CN1416465A - 在广谱脉冲光治疗时保护生物衍生的组合物中的分子的方法 - Google Patents
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Abstract
对在用至少一次广谱非相干多色光(BSPL)高强度短历时脉冲照射下生物衍生组合物中感兴趣生物分子的保护方法。用白蛋白补充这种组合物,然后进行这种照射,由于白蛋白提供的保护,照射后的组合物中感兴趣生物分子保留了其生物活性,且BSPL也对该组合物起到了所需的作用。例如,可大大降低活病原体或其它毒素的含量,或杀死活细胞如肿瘤细胞或基因工程改造的真核细胞,或让光敏蛋白质恢复活性。生物衍生组合物可以是基因工程改造的细胞系等的产物,或是人或动物血清的分离组分或分离物。
Description
发明背景
在科学研究和在药物/治疗剂制造中生物衍生组合物的使用无所不在。通常,用多种人和动物的血清作为蛋白质制剂的来源,用于治疗各种疾病和异常;例如,提供所需的能有效作为治疗剂的分子和用于回收可用于制备疫苗的抗原。目前,通常使用器官培养方法来生产多种药物/治疗药和相关组合物,如重组DNA和/或重组蛋白(从基因工程改造的细胞系制备)、病毒载体、氨基酸、胨、胰岛素和单克隆抗体;这些生物反应器的产物需要进一步加工。
由于这些组合物来自活生物体,包括人类、动物、植物和细菌,它们可能被一种或多种病毒、细菌或其它病原体或化学毒素(通常由某些加工步骤造成的)污染。具有严重免疫系统缺陷的人,如患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病人,特别容易通过接触生物衍生组合物中污染的病原体或化学毒素而感染。除了对接受生物衍生组合物的人或动物造成感染危险外,由于存在病毒、细菌和其它病原体或化学毒素污染物,这种组合物本身的效力也可能是有缺陷的。
重组DNA和蛋白质、单克隆抗体、病毒载体和相关组合物也是用于研究和制造过程中可能被病毒、细菌和/或其它病原体污染的生物衍生组合物实例。因此,在药物制备方法的开发中,通常包含去除生物衍生的组合物中可能存在的病毒和其它病原体或毒素或对其进行消毒的步骤。目前,已有许多去除生物衍生组合物中的污染或对其进行消毒的方法,方法包括物理方法、化学方法、加热方法、辐照方法和它们的组合。
如美国专利No.4,540,573(Neurath等人)、美国专利No.4,946,648(Dichtelmüller等人)、美国专利No.5,418,130(Platz等人)、美国专利No.5,527,704(Wolf,Jr.等人)、美国专利No.5,663,043(Zepp等人)和美国专利No.5,866,316(Kempf等人)中描述了其它去除或灭活病毒、细菌/或其它病原体污染的生物衍生组合物的熟知方法。这些专利描述了联合处理生物衍生组合物来灭活其中的病毒和/或细菌污染物,但其包括使用至少一种化学药品直接降解污染生物或使其对另一种化学药品或加热或辐照的降解作用敏感。与此相反,最近发现用特殊的光能特别有效且高效地处理这些组合物。例如,美国专利No.4,726,949、4,866,282和4952,812,Miripol等人描述了用波长主要为280纳米-320纳米的紫外光持续辐射一薄层白血细胞约0.25-15分钟,以导致白血细胞基本上丧失其在同种异体免疫病人中引发免疫反应的能力。
广谱脉冲光(BSPL)提供了一种用广谱的非相干多色光的高强度短历时脉冲灭活微生物和毒素的方法。BSPL也可用于实现所需的光敏生物分子的重排,使它们具有更高的生物活性。BSPL与连续非脉冲紫外光有许多方面的不同。BSPL的光谱含有紫外光,但还包括更宽的光谱,尤其是在约170-2600纳米之间的光谱。BSPL的光谱和海平面的阳光光谱相似,虽然比其强90,000倍,并含有在正常情况下被地球大气层滤去的200-300纳米之间波长的紫外光。与非脉冲紫外光的更长曝光时间和较低能量相比,BSPL以相对高能的短历时脉冲应用。参见美国专利No.5,034,235(Dunn等人)、5,489,442(Dunn等人)、5,768,853(Bushnell等人)和5,786,598(Clark等人)。
BSPL提供了与非脉冲紫外光不同的生物学作用。例如已知产生色素的细菌,如黑曲霉(Aspergillus niger)对紫外光辐射比芽孢杆菌孢子更有抗性。然而在用BSPL的研究中,黑曲霉在干燥表面上比以下三种不同的芽孢杆菌孢子更敏感:嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、和短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。另外,常规UV处理会损伤DNA,其损伤机制在某些实验条件下可逆转,这些机制分类为“暗酶修复”或“光酶修复”(Block S
“消毒、灭菌和防腐”,第四版,Williams and Wilkins,U.S.A.(1991))。在用BSPL处理微生物(如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、黑曲霉、生孢梭菌(Clostridium sporogenens)、白色念珠菌(Candida albicans)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱沙门菌和绿脓杆菌)时,该暗酶或光酶的光反应不发生。存在可见光范围内的波长,以及产生这两种不同光的方法进一步将BSPL与紫外光区分开来。常采用汞灯产生紫外光,它造成了一些安全威胁;而BSPL是使用惰性气体(如氙气)的灯产生的。
