CN1449291A - 用于抑制血小板与胶原粘附的新的特异性机制 - Google Patents

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Abstract

多肽乳清酸在制造一种药物中的用途，该药物具有显著减少血管损伤或者动脉内膜切除术后的血小板粘附和聚集的能力。本发明进一步涉及到乳清酸的一种新的医学用途，在该用途中乳清酸作为血栓形成和内膜增生的抑制剂，其中所述的多肽可被局部用作为表面试剂或者作为治疗设备上的包被物或者掺入其中或与之相结合。

Description

用于抑制血小板与胶原粘附的新的特异性机制
发明概述
本发明涉及到被称为乳清酸的多肽，该多肽显著地降低诸如动脉内膜切除这样的血管损伤后的血小板粘附和聚集。本发明进一步涉及到抑制在高度剪切条件下血小板同血管壁胶原之间依赖于vWF的结合，更详细地说，本发明涉及到乳清酸作为血栓形成抑制剂的一种新的医学用途，其中所述的多肽可在局部被用作表面试剂或者被用作某种治疗设备的包被物。
发明领域
血细胞，特别是血小板同受创血管壁的粘附在血管成形和手术过程中是一种众所周知的现象。这样的创伤可能在多种手术和经皮肤进行的治疗中发生，这样的治疗被用于重新打开阻塞的通道、导管以及其它的管腔，用于除去病变组织以及用于移植代用组织或者其组成部分。
已经开发出多种类型的介入技术用于辅助降低或者清除血管中的阻塞，以增加流经该血管的血液。一种用于治疗血管狭窄或者阻塞的技术为经皮球囊血管成形术。将一种球囊导管引入该患者的动脉系统并且插进窄化或者阻塞的区域并且将球囊充气以扩展该受限区域。经皮经腔血管成形术(PTCA)是被用于打开受阻的粥样硬化动脉的最广泛的血管成形方法。
一般来说，除去需要旁路手术之外，血管成形术过程会产生出色的效果，但在约30-40％的患者之中，表面上成功的动脉初始扩张在约3到9个月后可能会继以血管的再度窄化(再狭窄)。如果这种血管再狭窄很严重，该患者可能需要第二次血管成形过程，通常还要植入一种支架以作为血管中的骨架结构。
在其它情况下可能需要通过旁路手术进行动脉重建，这是更为危险的过程。对于每年在全世界范围内进行的800,000例以上的PTCA过程，这一30-40％的血管再狭窄率的社会经济牵涉问题已经成为介入心脏病学家所密切关注的问题。
血管再狭窄通常是球囊介导对动脉壁的拉伸和挤压损伤的结果，在这种过程所使用的导管的导丝在伸展中可能导致损伤并且引起该动脉的平滑肌细胞的增殖，从而导致数月后该动脉的再度闭锁(“再狭窄”)。
由于可能出现的血管再狭窄相关的并发症和对从溃疡性斑块中释放出栓子及其严重后果的忧虑，重复性的血管成形术在颈动脉中的应用严重地限制了对最低限度的侵入式介入的选择。
在此之前进行了一些尝试以用于通过其它类型的介入方法来治疗导向脑组织的颈动脉阻塞。
颈动脉内膜切除术是一种用于从颈动脉中除去阻塞物的手术方法并且是在美国中使用的最普通的血管手术程序。多中心试验的结果已经证实了该程序在有症状和无症状患者体内治疗颅外颈动脉疾病中的效果(JAMA 1995；273：1421-28；NEngl.J.Med.1991；325：445-53)并且动脉内膜切除程序被用于在其它血管床中治疗阻塞性血管疾病(Vasc.Surg.1999；33：461-70)。
在动脉内膜切除术中，颈动脉被切割出缝并且血小板被从裂缝区域的血管中除去。在一个手术中，颈动脉分叉部分通过该患者颈部的切割而被暴露，并将血管钳置于闭塞处的任意侧以将其分离，并且进行一次切开以打开该动脉。除去该闭塞部分，灌注并吸出该分离区域，并且闭合该动脉裂缝。去除血管钳以重建通过该动脉的血流。血管钳中所包含的栓塞物和碎片可能在颈动脉打开后导致相当大的问题，这可能使血液流入先前分离的区域。
尽管动脉内膜切除是一种有效的治疗方法，但该方法经常使外膜和成血栓的内皮下层被暴露。尽管颈动脉内膜切除术的效果不错，该手术可能会导致一些并发症，包括血栓形成以及内膜增生，这可以导致消除该介入处理的良性效果的并发症或者产生新的问题。
