CN1282378A - 利用颗粒标记物检测分析物 - Google Patents

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Abstract

本方法适用于特异性地检测样品中一种或多种分析物,包括将样品中一种或多种分析物与可探测的光散射颗粒特异性地结合,在产生颗粒散射光的条件下照明与分析物结合的任意颗粒,并且在放大倍数低于500倍及无需电子放大的情形下,利用人眼检测一个或多个颗粒所产生的散射光。本方法亦包括在上述条件下以测量分析物的存在为目的而对上述任意颗粒的散射光进行的检测。

Description

利用颗粒标记物检测分析物
发明背景
以下为与本方法有关的、业已存在的检测方法概述。同时这亦是对有助于读者理解本发明细节的相关科学所作的总结。但这不应该被认为承认所引述的任一技术都是权利要求的先有技术。引用的方法这里特此引入作为参考，从而对本发明实践有益的技术步骤和方法不必在此处赘述。因此，申请人特别引入与“结合对”(“binding-pair”)方法学一般方法以及光散射测量方法有关的部分。灵敏的分析物检测方法
结合对(亦称为配体受体，分子识别结合等)技术在生物医学的许多应用上起着重要作用，并且在环境科学、兽医学、医药研究、食品和水质量控制等领域正在获得重要地位。为了检测低浓度样品(低于1微微摩尔分析物/所分析的样品体积)，经常使用荧光，发光、化学发光或电化学发光标记及检测方法。
为了在诊断学领域检测低浓度分析物，化学发光和电化学发光方法正在得到广泛应用。化学发光和电化学发光方法提供了一种探测低浓度分析物的方法，就是通过对发光分子数目或光子产生事件放大多倍以产生“信号放大”，从而允许低浓度分析物探测。
此外，聚合酶链式反应方法和其它相关技术在放大样品中的核酸分析物的数目方面已得到广泛使用。通过加入适当的酶，试剂并使用温度循环的方法，核酸分析物分子数目被放大，从而使分析物可以用最熟知的方法检测出来。在发展新的信号产生和探测系统中的高度商业活动，以及利用信号和分析物分子放大的新型测试试剂盒和仪器件的发展，表明灵敏探测方法的重要性及其需求性。
然而，上述信号和分析物分子放大的方法具有一定的局限性，这使得用这些方法进行探测的过程复杂，不易使用，费时并且价格昂贵。化学或酶反应的干扰问题、污染、复杂且多步骤，对单步骤“均一”(非分开的)方式的有限适用性，以及对昂贵和复杂仪器的需求正是本领域研究人员不懈努力以改进的方面。
因此，很大程度上要求探测分析物的步骤和仪器易于使用，定量，多分析物分析以及价格便宜。如此的步骤，试剂盒以及仪器将克服现有的信号和分析物分子放大方法的缺点和局限性，且将应用于研究，具体的诊疗场所(医生诊所、急诊室、野外等)以及大量的检验应用中。
本发明的目标是提供一种新方法，比以前可能更易于检测样品中一种或多种以前不能检测的低浓度分析物。本发明无需对信号或分析物分子进行放大就可以检测低浓度的分析物。
本发明提供一探测分析物的信号探测系统，且步骤可以简化，步骤和试剂的量与类型可以减少，还可提供对样品中单一或多个分析物进行定量探测的方法。本发明亦可大大减少分析所需的不同测试及样品材料的数量。具体测试数量的减少导致费用降低及废物减少，特别是必须处理的与医学相关的废物的产生减少。光散射检测方法及光散射颗粒的性质
有关颗粒光散射现象，诊断方法中颗粒标记和光散射方法的应用已有大量的研究信息。作为与本发明相关的技术，上述信息将在下面的讨论中加以叙述，但这并非承认任何上述信息对于本发明的权利要求而言是现有技术。基于上述信息的技术作为背景知识提供于此，有益于理解本发明的新颖性和实用性。
光散射的一般研究包括范围十分广泛。近一百年来，光散射现象得到了深入地研究，光散射研究在人类致力发展的不同方面上的应用十分广泛且多种多样。
光散射的经典理论最初是由Rayleigh发展起来的。该经典理论处理较小的、均一的、非光吸收的、直径约为入射辐射波长1/20或短些的球形颗粒的光散射。由均一，任意大小和组成的球形颗粒所引入的光散射较为一般的表象理论是由Mie在晚些时候发展起来的。Mie理论适用于光吸收及非光吸收颗粒。Mie理论亦表明当颗粒尺寸大大小于入射光波长时，Rayleigh散射方法可以容易地推广到适用于吸收光的颗粒情形。对于这些小直径的颗粒，Mie理论和推广的Rayleigh理论给出相似的结果。光散射(弹性)可以用经典或量子力学观点来处理。经典理论可以给出很好的定量描述。
除描述散射光和其它电磁辐射的基本理论以外，下面的参考文献还提供了历史背景：《小颗粒的光吸收和散射》(1983)，C.F.Bohren，D.R.Huffman，John Wiley and Sons；《光和其它电磁辐射的散射》(1969)，M.Kerker，Academic Press。
下列出版物提供了光散射现象的进一步的背景信息。
Zsigmondy在《胶体和超微显微镜-胶体化学和超微显微术手册》(1914，John Wiley ＆ Sons，Inc.)中描述了金颗粒和其它类型的颗粒不同的光散射性质。
Hunter在《胶体科学基础》(第一卷，105页，1991)中描述了光学显微镜，超微显微镜和电子显微镜在颗粒观察方面的应用。
Shaw等在《胶体和表面化学导论》(第2版，41页，1970)中描述了胶体的光学性质和电子显微术的应用以及暗场显微术，如超微显微术。
Stolz在“Springer Tracts”(130卷)中描述了时间分辨光散射方法。
Klein和Metz在《摄影科学和工程》(第5卷，5-11，1961)中叙述了明胶中胶体银颗粒的颜色。
Everso1e和Broida在《物理评论》(第15卷，1644-1654，1977)中叙述了诸如银、金和铜等不同金属颗粒大小和形状对光散射的影响。
Kreibig和Zacharias在《Z.Physik》(第231卷，128-143，19707)中叙述了小的球形银和金颗粒表面等离子体共振。
Bloemer等在《物理评论》(第37卷，8015-802l，1988)中叙述了亚微米尺寸银针的光学性质。在Bloemer美国专利5，151，956中描述了该针的应用，在此专利中描述了金属小颗粒对波导中传播的偏振光的表面等离子共振现象。
Wiegal在“Zeitschrift fur Physik”(第136卷，Bd_642-653，1954)中叙述了胶体银的颜色及电子显微术的应用。颗粒的应用，光散射和其它检测分析物的方法
近35年以来，在许多不同类型的分析和／或诊断研究中，包括金和银在内的金属颗粒作为相差增强工具或光吸收标记而得到应用。上述应用的大部分集中在细胞免疫化学研究领域，该领域已经应用金颗粒或银增强金颗粒作为标记物来研究细胞，亚细胞或组织的结构。在这些研究中，常常使用电子显微术包括扫描、透射电镜术及BEI(背散射电子成像)，探测和定位金属颗粒。这些方法利用金属电子密度性质或金属的高原子序数，依靠密度较高的金属产生大量的二次和背散射电子以利于金颗粒的探测(见Hayat，免疫金银染色参考文献，第1页和第1、6、15章；及Hayat，胶体金参考文献第1、5、7章等)。
在光学显微研究中，对于利用金和银增强金颗粒的应用有许多报道。例如，在1978年，用光学显微术探测了用作免疫金染色的金颗粒。1995年出版的有关光学显微术中金颗粒的应用的评论(见Hayat，免疫金银染色参考文献，第3页)讨论了上述1978年的工作并提出了下列分析：
“Geoghehan等于1978年首先在石蜡切片中利用胶体金溶胶的红色或粉红色进行光学显微免疫金染色。在半薄树脂切片中，利用光学显微术在包含高浓度标记抗原的细胞器内观察到直径为14nm的金颗粒散射的红光(Lucocq和Roth，1984年)。由于光学显微术免疫金染色灵敏度不如其它免疫细胞化学技术，该技术未得到广泛应用；金颗粒沉积产生的粉红色难以观察”。
本段表明在诊断和分析研究中，如何理解应用金及其它金属颗粒的光散射特性。本段特别指出“在半薄树脂切片中，利用光学显微术在包含高浓度标记抗原的细胞器内观察到直径为14nm金颗粒散射的红光”。
然而，用白光照明时，14nm金颗粒散射光主要为绿光。由于颗粒在光学显微镜下呈红色，这表明探测到纯散射光以外的某些相互作用。在光学显微镜下所观察到红光可能主要为透射光而非散射光。当金颗粒在细胞组织切片或其它表面的靶位积累足够多时，透射光所产生的红光将被观察到(亦见，J.Roth(1983)，《免疫细胞化学》，2，p.217；及Dewaele等(1983)，《免疫化学技术》，第2卷，第1页，编者为Bullock和Petrusz，Academic Press)。
在上面所提到的引文中，光学显微术中免疫金染色的灵敏度似乎被认为不如其它方法的高，而且金颗粒作为标记物在光镜中的应用未得到广泛接受，由Gao所著1995年出版的评论书中，第12章第198页上涉及相同题目的一段文字引用于下：
“胶体金由于其电子致密性质及二次电子发射特征(Horisberger，1979)，最初仅作为标记物在电子显微术(EM)中应用。在光学显微术(LM)中直接观察胶体金受到限制。虽然使用高浓度的免疫金，细胞可以被这种试剂染成红色，但在光镜水平由于胶体金尺寸太小而无法探测(Geoghegan等，1978年；Roth，1982年；Holgate等，1983年)。”
在上述两段引文中，在光学显微术下对胶体金探测的灵敏度被认为是低的，金颗粒的银增强方法被发展起来以克服这一觉察到的缺点。下面是1995年出版的评论书中的另一段文字：
“在5微米石蜡切片中，引入结合免疫球蛋白的银增强胶体金颗粒(20nm)导致了光学显微术免疫金染色的真正突破(Holgate等，1983年)。这一方法显著地增加了利用光学显微术探测抗原的灵敏度，效率和精度。使用IGSS，在光镜下可观察到直径为1nm的金颗粒。满足IGSS方法的薄切片亦可在光镜下观察到，特别是在使用相差或表面偏振照明的情形下(Stierhof等，1992年)。”
银增强金颗粒方法得到广泛的应用，该增强方法将金颗粒标记物转化为一个金属大颗粒或者尺寸为若干微米或更大的结构。这些结构主要由银组成。在明场光学显微镜下，如此扩大的颗粒可以更容易地被肉眼探测到。用高分辨激光共焦光学显微术和表面偏振光学显微术已经观察到一个个放大了的颗粒。见同一著作26页和203页。
然而，即使使用银增强技术，本领域的研究人员指出该方法的灵敏度和特异性仍达不到其它方法的水平。例如，在T.I.Vener等刊登在《分析生物化学》，198卷，第308-311页，(1991年)上的文章中，作者讨论了一灵敏分析物探测的新方法-胶乳杂交分析(LHA)。在该方法中，他们采用充满了很多高荧光的染料分子的直径为1.8微米的聚合物大颗粒作为分析物示踪物，通过荧光信号探测结合的分析物。下面为上文的一段节录：
“为了评价胶乳杂交分析(LHA)方法的优点，我们将我们的技术与文献中叙述的其它两种间接非放射性技术进行了比较。由于杂交信号银增强链霉抗生物素蛋白胶体金方法为竞争性微粒技术，因此该方法是进行比较的最适当的技术。然而，即使采用了银增强，此方法仍不十分灵敏：使用该方法探测到8pg的λ噬菌体DNA，而用胶乳杂交分析可探测到尼龙膜上0.6pg或2×104λDNA分子。”
Stimpson等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92卷，6379-6383页(1995年7月)上描述了实时探测杂交DNA的方法。作者叙述了靶DNA微粒标记物的使用，其作用如下：
“当用波导的损耗波照射光散射源时只有结合于表面的标记物产生信号。…。损耗波由波导产生，该波被用来从位于波导表面的多DNA捕获区所吸附的微粒标记物散射光波。由于损耗波从波导表面传播仅几百纳米，未结合或解离标记物不散射光且不需清洗步骤。信号强度足够强可进行表面结合测量，并且可以实时研究光散射标记物的解离；即探测是非限速的。在切片上的杂交模式可用肉眼进行评价或者使用带有8位视频帧获取器的标准CCD相机在1/30秒内得到杂交模式以进行定量分析”。实验采用70纳米直径的金颗粒和200纳米直径的硒颗粒。使用硒颗粒时得到较强的信号。作者指出：
“在4和40nm DNA之间可产生能鉴别单碱基的足够强的波导信号。因此该波导信号可与荧光信号系统相比。”
此方法使用波导和损耗波类型的照明。此外，该方法与目前基于荧光的探测系统的灵敏度一样高。直径70nm及70nm以上的颗粒为优选颗粒。
Schutt等在美国专利5，017，009中叙述了探测配体或配体结合配偶体的免疫分析系统，该系统的探测方式比较复杂。这种系统基于以下探测：
“通过免疫反应使胶体金标记物存在于界面，损耗波因胶体金的存在受到扰动产生背向散射光。…将探测器置于高于临界角的某一背向角位置上，这可以保证系统具有高的信噪比”。
作者解释了该免疫分析系统利用散射的全内反射，即损耗波的传播。他们指出胶体金的存在干扰了损耗波传播，导致散射光产生，这一点可通过光电倍增管或其它光感元件探测散射光提供一反应信号而探测到。他们指出他们发明的一个重要方面是探测器的物理位置。
“探测器的理想位置为高于临界角的一角度。位于该角度时，探测器仅探测背向光源散射的光波。因此，该位置理想地避免了探测大量液体介质内的占优势的散射光”。
入射光束的全内反射被用来产生照明的损耗波模式，并且探测在光学透明的表面上进行探测。优先应用特殊装置。
Leuvering等在美国专利4，313，734中叙述了探测特异性结合蛋白的方法。该方法将“直径至少为5nm的金属，金属化合物，或包被金属或金属化合物的多聚核酸的水分散相中”的颗粒结合起来以获得标记的成分，利用这种标记成分进行探测。该方法据说特别适合于预测诸如半抗原、抗原和抗体等免疫化学物质。金属颗粒据说已经作为相差增强标记物在电子显微术中使用，但是金属颗粒则明显地应用在免疫分析中。
“未曾报道过，而在目前则令人惊奇地被证明是可行的。
                   *        *       *
根据业已不断发展的本发明，金属溶胶颗粒，免疫化学技术不仅比已知的放射或酶免疫技术更为灵敏，而且通过使用不同化学组分的溶胶颗粒作为标记物进一步使同时显示和测量相同测试介质中两种以上的免疫物质成为可能”。
金属的实例包括铂、金、银和铜或者它们的盐。
“对于在反应混合物一特定相中的金属和/或所形成的包含金属的聚集物的物理性质和/或浓度，可以通过很多技术进行测量，这些技术本身是已知的。举例说明这些技术：在色度测量中，可以利用一些色散的浓色随生理化学条件变化而改变颜色的性质；根据金属溶胶具有颜色这一前述事实，光学方法已经常在定量测量中应用；火焰发射分光光度术或等离子体发射分光光度方法的应用使同时探测成为可能，无火焰原子吸收分光光度术方法具有高灵敏度”。
一样品中两个或两个以上分析物的探测可优先选用火焰发射分光光度术或等离子体发射分光光度方法。对于要求最高灵敏度的探测，可以选用无火焰原子吸收分光光度术方法。
Swope等在美国专利5，350，697中叙述了测量散射光装置。在该装置中，光源的位置使光波以小于临界角的方向入射样品。探测器位于探测临界角包络以外的散射光的位置。
Craig等在美国专利4，480，042中叙述了光散射免疫分析中高折射率颗粒试剂的应用。优选的颗粒由聚合物材料组成。通过测量由于颗粒凝集或凝集抑制所引起的混浊度变化，确定生物学感兴趣的化合物浓度。优选的颗粒直径近似小于0.1μm且大于0.03μm。“较短的波长，如340nm，比较长的波长，如400nm，给出较大的信号区别”。
Cohen等在美国专利4，851，329中及Hansen在美国专利5，286，452中叙述了利用光脉冲颗粒尺寸分析或光流颗粒分析仪探测凝集颗粒的方法。这些系统据说可用于测量抗原或抗体浓度。这些方法使用复杂的装置和特殊的信号处理方式。在Cohen的方法中，优选颗粒直径约0.1至1微米；而在Hansen方法中，优选颗粒直径约为0.5至0.7微米。
Okano等在1992年出版的《分析生物化学》(202，120)中叙述了一复杂的三明治式免疫分析方法。该方法使用微颗粒，其数目可在倒置光镜上计数。微颗粒直径约为0.76微米，且羰化微颗粒由丙烯酸制成。
Block在美国专利3，975，084中，Kuroda在美国专利5，274，431中，Ford，Jr.在美国专利5，305，073中，Furuya在美国专利5，257，087中及Taniguchi等在美国专利5，311，275中叙述了其它颗粒探测方法。
Geoghegen等在《免疫通讯》(第7卷，1-12，1978)叙述了利用胶体金标记兔抗羊IgG对其它抗体进行非直接探测。使用光镜和电镜探测标记颗粒。金颗粒平均尺寸为18-20纳米且应用明场光学显微术。在电子显微术中，使用了环氧树脂银-金薄切片。“免疫荧光方法和胶体金明场方法观察到相似百分比的表面标记细胞”。电子显微术可以探测到每个细胞标记上1-5个颗粒，但是作者指出：
“荧光或明场显微术未探测到如此小的标记数量。这样小的标记数量可能表示非特异性Fc受体结合GAD和GAM；在此情形下，GAD和GAM处理的细胞表面上存在低水平的表面免疫球蛋白(S.Ig)”。
Hari等在美国专利5，079，172中叙述了利用电子显微镜对抗体反应中的金颗粒进行探测的应用。例举了15nm的金颗粒。在优选的方法中，使用了电镜。
DeMey等在美国专利4，420，558中叙述了利用明场光学显微术方法计数金标记抗体标记的细胞。该方法利用明场配置的光学显微镜，且计数金标记的过氧化物酶阴性细胞时，放大倍数为500倍或更高并使用油浸透镜。对标记表面的观察基于金颗粒的聚集性质。在指出的条件下，金颗粒经历广泛的斑点化；这些位于细胞表面的斑点可用上述方法分辨。40nm的金可给出最佳光学结果。
De Mey等在美国专利4，446，238中叙述了一类似的明场光学显微免疫细胞化学方法。该方法对组织切片中作为红色标记物的胶体金标记免疫球蛋白进行定位。作者叙述了免疫金染色(IGS)方法：
“在两种方法中，终产物均是大量的金颗粒在包含抗原的区域内聚集，因此产生胶体金溶胶典型的红色”。
DeBrabander等在美国专利4，752，567叙述了利用明场或表面偏振显微术探测直径小于200nm的单个金属颗粒的方法，并且叙述了用视频象机进行相差增强。发明人指出：
“在上述步骤中，所使用的典型金属颗粒直径约为10至100nm。一般认为明场显微术的分辨率大约为200nm，显然上述金属颗粒的直径小于明场显微术的分辨极限。因此，所有已知的视觉光学显微方法在探测金属颗粒固定的聚集物时，其应用性均受到限制，这是明显符合逻辑的。只有使用超微显微技术，特别是电子显微术，才可能观察到单个颗粒。
目前十分令人惊奇地发现，如果用电子相差增强处理所产生的象，则在可见光范国内可利用明场光学显微术或表面偏振显微术可以清楚地看到直径小于200nm的单个金属颗粒”。
在以下的部分，作者指出：
“与基于溶胶颗粒免疫分析的现有诊断方法比较，本方法具有高得多的灵敏度。一般而言，现有方法的确基于大量吸附或悬浮金属颗粒的光吸收或散射。对颜色的观察，如在印迹介质上，明显地需要大量颗粒的存在。与此形成对比，本方法使观察和计数单个颗粒成为可能。因此，本方法将大大促进诊断印迹方法应用的发展，现有技术，如视觉或色度技术，灵敏度太低，例如在检测肝炎时”。
Schafer等在1991年出版的《自然》(352卷，第444-448页)叙述了纳米尺寸金颗粒的应用，利用视频增强差分干涉相差显微术可以观察到该类颗粒。一个40nm直径的金颗粒被使用。
DeBrabander等在《细胞迁移与细胞骨架》(第6卷，第105-113页，1986年)(及美国专利4，752，567)中叙述了亚显微金颗粒和明场视频相差增强技术的应用。当使用5-40纳米直径的金颗粒，明场视频相差增强显微术明确地观察到细胞。他们亦指出：
“单个金属颗粒尺寸小于正负100纳米，吸附在玻片或细胞上，或者经显微注射入细胞时，利用光学显微镜无法看到它们。然而，当利用视频象机在电子学上对相差进行增强时，可以容易地观察到。
作者叙述了偏振光表面照明和反射光收集的应用，或者使用单色光和简易象机、透射明场照明的一种“比较方便且明显更为灵敏的方式”。
作者指出利用相差显微术可以容易地探测到金颗粒：
“当使用较大金颗粒(通常20-40nm)时，观察是可能的。与之不同的是，即使5nm金颗粒的致密积累，如在微管等结构上，也无法在光学显微镜上观察到。5nm金颗粒不能产生可探测的红色。最近，通过一物理方法的发展使这一缺点得到改进。在该方法中，使用银盐增大金颗粒的尺寸，这样可产生易观察到的黑色染色。
                  *         *        *
我们叙述了几乎可在分子水平定位配体的方法。在该方法中，由于分散的，单个的标记物可以明确地与背景结构分开，所以该方法使得人们第一次利用光学显微镜在接近分子水平上定位配体。因此该方法是全新的。由于此方法甚至可用于活细胞，人们因此可以追踪各个蛋白的动态行为。因为该方法将两种很成熟的技术-金标记和视频显微术-结合起来，所以该方法是。使用价格不贵的视频设备，可以完成大多数有关该方法的应用。上述视频设备的价格低于最佳的100×油浸式物镜。进一步而言，将该方法与现代数字图象处理相结合可提供更为广泛的许多应用可能性。一些附加优点值得注意。标记由单个、分散的标记物组成，所以手动和自动(计算机辅助)计数简便且可靠。标记物的较小尺寸使穿入和扩散问题降之最小程度。在该方法中，可以几乎随意地改变标记物电荷。这种可能性有助于在任何特殊应用中消除非特异性结合。”
作者将该方法称之为“纳米颗粒视频超微显微术或短纳米视频超微显微术”。Geerts等在《自然》(第351卷，第765-766页，1991年)上叙述了与之相似的技术。
通过对光散射方法目前发展水平、光散射颗粒应用及在诊断学领域光散射方法应用的讨论，可以清楚地看到目前分析物检测方法的局限以及本发明的新颖性和极大的应用性。本发明的目的不仅在于克服目前基于光散射的诊断分析方法的局限性和缺点，而且还可以克服其它诸如信号和分析物分子放大等的非光散射方法的局限性和缺点。此处叙述的本发明容易使用，探测灵敏度高，分析物浓度测量范围比此前可能分析的范围要宽。本发明作为分析物探测的信号发生和探测系统广泛适用于大多数样品类型和分析方式。发明概述
本发明是以探测和测量样品中一个或多个分析物为特征的一种新方法。该方法基于一定颗粒的特定组成，尺寸和形状以及探测和/或测量该颗粒一种或多种光散射性质的应用。对于颗粒光散射性质的探测和/或测量与样品中一种或多种分析物的存在与否，和/或其含量有关。本发明是多用途的，可以不同方式来探测和测量样品中一种或多种分析物。
本发明涉及将分析物与至少一种可探测的光散射颗粒结合，颗粒尺寸小于照明光波波长，对样品中一种或多种分析物进行探测的方法。该颗粒的照明条件为：放大倍数低于500倍，人眼可探测到由颗粒引起入射光波的散射光。在上述条件下，由颗粒引起的散射光作为一种或多种分析物存在的量度而被探测。仅仅通过确保适当的照明及特异散射光的最有效探测，申请人惊奇地确定可以产生一种极为灵敏的探测方法。光波照明和探测的方法被申请人称为“DLASLPD”(定向入射光波角度使仅有颗粒的散射光被检测到)。
本方法和相关装置的设计使之能够最有效地探测仅由颗粒产生的散射光，因此其灵敏度比使用荧光团或者这类颗粒在上述诸方法中的应用要高出许多倍。使用一低放大倍数显微镜(放大倍数2至500倍，如10至100倍)且信号无需任何电子放大，就可以探测这类颗粒。此外，还提供了无需显微镜或成象系统的测量方法。在该方法中，光波通过液相或固相样品时受到散射；液相或固相样品的一种或多种光散射特性被探测，可以利用这些光散射特性来确定任何特殊样品中分析物存在与否或其含量。
一般而言，光源不需要以任何特殊方式加以处理(如：偏振，或激光或高强度)，而仅需要使之定向以保证探测由颗粒所引起的散射光。可以使用空间滤波来确保减少非特异光散射。其它仪器装置和减少杂散光的样品室可以作为空间滤波的辅助设备。
定向光波可以是多色或单色的，稳态或脉冲的，相干或非相干的。它不必是偏振的，并且可由诸如发光二极管(LED)这样的低功率光源，或12瓦灯泡等产生。正如Stimpson在前文中所描述的那样，光波为非损耗波。光波以一定角度入射可能含有颗粒的样品。当以该角度入射时，除非入射光被颗粒散射，否则其本身不会被探测器检测到。该方法和装置与Swope文中的不同之处在于在临界角范围内，优先选择照明角度范围，这样的散射用肉眼可观察到。然而，在高于临界角的位置上以及在散射光前进方向的强度包络之外亦可探测到散射光。当使用一成象装置时，如显微镜，本方法优先使用垂直于样品平面的探测器。
与在“发明背景”中所叙述的诊断技术不同，申请人发现对特定类型颗粒的探测和测量可以达到很低的浓度和高度的特异性，并且可以利用易于操作且价格较低的方法和装置在宽浓度范围进行探测和测量。本发明在分析物探测上与已知方法相比，使用更为方便，灵敏度和特异性更高，并且价格便宜。
通过理论模型和物理实验的方法，申请人已经证实与未包被的金属样颗粒相比，包被的金属样颗粒具有相似的光散射性质；与非金属样颗粒相比，两者均具有优越的光散射性质。“金属样”颗粒意指任何颗粒或颗粒样物质，它们由金属、金属化合物、金属氧化物、半导体(SC)、超导体组成；或指这样一种一个颗粒，它由混合组分组成，包含至少0.1％重量的金属、金属化合物、金属氧化物、半导体、或超导材料。“包被”颗粒系指在颗粒表面具有一层附加的金属。该层金属的作用为在不同样品环境中从化学上使颗粒稳定和/或通过分子识别机制结合成特定分析物。这样的包被举例有：无机和/或有机化合物、高聚物、蛋白、肽、激素、抗体、核酸、受体等，“非金属样”颗粒指其不由金属、金属化合物、超导体、金属氧化物、半导体组成，或其混合组分中不含至少0.1％重量的金属、金属化合物、金属氧化物、超导体、或半导体材料。
申请人亦已证实：(1)通过探测和/或测量金属样颗粒的一种或多种特异光散射性质即可探测和测量某一样品中的一种或多种分析物。这些光散射性质包括散射光的强度、波长、颜色、偏振、角度依赖性、以及RIFSLIW(散射光强度和/或波长的独立旋转涨落)。颗粒散射光的一种或多种上述这些性质可以用来提供有关样品中分析物的信息；(2)通过以不同的组合方式改变金属样颗粒的尺寸，和/或形状和/或组分，可以使一种或多种光散射性质产生极容易被探测和测量的光散射信号；(3)利用DLASLPD照明和探测一定尺寸、形状和组分的金属样颗粒可以提供通过光散射性质探测和测量金属样颗粒的高灵敏度且易于使用的方法。该方法提供了用于单颗粒探测的易于使用和价格便宜的装置；(4)DLASLPD方法可与颗粒计数和/或积分光强度测量结合使用，以在宽浓度范围内探测和测量颗粒；(5)使用折射率增强方法可以增强一颗粒的光散射性质，和/或降低非特异性光的背景；(6)使用DLASLPD视频相差增强方法可以提高许多不同类型样品及诊断分析方式探测的灵敏度；(7)对于以微阵列和阵列芯片方式存在于小固相区域中分析物的灵敏探测，一定类型的金属样颗粒比其它颗粒优先使用。以微阵列和阵列芯片方式排列的金属样颗粒通过DLASLPD方法可以进行最容易且价格不贵的探测。通过激光扫描共焦显微术，明场或表面偏振显微术，及反射相差和差分干涉相差显微术，亦可探测以上述形式排列的这类颗粒。然而，这些方法和装置不如DLASLPD方法易于使用，且价格较贵；(8)可以建立适用于特定试剂盒的装置和颗粒类型。这些不同的试剂盒和有关装置适合于用户使用，也便携野外使用和各类医疗卫生地点，如医生诊所，临床门诊，急救室等，研究实验室和集中的、大批量的测试。本发明的上述各方面可以提供对许多不同样品类型及诊断分析方式中一种或多种分析物进行探测。
正如将在以下进行更详细讨论那样，存在许多不同类型的颗粒、光源和光探测机制。此外，所用颗粒的类型可进行许多改变。
在优选实施方案中，颗粒的尺寸，组分和形状适合于产生特定波长的特定光散射信号、颜色、偏振、角度依赖性，以及由眼睛或光电探测器方法可探测的散射光的RIFSLIW；探测包括颗粒计数的方法，和/或作为颗粒浓度的量度测量散射光的强度；颗粒由金属样材料形成或由包括非金属样材料的混合组分形成，颗粒为球形、椭球形、或非对称的(非对称指形状偏离球形)；颗粒包被为粘合剂，高聚体、化学反应基团、基本材料分子、无机和有机化合物；利用二次结合对将一个或多个光散射颗粒与分析物结合；在分析方式中，当两个或多个颗粒相互接近时，散射光性质将发生变化，这一现象被利用；包含金属样材料及用基本材料分子包被以适合于与结合物结合的颗粒被使用；两个或两个以上颗粒足够接近以使这两个或两个以上颗粒的光散射性质可与单个颗粒的区别开，这一分析方式被使用；将相互很接近的两个或两个以上颗粒分开以使任何一个颗粒的光散射性质发生改变，此分析方法被使用；两个或两个以上颗粒由一种或两种以上分子相互作用连结起来，当将颗粒连结在一起的分子相互作用受到破坏时，一个或多个颗粒被释放，这分析方式被使用；通过使用化学或生物交联剂将两个或两个以上颗粒交联起来以使分析物探测得到放大，此分析方式被使用；用药靶物质进行分析的方式，药物靶物质包括细胞表面受体、细胞间受体、细胞间信号蛋白、G-蛋白耦合受体以及离子通道，蛋白酶、激酶、DNA结合蛋白、核酸和激素等，它们可被用于筛选、识别和特征化新的药物。磁珠和其它珠可作为固相，并检测与珠子结合的光散射颗粒或在探测之前被释放到溶液中；颗粒由附加材料组成以使颗粒在电场、磁场或相关的电磁场(EMF)中定向排列起来；颗粒与具有磁或铁电性质的其它颗粒结合在一起；被用的光散射颗粒有磁或电泳性质，导致电场或磁场分别能使光散射颗粒集中在样品的一个或多个区域。选择某一波长的照明光束，与其它波长光束相比选择该波长的光束可降低背景。
在其它实施方案中，照明光为稳态或脉冲的；照明光是相干的或非相干的，照明光是偏振的或非偏振的；从同一光源或从两个或两个以上不同光源产生的两个或多个不同波长被用来照明样品，而散射光信号则被探测。
在其它实施方案中，所用方法使用许多不同颗粒，每一颗粒具有一种或多种散射光性质，利用眼睛或光电探测器可以探测到这些物质；和/或在照明或探测步骤中使用多种不同波长的光；为了降低非特异性光的背景，采用了折射率增强方法；探测器置于一定角度位置，这些位置位于样品和光束散射光前进方向包络之外。使用空间滤波方法，在探测步骤中为了降低非特异性背景光，使用了光学滤波片，如截止和/或窄带通滤片。
在又一个实施方案中，在探测前利用自动金相显微术方法增加颗粒的尺寸；照明光束不含红外辐射；分析物存在于血清中；在探测前颗粒被释放至溶液中；在探测前颗粒被浓缩成一小体积或固相区；通过时间依赖结合至一表面或使颗粒流动通过一探测器或一套探测器对颗粒进行探测；多分析物以固相微阵列形式被探测；固相微阵列形式包括核酸、蛋白、肽、抗体、抗原物质，药物或靶或其它结合剂，这种模式和束缚到某一阵列或微阵列不同区域的光散射颗粒的数量可用来决定基因表达和蛋白表达的水平，可用来识别核酸序列，识别有机物或细胞或特殊链，因此，也可用来识别药物剂的药理属性。微阵列浸没在液体中或是干燥的；在细胞表面、细胞溶解物、或染色体制备上的单个或多个分析物被探测；照明光束为复色白光或单色光；分析物存在于溶液或固相中，或在显微镜载玻片上，或微滴定板或试管、毛细管、流动池、微型通道装置、小容器、探测尺或另一种塑料容器；颗粒为金颗粒或银颗粒，尺寸为1至500nm，优选为10～200nm；探测步骤不包括使用电子学方法对散射光进行放大；照明光束由棱镜或其它光导系统导向颗粒。
此外，探测可包含至少一10倍物镜以观察颗粒；使用DLASLPD视频相差增强方法，光纤光学照明和探测被使用；使用明场，激光共焦扫描，反射相差或差分干涉相差显微术探测方法；一种装置可用来对样品进行扫描和在样品的一个或多个区域内探测散射光强度。在每个被测量的探测点，有被探测光散射信号重新组成了样品的一个或多个区域的二维图象，用一种仪器来收集样品的一个或多个区域的图象。用图象光电探测器来探测颗粒，再利用图象分析工具，可以获得样品的一个或多个区域的数字图象，在样品中，用直接观察法或图象分析法可探测和测量颗粒的一种或多种性质。在样品内，边缘探测方法可用来识别颗粒，成象中的颗粒根据被探测和测量的一种和多种性质进行辨别和分类，这些性质包括灰度、基于不同强度的颜色、尺寸、形状，或这些性质的某种组合。通过计数被识别的颗粒，求出被识别为颗粒的象的整个区域的单个象素的强度值之和，而且求出被识别为一个颗粒或一些颗粒的组合的每个象区的平均强度值之和，那么在样品中，光散射的数量就可以确定。对组合合成分子进行探测和纯化；使用颗粒和/或特殊包被作为组合或其它合成分子的固相合成支持物；使用特殊设计的样品室；对光学元件和样品室镀制减反膜；仪器装置可供野外、医生诊所、门诊和医疗机构使用；适当的试剂盒中提供特殊颗粒类型。
本发明信号产生和探测系统的灵敏度高，且使用方便，这意味着本领域技术人员可以使用费用不高的方式探测和测量一样品中极低浓度的一种或多种分析物，而不需使用信号(标记)或靶分析物分子放大的方法。
本发明中来自不同颗粒类型的特异光散射信号范围很宽，这意味着本领域中的技术人员可以对一样品中的一种或多种分析物进行高度特异性的探测和测量。
本发明对两种或两种以上不同颗粒类型的高光学分辨能力意味着实现对一样品中多分析物十分简易的探测(如两个或两个以上不同分析物)是可能的，且无需复杂装置。
本领域的技术人员将认识到申请人发现了应用性十分广泛的新方法和装置。本发明可以各种方式适用于大多数情形，在这些情形中需要使用一信号产生和探测系统作为检测系统的一部分以数量表示和/或探测一分析物的存在与否。除了所有种类的生物细胞和组织，如此分析物还包括所有类型的工业和药物化合物、蛋白质、肽、激素、核酸、脂、和碳水化合物。本发明的各种应用模式可以适合于大多数检验方式，这些检验方式在所有种类的诊断检验中是通用的。例如，它们包括复杂和简单的检验方式，具有三明治类型、聚集类型、间接或直接类型等。样品类型可以是液相、固相、或混合相。
从下面对优选实施方案的描述及权利要求中，可以明显看到本发明的其它特点和优点。优选实施方案描述
首先简要叙述附图。附图
图1表示从样品下方对样品照明。L为一透镜；D为透镜的直径；O表示在表面S上被探测的区域；C为透镜L收集光的孔径角；LB表示照明光束。
图2表示一透镜的收集孔径角。D为透镜的直径；f为焦距的长度；O为探测区；θH为收集孔径角的平面半角。
图3定义在一表面上描述反射和折射所用的角度。S为表面，ni和nt分别为入射介质和表面介质的折射率；RFRB和RFLB分别为折射光束和反射光束；IB为入射光束；θi、θr、和θt分别为光束的入射角，反射角和折射角。
图4A、4B、和4C为当ni＜nt时用不同方式表示的光反射图。
图5A、和5B为当ni＞nt时用不同方式表示的光反射图。
图6表示对空气中干燥表面上的颗粒照明时所产生的折射和反射。
图7为n2=1．5，n3=1时，将θi2对θi1作图所得到的曲线(见图6)。
图8表示由表面人造物和颗粒所引起的散射光角度分度；虚线表示颗粒引起的散射光；带有箭头的实线为入射白光束和一束由表面人造物所引起的散射光。圆圈为散射光在前进方向上的强度包络。
图9表示显微镜载玻片上一样品薄膜水层，该样品层由盖玻片包被。照明光束与4个介质界面相遇；S1(空气到玻璃)；S2(玻璃到水)；S3(水到玻璃)；S4(玻璃到空气)。颗粒位于表面S2上的0点或在表面S2上方自由运动。入射光从表面S1入射。
图10表示从上方照明样品。L为透镜；C为收集光锥。
图11表示使用棱镜配置进行照明(从下方照明)。S1为棱镜表面，入射光从该表面入射；S2和S3分别为一塑料片衬底的下表面和上表面。
图12A、12B、12C、12D和12E分别表示一有孔棱镜(pore prism)(12A)、一等边棱镜(12B)、一自制棱镜(12C)、以及一平凸透镜(12D)。
图13表示用诺丹明塑料块观察照明光束。
图14表示一表面和有关平面，该表面及平面用于描述图15；S1为光学透明或不透明的固体衬底；SP1为表面S1平面上方的3维空间；SP2为表面S1平面下方的3维空间。光散射颗粒或材料位于SP1内或表面S1附近。
图15对DLASLPD照明和探测的不同方法作了总结。
图16表示对于包被和非包被的直径为100nm金颗粒而言，实验测量的散射光强度与入射光波长之间关系的曲线。
图17、18和19表示不同样品室的设计，其目的在于减少非特异性光的背景。这些样品室可用来测试液体样品和固定样品。在图17中，光束从S1表面入射样品室；S2表面包含光散射材料(对于固定样品)。S3为另一倾斜的表面；根据照明的角度，S1和S3表面的倾角从约20度至70度进行调整，S1表面倾角应使入射光在S1表面入射时与法线的夹角为零；S4为光学透明表面，该表面具有或不具有一开口；S5是与S2表面相对的面。如果样品室是封闭的(即S4表面不带开口)，为了样品的放入和需要时做清洗，在某一表面上将有一小开口。
图18表示的样品室与图17的设计相似，所不同的是倾斜平面被曲面代替。而其它部分则与图17的设计完全一样。
在图19中，S1为光学透明的倾斜平面，入射光从该表面入射到样品室。S1表面的倾角应使入射光在S1表面入射时入射角为零；S2表面包含固定的光散射材料；S3为另一曲面或倾斜平面。对于一封闭样品室来说，S4为光学透明表面；S4亦可带有一不同大小和形状的开口，用于样品清洗和探测；S5为与S2面相对的面。如果样品室是封闭的，为了样品的引入和/或清洗，在某一面上需有一小开口。
图20表示用来描述颗粒与偏振光相互作用的坐标系，光沿y方向传播且在z方向上偏振。D为散射光强度探测器。γ为观察方向。θ和φ分别为锥角和极角。
图21为用于分析液体样品的仪器简图。通过一透镜系统会聚来自灯丝或放电光源的光。该透镜系统用透镜L1表示使之照明单色仪的入射狭缝，；从单色仪出射的单色光由透镜L2收集并透镜L3会聚至透明的样品室(ST)中心；样品室含有荧光分子溶液或光散射颗粒悬浮液；样品室可调至某一角度或倾斜以使从其表面反射的光向下偏转且避开光电探测器；由样品散射或发射的光由透镜L4收集，在M平面上形成样品室和液体内容物的放大象。在M平面上放置一小光栏，该光栏有选择性地使样品室中心处液体所发射或散射的光进入光电探测器，并且挡住从样品室池壁反射或散射的光进入光电探测器；由于样品室倾斜后池壁折射率效应的影响，位于M平面上样品室液体内容物中心处的放大象偏离了透镜L4的光轴；光电探测器和光栏位于透镜L4光轴的一侧以使液体中心偏离后的象落入光栏和光电探测器；为了在照明及散射光路中放入滤光片和/或偏振片，提供了光具座(H1和H2)；在光电探测器前面，放置了光快门。由于光电探测器的光敏区域较小，所以用透镜L5将通过M平面上光栏的光会聚至光敏区域。如果不需要单色光，则单色仪可以方便地移开；从灯丝或放电光源产生的光可直接经透镜L1、L2和L3进入样品室的中心。
图22、23和24概述了使用光散射颗粒和特异DLASLPD的方法，该方法导致了特异性试剂盒和装置的应用。
图25概述了一装置和检测方法的建立过程。
图26A、B、C、D、E和F表示散射光强度计算值与入射光波长的关系。散射颗粒分别为球形的、直径为10nm的金、银、铝、铜、硒和聚苯乙烯颗粒。Lk为波长；Csca为光散射截面。
图27A、B、C、D、E和F表示对应于不同尺寸金颗粒散射光强度计算值与入射光波长的关系。A、B、C、D、E和F分别对应于直径为10、20、40、60、80和100nm的球形金颗粒。REL CSCA为相对光散射截面；WAVE NM为波长。
图28为一球形包被颗粒的简图。(1)为聚合物、结合剂、或在颗粒表面上的其它物质；(2)为核心颗粒。
图29A、B和C表示MLSP(可处理的光散射颗粒)混合组分颗粒。A(1)为由(2)理想光散射材料包被的核心磁或铁电材料；B表示由(3)磁或铁电材料包被的光散射材料；C表示(5)光散射材料和(6)磁或铁电材料形成的混合物。
图30A、B和C分别表示对于可定向MLSP颗粒的二聚体、四聚体和高级颗粒结构。(1)为光散射可探测颗粒，(2)为磁或铁电颗粒。线(3)为化学、离子、或其它连接，在多颗粒结构中，通过这些连接使颗粒结合起来。
图31表示被探测散射光强度具有一系列不同直径的粗糙球形金颗粒的浓度之间的关系。
图32表示被探测散射光强度与和固相有关的、直径大约为60nm的粗糙的球形金颗粒的强度之间的关系。
图33表示由光散射颗粒引起的光散射探测仪器图。用一聚焦透镜(200)和光屏装置(500)，照明光源(100)向样品(400)提供光束。调整照明角度，用光屏装置聚焦光束和准线，可确定在样品内被照明区域的面积和方位。一样品暗盒(300)可用来存放样品，在三维空间中，根据照明光和探测光调整样品的位置。照明光定向射入样品(400)，结果很少或没有杂散的，或被反射的光进入收集光(600)中。通过改变透镜的不同组合，调整收集光，结果获得了该样品的
一种可见的理想场。通过收集光，样品的辐射光束聚焦到图象光电探测器(700)上，图象光电探测器的输出和光学数字转换器(800)和图象处理器(900)相组合，也可以说，光学数字转换器和图象处理器(900)是微处理器的控制器或计算器(100)的零件或附属。微处理器的控制器或计算器控制着数字化图象到计算机屏幕或存储介质的转换。
本文使用下列缩写。
E-EMR-发射电磁辐射
I-EMR-入射电磁辐射
EMF-电磁场
SC-半导体
Sec-秒
Qf-荧光量子产额
Iabs-入射光吸收(每秒吸收的光子数)。
Io-入射光强度(光子/秒)
M-摩尔浓度(摩尔数/升)
ml-毫升
mM-毫摩尔浓度
g-克
mg-毫克
mm-毫米
μl-微升
pI-等电点
E或e-常用对数摩尔(Molar Decadic)消光系数(M-1cm-1)
C-摩尔浓度(M)
X-光程长度(cm)
If-荧光强度(光子/秒)
Seff-颗粒的散射效率
Cabs-吸收截面(cm2)
ACSR-颗粒吸收截面与颗粒物理截面比
Csca-散射截面(cm2)
SCSR-颗粒散射截面与颗粒物理截面比
a-颗粒的半径
Cext-颗粒散射消光截面(cm2)
I-穿透厚度为X的溶液后出射的每秒光子数
N-颗粒浓度(颗粒数/立方厘米)
t-悬浮液的混浊度
Is-散射强度(光子/秒)
n2-材料的折射率
n2Rel-n2的实数部分
n2Im-n2的虚数部分
n1-介质的折射率
m-颗粒材料折射率与介质折射率比
lo-入射光波长(nm)
RI-折射率因子
Refmed-介质的折射率(n1)
em-介质的介电常数
nm-介质的折射率
a-测量包被颗粒的极化强度
nm-纳米
cm-厘米
μ-微米发明叙述
本发明的特点在于提供了探测和测量样品中一种或多种分析物的方法。该方法基于具有确定组分、尺寸和形状的特定类型颗粒的应用以及一种或多种颗粒光散射性质的探测和/或测量。
与以前可行的方法比较，本发明容易使用，灵敏度和特异性更高，并且能在更宽的分析物浓度范围进行探测和测量。与信号和靶分析物放大方法(如化学发光和PGR)，荧光标记和荧光方法以及以前的基于颗粒检测和光散射方法相比，本发明具有许多优点。本方法是通用的并且在诊断学领域以及其它领域具有广泛的应用性。对于以液相、混合相、固相以及固相微阵列检测方式存在的样品，本方法可以应用于大多数(如果不是全部)标准结合对类型的检测中，如免疫检测核酸检测等。
申请人将叙述主要因素和考虑以使在本领域中普通技术人员可以应用本发明来满足大多数(如果不是全部)分析物探测需要，而不是通过详细说明本发明的某一特殊形式的每一种具体应用来阐明其广泛应用性。本发明的应用将导致产生特定的仪器装置和试剂盒。
此处的叙述可使本领域中的普通技术人员以许多不同方式应用本发明来取得适合于大多数(如果不是全部)样品类型、分析物类型、诊断检测方式类型及仪器装置类型的理想的分析物或颗粒探测可能性。本发明的通用性极强，可应用于以下场所探测一种或多种分析物：野外(远离实验室)、或一个较小的医学或分析实验室，床边、急救室、特殊的医院治疗室(如心脏治疗室、重症治疗室、创伤治疗室等)，研究实验室、且具有每日处理许多样品的能力。以各种方式应用本发明可以制作出不同类型的价格较便宜的仪器装置和试剂盒。
本发明的一些方面可以不同方式彼此结合起来而应用，这确定了本发明在特定应用中检测分析物的能力。这些方面中的两个为(1)在一确定分析方式和样品类型中，具有高度可测量和可探测性光散射性质的各种特定颗粒类型的应用，(2)在DLASLPD照明和探测优选方法中，各种特定颗粒类型的应用。在特定的应用中，折射率增强方法和DLASLPD视频相差增强方法亦得到使用。有效的金属样颗粒光散射特性的确定
下面提供的信息有助于完全理解权利要求所要求保护的发明。这些公式在实际中和发明的最优化中都是有用的，但是不承认其优先于本申请的权利要求。
在开发用来探测当前发明的分析物的新型激发产生和探测系统的过程中，我们发现开发新公式很有用，这些公式允许我们按照光荧光参数来估计不同类型颗粒的光散射特性。这允许我们研究ε、Qf、荧光和激发光谱，发光强度与观察角度的依赖关系，还有发光的偏振态(这些在以后定义)。这些新公式允许此领域中的技术人员来选择特别的颗粒参数，如组分、大小和形状以体现能被探测和测量的预期的光散射特性。这些公式用于诊断性的分析和其他方面的应用。方程1到7表达背景信息，使得读者能理解新公式，方程8到15，这并不会承认已叙述的任何公式和光散射参数是优先于所述的权利要求的。
申请人提出一种分析方法，它基于对已知Rayleigh和Mie光散射理论的某些改进，估计不同类型颗粒的不同参数、大小、形状、组分和均匀性，以判定颗粒参数的什么特征构形导致在分析性和诊断性的检验中易于检测和测量的光散射信号。荧光参数的定义
对于荧光材料，荧光强度决定于每秒吸收的光子数和吸收光子重新发光的比例，如方程1所示。
Iabs(λ)=2.303Io(λ)e(λ)Cx    (1)
式中Io(λ)是入射光强度(光子数/秒)，波长λ，I(λ)是波长入时单位长度的常用对数摩尔消光系数，单位是M-1cm-1，C是荧光团的摩尔浓度(单位M)，x是光路长度，单位cm。
总荧光强度I(λf)(每秒辐射光子在各个方向的总和)在发光波长λf和激发光波长λe时给出下式(针对低磷光团浓度)：
I(λf)=2．303Io(λe)Qf(λf)e(λf)Cx    (2)
按照上述参数，在检验应用中荧光化合物的有用性的估计是众所周知的方法。荧光分子和荧光技术的使用受限于荧光分子发光可靠性，以及在强非特异性荧光，磷光和散射光的水平上检测样品特异性荧光信号的能力。为了灵敏地探测荧光分子和其他荧光物质，诸如由荧光染料分子组成的颗粒，需要更高级的仪器。光散射参数的定义颗粒的吸收截面(Cabs)
考虑颗粒被一束波长为λ的单色光照射。颗粒的吸收截面定义为包围颗粒的面积(单位通常表示为cm2或μ2)，这样，落在这个面积上的任何光子都被颗粒无反射地吸收。Cabs的数值依赖于颗粒的大小、组分、形状和均匀性。它还依赖于光波波长和描述颗粒纯吸收分布曲线的Cabs-λ图。具有均匀组分的任何球形颗粒的Cabs对波长的分布曲线都能由Rayleigh和Mie理论计算出。在我们专门术语中，Cabs与不可逆反射光吸收有关。Cabs的本质能通过下面我们定义的消光截面Cext更好地理解。相对吸收截面Acsr
相对吸收截面Acsr定义为颗粒的吸收截面因子Cabs与颗粒的实际截面积πa2的比值，其中a为颗粒的半径，也就是说，Acsr=Cabs/πa2。Acsr提供了一种方法测量光子照射在包裹颗粒面积上颗粒无反射吸收能力。Acsr依赖于颗粒的组分、大小、形状以及光波波长，在0到6之间取值。比1大的数值意味颗粒能超出颗粒的实际尺寸以外吸引光子并吸收它们。在科学文献中，Acsr被称为颗粒吸收效率因子。这个术语产生了误解，因为Acsr存在比1大的值，而不具有效率的特征。颗粒的光散射截面(Csca)
存在一定几率被散射颗粒吸收(这里包括可逆的和不可逆的吸收)的光子重又以吸收光子相同的波长发射(量子力学观点)。再发射的光子能以不同于入射光子方向发射。这就是说，通过吸收和再发射入射光子被散射。颗粒的散射截面(Csca)在入射光的波长上被定义为包围颗粒的面积，因此落在此面积上的光子将被散射(这就是量子力学观点的吸收和再发射)。Csca通常以单位cm2或μ2来表示，并且依赖颗粒的组分、形状、大小和均匀性，还有光波波长。对于任何均匀组分的球形颗粒，Csca对波长的光散射分布曲线能通过Rayleigh或Mie理论计算出。Csca与颗粒的实际或几何截面Scsr的比值
颗粒的Csca与实际或几何截面积πa2的比值(其中a是颗粒球的半径)提供一种方法测量颗粒从其包围面积上吸引，吸收和再发射光子的能力。这就是Scsr=Csea/πa2。在科学文献中，Scsr称为散射效率因子。
实验和理论的结果表明Scsr的取值范围在1到5或者更大，这依赖于颗粒的组分、形状、均匀性和大小，还有光波波长。一个比1大的Scsr值意味着，颗粒能超过实际尺寸吸引光子，并吸收再发射它们。这可能是因为颗粒与电磁波的电场相互作用能够超出颗粒半径的范围发生。一般说来，Scsr随着颗粒尺寸而增加。对于小颗粒(小于40纳米)，Scsr小于1，而对于较大颗粒Scsr比1大，并能达到5。颗粒的消光截面
颗粒的光散射消光截面Cext定义为散射截面Csca和吸收截面Cabs之和
Cext=Csca+Cabs    (3)Cext的单位通常表示为cm2或μ2。
任何颗粒的消光截面在任何给定波长时用常规吸收光谱仪可以容易测得。设Io(光子数/秒)为照射在悬浮颗粒上的光束强度，颗粒浓度为N颗粒数每立方厘米。X(cm)为溶液的深度，I(光子数每秒)是通过距离x后从溶液出射的光强。此强度与Cext有关，可表示为：
I(λ)=Io(λ)e-NCext(λ)x    (4)这个表达式清楚地表明诸参数依赖于λ。这假定此光电探测器不探测散射光。
当颗粒为纯散射体时，这就是说，单向不吸收光，那么Cext=Csca，并且上述方程可写为
I=Ioe-NCScaX=Ioe-tx    (5)(6)
其中t=NCsca为悬浮物的混浊度。常用对数摩尔消光系数
在化学领域中，溶液中物质吸收给定波长光的能力表示为常用对数摩尔消光系数e，单位是M-1cm-1(M代表摩尔每升)。这个系数与实验确定的吸收相联系，表示为
A(λ)=e(λ)Cx    (7)申请人导出了研究光散射参数的公式
申请人现在简单地表述他自己使用的理论方法。此领域的技术人员能够应用下面的方法，对特异性颗粒的组分、大小、形状和均匀性参数进行计算、修正和调整，以得到一个或更多需要的光散射特性，它们容易被检测和测量。根据样品类型、诊断格式和仪器方法的限制还要作些考虑。例如，在一项申请中，多分析物探测可能适合于在大批量测试装置中处理固相样品，样品包含强非特定背景光，而在另一项申请中，简单的溶液中分析物探测可在医生工作室里进行。
申请人的主要兴趣在于分析性和诊断性检验中的颗粒类型优化。在大多数这些申请中，颗粒必须用大分子物质如聚合物、蛋白质或者类似物质包被，使得在不同介质中有合适的化学稳定性。这在本领域中是众所周知。申请人也把结合剂如抗体、受体、肽和类似物包被在颗粒表面以使已包被的颗粒能用于分析或诊断的形式要求。在某些申请中，结合剂具有两重功能，稳定溶液中颗粒和提供粘结分析物的结合组分的专门识别。对颗粒进行蛋白质如抗体的包被在此领域众所周知。但是，申请人的兴趣在于测量各种颗粒的光散射信号中的一个或更多特定参数，这些颗粒在某些情况下具有相同的大小和/或形状和/或组成，并且还不清楚能否光学分辨它们包被后一个或更多的特异性光散射性质。
申请人通过实际实验和理论模拟认定，对颗粒表面薄层包被结合剂，光还吸收聚合物(在可见光谱区)或其他材料，不会明显地改变那种颗粒的光散射特性。这是与颗粒不包被此类材料时相比较而言的。薄层包被意指在颗粒表面包被上述材料不同数量和组分的单层膜。
申请人认定，对包被或没包被的颗粒悬浮体，其常用对数摩尔消光系数可通过测量某一波长时的吸收来确定。常用对数摩尔消光系数可用公式(7)计算，下面的表达式把颗粒浓度从N(颗粒数每立方厘米)改为C(M)。M是摩尔每升。
C(M)=1000N(颗粒/cm3)/6.03×1023    (8)
常用对数摩尔消光系数与消过光截面Cext(或反过来也一样)有关，可表示为：ε(M-1cm-1)=[Cext(cm2/颗粒)(6.03×1023)]/2.303×1000  (9)=2.63×1020Cext(cm2/颗粒)    (10)或者
Cext(cm2/颗粒)=2.303(M-1cm-1)×1000/6.03×1023    (11)
              =3.82×10-21ε(M-1cm-1)    (12)
利用方程(9)和(10)我们能从Cext中计算出ε。
如前所述，本领域中众所周知，对于颗粒，消光截面(Cext)等于截面(Csca)与吸收截面(Cabs)之和。通过单向光吸收和光散射(吸收和再发射)，消光系数e反映了入射光的损耗。申请人认定颗粒的常用对数摩尔消光系数可以通过实验和计算消光截面计算出来，能够用于比较颗粒的吸收能力和如后面要叙述的荧光的吸收能力。光散射效率(Seff)
申请人认为光散射效率Seff可以定义为：类似于荧光效率Qf，有包被层或无包被层的颗粒在以散射光形式的再发射光与吸收光的比值(单向和双向吸收)。数学上，申请人定义散射效率表达为：
Seff=Csca／Cext=Csca／(Csca+Cabs)    (13)
对于纯散射体的颗粒，也就是说，颗粒由单向不吸收光而是吸收光再发射出去的材料组成，Cabs等于零，Seff等于1。微小聚苯乙烯颗粒在可见光区表现为纯散射体，因此对于这些颗粒Seff等于1。对于由单向和双向吸收光的材料组成的颗粒，Seff小于1。金颗粒在可见光区就表现出后一种行为。颗粒散射光强度
