CN1299419A - 增强核酸分子合成的组合物和方法 - Google Patents

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D·舒斯特
夏九林
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    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Abstract

本发明涉及用于增强核酸分子,尤其是富含GC的核酸分子合成的组合物和方法。具体来说,本发明提供了包含一或多种含氮有机化合物(或者其盐或衍生物)的组合物,所述化合物具有选自通式Ⅰ或通式Ⅱ的分子式,优选是4－甲基吗啉－N－氧化物或甜菜碱(羧甲基三甲基铵),该组合物中还包含一或多种选自脯氨酸和N－烷基咪唑化合物的化合物,更优选脯氨酸、1－烷基咪唑或4－烷基咪唑。本发明另外涉及增强高忠实性合成核酸分子的方法,包括经由扩增(尤其是PCR)、反转录以及测序的方法。本发明还涉及由这些方法合成的核酸分子、其片段或衍生物,涉及包含这样的核酸分子、片段或衍生物的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于合成、扩增、反转录或测序核酸分子的试剂盒,所述试剂盒中包含一或多种本发明的组合物。

Description

增强核酸分子合成的组合物和方法
发明背景
发明领域
本发明为分子和细胞生物学领域。本发明广泛地涉及用于增强合成核酸分子，尤其是从富含GC的核酸模板来进行合成的化合物、组合物和方法。具体来说，本发明提供了包含一或多种分子式选自通式Ⅰ和通式Ⅱ的化合物的组合物。优选用于本发明的是4-甲基吗啉N-氧化物、甜菜碱(羧甲基三甲基铵)、任何氨基酸(或其衍生物)，和/或N-烷基咪唑化合物，比如1-甲基咪唑或4-甲基咪唑。在一个优选的方式中，将两或多种、三或多种、四或多种本发明所述化合物结合起来用于促进核酸合成。
本发明还涉及包含一或多种本发明所述化合物以及一或多种附加成分的组合物，所述附加成分选自(ⅰ)一或多种核酸分子(包括核酸模板)，(ⅱ)一或多种核苷酸，(ⅲ)一或多种聚合酶或反转录酶以及(ⅳ)一或多种缓冲盐。
本发明的化合物和组合物可以用于增强高忠实度合成核酸分子的方法中，包括经由扩增(尤其是PCR)、反转录和测序进行合成的方法。本发明还涉及由这些方法制备的核酸分子、其片段或衍生物，涉及包含这样的核酸分子、片段或衍生物的载体和宿主细胞。本发明还涉及利用这些核酸分子来制备所需多肽。本发明还涉及包含本发明所述组合物或化合物的试剂盒。
相关技术
基因组DNA
在考察一个生物、组织或细胞的结构和生理时，经常希望确定其遗传学组成。在脱氧核糖核酸(DNA，它包含在生物的体细胞和生殖细胞中)的双链核苷酸碱基序列中编码着该生物的基因结构(即基因组)。一个特定DNA片段，或基因的遗传学内容仅在产生由该基因最终编码的蛋白质时才显现。为了产生蛋白质，由聚合酶产生DNA双螺旋的一个链(有义链)的互补拷贝，从而得到信使核糖核酸(mRNA)的特异序列。然后由细胞的蛋白质合成机制对该mRNA进行翻译产生由该基因编码的特定蛋白质。在基因组中有一些不编码蛋白质的附加序列(即非编码区)，它们发挥结构、调节或未知的一些功能。因此，一个生物或细胞的基因组是编码蛋白质的基因以及间插的非编码DNA序列的总和。重要的是，多细胞生物的每一个体细胞都含有该生物的全部基因组DNA，除了在病灶性感染或癌症的情况中可能在特定细胞的基因组DNA中插入了1或多个异种DNA序列，而在该生物其他未感染细胞中未插入。但是正如以下提及的，构成基因组DNA的基因的表达在各个细胞间可以不同。
cDNA和cDNA文库
在一个给定细胞、组织或生物中，存在着多种mRNA，每一个编码一个独立和特异的蛋白质。这个事实给希望研究组织或细胞内基因表达的研究人员提供了一种有力的工具一可以分离mRNA分子并进一步通过各种分子生物学技术进行操作，从而能弄清一个细胞、组织或生物的全部功能性遗传学组成。
研究基因表达的一个常见方法是制备互补DNA(cDNA)克隆。在这项技术中，从生物的细胞或组织提取物中分离该生物的mRNA分子。分离经常采用固相层析介质，比如已复合了脱氧胸苷(dT)寡聚物的纤维素或羟磷灰石。因为所有真核mRNA分子3’末端都含有一段脱氧腺苷(dA)碱基，并且dA能结合dT，就可以迅速地从组织或细胞提取物中的其他分子和物质中纯化出mRNA分子。由这些纯化的mRNA分子，可以利用逆转录酶制备cDNA拷贝，就产生单链cDNA分子。然后可以通过DNA聚合酶的作用将该单链cDNA分子转化为原来的mRNA的完整双链DNA拷贝(也就是原来包含在生物的基因组中，编码所述mRNA的双链DNA序列)。然后可以将蛋白质特异性双链cDNA插入质粒，再将后者导入宿主细菌细胞。使该细菌细胞在培养基中生长，产生一群含有(或者在许多情况中是表达)目的基因的细菌细胞。
这个完整的过程，从分离mRNA到将cDNA插入质粒再到含有分离基因的细菌群落的生长称为：“cDNA克隆”。如果cDNA是从许多不同的mRNA制备的，产生的一组cDNA称为“cDNA文库”，代表来源细胞、组织或生物体内存在的不同功能性(即表达的)基因。这些cDNA文库的基因型分析能得到它们所来源的生物的许多有关结构和功能的信息。
DNA扩增
为了使样品中的特异DNA序列增加拷贝数或“扩增”，研究人员采用了许多扩增技术。一个常用的扩增技术是Mullis和同事(美国专利4683195；4683202和4800159)描述的聚合酶链式反应(“PCR”)。该方法使用了与待扩增DNA序列相应区域互补的“引物”序列。将这些引物与过量的核苷酸碱基以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)一起加入DNA靶样品中，引物就通过碱基特异性结合作用(即腺苷结合胸腺苷，胞苷结合鸟苷)结合到靶序列上。反复使反应体系经过升高和降低温度的循环(使靶序列上的DNA双链解离，由聚合酶合成每个链的互补拷贝以及新互补链重新退火)，可以迅速增加特定DNA序列的拷贝数。
也已经建立了用于扩增靶核酸序列的其他技术。例如，Walker等(美国专利5455166；EP0684315)描述了一种叫作链取代扩增(SDA)的方法，它与PCR的不同之处在于它采用单一温度，联合使用聚合酶/内切核酸酶来制备靶DNA序列的单链片段，后者然后作为生产互补DNA(cDNA)链的模板。Davey等(美国专利5409818；EP0329822)公开了一种替代的扩增步骤，称为基于核酸序列的扩增(NASBA)。与SDA类似，NASBA采用了恒温反应，但它基于利用RNA引物，而非PCR或SDA中的DNA引物来进行扩增。另一种已知的扩增步骤包括Berninger等(美国专利5194370)描述的启动子连接激活的转录酶(LAT)。
基于PCR的DNA指纹作图
尽管已有多种扩增技术可供使用，多数DNA指纹作图方法利用PCR技术已确定的方案和自动操作，依赖该项技术进行扩增。这种基于PCR的指纹图谱技术包括随机扩增的DNA多态性(RAPD)分析(Williams,J.G.K等，核酸研究18(22)：6531-6535(1990))，任意引物PCR(AP-PCR；Welsh,J.和McClelland,M.,核酸研究18(24)：7213-7218(1990))，DNA扩增指纹图谱(DAF；Caetano-Anolles等，生物/技术9：553-557(1991))以及微卫星PCR或小卫星区域DNA的定向扩增(DAMD；Heath,D.D.等，核酸研究21(24)：5782-5785(1993))。所有这些方法都是基于利用任意选择的引物，通过PCR来扩增随机DNA片段。
DNA测序
通常，有两种技术用于核酸测序。在以其两个创立者命名为“Maxam和Gilbert测序法”的第一种方法(Maxam,A.M.和Gilbert,W.美国科学院学报74：560-564,1977)中，将DNA放射性标记，分成4份样品并用选择性破坏DNA中的特定核苷酸的化学物质处理，在损伤位点裂解分子。通过凝胶电泳将所得片段分成独立条带，并将凝胶对X光胶片曝光就可以从胶片上读出原始DNA分子的序列。该技术可用来确定某些复杂DNA分子的序列，包括灵长动物病毒SV40(Fiers,W.,等，自然273：113-120,1978；Reddy,V.B.等，科学200：494-502,1978)和细菌质粒pBR322(Sutcliffe,G.,冷泉港研讨会，定量生物学43：444-448,1975)。
更常用的是另外一种根据创立者命名为“Sanger测序法”(Sanger,F.,和Coulson,A.R.,分子生物学杂志94：444-448,1975)的测序技术。这种方法利用DNA聚合酶的DNA合成活性，即与含有终止反应的双脱氧核苷三磷酸及一个短引物(其中之一可被可检测地标记)的体系结合时，能产生一系列特异终止于四种双脱氧碱基之一的新合成的DNA片段。然后通过凝胶电泳分辨这些片段，并按照上述Maxam和Gilbert测序法确定序列。通过进行四个独立的反应(每次用一种ddNTP)，即使相当复杂的DNA分子也能迅速地确定其序列(Sanger,F.,等，自然265：678-695,1977；Barnes,W.,酶学方法152：538-556,1987)。Sanger测序法通常使用大肠杆菌或T7 DNA聚合酶(美国专利4795699)，而近来该技术改用T7聚合酶的突变体使得在含有不同浓度的四种链终止ddNTP的体系中一次反应即可完成测序(美国专利4962020和5173411)。对这项技术的其他改进，即减少或消除反应体系中影响反应的焦磷酸的积累，也已有描述(美国专利5498523)。测定核酸分子序列的其他方法也有描述(见Murray,核酸研究17：8889,1989；和Craxton,方法：酶学方法的比较，3：20-25,1991)。
局限性
正如以上提到的，忠实和高保真地拷贝模板核酸分子是扩增、反转录和测序中合成核酸分子的关键步骤。然而，采用常规组合物和方案来进行合成经常效率很低，因为这些方法倾向于在核酸模板中的某些二级结构(Gerard,G.F.,等，FOCUS11(4)：60(1989)；Myers,T.W.,和Gelfand,D.H.,生物化学30：7661(1991))和序列(Messer,L.I.等，病毒学146：146(1985)；Abbotts,J.,等，生物化学杂志168：10312-10323(1993))障碍处过早地终止核酸分子的合成。对于那些鸟苷/胞苷含量高(即“富含GC”的模板)以及较大(即长度超过3-5kb的模板)的模板序列更是如此。模板核酸分子中的这些二级结构和序列障碍经常出现在均聚体片段中(Messer,L.I.等，病毒学146：146(1985)；Huber,H.E.,等，生物化学杂志264：4669-4678(1989)；Myers,T.W.,和Gelfand,D.H.,生物化学30：7661(1991))，且更经常是序列而非二级结构障碍(Abbotts,J.,等，生物化学杂志168：10312-10323(1993))。如果能克服这些障碍，合成反应中的总核酸产量和全长核酸产物的产量就能提高。
