入20ml软化(50℃)TSA，并且轻轻旋转平板进行混合。
7.重复步骤5-6.，直至所有的肽浓度都已经倒平板。
8.对于对照孔，用LTM以1∶100稀释样品，将50μl稀释液倒平板，获得精确测定的CFU。
9.当该琼脂固化后，倒置平板，于37℃(细菌)或30℃(酵母)培养18-24小时。
10.在时间T＝30分钟、60分钟、120分钟和240分钟时，对所有肽浓度和对照样品重复步骤5-9。
11.对每个平板的CFU计数，估计每个肽浓度CFU的降低。为了评价采用该分析的效果，该肽的CFU必须降低至少一个数量级(即每个平板至少800 CFU)。尽管这类数字高于建议的精确度(30-300CFU/平板)，但可回收CFU的对数级的变化显示出显著的杀菌效力。
12.为了获得相当的杀死曲线，将分级存活率的log对肽浓度作图。
表21表示采用上述MCB-3分析(即103 CFU)的多种本发明肽对各种靶生物的抗微生物活性。以“肉汤中最低生长抑制浓度”(MCB)给出结果，MCB为导致无可见浊度的最低浓度。TSA上的“最低杀菌浓度”(MBC)与MCB相同。浓度单位为μg/ml。如表21所示，可以在肽链中进行各种置换，以便精细地调节抗微生物活性的范围。C-末端的星号表示，该肽以游离酸形式供给；否则在该分析使用酰胺。
                   表21
        在MCB-3中抗微生物肽的评价(μg/ml)
          序列                 MRSA     Psa     VREF  假丝酵母  大肠杆菌RGGRLCYCRRRFCVCVGR*             1.5      0.11          1.2       0.6RGGGLCYCRRRFCVCVGR*                                    3.29      0.4RGGGLCYCRRGFCVCFGR               1.93     0.14          1.62RGGGLCYCRRPFCVCVGR               3.1      0.06          7.69      0.15RGGLCYCRPRFCVCVGR*                                     17.7      3.51RGGRLCYCRXRFCVCVGR* (X＝MeGly)  5.33       2       1RGGRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)     4       1.67    0.83RGGLCYCRGRFCVCVGR               10.6     0.83RGGRLCYCXGRFCVCVGR (X＝Cit)XGGRLCYCRGRFCVCVGR (X＝Cit)RGGRVCYCRGRFCVCVGR               8         1RGGRVCYCRGRFCVCVGR*RGGGLCYCFPKFCVCVGR              3.48      1.2           15.96RCWGLCYCRPRFCVCVGR              1.55      0.27    0.09  5.68     0.1RGWRLCYCRXRFCVCVGR* (X＝MeGly) 26.7      10.6RGWRLCYCRGRFCVCVGR              5.3       0.5RGWRLCYCXPRFCVCVGR (X＝Cit)RWRLCYCRPRFCVCVGR              4.7       3.3           1.7RGWRLCYCRPRFCVCVGR              4.7       5.3           6.1RGWRACYCRPRFCACVGR              4.7       1.3     2     4.7     0.34GWRLCYCRPRFCVCVGR              4.7       4             2.7     0.86RWRLCYCKGKFCVCVGRRGWRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)GGWRLCYCRGRFCVCVGR                 16       9.3RGGWLCYCRGRFCVCVGR                32       5.3RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)      4       3.3RLLRACYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)     10.6     3RLLRLCYCRRRFCVCVGRRGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)       6.7      2.3RGGRLCYCRXRZCVCWGR (X＝MeGly)
                 (Z＝Cha)RGGRWCVCRXRZCYCVGR (X＝MeGly)
                 (Z＝Cha)RGLRXCYCRGRFCVCVGR* (X＝Cha)   16       8RGGRWCVCRGRXCYCVGR (X＝Cha)RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)
  LCYCRRRFCVCV                16        4      4       5.9     1.9
  LCYCRRRFCVCV*              32        8
  LCYCRPCFCVCV                64        5.3    3.33    ＞64
  LCYCRRRFCVCF                4         2      2                3
  LCACRRRACVCV                ＞64      13.3
  LCYCRXRFCVCV (X＝D-Arg)     4         2      1.32    5.72    1.18
  LCWCRRRFCVCV                5.3       2       4      8.91    0.76
  WCYCRRRFCVCV                5.3       2.7     2      4.7     2.3
  LCYCRRRXCVCV (X＝hPhe)      8(64)     6.7     2.7
  LCYCRRRXCVCV (X＝Phe(4-Cl)) 4         2       1.3
  XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)       2.67      2.67    1.33
  LCYCRRRFCXCV (X＝D-His)    ＞64       10.7            ＞64
  LCYCRRRXCVCV (X＝MeGly)    ＞64       13.3    42.7
  LCYCRRRXCVCV (X＝MePhe)
  LCYCRRRFCXCV (X＝MeVal)序列                         MRSA     Psa     VREF     假丝酵母    大肠杆菌
LCXCRRRXCVCV (X＝Cha)    18.7      16      8        3.98        0.37
LCGCRRRGCVCV             ＞32          ＞16              ＞128
LCACRGRACVCV             ＞32      6.7     21.3RLCYCRRRFCVCV             8         4RACYCRPRFCACV             ＞64      2.7RLCYCRPRFCVCFRLCYCRPRFCVCV             5.3       2.7     2KLCYCKPKFCVCV             16        2       2.67                 2.07RLCACRGRACVCV             ＞32      2.7     10.7      9.51       3.93RLCYCRXRFCVCV (X＝MeGly)  5.3       2       2         6          2.54RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)    2.67      2.67    0.83RWCFCRPRFCVCV             3.3       2       2         5.2        2.2WLCYCRRRFCVCV             5.3       1.3WLCFCRRRFCVCVFLCFCRRRFCVCVWLCFCRRRXCVCV (X＝MePhe)WLCYCRRRFCVCV*           8         4       2         7.14       0.99RLCYCRRRFCVCV*           8         1.67    2WYCYCRRRFCVCV*WXCYCRRRFCVCV* (X＝Cha)RXCFCRGRZCVCV (X＝Cha)
             (Z＝MePhe)XLCFCRRRZCVCV (X＝Cha)
             (Z＝MePhe)RLCYCRPRFCVCVGR           0.65      0.1     0.89      0.05RLCYCRPRFCVCVGR           3.3       0.7     1.3       3.3        0.98RLCYCRPRFCVCVGR*         8         2.7     2         12.1       1.6WLCYCRRRFCVCVGR*WXCYCRRRFCVCVGR* ( X＝Cha)RLCYCRGPFCVCR             16.6      1.1              7.73RRWCFVCYAGFCYRCR           64        8      4RGGRLCYCRRRFCVC              ＞32      1.6*   2.7RRCYCRRRFCVCVGR           ＞64      1.3    2                     8.07
