CN1359301B - 含有与Aβ1-10残基内的表位特异性结合的抗体的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗与患者脑部Aβ淀粉样沉积物相关之疾病的改进的治疗药物和方法。该方法包括给患者施用一种诱导对淀粉样沉积物产生有益免疫应答的药物。该方法在预防和治疗阿耳茨海默氏病中尤其有用。优选的治疗药物包括Aβ的N末端片段及与其结合的抗体。

Description

含有与Aβ1-10残基内的表位特异性结合的抗体的药物组合物及其应用
相关申请的相互参考 
本发明为申请于1999年5月28日的USSN 09/322,289部分的延续，在这里全文引用作为参考。 
技术领域
本发明属于免疫学和医学领域。 
发明背景 
阿尔茨海默氏病(早老性痴呆，AD)是一种导致老年性痴呆的进行性疾病。一般参见Selkoe，TINS，16，403-409(1993)；Hardy等，WO92/13069；Selkoe，J.Neuropathol.Exp.Neurol.53，438-447(1994)；Duff等，Nature，373，476-477(1995)；Games等，Nature，373，523(1995)。广义上讲，该疾病分为两类，发生在晚年(65岁以上)的晚期发作，和老年期之前(即35-60岁)形成的早期发作。在该病的两种类型中，病理学是相同的，但是如果在早年开始，异常可能更加严重且分布更广泛。该疾病特征在于大脑的至少两种类型的损伤，衰老斑和神经纤维缠结。通过脑组织切片的显微分析观察到，衰老斑是直径达150μm、中心穿插有胞外淀粉样沉积物的紊乱的神经纤维网区域。神经纤维缠结是含有两根细丝(互相成对地缠绕在一起)的τ蛋白质的细胞内沉积物。 
衰老斑的主要成分是被称为Aβ或β-淀粉样肽的肽。Aβ肽是被称为淀粉样前体蛋白质(APP)的前体蛋白质的含39-43个氨基酸的内部片段。阿尔茨海默病的发生与APP蛋白质的几种突变有关。参见，例如Goate等，Nature，349，704(1991)(缬氨酸717变为异亮氨酸)；ChartierHarlan等，Nature，353，844(1991)(缬氨酸717变为甘氨酸)；Murrell 等，Sciences，254，97(1991)(缬氨酸717变为苯丙氨酸)；Mullan等，Nature Genet.，1，345(1992)(赖氨酸595-甲硫氨酸596变为天冬胺酸595-亮氨酸596的双突变)。认为该突变通过增加或改变APP到Aβ的加工，特别是使APP增量加工成为长型Aβ(即，Aβ1-42和Aβ1-43)，引起阿尔茨海默病。认为其它基因(如早衰素(presenilin)基因，PS1和PS2)的突变，间接影响APP加工，产生长型Aβ的增量(参见Hardy，TINS，20，154(1997))。该观察表明Aβ，特别是它的长型，是引起阿尔茨海默氏病的病因。 
McMichael在EP 526,511中提出了对已确定为AD的患者以顺势疗法剂量给药Aβ(小于或等于10-2mg/天)。对于具有5升血浆的一般人，甚至该剂量的上限可以为产生不超过2pg/ml浓度的剂量。在人血浆中Aβ的正常浓度一般地在50-200pg/ml范围内(Seubert等，Nature，359，325-327(1992))。因为在EP 526,511中提出的剂量只是改变内源性循环Aβ的水平，并因为在EP 526,511中没有推荐使用佐剂，似乎产生的任何治疗性结果都是难以置信的。 
相反，本发明通过在患者体内产生有益免疫应答的条件下，对患者给药Aβ的片段，或Aβ内某些表位的抗体，直接在体内治疗阿尔茨海默氏病或其它致淀粉样病。因此本发明满足了长期存在的对预防或改善阿尔茨海默氏病之神经病理学的治疗方案的需要。 
本发明与申请于1998年11月30日的WO99/27944，申请于1997年12月2日的USSN 60/067,740，申请于1998年4月7日的USSN60/080,970以及申请于1998年11月30日的USSN 09/201,430有关，为各种目的在这里全文引用作为参考。 
发明简述 
一方面，本发明提供了预防或治疗与患者脑部Aβ的淀粉样沉积物相关之疾病的方法。这类疾病包括阿尔茨海默氏病、唐氏先天愚症 及认知损伤。后者的产生可能有或没有致淀粉样疾病的其它特征。本发明的这些方法需要给患者施用有效剂量的可以特异性结合淀粉样沉积物成分的抗体。这些方法特别适用于人类患者阿尔茨海默氏病的预防与治疗。一些方法需要给药有效剂量的结合Aβ的抗体。一些方法需要给药有效剂量的特异性结合位于Aβ残基1-10内表位的抗体。在一些方法中，所述抗体特异性地结合位于Aβ残基1-6内的表位。在一些方法中，所述抗体特异性地结合位于Aβ残基1-5内的表位。在一些方法中，所述抗体特异性地结合位于Aβ残基1-7内的表位。在一些方法中，所述抗体特异性地结合位于Aβ残基3-7内的表位。在一些方法中，所述抗体特异性地结合位于Aβ残基1-3内的表位。在一些方法中，所述抗体特异性地结合位于Aβ残基1-4内的表位。在一些方法中，所述抗体特异性地结合含有Aβ自由N末端的表位。在一些方法中，所述抗体特异性地结合位于Aβ残基1-10的表位，其中这种Aβ的残基1和/或7是天冬氨酸。在一些方法中，所述抗体特异性地结合Aβ肽而不结合全长的淀粉样前体蛋白质(APP)。在一些方法中，所述抗体的同种型是人IgG1。 
在一些方法中，所述抗体结合患者的淀粉样沉积物并诱导对淀粉样沉积物的清除应答。例如，这种清除应答可以由Fc受体介导的吞噬实现。 
这些方法可以用于无症状的患者和那些目前出现症状的患者。在这些方法中使用的抗体可以是人抗体、人源化、嵌合及非人抗体，可以是单克隆或多克隆的抗体。一些方法中，所述抗体从用Aβ肽免疫的人中制备，该人可以是将由抗体治疗的患者。 
一些方法中，将所述抗体与一种药物载体以药物组合物的形式给药。一些方法中，抗体以每千克体重0.0001到100毫克，优选的至少1毫克的剂量给药。一些方法中，抗体在一段长时期内以多剂量给药，如至少六个月。一些方法中，抗体以持续释放组合物给药。抗体可以 以例如腹膜内、口腔、皮下、颅内、肌内、局部、鼻内或静脉内给药。 
一些方法中，抗体的给药通过给患者施用一种编码至少一个抗体链的多核苷酸完成。这种多核苷酸在患者体内表达产生抗体链。可选择的是，多核苷酸编码抗体的轻链和重链。这种多核苷酸在患者内表达产生轻链和重链。一些方法中，监控患者血液中被给药抗体的水平。 
另一方面，本发明提供了预防或治疗与患者脑部Aβ的淀粉样沉积物相关之疾病的方法。例如，这些方法可用于治疗阿尔茨海默氏病、唐氏先天愚症或认知损伤。这些方法需要给药Aβ片段或其类似物以诱导对Aβ中某些表位的免疫应答。一些方法需要给患者施用有效剂量的包含至少含有Aβ第1-5残基的N末端节段的多肽，Aβ的第一个残基作为多肽的N末端残基，且该多肽不含有Aβ的C末端节段。一些方法需要给患者施用有效剂量的含有AβN末端节段的多肽，这种节段起始于Aβ残基1-3且终止于Aβ残基7-11。一些方法需要给患者施用有效剂量的可诱导对Aβ N末端节段之免疫应答的治疗药物，这种节段起始于Aβ残基1-3且终止于Aβ残基7-11，对位于Aβ43的12-43残基内的表位不产生免疫应答。 
以上一些方法中，Aβ N末端节段的C端连接有一个异源多肽。以上一些方法中，Aβ N末端节段的N端连接有一个异源多肽。以上一些方法中，Aβ N末端节段的N端和C端分别连接有第一和第二异源多肽。以上一些方法中，Aβ N末端节段的N端连接有一个异源多肽，并且其C端连接有至少一个该N末端节段的附加拷贝。以上一些方法中，为异源多肽并因此产生B细胞对该N末端节段的应答。以上一些方法中，所述多肽进一步含有N末端节段的至少一个附加拷贝。以上一些方法中，所述多肽从N端到C端分别包括：Aβ N末端节段、多个AβN末端节段的附加拷贝及异源氨基酸节段。以上一些方法中，Aβ N末端节段含有Aβ1-7。以上一些方法中，Aβ N末端节段含有Aβ3-7。 
一些方法中，所述片段至少不含有Aβ 43内的5个C末端氨基酸。一些方法中，所述片段含有来自Aβ的多至10个连续的氨基酸。片段的典型的给药为每人每剂多于10微克。 
一些方法中，所述片段与可以增强对Aβ肽免疫应答的佐剂共同给药。佐剂和片段可依次给药也可以组合物形式共同给药。佐剂可以是例如：氢氧化铝，磷酸铝，MPLTM，QS-21(StimulonTM)或不完全弗氏佐剂。 
本发明进一步提供了药物组合物，其含有一种佐剂和Aβ片段，或如以上所述其它可诱导对Aβ相同表位产生免疫应答的治疗药物。本发明还提供了含有以上所述的任一种抗体与可药用载体的药物组合物。 
另一方面，本发明提供了筛选在治疗与患者脑部Aβ沉积物相关疾病(如阿尔茨海默氏病)中有活性的抗体的方法。这些方法包括使抗体接触一种多肽，该多肽不含有AβC末端节段，但含有AβN末端节段的至少5个连续氨基酸，且这种连续的节段起始于Aβ1-3之间的某个残基。籍此，可以确定是否这种抗体特异性地结合该多肽。特异性结合显示该抗体对于这类疾病的治疗有活性。 
另一方面，本发明提供了筛选对清除与抗原相关的生物实体有活性的抗体的方法。这些方法包括将与抗原相关的生物实体、抗体及带有Fc受体的吞噬细胞混合于一培养介质中。然后监测培养介质中存留的与抗原相关的生物实体的含量。抗原相关的生物实体含量的减少暗示该抗体在清除抗原相关的生物实体中有活性。抗原可以是组织样品或以分离的形式存在。例如，抗原可以是来自阿尔茨海默氏病患者或表现阿尔茨海默氏病病理学现象的哺乳动物脑部的组织样品。在测试对清除抗原相关的生物实体有活性的抗体中，还可以使用其他组织 样品，包括：癌化组织样品、病毒感染的组织样品、含有炎症细胞、非恶性异常细胞增生的组织样品或含有异常胞外基质的组织样品。 
另一方面，本发明提供了检测患者的淀粉样沉积物的方法。这些方法包括给患者施用可特异性结合位于Aβ1-10氨基酸内表位的抗体，并检测抗体在患者脑部的存在。一些方法中，抗体结合位于Aβ4-10残基内的表位。一些方法中，抗体标记有顺磁标记物，因此可以通过核磁共振X断层照像检测。 
本发明进一步提供了适用于以上方法的诊断试剂盒。该试剂盒含有特异性结合含有Aβ1-10残基的表位的抗体。一些试剂盒带有体外诊断或监测阿尔茨海默氏病的抗体的使用说明标签。 
附图说明
图1：给转基因小鼠注射Aβ1-42后的抗体效价。 
图2：海马中的淀粉样损伤。通过对免疫反应脑切片进行的计算机辅助定量图像分析，测定了淀粉样斑占据的海马区面积百分率(由与Aβ-特异性mAβ3D6的反应性确定)。个体小鼠的该值表示成分类治疗组。每组的横线表示分布的中值。 
图3：海马中的神经性营养不良。通过对免疫反应脑切片进行的计算机辅助定量图像分析，测定了营养不良神经占据的海马区面积百分率(由它们与人APP-特异性m Aβ 8E5的反应性确定)。个体小鼠的该值表示为AN1792治疗组和PBS治疗对照组。每组的横线表示分布的中值。 
图4：夹肌后皮质中的星形细胞增生。通过对免疫反应脑切片进行的计算机辅助定量图像分析，测定了神经胶质纤丝酸性蛋白质(GFAP)-阳性星形细胞占据的皮质区的面积百分率。个体小鼠的该值表示为分类治疗组，组中值用横线表示。 
图5：用八种剂量的AN1792(0.14、0.4、1.2、3.7、11、33、100或300μg)免疫后，Aβ1-42抗体效价的几何平均值。 
图6：对AN1792免疫的抗体反应动力学。效价通过每组6个动物的几何平均值表示。 
图7：PBS-和AN1792-治疗小鼠中皮质淀粉样损伤的定量图像分析。 
图8：PBS-和AN1792-治疗小鼠中神经性斑损伤的定量图像分析。 
图9：PBS-和AN1792-治疗小鼠中星形细胞占据夹肌后皮质的百分率的定量图像分析。 
图10：AN1792-处理(上图)或PBS-处理(下图)的脾细胞的淋巴细胞增殖分析。 
图11：皮质中Aβ的总体水平。用Aβ或APP衍生物结合弗氏佐剂免疫的小鼠中个体Aβ的散点图。 
图12：通过对用Aβ肽共轭物Aβ1-5、Aβ1-12和Aβ13-28；全长Aβ聚集物AN1792(Aβ1-42)和AN1528(Aβ1-40)以及PBS治疗对照组免疫的小鼠的免疫反应脑切片进行的定量图像分析测定的皮质中淀粉样损伤。 
图13：用Aβ或APP衍生物结合弗氏佐剂免疫的各组小鼠的Aβ特异性抗体的几何平均效价。 
图14：用AN1792或其棕榈酸酯衍生物结合不同佐剂免疫的各组豚鼠的Aβ肽特异性抗体的几何平均效价。 
图15(A-E)：用AN1792或AN1528和不同的佐剂治疗的12个月龄的PDAPP小鼠皮质中的Aβ水平。 
图16：Aβ的多克隆抗体处理的小鼠的平均效价。 
图17：Aβ的单克隆抗体10D5处理的小鼠的平均效价。 
图18：Aβ的单克隆抗体2F12处理的小鼠的平均效价。 
图19：表位成像：限定于N末端应答。ELISA测定175天的猕猴血清，检测覆盖AN1792完整序列的一系列十聚体重叠肽。F10920M号动物显示对覆盖作为免疫原的AN1792肽链1-10氨基酸的DAEFRHDSGY肽产生代表性的N末端限制性应答。 
图20：表位成像：非限定性N末端应答。ELISA测定175天的猕猴血清，检测覆盖AN1792完整序列的一系列十聚体重叠肽。 F10975M号动物显示代表性的N末端非限制性应答，对覆盖AN1792肽的第1-10氨基酸的DAEFRHDSGY肽两个N末端和一个C末端产生了应答反应。 
定义 
术语“基本上相同”是指两个肽序列，当最优序列对比时，例如通过GAP或BESTFIT程序采用默认间隙重量，具有至少65％的序列等同性，优选至少80或90％的序列等同，更加优选至少95％或更多的序列等同(例如，99％或更高的序列等同)。优选不同的残基位置通过保守氨基酸取代鉴别。 
进行序列比较时，通常选定一个序列作为参照序列，将测试序列与其相比较。运行序列比较程序时，将测试序列和参照序列输入计算机，如果需要，指定序列等同物，并指定序列运算程序。然后序列比较运算程序根据指定的程序参数计算出测试序列相对于参照序列的序列等同百分率。 
可以通过Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981))的局部同源性运算法则；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，48：443(1970))的同源性排列运算法则；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(1988))的相似性检索方法；运算法则(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，遗传学计算机组，575科学Madison，WI博士)的计算机化实施，或者通过目检(一般性参见Ausubel等，同上)进行序列的优化排列比较。适于确定序列等同性百分率和序列相似性百分率的运算法则的一个实例是BLAST运算法则，它由Altschul等描述，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)。进行BLAST分析的软件由国家生物技术信息中心向公众提供(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)。通常，可以用默认程序参数进行序列比较，当然也可以使用用户化参数。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认单词长度(W)为3，预期值(E)为10，BLOSUM62记录矩阵(参见 Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915(1989))。 
为了将氨基酸替代分成保守或非保守替代，须将氨基酸如下分组：组I(疏水侧链)：正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；组II(中性亲水侧链)：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸；组III(酸性侧链)：天冬氨酸，谷氨酸；组IV(碱性侧链)：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸；组V(影响链方向的残基)：甘氨酸，脯氨酸；和组VI(芳香族侧链)：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。保守替代涉及同类氨基酸之间的替代。非保守替代由一组中的一个成分改变成为另一组中的一个成分。 
本发明的治疗药物典型地是基本纯的，不含有所不期望的污染物。这意味着药物纯度典型地至少约为50％w/w(重量/重量)，并且基本上没有干扰蛋白质和污染物。有时药物纯度至少约为80％w/w，更优选纯度至少90％或约95％w/w。然而，利用常规蛋白质纯化技术，可以得到至少99％w/w的均一多肽。 
两个实体之间的特异性结合指亲和力至少106、107、108、109M-1或1010M-1。优选亲和力高于108M-1。 
使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体和其结合片段。通常，片段与其来源的完整抗体竞争性地与抗原特异性结合，包括独立的重链，轻链Fab，Fab’F(ab’)2，Fabc，以及Fv。重组DNA技术或完整免疫球蛋白的酶法或化学法分离获得片段。术语“抗体”也包括可以与其它蛋白质化学偶联，或者与其它蛋白质以融合蛋白质的形式表达的一个或多个免疫球蛋白链。术语“抗体”也包括双特异性抗体。双特异性抗体或双功能抗体是一种含有两个不同重、轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法获得，包括杂交瘤融合或Fab’片段的交联。参见，例如，Songsivilai& Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等，J. Immunol.148，1547-1553(1992)。 
APP695、APP751和APP770分别指由人APP基因编码的695、751、和770个氨基酸残基长的多肽。参见Kang等，Nature，325，773(1987)；Ponte等，Nature，331，525(1988)；和Kitaguchi等，Nature，331，530(1988)。人淀粉样前体蛋白(APP)中的氨基酸依照APP770同种型的序列指定编号。例如Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42、和Aβ43指含氨基酸残基1-39、1-40、1-41、1-42、和1-43的Aβ肽。 
“抗原”是与抗体特异性结合的实体。 
术语“表位”或“抗原决定簇”指使B和/或T细胞应答的抗原上的位点。B-细胞表位可以由相邻氨基酸形成，也可以由通过蛋白质三级折叠靠近的非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常维持结构，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常失去结构。在一个单一立体构型中表位通常包括至少3个，更经常至少5或8-10个氨基酸。确定表位的立体构型的方法包括，例如，X-射线晶体学和2维核磁共振。参见，例如，分子生物学方法中的表位成像方案(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecularbiology)66卷，Glenn E.Morris编(1996)。通过显示一个抗体阻断另一个抗体与靶抗原结合能力的简单的免疫分析可以鉴定识别同样表位的抗体。CD8 T-细胞识别约9个氨基酸的连续表位，CD4 T-细胞识别约13-15个氨基酸的连续表位。识别表位的T细胞可以通过测定抗原-依赖性增殖的体外分析来鉴定(如通过3H-胸苷掺入对表位应答的激活T-细胞确定)(Burke等，J.Inf.Dis.170，1110-19(1994))，通过抗原-依赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞分析，Tigges等，J.Immunol.，156，3901-1910)或者通过细胞因子分泌。 
术语“免疫学”或“免疫”应答是在接受治疗的患者体内形成对抗淀粉样肽的有益的体液(抗体介导的)和/或细胞(抗原特异性T细胞或 其分泌产物)应答。该应答可以是通过给药免疫原诱导的主动应答，也可以是通过给药抗体或激活的T-细胞诱导的被动应答。在存在与I类或II类MHC分子有关的多肽表位，以激活抗原特异性CD4+ T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞的条件下诱导细胞免疫应答。应答还可以涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱细胞、树状细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜曙红细胞或其它具有天然免疫力成分的激活。可以通过增殖检测(CD4+ T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)检测确定细胞介导的免疫学应答的出现(参见，Burke，同上；Tigges，同上)。体液和细胞应答对免疫原产生的保护或治疗效果的相对贡献可以用下述方法区别，即从免疫的同系动物体内单独分离抗体和T-细胞，然后在第二受试者体内测定保护或治疗效果。 
“免疫原性的药物”或者“免疫原”是在对哺乳动物给药(任选结合佐剂)后能够诱导对自己的免疫应答。 
术语“裸多核苷酸”指没有与胶状材料复合的多核苷酸。裸多核苷酸有时被克隆到质粒载体中。 
术语“佐剂”指当与抗原结合给药时增强对抗原的免疫应答，但当单独给药时，对抗原不产生免疫应答的化合物。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，包括征集淋巴细胞、激活B和/或T细胞、和激活巨噬细胞。 
术语“患者”包括接受预防性或治疗性处理的人和其他哺乳动物受试者。 
解聚或单体Aβ指Aβ的可溶解、单体肽单元。制备单体Aβ的一种方法是在洁净DMSO中超声溶解冻干肽。将得到的溶液离心除去所有不溶颗粒。聚集Aβ是低聚体的混合物，其中单体单元通过非共价键结合到一起。 
分析受测免疫球蛋白对参照抗体和普通抗原(如Aβ)之间特异性结合的抑制，以确定抗体间的竞争。业已知道多种竞争结合分析类型。例如，直接或间接的固相放射性免疫分析(RIA)、直接或间接的固相酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见Stahli等，Methods InEnzymology.9：242-253(1983))、直接固相生物素-亲合素EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.137：3614-3619(1986))、直接固相标记分析、直接固相标记夹心分析(参见Harlow&Lane，“Antibodies，A LaboratoryManual，”冷泉港出版社(1988))、I-125标记的直接固相标记RIA(参见Morel等，Molec.Immunol.25(1)：7-15(1988))、直接固相生物素-亲合素EIA(参见Cheung等，Virology 176：546-552(1990))、直接标记RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32：77-82(1990))。典型地，这些分析需要使用结合于固体表面的纯化抗原或带之的细胞、未标记的受测免疫球蛋白以及标记的参照免疫球蛋白。通过确定受测免疫球蛋白存在时结合于固体表面或细胞的标记可以量化竞争性抑制。通常受测免疫球蛋白过量存在。竞争分析法测定出的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体结合同一表位的抗体，以及其结合的表位与参照抗体所结合的表位足够接近以至于产生空间上阻碍的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在，至少可以抑制参照抗体与普通抗原间50或75％的特异性结合。 
“包括”一种或多种所提及元素的组合物或方法可以包括没有具体提及的其他元素。例如，含有Aβ肽的组合物中包含分离的Aβ肽和作为一种较长多肽序列成分的Aβ肽。 
发明详述 
I.总则 
一些致淀粉样疾病及症状的特征是患者脑部出现沉积的聚集成不溶团块的Aβ肽。该疾病包括阿尔茨海默氏病、唐氏先天愚症及认知 损伤。后者是阿尔茨海默氏病和唐氏先天愚症的一个症状，但也可以没有这二者的其它症状。例如，轻度认知损伤或与衰老相关的记忆丧失出现于一些至今仍未患阿尔茨海默氏病或永远不会患该病的患者中。约定俗成地认为，轻度认知损伤可以通过微型智力状况测试的得分确认。这类疾病的特征是具有β折叠片层结构的Aβ聚集及刚果红染色。预防或治疗阿尔茨海默氏病或其它致淀粉样疾病的基本方法是对患者的淀粉样沉积物成分产生免疫应答，这种方法在WO99/27944中作了描述(在此引入以作参考)。本发明重复并肯定了这种基本方法的有效性。然而，本发明主要在于改进的治疗药物和方法。这些改进部分基于这样的前提：本发明人定位了免疫应答所针对的Aβ内的优选表位。Aβ内优选表位的定位导致了效率增加、不良负效降低、和/或制备、配制和给药更加容易的治疗药物和方法。 
II.治疗药物 
免疫应答可以是主动的，如给药免疫原以诱导与患者Aβ反应的抗体，也可以是被动的，如给药与患者Aβ直接结合的抗体。 
1.诱导主动免疫应答的药物 
治疗药物诱导特异性针对Aβ肽内某些表位的免疫应答。优选的药物是Aβ肽本身和其节段。也可以使用诱导和/或与Aβ肽优选表位的抗体有交叉反应的天然Aβ肽的节段变体、类似物和嵌合体。 
Aβ，也被认为是β-淀粉样肽，或者A4肽(参见US4666829；Glenner和Wong，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)120，1131(1984))，它是一种含39-43个氨基酸的肽，是阿尔茨海默氏病特征斑的基本成分。Aβ是通过两种酶(被称为β和γ分泌酶)加工较长蛋白质APP产生的(参见Hardy，TINS，20，154(1997))。已知的与阿尔茨海默氏病有关的APP中的突变发生在紧邻β或γ分泌酶的位点，或者在Aβ中。例如，在APP加工成Aβ时，位置717紧邻APP的γ分泌酶酶切位点，位置670/671紧邻β分泌酶酶切位点。据信突 变通过与形成Aβ的酶切反应相互作用，增加了产生的42/43个氨基酸形式的Aβ的量，从而导致AD。 
Aβ具有不寻常的特性，即它能够固定和激活典型和替代补体级联。特别是，它结合Clq并最终结合C3bi。这种关系有利于结合导致B-细胞激活的巨噬细胞。另外，C3bi进一步分解，然后与B细胞上的CR2以T细胞依赖性方式结合，导致这些细胞的激活增加10000倍。这种机制导致Aβ比其他抗原产生更强的免疫应答。 
Aβ肽有几种天然存在的形式。Aβ的人中的形式为Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42或Aβ43。这些肽的序列和他们与APP前体的关系如Hardy等(TINS，20，155-158(1997))图1所示。例如，Aβ42具有如下序列： 
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH 
Aβ41、Aβ40和Aβ39与Aβ42的不同之处在于，它们分别缺失C-末端的Ala、Ala-Ile、和Ala-Ile-Val。Aβ43与Aβ42的不同之处在于，它在C-末端还具有一个苏氨酸残基。 
相对于目前方法使用的完整分子，Aβ的免疫原性片段在几个方面有其优势。第一，由于Aβ内只有某些表位可以诱导对阿尔茨海默氏病的免疫应答，带有这些表位的片段比同样剂量完整Aβ在有用免疫原性表位上有更高的摩尔浓度。第二，Aβ的某些免疫原片段在产生对淀粉样沉积物的免疫应答时，对Aβ来源的APP蛋白不产生显著的免疫应答。第三，由于其分子更小，Aβ的片段比完整Aβ更容易操作。第四，Aβ的片段不象完整Aβ一样聚集，简化了药物组合物和其给药的准备。 
一些Aβ的免疫原片段具有来源于天然肽的至少2、3、5、6、10 或20个连续氨基酸的序列。一些免疫原片段具有来源于Aβ的不超过10、9、8、7、5或3个连续氨基酸的序列。来源于Aβ N-端一半的片段是优选的。优选的免疫原片段包括Aβ1-5、1-6、1-7、1-10、3-7、1-3和1-4。例如，Aβ1-5表示含有Aβ第1-5残基但缺乏Aβ其它残基的一个片段。特别优选起始于Aβ 1-3残基且终止于Aβ 7-11残基的片段。也可以使用Aβ1-12残基，但优选性稍差。一些方法中，是除Aβ1-10以外的N-端片段。其它优选性稍差的片段包括Aβ13-28、17-28、1-28、25-35、35-40和35-42。这些片段在使用之前需要按照实施例的说明，筛选其清除或预防淀粉样沉积的活性。一些方法中使用的片段至少缺少一个，有时缺少Aβ天然形式中的至少5到10个C末端氨基酸。例如，缺少Aβ43C末端起的5个氨基酸的片段包括AβN末端最初的38个氨基酸。淀粉样斑的其它成分，如同型核蛋白及其表位片段也可以用于诱导免疫应答。 
