CN1379684A - 使用抗－ErbB2抗体治疗前列腺癌 - Google Patents

使用抗－ErbB2抗体治疗前列腺癌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了使用抗－ErbB2抗体治疗前列腺癌的方法。

Description

使用抗-ErbB2抗体治疗前列腺癌
                   发明领域
本发明涉及使用抗-ErbB2抗体治疗前列腺癌的方法。
                   发明背景
ErbB族受体酪氨酸激酶是细胞生长、分化和存活的重要介体。该族受体包括4种不同的成员，它们包括表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbBI基因编码的EGFR与引起人体恶性肿瘤相关。特别是，已经观察到EGFR在乳腺、膀胱、肺、头、颈和胃癌以及成胶质细胞瘤中的表达增加。EGFR受体表达的增加通常与通过自分泌刺激途径导致受体活化的相同肿瘤细胞产生的EGFR配体即转化生长因子α(TGF-α)的增加有关。Baselga和Mendelsohn《药物疗法》(Pharmac.Ther.64：127-154(1994))。已经在治疗这类恶性肿瘤中作为治疗剂评价了针对EGFR或其配体、TGF-α和EGF的单克隆抗体。例如参见：Baselga和Mendelsohn.，上文；Masui等《癌症研究》(CancerResearch)44：1002-1007(1984)；和Wu等《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)95：1897-1905(1995)。
ErbB族的第二个成员p185neu开始被鉴定为来自化疗大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。neu原致癌基因的活化形式是由所编码的蛋白质跨膜区中的点突变(缬氨酸转变成谷氨酸)所产生的。在乳腺癌和卵巢癌中观察到了neu的人体同源物的扩增且这种扩增与预后较差相关(Slamon等，《科学》(Science)，235：177-182(1987)；Slamon等，《科学》(Science)，244：707-712(1989)；和美国专利US4,968,603)。迄今为止，对人体肿瘤尚未报导与neu原致癌基因中相似的点突变。另外，已经在包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰腺和膀胱的癌症在内的其它癌中观察到了ErbB2的超表达(通常并不与基因扩增一致)。参见包括下列文献在内的文献：King等，《科学》(Science)，229：974(1985)；Yokota等，《柳叶刀》(Lancet)：1：765-767(1986)；Fukushigi等，《细胞分子生物学》(Mol Cell Biol.)，6：955-958(1986)；Geurin等，《癌基因研究》(Oncogene Res.)，3：21-31(1988)；Cohen等，《癌基因》(Oncogene)，4：81-88(1989)；Yonemura等，《癌症研究》(Cancer Res.)，51：1034(1991)；Borst等，《妇科肿瘤学》《Gynecol.Oncol.》，38：364(1990)；Weiner等，《癌症研究》(Cancer Res.)，50：421-425(1990)；Kern等，《癌症研究》(CancerRes.)，50：5184(1990)；Park等，《癌症研究》(Cancer Res.)，49：6605(1989)；Zhau等，《致癌分子》(Mol.Carcinog.)，3：354-357(1990)；Aasland等《英国癌症杂志》(Br.J.Cancer)57：358-363(1988)；Williams等《病理生物学》(Pathiobiolog)59：46-52(1991)；和McCann等，《癌症》(Cancer)，65：88-92(1990)。ErbB2可以在前列腺癌中被超表达(Gu等《癌症通讯》(Cancer Lett.)99：185-189(1996)；Ross等《人体病理学》(Hum.Pathol.)28：827-833(1997)；Ross等《癌症》(Cancer)79：2162-2170(1997)；和Sadasivan等《泌尿科学杂志》(J.Urol.)150：126-131(1993))。已经描述了针对大鼠p185neu和人ErbB2蛋白产物的抗体。Drebin和同事们开发出了针对大鼠neu基因产物p 185neu的抗体。例如参见Drebin等，《细胞》(Cell)41：695-706(1985)；Myers等，《酶学方法》(Meth.Enzyni.)198：277-290(1991)；和WO94/22478。Drebin等在《癌基因》(Oncogene)2：273-277(1988)中报导了与p 185neu的两个不同区反应的抗体混合物可对植入裸鼠的neu-转化的NIH-3T3细胞产生协同的抗肿瘤作用。另外参见1998年10月20日授权的美国专利US 5,824,311。
Hudziak等在《细胞分子生物学》(Mol. Cell Biol.)9(3)：1165-1172(1989)中描述了使用人体乳腺肿瘤细胞系SKBR3进行特征记述的一组抗-ErbB2抗体的产生。在72小时后通过单层的结晶紫染色来测定与所述抗体接触后SKBR3细胞的相对细胞增殖情况。使用这种测定方法，应用称作4D5的抑制细胞增殖达56％的抗体获得了最高抑制率。在本试验中该组中的其它抗体将细胞增殖减少到较低的程度。进一步发现抗体4D5可以使超表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性作用敏感。另外参见1997年10月14日授权的美国专利US 5,677,171。Hudziak等讨论的抗-ErbB2抗体的进一步特征在下列文献中描述：Fendly等《癌症研究》(Cancer Research)50：1550-1558(1990)；Kotts等《体外》(In Vitro)26(3)：59A(1990)；Sarup等《生长调节》(Growth Regulation)1：72-82(1991)；Shepard等《临床免疫学杂志》(J.Clin.Immunol.)11(3)：117-127(1991)；Kumar等《细胞分子生物学》(Mol.Cell.Biol.)11(2)：979-986(1991)；Lewis等《癌症免疫学和免疫疗法》(Cancer Immunol.Immunother.)37：255-263(1993)；Pietras等《癌基因》(Oncogene)9：1829-1838(1994)；Vitetta等《癌症研究》(Cancer Research)54：5301-5309(1994)；Sliwkowski等《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)269(20)：14661-14665(1994)；Scott等《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)266：14300-5(1991)；D′souza等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.)91：7202-7206(1994)；Lewis等《癌症研究》(CancerResearch)56：1457-1465(1996)；和Schaefer等《癌基因》(Oncogene)15：1385-1394(1997)。
重组人源化型的鼠抗-ErbB2抗体4D5(huMAb4D5-8，rhuMAbHER2或HERCEPTIN；美国专利US 5,821,337)在临床上对患有已经广泛接受现有抗癌疗法的ErbB2-超表达转移乳腺癌的患者有效。(Baselga等，《临床肿瘤学杂志》(J.Clin.Oncol.)14：737-744(1996))。HERCEPTIN于1998年9月25日获得了食品与药品管理机构(the Food and Drug Administration)的销售许可以用于治疗患有肿瘤超表达ErbB2蛋白的转移乳腺癌的患者。
已经在下列文献中描述了其它具有不同特性的抗-ErbB2抗体：Tagliabue等《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)47：933-937(1991)；McKenzie等《癌基因》(Oncogene)4：543-548(1989)；Maier等《癌症研究》(Cancer Res.)51：5361-5369(1991)；Bacus等《分子致癌作用》(Molecular Carcinogenesis)3：350-362(1990)；Stancovski等PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus等《癌症研究》(Cancer Research)52：2580-2589(1992)；Xu等《国际癌症杂志》(Int.J.Cancer)53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等《癌症研究》(Cancer Research)52：2771-2776(1992)；Hancock等《癌症研究》(Cancer Res.)51：4575-4580(1991)；Shawver等《癌症研究》(Cancer Res.)54：1367-1373(1994)；Arteaga等《癌症研究》(Cancer Res.)54：3758-3765(1994)；Harwerth等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)267：15160-15167(1992)；美国专利US 5,783,186；和Klapper等《癌基因》(Oncogene)14：2099-2109(1997)。
同源筛选已经导致鉴定了两种其它的ErbB的受体家族成员；ErbB3(美国专利US 5,183,884和US 5480968以及Kraus等PNAS(USA)86：9193-9197(1989))和ErbB4(欧洲专利申请EP 599,274；Plowman等，《美国国家科学院院报》Proc.Natl Acad.Sci.USA，90：1746-1750(1993)；和Plowman等，《自然》(Nature)，366：473-475(1993))。这两种受体表现出对至少某些乳腺癌细胞系的表达增加。
一般在细胞内的不同混合物中发现了ErbB受体且认为异二聚化可增加对各种ErbB配体的细胞反应的多样性(Earp等《乳腺癌研究与治疗》(Breast Cancer Research and Treatment)35：115-132(1995))。EGFR被6种不同的配体所结合：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、β动物纤维素和epiregulin(Groenen等《生长因子》(Growth Factors)11：235-257(1994))。因对单基因的可选择剪接所产生的一族heregulin蛋白是ErbB3和ErbB4的配体。heregulin族包括：α、β和γheregulins(Holmes等《科学》(Science)，256：1205-1210(1992)；美国专利US5,641,869；和Schaefer等《癌基因》(Oncogene)15：1385-1394(1997))；neu分化因子(NDFs)、胶质生长因子(GGFs)；诱导活性的乙酰胆碱受体(ARIA)；和感觉和运动神经元衍生的因子(SMDF)。就综述而言，参见：Groenen等《生长因子》(Growth Factors)11：235-257(1994)；Lemke，G.《分子和细胞神经科学》(Molec.& Cell.Neurosci.)7：247-262(1996)和Lee等《药物综述》(Pharm.Rev.)47：51-85(1995)。近来鉴定了三种其它的ErbB配体；据报导与ErbB3或ErbB4结合的神经调节蛋白-2(NRG-2)(Chang等《自然》(Nature)387509-512(1997)；和Carraway等《自然》(Nature)387：512-516(1997))；与ErbB4结合的神经调节蛋白-3(Zhang等PNAS(USA)94(18)：9562-7(1997))；和与ErbB4结合的神经调节蛋白-4(Harari等《癌基因》(Oncogene)18：2681-2689(1999))；还与ErbB4结合的HB-EGF，β动物纤维素和epiregulin。
尽管EGF和TGFα不与ErbB2结合，但是EGF刺激EGFR和ErbB2而形成一种异二聚体，这种异二聚体激活EGFR并导致ErbB2在该异二聚体中的磷酸根转移。二聚化和/或磷酸根转移看起来激活了ErbB2酪氨酸激酶。参见Earp等，上文。同样，当ErbB3与ErbB2一起被共表达时，形成活性信号复合体且针对ErbB2的抗体能够破坏这种复合体(Sliwkowski等，《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)，269(20)：14661-14665(1994))。另外，在与ErbB2共表达时ErbB3对heregulin(HRG)的亲合力增加至较高的亲和状态。就ErbB2-ErbB3蛋白复合体而言，另外参见Levi等，《神经科学杂志》(Journal of Neuroscience)15：1329-1340(1995)；Morrissey等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92：1431-1435(1995)；和Lewis等，《癌症研究》(Cancer Res.)，56：1457-1465(1996)。类似于ErbB3，ErbB4形成一种含有ErbB2的活性信号复合体(Carraway和Cantley，《细胞》(Cell)78：5-8(1994))。
                      发明概述
在第一个方面中，本发明提供了一种治疗人体内前列腺癌(例如雄激素非依赖性前列腺癌)的方法，该方法包括对人给予治疗有效量的与ErbB2结合并阻断ErbB受体的配体活化的抗体的步骤。优选所述的抗体阻断单克隆抗体2C4与ErbB2结合和/或阻断促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的TGF-α活化。
本发明进一步提供了一种治疗人体内前列腺癌的方法，该方法包括对人给予治疗有效量的化疗剂(例如紫杉烷)和与ErbB2结合并阻断ErbB受体的配体活化的抗体的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及一种包括容器和其中包含的组合物的制品，其中所述的组合物包括与ErbB2结合并阻断ErbB受体的配体活化的抗体，且该制品进一步包括表明可以将所述组合物用于治疗前列腺癌的包装说明书。
此外，本发明涉及一种治疗人体内雄激素依赖性前列腺癌的方法，该方法包括对人给予治疗有效量的与ErbB2结合的抗体的步骤。该方法可以使得人体内的前列腺特异性抗原(PSA)的指数升高。在一个实施方案中，所述的抗体是一种诸如单克隆抗体4D5(例如人源化4D5)这样的抗体，它可抑制超表达ErbB2的癌细胞的生长。在另一个实施方案中，所述的抗体是一种类似于单克隆抗体2C4(例如人源化2C4)的抗体，它可阻断ErbB2受体的配体活化。该方法可以进一步包括对人给予一种化疗剂，优选地是紫杉烷，的步骤或不包括该步骤。
在另一个方面中，本发明提供了一种包括容器和其中包含的组合物的制品，其中所述的组合物包括与ErbB2结合的抗体，且该制品进一步包括表明可以将所述组合物用于治疗雄激素依赖性前列腺癌的包装说明书。该包装说明书中可以进一步指明用诸如紫杉烷这样的化疗剂治所述患者。
                  附图简述
附图1A和1B描绘了如通过平截突变体分析和位点定向诱变(Nakamura等《病毒学杂志》(J.of Virology)67(10)：6179-6191(1993)；和Renz等《细胞生物学杂志》(J.Cell Biol.)125(6)：1395-1406(1994))所测定的ErbB2胞外结构域(ECD)内22-645位残基22-645的表位图谱(附图IA中所示氨基酸序列，包括信号序列；SEQID NO：13)。使用聚合酶链反应技术由cDNA制备各种ErbB2-ECD平截体或点突变体。在哺乳动物表达质粒中将ErbB2突变体表达为gD融合蛋白。这种表达质粒使用带有位于插入的cDNA下游的SV40终止和聚腺苷酸化信号的巨细胞病毒启动子/增强子。将质粒DNA转染入293细胞。在转染后的1天，将该细胞在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的低葡萄糖DMEM中以代谢方式标记过夜，所述的DMEM中含有1％透析的胎牛血清和各25μCi的35S甲硫氨酸和35S半胱氨酸。收集上清液并向该上清液中添加抗-ErbB2单克隆抗体或对照抗体并在4℃下温育2-4小时。使复合体沉淀、上10-20％Tricine SDS梯度凝胶并在100V下电泳。将凝胶电印迹到膜上并通过放射自显影术进行分析。正如附图1B中所示，抗-ErbB2抗体7C2、7F3、2C4、7D3、3E8、4D5、2H11和3H4结合不同的ErbB2 ECD表位。
附图2A和2B表示抗-ErbB2单克隆抗体2C4和7F3对rHRGβ1激活MCF7细胞的作用。附图2A表示2C4或7F3对HRG刺激酪氨酸磷酸化的抑制作用的剂量反应曲线。附图2B表示通过2C4或7F3抑制125I-标记的rHRGβ177-244与MCF-7细胞结合的剂量反应曲线。
附图3描绘了通过抗-ErbB2单克隆抗体2C4或7F3抑制特异性125I-标记的rHRGβ1177-244与一组人肿瘤细胞系结合。单克隆抗体-对照品是不阻断rHRG结合的同型配对的鼠单克隆抗体。根据在有100nM rHRGβ1存在情况下进行的平行温育来确定非特异性125I-标记的rHRGβ1177-244结合率。非特异性125I-标记的rHRGβ1177-244结合率的值低于测试的全部细胞系总数的1％。
附图4A和B表示单克隆抗体2C4和4D5对MDA-MB-175(附图4A)和SK-BR-3(附图4B)细胞增殖的作用。将MDA-MB-175和SK-BR-3细胞接种在96孔平板上并使之粘附2小时。在含有1％血清的培养基中进行实验。添加抗-ErbB2抗体或单独的培养基并在37℃下将细胞温育2小时。随后添加rHRGβ1(1nM)或单独的培养基并将细胞温育4天。洗涤单层细胞并用0.5％的结晶紫染色/固定。为了测定细胞增殖情况，在540nm处测定吸光度。
附图5A和5B表示单克隆抗体2C4、HERCEPTIN抗体或抗-EGFR抗体对ErbB2与ErbB3在表达低/正常水平的ErbB2(附图5A)的MCF7细胞中和在表达高水平的ErbB2(附图5B)的SK-BR-3细胞中的heregulin(HRG)依赖性结合的作用；参见下面的实施例2。
附图6A和6B比较了完整鼠单克隆抗体2C4(mu 2C4)和嵌合2C4Fab片段的活性。附图6A表示通过嵌合2C4 Fab或完整鼠单克隆抗体2C4抑制125I-HRG与MCF-7细胞结合。将MCF7细胞接种在24-孔平板(1×105个细胞/孔)并使之生长至约85％融合、持续2天。如Lewis等在《癌症研究》(Cancer Research)56：1457-1465(1996)中所述进行结合实验。附图6B描绘了如Lewis等在《癌症研究》(CancerResearch)56：1457-1465(1996)中所述进行的对MCF-7细胞中rHRGβ1激活p180酪氨酸磷酸化的抑制。
附图7A和7B描绘了鼠单克隆抗体2C4的可变轻链(VL)(附图7A)和可变重链(VH)(附图7B)结构域(分别为SEQ ID Nos.1和2)、人源化Fab型574的VL和VH结构域(分别为SEQ ID Nos.3和4)以及人VL和VH共有构架(hum κl，轻链卡巴亚型I；humIII，重链亚型III)(分别为SEQ ID Nos.5和6)的氨基酸序列排列。星号等同于人源化Fab型574与鼠单克隆抗体2C4或人源化Fab型574与人构架之间的差异。互补决定区(CDRs)位于括号内。
附图8A-C表示如实施例3中ELISA所测定的嵌合Fab 2C4(Fab.v1)和几种人源化2C4变体与ErbB2胞外结构域(ECD)的结合率。
附图9是带有标记的白CDR主链(L1、L2、L3、H1、H2、H3)的单克隆抗体2C4的VL和VH结构域的带状结构示意图。还表示了通过人源化过程中的诱变评价的VH侧链(参见实施例3、表2)。
附图10描绘了单克隆抗体2C4或HERCEPTIN对EGF、TGF-α或HRG介导的促分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活化的作用。
附图11A-H描绘了异种移植肿瘤对HERCEPTIN(H，■)、对照品(C，o)，TAXOL(T，▲)和HERCEPTIN/TAXOL联合(H/T，
Figure A0081086600121
)治疗的反应。表示了雄激素非依赖性肿瘤CWR22R和CWRSA6(分别为附图11A和B)以及雄激素依赖性肿瘤CWR22和LNCaP(分别为附图11C和D)对HERCEPTIN和对照品的反应。所述肿瘤对HERCEPTIN、TAXOL、HERCEPTIN/TAXOL和对照品的反应如附图11E(CWR22)、附图11F(LNCaP)、附图11G(CWR22R)和附图11H(CWRSA6)中所示。将结果表示为平均肿瘤体积+/-SE。
附图12A和12B描绘了患有用HERCEPTIN治疗的雄激素依赖性前列腺癌异种移植物的动物的相对前列腺特异性抗原(PSA)指数反应。在附图12A中，在治疗前和开始治疗后的第9和第21天时在LNCaP异种移植模型中测定PSA指数并以与预治疗值之比表示。在附图12B中，在治疗前和开始治疗后的第9和第21天时在CWR22异种移植模型中测定PSA指数并以与预治疗值之比表示。将结果表示为平均相对PSA+/-SE。
附图13描绘了雄激素依赖性肿瘤CWR22对使用对照抗体(C，▲)、HERCEPTIN(H，o)或单克隆抗体2C4(2，■)疗法的反应。给予2C4表示为*；给予HERCEPTIN表示为+。
附图14描绘了雄激素依赖性肿瘤CWR22对使用单独的TAXOL(T，o)、单独的单克隆抗体2C4(2，■)或联用单克隆抗体与TAXOL(2/T，▲)疗法的反应。给予2C4表示为*；给予TAXOL(6.25mg/kg)表示为+。
附图15描绘了雄激素非依赖性肿瘤CWR22对使用对照抗体(C，▲)、HERCEPTIN(H，o)或单克隆抗体2C4(2，■)疗法的的反应。给予单克隆抗体2C4表示为+；给予HERCEPTIN表示为+。
附图16描绘了雄激素非依赖性肿瘤CWR22对使用单独的TAXOL(T，o)、单独的单克隆抗体2C4(2，■)或联用单克隆抗体与TAXOL(2/T，▲)疗法的反应。给予2C4表示为*；给予TAXOL(6.25mg/kg)表示为+。
附图17描绘了雄激素非依赖性肿瘤CWRSA6对使用对照抗体(C，▲)、HERCEPTIN(H，o)或单克隆抗体2C4(2，■)疗法的反应。给予单克隆抗体2C4表示为+；给予HERCEPTIN表示为+。
附图18描绘了雄激素非依赖性肿瘤CWRSA6对使用单独的TAXOL(T，o)、单独的单克隆抗体2C4(2，■)或联用单克隆抗体与TAXOL(2/T，▲)疗法的反应。给予2C4表示为*；给予TAXOL(6.25mg/kg)表示为+。
附图19描绘了如实时定量PCR所测定的通过CWR22R或CWR22细胞产生TGF-αmRNA的相对表达量。
附图20描绘了如实时定量PCR所测定的通过CWR22R或CWR22细胞产生HB-EGF mRNA的相对表达。
附图21描绘了抗-ErbB2单克隆抗体治疗对前列腺癌异种移植物生长的作用。在各次治疗结束后处死对照组动物时，与对照组肿瘤相比，肿瘤生长正常化。CWR22所示的值与可触摸肿瘤形成后第23天的值一致；LNCaP所示的值与可触摸肿瘤形成后第51天的值一致；CWR22R所示的值与可触摸肿瘤形成后第22天的值一致；CWR22SA6所示的值与可触摸肿瘤形成后第33天的值一致。
附图22表示抗-ErbB2单克隆抗体治疗对PSA指数的作用。将PSA指数定义为正常血清PSA的量与肿瘤体积之比。
附图23评价了重组人源化单克隆抗体(rhuMAb 2C4)、其聚乙二醇化Fab片段和鼠2C4对CWR22R雄激素非依赖性前列腺异种移植物的活性。
附图24描绘了rhuMAb 2C4对WR22R雄激素非依赖性前列腺异种移植物的剂量反应。
附图25描绘了rhuMAb 2C4对MSKPC6雄激素非依赖性前列腺异种移植物的剂量反应。
附图26描绘了雄激素非依赖性前列腺异种移植物(CWR22)中2C4和7C2的剂量反应。
附图27描绘了用TAXOL以及抗-ErbB2抗体2C4和7C2治疗的CWR22R异种移植物的肿瘤体积。
              优选实施方案的详细描述I.定义
“ErbB受体”是一种受体蛋白酪氨酸激酶，它属于ErbB受体族且包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4受体以及即将鉴定的该族中的其它受体。ErbB受体一般包括可以与ErbB配体结合的胞外结构域、亲脂性跨膜结构域、保守的胞内酪氨酸激酶结构域和含有几个可以被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号结构域。ErbB受体可以是一种“天然序列”的ErbB受体或其“氨基酸序列变体”。优选ErbB受体是一种天然序列的人ErbB受体。
在本文中术语“ErbB1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”可以互换使用且指的是例如Carpenter等在《生物化学综述年鉴》(Ann.Rev.Biochem.)56：881-914(1987)中所述的EGFR、包括其天然出现的突变体形式(例如一种如Humphrey等在PNAS(USA)87：4207-4211(1990)中所述的缺失突变体EGFR)。erbB1指的是编码EGFR蛋白产物的基因。
在本文中表达方式“ErbB2”和“HER2”可以互换使用且指的是例如Semba等在PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto等在《自然》(Nature)319：230234(1986)中所述的人HER2蛋白(基因库登记号X03363)。术语“erbB2”指的是编码人ErbB2的基因且“neu”指的是编码大鼠p185neu的基因。优选的ErbB2是天然序列的人ErbB2。
“ErbB3”和“HER3”指的是例如如美国专利US 5,183,884和5,480,968以及Kraus等在PNAS(USA)86：9193-9197(1989)中公开的受体多肽。
本文中的术语“ErbB4”和“HER4”指的是例如在EP专利申请EP 599,274、Plowman等在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：1746-1750(1993)和Plowman等在《自然》(Nature)，366：473-475(1993)中所公开的受体多肽、包括例如在1999年4月22日公开的WO99/19488中所述的其同种型。
所谓“ErbB配体”指的是与ErbB受体结合和/或激活ErbB受体的多肽。本文特别关注的ErbB配体是一种天然序列的人ErbB配体，诸如：表皮生长因子(EGF)(Savage等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)247：7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等《科学》(Science)223：1079-1082(1984))；也称作神经鞘瘤或角质细胞自分泌生长因子的双调蛋白(Shoyab等《科学》(Science)243：1074-1076(1989)；Kimura等《自然》(Nature)348：257-260(1990)；和Cook等《细胞分子生物学》(Mol.Cell.Biol.)11：2547-2557(1991))；β动物纤维素(Shing等《科学》(Science)259：1604-1607(1993)；和Sasada等《生物化学和生物物理学研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)190：1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等《科学》(Science)251：936-939(1991))；epiregulin(Toyocla等，《生物化学杂志》270：7495-7500(1995)，和Komurasaki等，《癌基因》15：2841-2848(1997))；heregulin(参见下文)；神经调节蛋白-2(NRG-2)(Carraway等《自然》(Nature)387：512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang等《美国国家科学究院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94：9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari等《癌基因》(Ongene)18：2681-2689(1999)；或cripto(CR-1)(Kannan等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)272(6)：3330-3335(1997))。与EGFR结合的ErbB配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β动物纤维素、HB-EGF和epiregulin。与ErbB3结合的ErbB配体包括heregulins。能够结合ErbB4的ErbB配体包括β动物纤维素、epiregulin、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和heregulins。
本文所用的“Heregulin”(HRG)指的是由如美国专利US5641,869或Marchionni等在《自然》(Nature)，362：312-318(1993)中所公开的heregulin基因产物编码的多肽。heregulins的实例包括：heregulin-α、heregulin-β1、heregulin-β2和heregulin-β3(Holmes等《科学》(Science)，256：1205-1210(1992)；和美国专利US 5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles等《细胞》(Cell)69：205-216(1992))；诱导活性的乙酰胆碱受体(ARIA)(Falls等《细胞》(Cell)72：801-815(1993))；胶质生长因子(GGFs)(Marchionni等《自然》(Nature)，362：312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生的因子(SMDF)(Ho等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)270：14523-14532(1995))；γ-heregulin(Schaefer等《癌基因》(Oncogene)15：1385-1394(1997))。该术语包括天然序列HRG多肽的具生物活性的片段和/或氨基酸序列变体，诸如其EGF-样结构域片段(例如HRGβ1177-244)。
本文中的“ErbB异-寡聚体”是一种包括至少两种不同ErbB受体的共价结合的寡聚体。当表达两种或多种ErbB受体的细胞与ErbB配体接触时，这类复合体可以形成且可以通过免疫沉淀法分离它们并例如通过如Sliwkowski等在《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)，269(20)：14661-14665(1994)中所述的SDS-PAGE分析它们。这类ErbB异-寡聚体的实例包括EGFR-ErbB2、ErbB2-ErbB3和ErbB3-ErbB4复合体。此外，这种ErbB异-寡聚体可以包括与诸如ErbB3、ErbB4或EGFR这样不同ErbB受体结合的两种或多种ErbB2受体。在该异-寡聚体中可以包括诸如细胞因子受体亚单位(例如gpl30)这样的其它蛋白质。
所谓“ErbB受体的配体活化”指的是由与包括所关注的ErbB受体的ErbB异-寡聚体结合的ErbB配体介导的信号转导(例如该过程由磷酸化ErbB受体或底物多肽中的酪氨酸残基的ErbB受体的胞内激酶结构域所产生)。一般来说，该过程包括下列步骤：ErbB配体与激活异-寡聚体中的一种或多种ErbB受体的激酶结构域的ErbB异-寡聚体结合且由此导致一种或多种ErbB受体中的酪氨酸残基磷酸化和/或其它底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。可以使用各种酪氨酸磷酸化测定法对ErbB受体活化进行定量。