发现BSPL能特别有效地灭活病毒,在制造和使用生物衍生的组合物中病毒常常是最受关注的。根据基因组,病毒通常分为DNA或RNA病毒,和/或根据有衣壳或无衣壳的生理特征进行分组。另外,各个病毒常常分类编入一病毒家族,一个家族中共有某些进化特征。因此,例如疱疹病毒家族(疱疹病毒科)中的病毒是衣壳DNA病毒,而腺病毒家族的病毒是无衣壳DNA病毒。有衣壳和无衣壳RNA病毒的例子分别是黄病毒科(包括黄热病病毒、丙型肝炎病毒和牛腹泻病毒)和微小核糖核酸病毒科(包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和甲肝病毒)。对于人类毒性最强的病毒包括例如:细小病毒、猿猴乳多空病毒(SV40)、人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)。针对上述病毒BSPL都是有效的。
已用BSPL去除各种目标,如食品、包装、水和其它液体、半流体和固体的污染和/或对其消毒。本来,这些是通过将目标物放入或使目标物通过BSPL消毒室,使目标物暴露在合适数量的合适能量水平的BSPL光束下,见例如上述四个专利和美国专利No.5,900,211(Dunn等人)。其应用在出版物“纯光的灭菌系统”,W.H.Cover of PurePulse Technologies of San Diego,CA(1999年6月)中也有详细地描述。虽然BSPL已被证明能用于对各种微生物进行灭活,但它也可能会不良地降解一些感兴趣的生物分子,使它们的生物活性减少,从而大大降低其在处理特殊生物衍生的治疗剂和药物组合物中的价值。
于1999年7月9日申请的美国专利申请No.09/329,018(授权于本申请的申请人,本文将其纳入作为参考),公开了灭活生物衍生组合物中所含的病毒、细菌和/或其它病原体的方法,本方法对各种病原体,尤其是对于各种病毒是有效的,而且能用于各种组合物的处理中。但有时这种处理可能会降低终产物的效力,当有这种情况时,则需要使用针对该情况的监测或至少基本减少这种对感兴趣生物分子的不良作用。
发明概述
为满足上述需要和其它需要,本发明提供了以净化等为目的,用广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲(BSPL)处理含感兴趣生物分子的生物衍生组合物以保护感兴趣生物分子的方法。已发现:在将组合物进行BSPL处理之前,先在其中添加白蛋白,基本能避免感兴趣生物分子的降解。白蛋白指血清白蛋白和其它类似的在保护其它分子不受BSPL降解上功能相当的蛋白质。本发明还提供了经过如此改善的含感兴趣生物分子的组合物,例如这种组合物已不含致病或其它毒性污染物。
一些方法至少减少1个数量级的存在于含有感兴趣生物分子的生物衍生组合物中的活病原体,如病毒、细菌、毒素、致热原、真菌和/或原生动物或其它毒素的含量,或杀死活的真核细胞(基因工程改造以产生感兴趣蛋白)或携带感兴趣生物分子的肿瘤细胞。这些方法包括:在包含病原体或其它毒素和至少一种感兴趣生物活性分子的组合物中加入白蛋白制成补加组合物,将这种补加组合物进行广谱脉冲光照射来降解病原体或其它毒素,补加组合物中白蛋白的含量应能使活病原体或其它毒素的含量减少至少10倍且不会使生物分子的生物活性降低到不能接受的水平,这些方法还包括将生物分子回复到生物活性状态。较佳地,生物分子保留至少约50%生物活性,优选的是其更高的生物活性。
这些方法可有利地应用于生物衍生的组合物,如生物反应器中的发酵肉汤,含有基因工程改造的哺乳动物细胞系、其它细胞培养物、基因治疗产物(如病毒载体)、人和/或动物血衍生的分离物、生物药物(如肝素、蛋白胨、胰岛素和转铁蛋白),而不会破坏感兴趣的生物分子的治疗特性、药学性质、抗原性、营养或其他所需性能。特别是,将足够的白蛋白加入组合物,使存在于该生物衍生组合物中的蛋白质、多糖、核酸、脂类、单克隆抗体和其它感兴趣的生物分子不会丧失对其用途必须的性能,即感兴趣的生物分子不会被不可逆地改变(例如由于暴露于这种广谱脉冲光下,使它们不再显示其理想的生物活性)。因此,有益的是在经过这种广谱脉冲光处理后,生物衍生组合物几乎(如果存在)不需要其它加工步骤,一项作为生物分子回收部分的步骤为任选地白蛋白的分离。
一方面,在BSPL有效和可靠地灭活可能存在于生物衍生产品中的病毒,如HIV-1或-2、甲、乙或丙型肝炎病毒、HTLV-I或II或巨细胞病毒的同时,保护了感兴趣的生物分子。另一方面,本文提供了类似的快速、有效和可靠的方法来灭活可能存在于一些上述处理过的组合物中的化学毒素,即添加白蛋白后暴露于BSPL。
另一方面,本发明提供了活化存在于含有感兴趣生物分子的生物衍生的组合物中的光可活化蛋白质的方法,这些方法通过添加白蛋白,然后用广谱非相干多色光的高强度、短历时脉冲照射该补加的生物衍生组合物至少一次。
另一方面,本文提供了在灭活存在于生物衍生组合物中的至少一种病原体或其它毒素的同时,保护有此需要的至少一种生物分子免受暴露于BSPL的方法,这些方法通过添加白蛋白,然后使组合物接触广谱(即170-2600纳米;1.8×1015-1.2×1014Hz)非相干多色光的高强度(即0.01焦耳/平方厘米-50焦耳/平方厘米,如0.05焦耳/平方厘米-1.0焦耳/平方厘米,其中能量密度是在靶目标表面测得的)、短历时(即10纳秒-100毫秒,如0.3毫秒)脉冲。通常用1-5次脉冲。