除非有另外的说明，Aβ包括以上所述天然的人氨基酸序列及其类似物，包括等位基因的、种的和诱导的变异体。类似物通常与天然存在的肽在一个、两个或几个位置上不同，通常通过保守替代产生。类似物通常表现与天然肽至少有80％或90％的序列等同性。一些类似物还包括非天然氨基酸或N-或C-末端氨基酸在一个、两个或几个位置上的修饰。例如，Aβ的第1和/或7位的天然天冬氨酸残基可以被同型天冬氨酸所替代。非天然氨基酸的实例为D-氨基酸、α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酰胺、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸及同型天冬氨酸。可以按照下面的描述，与未处理或安慰剂对照的对比，在转基因动物模型中筛选具有预防或治疗效果的片段和类似物。 
Aβ，其片段和类似物可以通过固相肽合成或重组表达合成，或者从天然来源提取。很多供应商提供商品自动肽合成仪，例如应用生 物系统(Applied Biosystems)，Foster City，California。重组表达可以在细菌例如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞中进行。重组表达的方法如Sambrook等描述(分子克隆：实验室手册(C.S.H.P.出版社，NY，第二版，1989))。也有一些商品提供的Aβ肽(例如，AmericanPeptides Company，Inc.，Sunnyvale，CA和California Peptide Research，Inc.Napa，CA)。 
治疗药物还包括更长的多肽，其包括，例如，具有其它氨基酸的Aβ肽的活性片段。例如，优选的药物包括含有Aβ的节段与异源氨基酸序列融合的融合蛋白，可以诱导针对所述异源氨基酸序列的辅助T细胞应答，及针对所述Aβ节段的B细胞应答。与如下所述的未处理或安慰剂对照对比，可以在动物模型中筛选预防或治疗功效的所述多肽。Aβ肽、类似物、活性片段或其它多肽可以以结合形式给药，或者以多聚体形式给药，或者以分离形式给药。治疗药物还包括单体免疫原药物的多聚体。 
在进一步的改进中，免疫原肽，例如Aβ的片段可以以一种部分免疫组合物的病毒或细菌形式出现。将编码免疫原肽的核酸插入病毒或细菌的基因组或游离体。任选地，核酸以如下方式插入，即免疫原肽以分泌蛋白或与病毒的外壳蛋白或细菌的跨膜蛋白一起表达的融合蛋白的形式表达，以使该肽出现。该方法中使用的病毒或细菌应当是非病原性的或减毒的。合适的病毒包括腺病毒、HSV、委内瑞拉马脑炎病毒及其它甲病毒、水泡性口膜炎病毒、其它杆状病毒、痘苗病毒和鸡痘病毒。合适的细菌包括沙门氏菌属和志贺氏菌属。免疫原肽与HBV的HBsAg的融合尤其合适。治疗药物还包括不必具有与Aβ显著的氨基酸序列相似性，然而却作为Aβ的模拟物并诱导类似免疫应答的肽和其他化合物。例如，可以筛选所有形成β-折叠片层的肽和蛋白质的适用性。也可以使用抗Aβ或其它致淀粉样肽单克隆抗体的抗-独特型抗体。该抗-Id的抗体类似抗原，产生对它的免疫应答(参见基本免疫学(Essential Immunology)(Roit等，Blackwell科学出版社，Palo Alto， 第6版)，181页)。除了Aβ肽以外的药物可以诱导抗一个或多个以上列出Aβ优选节段(如，1-10，1-7，1-3和3-7)的免疫应答。优选地，这些药物诱导的免疫应答特异性地针对这些节段之一，而不针对Aβ的其它节段。 
还可以筛选肽或其它化合物随机文库的适用性。对于一些以按部就班方式合成的化合物类型可以创建组合文库，这类化合物包括多肽、β-转角模拟物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯并二氮、低聚N-取代甘氨酸和低聚氨基甲酸。可以通过Affymax，WO 95/12608，Affymax，WO93/06121，Columbia大学，WO94/08051，药典，WO 95/35503和Scripps，WO 95/30642中描述的编码合成文库(ESL)法构建化合物的大组合文库(每一文献为各种目的列入本文作为参考)。也可以通过噬菌体展示法产生肽文库。参见，例如，Devlin，WO 91/18980。 
首先通过确定组合文库和其它化合物与已知的特异于Aβ或其它致淀粉样肽的抗体或淋巴细胞(B或T)的结合能力，筛选它们的适用性。例如，可以用任何Aβ或其片段的多克隆血清或单克隆抗体进行最初的筛选。然后筛选结合Aβ内特定表位(如，1-10，1-7，1-3，1-4，1-5和3-7)的化合物。化合物的检测与抗体表位特异性成像的说明方法相同。然后进一步分析该筛选鉴定的化合物诱导Aβ或其中片段的抗体或反应性淋巴细胞的能力。例如，可以在用Aβ肽或其片段预涂的微量滴定平板上测试血清的多步稀释物，可以进行标准ELISA，以测试Aβ或其片段的反应性抗体。然后按照实施例中的描述，在预先诱导致淀粉样病的转基因动物体内测试化合物的预防和治疗功效。所述动物包括，例如，Games等(同上)所述的带有APP 717突变的小鼠，和带有APP 670/671瑞典突变的小鼠，例如，McConlogue等，US5,612,486和Hsiao等，科学，274，99(1996)；Staufenbiel等，美国国家科学院科学进展94，13287-13292(1997)；Sturchler-Pierrat等，美国国家科学院科学进展94，13287-13292(1997)；Borchelt等，神经 (Neuron)19，939-945(1997))。可以将同样的筛选方法用于其它潜在药物，例如前面所述的Aβ类似物和包括Aβ片段的更长肽。 
2.诱导被动免疫应答的药物 
本发明的治疗药物也包括特异性结合Aβ或淀粉样斑其它成分的抗体。该抗体可以是单克隆或多克隆的。这些抗体中的有些特异性结合聚集态的Aβ而不结合分离型的Aβ。有些特异性结合分离型而不结合聚集态。有些既结合聚集态又结合分离型。这些抗体中的一些结合Aβ的天然短型(即Aβ39、40或41)，而不结合Aβ的天然长型(即Aβ42或43)。一些抗体结合长型而不结合短型。一些抗体结合Aβ而不结合全长的淀粉样前体蛋白质。治疗中所用的抗体通常有完整的恒定区或至少足够的恒定区，使其可与Fc受体相互作用。优选人同种型IgG1，因为其在人同种型中对吞噬细胞上的FcRI受体有最高的亲合力。也可以使用双特异性Fab片段，其抗体的一个臂对Aβ有特异性，另一个对Fc受体有特异性。一些抗体与Aβ的结合亲和力大于或等于106、107、108、109或1010M-1。 
典型的，多克隆抗血清含有结合Aβ全长上一些表位的抗体的混合体。然而，多克隆抗血清可以特异性的针对Aβ的个别节段，如Aβ1-10。单克隆抗体结合Aβ内的构象化或非构象化的特异性表位。利用实施例所述的转基因动物模型测试抗体的预防和治疗效果。优选的单克隆抗体结合位于Aβ1-10残基内的表位(将天然Aβ第一个N末端残基设定为1)。一些优选单克隆抗体结合1-5残基内的表位，一些结合位于5-10残基内的表位。一些优选抗体结合氨基酸1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或3-7内的表位。一些优选抗体结合起始于Aβ1-3残基终止于7-11残基的表位。稍差的优选抗体包括那些结合Aβ10-15、15-20、25-30、10-20、20、30、或10-25残基内的表位。建议使用前在实施例所述的小鼠模型中对这些抗体进行活性筛选。例如，已发现10-18、16-24、18-21和33-42残基内表位的抗体缺乏活性。一些方法中，使用结合不同表位的多种单克隆抗体。抗体可以顺序或同时给药。除 Aβ以外的淀粉样成分的抗体也可以应用。例如，抗体可以是针对淀粉样相关蛋白同型核蛋白。 
所述抗体结合特定残基(如Aβ1-5)内的表位，是指抗体特异性地结合具有特定残基(此例中是Aβ1-5)的多肽。这类抗体不一定与Aβ1-5内的每个残基接触。也不是Aβ1-5内的每个氨基酸替代或缺失一定会影响结合亲和力。抗体表位特异性的确定可以通过构成噬菌体展示文库，其不同的成员显示Aβ的不同序列。然后，筛选特异性地结合受测抗体的噬菌体展示文库成员。分离序列家族。典型的，这种家族含有一个普遍的核心序列，以及不同成员的不同长度侧翼序列。特异性结合抗体的最短核心序列表明该抗体结合的表位。用已知表位特异性的抗体进行竞争性分析，也可以测定抗体的表位特异性。例如，与结合Aβ的3D6抗体竞争的抗体与3D6有相同或相似的表位结合，即，位于Aβ1-5残基内。同样的，与10D5抗体竞争的抗体与10D5有相同或相似的表位结合，即，位于Aβ3-6残基内。对抗体表位特异性的筛选是治疗效果的有用预示。例如，确定为结合位于Aβ1-7残基内表位的抗体可能有效预防和治疗阿尔茨海默氏病。 
特异性结合Aβ优选节段，且不结合Aβ其它区域的单克隆或多克隆抗体，相对于结合Aβ其它区域的单克隆抗体或结合完整Aβ的多克隆抗血清而言，有许多优势。第一，同样剂量时，特异性结合Aβ优选节段的抗体含有更高的有效清除淀粉样斑的抗体量。第二，特异性结合优选节段的抗体可以诱导对淀粉样蛋白斑的清除应答，而不诱导对完整APP多肽的清除应答。因此降低了负作用的潜在可能。 
i 免疫球蛋白的一般特征 
已知基本的抗体结构单位包括亚单位的四聚体。每个四聚体包含两个相同的多肽链对，每对含有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的氨基末端包括一个约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每个链的羧基末端包括一个主要负 责效应物功能的恒定区。 
轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，分别定义为抗体的同种型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。轻链和重链中约12或更多氨基酸形成的“J”区连接可变区与恒定区，重链还包括10或更多氨基酸形成的“D”区。(一般参见Fundamental Immunology(Paul，W.，编，第二版，Raven Press，N.Y.，1989第七章)，为各种目的在此全文引入以作参考)。 
每对轻链/重链的可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体有两个结合位点。除了双功能或双特异性抗体，这两个结合位点是相同的。所有的链都显示同样的一般结构，三个高度可变区(也称为互补决定区或CDRs)连接了相对保守的框架区。每对两个链的CDRs由框架区排列，使其可以结合特定表位。从N末端到C末端，轻链和重链的组成都包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区。每区的氨基酸排列与以下文献一致：Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)，或Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等，Nature 342：878-883(1989)。 
ii.非人抗体的获得 
非人单克隆抗体，如，鼠科动物、豚鼠、灵长类动物、兔或大鼠可以通过Aβ免疫动物制备。也可以使用含有Aβ、Aβ的免疫原性片段或Aβ抗体的抗-独特型抗体的更长多肽链。参见Harlow和Lane，抗体，实验室手册(CSHP，NY，1988)(为各种目的列入本文作为参考)。这样一种免疫原可以从天然来源获得、通过肽合成或者通过重组表达获得。选择的，如以下所述，免疫原可以融合载体蛋白或与其复合给药。选择的，免疫原可以结合佐剂给药。可以使用如以下所述的几种佐剂。免疫实验动物时，优选不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂的依次使用。兔和豚鼠典型的用于获得多克隆抗体。小鼠典型的用于获得单克隆抗 体。抗体结合Aβ的特异性筛选。选择的，进一步筛选结合Aβ特定区域的抗体。通过抗体与Aβ缺失突变群的结合，确定与抗体结合的缺失突变体，完成后者的筛选。可以通过如Western Blot和ELISA的方法估计结合作用。显示特异性结合抗体的最小片段定位了该抗体的表位。另一方面，表位的特异性可以通过分析测试所用抗体的参照抗体对Aβ的竞争结合进行确定。如果受测抗体与参照抗体竞争，则它们结合相同表位，或其结合的表位足够接近，以至一个的结合干扰了另一个的结合。这些抗体的优选同种型是小鼠同种型IgG2a或其它种属的相当同种型。小鼠同种型IgG2a是人同种型IgG1的相当同种型。 
iii.嵌合和人源化抗体 
嵌合和人源化抗体与提供构建该嵌合和人源化抗体的小鼠或其它非人抗体有同样或相似的结合特异性及亲和力。嵌合抗体典型地是通过基因工程，将属于不同种的免疫球蛋白基因片段构建成其轻链和重链。例如，小鼠单克隆抗体基因的可变区(V)可能结合人恒定区(C)节段，如IgG1和IgG4。优选人同种型IgG1。因此，典型的嵌合抗体为这样一个杂种蛋白，含有小鼠抗体V或抗原结合区和人抗体的C或效应区。 
人源化抗体的可变区结构残基主要来自人抗体(称为受体抗体)，互补性确定区主要来自鼠抗体(称为供体免疫球蛋白)。参见Queen等，美国国家科学院科学进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86：10029-10033(1989)和WO 90/07861，US 5,693,762、US 5,693,761和US5,585,089、US 5,530,101及Winter，US 5,225,539(为各种目的列入本文作为参考)。如果存在，恒定区主要或全部来自人免疫球蛋白。人可变区通常选自这种人抗体，其结构序列与该CDRs来源的小鼠可变区有高度的一致性。轻链和重链可变区结构残基可以来源于相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然产生的人抗体序列，也可以是几种人抗体的一致序列。参见Carter等，WO92/22653。基于其对CDR构象和/或抗原结合的可能影响，选择某些可变区的结构氨基 酸残基，进行替代。对这些可能影响的研究包括：建立模型，检验特定位点氨基酸的特性，或对特定氨基酸的替代、突变结果进行经验性观察。 
例如，当某个氨基酸在鼠可变区结构残基和选择的人可变区结构残基之间不同，在以下情况，人结构氨基酸通常将被来自小鼠抗体中的相当的氨基酸替代。即，合理地预期该氨基酸： 
(1)直接非共价地结合抗原， 
(2)邻近一个CDR区， 
(3)或者与一个CDR区相互作用(如位于CDR区约6A)，或 
(4)参与VL-VH界面。 
其它被用来替代的，候选在人免疫球蛋白这一位点不寻常的人受体结构氨基酸。这些氨基酸可以被鼠供体抗体相应位置上的氨基酸，或更加典型的人免疫球蛋白相应位置上的氨基酸替代。其它被用来替代的，候选在人免疫球蛋白这一位点不寻常的人受体结构氨基酸。人源化免疫球蛋白可变区结构通常与人可变区结构序列或这些序列的一致序列至少有85％的序列一致性。 
iv.人抗体 
人抗Aβ抗体由以下所述的多种技术提供。一些人抗体选自竞争性结合实验，或与特定的小鼠抗体(如实施例XI中说明的某个小鼠单克隆抗体)有同样的表位特异性。也可以通过仅用Aβ的一个片段作为免疫原，和/或通过筛选抗Aβ缺失突变体组的抗体，筛选具有特定表位特异性人抗体。优选的人抗体有同种型特异性人IgG1。 
(1)三杂交瘤(trioma)法 
Oestberg等描述了基本方法和本方法中作为范例的细胞融合组分，SPAZ-4，Hybridoma 2：361-367(1983)；Oestberg，US专利申请号4,634,664；Engleman等，US专利申请号4,634,666(为各种目的分别列 入本文作为参考)。由于抗体产生细胞系来自三个细胞：两个人细胞和一个小鼠细胞，这种获得抗体表达细胞系的方法称为三杂交瘤法。最初，一个小鼠骨髓瘤细胞与一个人B淋巴细胞融合，得到非抗体产生细胞的异种杂交细胞，如Oestberg(同上)所述的SPAZ-4细胞系。接着，该异种细胞与免疫化的人B淋巴细胞融合，获得产生抗体的三杂交瘤细胞系。发现三杂交瘤比来自人细胞的普通杂交瘤细胞有更稳定的抗体表达。 
免疫化的B淋巴细胞从人供体的血液、脾脏、淋巴结或骨髓中获得。如果期望抗体抗特定抗原或表位，优选使用该抗原或其表位免疫。免疫可以是体外或体内。体内免疫中，B细胞典型的从免疫的人中获得，包括Aβ、其片段、带有Aβ或其片段的更大的多肽，或Aβ抗体的抗-独特型抗体。一些方法中，B细胞来自最终被给药抗体治疗的同一患者。体外免疫中，典型的，B淋巴细胞在添加有10％人血浆的培养介质中(如RPMI-1640，参见Engleman，同上)，7-14天的时期接触抗原。 
利用众所周知的方法，免疫化的B淋巴细胞与异种杂交细胞(如SPAZ-4)融合。例如，细胞用40-50％聚乙二醇(分子量1000-4000)在37度处理5-10分钟。从融合混合物中分离细胞，在选择性培养介质中扩增期望的杂交细胞(如HAT或AH)。通过分析三杂交瘤培养介质中结合Aβ或其片段的能力，可以确定分泌具有所期望结合特异性的抗体的克隆。表达具有所期望特异性之人抗体的三杂交瘤细胞用限制稀释技术亚克隆，并在培养介质中体外培养。然后，测定获得的三杂交瘤细胞系结合Aβ或其片段的能力。 
尽管三杂交瘤细胞遗传上稳定，但并不高量表达抗体。可以将来自三杂交瘤细胞的抗体基因克隆于一个或多个表达载体，载体转化标准哺乳动物、细菌或酵母细胞系，以增加表达水平。 
(2)转基因的非人哺乳动物 
人抗Aβ抗体也可以由转基因的非人哺乳动物表达，其具有编码至少一个人免疫球蛋白基因座节段的转基因。通常，这种转基因哺乳动物的内源免疫球蛋白基因座功能上是无活性的。优选的，人免疫球蛋白基因座节段具有重链和轻链成分的未经重排的序列。内源免疫球蛋白基因的失活和外源免疫球蛋白基因的导入都可以通过定向同源重组，或YAC染色体的导入实现。由此获得的转基因哺乳动物能够功能性的重排免疫球蛋白成分的序列，大量表达人免疫球蛋白基因编码的各种同种型抗体，且不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些性质的哺乳动物的获得与特性详细说明于：如Lonberg等，WO93/12227(1993)；US5,877,397，US5,874,299，US5,814,318，US5,789,650，US 5,770,429，US 5,661,016，US 5,633,425，US 5,625,126，US 5,569,825，US 5,545,806，Nature 148：1547-1553(1994)，NatureBiotechnology 14，826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991)(为各种目的分别列入本文作为参考)。转基因小鼠特别合适。Aβ或其片段免疫转基因的非人哺乳动物中可以获得抗Aβ抗体，如Lonberg或Kucherlapati所述(同上)。利用已知的Kohler-Milstein技术制备单克隆抗体，如，将来自这些哺乳动物的B细胞和合适杂交瘤细胞系融合。还可以从用免疫原药物免疫的人血清中提供人多克隆抗体。任选，该多克隆抗体可以利用Aβ或其它淀粉样肽作为亲合试剂，通过亲合纯化浓缩。 
(3)噬菌体展示法 
更进一步获得人抗Aβ抗体的方法是筛选人B细胞DNA文库，一般的方案见Huse等，Sciences 246：1275-1281(1989)。在三杂交瘤法中说明的，B细胞可以从免疫的人中获得，包括Aβ、其片段、带有Aβ或片段的更大的多肽，或抗-独特型抗体。选择的，B细胞可以从最终接受抗体治疗的患者中获得。选择结合Aβ或其片段的抗体。接着，克隆并扩增编码这些抗体(或结合片段)的序列。Huse所述方案和噬菌体展示法一同使用将更加有效。参见，如，Dower等，WO91/17271 和McCafferty等，WO92/01047，US 5,877,218，US 5,871,907，US5,858,657，US 5,837,242，US 5,733,743，US 5,565,322(为各种目的分别列入本文作为参考)。在这些方法中，产生噬菌体文库，其中的成员在它们的外表面上展示不同的抗体。抗体通常展示为Fv或Fab片段。通过亲合浓缩选择对Aβ或其片段具有理想特异性的噬菌体展示抗体。 
在变化的噬菌体展示方法中，具有选择的鼠抗体结合特异性的人抗体被表达。参见Winter WO 92/20791。这种方法中，选择的鼠抗体的轻链或重链的可变区被用作起始材料。例如，如果轻链的可变区被用作起始材料，构建的噬菌体文库其成员展示相同的轻链可变区(即，鼠起始材料)和不同的重链可变区。重链可变区来自重排的人重链可变区文库。选择对Aβ有强特异性结合(如，至少108，优选的至少109M-1)的噬菌体。来自该噬菌体的人重链可变区接着作为构建另一个噬菌体文库的起始材料。该文库中，每个噬菌体展示相同的重链可变区(即，从第一个展示文库中鉴定的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区来自重排的人轻链可变区文库。又一次，选择对Aβ有强特异性结合的噬菌体。这些噬菌体展示完全的人抗Aβ抗体的可变区。这些抗体与小鼠起始材料有同样或相似的表位特异性。 
v 恒定区的选择 
嵌合的、人源化的、或人抗体的轻链和重链可变区可以与至少部分的人恒定区相连。恒定区的选择部分依赖于是否期望的是抗体依赖性补体和/或细胞介导的毒性。例如，同种型IgG1和IgG3有补体活性，而同种型IgG2和IgG4没有补体活性。同种型的选择也影响抗体进入脑部的途径。优选人同种型IgG1。轻链恒定区可以是λ或κ。抗体可以表达为含有两个轻链和重链的四聚体，可以是独立的轻链和重链，Fab、Fab’F(ab)’2和Fv，也可以作为轻链和重链通过间隔区域连接的单链抗体。 
vi 重组抗体的表达 
嵌合的、人源化的、或人抗体典型的可以通过重组表达获得。重组多核苷酸构建体典型的包括可操作的连接有表达调控序列的抗体链编码序列，包括天然的或异源的启动子区。优选的，表达调控序列是能转化或转染真核宿主细胞的载体内的真核启动子系统。在该载体进入合适的宿主后，使宿主维持在适合该核苷酸序列高水平表达、以及适合交叉反应抗体的收集和纯化的环境中。 
这些表达载体典型的可在宿主有机体中以附加体或宿主染色体DNA中的整合部分复制。一般的，表达载体带有选择标记(如青霉素抗性或潮霉素抗性)，使转化了所期望DNA的细胞得以检出。 
E.coli是一种特别适用于克隆本发明DNA序列的原核宿主。微生物，如酵母，也可用于表达。酿酒酵母是一种优选的酵母宿主，具有合适的带有表达调控序列的载体、复制起始位点、终止序列及其它希望的特点。典型的启动子包括3磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。可诱导的酵母启动子包括，来自乙醇脱氢酶，同型细胞色素C和其它参与麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。 
哺乳动物细胞是表达编码免疫球蛋白及其片段的核苷酸序列的优选宿主。参见，Winnacker，From Genes to Clones，(VCH Publishers，NY，1987)。本领域中发展了许多可以分泌完整异源蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。优选非人的细胞。这些细胞的表达载体包含表达调控序列，如复制起始位点、启动子和增强子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必须的加工信号位点，如核糖体结合位点、RNA剪切位点、多聚腺苷酸位点和转录终止序列。优选的表达调控序列是来自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒之类的启动子。参见Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。 
替代的，抗体编码序列引入转基因中，导入转基因动物基因组并 在转基因动物乳汁中的后续表达(参见，例如US5,741,957，US5,304,489，US5,849,992)。合适的转基因包括可操作的连接哺乳动物乳腺特异性基因(如酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子的轻链和重链的编码序列。 
根据宿主细胞类型，含有目的DNA节段的载体可以众所周知的方式转入宿主细胞。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、粒子轰击或病毒介导的转染可用于其它细胞宿主。转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用1，5-二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、原生质融合，脂质体，电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等，同上)。欲获得转基因动物，转基因可以注射入受精卵细胞，或可以引入胚胎干细胞的基因组中，以及转入去核卵细胞的核中。 
表达后，可以根据本领域标准的技术进行纯化，技术包括：HPLC纯化、柱层析，及凝胶电泳之类(一般参见Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，NY，1982))。 
3.载体蛋白质 
一些诱导免疫应答的药物含有诱导对淀粉样沉积物免疫应答的合适表位，但它们太小而不具有免疫原性。在这种情况下，可以将肽免疫原连接到适当的载体上，以帮助诱导免疫应答。合适的载体包括血清白蛋白、钥孔 
Figure G00808117419950825D000271
(keyhole limpet)血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素、或其它病原菌的类毒素，例如白喉，大肠杆菌，霍乱、或H.Pylori，或者减毒的毒素衍生物。其它载体包括结合多个MHC等位基因的T细胞表位，如，至少75％的全部人MHC等位基因。这些载体有时在本领域被称为“通用T细胞表位”。通用T细胞表位的例子包括： 
流感血凝素：HA307-319P 
Figure G00808117419950825D000272
Y 
Figure G00808117419950825D000273
KQN LAT 
PADRE(常见残基由黑体表示)：A X AAW AAA 
疟疾CS：T3表位EKKIAKMEKASSVFNV 
乙肝表面抗原：HbsAg19-28FFLLTRILTI 
热激蛋白65：hsp65153-171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG 
卡介苗QVHFQPLPPAVVKL 
破伤风毒素：TT830-844QYIKANSKFIGITEL 
破伤风毒素：TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 
HIV gp120T1：KQIINMWQEVGKAMYA 
刺激或增强免疫应答的其它载体包括细胞因子例如IL-1、IL-1α和β肽，IL-2、γINF、IL-10、GM-CSF、和趋化因子，例如M1P1α和β和RANTES。免疫原性的药物还可以如O’Mahony，WO 97/17613和WO 97/17614所述与增强跨组织运输作用的肽相连。 
免疫原性的药物可以通过化学交联连接到载体上。将免疫原连接到载体上的方法包括用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基-硫基)-丙酸酯(SPDP)和琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)(如果肽缺乏巯基，可以通过添加半胱氨酸残基提供)形成二硫键连接。这些试剂在其自身和肽的半胱氨酸残基之间建立了二硫键，以及通过赖氨酸上的ε-氨基或其它氨基酸中的其它游离氨基建立了酰胺键。免疫学研究(Immun.Rev.)62，185(1982)中描述了大量这类二硫/酰胺-形成试剂。其它的双功能偶联剂形成硫醚键而不是二硫键。商业提供了一些硫醚形成剂，包括6-马来酰亚胺基己酸、2-溴乙酸、和2-碘乙酸、4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸。羧基可以通过将其与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸钠盐结合而激活。 
免疫原性的肽还可以与载体(即异源肽)以融合蛋白质的形式表达。可以将免疫原性的肽的氨基末端、羧基末端、或两端都连接载体。任选，在融合蛋白质中可以多次重复出现免疫原性的肽。任选，免疫原性的肽可以连接异源肽的多个拷贝，例如，在该肽的N和C末端。一些载体肽诱导对该载体肽的帮助T细胞应答。被诱导的帮助T细胞 又诱导对该载体肽连接的免疫原性的肽的B细胞应答。 