有些报道已表明调节反应体系中的离子强度或摩尔渗透压浓度，尤其是Na+和K+离子浓度，可能象在体内的情况那样影响核酸的体外二级结构和缩合(Le Rudulier,D.等，科学224：1064(1984)；Buche,A.等，生物分子结构动力学杂志8(3)：601(1990)；Marquet,R.和Houssier,C.,生物分子结构动力学杂志9(1)：159(1991)；Buche,A.等，生物分子结构动力学杂志11(1)：95(1993)；Woodford,K.等，核酸研究23(3)：539(1995)；Flock,S.等，生物物理杂志70：1456(1996)；Flock,S.等，生物物理杂志71：1519(1996)；EP0821059A2)。在某些这类研究中，发现在含有任何一种天然和合成的渗透压保持(osmoprotectant)化合物的缓冲溶液中，体外的核酸构象和稳定性提高，所述化合物包括多糖，比如海藻糖(Carninci,P.等，美国科学院学报95：520-524(1998))，某些助溶剂，比如甘油和二甲基亚砜(Varadaraj,K.和Skinner,D.M.,基因140：1(1994))；甘氨酸及其衍生物(Buche,A.等，FEBS快报247(2)：367(1989)；Flock,S.等，生物分子结构动力学杂志13(1)：87(1995)；Houssier,C.等，Comp.Biochem.Physiol.117A(3)：313(1997))；低分子量胺比如β-丙氨酸、天冬酰胺和胱胺(Kondakova,N.V.等，分子生物学(Moscow)9(5)：742(1975)；Aslanian,V.M.等，Biofizika29(4)：564(1984))；以及其他含氮化合物和氨基酸比如脯氨酸、甜菜碱和ectoine(Rees,W.A.等，生物化学32：137-144(1993)；WO95/20682；DE4411588C1；DE4411594C1；Mytelka,D.S.等，核酸研究24(14)：2774(1996)；Baskaran,N.等，基因组研究6：633(1996)；Weissensteiner,T.和Lanchbury,J.S.,生物技术21(6)：1102(1996)；Rajendrakumar,C.S.V.,等，FEBS快报410：201-205(1997)；Henke,W.,等，核酸研究25(19)：3957(1997)；Hengen,P.N.TIBS22：225(1997))。甜菜碱和ectoine是许多细菌和动物细胞中的天然渗透压保持物(Chambers,S.T.,等，细菌学杂志169(10)：4845(1987)；Randall,K.,等，生物化学生物物理学报1291(3)：189(1996)；Randall,K.,等，生物化学细胞生物学74(2)：283(1996)；Malin,G.,和Lapidot,A.,细菌学杂志178(2)：385(1996)；Gouesbet,G.,等，细菌学杂志178(2)：447(1996)；Canovas,D.等，细菌学杂志178(24)：7221(1996)；Canovas,D.等，生物化学杂志272(41)：25794-25801(1997)。
但是本领域仍需要可用于增强核酸分子(尤其是那些富含GC和/或较大的核酸分子)合成的化合物、组合物以及方法。
                     发明简述
概括地说，本发明涉及用于增强特别是从富含GC的核酸模板合成核酸分子的化合物、组合物及方法。在一个方面，本发明涉及用于合成核酸分子的化合物和组合物，特别是用于模板介导的合成，诸如扩增、逆转录和测序反应。本发明的化合物和组合物包含一个或多个具有选自式Ⅰ或式Ⅱ的化学式的化合物，及其盐和衍生物。在一个优选方面，本发明中所用的化合物包括任何一种氨基酸、任何一种糖(单糖或多糖)、任何一种多元醇，或其盐或衍生物。本发明的化合物或组合物包括具有式Ⅰ或式Ⅱ中所示化学式的化合物，或其盐或衍生物，其中的芳基选自苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯、亚联苯基和芴基；其中的卤基选自氟、氯、溴和碘；其中的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基，也可能是支链烷基；其中的链烯基选自乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基和癸烯基，也可能是支链烯基；其中的炔基选自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基和癸炔基，也可能是支链炔基；其中的低级烷氧(醚)基是被上述某一个烷基取代的氧。本发明也涉及这些化合物的盐及衍生物。在本发明的特别优选的方面，化合物选自4-甲基吗啉N-氧化物、甜菜碱、肉碱、ectoine、脯氨酸、甘氨酸、2-哌啶酸、三甲胺N-氧化物、N-烷基咪唑化合物诸如1-甲基咪唑或4-甲基咪唑、平均分子量为约50,000-500,000道尔顿的聚(2-乙基-2-噁唑啉)、平均分子量为约100,000-200,000道尔顿的聚(氯化二烯丙基二甲基铵)，或其盐或衍生物。本发明也涉及包含本发明化合物和一种或多种其他组分的组合物，所述其他组分选自：(ⅰ)一种或多种具有核酸聚合酶活性的酶，它们可以是热稳定酶，(ⅱ)一种或多种核苷酸，(ⅲ)一种或多种缓冲盐，以及(ⅳ)一种或多种核酸分子。按照本发明的这个方面优选的酶可包括DNA聚合酶(诸如Taq,Tne,Tma,Pfu,VENTTM,DEEPVENTTM和TthDNA聚合酶，及其突变型、变体和衍生物)、RNA聚合酶(诸如SP6、T7或T3 RNA聚合酶，及其突变型、变体和衍生物)和逆转录酶(诸如M-MLV逆转录酶、RSV逆转录酶、AMV逆转录酶、RAV逆转录酶、MAV逆转录酶和HIV逆转录酶，及其突变型、变体和衍生物)。优选这些逆转录酶的RN ase H活性降低或实质降低。
本发明还涉及合成核酸分子的方法，包括(a)将核酸模板(可能是DNA分子比如cDNA分子，或RNA分子比如mRNA分子)与1或多个(优选2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个等)本发明所述化合物或组合物混合成反应体系；和(b)足以产生与全部或部分模板互补的第一核酸分子的条件下温育反应体系。任选本发明的这类方法包含1或多个附加步骤，比如在足以产生与全部或部分模板充分互补的第二个核酸分子的条件下温育上面描述的第一核酸分子。本发明还涉及由这些方法制备的核酸分子，涉及包含这些核酸分子的载体(可以是表达载体)，涉及包含这些核酸分子或载体的宿主细胞。本发明还涉及制备多肽的方法，包括在有利于宿主细胞产生该多肽的条件下培养以上描述的宿主细胞，以及分离多肽。本发明还涉及由这些方法制备的多肽。
本发明还涉及扩增核酸分子的方法，包括(a)将核酸模板与1或多个本发明所述化合物或组合物混合为反应体系；和( )在足以扩增与全部或部分模板互补的核酸分子的条件下温育反应体系。更具体地说，本发明涉及一种扩增DNA分子的方法，包括：
(a)提供第一和第二引物，其中该第一引物与所述DNA分子第一链的3’末端或附近的序列互补，第二引物与所述DNA分子第二链的3’末端或附近的序列互补；
(b)在有一或多种本发明所述化合物或组合物的情况下，使所述第一引物与第一链以及所述第二引物与第二链发生杂交，反应条件是保证合成与第一链互补的第三DNA分子以及与第二链互补的第四DNA分子；
(c)使所述第一和第三链，以及第二和第四链变性；以及
(d)重复步骤(a)到(c)1或多次。
这类条件可包括在有一或多种聚合酶，一或多种核苷酸和/或一或多种缓冲盐的情况下温育。本发明还涉及由这些方法扩增的核酸分子。
本发明还涉及核酸分子的测序方法，包括(a)将待测序的核酸分子与1或多个引物，一或多种本发明所述化合物或组合物，一或多种核苷酸以及一或多种终止剂混合为反应体系；(b)在能有效合成一组与全部或部分待测序分子互补的分子的条件下温育反应体系；以及(c)分离分子群从而确定待测序分子全部或部分的核苷酸序列。本发明更具体涉及一种DNA分子的测序方法，包括：
(a)使引物与第一DNA分子杂交；
(b)使步骤(a)所述分子与脱氧核苷三磷酸，一或多种本发明所述化合物或组合物，一或多种终止核苷酸接触；
(c)在能有效合成随机一组与所述第一DNA分子互补的DNA分子的条件下温育步骤(b)所述的反应体系，其中所述合成的DNA分子比第一DNA分子短，并且所述合成的DNA分子在其3’端含有一个终止核苷酸；以及
(d)按照大小分离所述合成的DNA分子从而能确定所述第一DNA分子的至少部分核苷酸序列。
所述终止核苷酸包括ddNTP、ddATP、ddGTP、ddITP或ddCTP。这类条件可包括在有一或多种DNA聚合酶和/或缓冲盐的条件下温育。
本发明还涉及用于合成核酸分子的试剂盒，该试剂盒包含1或多个含有一或多种本发明所述化合物或组合物的容器。任选本发明的这些试剂盒包含一或多种附加成分，其选自一或多种核苷酸、一或多种聚合酶和/或逆转录酶、合适的缓冲液、一或多种引物以及一或多种终止剂(比如一或多种双脱氧核苷酸)。
参考以下附图和说明书，以及权利要求书，本发明的其他优选实施方案对本领域技术人员是显而易见的。
附图简述
图1是溴化乙锭染色的PCR反应体系样品琼脂糖凝胶的照片，该样品是在有所示浓度的脯氨酸、1-甲基咪唑、4-甲基咪唑、甜菜碱或没有这些助溶剂的情况下扩增的。M：DNA分子量标记。
图2是溴化乙锭染色的PCR反应体系样品琼脂糖凝胶的照片，该样品是在有所示浓度的甜菜碱或MMNO的情况下扩增的。M：DNA分子量标记。
图3是溴化乙锭染色的各样品琼脂糖凝胶的照片，诸样品是在有或没有不同组合方式的化合物的情况下扩增的3个不同铜绿假单胞扩增子(AprD、AprE和AprF)。第1栏：1M甜菜碱；第2栏：1M TMANO；第3-7栏：2M(第3栏)、1M(第4栏)、0.5M(第5栏)、0.4M(第6栏)或0.2M(第7栏)的MMNO；第8栏：没有化合物的对照。M：DNA分子量标记。
图4是溴化乙锭染色的各样品琼脂糖凝胶的照片，诸样品是在有或没有所示浓度的甜菜碱、MMNO、或脯氨酸，于不同反应缓冲液条件下PCR扩增的p53外显子10。
图5是溴化乙锭染色的各样品琼脂糖凝胶的照片，诸样品是在有或没有所示浓度的甜菜碱、MMNO、或脯氨酸，于不同反应缓冲液条件下PCR扩增的Dra DNA聚合酶Ⅰ。
图6是溴化乙锭染色的各样品琼脂糖凝胶的照片，诸样品是在有或没有以不同比率混合的MMNO和脯氨酸，或者在只有MMNO、脯氨酸或甜菜碱，于不同反应缓冲液条件(Mg++浓度)下PCR扩增的p53外显子10。
图7是溴化乙锭染色的各样品琼脂糖凝胶的照片，诸样品是在有或没有以不同比率混合的MMNO和脯氨酸，或者在只有MMNO、脯氨酸或甜菜碱，于不同反应缓冲液条件(Mg++浓度)下PCR扩增的Dra DNA聚合酶Ⅰ。
图8是溴化乙锭染色的各样品琼脂糖凝胶的照片，诸样品是PCR扩增的富含GC的P32D9模板，照片显示了MMNO和脯氨酸的混合物，或者甜菜碱对最佳退火温度的影响。
图9是在有各种浓度甜菜碱或者MMNO和脯氨酸的1∶1混合物的情况下，从K562细胞系基因组经PCR扩增脆性X位点的样品的溴化乙锭染色琼脂糖凝胶照片。第1泳道：无助溶剂；第2泳道：0.25M；第3泳道：0.5M；第4泳道：0.75M；第5泳道：1M；第6泳道：1.25M；第7泳道：1.5M；第8泳道：1.75M；第9泳道：2M。M：DNA分子量标记。
图10是在有或无各种浓度的MMNO与脯氨酸的1∶1混合物情况下，经PCR扩增两个不同的富含GC的长腺病毒DNA片段样品的溴化乙锭染色琼脂糖凝胶电泳照片。第1泳道：无助溶剂；第2泳道：0.25M；第3泳道：0.5M；第4泳道：1.0M。M：DNA分子量标记。