在一个具体方面,本发明提供了一种在减少生物衍生组合物中病原体或其它毒素含量的同时保护生物分子基本不降解的方法,该方法包括步骤:提供一种生物衍生组合物,该组合物含有至少一种病原体或其它毒素和至少一种生物活性生物分子,该组合物还可包含活真核细胞如白细胞;将白蛋白加入该组合物,制得补加组合物;用广谱脉冲光(BSPL)照射该补加组合物,以降解所述的病原体或其它毒素,在所述的补加组合物中所述的白蛋白的含量,使所述的活病原体或其它毒素的含量减少至少10倍,但所述的生物分子的生物活性却没有减少至不能接受的水平;回收生物活性状态的所述的生物分子。
在另一个具体方面,本发明提供了一种含有感兴趣生物分子的生物衍生组合物,存在白蛋白时通过用BSPL处理使组合物中的活病毒含量比其原来含量至少降低了10倍,同时保留所述生物分子的生物活性。
在另一具体方面,本发明提供了一种用广谱脉冲光(BSPL)活化生物衍生组合物中的蛋白质的方法,且该生物衍生的组合物中还含有感兴趣的生物分子,所述的方法包括步骤:提供一种生物衍生组合物,该组合物含有光敏蛋白质和至少一种生物活性生物分子;将白蛋白加入该组合物制得补加组合物;用广谱脉冲光(BSPL)照射该补加组合物至少一次,从而活化所述的蛋白质而基本未降低所述的生物分子的生物活性。
在另一具体方面,本发明提供了一种在减少生物衍生组合物中存在的病毒或化学毒素含量的同时保护生物分子的方法,该方法包括步骤:提供一种生物衍生组合物,该组合物含有病毒或化学毒素和至少一种感兴趣的生物活性生物分子;将白蛋白加入该组合物制得补加组合物;用广谱的非相干多色光的高强度短历时脉冲(BSPL)照射该补加组合物至少一次,从而使所述的活病毒或化学毒素的含量减少至少10倍,而同时所述的生物分子保留其生物活性。
附图简述
图1是示范性脉冲光处理装置的处理区示意图,可用于按本发明将生物衍生组合物暴露于BSPL,以净化或光-活化蛋白质,该装置使用排列紧密的薄板,处理其中所放置的组合物;
图2是另一种本文所用的示范性脉冲光处理装置的示意图,该装置使生物衍生组合物沿纵向流过环绕一伸长的非相干脉冲光源的套筒,该光源提供广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲;和
图3是另一种示范性脉冲光处理装置的示意图,其中生物衍生组合物在椭圆反光镜内平行于一个或多个伸长的非相干光源流动,并用广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲处理。
优选例详细描述
本发明提供了在暴露于BSPL以有效灭活生物衍生组合物中存在的病原体或其它毒素和/或激活光敏蛋白质时保护感兴趣生物分子的生物学完整性的方法。已发现通过在该组合物中添加白蛋白,可用广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲来灭活存在于生物衍生组合物中的病毒、细菌、其它病原体和/或化学毒素,杀死某些活真核细胞,和/或活化光敏蛋白质,且一般不破坏感兴趣生物分子,如组合物中的蛋白质、多糖、抗体、核酸脂类、氨基酸和/或胨的所需生物学性质。例如,基因工程改造的细胞系衍生的组合物及其相关产物,如转基因动物的活组织可用作这种处理的潜在候选物。
对本专利申请的目的而言,白蛋白指血清白蛋白和其它类似的在保护其它分子不受BSPL降解上功能相当的蛋白质。包含约580个氨基酸残基的哺乳动物血清白蛋白和其它相当的血清白蛋白(如鱼、两栖动物和爬行动物的血清白蛋白)是优选。牛血清是一种易得的血清白蛋白源(其通常用于体外生物研究),人白蛋白是更优选的。一般添加的白蛋白使补加组合物的浓度为约1mg/ml到75mg/ml之间;但优选白蛋白浓度为约5mg到50mg之间。通过样品的测试易确定用BSPL实现所需的对病原体的灭活的同时提供适当保护所需的合适水平,在以下的实施例中列出了这些测试的实例。如果需要,在用BSPL处理后可从将添加的白蛋白与感兴趣分子分开,或者根据最终的用途省去分离步骤。这种任选的白蛋白的分离方法是本领域熟知的,包括过滤和液相层析。
具体说,将用白蛋白补充的生物衍生组合物置于和/或流过广谱脉冲光处理装置中,在该装置的处理区域中照射至少一次,优选两次,最优选三次短历时。脉冲持续时间低于约100毫秒,且是所用灯的人造现象且并非关键;通常维持时间为约0.3毫秒。脉冲应为高强度,如0.01-50焦耳/平方厘米,宜为0.05-2.0焦耳/平方厘米,更优选的是0.25-1.5焦耳/平方厘米,最优选的是0.5-1.0焦耳/平方厘米,在组合物表面测定计。BSPL是广谱非相干多色光,如170-2600纳米;即1.8×1015-1.2×1014Hz。总的说,预计这种商业方法可使用1-5次短脉冲。如此照射的结果,生物衍生组合物内的活病原体或其它毒素含量减少至少1个log(即10倍),且优选减少2个log以上(即100倍),或光敏蛋白质被活化,而同时补充的白蛋白保护了感兴趣生物分子。
可用各种装置实施这些BSPL照射方法。已有人描述了设计用于提供广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲的装置,例如在`235专利、`442专利、`853专利、`442专利、`853专利、`598专利和专利No.5,900,211中。与用于提供广谱脉冲光处理的装置相同的是,处理室是不透光的;闪光灯置于该装置内,使其射出的光最佳地照射在目标物体上;优选使用能进一步使脉冲光最大程度指向目标物体的反射材料;当在闪光灯和目标物体之间需要材料(如处理室内的目标物体的支持结构)还使用了可透射材料(如石英、蓝宝石或类似材料)。