                         (32)RRCYCRGRFCGCVGRRWRCYCGRRFCGCVGRRARCYCGRRFCGCVGRGWRCYCRGRFCGCRGWACYCRGRFCVCRRCYGRRRFGVCVGRRGWRLCYGRGRFKVCRGWRLCYCRGRFCVC
 CYCRRRFCVCF             53.3      4     3.33                   ＞64
 CYCRRRFCVCVGR           ＞64      2     21.3RGWRLCYCRXRFCVC (X＝MeGly)RGWRGCYCRXRFCGC (X＝MeGly)   ＞64      10.7
LCYCRRRFCVCVGR           8         2     5.8
LCYCRPRFCVCVGR           13.3      4
LCYCKPKFCVCVGK           64        2
LCYCRGRFCVCVGR           8         2     2                      2.14序列                          MRSA    Psa     VREF   假丝酵母    大肠杆菌
 LCYCRPRFCVCVGRGR          8       2RRWCYCRPRFCVCVR             2.87    0.18          2.98WRLCYCRPRFCVCVGR            5.3     4              5GWLCYCRGRFCVCVGR            21      16RWLCYCRGRFCVCVGR            16      5.3RLLCYCRGRFCVCVGR            6.6     1.3RWRLCYCRPRFCVCV              8       4              5RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)     16      5.3
              (Z＝MeGly)RGWRLCYCRGRXCVCV (X＝Cha)     32     13.3RGGRVCYCRGRFCVCV              8      2RGGRVCYCRGRFCVCV*            64     1
 LCYCRXRFCVCV (X＝D-Ala)   32     9.3      3.33     ＞64
 LCYCKPKFCVCV              64     3        6.7      ＞64
 VCYCRPRFCVCV              26.7   5.2                  5.26
 LCYCRPRFCVCW              53.3   42.3
 LCYRRPRFRVCV              ＞64   4        16      ＞64RGWRLCYCRGRXCVCV* (X＝Cha)   ＞32   ＞16RXRLCYCRZRFCVCV* (X＝Cha)   ＞32   21
               (Z＝MeGly)RXRLCYCRGRFCVCV (X＝Cha)RGGGLCYARGWIAFCVGR            2.1    0.59     32.6     0.81RGGGLCYARGFIAVCFGR            19     14       65.8     3.27RGGGLCYARPRFAVCVGRRGGGLCYTRPRFTVCVGR            8.7    0.07     ＞128    1.53RGGGLCYARKGFAVCVGR            ＞128  0.01     ＞128    2.65RGGRLCYARRRFAVCVGR*                 0.05     1.6      0.4RGGRLCYARRRFAVCVGR                   0.01     3        0.08RGGGLCYKRGFIKVCFGR            17     0.19     7.73     3.27RGGGLCYKRGWIKFCVGR            2.07   0.15     2.72     3.56RGGGLCYRLPKFRVCVGR            34.77  0.22     15.09    0.56RGGGLCYRLPGFRVCVGR            30.76  0.53     31.4     8.95RGWRGCYKRGRFKGCVGR            ＞64   9.3RGWRGCYKRGRFKGCVGR*          ＞32   8*
 LCYARRRFAVCV              ＞64   2        10.7
 LCYTRRRFTVCV              ＞64   4        16
 LCYKRGRFKVCV
 ICYRPRFVCVGR              ＞128  6.9      ＞128    10.78
*表示游离酸形式；其它都是酰胺形式。
MRSA为甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌
Psa为铜绿色假单孢菌
VREF为万古霉素抗性屎肠球菌
假丝酵母菌为白假丝酵母
表22-25显示在上述杀菌动力学分析中，通过各种本发明肽对MRSA、铜绿色假单孢菌和唾液中内源菌丛CFU的对数降低提供的活性。
                 表22
       MRSA(ATCC 33591)在LTM培养基中于37℃
       暴露于肽(2μg/ml)15分钟后CFU的降低序列                                    对数的
                                     降低
                                     CFURGGRLCYCRRRFCVCVGR                       2.44RGGRLCYCRRRFCVCVGR                       1.83RGGRLCYARRRFAVCVGR*                     0.29RWRLCYCRPRFCVCV                         1.41RGWRLCYCRPRFCVCVGR                       2.06GWRLCYCRPRFCVCVGR                      ＞3.19
XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)               1.32
LCXCRRRXCVCV (X＝Cha)               ＞3.19RLCYCRRRFCVCV*                      ＜0.90RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)               1.13
            (Z＝MeGly)RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)             2.48RWLCYCRGRFCVCVGR                      1.58GGWRLCYCRGRFCVCVGR                      2.47RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)           1.66RGGRLCYCRGRFCVCVGR*                    ＜0.90RXRLCYCRZRXCVCWGR* (X＝Cha)           1.38
               (Z＝MeGly)RGWRLCYCRGRFCVCVGR                      2.12WLCYCRRRFCVCV                        3.16RLLRLCYCRRRFCVCVGR                      2.16RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)           ＜0.90
*用*注释的肽为酸形式；其它都是酰胺形式。
起始接种物大约为4×105CFU/ml。
                   表23铜绿色假单孢菌(ATCC 9027)在LTM培养基中于37℃
暴露于肽(4μg/ml)15分钟后CFU的对数降低序列                                     对数的
                                     降低RGGRLCYCRRRFCVCVGR                        3.19RGGRLCYCRPRFCVCVGR                        3.65RGWGLCYCRPRFCVCVGR                        ＜1.2RGGGLCYTRPRFTVCVGR                        2.15RGGRLCYCRRRFCVCVGR*                      3.98
XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)                 2.81RLCYCRXRFCVCV (X＝MeGly)               ＜0.5RLCYCRPRFCVCVGR*                       3.29RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)                  1.78RLCYCRRRFCVCV*                         3.52RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)                2.87RGGLCYCRGRFCVCVGR                         3.61RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)              2.70RLLRACYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)              2.71RGGRLCYCRGRFCVCVGR*                       2.66RGWRLCYCRGRFCVCVGR                         2.54RGGRVCYCRGRFCVCVGR                         2.37RGGRVCYCRGRFCVCV                           2.18RGGRVCYCRGRFCVCV*                         1.55WLCYCRRRFCVCV                           1.27