“天然序列”多肽是一种与天然来源的多肽具有相同氨基酸序列的多肽(例如ErbB受体或ErbB配体)。这类天然序列的多肽可以分离自天然来源或可以通过重组或合成方式生产。因此，天然序列的多肽可以具有天然出现的人多肽、鼠多肽或来自任意其它哺乳动物种类的多肽的氨基酸序列。
术语“氨基酸序列变体”指的是与天然序列的多肽具有一定程度的差异的多肽类。一般来说，氨基酸序列变体与至少一种天然ErbB配体的受体结合结构域或至少一种天然ErbB受体的配体结合结构域具有至少约70％的同源性、且优选它们与这类受体或配体结合结构域具有至少约80％、更优选至少约90％的同源性。所述的氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位点上发生取代、缺失和/或插入。
将“同源性”定义为在进行序列对比且如果需要引入缺口以获得最高百分比同源性后属于相同的氨基酸序列变体中的残基百分比。用于进行序列对比的方法和计算机程序在本领域中是众所周知的。一种这类程序是“Align2”，该程序由Genentech，Inc.编程并于1991年12月10日在美国版权局(United States Copyright Office)，华盛顿，DC20559与用户证明一起进行了登记。
本文将术语“抗体”以广义使用且特别包括单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，条件是它们表现出所需的生物活性。
本文所用的术语“单克隆抗体”指的是获自基本上同型抗体群体的抗体，即包括所述群体的各个抗体除可能以最小量存在的天然出现的突变之外均是相同的。单克隆抗体针对单抗原位点具有高度特异性。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，各单克隆抗体针对的是抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们可以由其它抗体以不加污染的方式合成。修饰语“单克隆”表示获自基本上同型抗体群体的抗体的特性且并不解释为要求通过任何特定方法来生产所述抗体。例如，可以通过首先由Kohler等在《自然》(Nature)，256：495(1975)中所述的杂交瘤方法或可以通过重组DNA方法(例如，参见美国专利US 4,816,567)来制备本发明所用的单克隆抗体。例如，还可以使用Clackson等在《自然》(Nature)，352：624-628(1991)和Marks等在《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，222：581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离所述的“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链部分与来源于特定种类或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而剩余的链与来源于另一种类或属于另一种抗体类型或亚型的抗体以及这类抗体的片段中的相应序列相同或同源，条件是它们表现出所需的生物活性(美国专利US 4,816,567和Morrison等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81：6851-6855(1984))。本文关注的嵌合抗体包括“灵长类源化”抗体，它们包括来源于非人的灵长类(例如古代的猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
“抗体片段”包括部分完整抗体、优选包括其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；diabodies；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整”抗体是一种包括抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。所述的恒定结构域可以是天然序列的恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选所述的完整抗体具有一种或多种效应子功能。
抗体“效应子功能”指的是因抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)而产生的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；胞吞作用；减量调节细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等。
随着重链恒定结构域中氨基酸序列的不同，完整抗体可以被分入不同的“种类”。存在5种主要类型的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且可以将这些类型中的几种进一步分成″亚型″(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应不同类型抗体的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指的是一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体且随后导致靶细胞裂解。介导ADCC的原初细胞即NK细胞仅表达FcyRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。将FcR在对造血细胞上的表达概括在Ravetch和Kinet的《免疫学综述年鉴》(Annu.Rev.Immunol)9：457-92(1991)中464页上的表3中。为了评价所关注分子的ADCC活性，可以进行诸如美国专利US 5,500,362或5,821,337中所述的体外ADCC试验。用于这类试验的有用的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。另一方面或另外，例如，可以在体外诸如Clynes等在PNAS(USA)95：652-656(1998)中所述的动物模型中评价所关注分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcRs并起效应子功能的白细胞。优选所述细胞至少表达FcγRIII并起ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血液单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，其中优选PBMCs和NK细胞。效应细胞可以分离自其天然来源，例如效应细胞可以分离自本文所述的血液或PBMCs。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是一种天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是一种结合IgG抗体(一种γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚型受体的FcR，包括等位基因变体和这些受体可选择的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“活化受体”)和FcγRIIB(一种“抑制受体”)，它们具有主要在其胞质结构域方面存在差异的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基元(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基元(ITIM)。(参见M.Daёron在《免疫学综述年鉴》(Annu.Rev.Immunol)15：203-234(1997)中的综述)。在下列文献中综述了FcRs：Ravetch和Kinet，《免疫学年鉴综述》(Annu.Rev.Immunol)9：457-92(1991)；Capel等《免疫方法》(Immunomethods)4：25-34(1994)；和de Haas等《临床实验室方法杂志》(J.Lab.Clin.Med.)126：330-41(1995)。本文中的术语″FcR″包括其它FcRs、包括即将鉴定的那些FcRs。该术语还包括新生儿受体FcRn，它对于将母体IgGs转入胎儿来说是必不可少的(Guyer等《免疫学杂志》(J.Immuno1.)117：587(1976)和Kim等《免疫学杂志》(J.Immunol.)24：249(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指的是分子在有补体存在的情况下裂解靶物的能力。通过使补体系统(Clq)中的第一种成分与复合了关连抗原的分子(例如抗体)结合来启动补体活化途径。为了评价补体的活化，可以进行例如如Gazzano-Santoro等在《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)202：163(1996)中所述的CDC试验。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚化糖蛋白，它由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。各轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链中是可变的。每条重链和轻链还带有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端上带有可变结构域(VH)、后面是大量恒定结构域。每条轻链在一端带有可变结构域(VL)且在其另一断带有恒定结构域。将轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域进行序列对比并将轻链可变结构域与重链可变结构域进行序列对比。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面。
术语“可变”指的是可变结构域的某些部分在抗体中的序列方面具有广泛差异且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不是平衡地分布在抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中的称作高变区的3个片段中。可变结构域中更加高度保守的部分称作构架区(FRs)。天然重链和轻链的可变结构域包括4种FRs，它们大部分采用由3个形成环连接的高变区连接的β-折叠构型且在某些情况中形成部分β-折叠结构。各链中高变区彼此保持接近FRs，而来自另一链的高变区有利于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等《具有免疫意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域并不直接涉及抗体与抗原的结合，而表现出各种效应子功能、诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的参与。
本文使用术语“高变区”时指的是抗原结合必不可少的抗体的氨基酸残基。该高变区一般包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基；Kabat等《具有免疫意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变结构域中的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基以及重链结构域疾病结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位残基；Chothia和Lesk《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)196：901-917(1987))。“构架区”或“FR”残基是那些可变结构域的残基而非如本文定义的高变区残基。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生称作“Fab”片段的各自带有单一抗原结合位点的两种相同的抗原结合片段和一种名称反映出便于结晶的残余“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生带有两个抗原结合位点且仍然能够交联抗原的F(ab′)2片段。
“Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区由紧密非共价结合的一种重链和一种轻链可变结构域的二聚体组成。在这种构型中每个可变结构域中的3个高变区相互作用而确定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。6个高变区共同将抗原结合特异性赋予抗体。然而，甚至单一可变结构域(或仅包括对抗原具有特异性的3个高变区的一半Fv)也具有识别并结合抗原的能力，不过，它的亲和力低于完整的结合位点。
Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域(CH 1)。Fab′片段与Fab片段的区别在于在包括来自抗体铰合区的一个或多个半胱氨酸的重链CH 1结构域的羧基末端上添加了几个残基。Fab′-SH在本文中是Fab′的名称，其中恒定结构域中的半胱氨酸残基至少带有一个游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段开始作为Fab′片段对产生，在它们之间带有铰合部半胱氨酸。其它抗体片段的化学偶联也是公知的。
可以使称作κ和λ的基于其恒定结构域氨基酸序列的两种明显不同类型中的一种带有来自任意脊椎动物种类的抗体的“轻链”。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH and VL结构域，其中这些结构域以单多肽链形式存在。优选Fv多肽进一步在能够使scFv形成抗原结合所需结构的VH与VL结构域之间含有多肽接头。就对scFv的综述而言，参见Plückthun的《单克隆抗体药理学》(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。抗-ErbB2抗体scFv片段描述在W093/16185、美国专利US 5,571,894和美国专利US 5,587,458中。
术语“diabodies”指的是带有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在相同多肽链(VH-VL)中包括与可变轻链结构域(VL)连接的可变重链结构域(VH)。通过使用过短以致于不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头可以促使所述结构域与另一链的互补结构域配对并生成两个抗原结合位点。例如，Diabodies更完整地描述在EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger等的《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：6444-6448(1993)中。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人种类(供体抗体)高变区的残基所取代，所述的非人种类诸如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类。在某些情况中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基所取代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以便进一步精修抗体特性。一般来说，人源化抗体基本上包括至少一个且一般是两个可变结构域中的全部，其中高变环中的全部或基本上全部与那些非人免疫球蛋白一致且全部或基本上全部的FRs是那些人免疫球蛋白序列。人源化抗体还可以选择地包括至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)、一般是人免疫球蛋白的恒定区。就更具体的内容而言，参见Jones等《自然》(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等《自然》(Nature)332：323-329(1988)；和Presta，《最新结构生物学观点》(Curr.Op.Struct.Biol.)2：593-596(1992)。
人源化抗-ErbB2抗体包括：如美国专利US 5,821,337的表3中所述的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，特别将该文献引入本文作为参考；如下文所述的人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4。
“分离的”抗体是一种已经从其天然环境的成分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境中的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质且可以包括酶类、激素类和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)如Lowry法测定的95％以上(重量)的抗体且最优选99％以上(重量)；(2)通过使用转杯式测序仪纯化至足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE、使用考马斯蓝或优选银染色纯化至均匀性。分离的抗体在重组细胞内原位包括所述抗体，这是因为抗体的天然环境中的至少一种成分不存在。然而，一般来说，通过至少一种纯化步骤来制备分离的抗体。
“结合”例如ErbB2抗原这样的所关注抗原的抗体是一种能够结合具有充分亲和力的抗原的抗体，从而将该抗体用作靶向表达所述抗原的细胞中的治疗剂。如果该抗体是一种结合ErbB2的抗体，那么它通常优选结合与其它ErbB受体相反的ErbB2且可以是一种不与诸如EGFR、ErbB3或ErbB4这样的其它蛋白质发生显著交联反应的抗体。在这类实施方案中，正如荧光激活细胞分类(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)所测定的，所述抗体与这些非-ErbB2蛋白质的结合(例如与内源性受体结合的细胞表面)程度低于10％。有时，抗-ErbB2抗体不与大鼠neu蛋白发生显著交联反应，例如正如Schecter等在《自然》(Nature)312：513(1984)和Drebin等在《自然》(Nature)312：545-548(1984)中所述。
“阻断”ErbB受体的配体活化的抗体是一种如上所述减少或防止这类活化的抗体，其中该抗体对ErbB受体的配体活化的阻断作用基本上能够比单克隆抗体4D5有效，例如大约与单克隆抗体7F3或2C4或其Fab片段的功效相同且优选与单克隆抗体2C4或其单克隆抗体片段功效相同。例如，阻断ErbB受体的配体活化的抗体可以是一种在阻断ErbB异-寡聚体形成上大约比4D5有效50-100％的抗体。通过任意方式、例如通过干扰下列过程可以阻断ErbB受体的配体活化：配体与ErbB受体结合；ErbB复合体形成；ErbB受体在ErbB复合体中的酪氨酸激酶活性和/或酪氨酸激酶残基在ErbB复合体中的磷酸化或通过ErbB受体的磷酸化。阻断ErbB受体的配体活化的抗体实例包括：单克隆抗体2C4和7F3(它阻断：ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4异-寡聚体的HRG活化；以及EGFR/ErbB2异-寡聚体的EGF、TGF-α、双调蛋白、HB-EGF和/或epiregulin活化)；以及L26、L96和L288抗体(Klapper等《癌基因》(Oncogene)14：2099-2109(1997))，它们阻断EGF和NDF与表达EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4的T47D细胞结合。
具有诸如命名为2C4的单克隆抗体这样的指定抗体的″生物特性″的抗体是一种具有一种或多种不同于与相同抗原(例如ErbB2)结合的其它抗体的抗体生物特性的抗体。例如，具有2C4生物特性的抗体可以阻断包括ErbB2和ErbB3或ErbB4的ErbB异-寡聚体的HRG活化、阻断包括EGFR和ErbB2的ErbB受体的EGF、TGF-α、HB-EGF、epiregulin和/或双调蛋白活化、阻断MAPK的EGF、TGF-α和/或HRG介导的活化；和/或结合如2C4结合的ErbB2胞外结构域中的相同表位(例如阻断单克隆抗体2C4与ErbB2结合)。
除非另有说明，表达方式“单克隆抗体2C4”指的是带有下面实例的鼠2C4抗体的抗原结合残基或来源于下面实例的鼠2C4抗体的抗原结合残基的抗体。例如，单克隆抗体2C4可以是诸如人源化2C4这样的鼠单克隆抗体2C4或其变体，它带有鼠单克隆抗体2C4的抗原结合氨基酸残基。人源化2C4抗体的实例在下面的实施例3中描述。除非另有说明，本文所用的表达方式“rhuMAb 2C4”指的是包括分别与可以由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达的人轻链和重链IgG1(非-A异型)恒定区序列融合的SEQ ID Nos.3和4的可变轻链(VL)和可变重链VH序列的抗体。
除非另有说明，术语“单克隆抗体4D5”指的是带有鼠4D5抗体(ATCC CRL 10463)的抗原结合残基或来源于鼠4D5抗体的抗原结合残基的抗体。例如，单克隆抗体4D5可以是诸如人源化4D5这样的鼠单克隆抗体4D5或其变体，它带有鼠单克隆抗体4D5的抗原结合残基。人源化4D5抗体的典型实例包括如美国专利US 5,821,337中所述的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)，其中huMAb4D5-8(HERCEPTIN)是优选的人源化4D5抗体。
本文所用的“生长抑制剂”指的是在体外或体内抑制细胞生长、特别是表达ErbB的癌细胞的化合物或组合物。因此，该生长抑制剂可以是一种显著降低S期中表达ErbB的细胞百分比的生长抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞循环增长(在非S期的位置上)的试剂、诸如诱导G1抑制和M-期抑制的活性剂。传统的M-期阻断剂包括长春花属(长春新碱和长春碱)、紫杉烷和诸如阿霉素、表红霉素、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素这样的II型拓扑异构酶抑制剂。那些抑制Gl的活性剂也溢出进入S-期抑制，例如：DNA烷基化剂，诸如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可以在Murakami等(WB sauders：Philadelphia，1995)著的、Mendelsohn和Israel编辑的《癌症分子基础》(TheMolecular Basis of Cancer)第1章标题为“细胞循环调节、癌基因和抗肿瘤药物”(“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplasticdrugs”)、特别是第13页中找到。
“生长抑制性”抗体的实例是那些与ErbB2结合并抑制超表达ErbB2的癌细胞生长的抗体。优选的生长抑制性抗-ErbB2抗体对细胞培养物中SK-BR-3乳腺肿瘤细胞生长的抑制作用在抗体浓度约为0.5-30μg/ml时超过20％、且优选超过50％(例如约50％-约100％)，其中在SK-BR-3细胞与抗体接触后6天测定生长抑制率(参见1997年10月14日授权的美国专利US 5,677,171)。在该专利和下文中更为具体地描述了SK-BR-3细胞生长抑制试验。
“诱发细胞死亡”的抗体是一种导致存活细胞变成不能存活的细胞的抗体。所述的细胞一般是一种表达ErbB2受体的细胞，尤其是其中该细胞超表达ErbB2受体。优选所述的细胞是癌细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰腺或膀胱细胞。在体外，所述的细胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu 3、MDA-MB-453、MDA-MB361或SKOV3细胞。在没有用于区分由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱发的细胞死亡的补体和免疫效应细胞存在的情况下可以测定体外的细胞死亡。因此，可以使用加热失活的血清(即在没有补体存在的情况下)且在没有免疫效应细胞存在的情况下进行细胞死亡试验。为了测定所述抗体是否能够诱发细胞死亡，可以评价与未治疗细胞相比如碘化丙锭(PI)、锥虫蓝(参见Moore等《细胞工程学》(Cytotechnology)17：1-11(1995))或7AAD的摄取所评价的膜完整性的损耗。优选的诱发细胞死亡的抗体是那些在PI摄取试验中诱导BT474细胞中PI摄取的抗体(参见下文)。
“诱发编程性细胞死亡”的抗体是一种如通过膜联蛋白V的结合、DNA的断裂、细胞皱缩碎片、内质网的膨胀、细胞碎片和/或膜囊泡的形成(称作编程性细胞死亡体)所确定的程序性细胞死亡的抗体。所述细胞通常是一种超表达ErbB2受体的细胞。优选所述细胞是肿瘤细胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰腺或膀胱细胞。在体外，所述的细胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB361或SKOV3细胞。可以应用用于评价与编程性细胞死亡相关的细胞情况的各种方法。例如：可以通过膜联蛋白结合率确定磷脂酰丝氨酸(PS)的转运情况；可以通过DNA梯化率来评价DNA断裂情况；且可以通过任意亚二倍体细胞的增加来评价核/染色质与DNA碎片的凝聚情况。优选诱发编程性细胞死亡的抗体是一种在使用BT474细胞的膜联蛋白结合试验中产生约2-50倍、优选约5-50倍且最优选约10-50倍于未处理细胞的膜联蛋白结合诱发率的抗体(参见下文)。有时，前编程性细胞死亡抗体是一种进一步阻断ErbB受体的ErbB配体活化的抗体(例如7F3抗体)；即该抗体与单克隆抗体2C4共有生物特性。在其它情况中，所述抗体是一种不会显著阻断ErbB受体的ErbB配体活化的抗体(例如7C2)。此外，所述抗体可以是一种类似于不会在S期中诱发细胞百分比大规模降低而诱发编程性细胞死亡的7C2的抗体(例如一种与对照组相比仅诱发这些细胞百分比中降低约0-10％的抗体)。
“表位2C4”是抗体2C4所结合的ErbB2的胞外结构域中的区。为了筛选与2C4表位结合的抗体，可以进行诸如《抗体实验指南》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)、Harlow和DavidLane编辑(1988)中所述的常规交叉阻断试验。另一方面，可以进行表位作图以便评价所述抗体是否与ErbB2的2C4表位(例如包括ErbB2的约22位残基至约584位残基区中的任意一个或多个残基；参见附图IA-B)结合。
“表位4D5”是抗体4D5(ATCC CRL 10463)所结合的ErbB2的胞外结构域中的区。该表位与ErbB2的跨膜结构域邻近。为了筛选与4D5表位结合的抗体，可以进行诸如《抗体实验指南》(Antibodies，ALaboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)、Harlow和DavidLane编辑(1988)中所述的常规交叉阻断试验。另一方面，可以进行表位作图以便评价所述抗体是否与ErbB2的4D5表位(例如包括ErbB2的约529位残基至约625位残基区中的任意一个或多个残基；参见附图1A-B)结合。
“表位3H4”是抗体3H4所结合的ErbB2的胞外结构域中的区。该表位包括ErbB2胞外结构域的氨基酸序列中包含的约541-约599位残基；参见附图1A-B。
“表位7C2/7F3”是7C2和/或7F3抗体(各自寄存在ATCC，参见下文)所结合的ErbB2的胞外结构域N末端区。为了筛选与7C2/7F3表位结合的抗体，可以进行诸如《抗体实验指南》(Antibodies，ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory、Harlow和DavidLane编辑(1988)中所述的常规交叉阻断试验。另一方面，可以进行表位作图以便确定所述抗体是否与ErbB2上的7C2/7F3表位(例如包括ErbB2的约22位残基至约53位残基区中的任意一个或多个残基；参见附图1A-B)结合。
“治疗”指的是治疗方法和预防或保护性措施。需要治疗的那些情况包括已经患有疾病的那些情况以及预防所述疾病的那些情况。因此，本文所治疗的哺乳动物已经被诊断为患有所述疾病或可能易患所述疾病或怀疑患有所述疾病。
用于治疗目的的“哺乳动物”指的是被分类为哺乳动物的任意动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园动物、娱乐性动物或宠物，诸如狗、马、猫、牛等。优选的哺乳动物是人。
术语“治疗有效量”指的是有效治疗哺乳动物疾病或紊乱的药物的用量。就癌症而言，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤大小、抑制癌细胞渗入外周器官(即抑制到一定程度且优选使之终止)、抑制肿瘤转移(即抑制到一定程度且优选使之终止)、将肿瘤生长抑制到一定程度；和/或使与癌症相关的一种或多种症状缓解到一定程度。由于药物可以预防癌细胞生长和/或杀伤癌细胞至一定程度，所以它可能是抑制细胞的和/或细胞毒性的。就癌症疗法而言，例如可以通过评价疾病发展的时间(TTP)和/或测定反应率(RR)来确定功效。
术语“癌症”和“癌性的”用以描述一般特征在于细胞不受控制生长的哺乳动物的生理学状况。癌症的实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或恶性淋巴样肿瘤。这类癌症的更特殊的实例包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌，包括胃肠癌；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝细胞瘤；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；肛门癌；阴茎癌；以及头颈癌。
“表达ErbB的癌”是一种包括在细胞表面带有ErbB蛋白的细胞的癌症。“表达ErbB2的癌”是一种在细胞表面产生足够水平的ErbB2的癌症，使得抗-ErbB2抗体可以与之结合并具有对所述癌症的治疗作用。
“特征在于过度激活”ErbB受体的癌症是一种ErbB受体在癌细胞中的活化程度显著超过该受体在相同组织类型的非癌细胞中的活化水平的癌症。这类过度活化可以由ErbB受体的超表达和/或这种表达超过激活癌细胞中ErbB受体所用配体的正常水平所导致。这类过度活化可以导致癌细胞的恶性状态和/或由癌细胞的恶性状态产生这类过度活化。在某些实施方案中，对所述癌症进行诊断或预后试验以便确定是否发生了导致这类ErbB受体过度活化的ErbB受体扩增和/或超表达。另一方面或另外，可以对所述癌症进行诊断或预后试验以便确定是否在导致所述受体过度活化的癌症中发生了ErbB配体的扩增和/或超表达。在这类癌症的亚型中，所述受体的过度活化可以由自分泌刺激途径所产生。
在“自分泌”刺激途径中，自我刺激通过产生ErbB配体及其关连ErbB受体的癌细胞发生。例如，所述癌症可以表达或超表达EGFR且还可以表达或超表达EGFR配体(例如EGF、TGF-α或HB-EGF)。在另一个实施方案中，所述癌症可以表达或超表达ErbB2且还可以表达或超表达heregulin(例如γ-HRG)。
“超表达”ErbB受体的癌症是一种在细胞表面带有显著高于相同组织类型的非癌细胞的诸如ErbB 2这样的ErbB受体水平的癌症。这类超表达可以由基因扩增或通过转录或翻译的增加而产生。可以在诊断或预后试验中通过评价细胞表面上存在的ErbB蛋白的增加水平来测定ErbB受体的超表达(例如通过免疫组织化学测定法；IHC)。另一方面或另外，例如可以通过下列方法测定编码ErbB的核酸在所述细胞中的水平：原位荧光杂交(FISH；参见1998年10月公开的WO98/45479)；DNA印迹；或聚合酶链反应(PCR)技术，诸如实时定量PCR(RT-PCR)。还可以通过测定诸如血清这样的生物液体中的分散抗原(例如ErbB胞外结构域)来研究ErbB受体的超表达(例如，参见1990年6月12日授权的美国专利US 4,933,294；1991年4月18日公开的WO91/05264；1995年3月28日授权的美国专利US 5401638；和Sias等《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)132：73-80(1990))。除上述试验外，本领域技术人员可以应用各种体内试验。例如，可以使患者体内的细胞与可以用例如放射性同位素这样的检测标记标记的抗体接触且例如可以通过体外放射性扫描或通过分析取自预先与所述抗体接触的活检组织来评价患者体内所述抗体与细胞的结合情况。
