CN1268634C - 自寻址、自组装微电子集成系统、组成装置、机理和分子生物学分析和诊断的方法 - Google Patents

自寻址、自组装微电子集成系统、组成装置、机理和分子生物学分析和诊断的方法 Download PDF

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Abstract

设计和制造了一种自寻址、自组装微电子装置以显微尺寸主动进行和控制多步和多路分子生物反应。这些反应包括核酸杂交、抗体/抗原反应、诊断和生物聚合物合成。使用微-光刻技术和微-加工技术都可以制造出该装置。该装置可以电子控制特异结合体向特异微定位区的迁移和附着。该特异结合体包括分子生物分子，例如核酸和多肽。装置可以随后控制在寻址的特异微定位区上的分析物或反应物的迁移和反应。该装置能够富集分析物和反应物，去除非-特异性结合分子，对DNA杂交反应提供严紧控制，并改善分析物的检测。该装置在电子上可以被复制的。

Description

自寻址、自组装微电子集成系统、组成装置、机理和 分子生物学分析和诊断的方法
发明领域
本发明涉及一种在显微尺寸可以有效进行和控制多步和多路反应的自寻址、自组装微电子集成系统的设计、制造和应用。具体说来，这些反应包括分子生物学反应，例如核酸杂交、核酸扩增、样品制备、抗体/抗原反应、临床诊断和生物聚合物合成。
相关申请资料
本发明申请是1995年9月27日递交的申请序列号为08/534,454、名称为“用于主动式可编程阵列式装置的设备和方法”的部分连续申请，上述申请是1994年9月9日递交的申请序列号为08/304,657，名称为“自动分子生物诊断系统”，现已授权为美国专利号5,632,957(1997年5月20日递交的申请序列号为08/859,644，名称为“用于主动式、可编程电子微生物学系统的控制系统”的连续申请)的部分连续申请，所述申请是1994年7月7日递交的申请号为08/271,882，名称为“用于分子生物分析及诊断系统的电子严紧控制方法”现已授权的部分连续申请，所述申请是1993年11月1日递交的申请号为08/146,504，名称为“用于分子生物分析及诊断系统的主动式可编程电子装置”，现已授权为美国专利号5,605,662(1996年10月4日递交的申请序列号为08/725,976，名称为“用于聚合物电子合成”的连续申请)的部分连续申请，也是1996年9月6日递交的申请序列号为08/708,262，名称为“用于优化电子杂交反应的方法和材料”的部分连续申请。
发明背景
分子生物学包括很多种用于分析核酸和蛋白质的技术，其中有许多种形成临床诊断试验的基础。这些技术包括核酸杂交分析、限制酶分析、基因序列分析、和核酸和蛋白质的分离和纯化(见，例如，J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，和T.曼尼阿蒂斯，分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
许多分子生物学技术涉及对大量的样品进行大量的操作。这些操作通常是复杂和耗时的，并一般需要高度的准确性。许多技术由于缺少灵敏性、特异性或再现性而局限了其应用。例如，迄今为止由于灵敏性和特异性问题限制了核酸杂交的实际应用。
核酸杂交分析一般涉及用探针在大量的非靶核酸中检测很少量的特异靶核酸(DNA或RNA)。为了保持高的特异性，杂交通常在非常严紧的条件下进行，该严紧的条件通过温度、盐类、去垢剂、溶剂、促溶剂和变性剂各方面的结合来达到。
已经在多种滤膜和固体载体形式上进行了多样品核酸杂交分析(见G.A.Beltz等，酶学方法，100卷，B部分，R.Wu，L.Grossmam，K.Moldave编，学院出版社，纽约，19章，pp 266-308，1985)。一种形式，即所谓的“点渍法”杂交，涉及靶DNA与滤膜的非-共价附着，随后与放射性同位素标记的探针杂交。“点渍法”杂交获得广泛的应用，并发展了许多变型(见M.L.M.Anderson和B.D.Young，核酸杂交实用方法，B.D.Hames和S.J.Higgins编，IRL出版社，华盛顿特区，第4章，pp.73-111，1985)。“点渍法”杂交进一步发展用于基因突变的多元分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，见EPA 0228075，1987年7月8日)，以及用于检测重叠克隆和构建基因图谱(G.A.Evans，美国专利#5,219,726，1993年6月15日)。
另一种形式，即所谓的“夹层”杂交，涉及把寡核苷酸探针共价连接到固体载体上，并用它们来俘获和检测多元靶核酸。(M.Ranki等，基因，21，pp 77-85，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund，英国专利申请GB 2156074A，1985年10月2日；T.M.Ranki和H.E.Soderlund，美国专利#4,563,419，1986年1月7日；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale，PCT WO 86/03782，1986年7月3日；Y.Stabinsky，美国专利#4,751,177，1988年1月14日；T.H.Adams等，PCT WO 90/01564，1990年2月22日；R.B.Wallace等，6，核酸研究，11，p3543，1979；和B.J.Connor等，80，美国科学院院刊，pp278-282，1983)。这些形式的多元变型被称为“反点渍”。
利用目前的核酸杂交形式和严紧控制方法，即使使用最敏感的受体组(酶、荧光基团、放射性同位素、光度计、光子计数器、闪烁计数器等)，仍然很难检测靶核酸的低拷贝数(即，1-100,000)。
这一困难是由直接探针杂交有关的几个根本问题引起的。一个问题与杂交反应的严紧控制有关。杂交反应通常在严紧条件下进行以实现杂交特异性。严紧控制的方法主要涉及在杂交和随后的洗涤步骤中温度、离子强度、和变性剂的优化。另人遗憾的是，这些严紧条件的应用引起用于检测的杂交探针/靶复合物的数量显著降低。
另一个问题与在大多数样品中DNA的高度复杂性有关，尤其是在人基因DNA样品中。当一个样品包含与特异靶序列紧密相关的大量序列时，即使是最专一的探针序列也会与非靶序列部分产生大量的部分杂交。
第三个问题与探针与其特异靶之间的不利杂交动力学有关。即使是在最佳的条件下，大多数杂交反应也是在相对低浓度的探针和靶分子下进行的。另外，探针经常不得不与靶核酸的互补链竞争。
大多数杂交形式的第四个问题是非特异性背景信号的水平较高。这是由DNA探针与几乎所有材料的亲和性造成的。
这些问题，不管是单独还是结合起来，都会导致在上述形式中的核酸杂交的敏感性和/或特异性丧失。这是很令人遗憾的，因为对大多数基于核酸的临床诊断试验来说检测低拷贝数的靶核酸是必需的。
因为在检测低拷贝数靶核酸中的困难，研究机构过分依赖于聚合酶链反应(PCR)来扩增靶核酸序列(见M.A.Innis等，PCR方法和应用指南，学院出版社，1990)。PCR反应产生的大量的靶核酸序列改善了随后的直接核酸探针技术，当然，其代价为步骤冗长和麻烦。
与用直接探针检测低拷贝数靶核酸中常见的困难显著不同的是原位杂交技术。这一技术使得能在单个细胞中检测低拷贝数单一核酸序列。在原位形式中，靶核酸通常以相对高的局部浓度被限制在一个细胞的面积(～20-50μm2)或核的面积(～10μm2)。另外，探针/靶杂交信号被限制在显微和形态学显著区；同在固体载体上相比较这就使得从人工或非-特异性信号区分出正信号较容易。
在某些方面模仿原位杂交，发展了在微型多路或阵列式装置(例如，DNA芯片)上进行多样品核酸杂交分析的新技术(见M.Barinaga，253科学，pp 1489，1991；W.Bains，10生物/技术，pp 757-758，1992)。这些方法通常把特异DNA序列附着到固体载体非常小的特异区域，例如DNA芯片的微孔上。这些杂交形式是传统“反点渍法”和“夹层法”杂交系统的缩微型式。
缩微型式的杂交可以被用来“通过杂交进行序列分析”(SBH)(见M.Barinaga，253科学，pp1489，1991；W.Bains，10生物/技术，pp.757-758，1992)。SBH利用所有可能的n-核酸寡聚体(n-聚体)来识别在未知DNA样品中的n-聚体，然后通过算法分析定位以产生DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，南斯拉夫专利申请#570/87，1987；R.Drmanac等，4基因组，114，1989；Strezoska等，88美国国家科学院院刊10089，1991；和R.Drmanac和R.B.Crvenjakov，美国专利#5,202231，1993年4月13日)。
进行SBH有两种型式。一种型式包括在载体上产生所有可能n-聚体的矩阵，然后该矩阵与靶序列杂交。这是反点渍法的一种形式。另一种型式涉及把靶序列附着到载体上，顺次用所有可能的n-聚体对该载体进行探测。这两种型式都有直接探针杂交的基本问题，并还具有与多元杂交有关的困难。这就不能用直接杂交方法实现“通过杂交进行序列分析”，导致一种所谓的“型式3”，该型式包括一个连接酶步骤。虽然它提供了一定程度的改善，但它实际上代表一种不同的与酶反应步骤有关的机制以识别碱基差异。
Southern在英国专利申请GB 8810400，1988；E.M.Southern等在13基因组1008，1992，建议使用“反点渍”型式分析或对DNA进行测序。Southern使用PCR扩增的基因组DNA确定一种已知的单点突变。Southern还描述了一种用来在SBN的固体载体上合成寡核苷酸的矩阵。然而Southern并没有建议怎样在矩阵上对每一种寡核苷酸实现优化的严紧条件。
Fodor等，364自然，pp 555-556，1993，在固体载体上使用1,024 8聚体寡核苷酸矩阵来对DNA进行序列分析。在这种情况下，靶DNA是一个荧光标记的只含A和C碱基的单链12-聚体寡核苷酸。对于在矩阵上用8-聚体寡聚物进行杂交，12-聚体靶序列的浓度必需是1pmol(～6×1011分子)。结果表现出许多的错配。如同Southern，Fodor等没有致力于解决直接探针杂交的根本问题。这些问题连同需要大量的单一靶12-聚体，表明SBH形式有严重的局限性。
同时，Dramanac等，26科学1649-1652，1993，使用上述第二种型式对几种短(116bp)DNA进行序列分析。靶DNA被附着在膜载体上(“点渍”型式)。每一种滤膜都随后与272个标记的10-聚体和11-聚体寡核苷酸杂交。广泛范围的严谨条件被用来为每一种n-聚体探针实现特异杂交；清洗时间从5分钟到过夜变化。滤膜不得不曝光2到18小时以检测杂交信号。尽管可以使用单靶序列、寡聚体探针的还原形式以及使用能够达到的最严紧的条件，假阳性杂交总率还是达到5％。
Fodor等，251科学767-773，1991，使用光刻技术在一个阵列上合成寡核苷酸。Pirrung等，美国专利#5,143864，1992年9月1日，讲述了在硅基板上以矩阵式大规模光刻固相合成多肽。
在阵列式杂交的另一种方法中，Beattle等，1992年圣地亚哥会议：基因识别，1992年11月，使用微机器人系统把含特异DNA序列的微滴沉积到在玻璃基板上单个的细微制造的样品孔中。通过询问微电极检测设备检测在每一个样品孔中的杂交，该设备用交流电(AC)电场环绕每一单个的微孔。
不管是什么型式，所有目前的微型DNA杂交和SHB方法都不能克服核酸杂交反应伴生的问题。这些方法都需要非常高水平的相对短的单链靶序列或PCR扩增DNA，并即使在在最严紧的条件下也产生高水平的假阳性杂交信号。对于使用短寡核苷酸序列的阵列的多路型式，不可能用任何传统的方法对每一单个序列的严紧条件进行优化，因为这些型式的阵列或设备不能在单个定位区相对于其它定位区改变或调节温度、离子强度或变性剂。必须对设备上所有的序列使用共同的严紧条件。这就导致大量非特异性和部分杂交，严重限制了该设备的应用。当在矩阵上的不同序列的数量增加时，以及当序列的长度降低为10-聚体之下或增加到20-聚体之上，这一问题就变得更加严重。这对于需要大量的短寡核苷酸探针的SBH是尤其令人麻烦的。
通常用电泳技术来分离不同大小、电荷或构型的核酸，电泳技术可以通过在电场中它们不同的迁移率来区分杂交种类。脉冲场电泳在一种介质(例如，凝胶)周围使用多电极布置以分离通过传统的凝胶电泳系统(见核酸凝胶电泳-实用方法，第2版，D.Rickwood和B.D.Hames编，IRL出版社，纽约，pp.101-122，1990)不能解决的非常大的DNA片段。
Pace，美国专利#4,908,112，3月13日，1990，描述使用细微-制造技术以在硅基板上产生毛细管凝胶电泳。多个电极被加进系统内以通过设备中的分离介质移动分子。
Soane和Soane，美国专利5,126,022，1992年6月30日，描述可以使用许多电极通过在试管中含有的凝胶分离介质控制带电分子在混合物中的线性移动。电极必须被安装在试管中以控制在分离介质中分子的移动和位置。
Washizu，M.和Kurosawa，O.，26工业应用IEEE学报6，pp 1165-1172，1990，使用高-频交流(AC)电场在微制造的电极之间产生的电场线中定向DNA分子。然而，他们的工作中禁止使用直流电(DC)场。Washizu，25静电学杂志109-123，1990，描述了使用介电电泳操作细胞和生物分子的方法。细胞可以被融合，生物分子可以沿微电极结构之间AC电压产生的电场线定向。然而，介电电泳方法需要非常高频率的AC(1MHz)电压和低电导率的介质。尽管这些技术可以沿AV场线定向不同大小的DNA分子，但是它们不能区分出同样大小的杂交复合物。
MacConnell，美国专利4,787,936，1988年11月29日，描述以一个加速度退火核酸分子的方法和装置。核酸探针是电泳上可以富集的，有一个各种序列可以结合的表面。未退火的探针分子以电取向的反向从表面区电移出，这样就电泳移离先前在表面上富集的材料的表面。另外在另一方面，该专利描述了沿被结合有序列的表面的各个方向相继移动富集的退火探针分子。
Stanley，C.J.，美国专利5,527,670，于1996年6月18日授权，要求优先权到1990年9月12日递交的GB 9019946，1991年6月14日递交的GB 9112911。Staley公开了一种用于使在电化学室内的活性双链核酸材料变性成其单股的方法。用一个电极对核酸材料施加电压对核酸进行电处理。建议使用促进剂化合物，例如甲基紫精加速变性。该方法被建议用于通过杂交与标记探针检测核酸或通过聚合酶链反应或连接酶链反应对DNA进行扩增。
最近，已经尝试制造基于微芯片的核酸矩阵以通过杂交使得基因信息被迅速分析。许多这些装置利用了在最近40年半导体工业发展的复杂的硅制造工艺。在这些装置中，许多平行的杂交可以在固定化的俘获探针上同时进行。杂交的严紧性和速率通常通过温度和溶液和洗涤液的盐浓度来控制。虽然探针密度很高，这种“被动”微杂交方法有几个局限性，尤其是对于在反点渍型式定向的矩阵、对于碱基错配分析、以及对于通过杂交应用测序和重新测序来说更是如此。
首先，因为所有的核酸探针都同时处于相同的条件下，俘获探针必须具有类似的熔化温度，以达到类似的杂交严紧性水平。这就对俘获探针的长度、GC含量和二次结构造成了限制。另外，必须选出单链拔片段进行真正的杂交，就需要极长的杂交和严紧程度(见，例如，Guo，Z，等，核酸研究，V.22#24，pp 5456-5465，1994)。
其二，对于单个碱基错配分析和重测序应用，必须在矩阵上有相对大量的俘获探针(＞16)以询问在给定靶序列中的每一位置。例如，一个400碱基对的靶序列就需要有超过12,000个不同的探针序列的矩阵(见，例如，Kozal，M.J.，等，天然药物，V.2，#7，pp 753-759，1996)。
其三，对于许多使用大靶片段的应用，包括PCR或其它扩增子，不能被直接杂交到矩阵上。往往，需要扩增作子复杂的二次处理，包括：(1)进一步扩增；(2)转化成单链RNA片段；(3)减小尺寸以缩短寡聚体，和(4)复杂的分子生物/酶反应步骤，例如ligation反应。
其四，对于被动杂交，其速率与在溶液中的靶片段的起始浓度成正比，因此，就需要非常高浓度的靶片段以实现快速杂交。
其五，因为，控制杂交条件的困难，单个碱基的区别通常被局限于用中心placed差异俘获20碱基或更低的寡聚体序列(见，例如，Chee’96；Guo，Z，等，核酸研究，V.22，#24，pp 5456-5465，1994；Kozal，M.J.等，天然药物，V.2，#7，pp 753-759，1996)。
从上述讨论中可以很明显看出，已经进行了大量的尝试以提供有效的技术进行多步、多路杂交和其它分子生物学反应。然而，至少由于上述原因，这些技术已经被证明是有缺陷的。尽管长期以来已经认识到需要一种有效的技术，但这之前一直没有满意的解决办法。
发明概述
为了弥补这些局限性，一种基于微电子的核酸矩阵利用电场作为独立参数来控制核酸相互作用的迁移、杂交和严紧性。它们是“主动式”的矩阵装置，其中它们利用微电子以及微制造技术。这样，除了盐、pH、温度和促溶剂外，电场强度(尤其是电流水平和密度)提供了一种精确控制的和连续可变参数，用来调节核酸之间的相互作用。
本发明涉及一种在显微尺寸可以有效进行和控制多步和多路反应的自寻址、自组装微电子集成系统的设计、制造和应用。这些反应包括，但不限于大多数分子生物学方法，例如例如核酸杂交、抗体/抗原反应、细胞分离、和相关的临床诊断。
另外，该装置能够进行多步结合和复合合成，包括，但不局限于，不同寡核苷酸或多肽在特异微定位区的合成。
另外，本发明的微电子装置和方法在被认为通过任何被动或传统的杂交技术是不能杂交或非-严紧条件下，允许进行迅速的多路杂交和在全长DNA片段和PCR扩增子中识别出单个碱基的错配。
使用微光刻和微加工技术都可以制造出该装置。该装置在表面上有一个可寻址的显微定位矩阵；每一个微定位区都能够电控制和定向特异结合体向自身的迁移和附着(例如，核酸、抗体)。所有的微定位都可用其特异的结合体寻址。使用这些装置，系统可以在最小外界干扰下自组装。
在本发明起到很重要作用的是覆盖在电极上的离子可透过的“渗透”层。这一渗透层允许核酸附着从而允许进行固定化。更重要的是，渗透层分离附着的或被捆绑的寡核苷酸并从立即在电极表面产生的高反应电化学环境中杂交靶DNA序列。这一高反应电极表面和其电化学产物能够迅速破坏与其接触或离它很近的DNA探针和靶DNA序列。因此这一渗透层就允许要被“电瞄准”的寡核苷酸和DNA片段在实际的电极表面上并进行杂交以锚定互补寡核苷酸，同时免受反应表面和环境的破坏。
更重要地是，形成微定位区结构的微电极和渗透层的设计，允许在被限定的区域中达到高的电流强度，同时将电极自身产生的副作用降至最小。
自寻址装置能够控制和有效进行多种试验和反应。分析物或反应物能通过自由场电泳迁移到任何特异的微定位区，在微定位区分析物或反应物被有效富集并在所述微定位区与特异结合体反应。因为富集效应检测特异分析物或反应物的敏感性就提高了。通过颠倒微定位区的极性，就可以去除任何未结合的分析物或反应物。更重要的是，在一个微定位区产生精确控制的高电流水平或强度的能力，允许选择性地对DNA片段进行“去杂交”，达到单碱基错配或甚至完全互补序列去杂交的水平。因此，该装置能够改善试验和反应的特异性。
该装置的主动特性为在每一特异微定位区发生的杂交反应(或其他亲和反应)的所有方面都提供了独立的电控制。这些装置为影响杂交反应提供了新机制，被称为电严紧控制(ESC)。对于需要不同严紧条件的DNA杂交反应，ESC克服了传统矩阵技术的固有局限性。本发明的主动式装置能电在每一个微定位区生产“不同的严紧条件”。因此，所有的杂交都优选在相同的原溶液中进行。这些活性装置与传统的多路杂交矩阵和DNA芯片不同。尽管传统的矩阵在每一位点都定位有不同的探针或靶DNA；但是在矩阵上的所有位点都具有相同的共同反应或温度、缓冲液、盐浓度和pH的严紧条件。在反应或严紧条件中的任何变化，都会影响在矩阵上的位点。尽管复杂的光刻技术可以用来制造矩阵，或可以结合微电子传感元件进行检测，但是传统的装置是被动式的，不能控制或影响真正的杂交过程。本发明的主动式装置允许每一个微定位区起到完全独立的检测或分析位点的作用(即，它们在每一个定位区形成与“试管”等效的效果)。多元杂交反应能用最小的外界物理操作来进行。另外，不必改变温度，也显著降低了所需多次洗涤步骤。
另一个重要的考虑是迁移和杂交缓冲液的组成。为了便于自由溶液电泳中核酸的迅速移动，利用的是低电导率的缓冲液。为了达到低电导率和保持良好的缓冲容量，使用在其pI几乎没有或没有净电荷的两性离子缓冲液。这些缓冲液，通常具有低于100mS/cm的电导率。通常在分子生物学使用的缓冲液的电导率为1000倍以上，例如6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)。低电导率和没有净电荷的两性缓冲液并不能最好地屏蔽核酸磷酸二酯骨架电荷，因此，在被动条件下，并不能有助于杂交。尽管我们并不希望局限于任何特异的理论，但是据认为这有可能有助于避免变性核酸在迁移前的自我退火。然而，经验上发现，这些缓冲液选择性有助于电加速杂交。