申请人认为有包被层和无包被层颗粒散射光强度能决定于每秒钟吸收光子数(单向和双向)乘以再发射光子与吸收光子的比值(量子力学观点)。散射光强度的测量通常在稀溶液中进行，光吸收强度Iabs(每秒吸收的光子数)表示为
Iabs=Io2.303εCx    (14)
Io是入射光强度(光子数／秒)，ε是常用对数摩尔消光系数，其单位为M-1cm-1，C是摩尔溶度，x是光程长度，单位cm。
申请人又认识到，总的散射光强度Is，为各个散射角光强总和，给出下面关系式：
Is(λ)=2.303Io(λ)Seff(λ)e(λ)(C)(x)    (15)其中Io(λ)为入射光强度，这个方程与描述荧光团的方程(2)相仿。
注意到，从Csca和Cext中得到的ε和Seff的表达式代入上面的方程中，结果表明散射光强度直接正比于并完全决定于散射截面Csca的大小。这意味着不同颗粒的相对散射强度可从它们的散射截面推测出。颗粒的特异性光散射性质
申请人现在简要地总结一些非常重要光散射性质，它们能用于以不同的检验方式检测不同样品类型中的分析物。被测光的可被探测的散射性质为如下性质的一种或多种：强度、波长、颜色、偏振度、角度依赖性和RIFSLIW(散射光强度和／或者波长的周期性独立波动)。
有包被层和无包被层金属样颗粒有相似的光散射性质，并且与非金属样颗粒相比二者都有较多的光散射性质。另外，申请人还认定，通过以一种或另一种方式改变大小、形状、组成和均匀性来调整金属样颗粒的光散射性质是相当容易的，因此特异性光散射属性能够通过各种样品类型的金属样颗粒测量。
金属样颗粒的检测有极高灵敏度，使用DLASLPD照明和检测方法，利用便宜的又易于操作的仪器达到单颗粒的极限便可容易检测独立颗粒。
样品中的一种或多种金属样颗粒，使用DLASLPD照明和检测方法，在白光照明或类似宽带光照明下，测量颗粒颜色而得以检测。例如，样品中近似球形，直径为40、60、80nm的金颗粒(如包被结合剂，粘附在分析物上，稀释于溶液中或者依附于固体中)与大约30nm直径的银颗粒能够很容易检测和定量，这是通过鉴定每一种颗粒类型各自独特的散射光颜色和/或者测量其强度得到的。这种方法适用于固相上如微滴定池或者微阵列芯片，或适用于溶液中。溶液中的测量方法涉及多方面，因为不象在固相方式中颗粒是空间分辨的。例如，让溶液流过一系列探测器，每个用来测量不同的波长或者光谱区以及不同波长时的强度，这样可以探测液体中不同种类的颗粒。另一方面，有或没有流动系统的一系列不同波长的光照明和/或检测可用于测量不同颗粒类型。
对于固相分析的应用，根据颗粒浓度通过从颗粒计数改变为总光强的测量可以探测到金属样颗粒的广泛的浓度范围。颗粒单位面积的密度无论高低都能检测。
在其他的检验应用中，颗粒结合在固体衬底上，如玻璃球，凹坑的底面等，可以调整pH值，电离强度或其他液体性质使颗粒释放入液体中。加入较高的折射率液体，溶液中颗粒的光散射性质可被测量。同样，溶液中的颗粒在测量光散射性质之前可以通过不同的方法浓缩在更小的体积或面积。再者，较高折射率的液体可在测量之前加入。
理论计算和实际的实验都表明，对于任何组分直径达到约120nm或稍大的球形颗粒，颗粒散射的大部分光辐射出散射光前方的包络线(见图8)。申请人认定偏出前向散射光包络线的角度的散射光，检测和测量从光束和其他光被测散射成分和物质的非特异性光有明显的减少。这对许多样品来说，明显增加特异性散射光信号与非特异性散射光信号的比值。
颗粒的散射光强度在不同的方向和偏振态依赖于入射光的波长和偏振态以及颗粒的大小，形状和均匀性。下面我们总结了与某些类型的颗粒在不同方向发射出的光的强度和偏振态有关的一些非常重要的事实。
较小的球形颗粒(与光波长相比是波长的1/20或更小)的形为如各向同性偶极子散射体或发射体，这就是说，光是高度偏振的。这极其不同于荧光分子，它们通常具有线性偶极子发射体的形为。例如，受非偏振光照射的此类颗粒，散射光在φ=0°，θ=90°(见图20)是完全线偏振光(P=1)。这个性质可通过测量与许多不同类型样品中的荧光分子相类似的光散射性质来对分析物进行更特异性的或更灵敏的探测。
对于更大的颗粒(＞1/20光波长)，在一定颗粒度范围内，光偏振度P随着颗粒大小增加而减小，并且依赖于波长。当颗粒足够大时，在方向θ=0，φ=90°，其偏振度变为0。明显存在一定颗粒度范围，偏振度变化最剧烈，也就是说，偏振度对颗粒大小的斜率达到最大值。在斜率变化的这些区域就被使用于分析中，例如，凝聚或集聚类型的分析模式以探测和测量一种样品中一种或多种分析物。
对于在一定颗粒度范围内，如从约200nm到1.2微米直径的更大球形颗粒，在θ=0，φ在90°到-90°之间变化时，光强(单色入射光)在相对值1到0之间波动，参看如图20。这就是说，如果在水平面上(θ=0)观察散射光，那么人眼从φ=90°移动φ=-90°，光强从亮到暗波动。用白光照明，随着人眼从φ=90°移动到φ=-90°，散射光颜色改变。这就是说，颗粒具有衍射光栅的行为。这样光散射特性对于更特异性地和更高灵敏地检测很多不同样品中一种或多种分析物是极其有用的。
微小的非球形颗粒沿着颗粒长轴方向，其形为有点象具有吸收和发射偶极矩的线性偶极子散射体。申请人在DLASLPD照明和探测条件下，通过普通的光学显微镜已经观察下面的情况。当照明光是线偏振的，非球形颗粒随其转动发出闪光。颗粒的取向为其长轴与偏振方向一致时颗粒散射光最强，偶极矩与偏振方向垂直时颗粒散射光最小。相反，微小球形颗粒在偏振光照明下并不发生闪光。对于一定组成物的非球形颗粒，散射光的颜色(在白光照明下)随着非对称度变化而变化。当非对称度增加时，颜色向长波偏移。例如，使用普通光学显微镜在DLASLPD等条件下，申请人观察到，非对称性的银颗粒当其在溶液中转动时颜色发生变化。这个特性被申请人定义为“RIFSLIW”(旋转性散射光强度和或者波长的各自波动)，它使用于这个发明的很多不同方面，以更特异性地和灵敏地探测和测量样品中的一种或多种分析物或颗粒。
申请人也已经认定由金属样材料和非金属样与金属样材料构成的某颗粒混合物具有其它光散射特性和/或其它科学特性。这些特性包括通过施加EMF场控制这些颗粒的能力。在本发明一个或多个方面的应用中，颗粒的这一特性以多种不同的方式得以应用。申请人给出了依赖于颗粒的光散射特性以及这些特性用于探测样品中的一种或多种分析物的进一步说明性质的例证讨论。
首先按照均匀的球形颗粒具有不同大小和组合物时的光散射特性来描述这个发明是有用的。然而，能认定与本领域中的发明一样，本发明的基本方面也应用于非球形颗粒，这与。另外，按照入射光波长300nm-700nm描述此发明也是有用的。然而，本发明基本方面同样应用于基本上所有波长的电磁辐射。光是指紫外，可见区，近红外，红外和微波频段的电磁辐射。使用聚苯乙烯颗粒取代各种非金属颗粒来描述本发明将是非常有用的。其他的非金属颗粒类型包括玻璃组合物和很多其他聚合化合物。这些颗粒与聚苯乙烯颗粒相比有大致相似的光散射特性。
在相同强度和波长的入射光照射下，可以通过比较不同颗粒的Csca直接比较它们的散射光的相对强度。Csca越高，颗粒的散射能力越强(光散射强度)。在下面的部分我们使用“散射能力”这一词意指Csca或散射光强度。
在入射光波长在范围300-700nm之间时，我们计算过水中大小相同，组成不同微小球形颗粒的光散射能力。在这些计算中，我们使用真空中不同体材料的波长对应的折射率，这在标准手册已制列表。
对于一些颗粒组合物，从300nm到700nm光散射能力连续下降，而其他组合物的散射能力对波长的关系曲线却出现峰值和谱带。入射光为白光时，这些峰和带在可见光谱区，颗粒的散射光是有颜色的。
为了更加明晰，我们在下面的某些图表中对直径10nm不同类型颗粒的光散射性进行不同的比较。对列举的散射光的相对大小和波长，直径10nm颗粒与更大的直径达100nm的颗粒的一般趋势基本相同。例如，表1计算的是直径10nm的颗粒。然而，对于更小的颗粒(小于光波长的1/20)，当颗粒大小逐渐增加，只要限制于小颗粒的条件内，那么光散射强度对波长的关系曲线形状不发生改变。颗粒大小增加的明显结果是增加曲线图的幅度。这在理论物理和光散射领域众所周知，微小颗粒的散射能力随着半径的6次方增加。本领域的技术人员能从10nm颗粒的光散射能力乘以(d/10)6得到任何直径为d的微小颗粒的光散射能力，这里d的单位为nm。这种方法也被本领域的技术人员用于决定在各种诊断性检验方式申请中决定某一颗粒度的用途，申请中颗粒的散射光强度用于探测分析物的出现。
从我们理论和科学实验中，我们惊奇地发现这个普遍关系也适用于超出Rayleigh限制条件的较大颗粒，即颗粒直径大于30nm。
表1表明了计算出颗粒散射光最强烈的可见光区Csca值(光散射能力)和它们相对应的近似波长。表1的数据表明金属样颗粒比如聚苯乙烯颗粒是更强的光散射体。
图26示出选择对于某种10nm的球形颗粒算出的光散射强度与波长的关系曲线。由金或银组成的微小颗粒在可见光区表现出明显的散射和吸收峰，而铜颗粒在此光区出现一微小的散射和吸收峰。金和银散射最大值分别在530nm和380nm。甚至当入射光波长远离散射光最大值的波长时，金、银和其他金属样颗粒的光散射能力比同样颗粒大小的非金属样聚苯乙烯颗粒大很多。
表2给出了10nm的金属样颗粒和聚苯乙烯颗粒(非金属样)的光散射能力的计算值，此时入射光(照明)波长向长波偏移很多。在很多分析性和诊断性检验方式中，是需要工作在长波区。表2表明本领域的技术人员可以使用很长波长光照明，并且金属样颗粒远优于非金属样颗粒，如聚苯乙烯，这用在分析性和诊断性方法的申请中。例如，波长为700nm的入射光，此波长远离金颗粒光散射最大值波长530nm，此数据表明其散射光强度比同样大小和形状的聚苯乙烯颗粒强大约220倍。我们已经在实验中观察到，确实在可见光区，金属样颗粒的光散射能力(强度)远大于非金属样颗粒。
这些结果表明，金属样颗粒比非金属样颗粒在相比大小和形状差不多的情况下具有更大的光散射能力外，这一特性广泛应用于分析性和诊断性示踪器在很多领域中需要使用信号产生和探测系统。例如，在许多检验设计中，通过探测颗粒的散射光来检测分析物存在与否。表1 水中不同组成10nm球形颗粒Csca的计算值
颗粒组成 波长(nm)(a) Csca最大值(cm2) 相对Csca
聚苯乙烯     300  1.32×10-17     1
硒     300  8.6×10-16     ～65
铝     300  1.95×10-15     ～148
铜     300  7.8×10-16     ～59
金     530(b)  1.24×10-15     ～94
银     380(b)  1.1×10-14     ～833
(a)使用入射光波长，在EM光谱可见光区(300～700nm)出现最大值的波长；
(b)有些颗粒在某一区域出现峰值，看图27。
表2 水中不同组成的10nm球形颗粒在700nm
    光照明下的Csca计算值
颗粒组成 入射光波长(nm) Csca最大值(cm2) 相对Csca
聚苯乙烯     700     ～3.1×10-19     1
硒     700     ～1.4×10-17     ～45
铝     700     1.4×10-17     ～45
铜     700     4.7×10-17     ～152
金     700     7×10-17     ～225
表3比较了不同直径球形金颗粒的常用对数摩尔消光系数ε的计算值和实验测量值。
我们利用前面描述的表达式计算了在最大值波长时的ε值。ε的测量值是通过用标准光谱仪测量在计算的最大值吸收波长时，光吸收而得到的。计算和实验中测量的ε值虽不完全，但是符合的相当好。从观测和计算的结果看出约两倍的差别可能反映出金颗粒标定的半径的不准确。实验方法的细节将在实施例部分给出。表3 水中不同大小的金颗粒的摩尔常用对数消光系数
以及最大吸收波长的计算值和测量值
    计算值(b)     测量值(b)
颗粒直径a，b e(M-1cm-1) 最大吸收波长 ε(M-1cm-1) 最大吸收波长
    10nm  1.8×108 ～530nm  2.3×108 ～525nm
    16nm  9×108 ～530nm  5.2×108 ～522nm
    20nm  1.8×109 ～528nm  1.2×109 ～525nm
    40nm  1.6×1010 ～532nm  8.5×109 ～528nm
    60nm  5.6×1010 ～542nm  2.6×1010 ～547nm
    80nm  1.1×1011 ～550nm  5.8×1010 ～555nm
    100nm  1.6×1011 ～574nm  9.2×1010 ～575nm
(a)对于数值计算表示精确颗粒直径
(b)表示用于测量时金颗粒的大约直径。实际的直径比所标的直径稍微偏高或偏低。
对于可见波长光区的入射光，金属样颗粒光散射能力(即Csca)远大于可相比的非金属样颗粒，如聚苯乙烯。金属样和非金属样颗粒的光散射特性的另一重要区别为，对于金属样颗粒组成相同，但大小改变的金属样颗粒的散射光强度对入射光波长的关系曲线是很不相同的。这与非金属样颗粒相反，大小在10nm到几百nm的范围内颗粒的关系曲线基本上是相同的。这些差异对于更特异性地和更灵敏地探测不同样品中金属样颗粒是极其有用的。对于不同直径的银、金、铜和铝颗粒，出现最强光散射(Csca)时的入射光波长，在表4中给出。
图16表示了，近似球形直径100nm金颗粒在包被和未包被聚乙烯化合物(MW=20，000)时实验测量的散射光强度与入射光波长的关系曲线。数据表明，100nm直径的金颗粒在包被和未包被时其依赖于光散射强度特性的波长值是非常相同的。
图27示出了直径变化的球形颗粒，计算出散射光强度对入射光波长的变化曲线。当金颗粒度变大时，散射光的峰值波长向长波偏移。在液体中用白光照明或在光学显微镜用DLASLPD照明，我们已经直接观察到包被或未包被的金颗粒在直径为40、60、80、100nm时光散射特性，它们显现出绿色、黄绿色、橙色和橙红色颗粒。微小球形银颗粒显现蓝色。这样，包被各种结合剂的金属样颗粒以多种方式用于分析性检验中。不同种类的金属样颗粒的散射光的颜色性质可对多种分析物进行可见光探测。例如，球形的直径为40、60、80、100nm的金颗粒和直径为20nm的银颗粒，它们分别包被不同种类的结合剂，可用于在同种样品探测五种不同的分析物。在一种检测方式中，能够探测和观察到五种不同的细胞表面接收器或者其他出现在细胞表面的表面组合物。在光学显微镜中用白光照明，在DLASLPD条件下，有可能对依附在细胞表面不同包被的颗粒其散射光颜色进行探测。分析物的数目和类型可通过探测到绿色、黄色、橙色和红色颗粒的数目来区别。同样，染色体和基因分析如原位杂交等也可利用上面描述的方法。这时利用不同类型的金属样颗粒的散射光颜色，各种金属样颗粒被用作“染色体油漆”(“chromosome paint”)以鉴定样品中的各种核酸序列，核酸结合蛋白质和其他类似分析物。作为说明性实施例提供这些实施例，在此领域的技术人员将认识到不同种类金属样颗粒的散射光颜色能用于多种不同检验模式中以探测单一或多种分析物。
这样，调整某种球形金属样颗粒的大小是一种有用的方法，通过使用其散射光的颜色和/或者其他持性增加不同样品中的可探测性。使用白色光源，两种或更多种不同种类的颗粒可以轻易探测到非常低的浓度。
表5表明，金颗粒大小适当的增加能引起颗粒的光散射能力(Csca)的大幅度增加。最大Csca值对应的入射光波长随着颗粒大小明显增加，并且散射光强度的大小也显著增加。例如，对应金颗粒直径为40nm、100nm和140nm最大Csca值的入射光波长大约分别为535nm，575nm和635nm。在白光照明下，40nm的金颗粒强烈地和有选择的散射波长约为535nm的光，颗粒呈现绿色，而100nm颗粒呈现橙红色，140nm颗粒呈现红色。这更加表明，在白光照明下，同一样品中相同组成，大小不同的金属样颗粒可以通过散射光颜色相互区别。散射光强度的相对大小可以测量，并且与散射光的颜色或波长一起用于更特异性地和灵敏地探测相同样品中，甚至具有强的非特异性散射光背景的样品中的不同颗粒。
相反地，非金属性颗粒不具有这些独特的光散射特性，因此，与金属样颗粒相比，在大多数样品介质中探测非金属样颗粒要更加困难。
表4 水中观察的最大Csca值时入射光波长的计算值
颗粒材料 颗粒直径 最大Csca值出现时的入射光波长
银     10nm     ～380nm
    40nm     ～400nm
    100nm     ～475nm
金     10nm     ～528nm
    40nm     ～535nm
    100nm     ～575nm
    140nm     ～635nm
铜     100nm     ～610nm
    150nm     ～644nm
铝     100nm     ～377nm
硒     130nm     ～660nm
    200nm     ～702nm
表5 不同大小的球形颗粒光散射特性的计算值
颗粒直径(nm) 最大Csca值波长(nm) 最大Csca值(cm2) 相对散射能力的计算值
    10     ～528  1.26×10-15    1
    20     ～525  8.4×10-14    67.5
    30     ～530  1.03×10-12    817
    40     ～535  6×10-12    4.8×103
    60     ～545  6.3×10-11    5×104
    80     ～555  2.3×10-10    1.8×105
    100     ～575  4.6×10-10    3.6×105
    120     ～605  6.9×10-10    5.5×105
    140     ～635  8.8×10-10    7×105
    160     ～665  1×10-9    7.9×105
    200     ～567  1.4×10-9    1.1×106
    300     ～670  2.9×10-9    2.3×106
    600     ～600  1.01×10-8    8×106
    1，000     ～620  2.5×10-8    1.8×107
    1，000     ～670  2.5×10-8    1.8×107
相同形状和大小，组成不同的颗粒的相对光散射能力能够通过比较垂直入射光各个角度的光散射强度而直接在实验中比较。我们在实验中比较了相同大小和形状的金颗粒和聚苯乙烯颗粒的相对光散射能力，这里使用了我们自己制造的光散射仪器，来测量垂直于入射光路的散射光，我们在其他地方对其加以描述。表6表明，实验测量的由金组成的颗粒的散射能力比由聚苯乙烯组成的颗粒大得多，这是在相同的可见光入射两种颗粒进行比较的结果。表6中的实验测量值比计算值低2～3倍。这个差值主要归因于与计算值(看表3)相比金颗粒的常用对数摩尔消光系数实验测量值大约低2倍。另外，这也存在颗粒大小的某种程度的不确定性(例如对于制备21nm±1.5nm的聚苯乙烯颗粒，实际的颗粒度大于或小于1.5nm左右)。这种不确定性对聚苯乙烯和金颗粒都引起数值的较小的不确定，但并不改变相散射能力的基本结论。至于对于更大程度的不确定性，表6也表明，在散射最小值，金颗粒的光散射能力比类似大小和形状的聚苯乙烯颗粒大100～200倍。
表7，对于不同波长的可见光比较了相同大小和形状的金颗粒和聚苯乙烯颗粒的相对光散射能力。表7表明，甚至在照明光波长远离最大光散射强度波长时，金颗粒的光散射能力比类似大小和形状的聚苯乙烯颗粒大得多。这些实验结果与计算结果相符(见表2)。
表8表明，实验认定在白炽灯光照明的条件下，球形金颗粒的光散射能力比类似的聚苯乙烯大很多。
总的说来，我们这里给出的计算值和实验值符合得相当好。这证实了对于用来鉴定可能有用颗粒材料和组合物，以及估评这样的颗粒的光散射特性应用的计算结果和计算过程的利用是正确的。很多种光源，无论是产生多色和/或者单色光，稳态光和/或者脉冲光，相干光或者非相干光都能用于照明。我们的结果表明，与类似大小和形状的非金属颗粒相比较，从金属样颗粒能得到更特异性和更强的光散射信号。我们的结果表明，本发明提供了一种可能比以前能探测低含量颗粒的方法，和特异性地探测低含量或高含量的颗粒。
表6 入射光波长为金颗粒最大散射时波长，在水中类似大小和形状的聚苯乙烯和金颗粒的相对散射能力的计算值和测量值
颗粒组成 颗粒大小(b) 入射光波长 相对散射能力
计算值(a) 测量值
PST(c) 21±1.5nm ～525nm 1     1
金 19.8±＜1.9nm ～525nm ～664     ～220
PST 32±＜1.3nm ～527nm 1     1
金 29.5±＜3.5nm ～527nm ～663     ～318
PST 41±1.8nm ～530nm 1     1
金 39.5±＜6nm ～530nm ～985     ～461
PST 83±2.7nm ～560nm 1     1
金 76.4±＜15nm ～560nm ～708     ～211
(a)计算针对绝对球形颗粒
(b)制造商测量的颗粒大小，制造的颗粒是球形的但不是绝对的球形。这将稍微影响数值方面的比较(c)PST-聚苯乙烯表7 入射光波长远离金颗粒吸收带时相似大小和形状的聚苯乙烯和金颗粒在水中相对散射能力的测量值
颗粒组成 颗粒大小(a) 入射光 最大散射时的可见光波长     相对散射能力
直接比较值 根据颗粒大小的校正值(c)
聚苯乙烯(b) 41.1±1.8nm ～530nm～460nm～400nm ～300nm    111     111
金 39.9±＜6nm ～530nm～460nm～400nm ～530nm ～377～96～80     ～443～113～94
聚苯乙烯 83±2.7nm ～560nm～430nm～380nm ～300nm    111     111
金 76.4±＜15nm ～560nm～430nm～380nm ～560nm ～251～36～27     ～412～55～41
(a)制造商测量的颗粒大小(b)PST-聚苯乙烯(c)由于PST和金颗粒大小的不同调整金颗粒的相对光散射值，这利用了散射光强度随半径6次方增加的关系。尽管在这些大小范围内，这也是不很准确的，校正数字是很好的近似。
表8 相同大小和组成的聚苯乙烯(PST)和金颗粒在水中白光照明下相对散射能力的测量值
颗粒组成(a) 颗粒大小(b) 同样浓度下的相对散射能力 由于颗粒大小而调整后的相对散射能力(c)
聚苯乙烯金聚苯乙烯金聚苯乙烯金聚苯乙烯金聚苯乙烯金     21nm19.8nm38nm39.9nm37.9nm39.9nm59nm59.6nm79nm76.4nm     1～401～2121～1051～1001～108     1～581～1581～771～941～132
(a)聚苯乙烯来自于Interfacial Dynamics.Inc_Porland。Oregon or Duke Scientific，Inc_Palo Alto，CA.而金颗粒来自于Goldmark Biologicals，Phillipsburg，N.J.一个British Biocell LTD_Cardiff.UK.的分销商。
(b)制造商给出的颗粒直径。
(c)利用散射能力随颗粒直径的约6次方增加的关系得来。
(b)制造商给出颗粒直径。
(c)利用散射光强度随着颗粒直径的6次方增加的关系。与荧光相比，颗粒的发光能力
荧光常常用于很多检验中，以探测某种分析物是否存在。
荧光素是一种了解最多和使用最广泛的发生荧光的化合物。很多研究为探测尽可能低的荧光素分子的目的所推动。荧光素具有高常用对数摩尔消光系数(大约6×104M-1cm-1)和非常高的荧光量子产率，大约为0.8。
表9比较了某种颗粒与荧光素的计算出来的信号发生能力。很明显，单一金或银颗粒是比单一荧光分子更强的光源。在理想条件和利用合适的光学滤波片，一优质的荧光计可探测荧光素达到较低的约为
l0-10M～10-11M的浓度。表9给出的比较表明，这样荧光计能够探测60nm的金颗粒更低的浓度达到10-15M～10-16M。在实验中我们已验证了这些观察结果。
表9表明，单一60nm金颗粒总散射光输出相当于约350，000个荧光素分子的输出。一个荧光素分子不能直接在光学显微镜中看到，但我们能直接看到在多种不同样品和检验格式中的单一金属样颗粒。在样品上光直接以这样的角度射出，使得从颗粒散射的光能够最强被眼睛或光探测量看到和探测。我们发明的这种可广泛应用的照明和探测方法称作DLASLPD(以只有颗粒散射光被探测的角度的直接光照)，它以某种形式或其他形式用于分析性和诊断性的应用中。这些方法在其他地方详加描述。这允许单独颗粒的探测和这些颗粒的数量测量，使用颗粒计数方法包括图象分析，光子相关光谱，光学显微镜和其他方法。相比较，只有非常大的聚苯乙烯颗粒使用DLASLPD技术在光学显微镜中能看见。
表10给出了用白光照明实验测量的荧光素和不同大小金颗粒的相对信号发生能力的结果比较。这些结果与表8给出的相似，并且表明金颗粒的光发生能力比荧光素分子大得多。例如，在白光照明时，直径为39.9nm和59.6nm的金颗粒发出的光强度等于约2×104和2.3×105个荧光素分子发出的光强度。
在白光照明下，金颗粒发出的散射光由入射白光出现的所有波长组成，但是在任何特殊波长的光散射效率并不相同，以致于一个或多个散射光波长带散射更强烈。在白光为入射光时，实际的波长组成和散射光波长对散射光强度的关系曲线。依赖于若干变量，包括光源类型和光探测方法。表10的结果是通过白炽灯光源或色温为2800开尔文的光源得到的，并且通过一简单的滤波片使光通过样品之前减弱红外成分。散射光强度采用标准的光电倍增管测量。表10中的结果没有因为光电管和光源特性进行校正。任何同样的校正将不会影响这里讨论的结论。表9 各种组成和大小球形颗粒与荧光素的理论相对信号发生能力
颗粒组成 颗粒直径 颗粒体积(μm)3 必须与一个颗粒的总光强相符合的荧光素分子的数目(a)
聚苯乙烯  10nm20nm40nm60nm100nm  5.23×10-74.2×10-63.35×10-51.13×10-45.23×10-4     ～0.07～5～280～2800～42，000
银  10nm20nm40nm60nm100nm  5.23×10-74.2×10-63.35×10-51.13×10-45.23×10-4     ～46～3，500～150，000～770，000～2，300，000
金  10nm20nm40nm60nm100nm  5.23×10-74.2×10-63.35×10-51.13×10-45.23×10-4     ～7～455～35，000～350，000～3，100，000
(a)以产生最强荧光和光散射信号的波长，用相同的光强照明荧光体和颗粒。对于聚苯乙烯，入射光波长为300nm，而对于各种尺寸的金或银颗粒使用的入射光波长为最大Csca值的波长。
在表11中给出了，单色入射光照明下荧光素和近似为球形的不同尺寸的金颗粒的相对信号发生能力的测量结果。荧光素样品用单色入射光(波长490nm)照明，发出的光并不是单色或者偏振的，而是由体现荧光辐射特征的波长组成。用单色的入射光照明大小不同的球形金颗粒，其波长为最大散射时的入射光波长，散射光结果要么是完全偏振光要么是部分偏振光，这依赖于颗粒的大小。表10 白光照明下荧光素对金颗粒的相对信号产生能力的测量值(a)
信号源 颗粒直径 与一个金颗粒的光强相符合的荧光素分子的测量值(a)
    金 10.1±＜1.2     ～9
    金金金金金金聚苯乙烯(b) 19.8±＜229.5±＜3.539.9±＜649.2±＜9.859.6±＜11.976.4±＜15.380±＜6.6     ～2.3×102～4.1×103～2×104～7.3×104～2.3×105～9×105～8.3×105
(a)入射光为Leica显微镜的炽光源，其色温为2800°K辐射光通过一玻璃透镜来减弱红外光成分。
(b)PST-聚苯乙烯。
(c)结果没有校正。
表11 单色光照明下荧光素对金颗粒的相对信号产生能力的测量值
颗粒类型(a) 颗粒直径 入射光波长(b) 与一个金颗粒的光信号相符合的必要的荧光素分子的测量值(c)
金金金金金金金金 10.1nm19.8nm29.5nm39.9nm49.2nm59.6nm76.4nm～100nm ～525nm～530nm～532nm～535nm～550nm～542nm～565nm～560nm     ～4～120～1，400～7，800～25，000～78，000～190，000～550，000
(a)实际测量给出大小。
(b)单色入射光为从单色仪出来的水平偏振光主要部分所组成。垂直偏振入射光也将产生明显更大的颗粒信号强度，但不影响荧光素的信号强度。
(c)结果没有校正。
表11表明，单色入射光照明下，从不同大小的单个金颗粒产生散射光信号强度比从单一荧光素分子产生的光信号要强得多。这些结果更进一步表明了，单金属样颗粒，例如金颗粒在单色入射光照明下能探测到非常低的浓度，以合适的探测方法，使用这样的颗粒作为极其敏感的光散射标记在诊断性检验分析性应用，这种可探测性是极其有用的。
非金属颗粒，如聚苯乙烯，结合了100～1000个具有高荧光的分子在此领域中众所周知。例如，这样的一个颗粒，直径110nm，其中结合一荧光化合物，它具有的最大激发和发射波长分别为490nm和515nm，这与荧光素相类似。每个颗粒包含平均约为4400个具有高荧光的分子，每个颗粒的体积约为7×10-18cm3，颗粒的荧光分子浓度约为10-5M。表12给出直径为110nm的聚苯乙烯颗粒和直径100nm金颗粒的光产生能力的实验测量结果，其中聚苯乙烯颗粒嵌置很多具有高荧光的化合物分子。这些样品光产生能力与给出同样光产生能力的荧光素溶液直接比较。令人感兴趣的是注意到从110nm聚苯乙烯单颗粒产生的总散射光信号与大约12，000个荧光素分子产生的光信号差不多相等。在聚苯乙烯颗粒中存在荧光分子仅仅增加总的光信号约1.5倍。这种颗粒的荧光信号可通过在样品和探测器之间使用一合适滤波片与光散射信号分开，该探测器排除入射光波长，通过以荧光辐射为特征的波长。这样的一种滤波片导致这种颗粒产生的荧光信号强度等于大约3，000个荧光素分子的信号强度。与这些颗粒相比，直径100nm的金颗粒明显具有更优良的发射光产生能力。
表12 荧光素、聚苯乙烯颗粒，含有荧光物分子的聚苯
乙烯颗粒和金颗粒的相对信号产生能力的测量值
颗粒类型 颗粒直径(a) 每个颗粒含有的荧光素分子 入射光波长 必须符合来自于颗粒的光信号的荧光素分子的测量数值(c)
聚苯乙烯(d) 110nm     1  490nm ～12，000
聚苯乙烯 110nm     ～4400  490nm ～19，000
金(e) 100nm     0  555nm(b) ～1.3×106(e)
(a)测量的大小。
(b)见表11(b)。
(c)结果没有校正。
(d)聚苯乙烯。
(e)这里使用的100nm颗粒与表11使用的不是同一批。混合组成颗粒
混合组分的球形颗粒通过理论的和实际的实验得以估计，以确定他们用于各种诊断性和分析性的检验中的可能性。对于理论估计，包被着不同厚度银的金“核”颗粒和包被着不同厚度金或聚苯乙烯的银核颗粒已被研究。“核”意指球形颗粒，外面包被着一附加层或厚度的不同光散射材料，导致某种比例的混合组合物。对由混合组合物组成颗粒进行了直接的实际实验，这颗粒是直径为16nm金颗粒核外面加一厚层的银。在这里说明性的实施例中，金和银材料是金属样颗粒的代表，聚苯乙烯是非金属样颗粒的代表。这些实施例只是大量不同可能组成的几种而已，不同可能组成包括由一种或多种金属样和/或非金属样材料混合物的颗粒。
关于上面说明性实施例的光散射特性的计算结果在表13和14中给出。表13A部分表明，对于系列的直径为10nm的球形颗粒，颗粒由在金核外比例逐渐增加银包被层所组成，其光散射性变成非常象纯银颗粒。更重要的，我们在这些计算和实际的实验中，某一比例的银包被着金的颗粒可出现两个强的光散射最大值，这时入射光波接近大小相近的纯金和纯银颗粒的特征光散射波长。
使用简单的光学显微镜，在DLASLPD的条件下，利用的光照明对16nm直径金颗粒，其外包被银层，进行直接实验观察表明，这些颗粒中出现新颜色的散射光，这在以前在纯金或纯银颗粒样品中没有看到。很多颗粒具有极亮的紫色到深红色的散射光。
表13的B部分给出由10nm直径的金核外面包被不同厚度银组成的混合组分颗粒计算结果的比较。结果表明了与在表13A部分看到的同样趋势，这些混合组合物的光散射性质随着银和金的比例发生变化。在另外的计算中(表14)，银核外包被不同厚度金形成颗粒，如表13中所看到金和银的比例发生改变，其光散射性表现同样的变化趋势。表13由混合组分--包被银的金核组成
的球形颗粒的散射特征计算值
颗粒直径 金核直径 银层厚度 总体积 波长最大值时Csca(cm2) 散射极大时入射光波长(S)
A  10nm10nm10nm10nm     10nm9nm8.4nm4nm     00.50.8nm3nm     10.730.590.064 1.26×10-157.3×10-168×10-169×10-166.8×10-165.7×10-15     ～530nm～340nm～516nm～340nm～510nm～380nm
B  10nm11nm12nm20nm  10nm10nm10nm10nm     00.5nm1nm5nm     10.750.580.125 1.26×10-151.25×10-151.45×10-152.8×10-152×10-152.4×10-13     ～530nm～340nm～518nm～340nm～505nm～375nm
聚苯乙烯颗粒
C 10nm20nm 00 00 ---- 1.3×10-178.3×10-16 ～300nm～300nm
结合理论和实际的实验，我们认定下面的(结论)。对于由金属样材料的混合组分组成的颗粒，如金和银的混合组分，出现新的光散射特性，它们在很多不同样品类型和专门的诊断性和分析性的应用是很有用途的．具有两种或更多光学上不同并可分辨波长的高光散射强度的颗粒可通过改变金属样材料的组成制得。
相反，由非金属样材料和金属样材料的混合组分组成的颗粒，通常表现出类似于非金属样材料和金属样材料比例相当或略少的金属样颗粒的光散射性质．只在非金属样材料比例高于金属样材料时，混合组分颗粒的光散射特性类似于如表14B部分中结果所表明的非金属样颗粒的光散射性质。
混合的银-金组分和银-聚苯乙烯组分都表现出以纯金属样材料组成的颗粒为特征的很高的光散射能力和可见的散射带波长。通过专门探测这些类型的混合组分颗粒的一个或两个散射强度峰时的散射光，或者探测一种颜色或多种颜色，某种混合组合物的颗粒是可以探测的。此类混合组成物颗粒提高了探测微量颗粒的能力，更加特别地，提高了探测比以前可能的更少和更多数量的颗粒的能力。非对称形颗粒
按照光束实际取向的非对称形颗粒允许另外的散射光特性，将用于这些颗粒的探测。RIFSLIW的特性可用在本发明的很多不同方面，以便更专门和更灵敏地探测和/或测量样品中一种或多种分析物或颗粒。例如，散射光强度的闪烁和/或颜色的改变提供了另外的探测方法，以确定哪一种颗粒结合了某一表面，哪一种颗粒没有。这允许非间隔性类型的检验(均匀的)得以发展。所需要的就是通过颗粒计数，强度测量等来探测这些不闪光和/或不改变颜色的颗粒。未结合的颗粒在溶液中会闪光和/或改变颜色，而结合于表面的颗粒不会。另外图象处理方法如录像仪等提供另外的探测方法，其用于非对称的和球形(对称的)的颗粒。例如，在间隔性或非间隔性格式中，通过在表面聚焦合聚透镜，并且只记录某段时间内恒定的单位面积散射光信号，结合颗粒便被探测。在溶液中进行布朗运动和其他运动的游离颗粒导致单位时间单位面积不同的散射光强度。结合光散射颗粒是空间固定和不移动的。利用图像处理方法从“结合的”光散射颗粒中分开“运动的”光散射颗粒，结合颗粒的数量就得以确定，并且校正到符合样品中分析物的数量。本领域的技术人员会认识到，有很多其他图像处理方法可用于区别结合于表面的颗粒和溶液中未结合的球形或非对称形颗粒。在表面上或颗粒核上另加其他材料以提供与光散射特性无关的其它物理属性
在某些申请中，使用某些类型的组分，包被颗粒表面使得颗粒的化学性质更加稳定，或者增加在分析性和诊断性检验的专门申请中很重要的附加表面结合性质，这可能是非常有用的。例如，众所周知银很快会氧化。对于银颗粒的使用或者包含银的混合组分颗粒的使用，应用包被一薄层金或其他物质于银上，可以增加含银颗粒的化学稳定性，使得银不再易于受到环境对其化学稳定性的影响。
在另一个实施例中，可能需要其他材料包被表面，如含有特异性结合的结合剂的聚合物，或者用于附着的结合剂的其他材料，或者结合自己于颗粒上的介质。在这些实施例的每一个中，这些薄包被层不会明显地改变核材料的光散射特性。“薄”包被层意味着在颗粒表面单层或类似情况的包被。
可处理的光散射颗粒(MLSP’S)是这样的颗粒，除了具有一种或多种理想的光散射特性，它们还能应用EMF处理为一维、二维或三维空间。MLSP颗粒可用不同的方法制备。例如，MLSP颗粒通过给直径很小“核”铁电体，磁性的或类似材料包被一层更大比例的具有理想的光散射特性的材料来制备，例如，直径10nm的磁体或铁电体材料的核，用足够的金包被而得到50、70或100nm直径的颗粒。这在图29A中给出。
制备这样颗粒的另一种方法是，把具有理想光散射特性的材料包被上一薄层磁性或铁电体材料，例如，约50nm的金或银颗粒包被上一层1-2nm厚的磁体或铁电体材料。这在图29B中给出。
另一方面，MLSP颗粒通过混合适当比例的理想的光散射材料和铁电体或磁性材料而得到。如此制成颗粒，每个颗粒光散射理想材料对磁性或铁电体材料的适当比例得以得到。这在图29C中给出。
对上面的MLSP颗粒的一个选择是，连结或安装一种或多种具有理想光散射特性的颗粒于一种或多种能够用一EMF移动的颗粒之上。这种复合颗粒结构能够具有与MLSP颗粒相似的特性。例如，磁性或铁电体材料的小颗粒连结到一种或多种其光散射特性已被探测的颗粒上。连结利用电离、化学或其他方法，形成一稳定复合颗粒结构。例如，不同的颗粒用合适的聚合物包被，因此当以合适比例混合时，稳固复合颗粒结构的确切分布便通过交叉连结不同种类单独颗粒而得到。这里有很多不同的方法把颗粒连结在一起，得到理想复合颗粒结构。出于说明的目的，几种可能复合颗粒结构在图30中给出。图30A、B、C表明，二聚物、四聚物和更高级颗粒相对应地形成可取向的MLSP颗粒。在本领域的技术人员将认识到，只存在多种不同的可能复合颗粒结构的少量几种，并且有很多方法制备这样的结构。
由一种或多种颗粒的混合物组成的这些颗粒样品是可能的不同材料的大量不同组合物的几种而已，并且对于本领域的技术人员是显而易见的。颗粒大小、形状和均匀性
依靠于怎么探测颗粒的光散射特性，合适的大小和颗粒大小的分布数量可能是极重要的。例如，很多商品化可用的金颗粒样品引用颗粒大小分布大约从＜10到＜20百分比偏差。偏差的百分比定义为颗粒大小的标准偏差除以颗粒样品的平均值。这样，对于60nm的颗粒样品其偏差的百分比为20％，那么一个标准偏差单位大约为±12nm。这意味约10％的颗粒比48nm小或比72nm大。这样的大小偏差对样品中依赖于适当颗粒平均尺寸的散射光强度和散射光颜色有很大影响。
我们已经发展一个颗粒生长方法，它似乎给予比那些商品化可用的颗粒更狭窄的大小分布。方法包括，首先，制造“种”金颗粒的样品，然后将“种”颗粒用化学方法生长不同大小的金(见实施例11和15)和银颗粒(见实施例13)。例如，16nm的金颗粒用作“种”颗粒，更大直径金颗粒通过增加适当的反应物制得(见实施例15)。这种方法对于制造混合组合物颗粒也是非常有用的。颗粒均匀性－利用单一颗粒的散射光颜色探测分析物
在某些应用中，单一颗粒的颜色用于鉴定和量化特定的分析物。例如，在图象细胞计数应用中，通过探测依附在表面的不同种类的颗粒的数量和颜色来鉴定和计数不同种类的细胞表面抗原等，这可能是有趣的。对这种或其他有关的复合分析物探测，不同颗粒的大小分布需要尽可能保持固定。颗粒样品中的颗粒平均直径应选定以提供在白光照明下的理想散射光，在较小和较大颗粒中间点，选定其平均或“中间”的颗粒大小，这用于同样应用中以产生不同的散射光颜色。这种方式中，通过散射光颜色决定颗粒的不同类型的可能性达到最大程度。颗粒均匀性--积分光强度测量
在其他部分里，我们已经描述了散射光强度怎么随颗粒大小增加或减小而剧烈变化。当积分光强度测量在进行时，这种强度上的变化必须特别地考虑。使用上面描述的具有20％偏差的60nm颗粒制备品，这意味10％的颗粒具有比60nm颗粒高或低3倍的强度。另外，剩余90％的颗粒具有相当不同的强度。在测量很多颗粒的应用中，“平均”聚集光强度应该接近60nm的颗粒。但是，颗粒浓度较低时，这样的偏差统计量可能影响辨别样品的准确性，并且校正算法可能是需要的。利用尽可能狭窄的颗粒分布，测量的准确性和容易度得到增加。利用光吸收颜色检测分析物的有用的金属样颗粒
对于某种分析物检验，分析物达到这样的浓度，利用光吸收特性检测分析物可以实现。例如，在免疫层析检验中的当前问题就是使用典型大小(4到50nm直径)的颗粒，仅提供给那些用光吸收颜色法不能光学上解决的颗粒。当在滤纸或类似的固体诊断性检验介质上观察时，这些颗粒呈现出从粉红到红色。改变银和其他金属样颗粒的大小和/或形状，能够得到很多不同的光吸收颜色。通过颗粒的光吸收颜色，这些不同的光吸收颜色能够用来探测不同的分析物。这些能够用眼睛观测的颜色，在很多种固相检验中是非常有用的，如免疫层析流动检验，棋盘(panel)类型，和微排列或较大的固相的单一或复合分析物检验。球形或非对称的银颗粒和某种其它金属样颗粒的混合物允许宽范围的光吸收颜色。颗粒光散射特性的自动金相显微(autometallographic)的增强
在本领域众所周知，自动金相显微术和相关技术能够用于或多或少地放大现存的金属样颗粒的大小。由金属和/或半导体材料组成的颗粒的光吸收能力，特别是金颗粒和银颗粒已经常常用于量化和/或探测这些颗粒的存在，通过眼睛或测量光吸收的仪器来得到。这样的一种方法次于目前发明能够探测金相显微术放大的小数量的颗粒的光散射探测方法。
例如，已有报道(参看免疫金-银染色，原理，方法和应用，CRC．Press，1995，M.A.Hayat Ed.)称，用金相显微方法放大1nm直径的金颗粒，在约20分钟内用银包被1nm直径的金颗粒到约100nm。用这种方法制备的颗粒大小范围在40nm到200nm直径，形状近似为球形。令人吃惊的是，我们的计算表明，放大1nm直径核示踪颗粒到110nm导致散射能力大约1010倍的增强，而光吸收能力只增加大约105倍。
与同样材料微小核颗粒相比，增加微小颗粒的直径，最大光散射发生时的入射光波长向长波移动。因此，测量放大的颗粒的光散射信号，更容易探测微小的1nm颗粒的存在还是不存在。利用放大颗粒的最大光散射发生时，入射光探测放大的颗粒，与形成主要源的非特异性光散射背景的更小颗粒相比，放大颗粒更特异性的探测。
表14球形混合组合物颗粒--包被金或聚苯乙烯
    (PST)的银颗粒的散射特性计算值
颗粒直径 银核直径 包被物组成 包被层厚度 总银体积 波长最大值时Csca(cm2) 在散射最大时的入射光波长
A     10nm14nm20nm     10nm10nm10nm     --金金     02nm5nm  --0.360.125  1.1×10-144.5×10-156.5×10-15     ～384nm～372nm～525nm
B     10nm10nm10nm     10nm9nm7nm     --金金   00.5nm1.5nm   --0.730.34  1.1×10-141.9×10-155.6×10-166.8×10-16     ～384nm～384nm～300nm～520nm
C (a)10nmPST10nm(a)20nmPST20nm40nm60nm20nm20nm20nm     010nm020nm20nm20nm12nm10nm8nm      ------PSTPSTPSTPSTPST     000010nm20nm4nm5nm6nm    --0--10.1250.0370.2160.1250.064  1.3×10-171.1×10-148.3×10-167×10-139.3×10-131.25×10-134×10-141.4×10-144.3×10-13     ～300nm～384nm～300nm～382nm～412nm～418nm～408nm～410nm～414nm
(a)颗粒只由聚苯乙烯组成。
表15给出是，考虑到由金相显微术或相关的方法增加大小的小颗粒的光散射特性时附加的数据。我们的计算数据表明放大颗粒的大小导致颗粒的光散射能力比其光吸收能力有更大的增长。例如，颗粒直径增加20％就增强小颗粒光散射能力(1.2)6或大约3倍。小颗粒直径增大2和10倍，将导致光散射能力大约64倍和1，000，000倍的对应的增强，而光吸收能力仅仅相应地增加8倍和1，000倍。
因此，当本发明的方法用于量化和/或探测由金相显微术放大的颗粒的出现(即在金属样或非金属样材料组成的小直径颗粒上沉积一层金属样材料包被)时，便可能探测更小数目的这种颗粒，和更特定地探测更小数目的颗粒，这比以前更加可能。
上面所述是金属样颗粒核上沉积一层金属样包被的金相显微术放大的相结合的说明，接着的是利用本发明方法对放大的颗粒的探测。这种方法也能够用于在溶液中游离的和/或依附在某一表面上的放大的颗粒。上面的实施例只是这种结合方法的很多不同排列中的一种，这种结合方法包括这里讨论过的用光散射探测颗粒的很多不同的技巧和方法，还包括核和包被组合物与不同程度放大作用的不同结合。这些有选择的结合对于本领域的技术人员是非常明显的。这样的结合途径能够适应于大多数情况，这对于利用一信号产生和探测系统来探测分析物是理想的。
表15 2 nm直径的金示踪核颗粒--不同厚度的银包被层，厚度统一--计算的光散射特性
颗粒直径 银包被层厚度 颗粒光散射能力(Csca)(cm2) 最大散射发生时的波长 颗粒相对散射光强度 颗粒的相对Decadic摩尔消光系数
 2nm10nm20nm40nm80nm100nm150nm150nm  0nm4nm9nm19nm39nm49nm74nm74nm ～8×10-20～10-14～6.5×10-13～2.8×10-11～2.9×10-10～4.3×10-10～7.9×10-10～7.6×10-10 ～520nm～382nm～384nm～400nm～447nm～481nm～432nm～600nm 1～1.25×105～8.1×106～3.5×108～3.6×109～5.4×109～9.9×109～9.5×109     1～3×102(a)～2.3×103～1.6×104～5.8×104～7.6×104～1.5×105～1.2×105
(a)常用时数摩尔消光系数，Csca和最大光散射发生时的入射光波长基本上与10nm直径的纯银颗粒相同。折射率增加的方法
在光学显微镜，电信和其它相关领域中应用折射率匹配技术，在本领域已众所周知。这种技术一般用于减少非特定光的散射和反射，这发生在光束从一种介质或装置到另一种介质或装置时，如从一种材料的表面到另外一种不同材料的表面。
我们已经认定，特定颗粒的光散射能力(Csca)受到颗粒位于其中的介质影响。改变介质的折射率导致颗粒光散射特性的变化。
表16提供了一说明性的实施例，介质折射率影响选定的颗粒。折射率介质对10nm直径的金、银和聚苯乙烯球形颗粒理论上的影响给出了。
如表16表明，介质的折射率对金属样颗粒的影响相比与非金属样颗粒是相当不同的。介质折射率的增加，对于金属样颗粒如金颗粒，导致光散射的最大值波长和强度都增加，而对于非金属样颗粒如聚苯乙烯，光散射能力减弱了。
受样品介质折射率系数影响，金属样颗粒与非金属样颗粒相比所具有的独特的光散射特性能够用于更专门地和更灵敏地探测样品中金属样颗粒，这包括那些具有高的非特定的光散射背景的样品。对于很多不同类型的诊断性和分析性的检验，这是非常重要的。
表16折射率对直径为10nm、不同组成的颗粒理论上波长和强度的影响
    金     银     聚苯乙烯
    N1    (A)   (B)    (A)   (B)    (A)   (B)
    11.11.21.31.41.51.61.7    11.93.97.715.127.745.471.5 520nm525nm525nm530nm535nm540nm550nm555nm     11.62.32.93.95.37.39.7  355nm360nm370nm380nm390nm400nm415nm425nm     10.90.750.520.270.084～00.1  400nm400nm400nm400nm400nm400nm--400nm
(A)=不同介质折射率时的相对散射能力
(B)=发生最大散射时的波长
N1=介质的折射率
在很多种样品和诊断性检验形式中，非特定的散射光，反射光和从样品容器以及非分析物样品成分中发出其他背景光的问题众所周知。这些非特定的背景光使得通过探测和/或测量颗粒的散射光特性来对分析物进行灵敏性到超灵敏性探测很困难，甚至是不可能的。
我们已经认定，利用折射率增强的方法，金属样颗粒比非金属样颗粒能够探测到更大的特异性和灵敏度，现在加以描述此方法。颗粒和介质的折射率对散射光强度的影响可以通过下面的表达式进行估计(RI是折射率因子)。 RI = refmed 4 | m 2 - 1 m 2 + 2 | 2 - - - - - - ( 16 ) 其中refmed是介质的折射率，m等于颗粒的折射率/refmed。m隐含地依赖于波长，但准确的依赖性随颗粒的组成和介质变化。大多数无色溶剂的折射率通常与波长无关，至少在可见光区如此。
利用在灵敏检验中颗粒的光散射来确定哪个折射率值导致更高的光散射强度是非常有趣的，从方程(16)中折射率因子(RI)可得以确定。因子RI在方程(16)中分母为O时具有最大值，是无穷大值。这样，很高的光散射的条件是
m2+2=0    (17)
解上面的方程，我们得到
Figure 9881227900612
其中， 。 上面的方程表明，当折射率m是纯虚数，其值为1.41时，折射率因子有其最大值，颗粒的光散射也最大。表16中给出的理论数据符合预想结果。另外，当入射光波长远离金属样颗粒发生最大光散射的波长时，折射率增加的方法效果也非常好。
现在提供一个利用折射率增强方法的说明性实例。在高散射样品中，如具有很高的非特定光散射背景的样品，金属样颗粒和折射率增加方法都有如下应用。
本领域中的技术人员增加样品介质折射率的一个实例是，放置一层水或其他液体在干或温样品的顶部，这就增加了介质的折射率。另一实例是，把血清或其他高散射样品稀释于高折射率液体中，这样根本性地增加了介质的折射率。
在下面的过程中出现了上面提到的实例。当样品的折射率增加时，金属样颗粒特定的光散射信号增强，而非特定的光散射背景减弱。如表16中所示，当样品介质的折射率接近金属样颗粒的折射率时，颗粒中光散射与非特定散射背景的比值的增加量最大。这意味着，在介质的折射率值合适时，血清蛋白或类似的组成物非特定光的散射能够明显的降低或减弱，而颗粒的特定的光散射强度却增强。在金属样颗粒的光散射特性用作分析示踪物时，会得到分析物探测极优的信噪比。这些方法能够用于如干燥表面，溶液包被的表面和溶液等样品。
这些折射率匹配方法也能够用于长波，能更大地增加金属样颗粒特定光散射信号与非特定散射背景的比率。尽管表16只给出了对金和银颗粒的影响，但我们描述过的方法也能用来探测较小数量的由其他金属样材料组成的颗粒。这里介绍的折射率增加方法只给出了本发明的很多可能应用的几种。本方法可能有很多其它变化，对于本领域的技术人员是明显的。这些变化的一种或另一种能够有效地应用于大多数诊断性样式中以决定是否存在分析物。本发明的这个方向提供了一种方法，它能进行较小数量的颗粒探测，较小数量颗粒的更特定探测，和比以前可能的更少和更多数量的颗粒更特定探测。
本发明的一种方法，结合了折射率增加和早以描述的窄带通过滤波片法，对探测比以前可能更少或更多数量的颗粒提供了很大用途。这些方法是并协的。折射率增加方法用来减弱非特定光散射背景，而窄带滤波片用来降低或减小其它来源的非特定背景光如荧光等。结合这些方法可得到更优化的颗粒特定散射信号与非特定光背景的比值，并且能够更专门更灵敏的探测颗粒。
上面的实例只是这种结合方法的很多可能变化中的一种，其他的变化对于本领域的技术人员是显而易见的。在高散射的荧光样品--血清中光散射颗粒的探测
哺乳动物的血清包含很多生理上重要的物质，在分析实验室和其他地方确定了其数量和/或存在。很多不同的信号产生和探测系统用来确定血清中这些分析物的存在，这些方法包括光信号产生方法如荧光、光散射、化学发光，还有比色测量方法。最后一种用于包括直接标记和信号放大方法的形式中。天然血清包含一种物质，它能够通过荧光或者化学发光或者光散射机制产生一种非特定的光信号，另外，天然血清中还包含另一种物质，它干扰来自于示踪体的特定光信号的产生和/或探测，所有这些困难使得在纯的或近乎于纯的血清样品中进行分析物探测变得很困难甚至不可能。