相反，在一种诊断试验中，“特征并不在于超表达ErbB2受体”的癌症是与相同组织类型的非癌细胞相比不表达正常水平以上ErbB2受体的一种癌症。
“超表达”ErbB配体的癌症是一种产生显著高于相同组织类型的非癌细胞的配体水平的癌症。这类超表达可以通过基因扩增或通过转录或翻译的增加而产生。通过评价患者体内、例如肿瘤活检组织中的配体(或编码它的核酸)的水平或通过诸如IHC、FISH、DNA印迹、PCR这样的不同诊断试验或如上所述的体内试验可以以诊断方式确定ErbB配体的超表达。
“激素非依赖性”癌症是一种其增殖不依赖于与癌症中细胞所表达的受体结合的激素的存在的癌症。在施用减少肿瘤或肿瘤附近的激素浓度的药理或手术策略时，这类癌症并不会出现临床消退。激素非依赖性癌症的实例包括雄激素非依赖性前列腺癌、雌激素非依赖性乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌。在进行抗激素疗法后，这类癌症可以作为激素依赖性肿瘤开始并从激素敏感性阶段发展成激素顽固性肿瘤。
本文所用的术语“胞毒剂”指的是抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏的一种物质。该术语用来包括：放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)；化疗剂；和毒素，诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”是一种用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括：烷基化剂，诸如塞替派和环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯类，诸如白消安、胺丙内酯和嗪消安；氮丙定类，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；氮丙啶类和甲密胺类(methylamelamines)，包括六甲密胺、三亚胺嗪、三乙烯磷酰胺、塞替哌和三羟甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥子气，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、抗瘤氨酸、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，诸如卡氮芥、氯脲菌素、福替目丁、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷诺氮芥；抗生素，诸如阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、calicheamicin、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表红霉素、去羟阿霉素、去甲氧柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培来霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸、三甲祛沙；嘌呤类似物，诸如氟氘丙氨酸、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、环戊缩环硫雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，诸如氨基导眠能、邻对滴滴滴、腈环氧雄烷；叶酸补充剂，诸如frolinic acid；乙酰葡醛酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比山群；依达曲沙；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；醋酸羟哔咔唑；环氧甘醚；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；丙米腙；米托蒽醌；单哌潘生丁；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡喃阿霉素；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基卡肼；PSK；丙亚胺；西索菲兰；螺旋锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXON″*，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和docetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；西吉他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；维诺利宾；navelbine；甲酰四氢叶酸(LV)，二羟基蒽酮；鬼臼噻吩苷；柔红霉素；氨蝶呤；xeloda；ibandronate；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；esperamicins；capecitabine；和上述任意药物的药物上可接受的盐、酸或衍生物。在本定义中还包括起调节或抑制作用于肿瘤的激素的抗激素药，诸如抗雌激素药，包括：例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LYI 17018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素药，诸如氟利坦、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和性瑞林；以及上述任意药物的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是对作为细胞间介体的另一种细胞起作用的一种细胞群体所释放的蛋白质的一般名称。这类细胞因子的实例有：淋巴因子；单核因子和传统的多肽激素类。在所述细胞因子中包括：生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺素(TSH)，和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘促乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；米勒抑制物质；与小鼠促性腺激素相关的肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α，-β和γ；集落刺激因子(CSFs)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)诸如IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；一种肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；以及其它包括LIF和kit配体(KL)在内的多肽因子。本文所用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物和天然序列细胞因子的生物活性等同物的蛋白质。
本文所用的术语“EGFR-定向药物”指的是与EGFR受体结合且可以抑制EGFR受体活化的治疗剂。这类治疗剂的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的实例包括：MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利US4,943,533，Mendelsohn等)及其变体，诸如嵌合的225(C225)和重构的人225(H225)(参见WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；与EGFRII型突变体结合的抗体(美国专利US 5,212,290)；如美国专利US5,891,996中所述结合EGFR的人源化和嵌合抗体；以及结合EGFR的人抗体(参见WO98/50433，Abgenix)。可以使抗-EGFR抗体与一种胞毒剂缀合，由此生成免疫缀合物(例如参见EP659,439A2，Merck PatentGmbH)。与EGFR结合的小分子的实例包括ZD1839(Astra Zeneca)、CP-358774(OSI/Pfizer)和AG1478。
“抗生血管剂”指的是阻断或干扰血管发育至一定程度的化合物。抗生血管因子例如可以是与涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。本文优选的抗生血管因子是与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。
本说明书中所用的术语“前体药物”指的是与母体药物相比对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性且能够以酶促方式被激活或转化成更具活性的母体形式的药物活性物质的前体或衍生物形式。例如，参见Wilman的“癌症化疗中的前体药物”(″Prodrugs in CancerChemotherapy″)-《生化协会学报》(Biochemical SocietyTransactions)，14，pp.375-382,615th Meeting Belfast(1986)和Stella等的“前体药物：定向药物转运化学方法”(″Prodrugs：A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery″)-《定向药物转运》(DirectedDrug Delivery)，Borchardt等，(编辑)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于：含有磷酸盐的前体药物、含有硫代磷酸盐的前体药物、含有硫酸盐的前体药物、含有肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化前体药物、含有β-内酰胺的前体药物、含有可被取代或不被取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含有可被取代或不被取代的苯乙酰胺的前体药物、可以被转化成更具活性的细胞毒性的游离药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可以被衍生成用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述的那些化疗剂。
“脂质体”是一种由各种类型的脂类、磷脂类和/或用于将药物(诸如本文公开的抗-ErbB2抗体和可以是一种化疗剂)输送给哺乳动物的表面活性剂组成的小囊泡。脂质体的成分通常排列在形成的双层中，这与生物膜的脂类排列相似。
术语“包装说明书”用于指通常在治疗用产品商品包装中包括的说明书，该说明书中包含有关涉及这类治疗用产品的使用的应用、剂量、给药、禁忌症和/或警告的信息。
“心脏保护剂”是一种预防或缓解或缓解与对患者给予诸如蒽环类抗生素和/或抗-ErbB2抗体这样的药物相关的心肌功能异常(即心脏病和/或充血性心力衰竭)的心肌功能障碍的化合物或组合物。例如，心脏保护剂可以阻断或减少自由基介导的心脏毒性作用和/或预防或缓解氧化性应激损伤。本定义中包括的心脏保护剂的实例包括：铁螯合剂dexrazoxane(ICRF-187)(Seifert等《药物疗法年鉴》(The Annalsof Pharmacotherapy)28：1063-1072(1994))；降脂剂和/或抗氧化剂，诸如丙丁酚(Singal等《分子细胞心脏病学杂志》(J.Mol.CellCardiol.)27：1055-1063(1995))；amifostine(氨基硫醇2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇-二氢磷酸酯、也称作WR-2721及其称作WR-1065的去磷酸化的细胞摄取形式)和S-3-(3-甲氨基丙氨基)丙基硫代磷酸(WR-151327)，参见Green等《癌症研究》(Cancer Research)54：738-741(1994)；地高辛(Bristow，M.R.：Bristow MR，编辑《药物诱发的心脏病》(Drug-Induced Heart Disease.)New York：Elsevier 191-215(1980))；β-阻断剂，诸如美托洛尔(Hjalmarson等《药物》(Drugs)47：增刊4：31-9(1994)；和Shaddy等《美国心脏病杂志》(Am.Heart J.)129：197-9(1995))；维生素E；抗坏血酸(维生素C)；自由基清除剂，诸如齐墩果酸、熊果酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕获化合物，诸如α-苯基叔丁基硝酸灵(PBN)；(Paracchini等，《抗癌研究》(AnticancerRes.)13：1607-1612(1993))；硒代有机化合物，诸如P251(Elbesen)；等。II.抗-ErbB2抗体的生产
说明书描述了有关用于本发明抗体生产的典型技术。用于生产抗体的ErbB2抗原例如可以是一种含有所需表位的ErbB2或其部分胞外结构域的可溶形式。另一方面，可以将在其细胞表面上表达ErbB2的细胞(例如转化为超表达ErbB2的NIH-3T3细胞或诸如SKBR3细胞这样的癌细胞系，参见Stancovski等PNAS(USA)88：8691-8695(1991))用于生产抗体。用于生产抗体的ErbB2的其它形式对本领域技术人员来说是显而易见的。
(i)多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂使动物体内的多克隆抗体增加。可以将它用于使相关抗原与在所免疫接种的物种中是免疫原性的蛋白质缀合，所述的蛋白质例如是匙孔血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或使用双功能试剂或衍生试剂的大豆胰蛋白酶抑制剂，例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基缀合)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。
通过将例如100μg或5μg的蛋白质或缀合物(分别就家兔或小鼠而言)与3个体积的弗氏完全佐剂混合并经皮在多个部位上注射该溶液而针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物对动物免疫接种。一个月后，通过在多个部位上进行皮下注射而给动物加强注射1/5-1/10原始量的肽或缀合物的弗氏完全佐剂的溶液。7-14天后，对动物取血并检测血清的抗体滴度。给动物加强注射至滴度达到平顶期为止。优选给动物加强注射相同抗原且缀合了不同蛋白质和/或通过不同的交联试剂结合不同蛋白质的缀合物。还可以在重组细胞培养物中制备缀合物作为蛋白质融合物。此外，诸如明矾这样的聚集剂适用于促进免疫反应。
(ii)单克隆抗体
由基本上同型的抗体的群体获得单克隆抗体，所述基本上同型的抗体即包括群体相同但不包括可能以最小量存在的天然发生的突变体的各个抗体。因此，修饰语“单克隆”表示并不作为不连续抗体混合物的抗体的性质。
例如，可以使用首先由Kohler等在《自然》(Nature)256：495(1975)中描述的杂交瘤方法来制备所述的单克隆抗体或可以通过重组DNA方法(美国专利US 4,816,567)制备所述的单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，如上所述给诸如仓鼠这样的小鼠或其它合适的宿主动物进行免疫接种以便生成产生或能够产生与用于免疫接种的蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。另一方面，可以在体外免疫接种淋巴细胞。然后使用诸如聚乙二醇这样合适的融合剂使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而形成杂交瘤细胞(Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，pp.59-103(Academic Press，1986))。
将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其在其中生长，所述的培养基优选含有一种或多种可抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT or HPRT)，那么用于杂交瘤的所述培养基包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质可防止HGPRT-缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合、通过产生选择的抗体的细胞来维持高水平抗体稳定产生并对诸如HAT培养基这样的培养基敏感的骨髓瘤细胞。在它们中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如那些来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的商购自the SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California USA的细胞系和商购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，Rockville，Maryland USA的SP-2或X63-Ag8653细胞。还描述了用生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(Kozbor，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，133：3001(1984)；和Brodeur等，《单克隆抗体生产技术和应用》(Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications)，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987))。
测定杂交瘤生长的培养基中针对抗原产生的单克隆抗体。优选通过免疫沉淀法或通过诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶连接的免疫吸附剂测定法(ELISA)这样的体外结合测定法来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
例如，可以通过Munson等在《生化分析》(Anal.Biochem.)，107：220(1980)中所述的斯卡查德分析来测定所述单克隆抗体的结合亲和性。
在鉴定产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过限制稀释过程亚克隆所述克隆并通过标准方法使其生长(Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于该目的的合适的培养基包括但不限于：例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以使所述的杂交瘤细胞在体内作为动物体内的腹水肿瘤而生长。
由所述亚克隆分泌的单克隆抗体适合通过诸如例如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析这样的常规抗体纯化过程分离自所述培养基、腹水液体或血清。
使用常规方法便利地分离并测序编码所述单克隆抗体的DNA(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。所述的杂交瘤细胞用作优选的这类DNA的来源。一旦分离，则可以将该DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不会另外产生抗体蛋白的骨髓瘤细胞这样的宿主细胞中，从而在重组宿主细胞内获得合成的单克隆抗体。有关在编码所述抗体的DNA细菌中的重组表达的综述文章包括：Skerra等，《最新免疫学观点》(Curr.Opinionin Immunol.)，5：256-262(1993)和Pluckthun，《免疫学综述》(Immunol.Revs.)，130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty等在《自然》(Nature)，348：552-554(1990)中所述技术生产的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等在《自然》(Nature)，352：624-628(1991)和Marks等在《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，222：581-597(1991)中分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的公开文献中描述了通过链改组(Marks等，《生物/技术》(Bio/Technology)，10：779-783(1992))以及组合转染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等，《核酸研究》(Nuc.Acids.Res.)，21：2265-2266(1993))来产生高亲和性(nM范围)人抗体。因此，这些技术是可使用的分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的另外的选择。
例如，还可以通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列(美国专利US 4,816,567；和Morrison等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl Acad.Sci.USA)，81：6851(1984))或通过与用于非免疫球蛋白多肽全部或部分编码序列的免疫球蛋白编码序列共价结合来修饰所述的DNA。
一般来说，这类免疫球蛋白多肽类取代了抗体的恒定区或它们取代了抗体的一种抗原结合位点的可变区，从而生成了包括一种对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一种对不同抗原具有特异性的抗原结合位点的嵌合二价抗体。
(iii)人源化抗体
本领域中已经描述了用于使非人抗体人源化的方法。优选人源化抗体带有从一种非人来源引入其中的一种或多种氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基通常称作“输入”残基，它们一般取自“输入”可变区。可以按照Winter和合作者的方法(Jones等，《自然》(Nature)，321：522-525(1986)；Riechmann等，《自然》(Nature)，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，《科学》(Science)，239：1534-1536(1988))主要通过用高变区序列取代相应的人抗体序列来进行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利US 4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变区已经被相应的来自非人种类的序列取代。实际上，人源化抗体一般是人抗体，其中某些高变区残基和可能的某些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
对用于制备人源化抗体的人可变区即轻链和重链的选择对减少免疫性来说是极为重要的。按照所谓的“最佳适合”方法，对已知人可变区序列的完整文库筛选啮齿动物抗体可变区的序列。随后与啮齿动物序列最为接近的人序列被公认为用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等，《免疫学杂志》(J.Immunol)，151：2296(1993)；Chothia等，《分子生物学杂志》(J.Mol Biol)，196：901(1987))。另一种方法使用来源于特定亚型的所有人抗体的轻链或重链共有序列的特定构架区。可以将相同的构架用于几种不同的人源化抗体(Carter等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89：4285(1992)；Presta等，《免疫学杂志》(J.Immunol)，151：2623(1993))。
另外重要的是人源化的抗体保留了对抗原的高亲和性和其它有利的生物特性。为了实现这一目的，按照一种优选的方法，通过分析亲本序列的方法和使用亲本和人源化序列的三维模型的各种概念的人源化产品制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的且是本领域技术人员所熟知的。可利用解释和展现所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构型的计算机程序。对这些显示的情况的检查要求分析所述残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。在这种方式中，可以选择FR残基且它由受体序列和输入序列组合，从而获得诸如对靶抗原具有增加的亲和性这样所需的抗体特性。一般来说，高变区残基直接或最主要涉及影响抗原的结合。
下面的实施例3描述了结合ErbB2并阻断ErbB受体的配体活化的典型人源化抗-ErbB2抗体的生产。本文特别关注的人源化抗体对阻断EGF、TGF-α和/或HRG介导的MAPK的活化基本上与鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)同样有效和/或对ErbB2的结合基本上与鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)同样有效。例如，本文的人源化抗体可以包括并入人可变重链区的非人高变区残基且可以进一步在选自由69H、71H和73H组成的组的一个位置上包括构架区(FR)取代，它使用Kabat等在《具有免疫意义的蛋白质序列》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)第5版、Public Health Service、NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)中所列的可变区编号系统。在一个实施方案中，所述的人源化抗体在69H、71H和73H中的两个或全部位置上包括FR取代。
本文关注的典型人源化抗体包括：可变重链区互补测定残基GFTFTDYTMX，其中X优选是D或S(SEQ ID NO：7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO：8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ ID NO：9)，它可以包括那些CDR残基的氨基酸修饰或不包括CDR残基的氨基酸修饰，例如其中所述的修饰基本上维持或改善所述抗体的亲和性。例如，所关注的抗体变体可以在上述可变重链CDR序列中带有约1-约7个或约5个氨基酸取代。可以通过例如如下所述的亲和力成熟来制备这类抗体变体。最优选的人源化抗体包括SEQ IDNO：4中的可变重链结构域氨基酸序列。
所述的人源化抗体可以包括：可变轻链结构域互补测定残基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO：10)；SASYX1X2X3，其中X1优选是R或L；X2优选是Y或E；且X3优选是T或S(SEQ ID NO：11)；和QQYYIYPYT(SEQ ID NO：12)，例如，还包括上述段落中的那些可变重链结构域CDR残基。这类人源化抗体可以包括上述CDR残基的氨基酸修饰，例如，其中所述的修饰基本上维持或改善抗体的亲和力。例如，所关注的抗体变体可以在上述可变轻链CDR序列中带有约1-约7个或约5个氨基酸取代。可以通过例如如下所述的亲和力成熟来制备这类抗体变体。最优选的人源化抗体包括SEQ ID NO：3中的可变轻链结构域氨基酸序列。
本申请还关注亲和成熟抗体，该抗体结合ErbB2并阻断ErbB受体的配体活化。亲本抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如一种分别包括SEQ ID Nos.3和4的可变轻链和/或重链序列的抗体(即变体574)。所述的亲和成熟抗体优选与具有优于鼠2C4或变体574的亲和力的ErbB2受体结合(例如正如使用ErbB2-胞外结构域(ECD)ELISA所评价的，亲和力的改善例如约2或约4倍至约100倍或约1000倍)。用于取代的典型可变重链CDR残基包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99或它们中两个或多个的混合物(例如这些残基中的2、3、4、5、6或7个的混合物)。用于改变的可变轻链CDR残基包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97或它们中的两个或多个的混合物(例如这些残基中的2-3个、4个、5个或高达10个的混合物)。
所关注的是各种形式的人源化或亲和成熟抗体。例如，所述的人源化或亲和成熟抗体可以是抗体片段，诸如Fab，它任选地与一种或多种胞毒剂缀合以便生成免疫缀合物。另一方面，所述的人源化或亲和成熟抗体可以是诸如完整IgG1抗体这样的完整抗体。
(iv)人抗体
作为对人源化的另一种选择，可生产人抗体。例如，目前能够生产在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下通过免疫接种产生人抗体的全部组成成分的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体的产生受到完全抑制。人种系免疫球蛋白基因在这类种系突变体小鼠中的排列转移使得在抗原攻击时产生人抗体。例如，参见：Jakobovits等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：2551(1993)；Jakobovits等，《自然》(Nature)，362：255-258(1993)；Bruggermann等，《免疫学之年》(Year in Immuno.)，7：33(1993)；以及美国专利US 5,591,669,5,589,369和5,545,807。
另一方面，可以将噬菌体展示技术(McCafferty等，《自然》(Nature)348：552-553(1990))用于在体外由来自未免疫接种供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因的所有组成成分生产人抗体和抗体片段。根据这项技术，将抗体V结构域基因以符合读框的方式克隆入诸如M13或fd这样的丝状噬菌体的主要或次要包被蛋白基因中并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为所述的丝状颗粒含有所述噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于所述抗体功能特性的选择还导致对编码显示出那些特性的抗体的基因进行选择。因此，所述噬菌体模拟B-细胞的某些特性。可以按照不同方式进行噬菌体展示；就其综述而言，例如参见Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，《结构生物学最新观点》(Current Opinion in Structural Biology)3：564-571(1993)。可以将几种来源的V-基因片段用于噬菌体展示。Clackson等(《自然》(Nature)，352：624-628(1991))从来源于免疫接种小鼠脾脏的V基因的小随机组合文库中分离不同排列的抗-噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫接种人供体的V基因的所有组成充分且基本上可以按照下列文献中所述的技术分离针对不同排列的抗原(包括自身抗原)的抗体：Marks等，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)；或Griffith等.，《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)12：725-734(1993).另外参见美国专利US 5,565,332和5,573,905。
如上所述，还可以用体外活化的B细胞生产人抗体(参见美国专利US 5,567,610和US 5,229,275)。
1998年6月30日授权的美国专利US 5,772,997和1997年1月3日公开的WO 97/00271中描述了人抗-ErbB2抗体。