图11是在有或无各种浓度的MMNO与脯氨酸(A泳道)、甜菜碱(B泳道)、L-肉碱(C泳道)或DL-2-哌啶酸(D泳道)1∶1混合物的情况下，经PCR扩增K562基因组DNA中富含GC片段的样品的溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳照片。第1泳道：无助溶剂；第2泳道：0.25M；第3泳道：0.5M；第4泳道：1.0M。M：DNA分子量标记。
图12是在有或无各种浓度的甜菜碱(A泳道)或ectoine(B泳道)的情况下，经PCR扩增K562基因组DNA中富含GC片段的样品的溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳照片。第1泳道：无助溶剂；第2泳道：0.25M；第3泳道：0.5M；第4泳道：1.0M。M：DNA分子量标记。
图13显示了可以用于本发明的许多化合物实例的结构。
                     发明详述
定义
在以下的说明书中，广泛地使用了大量用于重组DNA技术的术语。为了清楚和一致地理解说明书和权利要求书(包括这些术语适用的范围)，给出如下定义。
文库。术语“文库”或“核酸文库”用在此处是指一组代表一种生物的全部或相当一部分DNA成分的核酸分子(环形或线形)(基因组文库)，或者一组代表细胞、组织、器官或生物中表达基因的全部或相当一部分的核酸分子(cDNA文库)。这些文库可以包含或不包含于1或多个载体中。
载体。在此处“载体”是质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体DNA，或者其他能在宿主细胞中自主复制，并且其特征在于有1或少量限制性内切核酸酶识别位点的DNA分子，在这些位点可以以不损害载体的基本生物学功能的确定方式将所述DNA序列切割，并插入DNA以便进行其复制和克隆。所述载体还可以包含适用于鉴定转化了载体的细胞的标记物。标记物，例如，包括但不限于四环素抗性或氨苄青霉素抗性。
引物。在此处“引物”指在DNA分子的扩增或聚合过程中，通过核苷酸单体共价结合延伸的单链寡核苷酸。
模板。此处所用术语“模板”指待扩增、合成或测序的双链或单链核酸分子。对于双链分子，优选在所述分子扩增、合成或测序前将其链变性以形成第一和第二链，或者可以直接用作模板。对于单链模板，在适当的条件下引物与其所互补的部分模板杂交，然后一或多种聚合酶可以合成与所述模板全部或部分互补的核酸分子。可选择地，对于双链模板，可以将1或多个启动子(例如，SP6、T7或T3启动子)与1或多个聚合酶联合使用来制备与全部或部分模板互补的核酸分子。新合成的分子，依照本发明，可以与原始模板在长度上相同或更短。
掺入。此处所用术语“掺入”意指成为DNA和/或RNA分子或引物的一部分。
扩增。“扩增”用在此处指任何利用聚合酶来提高核苷酸序列拷贝数的体外方法。核酸扩增导致核苷酸掺入DNA和/或RNA分子或引物中从而形成与模板互补的新分子。所形成的核酸分子及其模板可以作为合成另外的核酸分子的模板。在此处，一个扩增反应可以包括多轮复制。DNA扩增反应包括，例如，聚合酶链式反应(PCR)。一次PCR反应可以包括5到100轮DNA分子的变性和合成。
寡核苷酸。“寡核苷酸”指包含共价连接的核苷酸序列的合成或天然分子，它是在一个核苷酸中脱氧核糖或核糖的3’位点和相邻核苷酸中脱氧核糖或核糖的5’位点之间通过磷酸二酯键结合。
核苷酸。此处所用“核苷酸”指一种碱基-糖-磷酸结合体。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的单体单元。术语核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP以及脱氧核糖核苷三磷酸比如dATP、dUTP、dITP、dCTP、dGTP、dTTP或者它们的衍生物。这类衍生物包括，例如，[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及能赋予含有它们的核酸分子核酶抗性的核苷酸衍生物。术语核苷酸用在此处还指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的例子包括，但不限于，ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。根据本发明，核苷酸可以是未标记或通过公知技术可检测性地标记了的。可检测的标记包括，例如，放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标。
杂交。术语“杂交”指两个互补的单链核酸分子(RNA和/或DNA)经碱基配对形成双链分子。在这里，两个核酸分子的碱基配对即使不完全互补，也可以杂交。相应地，只要使用本领域公知的合适条件，错配碱基不防碍两个核酸分子的杂交。
单位。术语“单位”用在此处指酶的活性。例如指热稳定的DNA聚合酶时，1个酶活单位是能在标准的DNA引导合成条件下，于30分钟内将10纳摩尔dNTP掺入酸不溶物质(即DNA或RNA)所需的酶量。
文中使用的重组DNA技术和分子及细胞生物学领域的其他术语本领域技术人员一般能理解。
概述
总的来讲，本发明涉及用于增强核酸分子、尤其是富含GC的核酸模板的合成的化合物、组合物及方法。具体地说，本发明提供了包含一种或多种具有选自式Ⅰ和式Ⅱ的结构式的化合物或其盐或衍生物的化合物和组合物。按照本发明，优选使用至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个……等等这样的化合物或组合物。首选使用2-6、2-5、2-4或2-3个这样的化合物或组合物。本发明的化合物或组合物可以是盐的形式。
式Ⅰ：
其中A是
其中X是
其中Z可以与Y相同或不同，
其中Y和Z各自独立地选自-OH、-NH2、-SH、-PO3H、-CO2H、-SO3H和氢；f为0-2的整数，m为0-20的整数，e为0-2的整数；
其中R4、R5和R6可以相同或不同，各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、氨基、巯基、硫醇、卤、硝基、次氮基、羟基、羟基烷基、羟基芳基、磷酸基(phosphato)、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺酰基、磺基和酰氨基，d为0-2的整数；
其中a、b和c各自独立地为0-1的整数，条件是a、b和c中最多有两个为0；
其中R1、R2和R3可以相同或不同，各自独立地选自：
a)=0；
b)
Figure 9980575300204
其中R7和W可以相同或不同，各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、氨基、巯基、硫醇、卤、硝基、次氮基、羟基、羟基烷基、羟基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺酰基、磺基和酰氨基；g为0-2的整数，n为0-20的整数；
其中q可以为1-100,000。
在式Ⅰ化合物中，当q=1时，式Ⅰ化合物可以认为是一个单体，而当q=2-100,000时，式Ⅰ化合物可以认为是一个由2-100,000个单体组成的多聚体或聚合物，它们可以具有相同或不同的结构，并且它们可以经过一个或多个基团由一个或多个键相连，形成一个式Ⅰ化合物的多聚体(例如一个聚合物)。
在一个优选方面，当a、b或c为0时，相应的R基团是一对电子。
在另一个优选的实施方案中，当q=1且(R1)a、(R2)b和(R3)c之一为=0而另两个R基团相同或不同、各自独立地选自氢、甲基、乙基和丙基时，A不是甲基、乙基或丙基。
式Ⅱ：
其中式Ⅱ是饱和或不饱和的；
其中q可以为1-100,000；
其中X选自N、C、O、P和S；
其中Y选自O、N、S、P、C、-O-NH-、-O-CH2-O-、-O-S-、-O-CH2-S-、-O-CH2-NH-、-NH-S-、-NH-CH2-NH-、-O-CH(CH3)-NH-、-NH-CH(CH3)-NH-、-O-CH(CH3)-O-、-NH-C(CH3)2-NH-、-NH-CH2-S-，以及其他硫醇、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺酰基、磺基和酰氨基；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8可以相同或不同，各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、氨基、巯基、硫醇、卤、硝基、次氮基、羟基、羟基烷基、羟基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺酰基、磺基和酰氨基；
其中a、b、c、d、e、m、n和o是相同或不同的整数，a、b、c、d和e各自独立地选自0-2，m、n和o各自独立地选自0-5。
在式Ⅱ化合物中，当q=1时，式Ⅱ化合物可以认为是一个单体，而当q=2-100,000时，式Ⅱ化合物可以认为是一个由2-100,000个单体组成的多聚体或聚合物，它们可以具有相同或不同的结构，并且它们可以经过一个或多个基团由一个或多个键相连，形成一个式Ⅱ化合物的多聚体(例如一个聚合物)。
在本发明的一个优选方面，Y和/或X为N，m、n和o为1。在另一个优选方面，Y和/或X为N和/或O，m和n为1，o为2。优选地，当a、b、c、d和/或e为零时，相应的R基团是一对电子或者与不饱和结构的形成有关。
对于式Ⅰ和式Ⅱ化合物来说：
典型的C6-14芳基包括但不限于：苯基、苄基、甲基吲哚基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯、亚联苯基和芴基；
典型的卤基包括但不限于：氟、氯、溴和碘；
典型的C1-15烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基以及支链烷基；
典型的C2-15链烯基包括但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等，以及支链烯基；
典型的C2-15炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等等，以及支链炔基；
典型的低级烷氧(醚)基包括被上述某一个C1-4烷基取代的氧；
典型的C2-6烷酰氧基包括乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基及其支链异构体。
按照本发明可以使用的化合物包括糖、氨基酸和多元醇，及其衍生物。糖的实例包括但不限于低聚糖和单糖，诸如海藻糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、木二糖、琼脂二糖、纤维二糖、果聚二糖(levanbiose)、quitobiose、2-β-葡糖醛酸糖基葡糖醛酸(2-β-glucuronosylglucuronic acid)、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、山梨糖醇、果糖、木糖醇和阿糖醇。