*用*注释的肽为酸形式；其它都是酰胺形式。
起始接种物大约为4×107CFU/ml。
                   表24铜绿色假单孢菌(ATCC 9027)在LTM培养基中于37℃暴露于肽(0.12μg/ml)后CFU的对数降低序列                      15 min         120 minRGGRLCYCRRRFCVCVGR         3.48           3.68RGWGLCYCRPRFCVCVGR         3.48           3.68RGGGLCYTRPRFTVCVGR         0.75           3.68RGGGLCYARKGFAVCVGR         1.20           3.68GWRLCYCRPRFCVCVGR         2.70           2.21RGGRLCYCRRRFCVC            2.25           ＞3.73
LCYCRRRFCVCV           1.35           2.13起始接种物大约为4×105CFU/ml。
                     表25
  唾液中内源菌丛于37℃暴露于肽(320μg/ml)
      15分钟后CFU的对数降低序列                                        对数的
                                         降低RGGRLCYCRRRFCVCVGR                           1.80RGGRLCYCRPRFCVCVGR                           2.04RGGGLCYKRGWIKFCVGR                           1.09RGWGLCYCRPRFCVCVGR                           0.53RLCYCRPRFCVCVGR                           0.53RGGGLCYTRPRFTVCVGR                           1.05RGGRLCYCRRRFCVCVGR*                         1.25
LCYCRGRFCVCVGR                           1.02RWRLCYCRPRFCVCV                             0.22RGWRLCYCRPRFCVCVGR                           0.38RGWRACYCRPRFCACVGR                           0.28GWRLCYCRPRFCVCVGR                           0.26
XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)                    0.25WLCYCRRRFCVCV*                           0.16RLCYCRXRFCVCV (X＝MeGly)                  3.43RLCYCRPRFCVCVGR*                         0.66RGGGLCYCRPRFCVCVGR*                         1.51RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)                    0.71
               表25唾液中内源菌丛于37℃暴露于肽(320μg/ml)
     15分钟后CFU的对数降低序列                                  对数的
                                    降低RWCFCRPRFCVCV                        0.52
LCXCRRRXCVCV (X＝Cha)               0.23RGGRLCYCRRRFCVC                         0.86
  LCYTRRRFTVCV                      0.64
 RRCYCRRRFCVCVGR                    0.98
 RLCYCRRRFCVCV*                    0.21RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)             ＜0.6
               (X＝MeGly)RGWRLCYCRGRXCVCV   (X＝Cha)             ＜0.6RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)             1.65RGWRGCYKRGRFKGCVGR                      ＜0.97RGWRGCYCRXRFCGC  (X＝MeGly)             ＜0.6RGGLCYCRGRFCVCVGR                       2.52RLLRLCYCRXRFCVCVGR  (X＝MeGly)           0.65RLLRACYCRXRFCVCVGR  (X＝MeGly)           2.11RGGRLCYCRGRFCVCVGR*                     2.16RGWRLCYCRGRFCVCVGR                       1.89RGGRLCYCRGRFCVCVGR                       2.53RGGRVCYCRGRFCVCVGR                       2.37RGGRVCYCRGRFCVCV                         2.07RGGRVCYCRGRFCVCV*                       ＜0.97WLCYCRRRFCVCV                         1.87*用*注释的肽为酸形式；其它都是酰胺形式。起始接种物大约为4×107CFU/ml的唾液。将肽(3200μg/ml)溶于0.01％乙酸中，以1/10体积加入唾液中。
也采用通常不在TSA上生长、但在LTM中存活几小时的流感嗜血杆菌(ATCC 49247)进行动力学实验。
对数期细胞(在LTM中为4.5×105CFU/ml)用肽处理，然后在巧克力琼脂上倒平板，以测定活的CFU数。所有测试的肽(RGGRLCYCRRRFCVCVGR的酸形式和酰胺形式，和RGGLCYCRGRFCVCVGR的酰胺形式)对流感嗜血杆菌都为快速杀菌剂。同先前用铜绿色假单孢菌所见的一样，在240分钟时没有观察到再生长。
最后，采用幽门螺旋菌作为靶进行上述分析，提供的结果示于表26中。
                      表26
           暴露15分钟后肽对幽门螺旋菌
           (ACTT 33591)的CFU的作用序列                                 对数的降低CFURGGRLCYCRRRFCVCVGR                     2.90RGWGLCYCRPRFCVCVGR                     3.43RLCYCRPRFCVCVGR                     1.34RGGGLCYTRPRFTVCVGR                     ＜1.12RGGGLCYARKGFAVCVGR                     ＜1.2RGGRLCYCRRRFCVCVGR*                    3.00
LCYCRGRFCVCVGR                      ＜1.12RGWRACYCRPRFCACVGR                      ＜1.6
XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)               ＜1.70
WLCYCRRRFCVCV*                     ＜1.6
RLCYCRXRFCVCV (X＝MeGly)            1.57
RLCYCRPRFCVCVGR*                   ＜1.6
RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)              ＞4.66RGGRLCYCRRRFCVC                        ＜1.2
 LCYTRRRFTVCV                       ＜1.28
RLCYCRRRFCVCV*                     ＜1.2RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)              1.97
            (Z＝MeGly)RGWRLCYCRGRXCVCV(X＝Cha)                ＜1.47RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)             3.22RGGLCYCRGRFCVCVGR                      1.57RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)           2.10RLLRACYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)           1.42RGGRLCYCRGRFCVCVGR*                    2.40RGLRXCYCRGRFCVCVGR* (X＝Cha)           ＜1.47RGWRLCYCRGRFCVCVGR                      ＞3.57RGGRVCYCRGRFCVCV*                      ＜1.47