(v)抗体片段
已经开发了用于生产抗体片段的各种技术。一般来说，通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生这些片段(例如，参见Morimoto等，《生物化学和生物物理学方法杂志》(Journal of Biochemical andBiophysical Methods)24：107-117(1992)；和Brennan等，《科学》(Science)，229：81(1985))。然而，目前可以通过重组宿主细胞直接生产这些片段。例如，所述的抗体片段可以分离自上述抗体噬菌体文库。另一方面，可以从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段并通过化学方法使之偶联成F(ab’)2片段(Carter等，《生物/技术》(Bio/Technology)10：163-167(1992))。按照另一种手段，F(ab′)-片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。用于生产抗体片段的其它技术对本领域技术人员来说是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是一种单链Fv片段(scFv)。参见：WO 93/16185；美国专利US 5,571,894；和美国专利US 5,587,458。例如，正如美国专利US5641870中所述，所述的抗体片段还可以是一种″线性抗体″。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。典型的双特异性抗体可以与ErbB2蛋白的两种不同表位结合。其它这类抗体可以使ErbB2结合位点与EGFR、ErbB3和/或ErbB4的结合位点结合。另一方面，抗ErbB2臂可以与结合诸如T-细胞受体分子(例如CD2或CD3)这样白细胞上的触发分子或诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD 16)这样针对IgG(FcγR)的Fc受体的臂结合，从而使细胞防御机制集中在表达ErbB2的细胞上。还可以将双特异性抗体用于使胞毒剂定位在表达ErbB2的细胞上。这些抗体具有ErbB2结合臂和结合胞毒剂的臂(例如皂草素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。可以将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO 96/16673中描述了一种双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRIII抗体且美国专利US 5,837,234中公开了一种双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRI抗体。双特异性抗-ErbB2/Fcα抗体如WO98/02463中所示。美国专利US 5,821,337中教导了一种双特异性抗-ErbB2/抗-CD3抗体。
用于制备双特异性抗体的方法在本领域中是公知的。全长双特异性抗体的传统生产方法基于对两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述的两链均具有不同的特异性(Millstein等，《自然》(Nature)，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，所以这些杂交瘤(quadromas)产生有潜力的10种不同抗体分子的混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的对这种正确分子的纯化是相当繁琐的且产率很低。相似的步骤公开在WO 93/08829和Traunecker等的《欧洲分子生物学协会杂志》(EMBO J.)，10：3655-3659(1991)中。
按照一种不同的手段，使带有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。这种融合优选与包括至少部分铰合部、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域进行。优选的是具有含有轻链结合必不可少的位点的存在于至少一种融合体中的第一重链恒定区(CH1)。将编码所述免疫球蛋白重链融合体且如果需要编码所述免疫球蛋白轻链的DNAs插入独立的表达载体并共转染入一种合适的宿主生物体。该过程为调节实施方案中三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性，此时用于构建的三种多肽链的不均等比例产生了最佳产率。然而，当相同比例的至少两种多肽链的表达产生高产率或当所述比例不具有特定意义时，能够在一种表达载体中插入用于两种或全部三种多肽链的编码序列。
在这种手段的一个优选的实施方案中，所述的双特异性抗体由在一个臂上带有第一种结合特异性的杂种免疫球蛋白重链和在另一臂上的杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。发现当仅在一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了一种便利的分离方式时，这种不对称结构有利于从不需要的免疫球蛋白链的组合中分离所需的双特异性化合物。这种手段公开在WO 94/04690中。就生产双特异性抗体的进一步详细描述而言，例如参见Suresh等，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，121：210(1986)。
按照美国专利US 5,731,168中所述的另一种手段，可以对抗体分子对之间的界面进行改造以便使得从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比达到最大值。优选的界面包括抗体恒定结构域中的至少部分CH3结构域。在这种方法中，用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一种抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二种抗体分子界面上生成与所述大侧链相同或相似大小的代偿“腔”。这一过程为增加超过诸如同二聚体这样的其它不需要的终产物的产率提供了机理。
双特异性抗体包括交联的或“异缀合物”抗体。例如，可以使异缀合物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使异缀合物中的另一种抗体与生物素偶联。例如，已经建议这类抗体使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利US 4,676,980)并用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以使用任意常规的交联方法制备异缀合物抗体。合适的交联剂和许多交联技术本领域中是众所周知的且公开在美国专利US 4,676,980中。
在文献中还描述了用于从抗体片段生产双特异性抗体的技术。例如，可以使用化学键合制备双特异性抗体。Brennan等在《科学》(Science)，229：81(1985)中描述了一种方法，其中以蛋白水解方式使完整抗体裂解而生成F(ab)2片段。在有二硫酚络合剂亚砷酸钠存在的情况下还原这些片段以便使邻位二硫酚保持稳定并防止形成分子间二硫键。然后使产生的Fab′片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接着用巯基乙胺还原而使Fab′-TNB衍生物之一重新转化成Fab′-硫醇并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合而形成所述的双特异性抗体。可以将产生的双特异性抗体用作对酶类进行选择性固定的活性剂。
近来的研究进展已经有利于直接从大肠杆菌中回收Fab′-SH片段，可以通过化学方式使之偶联而形成双特异性抗体。Shalaby等在《实验药物杂志》(J.Exp.Med.)，175：217-225(1992)中描述了完整人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的生产。各Fab′片段独立地分泌自大肠杆菌并在体外进行定向化学偶联而形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够与超表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合并引发人细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶物的裂解活性。
还描述了用于直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链生产了双特异性抗体。Kostelny等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，148(5)：1547-1553(1992)。通过基因融合使来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽类与两种不同抗体的Fab′部分连接。在铰合区使抗体同二聚体还原成单体且然后再氧化成抗体异二聚体。还可以将该方法用于生产抗体同二聚体。由Hollinger等在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：6444-6448(1993)中描述的″diabody″技术已经提供了用于制备双特异性抗体片段的另一种机理。这些片段包括通过一种接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述的接头过短以致于不能使相同链上的两个区之间配对。因此，迫使一种片段的VH和VL结构域与另一种片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报导了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，152：5368(1994)。
所关注的是带有两种以上化合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等《免疫学杂志》(J.Immunol.)147：60(1991)。
(vii)其它氨基酸序列修饰
所关注的是本文描述的抗-ErbB2抗体的氨基酸修饰。例如，需要的是改善所述抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。通过将合适的核苷酸改变引入抗-ErbB2抗体核酸或通过肽合成来制备抗-ErbB2抗体的氨基酸序列变体。这类修饰例如包括在抗-ErbB2抗体的氨基酸序列内缺失和/或插入和/或取代残基。进行缺失、插入和取代的任意组合产生最终的构建体，条件是最终的构建体具有所需的特性。这种氨基酸变化还可以改变抗-ErbB2抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数量或位置。
用于鉴定优选为诱变位置的抗-ErbB2抗体的某些残基或区的有用方法称作如Cunningham和Wells在《科学》(Science)，244：1081-1085(1989)中所述的″丙氨酸扫描诱变″。其中鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)且其被中性或带负电荷的氨基酸(大部分优选丙氨酸或聚丙氨酸)所取代而影响氨基酸与ErbB2抗原之间的相互作用。然后通过在取代位置上引入另一种或其它变体或对该取代位置引入另一种或其它变体来精修对取代表现出功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，尽管预定了引入氨基酸序列的位点，但是突变的性质本身不需要预定。例如，为了分析给定位点上突变的性质，在靶密码子或区上进行ala扫描或随机诱变并对所表达的抗-ErbB2抗体变体筛选所需的活性。
氨基酸序列插入包括从一个残基到含有100个或100个以上残基的多肽类的长度范围内的氨基-和/或羧基末端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的实例包括带有N-末端甲硫氨酰残基的抗-ErbB2抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗-ErbB2抗体分子的其它插入变体包括与抗-ErbB2抗体的N-或C-末端融合成的一种酶(例如ADEPT)或增加所述抗体的血清半衰期的多肽。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗-ErbB2抗体分子上带有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。用于取代诱变的最有意义的位点包括高变区，不过也关注FR改变。保守取代如表1中上标题″优选的取代″中所示。如果这类取代导致生物活性改变，那么可以引入表1中称作″典型取代″的更为主要的改变或进一步引入参照下面所述的氨基酸种类并筛选产物。
                         表1
原始残基 典型取代 优选的取代
 Ala(A) val；leu；ile  val
 Arg(R) lys；gln；asn  lys
 Asn(N) gln；his；asp，lys；arg  gln
 Asp(D) glu；asn  glu
 Cys(C) ser；ala  ser
 Gln(Q) asn；glu  asn
 Glu(E) asp；gln  asp
 Gly(G) ala  ala
 His(H) asn；gln；lys；arg  arg
 Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸  leu
 Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe  ile
 Lys(K) arg；gln；asn  arg
 Met(M) leu；phe；ile  leu
 Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr  tyr
 Pro(P) ala  ala
 Ser(S) thr  thr
 Thr(T) ser  ser
 Trp(W) tyr；phe  tyr
 Tyr(Y) trp；phe；thr；ser  phe
 Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸  leu
通过选择取代来完成所述抗体生物特性中的主要修饰，所选择的取代在其对下列方面的维持作用方面明显不同：(a)例如片状或螺旋状构型这样所述取代区域内多肽主链结构、(b)靶位点上分子的电荷或疏水性或(c)侧链大小。将天然出现的残基分成基于通常侧链特性的组：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链方向的残基：gly、pro；和
(6)芳香性：trp、tyr、phe。
非保守取代要求在许多这些类型中之一与另一种类型之间进行大量互换。
一般还可以用丝氨酸取代不涉及维持抗-ErbB2抗体正常构型的任意半胱氨酸残基以便改善所述分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将半胱氨酸键加入到所述抗体中以便改善其稳定性(特别是在所述抗体是诸如Fv片段这样的抗体片段的情况下)。
特别优选的取代变体类型包括取代亲本抗体的一个或多个高变区残基(例如人源化抗体或人抗体)。一般来说，为进一步研发而选择的所得变体已经具有了比产生它们的亲本抗体改善的生物特性。用于生产这类取代变体的便利方式包括使用噬菌体展示的亲和力成熟法。简单地说，使几个高变区位点(例如6-7个位点)发生突变而在各位点上产生所有可能的氨基酸取代。以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示由此产生的抗体变体作为与包装在各颗粒内的M 13 III型基因产物的融合体。然后如本文所公开的技术筛选所述噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以便鉴定显著提供抗原结合的高变区残基。另一方面或另外，可能有利的是分析抗原-抗体复合体的晶体结构以便鉴定所述抗体与人ErbB2之间的接触点。这类接触残基和邻近残基是按照本文阐述的技术进行取代的候选者。一旦产生了这类变体，就如本文所述对变体组进行筛选且为进一步开发而可以在一种或多种相关试验中选择具有优良特性的抗体。
另一种类型的抗体的氨基酸变体改变了该抗体的原始糖基化方式。所谓改变指的是使在所述抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分缺失和/或添加在所述抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化一般是N-连接的糖基化或O-连接的糖基化。N-连接糖基化指的是碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链结合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是用于使碳水化合物部分与天冬酰胺侧链进行酶结合的识别序列，其中X是除脯氨酸以外的任意氨基酸。因此，在多肽中这些三肽序列的存在生成了可能的糖基化位点。O-连接的糖基化指的是糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸、大多数情况下通常是丝氨酸或苏氨酸结合，不过，也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列而使得它含有上述三肽序列中的一种或多种来便利地完成向所述抗体中添加糖基化位点的步骤(就N-连接的糖基化位点而言)。这种改变还可以通过向原始抗体的序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基进行取代来进行(就O-连接的糖基化位点而言)。
通过本领域中公知的各种方法来制备编码抗-ErbB2抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(就天然出现的氨基酸序列变体而言)或通过寡核苷酸介导的(或位点定向)诱变、PCR诱变和早期制备的变体或非变体形式的抗-ErbB2抗体的弹夹诱变进行制备。
例如，就效应子功能而言需要修饰本发明的抗体，从而增加抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这一过程可以通过将一种或多种氨基酸取代引入所述抗体的Fc区而实现。另一方面或另外，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，由此使得在该区中形成链间二硫键。由此产生的同二聚化抗体可能具有改善的摄入能力和/或提高的补体介导的杀伤细胞能力和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，《药物实验杂志》(J.Exp Med)176：1191-1195(1992)和Shopes，B.《免疫学杂志》(J.Immunol.)148：2918-2922(1992)。还可以使用Wolff等在《癌症研究》(CancerResearch)53：2560-2565(1993)中所述的异双功能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚化抗体。另一方面，可以改造具有双Fc区且由此可能具有增强的补体溶解和ADCC能力的抗体。参见Stevenson等，《抗癌药物设计》(Anti-Cancer Drug Design)3：219-230(1989)。
为了增加抗体的血清半衰期，例如可以如美国专利US 5,739,277中所述将补救受体结合表位引入所述抗体(尤其是抗体片段)。本文所用的术语″补救受体结合表位″指的是IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)中Fc区的表位，它对于增加IgG分子的体内血清半衰期来说是必不可少的。
(viii)对具有所需特性的抗体的筛选
用于生产抗体的技术已经如上所述。如果需要，可以进一步选择具有某些生物特性的抗体。
为了鉴定阻断ErbB受体的配体活化的抗体，可以测定所述抗体阻断ErbB配体结合表达ErbB受体的细胞的能力(例如在与另一种ErbB受体缀合的过程中，所关注形式的ErbB受体形成ErbB异-寡聚体)。例如，可以将天然表达或转染以表达ErbB异-寡聚体的ErbB受体的细胞与所述抗体一起温育且然后使之与标记的ErbB配体接触。接着可以评价ErbB异-寡聚体中抗-ErbB2抗体阻断配体结合ErbB受体的能力。
例如，可以按照基本上如下面的实施例1中所述的24-孔平板方式使用冰上的单层MCF7培养物通过抗-ErbB2抗体抑制HRG与MCF7乳腺肿瘤细胞系的结合。可以向各孔中添加抗-ErbB2单克隆抗体并温育30分钟。然后可以添加125I-标记的rHRGβ1177-224(25pm)并可以继续温育4-16小时。可以制备剂量反应曲线且可以对所关注的抗体计算IC50值。在一个实施方案中，阻断ErbB受体的配体活化的抗体具有的用于抑制HRG与MCF7细胞结合的IC50在本试验中约为50nM或50nM以下、更优选10nM或10nM以下。如果所述抗体是诸如Fab片段这样的抗体片段，那么在本试验中用于抑制HRG与MCF7细胞结合的IC50例如可以约为100nM或100nM以下、更优选50nM或50nM以下。
另一方面或另外，可以评价抗-ErbB2抗体阻断存在于ErbB异-寡聚体中的ErbB受体的ErbB配体刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可以将以内源性方式表达ErbB受体或转染以表达它们的细胞与所述抗体一起温育且然后使用抗磷酸酪氨酸单克隆(可以与检测标记结合)检测其ErbB配体依赖性酪氨酸磷酸化活性。美国专利US5,766,863中所述的激酶受体活化测定法也可以用来测定ErbB受体活化和通过抗体对该活性的阻断。
在一个实施方案中，可以按照基本上如下面的实施例1中所述筛选在MCF7细胞中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抗体。例如，可以将MCF7细胞平板固定在24-孔平板中且可以将对ErbB2的单克隆抗体添加到各孔中并在室温下温育30分钟；然后可以将rHRGβ1177-244添加到各孔中至终浓度为0.2nM并可以将温育过程继续进行8分钟。可以从各孔中对培养基抽吸并可以通过添加100μl的SDS样品缓冲液(5％SDS、25mM DTT和25mM Tris-HCI，pH6.8)来终止反应。可以对各样品(25μl)在4-12％梯度凝胶(Novex)上进行电泳且然后以电泳方式转到聚偏二氟乙烯膜上。可以展开抗磷酸酪氨酸(以1μg/ml)免疫印迹且可以通过反射光密度测定法对Mr～180,000下的主要反应带的强度进行定量。在本测定法中所选择的抗体显著抑制对p180酪氨酸磷酸化的刺激作用达到约为对照品的0-35％。可以制备如反射光密度测定法所测定的用于抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的剂量反应曲线且可以计算所关注抗体的IC50。在一个实施方案中，阻断ErbB受体的配体活化的抗体具有的用于抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC50在本测定法中约为50nM或50nM以下、更优选10nM或10nM以下。如果所述抗体是诸如Fab片段这样的抗体片段，那么在本测定法中用于抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC50例如可以约为100nM或100nM以下、更优选50nM或50nM以下。
例如，基本上如Schaefer等在《癌基因》(Oncogene)15：1385-1394(1997)中所述，还可以评价所述抗体对MDA-MB-175细胞的生长抑制作用。按照这项试验，用抗-ErbB2单克隆抗体(10μg/mL)将MDA-MB-175细胞处理4天并用结晶紫染色。与抗-ErbB2抗体一起温育可以显示出类似于通过单克隆抗体2C4所展示出的对这种细胞系的生长抑制作用。在另一个实施方案中，外源性HRG不会显著使这种抑制作用发生逆转。优选在有和没有外源性HRG存在的情况下，所述抗体能够使对MDA-MB-175细胞的细胞增殖的抑制作用达到超过单克隆抗体4D5对MDA-MB-175细胞的细胞增殖的抑制作用的程度(且可以使这种抑制作用达到超过单克隆抗体7F3所产生的抑制作用的程度)。
在一个实施方案中，正如诸如实施例2中所述共免疫沉淀实验中所测定的，所关注的抗-ErbB2抗体可以阻断MCF7和SK-BR-3细胞中ErbB2与ErbB3的heregulin依赖性结合，这种阻断作用基本上比单克隆抗体4D5更为有效且可能基本上比单克隆抗体7F3更为有效。
另一方面或另外，正如下面的实施例4中所显示的，可以测定所述抗体阻断EGF、TGF-α和/或HRG介导的对促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化的能力。可以选择对EGF、TGF-α和/或HRG介导的对促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的阻断作用程度超过HERCEPTIN或单克隆抗体4D5的抗体。此外，所关注抗体对EGF、TGF-α和/或HRG介导的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的阻断程度超过单克隆抗体7F3。
为了鉴定生长抑制性抗-ErbB2抗体，可以筛选抑制超表达ErbB2的癌细胞生长的抗体。在一个实施方案中，所选择的生长抑制性抗体能够在约0.5-30μg/ml的抗体浓度下将细胞培养物中生长的SK-BR-3细胞抑制约20-100％且优选抑制约50-100％。为了鉴定这类抗体，可以进行美国专利US 5,677,171中所述的SK-BR-3试验。按照该试验，使SK-BR-3细胞在1∶1的F12和DMEM培养基混合物中生长，所述培养基补充了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素链霉素。将SK BR-3细胞以20,000个细胞平板固定在35mm细胞培养皿上(2mls/35mm培养皿)。每个培养皿中添加0.5-30μg/ml的抗ErbB2抗体。6天后，使用电子COULTERTM细胞计数器对与未处理细胞相比的细胞数量进行计数。可以将对SK-BR-3细胞生长抑制约20-100％或约50-100％的那些抗体选作生长抑制性抗体。
为了选择诱发细胞死亡的抗体，可以评价例如通过PI、锥虫蓝或7AAD摄取所显示的与对照品相比较的膜完整性的损耗。优选的试验是使用BT474细胞进行的PI摄取试验。按照该试验，在下面的Dulbecco′s改进的Eagle培养基(D-MEM)：补充了10％加热失活的FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺的Ham’s F-12(50∶50)中培养BT474细胞(它们可以获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(Rockville，MD))。(因此，本试验在没有补体和免疫效应细胞存在的情况下进行)。以3×106/皿的密度将BT474细胞接种在100×20mm培养皿上并使之粘附过夜。然后除去培养基并用单独的新鲜培养基或含有10μg/ml的适宜单克隆抗体的培养基取代。使细胞温育3天的时间期限。在每次处理后，用PBS洗涤单层并通过胰蛋白酶消化进行分离。然后在4℃下将细胞以1200rpm离心5分钟、使沉淀悬浮于3ml冰冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH7.4，140mM NaCl，2.5mM CaCl2)中并等分入35mm加盖滤过器的12×75管(1ml/管，3管/治疗组)以用于除去细胞团。然后各管接受PI(10μg/ml)。可以使用FACSCANTM流式细胞器和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可以将如通过PI摄取测定的诱发具有统计显著性水平的细胞死亡的那些抗体选作诱发细胞死亡的抗体。
为了选择诱发编程性细胞死亡的抗体，应用使用BT474细胞进行的膜联蛋白结合试验。如上述段落中所述培养BT474细胞并接种在培养皿上。然后除去培养基并用单独的新鲜培养基或含有10μg/ml的适宜单克隆抗体的培养基取代。3天的温育期后，用PBS洗涤单层并通过胰蛋白酶消化进行分离。然后如上所述将细胞离心、重新悬浮于Ca2+结合缓冲液中并等分入试管以用于细胞死亡试验。各管随后接受标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。可以使用FACSCANTM流式细胞器和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可以将诱发与对照品相比具有统计显著性水平的膜联蛋白结合的那些抗体选作诱发编程性细胞死亡的抗体。
除膜联蛋白结合试验外，还应用使用BT474细胞进行的DNA染色试验。为了进行该试验，在37℃下将已经如上述两段中所述用所关注抗体处理的BT474细胞与9μg/ml HOECHST 33342TM一起温育2小时、然后在使用MODFIT LTTM软件(Verity Software House)的EPICS ELITETM流式细胞器(Coulter Corporation)上进行分析。可以使用该试验将诱发编程性细胞死亡细胞的百分比改变超过未处理细胞(达100％编程性细胞死亡的细胞)2倍或2倍以上(且优选3倍或3倍以上)的抗体选作前编程性细胞死亡的抗体。
为了筛选与通过所关注抗体结合的ErbB2上的表位结合的抗体，可以进行一种诸如在《抗体实验指南》(Antibodies，A LaboratoryManual)、Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和David Lane编辑(1988)中所述的常规交联试验。另一方面或另外，可以通过本领域中公知的方法进行表位作图(例如，参见本文中的附图1A和1B)。
(ix)免疫缀合物
本发明还涉及使用免疫缀合物的疗法，所述的免疫缀合物包括与诸如化疗剂、毒素(例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即一种放射性缀合物)缀合的抗体。
已经在上述描述了用于生产这类免疫缀合物的化疗剂。
本文还关注抗体和诸如加利车霉素、美登素(美国专利US5,208,020)单瑞孢菌毒素(trichothene)和CC1065这样的一种或多种小分子毒素的缀合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述抗体与一种或多种美登素分子结合(例如约1-约10个美登素分子/抗体分子)。例如，可以使美登素转化成May-SS-Me，可以将May-SS-Me还原成May-SH3并与修饰的抗体反应(Chari等《癌症研究》(Cancer Research)52：127-131(1992))而生成美登木素生物碱-抗体的免疫缀合物。
另一种所关注的免疫缀合物包括与一种或多种加利车霉素分子缀合的抗-ErbB2抗体。加利车霉素族抗生素能够在皮克摩尔以下浓度下产生双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θ1 I(Hinman等《癌症研究》(Cancer Research)53：3336-3342(1993)和Lode等《癌症研究》(Cancer Research)58：2925-2928(1998))。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美国商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单瑞孢菌毒素。例如，参见1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明进一步关注在抗体与具有溶核活性的化合物之间形成的免疫缀合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶、诸如脱氧核糖核酸酶：DNase)。