临床研究已经显示了在紧接的手术后期间具有1-10％的颈动脉内膜切除术后中风几率，几乎所有这样的情况归因于动脉内膜切除位置处的血栓形成以及随后的脑栓塞形成(Stroke 1984；15：950-55)。血小板的积累还可能因内膜增生的发展而导致再狭窄，这可能在手术后的两年内发生。据报道再狭窄在10-20％的经动脉内膜切除手术的患者中在手术后2-5年内发生，根据颈部双侧超声扫描的证实，其中大多数是由于内膜增生、内膜增厚以及血管直径减少所造成(J.Vasc.Surg.1986：3：10-23)。
血管壁针对机械诱导的损伤、手术介入、支架置入、某种血管移植物(动脉或者动静脉植入物，例如透析植入物)的置入的细胞和分子反应是炎症、平滑肌细胞迁移、增殖和成肌纤维细胞转化之间的一种复杂的相互作用，这种复杂作用一旦损伤发生便开始进行(Futura；1997 p.289-317)。如果动脉受到疾病的严重损伤并且可能由于钙沉积而硬化，介入可能会由局部的去内膜化和其下的细胞外基质成分的暴露而导致一定程度的额外伤害，所述的细胞外基质成分的例子如胶原和弹性蛋白。在一些患者中，过量的血小板和纤维蛋白原的募集可能随后导致一种急性血栓阻塞。
使用经动脉内膜切除处理的大鼠颈动脉模型(Neurosurg 1985；16：773-79)以及栓子切除球囊损伤模型(Lab.Invest 1983；49：327-33)进行的研究已经证明当内膜细胞在血管损伤期间被剥离时，血小板开始粘附于被暴露的内皮下层。Spallone等人(Neurosurg1985；16：773-79)通过使用扫描电镜已经证明在一只大鼠进行颈部动脉内膜切除术5分钟后在该受损区域上形成了一种单层血小板。损伤后15分钟观察到了血小板的聚集和血栓的形成。动脉内膜切除30分钟后，该位点被覆盖以激活的血小板并且为纤维蛋白和红细胞所包被。血栓的形成在损伤后3个小时达到顶峰，此时可观察到一种厚的纤维蛋白-血小板层。血小板是这种血栓形成以及所导致的血栓的整合成分，但也可能在在内膜增生中起到一定的作用。
使用患血小板减少症的大鼠而进行的研究进一步证明与对照大鼠相比较颈动脉损伤后的内膜增生明显降低(Proc.Natl Acad.Sci.USA 1989；86：8412-16)。一旦血小板粘附于受损血管的暴露的内膜下层它们便成为激活状态并且释放其颗粒。这些颗粒含有血管活性因子和凝血因子(5-羟色胺、ADP、纤维蛋白原、von Willebrands因子、血栓烷A2)以及生长因子(血小板生长因子、转化生长因子-β以及表皮生长因子)(Circulation 1985；72：735-40)。血小板增强内膜增生发展的精确机制尚未完全了解。研究显示，血小板主要为中膜平滑肌细胞在内膜增生发展的第二阶段向内膜的迁移提供了一种趋化刺激物(Vasc.Surg.1991；13：885-91)。使用抗PDGF抗体进行的其它研究证实了在血管损伤后PDGF在新的内膜平滑肌细胞聚集中所起的关键性作用(Science 1991；253：1129-32)。血小板增强内膜增生的发展的另一种可能的机制是通过损伤位点处的凝血酶的凝血级联激活和随后的聚集(J.Clin.Invest.1993；91：94-98，J.Vasc.Surg.1990；11：307-13)。另外，凝血酶已经证明为血小板激活的一种刺激物。忽略具体的准确机制，血小板在血管损伤位置的粘附和激活在血栓形成和内膜增生的发展中起着重要的作用，因此对血小板粘附和激活的抑制可能有助于防止或者降低血栓发生率和内膜增生的发展。
血小板对受损动脉壁的粘附在最初的情况下受到Von Willebrand因子(vWF)的介导，该因子为一种多聚的糖蛋白，该蛋白从内皮细胞中释放并且在血液中循环，在其中该因子作为因子VIII的一种载体蛋白发挥作用(Annu.Tev.Biochem.1998；67：395-424)。高度多聚化的vWF还包含在血小板的α-颗粒中进行循环，该因子随着血小板的激活而从中释放(Annu.Tev.Biochem.1998；67：395-424)。在高度剪切的情况下，例如在血管中遭遇粥样硬化斑或者机械介入的情况下，vWF可能通过其A 3结构域同表面暴露的胶原纤维结合(Biochemistry 1986；25(26)：8357-8361，Blood 1987；70(5)：1577-1583，J.Biol.Chem.1987；262(28)：13835-13841)。