序列                         对数的降低CFUWLCYCRRRFCVCV                     3.36WLCFCRRRFCVCV                     1.97FLCFCRRRFCVCV                     1.99WYCYCRRRFCVCV                     ＜1.6WXCYCRRRFCVCV (X＝Cha)            ＜1.6WLCYCRRRFCVCVGR                   ＜1.67WXCYCRRRFCVCVGR (X＝Cha)          ＜1.67RLLRLCYCRRRFCVCVGR                   ＜1.67RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)        ＜1.67起始接种物大约为4×105CFU/ml。*用*注释的肽为酸形式；其它都是酰胺形式。
也按上述方法使用修改的NCCLS分析，表28和表29中报道最低抑制浓度(μg/ml)。以在具有(+HSA)或不具有(-HSA)人血清白蛋白的0.01％AA中制备0.1％的肽。表28表明各种肽对各种生物测试的结果；表29表明在人血清白蛋白存在下的结果。假定通过防止吸附到塑料表面，HSA通常降低MIC。
               表28
   在修改NCCLS分析中测试的肽的最低抑制浓度序列                         铜绿色假单孢菌    MRSA     VREFRGGRLCYCRRRFCVCVGR                 8.00        8.00     2.00RGWGLCYCRPRFCVCVGR                 16.00       16.00RGGRLCYCRRRFCVCVGR*               8.00        16.00    2.00WLCYCRRRFCVCV*                 32.0        32.00RGGLCYCRGRFCVCVGR                 4.00        8.00     2.00RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)      16.00       16.00WLCYCRRRFCVCV                   128.00      16.00    3.00WYCYCRRRFCVCV                   32.0        64.00WLCYCRRRFCVCVGR                 ＞64        64.00RLLRLCYCRRRFCVCVGR                 32.0        32.00RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)      64.0        ＞128*用*注释的肽为酸形式；其它都是酰胺形式。在无HSA的0.01％乙酸中制备肽。
                                        表29
                       在Meuller Hinton培养基中的MIC(μg/ml)
生物     培养基添加 RGGLYCYCRGRFCVCVGR(酰胺)-HSA         +HSA        PG-1(酰胺)-HSA  +HSA    PG-1(酸)-HSA
金黄色葡萄球菌MSSA 无 4 4 4
金黄色葡萄球菌MRSA 无 13.3 2 16 5.3 16
屎肠球菌VREF 无 2 0.33 1.3 0.25 2
-羟高铁血色素 1
+羟高铁血色素 8
枯草杆菌 无 0.7 0.8 0.2
肺炎链球菌* -羟高铁血色素 2
+羟高铁血色素 8
唾液链球菌*绿色群 -羟高铁血色素 0.12
+羟高铁血色素 0.5
铜绿色假单孢菌 无 4 1.33 5.3 0.33 9.3
肺炎杆菌 无 5.3 4 4
粘质沙雷氏菌 无 16 16 21
大肠杆菌 无 4 0.33 5.3 0.12 4
-羟高铁血色素 0.5
+羟高铁血色素 8
流感嗜血杆菌 -羟高铁血色素 无生长
+羟高铁血色素 8
乙酸钙不动细菌 无 2 3 4
脑膜炎萘瑟氏菌 -羟高铁血色素 8
+羟高铁血色素 32
白假丝酵母 无 8 4 16 8 16
表30显示各种肽对多种微生物的MIC。
                                 MIC8(μg/mL)序列                            MRSA     Psa       VREF       Can.RGGRLCYCRRRFCVCVGR              2-4    0.3-1.7    0.13      8，16
WLCFCRRRFCVCV
FLCFCRRRFCVCV                5.3     ＞32      0.5       128
WYCYCRRRFCVCV*              42.7    32        1         ＞128
WXCYCRRRFCVCV* (X＝Cha)
WLCYCRRRFCVCVGR*            27-32   32-53    0.25-0.5   ＞128
WXCYCRRRFCVCVGR* (X＝Cha)RLLRCYCRRRFCVCVGR             32↑     32↑RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)   ＞128↑ 64↑RGVCVCFRRRCYCLWRGVCVCFRRRCYCLW               10.7    ＞32     0.5        32
 VCVCFRRRCYCLW               16      ＞32     1          ＞128
 FCVCFRRRCFCLF               16      ＞32     2          ＞128RGVCVCFRRRCYCRGGR             8       8        0.25       16RGVCVCFRRRCYCLRGGR (all D)    21      8        4          32RGVCVCFRRRCYCLW*             53     ＞32      2          128RGVCVCYRXRCYCLW (X＝MeGly)    13      32       1          64
WLCYCRXZYCVCVGR (X＝MeGly)
                (Z＝D-Arg)RGFCVCFRRVCYCLW               ＞32  128        2          ＞128
WLCYCRRRFCVCVGR              11    48         0.21       128
WLCYCRRXFCVCVR (X＝D-Arg)    5.3   32         0.25       64
WLCYCKKKFCVCVGK              6.7   4.3        0.21       32Octyl-WLCYCRRRFCVCVGR
  XLCYCRRRFCVCV (X＝1-Nal)   4     128        0.5        ＞128
WLCRGRFCVR*                ＞128  ＞128      ＞32       ＞128
WLCRGRFCFR                  ＞128  ＞128      16         ＞128
WLCYRRVCVR                  64     32         16         16
WLCYCOOOFCVCV               2      4          0.5        64
WLCYCXXXFCVCV (X＝Dab)      2      2          0.5        32
WLCYCRRRFCVCV (all D)       1      8          0.5        128HWRLCYCRPKFCVCV               13.3   32         1          ＞128KWRLCYCRPKFCVCV               1      4          0.5        128OWRLCYCRPKFCVCV               1      4          0.25       128XWRLCYCRPKFCVCV (X＝Dbu)      2.67   5.3        0.25       107RWHLCYCRPKFCVCV               4.3    13.3       0.25       ＞128
                                   MICs(μg/mL)序列                           MRSA    Psa    VREF    Can.RWKLCYCRPKFCVCV                 2      13.3    0.5    107RWOLCYCRPKFCVCV                 1      2.7     0.25   43RWXLCYCRPKFCVCV (X＝Dbu)        2      2       0.5    64WLCYCKXKFCVCVGR (X＝Tic)FCYCKXKFCYCV (X-Hyp)WLXYXRRRFXVXV (X＝hCys)       16     64WOLCYCOXOFCVCVO (X＝Tic)       1      2OFCVCVOXOFCVCVO (X＝Tic)      16     85OWOLCYCOXOFCVCV (X＝Tic)        4      11OFCVCXOLCYCFO (X＝Tic)        32     ＞128WLCYCKKKFCVCV                 2      5.3OWOLCYCOXOFCVCV (X＝Hyp)        1      2.3WLCYCOXOFCVCVO (X＝Pba)WLCYCOOOFCVCV (all D)XFCYCLRXFCVCVR* (X＝D-Arg)   8      48WLCYCRRXFCVCVZX* (X＝D-Arg)  64     48
