CN1425066B - 新的stra6多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有类似于Stra6(一种鼠视黄酸应答蛋白)的序列的新多肽，涉及编码所述多肽的核酸分子。本发明也提供包含这些核酸序列的载体和宿主细胞，含有本发明多肽与异源多肽序列融合的嵌合多肽分子，与本发明多肽结合的抗体，以及涉及本发明多肽的生产方法。

Description

新的STRA6多肽
发明领域
本发明主要涉及鉴定和分离新的DNA，涉及重组产生具有类似于鼠Stra6(一种鼠视黄酸易感蛋白)序列的新多肽。早些时候曾经将这些分子中的一些称为″PRO10282″，但在下文中也将之称为″Stra6″多肽。
发明背景
膜结合蛋白
膜结合蛋白和受体在多细胞生物的构造、分化和维持方面发挥重要作用。许多单个细胞的命运，如增殖、迁移、分化或与其它细胞相互作用，通常被接收自其它细胞和/或即时环境的信息所控制。这种信息常常由分泌多肽进行传输(例如，致有丝分裂因子，存活因子，细胞毒因子，分化因子，神经肽和激素)，而分泌多肽反过来被各种细胞受体或膜结合蛋白接收并翻译。此类膜结合蛋白和细胞受体包括但不限于：细胞因子受体、受体激酶、受体磷酸酶、细胞-细胞相互作用中所涉及的受体，以及细胞粘附分子如选择蛋白和整联蛋白。举例来说，调节细胞生长和分化的信号转导部分程度上受各种细胞蛋白质的磷酸化作用的调节。蛋白酪氨酸激酶(催化磷酸化过程的酶)，也起着生长因子受体的作用。实例包括成纤维细胞生长因子受体和神经生长因子受体。
膜结合蛋白和受体分子具有多种工业用途，包括作为药剂和诊断剂。比如，受体免疫粘附素可用作阻断受体-配体相互作用的治疗剂。膜结合蛋白也可用于筛选相关受体/配体相互作用的潜在的肽或小分子抑制剂。
工业和学术界都在进行着鉴定新的、天然受体或膜结合蛋白的不懈努力。许多努力集中在筛选哺乳动物重组DNA文库上以确定新受体或膜结合蛋白的编码序列。
本发明Stra6多肽与鼠蛋白Stra6具有序列同源性(73％相同和81％相似)，所述鼠蛋白Stra6的表达是由视黄酸诱导的。(Bouillet等，Dev.Biol.170：420-433[1995]；Bouillet等，Mech.Dev.63：173-186[1997]；Chazaud等，Dev.Genet.19：66-73[1996])。既然视黄酸是脊椎动物发育过程中一重要的信号分子，那么，认为应答视黄酸而诱导的基因在胚胎发育的生长和分化中发挥着重要作用。使用设计的为鉴定和分离视黄酸诱导基因的扣除杂交法，从P19鼠胚胎癌性细胞中分离出鼠Stra6cDNA，后者并未显示出与前面描述的蛋白质具有相似性。它含有与多个跨膜结构域相应的高度疏水伸展(stretches)的氨基酸残基，此是膜内在蛋白的一个特征。基于其表达模式，Stra6被认为在胚胎发育过程的早期对于背腹侧肢(dorsoventral limb)的结构形式和后期对软骨内成骨的控制方面起着重要作用(Chazaud等，Dev.Genet.19：66-73[1996])。
本文公开的Stra6多肽含有多个可能是构成跨膜结构域的高度疏水区，其表明Stra6多肽是膜内在蛋白。它们可以作为未知配体的受体发挥作用，并可能是影响细胞生长、发育或分化的信号转导通路的一部分。
肿瘤细胞中的基因扩增
在美国，恶性肿瘤(癌)是导致死亡的居心脏疾病之后的第二位主要原因(Boring等，CA Cancel J.Clin.，43：7[1993])。
恶性肿瘤的特征是，异常细胞数量增加或衍生自正常组织的肿瘤细胞增生形成肿瘤块，这些赘生的肿瘤细胞侵袭毗邻组织，并且增生的恶变细胞逐渐经血液或淋巴系统扩散到局部淋巴结和远端部位(转移)。在癌性状态下，细胞在正常细胞不生长的环境下增生。恶性肿瘤本身表现出多种形态，均以不同程度的侵袭性和侵犯性为特征。
基因表达的改变与不受抑制的细胞生长和去分化密切相关，而不受抑制的细胞生长和去分化是所有恶性肿瘤的共同特征。业已发现，一些进行过较好研究的肿瘤的基因组显示出隐性基因的表达减弱，隐性基因通常指肿瘤抑制基因，正常功能是抑制恶变细胞生长和/或抑制那些促进恶性肿瘤生长的某些优势基因如致癌基因的过度表达。这些中的每一种遗传学变化显得是肿瘤具有某些特性的原因，集合起来，则表现出全部的肿瘤表型(Hunter，Cell，64：1129[1991]和Bishop，Cell，64：235-248[1991])。
众所周知，肿瘤细胞中基因(例如，致癌基因)过度表达机制是基因扩增。这是在祖细胞染色体中产生特定基因多拷贝的过程。该过程涉及含有特定基因的染色体区域的异常复制，然后将复制的片段再重组回染色体中(Alitalo等，Adv.Cancer Res.，47：235-281[1986])。据信，基因过度表达与基因扩增相平行，即与生产的拷贝数成正比。
已经确定，编码生长因子和生长因子受体的原癌基因在各种人类恶性肿瘤(包括乳腺癌)的病因学中起着重要作用。例如，业已发现编码与表皮生长因子受体(EGFR)有关的185kd跨膜糖蛋白受体(p185HER2，HER2)的人ErbB2基因(erbB2，也称为her2或c-erbB-2)，在约25％～30％的人乳腺癌中过度表达(Slamon等，Science 235：177-182[1987]；Slamon等，Science 244：707-712[1989])。
据报道，原癌基因的基因扩增是更大恶性程度的恶性肿瘤中通常涉及的事件，并且可以起到临床发病预报器的作用(Schwab等，Genes ChromosomesCancer，1：181-193[1990]；Alitalo等，同上)。因此，erbB2过度表达一般被认为是预后差的预示，尤其对累及腋窝淋巴结的原发性疾病的患者而言(Slamon等，[1987]和[1989]，同上；Ravdin和Chamness，Gene，159：19-27[1995]；以及Hynes and Stern，Biochim.Biophys.Acta，1198：165-184[1994])，而且与对激素治疗和化学疗法的敏感性和/或抗性相关，所述化学疗法包括CMF(环磷酰胺，甲氨蝶呤，和氟尿嘧啶)和蒽环霉素(Baselga等，Oncology，11(3Suppl1)：43-48[1997])。然而，尽管erbB2过度表达与预后差有关，但是HER2-阳性患者对用taxanes治疗的临床反应几率却比HER2-阴性患者的反应几率大3倍以上(同上)。重组人源化抗ErbB2(抗-HER2)单克隆抗体(鼠抗ErbB2抗体4D5的人源化版本，称作rhuMAb HER2或HERCEPTINTM，对已经接受过广泛抗癌治疗的ErbB2过度表达型转移性乳腺癌患者进行的临床治疗有效(Baselga等，J.Clin.Oncol.14：737-744[1996])。
据上所述，显然存在着对于鉴定在诊断和治疗与基因扩增有关的肿瘤中有用的新的分子、方法和组合物的极大兴趣。
发明概述
已经鉴定了与编码鼠视黄酸易感蛋白Stra6并编码667个氨基酸的新多肽(在本申请中称为全长天然序列人″PRO10282″)的核酸具有同源性的人cDNA克隆(本文中指定为DNA148380-2827)。已经鉴定了编码658个氨基酸的新多肽(PRO 19578)的另一人cDNA克隆(本文指定为DNA148389-2827-1)，显示出与鼠Stra6和天然序列人PRO10282均具有显著序列同源性，它被认为是天然序列人PRO10282的剪切变体。正如后面将要讨论的那样，根据与鼠Stra6的同源性，也将本发明PRO10282多肽(包括天然序列和变体分子)称为″Stra6″多肽。
在一实施方案中，本发明提供分离的含有编码PRO10282多肽的核苷酸序列的核酸分子。
一方面，分离的核酸分子含有与(a)编码具有图2(SEQ ID NO：2)所示从约1至约667位氨基酸的序列(包括两端残基在内)的PRO10282多肽的DNA分子，或者(b)编码具有图7(SEQ ID NO：5)所示从约1至约658位氨基酸的序列(包括两端残基在内)的PRO19578多肽的DNA分子，或者(c)(a)或(b)所述DNA分子的互补链，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或约99％核酸序列同源的核苷酸序列。
另一方面，该分离的核酸分子含有(a)编码具有图2(SEQ ID NO：2)所示从约1至约667位氨基酸的序列(包括两端残基在内)的PRO10282多肽的核苷酸序列，或者(b)编码具有图7(SEQ ID NO：5)所示从约1至约658位氨基酸的序列(包括两端残基在内)的PRO19578多肽的核苷酸序列，或者(b)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列的核酸分子。
再一方面，该分离的核酸分子含有与(a)图1(SEQ ID NO：1)所示由约49至约2049位核苷酸的序列(包括两端残基在内)的DNA分子，或者(b)图6(SEQ ID NO：4)所示由约186至约2159位核苷酸的序列(包括两端残基在内)的DNA分子，或者(a)或(b)所述DNA分子的互补序列，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或约99％核酸序列同源的核苷酸序列。
另一方面，该分离的核酸分子含有图1(SEQ ID NO：1)所示由约49至约2049位核苷酸的序列(包括两端残基在内)，或者(b)图6(SEQ ID NO：4)所示由约186至约2159位核苷酸的序列(包括两端残基在内)，或者(c)(a)或(b)核苷酸序列的互补序列。
此外，本发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)编码由2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1181(DNA 148380-2827)的人蛋白cDNA编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)编码由2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA编码的相同成熟多肽的DNA分子，或者(c)(a)或(b)所述DNA分子的互补序列，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或约99％核酸序列同源的核苷酸序列。在一优选的实施方案中，分离的核酸分子含有(a)编码与2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1181(DNA 148380-2827)的人蛋白cDNA编码的相同成熟多肽的核苷酸序列，或者(b)编码由2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA编码的相同成熟多肽的核苷酸序列，或者(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列。
另一方面，发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PT-1181(DNA148380-2827)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或者(b)2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或者(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或约99％核酸序列同源的核苷酸序列。
在一优选的实施方案中，分离的核酸分子含有(a)2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PT-1181(DNA148380-2827)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或者(b)2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA的全长多肽编码序列，或者(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列。
还一方面，发明涉及编码下面定义的活性PRO10282多肽的分离的核酸分子，其包括能与编码图2(SEQ ID NO：2)中1～约667位氨基酸(包括两个端点氨基酸残基在内)的核酸序列的互补序列，或者与编码图7(SEQ ID NO：5)中1～约658位氨基酸(包括两个端点氨基酸残基在内)的核酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，其中该分离的核酸分子不是编码鼠Stra6的DNA。优选地，杂交在严格杂交条件和洗涤条件下发生。
另一方面，发明涉及编码下面定义的活性PRO10282多肽的分离的核酸分子，其包括与图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸约49和约2049之间(包括两个端点残基在内)核酸序列的互补序列，或者与图6(SEQ ID NO：4)所示核苷酸约186和约2159之间(包括两个端点残基在内)核酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，其中该分离的核酸分子不是编码鼠Stra6的DNA。优选地，杂交在严格杂交条件和洗涤条件下发生。
再一方面，发明涉及具有至少约765个核苷酸的分离的核酸分子，其是在严格条件下使测试DNA分子与(a)编码含图2(SEQ ID NO：2)所示从约1至约667的氨基酸序列(包括两端残基在内)的PRO10282多肽的DNA分子，或者(b)编码含图7(SEQ ID NO：5)所示从约1至约658的氨基酸序列(包括两端残基在内)的PRO19578多肽的DNA分子，或者(c)(a)或(b)所述DNA分子的互补序列进行杂交而产生的，而且，如果该测试DNA分子与(a)或(b)具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、更优选至少约99％的核酸序列同一性，则分离该测试DNA分子。
另一方面，发明涉及分离的核酸分子，其含有与(a)编码含图2(SEQ IDNO：2)所示从约1至约667的氨基酸序列(包括两端残基在内)，或者(b)编码含图7(SEQ ID NO：5)所示从约1至约658的氨基酸序列(包括两端残基在内)相比，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、更优选至少约99％评分阳性的多肽的核苷酸序列，或者含有(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互补序列。
本发明的另一特定方面，本发明提供包含编码PRO10282的核苷酸序列的分离的核酸分子，该核苷酸序列要么编码跨膜结构域缺失或者跨膜结构域失活，要么与此编码核苷酸序列互补，其中跨膜结构域已被试验性地确定为：在图2(SEQ ID NO：2)所示序列中，从约氨基酸54位向约氨基酸69位延伸、从约氨基酸102位向约氨基酸119位延伸、从约氨基酸148位向约氨基酸166位延伸、从约氨基酸207位向约氨基酸222位延伸、从约氨基酸301位向约氨基酸320位延伸、从约氨基酸364位向约氨基酸380位延伸、从约氨基酸431位向约氨基酸451位延伸、从约氨基酸474位向约氨基酸489位延伸、和从约氨基酸512位向约氨基酸531位延伸；而在图7(SEQ ID NO：5)所示序列中，从约氨基酸54位向约氨基酸71位延伸、从约氨基酸93位向约氨基酸111位延伸、从约氨基酸140位向约氨基酸157位延伸、从约氨基酸197位向约氨基酸214位延伸、从约氨基酸291位向约氨基酸312位延伸、从约氨基酸356位向约氨基酸371位延伸、从约氨基酸425位向约氨基酸481位延伸、从约氨基酸505位向约氨基酸522位延伸。因此，本发明所述PRO10282多肽的可溶性细胞外结构域也在考虑之内。
在这点上，本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，其含有与(a)编码图2(SEQ ID NO：2)1至x氨基酸的DNA分子，其中X是图2(SEQ ID NO：2)中自49到59的任何氨基酸，或(b)(a)中DNA分子的互补序列具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、更优选至少约99％同一性的核苷酸序列。在一特定方面，该分离的核酸分子含有(a)编码图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中1至X氨基酸的核苷酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO：2)中自49至59的任何氨基酸，或者(b)(a)中DNA分子的互补序列。一特定方面，该分离的核酸分子含有(a)编码图2ISEQ ID NO：2)，或图7(SEQ ID NO：5)中1至X的氨基酸，其中X是图2(SE ID NO：2)，或图7(SEQ ID NO：5)自49至59的任何氨基酸(包括两端氨基酸残基在内)，或者(b)(a)中DNA分子的互补序列的核苷酸序列。
本发明还有一方面，分离的核酸分子(a)编码与图2(SEQ ID NO：2)，或图7(SEQ ID NO：5)中约1至X残基氨基酸序列，其中X是图2(SEQ IDNO：2)中自49至59的任何氨基酸，或者(b)(a)中DNA分子的互补序列相比，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、更优选至少约99％阳性评分的多肽。
另一实施方案，涉及PRO10282多肽编码序列片段，这些片段例如可用作杂交探针，或者可任选地编码含抗-PRO10282抗体结合位点的PRO10282多肽的编码片段。此类核酸片段长度通常至少约20个核苷酸，优选至少约30个核苷酸，更优选至少约40个核苷酸，更优选至少约50个核苷酸，更优选至少约60个核苷酸，更优选至少约70个核苷酸，更优选至少约80个核苷酸，更优选至少约90个核苷酸，更优选至少约100个核苷酸，或者至少约110个核苷酸，更优选至少约120个核苷酸，更优选至少约130个核苷酸，更优选至少约140个核苷酸，或者至少约150个核苷酸，更优选至少约160个核苷酸，更优选至少约170个核苷酸，更优选至少约180个核苷酸，或者至少约190个核苷酸，更优选至少约200个核苷酸，更优选至少约250个核苷酸，更优选至少约300个核苷酸，更优选至少约350个核苷酸，更优选至少约400个核苷酸，更优选至少约450个核苷酸，更优选至少约500个核苷酸，更优选至少约600个核苷酸，更优选至少约700个核苷酸，更优选至少约800个核苷酸，更优选至少约900个核苷酸，更优选至少约1000个核苷酸，其中本文术语“约”是指核苷酸序列有关长度加或减10％。本发明核酸片段不同于鼠Stra6天然编码序列的片段。在一优选的实施方案中，该核苷酸序列片段衍生自图1(SEQ ID NO：1)或图6(SEQ ID NO：4)所示核苷酸序列的任何编码区。应当指出，可用常规方法测定编码PRO10282多肽的核苷酸序列的新片段，所述方法是：通过使用众多公知的序列对比程序中任何一个，将编码PRO10282多肽的核苷酸序列与其它已知核苷酸序列对比，测定出其中哪个或哪几个编码PRO10282多肽的核苷酸序列片段是新的。本文考虑到了所有这类编码PRO10282多肽的核苷酸序列，并且可以用不繁琐的实验予以测定。也考虑到由这些核苷酸分子片段编码的PRO10282多肽片段，优选是含有抗-PRO10282抗体结合位点的那些PRO10282多肽片段。
在另一实施方案中，本发明提供含有编码PRO10282或其变体的核苷酸序列的载体。该载体可含有上述鉴定的任何分离的核酸分子。
也提供含有此类载体的宿主细胞。例如，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌或酵母。进一步提供生产PRO10282多肽的方法，包括在适宜表达PRO10282的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物中回收PRO10282。
在另一实施方案中，发明提供由上面鉴定的任一分离的核酸序列所编码的分离的PRO10282多肽。
一特定方面中，本发明提供分离的天然序列的PRO10282多肽，它在某些实施方案中包括含有图2(SED ID ND：2)中自约1至约667残基，或者图7(SEQID NO：5)自约1至约658残基的氨基酸序列。
另一方面，本发明涉及分离的PRO10282多肽，其包括与图2(SEQ IDNO：2)中约1到约667残基所示氨基酸序列(包括两端残基在内)，或与图7(SEQID NO：5)中从约1至约658的残基氨基酸序列(包括两端氨基酸残基在内)具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、或更优选至少约99％同一性的氨基酸序列。
再一方面，本发明涉及分离的PRO10282多肽，其含有与2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1191(DNA148380-2827)或2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405(DNA148389-2827-1)的人蛋白cDNA编码的氨基酸序列具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。在一优选的实施方案中，分离的PRO10282多肽含有2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1191(DNA148380-2827)或2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏号为PTA-1405(DNA148389-2827-1)的人蛋白cDNA编码的氨基酸序列。
另一方面，发明涉及分离的PRO10282多肽，其含有与图2(SEQ ID NO：2)中约1到约667位残基的氨基酸序列(包括两端残基在内)或图7(SEQ IDNO：5)中约1到约659位残基的氨基酸序列(包括两端残基在内)相比，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、或更优选至少约99％评分阳性的氨基酸序列。
本发明另一方面提供分离的PRO10282多肽，其要么跨膜结构域缺失要么跨膜结构域失活。本文也描述产生该多肽的方法，该方法包括在适宜PRO10282多肽表达的条件下培养含有适合编码核酸分子的载体的宿主细胞，并从细胞培养物中回收PRO10282多肽。
照这样，本发明一方面涉及分离的可溶性PRO10282多肽，其含有与图2(SEQ ID NO：2)，或图7(SEQ ID NO：5)中1至X氨基酸(所述X是图2(SEQ ID NO：2)，或图7(SEQ ID NO：5)中自49至59的任何氨基酸)具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、或更优选至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的又一方面，该分离的可溶性PRO10282多肽含有与图2(SEQID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中约1至X的残基氨基酸序列相比时，(其中X是图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中自49至59的任何氨基酸)具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、或更优选至少约99％评分阳性的氨基酸序列。
还有一方面，本发明涉及分离的PRO10282多肽，其含有图2(SEQ IDNO：2)中从1约至约667残基的氨基酸序列(包括两端氨基酸残基在内)，或图7(SEQ ID NO：5)中从1约至约658残基的氨基酸序列(包括两端氨基酸残基在内)，或其生物活性片段，或足以提供与抗-PRO1282抗体结合位点的片段，其中具有生物活性或提供抗-PRO10282抗体结合位点的PRO10282多肽片段的鉴定，可以用本领域公知的常规技术来完成。这里的片段不是鼠Stra6多肽的片段。优选地，PRO10282片段在性质上保留天然PRO10282多肽的生物活性。
再一方面，本发明提供如下制备的多肽：(i)在严格条件下，使测试DNA分子与(a)编码具有图2(SEQ ID NO：2)中约1至约667残基的氨基酸序列(包括两端残基在内)的PRO10282多肽的DNA分子，或者(b)编码具有图7(SEQID NO：5)中约1至约658残基氨基酸序列(包括两端残基在内)的PRO19578多肽的DNA分子，(c)(a)或(b)所述DNA分子的互补序列，进行杂交，且如果该测试DNA分子与(a)或(b)或(c)具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或至少约99％的核酸序列同一性，则(ii)在适宜表达该多肽的条件下培养含有该测试DNA分子的宿主细胞，和(iii)从细胞培养物中回收该多肽。
在另一实施方案中，本发明提供含有与异源多肽或氨基酸序列融合的PRO10282多肽的嵌合分子，其中PRO10282多肽可含有前述任何PRO10282多肽或其变体或片段。此嵌合分子的一个实例是含有与免疫球蛋白表位标签序列或Fc区融合的PRO10282多肽的嵌合分子。
在另一实施方案中，发明提供下述定义的与前述PRO10282多肽特异结合的抗体。任选地，抗体是单克隆抗体、抗体片段或单链抗体。
在另一实施方案中，本发明涉及下述定义的天然PRO10282多肽的激动剂和拮抗剂。在一具体实施方案中，激动剂或拮抗剂是抗-PRO10282抗体或小分子。
在另一实施方案中，发明涉及鉴定PRO10282多肽的激动剂或拮抗剂的方法，方法包括使PRO10282多肽与候选分子接触，并检测由所述PRO10282多肽介导的生物活性。优选地，PRO10282多肽是天然PRO10282多肽。
在另外一个实施方案中，本发明涉及含有本文所述PRO10282多肽、PRO10282多肽的激动剂或拮抗剂、或抗-PRO10282抗体、以及载体的组合物。任选地，载体是可药用载体。
本发明另一实施方案涉及本文所述PRO10282多肽或其激动剂或拮抗剂或抗-PRO10282抗体在制备用于治疗对PRO10282多肽、其激动剂或拮抗剂、或抗-PRO10282抗体敏感的病症的药物中的应用。
再一方面，本发明涉及与PRO10282多肽特异结合的抗体。优选地，该抗体诱导表达PRO10282多肽的细胞死亡。在一具体优选的实施方案中，细胞是与相同组织类型的正常细胞相比过度表达PRO10282多肽的癌细胞。抗体优选是人源化的或人抗体，并且包括抗体片段单链抗体。
另一方面，本发明涉及含有与PRO10282多肽特异结合的抗体的组合物。
还有一方面，本发明涉及编码与PRO10282多肽特异结合的抗体的分离的核酸分子、含有该核酸的载体以及含有该载体的宿主细胞。本发明也涉及生产抗-PRO10282抗体的方法。
在另外一个实施方案中，本发明涉及检测在怀疑含有PRO10282多肽的样品中是否存在该多肽的方法，方法如此进行：将样品暴露于抗-PRO10282抗体(或PRO10282的另一拮抗剂)，并测定样品中该抗体(或拮抗剂)与PRO10282多肽的结合。在一具体重要的实施方案中，样品取自癌细胞。
在一不同的实施方案中，本发明涉及诊断哺乳动物肿瘤的方法，包括检测在(a)取自该哺乳动物的测试组织样品中，和(b)取自相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中，编码PRO10282多肽的基因的表达水平。与对照样品相比，测试样品中表达水平较高，表明测试组织所取自的哺乳动物存在肿瘤。
根据本发明的另一方法，如下步骤诊断哺乳动物中的肿瘤：(a)将抗PRO10282抗体与取自该哺乳动物组织细胞的测试样品进行接触，和(b)检测测试样品中抗体与PRO10282多肽之间复合物的形成。复合物形成，表明哺乳动物中存在肿瘤。
另一方面，本发明涉及癌诊断试剂盒，其含有抗-PRO10282抗体(或PRO10282的不同拮抗剂)和在适宜包装中的载体。任选地，试剂盒也含有指导使用抗体或其它拮抗剂来检测样品中存在PRO10282多肽的说明书。
还有一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞生长的方法，通过使表达PRO10282多肽的肿瘤细胞暴露于抑制PRO10282多肽生物活性的有效量的制剂中，从而抑制肿瘤细胞的生长。制剂可以例如是抗-PRO10282抗体或PRO10282的另一拮抗剂。肿瘤细胞可进一步暴露于常规的肿瘤治疗中，如放射治疗、用细胞毒性剂和/或化疗剂治疗等。
另一不同方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞生长的方法，通过使表达PRO10282多肽的肿瘤细胞暴露于抑制该多肽表达的有效量的制剂中，从而抑制肿瘤生长。
本发明进一步涉及阻止或减缓(减弱)以PRO10282多肽过度表达为特征的肿瘤发展、生长或扩散的类似方法。该治疗可直接减少肿瘤细胞的病变，或者使得肿瘤细胞对于其它治疗剂的治疗(例如放疗和/或化疗)更为敏感。本发明特别包括控制异常或转移，控制对毗邻组织正常功能的干扰、控制细胞因子或其它分泌产物非正常水平释放、控制炎症或免疫应答的抑制或加重等的方法。
本发明进一步涉及一种制品，包括：一容器，贴在容器上的标签，和装在容器中的含有活性剂的组合物；其中组合物对于抑制肿瘤生长是有效的，而贴在容器上的标签则注明该组合物用于治疗以肿瘤细胞中过度表达PRO10282多肽为特征的病症是有效的。
再有一方面，本发明涉及鉴定抑制PRO10282多肽生物学或免疫学活性的化合物的方法：在控制条件下，使候选化合物与PRO10282多肽接触足够长时间，以使两种组分相互作用，并检测PRO10282多肽的生物学或免疫学活性是否被抑制。
另一方面，本发明涉及鉴定抑制PRO10282多肽活性的化合物的方法，包括下列步骤：(a)在存在PRO10282多肽、适宜由PRO10282多肽正常地诱导细胞应答的条件下，使细胞与被筛选的候选化合物接触，和(b)检测所述细胞应答的诱导情况，以决定测试化合物是否是有效的拮抗剂。细胞应答诱导缺乏，表明测试化合物是有效的拮抗剂。
本发明还涉及鉴定抑制在表达PRO10282多肽的细胞中表达该肽的化合物的方法，通过使细胞与候选化合物接触，并测定表达是否被抑制。
本发明特别涉及通过本文筛选方法鉴定的PRO10282激动剂和拮抗剂。此类激动剂和拮抗剂包括但不限于：抗-PRO10282抗体、多肽、肽、和具有激动剂或拮抗剂特性的小的有机分子。
附图简述
图1显示含有编码天然序列PRO10282的核苷酸序列(核苷酸1-2732)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其中该核苷酸序列(SEQ ID NO：1)是本文称为″DNA 148380-2827″的克隆。也以粗字体和下划线标出各自的起始和终止密码子的位置。
图2显示衍生自SEQ ID NO：1中编码序列的天然序列PRO10282多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。也显示各种其它重要多肽结构域的近似位置。
图3A-D显示使用ALIGN-2序列比较计算机程序，用下述方法测定氨基酸序列同一性％(表3(A-B))和核酸序列同一性％(表3(C-D))的假设的例证，其中″PRO″表示假设的目标PRO10282多肽的氨基酸序列，″对照蛋白质″表示使目标″PRO″多肽与其进行比较的多肽的氨基酸序列，″PRO-DNA″表示假设的编码PRO10282的目标核酸序列，″对照DNA″表示使目标核酸分子″PRO-DNA″与其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，″X″、Y″和″Z″各自代表不同的假定氨基酸残基，而″N″、″L″和″V″各自代表不同的假定核苷酸。
图4A-Q提供ALIGN 2序列对比计算机程序的全部源序列码。为在UNIX操作系统上使用，可以对该源序列码进行常规编制，以提供ALIGN 2序列对比计算机程序。
图5显示本文指定为DNA100038(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列。
图6显示含有编码天然序列人Stra6多肽变体的核苷酸序列(核苷酸1-2778)的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，其中核苷酸序列(SEQ IDNO：4)是本文指定为″DNA148389-2827-1″的克隆。也以粗体和下划线标出各自起始和终止密码子的位置。
图7显示衍生自SEQ ID ND：4编码序列的天然序列人Stra6多肽变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。也显示各种其它重要多肽结构域的近似位置。
图8是图式表示DNA 148380-2827(天然的人PRO10282)编码的鼠Stra6和人Stra6蛋白。
图9显示DNA 148380-2827(天然的人PRO10282)编码的天然序列人Stra6蛋白的疏水性。
图10显示DNA148380-2827编码的天然序列人Stra 6蛋白在各种正常人组织中的相对RNA表达情况。
图11显示用定量PCR测定，DNA 148380-2827编码的天然序列人Stra6蛋白在人结肠肿瘤组织中相对于在同一患者正常粘膜中RNA表达的RNA折叠(fold)表达。数据来自同一试验中所作的一式三份实验。使用不同套PCR引物，至少重复试验2次。
图12A显示使用看家基因GAPDH作对照，DNA 148380-2827编码的天然序列人Stra6蛋白在人结肠组织中相对于在同一患者正常粘膜中RNA表达的NA表达。
图12B显示通过原位杂交，Stra6在结肠腺癌的上皮肿瘤细胞上的定位。
图13显示DNA148380-2827编码的天然人Stra6蛋白在人乳腺、肾、结肠和肺肿瘤细胞系中相对于在相应正常细胞系中的RNA表达。
图14图例说明衍生自DNA148380-2827编码的天然序列人Stra 6蛋白的肽片段在大肠杆菌中的表达。
图15描述人结肠癌细胞中，分别在存在和不存在全反式视黄酸(ATRA)和9-顺式-视黄酸(9cRA)的条件下，Stra6RNA的表达。
图16是Stra6在肿瘤切片上的原位杂交情况。显示出证明银粒(A，C，E，G)的暗视野图像和对应的苏木精-伊红染色的明亮视野图像(B，D，F，H)。在恶性黑素瘤中，中等密度的银粒压在肿瘤细胞上而不压在血管上(A，B)。在子宫内膜腺癌中，肿瘤上皮被适度地标记上而肿瘤基质呈阴性(C，D)。在Wilm′s肿瘤的发育不全的区域显示高表达水平，而肿瘤基质呈阴性(E，F)。嗜铬细胞瘤显示非常高的Stra6mRNA表达，而相邻的正常肾上腺皮质则呈阴性(G，H)。刻度棒＝100微米。
图17(A)对9-顺式-RA或全反-RA应答，在C57MG/Parent和C57MG/Wnt-1细胞中Stra6mRNA表达的诱导。(B)对条件介质中的Wnt-3A和9-顺式-RA应答，在C57MG/Parent细胞中Stra6mRNA表达的诱导。(C)视黄酸处理后，在HCT116和WiDr结肠腺癌细胞中Stra6mRNA表达的诱导。(D)用视黄酸处理前(上组)和处理后(下组)，经在HCT116细胞原位杂交证明Stra6表达的暗野图像。(E)视黄酸治疗前(-RA)和治疗后(+RA)，通过用直接针对人Stra6肽B的单克隆抗体进行的Western印迹，观察到WiDr细胞中Stra6蛋白的表达。(F)在未用视黄酸处理(左组)或用视黄酸处理(右组)的WiDr细胞中Stra6的膜定位。用抗人Stra6肽B单克隆杂交瘤培养物上清液(克隆12F4.2H9.1D5)进行免疫组织化学检测。试验用A-F表示，用视黄酸处理细胞48小时。完成定量PCR反应(每个进行40循环)后得到的Stra6产物示于下面每一图的A-C中。
图18(A)Wnt-1诱导RAR γ-1表达。在不含四环素0、24、48或72小时的条件下，得自四环素可抑制细胞C57MG/Wnt 1细胞的蛋白-等量的全细胞溶解产物，接受SDS-PAGE以及RAR γ-1和ERK2的免疫印迹分析。(B)在Wnt-1转基因小鼠增生的乳腺和乳腺肿瘤中RAR γ-1mRNA的表达。用定量RT-PCR测定mRNA的表达，相对于野生型乳腺中mRNA的表达，数据用表达倍数进行表述。
优选实施方案详述
I.定义
术语″PRO10282多肽″、″PRO10282蛋白″、″PRO10282″、″Stra6多肽″、″Stra6蛋白″和″Stra6″互换使用，并涵盖天然序列PRO10282(Stra6)和PRO10282(Stra6)多肽变体(本文将作进一步定义)。PRO10282(Stra6)多肽可以是从各种来源(如人组织或其它来源)分离得到的，或者是用重组和/或合成方法制得。
″天然序列PRO10282″或″天然序列Stra6″，包括具有与得自天然PRO10282相同的氨基酸序列的多肽。此天然序列PRO10282(Stra6)可以是从自然界分离得到的，或者是用重组和/或合成方法制得的。术语″天然序列PRO10282″或″天然序列Stra6″，特别包括PRO10282的天然截短型或分泌型(例如，细胞外结构域序列)、天然变体型(例如，可替换式剪切型)和天然等位变体。在本发明一实施方案中，天然序列PRO10282是包括图2(SEQ ID NO：2)中1至667氨基酸的成熟或全长天然序列PRO10282。在本发明另一实施方案中，天然序列PRO10282多肽是包括SEQ ID NO：5中1至658氨基酸的成熟或全长天然序列PRO19578多肽，后者据信是SEQ ID NO：2的天然序列PRO10282的可替换式剪切型。并且，尽管图2(SEQ ID NO：2)和图7(SEQ ID NO：5)公开的PRO10282多肽显示由本文定义为位置1的蛋氨酸残基开始，但是图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中氨基酸1位上游或下游的另一蛋氨酸残基作为PRO10282多肽的起始氨基酸残基是可以想象到的和可能的。
PRO10282多肽(Stra6)″细胞外结构域″或″ECD″，是指PRO10282多肽基本上不含跨膜和胞质结构域的一种形式。通常，PRO10282多肽ECD具有小于约1％的此类跨膜和/或胞质结构域，优选具有小于约0.5％的此类结构域。应当懂得，所确定的本发明PRO10282多肽的任何跨膜结构域(一个或多个)是依据本领域在鉴定疏水结构域类型中常规使用的标准而确定的。跨膜结构域的精确的边界会有不同，但在最初确定的结构域的两末端之一最多不超过约5个氨基酸。因此，在本发明的一实施方案中，人PRO10282多肽的细胞外结构域包括氨基酸1至X；其中X是图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中从氨基酸49到59的任何氨基酸。
″PRO10282变体多肽″或″Stra6变体多肽″，这些术语是可互换使用的，它们指如下定义的与下列氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性PRO10282多肽(Stra6)：(a)图2(SEQ ID NO：2)所示PRO10282多肽的1至667残基或图7(SEQ ID NO：5)所示PRO10282多肽的1至658残基的氨基酸序列，(b)图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中1至X残基的氨基酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中氨基酸49至59的任何氨基酸，或者(c)衍生自图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)所示氨基酸序列的另一特定片段。此类PRO10282(Stra6)变体多肽包括，例如，在图2(SEQ ID NO：2)或图(SEQ ID NO：5)中所示序列的N-和/或C-末端以及在一个或多个内部结构域内增加或删减一个或多个氨基酸残基的PRO10282多肽。通常，PRO10282变体多肽与(a)图2(SEQ ID NO：2)所示PRO10282多肽的1至667残基的氨基酸序列或图7(SEQ ID NO：5)所示PRO10282多肽的1至658残基的氨基酸序列，(b)图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中1至X残基的氨基酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中氨基酸49至59的任何氨基酸，或者(c)衍生自图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)所示氨基酸序列的另一特定片段，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或至少约99％的氨基酸序列同一性。PRO10282变体多肽不包括天然PRO10282多肽序列。一般地，PRO10282变体多肽的长度是至少约10个氨基酸，经常是至少约20个氨基酸，更经常是至少约30个氨基酸，更经常是至少约40个氨基酸，更经常是至少约50个氨基酸，更经常是至少约60个氨基酸，或者至少约70个氨基酸，更经常是至少约80个氨基酸，更经常是至少约90个氨基酸，更经常是至少约100个氨基酸，或者至少约150个氨基酸，更经常是至少约200个氨基酸，更经常是至少约250个氨基酸，更经常是至少约300或更多个氨基酸，并且不同于鼠Stra6序列的片段，见Bouillet等，Mechanisms ofDevelopment 63，173-186(1997)。