在设计或选择BSPL处理装置中,最重要的是装置处理区的结构,即装置内用脉冲光照射目标物体的区域。由于脉冲光必须照到目标物体的所有表面,一般将处理区设计成能将最大程度照向目标物体。例如,当同时使用多盏闪光灯来照射靶=目标物体时,优选将处理区设计成目标物体与每盏闪光灯都是等距离的,从而闪光灯能较佳地环绕目标物体。为了确保脉冲光照射到整个目标物体,在处理区中用来支持目标物体的结构优选由至少约1%,较佳地由至少约10%,更优选由至少约50%,和最优选由至少约85%的BSPL可透过的材料组成。
图1显示了用BSPL处理生物衍生组合物的优选示范性装置的处理区示意图。在该优选装置中,两片薄(如不到5毫米,例如约2毫米)的可透射板110、112彼此平行放置,并相互非常靠近(即间距不到5毫米,如约1毫米),提供了通道或管道100,使待处理的组合物能通过其中。在板110、112的背面装置了两个闪光灯系统102、104,各包括部分包围闪光灯108的反射片106。这些闪光灯系统是可购得的,例如可从PurePulse Technologies of San Diego以商品名PUREBRIGHT型PBS-1号购得。
优选延长闪光灯108,优选白蛋白补充的生物衍生组合物(由图1中的箭头114表示)的流动与延长的闪光灯平行。较佳地,板110、112彼此沿两条平行于闪光灯的对边固定,从而使在它们之间通过的组合物被包含在其中;可使用合适的透光胶体如琼脂糖密封边缘。在平行板中,可用正方形的透射管道(如石英或蓝宝石)将组合物转运过照射的处理区。虽然仅用两个闪光灯系统102、104照射,但也可使用其它系统;例如可用脉冲光源环绕管道100。在这两种情况下,当生物衍生组合物通过(或停留在)管道100时,从闪光灯系统116发出的光照向它,从而灭活其中所含的病毒和/或其它微生物或毒素和/或活化其中的光敏蛋白质。将管道100的板110、112靠近放置在一起有好处,可使待处理的组合物通过时分散成一薄层,即使组合物比较不透明和/或未稀释时,也有利于组合物整体暴露在脉冲光下。如果只需要在管道100上安置闪光灯,则只需要上板110是可透光的,下板则可以是不透明的。
图2显示了另一种示范性装置50的示意图,该装置可用于照射这种包含感兴趣生物分子和白蛋白的组合物。装置50包括一个反射性柱状外壳,形成了处理室202,组合物流经其中,周围环绕脉冲光源204。脉冲光源是高能氙闪光灯,按照常规的闪光灯操作实践装有合适的电源(未显示)。
液体循环泵208根据脉冲光源204的脉冲重复速率控制着组合物通过处理室202的流速,从而在组合物位于处理室202中时,使通过其中的全部产品暴露在预定数量的广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲。一般待处理的组合物以约1-4升/分钟的流速被泵送通过该处理室。
可以安排产品处理室202与脉冲光源204分开,以避免其中的组合物与光源204接触。要实现这一点,可以使用例如石英外壳(或石英柱)环绕光源204,而待处理的组合物在石英柱外通过。如果需要,冷却水可以在光源204和石英外壳之间循环。
处理室的直径可根据许多因素而不同,包括(但不限于)待处理的组合物的具体吸收特性,光源204(即闪光灯)的物理和操作特性,和光脉冲即闪光之间产品混合的程度。处理室202可包括一作为其外壁的集成反射片或外部反射片,以反射照射光穿过组合物回到组合物流动通道。当使用外部反射片时,该集成反射片可包括一石英(或其它透射材料)柱体(或管道),组合物在其中通过,外面装有外部反射片。
注意到一些天然或稀释后的生物衍生液体对包括相当部分的UV光谱的光相对透明,所以光在这些组合物中的吸收较少减弱,光通量密度主要仅随离光源的距离而下降。其它组合物可能具有显著吸收,光通量密度将以这种组合物吸收的函数形式下降。然而,并不将组合物的透射率视为潜在的问题,因为反射片将确保充足的照射通过。在任一情况下,在整个处理区中应维持所需的最小光通量密度,如0.4或0.5焦耳/平方厘米(或甚至低至0.1-0.2焦耳/平方厘米,这取决于照射处理的目的)。可另选的或另外的,应进行混合(如湍流),以确保所有要处理的液体都受到适当的光通量密度和脉冲数处理以达到所需程度或水平的病原体灭活或蛋白质光活化。
虽然闪光灯204在图2装置50中位于处理室202的内部,图3显示了可另选地(或另外地)将一盏或多盏闪光灯256置于处理室252的外部。显示了一种优选设计,其中将带处理的补充有白蛋白的组合物通过采用透射处理管道(如石英管)的处理室252。处理室252沿椭圆反射片254的一个焦点放置,沿椭圆反射片254的另一个焦点放置了一闪光灯256。闪光灯256最好套在石英管中,用水冷却。由于椭圆反射片254将光脉冲聚焦在处理室252的中央,对于待处理的组合物的光吸收提供了补偿,从而流过的组合物全部受到均一的光处理。在所示实施例的一个变化(未显示)中,如需要可采用多个椭圆反射片,每个在一个焦点有一个闪光灯,在另一个焦点具有处理室252。
虽然已描述在实施本发明的方法中可使用各种装置,但本领域技术人员将会理解为了这些目的可选择使用各种其它装置,包括上述装置的组合,因此它们在本文中是平等考虑的。
