CN1253213C - 用于粘膜再生的方法和膜 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过施用由衍生自天然含胶原组织的纯化胶原材料组成的膜而促进粘膜损伤的愈合的方法。本发明还涉及用于促进粘膜再生的粘膜再生制备物及其用途。

Description

用于粘膜再生的方法和膜
                发明背景
发明领域
本发明一般地涉及再生粘膜的方法。
背景技术描述
一段时间以来，在前庭加深(vestibular deepening)和口腔中其它类型前庭成形术中使用分层皮片移植物和口腔粘膜游离移植物已是一项熟知程序。另外，取自腭和颊部粘膜的游离粘膜移植物已用于在无牙牙槽嵴区域重建附着粘膜表面，特别是其与牙根形植入物一起应用。
尽管这类移植程序已熟知，但是开发有效的异质(alloplastic)或异种(xenogeniec)替代移植材料用于正常粘膜的重建和再生将会使前庭成形术有更广泛的应用。
现有技术中仍需要促进粘膜再生的改进方法，特别是前庭成形术的改进。
发明概述
根据本发明，粘膜再生作用通过使用由衍生自天然含胶原组织的纯化胶原材料组成的膜而改善。
附图简述
图1是覆盖待处理的粘膜区域的胶原膜材料修补片的平面图。
图2是显示根据本发明使用的膜的侧视图。
图3是显示根据本发明使用的另一种膜的侧视图。
优选实施方案的详细描述
本发明提供了一种促进粘膜再生的方法。虽然本发明方法通过在具体类型口腔手术后促进口腔中粘膜再生而举例描述，但是应理解的是本发明方法可用于促进具有受损粘膜组织的身体的任何一部分的粘膜的再生。
在优选的实施方案中，促进粘膜再生的方法包括如下步骤：用一片胶原膜材料修补片覆盖待处理的区域，其中所述胶原膜材料由具有一平滑面和与平滑面相对的纤维面的至少一个层组成，所述纤维面使得细胞可在其上生长，其中所述胶原膜优选地进一步包括一具有疏松海绵样结构的第二层，该第二层主要由II型胶原或I型胶原和III型胶原混合物组成。将所述胶原膜材料修补片固定在粘膜缺陷处，优选地缝合，使粘膜再生。
根据本发明，如图1所示，粘膜表面M的缺陷通过将修补片10置于缺陷上并将该修补片固定于缺陷周围的粘膜表面边缘而修补。随后使修补区域再生粘膜。在图1中示出修补片10通过缝合线12固定于粘膜表面M。或者，修补片也可以通过与周围宿主粘膜或待处理区域周围的其它结构粘合而固定在缺陷上，例如使用本领域已知的有机胶或任何其它合适方法固定。
修补片10由一种制备物形成，该制备物包括具有合适的揉曲性以与其所放置的粘膜表面形状紧密配合的胶原膜。在一优选的实施方案中，所述胶原膜包括至少一层胶原层，其具有足够的强度以适于缝合于粘膜并保护粘膜表面在愈合过程中不会发生创伤。
用作本发明的修补片的胶原膜的第一个实施方案如图2中的14所示，膜14包括一单胶原层16，其一侧具有平滑面18，平滑面相对的另一侧具有网纹或纤维面20。平滑面18优选是无孔的，以例如当进食时提供机械保护。纤维面20的构造使得细胞能在其上生长。在使用中，平滑面优选地不接触待处理的区域，而纤维面优选地朝向待处理的区域。
在优选的实施方案中，胶原层16主要是I型胶原、III型胶原或其混合物。这一层的一种合适材料是Biogide，购自本发明的申请人Ed.Geistlich Sohne AG fur Chemische Industrie。Biogide材料在美国专利5,837,278中描述，该文献引入本文作参考。
图3示出可用作本发明的修补片的多层胶原膜14′，这一膜包括如图2所示的第一胶原层16，并进一步包括具有疏松海绵样结构的第二胶原层22。第二胶原层22优选附着于第一胶原层16的纤维面20以放置于粘膜表面，促进粘膜再生。第二层22可由I、II、III、IV或VII型胶原或这些胶原类型的任何组合而形成，但优选主要由I型胶原、II型胶原或I型胶原和III型胶原的组合(例如，95％I型胶原和5％III型胶原)形成。第一层16和第二层22的组合增加了膜14′的厚度，从而易于操作并改善愈合。膜的厚度可根据应用而变换，但典型的范围为约0.5毫米至约5毫米之间，优选范围为约2毫米至约5毫米之间，厚度为3毫米是最优选的。
图2和图3所示的实施方案中的第一层16可以各种方式产生，包括但不限于美国专利5,837,278中描述的方法步骤；通过浆液的脱气和真空干燥(薄膜样透明膜)；或使用压缩海绵。第一层16可由I、II、III或IV型胶原或这些胶原类型的组合而制成。