结合于胶原的vWF随后通过vWF-Al结构域中的一个表位的依赖于剪切的暴露而将血小板“拴住”，该结构域同血小板的GPIb/IX/V相互作用(Blood 1985；65(1)：85-90，Blood 1985；65(4)：823-831，Br.J.Haematol 1986；63(4)：681-691)。因此，vWF作为胶原和血小板之间的一种桥梁而发挥作用，并且是血小板在流动中同胶原粘合的一个先决条件(J.Lab.Clin.Med.1974；83(2)：296-300)。血小板在vWF周围的转动导致了微弱的粘附，但是还需要胶原和血小板表面的其它受体之间的其它的直接相互作用以辅助持久的血小板粘附、激活和聚集(Thromb.Haemost 1997；78(1)：434-438，Thromb.Haemost 1997；78(1)：439-444)。血小板上的直接胶原受体包括GPVI(Blood 1987；69(6)：1712-1720，Thromb.Haemost 1999；81(5)：782-792，J.Clin.Invest.1989；84(5)：1440-1445)、GP Ia/IIa(α2/β1)(J.Clin.Invest.1989；84(5)：1440-1445，Nature 1985；318(6045)：470-472)以及较少量的GPIV(CD36)(J.Biol.Chem.1989；264(13)：7576-7583)，甚至可能还有p65(J.Clin.Invest.1997；100(3)：514-521)。在缺乏vWF辅助的血小板结合的情况下，这些受体被证明在介导血小板向血流中胶原的募集中过于微弱(Br.J.Haematol 1986；63(4)：681-691)。最后，同纤维蛋白原结合的vWF通过同血小板GP IIb/IIIa的结合辅助了血小板的交联和进一步的激活(J.Clin.Invest.2000；105(6)：783-791)，为形成中的血栓提供了稳定性和强度。
随着血小板GPIIb/IIIa和ADP受体拮抗剂的出现，近年来在抗凝治疗中已经获得了巨大的进步(Coronary Art Dis 1999；10(8)：553-560，J.Am.Coll.Surg.2000；191(1)：76-92)。但是，这些策略并非被设计用于抑制血小板同暴露的胶原纤维的初始粘合，并且尽管GP IIb/IIIa拮抗剂在衰减血小板-血小板间相互作用中具有效力，但血小板仍然粘附于受损的血管壁(Blood 1993；81(5)：1263-1276，Circulation 1995；91(5)：1354-1362)。进一步，血小板的激活几乎肯定延续于聚集和急性血栓形成之外，而亚急性和慢性内膜增生的进展至少部分受到有丝分裂原调节物的影响，例如由激活的血小板释放的血小板源生长因子(PDGF)。事实上，PDGF的抑制已经被证明能在多种动物中降低内膜增生(Science 1991；253(5024)：1129-1132，Circulation 1999；99(25)3292-3299)。
患有急性心肌梗塞的患者体内的循环vWF增加，并且vWF水平同不良的预后正性相关(Circulation 1998；98(4)：294-299)，这暗示了vWF的病理生理意义(Thromb Haemost 2000；84：204-209，Circulation 1998；98(4)：294-299)。体内研究已经进一步显示中和性的抗vWF抗体能抑制实验中的血栓形成，这证实了vWF在血栓形成中的关键性作用(Thromb.Haemost 1998；79(1)：202-210)。进一步，随着不可避免地导致血管壁的损伤和胶原的暴露的血管成形术在急性冠状动脉综合征的用途越来越广泛，对于在血小板粘附-激活-聚集级联中进行尽可能早的药物介入的策略的需求不断增加。