将各种放射性同位素用于生产放射性缀合的抗-ErbB2抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可以使用各种双功能蛋白质偶联剂制备抗体与胞毒剂的缀合物，所述的偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨基酯类的双功能衍生物(诸如盐酸己二酰亚胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛(glutareldehyde))、双-叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2，6-二异氰酸甲代亚苯酯)和双-活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等在《科学》(Science)238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰基苄基-3-亚甲二乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种用于缀合放射性核苷酸与抗体的典型螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是有利于在细胞中释放细胞毒性药物的“可裂解接头”。例如，可以使用遇酸不稳定的接头、肽酶敏感性接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等《癌症研究》(Cancer Research)52：127-131(1992))。
另一方面，例如可以通过重组技术或肽合成法制备包括抗-ErbB2抗体与胞毒剂的融合蛋白。
在另一个实施方案中，可以使所述抗体与用于预靶向肿瘤的“受体”(诸如链霉抗生物素)缀合，其中将所述的抗体-受体缀合物给予患者，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物且然后给予与胞毒剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
(x)抗体依赖性酶介导的前体药物疗法(ADEPT)
还可以通过使所述抗体与将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转化成活性抗癌药物的前体药物活化酶缀合而将本发明的抗体用于ADEPT。例如，参见WO 88/07378和美国专利US4,975,278。
用于ADEPT的免疫缀合物的酶成分包括能够以这类方式对前体药物起作用以便将其转化成其更具活性的细胞毒性形式的任意酶。
用于本发明方法的酶类包括但不限于：用于将含磷酸盐的前体药物转化成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含硫酸盐的前体药物转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将非毒性的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶类，诸如沙雷菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)，它们用于将含肽的前体药物转化成游离药物；用于转化含有D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰基羧肽酶类；碳水化合物裂解酶类，诸如用于将糖基化前体药物转化成游离药物的对半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将用β-内酰胺衍生的药物转化成游离药物的β-内酰胺酶；以及青霉素酰胺酶类，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，它们用于将在胺氮上分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转化成游离药物。另一方面，可以将具有酶活性的抗体、也称作“抗体酶”用于将本发明的前体药物转化成游离的活性药物(例如，参见Massey等《自然》(Nature)328：457-458(1987)。可以如本文所述制备抗体-抗体酶缀合物以便将抗体酶转运至肿瘤细胞群体。
可以通过本领域中众所周知的技术、诸如使用上述异双功能交联试剂使本发明的酶类与抗-ErB2抗体共价结合。另一方面，可以使用本领域中众所周知的重组DNA技术来构建至少包括与本发明酶的至少一种功能活性部分连接的本发明抗体的抗原结合区的融合蛋白。
(xi)其它抗体的修饰
本文关注对所述抗体进行的其它修饰。例如，可以使所述抗体与例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯类或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物这样的各种非蛋白质聚合物之一连接。还可以在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中捕获所述抗体、在胶体药物转运系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒或纳米胶囊)中捕获所述抗体或在粗乳状液中捕获所述抗体。这类技术公开在《Remington氏药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)第16版、Oslo，A.Ed.(1980)中。
还可以将本文公开的抗-ErbB2抗体配制成免疫脂质体。通过本领域中所公知的方法来制备含有所述抗体的脂质体，所公知的方法诸如下列文献中所述：Epstein等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：3688(1985)；Hwang等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4030(1980)；美国专利US 4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公开的WO97/38731。具有增加的循环时间的脂质体公开在美国专利US 5,013,556中。
可以通过使用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物的反相蒸发法来生产特另有用的脂质体。通过带有精细孔径大小的滤膜挤压脂质体以产生具有所需直径的脂质体。可以如Martin等在《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)257：286-288(1982)中所述通过二硫化物互换反应使本发明的抗体的Fab，片段与该脂质体缀合。在该脂质体中可以含有化疗剂或不含化疗剂。参见Gabizon等《国家癌症研究所杂志》(J.National Cancer Inst.)81(19)1484(1989)。III.药物制剂
通过将具有所需纯度的抗体与任意药物上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备储存用的冻干制剂或水溶液形式的用于本发明的治疗用制剂(《Remington氏药物科学》(Remington’s PharmaceuticalScience)第16版、Oslo，A.Ed.(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度上对接受者来说是无毒性的且包括：诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸这样的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯类，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽类；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子，诸如钠；金属螯合物(例如Zn-蛋白质螯合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选的冻干抗ErbB2抗体制剂描述在WO97/04801中，特别将该文献引入本文作为参考。
本文所述的制剂还可以含有治疗特定适应证必不可少的一种以上的活性化合物、优选含有那些具有不会彼此产生不利影响的互补活性的化合物。例如，需要在一种制剂中进一步提供与EGFR、ErbB2 (例如结合ErbB2上的不同表位的抗体)、ErbB3、ErbB4或血管内皮因子(VEGF)结合的抗体。另一方面或另外，所述的组合物可以进一步包括化疗剂、胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。这类分子适合以对所述目的有效的组合量存在。
还可以在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊、例如分别在羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中捕获所述活性组分、在胶体药物转运系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒或纳米胶囊)中捕获所述活性组分或在粗乳状液中捕获所述活性组分。这类技术公开在《Remington氏药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)第16版、Oslo，A.Ed.(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，这种基质是成形的制品形式，例如薄膜或微囊。缓释基质的实例包括聚酯类、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯类(美国专利US 3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)这样可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过经无菌滤膜的过滤而便利地完成。IV.用抗-ErbB2抗体的疗法
根据本发明，将抗-ErbB2抗体用于治疗前列腺癌，诸如雄激素非依赖性前列腺癌或雄激素依赖性前列腺癌。如果所治疗的癌症是雄激素非依赖性前列腺癌或雄激素依赖性前列腺癌，那么可以使用例如如如上所述的各种测定法中的任意一种来评价对雄激素(例如雄酮(andosterone)或睾酮)和/或其关连受体在肿瘤中的表达。另一方面或另外，患者可以被诊断患有雄激素非依赖性前列腺癌是由于他们不再对抗雄激素疗法起反应，而患者被诊断为患有雄激素依赖性前列腺癌可能是他对抗雄激素疗法有反应。这种癌症一般包括表达ErbB2的细胞，使得抗-ErbB2抗体能够与之结合。当这种癌症的特征可能在于对ErbB2受体的超表达时，本申请进一步提供了一种用于并不认为是超表达ErbB2的癌症的癌症的治疗方法。为了测定癌症中ErbB2的表达，应用各种诊断/预后测定法。在一个实施方案中，可以通过IHC、例如使用HERCEPTEST(Dako)来分析ErbB2的超表达。可以对来源于肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片进行IHC检测且使之符合如下的ErbB2蛋白质染色强度标准：得分为0
没有观察到染色或在少于10％的肿瘤细胞中观察到了膜的染色。得分为1+
在10％以上的肿瘤细胞中检测到了模糊/几乎不可察觉的膜染色。细胞仅在其部分膜上得到了染色。得分为2+
在10％以上的肿瘤细胞中观察到了由弱到中度完全的膜染色。得分为3+
在10％以上的肿瘤细胞中观察到了中度到强度的完全膜染色。
那些对ErbB2超表达评价具有0或1+得分的肿瘤的特征可能并不在于超表达ErbB2，而具有2+或3+得分的那些肿瘤的特征可能在于超表达ErbB2。
另一方面或另外，可以对福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织进行诸如INFORMTM(由Ventana，Arizona销售)或PATHVISIONTM(Vysis，Illinois)这样的FISH测定以便测定肿瘤中ErbB2超表达的程度(如果存在)。
本文所治疗的前列腺癌可能具有一种ErbB受体、例如EGFR过度活化的特征。这类过度活化可能是由于ErbB受体或ErbB配体的超表达或产生增加所导致的。在本发明的一个实施方案中，进行一种诊断或预后试验以便测定患者的癌症的特征是否在于ErbB受体的过度活化。例如，可以测定癌症中ErbB基因的扩增和/或ErbB受体的超表达。用于测定这类扩增/超表达的各种测定法在本领域中是可得到的且包括如上所述的IHC、FISH和排出抗原测定法。另一方面或另外，可以按照公知步骤测定诸如TGF-α这样的ErbB配体在肿瘤细胞中或与肿瘤结合的ErbB配体的水平。这类测定法可以检测所测试样品中的蛋白质和/或编码该蛋白质的核酸。在一个实施方案中，可以使用免疫组织化学法(IHC)测定肿瘤中的ErbB配体的水平；例如，参见Scher等《临床癌症研究》(Clin.Cancer Research)1：545-550(1995)。另一方面或另外，例如通过FISH、DNA印迹法或PCR技术可以评价所测试样品中编码ErbB配体的核酸的水平。
此外，可以使用体内诊断试验法、例如通过给予与所检测分子结合并用检测标记(例如放射性同位素)标记的分子(诸如抗体)并在体外扫描患者以用于标记的定位来评价ErbB受体或ErbB配体的超表达或扩增。
在某些实施方案中，对患者给予包括与胞毒剂缀合的抗-ErbB2抗体的免疫缀合物。优选免疫缀合物和/或与之结合的ErbB2蛋白由细胞摄入，从而导致所述免疫缀合物在杀伤它所结合的肿瘤细胞中的治疗功效增加。在一个优选的实施方案中，胞毒剂靶向或干扰肿瘤细胞中的核酸。这类胞毒剂的实例包括美登木素生物碱、加利车霉素、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
按照公知方法、诸如例如作为大丸剂的静脉内给药或通过在一段时间期限内连续输注、通过肌内、腹膜内、脑脊髓内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径来对患者给予抗-ErbB2抗体或免疫缀合物。优选通过静脉内或皮下给予所述抗体。
可以将其它治疗方案与给予抗-ErbB2抗体的方案合并。这种联合给药包括使用独立的制剂或单一药物制剂的共同给药和依次连续给药，其中优选给药是在一段时间期限，同时使两种(或全部)活性剂同时发挥其生物活性。
在一个优选的实施方案中，用两种不同的抗-ErbB2抗体治疗患者。例如，可以用第一种阻断ErbB受体的配体活化的抗-ErbB2抗体或具有单克隆抗体2C4生物特性的抗体以及第二种属于生长抑制性抗ErbB2抗体(例如HERCEPTIN)或诱发超表达ErbB2的细胞的编程性细胞死亡的抗-ErbB2抗体(例如7C2、7F3或其人源化变体)来治疗患者。优选这类联合疗法产生协同的治疗作用。
还需要将所述抗-ErbB2抗体或多种抗-ErbB2抗体与针对另一种肿瘤相关抗原的抗体联合给药。例如，在这种情况中所述的另一种抗体可以与，例如，EGFR、ErbB3、ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)结合。
在一个实施方案中，本发明的治疗方法包括联合给予抗-ErbB2抗体(或多种抗-ErbB2抗体)与一种或多种化疗剂或生长抑制剂的步骤、包括共同给予不同化疗剂的混合物的步骤。优选的化疗剂包括紫杉烷类(诸如紫杉醇和docetaxel)和/或蒽环类抗生素。可以按照制造商的说明或如本领域技术人员根据经验所确定的方法使用这类化疗剂的制剂和给药方案。用于这类化疗的制剂和给药方案还描述在《化疗服务》(Chemotherapy Service)编辑，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中。
可以将所述抗体与下列物质联用：抗激素化合物，例如抗雌激素化合物、诸如他莫昔芬；抗孕酮、诸如奥那司酮(参见EP 616 812)；或抗雄激素，诸如氟他胺，所使用的剂量是这类分子的已知剂量。如果所治疗的癌症是雄激素非依赖性癌症，那么患者可以预先进行抗雄激素治疗，而在癌症变成雄激素非依赖性癌症后，可以对患者给予抗-ErbB2抗体(和本文所述的任意其它活性剂)。
有时，可能有利的是对患者共同给予心脏保护剂(用于预防或缓解与治疗相关的心肌功能障碍)或一种或多种细胞因子。除上述治疗方案外，还可以对患者实施手术除去癌细胞和/或放疗。任意上述共同给予的活性剂的合适剂量是那些目前使用的剂量且可以因所述活性剂与抗-ErbB2抗体的联合作用(协同作用)而使该剂量降低。
为了预防或治疗疾病，抗体的合适剂量取决于如上所述的所治疗疾病的类型、严重程度和疾病的病程、是因预防目的还是因治疗目的给予所述抗体、以前的疗法、患者的临床病史和对所述抗体的反应以及参与护理的临床医师的自行处理的能力。一度或在一系列治疗方法中适合将所述抗体给予患者。随着疾病的类型和严重程度的不同，例如，无论是通过一次或多次的单独给药还是通过连续输注，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗体是用于对患者给药的起始候选剂量。典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或100mg/kg以上的范围，这取决于上述因素。为了在几天或更长的时间内反复给药，随着病情的不同，可以持续进行治疗，直到对疾病症状的所需抑制作用发生为止。优选的剂量方案包括给予约4mg/kg的起始负荷剂量、随后给予每周约2mg/kg抗-ErbB2抗体的维持剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法可以便利地监测该疗法的进展。
除对患者给予抗体蛋白外，本申请还关注通过基因疗法给予抗体。表达方式“给予治疗有效量的抗体”包括这类编码所述抗体的核酸的给药。例如，参见1996年3月14日公开的WO96/07321，该文献涉及产生胞内抗体的基因疗法的应用。
存在两种使所述核酸(可以包含在载体中或不包含在载体中)进入患者细胞的主要手段、即体内和体外手段。为了进行体内转运，通常将核酸直接注入患者需要抗体的部位。为了进行体外治疗，取出患者的细胞、将核酸导入这些分离的细胞并将修饰的细胞直接给予患者或例如包裹在植入患者的多孔膜内(例如，参见美国专利US 4,892,538和US 5,283,187)。存在将核酸导入活细胞的各种技术。这些技术根据是将所述核酸转入在体外培养的细胞还是所用宿主的体内细胞的不同而改变。适合于在体外将核酸转入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。体外转运所述基因通常使用的载体是反录病毒。
目前优选的体内核酸转运技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、单纯疱疹I型病毒或与腺相关的病毒)和基于脂类的系统(例如，所用的用于脂类-介导的基因转移的脂类是DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行转染。在某些情况中，需要使核酸来源中含有靶向靶细胞的活性剂，诸如对细胞表面的膜蛋白或靶细胞具有特异性的抗体、对靶细胞上的受体的配体等。如果使用脂质体，那么可以将结合与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质用于靶向和/或促进摄取，例如用于特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段、用于在循环中进行摄入的蛋白质的抗体和靶向胞内定位和增加胞内半衰期的蛋白质。例如在下列文献中描述了受体介导的胞吞技术：Wu等，《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)262：4429-4432(1987)；和Wagner等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：3410-3414(1990)。就对目前已知的基因制备和基因疗法的方案的综述而言，参见Anderson等的《科学》(Science)256：808-813(1992)。另外参见WO93/25673和其中引用的参考文献。V.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于治疗前列腺癌的物质的制品。该制品包括容器和在容器上或贴在容器上的标签或包装说明书。合适的容器例如包括瓶、小瓶、注射器等。该容器可以由诸如玻璃或塑料这样的各种物质制成。该容器中保存有有效治疗疾病的组合物且可以带有无菌入口(例如该容器可以是一种静脉内用溶液包或带有皮下注射针头刺入塞的小瓶)。在所述组合物中至少一种活性剂是抗-ErbB2抗体。标签或包装说明书表示该组合物用于治疗前列腺癌、雄激素非依赖性前列腺癌或雄激素依赖性前列腺癌。此外，该制品可以包括：(a)包含有组合物的第一种容器，其中所述组合物包括结合ErbB2并抑制超表达ErbB2的癌细胞生长的第一种抗体；和(b)包含有组合物的第二种容器，其中所述组合物包括结合ErbB2并阻断ErbB受体的配体活化的第二种抗体。本发明该实施方案中的制品可以进一步包括包装说明书，它表示可以将第一种和第二种抗体组合物用于治疗前列腺癌。另一方面或另外，该制品可以进一步包括第二种(或第三种)容器，该容器中包括药物上可接受的缓冲液诸如制菌注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、林格液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括商品或根据用户观点所需的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。VI.材料的寄存
已经将下列杂交瘤细胞系寄存在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA(ATCC)：抗体名称               ATCC号              寄存日7C2                   ATCC HB-12215    1996年10月17日7F3                   ATCC HB-1221     1996年10月17日4D5                   ATCC CRL 10463   1990年5月24日2C4                   ATCC HB 12697    1999年4月8日
通过下面的非限制性实施例来进一步具体地解释本发明。特别将本说明书中所有引用的文献的公开内容引入本文作为参考。
                      实施例1
            单克隆抗体2C4的生产和特征记述
如Fendly等在《癌症研究》(Cancer Research)50：1550-1558(1990)中所述生产与ErbB2胞外结构域特异性结合的鼠单克隆抗体2C4、7F3和4D5。简单地说，用含有25mM EDTA的磷酸缓冲盐水收集如Hudziak等在《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))84：7158-7163(1987)中所述生产的NIH 3T3/HER2-3400细胞(表达约1×10 ErbB2个分子/细胞)并用于给BALB/c小鼠进行免疫接种。在第0、2、5和7周给小鼠经腹膜内注射溶于0.5ml PBS中的107个细胞。在第9和第13周时给带有免疫沉淀的32P-标记的ErbB2的抗血清的小鼠经腹膜内注射麦胚凝集素-琼脂糖(WGA)纯化的ErbB2膜抽提物。在该步骤后经静脉内注射0.1ml的ErbB2制备物并使脾细胞与小鼠骨髓瘤系X63-Ag8.653融合。通过ELISA和免疫沉淀法对杂交瘤上清液筛选与ErbB2的结合。
通过竞争性结合分析来测定单克隆抗体4D5、7F3和2C4所结合的ErbB2表位(Fendly等《癌症研究》(Cancer Research)50：1550-1558(1990))。通过使用用于对荧光进行定量的PANDEXTM筛选机对完整细胞的直接荧光来对抗体进行交叉阻断研究。使用建立的方法使各单克隆抗体与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合(Wofsy等《细胞免疫学的筛选方法》(Selected Methods in Cellular Immunology)，p.287，Mishel和Schiigi(编辑)San Francisco：W.J.Freeman Co.(1980))。使成片单层的NIH3T3/HER2-3400细胞胰蛋白酶化、洗涤一次并以1.75×106个细胞/ml重新悬浮于含有0.5％牛血清清蛋白(BSA)和0.1％NaN3的冷PBS中。加入终浓度为1％的乳胶颗粒(IDC，Portland，OR)以便减少PANDEXTM板膜的阻塞。将细胞混悬液20μl和20μl的纯化单克隆抗体(100μg/ml-0.1μg/ml)加入到PANDEXTM板的孔中并在冰上温育30分钟。将预定稀释成20μl的FITC-标记的单克隆抗体加入到各孔中、温育30分钟、洗涤并通过PANDEXTM对荧光进行定量。如果与无关单克隆抗体对照品相比彼此对缀合的阻断达50％或50％以上，那么认为单克隆抗体共有一种表位。在本实验中，单克隆抗体4D5、7F3和2C4分别被赋予了表位I、G/F和F。
使用乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3评价单克隆抗体2C4、7F3和4D5的生长抑制特性(参见Hudziak等《细胞分子生物学》(Molec.Cell.Biol.)9(3)：1165-1172(1989))。简单地说，通过使用0.25％(体积/体积)的胰蛋白酶分离SK-BR-3细胞并以4×105个细胞/ml的密度悬浮于完整培养基中。将100μl(4×104个细胞)的等分样品平板固定入96-孔微量稀释平板、使细胞粘附且然后加入100ul单独的培养基或含有单克隆抗体(终浓度为5μg/ml)的培养基。72小时后，用PBS(pH7.5)将平板洗涤两次、用结晶紫(0.5％的甲醇溶液)染色并如Sugarman等在《科学》(Science)230：943-945(1985)中所述分析相对细胞增殖情况。与使用单克隆抗体4D5所达到的约56％的抑制率相比，单克隆抗体2C4和7F3对SK-BR-3相对细胞增殖的抑制率分别达到约为20％和约38％。
评价单克隆抗体2C4、4D5和7F3抑制来自MCF7细胞的完整细胞裂解物的Mr 180,000范围内的蛋白质的HRG-刺激的酪氨酸磷酸化的能力(Lewis等《癌症研究》(Cancer Research)56：1457-1465(1996))。据报导MCF7细胞表达所有已知的ErbB受体，但表达水平相对较低。由于ErbB2、ErbB3和ErbB4具有几乎相同的分子大小，所以在通过蛋白质印迹分析评价完整细胞裂解物时不能够辨别该蛋白质是否正在进行酪氨酸磷酸化。然而，这些细胞对HRG的酪氨酸磷酸化试验来说是理想的，这是因为在所用的试验条件下，在没有外源性添加的HRG存在的情况下，它们表现出的Mr 180,000范围内酪氨酸磷酸化蛋白质的水平低至不可检测到的水平。
将MCF7细胞平板固定入24-孔平板并向各孔中加入对ErbB2的单克隆抗体且在室温下温育30分钟；然后向各孔中添加rHRGβ1177-244至终浓度为0.2nM并将温育持续进行8分钟。从各孔中给培养基谨慎抽吸并通过添加100μl的SDS样品缓冲液(5％SDS、25mM DTT和25mM Tris-HCI，pH6.8)而终止反应。使各样品(25μl)进行4-12％梯度凝胶(Novex)电泳且然后以电泳方式转移到聚偏氟乙烯膜上。接着如上所述(Holmes等《科学》(Science)256：1205-1210(1992)；Sliwkowski等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)269：14661-14665(1994))，展开抗磷酸酪氨酸(4G10，来自UBI，以1μg/ml使用)免疫印迹并通过反射光密度测定法对Mr～180,000下的主要反应带的强度进行定量。
单克隆抗体2C4、7F3和4D5显著抑制了Mr180,000下HRG诱发的酪氨酸磷酸化信号的产生。在没有HRG的情况下，这些抗体中没有一种能够刺激Mr180,000范围内蛋白质的酪氨酸磷酸化。此外，这些抗体不与EGFR(Fendly等《癌症研究》(Cancer Research)50：1550-1558(1990))、ErbB3或ErbB4发生交叉反应。抗体2C4和7F3对HRG刺激p180酪氨酸磷酸化显著抑制到＜25％对照品的程度。单克隆抗体4D5能够阻断HRG刺激酪氨酸磷酸化达到～50％。附图2A表示如反射光密度测定法所测定的2C4或7F3抑制HRG刺激p180的酪氨酸磷酸化的剂量反应曲线。使用4-参数配合对这些抑制曲线进行的评价产生的IC50就2C4和7F3而言分别为2.8±0.7nM和29.0±4.1nM。
在冰上使用24-孔-平板形式中的单层培养物通过抗-ErbB2抗体抑制HRG与MCF7乳腺肿瘤细胞系的结合(Lewis等《癌症研究》(Cancer Research)56：1457-1465(1996))。向各孔中添加抗-ErbB2单克隆抗体并温育30分钟。加入125I-标记的rHRGβ1177-224(25pm)并继续温育4-16小时。附图2B提供了2C4或7F3抑制HRG与MCF7细胞结合的剂量反应曲线。在有125I-标记的rHRGβ1存在的情况下将可变浓度的2C4或7F3与MCF7细胞一起温育且抑制曲线如附图2B中所示。对这些数据的分析产生的IC50就2C4和7F3而言分别为2.4±0.3nM和19.0±7.3nM。2C4和7F3的最大抑制率约为约74％这一结果与酪氨酸磷酸化的数据一致。
为了测定所观察到的抗-ErbB2对MCF7细胞的作用是否是一种一般的现象，将人肿瘤细胞系与2C4或7F3一起温育并测定特异性125I-标记的rHRGβ1的结合程度(Lewis等《癌症研究》(CancerResearch)56：1457-1465(1996))。从本研究中得出的结果如附图3中所示。在所有细胞系中与121I-标记的rHRGβ1的结合均可以受到2C4或7F3的显著抑制，但不包括乳腺癌细胞系MDA-MB-468，据报导它对ErbB2的表达程度极低或不表达ErbB2。据报导剩余的细胞系表达ErbB2，其中ErbB2在这些细胞系中的表达水平可以广泛改变。实际上，所测试的ErbB2在所述细胞系中的表达范围可以改变达2个数量级以上。例如，BT-20、MCF7和Caov3表达～104 ErbB2受体/细胞，而BT-474和SK-BR-3表达～106ErbB2受体/细胞。从ErbB2在这些细胞中的宽范围表达和上述数据中可以推断出ErbB2与ErbB3或ErbB4之间的相互作用本身是一种发生在浆膜表面上的高亲和性相互作用。
在有或没有外源性rHRGβ1存在的情况下评价单克隆抗体2C4和4D5对MDA-MB-175和SK-BR-3细胞的生长抑制作用(Schaefer等《癌基因》(Oncogene)15：1385-1394(1997))。MDA-MB-175细胞中ErbB2的浓度是在正常乳腺上皮细胞中发现的浓度的4-6倍且ErbB2-ErbB4受体在MDA-MB-175细胞中以组成型方式被酪氨酸磷酸化。将MDA-MB-175细胞用抗-ErbB2单克隆抗体2C4和4D5(10μg/mL)处理4天。在结晶紫染色试验中，与2C4一起温育显示出对这种细胞系的强生长抑制作用(附图4A)。外源性HRG没有使这种抑制作用发生逆转。另一方面，2C4没有表现出对超表达ErbB2的细胞系SK-BR-3的抑制作用(附图4B)。在有和没有外源性HRG存在的情况下，单克隆抗体2C4均能够将MDA-MB-175细胞的细胞增殖抑制到超过单克隆抗体4D5的程度。通过4D5抑制细胞增殖取决于ErbB2的表达水平(Lewis等《癌症免疫与免疫疗法》(Cancer Immunol.Immunother.)37：255-263(1993))。在SK-BR-3细胞中可以检测到的最大抑制率为66％(附图4B)。然而，这种作用可以被外源性HRG所克服。
                      实施例2
 由单克隆抗体2C4阻断ErbB2与ErbB3的HRG依赖性结合
使用一种共免疫沉淀实验测试ErbB3与ErbB2结合的能力。将1.0×106 MCF7或SK-BR-3细胞接种在6孔组织培养平板内的含有10％胎牛血清(FBS)和pH7.2的10mM HEPES(生长培养基)的50：50DMEM/Ham′s F12培养基中并使之粘附过夜。在开始进行实验前使细胞在不含血清的生长培养基中饥饿2小时。
将细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)短暂洗涤且然后与100nM稀释入0.2％w/v牛血清清蛋白(BSA)、RPMI培养基的指定抗体、与pH7.2的10mM HEPES(结合缓冲液)或与单独的结合缓冲液(对照品)一起温育。在室温下1小时后，将HRG加入到半数孔(+)中至终浓度为5nM。向其它孔(-)中加入相似体积的结合缓冲液。将温育持续约10分钟。
通过抽吸取出上清液并在RPMI、pH7.2的10mM HEPES、1.0％v/v TRITON X-100TM、含有0.2mM PMSF的1.0％w/v CHAPS(裂解缓冲液)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽和10TU/ml抑酶肽中使细胞裂解。通过离心清除裂解物中的不溶性物质。