本发明的一些药物包括一种融合蛋白，其Aβ N末端片段的C端连有一载体肽。这些药物中，Aβ片段的N末端残基构成融合蛋白的N末端残基。相应的，这种融合蛋白有效诱导那些结合需要Aβ N末端残基以自由形式存在的表位的抗体。本发明的一些药物包括多个其C端连接有一个或多个载体肽拷贝的Aβ N末端节段。并入融合蛋白的AβN末端片段有时开始于Aβ1-3，终止于Aβ7-11。Aβ1-7、Aβ1-3、1-4、1-5和3-7是优选的Aβ N末端片段。一些融合蛋白含有不同AβN末端节段的串联重复。例如，融合蛋白可以包括Aβ1-7，跟随着Aβ1-3和一个异源多肽。 
一些融合蛋白中，Aβ N末端节段在其N端融合了一个异源载体多肽。也可以使用与Aβ N末端节段的相同种类的C端融合物。一些融合蛋白含有异源多肽，其连接了AβN末端节段的N端，而该Aβ的N末端片段又连接以串联形式存在的一个或多个另外的AβN末端节段。 
适用于本发明的融合蛋白的例子在以下有所表明。这些融合蛋白中的一些融合蛋白含有与破伤风毒素表位连接的Aβ节段，在US 5,196,512，EP 378,881和EP427,347中作了说明。一些融合蛋白含有与载体肽(说明于US 5,736,142中)连接的Aβ节段。一些异源肽是通用T细胞表位。一些方法中，给药的药物简单的是单一的融合蛋白，其中Aβ片段与一个异源多肽以线性构象连接。一些方法中，药物是代表结构为2X的融合蛋白多聚体，其中X是1-5的整数形式。优选的，X是1、2或3，其中2是最优选的。当X为2时，这种多聚体具有以优选构象相连的四个融合蛋白，称为MAP 4(参见US 5,229,490)。Aβ的表位是下画线的。 
以下展示了MAP 4的构象，其中分支结构的产生是通过在N末 端和赖氨酸的恻链氨基上起始肽链的合成。基于序列中和允许分支的赖氨酸的数量，产生的结构具有多个N末端。在此例中，带有赖氨酸的核心上产生了四个相同的N末端。这种多重性极大的增强了关联B细胞的应答性。 
Figure G00808117419950825D000301
AN90549(MAP4构象中的Aβ1-7/破伤风毒素830-844)： 
DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL 
AN90550(MAP4构象中的Aβ1-7/破伤风毒素947-967)： 
DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 
AN90542(线性构象中的Aβ1-7/破伤风毒素830-844+947-967)： 
DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 
AN90576(MAP4构象中的Aβ3-9/破伤风毒素830-844)： 
EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL 
US 5,736,142中所述肽(均为线性构象)： 
AN90562(Aβ1-7/肽)AKXVAAWTLKAAADAEFRHD 
AN90543(Aβ1-7x3/肽)：DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA 
其它融合蛋白的例子(Aβ的免疫原表位黑体)有： 
AKXVAAWTLKAAA- - - 
Figure G00808117419950825D000305
-AKXVAAWTLKAAA 
Figure G00808117419950825D000311
-ISQAVHAAHAEINEAGR 
Figure G00808117419950825D000312
-ISQAVHAAHAEINEAGR 
-ISQAVHAAHAEINEAGR 
PKYVKQNTLKLAT- - - 
Figure G00808117419950825D000316
-PKYVKQNTLKLAT- 
Figure G00808117419950825D000319
- 
Figure G00808117419950825D0003110
- 
Figure G00808117419950825D0003111
-PKYVKQNTLKLAT 
- -PKYVKQNTLKLAT 
-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV- 
QYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- 
Figure G00808117419950825D0003115
Figure G00808117419950825D0003116
- - -QYIKANSKFIGITEL- 
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 
-QYIKANSKFIGITEL-CFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 
-QYIKANSKFIGITEL-CFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- 
Figure G00808117419950825D0003121
位于具有两个分支的一个树脂上的 
Figure G00808117419950825D0003122
-QYIKANSKFIGITEL 
Figure G00808117419950825D0003124
SQAVHAAHAEINEAGR(MAP4构象中的同型核蛋白融合蛋白) 
相同或相似的载体蛋白以及连接方法可用于获得被用来制备被动免疫中抗Aβ抗体的免疫原。例如，连接载体的Aβ或片段可以给药实验动物，以获得Aβ的单克隆抗体。 
4.编码治疗药物的核酸 
对淀粉样沉积物的免疫应答也可以通过给药编码Aβ肽的节段、或其片段，或其它肽免疫原、或用于被动免疫的抗体及其链组分的核酸进行诱导。所述核酸可以是DNA或RNA。编码免疫原的核酸节段典型地与调控元件相连，例如启动子和增强子，这使DNA节段得以在患者的预期靶细胞中表达。对于在血细胞中的表达，诱导免疫应答 理想的是，来自免疫球蛋白轻链或重链基因的启动子和增强子元件或者CMV主要中早期启动子和增强子适用于指导表达。相连的调控元件和编码序列通常克隆到载体中。给药双链抗体时，其两条链可以克隆于同一个载体中，也可以分别克隆于不同载体中。 
公开的一些病毒载体系统包括逆转录病毒系统(参见例如，Lawrie和Tumin，遗传学进展的目前观点(Cur.Opin.Genet.Develop.)3，102-109(1993))；腺病毒载体(参见例如，Bett等，病毒学杂志(J.Virol.)67，5911(1993))；腺相关病毒载体(参见例如，Zhou等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)179，1867(1994))，来自痘病毒家族的病毒载体，包括痘苗病毒和禽痘病毒，来自α病毒属的病毒载体，例如来自新培斯病毒和塞姆利基森林病毒的载体(参见例如，Dubensky等，病毒学杂志，70，508-519(1996)，委内瑞拉马脑炎病毒(参见US5,643,576)和甲病毒如水泡性口膜炎病毒(参见WO96/34635)以及乳头瘤病毒(Ohe等，人类基因治疗(Human Gene Therapy)6，325-333(1995)；Woo等，WO94/12629和Xiao和Brandsma，核酸研究(Nucleic Acids.Res.)24，2630-2622(1996))。 
编码免疫原的DNA或含该DNA的载体可以包装于脂质体中。合适的脂质和相关类似物由US 5208036，5264618，5279833和5283185所描述。载体和编码免疫原的DNA还可以吸附或连接到颗粒性载体上，载体的例子包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物和聚丙交酯类以及聚(丙交酯-共-乙交酯)，参见例如，McGee等，J.Micro Encap.(1996)。 
可以通过对个体患者给药，向体内传递基因治疗载体或裸DNA，典型地通过全身给药(例如，静脉内、腹膜内、鼻腔、胃、皮内、肌内、皮下、或头颅内灌输)或者局部给药(参见例如US 5,399,346)。这种载体进一步可以包含如丁哌卡因的辅助药物(US5,593,970)。还可以利用基因枪给药DNA。参见Xiao和Brandsma，同上。编码免疫原的DNA可以沉淀到极微金属珠表面。用冲击波或扩散氦气加速微抛 射体，使它透过组织到达几个细胞层的深度。例如，Agacetus，Inc.Middleton WI生产的AccelTM基因传送装置是适用的。或者，仅需将裸DNA点在皮肤上伴随化学或机械刺激即可使DNA穿过皮肤到达血流(参见WO 95/05853)。 
在进一步的改进中，可以将编码免疫原的载体输送给离体细胞，例如来自个体患者的移植细胞(例如，淋巴细胞、骨髓穿刺液、组织活检)或者一般供体的造血干细胞，通常在筛选插入了载体的细胞后，再次将细胞移植到患者体内。 
III.筛选具有清除活性的抗体 
本发明提供在淀粉样沉积物，或其它抗原，或相关生物实体的清除中具有活性的抗体的筛选方法，这种清除活性是所期望的。筛选对淀粉样沉积物的清除活性，来自阿尔茨海默氏病患者或具有阿尔茨海默氏病病理现象之动物的脑部组织样品与带有Fc受体的吞噬细胞(如小胶质细胞)，以及受测抗体在体外培养介质中接触。吞噬细胞可以是初级培养物或如BV-2、C8-B4、THP-1之类的细胞系。一些方法中，这些成分被集合于显微载玻片上以便显微监控。一些方法中，多个反应在微量滴定板的孔中平行进行。这种方式中，独立的微型显微载玻片可以放置在独立的小孔中，或者，在可以使用非显微检测的方式，如Aβ的ELISA检测。优选的，对体外反应混合物中淀粉样沉积物的数量进行量化，从反应前的基线水平开始，反应进行中的一个或多个测试值。抗原可以通过染色检测，如荧光标记的抗Aβ或其它淀粉样沉积物的抗体。用于染色的抗体可以与受测清除活性的抗体相同，也可以不同。如果在淀粉样沉积的反应中出现相对于基线的降低，则认为受测抗体具有清除活性。这些抗体可能可以用于预防或治疗阿尔茨海默氏病和其它致淀粉样病。 
类似的方法可以用于筛选在清除其它类型生物实体中具有活性的抗体。该分析可以用于对几乎任何类型生物实体的清除活性的检测。 典型的，生物实体在人和动物的疾病中有其作用。生物实体可以组织样品或独立的形式提供。如果是组织样品，优选非固定的组织样品，使其成分易于接触，以及可以避免在固定状况时对成分构象的干扰。在本分析中可用于测试的组织样品包括癌组织、癌变前组织、良性生长的组织如瘤或痣、感染了病原微生物的组织、炎症细胞所浸润的组织、含有细胞间病理基质(如纤维蛋白性心包炎)的组织、带有异常抗原的组织，以及芽痕组织。可以使用的已分离的生物实体包括Aβ、病毒抗原或病毒、蛋白聚糖、其它病原微生物的抗原、肿瘤抗原，以及粘连分子。这些抗原可以从天然来源、重组表达或化学合成方法，或其它方式获得。该组织样品或已分离的生物实体与带有Fc受体的吞噬细胞(如小胶质细胞和单核吞噬细胞)，以及受测抗体在培养介质中接触。该抗体可能针对受测生物实体或与之相关的抗原。在后一种情况，目的在于测试是否带有该抗原的生物实体间接地被吞噬。通常的，尽管并不一定，抗体与生物实体(有时是相关抗原)的接触发生在吞噬细胞加入之前。然后监测残存于培养介质中的生物实体和/或相关抗原(如果存在)的浓度。培养介质中的生物实体或相关抗原浓度或数量的减少显示，在吞噬细胞参与时，该抗体对于该生物实体和/或相关抗原具有清除活性。 
IV.接受治疗的患者。 
接受治疗的患者包括具有患病风险，但没有表现出症状的个体，以及目前表现出症状的患者。对于阿尔茨海默氏病，实际上任何人，只要他或她活得足够长，都存在患阿尔茨海默氏病的风险。因此，本发明可以对普遍群体预防性给药，而无需评估受试患者的危险。本发明尤其对已知具有阿尔茨海默氏病遗传危险的个体有效。所述个体包括有患该病经历的亲属，和通过遗传学和生化标记分析确定存在风险的人群。对于阿尔茨海默氏病的风险遗传学标记包括APP基因的突变，尤其是在717位，670和671位的突变(分别被称为Hardy突变和瑞典突变(Swedish mutation))(参见Hardy，TINS，同上)。其他危险标记是早衰素基因(PS1和PS2)以及ApoE4中的突变、AD家族史、血胆 固醇过多或动脉粥样硬化。正患阿尔茨海默氏的个体可以通过特征性痴呆以及上述危险因子的存在识别。另外，可利用大量鉴定患AD的患者的诊断实验。这些实验包括测定CSFτ和Aβ42的水平。升高的τ和Aβ42水平下降表示患有AD。也可以通过实施例部分论述的ADRDA标准诊断患阿尔茨海默氏病的个体。 
对于无症状患者，可以在任何年龄开始治疗(例如10，20，30)。然而，通常在患者到40，50，60或70岁时，才需要开始治疗。治疗通常需要在一段时期内多剂量给药。可以通过分析抗体、或激活的T-细胞或B-细胞对超时治疗药物(例如Aβ肽)的应答，来监测治疗。如果应答失败，表明需要升高剂量。对于潜在的唐氏综合症患者，可以在产前对母亲给药治疗药物开始治疗，也可以在出生后不久对患者给药。 
V.治疗方案 
在预防应用中，对易感阿尔茨海默氏病、或相反存在患阿尔茨海默氏病危险的患者给药足以消除或降低危险、减轻重症、或延缓疾病发作剂量的药物组合物或药物，症状包括疾病的生化、组织学和/或行为症状，疾病发展中出现的中间病理现象及其复杂性。在治疗应用中，对易感或已经患所述疾病的患者给药足以治愈或至少部分抑制疾病症状(生化、组织学和/或行为症状，包括疾病发展中出现的中间病理现象及其复杂性)剂量的组合物或药物。一些方法中，药物的给药减少或消除了尚未表现典型阿尔茨海默氏病病理现象的患者的认知损伤。足以实现上述效果的量被称为治疗-或预防-有效剂量。在预防和治疗方案中，通常均给药几个剂量，直到实现充分的免疫应答。通常监测免疫应答，如果免疫应答开始衰弱则重复给药。 
对于治疗上述病症，本发明组合物的有效剂量随一些不同因素而改变，包括给药方法、靶部位、患者的生理状况、患者是人还是动物、给药的其他药物、以及处理是治疗性的还是预防性的。通常，患者为 人，但也可以治疗包括转基因哺乳动物在内的非人哺乳动物。需要测定治疗剂量，以优化安全性和有效性。免疫原的量依赖于是否还给药佐剂，如果没有佐剂则需要较高剂量。用于给药的免疫原的量有时在每位患者1μg到500μg内变化，更经常每次对人注射5-500μg。偶尔使用每次注射1-2mg的较高剂量。典型地每次对人注射约10、20、50、100μg。免疫原的量也依赖于免疫原内免疫原表位在整体免疫原总量中的比率。典型的，微克的免疫原使用10-3到10-5微摩尔的免疫原表位。值得注意的是注射时间可以从一天一次、到一年一次、到十年一次变化。在任何预定的给用一剂量的免疫原的那一天，如果还给药佐剂，则剂量高于1μg/位患者，通常高于10μg/位患者，如果没有佐剂则剂量高于10μg/位患者，通常高于100μg/位患者。典型疗法包括一次免疫，然后以6周间隔加强注射。另一种疗法包括一次免疫，随后1、2和12个月后加强注射。另一种疗法需要终生每两周注射一次。或者，可以如监测免疫应答所示，不定期加强注射。 
对于利用抗体的被动免疫，剂量范围为约0.0001到100mg/kg受体体重，更经常为0.01到5mg/kg受体体重。例如，剂量可能为1mg/kg受体体重或10mg/kg受体体重或在1-10mg/kg受体体重范围之内。典型的治疗方案包括每两周、或每个月，或每3-6个月给药。一些方法中，同时给药两个或多个具有不同结合特异性的抗体，这种情况每种抗体的给药剂量降到说明的范围内。抗体通常多次给药。每次的间隔可以是以周、月、年记。间隔也可以是不定期的，如通过测试患者Aβ的抗体血液水平所示。一些方法中，剂量被调整到使血浆中抗体浓度为1-1000μg/ml，一些方法中为25-300μg/ml。替代的，抗体可以持续释放剂量给药，这种情况下，不能频繁给药。根据患者的抗体半衰期改变剂量和频率。一般，人抗体有最长的半衰期，接下来依次为人源化抗体、嵌合抗体、和非人抗体。给药剂量和频率也依赖是否治疗性或预防性目的。在预防性应用中，在一段长的时期内，以相对不频繁的间隔，给药相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续受到治疗。在治疗性应用中，要求以相对较短的间隔给药相对较高的剂量，直到 疾病的发展得以减轻或终止，更优选的，直到该患者的疾病症状有部分或完全的改善。在此之后，可以给药患者一种预防性的方案。 
编码免疫原的核酸的剂量范围为10ng到1g，100ng到100mg，1μg到10mg，或30-300μgDNA每位患者。注射感染性病毒载体的剂量为每剂量10-100个毒粒或更多毒粒。 
诱导免疫应答的药物可以经非肠道、局部、静脉、口腔、皮下、关节内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方式给药，用于预防和/或治疗处理。最典型的免疫原药物给药途径为皮下给药，当然其它同样有效。其次最常用的是肌内注射。这种注射类型最典型地在胳膊或腿的肌肉内注射。在一些方法中，直接将药物注射到沉积物累积的特别组织中，例如颅内注射。抗体给药优选静脉输注的肌内注射。一些方法中，特异性的治疗抗体直接注射于颅内。一些方法中，抗体以一种缓释组合物或装置(如MedipadTM装置)给药。 
本发明的药物任选与其它治疗致淀粉样病至少部分有效的药物组合给药。对于脑中发生淀粉样沉积物的阿尔茨海默氏病和唐氏综合症，还可以将本发明的药物与其它促进本发明药物穿过血脑屏障的药物组合给药。 
本发明的免疫原药物，例如肽，有时与佐剂联合给药。可以使用多种佐剂与肽(例如Aβ)联合使用，以诱导免疫应答。优选的佐剂增强对免疫原的固有应答，而不导致影响应答定性形式的免疫原的构象改变。优选的佐剂包括氢氧化铝和磷酸铝、3脱-氧-酰化单磷酰脂类A(MPLTM)(参见GB 2220211RIBI ImmunoChem Reseach Inc.，Hamilton，Montana，现为Corixa的一部分)。StimulonTMQS21是从南美发现的Quillaja Saponaria Molina树的树皮中分离出的三萜糖甙或皂甙(参见Kensil等，疫苗设计：亚基和佐剂研究(Vaccine Design：The Subunit andAjuvant Approach)(Powell和Newman编，Plenum出版社，NY，1995)； 美国专利号：5057540)(Aguila Bio Pharmaleaticals，Framingham，MA)。其它佐剂是水包油型乳剂(例如角鲨烯或花生油)，任选与免疫刺激物(例如单磷酰脂类A)组合(参见Stoute等，N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))。另一种佐剂是CpG(WO98/40100)。或者，可以将Aβ与佐剂偶联。然而，这种偶联应答基本上不改变Aβ的结构，以不影响其产生的免疫应答的性质。佐剂可以作为治疗组合物的一种成分与活性药物一起给药，也可以在给药治疗药物之前、同时、或之后单独给药。 
佐剂的优选种类为铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝。这种佐剂可以与或不与其它特别的免疫刺激剂(例如MPL或3-DMP、QS21、多聚或单体氨基酸例如多聚谷氨酸或多聚赖氨酸)一起使用。另一种佐剂是水包油型乳剂。这种佐剂可以与或不与其它特别的免疫刺激剂(例如胞壁酰肽(例如，N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰葡糖氨基-N-乙酰胞壁酰-L-铝-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-二棕榈酰氧基丙酰胺(DTP-DPP)theramideTM))，或者其它细菌细胞壁成分。水包油型乳剂包括(a)MF59(WO 90/14837)，含5％角鲨烯、0.5％吐温80，和0.5％Span 85(任选含有各种量的MTP-PE)，用微型流化床器(例如110Y型微型流化床器，Microfluidics，Newton MA)配制成亚微细颗粒，(b)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普罗尼克-嵌段共聚物L121、和thr-MDP，微流化成亚微细粒乳剂或者旋涡振荡产生较大颗粒的乳剂，以及(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi ImmunoChem.Hamilton，MT)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80、以及由下述成分组成的一种或多种细菌细胞壁成分，单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)。另一种优选佐剂是皂甙佐剂，例如StimulonTM(QS21，Aquila，Framingham，MA)或者由它们产生的颗粒例如ISCOMs(免疫刺激复合物)和ISCOMATRIX。其它佐剂包括完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。其它佐剂包括细胞因子，例 如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)。 
佐剂可以与免疫原一起作为单一组合物给药，或者可以在免疫原给药之前、同时或之后给药。免疫原和佐剂可以包装在同一个小药水瓶中使用，也可以各自包装于单独小药水瓶，使用前混合。通常将免疫原和佐剂包装于贴有标明预期治疗应用标记的容器内。如果免疫原和佐剂单独包装，包装通常包括使用前混合的指示。佐剂和/或载体的选择依赖于含佐剂的免疫原制剂的稳定性、给药途径、剂量方案、佐剂对被接种的物种的效力，对于人类，可药用的佐剂是经有关管理机构认可或可接受用于对人给药的佐剂。例如，完全弗氏佐剂不适于对人给药。明矾、MPL和QS21是优选的。任选地，可以同时使用两种或多种不同佐剂。优选组合包括明矾与MPL，明矾与QS21，MPL与QS21，以及明矾、QS21和MPL。也可以使用不完全弗氏佐剂(Chang等，先进药物传送综述(Advanced Drug Delivery Reviews)32，173-186(1998))，任选与明矾、QS21、和MPL中的一种和它们的组合一起给药。 
本发明的药物通常作为包含活性治疗药物，和很多其它可药用成分的药物组合物给药。参见Remington’s药物学(第15版，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，1980)。优选剂型根据预期给药和治疗应用方式决定。组合物还可以根据所需的剂型包括可药用的、非毒性载体或稀释剂，它们被认为是常规用于配制给动物或人给药的药物组合物的载体。稀释剂根据不影响组合物的生物活性来选择。这类稀释剂的例子是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲液、林格液，葡萄糖溶液、和Hank’s溶液。另外，药物组合物或制剂还可以包括其它载体，佐剂，或非毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。 
药物组合物还可以包括较大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖如聚氨基葡糖、聚乳酸、聚羟基乙酸和共聚物(例如树胶功能化琼 脂糖凝胶TM、琼脂糖、纤维素等)，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，和脂类聚集物(例如油滴或脂质体)。另外，这些载体具备作为免疫刺激剂的功能(即佐剂)。 
对于非肠道给药，本发明的药物可以作为溶液或物质在生理可接受稀释剂中的悬浮液的可注射剂型与药剂载体(可以是无菌液体，例如水油、盐水、甘油、或乙醇)一起给药。另外，组合物中还可以含有辅助物质，例如保湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它成分是石油，动物、植物、或合成来源的，例如，花生油、大豆油、和矿物油。液体载体通常优选二醇例如丙二醇或聚乙二醇，尤其是可注射溶液。抗体可以以储存注射的形式或移植制剂的形式给药，其中可以以使活性成分持续或脉动释放的方式配制它们。一个范例的组合物包括5mg/ml的单克隆抗体存在于水相缓冲液(含有50mM L-组氨酸，150mM NaCl，用HCl调整pH到6.0)中。 
典型地，将组合物制备成液体溶液或悬浮液的可注射形式；也可以制备成注射前溶解于或悬浮于液体载体的固体剂型。如前面的论述，还可以将制剂乳化于或包埋于脂质体或微颗粒，例如聚丙交酯、聚乙交酯、或共聚物中，用于增强佐剂效果(参见Langer，科学，249，1527(1990)和Hanes，先进药物传送综述28，97-119(1997)。本发明的药物可以以储存注射的形式或移植制剂的形式给药，其中可以以使活性成分持续或脉动释放的方式配制它们。 
适合其它给药方式的其它剂型包括口服、鼻内应用、和肺部应用的制剂，栓剂、和透皮应用制剂。 
对于栓剂，粘合剂和载体包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酸酯；该栓剂可以通过含活性成分在0.5％到10％，优选1％-2％范围内的混合物制备。口服制剂包括赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、和碳酸镁。这些组合物配制成溶液、 悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、控释制剂或粉剂的形式，含有10％-95％活性成分，优选25％-70％活性成分。 
局部应用可以制成透皮或皮内给药制剂。局部给药可以通过共同给药霍乱毒素或其脱毒衍生物或亚基，或者其它类似细菌毒素促进(参见Glenn等，自然391，851(1998))。通过应用经化学交联得到的作为混合剂或连接分子的成分，或者表达为融合蛋白，实现共同给药。 
或者，利用皮肤通道或利用转移体(transferosome)实现透皮给药。(Paul等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)25，3521-24(1995)；Cevc等，生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)1368，201-15(1998))。 
VI.诊断方法 
本发明提供了检测患有或易感阿尔茨海默氏病的患者体内对Aβ的免疫应答。本方法对于监测接受给药患者的治疗过程尤其有用。本发明可以用于监测有症状患者的治疗处理以及无症状患者的预防处理。本发明可以用于监测主动免疫(例如，对给药免疫原应答表达的抗体)和被动免疫(例如，检测给药抗体的水平)。 
I.主动免疫 
一些方法需要确定一个剂量的药物给药之前患者体内的免疫应答基线水平，然后将该值与治疗后的免疫应答值相比较。免疫应答水平的显著增加(即同一样品重复测定中，高于试验误差的典型界限，表示为所述测定平均值基础上的标准差)表明治疗结果为阳性(即，药物的给药得到了或增强了免疫应答)。如果免疫应答的水平没有显著改变，或者有所降低，表明阴性治疗结果。通常，接受药物治疗的患者使用连续剂量时在初期表现为增加的免疫应答，其最终达到稳定期。药物的给药通常是连续的，而免疫应答是不断增加的。稳定期的获得表明治疗给药可以间断或者可以减少剂量或者次数。 
在其它方法中，测定对照组免疫应答的对照值(即，平均值和标准差)。典型地，对照组中的个体没有接受预先治疗。然后将给药治疗剂后患者体内的免疫应答测量值与对照值比较。相对于对照值的显著增加(例如高于平均值的一个标准差)表明阳性治疗结果。缺乏明显的增加或降低表明阴性治疗结果。通常连续给药药物，免疫应答相对于对照值不断增加。和前面一样，相对于对照对照值出现稳定期，表明治疗给药可以间断，或者降低剂量或次数。 
在其它方法中，测定接受治疗药物处理并且免疫应答对治疗的响应已经达到稳定期的个体对照组的免疫应答对照值(例如平均值和标准差)。患者体内免疫应答的测定值与对照值相比较。如果患者的测定值相对于对照值没有显著的不同(例如，高于一个标准差)，则治疗可以间断。如果患者体内的水平显著低于对照值，则需要保证连续给药药物。如果患者体内的水平持续低于对照值，则改变治疗方案，例如，可能预示应用不同的佐剂。 
在其它方法中，对目前没有接受治疗但以前曾接受一个疗程治疗的患者监测免疫应答，以确定是否需要再继续治疗。在早先一个疗程治疗之后，可以将患者体内免疫应答的测量值与患者以前获得的免疫应答值比较。相对于前期测量显著降低(即在相同样品的重复测量中，高于误差的典型界限)表明可以恢复治疗。或者，可以将患者的测量值与接受一个疗程治疗后的患者组测定的对照值相比较(平均值+标准差)。或者，可以将患者的测量值与接受预防处理、没有遗留疾病综合症的患者组或者接受治疗处理、表现疾病症状改善的患者组体内的对照值相比较。在所有这些情况下，相对于对照水平的显著降低(即，超过一个标准差)表明患者应当再继续治疗。 