在这样的处理装置中,通常用BSPL来照射和处理生物衍生组合物,以减少活病原体或化学毒素(如病毒和/或细菌)的含量至少10倍。较佳地,处理方法包括用强度至少约0.01焦耳/平方厘米,优选至少约0.05焦耳/平方厘米、更优选至少约0.25焦耳/平方厘米和最优选至少约0.5焦耳/平方厘米的脉冲光照射补充有白蛋白的生物衍生组合物,其中能量强度是在被照射的组合物表面测得的。
光脉冲优选历时宜非常短,脉冲历时则变化很大,因为其基本是所用闪光灯的人造现象。优选脉冲历时不到100毫秒;更优选约10毫秒以内(如约10纳秒-10毫米);通常使用的脉冲历时为约0.3毫秒。除了高强度和短历时脉冲光外,它应是广谱非相干多色光。优选包括170-2600纳米(即频率为1.8×1015Hz-1.2×1014Hz)的光。
因为脉冲之间的时间非常短,如不到100毫秒,在不到1分钟内完成补充有白蛋白的组合物的一次多脉冲处理。如果处理是被泵送或循环(与批处理相反)流动的产品,理想的是提供多个沿流动路线安置的闪光灯,使流速更快。这类短时处理与先前已知的减少生物衍生组合物中的病原体含量的方法形成强烈的对比,后者需要几小时才能完成。
为了根据本发明的方法最有效和最可靠的处理生物衍生组合物,整个组合物应尽可能的用广谱脉冲光充分照射。因此,为了避免阻挡光线照射到待处理组合物的表面,至少在处理过程中将待处理的组合物包含在BSPL能充分透射的材料中,较佳地使用这种广谱脉冲光能透射至少85%的材料。合适的材料的例子包括:例如聚烯烃,如聚乙烯和聚丙烯,尼龙,石英和蓝宝石;`598专利讨论了各种适用于脉冲光处理装置的其它聚合物。
为了形成包含材料可优选不同材料,这取决于使用的脉冲光处理装置的具体配置。例如,当处理装置使用靠近安置的薄板中流过生物衍生组合物时,这些板优选用较硬的透光性材料制成,如石英或蓝宝石。相反,当处理区是静脉管时,优选柔韧的聚合物材料。
除了考虑用何种脉冲光处理装置,和待要处理的生物衍生组合物包含在哪种材料中以外,还应考虑组合物本身的某些性质。例如,生物衍生组合物的透光性可能是确保广谱脉冲光的完全照射的一个因素。然而,即使可能已将生物衍生组合物的透光性降至广谱脉冲光,据信通常其中反射充足可以确保实现完全照射。另外,一般可用简单的稀释来调节生物衍生组合物的透光性。合适的稀释方法以及用BSPL处理后任选进行的再浓缩方法都是熟知的。
当将补充后的组合物进行BSPL时,感兴趣生物分子的生物活性可能有些减弱,而在待处理组合物中添加充足的白蛋白,使组合物中的白蛋白浓度达到保护水平,就可较佳地保持至少约50%感兴趣生物分子的生物活性,更佳地为保持其至少约70%的生物活性,更佳地为至少约80%生物活性,最优选的为至少约90%生物活性。通常,添加较大量的白蛋白(从而使带处理的补加组合物中白蛋白的浓度较高)可以保留较多的生物活性;另一方面,如果白蛋白的浓度过高,则可能阻碍病原体或其它毒素所需水平灭活的实现和/或实现所需灭活水平或光敏蛋白质所需水平活化需要更高的能量和/或更多次BSPL的脉冲。这种交替在以下的试验数据中是显见的。
如果需要,可将待处理的生物衍生组合物的样品用所需量的白蛋白悬浮,然后稀释或不进行稀释就处理。图1、2和3显示了三种将生物衍生组合物引入脉冲光处理装置处理区的三种优选示范方法,另外也可使用有任选搅拌的处理。处理后,可任选地进行白蛋白的分离。
图2和3描述了管式流动法的具体实施例。在这两个实例中,将组合物经柱状或椭圆处理装置的管子或类似的伸长通道引入处理室的处理区。优选至少在组合物所在点受到脉冲光照射的管道直径足够小,使组合物整体被照射到。
在批处理中,可将组合物分成相对少量,置于处理区域中的一个或多个合适的透光容器内并用脉冲光照射,按组合物可任选地搅拌。在图1所示的替代方法中,板式流动装置含有两张靠近放置的薄板,待处理的组合物从其中流过。这种具体方法可将组合物分散成薄而宽的层,允许一次处理相当体积的组合物。也可使用其它替代方法。
下面是一些用本文描述的各种方法通过BSPL灭活具体病原体的例子,以及说明暴露于示范性BSPL处理时用白蛋白保护各种酶的实施例,和存在这些保护浓度白蛋白时BSPL杀灭大肠杆菌的效力。先前已显示了BSPL能有效灭活胎牛血清中的SV-40、HIV-1、CPV和BVD以及大肠杆菌。提供其中的2个试验用以参考,随后的实施例显示存在不同浓度白蛋白时也能类似地灭活。随后的实施例说明当与灭活病原体剂量的BSPL接触时,白蛋白确实能有效地保护示范性蛋白质(即酶)基本不丧失生物活性。
实施例1:CPV的灭活
用CPV(ATCCVR-2017)接种A-72细胞(ATCC CRL1542)。当75%-100%的细胞显示细胞病变作用(CPE)时,收集病毒。冰冻病毒原液,于-60℃储藏在含有10%-15%FBS的培养液中。
用A-72细胞滴定含有CPV的样品。用于A-72细胞生长和维持的培养液是补充有5%-10%热灭活FBS、10毫克/毫升庆大霉素、100单位/毫升青霉素和2.5毫克/毫升两性霉素B的E-MEM。在36-38℃湿润的5-7%CO2环境中培育细胞培养物。
在无菌聚乙烯样品容器中加入0.2毫升以含有5%热灭活FBS的E-MEM配的CPV。制备了12份样品。9份样品用BSPL(即,约170-2600纳米光谱的非相干多色光,其中50%的波长低于约600纳米)处理。其中,三份用一次光脉冲处理,三份用两次脉冲处理,三份用三次脉冲处理。每次脉冲的密度为约1.0焦耳/平方厘米。三份未处理的样品作为对照。