为了能够有效地利用大多数(即使不是所有)，现存的测试系统探测血清，为了使血清适合于测试，有必要以某种方式对血清进行预先处理。很多这样的血清处理方法已存在，也许最简单的办法是把血清稀释于合适的溶液通常是天然的水中。另一常用的方法是以这样的方式进行实际的测试，就是在产生示踪物的特定光的出现得到确认之前，移去不理想的血清成分。从费用和劳动力的观点来看，进行测试需要的力量和测试试剂越少越好。完全不预处理样品是最理想的。这种能力对于测试的操作可能也是有利的。本发明提供了一种方法，在几乎是纯血清中进行这样的分析物测试；更是提供一种方法，在高浓度血清中更专门地探测比以前可能的更少或更多数量的颗粒。
例如，通常在用荧光示踪物如荧光体分析血清样品之前，把它稀释到大约百分之五的血清浓度，用490nm的单色光照明血清样品，再用光学滤波片把非特定散射光背景减弱到最小。非特定光信号等于含有10-8M到10-9M荧光素很纯的液体样品产生的信号。这样，在5％血清样品中，能够探测信噪比为2时的10-8M到10-9M荧光素，在95％的血清样品中，荧光素探测的最低限约高19倍，或者约1.9×10-7M到1.9×10-8M。这样，在95％的血清样品中，使用光学滤波片，荧光素探测的最低限约为1.9×10-7M到1.9×10-8M，并且这一数量荧光素的光信号(总光信号)对(非特定光信号)比值大约是2比1。
表17给出实验中可测量的探测限度。在非常高浓度血清中荧光素的限度为(总光信号)对(非特定光信号)比值2比1。在这个高血清浓度下，不用光学滤波清除由散射的入射光引起的非特定光信号，荧光素探测的最低限约为6×10-7M。
表18给出，把光学滤波片放置在样品和光电倍增管之间，用于减弱由散射的入射光引起的非特定光信号时，非常高血清浓度中荧光素探测的最低限。在这种状态，高血清浓度中荧光素探测的最低限大约为2×10-8M。
与荧光素对比，表17B部分和表18中给出的结果表明，不用光学滤波片时，在95％血清中直径为59.6nm的金颗粒能够以(总光信号)对(非特定光信号)的比值2比1探测到大约1.8×10-12M的浓度。从血清中观察到的非特定光信号等于大约5×10-7M荧光素的信号。在同样的条件下，直径为60nm的聚苯乙烯颗粒在高血清浓度中只能探测约6×10-9M的最低限(见表18)。表17 在高血清浓度中的探测直径为59.6nm的金颗粒
血清百分比 金颗粒浓度 入射光波长 荧光素浓度 相对光强度
A     97.8％95.7％97.8％95.7％     0000  490nm490nm545nm545nm  08.7×10-6M08.7×10-6M     10215.80.520.56
B     97.8％95.8％97.8％95.8％     01.77×10-12M01.77×10-12M  490nm490nm543nm543nm  0000     0(a)1.10.55105
胎牛血清购自于Biowhitaker，Walkerville，样品编号14-501F。血清出售前通过1微米过滤器过滤，是清洁的，且略微有点颜色。血清pH值调整在9到9.5。发出的光没有进行滤波。
(a)这里得到的光信号表示为值1，这个信号等于3.7×10-7M的荧光素。
表18 在92.8％血清浓度中荧光素，金
和聚苯乙烯颗粒探测的最低限
血清百分比 荧光素浓度 颗粒的类型和浓度 入射光波长 用于发射光滤波片 相对信号强度(c)
92.8％92.8％92.8％92.8％92.8％92.8％  0002.3×10-8M00 0金1.8×10-12M00PST 6×10-9M  554nm554nm496nm496nm554nm554nm 无无有(a)有无无 1(～520mv)(b)2.1(～1100mv)1(～39mv)～2(～79mv)1(～468mv)～2(～960mv)
聚苯乙烯(PST)和金颗粒的测量直径分别为60nm和59.6nm。含有荧光素的溶液pH值在测量前调整在pH 9-10。观察到血清中的最大光强度时，入射光波长对于荧光素约为496nm，对于59.6nm金颗粒约为554nm。
(a)从样品中发出的光信号在进入光电倍增管之前通过～No.16的Wratten滤波片。
(b)仪器测量结果都是在同一套仪器装置上得到的，互相可直接相比较(mv=毫伏)
(c)光探测仪器探测荧光素发光比颗粒发光的效率稍高一些。此外，对于水平偏振光入射的单色光更丰富，并且这将用于较低的光散射减弱颗粒的结果，但不会影响荧光素的光强度。整个仪器偏向荧光信号大约1.5-2倍。
表19的结果给出了，在95.7％血清中，100nm直径的金颗粒，110nm直径聚苯乙烯颗粒，和每个颗粒包含4，400个高荧光化合物分子的110nm直径聚苯乙烯颗粒的相对探测极限的对比(总信号与非特定光信号的比值为2比1)。这些结果进一步表明，100nm直径金颗粒比110nm直径聚苯乙烯颗粒或包含高荧光化合物的聚苯乙烯颗粒能被探测到更低的浓度。金颗粒在血清中测到的浓度比其他的非金属样颗粒低约230倍。
表20比较了，在相同照明条件下，相同浓度的59．6nm金颗粒分别在高浓度血清溶液和只含有水的溶液中，测量到的散射光数量。在这些条件下，可以探测1.8×10-12M浓度的金颗粒，其信噪比约为3。这些结果表明，血清或其他相同成分的存在并没有显出对金颗粒光散射能力的任何影响。金属样颗粒的光散射能力的稳定性和惰性使得它们在血清和其他相关的含有很多其他成分的样品中极其有用。
直径为100nm球形聚苯乙烯颗粒和金颗粒在血清中的探测提供更具说明性的实例。
哺乳动物血清含有大约质量百分比为3.7％的蛋白质，其中大约三分之二为血清蛋白。来自血清中的蛋白质和其他物质，还有其他来源的物质妨碍血清中聚苯乙烯颗粒的探测。在血清中聚苯乙烯颗粒与蛋白质以及其他物质具有类似的非特定光散射能力对可见入射光波长的关系曲线，这严重地限制了探测在血清中或其他高散射介质中探测聚苯乙烯颗粒的能力。
表19在高血清浓度中，由金、聚苯乙烯(PST)和含有荧光化合物的聚苯乙烯组成的颗粒的探测
血清百分比 颗粒直径和成分 颗粒摩尔数 入射光波长 相对光强度(d)
    100％95．7％95．7％95．7％     0110nm PST(b)110nm PST(a)+fluor100nm金(c)    01．9×10-11M1．9×10-11M8．2×10-14M     490nm580nm490nm580nm490nm580nm496nm580nm     1(e)0．271．90．542．20．541．10．59
(a)来自于Interfacial Dynamics Corp．，Portland，Oregon．每个颗粒平均大约含有4400荧光分子，对于荧光分子激发和发光最大值分别为490nm和515nm。颗粒中的荧光化合物浓度约为3×10-2M。
(b)来自于Interfacial Dynamics Corp．
(c)由本领域熟知的方法制备。
(d)没有对发射光进行滤波。
(e)观察的光信号表示为值1，所有其他值与这个值比较而得，这个信号等于来自于约2×10-1M的荧光素的信号。
表20在高血清浓度和O血清浓度中产生于直径为59．6nm金颗粒的信号
血清百分比 金颗粒浓度 入射光波长 相对总信号大小
    095．7％95．7％ 1．8×10-12M01．8×10-12M     543nm543nm543nm     10．581．38
金颗粒的测量直径分别都是59．6nm．95．7％的血清稍微有点颜色，并且其光学不透明度在543nm波长时为每厘米光程0．14。限定的散射测量在一6mm×50mm具有5mm内径的玻璃管中进行。据估计被血清光吸收的光将散射光信号减弱大约15％。
使用575nm的入射光代替300nm照明血清，导致非特定光散射信号减弱约13倍，但是也导致聚苯乙烯的特定光散射信号大约同等程度的减弱。对于聚苯乙烯或其他非金属样颗粒，增加照明光的波长，并没显著增加特定信号与背景的比值，也就是说，并没增强样品中聚苯乙烯颗粒的可探测性。
相比较而言，通过增加照明和/或探测的可见光波长，金属样颗粒相比于非金属样颗粒探测到的信号与背景的比值更大。在类似于水的含水介质中直径为100nm的金颗粒的散射光最大时，波长大约为575nm。用约575nm波长的单色光照明样品，引起金颗粒的最大光散射信号的产生，并且显著地减弱非特定光散射信号。在这样的条件下，相比于在与300nm波长的入射光相关的300nm波长的照明光下，其总的非散射光散射减弱大约13倍。
用白光为入射光照明血清样品，再加上适当的光学滤光片(低于或高于中心波长为575nm的特定光波带)，使在考虑波长以外的光的数目减至最小，提供了另一方法来探测血清中的较小数量的金属颗粒。在这些条件下，产生金颗粒的最大光散射强度的入射的可见光得以利用，而极大地减弱了来自于血清蛋白质和其他物质以及其他来源的非特定光散射信号。当用白光(或几种不同的波长)照明，并且使用适当排列的光学滤波片，可以探测在血清样品中复合类型的不同金属样颗粒。这种方法利用了每种颗粒在最大光散射出现时入射光波长不同(的性质)。
另一种方法，通过一合适的偏振滤波片和/或一带通滤波片过滤来自于样品的总的光信号。使用合适的偏振滤波片可以有效地排除非偏振的荧光背景，但非特定光散射背景大部分是偏振的，所以很少影响到。当使用宽波带照明时，如白光照明，使用大波长的光学带通滤波片能够显著地减弱非特定光散射和荧光背景。很多金属样颗粒在长波时光散射强度较高，这个特性能够与带通滤波片和/或偏振滤波片方法结合起来加以利用。例如，300nm直径的球形金颗粒在大约700nm波长时接近最大散射效率，它的散射光强度大约是100nm直径的金颗粒的6倍。使用300nm颗粒和中心波长为700nm的带通滤波片能够将非特定光减弱一半，并且使金颗粒散射能力增强6倍(相比于100nm的颗粒)。因此，在这个系统中信号与背景的比值增加了12倍。把这种方法用于非金属颗粒，如相同大小的聚苯乙烯，不能显著地增加信号与背景的比值，反而可能实际降低了它。使用仪器中光学元件和/或样品室上抗反射膜，也可能增加信号与背景的比值。很多其他手段和方法也是可能的，这些对于本领域的技术人员是明显的。
本发明的这个方面导致分辨诊断性检验系统中特定光散射信号和非特定光散射背景信号的能力得以提高，超过把散射光的探测作为测试系统的一部分的其他方法。另外，利用白光照明下不同种类的金属样颗粒表现出不同的颜色，使得在一种样品中探测多种颗粒的存在成为可能，这对于探测一种样品中多种分析物类型具有实用性。
金属样颗粒更多的优点是这些颗粒相比于荧光化合物的化学惰性。这样的颗粒不会光致褪色，并且它们的信号产生能力不受这样的机制影响。
对于利用由金属样材料组成的颗粒来提高分辨自于颗粒的特定光散射信号和来自于各种来源的非特定光散射信号的能力，上述的方法只是很多可能方法的一种。例如，很多手段是可行的，在这些手段中，这样的颗粒在与最大光散射发生的波长不同的波长时特定地探测。很多其他的手段或方法也是可行的，并且这些对于本领域的技术人员是显而易见的。
下面讨论通过检测一或多种光散射特征来检测固相或相关样品中的一或多种分析物。固相探测方法
在前面的部分中，我们描述本发明的各个方面，它们涉及到金属样颗粒的某些光散射特性，和液体中这些颗粒的探测。现在我们来描述颗粒在表面或非常接近表面时的探测方法。
我们已经认定，利用金、银、和其他金属样颗粒，以我们的DLASLPD照明和探测方法，我们能够探测在单位面积里数量很低的颗粒和颗粒标记的结合剂(包被的颗粒)。使用简单的照明和探测手段，能够探测单种和位于或接近某一表面的结合剂所包被的颗粒。这些方法能够用于光学透明的或者光学不透明的表面。
我们已经认定，利用颗粒间的某种结合与照明和探测方法，我们能够探测样品中颗粒浓度很宽的范围，从大约每平方微米(μ2)0.001到103个颗粒。使用合适类型的颗粒，不同种类的分析物能够被探测到非常低的水平，并且在同样的样品中，如在微排列中，达到非常宽的浓度范围。利用在同一样品中颗粒记数(在低颗粒浓度)和积分光强度测量(在高浓度)，这在一装置中便可实现。例如，如果利用固相相关的方法如排列切片或其他固相方法，如分析样品中有两种或更多不同的分析物的话，样品中不同种类的分析物是以不同的浓度存在的。这就是说，样品中一些分析物可能存在较高或较低的浓度，相比于其他分析物相差2个到几个数量级。采用这种方法，要达到理想的分析物探测灵敏度和浓度范围，选择合适种类的颗粒是非常重要的。这里我们描述的方法提供对这些样品中分析物探测的方法。如果更强的光源如激光予以利用，并且把更高级的探测方法如共焦成像加到我们基本的照明和探测方法上，可能有更宽的探测范围和更大灵敏度。
我们已经认定，我们能够更专门，更容易地探测高浓度的颗粒，也就是说，使用简单的方法得到非常好的信与背比。在本发明的某些方面，要使用一聚光透镜(成像透镜，反射镜或其它类似装置)，而在其他方面，则不用聚光透镜。
颗粒的散射光用一光学探测器探测，例如，光电二极管或光电二极管阵列，光电倍增管，照像机，摄像机或其他CCD设备，或人眼。颗粒的数量决定于单位面积的颗粒的数目计数和/或测量单位面积总的积分光强度。探测和测量的特定的散射光特性为下面的一种或多种：一个或更多波长的散射光强度，颜色，偏振，RIFSLIW，和/或单位面积颗粒散射光的角度。这与样品中分析物的存在，不存在和/或数量有关系。
在某些检验方式中，要确定一种或多种分析物，颗粒计数或积分光强度测量，其中的一种或两种都要用到。应当指出，选择合适的颗粒和使用DLASLPD照明和探测方法，便可得到通常光学上可解决的和可探测的散射光强度，以致于更高级的光源，空间的和光学的滤波技术是不需要的。但是，在某些样品中，可能存在明显的非特定光背景，最终的信号与背景比便通过使用光学滤波片，共焦成像，或其他小孔型空间滤波技术得以提高，以增加颗粒的散射光信号对总的非特定光背景的比值。
在一些分析性和诊断性应用中，散射光强度，仅使用我们的基本方法，没有用聚光透镜或反射镜便可探测和测量。在这些样品中，如上面所描述的同样方法，不使用聚光透镜，散射光的一种或多种特性就可被探测和测量。现在来更仔细地讨论这种方法。利用聚光透镜或反射镜来探测光散射颗粒的散射光
我们已经发现，我们能利用各种光收集光学装置来收集颗粒的散射光。我们已经使用颗粒记数和强度测量(单位表面面积的积分光强)，用我们的DLASLPD照明和探测的方法来探测给定面积上颗粒的一种或多种特定的光散射特性。我们发现，在所做的大多数实验中，当颗粒浓度约为每μ20.1个时，使用计数测量方法通常是有用的，而颗粒浓度比大约每μ20.1个大时，我们已经发现测量总的积分光强度是有用的测量方法。然而，应当指出，可以使用计数测量或积分光强度测量方法，无论颗粒浓度高于或低于每μ2大约0.1个颗粒。
用特定的一种或几种透镜来收集和/或对样品的散射光成像，我们发现我们在测量中感兴趣的表面区域或面积的有用关系，与被测量的样品容器类型和用颗粒计数测量的颗粒浓度上限的有用关系。例如，如果我们感兴趣的是测量较大面积来探测散射光，用一个10倍或更小的显微镜物镜或透镜或反射镜就可收集样品的散射光。同样，如果样品的更小面积要被测量，用一个20倍、40倍、100倍或者更大的显微镜物镜或类似的透镜或反射镜就可收集光。如果颗粒计数的方法要用于更高的颗粒浓度，用更高性能的物镜可得到高浓度颗粒的更好的颗粒分辨率。应当指出，当使用更大的物镜，附加的要求和限制也开始出现。例如，工作距离变得非常小，并且浸没油可能必须加到样品上。当照相机、摄像机、或类似的CCD型光子探测器予以利用时，来自样品上的总散射光被探测到。这信息接着被简单的硬件和/或软件方法处理，以分析散射光测量。这具有极强的能力，因为样品中很多不同的分析物能够使用固相微排列，排列切片，或类似的格式来探测和量化。在微排列格式中，通过不同种类的结合剂，很小面积的表面包被，在一个空间可分辨的区域内，特异性地结合一特定的分析物。后面我们描述本发明针对固相复合分析物微阵列等的特异性应用。
颗粒计数的方法通常比积分光强度测量有更多仪器上的要求。然而，对于非常灵敏地探测颗粒的一种或多种光散射特性，使用计数技术有很多优点。例如，光源和样品室的波动和不均匀性不会影响颗粒计数测量，而使用积分光强度测量时，就会引起严重问题。另外，还有很多软件和硬件方法来提高用计数技术测量颗粒的品质和信号/背景比。没有使用聚光透镜或反射镜时光散射颗粒的探测
我们也已开发，不需要聚光透镜来探测在或接近表面的颗粒的散射光的方法。在这个方案里，我们通常用积分光强度法来探测来自于感兴趣区的散射光。这借助于或不借助于肉眼或用以前描述的光子探测器就可做到。我们已发现，当我们使用约120nm左右直径的金属样颗粒时，以超出向前的散射光包络的角度放置我们的探测器(眼睛或光子探测器)，我们能够明显地提高颗粒的光散射信号与总的非特异性光背景的比值。提高信号/背景比值的基本原理
在我们详细地描述照明和探测的DLASLPD方法之前，先概述基本原理，当以一种或另一种形式使用时，它可确定光散射颗粒探测的信号和信号与背景的比值极限。这些方法附加调整和改变各种设备元件，如使用更强的光源，更准直的光源，更窄波带的光源，不同波长的光源，更灵敏的光子探测器，在照明光源和样品之间和/或在样品和探测器的光学的和/或空间的滤波片，和/或共焦的或类似的成像技术。这些策略和方法在下面给以概述。
(1)使用大直径的金属样颗粒，颗粒的光散射能力能够得到显著地增强。大小的增加也可能改变散射光强度对入射光波长的关系曲线。这些特性能够调整到满足任何特殊检验的需要，以致于一种或几种散射光特性能够容易探测。例如，对于具有高的非特异性光背景的样品中分析物的探测，较大的金颗粒，大约80～120nm直径或更大是有用的。与40nm直径的金颗粒相比，最强光散射发生时的最大波长向长波偏移，散射光强度也会增加。与40nm直径金颗粒相比，这两种效应的结合显著提高了信号/背景的比值。
(2)以超出向前的散射光的包络的角度测量样品的散射光，无论在强度还是计数模式方面，信号/背景的比值实质上是增加的。我们已观察到，探测器可以放置在样品表面所在平面之上或之下。并且照明光束位于样品所在平面的同一侧或不同侧。在这些不同的取向中，来自于颗粒的特异性光散射信号，在向前的散射光包络以外进行探测，而大多数来自于样品室中和样品中其他成分的光畸变的非特异性散射光，在向前的散射光包络以内进行探测。这使得可更灵敏地和更特异性地探测颗粒的散射光。
(3)正如我们前面所描述的，适量的非特异性反射光也影响探测的灵敏度。我们已经发现通过移动入射光表面尽可能远离被探测聚光区域，反射光实质上减弱。这可用多种不同的方式得以实现，其中包括样品室的可适设计(以后讨论)。例如，我们注意到，如果我们把一薄层浸没油涂在玻璃片的底部，光束穿透玻璃片照在背侧表面的颗粒上，我们看到极大地改善了结果。在另一个实验中，当我们把小塑料光标粘在塑料样品室的底部，样品内光标表面的对面有微排列的结合颗粒，我们看到了很强的结果。我们也使用更多的光学准直手段，如等边棱镜和/或其他类型的棱镜或光标，并且还在样品容器与棱镜交界的表面涂上浸没油。我们总结出这些极好的结果，(ⅰ)具有远离含有光散射颗粒的探测区的光入射表面；(ⅱ)具有零度入射到光标如棱镜面等(对应垂直面)表面的角度和(ⅲ)在系统中产生的反射光的大多数被导出了系统而远离聚光点。所有这些方法对于提高各种样品中光散射特性的探测的信号／背景的比值是有用的。还存在几种光传输方法，能用于有效地把反射光传出系统而提高相对于背景的信号。
(4)折射率增加方法对于提高不同种样品中信号与背景的比值也是极有用的。我们发现提高背景上信号的几种方法。现在来讨论其中几种。用液体包被含有颗粒的表面，液体的折射率越接近含有颗粒的表面的折射率，信号／背景比越好。我们发现，对于探测在干燥固相上的分析物，在表面上包被上一层液体会提高信号／背景比。例如，当折射率约为1.33的水缓冲液包被在样品表面，我们便得到相比于空气中测量同一表面上颗粒更好的结果。甚至，使用非常接近固相折射率的液体，也可得到更好信号／背景比。例如，首先用包被着结合剂的光散射颗粒把分析物粘附在浸在样品介质或其他合适的反应混合物或缓冲层中的固相上，可以进行一种检验。样品中的溶液，在探测颗粒之前，被稀释或用包被在固相上的选择折射率的溶液所代替。用这种方式，可以得到高灵敏度的结果。
除了上面的方法，在照明光束和样品之间或在样品和光学探测器或眼睛之间再使用窄带通光学滤波器，截止光学滤光片，空间滤波器如光栏，也将提高信号/背景比。在某些分析性的检验应用中，使用共焦成像技术可能也是有用的，这种技术和装备的费用和复杂性是不成问题的。使用长波光源，无论进行或不进行光学滤波，也是增加信号/背景比的方法。使用特殊设计的样品室消除多余光，把多余的非特异性光传出系统，这是另一种有用的方法。通常的样品室设计是有用的，后面要给以描述。本发明一个或多个方面的所有变化用来提高信号/背景比，并且还用来对样品一种或多种分析物的更特异性更灵敏的探测。
DLASLPD照明和探测方法有很多不同的方法能够专门地应用于样品，并且这些在图15中给出轮廓图。图14给出一个图用来定位和描述在图15中表示的DLASLPD方法的轮廓图。本领域的技术人员将认识到，当使用某金属样颗粒探测在固相或类似的样品中一种或多种分析物时，本方法所提供的用途。
现在来描述本方法的细节。照明和光聚集光学1．基本原理
现在我们描述的固相方法能够应用于光散射颗粒的测量。一种或多种光散射特性的探测和测量与样品中一种或多种分析物的存在与否或浓度有关。这些方法能适用于大多数，虽不是所有已知的固相分析方法，包括微阵列，阵列切片，或类似的格式。这方法设计得具有宽范围的灵敏度(从低灵敏度到特高灵敏度范围)。这个灵敏度范围，用易于使用，便宜的设备就可实现。
在这项技术中，表面上颗粒的数目或相对数目通过依靠颗粒光散射特性的方法来决定。探测系统基本上包括(1)放大透镜(也称作成像或聚光透镜)以形成光散射颗粒斑点或其一部分的放大图象，和(2)照明系统，使得颗粒作为黑暗背景中的明亮物体出现(DLASLPD方法)。此方法不需聚光透镜也能进行。用颗粒计数或测量散射光强度(正比于颗粒数目或浓度)便可得到放大图象中的颗粒数目。颗粒计数可以通过(a)眼睛(不借助或借助目镜，依赖于颗粒大小)，(b)电子成像系统(例如摄像机、CCD照像机，图象放大器)或(c)具有场限制光栏和扫描光束设计的光敏探测器来实现。散射光强度可用电子成像系统或光敏探测器来测量。表面上颗粒浓度低时(低于每μ20．1个颗粒)，颗粒计数方法优选，而表面上颗粒浓度高时(特别是，单颗粒靠得很近小于放大透镜的空间分辨能力)，稳定的光散射强度测量方法优选。本技术被设计能很容易在两种探测方法即颗粒计数和光强测量之间切换，并且能够使用直径小于20nm的颗粒，这依赖于颗粒的光散射能力和探测装置的专用硬件部件。光照明系统
照明系统是本技术中的关键部分。照明系统被设计为以高光强度照明颗粒点或颗粒点群体，这种方式就是让单颗粒在黑暗背景中以明亮物体出现。这使得依附在表面或在表面上流体膜中游离的颗粒可以看见。游离颗粒有别于结合颗粒，是由于游离颗粒作布朗运动，结合颗粒不作布朗运动。在下面的部分中，我们描述照明系统的细节和理论。
申请人已经实验过很多不同的照明系统，包括昂贵的商品暗场照明装置，即超聚光镜(Zeiss)。照明的两种基本方法和这两种方法的几种样式得到了应用。这些方法比，如超聚光镜，更简单，并且似乎能产生更高的照明光强度。基本照明方法的一般描述
照明系统被设计为(1)传输一束高强度光到一光散射颗粒点(或点群体)和(2)减小直接或通过反射进入探测系统照明光的通量。这通过限制光束和它的反射束到某角度，使其在探测系统的光收集角度以外。在一种照明方法中，聚光透镜和光源位于固相表面的相对的两边(从下面照明)，在另一方法中，照明光源和放大透镜位于表面的同侧。从放大透镜下面直接照明
图1表示所用一种基本照明方法的示意图。在这种方法中，光从表面下面照射到固相表面S上。假设S是透明的(尽管它可能有点颜色)。0是表面上含有光散射颗粒的区域。放大或光聚焦透镜L位于S上面。L收集光的角度表示为带阴影的锥形C(透镜L光收集锥)，其有在表面S上有一顶点(光散射颗粒位于其上)和由透镜直径D决定的底面积。照明光束(LB)成一定角度使得其不会进入L的光收集锥中。箭头表示LB的传播方向。
固相可以是，如显微镜玻片，微量滴定片或在临床诊断中使用的其他透明固相。光源可以是任何种类的光源，如阴极灯，放电管，发光二极管，激光等。使用光导纤维和/或聚光透镜把照明光束收集起来，然后用聚光镜聚焦在散射光颗粒上。调整光束与表面S的平均夹角θ，使光束不会进入透镜L，这正如上面所解释的。角度θ很容易被调节，只需通过放大透镜或目镜(组合显微镜)观察光散射颗粒，调节角度使得颗粒表现为黑暗背景中的明亮物体。既使在颗粒浓度高时，对光散射强度测量，这个角度也有好处，聚焦并不是必需的。
角度θ的大小可以从放大透镜的数值孔径求出。对于超灵敏探测，显微镜物镜用作放大或成像透镜。显微镜物镜的数值孔径通常刻在其机架上。可以按照图2中图示来定义数值孔径。此图所示的放大镜(焦距f)聚焦在0区光散射颗粒点上。透镜与0之间的距离等于f。透镜(L)收集所有从0进入立体锥的散射光。其底面是棱镜的直径D。角度θH定义为此立体锥平面半角。此锥的数值孔径(N.A.)与θH存在如下关系，其表达式为：
N.A.=n Sin(θH)    (36)其中n是透镜和点0之间介质的折射率。介质可以是，例如空气(n=1)，水(n=1.33)或浸没油(n=1.5)。对于很小的θH，N.A.近似等于D/2f，D是透镜的直径，f为焦距。
下面的表给出了常用物镜的数值孔径(n=1)和θH的典型数值。
放大倍数    N.A.    θH(以度表示)
×10        0.25         14.47
×20        0.5          30
×40        0.65         40.54
×63        0.85         58.2
如已经提到的那样，激发光束必须成一定角度，使得光束在放大透镜的光收集立体锥之外。对于高放大倍数，激发光束照射到固相表面的角度一定大。例如，对×40的物镜，入射角必须比40°大。因为表面反射的光随着入射角增加，我们必须考虑，必须在我们照明系统中使用的角度是否会导致由反射引起的大量损失。而且，我们必须考虑涉及到以大角度入射的临界反射(全内反射)。下面简要地讨论了折射和反射的基本规律，它用在随后的关于此照明系统中反射的影响的讨论中。斯涅耳折射定律
我们根据图3来描述斯涅耳折射定律，此图表示，一光束沿折射率为ni(i代表入射光介质)的介质传播，照射在折射率为nt(t代表透射光介质)介质表面S上。入射光的一部分透射进入介质t(折射光束)，一部分被反射回介质i中(反射光束)。如果入射角是θi，那么反射角可由斯涅耳定律给出，写作：
ni Sin(θi)=nt Sin(θt)    (37)
如果ni＜nt，那么θi＜θt，如果ni＞nt，那么θi＞θt，注意角度是相对于垂直表面S的垂线测量的。反射光的角度θr=θi(也就是说，入射角等于反射角)。反射定律：在表面反射的部分入射光
对于不同入射角θi被反射的入射光强度部分R可用菲涅耳反射方程计算出来。(应当指出，强度这里定义为单位时间单位面积的能量，强度也叫辐照度)。然而，为了简化，我们按照R和θi的关系图进行讨论。R与θi精确的依赖关系决定于ni和nt的值以及入射光的偏振态。关于反射的重要事实如下。ⅰ．光束从低折射率介质传入高折射率介质情况时的反射率(ni＜nt)
图4表明了，在ni=1(空气)，nt=1．5(后者接近玻璃或塑料的折射率)，以及相对于入射平面平行偏振(rp)和垂直偏振(rs)光情况下，R对θi(ω=θi)的关系图。入射平面定义为包含入射光束和垂直于表面的垂线的平面(见图3)。非偏振光的反射率R由平行于和垂直于入射平面的偏振光的曲线取平均给出。在图4中，非偏振光的反射率曲线标志为0rd(普通光)。图4的曲线表明
a．rs随φ增加而连续的增加(图4中的φ与这里使用的θi一样)。直到大约70°时，rs的增长是缓慢(反射率仅仅约为15％)，而后增加的很快，在90°时达到100％。这样，在入射角达到60°时，被反射部分的光低于20％。
b．rp随φ增加而减小，到约57°时rp为零。rp=0时的角称为布儒斯特角或起偏角。布儒斯特(Brewster)角由表达式
Tan(θb)=nt    (38)
算得，这假设ni=1(空气)。对于nt=1.5，从上面的方程得出θb=56.3°。应当指出，在布儒斯特角时，θi+θt=90°。因此对于nt=1.5，θi=θb=56.3°，θt=33.7°。对比布儒斯特角大的角，rp随φ很快增加，而增加很快，在90°达到100％。
c.对于非偏振光(普通光)，反射率随φ缓慢增加直至70°，然后增加很快，在90°时达到100％。θi＜70°时，少于20％的入射光被反射。
d．应当指出，反射光和透射光的强度加起来并不等于入射光的强度。这似乎违背了能量守恒定律。这表面上的违背实际上是由于把单位时间单位面积的能量作为强度的定义而引起。因为折射，入射光和透射光并不具有相同的截面。如果考虑到截面的不同，那么就可看出，单位时间反射光和透射光的能量加起来等于单位时间入射光的能量。ⅱ．光束从高折射率介质传到低折射率介质情况下的反射率(ni＞nt)
图5表示ni=1.54和nt=1时，偏振光的反射率对入射光的角度(φ=θi)的关系图。此图与ni＜nt时的图4相比非常不同。最明显的不同是入射光角度大于约41°时，全部光都被反射(100％反射，全反射)。内全反射发生时的最小入射角称为临界反射角θc。这角的数值依赖于ni和nt的值。从ni和nt的值计算θc的表达式，可以由考虑临界角时入射光和透射光的角度得出。正如特殊反射定律所要求的，在临界角θc，反射光中包含大多数入射光，得到相对于垂线于表面的直线的角θc。透射光强度很低，相对于垂线的角θt为90°。这就是说，透射光平行于表面。因此，我们代入θt=90°到斯涅耳方程中，便能得到θc的值。代入后得出：
ntSin(90°)=niSin(θc)    (39)因为Sin(90°)=1，我们可写出
Sin(θc)=ni／nt    (40)
对nt=1.54和ni=1(空气)，上面的方程给出θc=40.5°。应当指出，对于非偏振光和垂直于或平行于入射平面的偏振光，临界角是一样的。这就是说，θc与光是非偏振的还是平面偏振的无关。ⅲ．反射和折射对光照射光散射颗粒的影响
首先，我们考虑简单情形，颗粒位于空气中干燥的载玻片的表面上。这就是说，颗粒是干燥的，空气是载玻片两边的介质。图6示出了该情形中的反射和折射的草图。一次反射发生在表面S1(ni＜nt，ni=1和nt=1.5)。图4表明入射角增至70°时反射光所占比例低于20％。因此，用此方法照射S1面上的反射不会有问题。S2面可能会出现问题，因为光束从低折射率通过到达高折射率，在此表面上有可能存在全内反射。当ni=1.5，nt=1(空气)时，表面上的全内反射临界角约为42°(用方程(40)计算)。现在的问题是当表面1的入射光束角度很大时，是否能达到这一临界角。
图7为由斯涅耳方程(37)计算出的θi2随θi1的关系图，运用了θt1=θt2。如图所示，θi2随θi1增加急剧增加，直至θi1增加至约θi1=70°时。以后θi2的增加平缓，直至θi1=90°也未到达临界角。但是θi1=90°时，没有光透过S1。所以我们断定，对于图4的装置来说，以任何实际的角度θi1照射，不可能到达临界照射。进一步讲，θi1的值小于约70°时，反射并不能明显减少照射到S2面上颗粒的光通量。
我们已经在实验上证实了上述结论。但是在我们的实验中，我们已经发现由表面S1和S2上的污迹、灰尘、划痕及其它缺陷或人为破坏痕迹散射的光(非特异性散射光)可以和S2面上的颗粒散射的光相比拟，因此，背景光大大增强，从而降低了颗粒探测灵敏度。但是，S1和S2面上由人为破坏引起的非特异性散射光集中在照射光束的正方向上，而由颗粒(对于小颗粒)的散射光分布在所有方向上。图8说明了这一结果。
图8中，在任意方向θ，表面人为破坏的非特异性散射光的强度由从原点0延伸到强度包络面上的线段(夹角为θ)的长度给定，颗粒的散射光表示为从原点0向外射向各个方向的虚线。在实验上用表面上载有60nm的金颗粒的载玻片说明非特异性散射对探测特异性散射的影响。在空气中，这些颗粒散射绿光，没有非特异性光散射，一团被照射的颗粒在黑色背景上呈现出一个绿球。表面人为破坏痕迹散射白光，当此类非特异性散射叠加到特异性颗粒光散射上时，颗粒群体散射的光为浅白色而不是纯绿色。如图8所示，通过在不同角度θv方向上，用眼睛观看散射光，表面人为破坏痕迹的择优前散射效应可以被观察到。当人眼在θv=0时，散射光为浅绿色。随着观察角θv的增加，白色减弱，当θv增至30°时，只见到金颗粒的纯绿色光。因此，本发明中，在角度θv大于30°方向上，用眼睛观察或用光电探测器具探测是有用的。在后面我们会看到，通过光标如棱镜装置照明能进一步减少非特异性散射。
下面我们考虑的是水薄膜中的光散射颗粒，水薄膜在载玻上，用盖玻片盖上，见图9。照明光束遇到四个表面，即S1(空气对玻璃)、S2(玻璃对水)、S3(水对玻璃)、S4(玻璃对空气)，表面处折射率发生变化。象前几节一样，考虑每个表面的反射和折射可得到图9系统中的结论，反射并未明显减小传输光散射颗粒的光能，在任何表面处都未出现临界反射。如图8的情况，表面S1和S4上的人为破坏痕迹，出现了非特异性光散射。但是，水的出现大大减少了表面S2和S3上的非特异性光散射。从放大透镜的同侧直接照明
这种照明方法见图10。此处S、L、C和LB的意义与图2中的相同。激发光从上表面照射到表面S上。集光透镜也位于S之上。激发光束斜入射使得入射光和反射光都不能进入透镜L的集光锥面内。用这种方法照明，重要的是，使光路上不同面反射的光不被反射进入凸透镜或成像透镜L的集光锥面内。由于在每一面上反射角与入射角相同，可通过将照明光束限制在锥体C外面的角度内，来减小L对干扰反射光的收集。正如上一节所指出的，反射并不能明显减小输送给光散射颗粒的能量，以及在干燥和被水浸没的颗粒中不会发生临界反射。由表面破坏痕迹引起的非特异性光散射与上一节的讨论相同。通过棱镜装置的照明1．从下方照明
图11给出了棱镜放置的草图。在一种最简单的结构中，包括有一个三角棱镜。三角棱镜之上安放有微滴定池、玻璃片、塑料上的微阵列或玻璃等，他们含有被测光散射颗粒。含有光散射颗粒的样品室或薄片位于棱镜的上表面之上，含有颗粒的表面位于透镜L的焦点上。浸没油抹在样品室或薄片和棱镜之间，以减少由折射率匹配引起的非特异性散射光。空气中颗粒是干燥的。如果S2面上的折射率匹配恰当或大致恰当，那么光束在S2面上就不会发生明显的折射和反射。因此，当一束照明光束横向照射到棱镜上和含有光散射颗粒的表面上，基本上以直线传播。但是在空气--棱镜的界面S1和在S3面上存在折射。这里考虑的是入射到棱镜的照明光束垂直于S1面(入射角为0°)以及假设棱镜是45°棱镜(角度γ=45°)。因光束从S1面到S3面上的0点是以直线传播的，光束是以45°角照射到表面S1上。由于玻璃对空气的临界约为42°，因此光束会发生全内反射。因此，与没有棱镜从下方照明(见图6)相反，棱镜装置可发生临界反射。回顾一下，没有棱镜(图6)，正如图6所示(也可见图7)的S1面上的光折射，不可能出现临界反射。为了利用如棱镜这样的光导传输高能量的光束，照明光束必须有方向性，要求光束以小于42°的角度入射到S3面上(图11)。现在的问题是不是在S3面上入射角小于42°就能满足从S3面上出射的光一定在透镜的收集锥面之外这样的条件。假设S3面上的光入射角为35°，由斯涅耳定律(所有ni=1.5和nt=1)我们可计算出射角为62°，在大多数所需物镜收集锥面之外，如×40的物镜θH=41°。我们可以得到这样的结论图11的棱镜装置维持一个黑背景时，可以向空气中干燥的光散射颗粒输送高的光能。
我们现在考虑图11的棱镜装置，其中用水和盖玻片包被在光散射颗粒上。正如前面所描述的，激发光束沿直线从S1传播到0，在0点遇到玻璃--水界面。然后，光束穿过水和盖玻片，最后至盖玻片的上表面遇到玻璃--空气界面。考虑玻璃--水和玻璃空气界面上的反射是有意义的。空气--水界面上临界反射角度等于62.5°(在方程(40)中用ni=1.5和nt=1.33)。因此，表面S3上水的引入，使得不发生全内反射的照明角比在空气中要大得多。此外，小于62.5°角度时，玻璃--水界面的反射低。现在我们考虑盖玻片--空气界面上的。反射考虑一束垂直入射表面S1上的光。如棱镜是45°棱镜，那么光束以45°角入射到S3上，发生全内反射。S3面(玻璃对水)上的折射将光束的角度改为55°。但是，水--盖玻片界面的折射使光束折回到45°。所以光束以45°角照射到盖玻片和空气的界面上。因此，颗粒在水中和在盖玻片内的棱镜装置，可将光能有效输送到光散射颗粒(附着在表面S3或游离在水中)，但在盖玻片上入射光被全反射。
从以上讨论我们可归纳出，反射并没有严重影响光能输送到水薄膜中的光散射颗粒。在盖玻片--空气界面上确实发生全反射，但此反射并不影响入射光能量输送到散射颗粒上。
以上讨论很明显，有棱镜的装置和没有棱镜的装置都可通过倾斜照明附着在表面的颗粒或悬浮在溶液中的颗粒而有效地输送光能量。我们所说的有效输送意即在任何有关的表面上不会发生全内反射以及非特异性散射被降至最小。但是，实验上，我们发现在某些实际应用中用棱镜装置可以得到最佳的探测能力，因为棱镜装置可以消除或大大减小不规则缺陷引起的光散射干扰，此不规则缺陷来自于靠近光散射颗粒的玻璃表面或塑料面上。浸没油被用于耦合固体和棱镜，可消除几乎全部S2面(图11)上不规则缺陷引起的非特异性光散射，这些效应看起来是缘于折射率的匹配机制。在S1面上的光束入射点的非特异性光散射可以从0点的特异性散射颗粒中移到远处(假如棱镜足够大)，因而对放大透镜收集的散射光没有贡献。而且，如果特异性散射是在水中，由水膜匹配的折射率大大减小S3面上的非特异性散射。并且，水和盖玻片的出现，在其界面处照明光束发生全反射。这一反射大大减弱了盖玻片--空气界面上的不规则缺陷引起的非特异性散射，因为只有少部分的光能到达此表面上的不规则缺陷。另外，全内反射减弱或消除了照明光能直接进入放大透镜的光收集锥面内的可能性。应注意全内反射也可影响透镜L的收集角，因为入射到盖玻片--空气界面上角度42°的颗粒散射光被全反射。但这一效应并不严重。显微观察
上一节，我们着重于几个因素(反射和折射)讨论了照明和探测(放大透镜)系统，在减小收集非特异性散射光的同时，这些因素决定着将光能有效地输送给光散射颗粒(附着在表面上或正好悬浮在表面之上)。在这一节中，我们给出一些通过目镜进行肉眼观察的实验细节，其中放大透镜L给出所观察的放大像。a．光源和光纤的细节
我们已经使用过如下三个不同类型的光源。ⅰ．莱卡(leica)显微镜照明器
这是一种标准的，商业化的显微镜照明器。它用的是一只钨丝灯泡和一组透镜。这组透镜在距离照明器的端部22mm处成一个5×7mm的灯丝聚焦像。为了得到一束聚焦好的光束，我们在显微镜上安装了一只10倍的物镜。这一透镜距离照明器的端部约6.5cm。在距物镜约7mm处得到一个直径大约4～5mm的聚焦光斑。ⅱ．Bausch和Lomb Fiber Lite照明器
这也是一种商业化的照明器。它有一只150瓦的钨丝灯泡。安装在一个抛物反光镜上。反光镜产生一束直径约25mm几乎平行的光束。一根直径11mm的光学光导(由许多捆在一起的细光纤组成)靠近钨丝灯泡。将这根光学光导分成两根相同的光导，每一根的直径约5．3mm，长度约为2英尺。我们用其中一根。为了得到一个聚焦光斑，我们在光纤的一端约25mm处放置一只25mm焦距的透镜(20mm直径)，用来准直从光纤出射的光。然后，在离准直透镜50mm处放一只×10的物镜，将准直后光聚焦成一个5mm直径的光斑。准直透镜和物镜安装在一个与光纤紧固的小型(compact)支架上。光纤的可弯曲性使这一类型的光源系统比固定的莱卡(leica)显微镜照明器更易于使用。ⅲ．自制照明器(customi lluminator)
这是我们制造的照明器，它有一只12V，28W钨丝灯泡，安装在一个抛物型反光镜上。反光镜反射一束几乎平行的光束，此平行光束经聚焦进入一根直径为0．125英寸的光导。光导长为36英寸。反射器反射的光被聚焦在带有一个透镜(焦长23mm，直径9mm)的光纤上，光纤靠近灯。光导的数值孔径为0．55，接收光锥体的平面半角为60°。和一个焦长为12mm的透镜(直径为11mm)准直由光导的另一端出射的光，透镜放在离光纤端部17mm处。最后，准直光由一个×10的物镜聚焦成一个直径为5mm的亮斑。物镜放置在离准直透镜约26mm的地方。5mm的亮斑位于离聚焦透镜12mm处。b．棱镜(光导)
图12给出了一些象棱镜这样的光导，我们发现这些光导对我们的照明系统有用。有些并不是传统意义上的真实棱镜。应称作光导器或光导。当与入射光面相对的面上反射出反射光时，光导能以某一角度有效地传送光。因下列原因，光导的尺寸一定可以减至最小。由于表面不规则缺陷，入射光和反射光的光斑能产生明显的非特异性散射。必须从特异性光散射颗粒中充分除去这些光斑，将非特异性散射的贡献降至最小。光导与样品室在制在一个片上，因此为消除这一个足可以将浸没油抹在光导和分析片之间。我们已经制出了样机，如将一个小光导粘在塑料池的底部，塑料池里有链霉抗生物素蛋白点(Streptavidin Spots)微阵列，铺在样品室的内表面。用这一台样机对结合在微阵列上的各个独立小点上的光散射颗粒，进行探测和测量，基本上与我们用颗粒计数的测量和用样品室放置在棱镜上的强度测量相同，上述强度测量中样品室和棱镜两表面间抹有浸没油。c．显微观察
用目镜来肉眼显微观察，我们已经评价几种照明装置，特别着重于颗粒的亮度、背景的暗度及在不同类型的临床检定方式中的应用。我们已经找到了可得到好结果的几种装置。这里我们限于讨论最易于使用、最便宜、能给出最佳结果的照明装置之一。我们所指的最佳结果就是指用×10和×40的物镜作为放大镜在黑暗背景上的明亮颗粒。
成像系统是一台Edmund Scientific的价格低廉的显微镜。这台显微镜由一个物镜(×10或×40)和一个目镜组成，目镜在一个标准的160mm的镜筒内。使用显微镜的原因，是为细/粗调节显微镜的焦距提供方便，而不是仅仅简化物镜和目镜。但是，我们已经改装了显微镜的平台，使之能适用于我们的照明方法，如图12(d)所示，已经用光导(棱镜)替换了显微镜的聚焦透镜。棱镜下方的镜筒安装在聚焦透镜支架里。改装后的显微镜平台和照明器使得用载玻片、微滴定池和其它塑料池测量成为可能。但是，×40的物镜不能用于厚塑料池，因为此物镜的工作距离小(约0.45mm)，而×40的物镜工作距离较长可以使用。用自制照明器照明。
为了要建立DLASLPD显微系统，在显微镜的平台上放置一块含有悬浮或结合金颗粒(用盖玻片盖住水薄膜，其中有60nm的金颗粒)的载玻片。安装棱镜使其表面几乎与载玻片接触。载玻片和棱镜表面用浸没油连接。安装照明系统中的×10聚焦物镜，使其几乎与被光照射的棱镜的边相接触(见图3)。物镜倾斜成一定角度，使得光垂直入射到照射面上，以45°角照射表面S(与载玻片接触的表面)。如载玻片上的金颗粒膜有足够高的颗粒浓度(约6×109颗粒/ml或更高)，光穿过颗粒膜时的光斑，由于颗粒的光散射，呈现强黄绿色。调整×10照明物镜的位置和倾斜角，在黑暗的背景上产生明亮的物像。重复上述调整，同样调整显微镜中×40的物镜。对于×10和×40倍的物镜，在黑背景上成出明亮的像，其物镜位置的变化范围窄。
应该注意的是当照明光束以高于42°(在塑料或玻璃-空气界面上全内反射的临界角)的角照射到棱镜表面上时，没有照明光传播到载玻片上方的空气隙中。在我们的安排中，入射角为45°。这可以在载玻片上方放一张白纸来验证。但是，用肉眼观察照明光束，检测其形状或空间断面是有意义。进行这一观测可以在载玻片的上部放一块若丹明塑料块，用浸没油连接。若丹明块是透明的塑料块，含有荧光分子若丹明。光束在若丹明块中传播可以从产生的若丹明荧光中观察。浸没油消除空气气隙，使照明光束进入此塑料块。如图13中所示，通过塑料块的内侧的荧光可以观看到照明光束的断面形状。
一旦照明系统被调整好，在载玻片、塑料池以及固体微阵列或阵列芯片上，可观察到大于约30nm的金颗粒。×10的物镜可以观察到颗粒的密度小于每平方微米0.005个颗粒。×10物镜的工作距离约8.5mm，因此，能适用于8mm厚的塑料片。DLASLPD视频相差增强方法
我们确信运用此方法DLASLPD视频相差增强法，样品中的金属样颗粒和非金属样颗粒可探测到更高的灵敏度。这种方法是调节电子像的非特异性光背景，因此要使各个颗粒都能被观察到，实质上就是从像场中消除非特异性光背景。与本文中所述的其它方法相比这种方法很好，用这种方法我们已经观察到改进后的特异性和灵敏度结果。样品室的改进
我们积极承担了本发明中某些工作，本着易于使用，适用于不同的测试环境和条件的原则，现对本发明作进一步改进。样品室是用于导入样品和检测分析物的，我们已经发现本发明中几方面的工作在样品室的设计方面得到了具体体现。
例如，我们在观察和推理的基础上，将我们的原理应用到样品室的一般性设计中，样品室为装载被分析样品的容器。这些改进能有利于易于使用以及应用到以上简述的测试类型和测试条件中。但是应该说明，没有运用下列样品室的改进，本文所述发明同样能很好地实施。这些改进是为了增加本发明实际应用于特异性测试条件和环境中去，这些条件和环境在本文其它地方叙述。
我们已经发现将表面S1(入射光表面)从含有待测颗粒的区域内移出尽可能远的地方，可以明显提高信噪比。前面，我们已经描述了诸如棱镜或类似于光学光导的准直器具的应用，准直器具有助于将照明光束定向传输到表面S1上。通常人们用浸没油抹在光导(棱镜等)和样品室的表面之间。在分析测试中，多数情况可能不倾向于用浸没油作为一种实验分析的器材。正如前面所叙述的，我们决定通过增加颗粒附着或接近的表面厚度来大大降低非特异性光的水平。
我们已经将本专利发明或其它方面的专利发明应用到样品室的设计中，来探测样品中的一种或多种分析物。这些通常的样品室设计草图见图17、18和19。图17的一个样品室侧面是斜截平台侧面。斜截平台侧面的角度与照明角相近，这样照明光束以尽可能接近0度(相对于垂直方向)的角度入射到斜截侧面上。这种方法中，非特异性反射和散射被降至最小。图18所示的样品室侧面是弯曲型面，而不是图17中的斜截平台侧面。此样品室中，出射光发散，曲面可更有效地消除这种非特异性光。图19所示的样品室运用两种思想，将光束入射到样品上的入射面从待测区域中进一步分开；曲面可更有效地除去非特异性散射光。因此，这种样品室增加了室底表面以下物质的厚度，室底表平面以下的斜截平面用于照明，样品室底部表平面以上的曲面可有效地去除非特异性光，图17、18和19所示的样品室不仅对溶液样品测量有用，而且对测量固定化样品也有用。光散射颗粒的选择，探测和测量
在这项发明中，所探测的光散射颗粒产生的光散射信号多数来自溶液中悬浮的颗粒或与某一固体相连的颗粒。我们已经描述了液态和固态样品的DLASLPD照明和探测方法的多种变化。DLASLPD方法的这些变化主要与样品性质和样品的容器有关。
此发明在多种不同类型的分析形式从而在不同分析容器或其它可用于探测和测量样品中一种或多种被分析物的存在与总量的器件中均有很大的作用。例如，可以使用微滴定池和平板，测试试管，毛细管，流体池，微通道器件，透明的小容器，量油计，显微镜波片，光学透明表面，珠子，磁珠，点缺陷，高或低密度的阵列。
对于给定的被测物的探测应用，恰当地选择最好的颗粒类型是把此发明应用于被测物的测定时很重要的一点。这点部分依赖于所需的分析形式和灵敏度。颗粒的光散射信号既以独个颗粒为基础，同时又决定于被探测和测量的众多颗粒的光散射性质。
选择任何给定的特定分析应用的最佳光散射颗粒时要考虑很多因素。这些因素一般与以下几项相关：(1)所用照明和探测系统的贡献；(2)测量所用的容器或装置的本质和特性；(3)所用的分析形式；(4)探测和测量的是否是单个颗粒或众多颗粒和(5)待分析物探测的浓度和范围。
不论在液态或固态为基础的分析中，最重要的是散射光信号和被探测颗粒的浓度的关系。为测量样品中光散射颗粒的总量，必须发展和使用一种算法，使一束或更多的被测光散射信号与颗粒的总数相联系。在此发明中，来自独个或众多颗粒的光散射信号可以多种不同形式被探测和测量。
对于固体或溶液中多颗粒的聚合的光散射信号被探测(也就是说，独个颗粒的信号不被探测)的情况，我们已确定被探测颗粒的相对光散射强度，偏振，和色谱如何随浓度变化。如文中所述，散射光的强度和色谱依赖于颗粒直径，形状，和组分，颗粒浓度，和介质折射率。在多颗粒聚合光散射信号的探测和测量的方法中，积分光散射强度的探测和测量是测量中非常有用的光散射性质。图31和图32分别示出了悬浮在溶液中或与固体相连的颗粒的散射光强度与颗粒浓度的关系。在这些说明性的例子中，介质折射率约为1.33。溶液中的悬浮颗粒用SpectraMetrix液相探测装置测量，固态颗粒用文中描述的以显微镜为基础的探测装置测量。在给出的例子中，SpectraMetrix液相探测装置和以显微镜为基础的探测系统分别是光电倍增管和CCD单片彩色相机来探测光信号。
作为说明性的例子，图31说明了一系列不同直径的近球形金颗粒的散射光强度随颗粒浓度变化的特性。通过测量颗粒散射光的光散射强度随颗粒浓度的变化，可以得到银，硒和其他金属状的颗粒的相似的图形。照明光波长调至不同颗粒的最大散射波长。图31的综合数据表明，探测的灵敏度和探测与测量的工作浓度范围随金颗粒的直径变化而呈函数变化。用本发明中照明和探测方法的任意具体表现，可得到散射光强度与颗粒浓度的关系图，精通本领域的人可通过这个图确定最适合于任意给定分析应用的颗粒类型。有最大的分析效率的最佳光散射颗粒类型的选择以下面几点为基础；(1)探测的可接受的动态范围；(2)样品中被分析物预期浓度的低值端有合适的探测浓度；(3)探测的合适的分辨率(也就是说，一定的颗粒浓度范围内，分立的可探测强度值的数目)。以图31为例，直径为52nm的金颗粒最适合用于所探测最小和最大的光散射颗粒浓度分别为5×10-13M和1×10-11M的分析探测应用。直径为87nm的颗粒最适合于最小和最大的探测浓度分别为1×10-15M和5×10-11M的分析探测。任何颗粒的绝对探测灵敏度都基于颗粒的相干光散射功率及照明和探测的方法。有本领域一般知识的人都知道上下绝对探测限可通过改变照明源和光学性质(如波长，功率，光束尺寸，光程等)及所用的收集镜片和光电探测器增大或减小。如文中所揭露，银颗粒有大于相近尺寸金颗粒的散射功率。最好是用金属状的颗粒，银和金颗粒最佳。任何给定颗粒类型产生的光散射信号都可通过用靠近该颗粒散射的最大波长照明来优化。然而，我们研究的多数颗粒类型的光散射功率都太强以至于多数情况中，可通过非靠近或相似的最大散射波长照明来得到合适的光散射信号。例如，使用照明波长为630nm的3mW的激光笔，并使用裸眼作为光电探测器，我们可探测到至很低浓度(小于10-14M)的近球形的60nm的金颗粒的光散射。这个体系中，使用了微滴定池作为样品容器。池通过激光笔从以近垂直于池侧面的角度照明。使我们的观测角高于或低于该池，或者，与照明光束成近90度角，便可用裸眼探测颗粒的散射光。
对于以固体为基础的分析，除了(1)在探测与测量的过程中，颗粒与一固体相连，且(2)有额外的因素起作用外，决定最佳颗粒类型的选择和优化的方法与我们描述的液体中的情形相同。图32是一个说明性的例子，金颗粒直径为60nm，其散射光强度是颗粒浓度的函数。对于与固体相连的光散射颗粒的探测与测量，我们用颗粒密度(颗粒数/平方微米表面面积)描述颗粒浓度。固体分析与探测中最佳颗粒类型的选择中一个额外的考虑是颗粒尺寸。例如，阵列基片及诸如此类的物体可能含独立的束缚点，这些点只有10平方微米大。因此，光散射颗粒的相对物理尺寸限制了有效的束缚表面面积饱和时表面上可被束缚的颗粒的数目。仔细的研究如关于不同颗粒类型的探测的灵敏度和探测的动态范围必须在装置上算出以确定相对所需探测灵敏度及可能被探测的颗粒浓度范围的颗粒类型的最佳形式。例如，选择有较低散射功率较小的颗粒类型将使更多的颗粒被束缚于单位束缚表面。然而，低束缚密度时信号太弱难以探测。另一方面，有大得多的光散射功率且尺寸较大的颗粒类型允许低束缚密度的探测，但由于束缚点中颗粒饱和时，颗粒数低得多，和/或总强度可能对探测装置饱和，它将有受限制的动态范围。
在检测系统的照明和探测条件下，对于任意光散射颗粒所探测到的光散射强度与颗粒浓度的函数关系提供了发展计算颗粒浓度算法的基础，由此可以从所探测到的光散射强度确定样品中的颗粒浓度。
本领域的普通技术人员可认定最好的颗粒类型，并发展颗粒类型－系统特殊的算法，如下所述用这种算法将测得的光散射强度或任何其他可探测、可测量的光散射信号与样品中颗粒浓度联系起来。使用出射装置，实验性的光序列(如照明源，样品支架，光电探测器，和镜片)和样品容器或装置来确定光散射信号和颗粒浓度的关系。而后用对各种不同颗粒类型计算得到的标准曲线图，确定哪种颗粒类型使被探测分析物有最佳表现参数(动态范围，分辨本领，最小探测灵敏度等等)。所测光散射强度或其他光散射信号与颗粒浓度的关系便成为从测得的光散射信号确定样品中颗粒浓度或总量的算法的基础。相关的算法中，被探测的颗粒总量与样品中被分析物的总量有关。有本领域基础知识的人可选择最佳颗粒类型，并发展特殊的颗粒类型/样品容器/探测装置算法，对本发明中任意形式的大多数，使测得的光散射信号与被探测颗粒总量相连。单颗粒和多颗粒结构的探测和测量