                (Z＝MeGly)*用*注释的肽为酸形式；其它都是酰胺形式。MRSA为甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌Psa为铜绿色假单孢菌VREF为万古霉素抗性屎肠球菌假丝酵母菌为白假丝酵母↑表示分析中无HSA或BSA

Claims (38)

1.抗微生物肽或其药学上可接受的盐或其N-末端酰化形式或其C-末端酰胺化或酯化形式，该抗微生物肽包含大约10-30个氨基酸残基，并含有以下氨基酸序列：(I)  X1-X2-X3-X4-X5-C6-X7-C8-X9-X10-X11-X12-C13-X14-C15-X16-X17-X18其中：
C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个半胱氨酸状、碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
C6和C15中的每个独立地为一个半胱氨酸状、碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
X1-X5中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为一个疏水氨基酸或小氨基酸；
X9和X12中的每个独立地存在或不存在；
结合在一起的X9-X12当含于式(I)的氨基酸序列中时，能够实现回折，并且X9-X12中的至少一个必须是碱性氨基酸；
X16-X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
并且其中包含所述抗菌肽的至少大约15％-50％的氨基酸为碱性氨基酸，使得所述抗菌肽在生理pH下的净电荷至少为+1。
只要如果X1-X4都存在，并且X1-X4都不是疏水氨基酸时，X5、X8、X9、X12、X13或X16中的至少一个必须不存在，或X5必须为碱性。
2.权利要求1的抗微生物肽，其中所述肽含有两个二硫桥，为天然形式。
3.权利要求1的抗微生物肽，其中所述肽含有一个二硫桥，为子弹形式或风筝形式。
4.权利要求1的抗微生物肽，其中所述肽不含二硫桥，为蛇形式。
5.权利要求1的抗微生物肽，其中所述肽在生理条件下的净电荷至少为+3。
6.权利要求1的抗微生物肽，其中所述肽包含10-24个氨基酸残基，并且其中
C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个小氨基酸、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
C6和C15中的每个独立地为一个小氨基酸、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
X1-X5中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸或小氨基酸，并且X1-X5中的任何两个可以是疏水氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为疏水氨基酸；
X9和X12中的每个独立地存在或不存在，如果存在，每个独立地为碱性氨基酸或疏水氨基酸；
X10为碱性氨基酸、疏水氨基酸或小氨基酸或脯氨酸；
X16存在或不存在，如果存在，为碱性氨基、小的或疏水氨基酸；
X17和X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸或小氨基酸；
X16-X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，每个独立地为碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大或小氨基酸。
7.权利要求1的抗微生物肽，其中所述肽包含大约10-18个氨基酸残基，并且其中：
C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为小、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
C6和C15中的每个独立地为小氨基酸、疏水氨基酸或极性/大氨基酸或半胱氨酸；
X1-X4中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为碱性氨基酸或小氨基酸，并且X1-X4中的任何一个可以是疏水氨基酸；
X5和X16中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为疏水氨基酸或碱性氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为疏水氨基酸；
X9存在或不存在，如果存在，为碱性氨基酸或疏水氨基酸；
X10为碱性氨基酸或小氨基酸或脯氨酸；
X11为碱性氨基酸或疏水氨基酸；
X12存在或不存在，如果存在，为疏水氨基酸；
X17存在或不存在，如果存在，独立地为小氨基酸；以及
X18存在或不存在，如果存在，为碱性氨基酸。
8.权利要求1的抗微生物肽，其中每个C6、C8、C13和C15都为半胱氨酸氨基酸，而每个X7和X14独立地为疏水氨基酸。
9.权利要求8的抗微生物肽，其中每个X7和X14独立地为I、V、L、W、Y或F。
10.权利要求9的抗微生物肽，其中X7为I、F、Y或W，而X14为I、V、L、W、Y或F。
11.权利要求1的抗微生物肽，其中X1-X4不存在。
12.权利要求1的抗微生物肽，其中X1-X4中的至少一个是疏水氨基酸。
13.权利要求12的抗微生物肽，其中所述疏水氨基酸为I、V、L、W、F或Y。
14.权利要求1的抗微生物肽，其中X9-X12中的至少一个是疏水氨基酸。
15.权利要求1的抗微生物肽，其中X1和X9每个独立地为R、K、Om、Dab、Har或疏水氨基酸。
16.权利要求1的抗微生物肽，其中X2和X3每个独立地为G、A、S、T、I、V、L、F、Y或W。
17.权利要求1的抗微生物肽，其中X4为R、K、H、Orn、Dab、G、A、S、F、Y或W。
18.权利要求1的抗微生物肽，其中X9为R、K、H、Orn、Dab、Har、I、V、L、Nle、W、Y或F，而X12为I、L、V、W、F或Y。
19.权利要求1的抗微生物肽，其中在一起的X9-X12为三个氨基酸残基的γ-转角。
20.权利要求1的抗微生物肽，其中在一起的X9-X12为四个氨基酸残基的γ-转角。
21.权利要求1的抗微生物肽，其中所述β-转角为ZZZG、ZZZF、ZZSG、ZZAL、ZGZL、ZFZL、ZPZV、ZPZF、ZGZY、IZGZ、LZZF或YZGZ，其中每个Z独立地为R、K、Dbu或Orn的L-或D-对映体。
22.权利要求1的抗微生物肽，其中所有氨基酸都为D-对映体。
23.权利要求1的抗微生物肽，选自：
  WLCFCRRRFCVCV                   (SEQ ID NO：2)；
  FLCFCRRRFCVCV                   (SEQ ID NO：3)；
  WYCYCRRRFCVCV                   (SEQ ID NO：4)；
  WXCYCRRRFCVCV (X＝Cha)          (SEQ ID NO：5)；
  WLCYCRRRFCVCVGR                 (SEQ ID NO：6)；
  WXCYCRRRFCVCVGR(X＝Cha)         (SEQ ID NO：7)；RLLRLCYCRRRFCVCVGR                 (SEQ ID NO：8)；RGGRLCYCRRRFCXCVGR(X＝MeVal)       (SEQ ID NO：9)；
 RGVCVCFRRRCYCLW                  (SEQ ID NO：10)；
 RGVCVCFRRRCYCLW                  (SEQ ID NO：11)；
   VCVCFRRRCYCLW                  (SEQ ID NO：12)；
   FCVCFRRRCFCLF                  (SEQ ID NO：13)；
 RGVCVCFRRRCYCRGGR                (SEQ ID NO：14)；
 RGVCVCFRRRCYCLRGGR(all D)        (SEQ ID NO：15)；
 RGVCVCFRRRCYCLW                  (SEQ ID NO：16)；
 RGVCVCYRXRCYCLW (X＝MeGly)       (SEQ ID NO：17)；
  WLCYCRXZYCVCVGR (X＝MeGly)      (SEQ ID NO：18)；
                  (Z＝D-Arg)
 RGFCVCFRRVCYCLW                  (SEQ ID NO：19)；
  WLCYCRRRFCVCVGR                 (SEQ ID NO：20)；
  WLCYCRRXFCVCVR (X＝D-Arg)       (SEQ ID NO：21)；
  WLCYCKKKFCVCVGK                 (SEQ ID NO：22)；OCtyl-WLCYCRRRFCVCVGR                 (SEQ ID NO：23)；
  XLCYCRRRFCVCV (X＝1-Nal)        (SEQ ID NO：24)；
  WLCRGRFCVR                      (SEQ ID NO：25)；
  WLCRGRFCFR                      (SEQ ID NO：26)；
        WLCYRRVCVR                        (SEQ ID NO：27)；
        WLCYCOOOFCVCV                     (SEQ ID NO：28)；
        WLCYCXXXFCVCV (X＝Dab)            (SEQ ID NO：29)；
        WLCYCRRRFCVCV (all D)             (SEQ ID NO：30)；
      HWRLCYCRPKFCVCV                     (SEQ ID NO：31)；
      KWRLCYCRPKFCVCV                     (SEQ ID NO：32)；
      OWRLCYCRPKFCVCV                     (SEQ ID NO：33)；
      XWRLCYCRPKFCVCV (X＝Dab)            (SEQ ID NO：34)；
      RWHLCYCRPKFCVCV                     (SEQ ID NO：35)；