关于本文鉴定的PRO10282(Stra6)多肽序列的″氨基酸序列同一性百分比(％)″，是指候选序列的氨基酸残基，在进行序列对比并在必要时导入空隙以获取最大百分比的序列同一性，而不将任何保守取代视为序列同一性时，与PRO10282序列的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域各种方法进行序列对比以便测定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量对比的适宜参数，包括针对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性％值是使用下述序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中ALIGN-2程序的全部源代码见表4A-Q。ALIGN-2序列对比计算机程序的作者是Genentech，Inc.，表4A-Q所示源代码和用户数据一起已经提交地处Washington D.C.，20559的美国版权局，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者可从表4A-Q提供的源代码进行编制。ALIGN2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIX V4.0D使用而进行编制。ALIGN-2程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有给定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下计算：
X/Y比值乘以100
其中X是用序列对比程序ALIGN-2比较A和B的氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数，其中Y是B的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。作为计算氨基酸序列同一性％的一个实例，表3A-B说明如何计算指定为″对照蛋白″的氨基酸序列与指定为″PRO″的氨基酸序列的序列同一性％。
除非另外特别声明，否则本文所用所有氨基酸序列同一性％值是按照上述使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，氨基酸序列同一性％也可使用序列对比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic acids Res.25：3389-3402(1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽＝是(yes)，链(strand)＝全部(all)，预期的出现＝10，最低复杂长度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常数＝25，最终缺口化对比的陡降(dropoff)＝25，和评分矩阵＝BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比较时，给定氨基酸序列A针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者说，给定氨基酸序列A具有或含有与给定氨基酸序列B相同的氨基酸序列的％)如下计算：
X/Y比值乘以100
其中X是用序列对比程序NCBI-BLAST2比较A和B氨基酸残基后计算出的相同氨基酸数量，其中Y是B的氨基酸残基总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A针对B的氨基酸序列同一性％将不等于B针对A的氨基酸序列同一性％。
″PRO10282变体多核苷酸″或″PRO10282变体核酸序列″是指编码下述定义的活性PRO10282多肽的多核苷酸分子，它与(a)编码图2(SEQ ID NO：2)所示PRO10282多肽的1至667残基的氨基酸序列的核苷酸序列或编码图7(SEQ ID NO：5)中1至658残基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)编码图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中1至X氨基酸的核苷酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中49至59的任何氨基酸，或者(c)编码衍生自图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)所示氨基酸序列的另一特定片段的核苷酸序列，具有至少约80％的氨基酸序列同一性。通常，PRO10282变体多核苷酸与(a)编码图2(SEQ ID NO：2)所示PRO10282多肽的1至667残基的氨基酸序列的核苷酸序列或编码图7(SEQ ID NO：5)中1至658残基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)编码图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中1至X氨基酸的核苷酸序列，其中X是图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)中49至59的任何氨基酸，或者(c)编码衍生自图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ ID NO：5)所示氨基酸序列的另一特定片段的核苷酸序列，具有至少约80％、优选至少约81％、更优选至少约82％、更优选至少约83％、更优选至少约84％、更优选至少约85％、更优选至少约86％、更优选至少约87％、更优选至少约88％、更优选至少约89％、更优选至少约90％、更优选至少约91％、更优选至少约92％、更优选至少约93％、更优选至少约94％、更优选至少约95％、更优选至少约96％、更优选至少约97％、更优选至少约98％或至少约99％的核酸序列同一性。PRO10282多核苷酸变体不包括天然PRO10282核苷酸序列或天然PRO19578核苷酸序列。
一般地，PRO10282(Stra6)变体多核苷酸的长度是至少约30个核苷酸，经常是至少约60个核苷酸，更经常是至少约90个核苷酸，更经常是至少约120个核苷酸，或者至少约150个核苷酸，更经常是至少约180个核苷酸，更经常是至少约210个核苷酸，更经常是至少约240个核苷酸，或者至少约270个核苷酸，更经常是至少约300个核苷酸，更经常是至少约450个核苷酸，或至少600个核苷酸，或至少900或更多个核苷酸，而且特别排除包含在鼠Stra6核苷酸序列内的多核苷酸，参见Bouillet等，Mechanisms ofDevelopment 63，173-186(1997)所公开的内容。
有关本文鉴定的编码PRO10282(Stra6)多肽的核酸序列的″核酸序列同一性百分比(％)″，是指候选序列中与编码PRO10282多肽的核酸序列相比时，具有相同核苷酸的百分数，这是在对比序列，和如果必要则引入空隙，以达到最大序列同一性百分比的前提下获得的。为测定核苷酸序列同一性百分比而进行的序列对比，可使用本领域各种方法，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于测量对比的适宜参数，包括针对所比较序列的全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为此目的，核苷酸序列同一性％值是如下述使用序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中ALIGN-2程序的全部源代码见表4A-Q。ALIGN-2序列对比计算机程序的作者是Genentech，Inc.，表4A-Q所示源代码和用户数据一起已经提交地处Washington D.C.，20559的美国版权局，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者从表1提供的源代码进行编制。ALIGN2程序应当为在UNIX操作系统，优选在数码UNIX V4.0D使用而进行编制。ALIGN-2程序设定了所有序列对比参数并且不变。
为了本发明目的，给定核酸序列C相对于给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者这样说：给定核酸序列C具有或含有与给定核酸序列D相同的核酸序列的％)如下计算：
W/Z比值乘以100
其中W是用序列对比程序ALIGN-2比较C和D后计算出的相同核苷酸的数量，和其中Z是D的核苷酸总数量。可以理解，当核酸序列C与核酸序列D的长度不相等时，C针对D的核酸序列同一性％将不等于D针对C的核酸序列同一性％。作为计算核酸序列同一性％的一个实例，表3C-D说明如何计算指定为″对照DNA″的核酸序列与指定为″PRO-DNA″的核酸序列的同一性％。
除非另外特别声明，否则本文所用所有核酸序列同一性％值是按照上述使用ALIGN-2序列对比计算机程序获得的。然而，核酸序列同一性％也可使用序列对比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))进行测定。NCBI-BLAST2序列对比程序可从http://www.ncbi.nl m.nih.gov下载。NCBI-BLAST2使用数种检索参数，其中所有这些参数设定为默认值，包括例如，非掩蔽＝yes，链＝全部，预期的出现＝10，最低复杂长度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常数＝25，最终缺口化对比的陡降＝25，和评分矩阵＝BLOSUM62。
当使用NCBI-BLAST2进行序列比较时，给定核酸序列C与给定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者说，给定核酸序列C具有或含有与给定核酸序列D相同的核酸序列的％)如下计算：
W/Z比值乘以100
其中W是用序列对比程序NCBI-BLAST2比较C和D后计算出的相同核苷酸数量，和其中Z是D的核苷酸总数量。可以理解，当核酸序列C与核酸序列D的长度不相等时，C针对D的核酸序列同一性％将不等于D针对C的核酸序列同一性％。
在其它实施方案中，PRO10282(Stra6)变体多核苷酸是编码活性PRO10282多肽的核酸分子，它能够与编码图2(SEQ ID NO：2)或图7(SEQ IDNO：5)所示全长PRO10282多肽的核苷酸序列杂交(优选地在严格杂交和洗涤条件下杂交)。PRO10282变体多肽可以是由PRO10282变体多核苷酸编码的那些多肽。
在如上述进行氨基酸序列同一性比较时使用的术语″阳性″，不仅包括所比较的序列中相同的氨基酸残基，也包括其中具有相似特性的氨基酸残基。针对目的氨基酸残基评分为阳性值的氨基酸残基是那些与目的氨基酸残基相同或是目的氨基酸残基的首选取代的氨基酸残基。(见下表1中定义)。
为了本发明目的，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列阳性值％(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有与给定氨基酸序列B相同的氨基酸序列的阳性％)如下计算：
X/Y比值乘以100
其中X是用上述序列对比程序ALIGN-2比较A和B后得出的如上定义的评分阳性氨基酸数量，其中Y是B的氨基酸残基总数量。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A针对B的阳性％将不等于B针对A的阳性％。
当用″分离的″来描述本文的各种多肽时，是指已从天然环境的组成中鉴定和分离和/或回收的多肽。优选地，分离的多肽与其天然结合的所有组分没有任何结合。多肽的天然环境中的污染成分是那些将干扰使用多肽进行诊断和治疗的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶质。在优选的实施方案中，多肽被纯化为：(1)使用转杯式蛋白测序仪，达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或者(2)达到在非-还原或还原条件下经SDS-PAGE电泳和考马斯蓝或优选银染色证实为同质性的程度。分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为PRO10282(Stra6)自然环境中的至少一个组分是不存在的。然而，通常用至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。
编码PRO10282(Stra6)多肽的″分离的″核酸分子，是从PRO10282编码核酸的天然来源中通常与其结合的至少一种杂质核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。优选地，所述分离的核酸与其天然结合的所有组分没有任何结合。一分离的编码PRO10282的核酸分子不同于其天然形式或组合(setting)。因此，分离的编码PRO10282的核酸分子区别于其在天然细胞中的存在形式。但是，编码PRO10282(Stra6)多肽的分离的核酸分子，包括通常表达PRO10282的细胞中所含的PRO10282-编码核酸分子，例如，所述核酸分子与天然细胞中相应核酸分子所在的染色体位置不同。
术语“控制序列”，指在特定宿主生物中使可操作连接的编码序列表达所需的DNA序列。适于原核生物的调控序列可包括如启动子，任选操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核生物细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当一种核酸与另一种核酸序列处于功能相关的位置时，该核酸与该另一种核酸“可操作相连”。例如如果一种多肽表达为参与该多肽的分泌的前体蛋白，则将前序列或分泌前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作相连；启动子或增强子当能影响编码序列的转录时可与该编码序列可操作相连；或核糖体结合位点当其位置能促进翻译时可与编码序列可操作相连。通常“可操作相连”指被连接的DNA序列是相邻的，而且，如果是分泌前导序列，则相邻且为阅读状态。然而，增强子不必是相邻的。连接可通过在方便的限制性位点相连而实现。如果不存在这样的位点，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
本文所用术语″抗体″是指最广义上的抗体，并特别包括例如单链抗-PRO10282单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异性的抗-PRO 10282抗体组合物、单链抗-PRO 10282抗体和抗-PRO 10282抗体的片段(见下述)。本文中术语″单克隆抗体″，是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。
杂交反应的″严格度″由本领域技术人员很容易地确定，通常根据经验在考虑探针长度、洗涤温度和盐浓度的基础上计算得出。一般而言，长的探针需要较高的温度以便正确退火，而短的探针需要较低温度。杂交通常取决于变性的DNA在低于解链温度的环境中存在互补序列时的重退火能力。探针和杂交序列之间所需同源程度越高，则可使用的相对温度越高。结果是，相对温度较高将使反应条件趋于更加严格，而较低温度则使反应的严谨度较小。有关杂交反应的严格度的其它细节和解释，见Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biologv，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文的″严格条件″或″高度严格条件″，可以定义为：(1)使用低离子强度和高温洗涤，例如，50℃0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中42℃使用变性剂如甲酰胺，譬如，含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或者(3)42℃使用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt′s溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中和于55℃在50％甲酰胺中洗涤，接着于55℃用含EDTA的0.1x SSC进行高度严格洗涤。
″中等严格条件″可以按照Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989的定义，包括使用严格度低于前述的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度，离子强度和SDS％)。中等严格条件的一个实例是，于37℃在如下组成的溶液中过夜温育：20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5xDenhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑精DNA，接着于37-50℃在1x SSC中洗涤杂交膜。本领域熟练技术人员懂得如何必要地调整温度、离子强度等条件以适应诸如探针长度等因素。
本文使用的术语″表位标签″，是指含有与″标签多肽″融合了的PRO10282多肽的嵌合多肽。该标记多肽具有足够多的残基以提供针对所制备抗体的表位，而且要足够短以便它不干预与其融合的多肽的活性。标记多肽也优选确实是独一无二的，以便该抗体与其它表位基本上不发生交叉反应。通常，适宜的标记多肽至少有6个氨基酸残基，一般为约8～50个氨基酸残基(优选为约10～20个氨基酸残基)。
本文所用术语″抗体″是指最广义上的抗体，并特别包括例如单链抗-PRO10282(抗-Stra6)单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)、具有多表位特异性的抗-PRO10282抗体组合物、单链抗-PRO10282抗体和抗-PRO10282抗体的片段(见下述)。
本文中术语″单克隆抗体”，是指来自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。
″抗体片段″包含完整抗体的一部分，优选是完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二价抗体；线形抗体(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段，Fc段的名称反应了其易于结晶的能力。经胃蛋白酶处理可产生具有两个抗原结合位点并仍然能交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的识别和结合位点的最小抗体片段。此区由一个重链可变区与一个轻链可变区紧密地非共价连接形成的二聚体组成。在这个构象中每个可变区的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半仅含有三个抗原特异性CDR)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其比完整的结合位点具有较低的亲和力。
Fab段还包括轻链恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab’与Fab的差别在于Fab在重链CH1的羧基末端多出几个残基，其包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定区半胱氨酸残基中至少有一个游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段在最初产生为Fab’片段对，在它们之间具有铰链区半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联是众所周知的。
脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可依据其恒定区氨基酸序列而归为完全不同的两型(称为k和λ)中的一型。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定区，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是众所周知的。
术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。例如，在EP 404，097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。
“分离的”抗体是已从其天然环境的组成中鉴定、分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰抗体的诊断或治疗应用的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，该抗体的纯度应达到：(1)经Lowery法确定的抗体重量的95％以上，最优选所述重量的99％以上，(2)足以获得用旋转杯状(spinning cup)序列分析仪所测至少15个残基的N端或内部氨基酸序列，(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色、优选银染色所证实的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为该抗体的自然环境中的至少一种组分已不存在。然而，一般情况下分离的抗体可通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“可变”是指可变区某些部分的序列在抗体之间有很大差异，它们可在各个抗体对其特定抗原的结合和特异性方面发挥作用。然而，该变异性不是均匀的分布于整个抗体的可变区。它集中于轻链和重链可变区中三个称为“互补决定区”(CDR)或超变区的节段中。可变区中保守性较高的区域称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括4个FR区，主要采取β-片层构象，由形成环状连接的三个CDR相连接，而在某些情况下可形成部分β片层结构。每条链的CDR通过FR区紧密的靠近在一起，并且与其它链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，第I卷，第647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应功能，例如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性作用。
术语“超变区”在本文中是指抗体上负责结合抗原的氨基酸残基。所述超变区通常包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))和/或那些“超变环”的氨基酸残基(即轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是那些除了本文所定义的超变区残基以外的可变区残基。
“人源化”型非人(例如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab)’2或抗体的其它抗原结合亚序列)，它们包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类等非人源物种抗体(供体抗体)的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv FR残基由相应的非人类残基所取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或供体CDR或框架序列中均不存在的残基。这些修饰旨在进一步改善和最大化抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中CDR区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。任选地，人源化抗体也包括PRIMATIZEDTM抗体，所述抗体的抗原结合区可从用目标抗原免疫接种猕猴制得的抗体中衍生获得。
本文中所用术语“免疫粘附素”定义为抗体样分子，其将异源蛋白(一种“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应器功能组合。结构上，免疫粘附素包括具有所需结合特异性之氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区序列的融合，所述氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合位点(即为“异源性”)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是至少包括一个受体或一个配体的结合位点的邻接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
本文中″活性″是指保留完整或天然PRO10282的生物学和/或免疫学活性的PRO10282形式，其中″生物学″活性指完整或天然PRO10282引起的生物学功能(抑制或兴奋)，并且不包括诱导产生针对完整或天然PRO10282所拥有的表位的抗体的能力；而″免疫学″活性则是指诱导产生针对完整或天然PRO10282所携表位的抗体的能力。优选的生物活性包括例如下述任何一种或多种活性：应答视黄酸而在生长、发育或分化中的作用。基于与Stra6(一种应答视黄酸而诱导的小鼠蛋白)的密切相似性，本文公开的PRO10282多肽，可能在例如早期的背腹侧四肢结构模式和后期的软骨内成骨中起着重要的作用。另一生物学活性涉及在肿瘤发展和生长中的作用。
本文所用″免疫学活性″，优选是″免疫交叉-反应性，″是指候选多肽能够与用已知活性PRO10282(Stra6)多肽制备(raised)的多克隆抗血清竞争性抑制具有此活性的PRO10282(Stra6)多肽的定性生物学活性。以常规方式制备此类抗血清，例如给山羊或兔子皮下注射在完全Freund′s佐剂中的已知活性类似物，接着经腹膜内或皮下注射在不完全Freund′s佐剂中的已知活性类似物以加强。免疫交叉反应性优选是″特异的″，这意味着所鉴定的免疫交叉-反应分子(例如抗体)与相应Stra6多肽的结合亲和力显著高于(优选高至少约2-倍，更优选至少约4-倍，更加优选至少约8倍，最优选高至少约10-倍)其与任何其它已知天然多肽的结合亲和力。
本文中术语″拮抗剂″，使用其广义含义，包括部分或完全阻断、抑制或中和本文所述天然PRO10282多肽生物活性的任何分子。类似地，术语″激动剂″也使用其广义含义，包括模拟本文所述天然PRO10282多肽生物活性的任何分子。适宜的激动剂或拮抗剂分子特别包括：激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段、天然PRO10282多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、小的有机分子等。鉴定PRO10282多肽的激动剂或拮抗剂的方法可以是，使PRO10282多肽与待测激动剂或拮抗剂分子接触，并测定正常情况下与PRO10282多肽有关的一个或多个生物活性的可测得变化。
本文中″肿瘤″是指所有赘生细胞生长和增殖(无论是恶性还是良性肿瘤)，和所有癌前和癌性细胞及组织。
术语″癌″和″癌性的″指或描述哺乳动物中通常以无控细胞生长为特征的生理状况。癌的实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌的更具体的实例包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非-小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌和各种类型头颈部癌。
″治疗″，既指治疗性治疗也指预防性措施，其目的是阻止或延缓(减轻)所针对的病理性病症。那些需要治疗的个体包括，已经患有病症或有患病倾向或者为了预防患上病症的个体。在肿瘤(例如癌)治疗中，治疗剂可直接减少肿瘤细胞的病状，或使得肿瘤细胞对其它治疗剂的治疗(例如，放疗和/和化疗)更为敏感。
癌的″病理学″包括危害患者健康的所有现象。包括但不限于：异常或失去控制的细胞生长、转移、干扰毗邻细胞的正常功能、异常水平释放细胞因子或其它分泌产物、抑制或加重炎症或免疫应答等。
″慢性″给药，指与快速给药模式相反，将试剂以连续给药模式施用，以便在长时间内保持初始治疗效果(活性)。″间断″给药是指治疗不是没有间歇地连续进行，而是以周期性为特征。
意欲治疗的″哺乳动物″是指归为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园里的动物、参与运动项目的动物或宠物如狗、猫、牛、绵羊、猪、山羊、兔、马等。优选所述哺乳动物为人类。
与一种或多种其它治疗剂″联合″给药，包括同时(并行)和以任何顺序联贯给药。
本文所用″载体″包括在所用剂量和浓度下对细胞或哺乳动物无毒性的可药用载体、赋形剂、稳定剂。可药用载体常常是含水的pH缓冲的溶液。可药用载体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
本文中所用″标记″一词，是指直接或间接地与抗体偶联从而产生″标记″抗体的可检测的化合物或组分。标记可以是其本身可被测得(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者如果是酶标记时，可催化底物化合物或组分发生化学变化，这种变化是可检测的。
“固相”是指本发明抗体可粘附的非水性基质。本文中固相的实例包括部分或全部由玻璃(如控制孔径的玻璃)、多糖(如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些实例中，根据上下文的内容，固相可包括测试板的孔；在其它的例子中，它可以是纯化柱(如亲和层析柱)。该术语也包括美国专利4275149中公开的分散颗粒的不连续固相。
“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文公开的PRO10282多肽和/或其抗体)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
本文中″小分子″定义为分子量低于约500道尔顿的分子。
短语″基因扩增″和″基因复制″可交替使用，它们是指使多拷贝基因或基因片段在具体细胞或细胞系内形成的过程。重复的区域(扩增DNA的延伸)一般常指″扩增子″。通常，信使RNA(mRNA)的产生量，即基因表达水平，也与表达的具体基因所产生的拷贝数量成比例增加。
本文所用术语“细胞毒性剂”，是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)，化疗剂，毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段。
″化疗剂″是治疗癌有效的化合物。化疗剂的实例包括：阿霉素，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷(arabinoside)(″Ara-C″)，环磷酰胺，噻替派，白消安，细胞毒素(cytoxin)，紫杉烷例如紫杉醇(Taxol，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和泰索帝(doxetaxel)(泰索常(Taxotere)，Rhne Poulenc Rorer，Antony，Rnace)，toxotere，甲氨蝶呤，顺铂，苯丙氨酸氮芥，长春花碱，博莱霉素，依托泊苷，异环磷酰胺，丝裂霉素C，米托蒽醌，长春新碱，长春瑞宾，卡铂，替尼泊苷，道诺霉素，洋红霉素，氨基蝶呤，放线菌素D，丝裂霉素，esperamicins(见美国专利4,675,187)，5-FU，6-硫代鸟嘌呤，6-巯基嘌呤，放线菌素D，VP-16，苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥及其它有关的氮芥子。对肿瘤起调节或抑制激素作用的激素制剂如他莫昔芬和奥那司酮也包括在此定义中。
本文所用″生长抑制剂″，是指抑制细胞生长的化合物或组合物，特别是抑制过度表达本文鉴定的任一种基因的癌细胞，无论是在体内还是在体外。因此，生长抑制剂是显著降低过度表达此基因的S期细胞百分比的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程的试剂(在S期之外的环节)，譬如，诱导G1期和M-期停滞的试剂。传统的M-期阻断剂包括长春花碱(长春新碱和长春碱)、紫杉酚和拓扑酶II抑制剂如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。那些使G1期停滞的试剂也使S-期停滞，例如，DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞嘧啶-C。进一步的信息可在下列文献中找到：TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel，eds.，Chapter 1，entitled″Cellcycle regulation，oncogens，和antineoplastic drugs″by Murakami等(WBSaunders：Philadelphia，1995)，特别是第13页。
″阿霉素″是蒽环霉素类抗生素。阿霉素的化学全名为(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三去氧-α-L-来苏-吡喃糖苷)]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟-8-(羟乙酰)-甲氧基-5，12-naphthacenedion。
术语″细胞因子″是一般性术语，指由一个细胞群释放的作用于另一个细胞群起细胞间调节子作用的蛋白。这些细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽类激素。细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；缪氏抑制物质(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮细胞生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
本申请所用术语″前体药物″，是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其相对于亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒作用较小且可酶促活化或被转换成更具活性的亲本形式。例见Wilman，″Prodrugs in Cancer Chemotherapy″， Biochemical Society Transactions，14：375-382，615th Meeting，Belfast(1986)，和Stella等，″Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery″，Directed Drug Delivery Borchardt等，(ed.)，pp.147-267，Humana press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于：含有磷酸盐的前体药物，含有硫代磷酸盐的前体药物，含有硫酸盐的前体药物，含有肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化的前体药物，含有β-内酰胺的前体药物，任选含有取代的苯氧乙酰胺的前体药物或任选含有取代的苯基乙酰胺的前体药物，5-氟胞嘧啶和可转化为更具细胞毒活性的游离药物的其它5-氟尿嘧啶前体药物。可衍生为本发明所用前体药物形式的细胞毒药物，包括但不限于上述化疗药物。
本文公开的多肽、其激动剂和/或拮抗剂对于抑制赘生细胞生长、肿瘤生长或癌细胞生长的″有效量″，是指能够将靶细胞生长抑制到一定程度的量。该术语包括可引发对靶细胞的生长抑制、细胞静息和/或细胞毒性作用和/或编程性细胞死亡的量。
而PRO10282(包括PRO19578)多肽或其拮抗剂，用于抑制赘生细胞生长、肿瘤细胞或癌细胞生长目的时的″有效量″，可以完全根据经验和以常规方式予以确定。
有关治疗肿瘤的″治疗有效量″，是指能够达到下列一种或多种效果的量：(1)将肿瘤生长抑制到一定程度，包括减缓生长和完全阻止生长；(2)减少肿瘤细胞数量；(3)缩小肿瘤尺寸；(4)抑制(即减少、减缓或完全阻止)肿瘤细胞浸润周边器官；(5)抑制(即减少、减缓或完全阻止)转移；(6)提高抗-肿瘤免疫应答，这可能但并非必须导致肿瘤消退或者排斥(rejection)；和/或(7)与病症有关的一种或多种症状缓解到一定程度。用于治疗肿瘤为目的的PRO10282多肽拮抗剂的″治疗有效量″，可根据经验和按常规方式予以确定。
PRO10282拮抗剂的″生长抑制量″，是能够抑制细胞尤其是肿瘤细胞(例如癌细胞)在体内或体外生长的量。用于抑制赘生细胞生长目的的PRO10282拮抗剂的″细胞毒性量″，可根据经验并以常规方式予以确定。
PRO10282拮抗剂的″细胞毒性量″，是能够引起体内或体外细胞尤其是肿瘤细胞(例如癌细胞)破坏的量。用于抑制赘生细胞生长的PRO10282拮抗剂的″细胞毒性量″，可根据经验和以常规方式予以确定。
″反义寡脱氧核苷酸″或″反义寡核苷酸″(术语之间可互用)，定义为可以按照序列-特异性方式抑制靶基因进行转录和/或翻译的核酸分子。术语″反义″是指核酸与靶基因的编码(″正义″)遗传序列互补的事实。反义寡核苷酸与新生的mRNA通过Watson-Crick碱基配对而反向平行杂交。通过与靶mRNA模板结合，反义寡核苷酸阻断mRNA模板所编码蛋白质的成功转录。术语特别包括称为″核酶(ribozomes)″的反义因子，已经证明所述核酶通过加入具有天然自-剪切活性的序列而诱导靶RNA催化裂解(Warzocha和Wotowiec，″Antisense  strategy″biological  utility  and prospects  in  the treatment  ofhematological malignancies.″Leuk.Lymphom 24：267-281[1997])。
II.本发明组合物和方法
A.全长天然序列人PRO10282和PRO19578(Stra6)多肽