因此，该公开的装置能够用完全和精确的电子控制进行多步和多路反应，优选在总微处理器控制下进行(即，用计算机运行)。多步和多路反应的特异性和敏感性就在该公开的设备上在特异微定位区上得到显著的提高。
该装置也有助于使用附属的光成像或扫描检测系统在每一个微定位区检测杂交的复合物。直接检测DNA的集成的光电子或电子传感元件也可以被结合进该装置自身中。这就是说，光波导管、激光、和检测器可以微制造成APEX芯片自身，因为它是一个基于硅的结构。
如果需要的话，写有特异结合体的原装置可以被电复制或拷贝到另一个基本装置上。因此，这就使得矩阵装置能够迅速制造。
本发明可以使用与本发明的目的一致的任意大小或形状的微定位区。在本发明优选的实施方案中，使用的微定位区在亚-毫米(10-100微米)的范围内。“特异结合体”通常意味着任何对另一个分子、大分子或细胞有特异亲和性通过共价结合或非-共价结合的生物或合成分子。优选地，特异结合体包括(或者是根据特性或者是根据修饰)一个官能化学基团(伯胺、巯基、醛等)、一个共同或单一序列(核酸)，一个抗原决定部位(抗体)、一个半抗原、或一个配基，能够共价反应或非-共价结合到在微定位区表面上的共同官能团。特异结合体包括，但不限于：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、合成寡核苷酸、多肽核酸(PNA)、抗体、蛋白质、多肽、凝集素、修饰的多糖、细胞、合成复合大分子、官能化的毫微结构、官能化的微结构、合成聚合物、修饰/阻断核苷酸/核苷、修饰/阻断氨基酸、荧光基团、发色团、配基、螯和物和半抗原。
“严紧性控制”意思是通过改变一些物理参数能够区分特异和非特异结合相互作用。在核酸杂交的情况下，通常用温度控制严紧性。反应在特定的双链杂交链熔化温度(Tm)或其附近进行。
因此，本发明的一个方面是一种有电子编程矩阵和自寻址显微微定位区。每一显微定位区包含一个在下面作用的直流电(DC)或基片支撑的DC/AC微电极。每一微定位区的表面有一个小反-离子能自由通过的渗透层，和一层与特定结合体共价结合的附着层。这些单一设计特性为装置提供了下列重要特性：(1)使得可控制的官能DC电极保持在微定位区之下；(2)允许进行电泳迁移；(3)在电极(金属)界面把亲和或结合反应从电化学和反电解反应分出来。应当强调的是，在该装置中使用的微电极的首要的功能是向特异定位区提供结合和反应物的电泳推动力。
“矩阵”或“阵列”意思是在装置上安排寻址定位区。可以以两维矩阵、三维矩阵或其它矩阵形式安排定位区。定位区的数目可以从几个到至少成百上千个。最重要的是，每一个定位区都代表一个完全独立的反应位点。
在第二方面，本发明的特征在于一种把结合体迁移到装置上的任何特异微定位区的方法。当启动后，微定位区可以直接影响任何带电的官能化的特定结合体的自由场电泳迁移。在接触到特定的微定位区时，官能化的特异结合体立即共价附着到特异微定位区的附着层表面。其它微定位区可以通过对带电分子保持相反的电势而同时得到保护。该步骤可以迅速进行直到所有的微定位区都被其特异结合体访问。
“带电官能化特异结合体”意思是化学反应性的(即，能够共价附着到定位区)和带净电荷(正或负)的特异结合体。
本发明的第三方面的特征在于一种在装置的任何特异微定位区富集分析物或反应物并与之反应的方法。在特定结合体附着后，在每一个微定位区下的微电极继续以直流电的模式起作用。这一独特的特性允许在保持与分析物或反应物分子相反电荷的任一特异微定位区上游离在溶液中的相对稀释的带电分析物或反应物分子迅速以连贯或平行的方式被迁移、富集、和反应。特异微定位区可以通过使它们保持相同的电荷而被保护或屏蔽。这种能在选定的微定位区富集稀释的分析物或反应物分子的能力大大加速了在这些微定位区的反应速率。
当完成所需的反应后，可以颠倒微电极的电势以从微定位区去除非特异性分析物或未反应的分子。
特异分析物或反应产物可以从任何微定位区释放出来，并被迁移到其它定位区进一步分析；或储存在其它可寻址定位区；或完全从系统中去除。
从这些微定位区排斥非特异体和对序列去-杂交的能力也能显著改善在特异微定位区随后对分析物分析。
本发明的第四个方面特征在于一种改善核酸杂交反应的效率和严紧性的方法，包括步骤：
迅速在杂交要发生的特异微定位区浓缩稀释的靶DNA和/或探针DNA序列；
迅速从杂交已经发生的特异微定位区去除非特异性结合靶DNA序列；
迅速从杂交已经发生的特异微定位区去除竞争靶DNA序列；
通过电流水平和强度调节电严紧控制(ESC)以部分去除杂交的DNA序列(大于一个碱基错配)；
使用在8-聚体到21-聚体范围内的探针(例如，识别点突变)通过电流水平和强度调节ESC以改善单个错配杂交的分辨力。
通过电流水平和密度使用ESC利用在常规步骤使用范围(例如，大于21-聚体和短于8-聚体)外的寡核苷酸点突变探针(例如，22-聚体到30-聚体和更长)。
通过电流水平和密度应用ESC以区分单核苷酸多态性(SNP)。
使用ESC以在俘获探针寡核苷酸的矩阵上改善扩增的靶DNA和RNA序列的总杂交。
使用ESC以在俘获探针寡核苷酸的矩阵上以反点渍型式改善任一靶DNA或RNA序列的杂交。
使用ESC以在俘获探针寡核苷酸的矩阵上以包层型式改善任一靶DNA或RNA序列的杂交。
使用ESC以在核苷酸探针的矩阵上以更标准的点渍型式(在阵列上的靶序列，加入的报道探针)改善任一靶DNA或RNA序列的杂交。
使用ESC以在核苷酸探针的矩阵上以同源/异源杂交型式改善靶核酸序列的杂交。
使用ESC以在基因表达应用的核苷酸探针的矩阵上改善靶RNA序列的杂交。
对在相同的主体溶液和相同的温度下发生的单个杂交应用各自的ESC。
使用ESC以改善未杂交靶DNA序列与俘获探针寡核苷酸的矩阵的杂交。
本发明的第五方面特征在于一种在微定位区复合合成生物聚合物的方法。
本发明的第六方面特征在于从一个原装置复制矩阵的方法。
本发明的第七方面特征在于一种电进行样品制备和把靶DNA迁移到装置的分析元件的装置。
本发明的第八方面特征在于一种使用最小的射流电传递试剂和反应物的装置。
本发明的第九方面特征在于一种进行分子生物学和DNA扩增反应(例如，限制切开反应、DNA/RNA聚合酶和DNA连接酶靶扩增反应)的装置。
本发明的第十方面特征在于一种能测定大小和识别限制片段(例如，进行电限制片段长度多态性和DNA指纹分析)的装置。
本发明的第十一方面特征在于一种进行抗体/抗原和免役诊断反应的装置。
本发明的第十二方面特征在于一种能够进行寡核苷酸和肽的复合合成的装置。
本发明的第十三方面特征在于一种选择性结合细胞、处理杂交细胞、溶解和从细胞中去除DNA，或在细胞内进行原位杂交。
本发明的第十四方面特征在于使用辅助有光、光电或电子检测系统或自寻址微电子装置或集成光、光电或电子检测系统的自寻址微电子装置检测和分析在访问的微定位区发生的反应的方法。
本发明的第十五方面特征在于在任何被动或常规杂交技术基本上被认为不能杂交和非严紧性的条件下允许迅速多路杂交和在全长双链或单链DNA片段、RNA片段、PCR扩增子和SDA扩增子识别出单碱基错配的装置和方法。
本发明的第十六方面特征在于在任何被动或常规杂交技术基本上被认为不能杂交和非严紧性的条件下结合缓冲液和电解化合物(包括但不局限于：组氨酸、二组氨酸、组氨酸肽、混合的组氨酸肽和其它低电导/DNA螺旋稳定化合物)的电杂交方法，使核酸片段(DNA、RNA等)产生迅速的迁移和杂交。
本发明的第十七方面特征在于在任何被动或常规杂交技术基本上被认为不能杂交和非严紧性的条件下允许多路杂交和识别多个重复序列(二-、三、四等)，包括在核酸片段中的串联重复(STR)的装置和方法。
本发明的第十八方面特征在于允许以原位型式进行迅速多路杂交的装置和方法。
本发明的第十九方面特征在于可以结合到允许对所谓的“制造你自己的芯片”产品和应用的APEX芯片装置的寻址的仪表系统的装置和方法。
本发明的第二十方面特征在于含有助于保持DNA杂交稳定性的化合物的改善的渗透层，这些化合物包括但不限于组氨酸、组氨酸肽、聚组氨酸、赖氨酸、赖氨酸肽和其它阳离子化合物或物质。
因为本发明的装置是主动式可编程电子阵列，缩写“APEX”被用来描述或指出这些装置的独特特性。APEX是微光刻生产的“芯片”和微-加工的装置的缩写。
APEX微电子装置和芯片的主动式特性使得我们创造了一种能进行更多种分子生物反应的新机制。包括实现线性和指数倍增或靶DNA和RNA分子扩增的新方法。
该装置为(1)在室温(例如，大大低于其Tm点)下共同的缓冲液中选择性变性DNA杂交；(2)在两个各个或更多微定位区迅速前后迁移或移动DNA；和(3)在所需的微定位区选择性地富集特定的反应物、试剂、和酶提供电子机制。这些机制全都涉及进行分子生物和靶扩增型反应的新物理参数。
已经发展了许多电控制分子生物反应的例子。包括：(1)电导向限制酶切除特定ds-DNA序列；(2)电限制性片段分析；(3)用DNA聚合酶电扩增靶DNA；和(4)用DNA和RNA聚合酶电连接和扩增靶DNA序列；和(5)用RNA聚合酶电增殖靶DNA。这些例子是能在APEX装置上进行的分子生物反应和步骤的种类的典型代表。
本发明的其它特点和优点从本发明下面详细的描述和权利要求书中可以明显看出来。
附图简述
图1是用微光刻技术制造的三个自寻址微定位区的横截面图。
图2是一个微光刻方法制造的微定位区的横截面图。
图3是一个自寻址微定位区64芯片的示意图。
图4示出的是允许特定的寡核苷酸共价耦联到微定位区的附着表面的特定附着化学步骤。
图5示出的是微加工的96微定位区装置的放大示意图。
图6示出的是微加工的装置的横截面图。
图7a和图7b示出的是在特定微定位区用来电浓缩分析物或反应物的机理和装置，图7a示出的是在中性条件下的寻址微定位区，图7b示出的是在带电状态下的寻址微定位区。
图8a、8b、8c和8d示出的是有三个特定寡核苷酸结合体(SSO-A，SSO-B，SSO-C)的装置的自导向组装，图8a示出的是被寻址的第一个微定位区(ML-1)、图8b示出的是被寻址的第二个微定位区(ML-2)、图8c示出的被寻址的第三个微定位区(ML-3)，以及图8d示出的是在寻址后组装后的三个微定位区。
图9a、9b和9c示出的是在含有特定DNA俘获序列的微定位区浓缩的样品/靶DNA电控制杂交步骤，图9a示出的是在寻址微定位区上的特定俘获序列，图9b示出的是邻近图9a结构的特异性和非特异性DNA，图9c示出的是邻近微定位区ML-1和ML-3的杂交材料。
图10a和10b示出的是一个电导向的系列杂交步骤，图10a示出的是邻近微定位区ML-3的材料，图10b示出的是邻近微定位区ML-3和ML-5微定位区。
图11a、11b和11c示出的是用来测定单点突变的杂交步骤的电严紧控制(ESC)，图11a示出的是不带电的寻址微定位区，图11b示出的是带负电的微定位区，图11c示出的是有从微定位区ML-3变性的物质的带负电微定位区。
图12a、12b、12c和12d示出的是不使用标记DNA探针，即电控制的荧光染料检测方法检测杂交DNA的示意图，图12a示出的是不带电的微定位区，图12c示出的是有染料的不带电微定位区，图12d示出的是带正电的微定位区。
图13a、13b和13c示出的是装置的电可控制复制示意图，图13a示出的是带负电的寻址微定位区，图13b示出的是两个正对的基片，一个基片是图13a的，另一个是含附着层的配合装置的，图13c示出的是两个基片，每一个基片都有结合到微定位区的序列。
图14a、14b、14c、14d、14e和14f示出的是电导向的寡核苷酸复合合成示意图。图14a示出的是有阻断基团的寻址微定位区，图14b示出的是有一个与去阻断基团结合的阻断基团的寻址微定位区，图14c示出的是在单体C存在下阻断和去阻断寻址微定位区，图14d示出的是与去阻断基团结合的寻址微定位区，图14e示出的是在单体A存在下在微定位区ML-2上去阻断的位点，图14f示出的是在序列末端上有去阻断基团的微定位区。
图15示出的是使用电严紧控制和常规技术对15-聚体碎片进行的12点突变杂交的比较结果图。
图16示出的是电控制的限制片段切除DNA示意图。
图17示出的是使用聚合酶电控制扩增片段DNA的示意图。
图18示出的是设计来进行样品制备和DNA分析的APEX装置示意图。
图19是在电杂交方法中杂交的组氨酸稳定性图解表示。
图20是每秒对1/电导相对荧光增加的图。
图21a和图21b是寡核苷酸对电流图。
图22是杂交的寡核苷酸对时间图。
图23是残留的寡核苷酸以缓冲液为函数的柱形图。
图24a和24b是各种电流和缓冲液以时间为函数的图。
图25是在GABA和组氨酸杂交率以各种电流和时间为函数的柱形图。
图26是在不同的pH下6X SSC和组氨酸中的被动杂交的btrRCA5。
发明详述
前言
本发明的装置和相关方法允许分子生物学和诊断反应在“完全电控制”下进行。在本发明中谈及的“电控制”超过该术语的常规含义。大多数常规的微定位区装置，仪器和检测系统都处在一定的电控制水平。本发明的微定位区不仅处在常规的电控制内，而且更重要的是它们还能在进行分子生物和诊断反应的物理方面直接进行电控制。本发明提供了一种有可编程和寻址显微定位的微电子装置。在优选的实施方案中，每一定位都有一个用来共价附着特定结合体的衍生上表面(即，附着层)，一个中间渗透层，和一个在下面的直流(DC)微电极(可选择运行DC/AC)。在基本的微电子结构最初形成后，该装置能够自引导每一特定的微定位区与特定结合体的寻址。因此，本发明的装置和方法能结合进一个允许有DNA或RNA探针或其它配基的APEX芯片装置寻址的仪器系统中。这种系统允许将允许“制造你自己的芯片”产品和应用。这种产品和应用将对许多研究者和临床诊断、分子生物学、官能基因组和药物发现应用的终端用户非常有用。自寻址装置随后能在其任何微定位区进行单个多步和复合反应。该装置还能进行多步反应，但重要的优点在于每一反应以真正独立的检测位点的当量进行。装置能够电引导和控制分析物和反应物迅速移动和浓缩到或离开其微定位区。装置能电控制各种反应的动力学方法提供了许多新机制和重要的优点和改进。
本发明的定义和实施方案分五部分描述。第一部分“总述”包括在装置中使用的物理参数和机制的各种发现和定义，包括对缓冲液的讨论。第二部分，“基本装置的设计和制造”描述基本的基础微定位区装置的设计和使用微光刻和微加工技术制造装置。第三部分，“装置的自引导寻址”描述装置的自寻址和自组装，特别是特异性结合体迅速迁移和附着到各个微定位区。第四部分，“装置的应用”描述怎样对各种多步、复合和多路反应提供电控制。这一部分也描述了装置的各种用途和应用。第五部分描述在本文公开的各个发明方面的各种实施例。
电泳行为
本发明的装置(指的是APEX装置、微芯片、DNA芯片、微加工装置、样品制备装置、电点渍等)涉及使用DC，也使用DC/AC电场以产生迁移、加速反应性、并改善带电试剂和分析物分子和物品(DNA、RNA、蛋白质、细胞等)的特异性。因此，有关电场对带电分子、电泳迁移的作用的物理参数的基本理解和定义，以及不同缓冲剂和电解液(阴和阳)的特性对本发明是很重要的。对本发明尤其重要的是在邻近电场发射和/或电流强度最高的部位绕微定位区或渗透层发生的物理效应或现象。
许多物理参数涉及在各种类型的电解液和缓冲液中的DNA和其它带电分析物的电泳迁移。本发明的装置基本上是DC(直流电)电子装置，在装置表面上产生电场，并在溶液中产生净电流。另外，许多低频(～0.1到500HZ)DC和DC/AC低频脉冲情况(还是产生净电流)改善总装置性能，试剂和分析物浓缩速率、DNA/RNA杂交速率和效率，以及杂交特异性。另外，使用结合有用来选择细胞和定位特定的高频AC电场，和用于电泳迁移的DC电场的本发明的系统和装置都被公开在集成装置(样品制备等)上操作。高频(KHZ到MHZ)AC电场，不产生净电流、在溶液中不能产生带电分子的电泳迁移。然而，这些产生电场梯度高频AC电场能够导致细胞和其它有不同介电特性的实体沿电场梯度线排列。这一方法被称为介电电泳。
定义-对于DC场(电压大于1.0到1.2伏特)和脉冲DC和DC/AC场，这些介电场的确会在相反(+/-)偏压的微定位区中间或装置上的检测定位区引起带电分子产生电泳迁移。在这种条件下，当使用大于1.0到1.2伏特的电压时装置产生显著的净直流电流。电流的产生被认为是“电泳方法的特征”。在该方法中，沿电场梯度的方向电力使离子或带电颗粒迁移，电流和电压的关系对该方法非常重要。电泳迁移宏观上表明在施加电压下溶液导电，并遵循欧姆定律：
V＝R×I
其中：
V是电势(电压)
R是电解液的电阻[V×A-1＝Ω]
I是电流[安培]
溶液的电阻(R)是电导(L)的倒数，电导可以用电导仪测定。电导取决于测定装置的几何形状、缓冲液/电解液离子的种类和它们的浓度。尽管在分子生物学研究应用中这些的形成电泳技术基础电流/电压关系类似，但是本发明的装置产生的电场在许多情况下处于真正的显微环境中，受这些电场影响的分子有时靠近电场的起点(～1到20微米)。另外，在微定位区检测位点的电解液阴离子和阳离子(Na+，K+、Cl-等)、缓冲剂(磷酸盐、柠檬酸盐、三羧甲基氨基甲烷、组氨酸、半胱氨酸等)、和分析物分子(DNA、RNA、蛋白质、细胞等)在施加电场的过程中经受非常高的电流强度。
本发明的另一方面，这一高的电流强度看来是一个重要的特性，可以被用来从附着或连接到微定位区/渗透层检测位点的DNA序列“电去杂交”互补的部分互补的DNA序列(包括单碱基差异)。这是被称为“电严紧性”的方法的重要机制。第二个电严紧性机制是一个更基本的特性，未结合或未特异性结合的物质能从微定位区检测位点电泳的迁移出来。最后，应当指出的是，本发明的装置和方法利用“电泳迁移”的特性，与“电泳现象”不同，它通常被定义为使用电场使带电分子通过筛分介质分离出来。
某些方面，本发明的装置可以被认为是“微电机”，在装置表面驱动或迁移带电分析物和试剂从一个微定位区到另一个微定位区。另一方面，本发明的装置可以产生高的局部电流密度，可以用来控制、影响、作用和改善在微定位区检测位点上的杂交和去杂交步骤。
本发明的系统、装置和方法具有涉及纯源化电流和电压的各种方法、怎样使用各种电流和电压改善系统的系统的独特的特性。例如，可以提供一个数量几乎不受限制的DC和DC/AC脉冲步骤(线性和对数梯度)，并且看来对试剂和分析物迁移和浓缩、DNA杂交速率、DNA杂交率、和DNA杂交特异性或严紧性。在许多情况下，这些电脉冲步骤DC和DC/AC可以被用来降低或消除在“微电极”表面发生的电泳反应产生的电化学产物的不利影响(包括H+、OH-、O2、自由基等)。
1.1.1电泳迁移与离子强度
在电泳领域已经证明带电分析物种(蛋白质、DNA等)的迁移率对数降低，与电解液的离子强度的平方根成反比(见“毛细管电泳：原理和应用”，R.Kuhn和S.Hoffstetter，Springer-Verlag，1993，83页和图3.16)。在任何给定的核定电场强度下，当电解液浓度相对分析物种(蛋白质、DNA等)降低，分析物将以更快的速率迁移。Issaq等，色谱，Vol 32，#3/4，1991年8月(详见157页图3)通过danysalted氨基酸己经表现了证实了这一效应的类似结果。在P.D.ROSS和R.L.Scruggs，生物聚合物，12卷，231-236页，1964(详见232页图1)表明在不同电解液中的DNA有证实此效应的结果。
离子强度/电导关系-对涉及在溶液中完全溶解的阴离子和阳离子种类(Na+←---→Cl-，K+←---→Cl-等)非缓冲电解液(氯化钠、氯化钾等)，离子强度和电导是相当的，即，电导通常与离子强度成正比。对处于解离状态(例如：2Na+←---→PO4 --2)的电解缓冲液(磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐等)，离子强度和电导通常是相当的，即，电导与离子强度成正比。(缓冲液已经被定义为在添加酸或碱后抗pH变化的化学溶液。见，例如，生物技术词典，第二版，James Coombs，Stockton Press。如书中所述，传统的、基于无机盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、马来酸盐、巴比妥酸盐等被用于生物实验中。)对于有两性离子种类(在其pI无净电荷)缓冲电解液[良好缓冲液(MOPS、HEPES、TAPS、麦黄酮、N-二[羟乙基]甘氨酸)、氨基酸缓冲液、两性电解质等]，在等电点(pI)和(pKa)之间的每个pH单位差异电导基本上将降低10倍。例如，在其两性离子状态(-OOC-CH(R)-NH3+)的氨基酸的电导值将比完全是净正电荷(HCOOC-CH(R)-NH2 +←---→X-)、或净负电荷(Y+←---→-OOC-CH(R)-NH2)的“氨基酸部分”的电导低约1000倍。因此，当它偏离pI，在氨基酸部分就形成形式上的负或正电荷，电导和离子强度之间就开始产生关联。然而，当在或邻近pI，电导将比给定离子强度或浓度所希望的更低。当在或邻近其pI使用，电泳的内容就称良好缓冲液和氨基酸缓冲液为“在高离子强度或浓度有低电导”(见“毛细管电泳：原理和应用”，R.Kuhn和S.Hoffstetter，Springer-Verlag，1993，88页)。通常使用的电泳缓冲液“三羧甲基氨基甲烷-硼酸盐”的确具有比从其离子强度或浓度所预计的显著低的电导。这可能是由于“三羧甲基氨基甲烷阳离子”和“硼酸盐阴离子”在溶液中形成相对稳定的两性复合物。测定100mM的三羧甲基氨基甲烷-硼酸盐溶液的电导是694μS/cm，比从其离子强度预计的电导低约20倍，并大致相当于5mM磷酸盐或氯化钠溶液。表1表示的是许多迁移缓冲液的电导测定值。