对于使用了单颗粒或多颗粒聚合体的探测和测量方法的应用，有两种通用的样品分析方法：(1)颗粒流过照明源和探测器或(2)用成像光电探测器探测视场中的颗粒(与固体相关或在液体中)。
基于流体的方法的例子包括毛细管，显微通道，或包含此类结构的装置。另外的例子还包括如商用分光光度计，和流体白细胞计数器中所用的用于光学光谱分析的样品池。
与样品流动通过探测系统相反，用场分析方法可探测和测量全部或部分样品。场分析方法中，固体或液体薄膜通过想象视场表面面积和/或深度探测分析。显微技术是场分析通用方法的一个例子。特殊的应用包括点缺陷，微阵列，生物细胞，细胞组织等等的探测和测量。光散射颗粒的以流体为基础的探测和测量
对于以流体为基础的应用，来自光散射颗粒的光散射信号的探测测量可用本发明的一个或多方面的各种方法来完成。这些方法可大致分为两类：(1)单颗粒和多颗粒聚合体被探测的应用；和(2)一个或多个与可移动固体如小球，生物细胞或其他颗粒状物体相连的应用。
以流体为基础的独个颗粒或颗粒聚合体的探测和测量的方法中，有照明光束和探测器的较佳安排，这种较佳取向部分依赖于分析样品的本质。可用一个或多个光电探测器探测和测量光散射颗粒的光散射信号。在一些具体装置中，探测器置于散射光前向的包络外。另一些具体装置中，如样品中其他材料的背向散射光相对较弱，探测器可置于散射光前向的包络之内。照明光束应高度准直，可以是单色或多色。来自光散射颗粒的光散射信号的一个或多个分量可用一个或更多的探测器探测。可以探测和测量被探测散射光的偏振，强度和色谱。作为一个说明性的例子，在样品中进行分析来探测目标核酸的存在。一种以溶液为基础的三明治式分析形式被采用，其中用了两种或更多的探测核酸，它们维持一定次序，并与目标成分(targetstrands)的特殊区域相连。某种形式的探测剂与光散射颗粒相连接。探测剂与样品混合，培育(allowed to incubate)，而后把一些或全部样品置于流体系统中分析。流体池的物质贡献和流体池的动态均被调整使每次通过探测区的只有一个单一颗粒和多颗粒－颗粒聚合体。探测系统被校准，并设置成可以区分来自一个颗粒的信号和来自两个或多个颗粒的信号。若目标核酸存在，样品中将有部分颗粒有两个或多个颗粒构成的多颗粒结构。样品中目标核酸的总数通过探测和测量多颗粒聚合体的总量和/或类型来确定。以免疫学为基础的胶结分析在本领域中是广为人知的，在本发明中也可用于探测被分析物。这种方法中，探测和测量的是光散射颗粒和可与被分析物连结形成多颗粒结构的一种或多种抗体或抗原相连接形成的多颗粒聚合体。
本发明的流体－系统方法的另一种变形中，光散射颗粒与生物细胞，珠子或样品中其他物体相连。作为说明性的例子，本领域中很感兴趣的是生物细胞的分类和表面接受器及其他细胞组织含量的确定。本发明的一种方法中，生物细胞的识别和计数，及/或细胞组分总数的确定均通过使用光散射颗粒试剂来完成，其中，颗粒连结试剂对细胞中某中成分有特殊的束缚作用。正确的探测和测量前述细胞性质的要求是，探测并区分与颗粒相连的光散射颗粒的光散射信号与细胞的光散射信号。有高的光散射功率的的光散射颗粒是最佳的。可使用一个或多个探测器。探测器的位置和所使用的颗粒类型必须是最恰当的，才能得到最好的性能。例如，这种方法的一种具体装置中，可用一个有处于不同位置的两个探测器的单光束照明源探测和测量样品的光散射信号。一个探测器用于探测细胞的光散射信号，一般置于散射光前向的包络之中。另一个探测器用于探测光散射颗粒的光散射信号，一般置于散射光前向的包络之外。这种方法的基础是我们对多数直径小于～120nm尺寸的金属状的颗粒的发现，它们基本上在各方向上以相近比例发射散射光。较大的颗粒，如生物细胞和微米尺寸及更大的小球，一般在前向发射大部分的散射光。探测器的位置可变化，并与所用光散射颗粒类型，照明和探测光，及样品的本质有关。为使这种方法在特殊应用中发挥最大作用，可把含小球或细胞的样品置于样品容器中，照明样品时，移动第一个探测器至不同位置，并记录探测到的光散射信号值。用有光散射颗粒的流体池和第二个探测器重复这个过程。通过分析两个探测器置于不同位置时细胞的特异光和光散射颗粒的特异散射光，可以确定光电探测器的最佳位置。将用于探测小球或细胞的特异散射光的光电探测器放在这样一个位置上，使此时光散射颗粒的散射光最小，且来自小球或细胞的光散射信号可以被充分地探测。用于探测颗粒的散射光的光电探测器放置的位置，将使优先于来自小球或细胞的光散射信号的来自颗粒的散射光可被充分探测。滤波器的两个或更多波长将用于进一步分辨两种类型的光散射信号。利用两种不同的颗粒类型使不同颗粒的光散射信号在某种形式下可被分辨，这样至少可分辨一种以上的光散射颗粒类型。基于两个光电探测器探测的光散射信号，可以使用一种恰当的算法来测量小球或细胞的总数及单位小球或细胞的颗粒数。例如，某种算法中，对每个被探测物，测量每个光电探测器探测到的光强度。依靠每个探测器得到的强度值，可确定(1)没有颗粒与小球或细胞相连；或(2)与小球或细胞相连的光散射颗粒的相对含量；或(3)分立的若干颗粒与小球或细胞相连。而后在存在，不存在或与小球或细胞的相连的颗粒数的基础上，每个小球或细胞可被识别。测量细胞特异散射光的探测器用于计数小球或细胞的数目。对精通本领域的人，很清楚可能用于细胞分析的测量和算法有多种其他变形。光散射单颗粒和多颗粒结构的识别和测量
本发明的许多形式中，单颗粒和多颗粒结构可被观察与探测。我们已确定，颗粒类型和多颗粒结构的本质可通过一种或更多的可观察和探测到的光散射性质来识别。这些性质而后可用于探测和测量样品中某一被分析物的存在和总数。发明的这个方面在目前可获得的标定和探测技术中很有用，而应用至被分析物的探测则不那么有效。例如，荧光标定和荧光探测方法一般被认为是本领域中目前可得的，最灵敏的直接标定和探测的方法之一。然而，并没有实现用廉价，耐用和易于使用的显微系统对生物或其他样品中独个荧光分子或独个荧光分子的连结物的目测。荧光颗粒或尺寸约几百纳米含成千个荧光分子的小球在这种系统中可被探测，但这种颗粒的大尺寸和在许多应用中聚合的趋势限制了它们的应用。这个发明为单一分子的连结物，独个被分析物，及其在样品中的定位的探测和测量提供了新的方法。识别和定位被分析物的能力使它有很重要的地位，尤其在细胞的，分子的，进化的领域和神经生物学及新药，药用试剂的识别和发展中相关的使用等。
光颗粒的识别和量化及其多颗粒结构一般可通过(1)借助合适的采集光观察的直接目测或(2)用成像光电探测器和图象分析硬件及软件采集图象，使信息数字化，分析所采集到的光信息。对光电探测器唯一的要求是它能够基于各自的光学性质空间分辨视场中的目标物。对于直接目测，人类的眼睛就是有高度空间分辨能力的探测器的例子。成像光电探测器的例子包括电荷耦合装置(CCD)和电荷注入装置(CID)。依赖于所用光电探测器的能力，可得到不同分辨率的单色或彩色图象。
样品中光散射颗粒的探测，测量，和识别通过以下几点确定：(1)颗粒的特异光散射性质；(2)照明和探测的方法；(3)光电探测器，数字化和图象处理硬件及软件的能力；和(4)在探测到的光信号的基础上，用于识别和测量光散射颗粒的算法。
DLASLPD照明和探测法的一种或多种变形被优先使用，使通过合适的空间滤波，杂散的照明和反射光可最小。采集光和光电探测器一般放在与被探测样品催垂直的位置上。用一个成像光电探测器提供被探测光散射颗粒足够的空间和颜色分辨率，如果图象被采集。通过直接目测和/或用合适的数字化及图象处理硬件及软件可使颗粒在一种或多种变形中被识别，定位，分类和定量。例如，在某些应用中，有8-bit光学数字转化器的单色CCD片可能合适，而另一些应用中，可能要求有8-bit或更高光学数字转化器的3片彩色CCD光电探测器记录仪。基于计算机或其他微处理器的控制器被用于操作系统。用来分析所采集到的数字化数据的软件是以某种算法为基础的，这种算法基于光散射颗粒的一种或更多可测量性质，以一种或另一种形式识别及定量样品中颗粒的类型和总数。含光散射颗粒图象分析所要求的重要部件的装置图33。
现在描述的装置的变形是一个说明性的例子，熟悉本领域的一般人员都可认识到本发明中有多种其他的可能的结构。对于任何给定应用，根据该应用的本质，文中描述的基本系统可作成不同形式的商业的分类装置。在这个说明性的例子中，装置如研究领域中所要求的那样设计成有最大的操作灵活性。例如，研究人员使用的控制系统可作成能接受显微镜的载玻片或多数其他任何样品器件。许多系统参数如角度，波长，偏振，和照明光的光束直径，采集光的放大和聚焦，光电探测器的偏压，及样品相对探测器的移动都可通过控制器完成。一个光源和光导被用于把照明光对准样品。样品置于载物台或其他允许样品通过控制器有二维或三维移动的机械装置上。调节光照明的位置，使所要的采集光可使样品中的颗粒可最大程度地被探测和分辨。样品辐射的光用一个透镜或一系列采集透镜采集，并成像于成像光电探测器的表面。光电探测器可以是单色或彩色的。光电探测器是彩色时，如果希望所采集的图象有最好的颜色分辨率，可以使用3片照相记录仪装置。光电探测器与数字转化器和图象处理器相连接，而数字转化器和图象处理器又与计算机相连或是计算机的一部分。光散射颗粒的识别，分类，和定量的图象处理软件和算法被用于采集，储存，和分析光电探测器探测图象得到的光学信息。
颗粒种类及其数目利用图象处理手段的分析，测量，和鉴定依赖于通过一种或多种光散射性质识别颗粒的特殊的算法。总的来说，分析图象数据时，必须完成三种操作：(1)颗粒的识别；(2)一种或多种颗粒光散射性质的测量；及(3)颗粒的分类和量化。
光散射颗粒辐射可用于识别它们的特异光散射信号。例如，来自单颗粒和多颗粒结构的辐射光的强度和色谱可用成像光电探测器简单地探测和测量。另外，成像的颗粒也有可用于识别和进一步表征颗粒类型的尺寸和形状的性质。图象分析法对颗粒的识别和分类依赖于通过一种或多种可探测的颗粒性质来区分颗粒与背景及其他颗粒类型的本领。背景可能有不同尺寸，不同强度，和光电探测器记录的不同颜色的其他光散射特殊物体。对于用图象分析法对光散射颗粒的识别与空间定位，常用到某种形式的边缘探测。边缘探测法用来显示图象中探测到的光信号有不同强度的区域的边界。光电探测器由独立的像索组成，每个像索可检测来自给定位置样品的光辐射的总量。边缘探测法聚齐相连的有规定强度的像索，并在某种形式下把它们标定为已识别的物体，此时是光散射颗粒或多颗粒结构。根据所分析图象的本质，强度区分的判据可以改变。我们已确定光散射颗粒类型可用单色和彩色图象的边缘探测法的多种变形来识别和定位。本领域中所有已知的边缘探测，图象处理，和图象分析处理方法均通过参考文献纳入文中。完成边缘探测法的最后结果是图象的特殊区域被确定为光散射颗粒。
图象分析法中样品内光散射颗粒的准确度和可分辨性与所用的选择判据及光电探测器的分辨本领有关。例如，在单色光电探测器和8-bit数字转化器采集的图象中，有256级灰度可与位于光电探测器中每个像索探测的强度信号相连。用单片或多片彩色光电探测器，探测到的辐射光的红，绿，蓝波段(也就是RGB分量)可被测量。精通本领域的人可用更高分辨率的光电探测器和更高分辨本领的光学数字转换器来提高采集到的图象的分辨率。多数我们研究和在各种分析被分析物的探测应用中所优先使用的光散射颗粒表现为给定色谱中近球形的明亮的点光源。通过测量成像的光散射颗粒的一种或多种性质，眼睛和大脑可以轻易地探测和识别各种颗粒。这种人眼直接测量的准确度和精确性与随不同观测者的能力变化。为使这种分析在光探测的图象上通过图象处理方法完成，使用某种形式下完成边缘探测方法的软件算法来测定图象。对于光散射颗粒，照明源，光电探测器和样品光学背景条件的任意组合，存在鉴别类型的最佳选择，鉴别类型用于边缘探测过程及其最佳的最小和/或最大阈值的设定。例如，某些应用中，用单色光电探测器采集图象数据。已发现，鉴别时设定灰度最小阈值为50，最大灰度阈值为220，光散射颗粒可在样品中正确地识别和定量。阈值和鉴定类型随样品变化而变化。
操作的手动模式中，控制器可直接观测样品和采集的图象。控制者变化鉴别方法和限制阈值来确定那种条件相对他关于光散射颗粒的识别和定量的采集图象的目视整理分析能给出最准确的结果。对于分析图象所用的半自动或全自动的鉴别类型和限制阈值的优化，(1)对任何样品预先设置或(2)使用校准颗粒和/或其他材料反射背景条件，在样品的光探测过程前，之中和随后校准鉴别类型和阈值条件。根据鉴别类型和设置的阈值条件，物体(此时是光散射颗粒)随像索群的聚合被识别，在某种形式下被识别为光散射颗粒。任何可用于识别不同光散射颗粒类型和优化样品中颗粒识别的准确度的可测量的光散射颗粒的性质都可使用。
一旦光散射颗粒被识别，用不同方法可将颗粒进一步分辨，分类，和量化。我们已确定，基于多种可探测性质，光散射颗粒可被正确分类。这些性质包括(1)已识别的颗粒区域中所有像素的强度值之和(灰度，红，绿，蓝光及其组合)；(2)已识别的颗粒区域中像索强度的平均值(灰度，红，绿，蓝光及其组合)；(3)已识别的颗粒区域的尺度；(4)已识别的颗粒的形状；或(5)用两个或更多这些可探测可测量性质的组合。
样品中每种类型的光散射颗粒的定量是非常重要的结果，可以通过多种方法得到。例如，计数样品任何给定区域中已识别颗粒的数目。另一种变更的方法中，对于颗粒被识别为特定颗粒类型的情况，上面描述的任何可测量的光散射颗粒性质的和或和之比均可用来确定样品中每种颗粒类型的数目。
某些应用中，要求只探测和测量一种颗粒类型，而其他应用中，要求探测和测量两种或更多颗粒类型(包括多颗粒结构)。例如，以微阵列为基础的分析方法中，同样的颗粒类型可用于确定阵列的每个分离的连结区中连结的数目。其他应用，如以生物细胞为基础的分析中，两个或更多类型的光散射颗粒可用于识别和定量不同的细胞构成。本发明的其他应用中，多颗粒的存在和数目被探测和测量。而在其他应用中，颗粒尺寸和多颗粒结构和分布被确定。
作为说明性的例子，在细胞生物学的应用中，细胞为高度散射物体，并含可表现为不同形状，尺寸，和颜色的颗粒的细胞内成分。精通本领域的人使用有一种或多种可分辨于细胞的可探测和可测量的性质的光散射颗粒类型。例如，可以利用辐射光颜色不同于细胞辐射的散射光颜色的颗粒，并使用彩色光电探测器和恰当的鉴别方法及限制阈值来具体地探测，测量和定量光散射颗粒。
总的来说，对于光散射颗粒通过图象分析方法被探测，测量，和定量的本发明中的每一个应用，颗粒探测和测量算法均已优化。光散射颗粒的可探测性质的那一项可最适于分辨样品中的颗粒。本发明应用于分析诊断化验－装置类型和测试试剂盒(Test kits)
众所周知本领域中分析物类型范围广。这些分析物存在于不同样品环境中，如水、尿、血液、唾液、组织、土壤、空气等。根据分析化验特殊类型的需要，人们可以获取到所感兴趣的分析物的半定量或定量的信息，或两者的信息。在一些情况下，用小型的、价格低廉的、便携的仪器进行分析是理想的。例如，消费者使用、野外(远离实验室)使用、或医院临床护理。人们希望能快速对有疑问分析物进行半定量和/或定量测量。在其它应用中，对于小型实验室里，一天只检测少许几个样品，最理想的是用小型、便宜的分析物检测仪器，就能得到定量结果。例如，医生的办公室、小诊所、辅助测试实验室、研究实验室等。也有一些情况，人们想要每天测试几百个到几千个样品，诸如大批量的测试。基于上述每一种测试情况和环境从而需要不同类型的仪器设备。一旦一个样品中的分析物检测的准确需要完全确定下来后，才能仔细考虑这台仪器是否易于使用和仪器的价格方面优缺点。
我们已经认定随着DLASLPD探测方法的某些变化，某些金属样颗粒的使用应考虑那些用于上述测试环境和应用的特异性试剂盒和仪器的发展。对于分析物、测试环境、样品类型、检测方式、分析物检测需要和仪器价格、尺寸大小的需要有多种不同的结合。本领域的一般技术人员将会认识到本发明的巨大作用，其中本发明在一种方式或另一种方式的应用使仪器易于使用、价格便宜以及试剂盒能满足大多数分析物或诊断测试的需要。
DLASLPD方法，颗粒类型和样品类型有多种不同的配置与组合，组合在一起使用能获得特异性分析物的检测能力。在任何特异性诊断化验应用中，样品类型、照明方法、检测方法通常是固定的，例如象化验方式、样品室类型和检测仪器。金属样颗粒有独特的光散射特性，它随着颗粒的大小、形状、组合物和均匀性变化，而发生变化。那些可从颗粒中被检测和/或被测量颗粒的光散射特异性，是根据上文所述的颗粒特异性以及探测和测量颗粒散射光特粒异性的仪器设备和方法来进行的。因此，本发明在某一方式中的最终实际应用就是将各种照明、探测器具、样品类型与光散射颗粒的合适类型结合起来而获得的。其结果产生特异性仪器设备和试剂盒。
在许多不同组合中，通过运用各种颗粒类型、检测方式和仪器设备，本领域的技术人员能实现本发明许多不同方式以获得许多不同的结果诊断分析探测能力。图22画出了本发明各种不同方面的方框图，当特异性结合形成后，本发明提供了仪器设备和试剂盒，以适合特异性诊断分析测试的需要。通过选择方法学/设备类型组合(图23)和颗粒类型组合(图24)的适当组件的选择，构成了最终的仪器和试剂盒。图23表明，本领域的技术人员可选择照明光源，方法和其它仪器配件，检测化验类型和样品类型，以及探测方法和仪器配件。图24表明，本领域的技术人员可选择合适的颗粒组合物、形状，大小和均匀性，来探测颗粒的理想的光散射特性。图23和24概括的流程以及图22总结的流程导致生产出了特异性仪器和试剂盒。方框图25示出了普通检测方法中的一种，为满足特殊诊断的测试需要，我们运用这种方法开发出了特异性仪器和试剂盒。本领域的技术人员无需运用图25中的方法，就能在某一方面运用本发明。
正如本文所述的，将金属样颗粒与照明和探测DLASLPD方法结合起来，其显著信号的产生和探测能力可拓宽分析物探测灵敏度范围。借助于测试环境的一般类型和上述图22-25的简述，本领域的技术人员很容易研制出仪器和试剂盒，其中在一些诊断测试应用中，人们只需用肉眼就可探测和/或测试，而在其它情况下，用的是简单的光源，诸如LED(发光二极管)或低功率钨丝灯泡，也可用光电二极管或光电二极管阵列来探测和/或测量信号。在其它分析测试应用中，用激光器、激光二极管、钨丝灯泡等作光源，配带有照相机、摄像机或其它CCD器件(电荷耦合器件)成像，利用简单的图像处理装置，使在微阵列模式或其它任何模式中的颗粒散射出的光能被观察和测量到。这些实施例并不意味着限制而是大致展示了本发明对于探测样品中一种或多种感兴趣的分析物的通用性和广泛的应用性。
例如，一台小型手持便携式仪器，用低功率灯泡，LED或激光二极管作光源，它能检测样品中一种或多种分析物。用光电二极管或光电二极管阵列作探测器。依据所需探测灵敏度，用一定类型的金属样颗粒，配合该仪器就能满足分析物探测的需要，试剂盒是为液相或固相样品中的多分析物或者单一分析物而设计的。例如对于液相样品，利用其不同颗粒类型都有不同的易可探测的散射光特性。在固相样品和形式如微阵列中，一种颗粒类型可用于所有不同分析物，或者可以应用颗粒类型的各种结合体(依赖于样品中不同分析物的浓度)。
在另一实施例中，按如下方式设计一台便宜的仪器和试剂盒，能测很低的分析物的浓度。用低功率或高功率光源、配备光电倍增管、光电二极管阵列或摄像机，用一只透镜收集从含有颗粒表面散射出的散射光。用微处理器或外部台式计算机收集并分析散射光数据。多分析物固相分析的试剂盒是由适当的颗粒类型制得的，它包括有合适的微阵列样品室，能得到所需的浓度范围和探测限。这种类型的仪器和试剂盒可用于科研实验室、医生办公室、卫星站所、环境测试实验室和大批量测试实验室。
上述仪器和试剂盒的实施例是作为说明性的例证，不应理解为本发明仅有的应用。本领域的技术人员将会认识到本发明广阔的用途。通过应用本发明中一个或多个方面来满足特异性分析物测量的需要，本领域的技术人员将会认识到所制造出的仪器和试剂盒的使用测量范围宽。
在分析物检测中，磁性或电泳的活性光散射粒子的用途。
一个在分析化验和分析物检测的领域中的现有问题是作用动力学问题。在本发明的一定配置中，具有磁性或电泳特性的光散射粒子可用于增加粒子结合剂，结合到目标分析物的反应速率。有磁性被解释为通过磁场的应用，光散射粒子可被移动和浓缩在一个样本容器区域里，电泳可解释为通过电场的应用，光散射粒子可被移动和浓缩在一个样本容器区域里。
在本发明的具体实现中，有磁性特性的光散射粒子用于制造一个光散射粒子结合因子试剂，它可与目标分析物结合。磁性粒子反应物被应用于样本，磁场应用于样本时，只要引导磁性粒子反应物到样本容器中的一处或多处。样本容器中的一个或多个区域，包含了另外联合的结合因子，它可结合分析物并更允许粒子结合剂来结合，而通过固态结合剂来固定分析物。例如，一个或多个固态区域通过磁性区域的定向可被隶属于磁性粒子结合剂的高密度，以至磁性粒子结合剂被高度定位在样品设备或容器的结合位区域。在过了充足的反应时间后，磁性区域可被改变而消除任意未结合磁性粒子试剂。分析物数量通过从磁性粒子检测到的光散射数量来决定的，磁性粒子在固体中与结合位连接。在一个相同的形式中，一个电泳光散射离子结合因子剂，和一个适当的电子区的应用，可被用于浓缩电泳粒子结合因子剂到一个重要的区域。分析物的现有数量决定于，从结合位取消任何未结合电泳粒子结合因子，并且从结合电泳粒子结合因子剂到位区，检测散射光。在另一个变化中，光散射信号可在结合位被测量，或从结合位释放，并且在不同区域或检测中有用的个别的容量，固态或液态系列中测量。一个本领域的普通技术人员，认识到本发明的这一方法在完成一个检测所需的时间方面，提供了一个实质的改进
涉及分析物与特异性分析物识别试剂相互作用的两个或多个颗粒结合或聚集的分析
在本领域中，已知通过运用合适的结合剂以及合适结合剂和分析物的浓度、结合、聚集、交联、结成网络(networking)以及类似的结合方式就会出现，运用这些结合方式可以探测样品中一种或多种分析物。在一些免疫化验中，如抗原是可溶和多价态，能看见形成沉淀。在一些核酸检测中，一种特异单链探针能“交联”两个或多个单链靶和使网络扩展。换句话说，两个或多个不同单价态单链核酸探针能用于结合相同靶单链核酸上的不同位点。此研究中，可实现两个或多个靶交叉结合，或可以利用正好有两个单价态的探针，用结合于同一靶上的序列来进行探测。
本发明比以前可能有的发明更易于使用、更灵敏、有更多的分析物探测功能。在特异性检测方式中，本发明中的亚显微颗粒可形成不同类型的聚集物，无需从分析物结合颗粒中分离成游离态，就可直接用显微镜或通过肉眼观察或通过仪器测量观测到这些亚显微颗粒形成的聚集物。该类型的聚集物形成依赖于交联剂及其化合价态，依赖于附着到颗粒上的结合剂类型。聚集物包括两个颗粒到多个颗粒。
用于均匀、液相、聚集检测中的颗粒可被直接或间接作上标记。在直接标记检测中，能直接结合分析物的试剂被附着到信号发生颗粒上。例如，在一项直接标记的核酸分析物检测中，DNA探针被粘附到光散射颗粒上。在一项间接检测中，分析物探测剂用化学基团A来标记，因而颗粒用能识别组合物A的试剂作了标记或被包被起来。用直接或间接标记，一项检测就被格式化了，以致于分析物的已知结合剂与分析物相互作用(在间接标记的情况中与基团A相互作用)导致形成颗粒聚集。聚集物包含有两个或多个颗粒。
我们已经发现，如果一项测试中的聚集剂或交联剂尺寸小，以致于聚集物中的颗粒间靠得极近，那么在显微镜下含有两个或至多几个颗粒的聚集物表现为一个单颗粒(亚显微聚集物)。但是，由于颗粒--颗粒的微扰，与非聚集颗粒相比这种亚显微聚集颗粒表现出不同的光散射特性。我们已经观察到散射光颜色、强度RIFSLIW、偏振的变化依赖于颗粒的基团、大小和形状。这些变化能用于测量分析物的量，而无需从结合颗粒分析物中分离成游离态。在显微镜下，这些变化能用于区分亚显微聚集和非聚集颗粒，即使两者在显微镜下可能表现为单颗粒，如聚集或交联剂的尺寸很大，如长DNA链，聚集物中颗粒间的距离大于显微镜的分辨率，那么就能分别观察到聚合物中的颗粒，并通过聚集颗粒和非聚集颗粒靠在一起或一起移动，还能将他们从非聚集颗粒中识别出来。当聚集物中的颗粒少到只有两个时已能在显微镜下观察到这些显微聚集物。如果两颗粒间的距离足够大，以致于颗粒--颗粒间的扰动小，那么聚集物中的颗粒保持原来的光散射特性。以上讨论的两种普通的情况中颗粒--颗粒间也有分立距离，在一些特殊情况中，我们已观察到亚显微聚集物中的颗粒大概不会对其光散射特性产生扰动，因为这些颗粒没有靠得足够近，颗粒--颗粒间未出现微扰。尽管如此，仍可将聚集物从非聚集颗粒中区分出来，因为聚集物的强度是非聚集颗粒的n倍，这里n是一个聚集物中的颗粒数和/或相对于另外颗粒位置固定的颗粒数。
由以上讨论可见，如现有分析物产生的聚集物有与游离非聚集颗粒相比具有不同的光散射特性，则在宏观测量和用眼睛观察基础上，能进行液相、均匀检测。如果聚集物中颗粒--颗粒间的扰动小以致于聚集和游离颗粒的光散射特性类似，仍有可能利用眼睛观察或仪器测量分立颗粒和聚集物的光散射强度的方法来进行均匀检测。在能看见聚集物中分立颗粒的情况下，如上文所述通过肉眼观察或电子计算机化图像分析，容易将聚集物从游离颗粒中区分出来并定量化。由于聚集物比独立颗粒光强大，也能用流式细胞计或类似的仪器设备将聚集物从游离颗粒中区分出来并定量化。在用显微镜不能看到聚集物中各个独立颗粒，以及不存在颗粒--颗粒间扰动的情况下，已通过游离颗粒和聚集物散射光强度的差异，以及由确定的聚集物中颗粒数的差异(假定强度是外加的)，区分游离颗粒和聚集物。这可通过图像分析或流式细胞计数来完成，并包括通过激光扫描或其它用空间分析一个区域或一定体积的样品的方法进行成像处理。
随着亚显微聚集物中颗粒数目的增加，聚集物可被看成是一个扩大的颗粒或大颗粒，尽管通过显微镜还不能看到聚集物中分立的亚显微颗粒。在显微聚集物的状态中，聚集物中颗粒数目的增加产生了可见的网格，并且在网格中可数出颗粒数。大网格和颗粒聚集物产生可用肉眼就能观察到的宏观实体，并且形成沉淀物或凝集物。
本领域的一般技术人员将认识到前文所述的不同的聚集现象能被用来开发许多不同类型的均匀检测方式，其中有些检测方式用到显微镜或其它图像分析技术以及其它有关宏观观察或测量的技术。
以下选取几例说明如何操作均匀型检测方式或其它类型的检测。
应用光散射颗粒的检测方式之例
下面给出了几个有说明性的实施例，说明了本发明在不同检测方式中广泛的通用性和显著的效用。本领域的普通技术人员将会认识到此发明的许多方面，对于一种样品中一种或多种分析物的测量，比以往可行的方法能更有特异性，更易操作，且有更高灵敏性。
ⅰ．以结合为基础通过分子辨认涉及两个或多个颗粒相关的检测方式。
一般性原理
在一组实验中，用基底材料分子附着方法，将40nm直径金颗粒制品的表面生物素化。经离心和漂洗纯化后，我们滴一滴这样的物质到载玻片上用一个盖玻片盖上，然后，借助于光学显微镜用光照明和探测DLASLPD方法对其观察。此物质为均匀性，在布朗(Brownian)运动中运动很快呈绿色。然后我们去掉盖玻片，在载玻片上滴一滴链霉抗生物素蛋白溶液，再用盖玻片盖上，一段时间后，溶液中出现新的桔黄色，橙色和浅橙色颗粒结构，这些颗粒比绿色颗粒的光强要强得多，布朗运动的速度要慢得多。有些在溶液中旋转时，出现闪烁，表明这些颗粒结构为非对称性。一段时间后，许多绿色颗粒消失，而出现许多桔黄色和橙色颗粒聚集物。在显微镜下，当看到盖玻片的边缘时，上面包被有一层色彩非常鲜艳的橙色、桔黄色和浅橙色的颗粒聚集物。我们已经在均匀聚合物核酸系统中，观察到了类似的现象。这些观察表明在本发明的各个方法中，颗粒散射光特性的变化能被用于探测分子结合情况，此探测是通过减小“游离”单颗粒的数目，目测聚集物，或者通过运用其它方法应用于大量溶液中。例如，对于在大量溶液中或流体系统中探测，在适当条件下通过光照一部分溶液，发现从溶液发出的散射光有变化，即可检测出具有独特散射光特性的新颗粒结构的数目增加和/或原始特性的颗粒数目减小。另外，通过以流动为基础的系统，样品中的物质能被更特异性地分析出来。例如，使用微通道、毛细管或流式细胞术仪器或设备装置，对部分或全部样品溶液，可分析颗粒基底上的一个颗粒。溶液流经照明光源和探测器或者另一方法是溶液吸附到一个微通道或毛细管，然后沿样品长度方向移动样品室，光源或探测器(或其中的一些组合)，分析所有或部分微通道或毛细管。
例如，某一核酸分析物是由约100个核酸碱基组成，并出现在样品中。制备此样品使得该核酸为单链形式。两个或多个独立单链“探针”核酸序列被添加到样品中，样品中这些不同的探针核酸结合到靶链的不同区域上。通过间接或直接标记方法，每一个此探针核酸也已被吸附到一个或多个颗粒上。接着温育样品，将样品放入流式细胞仪或类似流体仪器设备中，对其中含有样品的溶液进行分析。如靶序列存在，就会出现结合在一起离得很近的两个或多个颗粒。依赖于颗粒间的分立距离，颗粒--颗粒间的扰动或许存在或许不存在。当探针链与靶链杂交后，用前述的适当方法，可探测含有两个或多个颗粒的分子结构。
ⅱ．涉及分子本体释放的测量
本发明中有几种检测方式的应用，根据分子、化学或其它方面的结果，可用于探测分析物的存在。例如，分子内或分子间的成键，交连或其它分子结构的改变，使得整个分子几何结构发生变化，或者，此过程使得分子碎片(pieces)解体。例如，肽、蛋白、核酸或药物剂通过应用本领域中已知的各种方法吸附到样品容器的表面上。在这些物质中有些有一个或多个分子内的交联或成键位置，可通过化学、生物或其它处理方法，裂解或者改换这些位置。例如，通过监视由一种特异性酶或核酸酶的活动释放出的裂解产物的量，探测这种特异性酶或核酶的存在。一种光散射颗粒直接或间接粘附到分子衬底区域上，这样裂解过程受到的影响最小。溶液中游离颗粒的存在和数量，或者吸附在样品容器上或其它颗粒上的结合颗粒的减少量，这些都与酶存在、数量以及活性有关系。另一例中，用一种抗原物质包被光散射颗粒上并与抗体混合，这样所有的颗粒通过抗体--抗原以一种多价态形式键合，而结合在一起。这种网状或凝集物放入一个样品容器中或按需要吸附到一个样品容器内。一个样品放入盛有分析物的容器内(分析物或许是相同的抗体或抗原或许是一种有些类似结构的对抗性抗体或抗原)。依赖于样品中抗原或抗体特异性分析物的存在和数量，抗体的某些部分和包被有抗原的颗粒通过竞争从网状结构中分离出来。通过测量溶液中的颗粒数量和／或残留在凝集网络上的颗粒数量，可探测分析物的量。这种测量方法也可通过在颗粒上包被抗体，或用其它结合剂，例如：核酸、肽、受体、药剂、激素等的改变，而得以应用。
ⅲ．分子结合情况的探测和特征描述
在另一个有说明性的实施例中，包被有结合剂颗粒的布朗运动，可用于图像分析方式中，探测一种分析物的存在和数量。这种方法也能用来研究在一个结合对中分子结合情况和特性，这里结合对中的一方被吸附到颗粒上，另一方悬浮在溶液中。这种能力在表现抗体、抗原、药剂、受体和任何物质的结合特性方面是极其重要的，此处分子的结合特性是重要的。例如，一种40nm金颗粒的制备方法是使其表面含有或者抗原、药剂或者抗体。然后，在显微镜载玻片上放上这些结合颗粒物，用DLASLPD照明和探测方法在显微镜下观察，他们的布朗运动特性被确定和量化。然后，加进含有一种分析物的样品溶液，该分析物可与吸附在颗粒上的结合剂结合。假如添加的溶液含有结合剂中的配偶体(partner)，它就会结合颗粒上的结合剂，观察到布朗运动中的变化。另一方面，为了表现应用性，滴定入浓度已知、具有分子特性的物质，来确定此物质的结合特性。在这种测量中，能研究大多数任何分子已知结合对的分子结合情况。
ⅳ．分析物的放大探测
在某些分析检测和诊断检测中，优选的检测方法可增加颗粒散射光特性的探测能力，使得所需探测仪器非常简化或无需探测仪器。通过使用适当的分子识别结合对和颗粒，有可能明显增加探测灵敏度水平。可用单链同聚合物或重复序列(ATATAT等)、抗生物素蛋白-生物素、链霉抗生物素蛋白-生物素以及其它结合对系统来“链接”和“组建”许多颗粒。例如，设计一个固相检测方案，其结构为一个三明治结构，抗体--抗原--抗体。其中一个抗体被吸附到一种固相体上，使得可捕获到抗原分析物。然后再加上另一个含有生物素团的抗体。接着将包被有链霉抗生物素蛋白和游离生物素加入溶液中。从(固相抗体)--抗原--(抗体生物素中)联合体中，生长一种···(链霉抗生物素蛋白颗粒)--生物素--(链霉抗生物素蛋白颗粒)--···结构，其中包含有许多结合在一起的颗粒。这样的一种颗粒聚集物或网状结构产生一个高散射光强度水平，比单颗粒更易探测。另一个实施例用的是多聚脱氧腺苷酸(poly dA)和多聚脱氧胸苷酸(poly dT)或其它同聚物单链核酸，此处poly dA同聚物序列被混合到单链“探针”分子的区域内。用与此同聚物互补的dT序列包被颗粒，将此颗粒添加到含有另一种“游离”dA单链物中，生成多颗粒结构。
在另一个实例中，一个或多个抗生物素蛋白链菌素分子吸附在一个特别给定的分析物抗体上。抗体与分析物结合，该分析物用附加生物基团标注的光散射粒子来检测。很多光散射粒子依靠抗生物素蛋白链菌素分子吸附在抗体上的数量，以及吸附在分析物-抗体-抗生物素蛋白链菌素的复合物上的生物素光散射粒子的数量，而被吸附到分析物上。
列举上述实施例是为了说明作用。本领域普通技术人员会认识到本发明工作的许多方面都依赖于分析物和诊断条件以及需求。
改进后的颗粒结合剂
本领域中，众所周知，用吸附方法将诸如抗体那样的蛋白结合剂吸附到金属样颗粒和非金属样颗粒以及其它表面上(参见M.Horisberger。扫描电子显微术(Scanning Electron Microscopy)(1981)，2，p.9-31)。用这种吸附方法例如通过抗体分子，将具有结合特性的物质附着到颗粒上。就抗体而论，将抗体分子附着到颗粒上也使颗粒具有部分化学稳定性。如果仔细控制吸附条件，一些抗体分子仍会对其相应的抗原具有结合活性。在本领域中，应用确定的合成聚合物和生物聚合物作为金属颗粒的化学稳定剂也是众所周知(参见Heller et al.(1960)，聚合物科学杂志(Journal ofPolymer Science)，47，p.203-217)。因此，此处所列的参考文献包括了这种方法，将物质附着到颗粒和其它表面上。
物质吸附到颗粒或其它表面上的准确的机理和特性不是很清楚。当抗体分子被吸附到颗粒或其它表面上时，被吸附抗体的密度和取向看起来与结合活性的水平有关。由于难以控制吸附过程，很可能许多结合抗体分子以这样一种方法被吸附，这样改变了分子结构的分子识别区域，以致于结合活性可能明显减小或者完全不具有活性。
此吸附法可使得蛋白结合剂和其它物质附着到颗粒上。所述蛋白结合剂和其它物质在对颗粒的分析物测试中可能有用也可能没有用。与此同时，附着某些类型的物质是困难的，此类物质在分析测试及其它领域可能是有意义的。例如，核酸、小蛋白质和类蛋白物质如肽，以及其它非蛋白物质如小分子量抗原物质、激素、药剂等，不能通过此吸附过程有效地附着到颗粒上。吸附技术更进一步的限制就是对于每一种类型的物质存在唯一的、必须仔细控制的吸附条件。甚至当严格按照这样的操作程序进行操作时，蛋白的量和吸附到表面上的物质的总量和结合特性也都会发生明显的变化。在许多情况下，与非吸附形式相比，被吸附结合剂的结合活性(亲和性和特异性)会明显减小。
我们用这种吸附方法，对附着在颗粒表面上的各种蛋白结合剂如抗体进行了实验。我们的实验表明结合剂的特性以及最终颗粒结合剂物质的稳定性有很大的可变性。被吸附抗体或其它结合剂的结合亲合势对标记条件有高的灵敏度，不同批次测量样品也有明显的变化。被吸附在颗粒上的抗体、亲合素、链霉抗生物素蛋白以及其它结合剂的结合活性都普遍地明显减小。在一些样品制备中，表明被吸附结合物的一些碎片很可能是从颗粒中解离出来的。在分析或诊断测试中，当此解离物与分析物颗粒结合剂相竞争时，就提出了严重的问题。
如此难以控制附着过程，结合活性的不稳定性和通过吸附方法对附着在颗粒上的这类物质的限制的不稳定性提出了许多分析检测所用此物质的制取和使用方面的问题。或许最重要的是用吸附技术制备的颗粒结合剂的成对之物对许多分析应用可能没有足够好的品质，在许多分析应用中，可探测很低浓度或超低浓度的分析物。
在本领域中，有一种方法很有用，把包含有大小和组分变化的结合剂的任何类型的物质可特异性地附着在颗粒或表面上，在颗粒或表面上被结合物的结合活性所受影响被减至最小。在本领域中，获取到每一颗粒(或任何普通表面)所需结合剂密度，也大有用处。另外，对于这些方法理想的情况就是允许多种类型结合剂的结合。从制造和价格方面考虑，如果此合成工艺容易操作、费用低廉，以致于用相同的基本程序能广泛地将各种不同类型的物质附着在颗粒上，那是大有用处的。
我们已经开发出了新的方法，可将结合剂和大多数其它物质特异性地附着在金属样颗粒和其它表面。按此新方法制取的颗粒剂稳定性高，具有非特异性结合性小，同时结合亲合力强。这些新方法克服了以前本领域中吸附过程中的许多限制，另外的好处就是吸附过程易于操作，费用低廉。在一些实施方案中，这些新工艺设计了一个万能联结器(universal linker)化学平台(chemistry platform)，在此平台上用许多相同的材料和工艺，几乎任何类型的物质都能被快速、简单地被附着在颗粒或表面上。这对于每天都制取这样的颗粒结合剂组成物，用于分析物的测试，是极其重要的。
以下一些工艺技术适用于任何物质，包括结合剂或其它物质，例如：抗原、抗体、外源凝集素、碳水化合物、生物素、亲合素、链霉抗生物素蛋白、核酸、肽和蛋白质、受体、药剂等。此方法能用于将大多数物质附着在金属、类金属、以及一些非金属样颗粒和宏观物质表面上。例如，非类金属表面和颗粒可以包括由有机材料或无机材料组成的材料，如玻璃、塑料等。
将物质附着在颗粒和其它表面上的方法
ⅰ．基本材料分子方法
在将物质附着在颗粒或其它表面上的这种方法中，用了两步法，此方法涉及基本材料分子的运用。合适的基本材料分子是能通过吸附或其它化学处理接近于表面和与表面相互作用的任何物质，以及具有易与附属物接近的官能团，能附着其它物质如结合剂。基本材料分子还具有另外的性质，使颗粒具有化学稳定性。一般地，基本材料分子为大分子形式(分子量＞1000MW)，但可以比这更小或更大。优选的基本材料分子是那些以高亲合力附着到颗粒上的分子，可使颗粒具有一定的物理稳定性水平，还具有易接近的化学官能团，这些官能团易于与大多数其它任何物质结合。化学官能团通过化学结合、共价键结合或非共价键结合使结合剂或其它物质连接在一起。例如，共价结合可能涉及到光化学或化学结合。非共价结合可能会涉及到与诸如象链霉抗生物素蛋白分子的交连，或者通过疏水、氢键键合或静电相互作用的吸附。这些基本材料分子也可包含有一个或多个化学官能团，通过运用适当的化学物质或交连剂，用这些化学官能团可跨越颗粒表面将几个基本单元的分子交连在一起。
下面选出了几个实施例，说明了如何用基本材料分子吸附方法合成颗粒结合剂组成物。这一物质具有高稳定性，对于与之结合的实体有高结合亲合力。这一物质提供了一种高灵活性，易于使用以及费用低廉的方法，可将大多数任何物质附着在颗粒或其它表面上。本领域的普通技术人员会认识到在多数实际场合中有许多通用技术可用于合成颗粒结合剂组成物。用这种新的方法，以一种易控制和可预见性方式，将抗体、肽、蛋白质、核酸、药剂和大多数任何其它物质附着在颗粒上。
例如，我们已经用的是一种分子量大小约为MW 20，000的聚乙二醇化合物的衍生物。这种分子(双(聚氧乙烯双[3-氨基-2-羟基丙基]))的特性可以用作基本材料分子。这种聚合物的每一个分子有四个胺基团，胺基团用作连结位置结合其它物质。聚乙烯衍生物的疏水主链与颗粒相互作用并通过吸附或一些其它过程，被附着到颗粒表面。这种相互作用是很强的，在下面的分析诊断检测标记和应用中，我们并未探测到有任何这类物质从颗粒表面解离出来。胺基团并没有表现出与颗粒表面相互作用，而是易获得吸附其它物质的结合位置，如结合剂。用这一聚合物作为基本分子，我们已制备出了两种不同类型颗粒结合剂的组成物质。一种试剂包含有作为结合剂的生物素，而另一种颗粒结合剂的组成物质是用包含有作为结合剂的单链核酸制成的。被用于吸附的生物素为一种化学修饰形式，它以共价键与胺基连结。对于核酸，5′末端被化学修饰，以致于他们与胺基团发生化学反应。在各种检测方式中，我们对这些试剂的检测，已发现这两种颗粒结合剂都表明了低浓度和高浓度盐水溶液中有高度的化学稳定性，同时伴随有异常的结合活性。在应用颗粒生物素试剂的实验中，未探测到对结合亲合力的影响。这可以通过配置颗粒生物素试剂悬浮液，浓度为6×10-14M并在此溶液中浸没一块包被有亲合素的塑料固体来确定。经一两个小时温浴后，取出固体冲洗。用DLASLPD照明和检测方法，在光学显微镜下检测时，可探测到颗粒被特异性地结合到固体上包被的亲合素，同时对照固体(不含有亲合素)上未见有颗粒结合。在颗粒生物素试剂的这些工作浓度下，如果附着在颗粒上的生物素结合特性大幅度下降，就不可能观察到结合现象。
在另一个实施例中，明胶用作基本材料，通过用铬酸盐离子或其它交连剂，在颗粒表面上，明胶能被交连以最大限度地减少吸附作用。然后，为了将结合剂或其它物质吸附在易获得的的氨基团，羧基或其它可实现吸附的化学基团上，通过合适的结合化学过程，将这些结合剂或其它物质连接到颗粒上。
再有一个实施例，用链霉抗生物素蛋白或亲合素作为一种基本材料。用含有至少一种生物素基团分子的一种化学修饰方式，将如结合剂等这样的物质附着在颗粒上。
再一个实施例中，适当条件下，聚合物类和具有聚合物类特点的其它材料，如，碳水化合物、聚氨基酸、蛋白质等，也可从溶液中的共聚物单元正好聚合到颗粒表面。
对于上述所有实验，也可首先将结合剂或其它物质与基本材料结合，然后将这种材料附着在颗粒表面上，颗粒表面带有或没有化学交连在一起的基本材料。另外，两种或更多种不同类型的基本材料分子或者一个或多个基本材料分子与其它化学稳定剂分子一起使用，使得供结合的化学反应基团的数量和颗粒结合剂结合物的化学稳定性得到调整，可满足多数任何分析的需要。
上述实施例中，使用选取了有效的材料用作基本材料分子，本领域的技术人员可以合成新类型的基本材料分子，进一步优化他们的应用，将物质附着在颗粒和其它表面上。有关吸附结合物或其它物质的结合亲合势方面，下列改进方法可使颗粒结合剂试剂有更高的化学稳定性，优化了结合过程从而增强了操作性。例如，辅助化学基团被添加到聚合物的主链结构上，增加了基本材料分子与颗粒表面结合的稳定性。各种不同长度连接键臂，其端部或靠近端部处有合适的反应化学基团。这些连接键臂的引入增加了颗粒与最终残留物的距离，在颗粒上附着有结合剂或其它物质。在基本材料中加入不同类型的反应化学基团可进一步改善交连的能力，另一方面或者使各单个的基本材料分子跨越颗粒表面结合在一起。
ⅱ．通过能吸附于金属表面的化学基团将物质直接附着于颗粒或其它表面
我们已经开发了辅助方法，许多不同种类的物质，包括结合剂，可直接附着于金属和金属样颗粒及表面。在材料科学领域和相关领域中，已知某些种类的小分子(＜1000分子量)能吸附于金属表面等。对于大多数这些小分子，在分子中的特定位置上存在某些种类的化学基团，这些基团可以使小分子的一部分结合于金属表面而其它部分则不结合于该表面。例如，附着含有硫醇类及二硫化物的物质、和亲水性物质如n-酮酸及某些洗涤剂分子可吸附于金属表面，在材料科学领域中是已知的(见Nuzzo et al.(1983)，Journal of theAmerican Chemical Society，105，p.4481-4483；Allara et a1.(1984)，Langmuir，l，p.45-52；and Bain et al.(1989)，Journal of the American Chemical Society，111，p.321-335)。附着物质于金属表面的方法特在此被引入参考文献。因此，允许上述物质附着的性质能被赋予结合剂和其他物质，方法是在那些准备用于附着的物质的分子结构中特定位置上引入恰当的化学基团。某些种类的物质用此方法将比其它方法更容易附着。例如，物质若其分子结构是带电的或者是离子性的亦或是极化的致使分子结构一端疏水而另一端亲水，则该物质在此方法的这种特殊变更中是普遍有用的。
例如，核酸包含着一个带有强负电荷的磷酸盐构架。一个单链核酸在3′或5′端上标记上硫醇类或二硫化物，带有或没有附加的疏水基团与分子中相同区域结合。此被修饰了的核酸将在以这些基团做标记的端点上与金属表面或颗粒结合。核酸的离子性部分使核酸分子结构的主链远离表面，这使得分子容易与大多数任一能与之特异性结合的物质相互作用。
其它物质诸如生物素、肽、药物结合剂、聚合物等能用此方法附着于颗粒上。此方法对于大多数在其天然状态下不与颗粒或表面显著反应的物质普遍适用。对于那些会与颗粒或表面反应的物质则需要用另外的方法。例如，某些小分子、蛋白质等会与颗粒或表面反应致使它们的结合活性降低。此方法的一个替代方法就是颗粒首先标记上比如一种聚合物稳定剂。标记后，在表面或颗粒上通常会露出一些区域能与小分子本体(molecule entities)结合。那些经过恰当修饰的物质便可加到用化学方法稳定过的颗粒中以得到一种所需的结合活性或其它性质。换句话说，在与颗粒或表面混合之前，让化学稳定剂和经化学修饰的结合剂以所需比例混合在一起。利用这些方法，大量、多种附着于颗粒或表面的物质能受到控制而产生一个具有所需的化学稳定性和结合活性包被表面或颗粒。
各种长度和组成的连接臂也能够合并到分子结构中。例如，可以应用一种分子量小的基本材料分子，其分子结构最适宜于附着在颗粒或表面，且最适宜于以高强的结合活性和所需取向吸附大多数任何物质。作为一个实施例，一种长度为20个氨基酸的线性多肽，在一个末端通过引入二硫化物或硫醇类化学基团作化学修饰。天然的多肽包含氨基酸成分，使得多肽链不会与表面发生作用。除非通过经化学修饰的那个末端起作用。在另一个末端存在一个游离的氨基，或是另一种情况，即此端经化学修饰形成所需的偶联突起(conjugationprocess)，使得几乎任何物质能被吸附于此位置。这种低分子量的基本材料分子于是可用于本文所描述的一种或多种本方法的变化中。
本文所描述的基本材料分子偶联方法和直接附着方法允许更特定地对大量、多种及各种取向的能附着于颗粒或其它表面的物质进行操纵。一种更进一步的利用是：这些方法为合成颗粒结合剂提供了试剂，此处附着结合剂的结合力可保持高水平。
此利用小分子量或大分子量的基本材料分子方法的一个重要特色是：通过正确选择和使用，基本材料分子能用作为一种普遍的接头平台(linker platform)，在此处几乎任何物质能附着于颗粒或表面。这种性能在基于颗粒、用于检测分析物的试剂的日常制造业中变得极端重要。这许多不同种类的新附着方法能通过改变化学基团、分子量、分子结构、标记反应条件及所使用的偶联化学类型(即交联、共价附着等等)而实现，这些方法将为本领域的普通技术人员所认识到。
利用光散射颗粒作微阵列(Microarray)或微图案(Micropattern)分析
这种微阵列微图案分析方法利用分立的空间上可达到的固相区域来探测不同种类的分析物。例如，各个空间可达到的区域或微点(microspot)可能包含不同种类的抗体、受体、核酸等。固相上空间可达到区域的分布受控于固相的尺寸、分析物的数量或将被利用的不同区域，和探测方法。各个包含一种特殊结合剂的空间可达到的微点其形状可能是方块、圆或任何依赖于制作微阵列方法的形状。其面积可能是几个平方微米到几个平方毫米或甚至更大。这种微阵列方法可以利用多固相形式中的一种而实现，这些多固相形式用于单种分析物的探测且在其中最终定量分析通过测量与结合于固相的分析物数量有关的固相信号而实现。实际中，此微阵列方法的主要分析步骤如下。此微阵列暴露于一种待分析样品中，比如血清，在一个合适的温育期后，清洗阵列并暴露于第二种分析物的结合物结合本体中。在一种形式中，第二种分析物的结合物结合于光散射颗粒，而探测的是这些颗粒的光散射性质。附着在每个微点上光散射颗粒的数目便是对出现在每个微点上分析物的量的一种测量，并且与样品中分析物的浓度有关。在另一种形式中，第二种特定的分析物的结合物并不结合于光散射颗粒。在后一形式中，结合于光散射颗粒的是第三种本体，它特定地与第二种特定结合物结合。这第三种本体比如，可以是链霉抗生物素蛋白，能特定地结合生物素，而此生物素共价附着于第二种本体。有许多其它的分析方法可用来探测第二种本体，它带有结合于光散射颗粒的第三种本体。在任何这些形式中，结合于各个微点的分析物的量可通过测量光散射信号而确定，被测的光散射信号与结合于各个微点上光散射颗粒的数目有关。
不同的方法能用于探测微阵列中各微点上光散射颗粒的数目。结合于各个点(spot)上分析物的量根据附着于各个点上光散射颗粒的数目确定，这在最终的分析步骤中实现。通常，某种成像系统需要从阵列里的不同区域中分离光散射信号。这需要用到对样品的一个或多个区域成像的光电探测器，或能使样品的一个或多个区域被照亮或探测的扫描方法来记录每一个扫描位置的探测光散射信号。许多不同的方式能用于成像及定量分析颗粒。选择何种方法取决于所需精度及每天需测的样品数目。所需精度有很大的变化范围，从仅需得到一个肯定或否定的回答的低精度情况到把分析物的量确定到几个百分点的极高精度情况均可以。
一些特色能被引入到微阵列中用于任何成像方法，比如，阵列中某些微点上的化学组分能被格式化产生一种已知幅度的本底信号以供定标，或被格式化用作包含分析物或颗粒已知量的校准点。从这些点来的信号能用于校准入射光的强度变化、多微点与阵列载体之间的透射光、集光效率和从一个样品到下一个样品光电探测器的灵敏度。现在描述一些特定的成像和定量分析光散射颗粒方法在阵列微及阵列芯片中的应用。a．借助简单光学显微镜的DLASLPD方法ⅰ．点上颗粒表面密度低(小于0.1个颗粒/μ2)情形
如果将待检测的样品数目不大，则各个点上的颗粒数目可以通过对各个点上颗粒数目进行目视的或其它的计数方法而确定。本底计数也进行了。计数能在液体包被的或干燥的微阵列上进行。每个微点上的颗粒数目其数值被认为是正的，由先前的检测实验所定义。如果需要检测的样品有许多，则可以利用一个简单的视频检波器和靶计数软件自动完成计数。ⅱ．点上颗粒表面密度高(大于0.1个颗粒/μ2)情形
对于只要求结果为肯定或否定的此类分析，各个点上的强度可以通过目测或光探测而检测到。一个结果是肯定的若其强度大于本底强度。如果需要得到定量结果且待检测的样品不多(例如，床边、野外、小诊所、或研究室检测)，则一种利用双观察点显微镜的技术指南可以使用如下。单个微点用一窄光束照明。利用其中一个观察点通过目测将光束定位于点上，而强度通过光敏器件定量测量。此光敏器件带有或不带有空间滤波孔，取决于杂散光信号的等级。各点上散射光强度通过在光束中手动扫描各点而测量。或换一种方式也行，手动扫描光束，从各点来的光用一个大范围光电探测器或小范围光电探测器探测，其中探测范围保持与照明点共焦。这也可以自动化。如果需要分析许多样品，则微阵列可用扩展光束照明，且微点的图像可通过视频摄像机和帧获取器数字化。各个微点强度便可通过软件图像分析确定。我们已经明确，这些方法允许一个待测样品中一种或多种分析物有很高的灵敏度和宽大的浓度范围。本领域的技术人员将体会到本方法的多种变更方法是可能的。利用某种金属样颗粒在微阵列和阵列芯片方法中探测分析物
在作微阵列分析的工作中，我们发现金属样颗粒作为光散射颗粒是优选的。用于特定的微阵列应用中的颗粒类型，其尺寸、形状、组分及均匀性主要依赖于下列各项因素。样品中无规光本底的数量；微阵列是干燥的还是为液体所包被；分立的固相结合区域的面积；待测物的数量和浓度变化范围；用眼睛探测还是用光电探测器探测，测量颗粒计数和/或测量强度。
作为一个实施例，我们能很容易检测到直径为60nm、包被有BSA－生物素的单个金颗粒结合于直径为80微米的点上，此点包含链霉抗生物素蛋白于一包被有缓冲溶液的微阵列形式中的一个塑性固相上。我们使用DLASLPD条件下传统的照明装置和我们自己开发的廉价显微镜系统。在微阵列链霉抗生物素蛋白微点上直径为60nm、密度较低、包被有BSA－生物素的金颗粒，我们对结合颗粒作了计数。在高密度情况，我们测量来自结合于单个链霉抗生物素蛋白微点上的颗粒的散射光强度。当信号与本底比例为13时，我们可探测的颗粒密度可低至约0.06个颗粒/μ2。这暗示对于此类分析，当信号与本底比例约为3时，我们可探测的颗粒密度可低至0.015个颗粒/μ2。密度非常高的结合颗粒也可探测(每个直径为80微米的个体微点上有效结合位置的饱和)。为了在一个干燥形式(没有流体包被)下实施同样类型的微阵列分析，需要使用直径更大的金颗粒或其它具有较大光散射能力的金属样颗粒以达到同样灵敏度。并且，使用波长较大的光源如氦氖激光器是有好处的，此激光器能发出波长大于600nm的光波并且具有空间滤波特性。
为了用小型手提式或其它类型的轻便装置来探测样品，可能需要更大的颗粒，这依赖于所需的灵敏度等级。典型的是，本领域的技术人员必定会在此装置中使用低功率光源。
对于微阵列形式中多分析物的探测，不同分析物的浓度可能存在很大不同，其差异在浓度上从1，000到1，000，000或甚至更大。在此种情况，光散射功率和颗粒的相关尺寸变得非常重要。例如，如果某人正在分析－阵列片或微阵列上的多种分析物，当阵列或微阵列上个体的分立结合区面积约为100平方微米时，则能结合于此100平方微米区域的颗粒数目强烈依赖于所用颗粒的尺寸。例如，如果采用一种尺寸为40nm的颗粒，在结合饱和情况下，约79，600个颗粒能结合于此区域。然而，如果采用尺寸为120nm的颗粒，大约仅8，800个颗粒能结合于此区域。为使测量可靠，则必须结合于此区域的最少颗粒数目可以有相当的变化，这依赖于无规光本底的量及颗粒的无规结合。例如，在某些情况，可能需要几千或更多的颗粒结合于微阵列上的结合区域以得到正的探测结果。采用大颗粒因而会限制分析物的可检测性。在小面积的结合区域，应该使用能给出充分大的信号/本底比值的最小颗粒。另外，光学和空间滤波、共焦成像、更强的光源及其它仪器元件能最有效地提高探测极限。类似地，如果两种或更多种分析物以非常不同的浓度存在，则需采用尺寸及光散射能力合适的不同类型的颗粒。