使用与亲和凝胶(Affi-Prep 10，Bio-Rad)共价偶联的单克隆抗体使ErbB2免疫沉淀。这种抗体(Ab-3，《癌基因科学》(Oncogene Sciences))识别胞质结构域表位。通过向各裂解物中添加含有约8.5μg固定化抗体的10ul凝胶浆液来进行免疫沉淀并使样品在室温下混合2小时。然后通过离心收集凝胶。将该凝胶用裂解缓冲液分批洗涤3次以除去未结合的物质。然后加入SDS样品缓冲液并将样品在沸水浴中短暂加热。
将上清液上4-12％聚丙烯酰胺凝胶并在硝化纤维膜上进行电印迹。通过用对胞质结构域表位(c-17，Santa Cruz Biotech)的多克隆抗体探测所述印迹来估计存在的ErbB3。使用化学发光底物(ECL，Amersham)使所述印迹显色。
正如附图5A和5B的对照泳道中所示，分别就MCF7和SK-BR-3细胞而言，ErbB3仅在用HRG刺激细胞时存在于ErbB2免疫沉淀物中。如果细胞首先与单克隆抗体2C4一起温育，那么ErbB3信号将在MCF7细胞中消除(附图5A，泳道2C4+)或在SK-BR-3细胞中基本上减少(附图5B，泳道2C4+)。正如附图5A-B中所示，单克隆抗体2C4对ErbB3与ErbB2在MCF7和SK-BR-3细胞中的heregulin依赖性结合的阻断作用基本上比HERCEPTIN更为有效。用HERCEPTIN预温育减少了MCF7裂解物中的ErbB3信号，但对从SK-BR-3裂解物中共沉淀的ErbB3的量具有很小的影响或没有影响。使用针对EGF受体(Ab-1，《癌基因科学》(Oncogene Sciences))的抗体进行预温育对ErbB3在各细胞系中与ErbB2共免疫沉淀的能力没有影响。
                        实施例3
     人源化2C4抗体和亲和力成熟的2C4抗体变体
首先将鼠单克隆抗体2C4的可变结构域克隆入使小鼠/人嵌合Fab片段产生的载体中。使用Stratagene RNA提取试剂盒、按照制造商的方案从杂交瘤细胞中分离总RNA。如上所述通过RT PCR扩增可变结构域、对其进行凝胶纯化并插入基于pUC119的质粒衍生物中，该质粒含有人卡巴恒定结构域和人CH1结构域(Carter等PNAS(USA)89：4285(1992)；和美国专利US 5,821,337)。将所得质粒转化入大肠杆菌菌株16C9以用于表达Fab片段。培养物的生长、蛋白质表达的诱导和Fab片段的纯化如上所述(Werther等《免疫学杂志》(J.Immunol.)157：4986-4995(1996)；Presta等《癌症研究》(Cancer Research)57：4593-4599(1997))。将纯化的嵌合2C4 Fab片段与鼠亲本抗体2C4比较其抑制125I-HRG结合MCF7细胞和抑制MCF7细胞中rHRG激活p180酪氨酸磷酸化的能力。正如附图6A中所示，嵌合2C4 Fab片段在破坏人乳腺癌细胞系MCF7上高亲和性ErbB2-ErbB3结合位点形成方面极为有效。对完整鼠2C4计算的相对IC50值为4.0±0.4nM，而Fab片段的值为7.7±1.1nM。正如附图6B中所说明的，单价嵌合2C4Fab片段在破坏HRG-依赖性ErbB2-ErbB3活化方面极为有效。对完整鼠单克隆抗体2C4计算的IC50值为6.0±2nM，而Fab片段的值为15.0±2nM。
对嵌合克隆进行的DNA测序使得鉴定CDR残基成为可能(Kabat等，《具有免疫意义的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))(附图7A和B)。如上所述使用寡核苷酸位点定向诱变将全部6个这些CDR区引入质粒VX4中所包含的完整人构架(VL卡巴亚群I和VH亚群III)(Presta等《癌症研究》(Cancer Research)57：4593-4599(1997))。如上所述表达并纯化来自所得″CDR-交换″的蛋白质。进行结合研究以便比较两种形式。简单地说，在4℃下给NUNC MAXISORPTM平板包被溶于pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液所得的1毫克/ml的ErbB2胞外结构域(ECD；如WO90/14357中所述产生)、持续过夜且然后在室温下用ELISA稀释剂(0.5％BSA，0.05％聚山梨醇酯20，PBS)封闭1小时。在平板上将连续稀释入ELISA稀释剂的样品温育2小时。洗涤后，用生物素化鼠抗-人卡巴抗体(ICN 634771)、随后用链霉抗生物素缀合的辣根过氧化物酶(Sigma)并使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)作为底物来检测结合的Fab片段。在450nm处读取吸收度。正如附图8A中所示，在构建CDR-交换人Fab片段时，所有的结合均消失了。
为了恢复人源化Fab的结合，使用来自CDR-交换的DNA作为模板构建突变体。使用计算机生成的模型(附图9)设计这些突变以便在位点上将人构架区残基改变成其鼠配对物，其中这种改变可能影响CDR构型或抗体-抗原界面。突变体如表2中所示。
                    表2
           人源化2C4 FR突变的设计
突变体号 构架区(FR)取代
 560  ArgH7lVal
 561  AspH73Arg
 562  ArgH71Val，AspH73Arg
 568  ArgH71Val，AspH73Arg，AlaH49Gly
 569  ArgH71Val，AspH73Arg，PheH67Ala
 570  ArgH71Val，AspH73Arg，AsnH76Arg
 571  ArgH71Val，AspH73Arg，LeuH78Val
 574  ArgH71Val，AspH73Arg，IleH69Leu
 56869  ArgH71Val，AspH73Arg，AlaH49Gly，PheH67Ala
各种突变体的结合曲线如附图8A-C中所示。看起来具有ArgH71Val、AspH73Arg和IleH69Leu改变的人源化Fab型574具有恢复至原始嵌合2C4 Fab片段结合程度的结合。可以修饰诸如L2、L54、L55、L56、H35和/或H48这样的其它FR和/或CDR残基(例如如下取代-IleL2Thr；ArgL54Leu；TyrL55Glu；ThrL56Ser；AspH35Ser；和ValH4811e)以便进一步精修或促进人源化抗体的结合。另一方面或另外，所述的人源化抗体可以是亲和力成熟的(参见上文)以便进一步改善或精修其亲和力和/或其它生物活性。
使用噬菌体展示法使人源化2C4型574亲和力成熟。简单地说，将人源化2C4.574 Fab克隆入噬菌体展示载体作为基因III融合体。当通过用M13K07辅助噬菌体感染而诱导噬菌体颗粒时，这种融合使得Fab在噬菌体尾丝蛋白的基因III的N-末端上展示(Baca等《生物学和化学杂志》(J Biol Chem.)272：10678(1997))。
为上述鉴定的6种CDRs中的每一种构建各个文库。在这些文库中，使用含有″NNS″作为密码子的寡核苷酸将使用可能在结合ErbB2方面显著的计算机生成的模型(附图9)鉴定的CDRs中的氨基酸随机化。然后对包被在NUNC MAXISORPTM平板上的ErbB2 ECD扫视所述文库，其中所述的平板中含有溶于含0.2％TWEEN 20(MPBST)的PBS的3％奶粉来取代所有的封闭溶液。为了选择具有高于2C4.574的亲和力的噬菌体，在扫视3、4和5个循环的过程中，在洗涤步骤中加入可溶性ErbB2 ECD或可溶性Fab 2C4.574作为竞争剂。在室温下将洗涤时间(times)扩展至1小时。
在扫视5个循环后，再次通过噬菌体-ELISA分析各个克隆。使各个克隆在Costar 96-孔U-形底组织培养平板中生长并通过添加辅助噬菌体诱导噬菌体。在生长过夜后，使大肠杆菌细胞沉淀并将含有噬菌体的上清液转入96-孔平板，其中在室温下用MPBST将所述噬菌体封闭1小时。如上所述用MPBST再次封闭包被了ErbB2 ECD的NUNCMAXISORPTTM平板。将封闭的噬菌体在所述平板上温育2小时。洗涤后，使用按1∶5000稀释入MPBST的辣根过氧化物酶缀合的抗-M13单克隆抗体(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.27-9421-01)、随后用3，3′，5，5′，-四甲基联苯胺作为底物来检测结合的噬菌体。在450nm处读取吸收度。
将来自产生最强信号的各文库的48个克隆进行DNA测序。将序列出现频率最高的那些克隆亚克隆入如上所述使得表达可溶性Fabs成为可能的载体中。诱导这些Fabs、纯化蛋白质并如上所述通过ELISA分析纯化Fabs的结合情况并将结合情况与原始人源化2C4.574型的结合情况进行比较。
在鉴定各个CDRs中有意义的突变后，如上所述构建并测试属于它们中的各种组合的其它突变体。产生比574改善的结合率的突变体如表3中所述。
                     表3
        来源于2C4.574亲和力成熟的突变体的命名
突变体名称        来自574的改变                                              突变体/574*
H3.A1                serH99trp，metH34leu                                       0.380
L2.F5                serL50trp，tyrL53gly，metH34leu                            0.087
H1.3.B3              thrH28gln，thrH30ser，metH34leu                            0.572
L3.G6                tyrL92pro，ileL93lys，metH34leu                            0.569
L3.G11               tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly，metH34leu                 0.561
L3.29                tyrL92phe，tyrL96asn，metH34leu                            0.552
L3.36                tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro，metH34leu                 0.215
654                  serL50trp，metH34leu                                       0.176
655                  metH34ser                                                  0.542
659                  serL50trp，metH34ser                                       0.076
L2.F5.H3.A1          serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，serH99trp                 0.175
L3G6.H3.A1           tyrL92pro，ileL93lys，metH34leu，serH99trp                 0.218
H1.3.B3.H3.A1        thrH28gln，thrH30ser，metH34leu，serH99trp                 0.306
L3.G11.H3.A1         tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly，metH34leu，serH99trp      0.248
654.H3.A1            serL50trp，metH34leu，serH99trp                            0.133
654.L3.G6            serL50trp，metH34leu，tyrL92pro，ileL93lys                 0.213
654.L3.29            serL50trp，metH34leu，tyrL92phe，tyrL96asn                 0.236
654.L3.36            serL50trp，metH35leu，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro      0.141
*Erb2-ECD ELISA 中需要产生标准曲线中的中等-OD的突变体的量与需要产生标准曲线中的中等-OD的574的量之比。小于1.0的数字表明突变体结合Erb2优于574结合Erb2。
还构建了下列突变体且在目前正在评价中：
659.L3.G6        serL50trp，metH34ser，tyrL92pro，ileL93lys
659.L3.G11       serL50trp，metH34ser，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly
659.L3.29        serL50trp，metH34ser，tyrL92phe，tyrL96asn
659.L3.36        serL50trp，metH34ser，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro
L2F5.L3G6        serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92pro，ileL93lys
L2F5.L3G11       serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly
L2F5.L29         serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92phe，tyrL96asn
L2F5.L36         serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro
L2F5.L3G6.655    serL50trp，tyrL53gly，metH35ser，tyrL92pro，ileL93lys
L2F5.L3G11.655   serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly
L2F5.L29.655     serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92phe，tyrL96asn
L2F5.L36.655     serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro
目前构建了下列通过同源性扫描建议的突变体：
678                            thrH30ala
679                            thrH30ser
680                            lysH64arg
681                            leuH96val
682                            thrL97ala
683                            thrL97ser
684                            tyrL96phe
685                            tyrL96ala
686                            tyrL91phe
687                            thrL56ala
688                            glnL28ala
689                            glnL28glu
在H34上优选的氨基酸是甲硫氨酸。如果发现在该位置上存在氧化，那么可以改变成亮氨酸。
发现AsnH52和asnH53是为结合而极为优选的。将这些残基改变成丙氨酸或天冬氨酸可显著减少结合。
已经制备了包括带有人IgG1重链恒定区的人源化Fab型574的完整抗体(参见美国专利US 5,821,337)。用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来生产完整抗体。
                      实施例4单克隆抗体2C4阻断EGF、TGF-α或HRG介导的MAPK活化
许多生长因子受体通过促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径传输信号。这些双特异性激酶是最终引起癌细胞分裂的信号转导途径中的关键点之一。按照下列方式评价单克隆抗体2C4或HERCEPTIN抑制EGF、TGF-α或HRG激活MAPK的能力。
将MCF7细胞(105个细胞/孔)平板固定在12-孔细胞培养平板内含有血清的培养基中。第2天除去细胞培养基并向各孔中加入含有0.1％血清的新鲜培养基。然后将该步骤再重复1天并在试验前用不含血清的结合缓冲液取代所述培养基(Jones等《生物学和化学》(J.Biol.Chem.)273：11667-74(1998)；和Schaefer等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)274：859-66(1999))。使细胞平衡至室温且然后与0.5mL的200nM HERCEPTIN或单克隆抗体2C4一起温育30分钟。然后将细胞用1nM EGF、1nM TGF-α或0.2nM HRG处理15分钟。通过抽吸细胞培养基且然后添加0.2mL含有1％DTT的SDS-PAGE样品缓冲液来终止该反应。如上所述通过使用抗活性MAPK抗体(Promega)的蛋白质印迹来评价MAPK的活化(Jones等《生物学和化学杂志》(J.Biol.Chem.)273：11667-74(1998))。
正如附图10中所示，单克隆抗体2C4对EGF、TGF-α和HRG介导的MAPK活化的阻断程度超过HERCEPTIN。这些数据提示单克隆抗体2C4与ErbB2表面结合，它用于其与EGFR或ErbB3的结合且由此防止信号受体复合体形成。
                     实施例5HERCEPTIN对雄激素依赖性和雄激素非依赖性人前列腺癌生长的作用
在人前列腺癌的临床前期模型中研究了HERCEPTIN单一疗法在雄激素依赖性和雄激素非依赖性前列腺癌异种移植模型中的作用和HERCEPTIN与紫杉醇的联合作用。使用雄激素依赖性CWR22和LNCaP人前列腺癌异种移植模型和CWR22的雄激素非依赖性亚系(Nagabhushan等《癌症研究》(Cancer Res.)56：3042-3046(1996)；Wainstein等《癌症研究》(Cancer Res.)54：6049-6052(1994)；和Stearns等《前列腺》(Prostate)36：56-58(1998))。
                   材料和方法
动物研究。4-6周龄的无胸腺裸BALB/c雄性和雌性小鼠获自National Cancer Institute-Frederick Cancer Center并将其维持在SloanKettering Institute的加压通风的笼中。给雄性动物皮下接种1×106个LNCaP细胞或来自雄激素依赖性CWR22的切碎肿瘤组织，而雌性小鼠接受雄激素非依赖性亚系CWR22R或CWR22SA 1、CWRSA4、CWRSA6，它们在去除雄激素后通过选择再生和增加的血清PSA的肿瘤而获得。如上所述(Nagabhushan等《癌症研究》(Cancer Res.)56：3042-3046(1996)；Wainstein等《Cancer Res.》54：6049-6052(1994)；和Sato等《癌症研究》(Cancer Res.)57：1584-1589(1997))将所有系与再建的基膜一起注射(Matrigel；Collaborative Research，Bedford，MA)。为了维持血清睾酮水平，在接受肿瘤细胞接种前给雄性小鼠皮下植入12.5-mg缓释睾酮丸(Innovative Research of America，Sarasota，FL)。治疗方案由每周经腹膜内注射两次20mg/kg HERCEPTIN的PBS溶液、持续不超过3周和/或皮下注射低剂量(6.25mg/kg、皮下；5x/周x3周)或高剂量(12.5mg/kg皮下、5x/周x2周)的紫杉醇(TAXOL，Bristol Myers-Squibb Company，Princeton，NJ)的无菌盐水溶液组成。对照组小鼠仅接受载体。每隔3-4天用游标卡尺测量一次肿瘤并通过公式计算肿瘤体积：p/6x较大直径x(较小直径)2。将带有建立的体积至少为65mm3的可触摸肿瘤的动物用于治疗组。
ErbB2态的异种移植物的测定。通过使用DAKO ErbB2试剂盒(HERCEPTEST，DAKO Corporation，Carpinteria，CA)的免疫组织化学法对异种移植物检测ErbB2表达情况。通过与DAKO试剂盒标准物中的标准对照品比较而在不了解的情况下获得样品的得分且得分如下：0(没有染色或低于10％的肿瘤细胞中存在膜染色)；1+(10％以上的肿瘤细胞中出现模糊不清的膜染色)；2+(＞10％的细胞中出现轻度至中度的完整膜染色)；或3+(＞10％的细胞中出现中度至强度的完全膜染色)。将得分为0或1+看作没有ErbB2超表达，而2+或3+表示ErbB2超表达。使用Oncor试剂盒(INFORM；ErbB2基因检测系统，Oncor Inc.，Gaithersburg，MD)进行FISH分析。对各肿瘤中最少100个肿瘤细胞估计核ErbB2基因拷贝数(RoSS等《人体病理学》(Hum.Pathol.)28：827-833(1997))。
血清PSA值的测定。在治疗前和在治疗的第9和第21天时取用微量容器的血清分离管(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)通过背侧尾静脉的表浅切口采集的雄性小鼠血样(～50ml)。然后使用Tandem-R PSA免疫放射分析(Hybritech，San Diego，CA)从血清中测定PSA值。
统计分析。使用排列测验在一段时间内比较治疗组肿瘤体积之间的配对差异。该测验的虚假说是在一段时间内治疗对肿瘤体积没有产生有差异的作用。用于测试该假说的统计量是全部时间点内统计的平均肿瘤体积之间差值的平方的总和。 SS _ DEV = Σ i = 1 k ( x - i - y - i ) 2
使用SS_Dev是为了获得各时间点处治疗组之间的平均差值。这种统计通过所述公式反映出两个治疗组的平均肿瘤体积的量是不同的。
                        结果
ErbB2的免疫组织化学染色和前列腺异种移植物的ErbB2基因拷贝数。通过免疫组织化学(IHC)和FISH检验雄激素依赖性和雄激素非依赖性前列腺异种移植物的ErbB2表达模式。亲本雄激素依赖性CWR22肿瘤表现出2+ErbB2染色且LNCaP肿瘤表现出3+ErbB2染色。CWR22的雄激素非依赖性亚系表现出对ErbB2的2+(CWRSA1)、3+(CWRSA4)、2+(CWRSA6)和1+(CWR22R)染色。经FISH发现所有肿瘤均带有2-4 ErbB2基因拷贝(正常范围)数。
HERCEPTIN对建立的前列腺癌异种移植物的作用。进行动物实验以便评价HERCEPTIN在充分建立的雄激素依赖性和雄激素非依赖性前列腺癌异种移植物中的功效。将CWR22、LNCaP、CWR22R和CWRSA6模型用于这些实验，因为它们可以提供再生生长曲线。在建立异种移植物后每周经腹膜内给予两次20mg/kg剂量的HERCEPTIN。当与对照组比较时，在任何雄激素非依赖性肿瘤内均没有观察到HERCEPTIN对肿瘤生长的作用(CWR22R，p＝0.60，n＝10，附图11A；CWRSA6，p＝0.63，n＝10，附图11B)。鼠抗-ErbB2抗体4D5对CWR22R雄激素非依赖性系中的肿瘤生长也没有作用(p＝0.21，n＝10)。相反，HERCEPTIN确实在雄激素依赖性异种移植物模型CWR22(68％生长抑制率；p＜0.03，n＝12，附图11C)和LNCaP(89％生长抑制率；p＝0.002，n＝12，附图11D)均表现出显著抑制作用。
HERCEPTIN与TAXOL联用对建立的肿瘤异种移植物的作用。当将紫杉醇与HERCEPTIN对动物共同给药时，就雄激素依赖性和雄激素非依赖性肿瘤而言，肿瘤体积均比对照组明显减小(CWR2298％的生长抑制率，p＜0.01，附图11E；CWR22R 92％的生长抑制率，p＜0.01，附图11G；LNCaP 94％的生长抑制率，p＝0.006，附图11F；CWRSA6 77％的生长抑制率，p＜0.01，附图11H)。在对带有雄激素依赖性异种移植物的动物的治疗期结束时，观察到联用HERCEPTIN和紫杉醇生长抑制率比单独使用各药剂提高(附图11E-H)：CWR22组(平均肿瘤体积，各组中n＝6，紫杉醇：408mm3；HERCEPTIN：520mm3；紫杉醇和HERCEPTIN：76mm3；紫杉醇与紫杉醇和HERCEPTIN联用相比p＜0.03)和LNCaP组(平均肿瘤体积，各组中n＝6，紫杉醇：233mm3；HERCEPTIN：163mm3；紫杉醇和HERCEPTIN：82mm3；紫杉醇与紫杉醇和HERCEPTIN联用相比p＜0.03)。此外，在对带有雄激素非依赖性异种移植物的动物的治疗期结束时，观察到联用HERCEPTIN和紫杉醇生长抑制率比单独使用各药剂提高(附图11E-H)：CWRSA6组(平均肿瘤体积，各组中n＝5，紫杉醇：1,496mm3；HERCEPTIN：2,941mm3；紫杉醇和HERCEPTIN：687mm3；紫杉醇与紫杉醇和HERCEPTIN联用相比p＜0.001)和CWR22R组(平均肿瘤体积，各组中n＝5，紫杉醇：1,273mm3；HERCEPTIN：3,811mm3；紫杉醇和HERCEPTIN：592mm3；紫杉醇与紫杉醇和HERCEPTIN联用相比p＝0.095)。
HERCEPTIN对经治疗的带有雄激素依赖性异种移植物的动物的PSA指数的影响。正如附图12A和B中所示，HERCEPTIN治疗的雄激素依赖性组比对照组的前列腺特异性抗原(PSA)指数(ngPSA/ml血清/mm3肿瘤)显著升高(CWR22：1864％与-4％，p＜0.0001，附图12A；LNCaP：232％与-68％，p＜0.0001，附图12B)。当与预治疗值相比时，使用HERCEPTIN与紫杉醇联合治疗后的PSA指数也得到提高。
                            结论
在这些前列腺癌模型系统中，单独的HERCEPTIN仅对雄激素依赖性肿瘤具有临床活性且HERCEPTIN与紫杉醇联用对雄激素依赖性和雄激素非依赖性肿瘤的生长均具有至少附加的作用。正如在HERCEPTIN治疗组中PSA指数显著升高，对HERCEPTIN的反应与PSA水平无关，而在对照组中该指数保持恒定。
                     实施例6单克隆抗体2C4对雄激素依赖性和雄激素非依赖性人前列腺癌生长的作
                         用
评价阻断ErbB受体的配体活化的抗体对人前列腺癌的作用。特别地，如上述实施例5中所述使用雄激素依赖性肿瘤CWR22和雄激素非依赖性肿瘤CWR22R和CWRSA6测定异种移植肿瘤对HERCEPTIN、单克隆抗体2C4、紫杉醇和2C4/紫杉醇联用治疗的反应。如实施例5中所述给予抗体和紫杉醇。
雄激素依赖性肿瘤CWR22对疗法的反应如附图13和14中所示。将结果以平均肿瘤体积±SE的形式给出。附图13中描绘的动物肿瘤体积表明HERCEPTIN对这种雄激素依赖性模型具有临床活性，作为单克隆抗体2C4也具有这种活性。单克隆抗体2C4和TAXOL联用表明生长抑制率比单独的2C4或TAXOL增加了(附图14；p＝0.003)。
雄激素非依赖性肿瘤CWR22和CWRSA6对使用HERCEPTIN、单克隆抗体2C4、紫杉醇或2C4/紫杉醇联合治疗的疗法的反应如附图15-18中所示。将结果以平均肿瘤体积±SE的形式给出。附图15和17中描绘的动物肿瘤体积表明HERCEPTIN对这些雄激素非依赖性模型具有极小的临床活性或不具有临床活性，而单克隆抗体2C4对这些模型具有临床活性。单克隆抗体2C4和TAXOL联用表明生长抑制率比单独的单克隆抗体2C4或TAXOL增加了(附图16和18；p＝0.002)。
如WO98/37200中所述在大肠杆菌中表达rhuMAb 2C4的Fab’片段并使之与20kD支链聚乙二醇(PEG)缀合，将该文献引入本文作为参考。使用上述CWR22R异种移植物评价鼠2C4抗体(20mg/kg)、rhuMAb 2C4(20mg/kg)和聚乙二醇化Fab片段(PEG-Fab；20或40mg/kg)在体内治疗雄激素非依赖性前列腺癌的能力。全部注射经腹膜内(IP)进行(N＝5)。这些研究结果如附图23中所示。这些数据表明使用2C4在CWR22R模型中观察到的对肿瘤的抑制并不需要完整的二价抗体。由于这些Fab片段不含Fc，所以可能不需要诸如ADCC这样的免疫机制。这些结果与使用体外系统和嵌合型2C4 Fab的附图6中所示的结果一致。2C4作为单价片段抑制肿瘤生长这一观察结果还使得人们相信这种抑制作用是阻断ErbB2与其它ErbB族成员异二聚化且由此抑制下游信号启动事件的能力的结果。
在CWR22R和MSKPC6(Agus等《癌症研究》(Cancer Research)59：4761-4764(1999))雄激素非依赖性前列腺异种移植物中使用rhuMAb 4D5进行剂量反应研究。对动物经腹膜内(IP)给予：对照品；6mg/kg负荷剂量、然后每周给予两次3mg/kg；20mg/kg负荷剂量、然后，每周给予两次10mg/kg；或60mg/kg负荷剂量、然后每周两次30mg/kg。这些研究结果如附图24和25中所示。这些数据表明2C4以剂量依赖性方式抑制雄激素非依赖性肿瘤异种移植物的生长。此外，这些结果进一步证明这种对肿瘤生长的抑制作用是由于2C4治疗而非实验用人工制品所导致的。
对如附图21中所示的来自实施例5和6的典型结果的总结。
                      实施例7雄激素依赖性和雄激素非依赖性人前列腺癌中的TGF-α和HB-EGF水平
在本实施例中评价CWR22细胞(雄激素依赖性)和CWR22R细胞(雄激素非依赖性)中的TGF-α和HB-EGF mRNA水平。
                     材料和方法
mRNA的制备。按照Qiagen的方案(Qiagen Maxi Kit #；75163)加工冷冻的肿瘤组织。简单地说，使用安装有应用15秒脉冲且然后暂停30秒的PT-DA 3012/2 TS发生器的Brinkman Poltron(Pt3000)均浆器完成对组织的均化。将该步骤重复3次并将提取物上Qiagen柱且按照制造商的说明书进行洗涤。将柱用1mL不含RNA酶的水溶液洗脱并通过在260nm处的吸收度测定RNA含量。由于在细胞系MDA-MB-231中表达TGF-α和HB-EGF，所以将来自这些细胞的总RNA用作TGF-α和HB-EGF定量的标准物。
实时定量PCR。如上所述使用实时定量PCR或TaqMan技术对TGF-α和HB-EGF mRNA进行定量(Gibson等《基因组研究》(GenomeResearch)6：986-994(1996)；和Heid等基因组研究》(GenomeResearch)6：986-994(1996))。用于这项分析的引物/探针组的序列如下所示：TGF-αF5′-GGACAGCACTGCCAGAGA-3′(SEQ ID NO：14)R5′-CAGGTGATTACAGGCCAAGTAG-3′(SEQ ID NO：15)P5′FAM-CCTGGGTGTGCCACAGACCTTCA-TAMRA-p-3′(SEQ IDNO：16)HB-EGF：F5′-TGAAGTTACCTCCAGGTTGGT-3′(SEQ ID NO：17)R5′-AGACACATTCTGTCCATTTTCAA-3′(SEQ ID NO：18)P5′-FAM-CAAGCTGCAAAGTGCCTTGCTCAT-TAMRA-p-3′(SEQID NO：19)
其中F和R分别是正向引物和反向引物且P是荧光标记探针。将β-肌动蛋白用作管家基因。为β-肌动蛋白设定的引物/探针组是：p-肌动蛋白F5′-ATGTATCACAGCCTGTACCTG-3′(SEQ ID NO：20)R5′-TTCTTGGTCTCTTCCTCCTTG-3′(SEQ ID NO：21)P     5′FAM-AGGTCTAAGACCAAGGAAGCACGCAA-TAMRA-p-3′(SEQ ID NO：22)
在标准96-孔型平板上进行TaqMan分析。使用用于TGF-α和HB-EGF分析的0.6-150ng mRNA和用于β-肌动蛋白的9.4-150ngmRNA构建标准曲线。将各稀释液按一式两份进行实验。就肿瘤样品而言，将100ng用于所有的基因分析。
                      结果