这类氨基酸可包括但不限于：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，及其衍生物。按照本发明可以使用D型和L型氨基酸以及非蛋白氨基酸。实例包括N-(3’-酮-5’-甲基)-己基丙氨酸、亮氨酸甜菜碱、N-甲基异亮氨酸和γ-谷氨酰基亮氨酸。
多元醇的实例包括但不限于甘油、乙二醇、聚乙二醇，等等。
本发明的优选化合物可包括但不限于：4-甲基吗啉-N-氧化物(MMNO)和N-烷基咪唑化合物，诸如1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑，甜菜碱(羧甲基三甲铵)，牛磺酸，ectoine，2-哌啶酸，2-哌啶酸，2-吗啉代乙磺酸，吡啶-N-氧化物，N,N-二甲基辛胺-N-氧化物，3-甲基异噁唑-5(4H)-酮吗啉盐，甘氨酸，肌氨酸，N,N-二甲基甘氨酸，N-甲基-脯氨酸，4-羟基-脯氨酸，1-甲基-2-吡咯羧酸，1-甲基吲哚-2-羧酸，2-吡嗪羧酸，5-甲基-2-吡嗪羧酸，4-甲基-5-咪唑-甲醛，1-甲基吡咯-2-羧酸，1-乙基-3-甲基咪唑鎓硝酸盐，乙基-氮杂环丁烷-1-丙酸盐，N,N-二甲基-苯丙氨酸，S-羧甲基-半胱氨酸，2-咪唑甲醛，4-咪唑乙酸，4-咪唑羧酸，4,5-咪唑二羧酸，肉碱-Ne-乙酰-b-赖氨酸，γ-氨基丁酸，反式-4-羟基水苏碱，Nα-氨基甲酰基-L-谷氨酰胺-1-酰胺，胆碱，二甲基噻亭，(磺基甜菜碱和二甲基乙酰噻亭，及其衍生物)，N-乙酰基谷氨酰胺酰基谷氨酰胺氨化物，二甲基锍基丙酸盐，ectoine(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶(pirymidine)羧酸)，hydroxy ectoine，谷氨酸盐，β-谷氨酰胺，真蛸碱，肌氨酸，三甲胺-N-氧化物(TMAO)，平均分子量为约50,000-500,000道尔顿的聚(2-乙基-2-噁唑啉)，平均分子量为约100,000-200,000道尔顿的聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)，以及所有其他氨基酸及其衍生物。
其他优选的化合物包括式Ⅰ和式Ⅱ化合物的衍生物和盐。例如，当式Ⅰ或式Ⅱ化合物含有羧基(C=O)时，本发明化合物包括该羧基的酯和酰胺，它们可以用常规化学合成方法制备，例如通过将含有羧基的化合物与醇或氨基化合物缩合。在本发明的这个方面有用的醇的实例包括C1-6醇和C7-12芳烷醇化合物，包括但不限于：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇，及其支链异构体。在本发明的这个方面有用的氨基化合物的实例包括C1-6氨基化合物和C7-12芳烷氨基化合物，包括但不限于：甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺，及其支链异构体。当式Ⅰ或式Ⅱ化合物含有羟基(-OH)时，本发明化合物包括这些化合物的酯，它们可以通过将含有羟基的化合物与例如C1-6链烷酸、C6-12芳基链烷酸、或C2-12二链烷酸或其酸酐等进行缩合而制备，例如，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸，及其支链异构体，以及琥珀酸、琥珀酸酐、富马酸、马来酸等等。结合本文中的教导和本领域中的常识，可以按照本发明制备和使用的式Ⅰ和式Ⅱ化合物的其他衍生物对于本领域技术人员来说是显而易见的。
本发明的范围内也包括式Ⅰ和式Ⅱ化合物的盐。利用常规化学合成方法可以形成式Ⅰ和式Ⅱ化合物的酸加成盐，例如通过将特定化合物的溶液与酸的溶液混合，诸如盐酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、草酸等等。利用常规化学合成方法也可以形成式Ⅰ和式Ⅱ化合物的碱性盐，例如通过将特定化合物的溶液与碱的溶液混合，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胆碱、碳酸钠、Tris等等。结合本文中的教导和本领域中的常识，可以按照本发明制备和使用的式Ⅰ和式Ⅱ化合物的其他盐对于本领域技术人员来说是显而易见的。
上述化合物和组合物可以单独使用或以其任意组合使用。按照本发明，优选使用至少两个、至少三个、至少四个、至少五个……等等的组合。在一个优选方面，使用2-10个、2-9个、2-8个、2-7个、2-6个、2-5个、2-4个和2-3个这类化合物。在一个优选方面，本发明涉及通过将上述化合物任意组合后混合得到的组合物。在将这些化合物混合在一起时可能会发生某些相互作用，这种作用可能改变所混合的一种或多种化合物的结构，并导致新的或不同的化合物形成。
这些组合物可以在用于增强核酸分子的高保真性合成的方法中使用，包括经扩增(特别是PCR)、逆转录和测序方法来增强核酸分子的高保真性合成的方法。本发明也涉及利用这些方法生产的核酸分子，其片段或衍生物，以及包含这类核酸分子、片段或衍生物的载体和宿主细胞。本发明也涉及将这类核酸分子用于生产所需的多肽。本发明还涉及包含本发明化合物或组合物的试剂盒。
合成方法
本发明的式Ⅰ和式Ⅱ化合物可以用本领域技术人员熟知的标准有机化学合成技术合成，如下所述。
式Ⅰ化合物的合成可以如下进行：
例如，当R4和Z为H，Y为-CO2H，d、e、f和m为1时，起始化合物为BrCH2CH2CO2H，它可以从商业上购得。
式Ⅱ化合物的合成可以如下进行：
例如，当R2和R3为H、b和m为1、c-1和n-1为0时，起始化合物为NH2-CH2-COH，它可以从商业上获得。
可以从商业上获得的还有BrCH2CO2H、CH3CH(Br)CO2H、CH2CH2CH(Br)CO2H、BrCH2CH2CH2CO2H、Cl-CH2-CH2-Cl(CH3)2CHCH(Br)CO2、CH3CH2CH(Br)CO2H、BrCH2CH2CH2CO2H、BrCH2CH2CO2H、HO2CCH2CH(Br)CO2H。这些化合物可以从Aldrich公司(St.Louis,MO)获得。
本发明中所用的许多化合物，诸如氨基酸及其衍生物、糖及其衍生物、以及N-烷基咪唑化合物(包括1-甲基咪唑和4-甲基咪唑)都可以从商业上得到，例如从Sigma公司(St.Louis,MO)获得。
为了配制本发明的组合物，可以将上述一种或多种化合物以任何方式混合在一起。这类混合物可以用以下方法得到：将这些化合物以粉末形式混合；用水或有机溶剂制得各种化合物的溶液并将这些溶液混合形成本发明的组合物；或者制备至少一种化合物的溶液并将其与粉末形式的一种或多种其他化合物混合。
本发明另一个优选的方面，所述组合物还可以包含一或多种具有核酸聚合酶活性的多肽。优选的这类具有核酸聚合酶活性的酶可以包括，但不限于，有DNA聚合酶活性的多肽、有RNA聚合酶活性的多肽以及具有逆转录酶活性的多肽。
更优选地，所述组合物制成工作浓度或浓缩液(2X、5X、10X、50X等)。这些组合物最好在不同温度储存时稳定。术语“稳定的”和“稳定性”用在这里表示组合物中的一种成分(比如化合物或酶)在组合物于大约4℃储存大约一周，或于大约-20℃储存大约6个月后，保持原始酶和/或化合物活性的至少70％，优选至少80％，最优选至少90％。
术语“工作浓度”用在这里表示一种化学化合物或酶的浓度，该浓度是或接近在执行特定功能(比如合成核酸)的溶液中所用的最佳浓度。
用于制成本发明所述组合物的水优选是蒸馏过、去离子并过滤除菌(流经0.1-0.2微米滤膜)的水，并且没有污染DNase和RNase酶。
这种水市场有售，例如从Sigma Chemical Company(Saint Louis,Missouri)购买，或者依照本领域技术人员公知的方法按需制备。
除了化学(以及任选多肽)成分，优选所述组合物包含一或多种缓冲液以及合成核酸分子所必需的辅助因子。尤其优选用于制成所述组合物的缓冲液是乙酸盐、硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐或游离酸形式的Tris-(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)，尽管与Tris离子强度和pKa类似的替代缓冲盐也能获得等同的结果。除了缓冲盐，组合物中还包括辅助因子盐比如钾盐(优选氯化钾或醋酸钾)和镁盐(优选氯化镁或醋酸镁)。
一般优选首先将缓冲盐和辅助因子盐在水里溶至工作浓度，并在加入化学化合物(以及任选多肽)之前调节溶液的pH。这样，在配制所述组合物的过程中，任何对pH敏感的化学化合物和多肽就不容易受到酸或碱介导的失活或降解。
为了配制缓冲盐溶液，将缓冲盐(优选Tris-(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的盐，最优选其盐酸盐)与足够量的水混合以便制成TRIS浓度为5-150毫摩尔，优选10-60毫摩尔，最优选大约20-60毫摩尔的溶液。向该溶液加入镁盐(优选氯化镁或醋酸镁)以使工作浓度达到1-10毫摩尔，优选1.5-8.0毫摩尔，最优选大约3-7.5毫摩尔。还可以向溶液中加入钾盐(最优选氯化钾)，工作浓度为10-100毫摩尔，最优选大约75毫摩尔。可以向溶液中加入还原剂(比如二硫苏糖醇)，优选终浓度为大约1-100mM，更优选大约5-50mM或大约7.5-20mM，最优选大约10mM。还可以加入少量乙二胺四乙酸(EDTA)盐，比如EDTA二钠盐(优选大约0.1毫摩尔)，虽然含有EDTA对于本发明所述组合物的功能或稳定性似乎不是必需的。加入所有缓冲液和盐以后，将缓冲盐溶液充分混合直至盐全部溶解，利用本领域已知的方法将pH调至7.4到9.2，优选8.0到9.0，最优选大约8.4。
向这些缓冲盐溶液中加入本发明所述化合物，以及任选一或多种具有核酸聚合酶活性的多肽，从而形成所述组合物。
在优选的组合物中，本发明的化合物以大约10∶1、大约9∶1、大约8∶1、大约7∶1、大约6∶1、大约5∶1、大约4∶1、大约3∶1、大约2.5∶1、大约2∶1、大约1.75∶1、大约1.5∶1、大约1.25∶1、大约1∶1、大约1∶1.25、大约1∶1.5、大约1∶1.75、大约1∶2、大约1∶2.5、大约1∶3、大约1∶4、大约1∶5、大约1∶6、大约1∶7、大约1∶8、大约1∶9或者大约1∶10的摩尔或化学计量比率混合。更优选地，所述化合物以大约1∶1的摩尔或化学计量比率混合。其他摩尔或化学计量比率可以通过常规的优化方法确定。如果使用两种以上化合物配制发明所述组合物，通过检测每种化合物对核酸合成的影响可以很容易地优化其用量。然后优选将这些化合物配制成工作浓度的组合物，以便用于下文描述的核酸合成方法，所述工作浓度为大约0.01-5M、大约0.05-5M、大约0.1-4M、大约0.25-3M、大约0.3-2.5M、大约0.4-2M、大约0.4-1.5M、大约0.4-1M或者大约0.4-0.8M。根据所用的化合物，按照预期结果可以使用其他摩尔量。本发明的组合物然后可以于65℃储存2-4周，室温到37℃储存1到两个月，4℃1到6个月，-20℃3个月到1年或更长时间，直至用于合成核酸分子。