                                             表1
  溶液/缓冲液   测定值1   测定值2   测定值3   平均/标准偏差
  10mM MgCl21mM MgCl20.1mM MgCl210mM NaCl1mM NaCl0.1mM NaCl10mM NaPO41mM NaPO450mM TRIS10mM TRIS250mM HEPES25mM HEPES3.3mM柠檬酸钠5mM琥珀酸钠5mM草酸钠10mM乙酸钠250mM半胱氨酸Milli-Q水   1.95mS/cm174μS/cm16.9μS/cm1.07mS/cm112μS/cm8.80μS/cm1.40mS/cm122μS/cm3.50mS/cm572μS/cm141μS/cm9.16μS/cm964μS/cm1.05mS/cm1.02mS/cm901μS/cm27.4μS/cm＜0.5μS/cm   2.02mS/cm208μS/cm16.7μS/cm1.10mS/cm115μS/cm8.98μS/cm1.44mS/cm128μS/cm3.14mS/cm562μS/cm144μS/cm9.44μS/cm964μS/cm960μS/cm1.03mS/cm917μS/cm17.3μS/cm   2.13mS/cm177μS/cm18.3μS/cm1.18mS/cm111μS/cm10.5μS/cm1.48mS/cm136μS/cm3.40mS/cm583μS/cm158μS/cm10.5μS/cm1.03μS/cm1.01mS/cm1.12mS/cm983μS/cm23.5μS/cm   2.03+/-0.09mS/cm186+/-18.8μS/cm17.3+/-0.87μS/cm1.12+/-0.057mS/cm112.7+/-2.08μS/cm9.43+/-0.93μS/cm1.44+/-0.04mS/cm128.7+/-7.0μS/cm3.35+/-0.19mS/cm572+/-10.5μS/cm147.6+/-9.07μS/cm9.7+/-0.71μS/cm986+/-38.1μS/cm1.01+/-0.045mS/cm1.06+/-0.055mS/cm934+/-43.5μS/cm22.7+/-5.09μS/cm0.1电解槽检测范围太低
两性离子缓冲液/电导/传导速率-使用两性缓冲液(良好缓冲液，氨基酸缓冲液)，或在或邻近其pI的三羧甲基氨基甲烷-硼酸盐缓冲液对电泳迁移DNA的速率或速度有一定的优点。如：1)这些缓冲液可以被以相对高的浓度使用来增加缓冲容量；2)在同样的浓度电导显著比其它种类的缓冲液低，3)能够利用对靶分析物(DNA)较高的电泳迁移。
在等电点(pI)两性离子缓冲液的能力-氨基酸缓冲液在其等电点的确具有缓冲的能力。由于给定的氨基酸在等电点可以或不可以具有其“最高缓冲能力”，所有它具有一定程度的缓冲能力。对于在pI和pKa之间的每一个pH单位，缓冲能力降低10倍；在其pI具有三个电离基团的氨基酸(组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等)比只有两个电解基团的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等)通常具有更高的缓冲能力。例如，组氨酸pI＝7.47，赖氨酸pI＝9.74，谷氨酸pI＝3.22，在其等电点比在其等电点有相对低的缓冲能力的丙氨酸或甘氨酸有相对高的缓冲能力(见A.L.Lehninger，生物化学，第二版，Worth出版社，纽约，1975；尤见79页图4-8和80页图4-9)。见，例如美国专利4,936,963在凝胶电泳中建议组氨酸作为缓冲液，但是在这一系统中不进行杂交。半胱氨酸的缓冲能力处于较中间的位置。半胱氨酸的pI是5.02，α羧基的pKa是1.71，巯基的pKa是8.33，，α氨基的pKa是10.78。250mM的半胱氨酸的酸碱滴定曲线表明半胱氨酸在～pH 5比20mM的磷酸钠具有较好的“缓冲能力”。在pH4到6的范围，半胱氨酸的缓冲能力比20mM的磷酸钠的显著高，尤其在较高的pH下更是如此。然而，在这些pH范围250mM的半胱氨酸的电导非常低～23μs/cm，同20mM磷酸钠的电导值为～2.9mS/cm相比大于100倍。
在过去20年发展的几种电泳技术是基于两性离子缓冲液在“其等电点”分离蛋白质的能力，这些技术被称为等电电泳，等速电泳，和等电聚焦(见“蛋白质凝胶电泳”，B.DV。Hames & D.Rickwood，IRL出版社，1981，见第3和4章)。各种氨基酸缓冲液和良好缓冲液都在其pI用于这些应用(见表2，上面所述的参考文献的168页)。
I.基本装置的设计和制造
为了使装置能进行多步和多路反应，其电子元件必须在水溶液中保持主动操作。为了满足这一要求，每一个微定位区必须有一个底层可控制和起作用的DC模式微定位区。然而，在活性DC电极表面发生的结合和亲和反应不能被电解反应所抑制对装置的性能，尤其是敏感性(信噪比)是很重要的。除了直接与电极表面接触的所有敏感试剂和分析物(DNA、RNA、蛋白质等)发生的破坏作用外，电极产生的电解产物，包括酸(H+)、碱(OH-)、氢、氧和各种自由基类也能够破坏敏感成分。设计和制造装置的其它考虑包括、但不限于材料的兼容性、特异性的结合体的特性以及随后的反应物和分析物，和微定位区的数目。
“可控制和起作用的DC模式微电极”意思是偏置的正或负微电极，以直流电模式操作(或者是连续的或者是脉冲的或DC/AC的)，能以可控制的方式影响或引起带电特异性结合体、反应物、或分析物自由场电泳迁移到或离开装置上的任何定位区或，或离开样品溶液。
在本发明的范围，分子的自由场电泳迁移并不真正取决于被绝缘材料限制或界定的所产生的电场。传统的电泳分离技术需要用绝缘(不传导的)材料限制或界定电场线。在自由场电迁移的情况下，带电分子从一个微定位区迁移到另一个微定位区，或从主体溶液迁移到特定的微定位区。因此，对本发明的这一方面来说不需要用特定安置或限制绝缘材料。然而，微定位区测试位点的局限区允许产生高的电流强度，这对实现去杂交合适的电严紧性是必需的；也提供了从主体溶液浓缩靶DNA序列的焦点。
可以设计小到只有两个寻址微定位区的装置，或多达成百上千个微定位区的装置。一般地，使用微光刻技术或结合微制造和微加工技术制造有大量微定位区的复合装置。制造在硅或其他合适的基质材料例如玻璃、二氧化硅、塑料、绝缘的金属或陶瓷材料上进行。
这些微定位区“芯片”设计被认为是大规模阵列或多路分析装置。使用微加工技术可以制造少量的微定位区的装置或微定位区。
寻址微定位区可以是任何形状的，优选是圆形、方形或矩形的。寻址微定位区的大小可以是任何大小的，优选从亚微米(～0.5μm)到几厘米(cm)，对用微光刻技术制造的装置5μm到100μm是最优选的尺寸范围，对用微加工技术制造的装置100μm到10毫米是最优选的。要制造小于微光刻方法分辨力的微定位区，将需要例如电子束光刻、离子束光刻或分子束外延(生长)方法。对分析和诊断性应用需要显微定位区，对例如，但不限于制备规模的生物聚合物合成，样品制备，试剂的电分配需要较大的寻址定位区或宏定位区(例如大于5mm)。
在使用微光刻和/或微加工技术制造微定位区后，利用化学修饰]聚合反应、旋涂或甚至其它微光刻制造技术来制造特定的附着和渗透层。这些重要的层把结合体从电极的金属表面分离开。这些重要的结构允许在每一微定位区表面下的DC模式微电极：(1)影响或引起特定的(带电)结合体从一个微定位区表面自由场电泳迁移到另一个微定位区的表面，或从主体溶液迁移到特定的微定位区；(2)浓缩或共价附着特定的结合体到特定的微定位区的特别修饰的表面上；(3)在特定结合体附着后以DC模式主动起作用，这样其他反应物和分析物就可以以可控制的方式迁移到微定位区或从微定位区迁移出来；(4)不可逆影响与电化学反应和产物的结合或亲和反应。
i(a)设计参数(微光刻技术)
图1示出的是使用微光刻技术制造自寻址微定位区的基本设计。在沉积在绝缘层/基底材料金属位点上形成三个微定位区(10)(ML-1，ML-2，ML-3)金属位点(12)起到微电极结构(10)底层的作用。电极材料包括但不限于：铝、铜、碳、铁、银、金、钯、铂、和氧化铟锡。绝缘材料把金属位点(12)彼此分割开来。绝缘体材料包括，但不限于，二氧化硅、氮化硅、玻璃、保护层、聚酰亚胺、橡胶或陶瓷材料。
图2示出的是在微光刻产生的金属位点上形成的单个微定位区(10)。在金属位点(12)上形成寻址微定位区，并结合有一层氧化层(在容易产生氧化物的铝或其它金属的情况下使用)20，渗透层(22)，和附着层(24)，和结合体层(26)。
在金属如铝的情况下，金属氧化物层提供渗透层共价耦联的基底。金属氧化物和羟基基团(或者是单独使用或者是结合使用)，和本技术领域技术人员公知的其它表面涂层化学材料可以提供共价位点，构成或固定渗透层。并不绝对要求渗透层的确与金属电极表面共价附着。渗透材料的物理重叠代表一种在本发明领域内可选的方法。在金属是如铂和金的情况下，渗透层可以是物理重叠的。
渗透层提供在金属表面和附着‘结合体层之间的空隙，并允许溶剂分子、小的反离子和电泳反应气体自由通到金属表面并从金属表面通过。可以在渗透层中包括能降低电泳反应的不利物理化学效应的物质，包括，但不限于氧化还原反应捕集物质，例如，捕集H2的铂和捕集O2和过氧化物的铁复合物。另外，渗透层可以包括有助于保持DNA杂交稳定性的化合物和物质；这些包括，但不限于组氨酸、组氨酸肽、聚组氨酸、赖氨酸、赖氨酸肽和其他阴离子化合物或物质。用于光刻产生装置的渗透层的厚度范围从约1纳米(nm)到100微米(μm)，最优选是2nm到10μm。渗透层材料包括，但不限于：金属氧化物、膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺、水凝胶、溶胶-凝胶、多孔玻璃、多孔硅、交联聚合物等。
附着层提供结合体共价结合的基底。光刻产生的装置的附着层的厚度范围从0.5到5μm，最优选为1nm到500nm。在某些情况下，可以用相同的材料形成渗透和附着层。可以进一步活化耦联结合体的某些渗透层材料包括在本发明的范围之内。
特异性结合体共价或亲和耦联到附着层上，形成特异性结合体层。例如，可以将抗生物素蛋白链菌素结合到渗透层中，提供生物素衍生的DNA探针的亲和结合位点。理想地，特异性结合体层通常是单层特异性分子。然而，在某些情况下，结合体层可以有几个或甚至许多层的结合分子。
渗透和附着层的某些设计和功能方面是由特异性结合体分子的物理(例如，大小和)化学特性支配的。一定程度上它们还受反应物和分析物分子的化学特性的支配，这些反应物和分析物分子随后被迁移和结合到微定位区。例如，寡核苷酸结合体可以附着到一种微定位区的表面，而不引起DC模式功能的损失，即，底层的微定位区仍可以引起分析物分子的迅速自由场电泳迁移到寡核苷酸结合体附着的表面或远离表面。然而，如果大的球蛋白结合体(例如，抗体)被附着到同样的表面，它们可以使表面绝缘，并引起DC模式功能的降低或完全丧失。这就必须适当地修饰附着层以或者降低大结合体(例如，大的球蛋白)的数量或者在表面上的结合体之间提供间距。
微定位区之间的间距是由制造的容易程度、在微定位区之间的检测分辨力的需要，以及在装置上的微定位区的数目决定的。然而，对装置的功能而言特定的微定位区间隔，或微定位区的特定排列或几何形状是不必的，微定位区的任何组合(即，底层的微电极)可以在整个装置表面面积上进行。另外也不需要包封装置或完全用介电或绝缘屏障限制微定位区。这是因为复合电场模式或介电边界对选择移动、分离、保留、定向在任何电极之间的空间或介质中的特定分子是不需要的。装置是通过把特异性结合分子，然后是分析物和反应物附着到寻址微定位区的表面来实现的。自由场电泳推力使得在装置任何和所有微定位区的所有带电分子迅速和直接迁移；或从主体溶液迁移到微定位区。然而，应当指出的是，可以将装置包封以容纳液体或防止生物危害。
当微定位区的数目超过几百个，微定位区底层的电路就变得复杂。在这种情况下就不得不改变微定位区编组模式并按比例增加间隔距离，或用多层电路制成装置，即，将晶体管和半导体控制元件直接结合到硅上。
除了已经被特异性结合体寻址的微定位区外，装置还可以含有非分析性微定位区和起到其他作用的宏定位区。这些微定位区或宏定位区可以用来储存试剂、暂时容纳反应物、分析物或细胞；并作为样品(例如，试剂配制和样品制备系统)中过量反应物、分析物或其他干扰成分的处理单位。可以把寻址微定位区和其他的非-寻址微定位区结合使用影响或作用在这些特异性微定位区发生的反应。这些微定位区增加了装置间或装置内活性和控制。例如，环绕检测位点微定位区矩阵的微定位区周界(有底层微电极)可以用作反电极以包容更大体积的检测溶液。另外，对微定位区来说也可以使两个单独的装置之间的分子相互作用和迁移。这就提供了一种用来加载具有从储存装置来的结合体或反应物的工作装置、用来制备样品和拷贝或复制装置的机制。
图3示出的是含有64个寻址微定位区(30)的矩阵型装置。64微定位区装置是常规的设计，与标准的微电子包装部件配合。这种装置在约1.5cm×1.5cm的硅芯片上制造，有一个含64微定位区的约75μm×75μm的中央区。每个微定位区(32)约50平方μm，邻近的微定位区之间的间隔为50μm。每一单个的底层微电极的连接电路接到外围(10mm×10mm)的金属连接垫片(300平方μm)(34)上。在微定位区和连接垫片之间的区域可以形成凸起的内周，产生能容纳约2到10微升(μl)的样品溶液。“芯片”可以安装在标准的方型包装内，芯片连接垫片(34)接线到方型包装引线上。系统中可以含多个芯片和另外的包装和邻近的元件以设计来解决与临床诊断，即，样品材料的添加、流体的传递和包含生物危害材料相关的问题。然后可以把包装的芯片插到微处理器控制的DC能量供应和可以控制和操作该装置的万用设备中。本发明认为装置的生产(在寻址前)基本上是涉及结合三个基本的元件，这三个元件基本上是夹在一起。结合体要附着的基本芯片在中间位置；样品或流体包含元件在板上顶部退火，控制元件将退火到基本芯片装置的底部。这一策略解决了与制造技术和材料兼容性有关的许多问题。
I(b)微光刻制造步骤
I(b)(1)制造步骤
通用的微光刻或光刻技术都可以用来制造大量较小的微定位区的复合“芯片”型装置。尽管装置的制备不需要复杂的光刻技术时，但是的确还需要特别地考虑材料的选择和电子装置在水溶液中积极起作用的需要。
图3所示的64微定位区装置(30)可以使用相对简单的掩膜设计和标准的微光刻技术来制造。一般地，基片材料是1到2平方厘米的硅基片或厚约0.5毫米的芯片。硅芯片首先包涂上1到2微米厚的二氧化硅(SiO2)绝缘层，这是用等离子增强化学蒸气沉淀(PECVD)涂布的。
下一步，用真空蒸发沉积0.2到0.5微米的金属层(例如铝)。也可以通过溅射技术沉积金属。除了铝之外，电路的合适金属和材料包括金、银、锡、钛、铜、铂、钯、多晶硅、碳和各种金属的组合。使用了特定的技术以确保绝缘基片材料(SiO2)与各种金属适当粘合在一起。装置的不同的导电元件可以使用不同的金属和其它材料，例如，使用铝作周边的连接垫片，多晶硅作中间连接电路，和贵重金属(金或铂)作微电极。芯片接着被涂布上正光刻胶(Shipley，Microposit AZ 1350 J)，掩盖(光场)有电路图案，曝光和显影。去除光熔性抗蚀剂，曝光的铝就被腐蚀掉。去除了抗蚀岛，在芯片上留下铝电路图案。这就包括金属连接垫片外周、导电电路(电线)，和起到寻址微定位区底层作用的微电极的中央阵列。
使用PECVD，芯片被首先包涂上一层0.2到0.4微米的SiO2，然后被包涂上一层0.1到0.2微米的氮化硅(Si3N4)。然后芯片被涂上一层正光刻胶，光刻胶掩盖连接垫片和微电极定位区，曝光、显影。去除光熔性抗蚀剂，腐蚀掉SiO2和Si3N4层，露出铝连接垫片和微电极。然后去除抗蚀岛，在连接垫片和微电极之间的连接电线通过SiO2和Si3N4层保持绝缘。
SiO2和Si3N4层为装置提供了重要特性。第二SiO2层提供了较好的接触，并改善了铝电路之间的密封性。也可以使用抗蚀剂材料绝缘和密封。这就防止在微电极操作时由于电解效应对电路的破坏。使用Si3N4作最后的表面层，因为它与用来修饰附特定结合体的微电极表面随后试剂的反应性很低。
I(b)(2)渗透层和附着层形成步骤
这时装置上的微电极就准备好被特定的渗透层和附着层修饰。这是本发明的一个重要方面。目标是在微电极上产生一个具有选择扩散特性的中间渗透层和最佳的结合特性的附着表面。
附着层最好每平方微米具有105到107官能化的定位区以附着特定的结合体。特定结合体的附着不应包涂或绝缘表面以避免底层电极不起作用。起作用的装置需要一定比率(～5％到25％)的实际金属微电极表面以使溶剂(H2O)分子容易接近，并允许产生反离子(例如Na+和Cl-)和电解气体(例如，O2和H2)扩散。
中间渗透层也被设计来允许扩散发生。另外，渗透层应当有孔径限制特性，抑制或阻止较大的结合体、反应物和分析物物理接触到微电极表面。渗透层保持活性微电极表面物理上不同于微定位区的结合体层。
这一设计允许电泳迁移所需的电泳反应在微惦记表面上发生，但是避免了对结合体、反应物和分析物不利的电化学效应。渗透层也可以被设计来包括清除在电泳反应中产生的不利物质(O2、H2、自由基等)的物质。可以在渗透层设计一个下层以达到此目的。
多种设计和技术可以用来生产渗透层。通常的设计包括：(1)“草坪式”，(2)“网式”和(3)“多孔”结构。
草坪式渗透层涉及以一层厚草的方式排列垂直于金属表面的线型分子或聚合。这些结构可以通过直接向金属表面附着线型或聚合亲水分子形成，在垂直结构中有最小的交联。理想地这些亲水线型分子是双功能的，一个末端适合于共价附着到金属垫片上，另一个末端适合于共价附着结合体。
网式渗透层涉及随机排列聚合物分子，形成平均孔径由交联度决定的网状结构。这些结构可以通过水凝胶型材料例如，但不限于聚丙烯酰胺、琼脂糖和各种其他生物和非生物可以聚合和交联的材料形成。这些材料可以被旋涂到矩阵表面上。
多孔型渗透层涉及对金属垫片使用可以在涂层上表面直接形成通道或孔的材料，这些材料包括，但不限于聚碳酸酯、聚砜或玻璃材料。在所有的情况下渗透层都必须确保物理或化学结合在金属表面上，并必须含官能基团或能被官能化以把结合体附着到其表面上。
生产草坪式结构的一个优选的方法涉及使用氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)的金属微电极表面的衍生。APS很容易与金属和硅片表面上的氧化物和或羟基反应。APS提供结合的具有用于随后共价耦联结合体的伯胺基团的渗透层和附着层。至于表面结合位点，APS在稍微氧化的铝表面产生相对高水平的官能化(即，大量伯胺基团)，在SiO2上产生中间水平的官能化，在Si3N4表面上产生非常有限的官能化。
用10％的APS甲苯溶液在50℃处理整个装置(例如芯片)30分钟进行APS反应。然后在甲苯、乙醇中洗涤，然后在50℃下干燥一小时，微电极表面被大量的伯胺基团(每平方微米105到106)官能化。这时结合体就可以共价结合到衍生的微电极表面。可以使用聚氧化乙烯双(胺)，双(聚氧化乙烯双(胺))和其它的聚乙二醇类或类似化合物增加这一“草坪式”渗透层的厚度。
APS方法对寡核苷酸结合体的附着很有效。图4示出的是3’-末端醛衍生的寡核苷酸(40)附着到APS官能化的表面(42)的机制。而这只是多种方法中的一种，各种形成渗透层和附着层的其他方法都是可能的。这就包括基极自身使用自-导向的寻址以：(1)通过电镀到基片微电极上形成第二金属层；(2)通过电聚合在微电极定位区形成聚合物层；或(3)通过自由场电泳方法迁移聚合物和试剂到微电极表面以形成随后的渗透和附着层，或(4)通过旋涂材料(水凝胶、琼脂糖、丙烯酰胺等)到阵列表面产生聚合物层。
I(c)微加工的装置的设计和制造
这一部分描述怎样使用微加工技术(例如，钻孔、磨制)或非-光刻技术制造装置。一般地，这些装置比微光刻产生的装置有较多的微定位区(＞100微米)。这些装置可以用于分析，以及用于制备型应用，例如生物聚合物合成，样品制备，试剂配制、储存部位及废物处理。可以以三维模式(例如，管或圆柱体)制造大量的寻址定位以携带大量的结合体。这种装置可以使用各种材料包括，但不限于塑料、橡胶、硅、玻璃(例如，微开槽的，毛细管等)或陶瓷制造。低荧光材料对于分析应用是更理想的。在微-加工装置的情况下，可以使用本领域现有技术人员已知的标准电路板印刷技术把连接电路和较大的电极结构印刷到材料上。