目前用于控制血小板粘附、激活和随后的血栓形成以及内膜增生的两条主要治疗路线是抗血小板药物以及抗血栓给药。尽管诸如阿司匹林这样的药物通过抑制环氧化酶途径而有效地阻断血栓烷A2的合成，但它们不能阻止胶原所诱导的血小板粘附和激活，这可以刺激内膜增生的发展。肝素作为一种抗凝血药物的应用伴随着一些并发症以及限制，这包括某种不可预知的药物反应、对紧密的实验室监控的需要、对抗同血块结合的凝血酶的活性有限、多个抑制位点、对抗凝血酶III的依赖性、大出血的危险以及对连续输注的需求。很明显，一种理想的治疗药物应当产生位点特异性和局部效果而没有全身的影响或者广泛的凝血紊乱。
加速导致血栓形成的级联事件以及随后的内膜增生的关键性步骤为血管损伤处的暴露的内膜下胶原同粘附于该暴露胶原的血小板单层之间的相互作用。因此，一种针对血小板同内膜下胶原粘附的抑制剂可用于阻止或者至少降低血栓和内膜增生的发展。
几种来源于水蛭的物质据报道可抑制胶原-血小板相互作用(Blood 1995；85(3)：705-711，Platelets 2000；11(2)：83-86，J.Biol.Chem.1992；267(10)：6893-6898，J.Biol.Chem.1992；267(10)：6899-6904，Blood Coagul Fibrinolysis 1991，2(1)：179-184)。一种分离自Hirudo medicinalis的具有纤维蛋白解聚活性的肽异构酶，即去稳定化酶，据报道可抑制由包括胶原在内的多种激动剂所诱导的血小板的聚集，但该酶据信可直接同血小板的膜相结合(Platelets 2000；11(2)：83-86)。水蛭抗血小板蛋白(LAPP)为一种来自于Haementeria officeinalis的约13kDa的蛋白，该蛋白抑制血小板在静态条件下(J.Biol.Chem.1992；267(10)：6899-6904，Thromb.Haemost 1999，82(3)：1160-1163)以及在高度流动条件(Arterioscler Thromb.Vasc.Biol.1995，15(9)：1424-1431)下对胶原的粘附，其效应针对vWF和血小板GP Ia/IIa所介导的对胶原的结合(Thromb.Haemost 1999，82(3)：1160-1163)。Calin为一种来自于Hirudo medicinalis的约65kDa的蛋白质，已经发现了该蛋白的简单的活性模式。Calin同样抑制静态或者流动状态下的胶原-血小板相互作用(Blood 1995；85(3)：705-711，Blood Coagul Fibrinolysis 1991，2(1)：179-184，Thromb.Haemost 1999，82(3)：1160-1163)。进一步，LAPP和Calin为胶原所诱导的血小板的聚集的强力抑制剂，它们抑制聚集的浓度同它们阻断vWF同胶原相结合相类似(J.Biol.Chem.1992；267(10)：6893-6898，Blood Coagul Fibrinolysis 1991，2(1)：179-184，Blood 1995，85(3)：712-719)。
LAPP和Calin已经在体内成血栓模型中进行了评估，取得了不完全的成功。LAPP不能在狒狒动静脉分流中降低包被以胶原的植入物上的血栓形成，尽管这些药物的使用抑制了胶原所诱导的血小板聚集(Arterioscler Thromb 1993，13(11)：1593-1601)，而Calin在仓鼠静脉血栓模型中以依赖于剂量的方式抑制血栓的形成(Blood1995，85(3)：712-719)。
用于支架或者导管的非成血栓以及抗成血栓包被物为本领域所已知。非成血栓的包被物和产品基于经修饰和改进的聚合物，其实例在WO9301221和WO9830615中给出。
抗血栓和抗再狭窄包被物一般是生物相容性的包被物，这些物质还可用作为局部药物递送的贮存器。这些包被物主要基于水凝胶，其实例在用于制备各种不同类型的水凝胶和包被药疗设备的方法的专利文献之中，包括WO92111896、WO9811828、WO0147572、EP0887369和WO0139811。