图3所示实施方案中的海绵样第二层22优选地是冻干的胶原浆。第二层22可由I、II、III、IV或VII型胶原或这些胶原类型的组合而制成。优选地，第二层由I型胶原、II型胶原或I型和III型胶原的混合物制成。
第二胶原层22可从牛或猪材料形成，优选地从猪材料形成。
在图3所示实施方案中，第一膜层16和第二膜层22可以任何合适的方式相连或组合。三种合适的组合方法的例子包括：用纤维蛋白胶将第一膜层附着于第二膜层；用胶原将将第一膜层附着于第二膜层；或用第二膜层所需胶原类型的胶原浆涂覆第一膜层，然后冻干该组合。
如果需要，促进粘膜再生的生长因子如EGF(表皮生长因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、β-FGF(成纤维生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)、TGF-β(转化生长因子)可掺入膜，和/或加至置于粘膜一侧的膜表面。
实施例1 制备修补片
(A)第一膜层根据WO93/11723(纯化的I型胶原的制备，猪皮)所述程序产生，该文献引入本文作参考。最后洗涤的纤维不进行冻干，而是将该材料真空脱气并倾注于连动杆(trace)中，在室温层流干燥。
(B)第二膜层根据WO93/11723(纯化的I型胶原的制备，猪腱)所述程序产生。最后洗涤的纤维不进行冻干，而是将该材料用盐酸酸化至pH2.9-3.2，至干含量为1.2-1.8％。这一浆液冻干成海绵。
(C)通过用上述pH2.9-3.2浆液覆盖第一膜层的一侧而组合第一和第二膜层。海绵在浆液上并冻干。
实施例2 制备修补片
(A)第一膜层根据美国专利5,837,278所述程序产生。
(B)第二膜层根据制备II型胶原浆的WO99/19005所述程序产生，该文献引入本文作参考。具体地，来自新屠宰的猪的冷冻软骨制备物用冷水洗涤足够长时间，使pH值至pH3-3.5。随后将这一材料均质5次，用水稀释，得到干含量为0.5-2.O％的匀浆物。
(C)通过将来自前一步骤的浆液倾注在第一层上而组合第一膜层和第二膜层。约30分钟后，将组合的产物冻干。
实施例3 制备修补片
(A)第一膜层根据美国专利5,837,278所述程序产生。
(B)通过用1N氢氧化钠溶液在约20℃处理来自猪的脱脂皮层约4小时，然后用1N盐酸溶液在约20℃处理约2小时，并如实施例2所述均质而产生第二膜层。
(C)通过将来自前一步骤的浆液倾注在第一层上而组合第一膜层和第二膜层。约30分钟后，将组合的产物冻干。
实施例4 制备修补片
(A)通过用丙酮除去水而干燥实施例3中获得的浆液，将丙酮湿润的产物在两个玻璃板中加压，用低于约1毫巴的压力在约35℃真空除去丙酮约48小时，产生第一膜层。
(B)通过等量混合实施例2和3中的第二步骤产生的浆液并冻干混合物成海绵而产生第二膜层。
(C)用纤维蛋白胶粘合而组合第一膜层和第二膜层。
实施例5 测试
所研究的膜材料制备自生产成两层的猪I型和III型胶原。胶原膜的深层或称内层(第二层)有一粗糙表面，与宿主手术准备部位相接触以便于血凝块的组构，促进新血管发生。双层胶原膜的外层(第一层)具有平滑结构，其具有合适弹性以适于缝合于宿主粘膜边缘并保护移植(修补)材料在生物降解和愈合过程中不会发生口腔创伤。所用部位是成年Papio anubis狒狒所有4个口腔粘膜四分体(quadrants)。在尖牙和前磨牙前庭深处粘膜下产生一3cm×2cm直径的椭圆切口。这一模型提供了用于前庭加深部位评价的12个样本。
另外，用无牙上颌骨的附着粘膜区确定所述材料用作在无牙牙槽嵴区域重新获得附着粘膜的基础时的效率。在3个动物中，在延伸自颊表面的嵴顶和腭表面上1cm的嵴顶双侧切下1cm×3cm区域。
将膜材料放入并用4-0单纤尼龙间断缝合将其固定于宿主粘膜表面边缘。(每个胶原膜放置物的总缝合数从10至16变化)。动物给予由肌肉内青霉素、普鲁卡因150000单位和苄星青霉素150000单位组成的术后抗生素保护，共4天。动物饮食如常，并允许在大笼中自由活动。