本发明提供编码本申请分别称为天然序列人PRO10282(或者也称为UNQ3126)和PRO19578多肽的新鉴定和分离的核苷酸序列。更具体而言，如下面的实施例进一步详细公开的那样，已经鉴定和分离出编码天然人PRO10282和PRO19578多肽的cDNA。应注意到在不同表达循环中产生的蛋白可能具有不同的PRO数，但是，任何特定DNA和其编码的蛋白的UNQ数是独一无二的，而且将不会变化。然而，为了简明起见，在本说明书中将DNA148380-2827编码的蛋白以及前述定义的PRO10282的所有其它天然同系物和变体均称为″PRO10282″，而不论其来源或制备模式如何。而″PRO10282″的天然变体-由DNA148389-2827-1编码的多肽，则特别称之为″PRO19578″。
如下面的实施例所公开的那样，本文的DNA148380-2827和DNA148389-2827-1cDNA克隆已经在ATCC保藏。该克隆的实际核苷酸序列，可由本领域熟练技术人员使用本领域常规方法通过对保藏克隆进行序列分析而很容易地测得。使用本领域常规技术可以预测该核苷酸序列编码的氨基酸序列。关于本文所述天然人PRO10282和PR1O9578多肽以及本文所述其编码核酸，申请人已经确定此时在阅读框上什么是与现有序列信息最一致的。
使用上述ALIGN-2序列对比计算机程序，业已发现：全长天然PRO10282序列(见图2和SEQ ID NO：2)与Stra6(应答视黄酸中诱导的小鼠蛋白(AFO62476))具有一定的氨基酸序列同一性。因此，目前据信本申请公开的PRO10282多肽是Stra6蛋白家族的新鉴定的成员，而且可能具有该蛋白家族通常具有的一种或多种生物学和/或免疫学活性或者特性。目前，据信PRO19578是天然全长人PRO10282的其它剪切变体，它在天然人PRO10282氨基酸序列的89-97位缺失9个氨基酸(SPVDFLAGD)，并且在518位处由Ile(I))替代了Met(M)，所述518位与PRO10282的527位相对应。这表明Stra6可以是多形态的。
B.PRO10282(Stra6)变体
本文公开了两种具体天然序列人Stra6多肽(天然序列人PRO10282和PRO19578)。如上所述，据信PRO19578是天然序列人PRO10282的其它剪切型天然变体，因而是一种″PRO10282变体″。除了本文描述的全长天然序列PRO10282和PRO19578多肽外，也考虑了制备PRO10282和PRO19578变体。通过在PRO10282或PRO19578DNA中引入适当的核苷酸改变，和/或通过合成所需PRO10282变体多肽，可以制备PRO10282和PRO19578变体。本领域技术人员懂得，氨基酸变化将会改变PRO10282或PRO19578的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量和位置或者改变膜锚着特性。
使用例如在美国专利5364934号中阐述的保守和非-保守突变的任一技术和指导路线，可以在天然全长序列PRO10282、PRO19578或者在本文所述PRO10282或PRO19578的各种结构域中制造变化。变化可以是编码PRO10282或PRO19578的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，其导致相对于天然序列PRO10282或PRO19578的PRO10282或PRO19578氨基酸序列变化。任选地，变化是PRO10282或PRO19578的一个或多个结构域中的至少一个氨基酸被任何其它氨基酸取代。将PRO10282或PRO19578序列与已知同源蛋白分子进行比较，并使高度同源区氨基酸序列数量变化最小，可以建立决定哪个氨基酸残基可以被插入、取代或缺失而对所需活性无负面影响的指导原则。氨基酸取代可以是一个氨基酸被另一个具有类似结构和/或类似化学特性的氨基酸代替的结果，如丝氨酸置换亮氨酸，即保守氨基酸置换。插入或缺失可任选地在约1～5个氨基酸的范围内。通过系统地在序列中进行氨基酸插入、缺失或取代并检测所得变体显示全长或成熟天然序列的活性的情况，可以确定能允许的变化。
本文提供PRO10282多肽片段。该类片段可以是，例如，与全长天然蛋白相比，在N-末端或C-末端截短的或者是缺乏内部残基的片段。某些片段缺乏那些对于PRO10282或PRO19578多肽的预期生物活性非必要的氨基酸残基。
PRO10282或PRO19578片段可以按照大量常规技术中的任何一个来制备。可以化学合成所需肽片段。另一方法涉及通过酶消化产生PRO10282或PRO19578片段，例如，用已知在特定氨基酸残基所限定的位点裂解蛋白的酶处理蛋白，或用适宜的限制性内切酶消化DNA并分离所需片段。另一适宜的技术包括分离并用聚合酶链反应(PCR)扩增编码所需多肽片段的DNA片段。将限定DNA片段所需末端的寡核苷酸用作PCR的5′和3′端引物。优选地，PRO10282或PRO19578多肽片段具有图2(SEQ ID NO：2)所示天然PRO10282或PRO19578多肽的至少一种生物学和/或免疫学活性。
在特定实施方案中，目标保守取代冠以优选取代的名称示于下表1中。如果这类取代导致生物活性变化，则可引入起更多实质性改变并筛选产物，所述改变在表1中命名为示范性取代，或者如下文有关氨基酸种类的详述。
表1
原始残基      示范性取代                  优选取代
Ala(A)        val；leu；ile                  val
Arg(R)        lys；gln；asn                  lys
Asn(N)        gln；his；lys；arg             gln
Asp(D)        glu                            glu
Cys(C)        ser                            ser
Gln(Q)        asn                            asn
Glu(E)        asp                            asp
Gly(G)        pro；ala                       ala
His(H)        asn；gln；lys；arg             arg
Ile(I)        leu；val；met；ala；phe；
              norleucine                     leu
Leu(L)        norleucine；ile；val；
              met；ala；phe                  ile
Lys(K)        arg；gln；asn                  arg
Met(M)        leu；phe；ile                  leu
Phe(F)    leu；val；ile；ala；tyr     leu
Pro(P)    ala                         ala
Ser(S)    thr                         thr
Thr(T)    ser                         ser
Trp(W)    tyr；phe                    tyr
Tyr(Y)    trp；phe；thr；ser          phe
Val(V)    ile；leu；met；phe；
          ala；norleucine             leu
对PRO10282多肽的功能和免疫学特性的实质性修改可通过选择性取代来完成，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为：
(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水性：cys，ser，thr；
(3)酸性：asp，glu；
(4)碱性：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链取向的残基：gly，pro；和
(6)芳香族：trp，tyr，phe。
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。也可将这种取代的残基引入到保守取代位点，或者更优选地引入其余(非-保守)位点。
可以使用本领域已知方法如寡核苷酸-介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变技术来产生变异。可以对克隆的DNA进行定点诱变[Carter等，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]、盒式诱变[Wells等，Gene，34：315(1985)]、限制选择诱变[Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知技术以产生PRO10282变体DNA。
扫描氨基酸分析也可沿邻接序列确定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。通常，丙氨酸是此组中优选的扫描氨基酸，因为它的β-碳上无侧链并且不太可能改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)]。优选丙氨酸的另一原因是因为它是最常用氨基酸。而且，它常常既出现在掩蔽位置也出现在暴露位置[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman&Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，则可使用同配氨基酸。
C.天然PRO10282(Stra6)和变体PRO10282(Stra6)的修饰
本发明包括PRO1028和PRO10282变体(包括PRO19578)的共价修饰。一种共价修饰包括使PRO10282多肽的靶氨基酸残基和能够与PRO10282的选定侧链或N-或C-末端残基发生反应的有机衍生化剂进行反应。具有双官能剂的衍生化是非常有用的，例如，PRO10282与纯化抗-PRO10282抗体方法中所用的非水溶性载体基质或表面交联，反之亦然。通常使用的交联剂包括例如，1，1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟琥珀酰亚胺酯如与4-叠氮基水杨酸的酯，高双官能亚胺基酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3，3′-连二硫酸双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双官能马来酰亚胺酯如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛酯和化学试剂如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙炔亚胺酯。
其它修饰包括谷氨酰胺和天冬酰残基分别成为相应的谷氨酰和门冬氨酰残基的脱酰胺，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基甲基化[T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]，胺的N-末端乙酰化，和任何C-末端羧基的酰胺化。
本发明还包括PRO10282多肽的另一类共价修饰，所述共价修饰包括改变多肽的天然糖基化模式。天然序列PRO10282和PRO19578多肽含有位于其氨基酸序列8-12位的N-连接的糖基化位点。″改变天然糖基化模式″，在这里的目的是为了删除天然序列PRO10282或PRO19578中一个或多个碳水化合物部分(通过除去发生糖基化的位点或者通过化学和/或酶手段而删除糖基化)，和/或在天然序列PRO10282或PRO19578中加入一个或多个本不存在的糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白糖基化的性质变化，包括不同碳水化合物部分在性质和比例上的变化。
通过改变氨基酸序列可以实现在天然或变体PRO10282多肽中加入糖基化位点。此变更可以例如，通过向天然序列PRO10282中加入、或者取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(针对O-连接的糖基化位点)而完成。任选地，可以通过DNA水平的变化，特别是通过使编码PRO10282多肽的DNA中预先选定的碱基发生突变从而产生将会翻译成期望氨基酸的密码子，来改变PRO10282氨基酸序列。
在PRO10282多肽上增加碳水化合物部分数量的另一方法是，将糖苷与多肽化学性或酶性地偶联。现有技术有此类方法的描述，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330，以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.第259-306页(1981)。
用化学或酶方法，或者通过突变性取代编码作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子，来实现去除PRO10282多肽中的碳水化合物部分。化学性去糖基化技术为本领域所公知，并描述在例如下述文献中：Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118：131(1981)。使用Thotakura等在Meth.Enzvmol.，138：350(1987)中描述的各种内-和外-糖苷酶，可以完成多肽中碳水化合物部分的酶裂解。
PRO10282的另一类共价修饰，包括以美国专利4640835、4496689、4301144、4670417、4791192或4179337中所述方式，将PRO10282多肽与各种非蛋白类聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇或聚氧化亚烷基。
本发明PRO10282多肽也可被修饰成嵌合分子，包括将PRO10282与另一异源多肽或氨基酸序列融合。
在一实施方案中，嵌合分子含有PRO10282与标记多肽的融合体，其中的标记多肽具有抗-标记抗体可选择性结合的表位。表位标记一般位于PRO10282的氨基-或羧基-末端。使用抗标记多肽的抗体，可以检测到此类表位-标记型PRO10282的存在。另外，表位标记的提供，使得利用抗-标记抗体或另一类与表位标记结合的亲和基质来亲和纯化PRO10282变得非常容易。各种标记多肽及其各自抗体是本领域众所周知的。实例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记；flu HA标记多肽及其抗体12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标记和它的8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体[Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其它标记多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽标记[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。
在另一实施方案中，嵌合分子可包括PRO10282与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合。对于二价形式的嵌合分子(也指″免疫粘附素″)，融合可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合优选包括PRO10282多肽的可溶形式(跨膜结构域缺失或失活)取代Ig分子内至少一个可变区。在一特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合包括IgG1分子的铰链区、CH2和CH3区，或铰链区、CH1、CH2和CH3区。免疫球蛋白融合体的制备也参见1995年6月27日发布的美国专利5428130。
D.天然或变体PRO10282(Stra6)多肽的制备
下面的描述主要涉及通过培养转化或转染了含PRO10282核酸的载体的细胞来制备天然序列PRO10282(Stra6)多肽和变体PRO10282(Stra6)多肽(特别包括PRO19578)。因此，当然考虑到本领域熟知的供选择方法可用于制备PRO10282。例如，通过利用固相合成技术的直接合成肽的方法来生产PRO 10282序列或其一部分[参见例如，Stewart等，Solid-Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，，85：2149-2154(1963)]。使用手工或自动操作技术，进行蛋白体外合成。例如，按照制造商的指示，使用实用生物系统肽合成仪(Foster City，CA)，可以完成自动合成。可以分别化学合成PRO10282的各部分，然后利用化学或酶学方法制得全长PRO10282。
1.编码PRO10282(Stra6)DNA的分离
可以从cDNA文库获得编码PRO10282的DNA，所述cDNA文库是从据信具有PRO10282mRNA并且以可测得水平表达PRO10282的组织制备的。相应地，如实施例中所描述的那样，从人组织制备的cDNA文库中可以很方便地得到人的PRO10282DNA。也可以从基因组文库或者通过已知合成方法(例如自动核酸合成)获得PRO10282-编码基因。
使用为识别目标基因或其编码的蛋白而设计的探针(如PRO10282抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)，可以筛选文库。使用标准操作，如Sambrook等在Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：ColdSpring Harbor Laboratory，1989出版)中所描述的方法，用选择的探针进行cDNA或基因组文库的筛选。分离PRO10282编码基因的另一个可选用方法是使用PCR方法[Sambrook等，出处同上；Dieffenbach等，PCR Primer：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1995年出版)]。
下述实施例描述cDNA文库筛选技术。选作探针的寡核苷酸序列应当具有足够的长度并且足够清晰，以便使假阳性出现机率最小。寡核苷酸优选是标记的，这样通过与正在筛选的文库中的DNA杂交而可被检测到。标记方法为本领域所公知，包括使用放射性标记物如32P-标记的ATP、生物素或酶标记。包括中等严格和高度严格的杂交条件，见Sambrook等，出处同上。
可将在筛选文库方法中鉴定的序列与其它已知的保藏序列或公共数据库如GenBank或其它私有序列数据库中的序列进行比较。使用本领域已知的和本文描述的方法，可以测定分子中限定区域或全长序列的序列同一性(无论在氨基酸水平还是在核苷酸水平)。
使用本文首次公开的推定氨基酸序列，和如果必要，使用Sambrook等(出处同上)描述的常规引物延伸程序，以检测没有被逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间体，可以从选定的cDNA或基因组文库获得具有蛋白编码序列的核酸。
2.宿主细胞的选择和转化
用生产本文所述PRO10282的表达或克隆载体转染或转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养宿主细胞，对所述培养基进行改良使之适宜于诱导启动子、选择性转化体或扩增编码所需序列的基因。无需繁琐的试验，本领域熟练技术人员就可以选择培养条件如培养基、温度、pH等。通常，使细胞培养物产量最大化的原则、方案和实用技术见于Mammalian CellBiotechnology：a Practical Approach，M.Butler编著(IRL出版，1991)和Sambrook等，出处同上。
转染真核细胞和转化原核细胞的方法为本领域熟练技术人员所已知，例如，CaCl2、CaPO4、脂质体-介导的方法和电穿孔法。根据所用的宿主细胞，使用适合于该宿主细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等出处同上所述的使用氯化钙的钙处理，或电穿孔法一般用于原核生物。如Shaw等在Gene，23：315(1983)和1989年6月29日公布的WO 89/05859中描述的那样，根癌农杆菌的感染用于转化某些植物细胞。对于没有细胞壁的哺乳动物来说，可以使用Graham和van der Eb在Virology，52：456-457(1978)中所述的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转化的总的情况在美国专利4399216中已有描述。根据Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，76：3829(1979)所述方法，通常可以完成向酵母的转化。然而，也可使用将DNA引入细胞的其它方法，例如通过核的显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合，或者聚阳离子如聚凝胺(polybrene)、聚鸟氨酸。转化哺乳动物细胞的各种方法见Keown等，Methods inEnzymology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。
克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜的宿主细胞，包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适宜的原核生物包括但不限于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌等真细菌，譬如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。各种大肠杆菌株均是公众可以得到的，如大肠杆菌K12株MM294(ATCC 31446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31537)；大肠杆菌株W3110(ATCC 27325)和K5772(ATCC53635)。其它适宜的原核宿主细胞包括肠杆菌科如埃希氏杆菌属，例如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文菌属，克雷白菌属，变形菌杆属，沙门菌属(如鼠伤寒沙门菌)，沙雷菌属(如粘质沙雷菌)和志贺菌属等，以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如1989年4月12日出版的DD 266710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属的铜绿菌假单胞菌，及链霉菌。这些实例是用于说明而并非限制于此。W3110株是一个特别优选的宿主或母宿主，因为它是重组DNA产物发酵的常用宿主株。优选地，宿主细胞分泌少量蛋白水解酶。例如，修饰W3110株以使编码宿主内源性蛋白的基因发生遗传突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110株1A2，该株具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110株9E4，该株具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110株27C7(ATCC 55244)，该株具有完整基因型tonA ptr3phoAE15(argF-lac)169 deg P omp Tkanr；大肠杆菌W3110株37D6，该株具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169degP ompTrbs7ilvG kanr；大肠杆菌W3110株40B4，它是37D6发生非-卡那霉素耐药degP缺失突变的株；和具有1990年8月7日发布的美国专利4946783中披露的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌株。或者，克隆的体外方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应，是适宜的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适于使编码PRO10282的载体克隆或表达的宿主。酿酒酵母是常用的低等真核宿主微生物。其它真核微生物包括：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290：140[1981]；1985年5月2日公布的EP 139383)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4943529；Fleer等，Bio/Technologv，9：968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)：737-742[1983])、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906；Van den Berg等，Bio/Technology，8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和克鲁维氏酵母属(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28：265-278[1988])；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙链孢霉(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP 394538)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉属宿主如构巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284-289[1983]；Tilburn等，Gene，26：205-221[1983]；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984])和黑曲霉等(Kelly和Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。在本文中嗜甲基(Methylotropic)酵母是适宜的，包括但不限于选自下述属的能够在甲醇中生长的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)，念珠菌属(Candida)，克勒克酵母属(Kloeckera)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属，球拟酵母属和红酵母属。此类酵母的例证性特定酵母属的清单见C.Anthony，TheBiochemistrv of Methylotrophs，269(1982)。
用于表达糖基化PRO10282的适合宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞(例如果蝇属S2和草地夜蛾Sf9)和植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更具体的实例包括SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆培养成在悬浮培养液中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；鼠赛尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝脏细胞(Hep G2，HB 8065)；和鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCCCCL51)。选择合适宿主细胞是本领域常识。
3.复制型载体的选择和应用
可将编码PRO10282的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体中以进行克隆(DNA扩增)或表达。各种载体是公众可以获得的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。使用各种方法可将合适的核酸序列插入载体。通常，利用本领域已知技术将DNA插入到合适的限制性核酸内切酶位点。载体组成部分一般包括但不限于：一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。使用本领域熟练技术人员熟知的标准连接技术，构建包括这些组成部分中一个或多个元件的适宜载体。
PRO10282不仅可直接重组制备，而且还可制备成与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特异性裂解位点的其它多肽。通常，信号序列是载体的一个组分或者是被插入载体的PRO10282-编码DNA的一部分。信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导区的原核信号序列。对于酵母分泌，可以是例如酵母转化酶前导区、α因子前导区(包括糖酵母属和克鲁维酵母属的α因子前导区，后者在美国专利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前导区、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导区(1990年4月4日公布的EP 362179)，或者1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信号序列。在哺乳动物细胞表达时，可使用哺乳动物信号序列以直接分泌蛋白，如得自相同物种或相关物种分泌型多肽的信号序列以及病毒分泌前导区。
表达载体和克隆载体均含有使载体在一个或多个选定宿主细胞中复制的核酸序列。在多种细菌、酵母和病毒中，这样的序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起点适宜于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒复制起始点适于酵母，各种病毒复制起始点(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)适宜于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常包含筛选基因，也称为可筛选标记。典型的筛选基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、新霉素、氨基蝶呤或四环素等的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不能得到的关键营养物质，例如编码芽孢杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的筛选标记实例，是那些使能接纳编码PRO10282核酸的细胞得到鉴定的标记，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是按照Urlaub等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980)中描述的方法制备和扩增的DHFR活性缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。适用于酵母的合适筛选基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，282：39(1979)；Kingsman等，Gene，7：141(1979)；Tschemper等，Gene，10：157(1980)]。trpl基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了筛选标记[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
表达和克隆载体通常含有可操作地连接于PRO10282-编码核酸序列的启动子，以指导mRNA合成。被各种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子，包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等，Nature，275：615(1978)；Goeddel等，Nature，281：544(1979)]，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic acids Res.，8：4057(1980)；EP 36776]，和杂合启动子如tac启动子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]。适用于细菌系统的启动子，也含有可操作地连接于编码PRO 10282的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动序列的实例，包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7：149(1968)；Holl and，Biochemistry，17：4900(1978)]的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母启动子，即那些具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区，即乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73657中进一步描述了用于酵母表达系统的适当载体和启动子。
在哺乳动物宿主细胞中，由载体转录PRO10282可受下述启动子调控，所述启动子来自病毒基因组如多瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，和来自热休克启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。
在载体中插入增强子序列，可以增加编码PRO10282的DNA在高等真核生物中的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，作用于启动子以增加所述DNA的转录，一般约10～300bp。目前已知很多哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，人们通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧(late side)的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。所述增强子可以剪接入PRO10282编码序列的5’或3’端，但优选位于启动子的5’端。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和mRNA结构稳定所必须的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含转录为编码PRO10282的mRNA的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。
在重组脊椎动物细胞培养中适应PRO10282合成的其它适宜方法、载体和宿主细胞，见Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；EP 117060；和EP 117058中的描述。
4.检测基因扩增/表达
使用基于本文提供的序列的合适标记的探针，利用常规技术如Southern印迹、测定mRNA转录量的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、点印迹(DNA分析)或原位杂交，可以直接在样品中测定基因扩增和/或表达。或者，使用能够识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂合双链体或者DNA-蛋白双链体。然后标记该抗体，进行试验，试验中，双链体结合于表面，使得通过在该表面双链体的形成，来检测与该双链体结合的抗体的存在。
或者，为直接定量测定表达的基因产物，用免疫学方法测定基因表达，所述方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液分析。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备。可以方便地制备抗天然序列PRO10282多肽的抗体，或抗基于本文提供的DNA序列的合成肽的抗体，或者抗与PRO10282DNA融合并编码特异抗体表位的外源序列的抗体。
5.多肽的纯化
可从培养基或宿主细胞裂解物中回收PRO10282。如果PRO10282与膜结合，那么使用适宜去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解使之自细胞膜释放。使用各种物理或化学手段，如反复冻融、超声、机械破碎或细胞溶解剂，使表达PRO10282所用的细胞破裂。
可以期望从重组细胞蛋白或多肽中纯化PRO10282。下述程序是适宜纯化步骤的实例：在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅或阳离子-交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如交联葡聚糖(Sephadex)G-75进行凝胶过滤；过蛋白A琼脂糖柱以除去污染物如IgG；和结合表位-标记形式PRO10282的金属螯合剂柱。可以使用蛋白纯化的各种方法，这些方法是本领域熟知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principes andPractice，Springer-Verlag，New York(1982)中作了描述。纯化步骤的选择，取决于例如，所使用的生产方法和所产生的特定PRO10282的性质。
E.编码PRO10282(Stra6)多肽的基因在肿瘤组织和细胞系中的扩增
一方面，本发明建立在对在某些癌细胞中扩增的基因的鉴定和描述上。
原核和真核生物的基因组表面上看来存在两个相矛盾的需求。一方面是作为遗传信息的DNA以其原始形式保存和扩增，以确保经过多代的稳定遗传。另一方面，细胞或生物体必须能够适应持久的环境变化。适应机制可以包括遗传物质在性质或数量上的修饰。性质上的修饰包括DNA突变，其中编码序列被改变从而产生结构和/或功能不同的蛋白质。基因扩增是数量上的修饰，由此全编码序列即基因的实际数量增加，导致可利用的转录模板的数量增加，可翻译的转录物的数量增加，并最终导致由扩增基因编码的蛋白质的大量增加。
基因扩增的现象及其发生机制，已在数种原核和真核培养系统做过体外研究。基因扩增最具特征的实例，涉及在含有不同浓度细胞毒药物甲氨蝶呤(MTX)的介质中培养真核细胞。MTX是一种叶酸类似物，它通过阻断二氢叶酸还原酶(DHFR)而干扰DNA合成。在最初暴露于低浓度MTX时，大多数细胞(＞99.9％)会死亡。少量细胞存活，并且通过产生大量DHFR-RNA和蛋白质而能够在MTX浓度升高的介质中生长。过度产生的基础是单一DHFR基因的扩增。发现该基因增加的拷贝呈小的、超数染色体(双微体)形式的非染色体拷贝或者呈集成染色体拷贝。
在发生对细胞毒性剂(细菌的抗体和真核细胞的化疗剂)抗性和致瘤性转化时最常遇到基因扩增。作为自发事件或由于病毒或化学/环境攻击而致的真核细胞的转化，通常与所述细胞中遗传物质发生变化有关。在人恶性肿瘤中观察到的最常见变化之一是p53蛋白突变。p53控制细胞从停滞期(G1)向复制期(S)转变并且在有DNA损害时阻止这种转变。换言之，p53突变体丧失功能的主要后果之一是DNA损害即遗传变化的积聚和扩增。除点突变外，肿瘤细胞中遗传变化的通常类型是扩增和严重的结构改变，如易位。