曝光后,在以A-72接种的96-孔微量培养板中制作各病毒样品的10倍稀释液,进行滴定。使CPV吸附1-2小时,然后从孔中除去,替换新鲜培养液。将上清液样品从CPV滴定板转移到新的滴定板中,测试血细胞凝集(HA)。用RPMI(无酚红)滴定作为对照。所有滴定在板中作一式四份,监测CPE和/或细胞毒性的存在达10日。表1列出了结果。
表1:用BSPL处理CPV
重复# | 0次脉冲 | 1次脉冲 | 2次脉冲 | 3次脉冲 |
#1 | 3.16×102 | 无存活* | 3.16×102 | |
#2 | 1×106 | 3.16×102 | 无存活* | 无存活* |
#3 | 3.16×102 | 无存活* | 无存活* | |
平均 | 1×106 | 3.16×102 | 无存活* | 3.16×102 |
*该实验的检测极限是≤3.16×101。
将曝光后滴度与曝光前滴度比较,以测定接触BSPL后病毒感染力是否下降。实施例1显示用BSPL后发生CPV减少了3-4个log。
该实施例中使用了可得到的最高滴度。当使用的起始滴度越高,用的脉冲次数越多,或培养液稀释到较低的蛋白浓度时,预期病毒减少也越大。
实施例2:大肠杆菌的灭活
用大肠杆菌(ATCC26)接种15%FBS样品并在32℃培养过夜,直到最终浓度为8.8×104CFU/ml(4.9log CFU/ml)。然后根据本文所述的方法,用3次广谱光的短历时脉冲(1.0焦耳/平方厘米/闪光)照射200微升受污染的血清(含有17,600CFU,即4.25log CFU),使组合物全部被照射。制备该样品的系列稀释液(10×)(用0.05M磷酸缓冲液)并接种于标准琼脂平板上。32℃培育该平板,在24和48小时计数。
培育48小时后,在任何平板上都观察不到存活的大肠杆菌。如果灵敏度水平是20CFU(即1.3log CFU),该试验证明仅用三次广谱光脉冲处理接种有大肠杆菌的FBS,导致细菌含量减少了3个log。(4.25logCFU-1.3log CFU=2.95log CFU)。
实施例3:存在BSA时大肠杆菌的灭活
制备5份组合物,分别含有5、25、50、75和100毫克BSA/毫升去离子水。将在TSB(胰蛋白酶的大豆肉汤)中培育过夜的大肠杆菌培养物分别加到这5份组合物中,使每份的大肠杆菌浓度>6log CFU/ml。然后取出这些补充过的组合物的各样品,用不同次数的闪光和/或不同的脉冲密度(0.25焦耳/平方厘米/闪光-1.5焦耳/平方厘米/闪光)的BSPL处理。每次处理3个一式两份的样品,并取结果的平均值。每个BSA浓度有3份对照,同样取它们的平均值。如实施例2所述,接种平板并在32℃培育,48小时后计数CFU。下表A列出了这些结果:
表A:处理悬浮于BSA溶液中的大肠杆菌
Log存活 | ||||||
J* 闪光 | BSA mg/ml5 25 50 75 100 | |||||
Ctnl. | N.T.* | 6.7 | 6.1 | 6.2 | 6.2 | 6.3 |
0.25 | 1 | 2.9 | --- | --- | --- | --- |
0.25 | 2 | 1.3 | --- | --- | --- | --- |
0.5 | 1 | 0.1 | --- | --- | --- | --- |
0.5 | 2 | N.S.*** | --- | --- | --- | --- |
1.0 | 1 | N.S.*** | --- | --- | --- | --- |
1.0 | 2 | N.S.*** | --- | --- | --- | --- |
1.5 | 3 | --- | N.S.*** | N.S.*** | 4.7 | 5.2 |
1.5 | 5 | --- | N.S.*** | N.S.*** | 3.0 | 4.4 |
1.5 | 7 | --- | N.S.*** | N.S.*** | 0.6 | 3.6 |
*焦耳/平方厘米/闪光
**未处理
***无存活
这些结果显示:存在5mg/ml BSA时,用0.5焦耳/平方厘米密度的单次闪光杀死6.61og,高于用0.25焦耳/平方厘米的2次闪光杀死5log,而用0.25焦耳/平方厘米单次闪光仅杀死4log不到。当用所含的BSA较高(即25-50mg/m1)时,用3次或更多次1.5焦耳/平方厘米密度的闪光就可实现完全杀灭。约75-100mg/ml浓度的BSA,需要附加的闪光,但易完成至少2.7的log减少。
实施例4:用白蛋白保护酸性磷酸酶
从Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)购得冻干的酸性磷酸酶,用经过滤的去离子水重建,将其等分并储藏于-20℃至需要时。每次试验使用约25U/1(国际单位)酶,通过用经过滤的去离子水或5mg/ml BSA溶液适当稀释。
用每次闪光密度为0.5焦耳/平方厘米、1.0焦耳/平方厘米或1.5焦耳/平方厘米的BSPL照射各样品进行处理。样品至多进行4次脉冲光的处理。所有试验都是一式三份进行的,并求结果的平均值。
用Sigma诊断碱、酸和磷酸酶试剂盒(Sigma程序#104)分析酶的活性。将接受过处理的酶样品的回复活性与未处理的对照相比,并以对照活性的百分比表示。下表B列出了有和无BSA的结果:
表B:酸性磷酸酶和血清白蛋白
焦耳* | 闪光 | 回复 | |
无BSA | 有BSA(5mg/ml) | ||
Cntl. | 0 | 100% | 100% |
0.5 | 1 | 70% | 94% |
0.5 | 2 | 69% | 88% |
0.5 | 3 | 60% | 86% |