如附图19-20中所示，雄激素非依赖性前列腺肿瘤系CWR22R对EGFR配体TGF-α和HB-EGF的表达水平明显高于雄激素依赖性细胞系CWR22。特别地，TGF-α在CWR22R肿瘤中的表达水平高于在CWR22肿瘤中表达水平的8-9倍。按照一种类似方式，HB-EGF在CWR22R中的表达水平高于在CWR22中表达水平的～19倍。
                    实施例82C4或HERCEPTIN对带有雄激素依赖性异种移植物的动物体内的
                 PSA指数的影响
如附图22中所示，在接近治疗结束时的第21天在雄激素依赖性动物中测定PSA指数(定义为ng PSA/mL血清/mm3肿瘤)。在HERCEPTIN治疗的雄激素依赖性动物中PSA指数显著升高，而对照组动物表现出PSA指数降低(第21天时：LNCaP：对照组与预治疗值相比＝0.6、HERCEPTIN组与预治疗值相比＝2.35；CWR22：对照组与预治疗值相比＝1.0、HERCEPTIN组与预治疗值相比＝18)。相对PSA指数在LNCaP未治疗组中降低，据推定这是对伴有肿瘤大小增加的坏死的继发性反应。相反，2C4对经治疗的肿瘤的PSA指数与对照组相比没显著性作用。不受任何一种原理的限制，对这种现象可能的解释是可能与ErbB2在前列腺癌细胞中的活化程度相关。ErbB2活化可以通过与雄激素受体信号途径的通讯而导致雄激素非依赖性生长(Craft等《自然科学》(Nature Med.)5：280-285(1999))。在我们的模型系统中，HERCEPTIN与ErbB2结合导致PSA的细胞分泌以雄激素非依赖性方式增加(Agus等《癌症研究》(Cancer Res.)59：4761-4764(1999))。这一结果进一步支持了ErbB2与雄激素受体信号途径之间通讯的观点。
                   实施例97C2抗-ErbB2抗体对雄激素依赖性和非依赖行异种移植物的作用
将诱发超表达ErbB2的细胞编程性细胞死亡的单克隆抗体7C2(ATCC HB-12215)在雄激素依赖性CWR22异种移植物中的作用与单克隆抗体2C4在雄激素依赖性CWR22异种移植物中的作用进行比较。每周将两种抗体以20mg/kg给药两次。如附图26中所示，类似于2C4和HERCEPTIN，7C2也可有效地治疗雄激素依赖性前列腺癌。使用CWR22R异种移植物来评价7C2对雄激素非依赖性前列腺癌的作用。附图27表示单独的7C2对这种模型无效、而在与TAXOL联用时对这种模型有效。
                   实施例10
       复发性或顽固性转移前列腺癌的疗法
RhuMAb 2C4是一种针对ErbB2的全长人源化单克隆抗体(在CHO细胞中产生)。RhuMAb 2C4阻断ErbB2与其它ErbB族成员的结合，由此通过ErbB途径抑制胞内信号。与HERCEPTIN相反，rhuMAb 2C4不仅可以抑制超表达ErbB2的肿瘤的生长、而且还可以阻断需要ErbB配体依赖性信号的肿瘤生长。
将RhuMAb 2C4指定为用于治疗激素顽固性(雄激素非依赖性)前列腺癌患者的单一活性剂。当使用单一活性剂时，初始功效终点与可获得的最佳治疗(米托蒽醌/泼尼松)相比包括全部存活且安全。次级功效终点包括：疾病发展的时间、反应率、生活质量、疼痛和/反应期限。每周或每隔3周分别以2或4mg/kg经静脉内(IV)给予RhuMAb 2C4，直到疾病发展为止。将抗体制成多剂量液体制品的形式。(20mL的填充量、浓度为20mg/mL或20mg/mL以上)。
还指定将RhuMAb 2C4与化疗联用治疗激素顽固性(雄激素非依赖性)前列腺癌患者。初始功效终点与化疗相比包括全部存活且安全。次级功效终点包括：疾病发展的时间、反应率、生活质量、疼痛和/反应期限。每周或每隔3周分别以2或4mg/kg经静脉内(IV)给予RhuMAb 2C4，直到疾病发展为止。将抗体制成多剂量液体制品的形式。(20mL的填充量、浓度为20mg/mL或20mg/mL以上)。
可以与抗-ErbB2抗体(阻断ErbB2受体的配体活化)联用治疗前列腺癌(例如雄激素非依赖性前列腺癌)的药物的实例包括：法尼基转移酶抑制剂；抗生血管剂(例如抗-VEGF抗体)；EGFR-靶向的药物(例如C225或ZD1839)；另一种抗-ErbB2抗体(例如生长抑制性抗-ErbB2抗体、诸如HERCEPTIN；或诱发编程性细胞死亡的诸如7C2或7F3这样的抗-ErbB2抗体、包括其人源化和/或其亲和力成熟的变体)；细胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；抗雄激素(诸如氟他胺或醋酸环丙孕酮)；亮丙瑞林；舒拉明；化疗剂，诸如长春碱、雌莫司汀、米托蒽醌、利阿唑(视黄酸代谢阻断剂)，环磷酰胺；蒽环类抗生素，诸如阿霉素、紫杉烷(例如紫杉醇或docetaxel)或甲氨蝶呤；或上述的任意组合物，诸如长春碱/雌莫司汀或环磷酰胺/阿霉素/甲氨蝶呤；泼尼松；氢化可的松；或它们的组合物。可以给予这些不同药物的标准剂量，例如：40mg/m2/周docetaxel(TAXOTERE)；6(AUC)卡铂；和200mg/m2紫杉醇(TAXOL)。
                       序列表<110>Genentech，Inc.等<120>用抗-ErbB2抗体治疗前列腺癌<130>P1760R1PCT<141>2000-06-23<150>US 60/141,315<151>1999-06-25<160>22<210>1<211>107<212>PRT<213>小鼠<400>1Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val1               5                  10                  15Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
              20                  25                  30Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln ser Pro Lys
              35                  40                  45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
              50                  55                  60Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
              65                  70                  75Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
              80                  85                  90Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
              95                 100                 105Ile Lys<210>2<211>119<212>PRT<213>小鼠<400>2Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly1               5                  10                  15Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
              20                  25                  30Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
              35                  40                  45Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
              50                   55                 60Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser
              65                  70                  75Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp
              80                  85                  90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
              95                 100                 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
             110                 115<210>3<211>107<212>PRT<213>人工<400>3Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1               5                  10                  15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
              20                  25                  30Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
              35                  40                  45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
              50                  55                  60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
              65                  70                  75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
              80                  85                  90Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
              95                 100                 105Ile Lys<210>4<211>119<212>PRT<213>人工<220><221>人工<222>1-119<223>Fab 574 VH<400>4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1               5                  10                  15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
              20                  25                  30Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
              35                  40                  45Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
              50                  55                  60 Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser
              65                  70                  75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
              80                  85                  90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
              95                 100                 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
             110                 115<210>5<211>107<212>PRT<213>人工<400>5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1               5                  10                  15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
              20                  25                  30Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
              35                  40                  45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
              50                  55                  60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
              65                  70                  75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
              80                  85                  90Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
              95                 100                 105Ile Lys<210>6<211>119<212>PRT<213>人工<400>6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1               5                  10                  15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
              20                  25                  30Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
              35                  40                  45Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
              50                  55                  60Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
              65                  70                  75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
              80                  85                  90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu
              95                 100                 105Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
             110                 115<210>7<211>10<212>PRT<213>小鼠<220><221>不确定<222>10<223>未知氨基酸<400>7Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa1                5                  10<210>8<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>8Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe1               5                  10                  15Lys Gly<210>9<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>9Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr1               5                  10<210>10<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>10Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala1               5                  10<210>11<211>7<212>PRT<213>小鼠<220><221>不确定<222>5-7<223>未知氨基酸<400>11Ser A1a Ser Tyr Xaa Xaa Xaa   1               5<210>12<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>12Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr1               5<210>13<211>645<212>PRT<213>人<400>13Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu1               5                  10                  15Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp
              20                  25                  30Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met
              35                  40                  45Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu
              50                  55                  60Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln
              65                  70                  75Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln
              80                  85                  90Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr
              95                 100                 105Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly
             110                 115                 120Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly
             125                 130                 135Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
             140                 145                 150Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp
             155                 160                 165Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala
             170                 175                 180Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys
             185                 190                 195Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu
             200                 205                 210Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala
             215                 220                 225Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
             230                 235                 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys
            245                 250                 255Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala
            260                 265                 270Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro
            275                 280                 285Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro
            290                 295                 300Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys
            305                 310                 315Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg
            320                 325                 330Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu
            335                 340                 345Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn
            350                 355                 360Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala
            365                 370                 375Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
            380                 385                 390Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu
            395                 400                 405Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro
            410                 415                 420Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile
            425                 430                 435Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile
            440                 445                 450Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu
            455                 460                 465Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
            470                 475                 480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His
            485                 490                 495Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala
            500                 505                 510Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro
            515                 520                 525Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys
            530                 535                 540Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val
            545                 550                 555Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln
            560                 565                 570Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val
            575                 580                 585Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys
            590                 595                 600Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys
            605                 610                 615Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
            620                 625                 630Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu
            635                 640                 645<210>14<211>18<212>DNA<213>人工<400>14ggacagcact gccagaga 18<210>15<211>22<212>DNA<213>人工<400>15caggtgatta caggccaagt ag 22<210>16<211>23<212>DNA<213>人工<400>16cctgggtgtg ccacagacct tca 23<210>17<211>21<212>DNA<213>人工<400>17tgaagttacc tccaggttgg t 21<210>18<211>23<212>DNA<213>人工<400>18agacacattc tgtccatttt caa 23<210>19<211>24<212>DNA<213>人工<400>19caagctgcaa agtgccttgc tcat 24<210>20<211>21<212>DNA<213>人工<400>20atgtatcaca gcctgtacct g 21<210>21<211>21<212>DNA<213>人工<400>21ttcttggtct cttcctcctt g 21<210>22<211>26<212>DNA<213>人工<400>22aggtctaaga ccaaggaagc acgcaa 26

Claims (23)

1.一种治疗人体内前列腺癌的方法，该方法包括对人给予治疗有效量的与ErbB2结合并阻断ErbB受体的配体活化的抗体的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的前列腺癌是雄激素非依赖性前列腺癌。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的抗体阻断单克隆抗体2C4与ErbB2的结合。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的抗体阻断促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的TGF-α活化。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的抗体具有单克隆抗体2C4的生物特征。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的抗体包括单克隆抗体2C4或人源化2C4。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的抗体是一种抗体片段。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的抗体片段是Fab片段。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的抗体不与胞毒剂缀合。
10.权利要求7所述的方法，其中所述的抗体片段不与胞毒剂缀合。
11.权利要求1所述的方法，其中所述的抗体与胞毒剂缀合。
12.一种治疗人体内前列腺癌的方法，该方法包括对人给予治疗有效量的化疗剂和与ErbB2结合并阻断ErbB受体的配体活化的抗体的步骤。
13.权利要求12所述的方法，其中所述的化疗剂是紫杉烷。