正如在DHFR实验系统所阐明的那样，DNA序列扩增可能表明特别的功能需要。因此，恶性肿瘤中一定致癌基因的扩增表明这些基因在恶性变和维持转变表型的过程中的成因性作用。该假说已经得到最近研究的支持。例如，发现bcl-2蛋白在某些类型的非何杰金氏淋巴瘤中增多。该蛋白抑制细胞凋亡并导致肿瘤细胞进行性积聚。
业已发现生长因子受体基因家族的成员在各种型癌中扩增，提示这些受体的过度表达可能使得赘生细胞对于有限量可利用的生长因子更加不敏感。实例包括：在雄激素剥夺治疗期间复发性前列腺癌中雄激素受体扩增，和乳腺癌中生长因子受体同系物ERB2扩增。最终，涉及细胞内信号和控制细胞周期进展的基因在恶性变过程中可以发生扩增。这被bel-1和ras基因在各种上皮和淋巴肿瘤中的扩增证实。
这些早期研究提示，在肿瘤中鉴定扩增的DNA序列的可行性，因为这种方法可以鉴定对于恶性变而言非常重要的基因。由于改变蛋白可能代表肿瘤治疗的新而特异的靶，因此，ERB2的情况从治疗的角度也已经证明了这种可行性。
数种不同的技术可用于证明扩增的基因组序列。对制备自癌细胞的染色体伸展(spreads)的经典细胞遗传学分析足以胜任鉴定大体的结构改变，如易位、缺失和倒位。如果有大范围的高拷贝数量或者以染色体外物质存在的话，则仅有扩增的基因组区域可以看得见。虽然细胞遗传学是证明具体染色体改变与特定肿瘤具有一致关联性的首选技术，但是对于鉴定和分离可控制的DNA序列来说是不充分的。最近开发的比较基因组杂交(CGH)技术已经证明肿瘤中广泛存在的基因组扩增现象。肿瘤DNA和正常DNA在正常细胞分裂中期同时杂交，通过对肿瘤中以增强的频率出现的DNA序列进行图形分析，可以筛选整个基因组(WO 93118186；Gray等，Radiation Res.，137：275-289[1994])。作为筛选方法，该类型分析法已经揭示了各种人肿瘤中大量的复发(recurring)扩增子(一段扩增的DNA)。尽管CGH较经典的细胞遗传学分析法在鉴定扩增的DNA段(stretches)方面更为敏感，但是使用标准分子遗传学技术CGH不能够快速鉴定和分离扩增子内的编码序列。
检测基因扩增最敏感的方法是基于聚合酶链反应(PCR)的分析法。这些分析法精巧灵敏，使用极小量的肿瘤DNA作为起始物料，提供用于后续分析(如序列分析)所需的DNA，并且该方法适于进行高容量通过量的分析。
上面提到的分析法并不相互排斥，而是经常被联合应用以鉴定肿瘤中的扩增。尽管细胞遗传学分析和CGH代表检查整个基因组扩增区域的筛选方法，但是基于PCR的分析法最适于编码序列即扩增区域的基因的最终鉴定。
根据本发明，使用定量PCR方法，通过将来源于各种原发肿瘤或肿瘤细胞系的RNA与来源于健康供体的库存(pooled)DNA进行比较，已经鉴定了这些基因(S.Gelmini等，Clin.Chem.43：752[1997])，所述肿瘤包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、脑瘤、肝癌、肾癌、胰腺癌、脾脏肿瘤、甲状腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌等。使用TaqMan仪(ABI)完成定量PCR操作。根据DNA的编码序列设计基因-特异性引物和荧光探针。
人肺癌细胞系，包括A549(SRCC768)，Calu-1(SRCC769)，Calu-6(SRCC770)，H157(SRCC771)，H441(SRCC772)，H460(SRCC773)，SKMES-1(SRCC774)，SW900(SRCC775)，H522(SRCC832)和H810(SRCC833)，所有这些均可从ATCC获得。原发性人肺肿瘤细胞通常衍生自腺癌，鳞状细胞癌，大细胞癌，非小细胞癌，小细胞癌和支气管肺泡癌，并且包括例如SRCC724(腺癌，简写为″AdenoCa″)(LT1)，SRCC725(鳞状细胞癌，简写为″SqCCa)(LTla)，SRCC726(腺癌)(LT2)，SRCC727(腺癌)(LT3)，SRCC728(腺癌)(LT4)，SRCC729(鳞状细胞癌)(LT6)，SRCC730(腺癌/鳞状细胞癌)(LT7)，SRCC731(腺癌)(LT9)，SRCC732(鳞状细胞癌)(LT10)，SRCC733(鳞状细胞癌)(LT11)，SRCC734(腺癌)(LT12)，SRCC735(腺鳞状细胞癌)(LT13)，SRCC736(鳞状细胞癌)(LT15)，SRCC737(鳞状细胞癌)(LT16)，SRCC738(鳞状细胞癌)(LT17)，SRCC739(鳞状细胞癌)(LT18)，SRCC740(鳞状细胞癌)(LT19)，SRCC741(肺细胞癌，简写为″LCCa″)(LT21)，SRCC811(腺癌)(LT22)，SRCC825(腺癌)(LT8)，SRCC886(腺癌)(LT25)，SRCC887(鳞状细胞癌)(LT26)，SRCC888(adeno-BAC癌)(LT27)，SRCC889(鳞状细胞癌)(LT28)，SRCC890(鳞状细胞癌)(LT29)，SRCC891(腺癌)(LT30)，SRCC892(鳞状细胞癌)(LT31)，SRCC894(腺癌)(LT33)。也包括指定为SRCC1125[HF-000631]，SRCC1127[HF-000641]，SRCC1129[HF-000643]，SRCC1133[HF-000840]，SRCC1135[HF-000842]，SRCC1227[HF-001291]，SRCC1229[HF-001293]，SRCC1230[HF-001294]，SRCC1231[HF001295]，SRCC1232[HF-001296]，SRCC1233[HF-001297]，SRCC1235[HF-001299]，andSRCC1236[HF-001300]的人肺肿瘤。
结肠癌细胞系，包括例如ATCC细胞系SW480(腺癌，SRCC776)，SW620(结肠腺癌的淋巴结转移，SRCC777)，Colo320(癌，SRCC778)，HT29(腺癌，SRCC779)，HM7(结肠腺癌细胞系ATCC的高粘蛋白产生的变体，SRCC780，得自Dr.Robert Warren，UCSF)，CaWiDr(腺癌，SRCC781)，HCT116(癌，SRCC782)，SKC01(腺癌，SRCC783)，SW403(腺癌，SRCC784)，LS 174T(癌，SRCC785)，Colo205(癌，SRCC828)，HCT15(癌，SRCC829)，HCC2998(癌，SRCC830)，和KM12(癌，SRCC831)。原发性结肠肿瘤包括指定为CT2(SRCC742)，CT3(SRCC743)，CT8(SRCC744)，CT10(SRCC745)，CT12(SRCC746)，CT14(SRCC747)，CT15(SRCC748)，CT16(SRCC749)，CT 17(SRCC750)，CT 1(SRCC751)，CT4(SRCC752)，CT5(SRCC753)，CT6(SRCC754)，CT7(SRCC755)，CT9(SRCC756)，CT11(SRCC757)，CT18(SRCC758)，CT19(腺癌，SRCC906)，CT20(腺癌，SRCC907)，CT21(腺癌，SRCC908)，CT22(腺癌，SRCC909)，CT23(腺癌，SRCC910)，CT24(腺癌，SRCC911)，CT25(腺癌，SRCC912)，CT26(腺癌，SRCC913)，CT27(腺癌，SRCC914)，CT28(腺癌，SRCC915)，CT29(腺癌，SRCC916)，CT30(腺癌，SRCC917)，CT31(腺癌，SRCC918)，CT32(腺癌，SRCC919)，CT33(腺癌，SRCC920)，CT35(腺癌，SRCC921)，and CT36(腺癌，SRCC922)的结肠腺癌。还包括指定为SRCC1051[HF-000499]，SRCC1052[HF-000539]，SRCC1053[HF-000575]，SRCC1054[HF-000698]，SRCC1142[HF-000762]，SRCC1144[HF-000789]，SRCC1146[HF-000795]和SRCC1148[HF-000811]的人结肠肿瘤。
人乳腺癌细胞系，包括例如HBL100(SRCC759)，MB435s(SRCC760)，T47D(SRCC761)，MB468(SRCC762)，MB 175(SRCC763)，MB361(SRCC764)，BT20(SRCC765)，MCF7(SRCC766)和SKBR3(SRCC767)，以及指定为SRCC1057[HF-000545]的人乳腺肿瘤中心。也包括指定为SRCC1094，SRCC1095，SRCC1096，SRCC1097，SRCC1098，SRCC1099，SRCC1100，SRCC1101的人乳腺肿瘤，和指定为SRCC893[LT 32]的人乳腺-转移-肺-NS肿瘤。
人肾肿瘤中心包括SRCC989[HF-000611]和SRCC1014[HF-000613]。
人睾丸肿瘤中心包括SRCC1001[HF-000733]和睾丸肿瘤边缘(margin)SRCC999[HF-000716]。
人甲状旁腺肿瘤包括SRCC1002[HF-000831]和SRCC1003[HF-000832]。
F.组织分布
本文基因扩增分析的结果，可通过进一步的研究如通过测定各种人组织中mRNA表达来加以证实。
如前面指出的那样，使用基于本文提供的序列的合适标记的探针，利用常规技术如Southern印迹、测定mRNA转录量的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、点印迹(DNA分析)或原位杂交，可以直接在样品中测定基因扩增和/或表达。或者，使用能够识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂化双链体或者DNA-蛋白双链体。
或者，为直接定量测定表达的基因产物，用免疫学方法测定基因在各种组织的表达，所述免疫方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液分析。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备抗体。可以方便地制备抗天然序列PRO10282(Stra6)多肽的抗体，或抗基于本文提供的DNA序列和编码特异抗体表位的合成肽的抗体。下文提供生产抗体所用的一般技术和Northern印迹与原位杂交所用的特殊方案。
G.染色体图谱
如果一指定基因的扩增是功能相关性的，那么该基因应当较对于肿瘤存活不重要的邻近基因组区域被更多地扩增。为证实这种观点，可通过例如放射-杂交分析法对特定染色体进行基因作图。然后在所确定的位置和在邻近基因组区域测定扩增水平。对选择性或优先性扩增的基因组区域的基因图谱表明，基因组区域选择性或优先性扩增与观察到的基因扩增促进肿瘤生长或存活的可能性是一致的。染色体图谱既包括框架绘图也包括中心绘图。更进一步的细节请参见例如，Stewart等，Genome Research，7：422-433(1997)。
H.抗体结合的研究
基因扩增研究的结果，可通过抗体结合研究而得到进一步证实。在该抗体结合研究试验中，检测抗-PRO10282(抗-STRA6)抗体抑制肿瘤(癌)细胞上STRA6多肽表达的能力。例证性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源偶联抗体，它们的制备将在下面予以描述。
可使用本领域已知的方法进行抗体结合研究，所述方法如竞争性结合试验、直接和间接夹心试验，及免疫沉淀试验。Zola，单克隆抗体：技术指南，147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
竞争性结合试验依赖于标记的标准品在同限定量抗体结合中与测试样品分析物竞争的能力。测试样品中靶蛋白(由肿瘤细胞中扩增的基因编码)的量与同抗体结合的标准品的量成反比。为便于测定结合形式的标准品的量，优选抗体在竞争之前或之后是不溶性的，这样可以很方便地把与抗体结合的标准品和测试样品从保持未结合状态的标准品和测试样品中区分开来。
夹心试验涉及使用被检测蛋白质的两种抗体，每一种抗体能够结合待测蛋白不同的免疫原性部分或表位。在一夹心试验中，首先使测试样品分析物与固定在固体载体上的第一抗体结合，然后再使第二抗体与分析物结合，从而形成不溶性的三组分复合物。参见例如美国专利4376110。第二抗体本身可标记有可检测部分(直接夹心试验)，或者通过使用标记有可检测部分的抗-免疫球蛋白抗体来测定第二抗体(间接夹心试验)。例如，一种类型的夹心试验是ELISA分析法，其中可检测部分是酶。
对于免疫组织化学而言，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或者是包埋在石蜡中并用防腐剂如福尔马林固定。
I.基于细胞的肿瘤分析
肿瘤(例如癌)的基于细胞的分析和动物模型，可用于证实基因扩增分析的发现，并进一步了解本文鉴定的基因与肿瘤细胞生长的进展、发病机理之间的关系。使用已经确定扩增本文所述基因的原发性肿瘤细胞或细胞系，可以检测本文鉴定的基因产物在肿瘤或癌发病和病理学中的作用。此类细胞包括例如乳腺、结肠和肺的癌细胞以及上文列举过的细胞系。
在不同的研究中，用本文描述的cDNA转染已知参与特定肿瘤的细胞类型的细胞，并分析这些cDNA诱导过度生长的能力。适宜的细胞，包括例如稳定的肿瘤细胞系如B104-1-1细胞系(neu原癌基因转染的稳定的NIH-3T3细胞系)和ras-转染的NIH-3T3细胞，可用所需的基因转染所述细胞系，并监测肿瘤发生的发展(tumorogenic growth)。然后，可将此转染的细胞系用于检测多克隆或单克隆抗体或抗体组合物通过对转化细胞生长发挥细胞抑制或细胞毒活性，或者通过介导抗体-依赖性细胞毒作用(ADCC)从而抑制肿瘤发生细胞生长的能力。用本文鉴定的基因编码序列转染的细胞，还可用于确定治疗肿瘤的候选药物。
此外，尽管优选稳定的细胞系，但是得自转基因动物(见下述)的原代培养物，可用于本文基于细胞的分析中。从转基因动物获取连续细胞系的技术为本领域所熟知(参见例如Small等，Mol.Cell.Biol.5，642-648[1985])。
J.动物模型
各种众所周知的动物模型，可用于进一步了解本文鉴定的基因在肿瘤发展和发病机理中的作用，并可用于检测候选治疗剂的有效性，所述候选治疗剂包括抗体和天然多肽的其它拮抗剂，后者包括小分子拮抗剂。此类模型的在体(in vivo)特性，使得它们可以具体预见在人类患者的反应。肿瘤和癌(如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等)的动物模型包括非-重组动物和重组(转基因)动物。非重组动物模型包括例如啮齿动物如小鼠模型，此类模型可通过利用标准技术将肿瘤细胞引入同系基因鼠体内而制得，譬如，把结肠癌细胞植入结肠组织中，所述标准技术如皮下注射、尾静脉注射、脾埋入法、腹膜内植入、肾囊植入法或orthopin植入。(参见例如，1997年9月18日公布的公开号为WO 97/33551的PCT申请)。
或许，肿瘤学研究中最常用的动物种系是免疫缺陷小鼠，更具体而言是裸鼠。观察到发育不良裸鼠可以成功地作为人肿瘤异种移植物宿主这一事实，使得裸鼠已经广泛用于此目的。常染色体隐性nu基因已被引入到极大量不同同类系裸鼠中，所述同类系裸鼠包括例如ASW，A/He，AKR，BALB/c，B10.LP，C17，C3H，C57BL，C57，CBA，DBA，DDD，l/St，NC，NFR，NFS，NFS/N，NZB，NZC，NZW，P，RIII和SJL。另外，已经培育了裸鼠之外的具有遗传性免疫缺陷的大量各种其它动物，并且将之用作肿瘤异种移植物的受者。进一步细节请参见例如，The Nude Mouse in Oncology Research，E.Boven and B.Winograd，eds.，CRC Press，Inc.，1991。
引入此类动物的细胞可来自于瘤癌细胞系(tumoricancer)，例如上述列举的任何肿瘤细胞，以及例如B 104-1-1细胞系(neu原癌基因转染的稳定的NIH-3T3细胞系)；ras-转染的NIH-3T3细胞；Caco-2(ATCC HTB-37)；II级中度分化的人结肠腺癌细胞系，HT-29(ATCC HTB-38)，或者来自肿瘤或癌细胞。使用标准条件，包括在液氮冷冻和贮存，可从正在接受手术的患者取得肿瘤或癌细胞样品(Karmali等，Br.J.Cancer，48：689-696[1983])。
通过多种方法可将瘤细胞引入动物如裸鼠中。小鼠的皮下(s.c.)间隙非常适宜肿瘤植入。可以将肿瘤以如下方式移植到皮下：固体块形式，通过使用套针而以针刺组织活检方式，或者以细胞悬液方式。对于固体块或套针方式植入，将合适尺寸的肿瘤组织片段植入到皮下间隙。对于细胞悬液方式植入，则要从原发肿瘤或稳定肿瘤细胞系新鲜配制细胞悬液并进行皮下注射。也可将肿瘤细胞作为皮下植入物进行注射。在这种场合，接种物储存在真皮结缔组织下部和皮下组织之间。Boven and Winograd(1991)，出处同上。
基本上按照Drebin等在PNAS USA，83：9129-9133(1986)中描述的方法，通过例如把大鼠神经母细胞瘤细胞(neu原癌基因最初就是从神经母细胞瘤中分离出来的)或neu-转化的NIH-3T3细胞植入到裸鼠中，可以制得乳腺癌动物模型。
类似地，通过把结肠癌细胞植入到动物如裸鼠中，致使动物出现肿瘤，从而制得结肠癌动物模型。例如，Wang等在Cancer Research，54：4726-4728(1994)和Too等在Cancer Research，55：681-684(1995)中已描述了人结肠癌在裸鼠的同位移植模型。该模型是建立在AntiCancer，Inc.(San Diego，California)出售的所谓″METAMOUSE″基础之上的。
可以把在动物体内长大的肿瘤取出并进行体外(in vitro)培养。然后，再将体外培养的细胞传代给动物。此类肿瘤可以作为进一步检测或筛选药物的靶向目标。或者，分离由传代细胞生发出的肿瘤，并从传代前细胞和经一轮或多轮传代后的细胞中分离RNA，对目的基因的差异表达进行分析。可以对任何已知的肿瘤或癌细胞系实施此类传代技术。
例如，Meth A、CMS4、CMS5、CMS21和WEHI-164是化学诱导的BALB/c雌性小鼠纤维肉瘤(DeLeo等，J.Exp.Med.，146：720[1977])，这为研究各种制剂的抗-肿瘤活性提供了具有高度可控性的模型系统(Palladino等，J.Immunol.，138：4023-4032[1987])。简言之，在体外通过细胞培养来繁殖肿瘤细胞，将肿瘤细胞注射到动物体内之前，在缓冲液中洗涤并悬浮细胞系，细胞密度约10×106～10×107细胞/ml，然后经皮下注射10～100μl细胞悬液而感染动物，使在1～3周出现肿瘤。
另外，小鼠的Lewis肺(3LL)癌(此是研究最彻底的实验用肿瘤之一)可用作实验肿瘤模型。对此肿瘤模型的效力与治疗诊断患有小细胞肺癌(SCCL)的人类患者的有益效果具有良好相关性。通过注射取自感染有肿瘤的小鼠的肿瘤片段或者注射保养在培养物中的肿瘤细胞，可以将肿瘤引入到正常小鼠体内。(Zupi等，Br.J.癌，41：suppl.4：309[1980])，而且证据表明：甚至注射单个细胞即可引发肿瘤，和极高比例的感染肿瘤细胞存活。关于此肿瘤模型的更多信息，请参见Zacharski，Haemostasis，16：300-320[1986]。
在动物模型中评估受试化合物对植入肿瘤效力的一种方法是测量治疗前、后肿瘤的大小。通常，用滑动卡规测量植入肿瘤的二维或三维尺寸。由于只进行二维测量并不能精确反映肿瘤的大小，因此，常常使用一个数学公式而将二维测量结果转换为相应的体积。然而，肿瘤大小的测量是极不准确的。治疗引发的生长延缓和具体的生长迟滞能更好描述候选药物的治疗效果。描述肿瘤生长的另一重要变量是肿瘤体积倍增时间。也可利用计算和描述肿瘤生长的计算机程序，如Rygaard和Spang-Thomsen，Proc.6th Int报道的程序，Workshop on Immune-Deficient Animals，Wu和Sheng编著，Basel，1989，301。但是，应当指出，事实上治疗后的坏死和炎症反应致使肿瘤增大，至少在初始时是这样的。因此，需要通过形态学方法与流式细胞分析法联合，而对这些变化予以小心监控。
使用生产转基因动物的标准技术，通过向感兴趣动物的基因组引入本文鉴定的基因的编码部分，可以对重组(转基因)动物模型进行工程改造。可作为转基因靶的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非-人灵长类动物如狒狒、黑猩猩和猴子。本领域已知的将转基因引入动物的技术，包括原核显微注射(Hoppe和Wanger，美国专利4873191)；逆转录病毒-介导的基因转引入干细胞系(germ lines)(例如，Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-615[1985])；基因靶向进入胚胎干细胞(Thompson等，Cell 56：313-321[1989])；胚胎的电穿孔(Lo，Mol.CeL.BioL3，1803-1814[1983])；精子-介导的基因转移(Lavitrano etal，Cell 57，717-73[1989])。有关评述参见例如美国专利4736866。
为了本发明的目的，转基因动物包括那些仅在其部分细胞携带转基因的动物(″镶嵌型动物″)。该转基因可以单个转基因形式或者以多联体形式(如头-头或头-尾串联体)进行整合。根据例如Lasko等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,6232-636(1992)中公开的技术，将转基因选择性引入特定类型细胞也是可能的。
使用标准技术，可以监测转基因动物中转基因的表达。例如，Southern印迹分析或PCR扩增技术可用于证实转基因的整合。然后，使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学法等技术，可分析mRNA的表达水平。进一步检测动物的肿瘤或癌发展体征。
或者，将编码PRO10282(Stra6)多肽的内源性基因与编码相同多肽的改变了的基因组DNA的同源重组物引入动物胚胎干细胞，而构建其编码本文鉴定的多肽的基因缺陷或改变的″基因敲除″动物。例如，按照已经建立的技术，编码PRO10282多肽的cDNA可用于克隆编码该多肽的基因组DNA。编码特定PRO10282多肽的基因组DNA的一部分，可被删除或用其它基因替换，如被用于监控整合的选择性标志的编码基因替换。通常，将数千碱基对未被改变的旁侧DNA(5′或3′末端)引入到载体中[参见例如Thomas和Capecchi，Cell，51：503(1987)对同源重组载体的描述]。将载体引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选出被引入的DNA已经与内源性DNA发生同源重组的细胞[参见例如，Li等，Cell，69：915(1992)]。接着，将选出的细胞注入动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中，以形成聚集嵌合体[参见例如，Bradley，in Teratocarcinomas和Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson编著(IRL，Oxford，1987)，113-152页]。将嵌合胚胎植入适宜的假妊娠雌性养育动物体内，胚胎生长到足月即成为″基因敲除″动物。使用标准技术，鉴定出在其干细胞中携带有同源重组DNA的子代动物，用这些子代动物繁殖出在所有细胞中均含有同源重组DNA的动物。基因敲除动物的特征在于，例如，抵御某些病理病症的能力和由于动物缺乏PRO10282多肽而发生病理病症。
特异结合于本文鉴定的多肽的抗体和其它候选药物的效力，也可在自发性动物肿瘤的治疗中得到测试。此类研究的合适靶是猫口腔鳞状细胞癌(SCC)。猫口腔SCC是高度侵袭性的恶性肿瘤，后者是猫最常见的口腔恶性肿瘤，占报道过的猫科口腔肿瘤的60％以上。尽管低转移发生率可能仅仅是猫患上此肿瘤后生存时间短的反映，但是该肿瘤极少转移到远端部位。主要由于猫口腔解剖学的原因，使得这些肿瘤通常不适宜接受手术。目前，对此肿瘤尚无有效的治疗办法。在接受研究之前，对每一只猫进行全身临床检查，活检并进行计算机断层摄影扫描(CT)。诊断为舌下口腔鳞状细胞肿瘤的猫排除在此研究之外。即使治疗杀灭肿瘤，舌也会因肿瘤的缘故而变得麻痹，动物不能自己进食。在一较长期间，对每只猫重复治疗。治疗期间的每一天进行肿瘤拍片(Photographs)，并与后来的每一张片进行核对。治疗后，每只猫再次接受CT扫描。治疗后每8周评价CT扫描和X线胸片。数据用于评价与对照组相比在存活、反应和毒性方面的差异。阳性反应需要肿瘤退缩的证据，优选伴有生活质量改善和/或寿命增加。
另外，也可检测其它自发性动物肿瘤，如犬、猫和狒狒的纤维肉瘤、腺癌、淋巴瘤、chrondroma，平滑肌肉瘤。其中，犬和猫的乳腺癌是优选的模型，因为其外观和行为与在人所见到的极为相似。然而，该模型的使用受此类型肿瘤在动物罕有发生的限制。
K.候选药物筛选试验
候选药物筛选试验，目的是鉴定与由本文确定的基因编码的多肽结合或复合的化合物，或者相反，鉴定那些干扰基因编码的多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选试验包括使用高通过量化学数据库筛选分析，使之特别适于鉴定小分子候选药物。考虑到的小分子包括合成的有机或无机化合物，包括肽，特别是可溶性肽、(多)肽-免疫球蛋白融合体，和尤其是抗体，包括但不限于多克隆抗体和单克隆抗体以及抗体片段、单链抗体、抗-独特型抗体和嵌合抗体或人源化抗体或片段，以及人抗体和抗体片段。试验可按照多种方式进行，包括蛋白质-蛋白质结合分析、生化筛选分析、免疫测定和基于细胞的分析，这些分析方法在本领域已被很好描述。
本文中所有的候选药物筛选试验均具有共同的特性，那就是：在控制条件下将候选药物与由本文鉴定的核酸编码的多肽接触足够时间，以使两种分子相互作用。
在结合分析中，相互作用是结合，从反应混合物中分离或检测形成的复合物。在一特定实施方案中，通过共价或非-共价附着方式，把由本文鉴定的基因编码的多肽或候选药物固定在固相上，如固定到微量滴定板上。一般通过用多肽溶液包被固体表面并进行干燥而完成非-共价附着。或者，固定抗体(例如对要被固定的多肽具有特异性的单克隆抗体)可用于使多肽固定到固体表面。试验这样进行：向固定组分中加入非固定组分，所述非固定组分可以标记上可检测的标记物，所述固定组分譬如含有使多肽固着的组分的被包被表面。当反应完成时，除去未反应的组分(例如，通过洗涤方式)，并检测固着在固体表面的复合物。当原来非固定组分带有可检测标记物时，检测到固定在表面的标记物，就表明复合物形成。如果原来非-固定组分没有携带标记物，则可以检测复合，例如，通过使用与固定复合物特异结合的标记抗体来进行检测。
如果候选化合物与由本文确定的基因编码的特定PRO10282多肽相互作用但是又不与之结合，那么，使用已知的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法来分析与PRO10282多肽的相互作用。此类分析方法包括惯常的方法，例如，交联、共-免疫沉淀和通过梯度或层析柱的共-纯化。此外，按照Fields与其同事(Fields和Song，Nature(340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991))和Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5789-5793(1991)公开的方法，使用酵母-基础上的遗传系统可以检测蛋白质-蛋白质相互作用。许多转录激活剂，如酵母GAL4，它由两个完全分散的调节结构域构成，其一作为DNA-结合结构域，另一个作为激活转录的结构域。前述出版物中描述的酵母表达系统(一般称为″双杂种体系(two-hybrid system)″)利用此特性，并使用两个杂合蛋白，其一的靶蛋白质与GAL4的DNA-结合区融合，另一个的候选激活蛋白质与激活结构域融合。在GAL4-激活的启动子控制下GAL1-lacZ报告基因的表达，依赖于通过蛋白质-蛋白质相互作用重建的GAL4活性。用β-半乳糖苷酶的显色底物检测含有相互作用多肽的菌丛。从Clontech可以商购利用双杂种技术鉴定两个特异蛋白质间蛋白质-蛋白质相互作用的全套试剂盒(MATCHMAKERTM)。该系统也可被扩展到描绘参与特异蛋白质相互作用的蛋白质结构域，并查明对于这些相互作用起关键作用的氨基酸残基。
为了寻找干扰本文确定的编码PRO10282的基因与其它细胞内或细胞外组分相互作用的化合物，通常在控制条件下，制备含有扩增基因产物和细胞内或细胞外组分的反应混合物，使两种产物相互作用和结合一定时间。为了测试候选化合物抑制上述结合的能力，在含有和不含有受试化合物的条件下进行反应。另外，可把安慰剂加入到第三反应混合物中，作为阳性对照。按照上述方法，监测混合物中受试化合物与细胞内或细胞外组分之间的结合(复合物形成)。在对照反应中有复合物形成，而在含有受试化合物的反应混合物中没有复合物形成，则表明该受试化合物干预受试化合物与其配伍化合物之间的相互作用。
为分析拮抗剂，可将PRO10282多肽与被筛选化合物一起加入到细胞中，一定活性和能力的化合物抑制共存的PRO10282多肽的有关活性，则表明该化合物是PRO10282多肽的拮抗剂。或者，在适当条件下使PRO10282多肽和潜在拮抗剂与结合在膜上的PRO10282多肽受体或重组受体结合，通过竞争性抑制实验来检测拮抗剂。可标记PRO10282多肽，如放射性标记，这样，结合在受体上的PRO10282多肽分子数量，就可用于测定潜在拮抗剂的效力。使用本领域已知的众多方法，例如，配体淘选和FACS分选，可以鉴定编码受体的基因。Coligan等，Current Protocols in Immun.，1(2)：Chapter5(1991)。优选使用表达克隆，其中多聚腺苷酸化RNA是从对PRO10282多肽应答细胞中制备的，由该RNA建立的cDNA文库被分成数个库，用于转染COS细胞或其它对PRO10282多肽不应答的细胞。使玻璃载玻片上生长的转染细胞与标记的PRO10282多肽接触。可用各种方法标记PRO10282多肽，包括碘化或位点特异蛋白激酶的识别位点的包埋。固定和温育后，载玻片接受放射自显影分析。鉴定阳性库，制备亚-库，并使用交互作用的亚-库进行再转染，重新进行筛选过程，直至得到编码推定受体的单个克隆。
作为受体鉴定的另一途径，可使标记的PRO10282多肽与细胞膜或表达受体分子的提取制品进行光亲和连接。用PAGE除去交联材料，暴露于X-线胶片。可切除含受体的标记复合物，分解为肽片段，接受蛋白微测序。从微测序得到的氨基酸序列，用于设计一套筛选cDNA文库的简并寡核苷酸探针，以鉴定编码推定受体的基因。
在拮抗剂另一分析方法中，在侯选化合物存在的条件下，哺乳动物细胞或表达受体的膜制品与标记的PRO10282多肽温育。然后测定化合物增强或阻断相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更特异实例包括与免疫球蛋白和PRO10282多肽的融合物结合的寡核苷酸，特别是抗体包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗-独特型抗体，和嵌合抗体或人源化抗体或抗体片段，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在拮抗剂是密切相关的蛋白，例如，PRO10282多肽的突变形式，其识别受体但不引起效应，从而竞争性抑制PRO10282多肽的作用。
另一潜在PRO10282多肽拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如，反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交和阻止蛋白翻译，起着直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于通过形成三体螺旋结构或通过反义DNA或RNA控制基因表达，这两种方法均建立在多核苷酸与DNA或RNA结合的基础上。例如，编码本文所述成熟PRO10282多肽的多核苷酸序列的5′编码部分，被用于设计约10～40个碱基对长度的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成参与转录基因区的互补序列(三链螺旋参见Lee等，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney等，Science，241：456(1988)；Dervan等，Science，251：1360(1991))，由此阻止转录和PRO10282多肽产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，阻断mRNA分子翻译成PRO10282多肽(反义，见Okano，Neurochem.，56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC Press：Boca Raton，FL，1988)。也可把上述寡核苷酸释放入细胞中，这样反义RNA或DNA可在体内表达，从而抑制PRO10282多肽的产生。当使用反义DNA时，优选衍生自翻译起始位点寡脱氧核苷酸，例如，靶基因核苷酸序列的约-10和+10位。
通常，反义RNA或DNA分子的长度至少约5个碱基、约10个碱基、约15个碱基、约20个碱基、约25个碱基、约30个碱基、约35个碱基、约40个碱基、约45个碱基、约50个碱基、约55个碱基、约60个碱基、约65个碱基、约70个碱基、约75个碱基、约80个碱基，约85个碱基、约90个碱基、约95个碱基、约100个碱基或更多。
潜在的拮抗剂包括与活性位点、受体结合位点、或生长因子或PRO10282多肽其它相关结合位点结合的小分子，从而阻断PRO10282多肽的正常生物活性。小分子的实例包括但不限于，小肽或类-肽分子，优选溶解的肽和合成的非-肽有机或无机化合物。
核酶是能够催化RNA特异性裂解的具有酶性质的RNA分子。核酶通过序列-特异性杂交于互补的靶RNA，接着产生核酸内裂解。使用已知技术，可以鉴定位于潜在RNA靶内的特异核酶裂解位点。进一步的细节请参见例如Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)，和PCT出版物WO 97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三链螺旋构型的核酸分子，应当是单链并由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸碱基组成是设计好的，这样它通过Hoogsteen碱基配对原则促进三链螺旋的形成，这一般需要双螺旋中一条链上的嘌呤或嘧啶相当大的延伸。更详细情况请参见例如，PCT出版物WO 97/33551，出处同上。
用上述讨论的筛选试验的任何一个或多个分析方法，和/或使用本领域技术人员熟知的任何其它筛选技术，可以鉴定这些小分子。
L.PRO10282(Stra6)的应用
编码PRO10282(Stra6)多肽的核苷酸序列(或其互补序列)在分子生物学领域具有多种用途，包括用作杂交探针、在染色体和基因图谱以及在制备反义RNA和DNA中的用途。PRO10282核酸对于通过本文所述重组技术来制备PRO10282多肽，也是非常有用的。
全长天然序列PRO10282基因(SEQ ID NO：1)或PRO19578基因(SEQ ID NO：4)或它们的一部分，可用作cDNA文库的杂交探针以分离出全长PRO10282或PRO19578cDNA，或分离出与图1(SEQ ID NO：1)中公开的PRO10282序列或图6(SEQ ID NO：4)中公开的PRO19578序列具有期望序列同一性的其它cDNA(例如，那些编码其它天然发生的PRO10282变体或来自其它种属的PRO10282的cDNA)。任选地，探针长度是约20～约50个碱基。杂交探针可源自于SEQ ID NO：1核苷酸序列的至少部分新区，其中所述新区是那些不需要十分繁琐实验就可确定的区域，或从包括启动子、增强子元件和内含子的天然PRO10282或PRO19578基因的基因组序列中确定的区域。举例来说，筛选方法包括：使用已知DNA序列合成约40个碱基的选定探针，来分离PRO10282或PRO19578基因的编码区。杂交探针可标记上各种标志，包括放射性核苷酸如32p或35S或酶标记，所述酶标记如通过亲和素/生物素偶联系统将碱性磷酸酶与探针耦合。具有与本发明PRO10282或PRO19578基因互补序列的标记探针，可用于筛选人cDNA文库、基因组DNA或mRNA，以测定探针与哪一文库发生杂交。下面的实施例将进一步详细描述杂交技术。
使用本文公开的方法，本申请公开的任何EST序列可类似地用作探针。
PRO10282(Stra6)核酸的其它有用片段，包括含有能与靶PRO10282(Stra6)mRNA(正义)或PRO 10282(Stra6)DNA(反义)序列结合的单链核酸序列(RNA或DNA)的反义或正义寡核苷酸。根据本发明，反义或正义寡核苷酸包括PRO10282(Stra6)DNA编码区的片段。该片段一般含有至少约14个核苷酸，优选地由约14～30个核苷酸。基于编码一给定蛋白的cDNA序列得到反义或正义寡核苷酸的能力，在例如Stein和Cohen(Cancer Res.48：2659，1988)及van der Krol等(BioTechniques 6：958，1988)的文章中有描述。
反义或正义寡核苷酸与靶核酸序列的结合，导致通过一种或多种方式阻断靶序列转录或翻译的双螺旋形成，所述阻断方式包括增加双螺旋降解、转录或翻译的成熟前终止或者其它方式。因此，反义寡核苷酸可用于阻断PRO10282(Stra6)蛋白的表达。反义或正义寡核苷酸进一步包括具有修饰过的糖磷酸二酯主链的寡核苷酸(或其它糖链接，如WO 91/06629中描述的那些)，其中此类糖链接是耐内源性核酸酶的。具有抗性糖链接的寡核苷酸在体内是稳定的(即，能够抗酶降解)，同时保留序列与靶核苷酸序列结合的序列特异性。
正义或反义寡核苷酸的其它实例包括那些与有机分子共价键合的寡核苷酸，如WO 90/10048中描述的那些寡核苷酸，和其它增加寡核苷酸与靶核酸序列亲和力的分子，如聚-(L-赖氨酸)。另外，嵌入剂(如椭圆玫瑰树碱)和烷基化剂或金属络合物可挂接在正义或反义寡核苷酸上，以修饰反义或正义寡核苷酸对靶核苷酸序列的结合特异性。
使用任何基因转移方法可将反义或正义寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的细胞中，所述方法包括例如，CaPO4-介导的DNA转染、电穿孔、或使用基因转移载体如Epstein-Barr病毒。在一优选的方法中，将反义或正义寡核苷酸插入到一适宜的逆转录病毒载体中，在体内或体外使含有靶核酸序列的细胞与重组逆转录病毒载体接触。适宜的逆转录病毒载体包括但不限于，得自小鼠逆转录病毒M-MuLV、N2(得自M-MuLV的逆转录病毒)，或称为DCT5A、DCT5B和DCT5C的双倍复制载体(见WO 90/13641)。
也可以通过使正义或反义寡核苷酸与配体结合分子形成偶联物的形式，而将正义或反义寡核苷酸引入到含有靶核苷酸序列的细胞中，见WO91/04753中的描述。适宜的配体结合分子包括但不限于：细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或能与细胞表面受体结合的其它配体。优选地，配体结合分子的偶联基本上不干扰配体结合分子与其相应分子或受体结合的能力，或阻断正义或反义寡核苷酸或其偶联型进入细胞。
或者，按照WO 90/10448描述的方法，通过形成寡核苷酸-脂复合物，而将正义或反义寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的细胞中。优选地，正义或反义寡核苷酸-脂复合物是在细胞内使用内源性脂酶分离的。
也可在PCR技术中使用探针，以产生用于鉴定最接近PRO10282编码序列的一组序列。
编码天然序列PRO10282(Stra6)多肽的核苷酸序列，还可用于构建在描绘编码PRO10282(Stra6)的基因图谱和对患有遗传病个体进行基因分析中使用的杂交探针。使用已知技术，如原位杂交、抗已知染色体标记物的连锁分析和与文库的杂交筛选技术，可将本文提供的核苷酸序列作图于染色体和染色体的特定区域。