0.5 | 4 | 54% | 82% |
0.5 | 5 | 45% | 78% |
1.0 | 1 | 62% | 92% |
1.0 | 2 | 37% | 83% |
1.0 | 3 | 23% | 70% |
1.0 | 4 | 13% | 65% |
1.0 | 5 | 7% | 57% |
1.5 | 1 | 51% | 85% |
1.5 | 2 | 21% | 74% |
1.5 | 3 | 11% | 62% |
1.5 | 4 | 6% | 53% |
1.5 | 5 | 4% | 45% |
*焦耳/平方厘米/闪光
对结果的分析表明:从这些结果可以看出,当与破坏病原体的BSPL接触时,浓度低至5mg/ml BSA的存在能提供对酸性磷酸酶的生物活性保护。当这种酶与所用量BSPL接触时其酶活性将大大丧失,而用如此小浓度的BSA则能提供基本保护,无论在0.5-1.5焦耳/平方厘米间的密度和1-5次闪光量的脉冲光。预计包含较高浓度(如10mg/ml)则可提供更多的保护。
实施例5:血清白蛋白对碱性磷酸酶的保护
从Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)购得冻干的碱性磷酸酶,用包含10mm Tris、50mm NaCl、1.5mm CHAPS的重建缓冲液(pH7.4)重建。将此酶溶液等分并储藏于-20℃至需要时。每次试验使用约93.5U/1(国际单位)酶,通过用已滤的去离子水或5mg/ml BSA溶液适当稀释。
用每次闪光密度为1.0焦耳/平方厘米或1.5焦耳/平方厘米的BSPL照射各样品进行处理。样品至多进行5次脉冲光的处理。所有试验都是一式三份进行的,并求结果的平均值。用Sigma诊断碱、酸和磷酸酶试剂盒(Sigma程序#104)分析酶的活性。将接受过处理的酶样品的回复活性与未处理的对照相比,并以对照活性的百分比表示。下表C列出了有和无BSA的结果:
表C:碱性磷酸酶和血清白蛋白
焦耳* | 闪光 | 回复 | |
无BSA | 有BSA(5mg/ml) | ||
Cntl. | 0 | 100% | 100% |
1.0 | 3 | 86% | l00% |
1.0 | 5 | 74% | 98% |
1.5 | 1 | 90% | 99% |
1.5 | 3 | 52% | 94% |
1.5 | 5 | 12% | 84% |
*焦耳/平方厘米/闪光
对结果的分析表明:从这些结果可以看出,当与破坏病原体的BSPL接触时,浓度低至5mg/ml BSA的存在能提供对碱性磷酸酶的生物活性保护。当这种酶与BSPL(如1.5焦耳/平方厘米)接触时其酶活性将大大丧失,而用如此小浓度的BSA则能提供基本保护,在1.5焦耳/平方厘米密度5次闪光能提供基本保护。预计包含较高浓度(如10mg/ml)则可提供更多的保护。
实施例6:血清白蛋白对乳酸脱氢酶的保护
从Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)购得乳酸脱氢酶(LDH),储藏于-20℃需要时等份地取出。每次试验使用约900U/1酶,通过用已滤的去离子水或5mg/ml BSA溶液适当稀释。
用每次闪光密度为0.焦耳/平方厘米的BSPL照射各样品进行处理。样品至多进行5次脉冲光的处理。所有试验都是一式三份进行的,并求结果的平均值。用Sigma诊断乳酸脱氢酶试剂盒(Sigma程序#500)分析酶的活性。将接受过处理的酶样品的回复活性与未处理的对照相比,并以对照活性的百分比表示。下表D列出了有和无BSA的结果:
表D:乳酸脱氢酶和血清白蛋白
焦耳* | 闪光 | 回复 | |
无BSA | 有BSA(5mg/ml) | ||
Cntl. | 0 | 100% | 100% |
0.5 | 1 | 27% | 100% |
0.5 | 2 | 13% | 100% |
0.5 | 3 | 4% | 92% |
0.5 | 4 | 0% | 84% |
0.5 | 5 | 2% | 74% |
*焦耳/平方厘米/闪光
对结果的分析表明:从这些结果可以看出,当与密度低至0.5焦耳/平方厘米的BSPL接触时,LDH是高度敏感易丧失生物活性的酶的一种实例。但当待照射的组合物中包含低至5mg/ml BSA时,2次闪光后能提供对该酶生物活性的完全保护,3次闪光后能提供对回复90%以上,4次闪光后能回复80%以上,且5次闪光后能回复近75%该酶的生物活性。本实施例表明白蛋白能向对这种具体的破坏病原体方法特别敏感的酶提供极好的保护。
虽然已用具体实施例及其应用描述了本文公开的发明,但是本领域技术人员可作出许多修改和变化,而不违背权利要求限定的本发明的范围。所有的参考文献和美国专利的公开内容引入本文以供参考。
Claims (20)
1.一种在减少生物衍生组合物中病原体或其它毒素含量时保护生物分子基本不发生降解的方法,其特征在于,所述的方法包括如下步骤:
提供一种生物衍生组合物,该组合物含有病原体或其它毒素和至少一种生物活性生物分子;
将白蛋白加入该组合物制得补加组合物;
用广谱脉冲光(BSPL)照射该补加组合物,以降解所述的病原体或其它毒素;
在所述的补加组合物中所述白蛋白的含量,使所述的活病原体或其它毒素的含量减少至少10倍,但所述的生物分子的生物活性却没有减少至不能接受的水平;和