      RWKLCYCRPKFCVCV                     (SEQ ID NO：36)；
      RWOLCYCRPKFCVCV                     (SEQ ID NO：37)；
      RWXLCYCRPKFCVCV (X＝Dab)            (SEQ ID NO：38)；
        WLCYCKXKFCVCVGR (X＝Tic)          (SEQ ID NO：39)；
         FCYCKXKFCYCV (X＝Hyp)            (SEQ ID NO：40)；
       WLXYXRRRFXVXV (X＝hCys)            (SEQ ID NO：41)；
      WOLCYCOXOFCVCVO (X＝Tic)            (SEQ ID NO：42)；
       OFCVCVOXOFCVCVO (X＝Tic)           (SEQ ID NO：43)；
     OWOLCYCOXOFCVCV (X＝Tic)             (SEQ ID NO：44)；
       OFCVCXOLCYCFO (X＝Tic)             (SEQ ID NO：45)；
       WLCYCKKKFCVCV                      (SEQ ID NO：46)；
     OWOLCYCOXOFCVCV (X＝Hyp)             (SEQ ID NO：47)；
       WLCYCOXOFCVCVO (X＝Pba)            (SEQ ID NO：48)；
       WLCYCOOOFCVCV (all D)              (SEQ ID NO：49)；
       XFCYCLRXFCVCVR (X＝D-Arg)          (SEQ ID NO：50)；
       WLCYCRRXFCVCVZX                    (SEQ ID NO：51)；
                      (X＝D-Arg)
                      (Z＝MeGly)PC11           LCYCRRRFCVCVGR                 (SEQ ID NO：52)；PC12           RCYCRRRFCVCV                   (SEQ ID NO：53)；PC15       RGGRLCYCRRRFCVCR                   (SEQ ID NO：54)；PC16           RCYCRRRFCVCR                   (SEQ ID NO：55)；PC17           LCYCRRRFCVCV                   (SEQ ID NO：56)；PC18           LCYARRRFAVCV                   (SEQ ID NO：57)；PC19           RCYARRRFAVCR                   (SEQ ID NO：58)；PC20           LAYCRRRFCVAV                   (SEQ ID NO：59)；PC21           RAYCRRRFCVAR                   (SEQ ID NO：60)；PC22           RGGRLCY  RR  VCV         (SEQ ID NO：61)；PC31            GGRLCYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：62)；PC32            RGRLCYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：63)；PC33             GRLCYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：64)；PC34             RRLCYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：65)；PC35              RLCYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：66)；PC36              RRCYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：67)；PC37                CYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：68)；PC44           RGGRLCYCRRRFCVC          (SEQ ID NO：69)；PC47          RGGRLCY RRRF VCV          (SEQ ID NO：70)；PC48          RGWRLCYCRRRFCVCV          (SEQ ID NO：71)；PC37a              CYCRRRFCVCVGR        (SEQ ID NO：72)；PC45          RGGRLCYCRRRFCV            (SEQ ID NO：73)；PC72              LCYCRRRFCVC           (SEQ ID NO：74)；PC64              LCYTRRRFTVCV          (SEQ ID NO：75)；PC64a             LTYCRRRFCVTV          (SEQ ID NO：76)；PC31a         GGRLCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：77)；PC32a         RGRLCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：78)；PC33a          GRLCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：79)；PC34a          RRLCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：80)；PC35a           RLCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：81)；PC36a           RRCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：82)；PC44a        RGGRLCYCRRRFCVCR           (SEQ ID NO：83)；PC47a        RGGRLCY RRRF VCVGR         (SEQ ID NO：84)；PC48a        RGWRLCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：85)；PC54         RGWRLAYCRRRFCVAVGR         (SEQ ID NO：86)；PC61             RCYCRRRFCVCV           (SEQ ID NO：87)；PC62             LCYCRRRFCVCR           (SEQ ID NO：88)；PC63             VCYCFRRFCYCV           (SEQ ID NO：89)；PC65             LCYTRPRFTVCV           (SEQ ID NO：90)；PC66             LCYTRGRFTVCV           (SEQ ID NO：91)；PC67             LCYFRRRFIVCV           (SEQ ID NO：92)；PC68             LCYFRPRFIVCV           (SEQ ID NO：93)；PC69             LCYTFRPRFVCV           (SEQ ID NO：94)；PC70             LCYTFRGRFVCV           (SEQ ID NO：95)；PC74              CYCFRRFCVC                  (SEQ ID NO：96)；PC77             LCYCRRRRCVCV                 (SEQ ID NO：97)；PC78             LCYCFRRRCVCV                 (SEQ ID NO：98)；PC79             LCYCRFRRCVCV                 (SEQ ID NO：99)；PC80             LCYCRRFRCVCV                 (SEQ ID NO：100)；PC81             LCYCRRFFCVCV                 (SEQ ID NO：101)；PC82             LCYCRFFRCVCV                 (SEQ ID NO：102)；PC83             LCYCFFRRCVCV                 (SEQ ID NO：103)；PC84             LCYCFRRFCVCV                 (SEQ ID NO：104)；PC85             LCYCFRFRCVCV                 (SEQ ID NO：105)；PC86             LCYCRFRFCVCV                 (SEQ ID NO：106)；PC87             LCYCFRFFCVCV                 (SEQ ID NO：107)；PC88             LCYCFFRFCVCV                 (SEQ ID NO：108)；PC89             LCYCFFFRCVCV                 (SEQ ID NO：109)；PC90             LCYCRFFFCVCV                 (SEQ ID NO：100)；