当PRO10282的编码序列编码能与另一蛋白结合的蛋白时(例如，PRO10282是受体时)，PRO10282可用在鉴定参与结合反应的其它蛋白或分子的分析中。使用此类方法，可以鉴定受体/配体结合反应的抑制剂。还可将参与此结合反应的蛋白用于筛选肽或结合反应的小分子抑制剂或激动剂。而且，受体PRO10282(Stra6)可用于分离相关配体。可设计筛选分析以寻找模拟天然PRO10282(Stra6)或与PRO10282结合的天然多肽(“PRO10282结合蛋白”)生物活性的主要化合物。此类筛选分析包括使用化学用数据库进行高-通过量筛选分析，使之特别适宜于鉴定小分子侯选药物。小分子包括合成的有机或无机化合物。可使用各种形式的分析法，包括蛋白-蛋白结合分析，生化筛选分析，免疫测定和以细胞为基础的分析，这些分析法均是本领域公知的。
编码PRO10282或其修饰形式的核酸，也可用于生产转基因动物或″敲除″动物，所得动物反过来对于开发和筛选适合的治疗剂是非常有用的。转基因动物(例如小鼠或大鼠)是含有转基因细胞的动物，所述转基因被引入到动物或孕期，例如胚胎期祖代动物中。转基因是整合入细胞基因组的DNA，由所述细胞发展为转基因动物。在一实施方案中，使用已经建立的技术和用于生产含有表达编码PRO10282DNA的细胞的转基因动物的基因组序列，编码PRO10282的cDNA可用于克隆编码PRO10282的基因组DNA。生产转基因动物的方法，特别是诸如小鼠或大鼠这样的动物，已经成为本领域常规技术，并在例如美国专利4736866和4870009中有描述。通常，带有组织-特异增强子的PRO10282转基因被整合入特定细胞中。包含在胚胎期被整合入动物干细胞一个拷贝编码PRO10282转基因的转基因动物，可用于检测增加编码PRO10282DNA表达的效果。此类动物可用作检测认为有可能对与过度表达有关的病理病症具有保护作用的药剂的试验动物。根据本发明的一个方面，与未经治疗的携带转基因的动物相比，用药剂治疗的动物，其病理病症的发生率降低，这表明该药剂对于这种病理病症具有潜在的治疗干预作用。
或者，PRO10282的非-人源同系物用于构建PRO10282的″敲除″动物，该动物具有缺陷的或改变的PRO10282编码基因，这是将内源性PRO10282编码基因和改变的编码PRO10282基因组DNA之间的同源重组物引入动物胚胎干细胞的结果。例如，按照已经建立的技术，可将编码PRO10282的cDNA用于克隆编码PRO10282的基因组DNA。编码PRO10282基因组DNA的一部分，可被删除或用其它基因替换，如被用于监控整合的选择性标志的基因编码替换。通常，将数千碱基对未被改变的侧面DNA(5′或3′末端)引入到载体中[参见例如Thomas和Capecchi，Cell，51：503(1987)对同源重组载体的描述]。将载体引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选出引入了已经与内源性DNA同源重组的DNA的细胞[参见例如，Li等，Cell，69：915(1992)]。接着，将选出的细胞注入动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中，以形成聚集嵌合体[参见例如，Bradley，in Teratocarcinomas和Embryonic StemCells：A Practical Approach，E.J.Robertson编著(IRL，Oxford，1987)，113-152页]。将嵌合胚胎植入适宜的假妊娠雌性养育动物体内，胚胎生长到足月即成为″敲除″动物。使用标准技术，鉴定出在其干细胞中携带有同源重组DNA的子代动物，用这些子代动物繁殖出在所有动物细胞中均含有同源重组DNA的动物。敲除动物的特征在于，例如，抵御某些病理病症的能力和由于动物缺乏PRO10282多肽而发生病理病症。
也可将编码PRO10282多肽的核酸用于基因治疗。在基因治疗应用中，将基因引入细胞以便达到在体内合成治疗有效的基因产物，例如置换缺陷基因。″基因治疗″，既包括经单次治疗就可获得永久效果的常规基因治疗，也包括基因治疗剂的给药，后者涉及一次或重复多次施用治疗有效量的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可用作阻断体内某些基因表达的治疗剂。业已证明，短链反义寡核苷酸可整合入细胞中，在所述细胞中，短链反义寡核苷酸起抑制剂的作用，而不论由于细胞膜的限制性摄取所导致其低细胞内浓度如何。(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4143-4146[1986])。可修饰寡核苷酸以增强其摄取，例如无电荷的基团取代带阴性电荷的磷酸二酯。
有各种可利用的技术来把核酸引入到活细胞中。所述技术依是否将核酸转移进体外培养细胞或目的宿主体内细胞中而异。将核酸转移入哺乳动物体外细胞的适宜技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括用病毒(通常为逆转录病毒)载体转染和用病毒包衣蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等，Trends in Biotechnology 11，205-210[1993])。有些情况下，希望提供带有针对靶细胞的物质的核酸源，所述物质如对细胞表面的膜蛋白具有特异性的抗体，或靶细胞上受体的配体等。使用脂质体时，将与参与胞吞的细胞表面膜蛋白结合的蛋白用作靶向和/或促进摄取的物质，例如对特定型细胞具有定向性的病毒衣壳蛋白或其片段、在循环中发生内化的蛋白的抗体、靶向于细胞内定位(localization)并增加细胞内半衰期的蛋白。有关受体-介导的胞吞的技术在例如Wu等，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中有描述。关于基因标志和基因治疗方案的综述，请参见Anderson等，Science 256，808-813(1992)。
本文所述PRO10282多肽也可用作电泳中蛋白的分子量标志。
本文所述编码PRO10282多肽或其片段的核酸分子在染色体鉴定中非常有用。在此方面，由于基于实际序列数据只有相对少数几个可利用的染色体标志剂，因而一直存在着对于鉴定新染色体标志的需求。本发明每一个PRO10282核酸分子均可用作染色体标志。
本发明PRO10282多肽和核酸分子也可用于组织分型，其中本发明PRO10282多肽在不同组织间有差别地表达。PRO10282核酸分子还可用于制备PCR、Northern印迹、Southern印迹和Western印迹分析用的探针。
本文所述PRO10282多肽也可用作治疗剂。按照已知制备有益药物组合物的方法，可制得本发明PRO10282多肽，所制得的PRO10282产品与可药用载体呈混合物结合。为了所制备的治疗剂的贮存，将具有所需纯度的活性组分与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合(Reminaton′s PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编著(1980))，制备成冷冻干燥制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂，在所用剂量和浓度范围对接受者没有毒性，其包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量多肽(小于约10个残基)；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖或糊精；螫合剂，如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌膜过滤而轻易实现。
本文的治疗组合物一般盛放在具有无菌存取口的容器中，例如该容器是静脉注射袋或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶。
给药途径与已知方法一致，例如注射或静脉输注、腹膜内、颅内、肌内、眼内、动脉内或损伤部位内给药，局部用药或使用持续释放系统给药。
本发明药物组合物的剂量和所需药物浓度，将依预想的特定用途而异。决定适宜剂量或给药途径是普通内科医师完全能够很好胜任的事情。动物试验为决定治疗人类患者所用剂量提供可靠指导。可按照Yacobi等编著的Toxicokinetics and New Drug Development(Pergamon Press，New York 1989)一书中，Mordenti，J.和Chappell在W.″The use of interspecies scaling intoxicokinetics″第42-96页所给出的方法换算种属间有效剂量的比例。
体内施用PRO10282多肽或其激动剂或拮抗剂时，取决于给药途径，每日标准剂量范围为约10ng/kg至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选地约1μg/kg/日～10mg/kg/日。文献提供了有关特定剂量的指导和给药方法，参见例如美国专利4657760；5206344；或5225212。对于不同治疗化合物和不同病症而言，可以预期不同制剂能够奏效，例如，施用于一种器官或组织的制剂必须以不同于施用于其它器官或组织的方式进行给药。
当期望PRO10282多肽在具有适宜于治疗那些需要施用PRO10282多肽的任何疾病或病症的释放特性的制剂中持续释放给药时，考虑使用微囊化。持续释放用的重组蛋白微囊化已被成功地用于人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MN rgp120的持续释放。Johnson等，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technologv 8：755-758(1990)；在Powell和Newman编著的Vaccine Design： The Subunit and Adjuvant Approach(Plenum Press：New York，1995)一书中第439-462页，Cleland，″Design and Production of Single Immunization VaccinesUsing Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems″；WO 97/03692，WO96/40072，WO 96/07399；和美国专利5654010。
由于聚乳酸-共乙醇酸(PLGA)聚合物具有生物相容性很宽范围的生物降解特性，所以使用该聚合物来制备蛋白的持续释放制剂。PLGA的降解产物，即乳酸和羟基乙酸，在体内被快速清除。而且，可以根据该聚合物的分子量和构成来调节其降解特性，可以是数月到数年不等。在M.Chasin和R.Langer(编著)，Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems(MarcelDekker：New York，1990)一书中第1-41页，Lewis，″Controlled release of activeagents from lactide/glycolide polymer″。
本发明包括筛选化合物的方法，以鉴定那些模拟PRO10282多肽(激动剂)或者阻止或抑制PRO10282多肽(拮抗剂)作用的化合物。拮抗剂侯选药物筛选试验，目的是鉴定与由本文确定的基因编码的PRO10282多肽结合或复合的化合物，或者相反，鉴定那些干扰基因编码的多肽与其它细胞蛋白相互作用的化合物。此类筛选试验包括使用高通过量化学数据库筛选分析，使之特别适于鉴定小分子侯选药物。
试验可按照多种方式进行，包括蛋白-蛋白结合分析、生化筛选分析、免疫测定和基于细胞的分析，这些分析方法在本领域已被很好描述。
所有拮抗剂试验共同的方面是，它们使侯选药物与由本文确定的核酸编码的PRO10282多肽接触足够时间以使得这两种组分相互作用。
在结合试验中，相互作用是结合，形成的复合物可被分离或在反应混合物中被检测。在一特定实施方案中，通过共价或非-共价地附着，而把由本文确定的基因编码的PRO10282多肽或侯选药物固定在固相上，例如，固定在微量滴定盘上。一般通过用PRO10282多肽溶液包被固体表面并进行干燥而实现非-共价附着。或者，固定抗体，例如，固定的对PRO10282多肽具有特异性的单克隆抗体，可用于使PRO10282多肽固定到固体表面。试验这样进行：向固定组分中加入非固定组分，所述非固定组分可以标记上可检测的标记物，譬如，包被的表面含有使PRO10282多肽固定的组分。当反应完成时，除去未反应的组分(例如，通过洗涤方式)，并检测固定在固体表面的复合物。当原来非固定组分带有可检测标记物时，检测到固定在表面的标记物，就表明复合物形成。如果原来非-固定组分没有携带标记物，则可以检测到复合，例如，通过使用与固定复合物特异结合的标记的抗体。
如果侯选化合物与本文确定的基因编码的特定PRO10282多肽相互作用但是又不与之结合，那么，使用已知的检测蛋白-蛋白相互作用的方法来分析与那个多肽的相互作用。此类分析方法包括惯常的方法，例如，交联、共-免疫沉淀和通过梯度或层析柱的共-纯化。此外，按照Fields与其同事(Fields和Song，Nature(340：245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991))和Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5789-5793(1991)公开的方法，使用酵母-基础上的遗传系统可以检测蛋白-蛋白相互作用。许多转录激活剂，如酵母GAL4，它由两个完全分散的调节结构域构成，其一作为DNA-结合结构域，另一个作为激活转录的结构域。前述出版物中描述的酵母表达系统(一般指″双杂种体系″)利用此特性，并使用两个杂合蛋白，其一的靶蛋白与GAL4的DNA-结合域融合，另一个的候选激活蛋白与激活结构域融合。在GAL4-激活的启动子控制下GAL1-lacZ报告基因的表达，依赖于通过蛋白-蛋白相互作用重建的GAL4活性。用对-半乳糖苷酶的显色底物检测含有相互作用多肽的菌丛。从Clontech可以商购利用双杂种技术鉴定两个特异蛋白间蛋白-蛋白相互作用的全套试剂盒(MATCHMAKERTM)。该系统也可被扩展到描绘参与特异蛋白相互作用的蛋白结构域，并查明对于这些相互作用起关键作用的氨基酸残基。
干预本文鉴定的基因编码的PRO10282多肽与其它细胞内或细胞外组分相互作用的化合物可如下测定：通常在控制条件下，制备含有基因产物和细胞内或细胞外组分的反应混合物，使两种产物相互作用和结合一定时间。为了测试候选化合物抑制结合的能力，在含有和不含有受试化合物的条件下进行反应。另外，可把安慰剂加入到第三反应混合物中，作为阳性对照。按照上述方法，监测混合物中受试化合物与细胞内或细胞外组分之间的结合(复合物形成)。在对照反应中有复合物形成，而在含有受试化合物的反应混合物中没有复合物形成，表明该受试化合物干预受试化合物与其配伍化合物之间的相互作用。
为分析拮抗剂，可将PRO10282多肽与被筛选化合物一起加入到细胞中，一定活性和能力的化合物抑制共存的PRO10282多肽的有关活性，则表明该化合物是PRO10282多肽的拮抗剂。或者，在适当条件下使PRO10282多肽和潜在拮抗剂与结合在膜上的PRO10282多肽受体或重组受体结合，通过竞争性抑制实验来检测拮抗剂。可标记PRO10282多肽，如放射性标记，这样，结合在受体上的PRO10282多肽分子数量，就可用于测定潜在拮抗剂的效力。使用本领域已知的众多方法，例如，配体淘选和FACS分选，可以鉴定编码受体的基因。Coligan等，Current Protocols in Immun.，1(2)：Chapter5(1991)。优选使用表达克隆，其中多聚腺苷酸化RNA是从对PRO10282多肽应答细胞中制备的，由该RNA建立的cDNA文库被分成数个库，用于转染COS细胞或其它对PRO10282多肽不反应的细胞。使玻璃载玻片上生长的转染细胞与标记的PRO10282多肽接触。可用各种方法标记PRO10282多肽，包括碘化或位点特异蛋白激酶的识别位点的包埋。固定和温育后，载玻片接受放射自显影分析。鉴定阳性库，制备亚-库，并使用交互作用的亚-库进行再转染，重新进行筛选过程，直至得到编码推定受体的单个克隆。
作为受体鉴定的另一途径，可使标记的PRO10282多肽与细胞膜或表达受体分子的提取制品进行光亲和连接。用PAGE除去交联材料，暴露于X-线胶片。可切除含受体的标记复合物，分解为肽片段，接受蛋白微测序。从微测序得到的氨基酸序列，用于设计一套筛选cDNA文库的简并寡核苷酸探针，以鉴定编码推定受体的基因。
在拮抗剂另一分析方法中，在侯选化合物存在的条件下，哺乳动物细胞或表达受体的膜制品与标记的PRO10282多肽温育。然后测定化合物增强或阻断相互作用的能力。
潜在拮抗剂的更特异实例包括与免疫球蛋白和PRO10282多肽的融合物结合的寡核苷酸，特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗-独特型抗体，和嵌合抗体或人源化抗体或抗体片段，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在拮抗剂是密切相关的蛋白，例如，PRO10282多肽的突变形式，其识别受体但不引起效应，从而竞争性抑制PRO10282多肽的作用。
另一潜在PRO10282多肽拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如，反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交和阻止蛋白翻译，起着直接阻断mRNA翻译的作用。反义技术可用于通过形成三体螺旋或通过反义DNA或RNA控制基因表达，两种方法均建立在多核苷酸与DNA或RNA结合的基础上。例如，编码本文所述成熟PRO10282多肽的多核苷酸序列的5′编码部分，，被用于设计约10～40个碱基对长度的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成参与转录基因区的互补序列(三链螺旋，参见Lee等，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooney等，Science，241：456(1988)；Dervan等，Science，251：1360(1991))，由此阻止转录和PRO10282多肽产生。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，阻断mRNA分子翻译成PRO10282多肽(反义，见Okano，Neurochem.，56：560(1991)；寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(CRC Press：Boca Raton，FL，1988)。也可把上述寡核苷酸释放入细胞中，这样反义RNA或DNA可在体内表达，从而抑制PRO10282多肽的产生。当使用反义DNA时，优选衍生自翻译起始位点寡脱氧核苷酸，例如，靶基因核苷酸序列的约-10和+10位。
潜在的拮抗剂包括与活性位点、受体结合位点、或生长因子或PRO10282多肽其它相关结合位点结合的小分子，从而阻断PRO10282多肽的正常生物活性。小分子的实例包括但不限于，小肽或类-肽分子，优选溶解的肽和合成的非-肽有机或无机化合物。
核酶是能够催化RNA特异性裂解的具有酶性质的RNA分子。核酶通过序列-特异性杂交于互补的靶RNA，接着产生核酸内裂解。使用已知技术，可以鉴定位于潜在RNA靶内的特异核酶裂解位点。进一步的细节请参见例如Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)，和PCT出版物WO 97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三链螺旋构型的核酸分子，应当是单链并由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸碱基组成是设计好的，这样它通过Hoogsteen碱基对原则促进三链螺旋的形成，这一般需要双螺旋中一条链上的嘌呤或嘧啶相当大的延伸。更详细情况请参见例如，PCT出版物WO 97/33551，出处同上。
用上述讨论的筛选试验的任何一个或多个分析方法，和/或使用本领域技术人员熟知的任何其它筛选技术，可以鉴定这些小分子。
Stra6-小鼠视黄酸诱导基因，在睾丸的塞尔托利氏(Sertol)细胞中有生精周期-依赖性表达。基于与Stra6的序列同源性，本文公开的PRO10282多肽在精子发生中具有重要作用，因而对于生育能力治疗具有潜在用途。目前认为PRO10282多肽的表达正如其小鼠同源物Stra6一样，是对视黄酸应答而被诱导的。所以，通过杂交测定PRO10282在mRNA水平的表达，或通过免疫分析法测定PRO10282在蛋白水平的表达，可用于决定受试化合物对于治疗广泛的各种维生素A类应答性疾病是否具有潜在的治疗作用。考虑到的作为治疗靶的疾病类型包括牛皮癣，痤疮，发育异常，癌和自身免疫性疾病。考虑到的发育异常的种类包括上皮组织的癌前病变如口腔粘膜白斑病，子宫颈发育异常，喉和支气管发育异常。考虑到的癌的种类包括结肠癌(腺癌)，肺癌(癌和腺癌)，皮肤癌，头颈部癌，子宫颈癌，子宫癌，乳腺癌和前列腺癌。考虑到的自身免疫性疾病的种类包括类风湿病性关节炎，骨关节炎，系统性红斑狼疮，寻常性天疱疮和落叶状天疱疮。治疗这些疾病或病症的潜在治疗剂是PRO10282的抗体和拮抗剂(包括小分子)。
M.治疗肿瘤的组合物和方法
适宜于治疗与本文鉴定的基因相关的肿瘤的组合物，包括但不限于抑制目标基因产物表达和/或活性的抗体、小的有机分子、肽、磷肽、反义分子和核酶分子、三链螺旋分子等。
举例来说，反义RNA和RNA分子通过与目标mRNA杂交和阻止蛋白质翻译而直接阻断mRNA翻译。当使用反义DNA时，优选得自翻译起始位点(例如靶基因核苷酸序列约-10～+10位)的寡脱氧核糖核苷酸。
核酶是能够催化RNA特异性裂解的具有酶性质的RNA分子。核酶通过序列-特异性杂交于互补的目标RNA，接着进行核酸内裂解。使用已知技术，可以鉴定位于潜在RNA目标内的特异核酶裂解位点。进一步的细节请参见例如Rossi，Current Biology，4：469-471(1994)，和PCT出版物WO97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制转录的三链螺旋构型的核酸分子，应当是单链并由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸的碱基组成是设计好的，这样它通过Hoogsteen碱基对原则促进三链螺旋的形成，这一般需要双螺旋中一条链上的嘌呤或嘧啶相当大的延伸。更详细情况请参见例如，PCT出版物WO 97/33551，出处同上。
用上述讨论的筛选试验中的任何一个或其任何联合，和/或使用本领域技术人员熟知的任何其它筛选技术，可以鉴定这些分子。
N.抗-PRO10282(抗-Stra6)抗体
本发明进一步提供抗-PRO10282(抗-Stra6)抗体。抗体的实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源偶联抗体。
1.多克隆抗体
抗-PRO1O282抗体包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法为本领域熟练技术人员所已知。多克隆抗体可在哺乳动物中产生，例如，通过一次或多次注射致免疫剂，如果需要，可加入佐剂。通常，对哺乳动物皮下或腹膜内多次注射致免疫剂和/或佐剂。致免疫剂可包括PRO10282多肽或其融合蛋白。将致免疫剂与针对所免疫的哺乳动物具有免疫原性的蛋白进行偶联是有效的。所述免疫原性蛋白的实例包括但不限于：匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷脂酰脂质A，合成的海藻糖双白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。无需繁琐的试验，本领域技术人员就可选择免疫方案。
2.单克隆抗体
或者，抗-PRO10282抗体是单克隆抗体。可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如Kohler和Milstein在Nature，256：495(1975)中描述的方法。在杂交瘤方法中，通常用致免疫剂来免疫小鼠、仓鼠或其它适宜宿主动物，以引发产生或能够产生将与致免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，在体外致敏淋巴细胞。
致免疫剂通常包括PRO10282多肽或其融合蛋白。一般而言，如果需要来源于人的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳动物来源的细胞，那么就使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用适宜的融合试剂如聚乙二醇，将淋巴细胞与无限增殖细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞[Goding，单克隆抗体：Principles和Practice，Academic Press，(1986)59-103页]。无限增殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人类起源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在适宜培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的无限增殖细胞生长或生存的物质。例如，亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(″HAT培养基″)，这些物质抑制HGPRT-缺陷细胞生长。
优选的无限增殖细胞系是那些有效融合、支持筛选出的抗体-生成细胞稳定地高水平表达抗体，并且对培养基如HAT敏感的细胞系。更优选的无限增殖细胞系是鼠骨髓瘤系，后者可得自例如Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，California和美国典型培养物保藏中心，Manassas，Virginia。人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系也已用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclone antibody ProductionTechniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，(1987)pp.51-63]。
接下来，可以检定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在直接抗PRO10282的单克隆抗体。优选地，用免疫沉淀或体外结合试验如放免分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)，来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这些技术和试验分析方法是本领域所已知的。使用例如Scatchard analysis of Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107：220(1980)公开的方法，可以测定单克隆抗体的结合亲和力。
鉴定出所需的杂交瘤细胞之后，经有限稀释法将克隆进行亚克隆并采用标准方法使之生长[Goding，出处同上]。用于此目的适宜的培养基包括例如，Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内以腹水形式生长。
使用常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析，可以从培养基或腹水中分离或纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体。
也可使用重组DNA方法生产单克隆抗体，例如在美国专利4816567中描述的方法。使用常规技术(例如，使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)，很容易地分离编码本发明单克隆抗体的DNA并进行序列测定。本发明的杂交瘤细胞作为此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，就可将其放入表达载体中，然后用该载体转染宿主细胞，所述宿主细胞如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。也可对DNA进行修饰，例如人重链和轻链恒定区的编码序列置换同源的鼠序列[美国专利4816567；Morrison等，出处同上]，或者将非-免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白的编码序列上。此类非-免疫球蛋白多肽可取代本发明抗体的恒定区，或可取代本发明抗体一个抗原结合部位的可变区，以产生嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法为本领域所已知。例如，有一个方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰后重链的重组表达。通常在Fc区的任何位点将重链截短，从而防止重链交联。或者，用其它氨基酸残基代替相关的半胱氨酸残基或者使半胱氨酸残基缺失以防止交联。
体外方法也适于制备单价抗体。使用本领域常规技术可以完成抗体消化而产生抗体片段，特别是Fab片段。
3.人抗体和人源化抗体
本发明抗-PRO10282抗体进一步包括人源化抗体或人抗体。非-人(例如，鼠)的人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，它们包含极少的非人免疫球蛋白序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)中受者互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔等非人源物种抗体(供体抗体)的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基由相应的非人类残基所取代。人源化抗体也可包含受者抗体或供体CDR或框架序列中均不存在的残基。通常，人源化抗体基本上包括至少一个、通常两个可变区的全部，其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，自然，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人源化非-人抗体的方法是本领域技术人员所已知的。通常，人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本如Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))所述，用一个或多个CDR序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4816567)，其中完整人类可变区的很大一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
使用本领域已知的各种技术可以制备人抗体，所述方法包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991)]。也可使用Cole等和Boerner等描述的技术制备人单克隆抗体[Cole等，Monoclonal Antibody and Cancer Therapy，Alan R.Liss，(1985)第77页，和Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)]。类似地，通过把人免疫球蛋白的基因座导入转基因动物例如鼠来生产人抗体，所述宿主动物的内源性免疫球蛋白基因已被部分或全部灭活。攻击后，观察到人抗体产生，这在各个方面均与在人体所见的极为相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。有关进展在例如下列专利和科学出版物中作了描述：美国专利5545807；5545806；5569825；5625126；5633425；5661016；Marks等，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
4.双特异性抗体
双特异性抗体是单克隆抗体，优选具有针对至少两种不同抗原的结合特异性的人抗体或人源化抗体。在本发明中，一种结合特异性针对PRO10282，另一种针对任何其它抗原，优选针对细胞表面蛋白或受体或受体亚单位。
制备双特异性抗体的方法为本领域所已知。通常，双特异性抗体的重组产生方法，是基于两条免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，所述这两条链具有不同特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来完成。类似的方法参见于1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)。
可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。产生双特异性抗体的进一步细节内容，参见例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据WO 96/27011所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这使得异二聚体的产量比不想要的终产物如同源二聚体的高。
双特异性抗体可以制备全长抗体或抗体片段(如F(ab’)2双特异性抗体)。从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献描述。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，Science 229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab′)2片段的方法。这些片段在二硫醇复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab’片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab’-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab’-硫醇，再与等分子量的其它Fab’-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。
Fab’-片段可从大肠杆菌中直接回收并经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)中描述了完全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。每一Fab’片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过度表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒性淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。
直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。还考虑了二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.，147：60(1991)。
例证性双特异性抗体可与本文指定的PRO10282多肽上的两种不同表位结合。或者，可将抗-PRO10282多肽臂与白细胞上触发分子的臂结合，从而强化针对表达特定PRO10282多肽细胞的细胞防御机制，所述引发分子如T细胞受体分子(CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG Fc受体(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγR II(CD32)和FcγRIII(CD16)。双特异性抗体还可用于将细胞毒制剂定位至表达特定PRO10282多肽的细胞上。这些抗体具有PRO10282-结合臂和结合细胞毒制剂或放射性核素螯合剂的臂，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA。另一种感兴趣的双特异性抗体结合PRO10282多肽并且进一步结合组织因子(TF)。
5.异源偶联抗体
异源偶联抗体也包括在本发明范围之内。异源偶联的抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980)，并可用于治疗HIV感染[WO91/00360，WO92/200373，EP03089]。可考虑使用蛋白化学合成中已知方法，包括涉及使用交联剂，在体外制备异源偶联抗体。举例来说，使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键，可以构建免疫毒素。用于此目的适当试剂的实例，包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基，巯基butyrimidate以及例如在美国专利4676980中描述的那些。
6.效应物功能的工程改造(Effector Function Engineering)
在效应物功能方面可能希望改进本发明的抗体，以增强在治疗(例如治疗癌症)时的效果。例如，可在Fc区域中引入半胱氨酸残基，从而在该区域中形成链间二硫键。这样制得的同型二聚体可能有改进的内化能力和/或提高的补体介导细胞杀伤能力及依赖于抗体的细胞毒作用(ADCC)。参见Caron等，J.Exp  Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。也可如Wolff等，Cancer Research 53：2560-2565(1993)描述的那样，用异二聚功能性交联剂来制备抗肿瘤活性增强的同型二聚抗体。或者，可将抗体经工程化改造成具有双Fc区，从而可能增强补体裂解和ADCC能力。见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
7.免疫偶联物
本发明还涉及免疫偶联物，其中含有与细胞毒制剂偶联的抗体，所述细胞毒药物如化疗剂、毒素(例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。
适用于制备这类免疫偶联物的化疗剂在上文已作描述。可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括Bi212、I131、In131、Y90和Re186。
抗体与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science，238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。
在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉亲和素)偶联，将该抗体-受体偶联物施用于患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。
8.免疫脂质体
本文公开的抗体还可制成免疫脂质体。含抗体的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；HWang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；美国专利4485045和4544545及1997年10月23日公开的WO97/38731。在美国专利5013566中公开了循环时间已增加了的脂质体。