这些实施例并不意味着限制，而是表明在各种应用中，选择某种金属样颗粒将如何导致微阵列分析中和多种分析物探测中特定的检测仪器的选用。本领域的技术人员将认识到本发明中的方法有许多其它变更方法可用于探测阵列片和微阵列上的多种分析物。本发明的某些方面在其它照明和探测方法下的使用
此发现意味着你可以在本领域中现有的诊断探测方法和设备条件下利用本发明的各个方面，甚至无需使用本发明所公开的最佳光照条件和探测方法及系统。例如，激光共焦显微方法、明视野和落射照明显微方法，及反射反差与差分干涉反差显微方法，在某种金属样颗粒下可用于测量微阵列等上的多种分析物。
例如，可以使用共焦显微镜，此种显微镜描述于Ekins的美国专利5，432，099(此处引入作为参考)。一般地，这种共焦显微镜依靠点照明而不是场照明，并且通常在落射照明下工作于荧光模式。通常，用光电倍增管作探测器，因为待探测的信号非常微弱。光源常常是激光。在本发明中，尽管信号极端强(对比常规共焦显微镜而言)，并且无需用激光作光源，但仍需要一个与共焦显微镜同样复杂的仪器。很清楚，利用此仪器为探测颗粒提供了更高的灵敏度，正如本发明中我们已发现的那样，并且使杂散光的影响降到最低限度。
如此，在另一个实施例中，Fodor等的方法也可以采用，即利用生物切片探测靶分子，见Fodor et al_Nature，364卷，555页，1993年。
当这些方法和仪器的费用及简易程度并不重要时，则这些方法与本发明的某个或多个方面组合使用在某些微阵列分析应用中是很有用的。我们注意到没有任何人将上面提到的本领域现有技术与金属样颗粒和/或折射率提高方法和/或自动金相显微术和/或本发明的任何其它方面相结合利用。我们因此要求对前面已述的本领域现有的探测方法和仪器同本发明的一个或多个方面的相结合利用拥有专利权。本发明应用于微阵列的其它修改
本发明的方法提供了非常好的途径以利用微阵列形式探测一种或多种分析物。下面的方法提供了另外的在某些分析应用中有用的变型。
我们可以使照明和探测方法小型化，这样便构造了一套单一的或基于多光纤(multi-optical fiber)的装置。这为探测提供了利用成像方法的选择。
采用二维阵列或者其它类型空间可达到的固相系统的一个问题是，微阵列上不同区域的信号之间会发生串音(crosstalk)。串音、眩光或其它类似问题存在几种来源，例如，(1)包含光散射或荧光材料的个体区域靠得太近以致它们显现得似是一个区域，或(2)某区域包含大量光散射或荧光物而其它毗连区域只包含少量上述物质。来自高强度区域的光的一部分将在强度较弱的光出来的区域被探测器采集，这与各个区域之间靠近的程度有关。
在本领域中一个可能的解决办法是：采用扫描方法分别照明各个空间可达到的固相位置，并且在照明各个空间可达到位置时分别记录来自各个位置的光信号。这可以通过移动照明光束或样品，一个时刻一个区域地扫描不同区域而完成。然而，这些扫描机构通常是复杂的并且给分析方法增加极大量的成本及复杂的过程，而且对临床检测实验室或高度活跃的研究实验室的日常的艰苦工作来说可能太昂贵而不够坚固耐用。
现在描述本发明另一个变型的实施例。一根光纤在一端被斜削成一个合适的角度，并用作分立的照明光源，使得当它被靠近到一待测区域时，此区域上的发射荧光或散射光可以从样品表面的另一侧(side)探测到。这种构形允许单个区域的特定照明并消除了上述串音问题。它也排除了对成像型探测器如视频摄像机的要求，任何类型的光电探测器都可以采用。作为一个实施例，对一个待测的有24个微点或独特(distinct)区域的阵列，将采用24根分立的照明光纤，每点一根。所要求的是各个体点彼此之间在不同时刻照明。能用此方法测量的几个空间可达到的小区域，其尺寸可小至光纤直径的1/2。
在本方法的另一个实施方案中，这里需要采用落射照明或类似方法，举例来说，共焦成像，人们可以把系统小型化，方法是：在光纤一端放置一个极小的成像透镜并达到共焦条件，在此条件下散射光或荧光能在微阵列中所需区域被测量到。对于在微阵列表面上任何需要测量的区域，采用单根带有微透镜的光纤来输送入射光并采集待探测的发射荧光或散射光。如果需要的话，可以象上述那样采用多根光纤来同时探测表面上多于一块的区域。
本领域的技术人员将认识到上述说明性的实施例仅是本发明的许多可能的变更方法中的一些。
本发明的应用
本发明可用于探测和计量的目标分析物范围宽广，这些分析物可以是有机化合物，病毒，细菌，细胞，蛋白质，肽，激素，蛋白脂质化合物，核酸，药剂，药品目标，类脂物，碳水化合物和含糖物质，抗体，抗原物质以及类似物质。为探测和计量这些类型的目标分析物，已经发展了许多不同类型的分析方法，免疫测定法，核酸分析法，以及很多其它的配位受体分析法，在本领域中都很有名，这些方法也被称为结合对或分子识别类型分析法，结合对中的一个被用作探针来探测和计量另一个的存在。分析形式及探测标记的许多变化形式在本领域中都知道。许多以结合对为基础的分析方法中，一个可探测的标记附着在目标分析物上做为目标探针结合对系统的直接结果(即，探测标记直接附着在探针上)或非直接结果(即，在探针或探针一目标复合体上使用第二个结合对)。
以一种或另一种形式使用本发明，通常采用以下三种方法之一来附着可探测光散射颗粒到目标分析物上：(1)结合对中的探针分子(即抗体分子，互补核酸序列，等等)包含一个或多个可探测光散射标记；(2)探针用第二个结合对中的一个或多个成分来标记；(3)一个或多个光散射探测标记包含在抗体，核酸插入物质，结合蛋白核酸，或其它与探针－目标分析物复合体有特定结合特性的制剂中。第二结合对的例子包含生物素和抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/抗生物素抗体；地高辛和抗地高辛抗体；荧光素和抗荧光素抗体。
我们现在阐明本发明在探测和计量各种各样的分析物的几个应用，下面的例子和讨论不是限制，而是显示了本发明的一个或多个形式的广泛应用。具备本领域一般技能的工作者会意识到本发明有许多变换形式。核酸探测分析应用
过去几年尽管本领域对核酸的探测和分析有很多研究，但它一直是个疑难问题，很多情况下，存在的核酸序列数目很小，可能每个细胞或细菌只有几个或甚至只有一个该序列的拷贝，为了探测到该核酸序列的存在，需采用“目标放大”的复杂方法，如PCR，NASBA，TMA和其它核酸序列放大技术，这些方法增加了分析的复杂性，需仔细控制和监控。同时发展了信号放大技术，如基于比色或荧光信号放大系统的化学发光、电化学发光及酶。事实上，与目标放大技术一样，信号放大技术必须仔细应用，它易受干扰且活动范围有大的可变性。
我们发现混合采用本发明的一种或多种变化形式，可以更容易地探测和计量特定的核酸序列，且有更高的探测灵敏度。花更少的时间和复杂方法而得到更高探测灵敏度的可能性允许很多不同领域核酸探测和分析有更宽广的范围，这些领域包括医药，生物和生物化学研究，药品发现和发展，兽医和诊所诊断，农业，食品，水，工业和环境科学。
用本发明的一种或另一种形式的混合杂交技术结合可以识别和测量RNA、DNA的特定核酸序列和其它核酸序列，例如，HnRNA(异源RNA)，tRNA(转运RNA)，mRNA(信息RNA)，rRNA(核糖体RNA)，和DNA可以被探测，计量和分析。应用在DNA上，基因、同素异构、连接花样、基因变异，异常基因，其它伴生序列和一个或多个基因的表达水平可被探测、计量和分析。本发明结合混合杂交方法可用来探测、计量和分析用化学或生物化学方法合成的核酸序列，如寡核苷酸，cDNA及类似物质。
核酸杂交方法在探测和识别核酸序列方面有广泛用途。杂交方法及杂交分析应用了核酸独特的物理化学性质，该性质允许两个或多个互补的核酸链形成双股杂交结构。杂交方法存在着很多不同的变化形式，同时发展了很多不同的分析形式来进行杂交分析。
杂交分析中，一个已知序列的核酸序列被用做“探针”来探测样品中与探针核酸序列的一个或多个区域互补的“目标”序列。探针核酸序列被加到样品上，如果样品中存在互补的目标序列，则探针核酸序列结合到该序列上。杂交反应之后，通过使用探针标记和识别探针－目标复合体，探针－目标复合体可被探测和计量。通常，这涉及用可被探测到的报告基团来对探针核酸或探针－目标复合体进行直接或间接标记，本领域中著名的核酸探测报告基团包括放射性同位素、荧光分子、化学发光和电发光分子和能产生比色、荧光或发光信号的酶。
在这里介绍几种不同的直接将光散射颗粒附着在核酸分子上的方法，更多的直接方法包括对核酸的一个或多个化学基团进行化学的或光化学修饰，使它可被用来与光散射颗粒表面形成化学键或其它连接。例如，由圣地亚哥，加利福尼亚大学化学系Jackson的博士论文提出的转胺基作用方法可用来在胞嘧啶残基形成活性氨基。这个方法包含在本文的文献中。本领域的普通技术人员可能认识到有很多不同的将光散射颗粒附着到核酸序列上的方法。
另一种方法中，如上所述，用到第二个结合对。例如，用本领域所熟知的任何方法将一个或多个生物素分子、荧光素或地高辛配基加到目标核酸序列上：(1)使用在目标核酸序列合成中包含这些的单个的核甙酸；(2)将基因加到目标核酸序列或3’或5’端的化学或光化学反应；(3)用生物化学方法来插入基团。这些方法被引入本文作为参考。探测和识别核酸序列
已知在探测核酸的应用中用光散射标记做为报告基团，例如，美国专利5，599，668和Stimpson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，pp.6379-6383(1995)介绍了使用光散射标记，用损耗波导器件来探测核酸杂交。
已发表的论文说明用损耗照明达到的nM探测灵敏度相当于基于荧光探测的灵敏度。因损耗技术所带来的很多问题在本领域中众所周知，缺乏商业特征或研究产品证明了其复杂性，使用困难及这样一套系统的其它问题。
本发明克服了损耗方法的许多局限。用一定的形式，本发明可探测单个的光散射颗粒和分立的单个分子键事件。与本领域所熟知的损耗和荧光技术相比，本发明的优点包括，对许多不同分析物类型有广泛应用，分析形式和器件，复杂性大大降低，使用更容易，探测灵敏度提高，费用更少。
例如，利用本发明和混合方法，我们可以探测含量非常低的目标核酸甚至溶液中两个互补核酸序列的单个化学键的事件。用本发明做核酸固相分析，我们加聚肌苷[Poly(I)]或聚胞苷[Poly(C)]核酸序列到显微镜载玻片的小区域上，用聚赖氨酸溶液覆盖玻片，风干，然后滴1-2毫升核酸溶液到玻片上，就做成直径为2-4毫米的“俘获”核酸序列点。液滴温育之后，冲洗玻片，接着用封闭液封闭玻片以防止非特定结合。在一个具体装置中，一个核酸被用一个光散射颗粒标记。包含目标核酸－光散射颗粒结合对的样品被涂到包含互补固定探针的玻片上。温育之后，目标核酸的存在和数目由探测和计量玻片上俘获核酸区域中光散射颗粒发出的光散射信号决定。例如，我们放直径2-4毫米的Poly(I)核酸序列点在玻片上做为固定俘获探针，附着在直径80纳米的金颗粒上的Poly(C)核酸序列做为目标，包含有用金颗粒标记的Poly(C)目标样品的一个等分试样放到玻片表面，玻片用盖玻片盖住，放到为我们的方法的照明和探测(DLASLPD)特别调制的光显微镜下，几分钟后，当Poly(C)-80偶联物束缚在玻片上Poly(I)俘获探针区域时，玻片上单个Poly(I)俘获点变成可见的。我们很惊奇，不必移开样品溶液，直接观察(肉眼)显微镜台上的玻片，就可看到俘获点。随着时间推移，Poly(I)俘获带变得非常明亮。通过显微镜观察玻片，可看到附着在玻片的单个颗粒，可见附着的许多颗粒在轻轻移动，正如所期望的颗粒被束缚在表面上的情形。清洗玻片，用缓冲液和盖玻片覆盖，放回显微镜上，可以探测和计量用几种方法与Poly(I)俘获点杂交的目标Poly(C)－金颗粒偶联物。一个方法是，用肉眼观察放在显微镜照明台上的玻片，可探测和计量由点发出的相对光散射信号。另一种方法，提高显微镜的放大倍数以便颗粒能被观察到，然后用眼睛数每个点中的颗粒数目。另一种方法，用CCD光电探测器来收集玻片图象，用帧获取器和图象处理软件来产生玻片表面的数字图象。数字化数据文件存在计算机或其它存储媒体或器件上，图象可在计算机屏幕上观察到，用目测或用图象处理方法来分析。图象也可用不同的打印设备或媒体打印出来。从数字化文件，用许多方法，我们可确定从玻片上每个俘获点或其它区域发出的光散射信号的大小。例如，一种方法，用商业图象分析处理软件在计算机屏幕上我们观察到玻片的数字化图象。用肉眼，通过比较斑点的相对亮度，可测定一个载玻片上不同斑点或不同载玻片上不同数字化图象的相对光强度。另一个分析方法，用商业化软件，选择不同的用户方程，我们给出不同的参数和参量常数，变量及算法的组合来分析不同斑点的光散射信号。如，我们用下面的方法来测量一个斑点的数字化图象的积分光强度。用一个画图工具，在包含光散射颗粒的成像斑点的周边画一个圈，确定该点为被分析的对象，考虑到每个象素的亮度和光强，软件的探测阈值被调整到反射一个目标斑点的近似尺寸，在该处设有附着光散射颗粒，这做为载玻片系统的背景信号，然后，利用不同的计量方程，得到该斑点总发光强度的积分。另一种方法，不将背景值探测水平设在载玻片背景，测量斑点的积分光强度，然后，从测量到的每个斑点的总的积分光强度中减去背景信号。
在很多图象中，可看到单个的颗粒。为测量斑点中光散射颗粒的相对数目或每个斑点散射光强度的相对量，可用下述方法。用软件中的画图工具确定目标，在个别颗粒的周围画圈，分析它们的各种可测量参数，如成像颗粒的尺寸(面积)，光散射信号的密度(单位面积测到的强度)，及散射光中用红、绿、蓝组分来表示的色谱。用一个或多个这些测量到的参数来识别少量颗粒，我们求出这类测量的校准参数。我们将一个或多个校准参数输入软件做为关于什么物质可被识别为光散射颗粒的极限值。采用这个方法，我们用画图工具选取俘获点来分析，用我们定义的，校准参数，我们用该软件来识别俘获点中的光散射颗粒。按照这个方法，我们能够数出每个俘获点的颗粒数，并求出所识别出的光散射颗粒的光散射信号的和。我们很惊奇地发现不管是用直接数颗粒的方法，或先识别颗粒，再求各个颗粒强度的和的方法，比用对整个点求积分光强的测量方法有高得多的信号背景比。为了得到一个载玻片中或许多不同的载玻片或样品间的可比较的定量测量，在玻片的特定区域加入一个内部校准带。校准区包括光散射颗粒，或已发现能从载玻片的不同样品上产生恒定校准数据的任何其它物质，阵列生成或任何被测量的固相表面。校准区被用来：(1)设定探测光散射强度的校准参数和识别光散射颗粒；(2)调节供给样品的照明光大小；(3)调节光电探测器的增益；(4)因照明光强度及探测效率的起伏，对测得的不同样品带的光散射强度归一。对于可识别单个颗粒的光散射颗粒超灵敏探测，计数或对单个颗粒散射光强度求和的方法较佳，可得到极好的信噪比。
另一种方法，每个斑点的积分光强度可用其它探测器如光电倍增管或光二极管测量。在本方法中，为探测由光散射颗粒发出的信号，可如Fodor等在Nature364：pp：555(1993)中所述扫描载玻片，或另外，做一个光二极管或其它探测器阵列，每个光电探测器探测从一个斑点发出的信号，如Stimpson等在US专利5，599，688中所述。这些方法包含在本文的文献中。
用此方法的另一种变更方法，我们想确认使用本发明的多层分析形式是否可行。多层形式中，使用两个或多个目标序列不同区域互补的探针核酸序列，我们如下执行多层核酸分析。Poly(c)序列被附着在玻片上2-4mm的小斑点上，不动的Poly(c)的作用是做为俘获样品中Poly(I)核酸序列的探针，需要注意，实验中用到的Poly(c)和Poly(I)序列有不同的长度布居数，Poly(I)的平均长度比Poly(c)的平均长度长出几百个基本组合，这样，对多数Poly(I)分子来说，可能附着两个或更多的Poly(c)分子在同一个Poly(I)分子上。用探针核酸序列，我们附着80nm金颗粒在Poly(c)核酸序列上，溶液中目标Poly(I)核酸序列的存在和数目可通过探测存在于Poly(I)俘获点中的光散射信号的大小来测量。可测到剩在溶液中的未结合的Poly(c)－颗粒探针数目，或可使用溶液中结合的与剩余的混合物。我们用两个方法之一来执行多层分析。第一种方法，目标Poly(I)和探针Poly(c)－颗粒混合在一起然后涂在玻片上。第二种方法，用载玻片先温育Poly(I)目标，再加上探针Poly(c)－颗粒。用其中任一方法，我们观察Poly(c)－颗粒与载玻片上探针俘获点的结合，用前面所介绍的不同方法测量总结合数。
本发明的另一个具体实施方案，用杂交序列(SBH)方法及Affymetrix公司制造的寡核苷酸阵列片，能够探测，计量和确定样品中目标核酸序列的序列。杂交序列方法在Dramac等的专利5，202，231和5，525，464中有说明，类似的方法在本领域中众所周知，并包含在本文的文献中。我们采用一个Affymetrix的可变密度的1164片，该片由附着在片表面小区域上的特定的寡核甙酸序列的多层重复阵列组成，通过在片上放置合适的序列，实际上，可分析样品中任何核酸序列。1164片包含成千个在表面上分立的结合区，每个结合区包含一个已知序列和固定在表面的寡核苷酸核酸序列长度的许多拷贝，结合区的大小从100×100微米到大约20×20微米。正如Chee等的文章SCIENCE：274，pp.610-614(1996)中所述，包含共焦成像及阵列扫描的荧光技术被用来探测和计量片上的结合区。
近来，将SBH寡核苷酸片和其它核酸序列带入更广阔的应用领域的挑战涉及简化现有设备及程序，降低总费用和提高探测灵敏度。假如这些挑战能被克服，寡核苷酸阵列及相关的阵列技术将在分子水平疾病诊断中扮演重要角色，包括传染病检查，基因型，基因突变分析和多态性分析。
我们如下探测，计量和确定样品中一个有20个碱基长度的目标核酸序列内部的10个碱基序列。一个20个碱基长的DNA寡核苷酸被用作目标序列，这个方法采用间接探测的方法，用生物素和抗生物素抗体做为第二结合对。一个生物素分子被附着到目标上做为结合对的一部分，平均颗粒尺寸为70nm的抗中物素－金颗粒偶联物做为探测探针，一个生物素基团附着到目标核酸的一端。分析方法如下，Affymetrix1164片用封闭液封闭以减少非特划结合，用被封闭的Affymetrix1164寡核苷酸阵列片温育一个含有20个碱基长度目标核酸序列的样品，杂交以后，阵列片用缓冲液冲洗，接着，金颗粒－抗生物素偶联物被涂在片上，温育一会儿，然后移开，用缓冲液冲洗片子。用DLASLPO方法的许多形式，我们可探测和计量片上与每个单个寡核苷酸结合点杂交了的目标核酸序列的数目。一种方法，我们用食指和拇指拿着1164片，用带有×10物镜的显微镜照明灯做光源，根据表面来转动片子的表面以减小到达眼睛的非特有散射光并有足够的照明光照在片子上以便探测。用这个方法，我们可探测到阵列的散射光，并且用肉眼就可分辨许多单个的结合区。DLASLPD的另一种方法，我们在眼睛和阵列间放一个放大镜并使它聚焦在片的表面，这提高了我们分辨每个阵列单元中单个的结合点的能力。另一种方法，类似于图12A所描绘，我们将阵列片放在一个棱镜上面，并在棱镜的上表面和片子的下表面间滴一滴浸润油，我们在片子的表面半干，缓冲液包被并有盖玻片的情况下观察，用这个方法，我们可测量用肉眼及有辅助(即放大镜)情况下光散射强度的相对水平。接着，我们将一彩色CCD视频相机放在三角架上，调节其方向，使得被照亮的整个片子表面的图像能被探测到。另一种方法，我们用一个类似于刚刚描述过的棱镜，将其改造安装在显微镜上，通过显微镜观察片子。在低放大倍数，我们能非常详细地看到来自每一结合点的光散射信号。我们看到在每个阵列单元，各个独立结合点之间非常稀疏的结合有很大强度差异，片上的每个阵列单元包含相同的组分和寡核甙酸结合点的二维图像，阵列上每个结合点光散射强度的相对量与片上每个阵列的相对量非常接近。用不同的放大倍数，手动移动片子，我们得到片子的不同区域的图象，并用安装在显微镜上的CCD相机拍摄图象。根据我们需要观察和测量的详细程度及片子表面的大小，选用不同的物镜装置。从数字化数据，用眼睛观察计算机屏幕上的数字化图象，我们能测出每个结合点光散射的相对量，我们还用之中所述的图象分析方法(即积分光强度，计数，求各个颗粒点强度的和)测量结合点的散射光强度。我们惊奇地发现，非特定结合的水平极低且数据具可再现性。还令我们惊奇的是，我们可以很快地收集图象且用不同的图象分析方法测量每个点的结合数目。探测的另一种具体装置中，散射光强度的机械化半自动或全自动探测可与共焦或非共焦设备和方法一起使用，例如，Trulson等美国专利5，578，832和Fodor等Nature364：pp.555(1993)介绍的方法可用来探测结合点的光散射信号，这些方法包含在本文的文献中。需要注意到，与荧光一起使用的现有的激光扫描(共焦成像或非共焦成像)方法，依据表面结合点的数量，通常要用几分钟。探测完之后，有大量的数据需要分析，这又要花几分钟。用我们的方法使用CCD相机，我们能在低放大倍数情况下，在一秒或更短时间内采集整个片子的数据。高分辨情况下，手动移动片子，不同区域被探测和数字化，这个操作可很容易转化为全自动的。我们用之中介绍的不同的图象分析方法人工分析数字化图象。一旦片子的设计确定，在数字化图象采集及用我们所讲的软件的图象分析方法测量的基础上，测量和分析可做成自动系统。这样，本发明做为寡核甙酸阵列及片子的信号产生和探测系统，其它类型阵列的快速筛查，分析物和新药剂的检测，有广泛用途。在这些应用方面使用本发明，能在提高样品探测及分析处理量的同时显著地降低操作及设备的复杂性及费用。基因表达和基因表达阵列
基因表达有研究在很多不同领域包括疾病诊断，药靶及发展新药和生物学化学研究等正变得非常重要。近来，在发展测量基因表达水平及提高收集信息速度的新方法和策略方面已做了许多努力，例如，已报导了在玻璃或其它基底上附着多层cDNAs的阵列基方法(Schena等，SCIENCE270，1995pp.467-470；Shalon等Genome Research 6：639-645)，另外一个利用寡核苷酸阵列测量基因表达的阵列方法也被介绍了(dockhart等，Nature Biotechnology14：1675-1680)。这些方法包含在本文文献中。
为测定任何给定基因的相对的或绝对的表达水平，必须测定有机体或细胞中mRNA含量的浓度。有许多本领域中熟知的测定样品中mRNA数量的方法，这些方法部分地采用了混合方法，在本文的文献中有介绍。本领域中现有的基因表达阵列采用荧光技术及荧光标记来探测和测量目标核酸序列标本与阵列的混合，混合的总量与样品中单个基因的mRNA的数目有关。
现在我们讲述利用本发明，基因表达阵列分析法如何估计，探测及量化样品中一个或多个基因的表达水平。前面我们已经讲过，光散射标记及不同分析特殊形式是如何被包含在纯核酸分析系统中的。做一个寡核甙酸，cDNAs或其它核酸序列的阵列，阵列中不同结合点中用到的核酸的序列是特定的(互补)，特定的目标mRNA，从mRNA目标生长出的cDNA，或实验室中转录的由目标mRNA的一个cDNA拷贝长出的序列。实际分析方法中，若样品中的mRNA在片上直接被分析，那mRNA就是目标核酸序列。在cDNA和实验室转录方法中，cDNs和实验室转录的核酸序列是被分析的目标核酸。一个或多个光散射标记被加到目标序列上，一旦目标核酸序列被标记，将标本涂到阵列上并用混合的方法，接着冲洗阵列，或不冲洗，用文中所述的许多不同的照明及探测形式的DLASLPD方法测量阵列。
另一个具体装置中，通过附着oligo-dT核酸序列到光散射颗粒上以形成结合在Poly(A)序列上的核酸序列一颗粒试剂，用基因表达阵列或其它形式能直接测量mRNA含量。众所周知，大部分mRNA分子的一端包含有一个聚腺苷酸序列(Poly(A))，这个Poly(A)尾巴常和含有oligo-dT的分离柱一起被用来从样品中提纯mRNA。如执行分析，做一个阵列片，该片有与感兴趣的mRNA互补的核酸序列，被固定在空间不同区域表面，采集样品mRNA，涂在片上，有PolydT包被的光散射颗粒可在杂交之前，中间或之后加到样品上，PolydT包被的光散射颗粒被束缚在mRNA中的Poly(A)序列上，样品中任意给定的mRNA目标的存在与数目通过测量与目标mRNA有互补核酸序列的片子的结合区的光散射信号大小确定。
可用基因表达测量及核酸探测计量的本发明的另一个具体装置中，特定的核酸序列，DNA结合蛋白，或其它分子识别剂被附着到光散射颗粒上并用来探测目标核酸序列的存在及数目。如一个或多个Poly(A)序列或另一个序列的同聚物偶联物，如Poly(I)和Poly(c)，可被用来产生第二结合对以探测目标核酸序列。
另一种方法中，一个核酸或DNA结合蛋白被附着到光散射颗粒上，核酸结合蛋白一颗粒试剂被做探测目标存在的探针，这个DNA结合蛋白所结合的核酸的序列可在目标序列中自然出现。或可被附着到分析操作中涉及到的目标或探针核酸序列上。
另一辅助的方法中，光散射颗粒被附着到DNA-DNA双链体或DNA-RNA双链体，甚至三链结构有特殊结合性质的探针分子上，例如，众所周知，有很多化合物表现出与双链核酸结构的特殊的结合性质。溴化乙锭，由它产生的二聚物和这个分子的其它形式与双链核酸结构结合，这样，在这个方法中，制备了光散射颗粒-乙基溴化物试剂，并在杂交后将其加到基因表达阵列上。从结合带测到的光散射的大小确定了表达的存在及数目。
本领域中所有已知的核酸分析中利用第二结合对的方法都包含在本文的文献中。光散射探测设备及方法举例
对大多数类型的核酸分析和任何类型的以阵列为基的方法。用本发明有几种不同类型的仪器可用于探测和计量光散射信号。在我们对探测和分析Affymetrixll64 DNA片的说明中，我们讲述了许多探测和分析的方法的不同变换形式，这些方法中的一些可选出简单的设备如探测光盒，例如，提供一个光源以合适的角度照亮阵列，一个载物台。窗口或其它供放置阵列以便照明和观察的平台，就做成了一个探测光盒。用这个设备，物理学家，实验技师，研究者或任何人将阵列放到支架的正确位置，接着用眼睛观察从阵列每个结合点发出的光散射的相对大小人工判读阵列。置于被观察阵列上方的覆盖层样板，或与观察到的光散射强度的图样的特定的描述有关的阵列的外貌的有特征的标准图形，可用来辅助解释阵列。若需要更多的量化信息，可如我们所讲的做一个以成像或非成像探测光学为基础的仪器。例如，若阵列包含许多结合点且需要较多的定时测量，可做一个半自动或自动图象分析系统的设备。如，用一个合适的收集透镜，一个与阵列表面垂直的光电探测器，照亮阵列并且设有或只有很少的光进入收集光学系统到达光电探测器的照明源，可做成一个成像设备。收集光学系统可以是共焦的。用CCD片成视频相机采集的图像可用图象分析方法和合适的对的检定特定的算法来分析。通过测量积分散射光强度，单个颗粒计数，或被计数的颗粒的积分光强度，或这些方法的某些给合，可分析探测到的信号。根据照明源的实际情况。可分析一个或多个光波长。细胞识别和测量
本发明可以多种不同形式被用来探测和计量样品中特定的细胞和细菌。我们已经讲述了如何利用混合技术来探测与传染病或任何细菌有关的核酸序列的存在及数量，也可用其它非混合方法。如，样品中的细菌或特定类型的细胞右用免疫化学技术，外源凝集素，药剂，或其它只与一定类型的细胞结合的物质被探测到。做一个光散射颗粒－抗体偶联物试剂涂在样品上，温育，接着，细胞准备就绪分析(非分离分析)。分离一个人类淋巴细胞标本，溶解红血细胞并将其冲洗。配制抗人类-IgG抗体-直径60纳米金颗粒偶联物试剂，颗粒试剂与淋巴细胞标本混在一起，接着，一个等分试样被放到显微镜的载玻片上，用合适的收集光学系统，采用DLASLPD方法，在光显微镜下观察。在这个方法中，可观察到成对试剂只与淋巴细胞标本中很少的选定的细胞结合，而很多细胞并没有与颗粒试剂结合。我们观察到大约1％的细胞被颗粒试剂标记，对淋巴细胞个数的这个标记比率。与所期望的大致相同，因为已知大约5％的B-淋巴细胞有抗原表现，B细胞的相对丰度大约是非-RBC淋巴细胞个数的20％。在视场中可观察到单个的颗粒偶联物做布朗运动。没有必要洗掉没结合或自由的颗粒来确定哪些细胞含有结合颗粒试剂而哪些没有。通过数附着在每个细胞上的颗粒，也可很容易在将结合颗粒对的数量量化。用CCD视频相机和图象处理方法，我们还能得到图象并数字化，测定哪些细胞被标记，及样品中被标记的细胞的相对量。正如其它在方所述的，可造一个以显微镜如基础的或其它成像的设备来探测和分析。
本发明的另一个实施方案中，用一个流式血红细胞计数器或其它设备，特定细胞的识别和量化也能探测和计量。在这个方法中，测到了与细胞连接在一起的光散射颗粒的一个或几个光散射参数，照明和探测光学元件被布置得能测到感兴趣的光散射参数的最大值。
本发明的另一个具体装置中，颗粒被附着在细胞表面，或被放到细胞内部，颗粒被用做细胞的识别标签以使在一系列操作中可追踪细胞，或在日后通过探测与细胞结合在一起的光散射颗粒的一个或多个光散射指标来确定细胞的数目。生物体探测和计量
样品中生物体的探测和计量可用本发明的一个或几个方面实现，利用核酸杂交技术的方法在其它地方已经讨论过。例如，制备特定的光散射颗粒－抗体偶联物，该偶联物与生物体表面抗原，由细菌产生的化学或生长物质，如毒素，或生物体的任何其它的特定物质。有特殊的结合特性。在一个实施方案中，采用夹层免疫测定形式，制备一个与细菌或病毒的已知的毒素分子或表面抗原有特殊结合性能的颗粒偶联物试剂，一个微孔，树脂，玻璃或其它固体表面上覆盖一层能与表面分析物或毒素结合的抗体，样品和颗粒结合剂可在被用到固相之前混合在一起，或分两步进行。在两步方法中，样品被用在容器中，冲洗，接着，使用颗粒结合对。任何一种方法，用颗粒结合对温育之后，冲洗固相，通过探测有无光散射信号及大小来测定样品中细菌的数目。
在另一个不同的实施方案中，在溶液中实现聚合体形式。光散射颗粒用特殊结合剂分子包被，将颗粒试剂加样品上，如果存在靶生物体，将形成多颗粒聚合体。多颗粒聚合体的数量，或聚合体的光散射特性，或颗粒结合剂的减少可被用来探测和计量存在的生物体数目。聚合体形式的另一种变化方式中，可用光学层析技术，正如Hatano等，Anal，Chem，69：PP2711-2716(1997)和Kanota等，Anal，Chem.69：PP2701-2710(1997)文中所述。这些方法包含在文献中。
在另一实施方案中，一个含有细胞特有的抗体，外源凝集素成附着到空间分立区阵列上的其它分子识别剂的以阵列如基础的设备被用来俘获不同的细胞到阵列的不同区域。在将样品涂到阵列之后，用光散射颗粒试剂做标记。在另一个例子中，采用本发明及能识别样品中特有的病毒或细菌的抗原或生物体菌种的单克隆或多克隆抗体探测和计量病毒和细菌，在由玻璃，树脂或其它光学透明介质做成的固相上，将抗体包被在待测生物体的表面，固相可以是片，浸量尺或其它形式，可在固相表面分离的区域以阵列或其它图形形式使用一种或多种特定结合剂，将样品涂到固相上，在温育期间或之后，涂上一种包含附着在与病毒或细菌的抗原结合的特定的抗体上的光散射颗粒溶液，然后，将固相从含有光散射颗粒－抗体结合对的溶液移开，在测量之前可冲洗。通过测量从固相结合区发出的光散射信号的大小，来测定细菌的存在及数目。可用肉眼或有辅助的眼睛，或用成像或非成像光探测方法测量，并如文中其它在方所述分析。可用类似的形式测量多种病毒或细菌，在固相上使用几个不同的结合区，每个结合区含有一种对一种病毒，细菌或细菌中单个的生物体的特定的抗原特有的结合剂。这些只是本发明在识别细胞和细菌的广泛应用中的几个例子。具备本领域的普通技术人员将认识到可以有多种形式用本发明的一种或另一种方式来探测样品中细胞或生物体的存在和数目。本发明在组合化学，制物靶药品识别和特征描述及高通量筛查中的应用
本发明的一种或另一种形式在制药的发现和开发领域有广泛的应用。近年来，在药物发明上挖掘出了新的方法和技术。已经发展了的组合化学方法，可很快建立起包含可做为药剂的成千个独特的分子的合成的，生物的或生物合成库。最近发表的与组合化学有关的几篇文章可做为背景信息的好来源(Chemical Reviews Volume 97Issue2(1997))，这些方法被引入本文作参考。组合库方法多种多样，例如，生物库方法包含那些涉及质粒，多核蛋白体，噬菌体表达方法。空间可寻址库方法包括多种系统，多次合成技术，该技术利用可分段载体，在纤维纸或聚合物膜片上的点合成，玻璃表面光控合成，基因表达阵列，和diversomer技术。另外，位置扫描，正交分割和迭代方法在本领域中一般都知道。一珠一化合物组合库方法和合成溶液库方法，亲合层析法选择和亲和毛细管电泳也都已知。这些方法的简单描述及进一步的详细的说明可在Lam等，Chemical Reviews97：PP411-448(1997))的文章中找到，这些方法及Lam等的文章被引入本文作参考。
所有组合方法通过常包含三个主要步骤：(1)建库；(2)筛查库以筛选药物活性药；和(3)分子水平活性物质本体的测定。本发明的许多不同形式可用于探测和测量潜在的药品物质和药靶，包括那些用组合化学方法制成的药品。利用本发明，可发展筛选分析法的许多不同类型。例如，有本发明，筛选及特征描述方法可发展为(1)靶药的识别和特征描述，(2)在靶药是分析的基础时，可发展针时该药剂的特异分析方法。
很可能地，成千上万个，大约～10，000不同的人类基因可作为潜在药靶的生物物质。人类基因组成计划及人类基因组分析的高水平研究的结果，很多基因已经被识别。另外，许多引起人类及动物疾病的生物体的基因也已被识别。功能基因表达和蛋白表达分析法可发展来测定哪一个可做靶。另外，存靶为基础的筛选测定可进一步发展用于筛选新药。药靶可以是生物成分，代谢路径，信息路径，或其它该药剂可以调节其作用的成分或系统。
组合化学方法，人类基因组计划和功能基因组的出现及发展，对能用来快速筛选成千上万个潜在药剂的探测系统有很大需求。高探测灵敏度，耐用，廉价，可有多种不同形式的灵活性都是重要的指标。到目前为止，荧光标记和荧光技术似乎是探测方法的选择，比色法，放射性同位素和化学发光方法也都知道，这些方法中的一些利用酶来达到信号放大(即碱性磷酸酶)。
例如，比色法探测方法一般局限到微摩尔(10-6摩尔到10-8摩尔)探测灵敏度。荧光方法提高了探测灵敏度，其灵敏度在纳摩尔到亚纳摩尔范围(10-8到10-11摩)。荧光标记和方法所带来的问题包括光分解和淬灭现象。在许多情况下，样品中的其它试剂能与荧光标记相互作用导致正在探测的信号改变。化学发光方法提高了好的探测灵敏度(10-12摩尔以下)，但要求特殊的试剂及仔细的操作技能，并且，化学发光法易受样品组分干扰。放射性同位素技术是已知的最灵敏的方法之一，但要求特殊的操作程序。它们是危险物品，一般难以使用且昂贵。
本发明为药靶及药剂的发现和发展提供了一个新的信号产生和探测系统，与目前用于药剂发现及品质坚定的本领域中已知的标记和探测技术相比，本发明有几个优点，包括提高了探测灵敏度，更方便使用，更广的应用，更耐用，并且更便宜。本发明在药靶和药剂分析的很多不同类型提供了稳定容易的探测光散射信号的方法。本发明的很多不同变化形式是这么敏感并且产生这么多可探测信号，使得这么小的阵列或极小反应和样品的容器可用来分析。样品的容器和阵列的微型化大大降低了分析的费用及所须的时间，这样大大加速了速度，提高了费用的效率，可做更多的分析。
借助本发明，生物体外的生物化学或细胞分析的许多不同形式可被发展来检验潜在的药剂。利用细胞表面受体，细胞内受体，细胞内信号蛋白，G蛋白耦合受体，离子通道，包含蛋白酶及蛋白激酶，DNA结合蛋白，核酸和激素作为靶子的分析方法可用来做新的药剂鉴别和特征描述。被分析的样品可以是单个或多个细胞，细胞裂解液，组织样品，膜制剂或许多其他样品。可与本发明一起使用的许多分析形式类似于生物，生物化学和医学诊断分析中的形式。这些形式包括竞争和非竞争分析，同源分析，固相微孔和更小的孔，阵列，微流室，探测和测量药剂结合活性和/或调节药靶系统功能的液相分析法。
为了进行分析，要选定一个特殊的分析形式和药靶系统，光散射颗粒作为提供探测信号的实体，光散射颗粒可粘附在受体，酶底物，激素，核酸，单克隆或多克隆抗体或其片段，肽，蛋白或能反映被测量目标物质的特定结合活动的一定水平的任何试剂上。基于DLASLPD方法的照明和探测方法被用来产生及探测光散射信号，根据分析的实际情况，可用一个或多个照明或探测波长。核酸及抗原物质同源分析不需要分离或冲洗，如我们在文中其他地方所述，可通过结合剂的合适组合进行分析。两个或多个颗粒很靠近的分析形式中，光散射强度的改变，偏振，角度依赖性，波长，或其他散射光性质可被用来探测和计量结合。DLASLPD方法与光学显微镜或能探测单个颗粒的类似成象系统结合，可探测和表示单个结合事件。
本发明可识别新的蛋白质和/或基因。如Jarvik等在Bio。Techniques 20：896-94(1996)之中所述的“CD-标记”方法与本发明的一种或多种形式结合用来探测与测量。CD-标记方法中，在一个单一复合事件中，一个特殊的标记被加到基因，mRNA和蛋白上，使用对标记来说特定的结合剂，该结合剂含有直接或间接附与其上的光散射颗粒。
本发明也可用来测量蛋白表达及样品中蛋白含量水平。一个或多个光散射颗粒粘附至抗体，配体，受体或与被测蛋白有特殊结合特性的结合剂上。可采用本领域中已有的不同分析形式或文中所述的分析形式，通过探测及计量光散射信号，可确定样品中蛋白的存在和数目。组合的合成分子库的筛选
在组合合成重要分子的发展迅速的领域中有一个极大的问题，即利用信号和探测技术及分析形式来探测新合成的组合分子的少数拷贝时缺乏高灵敏度、实用性及简易性。
我们已确定，我们的信号和探测技术能很容易用于包含空间可达到位置的固相，比如二维阵列或任何空间可达到的固相。因此，我们的方法在这种或那种形式中可直接应用于筛选和探测在此种形式中一类或多于一类筛选组合的或生物组合分子。此分析方法可以是本领域中任何已知的方法。
我们在本文中所描述的发明，也可以用于探测和量化空间不可达到的固相上一种或多于一种特定的组合分子、生物组合分子或另外的合成分子。例如，众所周知，在本领域中多种多样的生物组合和组合的分子能用以下方法合成“裂解合成”、“并行合成”及相关方法(所有这些方法在此是引入来的)。典型地，多种多样的组合分子是合成在小颗粒或其它固体基片上的，此处各个颗粒或基片包含一群独特的组合合成分子。鉴别和净化那些包含合成分子中的“活跃”群落的基片或颗粒，在本领域中还存在问题。
有几种途径可以利用我们的信号和探测系统来提纯或探测这些特定的、合乎需要的组合产物。在某种分析方法中，结合剂(它专门用于合乎需要的分析物)包被于一种精选的金属样颗粒上。当带有包被层的颗粒加到样品中，它将结合于分析物。或者反过来用一种间接方法也行，它包含利用生物素标记结合剂先结合于分析物，而此分析物便可通过在探测前加进包被有链霉抗生物素蛋白的金属样颗粒而探测到。光散射颗粒以这种或那样形式结合于合乎需要的、所考虑的分析物，而此分析物驻留于合成的固相。照这样，合乎需要的分子便通过过滤、分离、透析或任何其它本领域所已知的技术从样品中得到鉴别、隔离和净化。或者，可以加进以结合剂标记的光散射颗粒，以使聚集体或网状物形成于特定的包含分子的合成颗粒和金属样颗粒之间。与上述类似的方法可用于鉴别和净化合乎需要的分子。
不同组合的合成分子的多分析物分析可以通过利用各包被有不同类型结合剂的两种或更多种金属样颗粒而完成。折射率提高和DLASLPD视频一提高对照方法也可以采用。
在另一个分析方法中，金属样颗粒也包含一种铁电或磁性组合物，以便通过利用外加于反应容器的电磁场使得这些颗粒能被操纵于三维空间。照这样，包含“活跃的”组合分子的基片颗粒能很容易地从所有其它材料中净化并探测。应当指出，铁电体或磁性体与其它特定颗粒的类金属组合物的混合组合物在许多其它领域包括诊断分析是很有用的，对于分离和净化合乎需要的分子也如此。将折射率提高方法与上述方法配合使用，能提高探测灵敏度。金属样颗粒用作固相合成物载体
金属样颗粒当包被有合适的物质时，是引导化学或生物化学合成例如组合合成的很好的基片。类金属的特定包被层可以由，例如聚合物，抗体、蛋白质、核酸、氨基酸、活性化学基团等等组成。例如，金属样颗粒可以包被于包含化学活性胺基的聚乙二醇化合物。合成便开始于这些大量地存在于有包被层的金属样颗粒上的胺基上。其它活性化学基团或能被特定地激活的基团能代替胺基使用。在另一个实施例中，氨基酸或小肽直接包被于金属或金属样颗粒表面，或化学性地连接于包被在类金属表面上的聚合物或其它类型的分子。合成便开始于附着于有包被层的金属样颗粒的这些活性基团。在此外的另一个实施例中，活性基团附着于金属样颗粒表面以使蛋白质、核酸、化学制剂或生物化学合成能够实现。颗粒表面上活性基团的数目能用下面方法调节。带有或没有活性胺基(或其它活性基团)的聚乙二醇化合物(20，000分子量)以合适比例混合以使每个颗粒表面上活性基团达到所需数目。照这样，金属样颗粒便包被上了特定数量的化学合成位置(sites)或结合位置。这些位置的特定数目和活性基团位置的类型可以改变以适合于任何特殊的要求，例如，进一步的化学合成或为诊断试剂用途。例如，对于诊断型的应用，为达到所需的分析性能，每个金属样颗粒增加分立的数目的特定的结合剂分子可能是重要的。另外，两种或更多种不同的活性合成物或结合位置能通过按合适比例混合所需物质(即不同的结合剂或化学基团，等等)并以特定数量置于相同的金属样颗粒上，其方法与上述关于聚乙烯化合物的方法相同。这些类型的有包被层的颗粒是有用的，例如，利用相同颗粒分离、净化及探测两种或更多种不同的分子。许多种金属样颗粒具有高密度(g/cm3)，这也为所考虑的分子的净化、分离、鉴别提供了许多有利条件。MLSP型颗粒为更易于在介质中操纵颗粒提供了进一步的有利条件。上述实施例仅是本方法许多可能变更方法中的一些。其它变更方法对本领域技术人员将是显而易见的。本发明的各个方面在分析诊断领域之外的实践
本发明使通过探测颗粒的散射光性质而探测样品中一种或多种分析物的方法具有特色。应当指出，这里所公开的，本发明的各个方面可以直接适用于诊断领域之外的许多其它特定的应用中。这里所公开的东西使本领域或者其它领域如光学信息与存储、图像形成与处理、电光信号转导与转换、电信、信息变换器及许多其它相关应用中的技术人员能够在分析诊断检测领域之外运用本发明的各个方面具体地解决问题并创造新产品。
本发明的一个在其它领域非常有用的方面是通过独特的光学标记能够鉴别一定尺寸、形状、组成和均匀性的特异性金属样颗粒。此光学标记正是那种颗粒的特征。将上述特定的光学标记体现于极小结构，可以使这些颗粒信号试剂能够用于非常多的领域。例如，它们能用于工业质量控制、标记(markers)或标签(labels)以鉴别或示踪任何产品、材料、物质或包含颗粒的物体。这种或那种形式的颗粒能用作鉴别等的手段，类似于本领域所已知的“条形码(barcoding)”方法。例如，包含一种或多种颗粒的包被层能应用于消费产品以鉴别其真实性(authenticity)、日期或相关信息。类似地，纸币、股票和票据证书等能在表面包被上或在纸材料本身嵌入某种颗粒，这些颗粒能被探测以确定上述物品的真实性。另外的实施例包括放置少量特定类型的颗粒于处方或非处方药品中以鉴别或示踪药物。另外，颗粒可用作环境的、工业的、医药的或生物的示踪剂以研究某个系统如流体、材料等的配置的物理性质。本领域的技术人员将会认识到这些仅是许多可能性中的一些。
本发明的可以直接应用到其它领域的另一个方面是使用可以通过电场、磁场或相关场从而物理地操纵的光散射颗粒。我们给上述颗粒命名为可操纵的光散射颗粒(MLSP)，这些将随后详述。上述MLSP颗粒可以利用磁场、电场或相关电磁场在一维、二维或三维空间形成(be oriented)各种排列。这样，颗粒的独特的光散射性质可以用来形成某种图样、图像或色彩。借助于个体颗粒的光散射性质或最后所得到的光散射信息，形成特定排列的两种或更多种颗粒的光学标记，一种或多种MLSP颗粒的特定排列，可用来存储或转换信息。例如，分别散射蓝、红、绿光的三种不同颗粒放置于小区域或体积如荧光屏中的“像素点”里，此荧光屏包含特定数目的像素点于一个二维的阵列上。当被白光照明时，荧光屏形成一个彩色的或黑白的图像或类似于电视图像、视频图像、动画图像等的移动的图画。各个像素点或各组像素点是电场或磁场空间可达到的，因此，外加合适的电磁场，当适当照明时，散射蓝、红、绿光的个体颗粒会排列起来而产生具有一定色调和强度的特定颜色。例如，在一外加电磁场下，红色和绿色颗粒聚集于非常微小的点上而蓝光散射颗粒则游离地分散于像素点的内部体积中。此像素点便会显现出蓝色。使用不同的电磁场对红光或绿光散射颗粒能产生相应的效果。这样，通过特定地排列各个像素点上不同的颗粒，所需的颜色便可产生。此方法和设备为当前基于阴极射线管的图像信息技术等具有许多吸引人的优点。
在另一个实施例中，MLSP颗粒通过适当调节电磁场从一种特定的排列转换成另一种排列。例如，能产生绿色和红色散射光和/或还具有两种不同等级散射光强度的反对称银颗粒可使用如下：一个或多个颗粒放置于液体型的或固体型的材料的特定位置，此处颗粒能旋转，即是，当外加电磁场于包含颗粒的材料或装置时，颗粒能重新排列。颗粒的不同排列预示着不同类型的信息，这依赖于有多少颗粒被使用及仪器的所需功能。例如，在某种排列，反对称MLSP颗粒的光散射性质表示“关”或二进制编码系统中的0，而在另一不同位置或排列，光散射性质表示“开”或二进制中的1。反对称MLSP颗粒的排列可通过改变电磁场来改变以达到材料或装置中颗粒的所需排列。当光与这些有特定排列的颗粒相互作用，散射光的性质预示着某种上述的特定信息。照这样，可以做成简易的和多组件的光学转换器，它们在电信及相关领域是有用的。类似地，一系列的这种转换器能装配成串列的或并行的样式以存储和处理更复杂的信息。
新型的信息存储器件可以通过利用不同类型和/或排列的光散射颗粒和MLSP颗粒加密或存储信息而制成。例如，光学存储盘能被制造出来，它类似于本领域所已知的“硬盘”或“CD-R0M”盘等等。这里不是用压膜装置(bumps)投射到上表面来对信息编码，而是采用颗粒。颗粒可以置于任何材料上，只要颗粒的光散射性质能被探测到。照这样，存储更多的特定的信息及存储高密度信息是可能的。
本领域的技术人员将认识到，能用各种特殊应用中的光散射颗粒建造多种不同的设备。上面的实施例仅是金属样颗粒和MLSP颗粒用于分析、诊断探测领域之外的许多途径中的一些。这些应用通过这里公开的内容而成为可能，申请人特此对这里所描述的本发明的各个部分在诊断分析领域外的实施要求拥有专利权。液态样品的SpectraMetrix光谱仪及操作理论的描述
SpectraMetrix光度计是一种直角(right angle)光度计，它测量与激发光束成直角的散射或发射光的光强。此仪器的示意图给出于图21。光源是显微镜照明器或任何其它类型的光源。这仪器有无单色仪也可以使用。用于连接不同光源的连接器装备于光度计上。散射光或发射光用光电倍增管(PM)探测。光度计有个手动光闸，用来防止在更换样品时光进入到PM管中。光学滤波片或起偏振片当需要时可引入到入射或发射光路中。各种直径的圆柱形小容器(cuvets)(例如试管)用来作样品室。当然，任何类型的透光的样品容器辅以合适的支架也可以使用。采用直径为6mm×50mm的试管和带有红外(热)滤波片的显微镜照明器以得到本文所报告的数据。
照明器可以直接连接于光谱仪或先经过一单色仪再连接。用于本文所报告的测量的单色仪是一个衍射光栅单色仪。照明器用一稳定的6伏特，3安培直流电源驱动。
在此段中，我们描述无需单色仪操作的仪器的光学系统。一个×10的物镜把从照明器来的光聚集到样品管上。一个集光透镜(焦距23mm，直径19mm)，置于与激发光束成直角的位置上(离样品室中心约1．5英寸)，使样品管的像聚焦于离样品管中心约106mm远的地方。这段距离使得光闸和滤波片支架能放置于集光透镜与PM管之间。带有一个直径为3．25mm的孔(用#20的钻头制作)的挡板放置于像平面。PM管放在挡板后面。挡板阻挡从容易壁上反射来的光并仅允许从样品体积中心散射来的光到达PM管。挡板当减少了到达PM管的散射光的量的同时，也增大了信号本底比率。为了进一步降低探测从样品管反射过来的光，管被置于相对于垂直方向约40-50度的角度上使得反射光不能到达集光透镜。由于这角度和折射率效应，出射于管的光并不通过集光透镜的中心轴，像平面上散射光束从集光透射的中心轴向下移动。这需要将那直径为3.25mm的孔和PM管也从集光透镜中心轴向下移动。此装置制造成可以手动调节向下移动，以达到散射光的最佳探测效率。
当单色仪被采用时，其光学系统除与上述相同外，需用附加的透镜(焦距23mm，直径19mm)置于l0×物镜和单色仪出射狭缝之间。此透镜离样品室中心4英寸。单色仪的出射狭缝离样品室中心5.6英寸。照明器在单色仪入射狭缝处与连接器连接。光度计光学系统的调节
a．置一60nm、4×10-12M的金溶胶(gold sol)于一个6×50mm的在光谱仪样品支架上的温育管中心。相对于垂直方向调节管的角度使其在40到50度之间。放置此有一定成角的管以使已聚焦的激发光束穿过容器的中心。勿使激发光束射到管的前表面(面向集光透镜的表面)，因为这会增加输入到探测系统的反射光的量。
b．调节集光透镜与样品管中心的距离使得在离样品管中心106mm远处形成管壁的清晰的像。散射光束和样品管壁的像能在离管中心106mm处放置的白纸上清楚地看到。在像平面上，管的像的直径约为8到10mm。透镜需合适放置以便得到清晰的容器壁的像。在像平面上，散射光束显得有点模糊，这是由于此光束的有限宽度。透镜的最佳位置是离样品室中心约1.5英寸。激发光束当它穿过散射溶液时可以被清楚地看到。
c．上面对集光透镜位置的调节，是在把包含光闸、滤波片支架和挡板支架的构件从仪器中移开的条件下进行的。当透镜正确地放置后，将后面的构件复位并插入带3.25mm开孔的挡光隔板。PM管接入到位。
d．在步骤a、b和c后，如下调节光闸(aperture)相对于集光透镜光学系统的位置。放置一块白纸于一处，此处也就是当PM管接入后，其光电阴极平面将定位的地方。在光散射金颗粒置于样品室(Compartment)的条件下，调节光栏位置直到在PM管上可以看到的光为最大量。当光栏恰当放置后，光在纸上显示出直径为0.32英寸(8mm)的点。实施例
实施例1到10包含测量从颗粒散射来的或从荧光分子发射出的或两者兼有的光。用于测量光信号的仪器是一个用前面所述的SpectraMetrix制作的光度计。
实施例1到实施例3，用于这些测量的聚苯乙烯颗粒是NIST可示踪的经检定的纳米球(nanospheres)，购买于Duke ScientificCorp_Palo Alto，CA.金颗粒购自Goldmark Biologicals，Phillipsburg，N.J_英国Biocell Intl.Cardiff UK.的一个分销商。
实施例4到实施例10，荧光素购自Molecular Probes Inc_Eugene Oregon，金颗粒购买于Goldmark Biologicals，Phillipsburg，N.J_英国Biocell Intl_Cardrff UK.的一个经销商，Polystyrene颗粒购买于Interfacial Dynamtcs Inc_Portland，Oregon。
形状与尺寸相同但组合物不同的颗粒的相对光散射能力，可通过对比垂直于入射光路方向的散射光强而直接比较。如果已知浓度的各所考察的颗粒的光散射强度的测量是在直角方向观察而完成的，则浓度相同，尺寸、形状相同但组合物不同的颗粒的光散射强度能直接比较，并且不同颗粒的相对的总光散射本领也确定了。实施例1、2和3-可比较的聚苯乙烯和金颗粒的计算的和测量的相对散射能力
结果显示于表6、7和8。计算利用已知的光散射关系和前述的我们新定义的关系进行。对于水中颗粒的实验测量，通过在给定照明强度和波长条件下利用SpectraMetrix光度计探测被溶液中游离颗粒散射的光而完成。执行下面的步骤。
(a)用相同的入射光组成和强度照明对照物和可比较尺寸的颗粒。
(b)确定从一个装有水但无颗粒的对照管发射出的光信号。
(c)确定从一个装有已知浓度的颗粒的管发射出的光信号。
(d)将对照管的光信号值从(c)中的光信号值中减去。
(e)比较相同浓度的金和聚苯乙烯颗粒的光信号。实施例4-测量所得的荧光素与金颗粒相对的信号产生能力－白光照明
结果显示于表10。探测光的相同方法被实际用来确定在6mm×50mm的玻璃中所有样品发射的光信号。在测量来自金颗粒或荧光素的光信号时，没有使用光学滤波片。
所有测量均在水中进行，包含荧光素的溶液其pH值为8-9。仅包含水的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施：
A．(a)用相同组成和强度的入射光照明所有样品。
   (b)确定包含水但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
   (c)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
   (d)将对照光信号值(b)从光信号值(c)中减去。
来自荧光素的光信号的测量按下面步骤实施：
B．(a)如上用相同组成和强度的入射光照明样品。
   (b)确定从对照管发射的光信号。
   (c)确定从管中已知浓度的荧光素发射的光信号。