寻址微定位区装置可以使用微加工技术相对容易地制造出来。图5是代表96孔微定位区装置的示意图。这一微定位区装置由合适的原材料(2cm×4×1cm)制造，在材料上钻96个相称的排列的孔(直径1mm)。在薄片塑料原材料上形成电极电路板(52)，在微定位区元件(54)顶部精确配合。电路板的下面包括连接到每一个微定位区(55)的单根电线(印刷电路)。设计了短铂电极结构(～3-4mm)(62)延伸到各个微定位区室(57)中。印刷电路线被包涂有一层合适的防水绝缘物质。印刷电路线会聚到插口，插口允许连接到多路开关控制器(56)和直流电源(58)上。装置在共同的缓冲液容器中部分浸渍和操作。
尽管由微加工和微光刻技术制造的装置的主要功能相同，但他们的设计可以不同。在微光刻技术制造的装置中，渗透层和附着层直接在底层的金属微电极上形成。在微加工技术制造的装置中，渗透层和附着层可以被在单个室或储存器(57)中的缓冲液从其单个金属电极结构(62)上物理分离开(见图6)。在微加工装置中，可以使用相同的官能化亲水凝胶、膜、或其他合适的多孔材料形成渗透层忽然附着层。
一般地，渗透层和附着层的总厚度范围从10μm到30μm。例如，可以用20％到30％的聚丙烯酰胺(0.1％聚赖氨酸)修饰亲水凝胶部分填充(～0.5mm)装置的各个微定位区室。这些浓度的凝胶形成孔径范围从2nm到10nm的理想的渗透层。加进凝胶的聚赖氨酸提供随后附着特异性结合体的伯胺官能基团。这种凝胶渗透层允许电极以DC模式积极起作用。当电极被启动，凝胶渗透层就允许小的反离子通过，但较大的特异性结合体分子就浓缩在外表面上。因此它们就共价结合到伯胺外层，有效地成为附着层。
形成渗透层和附着层的另外技术是把多孔膜材料加进各个微定位区室的底层。然后用化学官能基团衍生膜的外表面以形成附着层。进行这一方法的合适的技术和材料对本领域的技术人员是公知的。
上面关于设计和制造光刻和微加工装置的描述不应被认为是限制了基本装置的其他变型或形式。许多具有用较大或较小寻址微定位区元件或其结合的装置变型可以用于不同的分析和制备应用。具有较大的寻址定位区的装置变型可以被设计来制备生物聚合物合成应用，样品制备、细胞分级系统、原位杂交、试剂的配制、强储存系统和废物处理系统。
II.装置的自导向寻址
本发明的装置能够用特异性结合体电自寻址每一微定位区。装置自身直接影响或引起带电特异性结合体迁移到特异性的微定位区上。结合体通常被官能化以使他们易于反应或共价结合到附着层上。装置能够自寻址其意义在于在特异性微定位区不需外部步骤、机制或装置物理导向、定位或安置特定结合体。自寻址方法既迅速和特异性，又能够以连续或平行方式进行。
通过维持所选微定位区处于DC模式和特异性结合体相反的电荷(电势)可以使装置连续被特异性结合体寻址。如果结合体具有净负电荷，那么结合体要迁移的微定位区就偏压到正电荷。反之，充有负电的微定位区将被用来迁移带正电的结合体。在连续的寻址方法中偏压其他的微定位区的选项包括：使所有的其他微定位区偏压处于相反的电荷(与要寻址的微定位区的电荷相反)；使有限组的微定位区偏压到相反电荷；或只使一个微定位区(或其他电极)处于在相反的电荷。在某些情况下，需要使一个或多个微定位区强烈偏压为相反电荷，而其他组的微定位区只是微弱偏压。这一方法使得先前寻址的微定位区在在寻址剩下的微定位区时受到保护。在结合体不过量于微定位区附着点的的情况下，有必要只启动一个其他的微电极以影响自由场电泳迁移到微定位区。特异性结合体可以迅速通过主体溶液，并直接在特异性微定位区浓缩，其中他们与附着层的特异性表面共价结合。迁移速率取决于结合体的大小和电荷，以及在微定位区之间所使用的电压或电流。一般地，迁移速率可以从几秒到几分钟，在一个特异性微定位区上电浓缩结合体、反应物或分析物(70)的能力见图7a和7b。所有其他的微定位区都可以被保护并在特异性结合体寻址的过程中保持不受影响。所有未反应的结合体都通过颠倒特异性微定位区的极性，并电泳到处理定位区而去除。重复这一循环知道所有所需的微定位区都被其特异性结合体寻址。图8a到图8b示出的是用特异性的寡核苷酸结合体(82，84，86)寻址特异性微定位区的连续步骤。能够自寻址装置的显著优点，引起仪器系统的发展，允许APEX芯片装置被DNA或RNA探针，或其他配基寻址。这种“制造你自己的芯片”的仪器包括一个平台以固定或安装芯片或包装芯片元件；提供电连接和控制以控制在芯片的每一定位的电压以控制电流；提供流体或电传送系统以向芯片提供探针序列；以及微处理器单元控制整个系统。这一系统将允许“制造你自己的芯片”产品和应用。这中产品和应用将对许多临床诊断、分子生物学、官能几何和药物发现应用的研究者和终端拥护是有用的。
寻址微定位区的平行步骤涉及同时启动多个微定位区(特定的一组)这样迁移、浓缩相同的特异性结合体，并与多个微定位区反应。随后的平行步骤类似于连续方法。
III.装置的应用
一旦装置被特异性结合体自寻址，可以在装置上进行各种分子生物学类型的多步和多路反应。本发明的装置能够为许多重要的反应参数电提供主动和动力学控制。这一电控制导致控制反应的新物理机制，并显著提高反应速率、特异性和敏感性。这些参数的改善来自装置装置能电控制和直接影响装置的能力：(1)迅速把反应物或分析物迁移到含附着特异性结合体的特异性微定位区；(2)由于反应物或分析物与特异性结合体在特异性微定位区表面浓缩增高了反应速率；(3)从微定位区迅速或选择去除未反应的和未特异性结合的成分；和(4)优化结合条件的严紧性。
本发明的自寻址装置能够迅速进行各种微形成多步和/或多路反应和步骤，包括，但不限于：
传统型式的DNA和RNA杂交步骤和分析；例如，附着靶DNA/探针DNA，附着探针DNA/靶DNA，附着俘获的DNA/靶DNA/探针DNA；
以连续和平行的方式进行多步或多路杂交反应；
限制性片段和通常的DNA/RNA片段大小分析；STR分析，SNP分析；
分子生物学反应，例如，限制性酶反应和分析，连接酶反应激酶反应，和DNA/RNA扩增；
涉及大或小抗原和半抗原的抗体/抗原反应；
诊断分析，例如，杂交分析(包括原位杂交)、基因分析、DNA指纹识别，法医应用和免疫分析；
生物分子共轭方法(即，核酸、酶、蛋白质、或有报告基团的抗体的共价和非共价标记，包括荧光、化学发光、比色和放射形同位素标记)；
生物聚合反应，例如，寡核苷酸或多肽的复合合成；
水溶性合成聚合物合成，例如，碳水化合物或线性聚丙烯酸酯；以及大分子和毫微结构(毫微大小的微粒和结构)合成和制造。
III(a)核酸杂交
由于其在诊断中的重要性，而且因为他们的特征在于是较困难类型的结合(亲和)反应之一，核酸杂交被用作本发明的主要实施例。当他们在多路型式中进行时尤其是这样，每一个的杂交反应都需要不同的严紧条件。
本装置和方法允许核酸杂交以多种常规的和新型式进行。本装置能电控制参数的能力显著改善了核酸杂交分析，尤其是装置能对阵列上每一单个的微定位区提供电严紧控制(ESC)。这就基本上允许每一单个杂交反映在共同的阵列上进行，就如单个试管分析一样。
术语“核酸杂交”意思包括所有天然和合成形式和衍生的核酸的杂交反应，包括：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、聚核苷酸和寡核苷酸、肽核酸等。
常规的杂交型式，例如“点渍法”杂交和“夹层”杂交，都可以本公开的装置和大规模阵列或矩阵型式进行。
例如，以下面的方式设计、制造和使用一个用于DNA杂交的APEX装置。首先使用微光刻(或微加工)技术制造微定位区阵列。在矩阵上的可寻址微定位区的数目取决于最终用途。装置以连续方式与一组特异性的寡核苷酸迅速自寻址。在这种情况下，特异性的寡核苷酸是6-聚体到100-聚体的3’-端醛官能化的寡核苷酸，如果需要的话可以附着较大的聚核苷酸。醛功能基团允许共价附着到特异性微定位区附着表面(见图4)。这组特异性的寡核苷酸易于使用传统的技术在常规的DNA合成仪上合成。每一特异性的寡核苷酸的合成是从核苷酸控孔玻璃载体触发的。因此，3’-端位置包括核苷酸，其在合成和纯化后通过高碘酸氧化反应容易转化成末端双醛衍生物。含醛寡核苷酸(40)通过席夫氏碱反应过程将容易与微定位区表面上的伯胺官能基团反应。
装置与特异性寡核苷酸的电寻址如图8a到8d所示。通过维持特异性微电极(ML-1)处于正DC电势，同时所有其他微电极保持在负电势(图8(A))，完成第一特异性微定位区(ML-1)(81)与其特异性寡核苷酸系列(SSO-1)(82)的寻址。在含水缓冲液中的醛官能化的特异性序列(SSO-1)自由场电泳到ML-地址，在那里它浓缩(＞106倍)并立即共价连接到ML-1(81)的表面。所有的其他微电极都保持负电，保护或屏蔽它们不与SSO-1序列反应。然后ML-1电势颠倒为负电(-)以使所有未反应的SSO-1电泳到处理系统。重复这一循环，SSO-2(84)--→ML-2(83)，SSO-3(86)--→ML-3(85)，SSO-n--→ML-n，直到所有所需的微定位区都被其特异性DNA序列寻址(图8(D))。
另外一种寻址该装置的方法是迁移特异性结合体例如从电试剂供应装置来的特异性寡核苷酸。这一供应装置将保留大量的结合体或试剂，并将用来装载分析装置。结合体将电迁移到两装置之间。这一系统消除了物理操作例如微-吸取的需要，以及在装置内或之间复杂的流体传送系统的需要。
另外寻址装置的另一方法是在特异性的微定位区进行特异性寡核苷酸的复合合成。复合合成将在下一部分描述。在装置被特异性的DNA序列寻址后，在阵列装置上微定位区下的微电极保持为独立的工作直流(DC)电极很重要。这是可能的，因为到电极表面附着的进行是在底层的微电极没有化学或物理绝缘的方式下进行的。每一微电极始终能够产生其他带电DNA分子自由场电泳迁移到微定位区表面所需的较强电流。因此，DNA阵列装置为所有的DNA杂交和任何随后的反应提供了电控制。
电控制杂交方法的一个例子如图9a到9c所示。在这种情况下，每一个寻址的微定位区都有一个特异性的俘获序列(90)。将含靶DNA(92)的样品应用到装置中。所有的微定位区都被启动，样品DNA在微定位区浓缩(图9(B))。稀释溶液的拔DNA分子就高度高度浓缩在微定位区，使得迅速杂交到表面上的特异性的互补DNA序列。颠倒微电极电势从微定位区排斥所有未杂交的DNA，而靶DNA保持杂交(图9(C))。以类似的方式，在随后的步骤杂交报告探针以检测杂交的复合体。
杂交过程的电控制通过增强总杂交效率和从微定位区面积去除非杂交DNA改善了靶DNA分子随后的检测。预计在未扩增的基因组DNA中10,000到100,000拷贝的靶序列将是可检测的。这种类型的杂交反应可以在低于探针的Tm等温条件下在几分钟或之内并且以最小的外部操作(即，降低常规洗涤步骤，在某些情况下是完全消除)进行。
DNA杂交检测的另一常见形式涉及使靶DNA固定化在表面上，然后杂交特异性探针到这些靶DNA上。这一型式还涉及在多定位点相同的靶DNA，或在特异性定位区的靶DNA。从图10a和10b可以看出，这一连续杂交型式的改善形式。在这一情况下，微定位区(101-107)被不同的俘获DNA寻址。它们与不同序列的特定寡核苷酸(108，109)杂交。微定位区随后偏压为正以迁移分子到其自身，然后偏压为负以把靶分子迁移到另一个微定位区。在合适的电极电势下，特异性杂交的DNA探针被迁移到另一个微定位区。序列特异性寡核苷酸探针可以用合适的报告基团例如荧光标记。公开的装置能提供电严紧控制。严紧控制地杂交特异性是必须的，并对解决点突变中单碱基错配是尤其重要的。图11a到11c示出的是电严紧控制是怎样用于单碱基错配分析。电严紧控制也能够应用于多碱基错配分析。在图11(A)中正确匹配的DNA杂交(110)比错配DNA(112)杂合体稍微稳定。通过在给定时间偏压微定位区为负(图11(B))，并供应限制量的电泳动力，有可能是错配的DNA杂合体变性或去除，同时保留正确匹配的DNA杂合体(图11(C))。图(15)比较了利用电严紧控制和常规杂交技术进行电杂交的结果。杂交涉及Ras 12癌基因15-聚体G和A点突变探针。电杂交结果表明与常规方法相比杂交率显著提高，对单碱基错配的识别率也非常大。
更具体地说，所要求保护的装置对在装置发生的每一特异性杂交反应提供了独立的严紧性控制。实际上每一杂交都是独立的反应。以常规或被动的矩阵形式，有可能对在相同杂杂交溶液中发生的所有杂交反应实现优化的严紧性控制。然而，本发明的主动式阵列装置能够提供对在不同微定位区的杂交不同的电严紧性，甚至即使是在它们在相同的主体杂交溶液中发生时也是这样。这一特征通过杂交(SBH)型式测序，以及其他多路分析克服了常规矩阵或阵列杂交型式的固有局限性。
除了改善杂交的特异性(即，识别率)和敏感性(例如单电突变检测)，电严谨控制允许在这些应用中使用正常大小范围之外的寡核苷酸。范围从8-聚体到21-聚体的寡核苷酸序列对用常规杂交方法点突变检测是可接受的。在使用常规方法的目前实践中，这些常规方法中以20-聚体到19-聚体的寡核苷酸最频繁使用，这些方法利用温度和盐浓度来严谨控制。已经发现短于10-聚体的寡核苷酸对多路杂交是不能接受的；短于8-聚体的序列因为其差的杂交率甚至被认为不能使用。长于21-聚体的序列因为在匹配和错配探针之间有很差的识别率而不能使用。当序列长度超过21-聚体，识别匹配和错配探针之间的杂交信号的差异的能力就显著下降。
我们已经发现用电严紧控制在APEX装置下进行杂交允许使用较短(7-聚体和更短)和较长(22-聚体和更长)的寡核苷酸而具有非常高的识别率。较短的寡核苷酸序列(7-聚体或更小)的使用的优点在于能通过杂交(SBH)测序。较短长度的序列允许使用较小数目的寡核苷酸(8-聚体＝65,536，7-聚体＝16,384，6-聚体＝4,096)的阵列用于SBH应用。较长探针的使用对有高复杂性的DNA样品提供了更高的敏感性，并具有较高的总杂交率。
电杂交技术也可以被用来进行原位杂交。原位杂交代表一种根本不同的杂交形式，在于靶DNA(或RNA)不从细胞中去除，而是直接在细胞中进行检测。原位杂交技术通常是很复杂和耗时的，而且检测短靶序列(即，单点突变)几乎是不可能的。电控制的原位杂交可以在APEX装置上进行，装置直接在装置的表面处理细胞(见实施例14中关于样品制备技术)。而APEX装置不是把DNA从细胞中提取出，而是电杂交报告探针到细胞中的DNA。通过消除许多非特异性结合或者改善总杂交效率使用电严紧控制增强选择性和敏感性。
对杂交提供电严紧控制的能力也提供了检测DNA杂交的新机制，而不需使用报告基团标记的DNA探针。它自身提供了进行更直接检测的杂交方法。荧光染料检测步骤如图12a到12d所示，如实施例4到6所述。通过使用DNA结合染料例如溴化乙锭可以实现DNA杂交的直接检测。该染料既能结合到双链DNA也能结合到单链DNA上，但对前者的亲和力更大。在图12(B)中带正电的染料(122)被迁移到负偏压的微定位区。染料既结合到杂交的(120)DNA序列，也结合到未杂交(121)的DNA序列上(图12C)。通过使微定位区偏压为正，并在各顶时间内提供一定量的功率，结合到未杂交微定位区的染料分子就被选择去除。可以应用不对DNA杂交有不利影响的合适量的电势。然后使用相关的或集成的光系统荧光检测结合上染料分子的杂交DNA。下面重申本发明的用于核酸杂交反应和分析的装置的重要优点：
(1)迅速迁移稀释的靶DNA和/或探针DNA序列到杂交发生的特异性微定位区。这一步骤可以在5到120秒中内发生。
(2)在杂交要发生的特异性的微定位区浓缩稀释的靶DNA和/或探针DNA序列浓缩效果可以很好地达到一百万倍(＞106)。
(3)迅速从杂交已经发生的微定位区去除非特异性结合的靶DNA序列。这一步骤可以在5到120秒内发生。
(4)迅速从杂交已经发生的微定位区去除完全互补的靶DNA序列。这一步骤可以在5到120秒内发生。
(6)在数分钟内就可以进行大量的独立杂交反应的能力。
(7)在远低于探针Tm的等温条件下，使用最少的操作或洗涤步骤进行杂交步骤的能力。
(8)使用电严紧控制(ESC)去除部分杂交的DNA序列。
(9)在1000到100,000拷贝范围进行杂交分析未扩增的基因组靶DNA序列的能力。
(10)使用ESC改善单碱基错配杂交(点突变)的识别率(即，分辨率)和敏感性。
(11)使用比在常规杂交步骤中短(7-聚体或更少)或长(22-聚体或更大)的点突变探针的能力。
(12)使用ESC在矩阵杂交中提供各个严紧性控制。
(13)通过去除非特异性背景成分改善杂交过程中的检测。
(14)在固定的细胞上进行电原位杂交的能力。
(15)消除使用共价标记的报告探针或靶DNA检测杂交的检测方法的发展。
III(b)装置的再生产
除了用特异性的结合体分别寻址各个装置，也可能生产主装置，该装置可以把特异性的结合体拷贝到其他装置上。这就代表了生产和制造装置的另一方法。复制该装置的步骤如图13a到13c所示。用各个互补DNA序列(130)杂交含已经被特异性序列寻址的微定位区的主装置。这些互补的序列被激化，并因此能够共价结合到微定位区附着层上。
用杂交的主装置对准含附着层的未寻址的姊妹装置(132)(图13(B))。该主装置微定位区被偏压为负，姊妹装置微定位区被偏压为正。DNA杂合体被电变性，并迁移到姊妹装置上，其中启动的DNA序列共价结合到微定位区(图13(C))。这一步骤可以平行或连续进行，这取决于装置的几何形状，这样在微定位区之间的串扰就可以降至最低。通过应用充分的负电势或使用带正点的促溶剂或变性剂将杂合体变性。
或者是，在溶液、凝胶基质、主装置单独的孔道或室中所含的DNA探针可以被连续或平行方式电迁移到选择的在姊妹装置上的微定位区。对于生产诊断和其他应用的寻址DNA芯片上述方法被认为是合适的。
III(c)部件装置和集成尖端系统
可以结合许多单独的APEX装置或芯片形成集成APEX系统。因为APEX型装置可以执行许多不同的功能，在装置之间的反应物可以通过自由场电泳去除，就可以发展集成系统。例如，各个APEX装置或芯片可以结合：(1)选择性结合和溶解细胞，(2)电分配试剂，(3)进行预杂交，(4)起到废物处理单元的作用，(5)提供DNA片段的储存，(6)进行杂交分析以形成样品制备和杂交分析系统(见实施例14和图19)。这些集成APEX微电子系统等价于完全临床分析者或可编程分子生物实验室(即，芯片实验室)。然而，它们远胜于自动化(机器人)或其他微分析装置之处在于他们需要非常少的流体或物理操作样品、试剂、和反应物。另外类型的集成APEX系统将包括，但不限于那些能够进行原位杂交、细胞选择和处理系统以及免疫诊断分析的系统。
III(d)检测系统和报告基团
在结合反应涉及荧光标记的报告基团的情况下，有可能使用落射光型显微镜检测系统分析在APEX装置上的结合反应。系统的总敏感性取决于相关的检测元件(冷却的电荷耦合装置(CCD)，增强的电荷耦合装置、微孔道盘检测器、或光子计数光电倍增管(PMT)系统)。或者是，敏感的CCD芯片检测器或雪崩式光电二极管(APD)检测器可以更直接地与APEX装置结合。这些系统将或多或少降低复杂光学器件的需要。更先进的系统将涉及把集成光电或电检测元件结合进芯片。使用这些系统光和直接电检测DNA都是可能的。本发明预计最先进的类型将最终涉及与一个微电检测器和在板控制器元件一起包层到基本的APEX芯片元件上。电和光(波导管)连接将直接通过APEX元件的底层进行。这一策略解决了许多与制造技术、材料相容性、制造一次性APEX元件成本效率相关的问题。
除了各种荧光染料和报告基团可以用来标记DNA探针、靶DNA或抗体外，也可以使用其他类型的标记或报告基团。这些标记包括化学发光标记、非线性光(频率倍增)材料、生物素/抗生物素蛋白复合体和各种酶。
III(e)复合生物聚合物合成
本方面的装置还能够进行生物聚合物例如寡核苷酸和肽的复合合成。这一步骤允许自导向合成的发生，不需任何外界导向、影响或机械运动。其它复合合成的方法需要物理掩膜和复杂的光刻方法、用来传送试剂的微机器人移液系统、或在显微定位区进行真正合成的复杂的物理运动。复合合成的基本概念涉及使用自由场电泳迁移以传递、浓缩和与单体反应，在装置上的特异性的可寻址微定位区耦联试剂或阻断试剂。这一概念利用装置的固有能力以电保护一定的定位区部首临近的实际和反应物的影响。另外，对该概念重要的是在一个或多个反应物或者是正电或是负电，或产生这些过程适合的试剂的化学合成过程中选择步骤性的识别。
复合寡核苷酸合成的一个方法如图14a到14f所示。这一方法从一套选择性的其表面用分块的伯胺(X-NH-)基团(142)衍生的可寻址微定位区(140)开始。在该方法中的起始步骤涉及使用带电分块剂(144)选择性分块微定位区。在这种情况下，试剂将带正(+)电荷。通过对分块的微定位区施加负电势，对要保护的微定位区施加正电荷进行这一过程(图14(B))。对选择性电极使用正或负电势引起带电试剂从试剂传送点移出，并在所需要分块的微定位区浓缩，同时排除从其他的微定位区来的试剂。
第二步，将第一个碱基在这里是胞嘧啶，化学耦联到分块的微定位区是通过简单暴露系统到氨基亚磷酸酯试剂(x-C)(146)。(C)核苷酸耦联到分块的微定位区表面。但不到任何封闭的电极表面(图14(C)和(D))。这时进行的是正常的磷酰胺化学直到下一分块步骤。
在第二分块步骤(图14(D))，使那些与下一碱基耦联的电极位置为负，使那些保护的为正。在这种情况下(x-A)(148)，将系统暴露到要耦联的下一碱基，并选择性耦联到分块的微定位区(图14(E)和(F))。重复耦联和分块步骤，直到在每一可寻址微定位区表面上都合成有全部的不同的DNA序列。