特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法而制得。脂质体挤压通过限定孔径的膜，获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，生物学化学杂志，257：286-288(1982)所述的那样，经二硫化物交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含一种化疗剂(如阿霉素)。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
9.抗体-依赖性酶介导前体药物疗法(ADEPT)
通过将抗体与使前体药物(例如，肽基化疗剂，见WO 81101145)转化为活性抗癌药物的药物前体-激活酶偶联，本发明抗体也可用于ADEPT至。参见例如，WO 88/07378和美国专利4975278。
对于ADEPT免疫偶联有用的酶组分，包括任何能够以使前体药物转化为其更具活性、细胞毒性形式的方式作用于前体药物的酶。
在本发明方法中有用的酶，包括但不限于糖苷酶，葡萄糖氧化酶，人溶菌酶，人葡糖醛酸糖苷酶，适于使含磷酸盐的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；适于使含有硫酸盐的前体药物转化为游离药物的酰基硫酸酯酶(arylsulfatase)；适于使无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；适于使含肽前体药物转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌属蛋白酶(serratiaprotease)，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶(例如，羧肽酶G2和羧肽酶A)以及组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；适于使含有D-氨基酸取代基的前体药物转化的D-丙氨酰羧肽酶；适于使糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物-裂解酶如半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶；适于使内酰胺化衍生的药物转化为游离药物的内酰胺酶；和适于使在其胺氮位上苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生的药物分别转化成游离药物的盘尼西林酰胺酶，如盘尼西林V酰胺酶或盘尼西林G酰胺酶。或者，被本领域称为″抗体酶″具有酶活性的抗体也可用于使本发明前体药物转化为游离活性药物(参见例如，Massey，Nature，328：457-458(1987))。可按照本发明的描述，制备用于将抗体酶递送到肿瘤细胞群的抗体-抗体酶偶联物。
使用本领域熟知的技术，如使用前面讨论过的异源双功能交联剂，可将本发明酶与抗-PRO10282(抗-Stra6)抗体共价结合。或者，使用本领域众所周知的重组DNA技术，可构建包括本发明抗体的至少一种抗原结合区与本发明酶的至少一个功能活性部分连接的融合蛋白(参见例如，Neuberger等，Nature，312：604-608(1984))。
10.抗体的药物组合物
与本文鉴定的PRO10282多肽特异性结合的抗体，以及用前述公开的筛选试验鉴定的其它分子，可以药学组合物的形式施用来治疗各种病症。
如果PRO10282多肽是在细胞内并且使用完整抗体作为抑制剂，则优选内化抗体。然而，也可用脂质转染物或脂质体将抗体或抗体片段递送至细胞内。使用抗体片段时，优选与靶蛋白结合结构域特异结合的最小抑制剂片段。例如，基于抗体可变区序列，可把肽分子设计为保留与靶蛋白序列结合的能力。此类肽可以化学合成和/或用重组DNA技术产生。参见例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993)。这里所述制剂也包含一种以上对于所治特定适应症而言必要的活性化合物，优选具有彼此之间无不利影响的互补活性的那些化合物。或者或另外，组合物可含有增强其功能的试剂，诸如细胞毒制剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。这些分子适宜以对所治疗目的而言有效的量联合。
也可将活性组分包被在按照例如凝聚技术或界面聚合技术制备的微胶囊中，例如，分别在胶态药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳化剂中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences，出处同上中。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过除菌膜过滤而轻易实现。
也可制备控释制剂。控释制剂的适当实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。控释制剂实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和酸酸亮丙瑞林(leuprolide)组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化的抗体长时间停留在体内时，它们会由于暴露在37℃水分下而变性或凝聚，从而导致生物活性损失，且免疫原性可能会改变。可以根据涉及的机理来设计稳定化的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、自酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂和开发特殊的聚合物基质组合物来达到稳定化。
O.抗-PRO10282(抗-Stra6)抗体的用途
本发明抗-PRO10282抗体具有多种用途。例如，抗-PRO10282抗体可用于PRO10282的诊断分析，譬如，检测PRO10282在特定细胞、组织或血清的表达。可使用本领域已知的各种诊断分析技术，如以异源或同源形式(phase)进行的竞争性结合试验、直接和间接夹心试验，及免疫沉淀试验。Zola，单克隆抗体：技术指南，147-158页(CRC Press，Inc.1987)。还可将所述抗体标记上可检测部分。可检测部分应当能够直接或间接产生可测得信号。例如，可测得部分是放射性同位素如3H、14C、32P、35S或125I，荧光或化学发光化合物如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素，或者酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。本领域已知的将抗体与可检测部分偶联的任何方法均可使用，包括在Hunter等，Nature，144：945(1962)；David等，Biochemistry，13：1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40：219(1981)；和Nygren，J.Histochem.和Cytochem.，30：407(1982)中描述的方法。
抗-PRO10282抗体也适用于从重组细胞培养物或天然来源中亲和纯化PRO10282。在该过程中，使用本领域已知方法将抗PRO10282抗体固定在适当载体如Sephadex树脂或滤纸上。然后，使固定的抗体与含有欲纯化的PRO10282的样品接触，接下来用能够基本上将样品中与固定载体结合的PRO10282之外的所有物质去除的适宜溶剂洗涤载体。最后，用能从抗体中释出PRO10282的另一适宜溶剂洗涤载体。
抗-PRO10282抗体可用于监测PRO10282多肽的表达，所述多肽具有作为筛选抗广泛多种维生素A类应答性疾病的治疗有效化合物的敏感方法的潜在用途。在这些类型疾病中，考虑到作为治疗靶的疾病包括牛皮癣，痤疮，发育异常，癌和自身免疫性疾病。考虑到的发育异常的种类包括上皮组织的癌前病变如口腔粘膜白斑病，子宫颈发育异常，喉和支气管发育异常。考虑到的癌的种类包括结肠癌(腺癌)，肺癌(癌和腺癌)，皮肤癌，头颈部癌，子宫颈癌，子宫癌，乳腺癌和前列腺癌。考虑到的自身免疫性疾病的种类包括类风湿病性关节炎，骨关节炎，系统性红斑狼疮，寻常性天疱疮和落叶状天疱疮。在治疗此类疾病和病症中，抗-PRO10282抗体具有潜在的治疗用途。
P.使用抗-PRO10282(Stra6)抗体和其它Stra6拮抗剂治疗的方法
考虑到本发明抗体和其它抗-肿瘤化合物可用于治疗多种病症，包括那些以本文确定的扩增基因的过度表达和/或激活为特征的病症。用此抗体和其它化合物(包括但不限于：小的有机和无机分子，肽，反义分子等)治疗的例证性病症包括良性或恶性肿瘤(例如，肾的癌，肝癌，肾癌，膀胱癌，乳腺癌，胃癌，卵巢癌，结肠直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝脏癌；肉瘤；成胶质细胞瘤；和各种头颈肿瘤)；白血病和恶性淋巴瘤；其它如神经细胞瘤，神经胶质瘤，星形胶质细胞瘤，下丘脑和其它腺癌，巨噬细胞癌，上皮细胞癌，基质癌和囊胚腔病症；以及炎症，血管生成和免疫紊乱。用本发明抗-Stra6抗体和其它拮抗剂治疗的特别优选的靶，是在Wnt-1通路中有基因缺陷的肿瘤(例如导致β-连环蛋白信号异常活化)和/或过度表达Stra6的肿瘤。业已发现，在Wnt-1通路中有基因缺陷的人类癌症通常也表现出Stra6过度表达，但并未知道所有Stra6过度表达肿瘤均与Wnt-1通路上的突变有关。本发明Stra6拮抗剂具有治疗Stra6过度表达肿瘤的巨大潜力。优选此组肿瘤包括结肠直肠肿瘤，卵巢癌，子宫内膜癌，和Wilm′s肾脏肿瘤，黑素瘤，以及嗜铬细胞瘤(一种衍发自肾上腺髓质的肿瘤)。
按照已知方法，如经静脉内快速浓注或连续输注一段时间，或者经肌内注射、腹膜内注射、脑脊柱内注射(intracerobrospinal)、皮下注射、关节内注射、滑膜腔内注射、鞘内注射、口服、局部施用或吸入途径给药，将本发明抗-肿瘤剂如抗体施用于哺乳动物，特别是人，抗体的静脉给药为优选。
其它治疗方案可与抗癌剂(如本发明抗体)的给药进行联合。例如，接受本发明抗癌剂治疗的患者，也可接受放射治疗。或者，将其它化疗剂施用于患者。此类化疗剂的配制和给药方案，按照制造商的指示进行或者由熟练的临床医师根据经验决定。化疗剂的配制和给药方案在Chemotherapy ServiceEd.，M.C.Perry，Williams &，Wilkins，Baltimore，MD(1)中也有描述。化疗剂可以在抗肿瘤剂如抗体之前或之后给药，或者二者同时给药。此外，抗体可与抗-雌激素化合物如他莫昔芬或抗-孕激素如奥那司酮(见EP616812)按照这些分子的已知用量联合给药。
也期望施用抗其它肿瘤相关抗原的抗体，如将会结合CD20、Cdlla、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或血管内皮因子(VEGF)的抗体。或者，或另外，本文公开的结合同一个或二个或多个不同抗原的二个或多个抗体，可联合施用于患者。有时，将一种或多种细胞因子也施用于患者是非常有益的。一个实施方案中，本发明多肽与生长抑制剂联合给药。例如，首先施用生长抑制剂，接下来施用本发明多肽。然而，也考虑了同时施用或首先施用本发明多肽。生长抑制剂的适宜剂量是目前所用剂量，同时由于生长抑制剂和本发明多肽的联合作用(协同作用)而可以降低用量。
为了预防或治疗疾病，本发明抗肿瘤剂如抗体的适宜剂量取决于所治疾病的类型(如上所述)、疾病的严重程度和病程(无论给药目的是预防还是治疗)、先前的治疗、患者的临床病史和对抗肿瘤剂的敏感度以及主治医生的判断。抗肿瘤剂适宜于一次性地或在一系列治疗中施用于患者。
例如，取决于受治疾病的类型和严重程度，施用于患者的抗体的初始候选剂量是1μg/kg～15mg/kg(如0.1-20mg/kg)，无论是例如通过一次或分多次给药，还是通过连续输注给药。依据上述因素，代表性的每日剂量为约1μg/kg～100mg/kg或更多。重复给药数天或更长时间时，视具体情况而将治疗持续至出现对疾病症状的所需抑制为止。然而，其它剂量方案也可能是有用的。治疗的进展很容易通过常规技术和试验分析加以监测。
Q.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有用于诊断或治疗上述疾病的物质的制品。所述制品包括一个容器和一个标签。适当的容器包括瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器内盛放能有效诊断或治疗病症的组合物，并具有无菌存取口(例如，该容器可以是静脉注射袋或带有能通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂通常是能够干扰本文确定的基因产物之活性的抗肿瘤剂，如抗体。容器上的或附带的标签说明该组合物用于诊断或治疗所选出的病症。制品还包括第二个容器，其中含可药用的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，ringer’s溶液和葡萄糖溶液。制品还可进一步包括具有商业需要以及符合用户需要的其它材料，如其它缓冲液、稀释剂，滤器，针头和注射器。
R.肿瘤的诊断和预后
细胞表面蛋白，如在一定肿瘤中过度表达的生长受体，是肿瘤(如癌)治疗候选药物的极好的靶，相同蛋白质与由肿瘤细胞中扩增的基因编码的分泌蛋白质一起，具有在肿瘤的诊断和预后中的另一用途。譬如，直接针对在肿瘤中增强的基因的蛋白质产物的抗体，可用作肿瘤诊断剂或预后剂。
举例来说，抗体(包括抗体片段)，可用于定性或定量测定由扩增的基因或过度表达基因(″标记基因产物″)编码的蛋白质的表达。抗体优选连接有可检测标记物，例如荧光素标记，并且可用光学显微镜、流式细胞仪、荧光测定仪或本领域已知的其它技术监测抗体结合。如果扩增的基因编码细胞表面蛋白，如生长因子，那么这些技术是特别适合的。此结合分析基本上按照前面第5部分的描述进行。
可通过例如免疫荧光或免疫电子显微镜检查法，完成在原位检测抗体与标志基因产物的结合。为此目的，自患者采出组织学样品，将标记抗体用在样品上，优选将抗体覆盖在生物样品上。此过程也可以测定标志基因产物在被测组织的分布。关于原位检测，大量的各种组织学方法是可以利用的，此点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
下述实施例只是为了描述的目的而提供，并非旨在以任何方式限定本发明的保护范围。
实施例
本说明书中引证的所有专利和参考文献，以其全部在此引入作为参考。
实施例中涉及的市售制剂按照生产商的使用说明应用，除非另有说明。以下实施例中，及说明书全文中，用ATCC保藏号所指定的那些细胞来源于美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA。在以下实施例中，除非另有说明，″Sra6″指天然序列PRO10282多肽。
实施例1
编码人PRO10282和PRO19578多肽的cDNA克隆的分离
采用酵母筛选来鉴定人类胎脑cDNA文库中编码天然人PRO10282和PRO19578多肽的cDNA(DNA148380-2827和DNA148389-2827-1)，所述文库优先代表最初cDNA克隆的5’末端。
DNA148380-2827克隆包含单个开放读框，49-51位核苷酸是一个明显的(apparent)翻译起始位点，2050-2052位核苷酸是中止密码子，该开放读框中止于此(图1)。所预测的多肽前体的长度是667个氨基酸(图2)。估测图2所示PRO10282蛋白全长的分子量约73502道尔顿且pI约为9.26。对图2(SEQ ID NO：2)所示PRO10282序列全长的分析证实其存在多种重要的多肽结构域，如图2所示，其中，这些重要的多肽结构域的位置基本如上所述。DNA148380-2827克隆于2000年1月11日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-1181。
DNA148389-2827-1克隆包含单个开放读框，186-188位核苷酸是一个明显的翻译起始位点，2160-2162位核苷酸是中止密码子，该开放读框中止于此(图6，SEQ ID NO：4)。预测的多肽前体的长度为658个氨基酸(图7，SEQ ID NO：5)。图7所示PRO19578蛋白的全长的估计分子量约为72583道尔顿，pI约为9.36。对图7所示的PRO19578序列全长(SEQ ID NO：5)的分析证实其存在多种重要的多肽结构域，如图7所示，其中，这些重要的多肽结构域的位置基本如上所述。值得注意的是存在9个潜在的跨膜结构域以及在人和相应的小鼠序列之间保守的14个半胱氨酸残基。小鼠Stra6有3个潜在的N连接的糖基化位点，而人PRO19578(天然的人Stra6)多肽有一个糖基化位点。148389-28271-1克隆在2000年2月23日保藏在ATCC，ATCC保藏号为PTA-1405。
利用对图2(SEQ ID NO：2)所示全长序列和图7(SEQ ID NO：5)所示全长序列的ALIGN 2序列比对来分析Dayhoff数据库(版本35.45SwissProt35)，结果表明PRO10282氨基酸序列和以下Dayhoff序列：AF062476，P-W88559和HGS-RE259之间存在序列同一性。
如图8所示，对人PRO10282和PRO19578多肽全长的比较显示PRO19578在PRO10282氨基酸序列的89-97位包含9个氨基酸(SPVDFLAGD；SEQ ID NO：13)的缺失。另外，PRO19578在518位包含异亮氨酸(I)，其取代了PRO10282相应位置(527位)上的蛋氨酸(M)，这是由该位置的G/A多态性所致。PRO10282和天然序列PRO19578多肽两者都被认为是小鼠Stra6多肽的人同系物，因而它们也被称为″Stra6″。小鼠Stra6和由DNA148340-2827编码的天然序列人类全长PRO10282多肽有约74％的氨基酸序列同一性。
图9显示由DNA148340-2827编码的天然序列人类全长PRO10282多肽(简称″人Stra6″)的疏水图谱。如图9所示，在该长度为667个氨基酸的多肽中50％的氨基酸残基是疏水性的。
通过UNIGENE确定人Stra6基因位于染色体15q23。初步精细作图显示，Stra6位于STS间隔D15S124-D15S 160中，GeneMap的第98位对应于G3图谱中的244.52。
实施例2
PRO10282和PRO19578作为杂交探针的应用
以下方法描述编码PRO10282和PRO19578的核苷酸序列作为杂交探针的应用
包含全长或成熟PRO10282或PRO19578编码序列的DNA用作探针在人类组织cDNA文库或人类组织基因组文库中筛选同源DNA(如编码天然存在的PRO10282或PRO19578变体的那些DNA)。
对包含上述任一文库DNA的膜的杂交和洗涤是在以下高严谨条件下进行的。放射性标记的PRO10282来源的探针与膜的杂交在42℃，50％甲酰胺，5x SSC，0.1％SDS，0.1％焦磷酸钠，50mM磷酸钠，pH 6.8，2x Denhardt′s溶液，和10％葡聚糖硫酸酯中进行20小时。膜的洗地在0.1xSSC和0.1％SDS的水溶液中42℃下进行。
采用本领域已知的标准技术对与编码全长天然序列PRO10282或PRO19578的DNA有所需同一性的DNA进行鉴定。
实施例3
PRO10282和PRO19578在大肠杆菌中的表达
该实施例描述了PRO10282或PRO19578d的非糖基化形式通过大肠杆菌中的重组表达所进行的制备。
首先采用所选择的PCR引物对编码PRO10282或PRO19578的DNA序列进行扩增。所述引物应该包含与所选择的表达载体上限制性酶位点相应的限制性酶位点。可以使用各种表达载体。适合载体的一个例子是pBR322(来源于大肠杆菌；参见Bolivar等，Gene，2：95(1977))，其包含氨苄青霉素和四环素抗性基因。将所述载体用限制性酶消化并且去磷酸化。然后将上述PCR扩增序列与所述载体连接。所述载体优选包括编码抗生素抗性基因，trp启动子，多组氨酸前导序列(包括最开始的6个STII密码子，多组氨酸序列，和肠激酶切割位点)，PRO10282或PRO19578编码区，λ转录中止子，和argU基因的序列。
然后采用Sambrook等，出处同上所描述的方法用上述所得的连接混合物转化所选择的大肠杆菌菌株。通过转化子在LB平板上的生长能力对其进行鉴定且将抗生素抗性菌落选择出来。对质粒DNA进行分离，并通过限制酶切分析和DNA测序鉴定。
在补充有抗生素的液体培养基如LB肉汤培养基上过夜培养所选择的克隆。随后将此过夜培养物用于接种较大规模的培养。然后使细胞生长到所需光密度，在此期间表达启动子被激发。
再将细胞培养几个小时后，离心收获细胞。可用本领域已知的各种制剂溶解离心所获得的细胞团，然后，被溶解的PRO10282蛋白在允许该蛋白紧密结合的条件下采用金属螯合柱进行纯化。
PRO10282或PRO19578可以以带有多组氨酸标签的形式在大肠杆菌中表达，表达步骤如下。首先采用所选择的PCR引物对编码PRO10282或PRO19578的DNA进行扩增。所述引物包含对应于所选表达载体上限制性酶切位点的限制性酶切位点，以及提供有效和可靠的翻译起始，在金属螯合柱上的快速纯化和肠激酶蛋白水解去除所需的其它有用序列。然后将PCR扩增的多组氨酸标记的序列连接到表达载体上，将该载体用于转化基于菌株52(W3110fuhA(tonA)Ion galE rpoHts(htpRts)clpP(laclq)的大肠杆菌宿主。使转化子首先生长在包含50mg/ml羧苄青霉素的LB中，30℃振荡培养直至O.D.600达到3-5。用CRAP培养基(3.57g(NH4)2SO4，0.71g柠檬酸钠2H2O，1.07g KCI，5.36g Difco酵母提取物，5.36g Sheffield hycase SF溶于500mL水中，和110mM MPOS，pH7.3，0.55％(w/v)葡萄糖，7mM MgSO4混合而成)将培养物稀释50-100倍，然后30℃下振荡培养大约20-30小时。取出样品通过SDS-PAGE验证表达，将大部分培养物离心以沉淀细胞。将所得细胞团冷冻直至纯化和重折叠(refolding)。
将0.5到1L发酵(6-10g细胞团)所得大肠杆菌以10倍体积(W/V)重新悬浮在7M胍，20mM Tris，pH 8缓冲液中。向该溶液加入固体亚硫酸钠和连四硫酸钠至各自终浓度为0.1M和0.02M，4℃搅拌过夜。该步骤导致蛋白变性，其中所有的半胱氨酸残基通过亚硫酸化作用被封闭。将上述溶液以40,000rpm在Beckman超速离心机中离心30分钟。所得上清液用3-5个体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍，20mM Tris，pH 7.4)稀释，并通过0.22微米膜过滤澄清。将澄清的提取物上样至已在金属螯合柱缓冲液中平衡过的5ml Qiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用包含50mM咪唑(Calbiochem，Utrolgrade)，pH7.4的另一种缓冲液洗涤该层析柱。用包含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白。汇集包含所需蛋白的级分并4℃储存。用根据所述蛋白的氨基酸序列所计算的消光系数，通过280nm吸光度估算蛋白浓度。
将样品缓慢加入新鲜配制的重折叠缓冲液中进行稀释，以使蛋白进行重折叠，所述缓冲液由以下组成：20mM Tris，pH8.6，0.3M NaCI，2.5M尿素，5mM半胱氨酸，20mM甘氨酸和1mM EDTA。选择重折叠的体积使最终的蛋白浓度在50-100μg/ml之间。4℃下轻轻搅拌重折叠溶液12-36小时。加入TFA至终浓度为0.4％(pH大约是3)来中止重折叠反应。对蛋白进一步纯化之前，用0.22微米膜过滤上述溶液并加入乙腈使其终浓度为2％-10％。将重折叠蛋白在Poros R1/H反向层析柱上层析，所用流动缓冲液为0.1％TFA，用从10％到80％的乙腈梯度进行洗脱。对具有A280吸光度的各级分取等份试样在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分析，汇集包含均一重折叠蛋白的级分。通常大多数蛋白中正确重折叠的蛋白在最低乙腈浓度时被洗脱，因为它们最为紧密，且它们疏水的内部受到保护而不与反向树脂相互作用。聚集的蛋白通常可用较高浓度的乙腈洗脱。除了可以区分蛋白的所需形式和错误折叠形式外，反向步骤也可以从样品中除去内毒素。
汇集包含所需折叠的PRO10282或PRO 19578多肽的级分并用直接引入溶液的柔和氮流除去乙腈。将所述蛋白配制在包含0.14M氯化钠和4％甘露醇的20mM Hepes，pH6.8的溶液中透析或采用在配制缓冲液中平衡的G25Superfine (Pharmacia)树脂进行凝胶过滤，并进行过滤灭菌。
具体地，天然人Stra6蛋白PRO10282的两个胞外结构域(ECD)肽A(氨基酸229-295)和肽B(氨基酸532-667)分别在大肠杆菌细胞质中表达为具有N末端多组氨酸前导序列的肽，其具有氨基酸序列MKHQHQHQHQHQHQMHQ(SEQ ID NO：12)。该前导序列提供最佳翻译起始，在镍螯合柱上的纯化，以及必要时用TAGZyme系统(UnizymeLaboratories)进行的有效去除。转录通过大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(Kikuchi等，Nucleic Acids Res.9：5671-5678[1981])控制，提供trp操纵子核糖体结合位点(Yanofsky等，Nucleic Acids Res.9：6647-6668[1981])用于翻译。翻译中止密码子下游是λt0转录中止子(Scholtissek和Grosse，Nucleic AcidsRes.15：3185[19871)，其后是稀有密码子tRNA基因pro2，argU，和glyT(Komine等，J.Mol.Biol.212：579-598[1990]；Fournier和Ozeki，Microbiol.Rev.49：379397[1985])。
通过PCR从全长cDNA克隆中制备Stra6的两个ECD编码序列DNA片段，并将其插入到上述称为pST239的表达载体中。验证了DNA序列后，用称为PE148380A和PE148380B的新的Stra6表达质粒转化大肠杆菌菌株58F3((fhuAΔ(tonAΔ)lonΔgalE rpoHts(htpRts)ΔclpP laclqΔompTΔ(nmpc-fepE)ΔslyD)。这些转化子的Luria肉汤培养物首先30℃生长过夜，然后用磷酸盐限制性培养基将其稀释100倍以诱导碱性磷酸酶启动子。30℃振荡培养24小时后，离心所述培养物，并将所得细胞团冰冻直至开始肽的纯化。
进行纯化时需将大肠杆菌菌团(6-10gm菌团)在10倍(w/v)体积的7M盐酸胍，20mMTris，pH8缓冲液中重新悬浮。加入固体的亚硫酸钠和连四硫酸钠使终浓度分别为0.1M和0.02M，4℃下搅拌该溶液过夜。通过离心使该溶液澄清，然后将澄清的溶液上样至已在6M盐酸胍，20mM Tris，pH 7中平衡的Qiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用另一种包含50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)的缓冲液洗柱。用包含250mM咪唑的缓冲液洗脱所述蛋白。汇集包含所需蛋白的级分，对1mM HCI透析并4℃储存。
实施例4
PRO10282和PRO19578在哺乳动物细胞中的表达
该实施例描述了通过哺乳动物细胞中的重组表达制备潜在糖基化形式的PRO10282和PRO19578
载体pRK5(参见EP 307，247，1989年3月15日公开)用作表达载体。
采用如Sambrook等，出处同上所述的连接方法，用允许PRO10282DNA任选用所选限制性酶将PRO10282或PRO19578DNA连接到pRK5中，以便用诸如Sambrook等，出处同上所述连接方法插入PRO 10282DNA。所产生的载体各自称为pRK5-PRO10282和pRK5-PRO19578。
在一个实施方案中，所选择的宿主细胞可以是293细胞。人293细胞(ATCC CCL 1573)在组织培养板中生长至汇合，所用培养基如补充有胎牛血清和任选，营养成分和/或抗生素的DMEM。将大约10g pRK5-PRO10282或pRK5-PRO19578DNA与约1g编码VA RNA基因的DNA[Thimmappaya等，Cell，31：543(1982)]混合并溶解在500L 1mM Tris-HCI，0.1mM EDTA，0.227M CaCl2中。向该混合物中逐滴加入500L 50mM HEPES(pH 7.35)，280mM NaCl，1.5mM NaPO4，25℃10分钟使沉淀形成。悬浮沉淀物并将其加入到293细胞中，然后37℃放置约4小时。吸出培养基并在30秒钟内加入2ml 20％甘油的PBS溶液。然后用无血清的培养基洗涤293细胞，再加入新鲜培养基温育细胞约5天。
转染后大约24小时，移走培养基并更换为培养基(单独)或包含200Ci/ml35S-半胱氨酸和200Ci/ml35S-蛋氨酸的培养基。12小时温育后，收集该条件(conditioned)培养基，在旋转过滤器上浓缩并上样至15％SDS凝胶上。可以将处理后的凝胶进行干燥，并暴露于胶片一段选定的时间，以显示PRO10282多肽的存在。可将包含转染细胞的培养物进一步温育(在无血清的培养基中)并用所选择的生物检测方法对该培养基进行检测。
在一种备选技术中，采用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.，12：7575(1981)描述的硫酸葡聚糖方法可以将PRO10282或PRO19578瞬时导入293细胞中。293细胞在旋转瓶中生长到最大密度后加入700g pRK5-PRO10282或pRK5-PRO19578DNA。首先通过离心从旋转瓶中浓缩细胞并用PBS洗细胞。将DNA-葡聚糖沉淀物在细胞团上温育4小时。所述细胞用20％甘油处理90秒，然后用组织培养基洗涤，再加入包含组织培养基，5g/ml牛胰岛素和0.1g/ml牛运铁蛋白的旋转瓶中。大约4天之后，离心该条件培养基并过滤以除去细胞和碎片。浓缩包含表达的PRO10282或PRO19578的样品并通过任何选定方法如透析和/或柱层析纯化。
在另一实施方案中，PRO10282或PRO19578可在CHO细胞中表达。用公知试剂如CaPO4或DEAE-葡聚糖可将pRK5-PRO10282或pRK5PRO19578转染到CHO细胞中。如上所述，温育细胞培养物，将培养基更换为用培养基(单独的)或包含放射性标记物如32S-蛋氨酸的培养基。确定存在PRO10282或PRO19578多肽之后，可以将培养基更换为无血清培养基。优选，将培养物温育大约6天，然后收获该条件培养基。包含表达的PRO10282或PRO19578的培养基通过任何选定方法浓缩并纯化。
带有表位标签的PRO10282或PRO19578也可以在宿主CHO细胞中表达。PRO10282或PRO19578也可以从pRK5载体中亚克隆出来。亚克隆插入子经PCR与所选表位标签如多组氨酸标签融合在杆状病毒表达载体的同一阅读框中。然后可将带有多组氨酸标签的PRO10282或PRO19578插入子亚克隆到SV40驱动载体中，所述驱动载体包含用于选择稳定克隆的选择标志如DHFR。最后，用该SV40驱动载体转染CHO细胞(如上所述)。可如上所述进行标记来验证表达。然后浓缩包含表达的多组氨酸标记型PRO10282或PRO19578的培养基并通过任何选定方法如通过Ni2+-螯合亲和层析进行纯化。
PRO10282或PRO19578也可以通过瞬时表达方法在CHO和/或COS细胞中表达或通过另一稳定表达方法在CHO细胞中表达。
采用以下步骤进行CHO细胞中的稳定表达。所述各种蛋白表达为IgG构建体(免疫粘附素)，其中每种蛋白的可溶性形式(例如细胞外结构域)的编码序列与IgG1恒定区序列融合，所述恒定区序列包含铰链区，CH2和CH2结构域，和/或所述蛋白是带有多组氨酸标签的形式。
PCR扩增之后，采用Ausubel等，Current Protocols of Molecular Biology，Unit 3.16，John Wiley和Sons(1997)所述的标准技术将每种DNA亚克隆到CHO表达载体中。构建CHO表达载体，使目的DNA的5’和3’端含有相容的限制性酶切位点，以准许cDNA便利地穿梭。用于在CHO细胞中表达的载体在Lucas等，Nucl.Acids Res.24：9(1774-1779(1996)中有描述，且使用SV40早期启动子/增强子驱动目的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR的表达可以用来选择转染后稳定维持的质粒。
采用市售转染试剂(Quiagen)，或
Figure G018064965D00903
(Boehringer Mannheim)将12μg的所需质粒DNA导入到大约1×107个CHO细胞中。所述细胞如lucas等，出处同上所述生长。将大约3×107个细胞冷冻在安瓶瓿中以备进一步培养和如下所述的制备。
将包含质粒DNA的安瓿放入水浴中解冻，通过涡旋将其混合。将内容物移到包含10ml培养基的离心管中，1000rpm，离心5分钟。吸出上清，并把细胞重悬浮在10ml的选择培养基中(0.2μm过滤的PS20，其含有5％0.2μm已渗滤的胎牛血清)。将细胞等分到100ml的含有90ml选择培养基的旋转器(spinner)中。1-2天后，将细胞转移到250ml的装有150ml选择培养基的旋转器中，37℃温育。再过2-3天后，以3×105细胞/ml将细胞接种到250ml，500ml和2000ml的旋转器中。通过在制备培养基中离心和重悬浮将细胞培养基更换为新鲜培养基。尽管可以使用任何适当的CHO培养基，但实际使用的是1992年6月16日授予的美国专利5122469中描述的制备培养基。以1.2×106细胞/ml接种3L的制备旋转器。第0天时，测定细胞数和pH值。第一天时，从旋转器中取样并开始用过滤的空气喷雾。第二天，从旋转器中取样，将温度转变到33℃，加入30ml 500g/l葡萄糖和0.6ml 10％消泡剂(例如35％的聚二甲基硅氧烷乳剂，Dow Corning 365医疗级乳剂)。整个生产过程中，依需要调整pH使其保持在7.2左右。10天后，或存活率降低到70％以下时，通过离心收获细胞培养物并经过0.22μm滤膜过滤。所得过滤物或者4℃储存或者立即上样至纯化柱上。
对于多组氨酸标记的构建体，用Ni-NTA层析柱(Qiagen)纯化蛋白。在纯化之前，向条件培养基中加入咪唑至5mM浓度。4℃下将条件培养基以4-5ml/min的流速泵到6ml Ni-NTA层析柱上，所述层析柱已用含0.3M NaCI和5mM咪唑的20mM Hepes pH 7.4缓冲液平衡。上样后，用另外的平衡缓冲液洗柱，用包含0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白。然后用25ml G25Superfine(Pharmacia)层析柱使高度纯化的蛋白脱盐至含10mM Hepes，0.14M NaCI和4％甘露醇，pH6.8的储存缓冲液中，-80℃储存。
免疫粘附素(包含Fc)构建体从条件培养基中如下进行纯化。将条件培养基泵到5ml的蛋白A层析柱上(Pharmacia)上，所述层析柱已经20mM磷酸钠缓冲液pH6.8平衡。上样后，用平衡缓冲液充分洗柱，之后用100mM柠檬酸pH3.5洗脱。将1ml的级分收集到包含275μl 1MTris缓冲液pH9的管中，使洗脱的蛋白立即得到中和。然后将高度纯化的蛋白脱盐至上述用于多组氨酸标记蛋白的储存缓冲液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶以及利用Edman降解法进行的N末端氨基酸测序来评估均一性。
实施例5
PRO10282和PRO19578在酵母中的表达
以下方法描述PRO10282和PRO19578在酵母中的重组表达。
首先，构建用于细胞内生产或分泌由ADH2/GAPDH启动子控制的PRO10282多肽的酵母表达载体。将编码PRO10282多肽(包括PRO19578)的DNA和该启动子插入到选定质粒的适当限制性酶切位点上，以指导PRO10282的细胞内表达。对于分泌的情况，可将编码PRO10282的DNA，连同编码ADH2/GAPDH启动子，天然PRO10282信号肽或其它哺乳动物信号肽，或例如酵母α因子或转化酶分泌信号/前导序列，或(必要时)用于PRO10282表达的接头序列克隆到该选定质粒中。
使用上述表达质粒转化酵母细胞，如酵母菌株AB110，并在选定的发酵培养基中培养。采用10％三氯醋酸沉淀对转化的酵母上清液进行分析，经过SDS-PAGE及之后的考马氏兰染色凝胶进行分离。
然后通过离心去除发酵培养基中的酵母细胞，来实现对重组PRO10282(包括PRO19578)的分离和纯化，并用选定的柱式滤器浓缩该培养基。采用选定的柱层析树脂对包含PRO10282(例如PRO19578)的浓缩物进一步纯化。
实施例6
PRO10282和PRO19578在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达
以下方法描述PRO10282和PRO19578在杆状病毒感染的昆虫细胞中的重组表达。
编码PRO10282或PRO19578的序列被融合在杆状病毒表达载体中表位标记的上游。所述表位标记物包括多组氨酸标签和免疫粘附素标签(如IgG的Fc区)。多种质粒都可以应用，包括由市售质粒如pVL1393(Novagen)衍生的质粒。简言之，编码PRO10282或PRO19578的序列或PRO10282或PRO19578编码序列的所需部分，如编码跨膜蛋白的细胞外结构域的序列，或者，如果所述蛋白是细胞外蛋白，编码成熟蛋白的序列，用与5’和3’区互补的引物进行PCR扩增。所述5’引物的旁侧可掺入(选定的)限制性酶切位点。然后将所得产物用那些选定的限制性酶消化并亚克隆到表达载体中。
用1ipofectin(购自GIBCO-BRL)将上述质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共转染到草地夜蛾(“Sf9”)细胞(ATCC CRL 1711)中，产生重组杆状病毒。28℃温育4到5天后，收获所释放的病毒用于进一步扩增。如O’Reilley等，Baculovirus expression vectors：A laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994)所述进行病毒的感染和蛋白的表达。
通过例如Ni2+螯合物亲和层析如下对表达的多组氨酸标记的PRO10282或PRO19578进行纯化。按Rupert等，Nature，362：175-179(1993)描述的从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简言之，洗涤Sf9细胞，然后将其重悬浮在超声处理缓冲液中(25ml Hepes，pH7.9；12mM MgCL2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCL)，在冰上超声处理2次20秒钟。离心澄清超声处理物，然后将所得上清液在上样缓冲液(50mM磷酸盐，300mMNaCl，10％甘油，pH7.8)中稀释50倍，并用0.45μm的膜过滤。制备5ml柱床体积的Ni2+-NTA琼脂糖层析柱(购自Qiagen)，用25ml的水洗柱，并用25ml的上样缓冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以每分钟0.5ml上样至层析柱上。用上样缓冲液洗所述层析柱至A280基线，此时开始收集级分。然后，用第二种洗柱缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH6.0)洗柱，该缓冲液洗脱非特异性结合的蛋白。重新回到A280基线后，用所述第二种缓冲液中0到500mM的咪唑梯度过柱。收集1ml级分，通过SDS-PAGE和银染或用Ni2+-NTA-偶联的碱性磷酸酶(Qiagen)经Western印迹分析。汇集包含洗脱的His10-标记型PRO 10282或PRO 19578的级分并使其对上样缓冲液进行透析。