依照本发明许多具有聚合酶活性的多肽都是有用的。这些多肽包括酶类比如核酸聚合酶(包括DNA聚合酶和RNA聚合酶)。所述聚合酶包括，但不限于，嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、那不勒斯栖热袍菌(The)DNA聚合酶、海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENTTM)DNA聚合酶、激烈热球菌(Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENTTM DNA聚合酶、沃氏热球菌(Pwo)DNA聚合酶、热球菌KDD2(KOD)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)DNA聚合酶、嗜热芽孢杆菌(Bacillus caldophilus,Bca)DNA聚合酶、嗜酸热硫化叶菌(Sac)DNA聚合酶、嗜酸热原体(Tac)DNA聚合酶、黄栖热菌(Tfl/Tub)DNA聚合酶、红栖热菌(Tru)DNA聚合酶、Thermus brockianus(DYNAZYMETM)DNA聚合酶、热自养甲烷杆菌(Mth)DNA聚合酶、分枝杆菌(Mtb、Mlep)DNA聚合酶，以及它们的突变体、变异体和衍生体。根据本发明还可以使用RNA聚合酶比如T3、T5和SP6以及它们的突变体、变异体和衍生体。
用于本发明的核酸聚合酶可以是嗜温或嗜热的，并且优选是嗜热的。优选的嗜温DNA聚合酶包括T7 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、Klenow片段DNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅲ等。优选可用于本发明所述方法和组合物的热稳定DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、Stoffel片段、VENTTM和DEEP VENTTM DNA聚合酶，以及它们的突变体、变异体和衍生体(美国专利5436149；美国专利4889818；美国专利4965188；美国专利5079352；美国专利5614365；美国专利5374553；美国专利5270179；美国专利5047342；美国专利5512462；WO9206188；WO9206200；WO9610640；Barnes,W.M.,基因112:29-35(1992)；Lawyer,F.C.,等，PCR方法与应用2：275-287(1993)；Flaman,J.M.,等，核酸研究22(15)：3259-3260(1994))。为了扩增长核酸分子(例如，长度超过3-5Kb的核酸分子)，通常至少使用两种DNA聚合酶(一种基本上缺乏3’核酸外切酶活性，另一种具有3’核酸外切酶活性)。参见美国专利5436149；美国专利5512462；Barnes,W.M.,基因112：29-35(1992)；以及1997年2月14日提交的同时待审的美国专利申请08801720，上述文献此处全文引作参考。基本上缺乏3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶包括，但不限于，Taq、Tne (exo-)、Tma(exo-)、Pfu(exo-)、Pwo(exo-)、Tth DNA聚合酶，以及它们的突变体、变异体和衍生体。
用于本发明的具有逆转录酶活性的多肽包括任何具有逆转录酶活性的多肽。这类酶包括，但不限于，逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、乙肝病毒逆转录酶、花椰菜花叶病毒逆转录酶、细菌逆转录酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Saiki,R.K.等，科学239：487-491(1988)；美国专利4889818和4965188)、Tne DNA聚合酶(WO96/10640)、Tma DNA聚合酶(美国专利5374553)以及它们的突变体、变异体和衍生体(参见例如A.John Hughes和DebK.Chatterjee的同时待审的美国专利申请08/706702和08/706706，均在1996年9月9日提交，此处全文引作参考文献)。优选用于本发明的酶包括那些RNase H活性降低或基本上降低的酶。一种酶“RNaseH活性基本上降低”意味着该酶的RNase H活性不到相应的野生型或RNase H+的酶(比如野生型莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MLV)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)或劳氏肉瘤病毒(RSV)逆转录酶)的活性的大约20％、更优选不到大约15％、10％或5％，最优选不到大约2％。酶的RNaseH活性可以通过多种检测方法确定，比如在例如美国专利5244797、Kotewicz,M.L.等，核酸研究16：265(1988)以及Gerard,G.F.等，FOCUS14(5)：91(1992)中所描述的方法(各文献全文引入本文作为参考)。特别优选用于本发明的多肽包括，但不限于，M-MLV H-逆转录酶、RSV H-逆转录酶、AMV H-逆转录酶、RAV(Rous-相关病毒)H-逆转录酶、MAV(成髓细胞瘤相关病毒)H-逆转录酶和HIV H-逆转录酶。但是本领域技术人员应当明白，任何能由核糖核酸分子(即具有逆转录酶活性)产生DNA分子，RNase H活性基本上降低的酶可以等同地用于本发明所述组合物、方法和试剂盒中。
用于本发明的DNA和RNA聚合酶可以，从例如LifeTechnologies,Inc.(Rockville,Maryland)、Perkin-Elmer(Branchburg,New Jersey)、New England BioLabs(Beverly,Massachusetts)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis,Indiana)购买。用于本发明的具有逆转录酶活性的多肽可以从，例如Life Technologies,Inc.(Rockville,Maryland)、Pharmacia(Piscataway,New Jersey)、Sigma(Saint Louis,Missouri)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis,Indiana)购买。替代的作法是，按照本领域技术人员所熟知的分离和纯化天然蛋白质的常规步骤从天然病毒或细菌来源中分离具有逆转录酶活性的多肽(参见例如Houts,G.E.等，病毒学杂志29：517(1979))。另外，可以通过本领域技术人员熟悉的重组DNA技术来制备具有逆转录酶活性的多肽(参见，例如Kotewicz,M.L.等，核酸研究16：265(1988)；Soltis,D.A.和Skalka,A.M.,美国科学院学报85：3372-3376(1988))。
优选具有聚合酶或逆转录酶活性的多肽以在溶液中大约0.1-200单位/ml，大约0.1-50单位/ml，大约0.1-40单位/ml，大约0.1-36单位/ml，大约0.1-34单位/ml，大约0.1-32单位/ml，大约0.1-30单位/ml，或者大约0.1-20单位/ml，最优选大约20-40单位/ml的终浓度用于本发明组合物和方法中。当然，本领域技术人员容易知道适用于本发明的这些聚合酶或逆转录酶的其他合适浓度。
核酸合成的方法
本发明的化合物和组合物可以用于核酸的合成方法。具体来说，已发现所述化合物和组合物可以促进鸟苷和胞苷含量高的核酸分子(即富含GC的核酸分子)的合成，尤其是经扩增反应(比如聚合酶链反应PCR)的合成。因此所述化合物和组合物可以用于任何需要合成核酸分子，比如DNA(尤其是cDNA)和RNA(尤其是mRNA)的方法。可以有利地使用本发明所述化合物和组合物的方法包括，但不限于，核酸合成方法、核酸扩增方法、核酸逆转录方法以及核酸测序方法。
合成
与本发明这一方面对应的核酸合成方法可以包括1或多个步骤。例如，本发明提供了一种合成核酸分子的方法，包括(a)将核酸模板与一或多种上面描述的发明所述化合物和组合物混合形成反应体系；以及(b)在足以产生与模板全部或部分互补的第一核酸分子的条件下温育所述体系。根据本发明这个方面，核酸模板可以是DNA分子比如cDNA分子或文库，或者是RNA分子比如mRNA分子。
根据本发明，可以由得自天然来源(比如各种细胞、组织、器官或生物)的核酸分子组制备所加入的核酸分子或文库。可以用作核酸分子来源的细胞可以是原核细胞(细菌细胞，包括埃希氏菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、梭菌、衣原体、奈瑟氏球菌、密螺旋体、枝原体、疏螺旋体、军团菌、假单胞菌、分枝杆菌、螺杆菌、欧文氏菌、农杆菌、根瘤菌以及链霉菌属中的种)或者真核细胞(包括真菌(特别是酵母)、植物、原生动物和其他寄生虫，以及动物包括昆虫(尤其是果蝇细胞)、线虫(尤其是Caenorhabditiselegans细胞)和哺乳动物(尤其是人细胞))。
可以用作核酸分子或核酸分子文库来源的哺乳动物体细胞包括血细胞(网织红细胞和白细胞)、内皮细胞、表皮细胞、神经细胞(包括中枢或外周神经系统)、肌细胞(包括来自骨骼肌、平滑肌或心肌的肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(包括成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞和成骨细胞)和其他基质细胞(例如，巨噬细胞、树突细胞、施旺细胞)。哺乳动物生殖细胞(精母细胞和卵母细胞)也可以作为本发明所述核酸或文库的来源，而能产生上述体细胞和生殖细胞的祖细胞、前体细胞和干细胞也可以。同样适用作核酸来源的是哺乳动物组织或器官比如来源于脑、肾、肝、胰、血液、骨髓、肌肉、神经、皮肤、泌尿生殖、循环、淋巴、肠胃和结缔组织的那些，以及来源于哺乳动物(包括人)胚胎或胎儿的。
以上原核细胞或真核细胞、组织和器官可以是正常的、病态的、转化的、建系的、始祖、前体、胎儿或胚胎。患病细胞可以，例如，包括与传染病(由细菌、真菌或酵母、病毒(包括HIV)或寄生虫引发的)、遗传病或生化病(例如囊性纤维化、血友病、Alzheimer’s病、肌肉萎缩或多发性硬化症)或癌变过程有关的细胞。转化或建系的动物细胞系可以包括，例如，COS细胞、CHO细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、K562细胞、F9细胞等。其他适合作为核酸来源用于本发明所述方法的细胞、细胞系、组织、器官和生物对本领域技术人员是显而易见的。这些细胞、组织、器官和生物可以得自它们的天然来源或者从比如美国典型培养物保藏中心(Rockville,Maryland)以及技术人员知道的其他来源购买。
一待获得了细胞、组织、器官或其他原材料样品，就可以通过本领域熟知的方法分离核酸分子(比如DNA、RNA(例如mRNA或者polyA+RNA)分子)或者制备cDNA分子或文库(参见，例如，Maniatis,T.等，细胞15：687-701(1978)；Okayama,H.,和Berg,P.,分子细胞生物学2：161-170(1982)；Gubler U.和Hoffman,B.J.,基因25：263-269(1983))。