用于分析的组织样品典型的是来自患者的血液、血浆、血清、粘液或脑脊液。分析样品对任何形式的Aβ肽，典型地是Aβ42的免疫应 答标记。可以通过例如，特异性结合Aβ肽的抗体或T-细胞的存在确定免疫应答。实施例部分描述了检测特异于Aβ的抗体的ELISA法。检测反应性T-细胞的方法前面已经描述过(参见定义)。一些方法中，免疫应答的确定是通过上述第三部分中的清除分析。这些方法中，来自被测试患者的组织样品与淀粉样沉积物(例如，来自PDAPP鼠)及带有Fc受体的吞噬细胞接触。检测随之而来的淀粉样沉积物的清除。清除应答的存在和程度显示了在被测患者组织样品中有效清除Aβ的抗体的存在和水平。 
2.被动免疫 
一般的，监测被动免疫的方法与上述的监测主动免疫的方法相似。然而，被动免疫后的抗体浓度先是迅速上升到峰值，接着指数性降低。如果没有另外的给药，根据给药抗体半衰期的不同，将在几天到几月的时期内降低至处理前的水平。例如，人抗体半衰期为20天。 
一些方法中，在给药前对患者的Aβ抗体进行基线量测，在此之后的第二次量测是为确定抗体的峰值，间隔进行一次或更多次的量测，以监测抗体的下降。抗体降低到基线或预先确定的峰值的更低基线(如50％、25％、或10％)，给药另一剂量的抗体。一些方法中，峰值或其后测定的更低背景与预先确定的参照相比较，以构成对其他患者产生有益的预防性或治疗性处理方案。如果测得的抗体水平明显小于参照水平(例如，小于治疗受益的患者群中参照值平均数减去一个标准差)，表明需要施用额外剂量的抗体。 
3.诊断试剂盒 
本发明进一步提供了进行上述诊断方法的诊断试剂盒。通常，该试剂盒含有特异性结合Aβ抗体的试剂。试剂盒还包括一种标记物。对于检测Aβ抗体，标记物通常是被标记的抗独特型抗体的形式。对于检测抗体，可以预先将试剂结合到固相上使用，例如结合到微滴定平皿的孔中。试剂盒典型地还含有提供使用试剂盒指导的标签。该标 签还可以包括显示测量的标记水平与Aβ抗体之间相关性的图或其他相应方式。术语“标签”指在试剂盒的生产、运输、销售或使用的任何时间，贴附于或包在试剂盒中的任何书写或记录材料。例如，术语“标签”包括广告宣传页和手册、包装材料、说明书、音频或视听磁带、计算机磁盘、以及直接印刷在试剂盒上的书写印记。 
本发明还提供了进行体内成像的诊断试剂盒。该试剂盒典型地含有结合Aβ表位的抗体，优选是1-10残基。优选的，试剂盒含有标记抗体或二级标记药物。优选的，试剂盒含有提供进行体内成像分析的说明的标签。 
VII.体内成像 
本发明提供了对患者淀粉样沉积物的体内成像方法。这种方法可用于诊断或确证阿尔茨海默氏病，或对其的怀疑。例如，该方法可用于出现痴呆症状的患者。如果患者有异常的淀粉样沉积物，则该患者可能患有阿尔茨海默氏病。该方法也可用于无症状的患者。异常淀粉样沉积物的存在表明将来易发展为有症状疾病。该方法也可用于监测疾病的发展和/或早先被诊断为阿尔茨海默氏病患者对治疗的应答。 
该方法给药一种结合患者Aβ的药物，如抗体，并在其结合后检测该药物。优选的抗体结合患者的Aβ沉积物，但不结合全长的APP多肽。特别优选结合于Aβ氨基酸1-10内表位的抗体。一些方法中，抗体结合于Aβ氨基酸7-10内的表位。这类抗体典型地结合且不诱导显著的清除应答。其它方法中，抗体结合于Aβ氨基酸1-7内的表位。这类抗体典型地结合并诱导对Aβ的清除应答。然而，利用缺少一个全长恒定区的抗体片段，如Fab，可以避免这种清除应答。一些方法中，同样的抗体可以作为治疗和诊断药物。一般的，结合Aβ10的C末端表位的抗体没有与结合1-10内表位的抗体相似的强信号。可能因为淀粉样沉积物内的C末端表位是难于接触的。相应的，这种抗体较不被优选。 
可以通过静脉注射患者身体，或颅内注射(或滴入头骨的小孔)脑部，，给药诊断性药物。药物的剂量应处于治疗方法中剂量范围内。典型的，药物是标记的。尽管在一些方法中，与Aβ亲和的一级药物未标记，而使用结合一级药物的标记二级药物，标记的选择基于检测方式。例如，荧光标记适用于光学检测。顺磁标记适用于无须手术参与的X射线断层检测。活性放射标记也可以用PET或SPECT检测。 
比较标记位点与相应基线值的数目、大小和/或强度以进行诊断。基线值代表未感病群体的平均水平。基线值也代表同一患者先前确定的水平。例如，基线值可以在患者治疗开始前确定，而之后的数值可与基线值比较。相对于基线的数值的下降是治疗阳性的信号。 
实施例 
I.抗AD的Aβ的预防功效 
这些实施例描述了对存在717位突变的APP(APP717V→F)过表达的转基因小鼠给药Aβ42肽，预先使它们形成阿尔茨海默氏病样神经病理学。Games等(自然，同上)描述了这些小鼠(PDAPP小鼠)的产生和特征。在这些动物的杂合型中，六个月后开始沉积Aβ。到十五个月，它们表现出的Aβ沉积水平与阿尔茨海默氏病中观察到的水平相同。给PDAPP小鼠注射聚集态Aβ42(聚集Aβ42)或磷酸盐缓冲盐水。选择聚集Aβ42是因为它能够诱导Aβ多表位的抗体。 
A.方法 
1.小鼠来源 
将三十只PDAPP杂合雌性小鼠随机分成下列组：10只小鼠注射聚集Aβ42(转运中一只死亡)，5只小鼠注射PBS/佐剂或PBS，10只是没有注射的对照。5只小鼠注射来自血清淀粉样蛋白质(SAP)序列的肽。 
2.免疫原的制备 
聚集态Aβ42的制备：将两毫克Aβ42(美国肽公司，lot k-42-12)溶解于0.9ml水，加入0.1ml 10×PBS至1ml。将其旋涡振荡，37℃保温过夜，在该条件下，肽聚集。所有未利用的Aβ作为冻干粉末在-20℃储藏，直到下次注射。 
3.注射剂的制备 
每次注射时，将对每只小鼠注射的PBS中的100μg聚集态Aβ42用完全弗氏佐剂(CFA)按照1∶1的比例乳化，至终体积为400μl的乳化剂，用于第一次免疫，之后2周，将不完全弗氏佐剂(IFA)中同样量的免疫原用作加强免疫。以月为间隔用IFA进行另外两次免疫。随后的免疫在500μl PBS中以月为间隔进行。腹膜内(i.p.)注射给药。 
PBS注射遵循同样的方案，每只小鼠用1∶1的PBS/佐剂混合物400μl，或者用500μl PBS注射。SAP注射剂遵循同样的方案，每次注射剂量为100μg。 
4.小鼠出血的滴定、组织准备和免疫组织化学 
上述方法在下面的一般材料和方法中描述。 
B.结果 
用聚集态Aβ42(被聚集的Aβ42)、SAP肽、或磷酸盐缓冲盐水对一组PDAPP小鼠注射。另外留出一组PDAPP小鼠作为未注射的阳性对照。从第四次加强免疫开始每隔一个月监测小鼠对聚集态Aβ42的效价，直到小鼠长到1岁。在第13个月，处死小鼠。在所有检查的时间点，九只聚集态Aβ42小鼠中的八只形成高抗体效价，其在一系列注射过程中，始终保持较高效价(效价高于1/10000)。第九只小鼠有点低，但也可测得效价约为1/1000(图1，表1)。SAPP注射小鼠对该免疫原的效价为1∶1000到1∶30000，仅一只小鼠超过1∶100000。 
在6、10和12个月测定PBS-处理小鼠对聚集Aβ42的效价。当稀释度为1/100时，对PBS小鼠测定的对聚集态Aβ42的效价，仅在一个数据点上比背景超过4倍，而在其它所有时间点上比背景少于4倍(表1)。SAP的特异性应答可以忽略，在这些时间点上所有效价低于300。 
在聚集态Aβ1-42组中九只小鼠中的七只脑中没有检测到淀粉样蛋白。相比较而言，在SAP和PBS组中，小鼠脑组织的海马、以及前皮质和色带环绕皮质中含有许多淀粉样沉积物。沉积模式类似于未处理对照的模式，特征在于累及易损亚区，例如海马锯齿状脑回的外分子层。Aβ1-42注射组的一只小鼠表现淀粉样侵害的明显降低，只限于海马。在另一只Aβ1-42处理小鼠体内鉴定了隔离斑。 
海马中淀粉样侵害的定量图像分析证明，Aβ42(AN1792)处理动物中实现淀粉样侵害显著降低(图2)。PBS组淀粉样侵害的中值(2.22％)和未处理的对照组的中值(2.56％)明显高于用AN1792免疫小鼠的中值(0.00％，p＝0.0005)。相比较而言，SAP肽(SAPP)免疫组的中值为5.74％。利用Aβ特异性单克隆抗体(mAb)3D6观察到未处理的对照小鼠脑组织(海马和夹肌后皮质中)含有大量Aβ淀粉样沉积物。用SAPP或PBS免疫小鼠也观察到类似模式的淀粉样沉积物(图2)。另外，在AD中典型地观察到，这后三组具有这样的特征，即累及脑中的易损亚区，例如在后三组中，均累及海马锯齿状脑回的外分子层。 
不含Aβ沉积物的脑中也缺乏在PDAPP小鼠中利用人APP抗体8E5通常可见的神经炎斑。剩余组(SAP-注射、PBS注射和未注射小鼠)的所有脑中含有大量未处理PDAPP小鼠中典型存在的神经炎斑。在一只AN1792处理小鼠中存在少量神经炎斑，在AN1792处理的第二只小鼠中发现一簇营养不良性轴突。显示于图3的海马图像分析表明，与PBS受体鼠(中值0.28％，p＝0.0005)相比，AN1792处理小鼠(中值0.00％)营养不良性轴突实质上消失。 
Aβ1-42注射组脑中也缺乏斑相关性发炎的星形细胞增生症状。其它组小鼠脑中富含，且丛生Aβ斑相关性神经胶质过多症典型的GFAP-阳性星形胶质细胞。用硫黄素S复染记数GFAP-反应性玻片的一个子集，以定位Aβ沉积物。SAP、PBS和未处理对照中，GFAP-阳性星形胶质细胞与Aβ斑有关。在斑-阴性Aβ1-42处理小鼠中没有发现该相关性，而在一只AN1792处理小鼠中鉴定了斑与神经胶质过多症之间的弱相关性。 
图4显示的夹肌后皮质的图像分析证明，AN1792处理小鼠星形细胞增生降低显著，中值为1.56％，而用SAP肽处理、PBS处理或未处理免疫组，中值高于6％(p＝0.0017)。 
来自Aβ1-42和PBS注射小鼠子集的证据表明Aβ1-42注射小鼠中缺乏斑-相关性MHC II免疫反应性，与Aβ-相关性炎性反应的缺乏一致。 
还将小鼠脑切片与特异于MAC-1(一种细胞表面蛋白质)的mAb反应。MAC-1(CD11b)是整联蛋白家族的成员，与CD18以异质二聚体存在。CD11b/CD18复合物存在于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和天然杀伤细胞上(Mak和Simard)。基于在MAC-1免疫反应性切片中相似的表现型形态学，脑中固有的MAC-1-反应性细胞类型可能是小胶质细胞。与PBS对照组相比，AN1792处理小鼠脑中斑-相关性MAC1标记较低，该结果与Aβ诱导的炎性反应的缺乏一致。 
C.结论 
用Aβ1-42注射的小鼠脑中，Aβ斑和反应性神经元和胶质细胞改变的缺乏表明，在它们的脑中没有或几乎很少沉积淀粉样蛋白，并且没有出现病理结果，例如神经胶质细胞过多症和神经炎病理学。Aβ1-42处理的PDAPP小鼠基本上显示同样缺乏如对照非转基因小鼠的病 理学。因此，注射Aβ1-42对于预防人Aβ沉积或从脑组织中清除人Aβ，以及消除随后神经元和炎性变性性改变高度有效。因此，Aβ肽的给药在预防AD方面具有治疗优点。 
II.剂量反应研究 
用在CFA/IFA中配制的300、100、33、11、3.7、1.2、0.4、或0.13μgAβ对几组五周龄、雌性瑞士Webster小鼠腹膜内给药免疫(每组N＝6)。以两周间隔给药三个剂量，一个月后给药第4个剂量。第一个剂量用CFA乳化，其它的剂量用IFA乳化。每次免疫后4-7天(第二次剂量之后开始)对动物取血，测定抗体效价。用11、33、或300μg抗原免疫的三组动物，在第四次免疫之后以月为间隔再取血四月，以监测一定免疫原制剂剂量范围内抗体应答的衰落。这些动物在研究开始之后的第七个月接受最后一次即第五次免疫。一周后处死动物，测定对AN1792的抗体应答并进行毒理学分析。 
观察到从300到3.7μg剂量应答逐步衰减，最低两个剂量没有应答。11-300μg抗原的3个剂量后平均抗体效价约为1∶1000，4个剂量后约为1∶10000(参见图5)。 
第三次免疫后，除了最低剂量组，其它组抗体效价均显著升高，GMTs升高了5-25倍。甚至0.4μg抗原的受体也检测到较低的抗体应答。1.2μg和3.7μg组效价相近，GMTs约为1000，最高四个剂量集中，GMTs约为25000，除了33μg剂量组GMT较低，为3000。大多数组在第四次免疫之后，效价增加不多。从0.14μg受体没有检测出抗体到11μg受体GMT为36000范围内的0.14μg到11μg较低抗原剂量组内表现出了清楚的剂量应答。此外，11到300μg的四个最高剂量组效价集中。因此，两次免疫之后，对于从0.4到300μg的宽范围内，抗体效价依赖于抗原剂量。到第三次免疫，最高四个剂量的效价彼此接近，再次接受免疫后，它们保持在稳定期上。 
第四次免疫之后一个月，300μg组中的效价比免疫之后5天取血测定的效价高2到3倍(图6)。该观测数据表明峰记忆抗体应答发生在免疫后5天之后。33μg组中，在该时间点，观察到较为平缓的增加(50％)。在300μg剂量组中，最后一个剂量之后两个月，GMTs锐减约70％。再一个月后，衰减不太剧烈为45％(100μg)，对于33和11μg剂量约为14％。因此，终止免疫之后循环系统中抗体效价的衰减速率可能是双相的，峰应答之后的第一个月锐减，随后衰减速率较为平缓。 
这些瑞士Webster小鼠的抗体效价和应答动力学类似于以平行方式免疫的幼年PDAPP转基因小鼠。对于诱导人类免疫应答的剂量有效性通常类似于小鼠的剂量有效性。 
III.对已确定AD的治疗功效的筛选 
设计本实验用于检测免疫原性药物在抑制或逆转衰老动物体内AD的神经病理学症状方面的活性。当PDAPP小鼠脑中已经出现淀粉样斑时，开始用42个氨基酸长的Aβ(AN1792)免疫。 
在该研究的过程中，未处理的PDAPP小鼠形成大量类似于AD中发现的神经变性改变(Games等，同上和Johnson-wood等，美国国家科学院科学进展94，1550-1555(1997))。Aβ沉积成为淀粉样斑与由异常轴突和树状元件(被称为营养不良性神经突)组成的变性神经元应答有关。被包围且含有营养不良性神经突的淀粉样沉积物被称为神经炎斑。在AD和PDAPP小鼠中，营养不良性神经突具有独特的球状结构，与识别APP和细胞骨架成分的抗体平板发生免疫反应，在亚显微结构水平上呈现复杂的亚细胞变性性改变。这些特征得以对PDAPP脑中神经炎斑进行疾病相关性、选择性和重现性地测量。PDAPP神经炎斑的的营养不良性神经元成分可以容易地用人APP特异性抗体观察(单克隆抗体8E5)，并可以通过计算机辅助的图像分析方便地测定。因此，除了测定AN1792对淀粉样斑形成的影响，我们还监测了该治疗对神经炎性营养不良的发展的影响。 
星形胶质细胞和小胶质细胞是应答和反应神经元损伤程度的非神经元细胞。在AD中常可观察到GFAP-阳性星形胶质细胞和MHC II-阳性小胶质细胞，它们活性的增加伴随疾病的加重。因此，我们也监测AN1792-处理小鼠体内反应性星形胶质细胞和小胶质细胞的发展。 
A.材料和方法 
将从Charles River得到的四十八只杂合雌性PDAPP小鼠(11到11.5月龄)随机分成两组：24只小鼠用100μg AN1792免疫，24只用PBS免疫，均与弗氏佐剂混合。当AN1792组和PBS组长到约15月龄时再次分组。15月龄时对AN1792-和PBS-处理动物组分别无痛处死约一半(n分别等于10和9)，其余的继续接受免疫，直到约18个月终止(n分别等于9和12)。研究过程中总共8只动物死亡(5只AN1792，3只PBS)。除了免疫动物，另外包括一岁龄(n＝10)、15月龄(n＝10)和18月龄(n＝10)未处理PDAPP小鼠，用于在ELISA中比较脑中的测量Aβ和APP水平；一岁龄的动物还用于免疫组织化学分析。 
除非另有说明，方法如实施例1所述。在15个月的时间点之前，用AN1792的US Peptides lot 12和California Peptides lot ME0339制备六次免疫给药的抗原。在15到18个月之间用California Peptides lotME0339和ME0439进行另外三次给药免疫。 
用于免疫时，200μl PBS中的100μg AN1792或者单独的PBS，按照1∶1(体积∶体积)的比例，用完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)或PBS乳化，至终体积为400μl。用CFA作为佐剂进行第一次免疫给药，接着的四个剂量与IFA一起给药，最后四个剂量与单独PBS不加佐剂给药。在七个月的时间段内总共进行九次免疫，前三个剂量应用两周方案，随后对于其他注射采用四周的间隔。在15月龄接受无痛处死的四个月治疗组，仅接受前六次免疫。 
B.结果 
1.AN1792对于治疗淀粉样侵害的效果 
通过定量图像分析确定的AN1792对皮质淀粉样侵害的治疗结果如图7所示。在未处理的12月龄PDAPP小鼠组中，皮质淀粉样侵害的中值为0.28％，该值代表研究开始时小鼠体内斑负荷。在18个月，在PBS-处理小鼠体内淀粉样侵害增长了17倍多，达到4.87％，而AN1792处理小鼠淀粉样侵害显著降低，仅为0.01％，明显低于12个月的未处理组和15个月和18个月的PBS处理组。AN1792受体体内，15个月和18个月淀粉样侵害均显著降低，分别为降低96％(p＝0.003)和降低＞99％(p＝0.0002)。 
典型地，PDAPP小鼠体内皮质淀粉样沉积最早出现在前和夹肌后皮质(RSC)中，在腹侧方向上扩展，累及枕叶和顶叶以及entorhinal皮质(EC)。12月龄(大约是首次AN1792给药的年龄)的EC中很少或没有发现淀粉样蛋白。4个月的AN1792治疗后，RSC中淀粉样沉积物很大程度上消失了，AN1792处理完全消除了EC的进行性累及。后一项观察结果表明AN1792完全终止了通常会侵入枕叶和顶叶以及腹侧皮质的淀粉样蛋白的扩展，同时抑制或可能逆转RSC中的沉积。 
进一步通过已经接受七个月治疗的18个月组论证了AN1792治疗PDAPP小鼠体内发展性皮质淀粉样侵害的深远影响。在AN1792处理小鼠体内发现皮质淀粉样蛋白几乎完全消失，扩散斑总体减少，以及紧密沉积物减少。 
2.与AN1792处理有关的细胞和形态学改变 
在典型含有淀粉样沉积物的脑区发现大群Aβ阳性细胞。引人注目的是，几个AN1792受体脑中，发现非常少或者没有发现胞外皮质淀粉样斑。大多数Aβ免疫反应性可能包含于具有大的小叶性和成群细胞体的细胞中。从表型上看，这些细胞类似激活的小胶质细胞或单核细胞。它们与识别通过激活的单核细胞和小胶质(MHC II和CD11b) 表达的配体的抗体具有免疫反应性，偶尔与血管壁或内腔结合。用Aβ和MHC II-特异性抗体标记的相邻切片的比较表明，这两种抗体均可以识别这些细胞的类似模式。对AN1792处理脑仔细检查发现，MHCII-阳性细胞被限制到残留在这些动物体内的有限淀粉样蛋白附近。在所用固定条件下，细胞与识别T细胞(CD3、CD3e)或B细胞(CD45RA、CD45RB)配体或白细胞共同抗原(CD45)的抗体不具有免疫反应性，但与识别与单核细胞交叉反应的白涎素(CD43)的抗体发生反应。任何PBS-处理小鼠体内均没有发现这种细胞。 
PDAPP小鼠毫无例外地在海马锯齿状脑回的外分子层形成严重的淀粉样沉积。沉积在穿孔通道(perforant pathway，在AD中典型地含有淀粉样斑的亚区)中形成明显的条纹。PBS-处理小鼠体内这些沉积物的特征性外观类似于前面描述的未处理PDAPP小鼠体内的特征。淀粉样沉积由连续带中的扩散斑和紧密斑组成。相比较而言，在一些AN1792处理小鼠的脑中，这种模式彻底改变。海马趾淀粉样沉积不再含有扩散淀粉样蛋白，带状模式完全打破。实际上，出现了一些不常见的与抗-Aβ抗体反应的点状结构，其中几个出现在含淀粉样蛋白的细胞中。 
MHC II-阳性细胞经常在AN1792处理动物的胞外淀粉样蛋白附近观察到。在几只AN1792处理小鼠的脑中，Aβ阳性细胞与淀粉样蛋白的关系模式非常类似。这些单核细胞的分布被限制到沉积的淀粉样蛋白附近，在没有Aβ斑的其它脑区完全不存在。MHC II-和Aβ-标记切片的共聚焦显微分析表明淀粉样斑物质存在于许多单核细胞中。 
MHC II和MAC I-标记切片的定量图像分析揭示了与PBS组相比AN1792处理小鼠的RSC和海马中免疫反应性增长趋势，其显示了在海马中测定MAC 1反应性的重要性。 
这些结果表明，携斑脑区淀粉样蛋白的主动的、由细胞介导的清 除。 
3.AN1792对Aβ水平的影响：ELISA测定 
(a)皮质水平 
在未处理PDAPP小鼠中，在12个月时皮质中总Aβ的中值为1600ng/g，到第15个月，该值增加到8700ng/g(表2)。到18个月，该值为22000ng/g，在实验期间中，增加了10倍多。PBS-处理动物在15个月总Aβ为8600ng/g，到18个月增加到19000ng/g。相比较而言，AN1792处理动物在15个月总Aβ(1600ng/g)比PBS免疫组低81％。在18个月将AN1792与PBS组比较时(表2)，发现总Aβ(5200ng/g)显著降低(p＝0.0001)，比应该出现的Aβ水平降低了72％。当比较Aβ42的皮质水平时得到类似的结果，即AN1792处理组含有很少的Aβ42，但在这种情况下AN1792和PBS组之间的差别在15个月(p＝0.04)和18个月(p＝0.0001，表2)显著。 
表2：皮质中Aβ水平的中值(ng/g) 
    未处理   PBS   AN1792
  月  龄   Aβ    Aβ42  (n)   总Aβ  Aβ42  (n)   Aβ     Aβ42   (n)
  12  15  18   1,600  1300   (10)  8,700  8,300  (10)  22,200 18,500 (10)   8,600  7,200  (9)  19,000 15,900 (12)   1,600   1,300*  (10)  5,200** 4,000** (9)
*p＝0.0412 
**p＝0.0001 
(b)海马中的水平 
在未处理PDAPP小鼠中，12月龄海马中总Aβ的中值为15000ng/g，到15个月增加到51000ng/g，到18个月进一步增加到81000ng/g(表3)。PBS免疫小鼠表现相似的值，15个月和18个月分别为40000ng/g和65000ng/g。AN1792免疫动物表现较低的总Aβ，具体在15 个月和18个月的时间点分别为25000ng/g和51000ng/g。18个月的AN1792处理组的值显著低于PBS处理组的值(p＝0.0105；表3)。对Aβ42的测定得出同样的结果模式，即在18个月评价时，AN1792处理组中的水平明显低于PBS组(分别为39000ng/g对57000ng/g；p＝0.0022)(表3)。 
表3：海马中Aβ的中值(ng/g) 
    未治疗   PBS   AN1792
  月龄   总Aβ  Aβ42  (n)   总Aβ  Aβ42 (n)   Aβ    Aβ42    (n)
  12  15  18   15,500 11,100 (10)  51,500 44,400 (10)  80,800 64,200 (10)   40,100 35,70 (9)  65,400 57,10 (12)   24,50  22,100   (10)  50,90* 38,900** (9)
*p＝0.0105 
**p＝0.0022 
(c)小脑中的水平 
在12个月未处理的PDAPP小鼠中，小脑中总Aβ水平的中值为15ng/g(表4)。在15个月，该值增加到28ng/g，到18个月增加到35ng/g。PBS处理动物在15个月总Aβ的中值为21ng/g，18个月为43ng/g。发现15个月的AN1792处理动物总Aβ为22ng/g，18个月的总Aβ(25ng/g)显著低于(p＝0.002)相应的PBS组(表4)。 
表4：小脑中Aβ的中值(ng/g) 
    未治疗   PBS   AN1792
  月龄   总Aβ (n)   总Aβ (n)   总Aβ (n)
  12  15  18   15.6  (10)  27.7  (10)  35.0  (10)   20.8  (9)  43.1  (12)   21.7  (10)  24.8* (9)
*p＝0.0018 
4.AN1792治疗对APP水平的影响 
APP-α和全长APP分子均含有全部或部分Aβ序列，因此可能潜在地被AN1792-介导的免疫应答影响。在对PDAPP小鼠的研究中，注意到随着神经病理学的增加，APP水平轻微上升。皮质中，APP-α/FL(全长)或APP-α在治疗中基本上没有变化，除了在18个月的时间点上，AN1792处理组比PBS处理组APP-α降低了19％。18个月的AN1792处理组APP值与12个月和15个月未处理组和15个月PBS组的值没有明显差异。在所有条件下，APP值均维持在PDAPP小鼠中正常出现的范围内。 
5.AN1792治疗对神经变性和神经胶质病理学的影响 
与15月龄和18月龄的PBS组相比，AN1792处理小鼠前皮质中神经炎斑侵害显著降低(分别为84％，p＝0.03；和55％，p＝0.01)(图8)。从15月龄到18个月龄PBS组神经炎斑侵害的中值从0.32％增加到0.49％。与此相比，AN1792组中神经炎斑的形成显著降低，15个月和18个月组中神经炎斑侵害的中值分别为0.05％和0.22％。 
看来能够很好地耐受AN1792的免疫，当与15月龄和18月龄的PBS组相比时，AN1792处理小鼠的RSC中反应性星形胶质细胞也明显降低，分别降低了56％(p＝0.011)和39％(p＝0.028)(图9)。从15个月到18个月，PBS组中星形胶质细胞增加百分率的中值从4.26％增加到5.21％。AN1792处理抑制了星形胶质细胞增多的进展，两个时间点上分别为1.89％和3.2％。这表明神经纤维网没有因该清除过程而破坏。 
6.抗体应答 
如上所述，十一月龄、杂合PDAPP小鼠(N＝24)接受用弗氏佐剂乳化的100μg AN1792连续五次免疫，在第0、2、4、8、和12周腹膜内给药，在第16周单独用PBS(无弗氏佐剂)进行第六次免疫。作为阴性对照，一系列平行的24只年龄相当的转基因小鼠接受用同样佐剂乳化的PBS免疫，按照同样的方案给药。第二个剂量之后，每次免 疫后三至七天内对动物取血。通过ELISA测定对AN1792的抗体应答。在第二、第三和最后(第六)一个剂量之后，AN1792免疫动物的几何平均效价(GMT)分别约1900、7600、和45000。对照动物中，第六次免疫之后没有测到Aβ特异性抗体。 
约一半的动物接受另外三个月的处理，约在20、24和27周接受免疫。每个剂量分别在单独的PBS(无弗氏佐剂)中给药。在这段时间内，平均抗体效价保持不变。事实上，相应于涵盖从第五次到第九次注射时期的第四次到第8次取血的抗体效价保持稳定。 
为了确定在AN1792处理小鼠的血清中检测到的、免疫诱导的Aβ特异性抗体是否也与沉积的脑淀粉样蛋白结合，将一系列来自AN1792和PBS处理小鼠的切片与小鼠IgG特异性抗体反应。与PBS组相比，AN1792处理的脑中Aβ斑被内源IgG包围。15月龄和18月龄的这两组中均发现这种差别。尤其震惊的是PBS组没有标记，尽管在这些小鼠中存在严重的淀粉样侵害。该结果表明，用合成的Aβ蛋白免疫产生识别和结合体内淀粉样斑中Aβ的抗体。 
7.细胞介导的免疫应答 
9只AN1792免疫和12只PBS免疫的18个月龄的PDAPP小鼠在第九次免疫之后取出脾脏。分离脾细胞，在Aβ40、Aβ42、或Aβ40-1(倒序蛋白质)存在下培养。促分裂原伴刀豆球蛋白A作为阳性对照。用＞1.7μM蛋白质得到最佳应答。来自所有九只AN1792处理动物的细胞均对Aβ1-40或Aβ1-42蛋白质应答而增殖，两种蛋白质的掺入水平相同(图10，上图)。对Aβ40-1反向蛋白质没有应答。来自对照动物的细胞对任何Aβ蛋白质均没有应答(图10，下图)。 
C.结论 
该研究结果表明对存在淀粉样沉积物的PDAPP小鼠进行的AN1792免疫减慢和防止进行性淀粉样沉积，并延缓随之发生的衰老 PDAPP小鼠脑中神经病理学改变。用AN1792免疫基本上终止了在结构上的发展淀粉样蛋白，其通常会形成淀粉样变性病。因此，Aβ肽的给药在治疗AD方面具有治疗优点。 
IV.Aβ片段的筛选 
用9种不同的APP区域和Aβ免疫100只9-11月龄的PDAPP小鼠，以确定哪些表位传送有效应答。9种不同的免疫原和一种对照如上述腹膜内注射。免疫原包括四种人Aβ肽共轭物1-12、13-28、32-42、1-5(均经半胱氨酸键与绵羊抗-小鼠IgG偶联)；APP多肽氨基酸592-695、聚集态人Aβ1-40、和聚集态人Aβ25-35、以及聚集态啮齿动物Aβ42。聚集态Aβ42和PBS分别用作正负对照。每个治疗组安排10只小鼠。如上述监测效价，在注射4个月末，对小鼠进行无痛致死。处死后测定组织化学、Aβ水平、和毒理学。 
A.材料和方法 
1.免疫原的制备 
偶联Aβ肽的制备：通过利用交联试剂磺基-EMCS加到Aβ肽上的人工半胱氨酸偶联制备四种人Aβ肽共轭物(氨基酸残基1-5、1-12、13-28、和33-42，均共轭结合绵羊抗小鼠IgG)。用下列终氨基酸序列合成Aβ肽衍生物。在每种情况下，插入的半胱氨酸残基的位置由下划线指出。Aβ13-28肽衍生物在指出的羧基端半胱氨酸之前还具有两个甘氨酸残基。 
Aβ1-12肽 NH2-DAEFRHDSGYEVC COOH 
Aβ1-5肽 NH2-DAEFRC COOH 
Aβ33-42肽 NH2-C-氨基-庚酸-GLMVGGVVIA COOH 
Aβ13-28肽 Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH 