上述例子代表合成寡核苷酸的一条可能的途径。另一方法涉及一种完全水溶性的DNA合成。在这种情况下，使用带电水溶性耦联剂，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDCA)与水溶性核苷酸衍生物进行合成。这一方法将对目前的基于有机溶剂需要大量封闭碱基部分的方法有显著的优势。水溶性合成将较为廉价并不必使用在目前基于有机溶剂的方法所使用的毒性物质。第三种方法，也是用于水溶性合成，涉及使用带电单体和酶。
III(e)用末端转移酶合成寡核苷酸
用于复合合成寡核苷酸的这一方法涉及使用核苷酸聚合酶。这一方法利用末端转移酶，三磷酸5’-脱氧核苷的3’-单磷酸酯和磷酸酶。末端转移酶用来耦联核苷酸。3’-磷酸酯起到在每一耦联步骤添加多于一个核苷酸的封闭基团的作用。3’-磷酸酯被用来去除下一步耦联步骤的3’-磷酸酯。
因为所有的试剂都是水溶性的并带有电荷，在这一复合合成步骤中可以对所有步骤使用通常的APEX技术。在该方法中，使用有A、T、G和C核苷酸的APEX矩阵，通过其5’-羟基位置连接到装置上的适当数目的寻址的微定位区。第一核苷酸被连接成为标准的APEX寻址技术。
通过使所有的在其第二位置将与A核苷酸耦联的微定位区偏压为正，含末端转移酶和三磷酸脱氧腺苷3’-磷酸酯的两个电试剂分配器偏压为负启动第一轮耦联反应。试剂自由场电泳到合适的微定位区，并通过末端转移酶把A核苷酸耦联到矩阵上的第一核苷酸上。因为三磷酸核苷在其3’位置被酯化，末端转移酶一次只能加一个核苷酸。
在完成核苷酸耦联之后，将微定位区偏压为负废物处理系统偏压为正，并去除酶和剩下的试剂。重复C、C和T核苷酸第一轮耦联，知道所有的微定位区已经被耦联。
当完成第一轮耦联(A、T、G和C)后，所有的微定位区都偏压为正，并将3’-磷酸酶的试剂分配器偏压为负。3’磷酸酶自由场电泳到微定位区，其中它水解3’-磷酸酯。磷酸酯的去除使得3’-羟基基团准备进行下一步耦联反应。进行耦联反应，直到在APEX装置上完成所需的寡核苷酸序列。
除了DNA合成，可以发展用于RNA合成、肽合成和其他复合多聚体的类似方法。
III(f)电控制的分子生物学和扩增反应
各种分子生物反应包括靶DNA和RNA分子的线性和指数增殖和扩增都可以用APEX微电子装置和芯片。
可以在完全的电控制下进行限制酶切除和DNA片段分析。使用APEX装置的核酸增殖或扩增反应与其他的“DNA芯片”装置的明显不同，“DNA芯片”装置对传统的扩增方法(PCR、LCR等)基本上是被动式微-矩阵载体。扩增的新机制直接来自APEX的主动特性。主动式装置提供独特的电机制到：(1)在等温反应条件并远低于其Tm点(热熔化温度)下选择变性DNA杂合体；(2)在两个或多个微定位区之间迅速来回迁移或移动DNA；和(3)在装置上的任何所需的微定位区选择性浓缩DNA修饰酶，例如，但不限于，限制性内切酶、DNA或RNA聚合酶和连接酶。可以在APEX装置上进行电控制的分子生物学和扩增反应的例子包括：(1)ds-DNA序列的电导向的限制性酶切；(2)用DNA聚合酶电扩增靶DNA；(3)用DNA和RNA连接酶电连接和增殖靶DNA序列；和(4)用RNA聚合酶电增殖靶DNA。
III(g)电限制片段分析
除了进行ds-DNA的限制酶切，APEX装置和电技术可以用来分析和确定DNA片段的相对大小。当有不同长度的DNA片段能杂交到在微定位区的共同的俘获序列上时这是可能的。或者是当不同长度的DNA片段能够杂交到不同的俘获序列上，它们都具有相同的杂交或结合能。在这种情况下，可以根据它们的未杂交或伸出的序列使用电严紧控制选择性去-杂交不同的DNA片段。在有较长的伸出序列的片段上的电泳力引起它们在有较短的伸出序列的片段之前去杂交。因此，如果为了检测对片段进行标记，并寻址到特定的微定位区，其大小可以通过从微定位区去杂交所需的电泳电势或功率水平进行测定。也可以进行类似于电限制片段长度聚合分析的步骤。
III(h)在低离子强度和低电导缓冲液中进行电迁移和杂交
在一系列荧光DNA检测板寻址实验中使用2.5％琼脂糖包被的有25(80微米)微定位区和Bodipy德克萨斯红-RCA5(btr-RCA5)荧光寡核苷酸检测探针的5580芯片在低离子强度/低电导溶液演示DNA迁移。检测板寻址涉及轮流使微定位区偏压为正和负，然后每6秒钟颠转偏压。这就在阵列上产生一个检测板模式，当荧光DNA探针在正偏压的微定位区浓缩，并移离负偏压的微定位区。对下面的低电导溶液演示迅速(6秒)检测板寻址和浓缩btr-RCA5荧光DNA探针：(1)250mM HEPES(低电导)，(2)10μM琥珀酸钠，(3)10μM柠檬酸钠，和(4)蒸馏水。同时，某些低电导或低离子强度的溶液可能具有某些较好的特性，用最低电导系统实现挡板寻址和迅速DNA迁移(DNA在6秒内聚集在80μM的垫板上，横向总距离是～200μM)。另外，在蒸馏水中DNA寻址到APEX芯片也是可能的，因为DNA(其实是聚阴离子)在提供电导的主体溶液中电解存在的。
电泳迁移率与阳/阴离子种类的关系
除了带电分析物种类(DNA、蛋白质等)的迁移率与电解液的离子强度有关这一事实外，淌度还受电解液中的阳和阴离子种类的特性影响(见参考文献“毛细管电泳：原理和应用”pp89)。这一点在上述参考文献生物聚合物，第2卷，pp 231-236，1964中详细描述。在这一参考文献的232页的图1表明当在相同的离子强度下使用不同的一价阳离子(Li+＞Na+＞K+＞TMA+)DNA的淌度改变。基本上，不同的阳离子DNA磷酸基团可以有不同的离解常数，和/或改变环绕DNA分子的杂交球，这就导致其迁移率的改变。除了对淌度有影响，不同的阳离子也可能影响双链DNA的相对稳定性。
电迁移和杂交增强缓冲液
本发明的许多方面涉及发现各种参数、DC和DC/AC脉冲、特定的电解质和缓冲液(组氨酸、半胱氨酸等)、和其他改善或优化试剂或反应物(DNA、RNA等)迁移速率、DNA或RNA杂交反应效率、在电系统和装置中的总杂交特异性，尤其是APEX微电子芯片的条件。其中有一些在先前的专利申请和CIP中包括了。特别是发现各种低电导和两性离子缓冲液，包括但不限于D-和L-组氨酸、二-组氨酸、1和3甲基-组氨酸、肌肽、咪唑、吡啶和可力丁，既能提供迅速DNA迁移和也能提供有效的杂交反应。相反，其他两性离子缓冲液例如半胱氨酸、甘氨酸、b-丙氨酸和g-氨基丁酸(GABA)能提供迅速迁移、但在这些条件下不能有助于有效杂交。当使用这些迁移和浓缩DNA的缓冲液时，在微定位区发生合适的DNA浓缩后通过迅速用更传统的杂交缓冲液(100mM NaCl和Na2PO4等)立即替换该缓冲液可以实现杂交。对杂交率的影响是无法预料的。低电导缓冲液和系统的另一个优点是当应用APEX芯片和装置时靶序列的相对变性条件。
组氨酸、二-组氨酸和其他杂交增强缓冲液的优点在于对操作10到100微米直径的微定位区的APEX微芯片型装置特别重要。一般地，这些装置(与较大规模的装置对应)被包被较薄的渗透层(～1到10微米)，并在较低的电流(～10nA到～5uA)和电压(～1.2到5.0伏特)范围内操作。这些较低的电流和电压(始终产生电泳迁移)用来降低在正和负偏压的微电极/渗透层界面上的主动气泡。在正电极上产生氧气，在负电极上产生氢气，但是气体通过扩散而散开这与主动气泡相对。在这些较低的电流(～10nA到～5uA)和电压(～1.2到5.0伏特)下当使用较高电导率的缓冲液和电解液(＞10mM NaCl、KCl、磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠、三羧甲基氨基甲烷等)时，发现DNA迁移率降低。另外，通过积聚在负偏压的微定位区渗透层表面上的较小和更多电解阴离子(磷酸盐、柠檬酸盐、Cl-等)的竞争浓度，聚阴离子核酸的浓缩缓慢降低。最后，由于高度浓缩的阴离子环境和对应缺少稳定阳离子，就降低了靶DNA序列杂交到附着到检测位点的DNA序列的能力。应当记住的是，较小的电解液阳离子(Na+、K+、Tris等)的浓缩也可逆地在负偏压的微定位区渗透层表面发生。另外，在低缓冲条件(＜10mM)或当主要缓冲液成分不是阴离子类(磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐等)的条件下，在正偏压的微定位区低pH(＜4)酸环境的产生降低了核酸杂交率，也促进在渗透层上或内的DNA或RNA沉淀。反之，在负偏压的微定位区的未缓冲的高pH(＞10)碱性环境的产生有不利的影响。
记住这些条件，进行“电泳DNA杂交”的方法之一是使用低电导缓冲液，例如半胱氨酸或丙氨酸，以相对高的浓度(～50nM到100nM)迁移DNA，其中相对低的电流和电压始终产生非常快的DNA迁移。在这些条件下靶DNA保持在相对变性的状态，降低了互补靶链的竞争杂交。靶DNA可以迅速浓缩在微定位区检测位点。在这些低电导缓冲液中的一个中迁移后，将溶液换成高盐缓冲液(＞100mM氯化钠或磷酸钠)，然后促进浓缩的靶DNA与微定位区位点上的DNA探针非常有效地杂交。
作用的组氨酸机制
在缓冲液依赖方式中，在对DNA浓缩和杂交的迁移和寻址步骤后，发现在正偏压的电极上的pH立即降低了。在单独的实验中，观察到当具有净正电贺在酸性pH下被动杂交可以有助于杂交，但在中性下不是这样(见实验部分)。这些组氨酸和有助于电杂交的相关的缓冲液与四个重要的特性有关：(1)保持靶DNA在相对变性的状态下的能力，(2)有助于DNA电场浓缩的能力，(3)缓冲在正偏压的微定位区酸性条件的能力，(4)获得能够屏蔽或消除DNA磷酸酯骨架稳定双链结构之间的排斥的能力。图19示出的是组氨酸稳定DNA结构的可能机制。基本上，因为组氨酸分子在a-氨基基团和咪唑环上带正电就变得质子化和重阳离子化，分子开始稳定双链DNA结构、促进杂交。实际上，在检测填充组氨酸和双链DNA的分子结构的CPK空间时，重组氨酸类看来与沿DNA骨架的磷酸氧阴离子空间非常“吻合”。而且，CPK空间填充结构的检测说明二-组氨酸和其他的二-、三-、和多肽结构将显著稳定ds-DNA结构。据认为除了这些多肽结构，大量的肽衍生物和合成结构可以设计来稳定ds-DNA。
组氨酸和相关缓冲液的优点对APEX微芯片型装置尤其重要。当这些特定的结构被覆盖有较薄渗透层(～1到10微米)，与深孔装置(～10到100微米渗透层)和微加工或显微型装置(样品制备、复杂性降低、扩增、电点渍等)相对，通常在较低的电流(～10nA到～5uA)和电压(～1.2到5.0伏特)下使用。这一较低的电流和电压在较高电导缓冲液和电解液中降低迁移率和杂交率。一般地，在这些情况下，DNA迁移将在低的电导缓冲液(例如半胱氨酸或丙氨酸)中进行，其中相对低的电流和电压将始终产生迅速的DNA迁移。在这些条件下，DNA迅速在检测位点聚集，但不能有效杂交。在这些低电导缓冲液中迁移后，通常将溶液假加入到高盐缓冲液中(＞100mM氯化钠或磷酸钠)，这些缓冲液然后促进浓缩的DNA有效杂交到在微定位区检测位点上的DNA探针上。
表2示出的是使用APEX芯片装置聚集DNA和杂交敏感性(效率)与缓冲液能力、pH和电导相关的一系列实验的结果。
                                          表2
 溶液   缓冲能力   在PI的pH   电导(μs)   相对DNA迁移率   SA-生物素T12敏感性   DNA杂交敏感性
 β-丙氨酸牛磺酸半胱氨酸组氨酸赖氨酸NaPO4   pK1-3.6pK2-10.2pK1-1.5pK2-8.7pK1-1.7pK2-8.3pK3-10.8pK1-1.8pK2-6.0pK3-9.0pK1-2.2pK2-8.9pK3-10.3综合   +7.3+/-4.6+/-5.2+++7.6++9.6+7.4   10.04.525.00212.0(172.0高纯度)477.01,400.0   +++++(最快)+++++++++++++++(最慢)   3×104＞7.5×10103×1073×106＞7.5×1010 7.5×10113×106
用20mM NaPO4调整pH为7.4
尤其是，表2示出的是各种两性离子氨基酸缓冲液[β-丙氨酸、牛磺酸、半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸和磷酸钠(不是两性离子缓冲液)]对迁移的靶DNA杂交到检测位点上的特异性俘获DNA能力的影响。从表2可以清楚看到用组氨酸(3×106靶点)比半胱氨酸(7.5×1010靶点)可以达到非常低的杂交敏感性。当要迁移时，在相同场条件下电导通常与迁移相关。β-丙氨酸、牛磺酸和半胱氨酸表现出优异的迁移，组氨酸表现出良好的迁移，赖氨酸和磷酸钠较好的迁移。报道的是具有负带电聚阴离子磷酸骨架的“正常DNA”的杂交敏感性。除了杂交敏感性外，表2还报道了抗生物素蛋白链菌素/生物素DNA探针俘获亲和性的敏感性。表2清楚地表明DNA迁移(聚集)与低电导(β-丙氨酸、牛磺酸、半胱氨酸、组氨酸)之间的关系。从表中可以看到使用β-丙氨酸、半胱氨酸和组氨酸对抗生物素蛋白链菌素/生物素探针具有良好的亲和性。如表2中的敏感性数据所反映的那样，组氨酸比半胱氨酸或其他缓冲液例如20mM的NaPO4的杂交效率高四个数量级。对半胱氨酸的相对提高为至少10倍，更特别地为102倍，最特别地至少为104。更重要地，用组氨酸缓冲液DNA杂交敏感性(效率)特别好。因此所有的两性离子氨基酸缓冲液都检测了，组氨酸、二-组氨酸和组氨酸衍生物提供出良好的迁移和良好的DNA/DNA杂交效率。
据认为低电导的组氨酸缓冲液系统是迅速的DNA迁移(积聚)的原因。对为什么组氨酸缓冲液产生相对高效的DNA/DNA杂交的原因有几种解释。一个优势是组氨酸良好的缓冲能力。由于其pI为7.47，组氨酸将在酸性和碱性条件下很好地缓冲(见A.L.Lehninger，生物化学，第2版，Worth出版社，纽约，1975，第80页的图4-9)。APEX芯片在DNA积聚杂交的正电极上产生酸，组氨酸有效缓冲这些条件。在其两性离子状态，组氨酸的浓度在正和负偏压的微定位区局部附近保持较高。更重要的是，在酸性条件(pH＜5)下，在正偏压的电极上组氨酸上的咪唑基团质子化开始把分子转变成二-阳离子类。这些有带正点的α-氨基基团和代正点的咪唑基团的阳离子类促进杂交，并稳定在APEX芯片上正偏压的微定位区上形成的DNA/DNA杂合体。已知阳离子、二阳离子和聚阳离子有助于通过减少在双链DNA结构上的带负电的磷酸酯骨架的排斥反应稳定DNA/DNA杂合体。因此，建议使用组氨酸设计具有两性离子、低电导和二-阳离子或多-阳离子特性用来改善在APEX芯片装置上的电杂交化合物(组氨酸多肽、混合肽、合成衍生物等)。
III(i)在双链PCR扩增子电杂交和点突变检测
本发明的显著优点是能够对相对大的DNA片段进行迅速的直接杂交和碱基错配分析。有可能处理双链PCR扩增子产品、其他扩增子产品(SDA等)、DNA片段、或RNA片段并：(1)把她们直接稀释到低电导组氨酸缓冲液(1到5，或更高的稀释度)，(2)迅速进行加热变性，(3)向APEX芯片(用俘获探针序列预寻址进行识别)加样品(～5uL)，(4)进行2分钟电泳杂交，(5)洗涤芯片几次，(杂交荧光报告探针序列(可选))，(7)进行30秒电严紧控制(对特定的碱基错配序列使用合适的电流水平)，(8)进行荧光检测和分析(～1分钟)。
进行整个过程的必须时间少于30分钟。快的杂交率是因为在低电导缓冲液如组氨酸类电杂交的独特优点。迅速的碱基错配识别是由于电严紧控制的独特优点。双链PCR产品可以应用到有最小变性的芯片上，不必分离单链靶序列。步骤(6)不是必须的，如果扩增子或片段已经被荧光标记，在大多数情况下可以在PCR扩增步骤中使用荧光标记引物进行标记。对完全扩增的PCR扩增子，不必对样品脱盐，因为它可以直接稀释到低电导(组氨酸缓冲液)。对于低拷贝数的扩增子，脱盐到较低电导的步骤四可选的。
在一个例子中，通过标准的PCR反应方法从镰刀形细胞阳性组织生产PCR扩增子。在25检测位点APEX阵列每5行的三个80微米微定位区用三个生物素标记俘获探针、一个24-聚体生物素标记的镰刀形细胞匹配序列(GCAP-3)；一个24-聚体生物素标记的镰刀细胞错配T--→A(GCAP-4)和一个完全非-互补序列(ATA4)预寻址。将扩增子以1比50稀释到组氨酸缓冲液中，并应用到APEX芯片上。然后进行上述基本步骤。使用四个不同的电严紧电流水平以确定优化的电严紧控制。获得下面的“错配比匹配”识别率：对533nA/位点是1.3比1；对566nA/位点是1.4比1；对600nA/位点是2.0比1；对633nA/位点是1.8比1；对600nA/位点是1.7比1，重复。因此有可能岁双链PCR扩增子靶材料的错配迅速检测和获得2比1识别率。所以本发明就允许一种迅速进行直接杂交碱基错配分析的迅速工艺。
本发明将参照下面的非限制性的实施例对制造和应用APEX装置更详细地进行描述。
缓冲液、溶液和在下面实施例中的介质配方在J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，和T.曼尼阿蒂斯，分子克隆实验指南，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989有描述。
IV实施例
实施例1：寡核苷酸的合成和修饰
使用传统的氨基亚磷酸化学在应用生物系统自动化DNA合成仪上制备合成DNA探针。设计寡核苷酸使之含有5’-氨基或3’-核糖核苷酸末端。通过使用ABI Aminolink 2试剂结合5’官能性，和通过从RNA CPG载体启动合成导入3’官能性。3’-核糖核苷酸末端可以通过高碘酸氧化方法转化成末端双醛与伯胺反应形成席夫氏碱。
反应条件如下：在水中溶解20-30O.D.寡聚体使终浓度为1OD/μl。加入1体积的0.1M乙酸钠，pH 5.2和1体积的0.45M高碘酸钠(在水中新鲜制备)。在暗处室温下搅拌和孵育反应至少2小时。将反应混合物装到在0.1M磷酸钠，pH 7.4平衡的Sephadex G-10柱(巴斯德滴管，0.6×5.5cm)中。收集200μl组分，在薄层色谱(TLC)点样并收集紫外(UV)吸收部分。
下面的寡聚体含3’-核糖核苷酸末端(U)：
ET-12R    5’-GCT AGC CCC TGC TCA TGA GTC TCU
CP-1      5’-AAA AAA AAA AAA AAiA AAA AAU
AT-Al     5’-CTA CGT GGA CCT GGA GAG GAA GGA GAC
              TGC CTG U
AT-A2     5’-GAG TTC AGC AAA TTT GGA GU
AT-A3     5’-CGT AGA ACT CCT CAT CTC CU
AT-A4     5’-GTC TCC TTC CTC TCC AGU
AT-A5     5’-GAT GAG CAG TTC TAC GTG GU
AT-A6     5’-CTG GAG AAG AAG GAG ACU
AT-A7     5’-TTC CAC AGA CTT AGA TTT GAC U
AT-A8     5’-TTC CGC AGA TTT AGA AGA TU
AT-A9     5’-TGT TTG CCT GTT CTC AGA CU
AT-A10    5’-CAT CGC TGT GAC AAA ACA TU
含5’胺基的寡聚体通常与荧光基团反应，例如德克萨斯红(TR，激发590nm，发射610nm)磺酰氯对伯胺的反应性很强形成稳定的磺胺连接。
如下制备德克萨斯红-DNA耦联：将德克萨斯红磺酰氯(分子探针)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中使终浓度为50mg/ml(80mM)。将寡聚体溶解在pH 9.0-9.1的0.4M碳酸钠中，使终浓度为1O.D./μl(对21-聚体是5.4mM)。在一个微试管中，合并10μl寡聚体和20μl德克萨斯红。在暗处使反应进行1小时。用氨或羟胺淬灭反应，水解样品，并用PAGE(Sambrook等，1989，如上)纯化。
下面的寡聚体含5’-核糖核苷酸末端(U)：
ET-21A     5’-氨基-TGC GAG CTG GAG TCA GAC AT
ET-10AL    5’-氨基-GAG AGA CTC ATG AGC AGG
ET-11AL    5’-氨基-CCT GCT CAT GAG TCT CTC
T-2      5’-氨基-TTT TTT TTT TTT TTT TTT T
RC-A1    5’-氨基-CAG GCA GTC TCC TTC CTC TCC AGG
                  TCC ACG TAG
RC-A2    5’-氨基-CTC CAA ATT TGC TGA ACT C
RC-A3    5’-氨基-GGA GAT GAG GAG TTC TAC G
RC-A4    5’-氨基-CTG GAG AGG AAG GAG AC
RC-A5    5’-氨基-CCA CGT AGA ACT GCT CAT C
RC-A6    5’-氨基-GTC TCC TTC TTC TCC AG
RC-A7    5’-氨基-GTC AAA TCT AAG TCT GTG GAA.