在实施本发明这个方面时，可以通过将如上获得的核酸模板(优选DNA分子，比如cDNA，或者RNA分子，比如mRNA或者polyA+RNA)分子)与一或多种以上描述的本发明的化合物或组合物混合成反应体系，从而合成第一核酸分子。在有利于所加入的核酸分子进行逆转录(RNA模板的情况)和/或聚合的条件下，合成与核酸模板全部或部分互补的第一核酸分子。这类合成通常在有核苷酸(例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)或者它们的衍生物)的情况下实现。
可选择地，本发明所述化合物、组合物和方法可用于单试管合成双链核酸分子。在这个步骤中，在能形成与第一核酸分子全部或部分互补的第二核酸分子的条件下温育如上所述合成的第一核酸分子。合成第二链可以，例如，通过改进的Gubler-Hoffman反应(D’Alessio,J.M.等，Focus9：1(1987))完成。
当然，本发明所述组合物和方法可以有利地应用的其他核酸合成技术对本领域技术人员是显而易见的。
扩增和测序方法
在本发明的其他方面，发明所述组合物可以用于核酸分子的扩增或测序方法中。对应发明这个方面的核酸扩增方法可以另外包括在本领域通常称为一步(例如，一步RT-PCR)或两步(例如，两步RT-PCR)逆转录-扩增反应的方法中使用一或多种具有逆转录酶活性的多肽。扩增长核酸分子时(即，长度超过3-5Kb)，本发明所述组合物可以包含具有DNA聚合酶活性的多肽的组合，详细描述见1997年2月14日提交的同时待审的美国申请08/801720，其内容此处全文引作参考文献。
对应本发明这个方面的扩增方法可以包括1或多个步骤。例如，本发明提供了一种扩增核酸分子的方法，包括(a)将核酸模板与一或多种上面描述的发明所述化合物或组合物混合成反应体系；以及(b)在能扩增与模板全部或部分形成互补的核酸分子的条件下温育所述体系。本发明还提供了由这类方法扩增得到的核酸分子。
用于扩增和分析核酸分子或片段的普通方法是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，美国专利4683195；4683202和4800159；Innis,M.A.等编辑，PCR手册：方法和应用指南，San Diego,California：AcademicPress,Inc.(1990)；Griffin,H.G.和Griffin,A.M.编辑，PCR技术：最新改进，Boca Raton,Florida：CRC Press(1994))。例如，根据本发明可以采用的扩增方法包括PCR(美国专利4683195和4683202)，链置换扩增(SDA；美国专利5455166；EP0684315)以及基于核酸序列的扩增(NASBA；美国专利5409818；EP0329822)。
一般来说，这些扩增方法包括在有一或多种引物序列的情况下，使核酸样品与含有一或多种具有核酸聚合酶活性的多肽的化合物或组合物进行接触，优选通过PCR或相当的自动扩增技术来扩增核酸样品从而形成一组扩增的核酸片段，以及任选地借助大小(优选经凝胶电泳)来分离所扩增的核酸片段，以及分析凝胶是否存在所述核酸片段，例如通过用核酸结合染料(比如溴化乙锭)将凝胶染色。
通过本发明所述方法进行扩增后，可以将所扩增的核酸片段分离以便进一步使用或鉴定。通常是通过任何物理或生物化学手段包括凝胶电泳、毛细管电泳、层析(包括分子筛、亲合和免疫层析)、密度梯度离心和免疫吸附来借助大小分离所扩增的核酸片段从而完成该步骤。特别优选的是经凝胶电泳分离核酸片段，因为它提供了一种快速和高度重复性的灵敏分离多种核酸片段的手段，并且能直接、同时地比较几种核酸样品中的片段。在另一个优选的实施方案中，可以将该步骤延伸到分离和鉴定这些片段或任何由本发明所述方法扩增的核酸片段。因此，本发明也涉及由本发明所述扩增或合成方法制备的分离的核酸分子。
在该实施方案中，依照常规技术比如电洗脱或物理切割从凝胶上取下1或多个扩增好的核酸片段用于鉴定(见上文)。然后将分离的单个核酸片段插入标准核苷酸载体，包括适合转染或转化多种原核(细菌)或真核(酵母、植物或动物包括人和其他哺乳动物)细胞的表达载体。可选择地，例如利用以下描述的和本领域常规的方法(参见，例如涉及DNA测序方法的美国专利4962022和5498523)通过测序(即，确定核酸片段的核苷酸序列)可以进一步鉴定采用本发明所述化合物、组合物和方法扩增和分离的核酸分子。
根据本发明的核酸测序方法可以包括1或多个步骤。例如，本发明提供了一种核酸分子的测序方法，包括(a)将待测序核酸分子与一或多种引物、一或多种上面描述的本发明的化合物或组合物、一或多种核苷酸以及一或多种终止试剂(比如双脱氧核苷酸)混合成反应体系；(b)在能合成与待测序核酸分子全部或部分互补的核酸分子群的条件下温育所述体系；以及(c)分离所述分子群以便确定待测序分子的全部或部分核苷酸序列。
可以采用本发明的组合物的核酸测序技术包括双脱氧测序技术，比如美国专利4962022和5498523中公开的。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包含本发明所述分离的核酸分子的载体，用所述重组载体基因工程化的宿主细胞，以及利用这些载体和宿主细胞生产重组多肽的方法。
用于本发明的载体可以是，例如，噬菌体或质粒，优选是质粒。优选为包含编码目的多肽的核酸的顺式作用调控区的载体。合适的反式作用因子可以由宿主提供，辅助载体或者由载体自身在导入宿主时提供。
在特定的优选实施方案中，载体保证特异表达由本发明的核酸分子编码的多肽；这类表达载体可以是诱导型和/或细胞型特异的。这类载体中尤其优选的是可通过容易操作的环境因素，比如温度和营养添加物诱导的载体。
可用于本发明的表达载体包括来源于染色体、附加体和病毒的载体，例如，来源于细菌质粒或噬菌体的载体，以及来源于其组合体的载体，比如粘粒和噬菌粒。
所述DNA插入片段应当可操纵地连接一个合适的启动子，比如噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子。其他合适的启动子是本领域技术人员已知的。所述基因融合构建体还可以含有转录起始、终止位点，以及在发生转录的区域中含有进行翻译的核糖体结合位点。构建体表达的成熟转录物的编码部分优选在待翻译多核苷酸的开头包括一个翻译起始密码子，在接近末端的位置有一个终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
所述表达载体优选包括至少一个选择标记。这类标记包括在培养大肠杆菌和其他细菌时的四环素或氨苄青霉素抗性基因。
用于本发明的载体优选包括Qiagen有售的pQE70、pQE60和pQE-9；Stratagene有售的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；Invitrogen有售的pcDNA3；以及Pharmacia有售的pGEX、pTrxfus、pTrc99a、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKk233-3、pDR540、pRIT5。其他合适的载体对本领域技术人员是显而易见的。
合适宿主细胞的代表性例子包括，但不限于，细菌细胞比如大肠杆菌、链霉菌、欧文氏菌、克雷伯氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。优选的宿主细胞是大肠杆菌，尤其优选的是可购买到的大肠杆菌菌株DH10B和Stb12(Life Technologies,Inc.；Rockville,Maryland)。
制备肽
正如前面提到的，本发明的方法适用于通过将以上描述的核酸分子或载体插入宿主细胞并由宿主细胞表达该核苷酸序列所编码的目的多肽从而制备任何长度的任何多肽。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法可以将核酸分子或载体导入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞。这类方法在许多常规实验手册中有描述，比如Davis等，分子生物学基本方法(1986)。一旦得到转化的宿主细胞，就可以在任何生理学上相容的pH和温度条件下，在含有可同化的碳源、氮源以及支持宿主细胞生长所必需的矿物质的任何合适的营养基质中培养所述细胞。产生重组多肽的培养条件根据用来转化宿主细胞的载体类型而变。例如，某些表达载体含有调控区，它使细胞在特定温度生长，或者要向细胞生长培养基中添加特定化学物质或诱导剂以便起始基因表达从而产生重组多肽。因此，本文所用的术语“重组多肽的产生条件”并非局限于任何一种培养条件。以上描述的宿主细胞和载体的适当的培养基和培养条件是本领域公知的。在宿主细胞中产生了目的多肽后，通过几种技术可以将其分离。为了从宿主细胞中释放出目的多肽，将细胞裂解或破碎。通过使细胞与低渗溶液接触、用破坏细胞壁的酶比如溶菌酶处理、超声处理、高压处理或者将以上方法结合使用可以完成所述裂解。其他本领域技术人员已知的破坏和裂解细菌细胞的方法也可以使用。
细胞破碎后，通过任何适合从复杂体系中分离颗粒的技术可以从细胞碎片中分离出所述多肽。然后可以通过公知的分离技术纯化该多肽。合适的纯化技术包括，但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、电泳、免疫吸附、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲合层析、免疫亲合层析、大小排阻层析、液相层析(LC)、高效LC(HPLC)、快速LC(FPLC)、羟磷灰石层析和凝集素层析。
试剂盒
本发明还提供了用于核酸分子合成、扩增或测序的试剂盒。根据本发明这个方面的试剂盒可以包括1或多个容器，比如小瓶、试管、安瓿、瓶子等，这些容器可以含有一或多种本发明所述组合物。
本发明的试剂盒可以包括一或多种以下成分：(ⅰ)一或多种本发明所述化合物或组合物，(ⅱ)一或多种聚合酶或逆转录酶，(ⅲ)一或多种合适的缓冲液，(ⅳ)一或多种核苷酸，以及(ⅴ)一或多种引物。
相关领域技术人员很容易理解，对本文所描述的方法和应用进行的其他合适的改进和调整是显而易见的，可以在不脱离本发明或任何实施方案的范围的情况下完成。至此已详细描述了本发明，参考以下实施例将更容易理解发明，这些实施例在这里只是用于阐述而非限制发明。
实施例
序言
对GC含量高的大量不同PCR扩增子(例如，CAG重复、假单胞菌基因组DNA等)检验4-甲基吗啉N-氧化物(以下用“MMNO”表示)。所检验的扩增子用目前的常规PCR反应体系很难扩增。为了检测新的助溶剂对高GC含量扩增子的PCR效率的影响，以不同浓度向PCR反应体系中添加MMNO和其他助溶剂。
方法
以下部分描述了如何制备实施例中使用的化学物质。
制备2.2X PCR反应体系(实施例1-3)
在实施例1-3中，制备了含有全部以下所列成分(除了模板DNA和引物)的2.2X PCR反应体系。下表说明了如何制备该2.2X PCR反应体系。
储液 加入体积 终浓度
10X PCR缓冲液  1.1ml  2.2X
 50mM MgCl2  0.33ml  3.3mM
 10mM dNTP  0.22ml  0.44mM
 Tween20  55μl  0.11％
Nonidet P-40  55μl  0.11％
Taq聚合酶(5单位/ml)  44μl  44单位/ml
 dH2O′ 补至5ml