14.一种包括一个容器和其中包含的一种组合物的制品，其中所述的组合物包括与ErbB2结合并阻断ErbB受体的配体活化的抗体，且该制品进一步包括表明可以将所述组合物用于治疗前列腺癌的包装说明书。
15.权利要求14所述的制品，其中所述的前列腺癌是雄激素非依赖性前列腺癌。
16.权利要求14所述的制品，其中所述的包装说明书进一步表明用一种化疗剂治疗所述患者。
17.权利要求16所述的制品，其中所述的化疗剂是紫杉烷。
18.一种治疗人体内雄激素依赖性前列腺癌的方法，该方法包括对人给予治疗有效量的与ErbB2结合的抗体的步骤。
19.权利要求18所述的方法，进一步包括对人给予治疗有效量的紫杉烷的步骤。
20.权利要求18所述的方法，该方法可使人体内的前列腺特异性抗原(PSA)指数升高。
21.权利要求18所述的方法，其中所述的抗体包括单克隆抗体4D5或人源化4D5。
22.权利要求18所述的方法，其中所述的抗体包括单克隆抗体2C4或人源化2C4。
23.一种包括一个容器和其中包含的一种组合物的制品，其中所述的组合物包括与ErbB2结合的抗体，且该制品进一步包括表明可以将所述组合物用于治疗雄激素依赖性前列腺癌的包装说明书。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918844A (zh) * 2007-06-18 2010-12-15 米迪缪尼有限公司 表达epha2和erbb2的细胞的协同治疗

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
CN100340575C (zh) * 1999-06-25 2007-10-03 杰南技术公司 人源化抗ErbB2抗体及其在制备药物中的应用
DK2283866T3 (en) * 1999-06-25 2015-05-18 Genentech Inc METHODS OF TREATMENT USING ANTI-ERBB ANTIBODY-MAYTANSINOID CONJUGATES
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) * 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6825333B1 (en) 1999-08-20 2004-11-30 Chiron Corporation EGFH2 genes and gene products
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
ES2331646T3 (es) 2000-05-19 2010-01-12 Genentech, Inc. Ensayo para la deteccion de genes para mejorar la probabilidad de una respuesta eficaz a una terapia contra el cancer basada en antagonistas de erbb.
WO2003086458A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Medimmune, Inc. Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
AU2003237367A1 (en) 2002-06-03 2003-12-19 Chiron Corporation Use of nrg4, or inhibitors thereof, in the treatment of colon and pancreatic cancer
CA2590618A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-18 Cedars-Sinai Medical Center Method of treating cancer using kinase inhibitors
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
EP3006463A1 (en) 2003-10-01 2016-04-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for stabilizing antibody and stabilized solution-type antibody preparation
JP4905624B2 (ja) * 2003-10-31 2012-03-28 学校法人 久留米大学 ペプチドワクチン投与およびエストラムスチン処置の併用療法
WO2005041981A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Kurume University Combination therapy of peptide vaccination and estramustine treatment
WO2005099756A2 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Agus David B ErbB ANTAGONISTS FOR PAIN THERAPY
SV2006002143A (es) * 2004-06-16 2006-01-26 Genentech Inc Uso de un anticuerpo para el tratamiento del cancer resistente al platino
ES2521140T3 (es) 2004-07-22 2014-11-12 Genentech, Inc. Composición de anticuerpos de HER2
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
KR20070085855A (ko) * 2004-12-07 2007-08-27 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ 억제제를 이용한 치료를 위한 환자 선택 방법
CN101141981A (zh) * 2005-01-21 2008-03-12 健泰科生物技术公司 Her抗体的固定剂量给药
DK1850874T3 (da) 2005-02-23 2013-11-11 Genentech Inc Forlængelse af tid til sygdomsprogression eller overlevelse for ovariecancer ved anvendelse af pertuzumab
PE20070207A1 (es) * 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her
TW200812615A (en) 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
EP1913958B1 (en) * 2006-08-03 2009-12-23 Sanofi-Aventis Antitumor compositions containing acetylcyclopropyl docetaxel and trastuzumab
EP2056874B1 (en) 2006-08-21 2012-09-19 F. Hoffmann-La Roche AG Tumor therapy with an anti-vegf antibody
EP2132573B1 (en) 2007-03-02 2014-04-23 Genentech, Inc. Predicting response to a her dimerisation inhbitor based on low her3 expression
PL2171090T3 (pl) 2007-06-08 2013-09-30 Genentech Inc Markery ekspresji genów odporności guza na leczenie hamujące HER2
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
US8557242B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains
US8454960B2 (en) 2008-01-03 2013-06-04 The Scripps Research Institute Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains
US8574577B2 (en) 2008-01-03 2013-11-05 The Scripps Research Institute VEGF antibodies comprising modular recognition domains
US8557243B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute EFGR antibodies comprising modular recognition domains
EP2769991B1 (en) 2008-01-03 2018-08-22 The Scripps Research Institute Antibody targeting through a modular recognition domain
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
EP2644204B1 (en) 2008-03-18 2017-04-19 Genentech, Inc. Combinations of an Anti-HER2 antibody-drug conjugate and pertuzumab
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
US8734795B2 (en) 2008-10-31 2014-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
TWI461211B (zh) 2009-03-20 2014-11-21 Genentech Inc 抗－ｈｅｒ抗體
SG176073A1 (en) 2009-05-29 2011-12-29 Hoffmann La Roche Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
US9556249B2 (en) 2010-02-18 2017-01-31 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
JP6082344B2 (ja) 2010-05-27 2017-02-15 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２エピトープに対するモノクローナル抗体
EP2576621B1 (en) 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
EP2643353A1 (en) 2010-11-24 2013-10-02 Novartis AG Multispecific molecules
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
US20140170149A1 (en) 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
ES2704038T3 (es) 2011-05-24 2019-03-13 Zyngenia Inc Complejos multiespecíficos multivalentes y monovalentes y sus usos
EP2744824A1 (en) 2011-08-17 2014-06-25 F.Hoffmann-La Roche Ag Neuregulin antibodies and uses thereof
UA123092C2 (uk) 2011-10-14 2021-02-17 Дженентек, Інк. Спосіб неоад'ювантного лікування her2-позитивного раку молочної залози на ранній стадії у пацієнта
WO2013063229A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 The Regents Of The University Of Michigan Her2 targeting agent treatment in non-her2-amplified cancers having her2 expressing cancer stem cells
CA2857114A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Genentech, Inc. Erbb3 mutations in cancer
US9376715B2 (en) 2011-12-09 2016-06-28 Roche Molecular Systems, Inc Methods for detecting mutations in the catalytic subunit of the phosphoinositol-3 kinase (PIK3CA) gene
WO2013096812A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Articles of manufacture and methods for co-administration of antibodies
EP2831115A1 (en) 2012-03-27 2015-02-04 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
JP6998646B2 (ja) 2012-11-30 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－ｌ１阻害剤併用療法を必要とする患者の同定
KR20140103554A (ko) * 2013-02-18 2014-08-27 고려대학교 산학협력단 sLZIP 단백질을 포함하는 안드로겐 의존성 전립선암 치료용 의약 조성물
BR112015023752B1 (pt) 2013-03-15 2023-11-14 Zyngenia, Inc. Domínio de reconhecimento modular (mrd), complexo compreendendo mrd e cetuximabe, usos do complexo para inibir a angiogênese e tratar câncer e composição farmacêutica compreendendo o dito complexo
EP3800204A1 (en) 2013-04-16 2021-04-07 F. Hoffmann-La Roche AG Pertuzumab variants and evaluation thereof
WO2015164665A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Genentech, Inc. Methods of treating early breast cancer with trastuzumab-mcc-dm1 and pertuzumab
US11406715B2 (en) 2015-05-30 2022-08-09 Genentech, Inc. Methods of treating HER2-positive metastatic breast cancer
WO2017087280A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating her2-positive cancer
EP3454863A1 (en) 2016-05-10 2019-03-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
KR20190075114A (ko) 2016-11-04 2019-06-28 제넨테크, 인크. Her2-양성 유방암의 치료
CA3046092A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 Genentech, Inc. Treatment of advanced her2 expressing cancer
UA123292C2 (uk) 2017-01-17 2021-03-10 Дженентек, Інк. Рідка фармацевтична композиція, яка містить пертузумаб та трастузумаб
US11077189B2 (en) 2017-03-02 2021-08-03 Genentech Inc. Adjuvant treatment of HER2-positive breast cancer
AU2018258263A1 (en) 2017-04-24 2019-10-24 Genentech, Inc. ErbB2/Her2 mutations in the transmembrane or juxtamembrane domain

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4935341A (en) * 1986-06-04 1990-06-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Detection of point mutations in neu genes
US6054561A (en) * 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
US4753894A (en) * 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US5169774A (en) * 1984-02-08 1992-12-08 Cetus Oncology Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) * 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4968603A (en) * 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
US4975278A (en) * 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5824311A (en) * 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
US5720937A (en) * 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989006692A1 (en) * 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
DK0474727T3 (da) * 1989-05-19 1998-01-12 Genentech Inc HER2 ekstracellulært domæne
US5705157A (en) * 1989-07-27 1998-01-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating cancerous cells with anti-receptor antibodies
EP0444181B2 (en) * 1989-08-04 2010-11-24 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft C-erbb-2 external domain: gp75
US6884418B1 (en) * 1989-08-04 2005-04-26 Berlex Laboratories, Inc. Use of ligand-mimicking agents and anti-neoplastic drugs in cancer therapy
US5183884A (en) * 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
CA2079585C (en) * 1990-04-06 1997-01-07 Mark I. Greene Ligand for the neu gene product
US5578482A (en) * 1990-05-25 1996-11-26 Georgetown University Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses
EP0517895B1 (en) * 1990-12-14 1996-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US5571894A (en) * 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5367060A (en) * 1991-05-24 1994-11-22 Genentech, Inc. Structure, production and use of heregulin
IL101943A0 (en) * 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
US5834229A (en) * 1991-05-24 1998-11-10 Genentech, Inc. Nucleic acids vectors and host cells encoding and expressing heregulin 2-α
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE122004000008I1 (de) * 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
ATE176328T1 (de) * 1991-08-22 1999-02-15 Becton Dickinson Co Methoden und zusammensetzungen zur krebstherapie und zur vorhersagbarkeit der reaktionen auf diese behandlung
US5288477A (en) * 1991-09-27 1994-02-22 Becton, Dickinson And Company Method for prognosticating response to cancer therapy
US5587458A (en) * 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ATE295420T1 (de) * 1992-02-06 2005-05-15 Chiron Corp Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5776427A (en) * 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
AU5355594A (en) * 1992-10-09 1994-05-09 Oncor, Inc. Methods for the detection of chromosome structural abnormalities by (in situ) hybridization to fixed tissue
FR2697752B1 (fr) * 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5869445A (en) * 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
WO1995030331A1 (en) * 1994-05-05 1995-11-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
US5910486A (en) * 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5480698A (en) * 1994-09-13 1996-01-02 Hayman-Chaffey; Charles Acrylic or polycarbonate sheet-lacquer laminates and articles of furniture made therefrom
US5846749A (en) * 1994-10-12 1998-12-08 The Regents Of The University Of California Quantitative measurement of tissue protein identified by immunohistochemistry and standardized protein determination
US5804396A (en) * 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US5783404A (en) * 1995-04-13 1998-07-21 Amgen Inc. Methods and compositions for determining HER-2/neu expression using monoclonal antibodies
US5663144A (en) * 1995-05-03 1997-09-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compounds that bind to p185 and methods of using the same
US6410690B1 (en) * 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
WO1997000271A1 (en) * 1995-06-14 1997-01-03 The Regents Of The University Of California Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
WO1998004689A1 (en) * 1995-07-31 1998-02-05 Urocor, Inc. Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate disease
US5783186A (en) * 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5922845A (en) * 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
JP4382879B2 (ja) * 1996-07-12 2009-12-16 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガンマ―ヘレグリン
US5789522A (en) * 1996-09-06 1998-08-04 Shipley Company, L.L.C. Resin purification process
KR20060079258A (ko) * 1996-10-18 2006-07-05 제넨테크, 인크. 항-ＥｒｂＢ２ 항체
US5885864A (en) * 1996-10-24 1999-03-23 Micron Technology, Inc. Method for forming compact memory cell using vertical devices
US5994071A (en) * 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
US6358682B1 (en) * 1998-01-26 2002-03-19 Ventana Medical Systems, Inc. Method and kit for the prognostication of breast cancer
US6417168B1 (en) * 1998-03-04 2002-07-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of treating tumors
DE60041808D1 (de) * 1999-01-27 2009-04-30 Cornell Res Foundation Inc Behandlung von mit her-2/neu-überexprimierung einhergehendem krebs
US6333348B1 (en) * 1999-04-09 2001-12-25 Aventis Pharma S.A. Use of docetaxel for treating cancers
WO2002044413A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 Response Genetics, Inc. Method of determining epidermal growth factor receptor and her2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates
US6582919B2 (en) * 2001-06-11 2003-06-24 Response Genetics, Inc. Method of determining epidermal growth factor receptor and HER2-neu gene expression and correlation of levels thereof with survival rates

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918844A (zh) * 2007-06-18 2010-12-15 米迪缪尼有限公司 表达epha2和erbb2的细胞的协同治疗

Also Published As

Publication number Publication date
CY1107637T1 (el) 2013-04-18
JP2003503361A (ja) 2003-01-28
BR0012195A (pt) 2002-07-23
DE60033658D1 (de) 2007-04-12
JP4579471B2 (ja) 2010-11-10
DE60033658T2 (de) 2007-11-22
CA2383493A1 (en) 2001-01-04
US20060083739A1 (en) 2006-04-20
ATE355079T1 (de) 2006-03-15
KR100754049B1 (ko) 2007-08-31
KR20020069104A (ko) 2002-08-29
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AU5499200A (en) 2001-01-31
PT1189634E (pt) 2007-06-06
DK1189634T3 (da) 2007-06-25
EP1189634B1 (en) 2007-02-28
CN100381172C (zh) 2008-04-16
JP2009269928A (ja) 2009-11-19
ZA200110088B (en) 2002-08-26
AU779209B2 (en) 2005-01-13
WO2001000238A1 (en) 2001-01-04
EP1189634A1 (en) 2002-03-27
MXPA01013395A (es) 2003-09-04
IL147017A0 (en) 2002-08-14
US20090087432A1 (en) 2009-04-02
CA2383493C (en) 2010-08-10

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