回收生物活性状态的所述的生物分子。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,加入所述的白蛋白使其在所述的补加组合物中的浓度至少为约5mg/ml。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法还包括:将所述的白蛋白与所述的感兴趣生物分子分开,作为所述的回收步骤的一部分。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的生物衍生组合物包含至少一种选自病毒、细菌、原生动物、真菌、朊病毒、热原和毒素的病原体。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的生物衍生组合物包含至少一种病毒,选自人免疫缺陷病毒-1、人免疫缺陷病毒-2、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HTLV-I、HTLV-II、巨细胞病毒、猿猴乳多空病毒40、牛病毒性腹泻病毒和犬细小病毒。
6.一种包含感兴趣生物分子的生物衍生组合物,其特征在于,通过权利要求5所述的处理方法,所述组合物的活病毒含量比其原来含量至少降低了10倍,同时保留所述生物分子的生物活性。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的生物衍生组合物包含活组织、生物反应器的发酵肉汤、细胞培养物、或转基因或其它动物的分离物。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的感兴趣生物分子选自:因子VIII、因子IX、抗凝血酶、转铁蛋白、免疫球蛋白、单克隆抗体、病毒载体、肝素、胶原、胰岛素、酶和用于疫苗制备的抗原。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少一次高强度短历时脉冲照射所述的生物衍生组合物,光强度至少0.01焦耳/平方厘米,脉冲历时少于100毫秒,光波长在170-2600纳米之间。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的照射步骤包括用广谱非相干多色光的至少二次高强度短历时脉冲照射该生物衍生组合物。
11.一种用广谱脉冲光(BSPL)活化生物衍生组合物中蛋白质的方法,该组合物还包含感兴趣生物分子,其特征在于,所述的方法包括步骤:
提供一种生物衍生组合物,该组合物含有光敏蛋白质和至少一种生物活性的生物分子;
将白蛋白加入该组合物制得补加组合物;和
用至少一个脉冲的广谱脉冲光(BSPL)照射该补加组合物,从而活化所述的蛋白质,但所述的生物分子的生物活性却基本未降解。
12.一种包含用权利要求11所述的方法处理的含蛋白质的生物衍生组合物,该组合物所含的生物分子保留了其生物活性。
13.一种在减少生物衍生组合物中的病毒或化学毒素含量或杀死其中活细胞时保护生物分子的方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
提供一种生物衍生组合物,该组合物含有病毒或化学毒素和/或活细胞,和至少一种感兴趣的生物活性分子;
将白蛋白加入该组合物制得补加组合物;和
用广谱非相干多色光(BSPL)高强度、短历时脉冲照射该补加组合物至少一次,使所述的活病毒或化学毒素的含量至少减少10倍或杀死活细胞,但所述的感兴趣生物分子保留了它的生物活性。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,加入所述的白蛋白使其在所述的补加组合物中的浓度为约1mg/ml到约50mg/ml之间。
15.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述的至少一种病毒选自人免疫缺陷病毒-1、人免疫缺陷病毒-2、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HTLV-I、HTLV-II、巨细胞病毒、猿猴乳多空病毒40、牛病毒性腹泻病毒和犬细小病毒,且所述的感兴趣生物分子是基因工程改造的哺乳动物细胞系的表达产物。
16.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述的照射是在使病毒灭活后活病毒含量至少减少2个log的条件下进行的。
17.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述的照射步骤包括:用广谱非相干多色光的高强度短历时脉冲照射该补加的生物衍生组合物至少二次。
18.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述的感兴趣生物分子选自:胰岛素、转铁蛋白、肝素、胶原、氨基酸、蛋白胨、肽、单克隆抗体和酶。
19.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述的生物衍生组合物包含基因工程改造的哺乳动物细胞系的产物,其包含构成所述的感兴趣生物分子的蛋白质。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述的白蛋白的添加,使补加组合物中所述白蛋白的浓度为约1mg/ml到约50mg/ml之间,在所述的照射后所述的生物分子保留了至少80%生物活性,且回收所述的生物分子并任选地将其与所述的白蛋白分开。
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