备选地，用已知的层析技术，包括例如，蛋白A或蛋白G柱层析对IgG标记的(Fc标记的)PRO10282或PRO19578进行纯化。
实施例7
结合PRO10282或PRO19578的抗体的制备
本实施例描述了能特异性结合PRO10282或PRO19578的单克隆抗体的制备。
单克隆抗体的制备技术在本领域是公知的并在，例如，Goding，出处同上中有描述。可应用的免疫原包括纯化的PRO10282和PRO19578，包含PRO10282或PRO19578的融合蛋白，以及在细胞表面表达重组PRO10282或PRO19578的细胞。本领域的技术人员无需实验即可对免疫原作出选择。
用乳化在完全弗氏佐剂中的PRO10282或PRO19578以1-100μg的量皮下或皮内注射来免疫小鼠，如Balb/c小鼠。或者，用MPL-TDM佐剂(RibiImmunochemical Research，Hamilton，MT)乳化免疫原并注射到所述动物的后足垫中。10到12天后用乳化在选定佐剂中的免疫原对免疫过的小鼠进行加强免疫。此后几周，也可以再进行免疫注射以加强免疫。定期通过眼眶后取血获得小鼠的血清样品，用ELISA检测法检测抗PRO010282抗体或抗PRO019578抗体。
检测到适当的抗体滴度后，对抗体“阳性”的动物最后静脉内注射PRO10282或PRO19578。3到4天后，处死小鼠，取其脾细胞。然后将所得脾细胞与选定的鼠骨髓瘤细胞系如P3X63AgU.1(ATCC，No.CRL，1597融合(用35％聚乙二醇)。然后将融合后产生的杂交瘤细胞平铺到包含HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷)培养基的96孔组织培养板中，所述培养基用于抑制未融合细胞，骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体增殖。
用ELISA筛选杂交瘤细胞抗PRO10282或PRO19578的反应性。对分泌所需抗PRO10282或PRO19578的单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的确定方法在本领域是公知的。
将阳性杂交瘤细胞腹膜内注射到同系Balb/c小鼠中，产生包含抗PRO10282或PRO19578单克隆抗体的腹水。或者，使杂交瘤细胞在组织培养瓶或旋转瓶中生长。用硫酸铵沉淀和随后的凝胶排阻层析对产生在腹水中的单克隆抗体进行纯化。或者应用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和层析。
具体地，用纯化的Unizyme偶联型氨基酸肽加Ribi佐剂(RibiImmunochem Reseach，Inc.，Hamilton，MO)超免疫5只Balb/c小鼠(CharlesRiver Laboratories，Wilmington，DE)，所述氨基酸肽相当于人Stra6的532-667位氨基酸。如前所述(Hongo等，Hybridoma 14：253-260[1995])使来自腘淋巴结的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)融合。10-14天后，收集上清，用直接酶联免疫吸附试验(ELISA)对抗体的产生进行筛选。通过有限稀释进行两轮亚克隆后，发现8个经直接ELISA和免疫组化检测免疫结合性最高的阳性克隆，将这些克隆注射给Pristine致敏的(primed)小鼠以体内制备mAb(Freud和Blair，J.Immunol.129：2826-2830[1982])。汇集腹水液并如前所述(Hongo等，出处同上)通过蛋白A亲和层析(Pharmacia快速蛋白质液相层析(FPLC)；Pharmacia，Uppsala，Sweden)对其进行纯化。纯化的抗体制品过滤(0.2μm孔径；Nalgene，Rochester，NY)除菌，并在磷酸盐缓冲液(PBS)中4℃储存。
实施例8
用特异性抗体纯化PRO10282和PRO19578多肽
可通过蛋白纯化领域中各种标准技术对天然或重组的PRO10282和PRO19578多肽进行纯化。例如，用特异于目标PRO10282多肽的抗体通过免疫亲和层析对原PRO10282或原PRO19578多肽，成熟的PRO10282或PRO19578多肽，或前PRO10282或前PRO19578多肽进行纯化。通常，通过使抗PRO10282或抗PRO19578多肽抗体与一种活化的层析树脂共价偶联来构建免疫亲和层析柱。
通过硫酸铵沉淀或固相蛋白A(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)纯化从免疫血清制备多克隆免疫球蛋白。类似的，通过硫酸铵沉淀或固相蛋白A层析从小鼠腹水液制备单克隆抗体。
将部分纯化的免疫球蛋白共价偶联到层析树脂如CnBr-活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)上。使所述抗体与树脂偶联，所述树脂被封闭，并依照生产商的使用说明洗涤所得的衍生树脂。
利用所述免疫亲和层析柱可纯化PRO10282或PRO19578多肽，其通过从细胞制备包含可溶形式的PRO10282或PRO19578多肽的组分。该制备可通过将完整细胞或亚细胞组分溶解来实现，所述亚细胞组分可通过加入去污剂然后差速离心而获得或通过本领域公知的其它方法获得。或者，包含信号序列的可溶性PRO10282或PRO19578多肽可以以有效量被分泌到细胞生长的培养基中。
使包含可溶性PRO10282或PRO19578多肽的制品流经免疫亲和层析柱，并在允许PRO10282或PRO19578多肽优先吸附的条件下(例如，在有去污剂的存在的高离子强度缓冲液)洗柱。然后在破坏抗体/PRO10282或PRO19578多肽结合的条件下(例如，低pH值如pH值约2-3的缓冲液或高浓度的离液剂如尿素或硫氰酸离子)洗脱层析柱，并收集PRO10282或PRO19578多肽。
实施例9
药物筛选
本发明尤其用于应用PRO10282(Stra6)多肽(包括PRO19578)或其结合片段以多种药物筛选技术中的任何一种筛选化合物。在所述检测中应用的PRO10282多肽或片段可以是在溶液中游离的，附着在固相支持物上的，细胞表面携带的，或者位于细胞内。药物筛选的一个方法利用已被表达PRO10282多肽或片段的重组核酸稳定转化的真核或原核宿主细胞。在竞争结合试验中筛选针对这种转化细胞的药物。这些细胞，无论是存活的还是固定形式的都可以用于标准结合试验。可以检测，例如，PRO10282多肽或其片段与待测制剂之间复合物的形成。或者，可以检测由待测制剂所导致的PRO10282多肽与其靶细胞或靶受体之间复合物形成的减少。
所以，本发明提供筛选能影响PRO10282(Stra6)多肽相关疾病或紊乱的药物或其它任何制剂的方法。这些方法包含使所述制剂与Stra6多肽或其片段接触，并通过本领域公知的方法检测(i)所述制剂和Stra6多肽或其片段之间复合物的存在，或(ii)Stra6多肽或其片段和细胞之间复合物的存在。在这样的竞争结合试验中，Stra6多肽或其片段通常被标记。适当温育后，游离的Stra6多肽或其片段与其结合形式分离，这样，游离或未形成复合物的标记物的量便成为特定制剂结合Stra6多肽或干扰Stra6多肽/细胞复合物的能力的一个指标。
药物筛选的另一技术可用于高通量筛选对多肽具有适当结合亲和力的化合物，该技术可参见1984年9月13日公开的WO 84/03564。简言之，在固体基质上，如塑料针或其它一些表面上合成大量不同的小肽待测化合物。如应用于PRO10282(Stra6)多肽的，使多肽待测化合物与Stra6多肽反应并进行洗涤。结合的Stra6多肽通过本领域公知的方法检测。也可将纯化的Stra6多肽直接包被在用于前述药物筛选技术的平板上。另外，非中和性抗体能用来捕获肽并将其固定到固相支持物上。
本发明也涉及竞争性药物筛选试验的应用，其中能结合Stra6多肽的中和抗体与检测化合物特异性竞争结合Stra6多肽或其片段。这样，抗体可用于检测与Stra6多肽有一个或多个共同抗原决定簇的任何肽的存在。
实施例10
合理的药物设计
合理的药物设计的目标是生产所需生物活性多肽(即PRO10282(Stra6)多肽)的结构类似物或与所述多肽相互作用的小分子，例如，激动剂，拮抗剂或抑制物。这些实例中的任何一个都能用于设计天然序列PRO10282或PRO19578多肽更具活性或更稳定形式的药物，或加强或干扰天然序列PRO10282或PRO19578多肽的体内功能的药物(c.f.，Hodgson，Bio/Technology，9：19-21(1991))。
通过X线晶体衍射，计算机模型设计或通常，通过这两种方法的组合，可以确定天然序列PRO10282或PRO19578多肽，或PRO10282或PRO19578多肽-抑制物复合物的三维结构。必须确定天然PRO10282或PRO19578多肽的形状和电荷，以阐明该分子的结构并确定其活性位点。有时，根据同源蛋白的结构设计模型可获得关于PRO10282或PRO19578多肽结构的有用信息。在上述两种情况下，相关的结构信息可用于设计类似的PRO10282多肽样分子或确定其有效的抑制物。合理药物设计的有效实例包括活性或稳定性已经改善的那些分子，如，Braxton和Wells，Biochemistry，31：7796-7801(1992)所述，或作为天然肽的抑制物，激动剂或拮抗剂起作用的那些分子，如Athauda等，J.Biochem.，113：742-746(1993)所描述。
也可以对如上所述功能分析选定的靶特异性抗体进行分离，然后揭示其晶体结构。该方法原则上产生一种药核(pharmacore)，在此基础上可以设计其后续的药物。通过针对功能性药物活性抗体产生抗独特型抗体(抗-ids)，有可能避开蛋白的结晶学分析。作为镜像的镜像，可推测出抗-ids的结合位点是最初受体的类似物。那么抗-id可用于从化学或生物学方法制备的肽库中鉴定和分离肽。那么这种分离的肽可用作药核。
根据本发明，可提供足量的PRO10282多肽(包括PRO19578)，用来进行这种分析研究，如X线晶体学研究。另外，本文提供的PRO19578多肽氨基酸序列的知识可对应用计算机模拟技术替代X线晶体学或除X线晶体学外还应用计算机模拟技术的那些人提供指导。
实施例11
组织表达分布
从编码PRO10282多肽的核苷酸序列构建用于定量PCR扩增反应的寡核苷酸探针，所述核苷酸序列见附图。选择寡核苷酸探针，使得在标准PCR反应中从与其结合的模板3’端产生约200-600个碱基对的扩增片段。所述寡核苷酸探针用于在标准定量PCR反应中，与分离自不同成人组织的Clontech RNA反应，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以定量PRO10282多肽-编码核酸在各种待测组织中的表达水平。对PRO10282多肽-编码核酸在各种不同人体组织中的表达模式或差异表达的了解提供了一种诊断标志，该标志在有或无其它组织特异性标志物的情况下都可以进行组织分型，用于判断转移性肿瘤的原始组织来源，等等。这些分析的结果(显示在图10)表明，DNA148380-2827分子在成人肾，睾丸和子宫中高表达；在乳腺，前列腺和气管中明显表达；在脑，心脏，肺和甲状腺中微弱表达；在肝脏，骨髓，结肠，骨骼肌，小肠，脾和胃中不表达。
总RNA购自Clontech(Palo Alto，California)并采用以下引物/探针进行PCR扩增分析：
hStra6.tmf3：5’CACACTCGAGAGCCAGATATTTT(SEQ ID NO：6)
hStra6.tmr4：5’AACAAGTTTATTGCAGGGAACAC(SEQ ID NO：7)
hStra6.tmp4：5’TGTAGTTTTTATGCCTTTGGCTATTATGAAAGAGGT(SEQ ID NO：8)
tmf＝正向引物
tmr＝反向引物
tmp＝探针
如以下实施例12描述的原位杂交确定了Stra6在肾小管上皮细胞，子宫肌层，乳腺导管和乳腺小叶周围的间质细胞中的表达，但在脑，肝脏，脾，胰腺，心脏，肺，胃，小肠，结肠，前列腺，脾和肾上腺皮质的切片中Stra6极少表达或无表达(数据未显示)。原位杂交检测的正常组织中，胎盘和肾上腺髓质可见最高水平的表达，在PCR分析中并非如此。
实施例12
人肿瘤中天然人PRO10282(Stra6)转录物的过表达
该实施例显示编码天然人全长PRO10282(Stra6)的基因在某些人结肠肿瘤中明显过表达，并在来源于各种人体肿瘤如结肠，肺，肾和乳腺肿瘤的细胞系中也是如此。
由于筛选的起始物质是分离自人结肠肿瘤或人结肠，肾，乳腺或肺的各种肿瘤细胞系的总RNA。在结肠肿瘤组织中，测定了Stra6RNA相对于同一患者正常结肠组织(粘膜)的RNA的表达。Stra6RNA在各种肿瘤细胞系中的表达与各种正常细胞系(即，正常结肠，肾和肺细胞系)相对比确定。
用Tagman分析试剂，通过实时(real-time)定量PCR(RT-PCR，例如，TAQMAN ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SystemTM[Perkin Elmer，Applied Biosystems Divison，Foster City，California])，监测正常细胞中和来源于某些癌或癌细胞系的细胞中PRO10282(Stra6)编码基因(相当于DNA148380-2827)表达量的差异。50μl RT-PCR反应的组成为5μl 10×Taqman缓冲液A，每种dNTP各300μM，5mM MgCl2，10个单位的RNA酶抑制物，12.5个单位的MnLV反转录酶，1.25个单位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶，200nM探针，500nM引物和100ng RNA。反应条件是48℃反转录30分钟，95℃变性25秒和65℃1分钟。反应产物在4-20％的聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上分析。
对每个所分析的样品用标准曲线确定每个目的基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)管家基因的相对表达水平。用目的基因mRNA水平除以GAPDH mRNA水平获得相对校正单位。对比试验样品和对照样品之间的相对校正单位以确定诱导倍数。
上述结果用于确定编码PRO10282的mRNA在任一种原发性结肠癌或被筛选的结肠，肾脏，乳腺或肺癌细胞系中是否过表达。用于该分析的一些匹配的人正常和结肠肿瘤样品的组织学情况显示如下(参见图11和12)。
编号            组织学
850    侵袭性腺癌；无坏死；保存完好。
851    侵袭性腺癌；极少量坏死；状态完好。
892    侵袭性腺癌；极少量坏死；状态完好。
869    侵袭性腺癌；极少量坏死；状态完好。
893    正常粘膜-发育不良-侵袭性腺癌；少量坏死；状态完好。
870    腺癌-严重发育不良；极少量坏死；状态完好。
871    腺癌-发育不良-正常粘膜；无坏死；状态完好。
848    腺癌-似乎起源于绒毛状腺瘤；粘膜/粘膜下正常；无坏
       死，状态完好。
872    侵袭性腺癌；大约70％的肿瘤坏死；整体保存完好。
778    腺癌-稀有乳头状形态；粘膜正常/增生；极少量坏死；可接受的保存。
17     中度良好分化的腺癌。
18     中度良好分化的腺癌。
64     中度良好分化的腺癌。
76     中度良好分化的腺癌。
人肺细胞系包括正常人肺成纤维细胞系MRCS(CCL-171)和MRC5(CCL-186)，人肺癌上皮细胞系A549(SRCC768，CCL-185)，人上皮样肺癌细胞系Calu-1(SRCC769；HTB-54)，人未分化的癌细胞系Calu-6(SRCC770，HTB-56可能来自肺)，人上皮细胞系NCI-H441(SRCC772；HTB-174)其来源于肺乳头状腺癌患者的心包液，和人肺鳞状细胞癌细胞系SW900(SRCC775；HTB-59)，这些都可从ATCC获得。
结肠细胞系包括，例如正常结肠成纤维细胞系CCD112Co(CRL-1541)，人结肠直肠腺癌细胞系CaCo-2(HTB-37)，人结肠直肠腺癌细胞系WiDr(CCL-218)，人结肠直肠腺癌细胞系HCT116(CCL-247)，人结肠直肠腺癌细胞系SK-Col(HTB-39)，人结肠直肠腺癌细胞系COLO320(SRCC778；CCL-220)，人结肠直肠腺癌细胞系HT29(SRCC779；HTB-38)，人结肠直肠腺癌细胞系SW403(CCL-230)，人结肠癌细胞系NCI/HCC2998，和人结肠直肠腺癌细胞系Colo320DM(CCL-220)，所有这些都来自ATCC或其它的公共渠道。
人乳腺癌细胞系包括人乳腺癌细胞系MCF7(SRCC766；HTB-22)，和人乳腺癌细胞系NCI/ADR-RES，上述两种细胞系都可以从公共途径购买到。
肾细胞系包括293细胞系(CRL-1573)，其是用腺病毒5DNA转化的。两种Wilm’s肿瘤细胞系，G401(CRL-1441)和SK-NEP-1(CRL-1573)也包括在该分析中。
RNA的制备：
从前述培养的细胞系制备RNA。应用Qiagen的纯化试剂盒，缓冲液组和蛋白酶，依照生产商的使用说明和以下描述进行分离。更具体的，用QiagenRNeasy微型柱从培养的细胞中分离总RNA。用RNA Stat-60(Tel-Test)分离来自组织样品的总RNA。通过氯化铯密度梯度离心分离制备从肿瘤制备的RNA。
固体的人肿瘤样品的制备和裂解：
对肿瘤样品称重，并放入50ml的锥形管中，冰上静置。限制每次制备仅处理不超过250mg组织(1tip/一次制备)。蛋白酶溶液新鲜配制，即将蛋白酶放入6.25ml冷双蒸水中稀释至终浓度为20μg/ml，并4℃储存。将DNAseA稀释至终浓度200μg/ml(从100mg/ml原液)来制备G2缓冲液(20ml)。为避免气溶胶的吸入，在层流TC罩超净台中应用polytron的大tip对10ml G2缓冲液中的肿瘤组织匀浆60秒，室温静置。每次取样之间，洗净polytron，方法是每次在2L双蒸水，然后在G2缓冲液中(50ml)中以2×30秒旋转。如果制备器(generator)tip仍然有组织存留，则将该设备拆开清洗。
加入Qiagen蛋白酶(如上制备的，1.0ml)，然后进行涡旋，并在50℃温育3小时。重复温育和离心直至裂解物澄清(例如，另外温育30-60分钟，4℃以3000xg，10分钟离心沉淀)。
定量
从RNA的实时PCR分析中获得的结果首先表示为ΔCT单位。一个单位对应于一个PCR循环或相对于正常大约2倍的扩增，二个单位相当于4倍，三个单位相当于8倍扩增等等。将数据转化成倍数差并如此表述出来。首先，用逆转录酶并用寡(dT)作引物从100ng总RNA或polyA+RNA合成cDNA。所产生的cDNA用作PCR模板。用来源于PRO10282编码序列3’非翻译区的引物和相当于各自间插序列的TAQMANTM荧光探针进行定量。应用3’区倾向于避免基因组DNA中内含子-外显子边界的交叉，这是应用此方法准确评估RNA表达的一个必要条件。用于PRO10282编码基因扩增的引物和探针的序列(正向，反向，和探针)如下：
一组包括以上实施例11中描述的正向和反向引物和探针，其分别显示在SEQ ID NO：6，7和8中。
另一组包括：
hStra6.tmf1：5’AGACCAGGTCCCACACTGA(SEQ ID NO：9)
hStra6.tmr1：5’TTCATAATAGCCAAAGGCATAAAA(SEQ ID NO：10)
hStra6.tmp1：5’CTGCCCACACTCGAGAGCCAGAT3’(SEQ ID NO：11)
人GAPDH：
正向引物：5’GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO：14)
反向引物：5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：15)
探针：5’CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3’(SEQ ID NO：16)
5’核酸酶分析反应是荧光PCR基础上的技术，该技术利用TaqDNA聚合酶的5’外切核酸酶活性实时监测扩增。用两种寡核苷酸引物产生PCR反应的典型扩增子。设计第三种寡核苷酸或探针以检测位于两个PCR引物之间的核苷酸序列。所述探针是不能通过TaqDNA聚合酶延伸的，用报告分子荧光染料和淬灭剂荧光染料标记。当两种染料在探针上的位置彼此靠近时，任何激光诱导的报告分子染料的发射都被淬灭染料所淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶以模板依赖的方式切割探针。所得探针片段在溶液中相互分散，来自所释放的报告分子染料的信号不受第二种荧光团淬灭作用的影响。每合成一新分子，便释放一分子的报告分子染料，对未淬灭的报告分子染料的检测为数据的定量解释打下了基础。
如上所述，5’核酸酶在实时定量PCR仪如ABI PRIZM 7700TM SequenceDetection SystemTM上起作用。所述系统由热循环仪，激光，电荷耦合装置(CCD)，照相机和计算机组成。该系统在热循环仪上扩增96孔板中的样品。在扩增期间，通过所有96孔的纤维光缆实时收集激光诱导的荧光信号，并在CCD上进行检测。该系统包括运行该仪器的软件和分析所得数据的软件。
5’核酸酶分析数据最初表示为Ct，或阈循环。将其定义为报告分子信号累积大于荧光的背景水平的循环。当癌细胞中RNA的表达与正常细胞RNA的表达相比较时，Ct值被用作核酸样品中特定靶序列启始拷贝相对数的定量值。
结果
当与相应的正常人结肠组织比较时，人结肠肿瘤组织中人Stra6RNA(相当于DNA 148380-2827)显示强烈过表达。如图11所示，在所检查的所有14份人肿瘤结肠组织中发现人Stra6RNA(相当于DNA 148380-2827)相对于来自同一患者相匹配的正常结肠直肠粘膜RNA是过表达的。过表达在2到170倍之间，并且14个肿瘤组织样品中7个过表达至少大约10倍。通过定量PCR获得的循环阈值显示，在许多正常的粘膜样品中Stra6mRNA的水平极低或可能不存在。
作为第二种检测方法，定量PCR反应(每次40个循环)完成后所获得的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并通过溴乙啶染色显影。如图12A所示，用管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作标准，肿瘤样品与它们的正常对应样品相比，从Stra6mRNA产生的PCR产物的量要大得多。为进行比较，从所有样品得到内部对照GAPDH mRNA的产物的可比较水平。
通过如下进行的原位杂交(ISH)发现结肠腺癌中Stra6的表达位于上皮肿瘤细胞中。32p标记的正义和反义核酸探针转录自874bp的PCR产物，该产物相当于由DNA 148380-2827编码的人Stra6多肽的编码序列中432-1247位核苷酸。如前所述(Pennica等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14717-22(1998))对甲醛固定且石蜡包埋的组织切片进行处理。所得结果显示在图12B中。
如图13所示，在乳腺，肾脏，结肠和肺的各种肿瘤细胞系中人Stra6RNA(相当于DNA 148380-2827)也是明显过表达的。“相对的RNA表达”指正常和肿瘤组织中RNA的表达显示为相对于任意选定的标准细胞系SW480中的表达。
从各种肿瘤组织切片获得的原位杂交结果也显示在图16中。除结肠腺癌外几种类型的肿瘤也显示高水平的Stra6表达。它们包括所有3例黑素瘤(图16A和B)，4例子宫内膜腺癌中的3例(图16C和D)，3例卵巢腺癌中的2例，和肾脏的Wilm’s瘤(图16E和F)。在这些不同的肿瘤中Stra6的原位杂交信号比结肠腺癌中的大得多，这与所显示的在正常肾脏和子宫中相对较高表达水平和在正常结肠中的低水平一致。因为在正常肾上腺髓质中检测到Stra6，所以我们也检测了二例来源于该组织的肿瘤嗜铬细胞瘤。在这些肿瘤中，Stra6的表达超过本研究中所检测的其它任何肿瘤或组织中的表达(图16G和H)。尽管Stra6在正常肾脏中检测到且在Wilm’s肿瘤中强表达，但在肾细胞癌中未检测到。在肾脏移行(transitional)细胞癌中，肿瘤相关间质细胞而不是肿瘤上皮细胞表达Stra6(数据未显示)。
因为在各种肿瘤和许多肿瘤来源的细胞系中，编码PRO10282的mRNADNA148380-2827过表达，所以其很可能与肿瘤的形成和/或生长有关。因此，预计直接针对由DNA148380-2827(PRO10282)编码的蛋白或该蛋白其它天然产生的变体，如由DNA148389-2827-1编码的PRO19578的拮抗剂(例如抗体，有机和无机小分子，肽和多肽，如Stra6变体，反义寡核苷酸)可用于诊断，预防和/或治疗癌症尤其，不予限制，结肠，肺，乳腺和/或肾脏的癌症。
所述拮抗剂如直接针对由DNA148380-2827(PRO10282)编码的蛋白的治疗性抗体的有效性可通过某些制剂来加强，所述制剂可刺激编码PRO10282的基因的表达。例如，用9-顺-视黄酸或全-反视黄酸处理人结肠直肠癌细胞系导致Stra6mRNA表达的明显增强(图15)。因此，预计用直接针对PRO10282的治疗性抗体与适当的维生素A类组合对癌症患者进行的治疗会提高所述抗体对肿瘤的杀伤。对直接针对在多种肿瘤中过表达的其它天然Stra6多肽，如由DNA148389-2827-1编码的人剪接变体的抗体来说也是如此。
实施例13
Wnt-1和维生素A类对Stra6的协同诱导
材料与方法
细胞培养
C57MG和C57MG/Wnt-1细胞生长在Dulbecco’s改良型Eagle培养基中，该培养基补充有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和2.5μg/ml嘌呤霉素(Edge Biosystems)。C57MG细胞(该细胞中Wnt-1的表达可被四环素阻抑)生长在完全培养基中，该培养基无嘌呤霉素，补充有400μg/ml G418(GibcoBRL)，100μg/ml潮霉素B(Gibco BRL)和50ng/ml四环素(Korinek等，Mol.Cell Biol.18：1248-56(1998))。对Wnt-1的诱导进行研究时，所述细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，在无四环素的培养基中培养10，24，48，72和96小时，然后收获。0小时的对照培养皿一直维持在含四环素的培养基中。同时收获所有培养皿中的细胞并提取每一时间点的总RNA。用Wnt-1，Stra6和GAPDH特异性引物和探针对来自每一样品的100ng总RNA进行RT-PCR。
从美国典型培养物保藏中心获得人结肠腺癌细胞系HCT116和WiDr细胞。HCT116细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)的McCoy’s 5A培养基中。WiDr细胞维持在补充有10％FBS的Dulbecco’s极限必需培养基(DMEM)中。对视黄酸诱导进行研究时，将细胞以105细胞/60mm平皿平铺在包含2.5ml培养基的培养皿上并使其生长24小时。用维生素D3，全-反-RA(Spectrum Laboratory Products)，或9-顺-RA(Toronto Research ChemicalsInc.)(在DMSO中的最终浓度为1μM)处理细胞指定的时间。对照细胞用等量的DMSO处理。
对C57MG/亲代细胞用Wnt-3a条件培养基处理时，将细胞在有或无1μM 9-顺-RA的情况下在常规培养基或已有L-细胞或L-W3A细胞生长的条件培养基中。条件培养基如前所述制备(Willert等，GenesDev.13：1768-73(1999))。到48小时的时候，刮取细胞放入包含氟化钠和钒酸盐的PBS中并在液氮中快速冷冻。用RNAeasy试剂盒(Qiagen)制备RNA，包括依照生产商的使用说明，在层析柱上进行另外的DNase I处理。
Western印迹
对于C57MG/Wnt-1TET细胞系，在无四环素存在的情况下培养所述细胞0，24，48或72小时来诱导Wnt-1的表达。在Triton X-100裂解缓冲液[20mM tris-HCl(pH8.0)，137mM NaCl，1％Triton X-100，1mM EGTA，10％甘油，1.5mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，1mM钒酸钠，50mM氟化钠和完全蛋白酶抑制剂混合物(Boehringer Mannheim)]中裂解细胞并对蛋白等价物进行SDS-PAGE和免疫印迹。所得印迹与0.2μg/ml亲和层析纯化的兔多克隆抗β-连环蛋白抗体(Rubinfeld等，Science 262：1731-1734[1993])，0.1μg/ml抗-E K2单克隆抗体(Transduction Laboratories)温育，或者抗RAR γ-1的1∶2000兔多克隆抗血清(Affinity Bioreagents)温育。对于WiDr细胞系，用1μM全-反-RA处理细胞48小时，然后在Triton X-100裂解缓冲液中将其裂解并如上所述进行处理。使所得印迹与1∶50抗-Stra6肽B单克隆杂交瘤培养上清(克隆12F4.2H9.1D5)温育。
免疫组化
WiDr细胞用9-顺-视黄酸或DMSO处理，然后脱壁并通过低速离心而沉淀。将细胞团在10％中性缓冲的福尔马林中固定过夜，脱水并用石蜡包埋。用抗Stra6肽B单克隆杂交瘤培养上清(克隆12F4.2H9.1D5)或非特异性小鼠同种型IgG2A作为第一抗体进行免疫组化，然后用亲和素-生物素复合物方法用二氨基联苯胺作为显色剂(Bectastain Elite试剂盒，Vector实验室)如前所述(Eberhard等，Am.J.Pathol.145：640-9[1994])进行检测。用苏木精复染切片。
Wnt-1转基因小鼠
在乳腺中表达Wnt-1原癌基因的转基因小鼠通常表现过度增生性损伤并在该组织中出现肿瘤(Tsukamoto等，Cell 55：619-625[1988])。在以下试验中使用这种小鼠。
结果
Easwaran等以前报导，当用突变的β-连环蛋白共转染并用维生素A类处理MCF-7细胞时，合成的视黄酸应答性报告基因的活化增强(Easwaran等，Curr.Biol.9：1415-1418(1999))。考虑到这一点，以及Stra6最初被鉴定为视黄酸可诱导基因(Bouillet等，Mech Dev.63：173-186[1997])，我们想知道视黄酸是否与Wnt-1协同增加C57MG细胞系中Stra6的水平。用9-顺-RA或者全-反-RA(ATRA)处理亲代C57MG细胞48小时，发现Stra6mRNA的水平明显增加，而DMSO和维生素D3无此作用(图17A)。如所预期的，用DMSO或维生素D3处理C57MG/Wnt-1细胞显示Stra6mRNA的水平相对于亲代细胞系是增加的。Wnt-1对Stra6的诱导水平与用9-顺-RA刺激亲代C57MG细胞观察到的相当。然而，C57MG/Wnt-1细胞系的9-顺-RA处理诱导的Stra6mRNA相对于未经处理的C57MG/Wnt-1或9-顺-RA处理的C57MG亲代再增加了10倍。用全-反-RA进行的试验也获得了类似的结果。
C57MG/Wnt-1细胞系中可能存在与Wnt-1表达无关的潜在克隆变体，因为这些细胞与亲代对照细胞相比对视黄酸的应答不同。为阐明这一点，我们检测了亲代C57MG细胞在有或无9-顺-RA存在的情况对可溶性Wnt-3a刺激的应答。Wnt-3a是Wnt-1的类似物，其显示与W nt-1类似的转化特性，在小鼠L细胞中为可溶性配体形式。表达Wnt-3a的培养的L细胞而非对照L细胞生长过的条件培养基诱导C57MG细胞中Stra6的表达(图17B)。用9-顺-RA对C57MG细胞进行处理可观察到诱导水平略微升高。然而，9-顺-RA和Wnt-3a的组合导致Stra6转录子的水平大大超过单独用任一制剂所观察到的水平。
如果β连环蛋白水平的增加可加强对视黄酸处理过的C57MG/Wnt-1细胞中Stra6的诱导，那么人们可以预计在人结肠癌细胞细胞(包含β连环蛋白突变或APC突变)中对视黄酸应答时对Stra6有类似诱导。为确定该现象是否发生，在视黄酸处理HCT116细胞(β连环蛋白中有激活突变)和WiDr细胞(野生型APC的两个拷贝都失去了)之前和之后检测Stra6mRNA水平。在这两种细胞系中，可观察到用ATRA或9-顺-RA处理比用DMSO或维生素D3处理，Stra6mRNA的水平明显增加(图17C)。在HCT116细胞系中，ATRA所致的Stra6基因活化通过原位杂交被确定(图17D)。用Stra6特异性的单克隆抗体经Western印迹检测到用ATRA处理的WiDr细胞中预计的73kDaStra6蛋白带的诱导(图17E)。对WiDr细胞的免疫组化分析揭示，对视黄酸应答时Stra6蛋白的增加定位在浆膜(图17F)。
已提出在非洲爪蟾属胚胎中RARγ基因为Wnt信号传递的靶，并且显示维生素A类对Stra6的诱导依赖于该视黄酸受体亚型的存在(McGrew等，Mech.Dev.87：21-32[1999]；Taneja等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：7854-81[1995])。同时，这些发现提示Wnt和维生素A类对Stra6的协同活化可能是由于Wnt信号传递对RARγ表达的活化。为确定Wnt-1信号传递对哺乳动物细胞中RARγ的水平是否有任何影响，我们对裂解物上的受体进行了Western印迹，所述裂解物制备自有条件地表达Wnt-1的C57MG细胞。通过Wnt-1的表达，在24小时时诱导出一种与RAR γ-1特异性抗体反应且以64kDa的表观分子量迁移的蛋白，在48小时时其表达增加(图18A)。我们也分析了过度增生的乳腺和来源于Wnt-1转基因小鼠的乳腺肿瘤，并检测了RAR γmRNA在这些组织中相对于正常乳腺中升高的水平(图18B)。用定量PCR评估从19例腺癌中分离到的等量RNA中RARγ转录子的水平。很明显，在所检查的19例人结肠肿瘤中14例(74％)的RARγmRNA的表达比正常人结肠组织增加大约2-4倍(图18C)。这些结果表明，Wnt-1信号传递促进RARγ的表达，这种受体受Wrnt-1途径的驱动，在小鼠和人肿瘤中增加。
实验结果的讨论
基因表达作图法是基于对mRNA转录子的无偏检测，因此对基因活化发生的机制有意外的发现。此处显示Wnt-1促进视黄酸应答基因Stra6的诱导，提示Wnt和视黄酸激发的信号传递途径之间有联系。这种联系进一步通过证实Wnt和视黄酸的组合对Stra6产生协同诱导而得到支持。对这种协同作用至少有三种不同的解释：i)直接应答Wnt的转录因子如TCF/LEFs可能结合和活化Stra6基因中的启动子元件；ii)Wnt途径中的信号传递成分可能直接与适当的视黄酸受体(RAR)相互作用并增强由RAR介导的基因活化；或iii)通过Wnt-1传递的信号能活化相应RAR的表达，然后RAR致使细胞对视黄酸敏感。尽管赞成这一最终提议，因为本文所呈现的数据显示Wnt-1信号传递快速诱导RAR γ受体的表达，但本发明没有受到任何特定理论或作用机制的限制。
以前的工作已显示，对RARγ基因特异性的破坏可大大减低维生素A类对Stra6基因的诱导，而这种诱导在该受体再表达时恢复(Taneja等，出处同上)。然而，除Wnt-1诱导RARγ表达之外仍有可能存在其它机制也对所观察到的协同起作用。β连环蛋白结合视黄酸受体的提议是引人注意的，但在我们的细胞系中没有观察到内源性RARγ和β连环蛋白之间任何特异性联系。然而，体外显示β连环蛋白与RARγ结合(Easwanran等，1999，出处同上)，这可能与Wnt-1对Stra6的活化有关。在无RARγ的转基因动物中Stra6的这种表达方式比在野生型同窝动物中观察到的更普遍，并且在裸(null)动物的细胞中视黄酸对Stra6的诱导与对照动物相比被加强(Bouillet等，1997，出处同上；Taneja等，1995，出处同上)。所以RAR γ可能抑制Stra6表达，且如果β连环蛋白抑制RAR γ的功能，Wnt-1对β连环蛋白的活化可能会有效解除这种抑制。
Wnt-1信号传递对视黄酸应答性基因的协同诱导提示那些在Wnt-1途径中有基因缺陷的人类癌症会出现Stra6的过表达。绝大多数的结肠直肠肿瘤在编码APC肿瘤抑制物或β连环蛋白的基因中含有突变(Polakes，Curr.Opin.Genet.Dev.9：15-21[1999])，因此我们检测了Stra6在全部14例结肠直肠肿瘤中相对于所匹配的正常组织中的过表达(参见实施例12)。在卵巢癌和子宫内膜癌，Wilm’s肾肿瘤和黑素瘤中也鉴定了β连环蛋白的活化突变，这表明Wnt-1信号传递中的缺陷对这些癌症的进展是起作用的(Kobayashi等，Jpn.J.Cancer Res.90：55-9[1999]；Koesters等，Cancer Res.59：3880-2[1999]；Palacinos and Hamallo，Cancer Res.58：1344-7[1998]；Rimm等，Am.J.Pathol.154：325-9[1999]；Rubinfeld等Science 262：1731-1734[1993]；Wright等Int.J.Cancer 82：625-9[1999])。通过原位杂交确定所有这四种人类肿瘤都呈现Stra6mRNA的过表达(参见实施例12)。嗜铬细胞瘤这种来源于肾上腺髓质的肿瘤显示极高水平的Stra6mRNA，然而，有关这些肿瘤在Wnt-1信号传递途径中的突变的状态尚无报道。产生黑素瘤和嗜铬细胞瘤的细胞类型在胚胎学上都来源于神经管嵴，这一点是令人非常感兴趣的。值得注意的是，肾脏的Wilm’s肿瘤，嗜铬细胞瘤和子宫内膜癌都起源于Stra6正常表达的器官。这提示肿瘤发生型信号传递，如由Wnt-1途径驱动的那些，可能与负责分化的信号相互作用，从而过度活化Stra6的表达。
人类Stra6蛋白位于细胞表面，可用人Stra6蛋白特异性单克隆抗体对结肠直肠癌细胞进行染色确定。而且，用视黄酸对细胞进行处理后在细胞膜上观察到染色强度增加。因此，Stra6可能编码定位于细胞表面的多次跨膜的蛋白。
材料的保藏
以下材料交美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA(ATCC)保藏：
材料                ATCC保藏号      保藏日
DNA148380-2827      PTA-1181        2000年1月11日
DNA148380-2827-1    PTA-1405        2000年2月23日
该保藏是按照国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约及其章程(布达佩斯条约)进行的。这确保自保藏日起30年的时间内保藏培养物保持存活。这使得通过ATCC可以获得在布达佩斯条约期限内的保藏物，并服从Genentech，Inc.与ATCC之间的协议，后者确保公众基于颁布的相关美国专利或者基于对任何美国或外国专利申请向公众的开放，无论哪一个先来，而可以永久性和无限制利用保藏培养物的传代物，并确保向美国专利商标委员会根据35U.S.C.§122和所依据的委员会规则(包括37C.F.R.§1.14，特别参见886OG 638)确定的个人发放传代物。
本申请的委托人已经同意，如果保藏培养物材料在适宜条件下培养过程中死亡或丢失或遭到破坏，应当在接到通知后及时用相同培养物的另一份材料替换保藏材料。保藏材料的获得不得解释为，违背任何政府当局根据其专利法的规定所赋予的权利，而实施本发明的许可。
前面撰写的说明书已经足以能使本领域技术人员实施本发明。本发明不受保藏构建体范围的限制，因为保藏方案旨在作为本发明一个特定方面的说明，功能等价的任何构建体也包括在本发明范围之内。本文的保藏材料既不构成准许本书面说明书所包含的不足以使本发明任何方面(包括其最佳模式)实施的内容的加入，也不解释为将权利要求的保护范围限定为特定的例证说明。事实上，除了本文所示和所述之外，对前面所描述的本发明进行各种变改，对于本领域技术人员而言是显而易见的，并落入本发明的保护范围。
序列表
<110>杰南技术公司(Genentech，Inc.)
     黛安娜·彭尼卡(Pennica，Diane)
     维多利亚·史密斯(Smith，Victoria)
     威廉·I·伍德(Wood，William I.)