RC-A8    5’-氨基-ATC TTC TAA ATC TGC GGA A
RC-A9    5’-氨基-GTC TGA GAA CAG GCA AAC A
RC-A10   5’-氨基-ATG TTT TGT CAC AGC GAT G
实施例2在微制造的装置上的电寻址微定位区-聚赖氨酸方法
用微毛细管(0.2mm×5mm)制造微定位区。将微毛细管填充以含0.1-1.0聚赖氨酸的18-26％聚丙烯酰胺并进行聚合。将多出的毛细管刻痕去除以避免气泡截留在管中，并使管长度标准化。这样安装毛细管，使它们共用共同的上缓冲液储存器，并各有自己的下缓冲液储存器。每一个低缓冲液储存器含有铂电极线。
在上储存器的微毛细管的上表面被认为是可寻址的微定位区。将上和下储存器填充以pH 7.4的0.1M磷酸钠，并在0.05mA常数下使用伯乐(BioRad)500/1000电源预运转10分钟。在开启电源下将约2μl(0.1O.D.)高碘酸盐氧化的ET-12R复活序列滴到上储存器并在恒定参数下电泳2-5分钟。ET-12R俘获序列就开始浓缩并立即共价结合到微定位区的伯胺上。然后颠转极性使得检测的毛细管偏压为负，并电泳另外2-5分钟。所有剩下的未结合DNA都被排斥，而共价附着的DNA保留在微定位区。
吸干上储存器并用缓冲液浸洗。将装置拆开并安装新的参比检测装置。将储存器重新注满，并荧光标记加入的互补DNA序列，即，ET-10AL-TR。在0.05mA的恒定电流下将寡聚体电泳浓缩到正偏压的检测微定位区2-5分钟。颠转极性使未互补的去除。去除检测装置并用落射光式荧光显微镜检验。用非-互补DNA序列ET-21-A-TR替换ET-10AL-TR对非特异性结合如上所述进行阴性控制。
在安装有滨松ICCD照相成像系统的耶拿(Jena)落射光式荧光显微镜下检测毛细管微定位区表面的横截面。荧光分析结果表明互补ET-10AL-TR杂交到结合体/俘获序列并即使在电势偏压为负的时候保持杂交。当电势颠转时非-互补ET-21A-TR不能保留在检测装置表面。
实施例3在微制造的检测装置上电寻址微定位区-丙烯酸琥珀酰亚胺方法
这一实施例描述的是另一个共价结合到寡核苷酸5’-末端的附着化学。除了用1％的丙烯酸琥珀酰亚胺(分子探针)代替聚赖氨酸，如上所述制造毛细管。新鲜制备毛细管，因为与伯胺反应的琥珀酰亚胺酯相对不稳定，特别是在pH 8.0下。如上所述安装毛细管，并用pH 7.4的0.1M的磷酸钠注入储存器。在0.05mA下预运行毛细管10分钟。在开启电源下将含5’-氨基末端的约2μl的ET10AL(0.1O.D.)滴到上储存器并电泳2-5分钟。当共价附着的DNA保留在微定位区，排斥未结合的DNA。
吸干上储存器并用缓冲液浸洗。将参比检测装置拆开并安装新的参比检测装置。将储存器重新注满，并荧光标记加入的互补寡聚体，ET-10AL-TR并如上进行电泳。用非-互补DNA序列ET-21-A-TR替换ET-10AL-TR对非特异性结合如上所述进行阴性控制。
每一检测装置的荧光分析结果表明互补ET-10AL-TR杂交到俘获序列(RT-10AL)，并即使在电势偏压为负的时候保持杂交。当电势颠转时非-互补序列ET-21A-TR不能保留在检测装置表面。
实施例4：电控制的荧光DNA/染料检测方法
某些染料，例如溴化乙锭(EB)在结合(插入)双链DNA时就变得有很高的荧光性。尽管在结合到双链DNA时荧光和结合亲和性变大；染料对单链DNA也有一定的亲和性，并产生低水平的荧光。下面的实施例表明的是电控制的DNA/染料检测方法是怎样开展的。
如实施例2和3所述制备和杂交毛细管检测装置。将溴化乙锭(EB)加到缓冲液(～0.05mM EB终浓度)，将检测装置偏压为负以在杂交和非杂交微定位区浓缩EB(带正电)。用落射光式荧光显微镜在550nm激发和600nm发射下观察检测装置。杂交和未杂交的微定位区都表现出从浓缩的EB来强烈的红色荧光。
将检测装置重安装偏压为正，电流为0.05mA 0.03伏特-小，以选择性去除EB。在未杂交微定位区的荧光消失，而杂交的微定位区保持非常高水平的EB荧光。结果如下：
  俘获   靶   正常化的信号
  ET-10ALET-10AL   ET-11AL(正)ET-21A(负)   ＞2001
使用ICCD成像照相系统测定荧光信号，显示出峰值荧光强度。如果积分整个荧光信号面积信噪比将大于1000倍。这就表明使用插入染料增加信噪比和DNA检测动力学范围的方法。
实施例5：主动式可编程电子矩阵(APEX)-微加工制造
6个可寻址的250μm毛细管定位区径向排列由塑料基质材料微加工。装置具有共同的上储存器和单独的低储存器，这样每一微定位区被单独寻址。将独特的寡聚体序列结合体定位并附着到用高度交联的聚丙烯酰胺按如上所述的方法制备的特异性微定位区上。检测微定位区具有正电势，而其他微定位区具有负电势以避免非特异性相互作用。
清洗阵列，然后用互补的荧光标记的DNA探针杂交。洗涤阵列以去除剩余的探针，然后在落射光式显微镜下进行观察。只有特异性寻址的微定位区是荧光性的。用其他结合体在其他定位区重复该方法，并与其他荧光部分标记的探针杂交检验。
DNA序列特异性定位在预定位置并与其他的定位区有可以忽略的串扰。这就在预定的定位区制造出几个到成百上千个独特的序列的微矩阵。
为了选择合适的低荧光背景的塑料基质，对不同的塑料基质在600nm下的荧光特性进行检测。用落射光式成像系统和荧光计对塑料进行检测。下表列出了从LS50B荧光计获得的基质和荧光读数。
  塑料基质   在610nm，5秒间隔的强度
  ABS聚苯乙烯丙烯酸UHMWDelrinTFE聚丙烯聚碳酸酯PVC   黑色白色透明白色浅色黑色透明白黑色白色黑色白色白色天然透明淡色白色黑色灰色   0.1406.8117.9550.16951.770.1510.03551.220.7431.83461.3996.050.74325.8211.323.10345.310.1562.667
实验表明黑色丙烯酸、ABS和聚碳酸酯具有最低荧光背景水平。
实施例6：主动式可编程电矩阵(APEX)-微光刻制造
在硅基片上设计、制造一个8×8矩阵(64个位点)的50平方微米的微定位区(见图3)，与一个转换开关箱(详见装置制造部分)组装。将用如下所述的几种改进材料和方法来提高APEX芯片装置的选择性和有效性。
6a)顶层部分
APS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)方法涉及芯片整个表面的反应。这一起始官能化方法的选择性取决于在芯片表面的各种材料的相对反应性。为了降低官能化和DNA随后附着到环绕微定位区需要一种比SiO2或金属氧化物更不易与APS反应的材料。检测光刻胶和氮化硅。将不同的顶层涂到二氧化硅芯片上。用落射光显微镜检测芯片，然后用APS处理，然后共价附着高碘酸氧化的聚-A RNA序列(Sigma，M 100,000)。在37℃杂交缓冲液中用200nM德克萨斯红标记的20-聚体(T2-TR)对芯片进行杂交5分钟。将芯片在洗涤缓冲液清洗三次，在1xSSC中清洗一次。用荧光在590nm激发和610nm发射下进行检测。
选择氮化硅是因为它相对于二氧化硅对APS的反应性小的多，并不象检测的光刻胶材料那样本身是发荧光的。其他方法，例如背景面积的UV熔蚀也是可能的。
6b)APEX物理特性
使用装有一个B&L显微镜和CCD照相机的探针检测站(微控制器模型6000)视觉检测完成的矩阵芯片。检测芯片在检测垫板和外接触垫板之间的连续性。这通过把垫板与控制器探针尖端接触而完成。连续性保证垫板已经被蚀刻到金属表面。然后检测垫板在电泳环境中的稳定性。金属线的等级为在干燥状态下处理达1mA。
把一滴(1-5微升)缓冲溶液(1xSSC)滴到8×8矩阵上。表面张力固定液体，使外接触层面积干燥。将探针尖端连接到接触垫板，另一探针尖端与液体接触。使用HP 6625电源和HP 3458A数字万用表在最大电压50V电流被递增至50uA。
最初的制造由硅基片、二氧化硅绝缘层、铝沉积和形成图案和氮化硅顶层组成。
第二制造方法包括在铝金属和氮化硅层之间的二氧化硅绝缘层。二氧化硅和Al具有更相容的物理特性，并形成较好的化学界面以提供比初始制造方法更稳定和坚固的芯片。
6c)DNA附着
用APS试剂如实施例5所示对一个8×8矩阵芯片官能化。用高碘酸氧化作用氧化的聚-A RNA序列(Sigma，平均分子量100,000)处理芯片。将芯片在洗涤缓冲液(WB)清洗去除多余的和微结合的RNA。这一方法用俘获序列包涂整个芯片，然而在暴露的金属表面的密度比在氮化物覆盖的面积更高。在37℃用200nM在杂交缓冲液(HB)中的TA-TR杂交芯片5分钟，然后在WB中清洗三次，在1xSSC中清洗一次，每次在室温下清洗一分钟。用荧光在590nm激发和610nm发射下进行检测。
开放的金属面积具有高的荧光，并具有50平方μ垫片(微定位区)形状。低的荧光强度和/或不规则的边界表明一些垫片还没有完全开放。在这种情况下将建议额外进行等离子体蚀刻几次。
6d)电控制的杂交
通过使用实施例8c的芯片进行主动式杂交，并偏压一个特异性微定位区为正。这通过使用转换开关箱或通过使用一个在外溶液中的电极完成，该转换开关箱也能自动偏压剩下的微定位区为负。只有三微升的缓冲液沉积在矩阵垫片上(微定位区)。施加～1-5nA的电流几秒钟，并把0.1pmol的T2-TR加到溶液中。去除液体并使芯片干燥，在德克萨斯红的590nm激发和610nm发射下检测德克萨斯红荧光。只有偏压为正的特异性微定位区有荧光性。这一实验可以重复许多次，使用在APEX芯片上的其他特异性微定位区。另外，通过偏压起初的定位区为负和目标微定位区为正在一个微定位区上的荧光DNA被电去-杂交并移位到另一个微定位区。
6e)电控制寻址和装置制造
如上使用APS对8×8APEX矩阵进行官能化。通过高碘酸氧化方法激发寡核苷酸结合体CP-1。将在矩阵中的四个微定位区偏压为正，并使剩下的偏压为负。在矩阵上沉积两微升缓冲液并施加电流。加入结合体CP-1并电浓缩到预定的定位区。去除液体，用缓冲液简单浸洗芯片，并将两微升缓冲液沉积在芯片上。再次施加电流数秒钟，加入0.1pmolT2-TR。马上去除液体，并在WB中清洗整个芯片3次。干燥芯片，并检测荧光。
结果表明四个正偏压的微定位区都被荧光化。这一例子表明有特异性结合体的微定位区选择寻址、定位和共价偶联到微定位区的附着序列，并且，互补靶序列特异性杂交到衍生的微定位区。
6f)基因分类APEX芯片
合成对HLA基因dQa多态性有特异性的有3’-核糖核苷酸末端的DNA结合体。用上述高碘酸氧化反应激发结合体。用5’-氨基末端合成反互补体，并与如上所述的荧光团例如德克萨斯红、若丹明或Bodipy染料偶联。如上所述通过用APS处理将微定位区官能化以伯胺。
在8×8矩阵上放置几微升溶液。通过偏压微定位区为正，使特异性的微定位区被寻址，加入高碘酸盐氧化的DNA寡聚体～0.1pmol，并转定位和共价偶联到定位区上。颠转极性，并去除未结合的结合体分子。对在另一寻址微定位区的另一结合体重复该步骤，直到所有的唯一结合到芯片上。
将芯片杂交到单个荧光标记的互补序列以确定偶联反应的特异性同时立即用肉眼观察所有的微定位区。
在点变性以去除互补寡聚体(90℃在0.05％SDS中10分钟)的同一芯片上，用未标记的靶DNA或基因组DNA杂交寻址的微定位区。如上所述通过荧光染料检测方法进行检测。
结果表明微定位区被唯一的结合体特异性寻址。非特异性结合到负偏压的微定位区将是可以忽略的。在变性条件下装置和相关的结合体化学是稳定的。变性杂合体的电方法有增加电流和/或增加施用时间。
实施例7：用15聚体PAS-12探针电严紧控制(7A)单点突变
使用15聚体探针用RAS-12致癌基因模型系统验证装置影响高水平电严紧控制的能力。相对于匹配的双链体在DNA双链体中的单碱基对错配只引起杂交对轻微的不稳。这种轻微的不稳引起错配双链体在比匹配的双链体稍低的Tm下变性。当对(匹配和错配)都在优化的严紧条件下对匹配进行杂交，错配的对的杂交效率将较低。错配杂交信号将或多或少比匹配的对的信号低。用常规的杂交方法。单点突变分析在8聚体到21聚体的范围内进行。在10聚体到20聚体范围内的探针最常使用。当突变体特异性探针比8聚体短，比20聚体长，以任何可靠的方法要从错配中区分出匹配就变得极为困难。这是因为在匹配和错配对之间的杂交信号几乎没有分别。在点突变分析中使用的常规的杂交严紧性控制传统方法取决于温度和盐浓度。我们发现还可以用电泳电势影响严紧性控制。
以RAS-12为例，15-聚体点突变特异性探针电杂交到附着到检测装置上的微定位区的30-聚体靶序列。在微定位区的极性就偏压为负，杂合体经受恒定的电流给定的时间，提供变性错配的确定功率水平而不影响准确的匹配。
下面的序列在一套有三个检测结构的装置上合成和检测，每一检测结构有250μm的表面定位区。下划的/粗体碱基表示错配位置。
附着序列是：
Ras-G 5’-GGT GGT GGG C BC CGB CGG TGT GGG CAA GAU-3’-微定位区
Ras-T 5’-GGT GGT GGG C GC CGT CGG TGT GGG CAA GAU-3’-微定位区
报告探针序列(用德克萨斯红标记)是：
Ras-1 3’-CC-G CG-GC C-GCC-ACA-C-5’-(TR)
Ras-2 3’-CC-G CG-GC A-GCC-ACA-C-5’-(TR)
Ras-3 3’-CC-G TG-GC A-GCC-ACA-C-5’-(TR)
如说明书上述检测装置由微毛细管制备。附着序列Ras-G和Ras-T被高碘酸氧化并共价偶联到寻址的微定位区。
然后将Ras-G微定位区用Ras-1、Ras-2或Ras-3杂交。Ras-1是Ras-G的准确匹配。Ras-2是一个碱基对错配(G-A)。Ras-3是一个两碱基对错配(G-A和G-T)。G-A错配对DNA双链体产生最小的去稳定作用，因此也是最难从正确的匹配中区分的。
首先进行常规的杂交，荧光检测微定位区以测定多大程度的互补序列被杂交。重新安装检测装置(微毛细管)，并然后进行电杂交。通过偏压它们在负电势(以恒定电流)使检测装置全都经受相同的电严紧性控制，直到完全去除错配杂合体而不显著改变正确匹配的杂合体。步骤和结构如下所示：
常规杂交步骤：
在40℃5xSSC杂交15分钟。
在20℃1xSSC洗涤三次，每次5分钟。
进行荧光分析。
所观察到的正确匹配(Ras-G/Ras-1)对1碱基对错配(Ras-/-2)的信号比：约10到1
电严紧控制(ESC)步骤：
在20℃5xSSC杂交5分钟。
“没有洗涤步骤”。
在150伏特(V)0.15毫安(MA)下应用电严紧性4分钟(20℃)。
进行荧光分析。
所观察到的正确匹配(Ras-G/Ras-1)对1碱基对错配(Ras-/-2)的信号比：＞100到1
对所有实验的完全结果见图(15)所示。这些结果表明在DNA杂交反应中不仅可能使用电泳电势进行严紧控制；而且表明比传统的杂交方法ESC既提供了较高的杂交效率，也提高了较高的识别率。另外，ESC可以应用到各个微定位区，在相同的主体溶液中提供各自的严紧性控制。
(7B)使用7-聚体和22-聚体探针进行单点突变分析
7聚体和22聚体，都在电突变分析通常使用的通常大小范围之外，被制备来进一步验证电杂交和ESC的优点。下面列出的点突变特异性寡聚体探针可以被配对，这样产生的杂合体有0、1或2个碱基错配。如上互补的寡聚体序列偶联到微定位区并杂交。颠转微定位区的极性(偏转为负)杂合体经受电流一定的时间，提供限定的功率水平以使错配变性而不去除正确的匹配。
将Ras-G或Ras-GA寡聚体(见下)附着到微定位区并用作靶序列。将下面所示的22-聚体和7聚体Ras特异性核苷酸系列用德克萨斯红荧光团如本说明书其他部分所述进行标记。“下划线和粗体”的碱基表示错配和/或可能的错配位置。
Ras-G        5’-GGT GGT GGG C GC CG G CG G TGT GGG CAA
             GAU
Ras-GA       5’-氨基-GGT GGT GGG C GC CG G CG G T GT GGG
             CAA GA
Ras-22C-TR  (TR)-5’-TGC CCA CAC CG C CGG CGC CCA C
Ras-22A-TR  (TR)-5’-TGC CCA CAC CG A CGG CGC CCA C
Ras-TA      (TR)-5’-TGC CCA CAC CG A CGG  TGC CCA C
Ras-7C      (TR)-5’-ACA  CCG C
Ras-7A      (TR)-5’-ACA  ACG C
如说明书上述从微毛细管制造检测装置。将寡聚体靶序列共价附着到微定位区然后用德克萨斯红标记的正确的22-聚体互补Ras-22C-TR杂交一个微定位区。用Ras-22A-TR，一个22聚体单碱基对错配(G-A)；或Ras-22-TA，一个22聚体双碱基对错配(G-A或G-T)杂交另一个微定位区。
如说明书上面所述立即以双道模式运行检测装置，其中两个微定位区同时经受相同的电流或功率水平。通过常规的方法首先杂交检测装置，荧光检测微定位区以测定要杂交的互补序列的量。然后使用检测装置进行电杂交以控制在恒定电流的时间，直到去除错配杂合体，而没有显著影响正确匹配的杂合体。通常将Bio-Rad 1000/500电源设定到0.02到0.1mA，并在恒定电流下进行实验0.02到0.04伏特-小时。拆卸装置，在安装有硅增强的CAD照相机(滨松)Jena显微镜上通过落射式荧光观察检测装置。使用滨松Argus 10图象处理器处理图象，并用索尼图象打印机记录。当需要其他的电严紧条件时重运行毛细管。
如上所述在7聚体上进行单碱基对错配。然而，由于较低的Tm，装置需要在4-6°的冷箱运行，而不能在室温下运行。
结果表明电杂交和严谨控制能够识别在7聚体和22聚体的单碱基错配。匹配∶错配率是100∶1或更大。信噪比任何一种报道使用温度和离子强度控制严紧条件的杂交方法都显著大。
电严紧控制能够从正确的错配中识别碱基G-A错配，即便G-A错配是最稳定的错配，因为G亚氨基部分能够参与与A形成的氢键，可以稳定双链体。
功率消耗计算和测定表明温度的变化可以忽略，这表明在微定位区的严紧条件不是由温度改变引起的。如上被动杂交的微定位区(不经受电杂交)在匹配和错配之间表现不出区别，这表明扩散作用不会造成识别。
这些实施例还表明每一微定位区都有各自的严紧控制，从而克服了受制于单共用杂交水平的大规模多路杂交的主要障碍。还有可能将电严紧功率水平与热熔化(Tm)数据关联以产生预言的电熔化(Em)曲线和方程。
(7c)在高基因组背景中电杂交
真正的靶DNA序列通常只组成在基因组DNA样品中的总DNA的一小部分。通过在APEX装置上的非常小的定位区浓缩总DNA，本发明增加了在异源DNA过剩的情况下靶杂交的效率。
在该实施例中，含有5’-氨基的附着序列被附着到含有22％PAGE、1％丙烯酸琥珀酰亚胺的检测装置。用ET-2AL或ET-11AL俘获序列衍生毛细管。用德克萨斯红标记靶探针ET-12R。ET-12R-TR将杂交到ET-23AL上，但不杂交到ET-11AL俘获序列，分别进行检测和控制。
将异源基因组DNA，小牛胸腺DNA(CT DNA，Sigma)，溶解到水中使终浓度为1mg/ml，超声处理以使DNA变性。在0.5xTBE中制备含有1010拷贝数的ET-12R-TR靶序列和0、0.1微克、1.0微克变性CTDNA的样品终体积100微升。这就代表相当于靶DNA多出0、1,000、10,000倍的CT DNA。
检测装置每次使用Bio-Rad 1000/500电源在0.3mA 0.5X TBE中预运行5分钟。设定装置以双道模式运行，这样检测和控制毛细管就可以在完全相同的条件下在相同的时刻运行。施加样品(100μl)，在0.03mA下5分钟使毛细管偏压为正电势以吸引DNA。颠转极性并施加相同的功率以从检测装置表面去除所有的未杂交的ET-12R-TR靶。吸出缓冲液，并在安装有硅增强CAD照相机(滨松)的Jena显微镜上通过落射式荧光观察检测装置，并用索尼图象打印机记录。
在每100微升中有或没有0.1μg CT DNA的绝对杂交信号和信噪比之间没有差异。信号强度相当，并且信号沿主动面积均匀分布。
以每100微升1微克CT DNA的水平，信号主要分布在环绕毛细管的周界，表明俘获序列被中断或饱和。通过在杂交步骤过程中摆动极性这一人工效应可以很容易地被克服。这将脉冲总DNA朝向或远离主动面积，允许靶更有效和均匀地杂交。
(7D)被动杂交和电控制的杂交
因为在电控制的杂交中的浓缩效应，电控制的杂交比被动杂交更有效和更快。
用ET-23AL和ET-11AL附着序列制造微毛细管检测装置分别作为检测和控制装置。就形成总体积100微升含1×1010拷贝数的ET-12R-TR与1微克CT DNA的杂交溶液。
被动杂交
在50℃用100微升在小试管中安置一套检测和控制装置，并杂交15分钟。然后在45℃1xSSC、0.1％SDS洗涤样品3次，每次5分钟。
电控制的杂交
在0.06mA下安装检测装置并预运行5分钟。吸出缓冲液并加入100微升杂交溶液。在0.06mA下偏压检测装置为正3分钟，然后颠转极性30秒钟，并再次颠转极性使检测装置再次为正3分钟。将检测装置偏压为负3分钟以电洗涤。
使用主动型式比被动型式杂交的效率和程度显著高。在主动(电)形式中的绝对信号比在被动型式中的信号高100倍多。在主动型式中的信噪比在被动型式信号增加10倍多。使用最小操作在10分钟内完成主动杂交试验。被动型式需要～30分钟，并需要几步试管和缓冲液的操作。
常规的杂交方法使用2.5nm探针和3次C.t15分钟，完成反应90％。以我们的实验中的探针浓度0.17nm，被动杂交反应动力学将通常需要～4小时。
主动杂交能使用较低浓度的探针，这会造成较低的背景。传统方法取决于扩散，从而必须使用更高浓度的探针以驱动反应动力学。主动方法能浓缩样品到一个非常小的体积，造成非常高的局部探针浓度和非常快的杂交反应动力学。
结构
通常，非扩增型杂交检测的总敏感性受制于非特异性结合的背景。当使用多报告组或与有多报告组的次级复合物时，这通常是一个主要的问题。因此，在达到报告标记的实际或固有检测极限之前，通常已经很好地达到了试验检测极限，
使用电控制的杂交方法，我们发现高荧光亚微米或毫微米级珠可以和附着的DNA探针一起使用进行超敏感试验。我们已经能够使用自由场DNA电泳控制DNA探针荧光毫微结构。因为电严紧控制从未杂交结构能高水平识别出杂交结构，DNA荧光毫微结构就能显著增强杂交敏感性。电严紧控制允许我们利用这些高荧光毫微结构或其他多标记的方案进行低拷贝数(50到1000靶)检测，而不必进行任何扩增。迄今为止，这对常规杂交方法和步骤都还是不可能的。
荧光毫微颗粒、荧光球得自分子探针公司。这些颗粒含有装有荧光染料例如德克萨斯红或荧光素的羧甲基乳胶球。可以获得有不同官能基团，例如胺或醛的乳胶球。粒径从0.01到5微米。
1)荧光毫微颗粒的表征
微修饰的、胺修饰的或醛修饰的毫微颗粒具有净正电荷。在电场中这些颗粒向负偏压的微定位区迁移。
2)DNA附着到荧光球的化学
可以将胺修饰的颗粒偶联到含末端醛基团的核酸上。后者可以通过与3’-末端核糖核苷合成，随后用在说明书上述高碘酸方法氧化的DNA探针产生。
将颗粒以在蒸馏水中的2％悬浊液形式储存。将25到50微升0.02-1.0微米的胺修饰的红色荧光荧光球沉淀，并重悬于pH 7.40.1M磷酸钠中。向悬浊液中加入过量的高碘酸氧化的聚ribo-A。使反应在室温下孵育90分钟。在1xSSC，0.1％SDS(0.15mM氯化钠，0.015mM柠檬酸钠，0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠，pH 7.0)洗涤和沉淀颗粒三次以去除未结合的和非特异性结合的聚ribo-A。