在3周和6周结束时制备前庭手术部位生物活检样本。在第3周，制备每个动物的一侧(2个四分体)上的生物活检样本，其从上部天然残留宿主粘膜表面延伸通过膜材料表面直至相反侧的内部移植物宿主边缘。样本表面合适地用缝合线标记以定位进行组织学检查。生物活检区用间断缝合术闭合，以使其愈合。使每个动物的2个四分体保持6周，此时切下整个区域，剥离粘膜表面并放在一起获得原发闭合(primary closure)。
附着粘膜区域的生物活检样本类似地获得：每个动物的一侧在第3周取样，另一侧在6周取样，每个时期总共3个样本。
在术后第14天除去所有的缝合线。这些动物的临床术后过程是顺利的，没有发炎或感染的临床症状，膜材料也没有脱落。膜留在原位，且边缘表明从宿主粘膜外周表面发生的逐渐的上皮再形成。从术后第2周至第3周临床可见残留膜残留区域。在第6周，整个手术部位发生上皮再形成，具有正常出现的粘膜。
在3周结束时的生物活检样本显示边缘上皮再形成，其具有正常的钉突(retepeg)形成。可看到上皮迁移过膜表面的胶原降解区。在测量约.5cm×.3cm的膜的中心部分(来自原始大小3×2cm)无上皮再形成。
在6周样本中，对修补区的完整切割和生物活检表明，有完全发育通过修补区的优异粘膜表面，粘膜下有新血管发生，并且有正常分层的鳞状上皮形成。有完全接受膜材料的迹象。在表面上皮下仅可见非常小的残留胶原。所用染色为Mason′s Trichrome以及苏木精和曙红。
从6周样本制备多个切片以保证对全部修补区的完全评价，从而保证在组织学检查过程中没有残留膜材料未被检测到。
当修补片置于上牙槽嵴和腭上颌表面中时，示出与在前庭深度类型测试部位所见类似的膜材料置换。在3周，有残留膜材料的迹象，其位于修补部位的中心部分。在修补部位的外周边缘可见成纤维细胞和迁移的上皮。在6周样本中，在腭表面、牙槽嵴顶和牙槽嵴的颊面上的所有样本中均可见新附着的粘膜。这表明材料被完全接受，且有优异的附着粘膜再形成。
组织学外观表明在上颌后区中的这一材料与根形植入物一起可用于重建附着粘膜，虽然在这一测试中未具体研究这一区域的效率。
动物中所选的用于前庭移植的部位是位于上颌和下颌尖牙以及前磨牙前庭粘膜区。这一区域在Papio anubis狒狒饲养和咀嚼过程中特别易于发生创伤的部位，其可作为应激产生测试部位。因此，在如下情形中放置材料，即非常可能被产生的感染和修补片的移动损害。这一现象在任何测试部位均没有发生，且材料保持在原位，并被宿主细胞活性的非常温和过程生物降解。
基于这些测试，可以总结出用胶原膜作为本发明的修补片是自体软组织移植物的非常好的替代物。某些类型的异质(alloplastic)或异种(allogeneic)表面敷料易于产生伤口挛缩并形成疤痕。另外，人工皮肤表面敷料也易于生物降解和过早脱落，或者保留时间过长导致迟发炎性应答。本发明未见疤痕形成或延长的炎性应答，也没有使用手术敷料有时会发生的粘膜下纤维化。
因此，这一材料看来可用作游离粘膜移植物或分层皮片移植物的替代物，以保持前庭高度和在根形植入物区域恢复附着粘膜。这一方法的一些显然优势为膜将(a)生物降解，而无负面炎性应答，(b)促进所述区域再生正常粘膜，(c)技术上适用于手术操作并显示对缝合的耐受。
由于所述实施方案可进行许多修改和变化，因此上述描述和附图中所示的所有部分均是举例性而非限制性的。

Claims (9)

1、一种由衍生自天然含胶原组织的纯化胶原材料组成的膜在制备一种用于覆盖粘膜损伤区域以促进粘膜再生的粘膜再生制备物中的用途，其中所述膜包含一个第一层，该层包括一外部平滑面，并进一步包括与所述平滑面相对的纤维面；所述膜包含一多层胶原膜材料片，其包括附着于所述纤维面的胶原材料第二层。
2、权利要求1的用途，其中所述第一层主要是I型胶原，III型胶原或其混合物。
3、权利要求1的用途，其中所述第二层包含I型胶原，II型胶原，III型胶原，IV型胶原，VII型胶原或其组合。
4、权利要求1的用途，其中所述膜厚度为0.5-5mm。
5、权利要求3的用途，其中所述第二层主要包含I型胶原。
6、权利要求3的用途，其中所述第二层主要包含II型胶原。
7、权利要求1的用途，其中膜携带至少一种粘膜再生生长因子。
8、权利要求7的用途，其中所述至少一种生长因子选自于表皮生长因子，胰岛素样生长因子，成纤维细胞生长因子，血小板衍生生长因子，转化生长因子，或其混合物。
9、权利要求1的用途，其中所述粘膜损伤是口腔粘膜损伤。
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