实施例1-9的材料：甜菜碱一水合物([羧甲基]三甲基铵)、L-脯氨酸、4-甲基吗啉-N-氧化物(MMNO)、ectoine(THP[B]；[S]-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸)、DL-pipecolic acid(DL-2-哌啶羧酸)、以及L-肉碱([-]-b-羟基-g-{三甲基铵}丁酸盐)购自Sigma(St.Louis,MO),并在无菌蒸馏水中制备成4M储液，过滤除菌。PCR试剂：Platinum Taq DNA聚合酶、Platinum Taq DNA聚合酶HighFidelity、10X Taq缓冲液(1X=20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl)、50mM 氯化镁、10X Taq High Fidelity 缓冲液(1X=60mMTris-SO4(pH8.9)、18mM(NH4)2SO4、50mM硫酸镁、10mM dNTP Mix、K562人基因组DNA以及无菌蒸馏水购自Life Technologies,Inc.(Rockville,MD)。寡核苷酸引物以脱盐制品购自LifeTechnologies,Inc.,无须纯化直接使用。
实施例1：滴定脯氨酸、1-甲基咪唑和4-甲基咪唑来增强由富含GC的模板的PCR扩增
检测几种化学物质来确定它们是否能增强使用富含GC的模板时PCR的效率。在第一个例子中，用各种浓度的3种不同化学物质(氨基酸脯氨酸、1-甲基咪唑和4-甲基咪唑)之一在富含GC的模板P55G12上实验。在0.2ml的试管中混合下列成分：13ml 2.2X PCR反应体系、0.5ml模板DNA(10pg)、0.5ml引物混合物(各10mM)和13ml 4M化学物溶液(脯氨酸、1-甲基咪唑或4-甲基咪唑)，将溶液吹吸混匀。PCR方案是：95℃，3分钟；30个循环的94℃，30秒、55℃，30秒、72℃，1分钟。PCR之后，向每个试管中加入5ml染料并将12ml反应体系加入琼脂糖凝胶进行电泳，然后通过溴化乙锭染色来显示DNA片段。
如图1所示，三种化学物质均在某个浓度比其他浓度效果好。对脯氨酸来说，300到600mM时P55G12扩增最好，而浓度高于600mM时没有产物。对于1-甲基咪唑，100和200mM最有效，而更高或低的浓度或者没有作用或者产物减少。对于4-甲基咪唑，稍低的浓度能增强扩增：60到100mM。注意PCR反应中不加这些化合物则没有扩增产物，1M甜菜碱能有效地使反应发生。
实施例2：滴定4-甲基吗啉-N-氧化物(MMNO)来进行富含GC的模板的PCR：比较MMNO和甜菜碱
在实施例1中，确定MMNO为一种新的可增强富含GC的模板PCR效率的试剂。下一个要解决的问题是MMNO效率与它在PCR体系中浓度的关系。在有1M甜菜碱或不同浓度MMNO的情况下，如上实施例1所述扩增富含GC的扩增子P55G12。
如图2所示，PCR反应体系中含有400到1000mM MMNO产生的PCR产物在强度上与含有1M甜菜碱时相当。MMNO浓度低于400mM时不产生PCR产物。
实施例3：高GC含量扩增子的PCR扩增：铜绿假单胞菌扩增子
铜绿假单胞菌的基因组含有高GC含量(70％)，因此难以通过PCR进行扩增。因此，在本发明所述PCR方法-PCR反应体系中使用甜菜碱、MMNO或三甲基胺N-氧化物(TMANO)中实验大小在1.3到1.8kb的三种不同铜绿假单胞菌扩增子。使用与实施例1中描述的相同的反应制品，但这些反应中模板DNA是30ng铜绿假单胞菌基因组DNA。DNA扩增使用以下PCR方案：95℃，5分钟；35个循环的94℃，2分钟、58℃，30秒和72℃，2分钟。
如图3所示，铜绿假单胞菌序列D在有甜菜碱或MMNO的情况下得到扩增，而序列E和F在有甜菜碱、MMNO或TMANO的情况下得到扩增。这些结果表明利用本发明的组合物和方法可以有效地扩增长的、富含GC的天然序列，比如来自铜绿假单胞菌基因组的序列。
实施例4：甜菜碱、脯氨酸和MMNO增强PCR扩增富含GC的模板的比较
检测各种浓度的甜菜碱、脯氨酸和MMNO增强PCR扩增人p53外显子10(62.2％GC)的1个156-bp片段或耐放射异常球菌DNA聚合酶Ⅰ基因的2782-bp编码区(66.7％)的能力。变化反应参数来评测缓冲液组分和镁浓度的影响。
用薄壁0.2ml试管在50ml反应体系中进行PCR扩增，反应体系含有2.5U Platinum Taq、1X Taq缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mMKCl)或1X Taq High Fidelity缓冲液(60mM Tris-SO4(pH8.9)、18mM(NH4)2SO4)、200mM各种dNTP以及200nM各种引物。镁，或氯化镁(Taq缓冲液反应)或硫酸镁(Taq High Fidelity缓冲液反应)浓度，在1.0到2.5mM之间。各种助溶剂(甜菜碱、MMNO或脯氨酸)的量如图所示变化。用Perkin Elmer9600型或2400型热循环仪使反应进行温度循环。扩增人p53外显子10序列时，反应含有100ng K562人基因组DNA并于95℃温育1分钟，然后作35个循环：95℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分钟。扩增DNA polⅠ基因时，反应含有20ng耐放射异常球菌基因组DNA并于95℃温育1分钟，然后作35个循环：95℃变性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸3分钟。取10ml各种PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析并用溴化乙锭染色来显示预期的DNA片段。
如图4所示，成功扩增156bp的人p53序列依赖于镁浓度和特定的缓冲液条件。在不加助溶剂时，在含有常规PCR缓冲液的反应中检测不到特异产物，使用硫酸铵缓冲液(Taq High Fidelity缓冲液)的PCR中只在1.0mM MgSO4中可检测到。加入甜菜碱、MMNO或脯氨酸助溶剂在两种缓冲液体系中，很宽的镁浓度范围内都能增强扩增产物的特异性和产量。MMNO对最适镁浓度范围的影响没有甜菜碱或脯氨酸明显。有较宽最适镁浓度的甜菜碱或脯氨酸的浓度在Taq缓冲液中比在Taq High Fidelity缓冲液中高。
与扩增p53外显子10所得结果相反，MMNO能在宽的镁浓度范围(1.0-2.5mM)内很有效地增强对Dra DNA polⅠ的2.8kb长扩增子的PCR(图5)。浓度在0.4到0.8M的MMNO均取得该效果，并与1M甜菜碱时观察到的结果类似。加入脯氨酸也能有效地增强对DNA polⅠ片段的扩增；但是脯氨酸的有效浓度要窄得多，并且它对镁浓度范围的影响没有甜菜碱或MMNO明显。通常，在常规Taq缓冲液中增强PCR所需的各助溶剂的浓度比含有Taq High Fidelity缓冲液的反应高。这与扩增p53外显子10所得结果一致。不含助溶剂的反应中没有观察到Dra DNA polⅠ的PCR产物。实施例5：MMNO和脯氨酸的混合物增强富含GC的模板的PCR扩增
由于以上实施例的结果表明脯氨酸能有效地增强短的富含GC的模板的最适扩增反应，而MMNO能有效地增强长的富含GC的模板的扩增，因此将这两种化合物混合在一起以便研究它们能否与片段大小无关地增强富含GC的模板的扩增。为了实验这种可能性，在有包含脯氨酸、MMNO或者它们两者的组合物的情况下扩增富含GC的模板。
在混合组合物中，分别以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比率将4M的MMNO和脯氨酸溶液合并以便形成4M的杂合助溶剂混合物。然后检测这些混合物对p53外显子10和Dra DNA polⅠ PCR扩增的影响。按照前面的描述在50ml体积中含有Platinum Taq DNA聚合酶的1X Taq高度忠实缓冲液中进行PCR反应。对所测助溶剂的每个浓度，硫酸镁的浓度在1.0到2.5mM之间变化。MMNO、MMNO与脯氨酸的混合物、脯氨酸以及甜菜碱的浓度如各图中所示。
如图6所示，MMNO和脯氨酸的混合物能有效地增强p53外显子10的156bp片段的特异扩增的镁和助溶剂浓度范围比每种助溶剂单独使用时要宽。使用MMNO：脯氨酸混合物还能非常有效地促进2.8kb的DraDNA polⅠ片段的扩增，并将单独使用脯氨酸得到的有效镁和助溶剂浓度显著地扩展(图7)。正如原来观察到的，MMNO在全部实验的镁和助溶剂浓度范围内能增强PCR扩增。总而言之，这些结果表明使用含有N-烷基羧酸和N-烷基胺氧化物的混合物的组合物产生了某些新的特性，可以利用这些特性来增强对富含GC的模板的PCR扩增。尤其是，MMNO和脯氨酸的比率为2∶1到1∶2的混合物可以用来增强大小范围很宽的富含GC的模板的PCR扩增，并且能在更宽的镁浓度范围内提高PCR的可信度。实施例6：MMNO：脯氨酸混合物增强富含GC的模板在很宽的最适退火温度内的PCR
为了评价PCR助溶剂对PCR反应中最适退火温度的影响，利用上面描述的MMNO：脯氨酸混合组合物经PCR扩增富含GC的模板P32D9。用薄壁的0.2ml试管(Stratagene,Inc.)在50ml体积中进行PCR反应。50ml反应体系含有2.5 U Platinum Taq,IX Taq High Fidelity缓冲液(60mMTris-SO4(pH 8.9)、18mM(NH4)2SO4)、1.5mM MgSO4、200mM各种dNTP、200mM各种引物、100ng K562人基因组DNA，以及加或不加助溶剂、0.5M甜菜碱，或者0.5 M 1∶1的MMNO：脯氨酸。通过将等体积的4M MMNO和4M脯氨酸混合在一起来制备浓缩的MMNO：脯氨酸混合物。利用带有加热的盖子的梯度区段Robo-循环仪(Stratagene)经无油操作来研究最适退火温度。于95℃变性1分钟后，反应循环35次：95℃，45秒；55-66℃，45秒；68℃，1分钟。通过在0.5X TBE中进行琼脂糖凝胶(1％Agarose1000,Life Technologies,Inc.)电泳和溴化乙锭染色分析10ml的每种PCR反应物。
如图8所示，没有PCR助溶剂时，仅在66℃得到特异的PCR产物，1个149bp，78.5％GC的片段。随着退火温度下降，产物得率迅速降低，导致非特异性产物的扩增。相反，甜菜碱和MMNO：脯氨酸混合物能扩大有效退火温度范围。利用MMNO：脯氨酸混合物产生了比用甜菜碱所得的更高的产物得率，并且在整个66到55℃的退火温度梯度内都能检测到特异产物。实施例7：利用MMNO：脯氨酸混合物扩增脆性X位点CGG重复序列
比较MMNO：脯氨酸混合物和甜菜碱促进有极高GC含量的DNA序列的PCR扩增的能力。所设计的引物包括脆性X位点的人FMR-1基因中的CGG重复序列(GenBank编号No.X61378)。按照以上描述，利用2.5UPlatinum高度忠实Taq DNA聚合酶，100 ng K562基因组DNA和补充有2mM硫酸镁(终浓度)的1X Taq高度忠实缓冲液进行PCR扩增。将如上所述制备的4M MMNO：脯氨酸混合物或4M甜菜碱的样品以不同用量加入PCR，以便使各种助溶剂终浓度为0.25M到2M。将PCR于95℃温育1分钟，然后进行35个循环：95℃，30秒；58℃，30秒；68℃，30秒。这些研究结果的琼脂糖凝胶分析示于图9。