   (d)将对照光信号值(b)从光信号值(c)中减去。
C．(a)比较从已知浓度的颗粒和荧光素分子得到的光信号。实施例5-荧光素和金颗粒的测量得的相对信号产生能力-单色照明
结果给出于表11。这些结果没有作入射光不同强度方面的修正。采用其波长能使荧光素发生最大光发射(490nm)及使金颗粒发生最大光散射的单色入射光。波长为490nm的入射光强度稍微低于用于金颗粒的强度，其强度在波长520nm入射光时，强度为86％，在波长为565nm入射光强度时为80％。在另一方面，光电倍增管的量子效率从0．34变化到约0．18，前者对应于荧光物质的基本发射波长(520nm)，而后者对应于560nm波长。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。在金颗粒或荧光素的光信号测量中均没有使用光学滤波片。
所有测量均在水中进行。包含荧光素的溶液其pH值为8-9。仅包含水的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素光信号值中减去。以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施：
A．(a)确定包含水但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
   (b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
来自荧光素的光信号的测量按下面步骤实施：
B．(a)确定从对照管发射的光信号。(b)确定从已知浓度的管中荧光素发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
C．(a)比较从已知浓度的颗粒和荧光素分子得到的光信号。实施例6-荧光素、聚苯乙烯、聚苯乙烯-荧光物质化合物及金颗粒的测量得的相对信号产生能力
结果给出于表12。这些结果没有作入射光不同强度方面的修正。
所有样品均用单色入射光照明。直径为100nm的金颗粒用单色入射光照明，所用波长在使颗粒发生最大光散射的波长附近。聚苯乙烯-荧光物质化合物用能发生最大荧光激发的波长(490nm)的单色入射光照明。此荧光物质化合物的最大荧光发射发生于515nm。此490nm处的入射光强度为555nm处光强的80％。光电倍增管的量子效率在555nm时约为515nm的60％。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。在金颗粒或荧光颗粒的光信号的测量中均没有使用光学滤波片。所有测量均在水中进行。仅包含水的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光物质颗粒光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光物质或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施：
A．(a)确定包含水但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
   (b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
来自荧光颗粒的光信号的测量按下面步骤实施：
B．(a)确定从对照管发射的光信号。
   (b)确定从已知浓度的管中颗粒发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
C．(a)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。实施例7-高血清浓度下直径为59．6nm的金颗粒和荧光素的探测
结果给出于表17。血清购买于Biowhittaker Inc_Walkerville，MD。血清在出售前已经用一1微米过滤器过滤，并且是透明的、显现出稻草色彩。对于荧光素测量，血清的pH值被调节到约9到9.5。包含金颗粒的溶液用波长为543nm的单色入射光照明，这波长接近使颗粒发生最大光散射的波长。包含荧光素的溶液用波长为490nm的光照明，此波长能使之发生最大的荧光激发。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。在金颗粒或荧光素的光信号的测量中均没有使用光学滤波片。
测量在规定浓度的血清中进行。仅包含原有浓度的血清的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施：
A．(a)确定包含原有浓度的血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
   (b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
来自荧光物质溶液的光信号的测量：
B．(a)确定从对照管发射的光信号。
   (b)确定从已知浓度的荧光素的管发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
C．(a)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。实施例8－在92.8％血清浓度下荧光素、金颗粒和聚苯乙烯颗粒的探测下限
结果给出于表18。对于荧光素测量，发射于包含荧光素的样品的光信号在碰到光电倍增管前通过一个kodak No.16 Wratten过滤器。荧光素溶液的最大光强在波长为498nm的单色入射光下观测到，而金颗粒的最大光散射在554nm处观测到。在金颗粒或聚苯乙烯颗粒的光信号的测量中没有使用光学滤波片。对荧光物质测量时，血清的pH值调节到约为9。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用于在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。
测量在规定浓度的血清中进行。仅包含原有浓度的血清的管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素的光信号值中减去以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施：
A．(a)确定包含原有浓度的血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
   (b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
来自荧光物质溶液的光信号的测量按下面步骤实施：
B．(a)确定从对照管发射的光信号。
   (b)确定从已知浓度的荧光素的管发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
C．(a)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。实施例9－聚苯乙烯、聚苯乙烯-荧光物质混合物和金颗粒在高血清浓度下的探测极限
结果给出于表19。测量在规定浓度的血清中进行。仅包含原有浓度的血清管子的光信号值需要从金颗粒或荧光素颗粒的光信号值中减去，以得到仅仅起因于荧光素或金颗粒的光信号。没有进行光学滤波。
来自颗粒的光信号的测量按下面步骤实施：
A．(a)确定包含原有浓度的血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。(b)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
   (c)将对照光信号值(a)从光信号值(b)中减去。
   (d)比较从已知浓度的颗粒得到的光信号。
除入射光波长外，相同的探测光的方法用在6mm×50mm的玻璃管中的所有样品。血清描述于实施例7。实施例10－在金颗粒浓度低的情况下，血清对金颗粒的光散射性质没有影响
结果显示于表20。浓度为95.7％的血清是透明的，呈稻草色彩，并且每一厘米路径长度上对波长为543nm的入射光有0.14的吸收率。光散射测量在内径约为5mm的6mm×50mm的玻璃管中进行。根据对波长为543nm的入射和散射光吸收的差异，来自血清样品中金颗粒的光散射信号应粗略地是来自水中相同浓度的金颗粒的信号的80％。本例中没有用光学滤波片。
执行下面的步骤：
(a)用相同组成和强度的入射光照明所有样品。
(b)确定包含水或原有浓度血清但不包含颗粒的对照管发射的光信号。
(c)确定包含已知浓度颗粒的管发射的光信号。
(d)将对照光信号值(b)从光信号值(c)中减去。
(e)比较从含有相同浓度金的血清和水来的光信号。实施例11-16nm金颗粒悬胶液的制备
2.5ml的无菌水加进0.1g HAuCl4·3H2O中形成一4％的HAuCl4·3H2O溶液。此溶液经离心分离以去除颗粒状物质。在一个单独的瓶中，10ml的无菌水加进0.1g的柠檬酸钠中形成1％的柠檬酸钠溶液。此柠檬酸盐溶液经一0.4M的聚碳酸酯膜过滤器过滤以去除颗粒状物质。100ml无菌水和0.25ml 4％HAuCl4·3H2O加入一个非常干净的250ml锥形烧瓶(Erlenmeyer flask)中。此瓶放置在一个定位于4的搅拌电炉(stir hot plate)上并盖上一个100ml的烧瓶。当混合物开始沸腾时，加入2ml 1％的柠檬酸钠。溶液在加入柠檬酸盐后片刻(1分钟之内)便变成黑色。随后它又变成紫色最后是深红色。此红色是在加入柠檬酸盐溶液后约2分钟得到的。让此混合溶液再沸腾30分钟然后冷却到室温，加入无菌水使总体积达到100ml。最终的金浓度约为0.005％而颗粒浓度为1.2×1012颗粒/ml，假设所有金盐转变为金颗粒。实施例12－用聚苯乙烯化合物将金属颗粒稳定化
将1克PEG化合物(20，000分子量)加进100ml无菌水中形成1％的PEG化合物溶液，并利用一50ml注射器将此溶液经一0.4μ的聚碳酸酯过滤器过滤.为稳定其给定体积的颗粒，将此体积的颗粒溶液加进某体积的1％PEG化合物溶液中并使最终的PEG浓度为0．1％。实施例13－从直径为5nm的金颗粒制备30nm的包被有银的颗粒
使10ml无菌水在一30ml烧杯中沸腾。然后将2mg明胶慢慢地加入，使溶液在搅拌下继续沸腾，直到所有明胶溶解。随后将溶液冷却至室温。加入pH值为5的2ml 47％的柠檬酸盐缓冲液。将0.18ml包含5nm金颗粒的溶液(金浓度约为0.005％，3.8×1013金颗粒/ml)加入，跟着加入3ml 5.7％的对苯二酚溶液。将此混合物调好，跟着加入无菌水使最终的体积为20ml。将50μl 4％的乳酸银溶液以10μl递增方式加入，并用手迅速搅拌混合溶液。最终的银浓度约为0.005％，最终的有银包被层的颗粒浓度约为3.4×1011颗粒/ml。假定所有加进去的银平均地沉积于各个金颗粒上，则颗粒尺寸计算得为30nm。在最后的添加之后，此溶液在室内光线下显现出亮黄色。在窄束白光照明下，光被盛在6×50mm的玻璃管中大量的上述溶液的稀释液散射时是蓝色的。当此银溶液的稀释液在DLASLPD条件下用10×物镜和12.5×目镜的SpectraMetrix显微镜作显微观察时，可以容易地看到不同颜色的光亮颗粒的混合物。在数量上占主要的颗粒是紫蓝色颗粒。通过调节这里所描述的过程(procedure)中我们所使用的直径为5nm的金颗粒浓度，我们制造出直径为20～100nm的包被有银的颗粒。实施例14－形成并检定于显微镜玻璃载片上的非球形银颗粒的散射光性质
将一小滴稀释的按描述于实施例13的方法制备的银颗粒溶液放置在一显微镜玻璃载片上盖以盖玻片以在此盖玻片与显微镜载片之间形成一层很薄的膜。当银溶液薄膜的一小点被极窄的光束照明并用肉眼观察时，在一个避免入射光进入眼睛的角度，被照明的小点有蓝色散色光出现。然后，在DLASLPD条件下，用一个带10×物镜和12.5×目镜的光学显微镜对此银溶液膜作显微观察。可观察到，几分钟功夫，多数颗粒便附着并固定于玻璃载片和护罩玻璃的表面。最丰富的是蓝色颗粒。然后我们发现，当用一细小探针挤压护罩玻璃上某点时，受挤压区域中的颗粒永久地由它们原始的蓝色改变颜色(散射光探测)。在受挤压区域中心，颗粒是红色的。此中心点被不同颜色的同心圆所围绕。自此中心向外，颜色从红色到绿色、黄色、蓝色变化。红色、绿色和黄色颗粒非常明亮。我们所作的理论计算表明，小的银颗粒呈蓝色。挤压的效果好象是改变了颗粒的形状。我们的结果因之表明，小的银颗粒通过改变其形状，其原始的蓝散射光颜色能转换为其它的散射光颜色。通过移动护罩玻璃，我们发现，我们能将受挤压区域中的带不同颜色的颗粒分散到液相中去。在此相中，颗粒作布朗运动，被绿色及红色颗粒散射的光是闪烁的，这对非球形颗粒是在预料之中。实施例15
将24mg的盐酸羟胺加到1ml无菌水中，搅拌，然后经连接于一10ml的注射器的4μ聚碳酸酯膜过滤器过滤，制得盐酸羟胺溶液。将2.5ml无菌水加到在一试管中的0.1g HAuCl4·3H2O里，搅拌，然后用离心分离方法去除颗粒状物质。制得4％的HAuCl4·3H2O溶液。将25ml无菌水加进一250ml的锥形烧瓶中，跟着，根据所希望得到的颗粒尺寸，按表1显示的量加入16nm金颗粒。下一步我们按表1给定的量加入4％HAuCl4·3H2O溶液。最后，我们加入无菌水使总体积为100ml。然后，按表1所给定的量加入盐酸羟胺溶液同时用手快速搅拌，并使混合剂静置(sit)30分钟。在加进盐酸羟胺后片刻，溶液便从透明、稍微粉红色变成最终的透明红色或暗褐色，这依赖于颗粒尺寸。较小的尺寸给出红色溶液。
表1
所希望得到的金颗粒直径，nm  16nm金溶液ml  HAuCl4·3H2O溶液，ml 羟胺溶液ml
    40     6.4     0.234     1.25
    60     1.9     0.245     1.25
    80     0.8     0.248     1.25
    100     0.41     0.249     1.25
更大直径的颗粒可按上述相同的过程制备，但是使用溶液的规定量描述于表2，并且采用直径为100nm的金颗粒溶液而不16nm金溶液。
表2
所希望得到的金颗粒直径，nm 16nm金溶液ml 4％HAuCl4·3H2O溶液，ml 羟胺溶液ml
    200     12.5     0.219     1.25
    400     1.56     0.246     1.25
    600     0.436     0.249     1.25
    800     0.195     0.25     1.25
    1000     0.1     0.25     1.25
    2000     0.012     0.25     1.25
实施例16－由16nm金颗粒制备包被有银层的颗粒
将25ml无菌水加到一250ml锥形烧瓶中，跟着加入6.4ml 0.005％的16nm金颗粒溶液并将最后得到的溶液搅拌。然后加入0.234ml40mg/ml L(+)乳酸银盐溶液。立刻便能看见深紫色。加入足够的无菌水使总体积为100ml。用手快速搅拌的同时，加入1.25ml 24mg/ml的盐酸羟胺溶液，最后得到的溶液呈现淡紫银色。将一小滴此溶液置于玻璃载片上，用盖玻片盖住，并在DLASLPD条件下用光显微镜观察。能看到红色的、绿色的、紫色的和黄色的颗粒。这些颗粒的稀释溶液在一试管中用白光照明时，其散射光为冰蓝色。实施例17－包被有BSA玻璃载片的制备
建立一个模型系统以研究信号和颗粒各种组合的探测参数以及探测固相上颗粒的照明及探测方法，正如固相分析中一样。
这系统包括，首先用牛血清白蛋白(BSA)包被玻璃载片，然后沉积不同量的金颗粒于特定区域以研究各参数。这里我们讨论我们用来将BSA包被于载片的方法。
将1.5g BSA加到15ml无菌超纯水中搅拌然后将此溶液用一0.44mm的聚碳酸酯膜过滤，制得10％的BSA水溶液。将20μl的此10％BSA溶液加到l0ml无菌水中并将此BSA溶液经一0.4mm的聚碳酸酯膜过滤，制得0.02％的BSA(200μg BSA/ml)溶液。
用蘸有甲醇的刷子擦洗，将普通的显微镜玻璃载片弄干净。擦洗后，利用塑料喷射瓶用无菌水喷射载片以清洁载片。将此载片浸没于一盛有0.02％BSA无菌水溶液的烧杯中并温育一小时，玻璃载片便包被上BSA。然后，将载片从烧杯中取出并用喷射器中的无菌水喷射漂洗。载片两面均漂洗。然后将此载片浸没于盛满无菌水的150ml烧杯中约10分钟。再次喷水漂洗。将游离BSA从载片上去除是很重要的，因为游离BSA阻碍金属颗粒结合于有包被层的载片。然后将包被有BSA的玻璃载片弄干并干燥保存于一干净的塑料盒中。实施例18－沉积金颗粒于BSA载片上
用金刚石划线器在包被有BSA的玻璃载片上划些小圆圈(直径约8mm)以对沉积金颗粒的区域作标志。3μl未加保护层的含所需金颗粒浓度的金颗粒溶液沉积于载片上已作标志的其中一块区域上。金颗粒溶液沉积于实际的刻划标志的反面以避免金颗粒溶液与刻划标志相互作用。
为在玻璃载片上制备一系列的金颗粒斑点，并且此处金颗粒密度有次序地降低，这需要使这系列斑点在载片中心成一直线。为达到这种排列，我们将载片固定在我们制作的一个支架上，这使得我们能沉积金斑点成正确的排列。应该指出，这些斑点在室内光线下看不见(即是，颗粒密度太低以致它们在室内光线下没有颜色)。我们就因此原因需要在载片的那面作标志以鉴别斑点的位置。制作标志是因为我们要沉积颗粒。为形成一颗粒斑点，我们沉积3μl未加保护层的已稀释到所需浓度的金溶液。然后载片在一封闭的塑料盒里温育一段规定的时间。盒内壁和盒底用湿纸巾包被以防止载片上金溶液蒸发。然后取出载片并用一巴斯德吸管喷射无菌水漂洗。我们已发现，为使金颗粒以最大效率结合于载片上的BSA，金颗粒溶液的pH值应调节到BSA的PI值(PI=4.58～5.45)。实施例19－微阵列分析性分析-结合包被有BSA-生物素的60nm金颗粒于塑料基片上分立个体的直径80微米的链霉抗生物素蛋白斑点
制备下面的溶液，将2mg的BSA-生物素加到2ml无菌水中制成1mg/ml的BSA-生物素溶液并在室温下一个500ml锥形烧瓶中以蒸馏水为背景透析。水需更换4次。最后那次更换用无菌水。20mM的Tris-盐水，0.1％的PEG化合物，0.02％的叠氮化钠pH值为7.4的缓冲溶液也已制备。所有溶液均经0.4μ的聚碳酸酯膜过滤器过滤。聚苯乙烯试管利用喷射器用无菌水清洗好，倒入4ml直径为60nm的金颗粒溶液并在分析离心器中离心分离半小时。
然后，如别处描述的那样清洗颗粒。柔软的球粒在10ml无菌水中重悬浮。
金溶液的pH值调节如下。将100μl 1％的PEG化合物溶液加进一干净的聚碳酸酯试管中。再加入1ml 60nm金溶液并温育2分钟。0.02M的K2CO3以2μl递增形式加到金溶液中直到pH值为6.6。然后计算出调节剩下的金溶液pH值所需0.02M K2CO3的数量并加进金溶液中。在本例中其数量为80μl。将9.5ml pH值为6.6的金溶液加到聚碳酸酯管中的1.15ml 1mg/ml的BSA-生物素溶液中，并在室温下温育5分钟。随后将此溶液在分析离心器中作离心分离半小时，于是浮在表面的东西被倒出。剩下的柔软球粒在3ml无菌水中重悬浮并如前述一样作离心分离，倒出浮在表面的东西，并重悬浮于0.1％的PEG化合物溶液中，再作离心分析。倒出浮在表面的东西，球粒重悬浮于20mM的Tris-Saline，1％PEG化合物溶液中并作离心分离，于是倒出了浮在表面的东西，留下约200μl的柔软球粒。将50μl的此溶液加进包含有直径为80μ的链霉抗生物素蛋白斑点的塑料孔中，并使孔在一潮湿的盒(chamber)中温育一个晚上。然后利用巴斯德吸液管用无菌水喷射清洗数遍并去除孔中的水。为使用显微镜探测，孔中装有60μl无菌水。实施例20－探测结合在包被有直径为80微米的链霉抗生物素蛋白结合位置的微阵列上的包被有BSA-生物素的60nm直径金颗粒
将BSA-生物素-金结合剂的悬胶液(60nm金颗粒)加到塑料孔中，此孔底表面含有直径为80μ的链霉抗生物素蛋白点的微阵列。经合适的温育时间后，清洗此孔并在DLASLPD条件下用我们所发展的光显微系统观察。我们观察到标记有BSA-生物素-金的颗粒结合于个体的80μ点上。80μ的链霉抗生物素蛋白点在加入颗粒前是看不见的，现在呈现为明亮的、相当圆的点。温育不同时间或使用不同的BSA-生物素-金浓度，可以得到包含不同密度BSA-生物素-金颗粒的个体点。利用我们的放大倍数约为200×的显微镜，我们能很容易用眼探测到，结合于链霉抗生物素蛋白点的低结合密度的个体颗粒。为了计数和从个体的80μ点来的积分光强度自动化，我们试验视频图像处理软件，这是我们从圣地亚哥(San Diego)这里的一个公司24小时借助的。我们使用以下器材获取视频图像，一个昂贵的黑白视频摄像机，一个视频帧捕获器，和一台简易的台式计算机成像器(imager)，后者包被在阵列装置孔中的25个个体点。此软件能测量各个点(spot)的总光强度，也可测量各个体点的颗粒数目。例如，一标记有低密度BSA-生物素-金结合剂的链霉抗生物素蛋白点可以用此视频成像系统的颗粒计数模式分析。为得到信号相对于本底的一些概念(idea)，一块80μ直径的固相区域点不要用链霉抗生物素蛋白包被上，用来分析以确定本底。在此初步的模型系统中，在非最佳照明和探测条件下，当点上标记密度约为0.06颗粒/μ2时，其信号/本底为317/25～13。基于此非最佳初步数据，这些数据暗示当信号/本底为3/1时，颗粒密度为0.015颗粒/μ2是可探测的。在更佳的条件下，灵敏度的较低等级会更低。实施例21－薄膜上金颗粒的探测灵敏度
60nm金溶液以倍数10稀释，将20μl各稀释液沉积于包被有BSA的载片上形成点。载片不加盖玻片，置于油浸的Porro棱镜上。各个金溶液点直径约为4mm。下表给出各点上的相应信息。
金溶液M 颗粒/ml 点直径(mm) 颗粒的# 观察结果*
3×10-11 2.3×1010     12.4 4.6×108 非常强黄色
3.8×10-12 2.3×109     12.8 4.6×107 强黄绿色
3.8×10-13M 2.3×108     11.4 4.6×106 弱但能探测绿色
*用眼观察下面用临床分析应用中更为有意义的单位表达出上面的数据。点上液体的高度可用此表达式算出：
            h=V/A此处V为点上液体的体积(20ml=0.02cm3)而A为点的面积(以cm2作单位)。取A=1.2cm2，我们得h=0.016cm=160μm。此高度远小于眼或我们的电子的和光学的探测方法的景深，因此各个点表现得(从几何观点看)好象所有颗粒均在载片表面上，表中报告的灵敏度与所期望的颗粒沉积于表面的灵敏度相似。
金M 点面积，cm2 点面积，μ2 每点上颗粒 #每μ2上颗粒 *点的强度
3.8×10-11     1.2 1.2×108 4.6×108 3.83 非常强，黄色
3.8×10-12     1.2 1.2×108 4.6×107 0.35 强，黄绿色
3.8×10-13     1.2 1.2×108 4.6×106 0.038 弱但能探测，绿色
*用眼探测
#此栏由每点上颗粒数除以点面积而算得。实施例22－60nm金颗粒沉积于包被有BSA的玻璃载片表面
制成一系列60nm金颗粒溶液的稀释液，并将3μl的各稀释液沉积成小点于包被有BSA的载片上。这些点在同一载片上排成一排。载片在一潮湿盒中温育6.5小时，然后用无菌水漂洗。各点上的颗粒密度可在DLASLPD条件下通过颗粒计数在一光显微镜中确定，此显微镜有一带已校准的标度线(reticle)的目镜。下面显示出我们的结果。
           沉积浓度     所沉积的颗    #每100微米2
区域号码   颗粒/ml*     粒的总数目    上的颗粒
1          2.3×1010    2.3×108      460
2          2.1×109     2.1×107      41.8
3          7×108       7×106        13.9
4          3.5×108     3.5×103      7
5          1.75×108    1.75×103     3.48
6          8.75×107    8.75×105     1.74
*沉积浓度为置于一点上的未加保护层的金溶液浓度。
#每平方微米颗粒数－这给出了每100平方微米上的颗粒数目，如果沉积于某特定区域上的溶液中所有颗粒变得附着于载片上的话。溶液包被的区域其直径约为8mm。其面积为A=3.1416
*(·4)2cm2=0.5cm2=0.5×108μm2。
6.5小时后，轻轻地喷射无菌水于载片上各个包含金的区域以清洗载片。和冷档的热枪(heat gun on cold setting)使载片干燥。在DLASLPD条件下用一光显微镜观察已干燥的载片，各区域上的颗粒密度用显微镜目镜上已校准的标度线计数颗粒/标度线方格(reticle square)而确定。下表显示了结果。沉积的颗粒    用标度线计数的颗   每100μm2上
样品    目测(Eye)*    /100μm2    粒(面积，μm2)#    计数的颗粒
1       非常强黄绿色     460        20**(39)          51.2
2       强黄绿色         41.8       7(39)             18
3       相当强黄绿色     13.9       13(100)           13
4       没有探测到强度   7           0                 0
5       没有探测到强度   3.48        0                 0
6       没有探测到强度   1.74        0                 0
*   目测－这是在DLASLPD条件下用显微镜照明器激发并从载片
    特定区域上的金用眼观察的光强。
**  此区域中的颗粒数目太多以致很难计数，列出于此处的计数其误差可能有2×那么大。
#   列出于括弧中的面积是用于颗粒计数的物镜和其它光学装置中1个标度线方格的面积。
  样品 每平方微米上的计数颗粒     目测
    1     0.512 非常强黄绿色
    2     0.18 强黄绿色
    3     0.13 相当强黄绿色
    4     0 没有探测到强度
    5     0 没有探测到强度
    6     0 没有探测到强度
实施例23－60nm金颗粒的小液体点强度的目视探测灵敏度
制备3.4×10-12M(0.005％金)60nm金溶液的两个稀释液，2ml的各个稀释液沉积于玻璃载片上分立的点上。各点直径约为4mm(面积=6.28×106m2)。不同的点在同一载片中间成一排。各点中颗粒浓度和密度显示于下表。
金溶液M           颗粒/ml       颗粒/μl      颗粒/μ2
3.4×10-12M      2.1×109       2.1×106      0.31
1.05×10-12M     1.05×109      1.05×106     0.155
0.5×10-12M      0.5×109       0.5×106      0.077
0.25×10-12M     0.25×109      0.25×106     0.0385
为了从用肉眼探测到的散射光强度中确定最低的颗粒密度，我们通过浸没油将载片置于一个Porro棱镜上。各点仍是液态，用在光纤末端带有×10物镜的Baush-Lomb照明器来的光顺次照明。照明器产生的点直径约为4mm。在暗室中，夜里，我们能看到小至0.0385，尽管后者刚好仅仅能看到。实施例24－光电二极管探测Immulon Plastic microtitier孔中不同浓度的60nm金颗粒(在悬胶液状态下)的灵敏度
60nm金溶液的不同稀释液置于不同的Immulen孔中(每孔200μl)。为探测散射光强度，孔的底部用从安装有×10物镜的Leica显微镜照明器来的白光照明。孔的底部离物镜几毫米。光经过物镜后形成一光束聚焦于孔中心。焦点上光束直径约为5mm。散射光用一光电二极管探测，此光电二极管安置以探测从孔的侧壁探测光(直角探测)。散射光通过安置于光电二极管前的一个小孔(直径约1mm)探测以限制本底光探测。盛有不同金溶液稀释液的孔相互连接，并且各个孔可以顺次安放在照明和探测路径中。光电二极管的输出用一工作于电流模式的运算放大器测量。运算放大器的反馈电阻决定了此放大器的灵敏度。光电二极管工作于光伏模式(photovoltaic mode)。制备两份60nm金稀释液，用光电二极管测量强度。
a．第一份稀释液
母溶液(3.8×10-11M)以倍数2稀释。可以得到下面的读数。读数用运算放大器的反馈环中的一个5兆欧的电阻实现。
金颗粒浓度    强度(伏特数)
1.9×10-11M   3.27
0.95×10-11M  1.6
4.75×10-12M  0.89
2.38×10-12M  0.44
1.2×10-12M   0.24
0             0.075
b．第二份稀释液
-×11的稀释溶液(3.4×10-12M)以倍数×2稀释。结果如下
金颗粒浓度    强度(伏特数)
3.4×10-12M   0.614
1.7×10-12M   0.378
8.5×10-13M   0.198
4.25×10-13M  0.147
2.13×10-13M  0.100
1.06×10-13M  0.086
0             0.075
上述结果表明，在孔中，我们能探测1.9×10-11M～1×10-13M的直径为60nm的金颗粒。此范围的上限可以拓宽。实施例25－沉积和目视探测(积分散射光强度)沉积于一包被有BSA的玻璃载片的60nm金颗粒的重复性(reproducibility)
将3μl 0.005％金(60nm)溶液的2×稀释液沉积于包被有BSA的载片上5个点的各点上。载片温育5分钟，然后放入一盛有150ml蒸馏水的烧杯中。这些水将未结合的金从载片上清洗掉。然后这些点用我们的照明器(白光Spectra Metrix照明器)照明。各点上的金颗粒以一个环的形式存在(即颗粒在这些点上分布不均匀但受限于一个环)，这种存在形式散射绿光，在暗室中用肉眼便能清楚地看到。
此实验用一新的包被有BSA的载片重复做，不同的是在温育金斑点的过程中，用手指轻敲载片边搅拌金颗粒点中的液体。5分钟后，将载片放到烧杯里的150ml无菌水中，各点的散射光利用白光Spectra Metrix照明器交替地观察。照明器在载片上产生一直径约5mm的光点。在金溶液沉积的地方，金颗粒通过散射光能清楚地看见。这些点通过将载片浸没在水中进行观察，这减少了载片上的不完整性的光散射。所有点均散射绿光并且用目视探测估计它们具有大致相同的强度。一个小的、非光散射的点(暗点)出现在各个点的中心。实施例26－不同金颗粒浓度下60nm金溶液散射光的颜色
用喷射瓶中无菌水漂洗六支8×50mm(1.6mL)的聚苯乙烯管。剩余的水通过抖动从各支管中去除，但不要把管干燥。然后将一金颗粒溶液(60nm，0．005％)顺次以倍数1、2、4、8、16和32稀释。各支管盛500mL金颗粒溶液。稀释了的金溶液在聚苯乙烯管中是稳定的(散射光长期不改变颜色)。没有凝聚作用的迹象。不同稀释液的散射光具有下面的颜色。用于此观察的金溶液用无菌水清洗数遍以去除盐(它们用于形成金溶液)，这些盐似乎使金颗粒不稳定。
稀释液 颜色
1 黄绿色
2 黄绿色
4 淡绿色
8 淡绿色
16 淡绿色
32 淡绿色
实施例27－用BSA稳定金颗粒
我们发现，为使金溶液稳定，则为抵消掉1％NaCl引起的凝聚作用，每毫升0.005％的60nm金溶液需要900mg BSA。实施例28－以高密度沉积60nm金颗粒于包被有BSA的玻璃载片上
此例表明如何在玻璃载片上沉积不同表面密度(25～100颗粒/μ2)的金颗粒的点。这些点将用于实施例30和31以确定，当用肉眼及用DLASLPD方法在光显微镜中观看时，来自这些点的散射光(白光照明)的强度、颜色和均匀性。
4m1 60nm金溶液(0.005％，3×1010颗粒/ml)在离心器中以最大速度作离心分离，直到所有金颗粒沉积于管底(约30分钟)。去掉浮在表面的东西并以倍数1、2和4稀释柔软球粒。我们估计，柔软球粒的颗粒浓度约为3×l011颗粒/ml。4ml的各个稀释液沉积于包被有BSA的玻璃载片上分立的点上，并让各个点的液体在室温下蒸发。沉积于各点的颗粒数目(假定×1的金溶液其浓度为3×1011颗粒/ml)显示于下表。应当指出，采用60nm金颗粒(饱和单层颗粒)所能达到的最大颗粒密度为354颗粒/μ2。
稀释液    沉积的颗粒#    颗粒/μ2*
1         1.2×109       100
2         6×108         50
4         3×108         25
*用颗粒/μ2作单位的颗粒密度是针对直径为4mm(4×103μ)
 及面积为12.6×106μ2的点计算的。
#针对4μl 3×1011颗粒/ml的60nm金溶液的沉积层计算。
溶剂蒸发后，在室内光线和DLASLPD照明(当用肉眼观察时)下观察各点的表现。DLASLPD照明含有一个Leica显微镜照明器。此照明器有一×10的物方聚焦透镜，它产生一窄束光聚焦于离物镜约10mm远的地方形成一个小点。点也用DLASLPD方法通过显微镜观察，此显微镜带有×2.5、×10、×25和×40物镜并附加×1.25、×1.6和
×2的放大倍数。用×10和×20物镜时，各点在一个时刻仅能看见一小区域。然而，用×2.5物镜则能看见整个点。为确定各点上的颗粒数目，我们数出经显微镜看见的在某给定面积上的颗粒数目，并将此数目除以面积。面积用安置于显微镜目镜的已用滑动千分尺校准的标度线确定。作为一个实施例，当颗粒计数用×40物镜和1．25及2的附加放大倍数(在目镜前)实现时，在目镜标度线上用于颗粒计数的单位方格分别为6.25μ×6.25μ(方格面积=39.1μ2)和10μ×10μ(面积=100μ2)。这些是物平面上的面积。实施例29－在空气中观察高表面密度金颗粒点
在本例中，按描述于实施例29制备的金颗粒点用DLASLPD照明作目视和显微观察。点是干燥的，金颗粒暴露于空气中。a．×1稀释液点
在室内光线下，点呈现出暗紫色，其中心有个直径小于1mm的较淡的点。在DLASLPD照明下，这些点呈现相当均匀的稍带白的橙色。点的强度很高。在DLASLPD条件下，点在显微镜(×10物镜，额外放大倍数×2、12.5目镜)中通过目镜观察，有一很强的橙色。个体点很容易看得见。可以看到，有些颗粒相互之间靠得非常近甚至相互重迭。大多数颗粒是橙色的但有些是绿色的。两个或更多个点相互之间分开的距离小于或约等于显微镜的空间分辨率则看起来象单个颗粒。如果颗粒之间的距离近到足以干扰它们的光散射性质，则看起来象单个颗粒的颗粒群其颜色不同于单个颗粒的颜色。在高颗粒密度下，可从理论计算预期，许多颗粒分开的距离将小于显微镜的分辨率。当用×10或×20物镜观察时，点的表现无多大变化。载片上点之外的区域(本底)比起强度大的点来是非常暗的。采用×2.5物镜，能看到整个点。它呈现很强的橙色，在边缘有一个小绿环。在橙色区域，颜色看起来相当均匀，尽管相同的斑点似乎比其它要淡。颗粒的表面密度在绿环上比橙色区域低得多。b．×2稀释液点
在室内光线下，点有一中度紫色的外环，其中心是一个约2mm的暗紫色点。在DLASLPD照明下，这些点呈现相当均匀的稍带白的黄色。点的强度很高。在DLASLPD条件下，点在显微镜(×10和×20物镜，×2额外放大倍数，12.5目镜)中通过目镜观察，有一很强的橙色，但此颜色没有×1稀释液那么均匀。有些斑点呈现淡绿色。距离靠得很近的颗粒能看得见。大多数颗粒是橙色的，但有些是绿色的，它们大量存在于绿色斑点中。当用×10或×20物镜时，点的表现并不多。比起强度大的点，点之外的区域非常暗。采用2.5物镜，能看到整个点。它呈现很强的橙色，在边缘有一小绿环。在橙色区域，颜色看起来相当均匀，尽管相同的斑点似乎比其它要淡。一些不均匀性起因于未作优化的照明系统的不均匀性。c．×4稀释液点
在室内光线下，点有一很淡的紫色，带有一个已偏移(displaced)到圆环一边上的小暗点(直径约1mm)。在DLASLPD照明下，这些点呈现相当均匀的稍带白的绿色。点的强度很高。在DLASLPD条件下，点在光显微镜(×10物镜，×2额外放大倍数，12.5目镜)中显得极不均匀，这很可能是溶剂蒸发不均匀所致。点的中心有很强的橙色或淡紫色。在此中心区域，颗粒之间靠得非常近甚至相互重迭，其中大多数颗粒呈橙色，一些呈绿色。远离中心之处，点呈现淡绿色，绿色颗粒占优势，还有一些橙色颗粒。从点的中心到边缘，交替出现绿色和黄色的环。比起强度大的点来，点之外的区域(本底)非常暗。采用×2.5物镜可以看见整个点。点呈现椭圆形，靠近中心有一个橙色或淡紫色的点(直径约1.5mm)。这围绕有交替出现黄绿色和绿色区域的强度高的环。边缘有一强度较低(但仍算强)的小环，呈明显的绿色。在此边缘区域，几乎所有颗粒都是绿色颗粒并能用×40物镜，额外放大倍数×2来计数。绿色颗粒区域中颗粒表面密度约为20颗粒/39.1μ2或0.5颗粒/μ2。当正好在边缘时，颗粒计数迅速降低，我们计数得约7颗粒/100μ2或0.07颗粒/μ2。此区域上颗粒的梯度使得我们能够作的颗粒计数高至约1颗粒/μ2的计数极限。对于空气中固定颗粒的结论
a．上面所描述的步骤使我们以高表面密度喷镀金颗粒从而形成小斑点(4mm)。在室内光线下观察时，喷镀结果并非象对于我们用来形成斑点的蒸镀方法所期待的那样完全均匀。
b．用光学显微镜在DLASLPD条件下观察，1倍和2倍稀释斑点相当均匀。对于4倍稀释，斑点显示非均一性较高。
c．斑点的颗粒密度似乎太高，致使颗粒计数没有意义(颗粒相距太近，不能将其分辨为单个颗粒)。然而，在4倍稀释斑点的周边能够对颗粒进行计数，并且此处的颗粒密度大约为0.5颗粒/μ2。这样的颗粒密度接近在我们所用显微镜分辨率下所能计数的最大颗粒密度。实施例30－利用水中高表面密度金颗粒进行观察
在实施例30中所用的载玻片浸入一烧杯内150ml的无菌水中。颗粒似乎未从载玻片上脱落，使用10倍物镜作为显微镜照明器，可以使一束细光对浸入水中载玻片上的每一个金斑点分别进行照明。斑点的颜色(用裸眼观察)似乎在从空气到水的过程中未见改变。将玻璃载玻片从烧杯内的水中取出，并用盖玻片包被。一薄水膜围绕着金颗粒。显微镜观察如下述。a．1倍稀释斑点
使用一光学显微镜，其物镜为2.5倍，附加放大倍数为1.25倍，目镜为12.5倍，在DLASLPD条件下观察时，斑点呈现相当均匀的橙淡紫色。斑点的周边含有明亮的、黄绿色颗粒。使用10至40倍物镜可以容易地在周边看见颗粒。斑点上各处甚至在周边上的颗粒表面密度很高，而在周边外沿一很窄的环处，可以容易地看到明亮物体般的单一颗粒。b．2倍稀释斑点
使用2.5倍物镜，1.25倍附加放大倍数，及12.5倍目镜，可以观察到完整颗粒。总体上来说，斑点呈现很强的黄色并且似乎是相当均匀的。斑点的大部分为黄色，但朝向周边处斑点呈黄绿色。使用40倍物镜和1.25倍附加放大倍数，可以看到具有极高表面密度的颗粒。大多数颗粒呈黄绿。一些颗粒呈绿色或红色。除了在周边处，斑点具有十分相当均一的密度，而在周边处的颗粒密度十分迅速地下降为零(暗背景)。在周边处由于颗粒表面密度很低，单一颗粒之间存在暗区，所以可以容易地看到单一颗粒且计数。c．4倍稀释斑点
使用2.5倍物镜和1.25倍附加放大倍数，可以看到完整斑点。斑点呈极强的黄绿色且该颜色十分均匀，与此形成对照，当在空气中观察时，斑点上具有很多绿块。使用40倍物镜和1.25倍附加放大倍数可以容易地观察到单一颗粒。与在空气中相比，处于水中的颗粒其颜色强得多或亮得多。周边的颗粒绿色不显著，但在水中大多数颗粒呈黄绿色，还有一些红色和橙色的颗粒。大多数斑点呈极强的黄色。使用40倍物镜可以看到单个颗粒，但是颗粒很密且有重叠。在斑点的最强区内，使用40倍物镜和2倍附加放大倍数所观察到的颗粒，其密度约为25颗粒/39.1μ2或约为0.6颗粒/μ2。这样的数值可能并不代表真正的颗粒表面密度，这是由于显微镜分辨率局限所致。对于由水包被的固定化颗粒的结论
将金斑点置入水中似乎使其均匀性提高。调整光学显微镜的照明，使之处于DLASLPD条件下(载玻片置于棱镜之上且两者之间由浸没油耦联)，当用裸眼观察时，2倍和4倍稀释的斑点似乎均呈黄色。对于裸眼而言，1倍稀释的斑点似乎为橙色。实施例31－60nm金-牛血清白蛋白(BSA)-生物素反应剂与磁珠结合
本实施例显示了我们通过对悬液光散射强度的测量从而探测金颗粒与磁珠的特异性结合且定量化的能力，以及利用光学显微术在DLASLPD条件下探测与磁珠结合的单个金颗粒。
60nm金颗粒由BSA包被且BSA被生物素共价标记(BSA-生物素-Au)。含0.1％BSA pH 7.4的磷酸盐缓冲液500μl加入5支微离心管内。5支离心管分别标记为0、1、2、3、4.BSA-生物素-Au溶液加入每一管内，使金颗粒浓度为3.8×10-11M/L且振摇每管。再次加入BSA-生物素-Au溶液，使每管内金-BSA-生物素颗粒的浓度达到8×10-13M/L。μl量的磁珠浓度为6.7×108Dyna磁珠/ml(10mg/ml)或约1×10-12M/L的Dyna磁珠M280链霉抗生物素蛋白(表面与链霉抗生物素蛋白共价连结的直径为2.8μ的磁珠)悬液溶于含0.1％BSA和0.02％NaN3的pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入每管。
管号  μl  磁珠浓度    生物素浓度   金-BSA-生物素浓度
0     0       0            0
1     5    1×10-14M    3×10-8M     8×10-13M
2     10   2×10-14M    6×10-8M     8×10-13M
3     15   3×10-14M    9×10-8M     8×10-13M
4     20   4×10-14M    12×10-8M    8×10-13M
每支管在室温下温育30分钟，然后从0号管开始一次一管，分别将每管放入MPC-E/E-1磁颗粒浓缩器内从溶液中分离磁珠。2分钟以后，小心取出上清液；管子仍留在磁分离器内。将上清液置入一只1ml的微温育管内。第5号管留在磁浓缩器内5分钟，其它管2分钟。利用SpectraMetrix光度计测量上清液的散射光强度，测量条件为：电阻器PM输出：0.1MΩ；激发边滤波器：橙色滤片CS 3-67；10倍中性密度衰减器：未用。散射光强度测量结果如下：
管号    强度
0       1.21V
1       1.04
2       0.644
3       0.49
4       0.362
将上清液分别倒回对应的，含磁珠的管内，然后再次温育2个小时。2小时后按上述步骤处理各管，得到上清液的下列散射光强度：
管号    强度(V)   归一化强度  金颗粒结合比值
0       0.855     1.21        0
1       0.604     0.85        0.3
2       0.382     0.54        0.55
3       0.326     0.46        0.61
4       0.206     0.29        0.76
再次温育2个小时并未引起金BSA-生物素与磁珠之间的更大结合。
将一滴结合金颗粒的磁珠悬液滴在显微镜玻璃载片上并且用盖玻片盖住。用一光学显微镜在DLASLPD条件下，检验该载片。作为强散射物体，磁珠可被容易地看到；但是由于较大磁珠的强散射，要看到磁珠上的金颗粒是比较困难的。然而，如果将水介质换成折射率约为1.4至1.5的油性介质，就可以比较清楚地看到金颗粒。此外，如果将照明光束相对垂直于载片的方向倾斜较高的角度，也可以比较清楚地观察到金颗粒。实施例32－核酸与40nm直径金(Au)颗粒标记核酸杂交的探测1．化学活化聚乙二醇胺包被金颗粒的制备
用于核酸与金颗粒结合的反应氨基按以下方法制备。利用实施例12中所述步骤，将40nm金颗粒用双(聚氧乙烯双〔3-氨基-2-羟基丙基〕)聚乙烯化合物包被。这导致产生聚乙烯化合物薄层包被的40nm直径金颗粒。该薄层含有化学活性的氨基，用于核酸和颗粒的结合。2．制备与40nm直径金颗粒结合的核酸
对多聚胞苷酸(Poly(C))和多聚次黄苷酸(Poly(I))的均一高聚物进行以下化学修饰。0.8mg和1.3mg的Poly(I)和Poly(C)分别置入两支试管内。在每支管内加入1.0ml用pH 8.5咪唑缓冲液配制的0.1M/L 1-乙基-3，3-双甲氨基丙基碳化二亚胺(CDI)溶液且温育1小时。然后利用乙醇沉淀法将核酸沉淀并在杂交缓冲液中(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA pH 7.6)重悬。3．活化核酸与活化金颗粒偶联
应用同样方法制备Poly(I)和Poly(C)。对于50μl的核酸溶液加入20μl的40nm-Au-PEG活化的颗粒溶液以及100μl的Hepes0.2M pH 8.0并且在50℃下温育1小时。反应后，Poly(C)和Poly(I)与40nm Au-核酸结合物通过离心收集，洗涤，且在杂交缓冲液中重悬。4．杂交实验
按下述方法研究核酸-40nm金颗粒结合物(40nm直径金颗粒表面高聚物包被与核酸共价结合)的杂交性质。利用光学显微镜DLASLPD方法。使用图9所示的玻璃载片-液体-盖片实验装置。在载片上滴一滴Poly(C)-Au颗粒结合制备液并且用盖片盖住。一滴浸没油滴在显微镜聚光器上，然后将载片置于聚光器上。使用10倍物镜。溶液看来相当均匀，并且可以观察到Poly(C)-Au颗粒结合物在视野中浮动。与我们对未用核酸标记的40nm金颗粒进行观察所得的结果相比，Poly(C)-Au颗粒结合物的布朗运动看来较小。一些Poly(C)-Au颗粒看来附着于玻璃载片表面上。存在一些Poly(C)-Au颗粒的聚集物，大多数为2至4个Poly(C)-Au颗粒。当在视野中浮动时，这些聚集物以一整体运动。在我们观察载片几分钟内，我们注意到附着于载片表面的Poly(C)-Au颗粒密度在增加。来自Poly(C)-Au颗粒的散射光颜色为绿色。取下盖片，在载片上含Poly(C)-Au液滴的区域附近滴一滴Poly(I)-Au制备液。使用一金属探针从Poly(I)-Au液滴拉出一液体形成的线条至载片上含Poly(C)-Au的区域以连接两个斑点。然后盖上盖片，将载片放回显微镜上并观察。我们观察到随着时间多Poly(I)-Au-Poly(C)-Au颗粒聚集物的数目在增加。大约20分钟后，我们扫描载片并且观察到单个颗粒的数目很少，大多数颗粒形成由几个颗粒组成的聚集物，很多聚集物附着于载片上。这些聚集物看来具有确定的形状，即似乎这些颗粒聚集物的装配遵循一特定方式：一些看起来象随机缠绕线形成的管子，其它的象带分枝的链网络。观察对照Poly(C)-Au载片显示聚集物数目很少，与之相比，上述这些多聚集物的外形非常不同。我们切换到40倍物镜。对于一些聚集物，有些颗粒的颜色看起来黄色比绿色强。然后我们取下含Poly(Au)-Poly(I)-Au反应的载片的盖片，在载片上加一滴10-5M/L的溴化乙锭且盖上盖片。我们观察到来自载片上颗粒聚集物的微弱橙色，即颗粒的绿色和黄绿色看起来象是位于微弱橙色背景之上。在聚集物之外的区域未观察到橙色。这微弱的橙色向我们表明接近或在颗粒聚集物内部存在核酸的双链结构。我们将此解释为Poly(C)-Au结合物与Poly(I)-Au结合物的杂交。取出载片，在镜下观察含一滴Poly(I)-Au的对照载片。与对照Poly(C)-Au载片类似，我们对该载片进行了观察。与Poly(C)-Au对照载片相比，Poly(I)-Au载片上小聚集物的数量约为前者上的2倍。散射光的颜色为绿色，而一些聚集物呈黄绿色。
在这特定的方式中，两条互补链均用金颗粒标记。由于互补链杂交，更多的颗粒聚集物产生。探测来自金颗粒或类似颗粒的散射光可以检测核酸的结合。当2个或2个以上的金颗粒相互很接近时，散射光的颜色亦可能变化。散射光颜色的变化亦可用来作为检测结合事件的一种方式。应该指出的是可以利用光散射能力强的金颗粒或者任何其它颗粒以许多不同方式检测核酸的结合，或者以单一或多步骤分析方式检测任何其它配体受体对。实施例33－金颗粒与大聚苯乙烯珠结合的探测
我们在一玻璃显微镜载片上滴一滴生物素包被的，直径约为2微米的球形聚苯乙烯溶液并在DLASLPD条件下用光镜观察。可以容易地看到聚苯乙烯颗粒如同明亮的白光点源。然后我们在聚苯乙烯颗粒液滴上滴一滴由链霉抗生物素蛋白包被的，直径为60nm的金颗粒制备液并在电镜下观察。可见明亮白色的聚苯乙烯颗粒且可观察到在聚苯乙烯颗粒周围微弱的黄绿色光晕。我们对载片上的溶液进行蒸发，然后在此制备物上滴一滴显微镜浸没油且在显微镜下观察。可以容易地看到单个金颗粒和黄绿金颗粒的大圆环区。聚苯乙烯颗粒看起来几乎象是一个暗或黑的点，其周围由一黄绿色的光晕或环围绕。本方法可用来检测金颗粒或其它金属样颗粒与固体颗粒物质，小固相物，如玻璃珠或其它珠，以及生物细胞等的结合。实施例34－聚乙烯复合物包被的金颗粒光散射性质
使用直径约为100nm的金颗粒。该金颗粒由柠檬酸盐方法制备。此溶液的一部分放置在另一容器内，并且利用其它地方所述的步骤，用聚乙烯乙二醇复合物(MW=20，000)包被金颗粒。
为了比较包被和未包被颗粒的散射光，将样品放入水中稀释直至溶液出现微弱的粉红色。利用SpectraMetrix光度计获得样品的散射光强度与入射波长关系曲线。
为了进行这些测量，光源和样品之间放置一单色仪。调整单色仪设定，从400nm至700nm，每隔10nm收集散射光数据。利用校正曲线对数据进行波长依赖单色仪和作为波长函数的光电探测器变化方面的修正。通过使用12nm二氧化硅颗粒来得到校正曲线。利用校正曲线对数据进行分析。该数据如图16所示。
此数据表明包被和未包被的100nm金颗粒具有非常相似的散射光强度随入射波长变化曲线。因此，许多不同类型的大分子物质，如抗体、核酸、受体或类似物质，可以被包被在颗粒表面，且对散射光性质不产生明显改变。
其它实施方案在下列权利要求内。

Claims (63)

1．选择颗粒类型通过光散射检测分析物的方法，包括以下步骤：
a)对待选颗粒，提供光散射信号强度与颗粒尺寸之间关系的信息；
b)选取一种颗粒，基于所述信息该颗粒可以提供可以接受的动态范围、可接受的低浓度探测灵敏度以及可接受的探测分辩率，通过对待分析样品中所涉及的分析物浓度水平的预期，确定可以接受的动态范围、可接受的低浓度探测灵敏度以及可接受的探测分辩率，在低于500倍的放大倍数及无电子放大的情形下，上述三项指标可以充分允许利用人眼检测一种或多种所述颗粒产生的散射光。
2．权利要求1的方法，其中所述通过光散射检测分析物是利用固相方法进行的，并且所述的选取还包括对光散射颗粒的识别，这使得颗粒的密度和尺寸达到共同优化，从而提供了信号强度和动态范围的有利组合。
3．权利要求2的方法，其中光散射信号由积分散射光信号组成。
4．权利要求2的方法，其中光散射信号由来自单颗粒或含多个颗粒的单个聚集体组成。
5．权利要求1的方法，其中利用液相方法进行分析物的检测。
6．权利要求5的方法，其中光散射信号由积分散射光信号组成。
7．权利要求5的方法，其中光散射信号由来自单颗粒或含多个颗粒的单聚集体组成。
8．对样品中一种或多种分析物进行特异性检测的方法，包括：将所述样品中任何所述一种或多种分析物与散射光可探测颗粒特异性结合；在所述颗粒产生散射光，并且在低于500倍放大倍数及无电子放大情形下可以利用人眼检测一种或多种所述颗粒的散射光条件下，照明与所述分析物结合的任何所述颗粒；作为测量一种或多种分析物的存在，在所述条件下检测任何所述颗粒的所述散射光，其中所述颗粒流经照明光源。
9．权利要求8的方法，其中所述颗粒流动经过所述照明光源，从而可以单独检测所述颗粒或包含多个所述颗粒的多颗粒结构。
10．权利要求8的方法，其中所述颗粒在选自毛细管、微通道及分光光度计或流式细胞计流动室的结构中在照明光源附近流动。
11．权利要求8的方法，其中所述分析物包括一核酸序列，并且至少一个可探测散射光颗粒与至少两条核酸链探针结合，所述核酸中至少有两条核酸链与所述核酸序列的不同区域相结合所述检测还包括使所述核酸序列逐个流过照明光源并且从两个或更多个颗粒中鉴别出单个颗粒，其中对两个或更多个颗粒的检测表明所述核酸序列的存在。
12．权利要求8的方法，其中所述分析物包括细胞或细胞组分并且所述检测还包括从所述细胞产生的散射光中鉴别所述可探测散射光颗粒的散射光。
13．权利要求12的方法，其中所述的鉴别包括使用两个探测器，对所述两个探测器而言，细胞特异性散射光和颗粒特异性散射光的相对强度不同。
14．权利要求8的方法，其中散射光信号由积分散射光信号组成。