将在缓冲液中的DNA-荧光球放置于直流电场中。观察到DNA-荧光球向正电极迁移，表明净电荷现在为负。这是一种确定偶联反应是否成功的简单和方便的方法。传统的杂交方法需要使用放射性标记的报告探针，因为从颗粒发出的荧光强度将使所有的杂交信号模糊。
3)DNA附着到检测装置上
用高交联琥珀酰亚胺聚合检测装置，其中高交联琥珀酰亚胺含1％丙烯酸琥珀酰亚胺，丙烯酸琥珀酰亚胺随后与5’-胺末端的DNA探针反应。通过与荧光标记的互补探针杂交验证俘获序列，寡-T的附着。检测装置表面被具有很高的荧光，这表明表面被俘获序列衍生。
4)电杂交和DNA-荧光球检测
在容纳两个微毛细管，共有一个共同的上储存室和各自的低储存室的检测装置中进行杂交反应。放映表面暴露到共同的储存室中。
将检测装置安装在该结构中，并在0.5xTBE 0.05mA下运行15分钟。一个检测装置具有T2互补附着序列，其他毛细管具有ET-10AL非互补附着序列。向上储存室加入一微升DNA荧光球。将检测装置偏压为正在0.02mA下5分钟以吸引DNA-荧光球(荧光毫微颗粒)检查检测装置以确定颗粒是否存在于表面上。颠转极性，这样检测装置就偏压为负，未杂交的DNA-荧光球就会排斥开来。
在试验毛细管和对照装置之间没有差异。无论施加多大的功率在反复几次尝试后颗粒也不能被去除。
5)被动杂交和DNA荧光球检测
不受任何理论或假说的限制，我们认为颗粒的电杂交物理嵌入或俘获在检测装置表面凝胶基质上中的颗粒。因此，被动杂交到凝胶表面上的附着序列的DNA-荧光球应当更容易被电去杂交去除。
如上所述安装新检测装置。将0.05％的DNA-荧光球滴到上储存室并被动杂交5分钟。吸出缓冲液，加入新鲜的1xTBE缓冲液。这时将检测装置偏压为负以排除颗粒。在0.02mA下操作检测装置5分钟，然后用荧光检查。
在室温下进行ECS总共10分钟后试验和对照毛细管之间有显著的区别。信号沿试验表面均匀分布，但浓缩在信号区域(pocket)。这就可能说明表面附着序列的可利用性被限制。可以使用较长的疏水、亲水或混合特性的间臂进行改善。这种间臂例如可以使用二氨基己烷和琥珀酸酐制造，其他各种间臂基团在本领域公知。
实施例9特异性ds-DNA序列的电导向限制性酶切
用两个例子验证APEX芯片装置选择性进行ds-DNA序列的限制性内切的能力。在这些例子中使用M13mp18(具有Xba I限制位点)和M13mp8(没有Xba I限制位点)载体。这些载体在许多克隆和DNA测序步骤中被普遍使用。
第一个例子验证：(1)在检测装置上电杂交M13mp序列到特异性微定位区，(2)自由场电泳迁移Xba I限制性酶到微定位区，和(3)在其他微定位区随后俘获切除的片段。例子还验证该设备用特异性结合体(寡核苷酸俘获序列)自寻址的能力。
在该方法的基本步骤见图(16)。在该方法中使用四个共价结合寡核苷酸俘获序列特异性微定位区(ML-1、ML-2、ML-3和ML-4)。使用电迁移系统迁移试剂(寡核苷酸、限制性酶等)和处理反应物。
第一步涉及M13-1寡核苷酸俘获序列向ML-1和ML-2微定位区的迁移和共价附着，M13-2寡核苷酸俘获序列向ML-3和ML-4微定位区的迁移和共价附着。因为在pH＞4下核酸带负电，当在pH范围5-9内电泳时它们总是向带正电的电极迁移。
第二步涉及自由场电泳迁移和M13mp18序列与在ML-1微定位区的ML13-1俘获序列的杂交，和M13mp8序列与在ML-2微定位区的ML13-1俘获序列的杂交。
第三步涉及XbaI限制性酶向ML-I(M13mp18)微定位区和ML-2(M13mp8)微定位区的迁移。XbaI切除在ML-1的M13mp18，但不切除在ML-2的M13mp8。从ML-1的切除切除片段被迁移并杂交到在ML-3的M13-2序列。作为一个对照实验，在ML-2和ML-4之间进行自由场电泳。因为在ML-2的M13mp8序列没有被切除，在ML-4就检测不到片段。
如说明书上述制备在这一实施例中使用的各种M13附着和探针序列。这些序列如下所示：
M13-C1      5’-CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC
            CAG U
M13-C2      5’-GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT TCC TGT GTG
            U
MP18-40C    5’GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA
            TCC CCG-GGT ATT C
M8-40C      5’-TGC CAA GCT TGG CTG CAG GTC GAC GGA
            TCC CCG-GGT ATT C
M18-R1      (TR)-5’-AAA TTG TTA TCC GCT CAC AAT TGC
MP8-R2      (F)-5’-ACA CAA CAT ACG AGC CGG AAG ACT
步骤1M13俘获序列的附着
在这一步中使用有200微米微定位区的胺激活高交联
将一个有200微米微定位区的胺激活高交联(26％)聚丙烯酰胺表面或聚碳酸酯(5-10nm)多孔膜表面的APEX试验装置用于这一步骤。
M13-C1俘获序列是一个含3’-核糖核苷的31聚体DNA寡核苷酸。M13-C1序列与M13mp18 3’端和M13mp8单链(+)载体互补。M13-C1俘获序列被设计来杂交和强烈结合所有的未切除的M13载体。
M13-C2序列是一个含3’-核糖核苷的31聚体寡核苷酸。M13-C2序列与从含Xba I限制性位点的克隆位点起M13序列上游部分互补。M13-C2俘获序列被设计来杂交和强烈结合所有的Xba I切除的M13载体。
通过paraded氧化M13-C1和M13-C2俘获序列被激活用来偶联到胺衍生的在APEX微定位区。通过paraded氧化方法3’核糖核苷酸末端转化成醛末端，醛末端就能与伯胺反应形成席夫氏碱。
反应条件如下：
在水中溶解10-20 O.D.的M13-C1或M13-C2寡聚体达终浓度1OD/μl。加入1体积的pH 0.45的0.1乙酸钠，和1体积钠paraded(在水中新鲜制备)。在暗处室温下搅拌和孵育反应至少2小时。将反应混合物装到用pH7.4 0.1M的磷酸钠平衡的Sephadex G-10柱(巴斯德滴管，0.6×5.5cm)。收集200微升组分，在薄层色谱(TLC)上点样2微升并收集在紫外(UV)吸收组分。
设计APEX试验装置的四个顶面为ML-1、ML-2、ML-3和ML-4可寻址的微定位区。
通过下面的步骤将M13-C1共价偶联到ML-1和ML-2微定位区上：
将上和下储存室充满pH7.4的0.1M磷酸钠，并使用BioRad 500/1000电源在0.05mA恒定电流下预运行5分钟。将含有～0.1 O.D.单位的paraded氧化的M13-C1寡聚体的电传送系统头放到下储存室。电传送系统是一个在里面有铂电极的特异性修饰的塑料滴管头。在0.1mA下使电传送系统偏压为负(-)，微定位区ML-1和ML-2偏压为正(+)。在恒定电流下是M13C-1电泳到ML-1和ML-22分钟，其中它共价结合到表面上。颠转极性～4分钟，使未反应的M13C-1从ML-1和ML-2去除。
用上述同样的方法将M13C-2序列附着到ML-3和ML-4微定位区。
步骤2-M13载体、互补序列和荧光报告探针的杂交
因为限制性内切酶切除需要双链DNA，单链M13mp18(从6240到6280)和M13mp8(从6230到6270)的克隆/限制位点片段必须用互补DNA序列杂交。电杂交被用来分别杂交40聚体互补片段(MP18-40C序列)到在ML-2/M13C-1微定位区的M13mp18载体；并杂交40聚体互补片段(MP8-40C序列)到在ML-2/M13C-1微定位区的M13mp8载体。
通过在0.1mA使含0.05 O.D.单位的M13mp18点传送系统偏压为负(-)，使ML-1/MP13C-1微定位区偏压为正(+)2分钟进行点杂交。对电杂交M13mp8到ML-1/M13C-1微定位区使用相同的步骤。
然后用两种不同的荧光报告探针电杂交M13mp18和M13mp8。在ML-1/M13C-1微定位区上的M13mp18电杂交以24聚体德克萨斯红标记的报告探针(MP18R-1序列)，探针杂交到5’端克隆/限制位点。M13mp8载体电杂交以24聚体荧光素标记的报告探针(MP8-R2序列)，探针杂交到5’端克隆限制位点。
步骤3使用Xba I限制酶限制切除M13
取决于它们的等电点(pI)，许多蛋白质和酶在pH 5-9的范围可带负电(pH＞pI)，不带电(pH＝pI)或带正点(pH＜pI)。大量限制内切酶的等电点在6-7范围。在pH大于pI时，这些酶将带负电荷。因此，当在pH＞7的缓冲液中进行自由场电泳，这些酶将向带正点的微定位区迁移。
对于许多DNA修饰酶例如限制性内切酶，总是需要选择一种缓冲液，该缓冲液能在优化的酶活性和相对快的电泳淌度之间取得平衡。在某些情况下，有可能在大于或小于pI的pH下都具有较好的酶活性。取决于所选择的pH，这些酶可以向正或负偏压的微定位区迁移。
如下进行在ML-1的M13mp18的Xba I切除。使用一个电传送系统Xba I首先自由场电泳到ML-1/M13mp18微定位区。在0.1mA下将在pH7.7的缓冲液中含100单位的Xba 1电传送系统偏压为负，ML-1/M13mp18微定位区偏压为正2分钟。然后降低电流到0.02mA3分钟。关闭电传送系统，同时在0.1mA下使ML-1/M13mp18微定位区偏压为负，ML-3/M13C-2微定位区偏压为正5分钟。这时ML-3/M13C-2微定位区偏压为负，启动电传送系统并在0.1mA下偏压为正2分钟以去除从ML-3/M13C-2微定位区Xba1和未杂交的片段。
通过落射式荧光显微镜观察可以看到在ML-1/M13mp18的红色荧光信号丧失，在ML-3/M13C-2微定位区出现红色荧光信号，验证了M13mp18载体的Xba 1切除。这时对ML-2/M13mp8微定位区重复进行相同的基本Xba切除步骤，以作为负对照。因为M13mp8载体没有Xba 1位点，片段的切除和产生是不可能的。ML-2/M13mp18微定位区因此就保持其绿色荧光信号，在ML-4/M13C-2微定位区观察不到荧光信号。
第二个例子用共价附着到装置上的可寻址的微定位区的限制酶进行限制切除反应。在这种情况下，限制性内切酶将被衍生并自由场电泳到它们能够共价结合的APEX装置的可寻址微定位区。将限制性酶衍生或共价结合到固体载体上的方法对本领域技术人员是公知的。许多不同的限制酶可以寻址到APEX装置上。通过自由场电泳进行特异性的酶切反应以在含所需限制性内切酶的微定位区浓缩ds-DNA载体或DNA样品。ds-DNA将被切除，然后片段移动到装置上的其他微定位区。这时所需的或有用的其它DNA修饰酶将偶联到APEX装置上的可寻址微定位区。另外，这一例子被认为不受DNA修饰酶的限制，因为大多数其它酶都能附着到在APEX装置上的可寻址微定位区。
实施例10电扩增方法
在用非常低靶序列拷贝数的(例如，HIV，脓血感染)杂交分析的情况下，靶DNA序列的增殖和扩增将通过纯化的靶DNA和/或RNA在APEX装置上的扩增使得敏感性提高。扩增也降低了在杂交分析之前非常高产率制备步骤的需要。
APEX扩增方法为DNA迁移、变性、和反应合成提供了完全的电控制。最重要的是不用高温或不需耐热聚合酶或其他热稳定酶就可以电变性杂合体。
作为第一个例子，可以使用DNA聚合酶(Klenow大片段)高保真地完成DNA合成。而不需进行热循环。在该实施例中，以异种使其共价结合到微定位区的方法扩增DNA链。该方法以下面的方式进行：1)将已知靶序列电杂交到在寻址微定位区上的已知序列的俘获探针上，2)通过已用俘获探针处理的DNA聚合酶合成新生互补链DNA(-)，3)将新合成的DNA杂合体电变性，4)进行靶链DNA向非-延伸俘获探针退火，和-链互补探针向新生-链DNA退火。5)用DNA聚合酶进行新生靶链DNA(+)的合成和如2所示的-链DNA的伴生合成，重复这些步骤从而加倍每次的+和-链的数目，和6)通过杂交到特意设计的互补探针上进行扩增靶的大小选择。完整的方法见图17所示，更详细地描述如下：
步骤1)靶序列向俘获序列的附着
将靶序列电泳迁移到含共价结合俘获探针的微定位区(1)。靶序列可以在非靶(基因组)序列背景下存在，但必须在退火到俘获探针之前被变性。最初被俘获的靶序列将有各种长度。
步骤2)与靶互补的DNA的合成
将DNA聚合酶和dNTP’s电迁移到微定位区1。俘获探针为DNA聚合酶提供3’末端，俘获的靶序列提供模板。施加足够的电流维持试剂浓度进行反应。电流可以是恒定或脉冲的，这些参数可以操作以获得不同长度范围的新生互补(-)链。
步骤3)新合成链的电变性
颠转在微定位区1的极性，施加电压分开两条链。电压量和施加时间将取决于杂交DNA复合体的长度和碱基组成。这些参数可以经验确定或从电变性曲线计算出来。
步骤4)引物退火(俘获和互补探针)到DNA链
寡聚体需要退火到+和-链以提供DNA聚合酶的引物位点。对于靶或+链这是通过电泳迁移+链到未伸展的俘获探针完成的。只要未伸展的俘获探针对伸展的共价结合-链DNA是过剩的这就会发生。互补探针电泳到微定位区并结合到共价结合的-链DNA。这时+和-链都有电泳到结合到它们的引物，并是DNA聚合酶催化合成的模板(见图)。互补探针与非共价结合-链DNA的结合也可以产生，但是，这些杂合体不能电变性，因此应对总扩增几乎没有影响。
步骤5)两种新DNA链的合成
重复步骤2，因为+和-链是引物模板，序列特异性DNA的量加倍。重复这些步骤每次DNA的量将几何增加。
步骤6)扩增靶序列的大小选择
互补探针的核酸序列将决定扩增靶DNA的大小和序列。因此，扩增的DNA通常被设计来增强在随后分析和/或操作中的效率。
在本发明中的扩增方法中可以使用其它酶，包括但不限于其他DNA聚合酶、T7或SP6 RNA聚合酶、逆转录酶、DNA连接酶和聚核苷酸phosphoreaylase，和其他核酸修饰酶(核酸内切酶、核酸外切酶)的结合。
实施例11：电控制器和数据系统
所有的装置，不管是APEX芯片还是微加工的装置，都具有可寻址微定位区(或宏定位区)阵列的特性。计算机控制/数据收集系统被设计来对阵列中的所有垫片各自施加电势并测量在微定位区电解液系统中产生的电流。计算机控制/数据收集界面提供：
a)显示微定位区的阵列。高电平和低电平显示在最高电平图下为所有微定位区的视图提供微定位区区段的分辨率，在较低电平下为它们提供完全分辨的微定位区区段。
b)在微定位区上的点击将弹出微定位区的窗口视图，该视图详述了微定位区的的特性，允许以各种类型、电势大小和标记等的信号时序设定微定位区的控制，显示覆盖在其他微定位区的控制时序。菜单为控制设计、观察的实际控制信号和收集的数据提供分析、记录和归档功能。
c)软件提供通过从b)描述的阵列控制软件所发出的输入所控制的硬件接口提供所有的切换和数据收集。
d)一个单独的硬件和软件系统提供图象收集和处理能力。这一系统成像微定位区阵列和记录在主动微定位区DNA结合相互作用发出荧光信号，以提供DNA结合实验结果的读出。图象处理软件提供定量处理这些图象和取出定量分析结果的能力。这一软件与阵列控制器/数据收集软件充分接口，以提供一个记录APEX装置控制/电解液现时数据和图象数据分析结果的集成系统，分析数据以提供关于这些结果的一致性和可靠性的辅助信息，和归档所有的数据和分析结果。
e)APEX控制器将结合所有的这些软件以及只提供“DO分析”的顶层，如果必要的话可再加一个存取a)到c)功能的按纽，但在所有的情况下a)到c)都将收集和存档。
f)用来开发本项目的控制器的初始版本使用麦金托什苹果机Quadra950作为主计算机，并使用与Quadra 950接口的国家标准仪表板(NationalInstruments)以提供如上所述的硬件接口。这些板对APEX微定位区使用可变电势，并测定在电解液系统中产生的电流。在这一控制器中使用的国家标准仪表板是高分辨力多功能I/O板，NB-MIO-16XL-18，模拟输出板，NB-AO-6，定时输入/输出板，NB-TIO-10，块模式DMA和GPIB接口板，NB-DMA2800，和模拟信号调节模块板和热电偶模块，以及其他的环境传感器，5B系列。在Quadra中的NuBus板和APEX装置之间的连接将通过安装在SCXI-1001机壳上的SCXI 16-道SPDT继电器模块板连接。
实施例12电控制的样品制备和杂交分析-集成APEX系统
样品制备通常涉及细胞的选择；细胞材料的破坏(例如，溶胞)，一系列分离步骤和亲和反应。样品制备对分子生物反应是很重要的。例如，由于在样品制备过程中的低效造成实际靶DNA序列大量丧失通常限制杂交实验。
用于电控制的基本APEX概念可以用于在DNA杂交试验中的样品制备。电方法将允许样品制备，细胞选择和分析在APEX元件的主动电系统进行。样品制备将从细胞选择和溶胞、在样品中从细胞和胞外材料粗分离DNA开始。电装置将电处理样品DNA并把它有效迁移到装置的分析元件上，同时去除其它的材料。系统提供有效处理靶DNA的合适的放大系数。对于人类基因组分析，电样品制备将包括一步高效的预杂交步骤，通过这一步骤大多数非特异性DNA的复合体将从靶DNA中分离出来。
有样品制备的集成装置或完整的APEX系统将抽取相对粗的样品(血液、唾液、尿等)，并用最小的机械操作和射流技术进行处理，然后电传送靶DNA到装置的分析元件上。这一“主动电处理”不同于通常是机械型手工处理和技术的自动化或机器人处理。
可以使用许多全基于通常APEX概念的元件制造集成DNA样品制备和分析的APEX系统。该系统的元件包括(1)电细胞分类单元；(2)电试剂分配单元；(3)电废物处理单元；(4)粗DNA选择器单元；(5)附属的DNA或限制片段选择器单元；(6)DNA片段储存单元；和(7)APEX分析单元(芯片)。集成APEX系统如图6所示。
这种系统可以在大的硅基片上制造。或者是，通过微光刻或微加工技术并在特意设定的平台单元上安置(即插入)制造各个元件。设计整个系统的元件使得其主动面积与其样品大小和样品(例如细胞)中的物质的量成比例。例如，细胞选择器主动面积通常比粗DNA选择器主动面积大，而粗DNA选择器反过来又比限制片段选择器活性面积大，限制片段选择器比APEX分析芯片有效面积大。
例如，细胞选择器的“主动面积”可以是几平方厘米的数量级，而64微定位区APEX分析元件的总“有效面积”将少于1平方毫米。平台单位被设计来在密封的共用缓冲储存室中容纳所有的元件单位。达几百微升的合适的样品通过临近细胞选择器元件的样品添加口加到系统中。细胞选择器元件是一个较大的APEX装置，对不同的细胞类型有几个或多个选择亲和性。这些亲和选择可以基于细胞表面电荷、半抗原和抗原进行。
例如，可以对全血样品亲和选择以从红细胞选择白血细胞(淋巴细胞等)。可以使用高选择性的方法从血样品材料中选择胚细胞。也可能为感染微生物(酵母、真菌、细菌和病毒)提供亲和选择。当选择的细胞保持与细胞选择器元件附着；所有的其他细胞和蛋白质材料被迁移到废物处理单元。在这时细胞可以通过带电去垢剂和/或促溶剂，和/或合适的水解酶和蛋白酶(溶菌酶、蛋白酶K、胃蛋白酶等)的从电试剂分配单元自由场电泳迁移到在细胞选择单元的细胞上而溶解。适当的电废物处理系统可以用来溶解废物材料。这时可以使用正偏压的粗DNA选择单元以迁移粗核酸(DNA/RNA)材料到这一元件。
粗DNA选择器是对DNA有普遍亲和性的APEX装置。这一亲和性可以是带正电的，或带常见或重复DNA序列。例如，一个Alu重复俘获序列将有效俘获大多数的从体细胞提出的粗DNA。当以感染疾病分析为目的时可以使用常见或基因细菌或病毒序列。除了从DNA去除多余的材料；APEX系统还能设计来降低样品DNA的复杂性。这可以通过使用限制性酶以在粗DNA选择器单元选择性切除DNA。限制性镁从试剂分配单元迁移出。这时通过使它偏压为正切除的限制性片段可以从次生的DNA或限制性片段选择单元。这一单元被设计来使用在其表面的合适的复活序列选择结合大的DNA片段。
这时，选择的DNA片段可以被迁移到APEX分析芯片进行杂交分析。也可能把DNA片段迁移到储存单元或甚至迁移出系统。上述这些例子只是代表样品制备和多杂交分析的某些可能的方案。元件的结合亲和编程能力和结合不同元件和功能的灵活性允许实现很多种类的方法。
实施例13用组氨酸和其他两性离子缓冲液的电杂交
在这些实验中使用的缓冲液和化学物质购自Sigma(圣路易斯，蒙大拿州)，Aldrich(密尔沃基，威斯康星州)，ICN Biochemicals(奥罗拉，俄亥俄州)，宝灵曼(印第安纳波利斯，印第安纳州)或Calbiochem(圣地亚哥，加利福尼亚州)。寡核苷酸合成’97)，或购自OligoTherapeutics(威尔逊威尔，俄勒冈)。肽核酸(PNA)寡核苷酸类似物由博大生物系统(PerSeptive Biosystem)合成。
微电子芯片，渗透层和仪器
除了下述之外与上述相同。这里所用的渗透层在顶层含抗生物素蛋白链菌素琼脂糖层(总厚约1微米)。为了制备下层，在涂布抗生物素蛋白链菌素-琼脂糖层之前将50ml乙二醛琼脂糖(2％)以2000rpm旋转20秒钟。简而言之，用于这些实验的5580系列APEX芯片由在阵列的每一个角有200nm微电极5×5阵列的80cm圆形微电极组成。芯片被安装在微操作台上并用电源和适当的可控继电器开关激发微电极。使用594nm HeNe激光倾斜照明肉眼观察在芯片上的荧光标记的寡核苷酸，使用NIH成像或IPLab光谱软件包对图象进行量化。
积聚和杂交
将两种生物素标记的俘获寡核苷酸、ATA5和ATA4进行电迁移并定位在临近的微定位区。去除溶液并在试验缓冲液中洗涤3-4x。在这些研究中使用的缓冲液列于表3，并以所列出的pH和浓度使用。
                                     表3
  溶液   浓度   pKa1   pI   pH2   电导
  甘氨酸甘氨酸β-丙氨酸GABA半胱氨酸半胱氨酸3(τ)-甲基组氨酸D-组氨酸L-组氨酸肌肽1(τ)-甲基组氨酸吡啶咪唑可力丁   50mM250mM50mM50mM50mM250mM50mM50mM50mM50mM50mM50mM   2.34，9.602.34，9.603.60，10.194.03，10.561.71，8.3310.781.71，8.3310.781.70，5.879.1631.78，5.978.971.78，5.978.972.64，6.83，9.511.64，6.468.6135.196.996.99   5.975.976.907.305.025.027.527.477.478.177.54---   6.016.116.716.765.08nd47.447.707.658.077.598.179.089.85   2.5+/-0.27.8+/-0.53.6+/-0.65.6+/-0.69.0+/-0.921.8+/-4.439.4+/-0.457.1+/-0.360.1+/-0.174.5+/-5.5117+/-2.85.0+/-0.817.6+/-1.633.0+/-0.9
1.数值得自Budavari，S.(1980)，Merck Index，11版，Merck & Co.Inc.Rahway，NJ，除非另有标注。
2.在室温水中测定缓冲液的pH。
3.Remelli，M.Munerato，C.和Pulidori，F.(1994)，J.Chem.Soc.DaltonTrans。2049-2056。
4.nd＝没有测定。
使用氨基酸的L-异构体，除非领有标注。芯片在试验缓冲液中平衡5-10分钟。然后使用含10nM BODIPY-德克萨斯红标记的RCA5(btrRCA5)与ATA5互补的寡核苷酸但不含ATA4(RS paper)的新鲜缓冲液。