         RGGRLCY  RR  VCVGR               (SEQ ID NO：111)；PC91             YCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：112)；PC95             ICYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：113)；PC96             FCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：114)；PC97             WCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：115)；PC99             RCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：116)；PC109           RLCYTRGRFTVCV                 (SEQ ID NO：117)；PC110            LCYTRGRFTVCVR                (SEQ ID NO：118)；PC111           RLCYTRGRFTVCVR                (SEQ ID NO：119)；PC112            LCYCHHHFCVCV                 (SEQ ID NO：120)；PC113            LCYTHHHFTVCV                 (SEQ ID NO：121)；
          RGGLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：122)；
         RGGRLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：123)；
         RGGGLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：124)；
         RGGGLCYCRRGFCVCFGR               (SEQ ID NO：125)；
         RGGGLCYCRRPFCVCVGR               (SEQ ID NO：126)；
         RGGGLCYCRPRFCVCVGR               (SEQ ID NO：127)；
         RGGRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：128)；
          RGGLCYCRGRFCVCVGR               (SEQ ID NO：129)；
         RGGRLCYCXGRFCVCVGR(X＝Cit)       (SEQ ID NO：130)；XGGRLCYCRGRFCVCVGR (X＝Cit)      (SEQ ID NO：131)；RGGRVCYCRGRFCVCVGR               (SEQ ID NO：132)；RGGGLCYCFPKFCVCVGR               (SEQ ID NO：133)；RGWGLCYCRPRFCVCVGR               (SEQ ID NO：134)；RGWRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：135)；RGWRLCYCRGRFCVCVGR               (SEQ ID NO：136)；RGWRLCYCXPRFCVCVGR (X＝Cit)      (SEQ ID NO：137)；RWRLCYCRPRFCVCVGR              (SEQ ID NO：138)；RGWRLCYCRPRFCVCVGR               (SEQ ID NO：139)；RGWRACYCRPRFCACVGR               (SEQ ID NO：140)；GWRLCYCRPRFCVCVGR              (SEQ ID NO：141)；RWRLCYCKGKFCVCVGR              (SEQ ID NO：142)；RGWRLCYCRXRFCVCVGR  (X＝MeGly)   (SEQ ID NO：143)；GGWRLCYCRGRFCVCVGR               (SEQ ID NO：144)；RGGWLCYCRGRFCVCVGR               (SEQ ID NO：145)；RLLRLCYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：146)；RLLRACYCRXRFCVCVGR (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：147)；RLLRLCYCRRRFCVCVGR               (SEQ ID NO：148)；RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)      (SEQ ID NO：149)；RGGRLCYCRXRZCVCWGR (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：150)；
               (Z＝Cha)RGGRWCVCRXRZCYCVGR (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：151)；
               (Z＝Cha)RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)      (SEQ ID NO：152)；RGGRWCVCRGRXCYCVGR (X＝Cha)      (SEQ ID NO：153)；RGGRLCYCRRRFCXCVGR (X＝MeVal)    (SEQ ID NO：154)；
LCYCRRRFCVCV                 (SEQ ID NO：155)；
LCYCRRCFCVCV                 (SEQ ID NO：156)；
LCYCRRRFCVCF                 (SEQ ID NO：157)；
LCACRRRACVCV                 (SEQ ID NO：158)；
LCYCRXRFCVCV (X＝D-Arg)      (SEQ ID NO：159)；
LCWCRRRFCVCV                 (SEQ ID NO：160)；
WCYCRRRFCVCV                 (SEQ ID NO：161)；
LCYCRRRXCVCV (X＝hPhe)       (SEQ ID NO：162)；
LCYCRRRXCVCV (X＝Phe(4-Cl))  (SEQ ID NO：163)；
XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)        (SEQ ID NO：164)；
LCYCRRRFCXCV (X＝D-His)    (SEQ ID NO：165)；
LCYCRRRXCVCV (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：166)；
LCYCRRRXCVCV (X＝MePhe)    (SEQ ID NO：167)；
LCYCRRRFCXCV (X＝MeVal)    (SEQ ID NO：168)；
LCXCRRRXCVCV (X＝Cha)      (SEQ ID NO：169)；
LCGCRRRGCVCV               (SEQ ID NO：170)；
LCACRGRACVCV               (SEQ ID NO：171)；RACYCRPRFCACV               (SEQ ID NO：172)；RLCYCRPRFCVCF               (SEQ ID NO：173)；RLCYCRPRFCVCV               (SEQ ID NO：174)；KLCYCKPKFCVCV               (SEQ ID NO：175)；RLCACRGRACVCV               (SEQ ID NO：176)；RLCYCRXRFCVCV (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：177)；RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)      (SEQ ID NO：178)；RWCFCRPRFCVCV               (SEQ ID NO：179)；WLCYCRRRFCVCV               (SEQ ID NO：180)；WLCFCRRRFCVCV               (SEQ ID NO：181)；FLCFCRRRFCVCV               (SEQ ID NO：182)；WLCFCRRRXCVCV (X＝MePhe)    (SEQ ID NO：183)；WYCYCRRRFCVCV               (SEQ ID NO：184)；WXCYCRRRFCVCV (X＝Cha)      (SEQ ID NO：185)；RXCFCRGRZCVCV (X＝Cha)      (SEQ ID NO：186)；
             (Z＝MePhe)XLCFCRRRZCVCV (X＝Cha)      (SEQ ID NO：187)；
             (Z＝MePhe)RLCYCRPRFCVCVGR             (SEQ ID NO：188)；WLCYCRRRFCVCVGR             (SEQ ID NO：189)；WXCYCRRRFCVCVGR (X＝Cha)    (SEQ ID NO：190)；RLCYCRGPFCVCR               (SEQ ID NO：191)；RRWCFVCYAGFCYRCR             (SEQ ID NO：192)；RRCYCRGRFCGCVGR             (SEQ ID NO：193)；RWRCYCGRRFCGCVGR             (SEQ ID NO：194)；RARCYCGRRFCGCVGR             (SEQ ID NO：195)；GWRCYCRGRFCGC                (SEQ ID NO：196)；RGWACYCRGRFCVC               (SEQ ID NO：197)；