15．权利要求8的方法，其中散射光信号由来自单颗粒或含多个颗粒的单个聚集体的散射光组成。
16．权利要求8的方法，其中所测量的散射光信号特征至少包括强度、偏振、波长和观测角中的一个。
17．权利要求8的方法，其中当所述单颗粒或多个颗粒组成的聚集体进入溶液时，所测量的散射光信号可以检测出所述颗粒或多颗粒聚集体一种或多种可探测散射光性质的变化。
18．权利要求8的方法，其中可区别地检测出具有不同尺寸或者组分、或者两者皆不同的颗粒，每一种所述不同颗粒特异性地与不同分析物结合。
19．特异性地检测样品中一种或多种分析物的方法，包括以下步骤：特异性地将所述样品中的任何所述一种或多种分析物与可探测散射光颗粒结合；在一定条件下用光照明与所述分析物结合的任何所述颗粒，这些条件为由所述颗粒产生散射光并且可在低于500倍放大倍数且无电子放大的情形下，利用人眼可以检测由一种或多种所述颗粒所产生的散射光；作为测量所述一种或多种分析物的存在而在所述条件下检测由任何所述颗粒产生的散射光，其中所述的检测包括在空间上分辨和分类来自所述颗粒的散射光，从而识另单颗粒或多颗粒结构。
20．权利要求19的方法，其中所述的分辨和分类包括电子图象处理和分析。
21．权利要求19的方法，利用固相方法通过光散射进行对分析物的所述检测。
22．权利要求19的方法，利用液相方法进行对分析物的所述检测。
23．权利要求19的方法，其中所测量的散射光信号特征至少包括强度、偏振、波长和观测角中的一个。
24．权利要求19的方法，其中当所述单颗粒或聚集体进入溶液时，所测量的散射光信号可以检测出所述颗粒或多颗粒聚集体一种或多种可探测散射光性质的变化。
25．权利要求19的方法，可区别地检测出具有不同尺寸或者组分、或者两者皆不同的颗粒，每一种所述不同颗粒特异性地与不同分析物结合。
26．特异性地检测样品中一种或多种分析物的方法，包括以下步骤：特异性地将所述样品中的任何所述一种或多种分析物与可探测散射光颗粒结合；在一定条件下用光照明与所述分析物结合的任何所述颗粒，这些条件为由所述颗粒产生散射光并且可在低于500倍放大倍数且无电子放大的情形下，利用人眼可以检测由一种或多种所述颗粒所产生的散射光；作为测量所述一种或多种分析物的存在而在所述条件下检测由任何所述颗粒产生的散射光，其中所述可探测散射光颗粒亦具有磁或电泳性质，并且在检测过程中，所述性质可用来定位所述颗粒和/或将一种或多种分析物结合的颗粒与未结合分析物的颗粒区分开。
27．权利要求26的方法，利用固相方法通过光散射进行对分析物的所述检测。
28．权利要求26的方法，利用液相方法进行对分析物的所述检测。
29．权利要求26方法，所述光散射光信号特征至少包括强度，偏振，波长和观测角中的一个。
30．权利要求26的方法，其中当所述单颗粒或聚集体进入溶液时，所测量的散射光信号要以检测出所述颗粒或聚合体一种或多种要探测散射光性质的变化。
31．权利要求26的方法，可以区别检测具有不同尺寸或者组分，或者两者皆多种不同的颗粒，每一种所述不同颗粒特异性地结合不同分析物。
32．特异性检测样品中包含靶核酸序列的一种或多种核酸分析物的方法，它包括以下步骤：特异性将所述样品中的一种或多种核酸分析物与散射光可探测颗粒结合，其中所述特异性结合包括将至少一种分析物特异的核酸探针与任何所述一种或多种核酸分析物杂交，其中所述颗粒可与一所述探针直接结合或者所述探针具有所述颗粒可以结合的配体；在一定条件下用光照明与所述核酸分析物结合的任何所述颗粒，这些条件为由所述颗粒产生散射光并且可在低于500倍放大倍数且无电子放大的情形下，利用人眼可以检测由一种或多种所述颗粒所产生的散射光；作为测量所述一种或多种核酸分析物的存在而在所述条件下检测由任何所述颗粒产生的散射光。
33．权利要求22的方法，其中所述通过光散射探测分析物是在固相中检测。
34．权利要求22的方法，其中所述探测分析物是在液相中检测。
35．权利要求22的方法，其中：
所述一种或多种核酸分析物包含多个目标核酸序列；
所述多元核酸分析物或多个核酸探针在独立的点上附着于固相表面；以及
探测一个或多个所述独立的点的光散射可测量所述样品中所述一种或多种核酸分析物中至少一种的存在或其量的大小。
36．权利要求35的方法，其中认定的所述颗粒点的积分散射光强度可用来表定所述样品中所述核酸分析物的量。
37．权利要求35的方法，其中至少部分所述颗粒点中的可探测散射光颗粒的数量可用来表定所述样品中所述核酸的量。
38．权利要求37的方法，其中所述的至少部分所述颗粒点中可探测散射光单颗粒的光散射信号相加得到一个总的散射光信号，可标定所述样品中所述核酸的量。
39．权利要求35的方法，其中每一所述颗粒点的光散射可扫描所述独立点来探测。
40．权利要求35的方法，其中所述颗粒点的光散射可利用每一所述颗粒点的独立探测器被探测。
41．权利要求35的方法，其中每一所述颗粒点的光散射可通过所述多个颗粒点的同时成像被探测。
42．权利要求41的方法，其中所述多个颗粒点的至少一个图像可利用电子图像处理被分析。
43．权利要求35的方法，其中所述多个颗粒点包含一个阵列。
44．权利要求43的方法，其中所述阵列对于杂交测序或确定至少一个核酸序列的表达水平是适用的。
45．权利要求32的方法，其中不同尺寸或组份或两者的多个不同颗粒分别被探测，每一所述不同颗粒特异性地与一种不同的核酸分析物结合。
46．识别样品中至少一种细胞类型或生物体的存在或量，或探测至少一种在细胞类型或组织之中或之内的分析物的方法，该方法包含探测至少一种与所述至少一种细胞类型或生物体特异性地结合的可探测散射光颗粒的存在或量的步骤：
其中所述，至少一种可探测散射光颗粒在产生至少一种颗粒的光散射的条件下被光照明；在此方法中，所述至少一种颗粒的光散射放大小于500倍由人眼观测，而无需电子放大；探测任何所述至少一种颗粒散射的光，可测量任何所述至少一种细胞类型或生物体的存在或量，或可测量所述至少一种在所述细胞类型或生物体之上或之内的分析物的存在或量。
47．权利要求46的方法，其中所述辨别细胞类型或生物体的含量还包括相对于未用所述至少一种所述颗粒特异性地结合的所述细胞类型或生物体而测定用至少一种所述颗粒特异性地结合的所述细胞或生物体的含量。
48．权利要求46的方法，其中利用不同的颗粒类型在不同细胞类型或生物体区分或识别至少一种细胞类型或生物体的存在和含量，其中所述每一种不同的颗粒类型特异性地与一种不同细胞尖型或生物体结合，并且在所述的不同颗粒类型中，每一种颗类型的散射光与所述不同颗粒类型中的其它颗粒类型的散射光可以区分开。
49．权利要求46的方法，其中利用不同的颗粒类型在不同细胞类型或有机体中区分或识别至少一种细胞类型或有机体，其中每一种所述不同的颗粒类型特异地与至少一种所述不同细胞类型或生物体结合，并且在所述的不同颗粒类型中，每一种颗粒类型的散射光与所述不同颗粒类型中的其它颗粒类型的散射光可以加以区分。
50．权利要求49的方法，其中至少一种所述分析物位于细胞内。
51．权利要求46的方法，其中所述对至少一种细胞类型或生物体的存在或含量测定包括识别至少一种细胞类型或生物体。
52．权利要求46的方法，其中所述分析物位于细胞内。
53．权利要求46的方法，其中所述一种所述颗粒含金或含银或者含有两者。
54．监测细胞或生物体的方法，它包括以下步骤：
将至少一种散射光可探测颗粒放入细胞，并且检测所述细胞或生物体内的至少一种所述散射颗粒的存在，以此作为所述细胞或生物体存在的标志，其中在一定条件下用光照明至少一种散射光可探测颗粒，这些条件为由所述颗粒产生散射光并且可在低于500倍放大倍数且无电子放大的情形下，利用人眼可以检测由一种或多种所述颗粒所产生的散射光。
55．识别潜在药物靶或确定其特征的方法，包括以下步骤：在潜在靶和或药物库中进行筛选以检测靶与潜在药物之间的相互作用，其中所述筛选包括将任何潜在靶或潜在药物或表达产物或mRNA与可探测散射光颗粒特异性地结合，在一定条件下用光照明与任何所述潜在靶或潜在药物或表达产物或mRNA结合的任何所述颗粒，这些条件为由所述颗粒产生散射光并且可在低于500倍放大倍数且无电子放大的情形下，利用人眼可以检测由一种或多种所述颗粒所产生的散射光；在所述条件下检测任何所述颗粒的散射光，以所述光的检测作为所述相互作用的指示。
56．权利要求55的方法，其中所述相互作用包括靶或潜在靶与所述潜在药物之间的结合作用。
57．权利要求55的方法，其中所述相互作用包括对药靶系统的调控。
58．权利要求57的方法，其中对所述调控的所述确定包括对所述系统组分表达水平的确定。
59．权利要求55的方法，其中利用均相方法对任何所述颗粒的所述散射光进行所述检测。
60．权利要求55的方法，其中潜地靶或潜在药物在一空间可寻址的库内。
61．权利要求55的方法，其中每一种所述的潜在药物与一固相底物颗粒结合。
62．权利要求61的方法，其中所述散射光可探测颗粒亦包括磁或铁电组分，并且所述方法还包括处理所述与所述潜在药物结合的颗粒的位置。
63．权利要求55的方法，其中通过所述相互作用改变所述表达产物或mRNA的量。
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Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102369427A (zh) * 2009-03-23 2012-03-07 金希克股份有限公司 探测分子的方法和装置
CN103267854A (zh) * 2013-05-03 2013-08-28 西安交通大学 一种增强试纸检测信号的方法
CN101978254B (zh) * 2008-01-03 2013-10-09 中央佛罗里达大学研究基金会有限公司 使用金属纳米粒子探针和动态光散射的分析物检测
CN103608664A (zh) * 2011-06-24 2014-02-26 贝克顿·迪金森公司 吸收光谱扫描流动血细胞计数
CN105259086A (zh) * 2015-10-29 2016-01-20 广东美的制冷设备有限公司 粉尘浓度的检测方法及检测系统
CN105917227A (zh) * 2013-11-12 2016-08-31 新加坡科技研究局 实时定量和终点比色的pcr装置
CN106716125A (zh) * 2014-06-03 2017-05-24 加利福尼亚大学董事会 纳米颗粒分析器
CN106829856A (zh) * 2016-12-14 2017-06-13 佛山旋疯纳米科技有限公司 一种团簇离子束纳米加工设备控制装置及其控制方法
CN109254022A (zh) * 2018-10-24 2019-01-22 首钢智新迁安电磁材料有限公司 一种测量晶粒尺寸的方法
CN109387460A (zh) * 2017-08-14 2019-02-26 阅美测量系统（上海）有限公司 一种污染颗粒观察及测试装置及分析方法
CN109542186A (zh) * 2018-12-12 2019-03-29 深圳市福瑞康科技有限公司 一种机箱主箱体、机箱及闪烁检测装置
CN110127771A (zh) * 2019-05-31 2019-08-16 重庆科技学院 四氧化三铁纳米颗粒的调控聚集方法
CN110234600A (zh) * 2016-10-21 2019-09-13 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 分子纳米标签
CN111148572A (zh) * 2017-06-06 2020-05-12 西北大学 跨界面磁性分离
CN112014369A (zh) * 2020-08-25 2020-12-01 上海市皮肤病医院 超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法
CN113049455A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 中核北方核燃料元件有限公司 一种包覆燃料颗粒及核芯溯源性直径辅助测量装置
CN113340894A (zh) * 2021-05-28 2021-09-03 上海睿钰生物科技有限公司 一种非透明微粒的检测方法
CN113552041A (zh) * 2021-06-08 2021-10-26 上海交通大学 一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法
CN114491387A (zh) * 2022-04-06 2022-05-13 天津美腾科技股份有限公司 干选机的识别设备布置方法、装置、电子设备及分选系统

Families Citing this family (235)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586193B2 (en) * 1996-04-25 2003-07-01 Genicon Sciences Corporation Analyte assay using particulate labels
US6984491B2 (en) 1996-07-29 2006-01-10 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US7098320B1 (en) 1996-07-29 2006-08-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US6506564B1 (en) 1996-07-29 2003-01-14 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6361944B1 (en) 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
DE69737598T2 (de) 1996-07-29 2007-12-27 Nanosphere Inc., Skokie Nanopartikel mit daran angehefteten oligonukleotiden sowie deren verwendungen
US6750016B2 (en) 1996-07-29 2004-06-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
EP1060455A4 (en) * 1998-02-10 2002-08-07 Ey Lab Inc REFLECTOR SYSTEM WITH COMPENSATION FOR THE TOPOGRAPHY OF THE SAMPLING HOLDER AND WITH SYNCHRONOUS ELIMINATION OF THE SYSTEM-RELATED NOISE
US20030153023A1 (en) * 1999-05-13 2003-08-14 Starzl Timothy W. Enumeration method of analyte detection
AU1219800A (en) * 1998-10-20 2000-05-08 Ljl Biosystems, Inc. Improvements in luminescence assays
US20030096321A1 (en) * 1999-05-19 2003-05-22 Jose Remacle Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
WO2001051665A2 (en) 2000-01-13 2001-07-19 Nanosphere Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
CA2403427C (en) * 2000-03-22 2013-04-30 M. Cynthia Goh Method and apparatus for assay for multiple analytes
US7875442B2 (en) 2000-03-24 2011-01-25 Eppendorf Array Technologies Identification and quantification of a plurality of biological (micro)organisms or their components
US7829313B2 (en) 2000-03-24 2010-11-09 Eppendorf Array Technologies Identification and quantification of a plurality of biological (micro)organisms or their components
US8288128B2 (en) 2004-11-18 2012-10-16 Eppendorf Array Technologies S.A. Real-time quantification of multiple targets on a micro-array
AU2001263286A1 (en) * 2000-05-19 2001-12-03 Iowa State University Research Foundation Inc. High-throughput methods of distinguishing at least one molecule individually in a sample comprising multiple molecules and systems for use therein
US6784981B1 (en) * 2000-06-02 2004-08-31 Idexx Laboratories, Inc. Flow cytometry-based hematology system
AU2001275475A1 (en) * 2000-06-12 2001-12-24 Genicon Sciences Corporation Assay for genetic polymorphisms using scattered light detectable labels
AU7687001A (en) 2000-07-11 2002-01-21 Nanospherre Inc Method of detection by enhancement of silver staining
EP1319179B1 (en) * 2000-07-19 2008-03-05 Genisphere Inc. Methods for detecting and assaying nucleic acid sequences
US20020049682A1 (en) * 2000-09-01 2002-04-25 Nobuko Yamamoto Authentication certificate, authentication certificate issuance system, and authentication system
EP1322951A2 (en) * 2000-09-20 2003-07-02 Molecular Reflections Microfabricated ultrasound array for use as resonant sensors
AU9657901A (en) * 2000-10-03 2002-04-15 Minerva Biotechnologies Corp Magnetic in situ dilution
GB2383843B (en) * 2000-10-05 2004-07-28 Palti Yoram Prof Geometrically efficient particle agglutination, particularly to detect low affinity binding
US20040058385A1 (en) * 2000-11-17 2004-03-25 Abel Andreas Peter Kit and method for determining multiple analytes, with provisions for refrencing the density of immobilised recognition elements
US7361472B2 (en) 2001-02-23 2008-04-22 Invitrogen Corporation Methods for providing extended dynamic range in analyte assays
FR2824001B1 (fr) * 2001-04-26 2003-10-10 Bio Merieux Procede de depot d'un spot d'un produit d'interet, et application pour l'isolement et/ou la determination d'un analyte
US20040166593A1 (en) * 2001-06-22 2004-08-26 Nolte David D. Adaptive interferometric multi-analyte high-speed biosensor
US20040161741A1 (en) * 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
US6714299B2 (en) 2001-07-13 2004-03-30 Genicon Sciences Corporation Use of light scattering particles in design, manufacture, and quality control of small volume instruments, devices, and processes
US20030013083A1 (en) * 2001-07-16 2003-01-16 Tsai Tenlin S. Particle analysis as a detection system for particle-enhanced assays
EP2302363A2 (en) * 2001-09-05 2011-03-30 Life Technologies Corporation Method for normalization of assay data
US20030049866A1 (en) * 2001-09-05 2003-03-13 Genicon Sciences Corporation Sample device preservation
WO2003022999A2 (en) 2001-09-06 2003-03-20 Genomic Profiling Systems, Inc. Rapid detection of replicating cells
JP3685119B2 (ja) * 2001-10-18 2005-08-17 株式会社日立製作所 生体分子回収方法
DE60228128D1 (de) 2001-11-09 2008-09-18 Nanosphere Inc Biokonjugat-nanopartikelsonden
DE60232013D1 (de) * 2001-11-20 2009-05-28 Exact Sciences Corp Automatische probenvorbereitungsverfahren und -vorrichtungen
GR1004178B (el) * 2001-11-29 2003-03-05 "����������" Ολοκληρωμενος οπτοηλεκτρονικος βιοαισθητηρας πυριτιου για ανιχνευση βιομοριων επισημασμενων με χρωμοφορες ομαδες ή νανοσωματιδια
JP3856214B2 (ja) * 2002-03-11 2006-12-13 横河電機株式会社 蛍光強度増強ビーズ
US20040038264A1 (en) * 2002-05-14 2004-02-26 Souza Glauco R. Fractal dimension analysis of nanoparticle aggregates using angle dependent light scattering for the detection and characterization of nucleic acids and proteins
CN100357737C (zh) * 2002-11-12 2007-12-26 松下电器产业株式会社 特异结合反应测定方法、测定装置以及其中所用试剂盒
WO2004046100A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 University Of Maryland, Baltimore Release of the self-quenching of fluorescence near silver metallic surfaces
JP2004184312A (ja) * 2002-12-05 2004-07-02 Yokogawa Electric Corp 生体高分子検出方法およびバイオチップ
US7053783B2 (en) 2002-12-18 2006-05-30 Biovigilant Systems, Inc. Pathogen detector system and method
WO2004057330A1 (ja) * 2002-12-20 2004-07-08 Shigeki Higashiyama 細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法および細胞増殖抑制剤
WO2004077014A2 (en) * 2003-02-13 2004-09-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detection and analysis of polynucleotide-binding protein interactions using light harvesting multichromophores
WO2004074508A2 (en) * 2003-02-15 2004-09-02 Golovlev Valeri V Method of visualization and quantification of biopolymer molecules immobilized on solid support
US20080050842A1 (en) * 2003-02-15 2008-02-28 Golovlev Valeri V Method of visualization and quanitification of biopolymer molecules immobilized on solid support
EP1597399A2 (en) * 2003-02-27 2005-11-23 Nanosphere, Inc. Label-free gene expression profiling with universal nanoparticle probes in microarray assay format
US7687239B2 (en) 2003-07-12 2010-03-30 Accelrs Technology Corporation Sensitive and rapid determination of antimicrobial susceptibility
US20120077206A1 (en) 2003-07-12 2012-03-29 Accelr8 Technology Corporation Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing
US7341841B2 (en) * 2003-07-12 2008-03-11 Accelr8 Technology Corporation Rapid microbial detection and antimicrobial susceptibility testing
US7641971B2 (en) * 2003-08-13 2010-01-05 Crane Company Metal-treated particles for remediation
US20060035242A1 (en) 2004-08-13 2006-02-16 Michelitsch Melissa D Prion-specific peptide reagents
US7352467B2 (en) * 2003-10-24 2008-04-01 University Of Washington Surface plasmon resonance imaging system and method
US20050112586A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-26 Roland Janzen Method and composition for stabilizing liquid reagents
US7329391B2 (en) * 2003-12-08 2008-02-12 Applera Corporation Microfluidic device and material manipulating method using same
US20050141843A1 (en) * 2003-12-31 2005-06-30 Invitrogen Corporation Waveguide comprising scattered light detectable particles
CA2834041C (en) * 2003-12-31 2017-05-16 President And Fellows Of Harvard College Assay device and method
CA2552872A1 (en) * 2004-01-14 2005-08-04 Luminex Corporation Methods for altering one or more parameters of a measurement system
ES2439225T3 (es) 2004-01-26 2014-01-22 President And Fellows Of Harvard College Sistema y método para el suministro de fluidos
US8030057B2 (en) * 2004-01-26 2011-10-04 President And Fellows Of Harvard College Fluid delivery system and method
CN1667418B (zh) * 2004-03-10 2010-10-06 马杰 多功能测量、分析和诊断便携式装置
WO2005115737A2 (en) * 2004-03-22 2005-12-08 Quantaspec Inc. System and method for detecting and identifying an analyte
US20070095393A1 (en) * 2004-03-30 2007-05-03 Piero Zucchelli Devices and methods for programmable microscale manipulation of fluids
US7771660B2 (en) * 2004-05-04 2010-08-10 University Of North Carolina At Chapel Hill Electrophoretic interactive spectral methods and devices for the detection and/or characterization of biological particles
CN1957245B (zh) 2004-05-19 2010-12-08 Vp控股有限公司 通过sers增强化学基团检测的具有层化等离子体结构的光学传感器
US20050287680A1 (en) * 2004-06-25 2005-12-29 Srivatsa Venkatasubbarao Multianalyte assay method
US20060024815A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Allman Steve L High sensitivity array-based detection system
KR101170859B1 (ko) * 2004-07-30 2012-08-02 바이오비질런트 시스템즈 인코포레이티드 병원균 및 입자 탐지기 시스템과 방법
US7750352B2 (en) * 2004-08-10 2010-07-06 Pinion Technologies, Inc. Light strips for lighting and backlighting applications
US9494581B2 (en) 2004-08-24 2016-11-15 University Of Wyoming System and method for Raman spectroscopy assay using paramagnetic particles
US20060046279A1 (en) * 2004-08-24 2006-03-02 Truong Palestrina R Analytical methods utilizing real-time energy/particle interaction-based determination techniques
US20080050659A1 (en) 2004-09-30 2008-02-28 Japan Science And Technology Agency Method of Patterning Self-Organizing Material, Patterned Substrate of Self-Organizing Material and Method of Producing the Same, and Photomask Using Patterned Substrate of Self-Organizing Material
WO2006076683A2 (en) * 2005-01-13 2006-07-20 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Isolation and detection of pathogenic prions
US7663092B2 (en) * 2005-02-01 2010-02-16 Purdue Research Foundation Method and apparatus for phase contrast quadrature interferometric detection of an immunoassay
US7910356B2 (en) * 2005-02-01 2011-03-22 Purdue Research Foundation Multiplexed biological analyzer planar array apparatus and methods
US20070023643A1 (en) * 2005-02-01 2007-02-01 Nolte David D Differentially encoded biological analyzer planar array apparatus and methods
WO2006105110A2 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Inverness Medical Switzerland Gmbh Assay device and methods
US7300631B2 (en) * 2005-05-02 2007-11-27 Bioscale, Inc. Method and apparatus for detection of analyte using a flexural plate wave device and magnetic particles
US7611908B2 (en) * 2005-05-02 2009-11-03 Bioscale, Inc. Method and apparatus for therapeutic drug monitoring using an acoustic device
US7749445B2 (en) * 2005-05-02 2010-07-06 Bioscale, Inc. Method and apparatus for analyzing bioprocess fluids
CA2608119A1 (en) 2005-05-11 2006-11-16 Optosecurity Inc. Method and system for screening luggage items, cargo containers or persons
US7991242B2 (en) 2005-05-11 2011-08-02 Optosecurity Inc. Apparatus, method and system for screening receptacles and persons, having image distortion correction functionality
US20070036026A1 (en) * 2005-05-16 2007-02-15 Laibinis Paul E Magnetic Particle Systems and Methods
US20070081163A1 (en) * 2005-06-03 2007-04-12 Minhua Liang Method and apparatus for scanned beam microarray assay
JP5112312B2 (ja) * 2005-07-15 2013-01-09 バイオヴィジラント システムズ インコーポレイテッド 病原体及び微粒子検出システム並びに検出法
US20070031282A1 (en) * 2005-08-04 2007-02-08 Piero Zucchelli Devices and methods for interfacing microfluidic devices with fluid handling devices
US20070030482A1 (en) * 2005-08-08 2007-02-08 Zhenghua Ji Spectrophotometer with adjustable light pathlength
US7791728B2 (en) 2005-08-11 2010-09-07 Hewlett-Packard Development Company, L.P. System for optically analyzing a substance with a selected single-wavelength
WO2007030521A1 (en) * 2005-09-06 2007-03-15 Invitrogen Corporation Control of chemical modification
EP1931695B1 (en) 2005-09-09 2013-04-10 Novartis AG Prion-specific peptoid reagents
US8592136B2 (en) * 2005-09-13 2013-11-26 Affymetrix, Inc. Methods for producing codes for microparticles
US20120231453A1 (en) * 2005-09-13 2012-09-13 Affymetrix, Inc. Brownian Microbarcodes for Bioassays
JP5160428B2 (ja) 2005-09-26 2013-03-13 ラピッド マイクロ バイオシステムズ インコーポレイテッド 増殖培地を含むカセット
WO2007067680A2 (en) * 2005-12-05 2007-06-14 Guava Technologies Particle-based analyte characterization
US7463358B2 (en) 2005-12-06 2008-12-09 Lumera Corporation Highly stable surface plasmon resonance plates, microarrays, and methods
FI120560B (fi) * 2005-12-21 2009-11-30 Outotec Oyj Menetelmä alkuaineen ja/tai mineraalin pitoisuuden määrittämiseksi
WO2007087582A1 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Invitrogen Corporation Device and methods for quantifying analytes
US8492098B2 (en) 2006-02-21 2013-07-23 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of reaction components that affect a reaction
CA2643169A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-27 Vivacta Ltd A chemical sensing device
WO2007131103A2 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Quadraspec, Inc. Direct printing of patterned hydrophobic wells
RU2444736C2 (ru) 2006-05-09 2012-03-10 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Детектирование молекул-мишеней в пробе
US7899232B2 (en) 2006-05-11 2011-03-01 Optosecurity Inc. Method and apparatus for providing threat image projection (TIP) in a luggage screening system, and luggage screening system implementing same
CA2657970A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Luminex Corporation Chip-based flow cytometer type systems for analyzing fluorescently tagged particles
US7531774B2 (en) * 2006-06-05 2009-05-12 General Dynamics Advanced Information Systems, Inc. Measurement-diverse imaging and wavefront sensing with amplitude and phase estimation
US20100035243A1 (en) * 2006-07-10 2010-02-11 Nanosphere, Inc. Ultra-sensitive detection of analytes
JP4756270B2 (ja) * 2006-07-13 2011-08-24 独立行政法人産業技術総合研究所 光学分光測定方法及び装置
US8494210B2 (en) 2007-03-30 2013-07-23 Optosecurity Inc. User interface for use in security screening providing image enhancement capabilities and apparatus for implementing same
EP2059811A2 (en) * 2006-08-18 2009-05-20 3M Innovative Properties Company Methods of detection using acousto-mechanical detection systems
JP5151097B2 (ja) * 2006-09-01 2013-02-27 株式会社リコー 複合金属ナノ粒子、複合金属ナノ粒子を含む多光子吸収反応材料と反応生成物、複合金属ナノ粒子を含む多光子吸収反応助剤
US8207509B2 (en) 2006-09-01 2012-06-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates, systems and methods for analyzing materials
US7522282B2 (en) * 2006-11-30 2009-04-21 Purdue Research Foundation Molecular interferometric imaging process and apparatus
US20080144899A1 (en) * 2006-11-30 2008-06-19 Manoj Varma Process for extracting periodic features from images by template matching
US20080230605A1 (en) * 2006-11-30 2008-09-25 Brian Weichel Process and apparatus for maintaining data integrity
WO2008083279A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 3M Innovative Properties Company Method of detection of bioanalytes by acousto-mechanical detection systems comprising the addition of liposomes
SE530789C2 (sv) * 2007-01-17 2008-09-09 Hemocue Ab Apparat och metod för positionsbestämning av objekt vilka inryms i ett prov
WO2008088249A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Hemocue Ab Apparatus for determining positions of objects contained in a sample
WO2008089495A2 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Purdue Research Foundation System with extended range of molecular sensing through integrated multi-modal data acquisition
CA2681722A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 Purdue Research Foundation Method and apparatus for conjugate quadrature interferometric detection of an immunoassay
DK2152417T3 (en) 2007-05-04 2018-08-06 Opko Diagnostics Llc APPARATUS AND PROCEDURE FOR ANALYSIS IN MICROFLUID SYSTEMS
JP4803125B2 (ja) * 2007-05-10 2011-10-26 ソニー株式会社 ビーズ群と該ビーズ群の作製方法、並びにビーズ群を用いる方法
GB0724404D0 (en) 2007-05-29 2008-01-30 Invitrogen Dynal As A sample vessel retaining portion
US9199247B2 (en) * 2007-05-29 2015-12-01 Invitrogen Dynal As Magnetic separation rack
US8094307B2 (en) * 2007-07-05 2012-01-10 Baxter International Inc. Method and apparatus for measuring the presence and concentration of pharmaceutical substances in a medical fluid administered by a medication delivery system
WO2009033056A1 (en) 2007-09-06 2009-03-12 Bioscale, Inc. Reusable detection surfaces and methods of using same
CA2741911A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Quantification of an absorber through a scattering medium
EP2246702B1 (en) * 2007-12-03 2015-10-07 Tamagawa Seiki Co., Ltd. Biosensing method using coated magnetic microparticles and biosensing device to be used in the method
US8628976B2 (en) * 2007-12-03 2014-01-14 Azbil BioVigilant, Inc. Method for the detection of biologic particle contamination
US8004669B1 (en) 2007-12-18 2011-08-23 Plexera Llc SPR apparatus with a high performance fluid delivery system
WO2009081406A2 (en) * 2007-12-26 2009-07-02 Yissum, Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method and apparatus for monitoring processes in living cells
KR100962290B1 (ko) * 2008-02-13 2010-06-11 성균관대학교산학협력단 금 나노입자의 국지화된 표면 플라즈몬 공명 센서를 이용한 생체물질 검출 방법
JP5344828B2 (ja) * 2008-02-28 2013-11-20 富士フイルム株式会社 センシング装置