这些研究的结果表明与甜菜碱相比，MMNO：脯氨酸混合物具有更优良的促进极高(＞80％)GC含量的目的序列的PCR扩增的能力。没有PCR助溶剂时，未检测到特异产物。而在含有1.75M甜菜碱的反应中可以看到一个微弱的预期大小的条带。相反，在含有1.5到2M MMNO：脯氨酸的反应体系中显示出CGG重复序列的强扩增。实施例8：MMNO：脯氨酸混合物在长PCR中的应用
已利用包含Taq DNA聚合酶和一种具有校正活性的古细菌DNA聚合酶混合物扩增了长达40-kb的DNA片段(Barnes,W.M.,美国科学院学报91：2216-2220(1994))。利用设计来扩增腺病毒2型DNA(~60％ GC)中7.77-kb或9.75-kb片段的引物检验MMNO：脯氨酸混合物促进扩增长的富含GC的序列的能力。用1pg腺病毒2型DNA(Life Technologies,Inc.)、补充了1.5mM硫酸镁的1x Taq高度忠实缓冲液，以及不同量(0到1M)的MMNO：脯氨酸混合物基本按照上面的描述进行PCR，但是用2.5U Platinum高度忠实Taq DNA聚合酶，即一种来自水生栖热菌和热球菌GB-D种之DNA聚合酶的混合酶替代Platinum Taq DNA聚合酶。反应体系于95℃温育1分钟，然后进行35个循环：95℃，30秒；58℃，30秒；68℃，10分钟。
如图10所示，成功地扩增出预期的7.77kb和9.75kb DNA片段依赖于含有MMNO：脯氨酸助溶剂。在没有MMNO：脯氨酸的反应体系中未检测到特异产物；而加入0.25M MMNO：脯氨酸混合物就得到强扩增和很高的产物得率。长PCR中的产物得率对MMNO：脯氨酸的用量敏感，随着MMNO：脯氨酸浓度增加，7.3和9.7kb的目的产物的得率均下降。实施例9：补偿型溶质增强富含GC的模板的PCR扩增
许多氨基化合物都显示出保护生物抵抗渗透压的重要功能。甜菜碱和脯氨酸是大肠杆菌中的主要渗透压保护剂，因为这两种化合物都能破坏DNA螺旋的稳定性，从而促进富含GC的模板的扩增，我们还考察了其他已知的和市场上销售的渗透压调节化合物对PCR的影响。
在50ml体积中制备PCR反应体系，该体系含有2.5U Platinum TaqDNA聚合酶、60mM Tris-SO4(pH 8.9)、18mM(NH4)2SO4、1.5mM MgSO4、dNTP各200mM、200nM的各种引物、100ng K562人基因组DNA以及不同量的PCR助溶剂。反应于95℃温育1分钟，然后进行35个循环：95℃，30秒；58℃，30秒；68℃，1分钟。
MMNO：脯氨酸混合物、甜菜碱、L-肉碱以及DL-2-哌啶酸的效力比较见图11，一个比较ectoine和甜菜碱的单独实验的结果如图12所示。实验条件基本上与以上描述的相同，只是最终反应体积为25ml。
在这些实验中检测的全部渗压剂都能有效地扩增P32D9序列，并且显示出很多种N-烷基羧酸衍生物都能用于促进难于扩增的模板(比如GC含量高的模板)的PCR扩增。
通过有助理解的阐述和举例，至此已详细地描述了本发明。显然，对本领域技术人员来说，在不影响发明范围或任何具体实施方案的情况下，通过在广泛而等同的条件、制剂和其他参数范围内改进或变化发明可以实施同样的发明，并且这类改进或变化涵盖在所附权利要求的范围内。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请能代表发明相关领域的技术人员的技术水平，并且全文引作参考文献，并视作每篇出版物、专利和专利申请是逐一并个别地全文引作参考文献。

Claims (29)

1、一种用于合成核酸分子的组合物，其中包含一种或多种具有选自式Ⅰ或式Ⅱ的化学式的化合物，或其盐或衍生物：
式Ⅰ：
其中A是
Figure 9980575300022
其中X是
Figure 9980575300023
其中q=1-100,000，其中当q=2-100,000时，每个式Ⅰ单体可以与其他式Ⅰ单体相同或不相同；
其中Z可以与Y相同或不同；
其中Y和Z各自独立地选自-OH、-NH2、-SH、-PO3H、-CO2H、-SO3H和氢；
其中f为0-2的整数，m为0-20的整数，e为0-2的整数；
其中R4、R5和R6可以相同或不同，各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、氨基、硫醇、巯基、卤、硝基、次氮基、羟基、羟基烷基、羟基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺酰基、磺基和酰氨基，d为0-2的整数；
其中a、b和c各自独立地为0-1的整数，条件是a、b和c中最多有两个为0；
其中R1、R2和R3可以相同或不同，各自独立地选自：
a)=0；
b)
其中R7和W可以相同或不同，各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、氨基、巯基、硫醇、卤、硝基、次氮基、羟基、羟基烷基、羟基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺酰基、磺基和酰氨基；g为0-2的整数，n为0-20的整数；式Ⅱ：
Figure 9980575300032
其中式Ⅱ是饱和或不饱和的；
其中q=1-100,000，其中当q=2-100,000时，每个式Ⅱ单体可以与其他式Ⅱ单体彼此相同或不相同；
其中X选自N、C、O、P和S；
其中Y选自O、N、S、P、C、-O-NH-、-O-CH2-NH-、-O-CH2-O-、-NH-CH2-NH-、-O-CH(CH3)-NH-、-NH-CH(CH3)-NH-、-O-CH(CH3)-O-、-NH-C(CH3)2-NH-、-O-S-、-O-CH2-S-、-NH-S-、-NH-CH2-S-，以及其他硫醇、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺酰基、磺基和酰氨基；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8可以相同或不同，各自独立地选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、氨基、巯基、硫醇、卤、硝基、次氮基、羟基、羟基烷基、羟基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺酰基、磺基和酰氨基；并且
其中a、b、c、d、e、m、n和o是相同或不同的整数，a、b、c、d和e各自独立地选自0-2，m、n和o各自独立地选自0-5。
2、如权利要求1的组合物，条件是当q=1且(R1)a、(R2)b和(R3)c之一为氧而另两个R基团相同或不同、各自独立地选自氢、甲基、乙基和丙基时，A不是甲基、乙基或丙基。
3、如权利要求1的组合物，其中当a、b或c为0时，相应的R基团是一对电子。
4、如权利要求1的组合物，其中Y和/或X为N且m、n和o为1。
5、如权利要求1的组合物，其中Y和/或X为N和/或O，且m和n为1，o为2。
6、如权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少两种式Ⅰ或式Ⅱ化合物，或其盐或衍生物。
7、如权利要求6的组合物，其中所述组合物包含2-5种式Ⅰ或式Ⅱ化合物，或其盐或衍生物。
8、如权利要求6的组合物，其中所述组合物包含脯氨酸或其衍生物。
9、如权利要求6的组合物，其中所述组合物包含一种N-烷基咪唑化合物。
10、如权利要求9的组合物，其中所述N-烷基咪唑化合物是1-甲基咪唑或4-甲基咪唑。
11、如权利要求1的组合物，其中所述化合物选自4-甲基吗啉-N-氧化物、甜菜碱、肉碱、ectoine、平均分子量为约50,000-500,000道尔顿的聚(2-乙基-2-噁唑啉)和平均分子量为约100,000-200,000道尔顿的聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)。
12、如权利要求6的组合物，其中所述化合物选自4-甲基吗啉-N-氧化物、甜菜碱、肉碱、ectoine、平均分子量为约50,000-500,000道尔顿的聚(2-乙基-2-噁唑啉)和平均分子量为约100,000-200,000道尔顿的聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)。
13、如权利要求1的组合物，其中还包含一种或多种具有核酸聚合酶活性的酶。
14、如权利要求6的组合物，其中还包含一种或多种具有核酸聚合酶活性的酶。
15、如权利要求13的组合物，其中所述具有核酸聚合酶活性的酶选自DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。
16、如权利要求14的组合物，其中所述具有核酸聚合酶活性的酶选自DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。
17、如权利要求15的组合物，其中所述DNA聚合酶选自Taq,Tne,Tma,Pfu,VENTTM，DEEPVENTTM和Tth DNA聚合酶，及其突变型、变体和衍生物。
18、如权利要求15的组合物，其中所述逆转录酶选自M-MLV逆转录酶、RSV逆转录酶、AMV逆转录酶、RAV逆转录酶、MAV逆转录酶和HIV逆转录酶，及其突变型、变体和衍生物。
19、如权利要求15的组合物，其中所述逆转录酶的RNase H活性基本上降低。
20、一种用于合成核酸分子的组合物，它包含一种或多种选自以下成员的组分：一种或多种氨基酸，一种或多种糖，一种或多种多元醇，或其衍生物，或其组合。
21、一种通过将两种或多种权利要求1或20中任意一项所述的化合物或组分组合在一起而得到的组合物。
22、一种合成核酸分子的方法，它包含：
(a)将核酸分子模板与一种或多种权利要求1或20所述的组合物混合形成反应体系；以及
(b)在足以形成与所述模板所有或一部分互补的第一核酸分子的条件下温育所述体系。
23、如权利要求22的方法，它还包含在足以形成与所述第一核酸分子所有或一部分互补的第二核酸分子的条件下温育所述第一核酸分子。
24、一种按照权利要求22的方法制得的核酸分子。
25、一种用于扩增核酸分子的方法，它包含：
(a)将核酸模板与一种或多种权利要求1或20所述的组合物混合形成反应体系；以及
(b)在足以扩增与所述模板所有或一部分互补的核酸分子的条件下温育所述体系。
26、一种核酸分子的测序方法，它包含：
(a)将待测序的核酸分子与一种或多种引物、一种或多种权利要求1或20所述的组合物、一种或多种核苷酸以及一种或多种终止剂混合形成反应体系；
(b)在足以合成一群与所述待测序分子所有或一部分互补的分子的条件下温育所述体系；以及
(c)分离所述分子群，以确定所述待测序分子所有或一部分的核苷酸序列。
27、一种用于合成核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种权利要求1或20所述的化合物或组分。
28、如权利要求27的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少两种所述化合物或组分。
29、如权利要求27的试剂盒，它还包含一种或多种选自以下成员的组分：一种或多种核苷酸、一种或多种DNA聚合酶、一种或多种逆转录酶、一种或多种适宜的缓冲液、一种或多种引物以及一种或多种终止剂。
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