RRCYGRRRFGVCVGR            (SEQ ID NO：198)；RGWRLCYGRGRFKVC               (SEQ ID NO：199)；RGWRLCYCRGRFCVC               (SEQ ID NO：200)；
 CYCRRRFCVCF              (SEQ ID NO：201)；RGWRLCYCRXRFCVC (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：202)；RGWRGCYCRXRFCGC (X＝MeGly)    (SEQ ID NO：203)；
LCYCRPRFCVCVGR            (SEQ ID NO：204)；
LCYCKPKFCVCVGK            (SEQ ID NO：205)；
LCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：206)；
LCYCRPRFCVCVGRGR          (SEQ ID NO：207)；RRWCYCRPRFCVCVR             (SEQ ID NO：208)；WRLCYCRPRFCVCVGR            (SEQ ID NO：209)；GWLCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：210)；RWLCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：211)；RLLCYCRGRFCVCVGR            (SEQ ID NO：212)；RWRLCYCRPRFCVCV              (SEQ ID NO：213)；RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：214)；
             (Z＝MeGly)RGWRLCYCRGRXCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：215)；RGGRVCYCRGRFCVCV              (SEQ ID NO：216)；
LCYCRXRFCVCV (X＝D-Ala)   (SEQ ID NO：217)；
LCYCKPKFCVCV              (SEQ ID NO：218)；
VCYCRPRFCVCV              (SEQ ID NO：219)；
LCYCRPRFCVCW              (SEQ ID NO：220)；
LCYRRPRFRVCV              (SEQ ID NO：221)；RGWRLCYCRGRXCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：222)；RXRLCYCRZRFCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：223)；
             (Z＝MeGly)RXRLCYCRGRFCVCV (X＝Cha)     (SEQ ID NO：224)；RGGGLCYARGWIAFCVGR            (SEQ ID NO：225)；RGGGLCYARGFIAVCFGR            (SEQ ID NO：226)；RGGGLCYARPRFAVCVGR            (SEQ ID NO：227)；RGGGLCYTRPRFTVCVGR            (SEQ ID NO：228)；RGGGLCYARKGFAVCVGR            (SEQ ID NO：229)；RGGRLCYARRRFAVCVGR            (SEQ ID NO：230)；RGGGLCYKRGFIKVCFGR            (SEQ ID NO：231)；RGGGLCYKRGWIKFCVGR            (SEQ ID NO：232)；RGGGLCYRLPKFRVCVGR         (SEQ ID NO：233)；RGGGLCYRLPGFRVCVGR         (SEQ ID NO：234)；RGWRGCYKRGRFKGCVGR         (SEQ ID NO：235)；
LCYKRGRFKVCV           (SEQ ID NO：236)；
ICYRPRFVCVGR           (SEQ ID NO：237)；WLCYCRRRFCVCV           (SEQ ID NO：238)；RLCYCRRRFCVCV           (SEQ ID NO：240)；RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR      (SEQ ID NO：241)；和RRRLCYCRRRFCVCVGR         (SEQ ID NO：242)。
24.生产按照权利要求1的抗微生物肽的重组表达系统，该表达系统包含一个编码所述肽的核苷酸序列，后者操作性地连接用于实现表达的控制序列。
25.经修饰含有权利要求25表达系统的重组宿主细胞或其子代。
26.生产抗微生物肽或其中间肽的方法，所述方法包括在生产所述肽的条件下，培养按照权利要求24的修饰宿主细胞或其子代；并且从该培养物中回收该抗微生物肽的步骤。
27.抗微生物肽药物组合物，包含与至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的按照权利要求1的抗微生物肽。
28.应用于植物的抗微生物环境组合物，包含与至少一种环境可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的按照权利要求1的抗微生物肽。
29.防止病毒或微生物生长的方法，包括将支持所述病毒或微生物生长的组合物与防止所述生长有效量的按照权利要求1的抗微生物肽接触的步骤。
30.使革兰氏阴性细菌内毒素失活的方法，包括将所述内毒素与失活所述内毒素有效量的按照权利要求1的抗微生物肽接触的步骤。
31.与权利要求1的抗微生物肽特异性反应的抗体。
32.治疗或预防对象中微生物或病毒感染的方法，包括给予需要这种治疗的对象治疗有效量的抗微生物肽或其药学上可接受的盐或其N-末端酰化形式或其C-末端酰胺化或酯化形式，该肽含有大约10-30个氨基酸残基，并含有以下氨基酸序列：(I)    X1-X2-X3-X4-X5-C6-X7-C8-X9-X10-X11-X12-C13-X14-C15-X16-X17-X18其中：
C8和C13中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个半胱氨酸状、碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
C6和C15中的每个独立地为一个半胱氨酸状的、碱性氨基酸、小氨基酸、极性/大氨基酸或疏水氨基酸；
X1-X5中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
X7和X14中的每个独立地为一个疏水氨基酸或小氨基酸；
X9和X12中的每个独立地存在或不存在；
结合在一起的X9-X12当含于式(I)的氨基酸序列中时，能够实现回折，并且X9-X12中的至少一个必须是碱性氨基酸；
X16-X18中的每个独立地存在或不存在，如果存在，那么每个独立地为一个碱性氨基酸、疏水氨基酸、极性/大氨基酸或小氨基酸；
并且其中包含所述抗菌肽的至少大约15％-50％的氨基酸为碱性氨基酸，使得所述抗菌肽在生理pH下的净电荷至少为+1。
33.权利要求32的方法，其中该微生物感染由金黄色葡萄球菌引起。
34.权利要求31的方法，其中该抗微生物肽选自：
RGWRLCYCRPRFCVCVGR      (SEQ ID NO：139)；
GWRLCYCRPRFCVCVGR       (SEQ ID NO：141)；
XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)   (SEQ ID NO：164)；和
WLCYCRRRFCVCV           (SEQ ID NO：180)。
35.权利要求32的方法，其中该微生物感染由假单孢菌引起。
36.权利要求35的方法，其中该抗微生物肽选自：
RGGRLCYCRRRFCVCVGR    (SEQ ID NO：1)；
RGGRLCYCRPRFCVCVGR    (SEQ ID NO：239)；
RGGGLCYTRPRFTVCVGR    (SEQ ID NO：228)；和
RLCYCRRRFCVCV         (SEQ ID NO：66)。
37.权利要求32的方法，其中该微生物感染由幽门螺旋菌引起。
38.权利要求37的方法，其中该抗微生物肽选自：
WLCYCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：180)；
RXCFCRPRFCVCV (X＝Cha)       (SEQ ID NO：178)；
RGGRLCYCRRRFCVCVGR           (SEQ ID NO：1)；
RGWGLCYCRPRFCVCVGR           (SEQ ID NO：134)；
RLCYCRPRFCVCVGR              (SEQ ID NO：138)；
RGWRLCYCRGRFCVCVGR           (SEQ ID NO：136)；
RGRVCLRYCRGRFCVRLCFR         (SEQ ID NO：241)；
RGLRXCYCRGRFCVCVGR (X＝Cha)  (SEQ ID NO：149)；
GWRLCYCRPRFCVCVGR            (SEQ ID NO：139)；
RLCYCRRRFCVCV                (SEQ ID NO：66)；
WLCYCXXXFCVCV (X＝Dab)       (SEQ ID NO：29)；
OWRLCYCRPKFCVCV              (SEQ ID NO：33)；
RWOLCYCRPKFCVCV              (SEQ ID NO：37)；
RRCYCRRRFCVCVGR              (SEQ ID NO：82)；
XCYCRRRFCVCV (X＝Cha)        (SEQ ID NO：164)；
RRRLCYCRRRFCVCVGR            (SEQ ID NO：242)；和
RRRLCYCRRRFCVCVGR (all D)    (SEQ ID NO：243)。
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