为了进行偶联反应，将10mg绵羊抗小鼠IgG(Iackson ImmunoResearch Laboratories)对10mM硼酸钠缓冲液(pH 8.5)透析过夜。然后 利用Amicon Centriprep管将透析抗体浓缩到体积为2ml。将10mg磺基EMCS(N-(ε马来酰亚胺铜氧基)琥珀酰亚胺)(分子科学公司(Molecular Sciences Co.))溶解于1ml去离子水。将40倍摩尔过量的磺基-EMCS在搅拌下逐滴加入绵羊抗-小鼠IgG，然后再次搅拌溶液十分钟。纯化活性的绵羊抗-小鼠IgG，通过经0.1M NaPO4、5mM EDTA、pH 6.5的溶液平衡的10ml凝胶过滤柱(Pierce Presto柱，从PierceChemicals获得)，交换除去缓冲液。收集经280nm吸收值鉴定的含抗体的组分，稀释到浓度约为1mg/mL，应用1.4mg/光密度作为消光系数。将40倍摩尔过量的Aβ肽溶解于20mL 10mM的NaPO4(pH 8.0)，除了Aβ33-42肽不同，将其10mg首先溶解于0.5mL DMSO，然后用10mM NaPO4缓冲液稀释到20mL。将肽溶液分别加到10mL活化的绵羊抗-小鼠IgG中，室温下振摇4小时。将得到的共轭结合物用AmiconCentriprep管浓缩到体积小于10mL，然后对PBS透析，以缓冲交换缓冲液，除去游离肽。使共轭物过0.22μ孔尺寸的滤器，用于除菌，然后等分成1mg的组分，-20℃冷冻储藏。利用BCA蛋白质分析(PierceChemicals)，用马IgG作标准曲线，测定共轭物的浓度。通过结合肽相对于活化绵羊抗-小鼠IgG分子量的增加证明共轭结合。Aβ1-5绵羊抗-小鼠共轭物是两次共轭偶联的集合制品，其余的为单一制品。 
2.聚集态Aβ肽的制备 
用人1-40(AN1528；California Peptides Inc.，Lot ME0541)、人1-42(AN1792；California Peptides Inc.，Lot 0339和ME0439)、人25-35、和啮齿动物1-42(California Peptides Inc.，Lot ME0218)的-20℃脱水储藏的冻干粉末新溶解配制一系列注射液。对于这种目的，将2mg肽加入0.9ml去离子水，旋涡搅拌，产生相对均一的溶液或悬浮液。所有这四种中，AN1528是这一步唯一可溶的肽。当AN1528开始沉淀时，加入100μl 10×PBS溶液(1×PBS：0.15M NaCl、0.01M磷酸钠，pH7.5)。悬浮液再次旋涡振荡，在37℃保温过夜留待次日使用。 
pBx6蛋白质的制备：按照Oltersdorf等(生物化学杂志，265， 4492-4497(1990))的描述，构建了编码pBx6的表达质粒，pBx6是由100个氨基酸的噬菌体MS-2聚合酶N-末端前导序列跟随APP的592-695氨基酸(βAPP)组成的融合蛋白质。将质粒转染到E.coli中，经启动子诱导后蛋白质得以表达。使细菌在8M脲中胞溶，通过制备性SDSPAGE部分纯化pBx6。通过Western印记，利用兔抗-pBx6多克隆抗体，鉴定含pBx6的组分，合并组分，利用Amicon Centriprep管浓缩，对PBS透析。制品的纯度，经考马斯蓝染色的SDS-PAGE评价，约为5-10％。 
B.结果和讨论 
1.研究设计 
从Charles River实验室和Taconic实验室获得一百只雄性和雌性、九到十一月龄的杂合PDAPP转基因小鼠。将小鼠分成十组，接受由不同区域的Aβ或APP结合弗氏佐剂的免疫。使动物组内性别、年龄、家系和动物来源匹配，分布尽可能地接近。免疫原包括四种来源于人序列：1-5、1-12、13-28、和33-42的Aβ肽，分别共轭结合绵羊抗-小鼠IgG；四种聚集态Aβ肽，人1-40(AN1528)、人1-42(AN1792)、人25-35、和啮齿动物1-42；以及含有APP氨基酸残基592-695的、被称为pBx6的融合多肽。第十组用PBS结合佐剂免疫，作为对照。 
对于每一种免疫，将溶于200μl PBS的100μg各种Aβ肽或者将溶于同样体积PBS的200μg APP衍生的pBx6或者单独PBS用完全弗氏佐剂(CFA)按照1∶1(体积∶体积)的比例乳化，至终体积为400μl，用于第一次免疫，随后用不完全弗氏佐剂(IFA)中的同样量的免疫原进行其后四个剂量的加强免疫，用PBS作为最后一个剂量。前三个剂量以间隔两周的方案腹膜内给药免疫，然后采用间隔一个月的方案。第二个剂量之后，每次免疫开始后四到七天对动物取血，用于测定抗体效价。最后一个剂量之后约一周无痛处死动物。 
2.脑中的Aβ和APP水平 
用各种Aβ肽或APP衍生物免疫约四个月后，对盐水灌注动物取脑。一个半球准备用于免疫组织化学分析，另一个半球用于Aβ或APP水平的定量分析。为了测定各种形式的β淀粉样肽和淀粉样蛋白前体蛋白质的浓度，解剖半球，在5M胍中制备海马趾、皮层、和小脑区的匀浆。将它们稀释，通过与ELISA中安排的一系列已知浓度的Aβ肽或APP标准品的稀释度相比较，定量淀粉样蛋白或APP的水平。 
用PBS免疫的对照组中，海马中总Aβ浓度的中值比皮层中总Aβ浓度的中值高5.8倍(海马组织的中值为24318ng/g，皮层中为4221ng/g)。对照组小脑中的中值(23.4ng/g组织)比海马中的中值约低1000倍。这些水平类似于我们以前报道的同年龄的杂合PDAPP转基因小鼠的该水平(Johnson-Woods等，1997，同上)。 
对于皮层，处理组子集具有显著不同于对照组的总Aβ和Aβ1-42水平的中值(p＜0.05)，如图11所示，这些动物接受AN1792、啮齿动物Aβ1-42或者Aβ1-5肽共轭物。与对照相比，这些处理组总Aβ的中值分别降低75％、79％和61％。所有组脑皮层区Aβ特异性抗体的效价和Aβ水平之间没有可辨别的相关性。 
在海马中，与AN1792处理相关的总Aβ中值的降低(46％，p＝0.0543)不象在皮层中观察到(75％，p＝0.0021)的那么显著。然而，在海马中降低的量却远远大于皮层，海马中净降低为11186ng/g组织，而皮层中为3171ng/g组织。对于接受啮齿动物Aβ1-42或Aβ1-5的动物组，总Aβ水平的中值分别降低36％和26％。然而，假设组中个体较少，组内动物之间淀粉样肽水平高度可变，这些降低就不明显了。测定海马中Aβ1-42的水平时，没有出现明显的治疗诱导的降低。因此，基于皮层中Aβ侵害较小，该区中的改变是治疗效果的更为灵敏的指标。经ELISA测定的皮层中Aβ水平的改变相似，但是免疫组织化学分析的结果(见下面)却不同。 
也测定了小脑中的总Aβ，该区在AD病理学中通常极少受影响。用各种Aβ肽或APP衍生物免疫的所有组的Aβ浓度的中值均与脑中该区的对照组没有差别。该结果表明处理没有影响Aβ的非病理水平。 
还通过ELISA测定了治疗和对照小鼠皮层和小脑中的APP浓度。应用两种不同方法分析APP。其一，指定的APP-α/FL，识别两种APP-α(α，APP的分泌型，其在Aβ序列中被酶切)，以及APP的全长型(FL)，而第二种仅识别APP-α。在治疗组子集中，与治疗相关的Aβ的降低相比，所有治疗动物的APP水平没有相对于对照动物改变。这些结果表明Aβ肽的免疫没有耗尽APP；治疗作用对Aβ更专属。 
总之，通过AN1792、啮齿动物Aβ1-42或Aβ1-5共轭物的治疗，皮层中总Aβ和Aβ1-42的水平显著降低。海马中，仅AN1792治疗组总Aβ降低显著。在海马趾、皮层或小脑区中，Aβ或APP水平没有其它显著的治疗相关性改变。 
2.组织化学分析 
取来自六组动物的脑用于免疫组织化学分析，三组用Aβ肽共轭物Aβ1-5、Aβ1-12、和Aβ13-28免疫；两组用全长Aβ聚集物AN1792和AN1528免疫，另一组用PBS处理作为对照组。来自这些组脑切片的淀粉样侵害图像分析结果如图12所示。三组治疗组比对照动物皮层区中淀粉样侵害显著减少。在接受AN1792的组中观察到淀粉样侵害最大程度的降低，平均值降低了97％(p＝0.001)。用AN1528和Aβ1-5肽共轭物治疗的动物也观察到显著降低，分别降低95％(p＝0.005)和67％(p＝0.02)。 
通过ELISA定量测定总Aβ或Aβ1-42得到的结果和通过图像分析得到的淀粉样侵害某种程度上不同。当定量图像分析测定时，AN1528处理对皮层淀粉样侵害水平影响显著，而当ELISA测定时，该区种总Aβ的浓度却没有被显著影响。这两种结果的差异可能因为分析的特异 性导致。图像分析仅测定聚集成斑的不溶性Aβ。相比较而言，ELISA测定所有形式的Aβ，包括可溶的和不溶的，单体和聚集体。既然认为该病的病理与Aβ的不溶斑相关型有关，图像分析技术显示治疗效果可能更灵敏。然而，因为ELISA更快速和容易分析，作为筛选目的它非常有效。而且，它可以显示结合斑型比总Aβ的治疗相关性Aβ降低更大。 
为了确定治疗动物中免疫诱导的Aβ特异性抗体是否与沉积的脑淀粉样蛋白反应，将来自治疗动物和对照小鼠的一系列切片与小鼠IgG特异性抗体反应。与PBS组相比，用Aβ肽共轭物Aβ1-5、Aβ1-12、和Aβ13-28和全长Aβ聚集物AN1792和AN1528免疫的动物含Aβ的斑被内源IgG包围。用其它Aβ肽或APP肽pBx6免疫的动物的脑没有用该方法分析。 
3.抗体效价的测定 
第二次免疫之后，每次免疫开始后四到七天对小鼠取血，共取血五次。利用夹心ELISA，用Aβ1-42包被的塑料多孔平板，测定作为Aβ1-42结合抗体的抗体效价。如图13所示，对于诱导AN1792特异性抗体最高效价的四种免疫原制剂AN1792，(峰GMT：94647)；AN1528，(峰GMT：88231)；Aβ1-12共轭物，(峰GMT：47216)；和啮齿动物Aβ1-42，(峰GMT：10766)，第四个剂量之后诱导抗体的效价达到峰位。这些组的效价在第五和第六个剂量之后有点衰减。对于其它五种免疫原，第五或第六个剂量之后达到峰效价，但它们的量比四种最高效价组低很多：Aβ1-5共轭物(峰GMT：2356)、pBx6(峰GMT：1986)、Aβ13-28共轭物(峰GMT：1183)、Aβ33-42共轭物(峰GMT：658)、Aβ25-35(峰GMT：125)。还利用同样的ELISA夹心模式测定了一系列免疫原(那些组用Aβ1-5、Aβ13-28、Aβ25-35、Aβ33-42或啮齿动物Aβ1-42免疫)对同源肽的抗体效价，这些效价与对Aβ1-42测得的效价基本上相同，除了啮齿动物Aβ1-42为免疫原的情况下的抗体效价对同源免疫原约高两倍。个体动物的AN1792特异性抗体效价的量或治 疗组的平均值与由皮层中Aβ降低测定的功效没有相关性。 
4.淋巴细胞增殖反应 
利用最后一次即第六次免疫之后约一周取到的脾细胞测定了Aβ依赖性淋巴细胞增殖。在存在用于刺激的、浓度为5μM的Aβ1-40的条件下，以每孔105的量培养新鲜收获的细胞。还在存在反向肽Aβ40-1的条件下培养来自十组中七组的细胞。作为阳性对照，另外的细胞与T细胞促分裂原，PHA一起培养；作为阴性对照，细胞在不加肽下培养。 
来自大多数动物的淋巴细胞对PHA反应而增殖。对Aβ40-1反向肽没有明显的反应。当用AN1792受试者体内最高cpm的Aβ1-40刺激时，来自较大的聚集态Aβ肽、AN1792、啮齿动物Aβ1-42和AN1528免疫动物的细胞增殖剧烈。用Aβ1-12共轭物、Aβ13-28共轭物和Aβ25-35免疫的各组中有一只动物对Aβ1-40应答增殖。接受Aβ1-5共轭物、Aβ33-42共轭物、pBx6或PBS的其余组没有动物对Aβ刺激应答。结果如下表5概述。 
这些结果表明，AN1792和AN1528强烈刺激T细胞(更可能是CD4+表型)应答。用Aβ1-5免疫动物的体内缺乏Aβ特异性T细胞应答并不奇怪，因为CD4+T细胞识别的肽表位通常约15个氨基酸长度，当然较短的肽有时也具有较低效果的功能。因此，四种结合肽的大量辅助T-细胞表位可能出现在IgG结合模式中，但不在Aβ区。上述每种治疗组中动物的增殖性应答的几率非常低，支持了该假设。既然Aβ1-5共轭物对于显著降低明显缺乏Aβ特异性T细胞的脑中的Aβ水平非常有效，通过这种肽免疫而诱导的免疫应答的关键效应物可能是抗体。 
对于包括所有Aβ残基、含APP氨基酸592-695的融合肽pBx6，缺乏T细胞应答，且抗体应答较低，可能因为这种特殊制品免疫原性较低。Aβ25-35聚集物的低免疫原性可能因为该肽太小而可能不含辅助诱导抗体应答的良好的T细胞表位。如果将该肽与载体蛋白质结合，它将可能有更好的免疫原性。 
V.用于被动保护的多克隆抗体的制备 
125只非转基因小鼠用100μg Aβ 1-42，添加佐剂CFA或IFA进行免疫，到第4-5月无痛处死小鼠。对免疫小鼠采血。将IgG与其它血液成分分离。可以通过亲合层析部分纯化特异于该免疫原的抗体。每只小鼠得到平均约0.5-1mg的免疫原特异性抗体，总量60-120mg。 
VI.用Aβ抗体进行被动免疫 
如下所示，对7-9月龄PDAPP小鼠组中的每一只注射0.5mg多克隆抗-Aβ抗体或特异性抗-Aβ单克隆抗体的PBS液。纯化所有抗体制剂，使其具有较低的内毒素水平。可以通过将Aβ片段或长型注射到小鼠体内，制备杂交瘤、筛选特异性结合Aβ目的片段而不结合其它Aβ非重叠片段的抗体的杂交瘤，制备针对该片段的单克隆抗体。 
表6 
  抗体   表位
  2H3   Aβ1-12
  10D5   Aβ1-12
  266   Aβ13-28
  21F12   Aβ33-42
  小鼠多克隆抗人  Aβ42   抗聚集态Aβ42
在4个月的时间内，按照需要对小鼠腹膜内注射，以维持通过ELISA效价测定的高于1/1000(通过ELISA对Aβ42或其它免疫原确定)的循环抗体浓度。如上述监测效价，在注射的六个月末无痛处死小鼠。处死后，研究组织化学、Aβ水平和毒理学。每组安排十只小鼠。其它被动免疫研究在以下实例XI和XII中作了说明。 
VII.不同佐剂的比较 
该实施例比较了CFA、明矾、水包油型乳剂和MPL刺激免疫应答的能力。 
A.材料和方法 
1.研究方案设计 
将从Elm Hill得到的100只雌性Hartley系六周龄豚鼠分成10组，用AN1792或其棕榈酰化衍生物结合各种佐剂免疫。七组接受AN1792(33μg，除非另有说明)结合a)PBS，b)弗氏佐剂，c)MPL，d)角鲨烯，e)MPL/角鲨烯，f)低剂量的明矾，或g)高剂量的明矾(300μgAN1792)的注射。两组接受AN1792棕榈酰化衍生物(33μg)结合a)PBS或b)角鲨烯的注射。最后一组，即第十组接受单独PBS(无抗原或其它佐剂)的注射。对于接受弗氏佐剂的组，第一个剂量用CFA乳化，其余四个剂量用IFA乳化。除了高剂量明矾组接受300μg AN1792， 其它各组以33μg的剂量给药抗原。对于CFA/IFA，腹膜内注射给药，对于其它各组，在后肢四头肌左侧和右侧交替肌肉内注射给药。前三个剂量以两周间隔方案给药，随后两个剂量以每月间隔给药。从第二个剂量之后开始，每次免疫后六到七天取血，用于测定抗体效价。 
2.免疫原的制备 
将2mg Aβ42(California Peptide，Lot ME0339)加入0.9ml去离子水，旋涡振荡混合物，产生相对均一的混悬液。加入100μl 10×PBS(1×PBS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠，pH 7.5)。混悬液再次旋涡振荡，37℃保温过夜留待次日使用。将不用的Aβ1-42脱水成为冻干粉末，于-20℃储存。 
通过在二甲基甲酰胺液中，将棕榈酸酐偶联到AN1792的氨基末段残基上，然后从氢氟酸处理的树脂上提取新生肽，制备AN1792的棕榈酰化衍生物。 
为了制备与完全弗氏佐剂(CFA)结合的制剂(组2)，将200μl中的33μg AN1792用CFA按照1∶1(体积∶体积)的比例乳化至终体积为400μl，用于第一次免疫。对于随后几次免疫，用不完全弗氏佐剂(IFA)进行类似乳化。 
为了制备第5组和第8组的结合MPL的制剂，将冻干粉末(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)加入到0.2％的三乙胺水溶液，至终浓度为1mg/ml，然后旋涡振荡。将混合物加热到65-70℃保温30秒，以制备轻微浑浊的均匀的胶束悬浮液。新鲜配制用于一系列注射的溶液。对于第5组的各次注射，将16.5μl PBS、50μg MPL(50μl)和162μl PBS中的33μg AN1792在硼硅酸盐试管中混合后立即使用。 
为了制备与低水包油型乳剂形成的制剂，将AN1792的PBS液加入含5％角鲨烯、0.5％吐温80、0.5％ Span 85的PBS液，至终单剂量 浓度为250μl液体中33μg AN1792(第6组)。将混合物过两仓手动装置乳化15到20次，直到显微镜下观察可见乳滴直径基本上等于1.0μm直径的标准乳珠。得到的混悬液为牛奶状乳白色。新鲜配制用于一系列注射的乳剂。对于第8组，将0.2％三甲胺中的MPL以每剂量50μg的浓度加入角鲨烯和去污剂混合物，用于进行如上述的乳化。对于棕榈酰衍生物(第7组)，将每剂量33μg棕榈酰-NH-Aβ1-42加入角鲨烯，然后旋涡振荡。然后在旋涡振荡下，加入吐温80和Span 85。将该混合物加入PBS，至终浓度为5％角鲨烯、0.5％吐温80、0.5％ Span 85，将混合物如上述乳化。 
为了制备结合明矾的制剂(第9组和第10组)，将AN1792的PBS液加入含铝水凝胶(氢氧化铝凝胶，Accurate，Westbury，NY)，达到250μl终制剂体积中每5mg明矾33μg(低剂量，第9组)或300μg(高剂量，第10组)AN1792的浓度。混悬液在室温下温和混合4小时。 
3.抗体效价的测定 
从第二次免疫开始后，每次免疫后六到七天对豚鼠取血，总共取血四次。通过一般材料和方法中描述的ELISA测定抗Aβ42的抗体效价。 
4.组织制备 
约14周后，对所有豚鼠使用CO2无痛处死。收集脑脊液，取出脑，解剖三个脑区(海马、皮层和小脑)，用于利用ELISA测定总Aβ蛋白质的浓度。 
B.结果 
1.抗体应答 
当测定免疫后对AN1792的抗体应答时，各种佐剂产生效力范围变化较大。如图14所示，当在PBS中给药AN1792时，二或三次免疫后没有检测到抗体，第四和第五个剂量后检测到的应答可忽略不 计，几何平均效价(GMT)仅约为45。水包油型(o/w)乳剂第三个剂量后诱导中度效价(GMT 255)，第四个剂量后该值维持(GMT 301)，最后一个剂量后衰减(GMT 54)。对于结合明矾的AN1792存在明显的抗原剂量应答，在所有时间点上300μg的抗原比33μg的抗原具有更好的免疫原性。在抗体应答的峰位，即第四次免疫后，两个剂量之间GMT的差异为43％，为1940(33μg)和3400(300μg)。对33μg AN1792加MPL产生的抗体应答非常类似于剂量几乎高出十倍的抗原(300μg)结合明矾产生的抗体应答。将MPL加入o/w乳剂相对于MPL作为单独佐剂使制剂的效力降低近75％。AN1792的棕榈酰衍生物在PBS中给药时，完全没有免疫原性，当在o/w型乳剂中给药时，在第三次和第四次取血时得到中度效价，GMT分别为340和105。用弗氏佐剂产生最高抗体效价，峰GMT约为87000，该值比其次两个最有效制剂(MPL和高剂量AN1792/明矾)的GMT高出近30倍。 
经该研究鉴定的最值得推荐的佐剂是MPL和明矾。对于这两种，MPL看起来更为优选，因为它只需要低10倍的抗原剂量即可产生用明矾得到的相同的抗体应答。可以通过增加抗原和/或佐剂剂量，和通过优化免疫方案促进应答。对于AN1792，o/w型乳剂是一种非常差的佐剂，将o/w型乳剂加入MPL佐剂削弱了单独MPL的固有佐剂活性。 
2.脑中的Aβ水平 
在大约14周时，使豚鼠深度麻醉，提取脑脊液(CSF)，切下以下各组动物的脑，它们是用弗氏佐剂(第2组)、MPL(第5组)、明矾与高剂量(300μg)AN1792(第10组)免疫的组和PBS免疫的对照组(第3组)。为了测定Aβ肽的水平，解剖一个大脑半球，在5M胍中制备海马趾、皮层、和小脑区的匀浆。将它们稀释，然后通过与ELISA模式中已知浓度的Aβ标准蛋白质的一系列稀释度相比较对它们定量。所有四组的海马、皮层和小脑中Aβ蛋白质的水平都非常接近，尽管由这些制剂诱导的对Aβ的抗体应答的范围非常宽。海马中测定的平均Aβ水平约为25ng/g组织，皮层中为21ng/g，小脑中为12ng/g。因此，在某 些动物中出现的近三个月对Aβ的高循环抗体效价没有改变它们脑中的总Aβ水平。各组之间，CSF中的Aβ水平也非常接近。AN1792免疫对内源性Aβ缺乏巨大影响表明免疫应答集中在Aβ的病理学形成上。 
VIII.小鼠体内对不同佐剂的免疫应答 
用六周龄雌性瑞士Webster小鼠进行该研究，每组10-13只动物。在第0、14、28、60、90和20天皮下给药进行免疫，制剂体积为200μl。用PBS作为所有制剂的缓冲液。从第二个剂量开始后，每次免疫后7天对动物取血，通过ELISA分析抗体效价。各组的治疗方案如表7概述。 
表7 
Figure G00808117419950825D000701
脚注： 
a 实验开始时各组中小鼠的个数 
b 表明佐剂。所有这些制剂的缓冲液均为PBS。对于第8组，没有佐剂也没有抗原。 
各组中针对Aβ42的抗体ELISA效价显示于下表8中。 
表8 
该表显示第4、5和18组得到最高效价，其中佐剂是125μg MPL，50μg MPL和QS21加MPL。 
IX.不同佐剂的治疗效果 
在PDAPP转基因小鼠中，研究了一系列适合人类应用的佐剂的治疗效果，以确定它们增强对Aβ免疫应答的能力和诱导免疫介导的淀粉样沉积物在脑中清除的能力。 
从Charles River实验室得到180只雄性和雌性7.5到8.5月龄的杂合PDAPP转基因小鼠。将小鼠分成9组，每组含动物15-23只，用AN1792或AN1528结合各种佐剂免疫。分配动物时，使各组之间动物的性别、年龄、和动物家系尽可能匹配。佐剂包括明矾、MPL、和QS21，分别与两种抗原混合，弗氏佐剂(FA)仅与AN1792组合。另外一组用加有防腐剂硫柳汞的PBS缓冲液配制的AN1792不加佐剂免疫。第9组单独用PBS免疫，作为阴性对照。 
聚集态Aβ肽的制备：用人Aβ1-40(AN1528；California Peptides Inc.，Napa，CA；Lot ME0541)和人Aβ1-42(AN1792；California Peptides Inc.，Lot ME0439)肽的脱水储藏于-20℃的冻干粉末新溶解配制一系列注射制剂。对于这种目的，将2mg肽加入0.9ml去离子水，旋涡振荡，产生相对均一的溶液或悬浮液。与AN1792相比，AN1528在该步骤中是可溶的。当AN1528开始沉淀时，加入100μl 10×PBS溶液(1×PBS：0.15M NaCl、0.01M磷酸钠，pH 7.5)。悬浮液再次旋涡振荡，在37℃保温过夜留待次日使用。 
为了制备结合明矾的制剂(第1组和第5组)，将PBS中的Aβ肽加入含铝水凝胶中(Alhydrogel，2％氢氧化铝凝胶水溶液，Sargeant，Inc.，Clifton，NJ)，至每1mg明矾100μg Aβ肽的浓度。加入10×PBS溶液至终制剂体积为1×PBS液200μl。然后将混悬液在室温下温和混合约 4小时，以便注射。 
为了制备结合MPL的制剂(第2组和第6组)，将冻干粉末(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT；Lot 67039-E0896B)加入0.2％的三乙胺水溶液，至终浓度为1mg/ml，然后旋涡振荡。将混合物加热到65-70℃保温30秒，以制备轻微浑浊的均匀的胶束悬浮液。该溶液在4℃储藏。用于每组注射，将每剂量50μl PBS中100μg的肽、每剂量50μg的MPL(50μl)和每剂量100μl的PBS在硼硅酸盐试管中混合后立即使用。 
为了制备结合QS21的制剂(第3组和第7组)，将冻干粉末(Aquila，Framingham，MA；Lot A7018R)加入PBS(pH 6.6-6.7)，至终浓度为1mg/ml，然后旋涡振荡。将溶液在-20℃储藏。用于每次注射时，将50μlPBS中每剂量100μg的肽、25μl PBS中每剂量25μg的QS21和每剂量125μl的PBS在硼硅酸盐试管中混合后立即使用。 
为了制备与弗氏佐剂(CFA)结合的制剂(组4)，将200μl PBS中的100μg AN1792用完全弗氏佐剂(CFA)按照1∶1(体积∶体积)的比例乳化，终体积为400μl，用于第一次免疫。对于随后几次免疫，用不完全弗氏佐剂(IFA)对抗原进行类似乳化。对于含有佐剂明矾、MPL或QS21的制剂，将每剂量100μg的AN1792或AN1528与明矾(每剂量1mg)或MPL(每剂量50μg)或QS21(每剂量25μg)混合，在PBS中至终体积为200μl，在后背肩胛骨之间皮下接种给药。对于接受FA的组，将100μg的AN1792用完全弗氏佐剂(CFA)按照1∶1(体积∶体积)的比例乳化，终体积为400μl，腹膜内给药，作为第一次免疫，随后用同样量的免疫原在不完全弗氏佐剂(IFA)中进行其后五个剂量的加强免疫。对于接受不含佐剂的AN1792治疗的组来说，将10μg AN1792与5μg硫柳汞混合，在PBS中终体积为50μl，皮下给药。第九组即对照组仅接受200μl PBS皮下给药。在第0、16、28、56、85和112天上，对前三个剂量采用两周间隔方案进行免疫，之后以一月间隔方案 免疫。第二个剂量开始后，每次免疫后六到七天对动物取血，用于测定抗体效价。最后一个剂量后约一周，无痛处死小鼠。通过脑中Aβ和APP水平的ELISA分析，以及通过脑切片中存在的淀粉样斑的免疫组织化学评价，测定结果。另外，确定Aβ特异性抗体效价、和Aβ-依赖性增殖应答和细胞因子应答。 
表9表明，FA和AN1792诱导出对Aβ1-42的最高抗体效价，第四次免疫之后达到峰效价(峰GMT：75386)，最后一次免疫，即第六次免疫后，衰减了59％。由MPL和AN1792诱导的峰平均效价(峰GMT：28867)比与FA产生的峰平均效价低62％，并且也在免疫方案中很早(3个剂量之后)达到峰，之后到第六次免疫后，峰值衰减到28％。由QS21和AN1792产生的峰平均效价(GMT：1511)比用MPL得到的效价约低5倍。另外，应答动力学较慢，因此需要再一次免疫以达到峰应答。由明矾-结合AN1792产生的效价略高于用QS21得到的效价，应答动力学也较QS21的迅速。对于在加有硫柳汞的PBS中给药的AN1792，效价的频率和大小仅高于PBS单独处理组。MPL和AN1528产生的峰效价(峰GMT3099)比用AN1792产生的约低9倍。结合明矾的AN1528免疫原性非常低，仅在一些动物体内产生较低效价。用单独PBS免疫的对照动物体内没有观察到抗体应答。 
表9 
脚注： 
a 测定对Aβ1-42的几何平均抗体效价 
b 每组应答者的数目 
通过ELISA测定的，AN1792或AN1528结合各种佐剂、或者硫柳汞治疗12月龄小鼠皮层淀粉样侵害的结果如图15所示。在PBS 对照PDAPP小鼠中，12个月时，皮层中总Aβ的水平中值为1817ng/g。在用AN1792加CFA/IFA、AN1792加明矾、AN1792加MPL和QS21加AN1792处理的小鼠中观察到Aβ水平显著降低。仅AN1792加CFA/IFA的降低达到统计的显著度(P＜0.05)。然而，如实施例I和III所示，在降低Aβ水平方面的免疫效果在15月龄和18月龄小鼠中基本上较大。因此，期望AN1792加明矾、AN1792加MPL、AN1792加QS21组合物至少在治疗年龄较大小鼠时将获得统计的显著度。相反，AN1792加防腐剂硫柳汞显示，Aβ的中值与PBS治疗小鼠基本上相同。当比较皮层Aβ42的水平时，得到类似的结果。PBS对照组中Aβ42的中值为1624ng/g。用AN1792加CFA/IFA、AN1792加明矾、AN1792加MPL、AN1792加QS1处理小鼠中观察到显著降低的中值，分别为403、1149、620和714，AN1792CFA/IFA处理组的降低获得统计的显著度(p＝0.05)。AN1792硫柳汞处理小鼠中Aβ42的中值为1619ng/g。 
进一步的治疗佐剂或免疫原效率分析实施于9-10.5月龄的雄性和雌性异源PADPP转基因小鼠中。每个处理组29-40只动物，研究期为25周；所以在实验结束时动物为15-16.5月龄。处理组显示于下表10中。 
    佐剂   免疫原   稀释缓冲液   给药方式
 组1   MPL-SE   AN1792-GCS(75μg)   PBS   SC(250μl)
 组2   ISA51   AN1792-GCS(75μg)   PBS   IP(400μl)
 组3   QS21   AN1792-GCS(75μg)   PBS   SC(250μl)
 组4   QS21(简)   AN1792-GCS(75μg)   PBS   SC(250μl)
 组5   PBS   -------   -------   SC(250μl)
表10缩写：MAP-多抗原性肽；TT-破伤风毒素T细胞表位(830-844)；SQ-皮下；IP-腹膜内；PBS-磷酸缓冲盐溶液；ISA-51类似IFA的商业化佐剂；GCS-由甘氨酸/柠檬酸/蔗糖溶液构成；MPL-SE是稳 定水油乳浊液中的MPL。 