ATA5       5’-GATGAGCAGTTCTACGTGG-3’-生物素
ATA4       5’-GTCTCCTTCCTCTCCAG-3’-生物素
btrRCA5    btr-5’-CTACTCGTCAAGATGCACC-3’
将200nm的微定位区用作阴极，在阵列中的一个微电极用作相应的阳极。通过对各个微定位区提供500nA的恒定电流30秒钟，并监测在微电极阵列中正偏压的(阳极)位点上荧光的积聚评定积聚状况。减去从非荧光源产生的信号(即，热噪声等)。以类似的方式对不同电流对信号积聚的影响进行检测实验，除了施加电流从100nA到1mA变化。在起初5秒的信号积聚中计算起始速率，其中，在所有的缓冲液中都观察到线性荧光积聚。为了比较各种缓冲液的电导性，使起初荧光的数据增加数倍，以解释在信号水平的芯片对芯片变化以及激光照明变化。对于其他实验，在把观察的荧光强度转化为标记的寡核苷酸摩尔数后，以微微微摩尔产物对时间表示数据。
在一个微电极定位区聚集后，去除缓冲液并加入含btrRCA5的新鲜缓冲液。临近的微定位区以同样的方式提供电源。完成后，去除缓冲液，用不含btrRCA5的试验缓冲液洗涤芯片5-7x。然后照明预先靶定的微电极对定量在每一位点存在的荧光。对照实验利用bodipy-德克萨斯红标记的与ATA4互补的寡核苷酸以检验ATA4俘获寡聚体的完整性和浓度。杂交百分率如下计算：(互补寡核苷酸信号-非互补信号)/(在施加电流那一刻存在的信号)×100。
缓冲液电导和pH测定
在RT使用一个与Accumet型50pH/离子/电导仪(Fisher Scientific)连接的Acument 1.0cm-1玻璃电导池测定用于迁移和杂交的试验缓冲液的电导。使用一个Accu-pHast可变温度复合电极和相同型号的电导仪测定缓冲液pH值。
微pH测定
使用在其他地方(Horrock‘93)已经描述的方法制造锑电极，除了下面微小的改动。θ玻璃，世界精密仪器，萨拉索塔，佛罗里达州)双柱型电极，另外，所有的毛细管被手工拉到最终尖端直径估计为75微米。使用上述pH测定相对于Ag/AgCl参比电击锑电极的电势。锑电极的标定产生57mV/pH的斜率，这与其他文献值一致(Horrock’93，Bicher’72，Matsumara’80，Glab‘89)。当通过显微镜进行观察，使用一个机动的X-Y-Z微操作器把锑电极降低到琼脂糖涂布的芯片的表面，直到观察到电极弯曲。然后把电极升高到一定高度，恰好高于所观察的拐点。从锑电极到芯片表面的距离测定为7微米。然后把锑电极的尖端以一倾斜角定位在各个微电极孔之上，以使扩散效应最小化(Horrock‘93)。在50mM KCl、50mM组氨酸、50mM咪唑或50mM GABA中使用200nA或500nA获得pH读数。
被动杂交与电场杂交
将ATA5电靶送到上述制备的抗生物素蛋白链菌素/琼脂糖包被的芯片上的微阵列的起初4列上，将ATA4靶送到剩下的列上。对于被动杂交，在5x SSC(1x＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸盐，pH 7.0)施加5.0nM或0.5nM btrRCA5 1分钟，然后在缓冲液中洗涤6x并成像。对于3分钟的时点，施加含btrRCA的新鲜缓冲液并孵育另外2分钟以达到3分钟的累积孵育时间。对剩下的时点重复这一方法。使用在50mM组氨酸中的5nMbtrRCA5进行类似实验。对于电场杂交，施加在50mM中的5.0nM或0.5nMbtrRCA5。总共使用3.1V(约500nA/位点)，电靶送五个位点，4个预先附着以ATA5，一个预先附着以ATA4。在对所需的时间段施加电流后，在组氨酸中洗涤6x并成像。对于表明的次数以类似的方式通过靶送新鲜的在组氨酸中的btrRCA5到预先未靶定的位点获得数据点。在被动和电场介导的杂交，在ATA4位点存在的背景信号减去在ATA5位点存在的信号。
磷酸二酯连接的寡核苷酸与PNA类似物的杂交的比较
在pH 7.410％甘油，25mM NaCl，25mM磷酸钠中使用Eppendorf微操作器5171和Transjector 5246将30μM生物素标记的寡核苷酸或这些寡核苷酸的PNA型微沉积在抗生物素蛋白链菌素/琼脂包被的微阵列的各个位点。孵育30分钟后，将芯片用水洗涤。寡核苷酸序列和PNA类似物序列如下：
DNA1：生物素-CACCTGCTTTGATAGCTG
PNA1：生物素-0-O-CACCTGCTTTGATAGCTG，O＝接头
DNA2：生物素-GATGAGCAGTTCTACGTGG
PNA2：生物素-O-O-TGTACGTCACAACTA
报告DNA：btr-CAGCTATCAAAGCAGGTG，btr＝与报告DNA互补的BODIPY-德克萨斯红DNA1和PNA1，其中DNA2和PNA2起到对照作用以评定非特异性杂交。用在50mMGABA或50mM组氨酸中的5微升DNA报告探针进行电杂交。芯片在200nA或30秒或在500nA 30秒电激活。在每一电杂交后，将芯片用相同的缓冲液洗涤几次。在最后电杂交后，用0.2xSTE(20Mm NaCl，2mM Tris-HCl，pH8.0，0.2mMEDTA，pH8.0)和0.1％十二烷基硫酸钠浸洗芯片几次，并最后进行成像。如上计算杂交率。
在不同的pH进行被动杂交
将生物素标记的ATA 5和ATA4靶送到用抗生物素蛋白链菌素/琼脂糖包被的微阵列的临近位点。将在其等电点(pH＞＞7.5)，或用HCl调节到或者pH 6.0，5.0，4.0，或3.0的50mM组氨酸中含100nM btrRCA5的缓冲液加到每一芯片并使之反应10分钟。在6x SSC中进行平行杂交实验。在杂交后，如上在0.2x STE，0.1％十二烷基硫酸钠中洗涤芯片几次，定量在每一位点剩下的荧光。荧光值就是在ATA4位点的荧光值减去临近的ATA5位点的荧光值并把剩下的荧光转化成btrRCA5特异性杂交的微微微摩尔数。在这一方法中重复另外实验，并还检查用浓缩的乙酸(在等电点或pH6和5)。观察到类似的结果。
结果
缓冲液组分对寡核苷酸迁移的影响
为了促进互补核酸在稀释溶液中的杂交，样品必须在俘获序列之上浓缩。这就引起环绕俘获的区域内检测时间(Cot)的局部增加，通过质量作用增加杂交速率。在恒定的电流条件下，电荷将被在溶液中的所有的离子种类迁移，从而溶液的电导将决定寡核苷酸携带的电流部分。因此，希望低电导溶液以使寡核苷酸更迅速迁移和聚集在阳极上。为了测量它，荧光标记的报告基因寡核苷酸被电靶送到定位区，其中互补或非互补寡核苷酸预先已经被附着。然后对几种不同的缓冲液(表3)在对应于施加电流的时间聚集荧光信号。我们注意到最终聚集达到一个平台。因此，为了准确测定电导的效果，我们测定了聚集的起始速率。图20示出了对选择的代表性的缓冲液的分析。荧光信号的最初增加与缓冲液电导的倒数(即，溶液的电阻)比较。这一曲线表明溶液电阻与信号的聚集之间基本上是线性关系。溶液越导电，寡核苷酸聚集的速率越缓慢。
有趣的是，在半胱氨酸中的聚集速率(在图20中两组数据都在横坐标之上并远离截距)比基于起始电导所预计的速率低。一个可能的解释是半胱氨酸的巯基在电压低于水解所需的电压时是电化学反应的(Davis’66)，并产生多余的反应离子或分子。因此，除了溶液的起始电导之外的因素也可能支配缓冲液例如半胱氨酸的电泳特性。
如上所述，我们还注意到荧光聚集的逐渐放慢，不同缓冲液之间的速率不同。在恒定的电流，在一定时间离子强度梯度从电极进入到主体溶液中(Oldham’88，Newman’91)。这就导致在溶液中的电导增加恰好电极之上。这种电导的增加引起较低的淌度，或DNA聚集速率的降低。另外，当DNA在电极上聚集，扩散增加对抗电场介导的DNA迁移，也表现为总聚集速率。最后，达到一种稳态，其中扩散速率等于电场迁移，造成没有寡核苷酸的净聚集(Newman’91)。另外，当它们遭遇电化学介导降低的pH与寡核苷酸匹配的区域时(见下)寡核苷酸的淌度下降。最后，在反应后期荧光信号被电化学淬灭，信号丧失。
如果核苷酸自己携带电流，带电寡核苷酸的迁移将根据与施加电流成比例进行预计。然而，在图21的分析表明随着电流的增长没有线性行为。当施加的电流增加信号聚集的速率看来达到一个平台。这一效应对组氨酸这种比GABA电导更高的缓冲液更具有戏剧性。非线性聚集速率与在较高电流下离子组成的构建更快或缓冲液的产品分解不一致。
应用到杂交的电场的影响
图22示出了寡核苷酸的电浓度对杂交速率的影响。在这一实验中，寡核苷酸首先被导向到然后锚定在微阵列的选择的位点上。相应的荧光标记互补寡核苷酸，或者被以高盐缓冲液(5xSSC)导入，并允许被动杂交，或者以50mM组氨酸导入，并电靶送到俘获寡核苷酸上。如图所示，被杂交寡核苷酸的电靶送速率是被动杂交的30到40倍多。在缺少施加电场的情况下使用组氨酸没有观察到杂交，不管进行多少时间。因此，浓缩自身并不能充分解释在电场中寡核苷酸杂交效率显著的增加。
除了迅速的迁移和信号在碘片上的高水平的聚集，D]GABA、b-丙氨酸，以及甘氨酸都不能支持序列的特异性杂交。半胱氨酸则很难评定，因为其信号聚集很差。相反，当使用非互补俘获序列作为对照时组氨酸表现出特异性杂交。互补俘获信号序列水平对非互补俘获信号水平的比率可以作为特异性的指示。图23示出了被发现在促进电杂交中有效(互补＞非互补，P＜0.05)的缓冲液的比较。这些缓冲液包括组氨酸、取代的组氨酸、和杂环类例如咪唑、吡啶和可力丁(异种三甲基化的吡啶)(图5)。在表4中列出的缓冲液中的共同特性是弱碱的存在，例如咪唑环，其pKa值接近中性。
                          表4
  缓冲液   被迁移1，2   特异性杂交 1 (微微微摩尔)   杂交率 3
  吡啶咪唑可力丁3-甲基组氨酸D-组氨酸L-组氨酸肌肽1-甲基组氨酸   764+/-66528+/-63382+/-63259+/-48490+/-50533+/-65129+/-45141+/-20   12.8+/-4.221.2+/-6.614.1+/-4.654.0+/-14.8119+/-11.878.0+/-9.133.7+/-12.130.0+/-5.0   1.74.03.720.824.314.626.121.3
1.数据以值+/-SEM的形式列出。
2.在完成电靶送后出现荧光信号。
3.杂交率＝{(特异性杂交)/(迁移的)}
相反，不支持杂交的缓冲液不含这种缓冲基团。两性离子缓冲液例如GABA尽管有高的聚集，但不支持电杂交，再次说明除了寡聚体浓缩之外的因素很重要。这些结果表明在中性pH的缓冲能力对这些条件下支持杂交可能是一个重要的特性。
进一步分析表4揭示在杂交相对效率之间有显著的差异。这就是说，在数据中出现了两组明显不同的组。一组由咪唑、吡啶和可力丁组成。同其他缓冲液，D-和L-组氨酸、肌肽和甲基化的组氨酸衍生物相比，这些化合物产生的杂交率低5倍多。(这些实验被设计来揭示杂交率的差异，并因此在不饱和现有的俘获位点的条件下进行)。更有效的缓冲液都含有咪唑或取代的咪唑环，在支持杂交方面比咪唑自身更有效。这就表明在这些分子上的其他官能基团也有助于杂交过程。
在表4中列出的最后方面是同其他组氨酸类的化合物相比，L-组氨酸相对低的杂交率。因为特异性杂交是基于从特异性信号中减去非特异性信号，因此这些参数的任何一个都会影响最终的杂交率。同迁移的材料相比，评定非特异性信号的水平表明L-组氨酸具有较高的非特异性信号，同其他组氨酸类缓冲液为1％或更抵相比为2.2％。在L-组氨酸中高残留的原因不清楚，然而其他实验表明这一背景信号可以不必更多的清洗就可以去除。可能的原因是与其他组氨酸类衍生物比较L-组氨酸中的迁移稍高，造成某些域浓度，这样更多的荧光寡核苷酸进一步浓缩在渗透层，并因此更难于去除。从吡啶得出的结果某种程度上支持了这一可能性。当与咪唑或可力丁比较，吡啶具有较高的迁移和非特异性信号，但是，在它那一组中，它也具有最低的杂交效率。然而，与L-组氨酸中的非特异性相互作用不同，寡核苷酸和有可能渗透层都不能被清除。
pH对杂交的影响
如上所述，这些成功地支持杂交的缓冲液具有可滴定的取代基，其pK值等于或接近中性pH。这将是非常重要的，因为在迁移中在阳极(俘获位点)上电解产生酸。为了评定pH对杂交的影响，一个约75mm外径的微pH电极被构建和位于各个电极位点上恒定的距离。因为水的水解在电极(或在电化学双层上)上产生质子，从电极表面到渗透层向外，并向外到溶液有一个质子梯度。在图24a和b所示的pH测定值可能比渗透层顶部锚定的寡核苷酸的受到的pH要多少高一些。在缺少缓冲液的情况下，即使在低的电流水平200nA，(图24a和b)也能观察到pH显著的降低。在500nA，微缓冲的系统显示出pH极迅速的下降，并产生气泡(图6B)。相反，GABA在低电流下在缓冲pH某种程度上更加有效。对于200nA或500nA的电流组氨酸和咪唑被证明在维持渗透层上的pH为5以上更加有效。
这些发现表明咪唑环起到缓冲组氨酸和咪唑在这些pH范围的主要根源的作用。相反，GABA不具有这一基团，因此必须依赖羧酸酯基团在低pH下进行缓冲。这些低的pH不支持寡核苷酸孔的杂交(Bloomfield’74)。或者是，在中性附近不能变得质子化可能阻止这些缓冲液提供屏蔽带负电的磷酸骨架之间的排斥作用的阳离子。
为了弄清楚GABA不能支持杂交是酸环境还是不能提供足够的阳离子屏蔽的结果，用中性骨架(PNA)代替俘获寡核苷酸的带负电的磷酸酯骨架，并检验替换的效果。PNA杂合体被证明具有类似的亲和性，但很大程度上是盐依赖的(Egholm’93)。在图25中显示了检查PNA替换效果的四组实验的的一组代表结果。该图表示使用PNA或DNA俘获寡核苷酸和一个共用的荧光标记的DNA寡核苷酸在组氨酸和GABA中的比较。可以看到在200nA下在GABA中的杂交在不带电荷的PNA骨架寡核苷酸和DNA报告寡核苷酸之间，对相应的DNA：DNA配对没有观察到杂交。因为达到了类似程度的局部核苷酸浓度，这就表明磷酸二酯骨架的屏蔽杂交过程是在这些条件下的一个重要部分。这一观察进一步通过在200nA的GABA中和500nA的组氨酸中获得的pH(图24)而得到支持。在200nA的GABA中没有观察到杂交，尽管pH的范围与DNA：DNA杂交的相近。因此一些除了pH之外的成分看来对杂交是必需的。
然而，如果pH降低到临界水平之下，酸性将对于支持核苷酸碱基之间的杂交太强。这可以解释为什么在500nA下GABA中PNA：DNA或DNA：DNA双链体不能杂交的原因。
相反，在组氨酸中的DNA：DNA杂交只在500nA下产生，而PNA：DNA杂交在所有电流下都有几乎相等的效率。在组氨酸中比在GABA中这些电流对应于较高pH值。在200nA，溶液的pH＞＞5，在500nA，pH＞＞5。因此，在200nA同在500A相比，较少的组氨酸分子被质子化。较高浓度的质子化的种类将适合于屏蔽磷酸二酯骨架并允许DNA杂交。
为了检验是否组氨酸有助于杂交，在组氨酸中进行被动(非电)杂交。如图26所示，在其等电点的组氨酸不能有助于杂交。在这一pH，不管多么长的时间组氨酸分子几乎不拥有净正电荷。相反，在pH 6.0和5.0的组氨酸促进杂交。因此，在组氨酸支持杂交的能力和其质子话程度之间看来有对应关系。通过含近1M盐的SSC与50mM组氨酸对比有更高的效率证明屏蔽可以是更有效的。然而，因为溶液变得更酸性，在组氨酸中的杂交降低。这可能是由于对寡核苷酸自身的影响以及对增加组氨酸的质子化没有贡献，而组氨酸的质子化将增加在组氨酸上的净正电荷并有助于杂交。和前面的结果一起看，因此在这些条件下包括浓缩、维持pH在近中性和产生合适屏蔽核苷酸磷酸二酯骨架的阳离子类都促进电介导的DNA：DNA复合体杂交。
讨论
将电场施加到微规模的寡核苷酸阵列上将使得杂交反应显著增强和精确控制。这些优点通过使用低电导率或某些两性离子缓冲液来增强。一般地，在施加电流的情况下这些低离子强度的缓冲液允许寡核苷酸有效迁移到离散的位点。因为在被动条件下这些缓冲液对杂交是不适宜的，这就为杂交的控制提供只提供了可编程的阳极位点。除了浓度的质量作用效应，我们的结果表明电化学介导的产生的带正点的缓冲液离子也有助于杂交过程。我们已经注意到在这些条件下支持杂交的低电导缓冲液选择的小组。因此，我们可以通过应用缓冲液和电流把迁移从杂交分离出来。
这一编程的pH梯度使得杂交区离散激活，并对微点子装置是一种新型的应用。在我们所说的情况下，缓冲液起到两个作用：1)尽可能维持pH接近中性；2)主动参与反应。实际上，如果pH低至临界域值之下，杂交将被阻止。简而言之，在减轻在阳极水解产生的有害pH效果上，我们形成了对杂交反应有利的一些缓冲液种类。
有趣的是，这些缓冲液支持杂交过程的的效率取决于所具有的官能团的特性。这就是说，一旦满足在杂交窗口内具有的缓冲能力和并结果产生带正电种类的标准，其他的官能团也可能影响杂交过程。组氨酸和相关分子比咪唑自身的效率增加5倍也可以反映出组氨酸能在咪唑环以及伯胺上维持正电荷。向简单的二价阳离子盐例如Mg++，这两个正电荷将更有效地减少骨架的排斥作用。进而这些两性离子的修饰可以导致杂交率额外增加。
对这些微电极装置的利用才刚刚开始。随着我们对这些装置的行为和允许它们优化使用的条件更清楚的理解，它们的利用将从核酸扩展到其他带电物质上。最终，通过合适的显微装置它们可以代替我们目前的分子生物装置。
尽管DNA被用作首要的例子，上述装置和方法也可以用于处理和分析靶RNA分子、蛋白质、多糖、脂质和其他大分子。
所有参考的刊物在在这里都被引用作为参考，包括在每一刊物中列出的核酸序列和氨基酸序列。
实施例14双链DNA片段的电杂交和单碱基错配分析
下面描述了在基本上含双链(ds)核酸靶序列的样品中进行迅速的电杂交和单碱基错配识别的基本实验步骤。在这一实施例中，靶材料是从镰刀形红细胞阳性人胎盘组织中扩增的β-球蛋白序列的123个碱基对(bp)PCR扩增子。β-球蛋白序列含有镰刀形细胞突变位点(密码子7)其中有一个A---→T的碱基变换。
标准的有80微米试验位点(微定位区)的25位APEX芯片被用于这些实验。芯片被覆盖上一层0.7微米的厚/薄琼脂糖(见实验13)，其中上层含有抗生物素蛋白链菌素，以提供要寻址的寡核苷酸生物素俘获探针的附着位点。三个不同的俘获探针被电寻址到在25微定位区APEX芯片上的5行试验位点之一的2，3，和4试验位点(列)位置。这些俘获探针是(1)GCAP-1，与野生型β-球蛋白靶序列互补的24聚体序列；(1)GCAP-2，与错配(突变)序列互补的24聚体序列；和ATA-4，与野生型β-球蛋白靶序列互补的17聚体序列。序列如下所示：
GCAP-1    5’-CAGACTTCTCC(T)CAGGAGTCAGGT-3’-生物素
GCAP-2    5’-CAGACTTCTCC(A)CAGGAGTCAGGT-3’-生物素
ATA-4     5’-GTCTCCTTCCTCTCCAG-3’-生物素
使用下面的方法寻址上述俘获探针。在50mM组氨酸(pH 7.4)中的约500uM浓度供应每一探针。约5ul的GCAP-1俘获探针溶液被加到第2列芯片表面的主动区域上。电寻址条件是每微定位区200那安培(nA)1分钟，同时使寻址的定位区相对于偏压为负的周边对照垫片偏压为正。然后用50mM的组氨酸进行浸洗。接着将约5ul的GCAP-2俘获探针溶液加到芯片表面的主动区域上并电寻址到第3列中的五个微定位区上。电寻址条件是每个微定位区200nA 1分钟，同时使寻址的定位区相对于偏压为负的周边对照垫片偏压为正。
最后，将5ul的ATA-4俘获探针加到芯片表面的主动区域，并电寻址到第4列芯片的第5微定位区上。电寻址条件是每微定位区200nA 1分钟，同时使寻址的定位区相对于偏压为负的周边对照垫片偏压为正。
使用标准的PCR条件进行镰刀细胞阳性人胎盘组织的PCR扩增。这时将约2vl PCR扩增材料直接从PCR反应试管中取出并与98vl 50mM组氨酸(pH 7.4)混合，将样品加热到100℃并迅速冷却到室温。然后将5vl这一样品直接加到芯片表面。然后将在芯片上的每一行(1到5)的三个试验定位区(在2，3和4列)通过偏压为正(相对地周边对照电极偏压为负)杂交到产生1.8vA直流电(每一试验位点为60nA)的三个试验微定位区2分钟。在电杂交到试验位点后，用组氨酸和40mM磷酸钠/500mM氯化钠(pH 7.4)缓冲液进行洗涤。然后用与靶扩增序列的另一部分互补的荧光(bytr)报告探针被动杂交芯片5分钟。应当指出的是如果扩增子具有已经结合(通过PCR引物之一)的荧光标记，或如果使用插入染料技术之一能检测杂合体，这一步骤不是必需的。在报告探针杂交后，用组氨酸缓冲液洗涤芯片。在20mM磷酸钠/Tris(pH9.5)下进行电严紧控制，在如下的电流水平使用150DC脉冲(0.1秒/0.1秒切断)30秒(对每行的三个试验位点)：
  行   电流(vA)/3个垫片   错配/匹配率
  (1)(2)(3)(4)(5)   1.61.71.81.91.8   1.3到11.4到12.0到11.8到11.7到1
在进行电严谨控制后通过测定荧光强度的相对差异确定匹配/错配率。可以看到，最优选的电严紧控制是对三个点1.8到1.9vA，或对每个点600到630nA。
尽管上述发明为了清楚和便于理解在一定程度上是通过举例和实施例描述的，但对本发明的讲述，本领域普通技术人员而言很清楚可以进行一定程度的改动和修改，而不偏离附加的权利要求的精神和范围。

Claims (11)

1.一种用来在一种主动式电子系统中迁移和杂交DNA的方法，包括：
在所述主动式电子系统上提供一种具有低于100mS/cm的电导率的低电导率的两性离子缓冲液，
把所述核酸电泳迁移到一个微定位区，
向微定位区施加电流和电压以影响迁移，其中，在其微定位区上的局部pH低于缓冲液在其等电点的pH，从而使核酸和位于微定位区的探针之间的杂交得到加强。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于低电导率的两性离子缓冲液是组氨酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，低电导率的两性离子缓冲液是L-组氨酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，低电导率的两性离子缓冲液是D-组氨酸缓冲液。
5.一种用来在一种主动式电子阵列式装置上有效迁移和杂交DNA的方法，该装置具有多个微定位区，并至少在某些微定位区包括探针，该方法包括步骤：
向装置上提供第一种具有低于100mS/cm的电导率的低电导率的两性离子缓冲液，
把所述核酸提供到装置的所述低电导率的两性离子缓冲液中，
向至少某些微定位区施加电流和电势以使所述核酸向选定的微定位区迁移，
将该缓冲液改换成具有大于100mM的盐浓度的第二种缓冲液，和
使所述核酸与在选定的微定位区的探针之间进行杂交。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于低电导率的两性离子缓冲液是胱氨酸缓冲液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于低电导率的两性离子缓冲液是丙氨酸缓冲液。
8.一种用来检测在双链扩增子中的点突变的方法，包括步骤：
向一个主动式、可编程电子阵列式装置提供扩增子产物，
在低电导组氨酸缓冲液中稀释所述产物，
使所述产物变性，
在装置上的组氨酸缓冲液中杂交所述变性产物，
进行严紧型控制以鉴别匹配与错配，和
检测和分析所述产物。
9.根据权利要求8所述的用来检测在扩增子中的点突变的方法，其特征在于严紧控制包括电子严紧控制。
10.根据权利要求8所述的用来检测在扩增子中的点突变的方法，其特征在于该检测是荧光检测。
11.根据权利要求8所述的用来检测在扩增子中的点突变的方法，其特征在于荧光指示探针序列与所述产物杂交。
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