<120>新的STRA6多肽
<130>GENENT.2827VPC
<150>60/197089
<151>2000-04-14
<150>60/175849
<151>2000-01-13
<160>5
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>2732
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(49)…(2052)
<400>1
agtcccagac gggcttttcc cagagagcta aaagagaagg gccagaga atg tcg tcc 57
                                                     Met Ser Ser
                                                      1
cag cca gca ggg aac cag acc tcc ccc ggg gcc aca gag gac tac tcc  105
Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr Glu Asp Tyr Ser
     5                   10                  15
tat ggc agc tgg tac atc gat gag ccc cag ggg ggc gag gag ctc cag  153
Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly Glu Glu Leu Gln
 20                  25                  30                  35
cca gag ggg gaa gtg ccc tcc tgc cac acc agc ata cca ccc ggc ctg  201
Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys His Thr Ser Ile Pro Pro Gly Leu
                 40                  45                  50
tac cac gcc tgc ctg gcc tcg ctg tca atc ctt gtg ctg ctg ctc ctg  249
Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val Leu Leu Leu Leu
             55                  60                  65
gcc atg ctg gtg agg cgc cgc cag ctc tgg cct gac tgt g tg cgt ggc  297
Ala Met Leu Val Arg Arg Arg Gln Leu Trp Pro Asp Cys Val Arg Gly
         70                  75                  80
agg ccc ggc ctg ccc agc cct gtg gat ttc ttg gct ggg gac agg ccc    345
Arg Pro Gly Leu Pro Ser Pro Val Asp Phe Leu Ala Gly Asp Arg Pro
     85                  90                  95
cgg gca gtg cct gct gct gtt ttc atg gtc ctc ctg agc tcc ctg tgt    393
Arg Ala Val Pro Ala Ala Val Phe Met Val Leu Leu Ser Ser Leu Cys
100                 105                 110                 115
ttg ctg ctc ccc gac gag gac gca ttg ccc ttc ctg act ctc gcc tca    441
Leu Leu Leu Pro Asp Glu Asp Ala Leu Pro Phe Leu Thr Leu Ala Ser
                120                 125                 130
gca ccc agc caa gat ggg aaa act gag gct cca aga ggg gcc tgg aag    489
Ala Pro Ser Gln Asp Gly Lys Thr Glu Ala Pro Arg Gly Ala Trp Lys
            135                 140                 145
ata ctg gga ctg ttc tat tat gct gcc ctc tac tac cct ctg gct gcc    537
Ile Leu Gly Leu Phe Tyr Tyr Ala Ala Leu Tyr Tyr Pro Leu Ala Ala
        150                 155                 160
tgt gcc acg gct ggc cac aca gct gca cac ctg ctc ggc agc acg ctg    585
Cys Ala Thr Ala Gly His Thr Ala Ala His Leu Leu Gly Ser Thr Leu
    165                 170                 175
tcc tgg gcc cac ctt ggg gtc cag gtc tgg cag agg gca gag tgt ccc    633
Ser Trp Ala His Leu Gly Val Gln Val Trp Gln Arg Ala Glu Cys Pro
180                 185                 190                 195
cag gtg ccc aag atc tac aag tac tac tcc ctg ctg gcc tcc ctg cct    681
Gln Val Pro Lys Ile Tyr Lys Tyr Tyr Ser Leu Leu Ala Ser Leu Pro
                200                 205                 210
ctc ctg ctg ggc ctc gga ttc ctg agc ctt tgg tac cct gtg cag ctg    729
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Phe Leu Ser Leu Trp Tyr Pro Val Gln Leu
            215                 220                 225
gtg aga agc ttc agc cgt agg aca gga gca ggc tcc aag ggg ctg cag    777
Val Arg Ser Phe Ser Arg Arg Thr Gly Ala Gly Ser Lys Gly Leu Gln
        230                 235                 240
agc agc tac tct gag gaa tat ctg agg aac ctc ctt tgc agg aag aag    825
Ser Ser Tyr Ser Glu Glu Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Cys Arg Lys Lys
    245                 250                 255
ctg gga agc agc tac cac acc tcc aag cat ggc ttc ctg tcc tgg gcc    873
Leu Gly Ser Ser Tyr His Thr Ser Lys His Gly Phe Leu Ser Trp Ala
260                 265                 270                 275
cgc gtc tgc ttg aga cac tgc atc tac act cca cag cca gga ttc cat    921
Arg Val Cys Leu Arg His Cys Ile Tyr Thr Pro Gln Pro Gly Phe His
                280                 285                 290
ctc ccg ctg aag ctg gtg ctt tca gct aca ctg aca ggg acg gcc att    969
Leu Pro Leu Lys Leu Val Leu Ser Ala Thr Leu Thr Gly Thr Ala Ile
            295                 300                 305
tac cag gtg gcc ctg ctg ctg ctg gtg ggc gtg gta ccc act atc cag    1017
Tyr Gln Val Ala Leu Leu Leu Leu Val Gly Val Val Pro Thr Ile Gln
        310                 315                 320
aag gtg agg gca ggg gtc acc acg gat gtc tcc tac ctg ctg gcc ggc    1065
Lys Val Arg Ala Gly Val Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu Leu Ala Gly
    325                 330                 335
ttt gga atc gtg ctc tcc gag gac aag cag gag gtg gtg gag ctg gtg    1113
Phe Gly Ile Val Leu Ser Glu Asp Lys Gln Glu Val Val Glu Leu Val
340                 345                 350                 355
aag cac cat ctg tgg gct ctg gaa gtg tgc tac atc tca gcc ttg gtc    1161
Lys His His Leu Trp Ala Leu Glu Val Cys Tyr Ile Ser Ala Leu Val
                360                 365                 370
ttg tcc tgc tta ctc acc ttc ctg gtc ctg atg cgc tca ctg gtg aca    1209
Leu Ser Cys Leu Leu Thr Phe Leu Val Leu Met Arg Ser Leu Val Thr
            375                 380                 385
cac agg acc aac ctt cga gct ctg cac cga gga gct gcc ctg gac ttg    1257
His Arg Thr Asn Leu Arg Ala Leu His Arg Gly Ala Ala Leu Asp Leu
        390                 395                 400
agt ccc ttg cat cgg agt ccc cat ccc tcc cgc caa gcc ata ttc tgt    1305
Ser Pro Leu His Arg Ser Pro His Pro Ser Arg Gln Ala Ile Phe Cys
    405                 410                 415
tgg atg agc ttc agt gcc tac cag aca gcc ttt atc tgc ctt ggg ctc    1353
Trp Met Ser Phe Ser Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Ile Cys Leu Gly Leu
420                 425                 430                 435
ctg gtg cag cag atc atc ttc ttc ctg gga acc acg gcc ctg gcc ttc    1401
Leu Val Gln Gln Ile Ile Phe Phe Leu Gly Thr Thr Ala Leu Ala Phe
                440                 445                 450
ctg gtg ctc atg cct gtg ctc cat ggc agg aac ctc ctg ctc ttc cgt    1449
Leu Val Leu Met Pro Val Leu His Gly Arg Asn Leu Leu Leu Phe Arg
            455                 460                 465
tcc ctg gag tcc tcg tgg ccc ttc tgg ctg act ttg gcc ctg gct gtg    1497
Ser Leu Glu Ser Ser Trp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Ala Leu Ala Val
        470                 475                 480
atc ctg cag aac atg gca gcc cat tgg gtc ttc ctg gag act cat gat    1545
Ile Leu Gln Asn Met Ala Ala His Trp Val Phe Leu Glu Thr His Asp
    485                 490                 495
gga cac cca cag ctg acc aac cgg cga gtg ctc tat gca gcc acc ttt    1593
Gly His Pro Gln Leu Thr Asn Arg Arg Val Leu Tyr Ala Ala Thr Phe
500                 505                 510                 515
ctt ctc ttc ccc ctc aat gtg ctg gtg ggt gcc atg gtg gcc acc tgg    1641
Leu Leu Phe Pro Leu Asn Val Leu Val Gly Ala Met Val Ala Thr Trp
                520                 525                 530
cga gtg ctc ctc tct gcc ctc tac aac gcc atc cac ctt ggc cag atg    1689
Arg Val Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Asn Ala Ile His Leu Gly Gln Met
            535                 540                 545
gac ctc agc ctg ctg cca ccg aga gcc gcc act ctc gac ccc ggc tac    l737
Asp Leu Ser Leu Leu Pro Pro Arg Ala Ala Thr Leu Asp Pro Gly Tyr
        550                 555                 560
tac acg tac cga aac ttc ttg aag att gaa gtc agc cag tcg cat cca    1785
Tyr Thr Tyr Arg Asn Phe Leu Lys Ile Glu Val Ser Gln Ser His Pro
    565                 570                 575
gcc atg aca gcc ttc tgc tcc ctg ctc ctg caa gcg cag agc ctc cta    1833
Ala Met Thr Ala Phe Cys Ser Leu Leu Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu
580                 585                 590                 595
ccc agg acc atg gca gcc ccc cag gac agc ctc aga cca ggg gag gaa    1881
Pro Arg Thr Met Ala Ala Pro Gln Asp Ser Leu Arg Pro Gly Glu Glu
                600                 605                 610
gac gaa ggg atg cag ctg cta cag aca aag gac tcc atg gcc aag gga    1929
Asp Glu Gly Met Gln Leu Leu Gln Thr Lys Asp Ser Met Ala Lys Gly
            615                 620                 625
gct agg ccc ggg gcc agc cgc ggc agg gct cgc tgg ggt ctg gcc tac    1977
Ala Arg Pro Gly Ala Ser Arg Gly Arg Ala Arg Trp Gly Leu Ala Tyr
        630                 635                 640
acg ctg ctg cac aac cca acc ctg cag gtc ttc cgc aag acg gcc ctg    2025
Thr Leu Leu His Asn Pro Thr Leu Gln Val Phe Arg Lys Thr Ala Leu
    645                 650                 655
ttg ggt gcc aat ggt gcc cag ccc tga gggcagggaa ggtcaaccca          2072
Leu Gly Ala Asn Gly Ala Gln Pro  *
660                 665
cctgcccatc tgtgctgagg catgttcctg cctaccatcc tcctccctcc ccggctctcc 2132
tcccagcatc acaccagcca tgcagccagc aggtcctccg gatcactgtg gttgggtgga 2192
ggtctgtctg cactgggagc ctcaggaggg ctctgctcca cccacttggc tatgggagag 2252
ccagcagggg ttctggagaa aaaaactggt gggttagggc cttggtccag gagccagttg 2312
agccagggca gccacatcca ggcgtctccc taccctggct ctgccatcag ccttgaaggg 2372
cctcgatgaa gccttctctg gaaccactcc agcccagctc cacctcagcc ttggccttca 2432
cgctgtggaa gcagccaagg cacttcctca ccccctcagc gccacggacc tctctgggga 2492
gtggccggaa agctcccggt cctctggcct gcagggcagc ccaagtcatg actcagacca 2552
ggtcccacac tgagctgccc acactcgaga gccagatatt tttgtagttt ttatgccttt 2612
ggctattatg aaagaggtta gtgtgttccc tgcaataaac ttgttcctga gaaaaaaaaa 2672
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2732
<210>2
<211>667
<212>PRT
<213>人(Homo Sapiens)
<400>2
Met Ser Ser Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr Glu
 1               5                  10                  15
Asp Tyr Ser Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly Glu
            20                  25                  30
Glu Leu Cln Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys Hi s Thr Ser Ile Pro
        35                  40                  45
Pro Gly Leu Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val Leu
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Arg Arg Arg Gln Leu Trp Pro Asp Cys
65                  70                  75                  80
Val Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Ser Pro Val Asp Phe Leu Ala Gly
                85                  90                  95
Asp Arg Pro Arg Ala Val Pro Ala Ala Val Phe Met Val Leu Leu Ser
            100                 105                 110
Ser Leu Cys Leu Leu Leu Pro Asp Glu Asp Ala Leu Pro Phe Leu Thr
        115                 120                 125
Leu Ala Ser Ala Pro Ser Gln Asp Gly Lys Thr Glu Ala Pro Arg Gly
    130                 135                 140
Ala Trp Lys Ile Leu Gly Leu Phe Tyr Tyr Ala Ala Leu Tyr Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Cys Ala Thr Ala Gly His Thr Ala Ala His Leu Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Ser Trp Ala His Leu Gly Val Gln Val Trp Gln Arg Ala
            180                 185                 190
Glu Cys Pro Gln Val Pro Lys Ile Tyr Lys Tyr Tyr Ser Leu Leu Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Gly Phe Leu Ser Leu Trp Tyr Pro
    210                 215                 220
Val Gln Leu Val Arg Ser Phe Ser Arg Arg Thr Gly Ala Gly Ser Lys
225                 230                 235                 240
Gly Leu Gln Ser Ser Tyr Ser Glu Glu Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Cys
                245                 250                 255
Arg Lys Lys Leu Gly Ser Ser Tyr His Thr Ser Lys His Gly Phe Leu
            260                 265                 270
Ser Trp Ala Arg Val Cys Leu Arg His Cys Ile Tyr Thr Pro Gln Pro
        275                 280                 285
Gly Phe His Leu Pro Leu Lys Leu Val Leu Ser Ala Thr Leu Thr Gly
    290                 295                 300
Thr Ala Ile Tyr Gln Val Ala Leu Leu Leu Leu Val Gly Val Val Pro
305                 310                 315                 320
Thr Ile Gln Lys Val Arg Ala Gly Val Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu
                325                 330                 335
Leu Ala Gly Phe Gly Ile Val Leu Ser Glu Asp Lys Gln Glu Val Val
            340                 345                 350
Glu Leu Val Lys His His Leu Trp Ala Leu Glu Val Cys Tyr Ile Ser
        355                 360                 365
Ala Leu Val Leu Ser Cys Leu Leu Thr Phe Leu Val Leu Met Arg Ser
    370                 375                 380
Leu Val Thr His Arg Thr Asn Leu Arg Ala Leu His Arg Gly Ala Ala
385                 390                 395                 400
Leu Asp Leu Ser Pro Leu His Arg Ser Pro His Pro Ser Arg Gln Ala
                405                 410                 415
Ile Phe Cys Trp Met Ser Phe Ser Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Ile Cys
            420                 425                 430
Leu Gly Leu Leu Val Gln Gln Ile Ile Phe Phe Leu Gly Thr Thr Ala
        435                 440                 445
Leu Ala Phe Leu Val Leu Met Pro Val Leu His Gly Arg Asn Leu Leu
    450                 455                 460
Leu Phe Arg Ser Leu Glu Ser Ser Trp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Ala
465                 470                 475                 480
Leu Ala Val Ile Leu Gln Asn Met Ala Ala His Trp Val Phe Leu Glu
                485                 490                 495
Thr His Asp Gly His Pro Gln Leu Thr Asn Arg Arg Val Leu Tyr Ala
            500                 505                 510
Ala Thr Phe Leu Leu Phe Pro Leu Asn Val Leu Val Gly Ala Met Val
        515                 520                 525
Ala Thr Trp Arg Val Leu Leu Ser Ala Leu Tyr Asn Ala Ile His Leu
    530                 535                 540
Gly Gln Met Asp Leu Ser Leu Leu Pro Pro Arg Ala Ala Thr Leu Asp
545                 550                 555                 560
Pro Gly Tyr Tyr Thr Tyr Arg Asn Phe Leu Lys Ile Glu Val Ser Gln
                565                 570                 575
Ser His Pro Ala Met Thr Ala Phe Cys Ser Leu Leu Leu Gln Ala Gln
            580                 585                 590
Ser Leu Leu Pro Arg Thr Met Ala Ala Pro Gln Asp Ser Leu Arg Pro
        595                 600                 605
Gly Glu Glu Asp Glu Gly Met Gln Leu Leu Gln Thr Lys Asp Ser Met
    610                 615                 620
Ala Lys Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Arg Gly Arg Ala Arg Trp Gly
625                 630                 635                 640
Leu Ala Tyr Thr Leu Leu His Asn Pro Thr Leu Gln Val Phe Arg Lys
                645                 650                 655
Thr Ala Leu Leu Gly Ala Asn Gly Ala Gln Pro
            660                 665
<210>3
<211>676
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)…(26)
<223>n＝A，T，C或G
<400>3
gtgctctccg aggacaagca ggaggnggtg gagctggtga agcaccatct gtgggctctg 60
gaagtgtgct acatctcagc cttggtcttg tcctgcttac tcaccttcct ggtcctgatg 120
cgctcactgg tgacacacag gaccaacctt cgagctctgc accgaggagc tgccctggac 180
ttgagtccct tgcatcggag tccccatccc tcccgccaag ccatattctg ttggatgagc 240
ttcagtgcct accagacagc ctttatctgc cttgggctcc tggtgcagca gatcatcttc 300
ttcctgggaa ccacggccct ggccttcctg gtgctcatgc ctgtgctcca tggcaggaac 360
ctcctgctct tccgttccct ggagtcctcg tggcccttct ggctgacttt ggccctggct 420
gtgatcctgc agaacatggc agcccattgg gtcttcctgg agactcatga tggacaccca 480
cagctgacca accggcgagt gctctatgca gccacctttc ttctcttccc cctcaatgtg 540
ctggtgggtg ccatggtggc cacctggcga gtgctcctct ctgccctcta caacgccatc 600
caccttggcc agatggacct cagcctgctg ccaccgagag ccgccactct cgaccccggc 660
tactacacgt accgaa                                                 676
<210>4
<211>2777
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(186)…(2160)
<400>4
cacaaccagc cacccctcta ggatcccagc ccagctggtg ctgggctcag aggagaaggc 60
cccgtgttgg gagcaccctg cttgcctgga gggacaagtt tccgggagag atcaataaag  120
gaaaggaaag agacaaggaa gggagaggtc aggagagcgc ttgattggag gagaagggcc  180
agaga atg tcg tcc cag cca gca ggg aac cag acc tcc ccc ggg gcc aca  230
      Met Ser Ser Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr
       1               5                   10                  15
gag gac tac tcc tat ggc agc tgg tac atc gat gag ccc cag ggg ggc    278
Glu Asp Tyr Ser Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly
                 20                  25                  30
gag gag ctc cag cca gag ggg gaa gtg ccc tcc tgc cac acc agc ata    326
Glu Glu Leu Gln Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys His Thr Ser Ile
            35                  40                  45
cca ccc ggc ctg tac cac gcc tgc ctg gcc tcg ctg tca atc ctt gtg    374
Pro Pro Gly Leu Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val
         50                  55                  60
ctg ctg ctc ctg gcc atg ctg gtg agg cgc cgc cag ctc tgg cct gac    422
Leu Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Arg Arg Arg Gln Leu Trp Pro Asp
     65                  70                  75
tgt gtg cgt ggc agg ccc ggc ctg ccc agg ccc cgg gca gtg cct gct    470
Cys Val Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Arg Pro Arg Ala Val Pro Ala
80                  85                  90                  95
gct gtt ttc atg gtc ctc ctg agc tcc ctg tgt ttg ctg ctc ccc gac    518
Ala Val Phe Met Val Leu Leu Ser Ser Leu Cys Leu Leu Leu Pro Asp
                100                 105                 110
gag gac gca ttg ccc ttc ctg act ctc gcc tca gca ccc agc caa gat    566
Glu Asp Ala Leu Pro Phe Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Ser Gln Asp
            115                 120                 125
ggg aaa act gag gct cca aga ggg gcc tgg aag ata ctg gga ctg ttc    614
Gly Lys Thr Glu Ala Pro Arg Gly Ala Trp Lys Ile Leu Gly Leu Phe
        130                 135                 140
tat tat gct gcc ctc tac tac cct ctg gct gcc tgt gcc acg gct ggc    662
Tyr Tyr Ala Ala Leu Tyr Tyr Pro Leu Ala Ala Cys Ala Thr Ala Gly
    145                 150                 155
cac aca gct gca cac ctg ctc ggc agc acg ctg tcc tgg gcc cac ctt    710
His Thr Ala Ala His Leu Leu Gly Ser Thr Leu Ser Trp Ala His Leu
160                 165                 170                 175
ggg gtc cag gtc tgg cag agg gca gag tgt ccc cag gtg ccc aag atc    758
Gly Val Gln Val Trp Gln Arg Ala Glu Cys Pro Gln Val Pro Lys Ile
                180                 185                 190
tac aag tac tac tcc ctg ctg gcc tcc ctg cct ctc ctg ctg ggc ctc    806
Tyr Lys Tyr Tyr Ser Leu Leu Ala Ser Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu
            195                 200                 205
gga ttc ctg agc ctt tgg tac cct gtg cag ctg gtg aga agc ttc agc    854
Gly Phe Leu Ser Leu Trp Tyr Pro Val Gln Leu Val Arg Ser Phe Ser
        210                 215                 220
cgt agg aca gga gca ggc tcc aag ggg ctg cag agc agc tac tct gag    902
Arg Arg Thr Gly Ala Gly Ser Lys Gly Leu Gln Ser Ser Tyr Ser Glu
    225                 230                 235
gaa tat ctg agg aac ctc ctt tgc agg aag aag ctg gga agc agc tac    950
Glu Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Cys Arg Lys Lys Leu Gly Ser Ser Tyr
240                 245                 250                 255
cac acc tcc aag cat ggc ttc ctg tcc tgg gcc cgc gtc tgc ttg aga    998
His Thr Ser Lys His Gly Phe Leu Ser Trp Ala Arg Val Cys Leu Arg
                260                 265                 270
cac tgc atc tac act cca cag cca gga ttc cat ctc ccg ctg aag ctg    1046
His Cys Ile Tyr Thr Pro Gln Pro Gly Phe His Leu Pro Leu Lys Leu
            275                 280                 285
gtg ctt tca gct aca ctg aca ggg acg gcc att tac cag gtg gcc ctg    1094
Val Leu Ser Ala Thr Leu Thr Gly Thr Ala Ile Tyr Gln Val Ala Leu
        290                 295                 300
ctg ctg ctg gtg ggc gtg gta ccc act atc cag aag gtg agg gca ggg    1142
Leu Leu Leu Val Gly Val Val Pro Thr Ile Gln Lys Val Arg Ala Gly
    305                 310                 315
gtc acc acg gat gtc tcc tac ctg ctg gcc ggc ttt gga atc gtg ctc    1190
Val Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Phe Gly Ile Val Leu
320                 325                 330                 335
tcc gag gac aag cag gag gtg gtg gag ctg gtg aag cac cat ctg tgg    1238
Ser Glu Asp Lys Gln Glu Val Val Glu Leu Val Lys His His Leu Trp
                340                 345                 350
gct ctg gaa gtg tgc tac atc tca gcc ttg gtc ttg tcc tgc tta ctc    1286
Ala Leu Glu Val Cys Tyr Ile Ser Ala Leu Val Leu Ser Cys Leu Leu
            355                 360                 365
acc ttc ctg gtc ctg atg cgc tca ctg gtg aca cac agg acc aac ctt    1334
Thr Phe Leu Val Leu Met Arg Ser Leu Val Thr His Arg Thr Asn Leu
        370                 375                 380
cga gct ctg cac cga gga gct gcc ctg gac ttg agt ccc ttg cat cgg    1382
Arg Ala Leu His Arg Gly Ala Ala Leu Asp Leu Ser Pro Leu His Arg
    385                 390                 395
agt ccc cat ccc tcc cgc caa gcc ata ttc tgt tgg atg agc ttc agt    1430
Ser Pro His Pro Ser Arg Gln Ala Ile Phe Cys Trp Met Ser Phe Ser
400                 405                 410                 415
gcc tac cag aca gcc ttt atc tgc ctt ggg ctc ctg gtg cag cag atc    1478
Ala Tyr Gln Thr Ala Phe Ile Cys Leu Gly Leu Leu Val Gln Gln Ile
                420                 425                 430
atc ttc ttc ctg gga acc acg gcc ctg gcc ttc ctg gtg ctc atg cct    1526
Ile Phe Phe Leu Gly Thr Thr Ala Leu Ala Phe Leu Val Leu Met Pro
            435                 440                 445
gtg ctc cat ggc agg aac ctc ctg ctc ttc cgt tcc ctg gag tcc tcg    1574
Val Leu His Gly Arg Asn Leu Leu Leu Phe Arg Ser Leu Glu Ser Ser
        450                 455                 460
tgg ccc ttc tgg ctg act ttg gcc ctg gct gtg atc ctg cag aac atg    l622
Trp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Ala Leu Ala Val Ile Leu Gln Asn Met
    465                 470                 475
gca gcc cat tgg gtc ttc ctg gag act cat gat gga cac cca cag ctg    1670
Ala Ala His Trp Val Phe Leu Glu Thr His Asp Gly His Pro Gln Leu
480                 485                 490                 495
acc aac cgg cga gtg ctc tat gca gcc acc ttt ctt ctc ttc ccc ctc    1718
Thr Asn Arg Arg Val Leu Tyr Ala Ala Thr Phe Leu Leu Phe Pro Leu
                 500                 505                 510
aat gtg ctg gtg ggt gcc ata gtg gcc acc tgg cga gtg ctc ctc tct    1766
Asn Val Leu Val Gly Ala Ile Val Ala Thr Trp Arg Val Leu Leu Ser
            515                 520                 525
gcc ctc tac aac gcc atc cac ctt ggc cag atg gac ctc agc ctg ctg    1814
Ala Leu Tyr Asn Ala Ile His Leu Gly Gln Met Asp Leu Ser Leu Leu
        530                 535                 540
cca ccg aga gcc gcc act ctc gac ccc ggc tac tac acg tac cga aac    1862
Pro Pro Arg Ala Ala Thr Leu Asp Pro Gly Tyr Tyr Thr Tyr Arg Asn
    545                 550                 555
ttc ttg aag att gaa gtc agc cag tcg cat cca gcc atg aca gcc ttc    1910
Phe Leu Lys Ile Glu Val Ser Gln Ser His Pro Ala Met Thr Ala Phe
560                 565                 570                 575
tgc tcc ctg ctc ctg caa gcg cag agc ctc cta ccc agg acc atg gca    1958
Cys Ser Leu Leu Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Arg Thr Met Ala
                580                 585                 590
gcc ccc cag gac agc ctc aga cca ggg gag gaa gac gaa ggg atg cag    2006
Ala Pro Gln Asp Ser Leu Arg Pro Gly Glu Glu Asp Glu Gly Met Gln
            595                 600                 605
ctg cta cag aca aag gac tcc atg gcc aag gga gct agg ccc ggg gcc    2054
Leu Leu Gln Thr Lys Asp Ser Met Ala Lys Gly Ala Arg Pro Gly Ala
        610                 615                 620
agc cgc ggc agg gct cgc tgg ggt ctg gcc tac acg ctg ctg cac aac    2102
Ser Arg Gly Arg Ala Arg Trp Gly Leu Ala Tyr Thr Leu Leu His Asn
    625                 630                 635
cca acc ctg cag gtc ttc cgc aag acg gcc ctg ttg ggt gcc aat ggt    2150
Pro Thr Leu Gln Val Phe Arg Lys Thr Ala Leu Leu Gly Ala Asn Gly
640                 645                 650                 655
gcc cag ccc t gagggcaggg aaggtcaacc cacctgccca tctgtgctga          2200
Ala Gln Pro
ggcatgttcc tgcctaccac ctcctccctc cccggctctc ctcccagcat cacaccagcc  2260
atgcagccag caggtcctcc ggatcactgt ggttgggtgg aggtctgtct gcactgggag  2320
cctcaggagg gctctgctcc acccacttgg ctatgggaga gccagcaggg gttctggaga  2380
aagaaactgg tgggttaggg ccttggtcca ggagccagtt gagccagggc agccacatcc  2440
aggcgtctcc ctaccctggc tctgccatca gccttgaagg gcctcgatga agccttctct 2500
ggaaccactc cagcccagct ccacctcagc cttggccttc acgctgtgga agcagccaag 2560
gcacttcctc accccctcag cgccacggac ctctctgggg agtggccgga aagctcccgg 2620
gcctctggcc tgcagggcag cccaagtcat gactcagacc aggtcccaca ctgagctgcc 2680
cacactcgag agccagatat ttttgtagtt tttatgcctt tggctattat gaaagaggtt 2740
agtgtgttcc ctgcaataaa cttgttcctg agaaaaa                          2777
<210>5
<211>658
<212>PRT
<213>人(Homo Sapiens)
<400>5
Met Ser Ser Gln Pro Ala Gly Asn Gln Thr Ser Pro Gly Ala Thr Glu
 1               5                  10                  15
Asp Tyr Ser Tyr Gly Ser Trp Tyr Ile Asp Glu Pro Gln Gly Gly Glu
            20                  25                  30
Glu Leu Gln Pro Glu Gly Glu Val Pro Ser Cys His Thr Ser Ile Pro
        35                  40                  45
Pro Gly Leu Tyr His Ala Cys Leu Ala Ser Leu Ser Ile Leu Val Leu
    50                  55                  60
Leu Leu Leu Ala Met Leu Val Arg Arg Arg Gln Leu Trp Pro Asp Cys
65                  70                  75                  80
Val Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Arg Pro Arg Ala Val Pro Ala Ala
                85                  90                  95
Val Phe Met Val Leu Leu Ser Ser Leu Cys Leu Leu Leu Pro Asp Glu
            100                 105                 110
Asp Ala Leu Pro Phe Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Ser Gln Asp Gly
        115                 120                 125
Lys Thr GIu Ala Pro Arg Gly Ala Trp Lys Ile Leu Gly Leu Phe Tyr
    130                 135                 140
Tyr Ala Ala Leu Tyr Tyr Pro Leu Ala Ala Cys Ala Thr Ala Gly His
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala His Leu Leu Gly Ser Thr Leu Ser Trp Ala His Leu Gly
                165                 170                 175
Val Gln Val Trp Gln Arg Ala Glu Cys Pro Gln Val Pro Lys Ile Tyr
            180                 185                 190
Lys Tyr Tyr Ser Leu Leu Ala Ser Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Gly
        195                 200                 205
Phe Leu Ser Leu Trp Tyr Pro Val Gln Leu Val Arg Ser Phe Ser Arg
    210                 215                 220
Arg Thr Gly Ala Gly Ser Lys Gly Leu Gln Ser Ser Tyr Ser Glu Glu
225                 230                 235                 240
Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Cys Arg Lys Lys Leu Gly Ser Ser Tyr His
                245                 250                 255
Thr Ser Lys His Gly Phe Leu Ser Trp Ala Arg Val Cys Leu Arg His
            260                 265                 270
Cys Ile Tyr Thr Pro Gln Pro Gly Phe His Leu Pro Leu Lys Leu Val
        275                 280                 285
Leu Ser Ala Thr Leu Thr Gly Thr Ala Ile Tyr Gln Val Ala Leu Leu
    290                 295                 300
Leu Leu Val Gly Val Val Pro Thr Ile Gln Lys Val Arg Ala Gly Val
305                 310                 315                 320
Thr Thr Asp Val Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Phe Gly Ile Val Leu Ser
                325                 330                 335
Glu Asp Lys Gln Glu Val Val Glu Leu Val Lys His His Leu Trp Ala
            340                 345                 350
Leu Glu Val Cys Tyr Ile Ser Ala Leu Val Leu Ser Cys Leu Leu Thr
        355                 360                 365
Phe Leu Val Leu Met Arg Ser Leu Val Thr His Arg Thr Asn Leu Arg
    370                 375                 380
Ala Leu His Arg Gly Ala Ala Leu Asp Leu Ser Pro Leu His Arg Ser
385                 390                 395                 400
Pro His Pro Ser Arg Gln Ala Ile Phe Cys Trp Met Ser Phe Ser Ala
                405                 410                 415
Tyr Gln Thr Ala Phe Ile Cys Leu Gly Leu Leu Val Gln Gln Ile Ile
            420                 425                 430
Phe Phe Leu Gly Thr Thr Ala Leu Ala Phe Leu Val Leu Met Pro Val
        435                 440                 445
Leu His Gly Arg Asn Leu Leu Leu Phe Arg Ser Leu Glu Ser Ser Trp
    450                 455                 460
Pro Phe Trp Leu Thr Leu Ala Leu Ala Val Ile Leu Gln Asn Met Ala
465                 470                 475                 480
Ala His Trp Val Phe Leu Glu Thr His Asp Gly His Pro Gln Leu Thr
                485                 490                 495
Asn Arg Arg Val Leu Tyr Ala Ala Thr Phe Leu Leu Phe Pro Leu Asn
            500                 505                 510
Val Leu Val Gly Ala Ile Val Ala Thr Trp Arg Val Leu Leu Ser Ala
        515                 520                 525
Leu Tyr Asn Ala Ile His Leu Gly Gln Met Asp Leu Ser Leu Leu Pro
    530                 535                 540
Pro Arg Ala Ala Thr Leu Asp Pro Gly Tyr Tyr Thr Tyr Arg Asn Phe
545                 550                 555                 560
Leu Lys Ile Glu Val Ser Gln Ser His Pro Ala Met Thr Ala Phe Cys
                565                 570                 575
Ser Leu Leu Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Arg Thr Met Ala Ala
            580                 585                 590
Pro Gln Asp Ser Leu Arg Pro Gly Glu Glu Asp Glu Gly Met Gln Leu
        595                 600                 605
Leu Gln Thr Lys Asp Ser Met Ala Lys Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser
    610                 615                 620
Arg Gly Arg Ala Arg Trp Gly Leu Ala Tyr Thr Leu Leu His Asn Pro
625                 630                 635                 640
Thr Leu Gln Val Phe Arg Lys Thr Ala Leu Leu Gly Ala Asn Gly Ala
                645                 650                 655
Gln Pro

Claims (33)

1.特异性结合Stra6多肽的抗体，所述Stra6多肽由以下各项组成：(a)图2氨基酸残基532-667的氨基酸序列；或(b)图2氨基酸残基1-667的氨基酸序列，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
2.权利要求1的抗体，其诱导表达所述多肽的细胞死亡。
3.权利要求2的抗体，其中所述细胞是与同一组织类型的正常细胞相比所述多肽过表达的肿瘤细胞。
4.权利要求1的抗体，其是单克隆抗体。
5.权利要求4的抗体，其包含非人的互补决定区(CDR)或人的框架区(FR)。
6.权利要求1的抗体，其是标记的抗体。
7.权利要求1的抗体，其是抗体片段或单链抗体。
8.一种治疗肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1的抗体，所述抗体与可药用载体混合。
9.权利要求8的药物组合物，其包含治疗有效量的所述抗体。
10.权利要求8的药物组合物，其进一步包含细胞毒制剂或化疗制剂。
11.权利要求1-7中任一项的抗体在制备诊断哺乳动物肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤是乳房肿瘤、肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、或嗜铬细胞瘤。
12.一种癌症诊断试剂盒，其在适当包装中包含权利要求1的抗Stra6抗体和一种载体。
13.权利要求12的试剂盒，其进一步包含使用所述抗体检测怀疑有Stra6多肽的样品中该多肽的存在的说明。
14.权利要求1-7中任一项的抗体在制备治疗肿瘤的药物中的用途，其中所述肿瘤是乳房肿瘤、肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、或嗜铬细胞瘤。
15.抗Stra6抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其中所述抗Stra6抗体或其抗原结合片段特异性结合由以下各项组成：(a)图2氨基酸残基532-667；或(b)图2氨基酸残基1-667的Stra6多肽，所述肿瘤是乳房肿瘤、肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾肿瘤、黑素瘤、或嗜铬细胞瘤。
16.权利要求15的用途，其中所述Stra6多肽是包含图2氨基酸残基1-667的多肽。
17.权利要求15的用途，其中所述肿瘤细胞与同一组织类型的正常细胞相比过表达Stra6多肽。
18.权利要求15的用途，其中所述药物包含维生素A类或者与维生素A类联合施用。
19.权利要求18的用途，其中所述维生素A类刺激或增强Stra6在所述肿瘤细胞中的过表达。
20.权利要求15-19任一项的用途，其中所述肿瘤细胞具有Wnt途径中的基因缺陷。
21.权利要求20的用途，其中所述缺陷导致β-连环蛋白信号异常活化。
22.权利要求20的用途，其中所述肿瘤细胞包含β-连环蛋白的APC肿瘤抑制物的突变。
23.权利要求15-19任一项的用途，其中所述抗Stra6抗体诱导细胞死亡。
24.权利要求15-19任一项的用途，其中所述药物是进一步联合放射治疗、细胞毒剂或化疗剂治疗的药物。
25.权利要求15-19任一项的用途，其中所述肾肿瘤是Wilm氏肾肿瘤。
26.权利要求15-19任一项的用途，其中所述抗体偶联有细胞毒剂或使前体药物转化为活性抗癌药物的药物前体-激活酶。
27.权利要求15-19任一项的用途，其中所述抗Stra6抗体是异源偶联的抗体。
28.权利要求27的用途，其中所述抗体偶联有细胞毒剂或使前体药物转化为活性抗癌药物的药物前体-激活酶。
29.权利要求1的抗体，其中所述抗体是异源偶联的抗体。
30.权利要求29的抗体，其中所述抗体偶联有细胞毒剂或使前体药物转化为活性抗癌药物的药物前体-激活酶。
31.权利要求15-19任一项的用途，其中所述抗体的抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段。
32.权利要求15-19任一项的用途，其中所述抗Stra6抗体是单克隆抗体。
33.权利要求15-19任一项的用途，其中所述抗Stra6抗体是人源化抗体。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60137829D1 (de) * 2000-01-13 2009-04-16 Genentech Inc Menschliche stra6 polypeptide
WO2002077027A1 (en) * 2000-03-23 2002-10-03 Curagen Corporation Human stra6-like protein and nucleic acids encoding the same
CN1339489A (zh) * 2000-08-23 2002-03-13 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人视黄酸效应蛋白53.57和编码这种多肽的多核苷酸
JP2004507251A (ja) * 2000-08-29 2004-03-11 ジェネンテック・インコーポレーテッド 癌の治療効果を増強するための方法
AU2002308557A1 (en) * 2001-05-01 2002-11-11 The Regents Of The University Of California Wnt and frizzled receptors as targets for immunotherapy in head and neck squamous cell carcinomas
ES2486265T3 (es) * 2002-03-13 2014-08-18 Genomic Health, Inc. Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados
US7666627B2 (en) * 2002-08-08 2010-02-23 Targetex Kft. Folded recombinant catalytic fragments of multidomain serine proteases, preparation and uses thereof
WO2004039412A2 (en) * 2002-10-29 2004-05-13 Engene, Inc. Compositions for cancer treatment
CA2524172A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Centocor, Inc. Cngh0010 specific polynucleotides, polypeptides, antibodies, compositions, methods and uses
US7780721B2 (en) * 2004-09-01 2010-08-24 C. R. Bard, Inc. Stent and method for manufacturing the stent
WO2008089438A2 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 The Regents Of The University Of California A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin a, methods of use and compositions
US20110159017A1 (en) * 2008-04-11 2011-06-30 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Trytophan catabolism in cancer treatment and diagnosis
US20120183477A1 (en) * 2009-06-26 2012-07-19 Five Prime Therapeutics, Inc. Therapeutic Antibody Target Validation and Screening In Vivo
SG181806A1 (en) * 2010-01-11 2012-07-30 Genomic Health Inc Method to use gene expression to determine likelihood of clinical outcome of renal cancer
ES2925983T3 (es) * 2010-07-27 2022-10-20 Genomic Health Inc Método para usar la expresión génica para determinar el pronóstico del cáncer de próstata
EP3179393B1 (en) 2012-01-31 2020-07-08 Genomic Health, Inc. Gene expression profile algorithm and test for determining prognosis of prostate cancer
KR102148303B1 (ko) 2012-02-11 2020-08-26 제넨테크, 인크. R-스폰딘 전위 및 그의 사용 방법
JP2016521979A (ja) 2013-05-30 2016-07-28 ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド 腎臓がんを有する患者に対する再発スコアを計算するための遺伝子発現プロファイルアルゴリズム
EP3636661A1 (en) * 2018-10-12 2020-04-15 Bioc3 Phosphate translocator

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4444545A (en) * 1982-04-08 1984-04-24 Sanders David F Pump control system
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
US4485054A (en) * 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4676417A (en) * 1986-04-14 1987-06-30 Richard Hirschkoff Ski carrier
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4997852A (en) * 1987-08-26 1991-03-05 Ohio State University Research Foundation Method and composition for achieving cancer chemopreventive and chemotherapeutic activity
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
KR0154872B1 (ko) 1987-12-21 1998-10-15 로버트 에이. 아미테이지 발아하는 식물종자의 아크로박테리움 매개된 형질전환
SE8802525L (sv) 1988-07-06 1990-01-07 Fmg Filipstad Ab Stol
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5009772A (en) 1989-02-27 1991-04-23 Kerr-Mcgee Corporation Solvent extraction process
DE394538T1 (de) 1989-04-28 1991-04-11 Rhein Biotech Ges. Fuer Biotechnologische Prozesse Und Produkte Mbh, 4000 Duesseldorf, De Hefezellen der schwanniomyces-gattung.
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
WO1990013641A1 (en) 1989-05-10 1990-11-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Stably transformed eucaryotic cells comprising a foreign transcribable dna under the control of a pol iii promoter
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5731167A (en) 1992-01-17 1998-03-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Autotaxin: motility stimulating protein useful in cancer diagnosis and therapy
US5756448A (en) 1992-02-26 1998-05-26 The General Hospital Corporation Constitute activator of retinoid (CAR) receptor polypeptides
CA2131543C (en) 1992-03-04 2002-09-17 Daniel Pinkel Comparative genomic hybridization
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
ATE195652T1 (de) 1992-12-02 2000-09-15 Alkermes Inc Wachstumhormon enthaltende mikrosphaeren mit kontrollierter freisetzung
US5547947A (en) * 1993-03-11 1996-08-20 Hoffmann-La Roche Inc. Methods of treatment
ATE186219T1 (de) 1993-03-24 1999-11-15 Berlex Biosciences Kombination von antihormonale und bindende moleküle zur krebsbehandlung
US5681860A (en) * 1993-09-21 1997-10-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of increasing expression of HLA, cell surface and TAA antigens of cells using 3-(N-acetylamino)-5-(N-decyl-N-methylamino)-benzyl alcohol
EP0779806B2 (en) 1994-09-09 2008-04-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Sustained release preparation containing metal salt of a peptide
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6316007B1 (en) 1995-04-04 2001-11-13 Wound Healing Of Oklahoma Combined physical and immunotherapy for cancer
CZ288147B6 (en) 1995-06-07 2001-05-16 Alkermes Inc Preparation for prolonged release of human growth hormone
ZA965368B (en) 1995-07-14 1997-01-14 Novo Nordisk As A pharmaceutical formulation
US5871697A (en) * 1995-10-24 1999-02-16 Curagen Corporation Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing
AU2582897A (en) 1996-03-15 1997-10-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
US6525174B1 (en) * 1997-06-06 2003-02-25 Human Genome Sciences, Inc. Precerebellin-like protein
EP1039801A4 (en) * 1997-06-06 2003-03-26 Human Genome Sciences Inc 207 HUMAN SECRETED PROTEINS
WO2001012660A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Sagami Chemical Research Center HUMAN PROTEINS HAVING HYDROPHOBIC DOMAINS AND DNAs ENCODING THESE PROTEINS
DE60137829D1 (de) * 2000-01-13 2009-04-16 Genentech Inc Menschliche stra6 polypeptide
WO2002077027A1 (en) * 2000-03-23 2002-10-03 Curagen Corporation Human stra6-like protein and nucleic acids encoding the same
US7301008B2 (en) * 2000-06-05 2007-11-27 Genentech, Inc. PRO7174 polypeptides
US20030187201A1 (en) * 2000-09-15 2003-10-02 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7157558B2 (en) * 2001-06-01 2007-01-02 Genentech, Inc. Polypeptide encoded by a polynucleotide overexpresses in tumors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
作者:BOUILLET PHILIPPE ET AL.标题:Developmental expression pattern of Stra6, a retinoicacid-responsive gene encoding a new type of membraneprotein..MECHANISMS OF DEVELOPMENT卷号：63 期号：2.1997,63(2),173-186.
作者:BOUILLET PHILIPPE ET AL.标题:Developmental expression pattern of Stra6, a retinoicacid-responsive gene encoding a new type of membraneprotein..MECHANISMS OF DEVELOPMENT卷号:63 期号:2.1997,63(2),173-186. *

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AU785055B2 (en) 2006-09-07
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