免疫方案除了第三组(缩短的QS21/AN1792)外，各处理组都相同。在0、2、4、8、12、16、20和24周注射小鼠，在3、5、9、13、17、21和25周取血。在本研究的25周内，第一、二组注射8次而第三组4次。第四组，QS21/AN1792的缩减方案，仅在第0、2、4、和8周接受注射。尽管以同样的取血方案对其取血以跟踪效价的下降，在其它之后的周中，该组不受注射。第三和第五组，分别是QS21/AN1792和PBS，在本实验中作为阳性和阴性对照。 
通过抗Aβ抗体效价分析确定各效价。 
第一组，MPL-SE/AN1792组。第九周几何平均效价(GMT)上升至峰值17,100，25周时GMT降至10,000。初始时，MPL-SE效价上升至略高于QS21/AN1792对照组(第四组)。 
第二组，ISA-51/AN1792组。在整个实验中产生高效价，后9周内GMT超过100,000。 
第三组，QS21/AN1792对照组。效价在17周达到峰值，GMT 16,000。然后效价在以后的8周中下降，最后以GMT8,700结束。本组中一只动物在实验的全过程中未升高效价。 
第四组，QS21/AN1792缩减的注射方案组。效价在最后一次注射的5周后的第13周达到峰值7,300。最后取血时(25周)效价降至GMT2,100。在此对照组中，一只动物无可检出的升高效价，而另一只动物在下降期结束后丧失所有的效价。 
第五组，PBS独立处理的组，无效价。 
评价皮层Aβ的水平，可用ELISA量化总Aβ和Aβ1-42。简述如 下，脑半球分离为皮层、海马和小脑组织，5M的胍缓冲液中匀浆并分析脑部Aβ。皮层的总Aβ和Aβ42有相似结果。进行Mann-Whitney统计学分析以确定在P值为0.05(表明Aβ显著变化)的组之间的显著度。 
与PBS对照组相比，所有的处理组显著降低了总Aβ的水平(见表11)。MPL-SE/AN1792组的Aβ变化最大，并显著优于其它处理组。QS21/AN1792缩减组在Aβ总体变化上与接受所有8次注射的QS21对照组相似。与CFA/IFA-MAP(Aβ1-7)组相比，ISA51/AN1792组的Aβ水平也有相似的降低。 
表11皮层Aβ水平 
    PBS   MPL-SE   ISA   QS-21   QS-21(4)
  平均值  (纳克/克组织)   7,335   1,236   3,026   2,389   2,996
  范围  (纳克/克组织)   550-18,358   70-3,977   23-9,777   210-11,167   24-16,834
  P值   ---   ＜0.0001   ＜0.0001   ＜0.0001   ＜0.0001
  N   38   29   36   34   40
总之，佐剂MPL-SE、ISA-51和QS-21与AN1792结合可以有效的诱导足量的免疫应答，显著减缓Aβ在皮层中的沉着。 
X.毒性分析 
在实施例2、3和7描述的研究的末期，收集组织，用于组织病理学检查。另外，对来自实施例3和7的末期血样进行血液学和临床化学检查。评价大多数主要器官，包括脑、肺、淋巴、胃肠道、肝、肾、肾上腺和性腺。虽然在研究动物中观察到偶发性损伤，但是在AN1792处理和未处理动物之间，无论是受影响组织还是损伤严重性上均没有明显差异。AN1528免疫动物与PBS处理或未处理动物相比 没有特别的值得注意的组织病理学损伤。在实施例7中，佐剂组和PBS处理动物之间临床化学表现也没有差异。虽然，实施例7中AN1792和弗氏佐剂处理动物相对于PBS处理动物，几种血液学参数存在显著增加，但是这些类型的影响是弗氏佐剂治疗和伴生的腹膜炎带来的能够意料到的影响，它们不能说明AN1792治疗带来任何不利作用。虽然不是部分毒理学评价，但广泛地检查了PDAPP小鼠的脑部病理作为部分功效端点。在所有研究中没有发现与治疗有关的脑病理学不良影响的迹象。这些结果表明AN1792治疗可以很好地耐受，至少基本上没有副作用。 
XI.抗Aβ抗体的治疗性处理 
本实施例测试各种Aβ多克隆和单克隆抗体抑制异源转基因小鼠脑部Aβ聚集的能力。 
1.实验设计 
60只8.5-10.5月龄的雄性和雌性杂合PADPP转基因小鼠来自Charles River实验室。小鼠被分成6组，分别用针对Aβ的各种抗体处理。分组使每组中动物性别、月龄、家系和来源尽可能保持一致。如表10所示，抗体包括四种鼠Aβ特异性的单克隆抗体，2H3(针对Aβ残基1-12)，10D5(针对Aβ残基1-16)，266(针对Aβ残基13-28，结合单体的AN1792而非聚集态AN1792)，21F12(针对Aβ残基33-42)。第五组用Aβ特异性的多克隆抗体组分(用聚集态AN1792免疫获得)处理。阴性对照组仅接受稀释剂PBS，没有抗体。 
单克隆抗体每次注射剂量约每千克体重10毫克(假设小鼠重50克)。平均每七天进行腹膜内给药，使抗Aβ效价维持在1000以上。尽管因mAb 266不与本实验中用作捕捉抗原的聚集态AN1792良好结合，从而有效价较低，但仍然使用同样的剂量方案。由于在体内抗体被快速清除，接受单克隆抗体2H3的组在前三周内被终止。每次给药前对动物取血以测定抗体效价。治疗持续6个月，总计约196天。在 最后一次给药一周后，无痛处死动物。 
表12： 
脚注： 
a：实验结束时组内的小鼠数目，所有的组以每组10只动物开始。 
b：NA：不适用 
c：mAb单克隆抗体 
2.材料和方法 
a：抗体制备 
从两组动物采集的血液中制备抗Aβ多克隆抗体。第一组含有6-8周龄的100只雌性瑞典Webster小鼠。在0、15和29天用100μg与CFA/IFA组合的AN1792免疫。第三十六天进行第四次注射，给药一半剂量的AN1792。第42天放血法处死动物，制备血清，共收集血清64ml。第二组含有24只6-9周龄的雌性小鼠，与PDAPP小鼠等基因，但非转基因人APP基因的。在0、14、28和56天用100μg与CFA或IFA组合的AN1792免疫。第63天放血法处死动物，制备血清，共收集血清14ml。混合这两种血清。使用50％饱和硫酸氨进行两次连续的沉淀作用，以纯化抗体组分。最终的沉淀物在PBS中透析并检测 内毒素。内毒素的水平小于1EU/mg。 
抗Aβ单克隆抗体制备于腹水液。冰冷的腹水液中加入浓缩的硫酸葡聚糖钠盐进行脱水，在冰上搅动使终浓度为0.238％。搅动加入浓缩的CaCl2，使其终浓度为64mM。10,000g离心该溶液，丢弃沉淀。在冰上逐滴搅动加入等体积的饱和硫酸氨于上清液中。10,000g离心该溶液，丢弃上清液。沉淀重悬并透析于20mM Tris-HCl，0.4M NaCl中pH7.5。这一部分使用Pharmacia FPLC Sepharose Q柱，并以反向梯度从0.4M到0.275M NaCl(溶于20mM Tris-HCl pH7.5)洗脱。 
抗体的峰值可以通过280纳米的吸收确定，从而收集合适的部分。通过BCA方式测定蛋白浓度，以及SDS-PAGE测定纯度，对纯化的抗体制备物进行定性。也检测抗体池的内毒素。内毒素水平低于1EU/mg。低于100的效价被任意地给一个25的效价值。 
3.脑部Aβ和APP的水平 
各种抗Aβ抗体制备物处理6个月后，移去动物脑部，盐水灌注。大脑半球之一准备用于免疫组织化学分析，第二个用于测定Aβ和APP水平。为了测定各种形式β淀粉样沉积物和淀粉样前体蛋白(APP)浓度，解剖大脑半球，在5M胍中匀浆海马、皮层和小脑三个区。进行一系列的稀释，与ELISA模式中已知浓度的Aβ肽或APP的一系列稀释标准比较，从而量化淀粉样肽或APP的水平。 
ELISA测定的皮层和海马匀浆液中总Aβ和Aβ1-42的水平，小脑中总Aβ的水平分别在表11、12和13中作了说明。接种PBS的对照组总Aβ浓度的中值在海马中比皮层中高3.6倍(海马组织中值63,389ng/g比皮层组织中值17,818ng/g)。对照组小脑的中值(30.6ng/g组织)比海马中低超过2,000倍。这些水平与从前报道的同龄杂合PDAPP转基因小鼠相似(Johnson-Wood等，1997)。 
皮层中，一个处理组的Aβ水平中值(以Aβ1-42测定的)与对照组(p＜0.05)的显著不同，那些动物接受了表13所示的多克隆抗Aβ抗体。与本处理组的对照组相比，Aβ1-42的中值降低了65％。与另外一个处理组(动物被给药单克隆抗体10D5，p＝0.0433)相比，Aβ1-42的中值降低了55％。 
海马中，与多克隆抗Aβ抗体处理相关的总Aβ的中值降低的百分率(50％，p＝0.0055)小于皮层中观察到的(65％)(表14)。但海马中降低的绝对量几乎比皮层大三倍，海马中净降低为31,683纳克/克组织而皮层中为11,685纳克/克组织。如不以总Aβ，而以Aβ1-42这种更加致淀粉病的Aβ形式为测定基准，多克隆抗体导致的降低是显著的(p＝0.0025)。单克隆抗体10D5和266处理组的中值分别降低33％和21％。 
Figure G00808117419950825D000851
也测定了小脑中的总Aβ(表15)。在多克隆抗Aβ抗体和266抗体处理组中，总Aβ水平显著降低(分别为43％和46％，p＝0.0033和p＝0.0184)，而10D5处理组有几乎显著的降低(29％，p＝0.0675)。 
表15 
脚注： 
a：实验结束时每组动物的数目。 
b：纳克/克组织。 
c Mann-Witney分析。 
d NA：不适用。 
e 标准偏差。 
ELISA测定了来自抗原处理的及对照，PBS处理的小鼠皮层和小脑APP浓度。使用两种不同的APP分析。第一种，APP-α/FL，识别APP-α(α，剪切自Aβ序列的分泌型APP)和APP的全长型(FL)。第二种分析只识别APP-α。与Aβ在一系列处理组中的处理相关性降低相反，与对照动物相比，在所有处理组中APP水平几乎不变。这些结 果表明Aβ抗体的免疫消耗Aβ，但不消耗APP。 
总之，抗AN1792的多克隆抗体处理的小鼠，其皮层、海马和小脑中Aβ的水平显著降低。Aβ1-42氨基末端，特别是1-16和13-28的氨基酸，的单克隆抗体也表现显著的治疗效果，尽管程度更小。 
4.组织化学分析 
PBS、多克隆Aβ42、21F12、266和10D5免疫的小鼠脑部亚群中，Aβ-免疫活性斑的形态与之前研究中的形态(使用Aβ42的标准免疫程序)进行定性比较。 
淀粉样斑的程度和外形的最大变化均产生在多克隆Aβ42免疫的动物中。淀粉样侵害、侵蚀的斑形态以及细胞相关的Aβ-免疫活性，这三者的降低非常类似标准免疫程序所产生的效果。这些观察支持ELISA的结果，即，给药多克隆Aβ42抗体可以导致总Aβ和Aβ1-42的显著降低。 
同样的定性估计中，10D5组的淀粉样斑在数量和形态上也有所减少，并存在细胞相关的Aβ-免疫活性。相对于对照处理动物，抗Aβ的多克隆Ig组分和一个单克隆抗体10D5分别降低了93％和81％的斑侵害(p＜0.005)。似乎21F12对斑侵害有相对较弱的效果。相对于对照处理的动物，对pabAβ1-42处理后的脑部显微照相显示出弥散的沉积物，以及pab Aβ1-42处理组中许多更大紧密聚集斑的消失。 
5.抗体效价的测定 
每次腹膜内接种之前，对三个来自每组的，随机选择的小鼠亚群进行采血，共30个血样。夹心ELISA的方法，使用包被Aβ1-42的塑料多孔板进行抗体效价的测定，测定的抗体为Aβ1-42结合抗体，在“一般材料和方法”中有详细的说明。每次采血的平均效价显示于图16-18中(分别为多克隆抗体和单克隆抗体10D5及21F12)。在这段时 期，多克隆抗体制剂的效价平均高于1000，而10D5及21F12处理的动物效价略高于这一水平。 
6.淋巴细胞增殖应答 
最后一次抗体融入8天后收集脾细胞，测定依赖Aβ的淋巴细胞增殖。新鲜收集的细胞，每孔105个，在Aβ1-40(浓度为5μM，以起刺激作用)存在下培养5天。作为阳性对照，另外的细胞与T细胞有丝分裂原PHA共同培养，作为阴性对照，细胞的培养无外加的肽。 
各种抗Aβ抗体被动免疫的衰老PDAPP小鼠的脾细胞在体外经AN1792刺激、增殖，测定细胞因子应答。这些分析的目的在于确定是否被动免疫促使抗原的呈递，并因此引发AN1792特异性的T细胞应答。在抗Aβ抗体被动免疫的小鼠中未观察到AN1792特异性的增殖或细胞因子应答。 
XII.被动免疫的深入研究 
在第二项研究中，重复10D5的处理并检测两种另外的抗Aβ抗体，单克隆抗体3D6(Aβ1-5)及16C11(Aβ33-42)。对照组接受PBS或一种不相关的配合同种型抗体(TM2a)。小鼠较前述研究中大(11.5-12月的杂合体)，其它实验设计都相同。再一次，在处理6个月后，与PBS或配合同种型抗体对照组(p＝0.003)相比，10D5使斑侵害降低了超过80％。另外一个抗Aβ抗体3D6同样有效，产生86％的降低(p＝0.003)。相反，第三个抗该肽的抗体，16C11，对斑侵害无效。Aβ42 ELISA定量也获得相似的结果。这些结果表明在缺少T细胞免疫情况下，抗Aβ肽的抗体应答足以降低PDAPP小鼠的淀粉样沉着，但并非所有的抗Aβ抗体都有效。针对具有Aβ氨基酸1-5或3-7的表位的抗体特别有效。 
总之，我们表明了被动给药抗Aβ抗体降低了患阿尔茨海默氏病模式小鼠的斑沉着的程度。较为平缓的血清浓度时(25-70μg/ml)，抗体 以足以修饰β-淀粉样斑的水平接触CNS。抗体对CNS的进入并非因为血脑屏障的异常泄漏，因为Evans蓝检测PDAPP小鼠，未发现血管通透性的增加。衰老PDAPP小鼠脑主质中的抗体浓度和非转基因小鼠相似，即血清中抗体浓度0.1％(不考虑同种型)。 
XIII.抗体结合的监测 
检测是否抗Aβ抗体可以在CNS内直接作用，取实施例XII结束时盐水灌注的小鼠脑部，确定外周给药的抗体是否存在。未固定的恒冷箱脑切片暴露于抗鼠免疫球蛋白(羊抗鼠IgG-Cy3)的一种荧光药物中。10D5和3D6处理组的脑部淀粉样斑被抗体强烈地着色，而16C11组无染色。为充分展示斑沉着的程度，先用抗Aβ抗体与各个脑组织的系列切片免疫反应，然后用第二种试剂，外周给药后10D5和3D6接触CNS内的大多数淀粉样斑。与16C11组相比，这些组中的斑侵害被极大的降低。这些数据表明，外周给药的抗体可以进入CNS内，并在其中直接引发淀粉样沉积物的清除。可能16C11也能接触到淀粉样斑，但却不能结合。 
XIV.离体筛选分析抗淀粉样沉积物抗体的活性 
为了检测抗体对斑清除的效果，我们用初级小胶质细胞与未固定的恒冷箱脑切片(来自PDAPP鼠或人AD脑)共同培养建立了一种离体分析。小胶质细胞来自新生DBA/2N小鼠(1-3天)的脑皮层。在HBSS(Hanks平衡盐溶液，Sigma)和50μg/ml DNA酶I中机械化分散皮层。用100μm细胞滤器(Falcon)过滤分散化的细胞，1000rpm离心5分钟。沉淀重悬于生长培养介质中(高葡萄糖DMEM，10％FBS，25ng/mlrmGM-CSF)，以每个T-75培养瓶两个脑组织的密度铺板细胞。7-9天后，培养瓶在定轨摇床以200rpm的速度37℃培养2小时。细胞悬浮物在1000rpm离心，重悬于分析培养介质。 
PDAPP鼠或人AD脑(死亡时间小于3小时)的10μm恒冷箱脑切片融化后，置于多聚赖氨酸覆盖的园行玻璃盖片上，并放置在24 孔组织培养平板孔中。分析培养介质冲洗盖片二次，分析培养介质含有1％FBS的H-SFM(无杂交瘤细胞血清培养介质，Gibco，BRL)、谷氨酰氨、青霉素或链霉素，以及5ng/ml rmGM-CSF(R&D)。一小时内加入两倍浓度的对照或抗Aβ抗体(终浓度5μg/ml)。以0.8X106细胞/ml密度接种小胶质细胞于分析培养介质中。培养物在湿润培养箱内(37度5％CO2)孵育24小时或更长时间。孵育结束后，4％的甲醛固定培养物并浸透于0.1％的Triton-X100。切片用生物素酰化的3D6染色，接着链霉素或Cy3共轭(Jackson ImmunoResearch)。外源的小胶质细胞通过核染色(DAPI)可见。倒置荧光显微镜(Nikon，TE300)观察培养物，SPOT数码相机用SPOT软件(诊断装置)进行光学显微照相。Western印记分析中，培养物用8M尿素抽提，在还原tricine样品缓冲液中以1∶1稀释，并上样于16％ tricine凝胶中(Novex)。转至转移膜上后，印记暴露于5μg/ml pabAβ42和HRP偶联的抗鼠抗体，在ECL(Amersham)中显像。 
16C11(一种抗Aβ抗体，在体内无效)存在时，对PDAPP脑切片进行分析，β淀粉样斑保持其完整性，并且未观察到吞噬现象。相反，邻近的切片在10D5存在时，淀粉样沉积物大多不存在，并且小胶质细胞显示许多含有Aβ的吞噬泡。AD脑切片也有同样的结果；10D5诱导对AD斑的吞噬，而16C11无效。此外，该分析提供了进行鼠或人小胶质细胞和鼠、兔或灵长类动物抗Aβ抗体的可比性结果。 
表16表示几种不同结合特异性的抗体是否产生结合和/或吞噬作用。表中可见，结合氨基酸1-7内表位的抗体结合并清除淀粉样沉积物，而结合氨基酸4-10内表位的抗体结合但不清除淀粉样沉积物。结合C末端到残基10处表位的抗体既不结合也不清除淀粉样沉积物。 
表16：表位特异性分析 
表17显示的结果获自几种抗Aβ抗体，比较其离体分析中诱导吞噬的能力，以及在体内被动转移研究中减少斑沉积的能力。尽管16C11 和21F12可以高亲和地结合合成的聚集态Aβ肽，这些抗体不能与未固定的脑切片中的β淀粉样斑反应，因此不能引发离体分析中的吞噬，而且在体内并不有效。在三种测定中，10D5、3D6和多克隆抗Aβ抗体都有活性。22C8抗体对Aβ天然形式的类似物有更强的结合，其1和7处的天冬氨酸在类似物中被同型天冬氨酸所替换。这些结果显示体内效果是基于CNS中直接抗体介导的斑清除作用，并且离体分析可以预示体内效果。 
同样的分析被用来检测抗一个同型核蛋白片段(称为NAC)抗体的清除作用。已知同型核蛋白是一种淀粉样斑相关蛋白。NAC的抗体与具有淀粉样斑、小胶质细胞的脑组织样品接触，同前。用兔血清作对照。接下来的监测显示斑的数目和尺度有显著的减少，显示了抗体的清除活性。 
表17离体分析预示体内效果 
共聚焦显微镜被用来确定离体分析中抗体已内化。在对照抗体存在时，使外源的小胶质细胞维持在组织上方的一个共聚焦平面，在此区域没有含Aβ的吞噬细胞和完好的淀粉样斑。在10D5存在时，几乎所有的淀粉样斑物质都存在于外源小胶质细胞的小泡中。为了确定内 化肽的最终命运，在各个时间点对10D5处理的培养物进行8M尿素抽提，并进行Western印记分析检测。在第一小时时间点，还未产生吞噬作用，与多克隆抗Aβ抗体的反应显示一个强的4kD条带(相应于Aβ肽)。Aβ的免疫活性在第一天降低，到第三天消失。因此，抗体介导Aβ的吞噬作用导致了其降解。 
为了确定是否是Fc在离体分析中介导了吞噬，制备抗Aβ抗体3D6的F(ab’)2片段。尽管F(ab’)2片段保持了其与淀粉样斑反应的全部能力，它们不能引发小胶质细胞的吞噬作用。此外，整个抗体的吞噬可以被抗鼠Fc受体(抗CD16/32)的药物阻断。这些数据显示Aβ的体内清除是通过Fc受体介导的吞噬进行的。 
XV.抗体通过血脑屏障的途径 
本实施例通过静脉注射到正常或PDAPP小鼠周边组织后，确定进入脑部的抗体的浓度。0.9％NaCl溶液灌注PDAPP或对照的正常小鼠。剖出脑区(海马和皮层)并快速冷冻。在0.1％ Triton+蛋白酶抑制剂中匀浆脑组织。ELISA检测抽提物中的免疫球蛋白。Fab’2羊抗鼠IgG包被RIA板作为捕捉试剂。将脑抽提物或血清孵育1小时。用抗鼠IgG1-HRP、IgG2a-HRP或IgG2b-HRP(Catlag)检测同种型。发现无论何种同种型，存在于CNS中的抗体与其在血液中的浓度比为1∶1000。例如，当血液中IgG1浓度是血液中IgG2a浓度的三倍时，在脑部的浓度也是它的三倍，二者的浓度都是血液中浓度水平的0.1％。在转基因或未转基因的小鼠中都观察到这一结果，因此PDAPP没有独特的血脑屏障泄漏。 
XVI.MAP构象中的Aβ肽的治疗效果 
进行治疗性佐剂或免疫原效率的研究，选择9-10.5月龄的雄性和雌性PDAPP转基因小鼠，测试含有上述四聚体MAP构象中Aβ1-7的融合蛋白的治疗效果。研究持续时间为25周，每个处理组29-40只动物；因此在结束时，动物月龄15-16.5月。本研究使用的方法与上面实施例VIII对不同佐剂的治疗研究中的相同。各处理组在下表18中表示。 
表18 
    佐剂   免疫原   稀释缓冲液   给药方式
 组1   CFA/IFA  MAP(Aβ1-7：TT)(100μg)   PBS   IP(400μl)
 组2   QS21  AN1792-GCS(75μg)   PBS   SC(250μl)
 组3   PBS  -----   ---   SC(250μl)
表18缩写：MAP-多抗原性肽；TT-破伤风毒素T细胞表位(830-844)；SQ-皮下；IP-腹膜内；PBS-磷酸缓冲盐溶液；GCS-是甘氨酸/柠檬酸/蔗糖制剂。 
免疫方案各处理组都相同。在0、2、4、8、12、16、20和24周注射小鼠，在3、5、9、13、17、21和25周取血。第1，2，3，4和6组注射8次。第2和第3组，即QS21/AN1792和PBS，在本实验中分别作为阳性和阴性对照。 
通过抗Aβ抗体效价分析测定各组效价。 
第一组，CFA/IFA：MAP(Aβ1-7：TT)组，效价水平低。13周时GMT达到峰值，仅为1,200，且第25周降至600。30只小鼠中3只无任何效价升高，而另外7只实验结束时效价低于400。 
第二组，QS21/AN1792对照组。效价在17周达到峰值，GMT 16,000。然后效价在以后的8周中下降，最后以GMT8,700结束。此组中一只动物在实验全过程中都没有效价产生。 
第三组，PBS独立处理组。没有效价产生。 
与PBS对照组相比，两个处理组皮层Aβ水平显著降低(见表19)。尽管抗Aβ抗体的效价相对较低，CFA/IFA：MAP(Aβ1-7)组与PBS对照组相比，仍然显著地降低了皮层Aβ的水平。 
表19皮层Aβ水平 
    PBS   MAP   QS-21
  平均值  (纳克/克组织)   7,335   3,692   2,389
  范围(纳克/克组织)   550-18,358   240-10,782   210-11,167
  P值   ---   0.0003   ＜0.0001
  N   38   30   34
总之，Aβ1-7MAP免疫原可以有效的诱导充分的免疫应答，显著减缓Aβ在皮层中的沉着。 
XVII.猴中对Aβ的免疫应答表位成像 
本例分析灵长类动物对AN1792免疫(即Aβ1-42)的应答。结合了QS-21佐剂(50或100μg/剂)或5％无菌右旋糖水溶液(D5W，对照组)的AN1792(75或300μg/剂)免疫11组猴子(4只/性别/组)。所有的动物在表20所示的三个注射安排之一均接受IM注射，共计4、5或8次剂量。血清样品(来自4只/性别/组)在实验的第175天采集，CSF样品(来自3只/性别/组)在实验的第176天采集(第六个月尸体剖检)，并测定其结合Aβ1-40肽和APP的能力。 
表20；小组的分配及剂量水平 
  组   实验设计a   猴(M/F)   AN1792剂量(μg/剂)   QS21剂量(μg/剂)   途径
  1b   1   4/4   0   0   IM
  2   1   4/4   载体c   50   IM
  3   1   4/4   载体   100   IM
  4   1   4/4   75   50   IM
  5   1   4/4   300   50   IM
  6   1   4/4   75   100   IM
  7   1   4/4   300   100   IM
  8   2   4/4   75   100   IM
  9   2   4/4   300   100   IM
  10   3   4/4   75   100   IM
  11   3   4/4   300   100   IM
a：设计1，1、15、29、57、85、113、141、169日给药；设计2，1、29、57、113、169日给药；设计3，43、85、169日给药。 
b：D5W注射的对照组。 
c：含有甘氨酸/柠檬酸/蔗糖缓冲溶液的载体，是AN1792的赋形 剂。 
通过ELISA测定与覆盖Aβ1-42全序列之重叠肽结合的抗体，确定这些AN1792免疫动物的血清样品中的抗体所识别的线性肽的确切阵列。手性技术获得带有部分AN1792序列的生物素酰化的肽，即，10个氨基酸肽每个有9个残基的重叠和一个残基突出(合成号5366，5331和5814)。前32个肽(从AN1792N末端上游第八个氨基酸往下，直到AN179第24个氨基酸)的C端连接一个GGK接头使其生物素酰化。后10个肽(重复上一系列的32肽)的N端连接一个含有EGEG的接头使其生物素酰化。冻干的生物素酰化的肽溶解于DMSO中浓度为5mM。这些肽的储存液在TTBS(0.05％ Tween20，25mM Tris-HCl，137mMNaCl，5.1mM KCL，pH＝7.5)中稀释至5μM。5μM的溶液中取100μl以二等份加入预先覆盖有链亲和素的96孔板(Pierce)。平板在室温下孵育1小时，然后用TTBS洗4次。血清样品在不含叠氮化物的样品稀释剂中稀释以归一化效价每孔加100μl。这些平板在室温下孵育1小时，然后用TTBS洗4次。HRP偶联的羊抗人抗体(JacksonImmunoResearch)在不含叠氮化物的样品稀释剂中以1∶10,000稀释，每孔加入100μl。平板再孵育并冲洗。在加入用于终止反应的30μl 2N的H2SO4之前，每孔加入100μl TMB(Pierce)并孵育15分钟以产生颜色反应。在Vmax或Spectramax比色平板读取器上测定450nm的光密度。 
AN1792的免疫导致所有剂量组的100％的动物在175天时表达抗体。各组的平均效价范围从14596到56084。更高的效价倾向于那些有更高的抗原和/或佐剂浓度的免疫方案，但由于个体动物对免疫的应答有很高的波动，对此表现不出统计上的显著差异。 
AN1792抗体阳性的血清同样也是Aβ1-40抗体阳性血清。各组的平均效价范围从36867到165991，而抗AN1792的效价在175天各组没有表现出统计学上显著的差异。结合AN1792与结合Aβ1-40有 
AN1792免疫的各种设计安排的48只猴中，33只产生了体积和质量上足以用于分析的CSF样品。其中32只(97％)有对AN1792的阳性效价。效价范围从2到246，平均值为49.44±21.34。抗AN1792的CSF水平是血清中的0.18±0.11％，与血清效价表现出高的正相关(Spearman r＝0.7840)。组间及性别之间的CSF抗体百分率没有差异。CSF的抗体水平与通过血脑屏障进入中枢神经系统的外周产生抗体的被动转移一致。 
对于抗AN1792阳性之CSF样品的一个亚群的检测表明，和血清样品中的抗体相似，CSF的抗体对Aβ1-40有交叉反应。Aβ1-40效价和相应的AN1792效价有很高的相关性(Spearman r＝0.9634)。检测CSF样品中最高AN1792效价的亚群，显示对APP没有结合，正如血清抗体一样。 
检测第175天的血清对一系列10体重叠肽的抗性，所有猴的抗体都结合其序列覆盖AN1792肽1-10氨基酸的肽(APP的氨基酸653-672)。一些动物中，这是能被检测到结合的唯一肽链(见图19)。 
其它动物中还可以检测到其它反应活性，但所有的情况下，对肽链N末端的反应活性都是主导的。其它反应活性可以归结为两组。第一，也最普遍，是对以AN1792肽N末端1-10为中心的肽链的结合(图20)。这种类型的结合针对那些覆盖AN1792肽氨基酸1-8，1-9和2-11的肽。这些反应活性，和1-10肽的反应活性一起，代表了所有动物中的主要反应活性。个体动物在一段时间内的表位成像显示对1-10肽的抗体反应活性超过邻近的肽。这表明免疫应答强烈地倾向于具有自由天冬氨酸残基的AN1792肽N末端。在一些动物中，第二种次要的可检出的活性是对位于主要区域C端，以及覆盖AN1792肽氨基酸7-16，11-20和16-25为中心的肽的结合。这些反应活性仅在10％到30％的猴中可见。 
不同动物的应答变化(如，是否氨基酸1-10是专有的或主导性的活性表位)与抗原或佐剂剂量、给药安排，或抗体效价不相关，而且可能是各动物遗传组成的一个表现。 
XVIII.对人受试者的预防和治疗 
进行单剂量I期试验确定人体安全性。以逐步增加的剂量对不同患者给药治疗药物，从约0.01(推测功效的水平)开始，以3为系数增长，直到达到10倍有效小鼠剂量的水平。 
进行II期试验确定治疗功效。挑选利用阿尔茨海默氏病和相关病症协会(ADRDA)为可能发生的AD制定的标准确定的患早期到中度阿尔茨海默氏病的患者。按照微小精神状况检查(Mini-Mental State Exam，MMSE)，合适的患者积分在12-26范围内。其它选择标准是，患者在研究期间容易存活，以及不会出现复杂问题，例如可能带来干扰的伴随药物的使用。利用典型心理测量法(例如MMSE、ADAS，它们对于评价阿尔茨海默氏病的状况和功能是一种内容详尽的标尺)对患者功能作基线评价。这些心理测量标准能够测量阿尔茨海默氏病的发展。合适的定性生命标准也可以用来监测治疗。还可以通过MRI监测疾病发展。也可以监测患者的血液数据，包括分析免疫原特异性抗体和T细胞应答。 