US20090219509A1 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 Hiroshi Nomura Optical sensor with enhanced reflectance
US8008068B2 (en) * 2008-02-29 2011-08-30 Light Pointe Medical, Inc. Nonhemolytic optical sensor with enhanced reflectance
EP2265942B1 (en) 2008-03-12 2017-10-18 University Of Virginia Patent Foundation Detection of polymeric analytes
US7995854B2 (en) * 2008-03-28 2011-08-09 Tandent Vision Science, Inc. System and method for identifying complex tokens in an image
EP2285491A1 (en) 2008-04-25 2011-02-23 Claros Diagnostics, Inc. Flow control in microfluidic systems
US20110189692A1 (en) * 2008-04-30 2011-08-04 Novartis Ag Assay for pathogenic conformers
US7796256B2 (en) * 2008-05-05 2010-09-14 Fluid Imaging Technologies, Inc. Oil-immersion enhanced imaging flow cytometer
US8422002B2 (en) * 2008-06-24 2013-04-16 Satish Deshpande Malaria detection by small angle light scattering
DE102008035770A1 (de) * 2008-07-31 2010-02-18 Eads Deutschland Gmbh Optischer Partikeldetektor sowie Detektionsverfahren
US8345239B1 (en) 2008-08-04 2013-01-01 Fluid Imaging Technologies, Inc. System and method for monitoring birefringent particles in a fluid
US9151943B2 (en) 2008-08-04 2015-10-06 Fluid Imaging Technologies, Inc. System and method for monitoring birefringent particles in a fluid
TW201017149A (en) 2008-08-06 2010-05-01 Invitrox Inc Use of focused light scattering techniques in biological applications
EP4325209A2 (en) 2008-09-16 2024-02-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Integrated optical device
WO2010036829A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Straus Holdings Inc. Imaging analyzer for testing analytes
US20100099076A1 (en) * 2008-10-16 2010-04-22 Kent State University Sensitive and rapid detection of viral particles in early viral infection by laser tweezers
EP2376226B1 (en) 2008-12-18 2018-09-12 Opko Diagnostics, LLC Improved reagent storage in microfluidic systems and related articles and methods
CA2647953A1 (en) * 2008-12-29 2010-06-29 Sqi Diagnostics Systems Inc. Multiplex analyte detection
EP3278877B1 (en) 2009-02-02 2020-06-03 Opko Diagnostics, LLC Structures for controlling light interaction with microfluidic devices
EP2223650A1 (en) * 2009-02-25 2010-09-01 The Provost, Fellows and Scholars of the College of the Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth near Dublin Method and apparatus for imaging tissue topography
US20110171124A1 (en) 2009-02-26 2011-07-14 Osi Pharmaceuticals, Inc. In situ methods for monitoring the EMT status of tumor cells in vivo
US8477186B2 (en) * 2009-04-06 2013-07-02 Sumco Corporation Apparatus for removing reflected light
WO2010120686A2 (en) * 2009-04-13 2010-10-21 Parsons J Kellogg Methods for the diagnosis and treatment of benign prostatic hyperplasia
US8153987B2 (en) * 2009-05-22 2012-04-10 Jordan Valley Semiconductors Ltd. Automated calibration methodology for VUV metrology system
US20130084565A1 (en) * 2009-11-03 2013-04-04 University Of Virginia Patent Foundation Versatile, visible method for detecting polymeric analytes
CA2779846A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Novartis Ag Positively charged species as binding reagents in the separation of protein aggregates from monomers
PT2504105T (pt) 2009-11-24 2021-03-31 Opko Diagnostics Llc Mistura e distribuição de fluidos em sistemas microfluídicos
KR101422573B1 (ko) * 2009-11-26 2014-07-25 삼성전자 주식회사 원심력기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 면역혈청검사방법
WO2011065912A1 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method and system for interaction analysis
CN102667447B (zh) * 2009-11-30 2016-03-23 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于结合行为分析的方法和系统
EP2513636B1 (en) * 2009-12-18 2020-08-05 Koninklijke Philips N.V. Substance determining apparatus
US20110223586A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 David Karabinus Optical particle characterization system
US20110223587A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Schulman Joseph D Optical particle characterization system
EP2369325A1 (en) 2010-03-12 2011-09-28 Eppendorf Ag Array analysis for online detection
AU2011241208B2 (en) * 2010-04-15 2017-02-02 Digital Sensing Limited Microarrays
US8580569B2 (en) 2010-04-16 2013-11-12 Opko Diagnostics, Llc Feedback control in microfluidic systems
EP2566974B1 (en) * 2010-05-05 2014-11-05 Beckman Coulter Biomedical, LLC Diagnostic instrument and flow process
USD645971S1 (en) 2010-05-11 2011-09-27 Claros Diagnostics, Inc. Sample cassette
CN103025886A (zh) 2010-05-25 2013-04-03 阿尔利克斯公司 用于确定颗粒和/或细胞分散体的迁移率的全息波动显微装置和方法
CN103221806B (zh) * 2010-09-10 2015-11-25 奥林巴斯株式会社 使用两个以上的波长带的光的测量的光学分析方法
EP2631631B1 (en) * 2010-11-25 2016-01-20 Olympus Corporation Photometric analysis device and photometric analysis method using wavelength characteristic of light emitted from single illuminant particle
CN103380509B (zh) 2011-02-16 2017-02-15 株式会社半导体能源研究所 发光元件
CN103492859B (zh) * 2011-02-28 2017-05-24 皇家飞利浦有限公司 物质确定装置
US10254204B2 (en) 2011-03-07 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Membrane-assisted purification
ES2551922T3 (es) 2011-03-07 2015-11-24 Accelerate Diagnostics, Inc. Sistemas rápidos de purificación celular
EP2693200B1 (en) * 2011-03-29 2019-06-12 Hamamatsu Photonics K.K. Terahertz-wave spectrometer
TWI648532B (zh) * 2011-08-29 2019-01-21 美商安美基公司 用於非破壞性檢測-流體中未溶解粒子之方法及裝置
MX2014002728A (es) 2011-09-07 2014-08-22 Rapiscan Systems Inc Sistema de inspeccion de rayos x que integra datos de manifiesto con procesamiento de deteccion / generacion de imagenes.
FR2981283B1 (fr) * 2011-10-13 2014-08-29 Chambre De Commerce Et De L Ind De Paris Au Titre De Son Etablissement D Enseignement Superieur Esie Dispositif microfluidique pour analyser un fluide sous pression.
US8994945B2 (en) 2011-10-27 2015-03-31 Fluid Imaging Technologies, Inc. Method of treatment analysis with particle imaging
EP3327110B1 (en) 2011-11-07 2020-01-29 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cassette for sterility testing
EP2618130A1 (en) * 2012-01-17 2013-07-24 F. Hoffmann-La Roche AG Device for use in the detection of binding affinities
WO2013116839A1 (en) * 2012-02-04 2013-08-08 Douglas Scientific Method and apparatus for rapid, high sensitivity analysis of low volume samples of biological materials
CN104364788B (zh) 2012-03-05 2018-02-06 阿克蒂克合伙公司 预测前列腺癌风险及前列腺腺体体积的装置
EP4060016A1 (en) 2012-04-16 2022-09-21 Rapid Micro Biosystems, Inc. Cell culturing device
US8879797B2 (en) 2012-05-25 2014-11-04 Fluid Imaging Technologies, Inc. System and method for total internal reflection enhanced imaging flow cytometry
DK2877832T3 (da) * 2012-07-27 2021-01-18 Engender Tech Limited System til mikrofluidisk orientering og sortering af partikler
KR101384386B1 (ko) 2012-10-25 2014-04-10 전남대학교산학협력단 저 투과성 암체의 물성 측정 시스템
US10610861B2 (en) 2012-12-17 2020-04-07 Accellix Ltd. Systems, compositions and methods for detecting a biological condition
EP3508848B1 (en) 2012-12-17 2022-10-05 Accellix Ltd Systems and methods for determining a chemical state
US9759722B2 (en) * 2012-12-17 2017-09-12 Leukodx Ltd. Systems and methods for determining a chemical state
CN105324489A (zh) * 2013-03-04 2016-02-10 韦拉克斯生物医学股份有限公司 多分析物试验
EP2965082B1 (en) * 2013-03-05 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Method and system for determining a biological response of a target to a soluble candidate substance
CA2900708C (en) 2013-03-13 2021-06-15 Opko Diagnostics, Llc Mixing of fluids in fluidic systems
US9677109B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Accelerate Diagnostics, Inc. Rapid determination of microbial growth and antimicrobial susceptibility
EP2827130A1 (en) * 2013-07-15 2015-01-21 F. Hoffmann-La Roche AG Device for use in the detection of binding affinities
WO2015096981A1 (en) * 2013-12-23 2015-07-02 Koninklijke Philips N.V. Detection apparatus for detecting particles
US10133048B2 (en) * 2014-07-09 2018-11-20 Ntp Nano Tech Projects S.R.L. Laser optical coupling for nanoparticles detection
EA038479B1 (ru) 2014-12-12 2021-09-03 Опкоу Дайагностикс, Ллк Устройство для проведения анализа пробы и способ эксплуатации указанного устройства
JP2018048811A (ja) * 2015-01-30 2018-03-29 京セラ株式会社 検出対象のセンシング方法
US10458990B1 (en) * 2015-03-06 2019-10-29 Scanit Technologies, Inc. Spore state discrimination
US10023895B2 (en) 2015-03-30 2018-07-17 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microogranism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
US10253355B2 (en) 2015-03-30 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
USD804682S1 (en) 2015-08-10 2017-12-05 Opko Diagnostics, Llc Multi-layered sample cassette
JP6781361B2 (ja) * 2015-08-28 2020-11-04 国立大学法人群馬大学 荷電粒子放射線計測方法および荷電粒子放射線計測装置
US9983115B2 (en) 2015-09-21 2018-05-29 Fluid Imaging Technologies, Inc. System and method for monitoring particles in a fluid using ratiometric cytometry
US20170160187A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-08 Tdk Corporation Laser Scanner Particle Counter and Imager
WO2017100457A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 Opko Diagnostics, Llc Fluidic systems involving incubation samples and/or reagents
JP6155452B1 (ja) * 2016-02-16 2017-07-05 国立大学法人電気通信大学 基板上の粒子の検出装置
WO2017146930A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Rapiscan Systems, Inc. Systems and methods for detecting threats and contraband in cargo
ITUA20161345A1 (it) * 2016-03-04 2017-09-04 Eltek Spa Dispositivo sensore per contenitori di sostanze liquide
CN110650794B (zh) 2017-03-17 2022-04-29 雅普顿生物系统公司 测序和高分辨率成像
WO2018175039A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 Miller John F Measuring electrophoretic mobility
US11156960B2 (en) * 2017-08-08 2021-10-26 California Institute Of Technology Focusing light inside scattering media with magnetic particle guided wavefront shaping
WO2019051181A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND APPARATUSES BASED ON NANOCAPTERS FOR THE DETERMINATION OF ANALYTES
CN109864747B (zh) * 2017-12-05 2023-08-25 心脏起搏器股份公司 多模式分析物传感器光电子接口
CN109957503B (zh) * 2017-12-14 2022-05-31 长春长光华大智造测序设备有限公司 一种用于高通量基因测序设备的工艺芯片及其应用
US20210341369A1 (en) * 2018-05-18 2021-11-04 President And Fellows Of Harvard College Sample analysis with mirrors
US11557042B2 (en) * 2018-06-12 2023-01-17 King Abdullah University Of Science And Technology Single-camera particle tracking system and method
JP7219390B2 (ja) * 2018-06-29 2023-02-08 澁谷工業株式会社 細胞観察装置
CN109738393B (zh) * 2019-01-10 2021-03-05 上海奥普生物医药股份有限公司 光学检测装置及特定蛋白分析仪
US20240050951A1 (en) * 2020-12-31 2024-02-15 3M Innovative Properties Company Nanopatterned Films with Patterned Surface Chemistry
AU2021221727A1 (en) * 2021-04-20 2022-11-03 Martin Terence Cole IMPROVEMENTS RELATED TO PARTICLE, INCLUDING SARS-CoV-2, DETECTION AND METHODS THEREFOR
WO2022240656A1 (en) * 2021-05-10 2022-11-17 The Regents Of The University Of California Methods of analyzing shaped particles containing cells using fluorescence activated cell sorting
US11828175B2 (en) 2021-07-08 2023-11-28 Saudi Arabian Oil Company Systems and methods for measuring phase flow rates of a multiphase production fluid
US20230194517A1 (en) * 2021-12-21 2023-06-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplex detection in high resolution devices through measurement of localized fluorescence ratios
KR102638903B1 (ko) * 2021-12-21 2024-02-22 공주대학교 산학협력단 연마 공구의 표면 미세 연마 입자 비전 분석 장치 및 방법
CN114295550A (zh) * 2021-12-31 2022-04-08 电子科技大学长三角研究院(湖州) 一种基于表面晶格共振的光流控器件及其应用
CN114152574B (zh) * 2021-12-31 2023-10-17 天津工业大学 用于膜组件完整性检测的便携式水质分析仪及其检测方法
CN116448637B (zh) * 2023-06-14 2023-09-08 北京建工环境修复股份有限公司 一种改性金颗粒标记的暗场显微成像检测纳米塑料的方法

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3975084A (en) 1973-09-27 1976-08-17 Block Engineering, Inc. Particle detecting system
US3939350A (en) * 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US4210384A (en) * 1976-09-11 1980-07-01 Carl Zeiss-Stiftung Inverted-design optical microscope
NL7807532A (nl) 1978-07-13 1980-01-15 Akzo Nv Metaal-immunotest.
US4245031A (en) * 1979-09-18 1981-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Photopolymerizable compositions based on salt-forming polymers and polyhydroxy polyethers
US4420558A (en) 1981-02-12 1983-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors
GB2095258B (en) 1981-03-19 1984-09-05 Janssen Pharmaceutica Nv A bright field light microscopic method of localizing tissue antigens
US4480042A (en) 1981-10-28 1984-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays
US4597944A (en) * 1983-10-18 1986-07-01 Cottingham Hugh V Agglutination reagent detection system
JPS60149130A (ja) * 1984-01-17 1985-08-06 Hitachi Ltd パターン検出方法およびそれに用いる反射防止膜用材料
US4624923A (en) * 1984-06-08 1986-11-25 Yeda Research And Development Company Limited Metal-coated polyaldehyde microspheres
US4752567A (en) 1984-06-21 1988-06-21 Janssen Pharmaceutica N.V. Method of visualizing individual submicroscopic metal particles
US4647544A (en) * 1984-06-25 1987-03-03 Nicoli David F Immunoassay using optical interference detection
CA1291031C (en) * 1985-12-23 1991-10-22 Nikolaas C.J. De Jaeger Method for the detection of specific binding agents and their correspondingbindable substances
US5137827A (en) * 1986-03-25 1992-08-11 Midwest Research Technologies, Inc. Diagnostic element for electrical detection of a binding reaction
US4877647A (en) * 1986-04-17 1989-10-31 Kansas State University Research Foundation Method of coating substrates with solvated clusters of metal particles
US4929400A (en) * 1986-04-28 1990-05-29 California Institute Of Technology Production of monodisperse, polymeric microspheres
US4851329A (en) 1986-06-06 1989-07-25 Massachusetts Institute Of Technology Immunoassay employing optical pulse particle size analysis
US5514602A (en) 1986-06-09 1996-05-07 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Method of producing a metal sol reagent containing colloidal metal particles
US5017009A (en) * 1986-06-26 1991-05-21 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Scattered total internal reflectance immunoassay system
US4876208A (en) * 1987-01-30 1989-10-24 Yellowstone Diagnostics Corporation Diffraction immunoassay apparatus and method
EP0278060B1 (en) * 1987-02-13 1994-04-06 Toray Industries, Inc. Anti-reflection optical article and process of producing the same
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US4806583A (en) * 1987-06-19 1989-02-21 Battaglia Charles R Antiglare coating
GB8803000D0 (en) 1988-02-10 1988-03-09 Ekins Roger Philip Determination of ambient concentrations of several analytes
US4979821A (en) * 1988-01-27 1990-12-25 Ortho Diagnostic Systems Inc. Cuvette for receiving liquid sample
NO164622C (no) 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
DE3826055A1 (de) * 1988-07-30 1990-02-01 Boehringer Mannheim Gmbh Mit reagenz abloesbar impraegnierte traegermatrix
US5079172A (en) 1988-11-04 1992-01-07 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for detecting the presence of antibodies using gold-labeled antibodies and test kit
US5100805A (en) * 1989-01-26 1992-03-31 Seradyn, Inc. Quantitative immunoassay system and method for agglutination assays
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5145748A (en) * 1989-06-20 1992-09-08 W.R. Grace & Co. -Conn. Waterproofing system for water-penetrable construction surfaces
US5376556A (en) * 1989-10-27 1994-12-27 Abbott Laboratories Surface-enhanced Raman spectroscopy immunoassay
JP2899360B2 (ja) 1990-05-21 1999-06-02 興和株式会社 流体中の粒子計測方法及びその装置
US5350697A (en) * 1990-08-28 1994-09-27 Akzo N.V. Scattered light detection apparatus
US5294369A (en) 1990-12-05 1994-03-15 Akzo N.V. Ligand gold bonding
US5784162A (en) * 1993-08-18 1998-07-21 Applied Spectral Imaging Ltd. Spectral bio-imaging methods for biological research, medical diagnostics and therapy
JP3115641B2 (ja) 1991-04-24 2000-12-11 シスメックス株式会社 粒子計数方法
US5286452A (en) 1991-05-20 1994-02-15 Sienna Biotech, Inc. Simultaneous multiple assays
JP2523227Y2 (ja) 1991-07-30 1997-01-22 株式会社堀場製作所 異物検査装置
US5151956A (en) 1991-12-20 1992-09-29 The United Staes Of America As Represented By The Secretary Of The Army Waveguide polarizer using localized surface plasmons
US5248772A (en) * 1992-01-29 1993-09-28 Coulter Corporation Formation of colloidal metal dispersions using aminodextrans as reductants and protective agents
US5305073A (en) 1992-02-12 1994-04-19 Precision Detectors, Inc. Methods and apparatus for molecular characterization
US5518887A (en) * 1992-03-30 1996-05-21 Abbott Laboratories Immunoassays empolying generic anti-hapten antibodies and materials for use therein
DE4404128A1 (de) * 1993-02-19 1994-08-25 Gao Ges Automation Org Sicherheitsdokument und Verfahren zu seiner Herstellung
US5350911A (en) * 1993-04-09 1994-09-27 Hughes Aircraft Company Wavefront error estimation derived from observation of arbitrary unknown extended scenes
DE4414166C1 (de) * 1994-04-22 1995-12-07 Lorenz Mesgeraetebau Verfahren und Vorrichtung zur Messung der Lichtstreuung an Partikeln
US5734498A (en) * 1994-05-09 1998-03-31 The Regents Of The University Of California Illuminator elements for conventional light microscopes
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5728590A (en) * 1994-07-29 1998-03-17 Nanoprobes, Inc. Small organometallic probes
US5498875A (en) * 1994-08-17 1996-03-12 Beckman Instruments, Inc. Signal processing for chemical analysis of samples
US5599668A (en) 1994-09-22 1997-02-04 Abbott Laboratories Light scattering optical waveguide method for detecting specific binding events
US6159748A (en) * 1995-03-13 2000-12-12 Affinitech, Ltd Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry
JP3284056B2 (ja) * 1995-09-12 2002-05-20 株式会社東芝 基板処理装置及びパターン形成方法
US5981180A (en) * 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
US5815278A (en) * 1995-10-25 1998-09-29 University Of Washington Surface plasmon resonance light pipe sensing probe and related interface optics
US5851777A (en) * 1996-02-05 1998-12-22 Dade Behring Inc. Homogeneous sol-sol assay
US6586193B2 (en) * 1996-04-25 2003-07-01 Genicon Sciences Corporation Analyte assay using particulate labels
CA2253710A1 (en) * 1996-04-25 1997-10-30 Spectrametrix Inc. Analyte assay using particulate labels
US5856018A (en) * 1996-06-17 1999-01-05 Yazaki Corporation Plastic articles having multi-layer antireflection coatings, and sol-gel process for depositing such coatings
AU725065B2 (en) * 1996-07-08 2000-10-05 Burstein Technologies, Inc. Cleavable signal element device and method
US6165798A (en) * 1996-10-10 2000-12-26 University Of British Columbia Optical quantification of analytes in membranes
JPH10206603A (ja) * 1997-01-20 1998-08-07 Dainippon Printing Co Ltd 反射防止フィルム及びその製造方法
US6122042A (en) * 1997-02-07 2000-09-19 Wunderman; Irwin Devices and methods for optically identifying characteristics of material objects
WO1998037417A1 (en) 1997-02-20 1998-08-27 The Regents Of The University Of California Plasmon resonant particles, methods and apparatus
US6294327B1 (en) 1997-09-08 2001-09-25 Affymetrix, Inc. Apparatus and method for detecting samples labeled with material having strong light scattering properties, using reflection mode light and diffuse scattering
JP3507319B2 (ja) * 1997-12-08 2004-03-15 キヤノン株式会社 光学的特性測定装置
US6087102A (en) * 1998-01-07 2000-07-11 Clontech Laboratories, Inc. Polymeric arrays and methods for their use in binding assays
US6311275B1 (en) * 1998-08-03 2001-10-30 Cisco Technology, Inc. Method for providing single step log-on access to a differentiated computer network
US6171793B1 (en) * 1999-04-19 2001-01-09 Affymetrix, Inc. Method for scanning gene probe array to produce data having dynamic range that exceeds that of scanner
US6627923B1 (en) * 1999-07-12 2003-09-30 Massachusetts Institute Of Technology Resonant microcavities
KR20010108656A (ko) * 2000-05-30 2001-12-08 윤종용 플래쉬 메모리의 프로그래밍 방법
US7361472B2 (en) * 2001-02-23 2008-04-22 Invitrogen Corporation Methods for providing extended dynamic range in analyte assays
US6714299B2 (en) * 2001-07-13 2004-03-30 Genicon Sciences Corporation Use of light scattering particles in design, manufacture, and quality control of small volume instruments, devices, and processes
US7555173B2 (en) * 2003-04-09 2009-06-30 Cornell Research Foundation, Inc. Electro-optic modulator on rib waveguide

Cited By (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101978254B (zh) * 2008-01-03 2013-10-09 中央佛罗里达大学研究基金会有限公司 使用金属纳米粒子探针和动态光散射的分析物检测
CN102369427A (zh) * 2009-03-23 2012-03-07 金希克股份有限公司 探测分子的方法和装置
US10113967B2 (en) 2011-06-24 2018-10-30 Becton, Dickinson And Company Absorbance sprectrum scanning flow cytometry
CN103608664A (zh) * 2011-06-24 2014-02-26 贝克顿·迪金森公司 吸收光谱扫描流动血细胞计数
US9423348B2 (en) 2011-06-24 2016-08-23 Becton, Dickinson And Company Absorbance spectrum scanning flow cytometry
CN103608664B (zh) * 2011-06-24 2016-09-07 贝克顿·迪金森公司 吸收光谱扫描流动血细胞计数
CN103267854A (zh) * 2013-05-03 2013-08-28 西安交通大学 一种增强试纸检测信号的方法
CN105917227A (zh) * 2013-11-12 2016-08-31 新加坡科技研究局 实时定量和终点比色的pcr装置
CN106716125A (zh) * 2014-06-03 2017-05-24 加利福尼亚大学董事会 纳米颗粒分析器
CN105259086A (zh) * 2015-10-29 2016-01-20 广东美的制冷设备有限公司 粉尘浓度的检测方法及检测系统
CN105259086B (zh) * 2015-10-29 2018-03-27 广东美的制冷设备有限公司 粉尘浓度的检测方法及检测系统
US11536719B2 (en) 2016-10-21 2022-12-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Molecular nanotags
CN110234600B (zh) * 2016-10-21 2023-03-21 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 分子纳米标签
CN110234600A (zh) * 2016-10-21 2019-09-13 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 分子纳米标签
CN106829856A (zh) * 2016-12-14 2017-06-13 佛山旋疯纳米科技有限公司 一种团簇离子束纳米加工设备控制装置及其控制方法
CN111148572A (zh) * 2017-06-06 2020-05-12 西北大学 跨界面磁性分离
CN109387460A (zh) * 2017-08-14 2019-02-26 阅美测量系统（上海）有限公司 一种污染颗粒观察及测试装置及分析方法
CN109254022A (zh) * 2018-10-24 2019-01-22 首钢智新迁安电磁材料有限公司 一种测量晶粒尺寸的方法
CN109542186A (zh) * 2018-12-12 2019-03-29 深圳市福瑞康科技有限公司 一种机箱主箱体、机箱及闪烁检测装置
CN110127771B (zh) * 2019-05-31 2022-03-01 重庆科技学院 四氧化三铁纳米颗粒的调控聚集方法
CN110127771A (zh) * 2019-05-31 2019-08-16 重庆科技学院 四氧化三铁纳米颗粒的调控聚集方法
CN113049455A (zh) * 2019-12-26 2021-06-29 中核北方核燃料元件有限公司 一种包覆燃料颗粒及核芯溯源性直径辅助测量装置
CN113049455B (zh) * 2019-12-26 2023-04-14 中核北方核燃料元件有限公司 一种包覆燃料颗粒及核芯溯源性直径辅助测量装置
CN112014369A (zh) * 2020-08-25 2020-12-01 上海市皮肤病医院 超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法
CN112014369B (zh) * 2020-08-25 2024-02-09 上海市皮肤病医院 超灵敏数字层析快速检测分析物的系统及方法
CN113340894A (zh) * 2021-05-28 2021-09-03 上海睿钰生物科技有限公司 一种非透明微粒的检测方法
CN113552041A (zh) * 2021-06-08 2021-10-26 上海交通大学 一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法
CN113552041B (zh) * 2021-06-08 2022-10-11 上海交通大学 一种基于单颗粒成像的外泌体亚型分析方法
CN114491387A (zh) * 2022-04-06 2022-05-13 天津美腾科技股份有限公司 干选机的识别设备布置方法、装置、电子设备及分选系统
CN114491387B (zh) * 2022-04-06 2022-07-12 天津美腾科技股份有限公司 干选机的识别设备布置方法、装置、电子设备及分选系统

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