测定基线后，患者开始接受治疗。将它们完全打乱，以双盲方式用治疗药物或安慰剂治疗。至少每六个月监测患者一次。通过进展中治疗组相对于安慰剂组有效降低确定效果。 
进行第二次II期试验，评价患者从非阿尔茨海默氏病的早期记忆丢失(有时被称为年龄有关的记忆损伤(AAMI)或轻度认知损伤(MCI))到经ADRDA标准确定为可能的阿尔茨海默氏病的改变。通过筛选参照群体的记忆丢失早期迹象或其它与前阿尔茨海默氏病症候学、阿尔 茨海默氏病的家族史、遗传危险因素、年龄、性别和已发现的其它预示阿尔茨海默氏病高危特征有关的不利，从非临床群体选择具有转化成阿尔茨海默氏病高风险的患者。收集基于包括MMSE和ADAS的合适法则和其它设计用来评价较为正常群体法则的基线积分。将这些患者群体分成合适的安慰剂对交替剂量药物组。间隔六个月后，对这些患者群体进行跟踪，每个患者的端点是到观察结束时他或她是否转化成可能的阿尔茨海默氏病(按照ADRDA标准判断)。 
XIX.一般材料和方法 
1.抗体效价的测定 
在小鼠尾静脉切开小口取血，采集约200μl血置于微量离心管(microfuge tube)。豚鼠如下取血，首先剃去后腿背面的毛，然后用18号针头划破跖骨静脉，采血于微量离心管。室温下(RT)静置1小时使血液凝结成块，旋涡振荡，然后在14000×g离心10分钟，将血块从血清中分离出来。然后将血清转移到干净的微量离心管中，4℃储存直到测定效价。 
用ELISA测定抗体效价。在Well包被缓冲液(Well CoatingBuffer)(0.1M磷酸钠，pH 8.5，0.1％叠氮化钠)中含有10μg/ml Aβ42或SAPP或其它抗原(如各单独报道记录)，用100μl溶液包被96孔微滴定平板(Costar EIA平板)，室温过夜。吸干各孔，从1/100稀释度的样品稀释液(0.014M磷酸钠、pH7.4、0.15M NaCl、0.6％牛血清白蛋白、0.05％硫柳汞)开始向孔中加入血清。以三倍的跨度制备七个连续稀释度的样品，置于平板中，终稀释度为1/218700。稀释液在经包被的平板的孔中室温保温1小时。然后用含0.05％吐温20的PBS冲洗四次。将第二种抗体，结合辣根过氧化物酶的羊抗小鼠Ig(从BoehringerMannheim得到)，作为100μl 1/3000稀释度的样品稀释液加到孔中，室温保温1小时。再次用PBS、吐温20冲洗平板四次。为了形成色原体，将100μl慢TMB(Slow TMB，3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯，从Pierce Chemicals得到)加入各孔，室温保温15分钟。加入25μl 2M硫 酸终止反应。然后在分子装置Vmax(Molecular Devices Vmax)上记录450nm-650nm处的光密度。 
效价表示为得到最大光密度一半时血清稀释度的倒数。最大OD通常取自起始的1/100稀释液，除非该条件下具有非常高的效价，在这种情况下，需要建立较高起始稀释度的最大OD。如果两种稀释液之间下降了50％点位，则利用线性外推法计算最终效价。为了计算几何平均抗体效价，低于100的效价被任意地指定效价值为25。 
2.淋巴细胞增殖分析 
用异氟烷麻醉小鼠。取出脾，用5ml含10％热灭活胎牛血清的PBS(PBS-FBS)漂洗两次，然后置于Medimachine(Dako)的50°Centricon室(Dako A/S，Denmark)，在1.5ml PBS-FBS中以100rpm匀浆10秒，然后经100μ孔径的尼龙筛过滤。用15ml PBS-FBS冲洗脾细胞一次，然后在200×g离心5分钟沉淀。将沉淀重悬浮于5ml含0.15MNH4Cl、1M KHCO3、0.1M NaEDTA、pH 7.4的缓冲液中室温保持5分钟，使红细胞溶解。然后同上述冲洗白细胞。将新鲜分离的脾细胞(每孔105个细胞，每个样品重复三次)置于96孔U-型底处理培养物微滴定平板(Corning，Cambridge，MA)中，在添加2.05mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、和10％热灭活FBS的RPMI 1640培养基中(JRHBiosciences，Lenexa，KS)于37℃培养96小时。再加入5μM到0.18μM剂量范围内4个梯度的各种Aβ肽，Aβ1-16、Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ40-1反向序列蛋白质。对照孔中的细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)(Sigma，cat.#C-5275，浓度为1μg/ml)存在下不添加蛋白质培养。向细胞中加入3H-胸苷(1μCi/孔，从Amersham Corp.，Arlington Heights IL得到)培养最后24小时。然后收获细胞置于UniFilter平板，在Top Count微平板发光计数仪(Top Count Microplate Scintillation Counter(Packard Instruments，Downers Grove，IL))中计数。结果表示为插入不溶性大分子的放射性的每分钟计数(cpm)。 
4.脑组织制备 
无痛处死后，取脑，一个大脑半球准备进行免疫组织化学分析，解剖另一个大脑半球的三个脑区(海马、皮层和小脑)，用于利用特异性ELISA(Johnson-Wood等，同上)测定各种Aβ蛋白质和APP型的浓度。 
将用于ELISA的组织在10体积的冰冷胍缓冲液(5.0M胍-盐酸，50mM Tris-HCl，pH 8.0)中匀浆。匀浆液利用Adams振动器(Fisher)温和振摇，室温下混合三到四小时，然后于-20℃储藏，留待定量Aβ和APP时使用。前面的试验已经表明，在该储藏条件下，分析物是稳定的，当合成的Aβ蛋白(Bachem)混入同窝生小鼠的对照脑组织匀浆中时，可以定量提取(Johnson-Wood等，同上)。 
5.Aβ水平的测定 
用冰冷却的酪蛋白稀释液(0.25％酪蛋白、PBS、0.05％叠氮化钠、20μg/ml抑肽酶、5mM EDTA pH 8.0，10μg/ml亮肽素)以1∶10稀释脑匀浆，然后在4℃，16000×g离心20分钟。制备合成的Aβ蛋白质标准品(1-42氨基酸)和APP标准品，使终组合物中包括0.5M胍和0.1％牛血清白蛋白(BSA)。“总”Aβ夹心ELISA利用单克隆抗体266，特异于Aβ的氨基酸13-28(Seubert，等)作为捕捉抗体，生物素酰化的单克隆抗体3D6，特异于Aβ的氨基酸1-5(Johnson-Wood等)作为报道抗体。3D6单克隆抗体不能识别分泌型APP或全长APP，仅可检测氨基末端为天冬氨酸的Aβ类型。该分析法灵敏度下限约为50ng/ml(11nM)，不与浓度高达1ng/ml内源性鼠Aβ蛋白质表现交叉反应性(Johnson-Wood等，同上)。 
Aβ1-42特异性夹心ELISA应用mAβ21F12，特异于Aβ的氨基酸33-42(Johnson-Wood等)作为捕捉抗体。该分析同样用生物素酰化的mAβ3D6作为报道抗体，其灵敏度下限约为125μg/ml(28μM，Johnson-Wood等)。当进行AβELISA时，用100μl mAβ266(10μg/ml) 或mAβ21F12(5μg/ml)包被96孔的免疫测试平板(Costar)，室温下保温过夜。通过吸气除去溶液，向各孔中加入200μl 0.25％的人血清蛋白PBS溶液，于室温将各孔封闭至少1小时。除去封闭液，在4℃下储藏干燥的平板直到使用。用冲洗缓冲液(Tris-缓冲盐水(0.15M NaCl，0.01MTris-HCl，pH 7.5)加0.05％吐温20)在使用前使平板再水化。将样品和标准品加入每孔100μl的三等份，然后于4℃保温过夜。分析的每个步骤之间用冲洗缓冲液至少冲洗平板三次。加入生物素酰化的mAβ3D6(用酪蛋白分析缓冲液(0.25％酪蛋白，PBS，0.05％吐温20，pH 7.4)稀释到0.5μg/ml，室温下保温1小时。将亲合素-辣根过氧化物酶结合物((亲合素-HRP得自Vector，Burlingame，CA)用酪蛋白分析缓冲液以1∶4000的比例稀释，)加到孔中，室温保持1小时。加入比色物质，慢TMB-ELISA(Pierce)，使反应在室温下进行15分钟，之后，加入25μl 2N H2SO4终止反应。利用分子装置Vmax，测定450nm和650nm的吸收度差值，定量反应产物。 
6.APP水平的测定 
应用了两种不同APP测定法。其一，特指的APP-α/FL，识别APP-α和APP的全长型(FL)。第二种分析特异于APP-α。APP-α/FL分析法识别包括Aβ的前12个氨基酸的分泌型APP。因为报道抗体(2H3)与α-发夹-位点(存在于APP695的氨基酸612-613之间，Esch等，科学，248，1122-1124(1990))不具有特异性；因此该分析也可以识别全长APP(APP-FL)。利用固定于APP-FL细胞质末端的APP抗体消耗脑匀浆的APP-FL的初步试验表明，约30-40％的APP-α/FL APP是FL(数据未显示)。APP-α/FL和APP-α分析的捕捉抗体均为mAb 8E5，对APP695型的氨基酸444-592升高(Games等，同上)。APP-α/FL分析的报道mAb是mAb 2H3，其特异于APP695的氨基酸597-608(Johnson-Wood等，同上)，APP-α分析的报道抗体是mAb 16H9的生物素酰化衍生物，对APP的氨基酸605-611升高。APP-α/FL分析的灵敏度下限约为11ng/ml(150ρM)(Johnson-Wood等)，APP-α特异性分析的灵敏度下限约为22ng/ml(0.3nM)。对于这两种APP检测， 如前面mAb 266所述，将mAb 8E5包被到96孔EIA平板上。纯化的重组分泌型APP-α用作APP-α分析和APP-α/FL分析的参照标准品(Esch等，同上)。5M胍中的脑匀浆样品用ELISA样品稀释液(0.014M磷酸盐缓冲液，pH 7.4，0.6％牛血清白蛋白，0.05％硫柳汞，0.5M NaCl，0.1％NP40)以1∶10的比例稀释。然后用含0.5M胍的样品稀释液以1∶4的比例稀释它们。然后在室温下，16000×g离心稀释的匀浆15秒。将APP标准品和样品以两等份加入平板，室温下保温1.5小时。将生物素酰化的报道抗体2H3或16H9与样品一起在室温下保温1小时。链霉亲和素碱性磷酸酶(Boehringer Manneim)，在样品稀释液中稀释1000倍，加入孔中室温下保温1小时。加入荧光物质4-甲基-umbellipheryl-磷酸酯，室温下保温30分钟，在Cytofluor tm 2350荧光读数仪(Millipore)上在激发光365nm和发射光450nm下对平板读数。 
7.免疫组织化学 
在4％多聚甲醛的PBS液中于4℃固定脑三天，然后在1％多聚甲醛PBS液中于4℃储存1到7天，直到被切片。在vibratome上室温下将其切成40微米厚的冠状切片，在防冻剂(30％甘油，30％乙二醇，在磷酸缓冲液中)中于-20℃储存直到进行免疫组织化学处理。对于每个脑，在海马背水平上的六个切片，连续间隔240μm使彼此分离，在下列之一的抗体中保温过夜：(1)生物素酰化的抗-Aβ(mAb，3D6，特异于人Aβ)在PBS和1％马血清中稀释到浓度为2μg/ml；或(2)特异于人APP，8E5的生物素酰化的mAb，在PBS和1.0％马血清中稀释到浓度为3μg/ml；或(3)特异于神经胶质纤丝酸性蛋白质(GFAP；SigmaChemical Co.)的mAb，用含0.25％ Triton X-100和1％马血清的Tris-缓冲盐水(pH 7.4)(TBS)以1∶500的比例稀释；或(4)特异于CD11b(MHC-1抗原)(Chemicon International)的mAb，用0.25％ TritonX-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀释；或(5)特异于MHC II抗原的mAb(Pharmingen)，用含0.25％ Triton X-100和1％兔血清的TBS液以1∶100的比例稀释；或(6)特异于CD 43的大鼠mAb(Pharmingen)， 用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(7)特异于CD 45RA的大鼠mAb(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(8)特异于CD 45RB的大鼠单克隆Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(9)特异于CD 45的大鼠单克隆Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(10)特异于CD3e的生物素酰化多克隆仓鼠Aβ(Pharmingen)，用含1％兔血清的PBS液以1∶100的比例稀释；或(11)特异于CD3的大鼠mAb(Serotec)，用含1％兔血清的PBS液以1∶200的比例稀释；或(12)含1％正常马血清的无一级抗体的PBS溶液。 
与上面所列的1、2和6-12号抗体溶液反应的切片首先用含1.0％Triton X-100，0.4％过氧化氢的PBS液在室温下预处理20分钟，以封闭内源性过氧化物酶。接着将它们与一级抗体在4℃下保温过夜。然后使与3D6或8E5或CD3e mAb反应的切片在室温下与辣根过氧化物酶-亲和素-生物素-复合物与用PBS稀释75倍的试剂盒成分“A”和“B”(载体精英标准试剂盒(Vector Elite Standard Kit)，Vector Labs，Burlingame，CA)一起反应1小时。与特异于CD 45RA、CD 45RB、CD45、CD3的抗体和无一级抗体的PBS溶液反应的切片分别与生物素酰化的抗-大鼠IgG(Vector)(用PBS稀释75倍)或者生物素酰化的抗-小鼠IgG(Vector)(用PBS稀释75倍)一起在室温下保温1小时。然后将切片与辣根过氧化物酶-亲和素-生物素-复合物与试剂盒成分“A”和“B”(用PBS稀释75倍)(载体精英标准试剂盒，Vector Labs，Burlingame，CA)在室温下反应一小时。 
将切片置于0.01％过氧化氢、0.05％ 3，3′-对二氨基联苯(DAB)中室温下。用于与GFAP-、MAC-1-、和MHC II-特异性抗体一起保温的切片首先用0.6％过氧化氢在室温下预处理，以封闭内源性过氧化物酶，然后与一级抗体在4℃下保温过夜。与GFAP抗体反应的切片与生物素酰化的马体内制备的抗-小鼠IgG(载体实验室(Vector Laboratories)；Vectastain Elite ABC试剂盒)(用TBS稀释200倍)在室温下保温1小时。 接着将切片与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(载体实验室；Vectastain Elite ABC试剂盒)(用TBS稀释1000倍)反应1小时。接着将与MAC-1-或MHC II-特异性单克隆抗体作为一级抗体一同保温的切片与生物素酰化的来自兔的抗-大鼠IgG(用TBS稀释200倍)在室温下反应1小时，随后与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(用TBS稀释1000倍)保温1小时。然后将与GFAP-、MAC-1-和MHC II-特异性抗体一同保温的切片用0.05％DAB、0.01％过氧化氢、0.04％氯化镍、TBS液分别处理4和11分钟，使它们显色。 
将免疫标记的切片在载玻片(VMR，Superfrost玻片)上制作成标本，空气干燥过夜，在Propar(Anatech)中浸渍，然后用Permount(Fisher)作为标本介质用盖玻片覆盖。 
为了复染色Aβ斑，将一系列GFAP-阳性切片在免疫组织化学处理后置于Superfrost载玻片上制作成标本，在1％硫黄素S(Sigma)水溶液中保持7分钟。然后使切片脱水，在Propar中使其清晰，然后用Permount制作标本加盖玻片覆盖。 
8.图像分析 
通过CCD摄像机和Sony Trinitron监测仪连接于NikonMicrophot-FX显微镜的图像计150型图像分析系统(Oncor，Inc.，Gaithersburg，MD)被用来定量免疫反应切片。切片的图像储存于影象缓冲区中，确定基于颜色和饱和度的阈值以选择和计算免疫标记结构物所占据的总像素面积。对于每个切片，人工描绘出海马轮廓，计算海马占据的总像素面积。如下测定淀粉样侵害百分率：(含与mAb 3D6发生免疫反应的Aβ沉积物的海马趾面积的分数)×100。同样，神经炎侵害的百分率如下测定：(含与单克隆抗体8E5发生反应的营养不良性神经突的海马趾面积的分数)×100。运行简单32软件应用程序的C-成像系统(Compix，Inc.，Cranberry Township，PA)通过光电子学照相机连接于Nikon Microphot-FX显微镜，用于定量GFAP-阳性星形胶质细 胞和MAC-1-和MHC II-阳性小胶质细胞占据的夹肌后皮层的百分率。免疫反应切片的图像储存于显影缓冲区中，确定单色阈值，以选择和计算免疫标记细胞占据的总像素面积。对于每个切片，手工绘制除夹肌后皮层(RSC)的轮廓，然后计算RSC占据的总像素面积。星形胶质细胞增多百分率如下确定：(GFAP-反应性星形胶质细胞占据的RSC的分数)×100。同样，小胶质细胞增多百分率如下确定：(MAC-1-或MHC II-反应性小胶质细胞占据的RSC的分数)×100。对于所有的图像分析，定量每个动物的海马背水平上的六个切片(彼此以连续240μm的间隔分隔)。在所有条件下，动物的治疗状况对于观察者都是未知的。 
虽然为了便于清楚理解，如上述详细描述了本发明，但显然可以在附加权利要求范围内进行某些改动。本文为各种目的引证的所有出版物和专利文献以其全文内容引入，好象各自单独全文列入本文那样。 
显然本发明提供了多种用途。例如，本发明提供了以上说明的任何Aβ抗体在致淀粉样病的治疗、预防或诊断中的应用，以及其使用的医学或诊断组合物的制备。同样的，本发明提供了以上说明的任何Aβ表位片段在致淀粉样病的治疗、预防或诊断中的应用，以及其使用的医学制备。 
序列表
<110>神经实验室有限公司(Neuralab Limited)
<120>含有与Aβ1-10残基内的表位特异性结合的抗体的药物组合物及其应用
<130>SCT011723-09
<140>WO PCT/US00/14810
<141>2000-05-20
<150>US 09/322,289
<151>1999-05-28
<160>77
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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<213>Artificial Sequemce
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
    from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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<223>Description of Artificial  Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
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<213>Artificial Sequence
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Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His
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His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
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Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu
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<213>Artificial Sequence
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
  1               5                  10
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<212>PRT
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe
  1               5                  10
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<212>PRT
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe
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<212>PRT
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala
  1               5                  10
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
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His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu
  1               5                  10
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
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His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp
  1               5                  10
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val
  1               5                  10
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<212>PRT
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      from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
      peptide)
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Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly
  1               5                  10
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<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
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Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
  1               5                  10
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<212>PRT
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
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Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
  1               5                  10
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<212>PRT
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
  1               5                  10
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>28
Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly
  1               5                  10
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<212>PRT
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     from AN1792sequence(human Abeta42，beta-amyloid
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<400>29
Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
  1               5                  10
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>30
Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile
  1               5                 10
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>31
Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
  1               5                  10
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>32
Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly
  1               5                  10
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>33
Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
  1               5                  10
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>34
Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met
  1               5                  10
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>35
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val
  1               5                  10
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>36
Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly
  1               5                  10
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>37
Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly
  1               5                  10
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>38
Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val
  1               5                  10
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from ANl792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>39
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
  1               5                  10
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>40
Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile
  1               5                  10
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：10-mer peptide
     from AN1792 sequence(human Abeta42，beta-amyloid
     peptide)
<400>41
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
  1               5                  10
<210>42
<211>42
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<223>human Abeta42 beta-amyloid peptide
<400>42
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
  1               5                  10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
             20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
         35                  40
<210>43
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：influenza
     hemagglutinin HA-307-319 universal T-cell epitope
<400>43
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
  1               5                  10
<210>44
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：PADRE universal
     T-cell epitope
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Xaa＝any amino acid
<400>44
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
  1               5                  10
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：malaria CS，T3
     epitope universal T-cell epitope
<400>45
Glu Lys Lys Ile Ala Lys MetGlu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val
  1               5                 10                  15
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：hepatitis B
     surface antigen HBsAg-19-28universal T-cell
     epitope
<400>46
Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
  1               5                  10
<210>47
<211>19
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：heat shock
     protein 65 hsp 65-153-171 universal T-cell epitope
<400>47
Asp Gln SerIle Gly Asp LeuIle Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly
  1              5                 10                      15
Asn Glu Gly
<210>48
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：bacille
     Calmette-Guerin universal T-cell epitope
<400>48
Gln Val His  Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu
  1                5                  10
<210>49
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：tetanus toxoid
     TT-830-844universal T-cell epitope
<400>49
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
  1               5                  10                  15
<210>50
<211>21
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：tetanus toxoid
     TT-947-967universal T-cell epitope
<400>50
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
  1               5                  10                  15
Ala Ser His Leu Glu
             20
<210>51
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：HIV gp120T1
     universal T-cell epitope
<400>51
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
  1               5                  10                  15
<210>52
<211>22
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：AN 90549 Abeta
     1-7/tetanustoxoid 830-844
<400>52
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
  1               5                  10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu
             20
<210>53
<211>28
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：AN 90550 Abeta
     1-7/tetanus toxoid 947-967
<400>53
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
  1               5                  10                  15
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
             20                  25
<210>54
<211>43
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：AN90542Abeta
     1-7/tetanus toxoid 830-844+947-967
<400>54
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
  1               5                  10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
             20                  25                  30
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
         35                  40
<210>55
<211>22
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：AN 90576Abeta
     3-9/tetanus toxoid 830-844
<400>55
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
  1               5                  10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu
             20
<210>56
<211>20
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：AN90562Abeta
     1-7/peptide
<400>56
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu
  1               5                  10                  15
Phe Arg His Asp
             20
<210>57
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：AN90543Abeta
     1-7x 3/peptide
<400>57
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala
  1               5                  10                  15
Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala
             20                  25                  30
Ala Ala
<210>58
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>Xaa＝any amino acid
<400>58
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu
  1               5                  10                  15
Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg
             20                  25                  30
His Asp
<210>59
<211>20
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)
<223>Xaa＝any amino acid
<400>59
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu
  1               5                  10                  15
Lys Ala Ala Ala
             20
<210>60
<211>24
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：fusion protein
      with Abeta epitope
<400>60
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His
  1               5                  10                  15
Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
             20
<210>61
<211>24
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>61
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His
  1               5                  10                  15
Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
             20
<210>62
<211>24
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>62
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His
  1               5                  10                  15
Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
            20
<210>63
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>63
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu
  1               5                  10                  15
Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg
             20                  25                  30
His Asp
<210>64
<211>27
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>64
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu
  1               5                  10                  15
Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp
             20                  25
<210>65
<211>34
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>65
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala
  1               5                  10                  15
Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu
             20                  25                  30
Ala Thr
<210>66
<211>27
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>66
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys
  1               5                  10                  15
Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
             20                  25
<210>67
<211>79
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>67
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu
  1               5                  10                  15
Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser
             20                  25                  30
Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
         35                  40                  45
Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
     50                  55                  60
Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp
 65                  70                  75
<210>68
<211>57
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>68
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala
  1               5                  10                  15
Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
             20                  25                  30
Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val
         35                  40                  45
Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
     50                  55
<210>69
<211>44
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>69
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
  1               5                  10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
             20                  25                  30
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
         35                  40
<210>70
<211>51
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：fusion protein
     with Abeta epitope
<400>70
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
  1               5                  10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
             20                  25                  30
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe
         35                  40                  45
Arg His Asp
     50
<210>71
<211>26
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：synuclein
     fusion protein
<400>71
Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Ile Ser Gln Ala Val His Ala
  1               5                  10                  15
Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
             20                  25
<210>72
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Abeta 1-12
     peptide with inserted Cys residue
<400>72
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Cys
  1               5                  10
<210>73
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Abeta 1-5
     peptide with inserted Cys residue
<400>73
Asp Ala Glu Phe Arg Cys
  1               5
<210>74
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Abeta 33-42
     peptide with inserted Cys residue
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>Xaa＝amino-heptanoic acid
<400>74
Cys Xaa Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
  1               5                  10
<210>75
<211>19
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Abeta 13-28
     peptide with two Gly residues added and inserted
     Cys residue
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Xaa＝N-acetyl His
<400>75
Xaa His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
  1               5                  10                  15
Gly Gly Cys
<210>76
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：linker
<400>76
Glu Gly Glu Gly
  1
<210>77
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：N-terminal
     segment of Abeta
<400>77
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp
  1               5

Claims (19)

1.有效剂量的药物组合物在制备延缓或降低人类患者阿耳茨海默氏病的发作风险的药物中的应用，所述药物组合物含有与Aβ(SEQID NO：1)1-5残基内、Aβ(SEQ ID NO：1)3-6残基内或Aβ(SEQ ID NO：1)3-7残基内的表位特异性结合的嵌合、人或人源化抗体和可药用载体，其中所述抗体的同种型为人IgG1。
2.权利要求1所述的应用，其中所述患者是无症状的。
3.权利要求1所述的应用，其中所述患者小于50岁。
4.权利要求1所述的应用，其中所述患者具有显示对阿耳茨海默氏病有易感性的遗传危险因素。
5.权利要求1所述的应用，其中所述患者不具有已知的有关阿耳茨海默氏病的危险因素。
6.权利要求1所述的应用，其中所述抗体为一种多克隆抗体。
7.权利要求1所述的应用，其中所述抗体为一种单克隆抗体。
8.权利要求1所述的应用，其中所述抗体含有同一对轻链和重链的两个拷贝。
9.权利要求1所述的应用，其中所述抗体是一种双特异性抗体，其含有特异性地结合Aβ表位的第一对轻链和重链，还含有特异性地结合位于小胶质细胞上的Fc受体的第二对轻链和重链。
10.权利要求1所述的应用，其中所述抗体的链融合于异源多肽。
11.权利要求1所述的应用，其中所述抗体为从用Aβ肽免疫的人类B细胞中获得的抗Aβ(SEQ ID NO：1)的人抗体。
12.权利要求1所述的应用，其中所述抗体特异性地结合Aβ肽(SEQ ID NO：1)但不结合全长的淀粉样前体蛋白。
13.权利要求1所述的应用，其中所述抗体以腹膜内、口服、鼻内、皮下、肌内、局部或静脉内给药。
14.一种药物组合物，含有与Aβ(SEQ ID NO：1)1-5残基内、Aβ(SEQ ID NO：1)3-6残基内或Aβ(SEQ ID NO：1)3-7残基内的表位特异性结合的嵌合、人或人源化抗体和可药用载体，其中所述抗体的同种型为人IgG1。
15.权利要求14所述的药物组合物，其中所述抗体含有同一对轻链和重链的两个拷贝。
16.权利要求14所述的药物组合物，其中所述抗体是一种双特异性抗体，其含有特异性地结合Aβ表位的第一对轻链和重链，还含有特异性地结合位于小胶质细胞上的Fc受体的第二对轻链和重链。
17.权利要求14所述的药物组合物，其中所述抗体的链融合于异源多肽。
18.权利要求14所述的药物组合物，其中所述抗体为从用Aβ肽免疫的人类B细胞中获得的抗Aβ的人抗体。
19.权利要求18所述的药物组合物，其中所述抗体特异性地结合Aβ肽但不结合全长的淀粉样前体蛋白。
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