该包被物中所含有的治疗物质的释放特征可通过改变聚合物层的厚度或者选择影响选定的生理化学特性(例如电荷、疏水性、亲水性)的具体的聚合包被物以及/或者通过将该包被物制成不同的层面来进行调节。聚合物选择的标准以及释放速度的最优化为该领域中的普通技术人员所了解。其它包被物由Fischell(Circulation，1996，94：1494-95)、Topol等人(Circulation，1998，98：1802-20)以及McNair等人在device Technology，1996，16-22描述。
支架、线和导管在心血管系统中的使用是一种常见的操作，血管壁的损伤、栓塞和随之的再狭窄是心脏病专家在手术介入或者导管插入过程之中或者之后所关心的主要问题。替代性的方法，诸如动脉内膜切除术，可导致类似的问题。涉及对动脉的操作的每个过程，即，血管手术和血管成形术，它们对于内膜增生的发展较为敏感。用于防止或者降低内膜增生的发展的方法的用处如何强调亦不为过，一种能够做到这些并且不产生全身影响的方法则更为令人振奋。
因此，对于抑制病理生理(例如血小板粘附)中的最早期事件的新的改良药物和方法的需求是很明显的，并且在该领域中的贡献被期望能够极大地降低血管成形术或者手术过程随伴随的发病率和死亡率。
发明概述
大体上，本发明涉及到近来所描述的血小板粘附因子乳清酸向某种管腔内或者其上的位置中或者向该位置上的引入，该管腔位于某种组织内，即，脉管系统或者一种器官，该引入所处的条件使得乳清酸可被局部应用作为一种表面试剂或者作为一种在其表面的粘附性包被物，从而阻止和抑制某种针对损伤的不良的血栓形成和/或者再狭窄反应，该损伤反应于血管成形术、支架、透析植入物和其它血管植入物，还涉及到对良性增生性瘢痕形成的治疗以及对不稳定的动脉粥样硬化性斑的治疗和钝化。
乳清酸为一种新近被描述的(WO0056885)重组12kD蛋白，该蛋白最初分离自一种水蛭。该蛋白抑制血小板同动脉壁胶原在高度剪切条件下的依赖于vWF的结合，并且本发明的一个方面使得乳清酸适于抑制动脉血栓。另一种新的方面是，乳清酸可被用作为损伤位点的一种局部试剂，该试剂具有降低血栓形成和/或内膜增生而不具有任何全身反应的优点。这代表着一种特征，该特征具有特异性和局部化的效应，该特征非常适于外科医生或者介入放射学家等的需求。
乳清酸可同多种治疗剂进行组合以用于定点递送。在冠状动脉中的应用的例子为抗血栓形成剂，如前列环素和水杨酸盐，所述的例子还有溶栓剂，如链激酶、尿激酶、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)以及茴香酰化血纤维蛋白溶酶原-链激酶激活剂复合物(APSAC)，还包括血管扩张剂，即，硝酸盐和钙通道阻断药物，抗增殖剂，即，秋水仙碱和烷化剂，嵌入剂，生长调节因子，例如白细胞介素、转化生长因子-β以及血小板源生长因子同类物、针对生长因子的单克隆抗体，甾族和非甾族的抗炎剂以及其它的可调节血管张力、功能、硬化以及针对受损血管或者器官的愈合反应的试剂。抗生素也可包含在本发明的组合或者包被物中。进一步，一种包被物可被用于实现定位于血管壁内的药物递送。通过活性试剂在可膨胀聚合物中的掺入，该活性试剂应可通过该聚合物的膨胀而被释放。
在一个实施方案中，该包被物由一种水凝胶而制成，例如聚环氧乙烷、白蛋白、亲水的聚异丁烯酸酯和疏水的聚尿烷。
例如，本发明进一步提供了乳清酸及衍生物通过局部药物递送设备/导管或者通过支架以及支架包被物以及血管植入物和植入物包被物技术的用途。本发明还提供了以乳清酸组合物进行给药的方法，该组合物可在某一局部区域随时间稀释出受控量的乳清酸。
特别地，本发明的一个实施方案涉及到基于导管的设备在乳清酸局部递送中的用途。乳清酸乳清酸还可以结合其它治疗剂或者单独使用，它们使用导管从聚合物基质中进入体内组织。对于在本方法中使用的聚合物材料的基本的要求是生物相容性和药物释放特征，这些特征可针对具体的用途进行适配。
乳清酸的局部受控释放可单独通过渗透、离子电渗、电穿孔而达到，或者通过将离子电渗和电穿孔进行组合而用于释放并且将乳清酸有效地掺入血管腔内。在优选的情况下，该导管能够进行一些被设计用于在选定的血管腔内维持高浓度药物的程序以使其提供一种改善的血管包被物，该包被物为单独的乳清酸或者还含有其它的治疗药物。
本发明特别可应用于乳清酸在介入性心脏病学处理过程中以及在其后的局部递送，所述的处理过程如血管成形术和支架植入以及动脉内膜切除术。
发明详述
从多形汉逊氏酵母中表达并分离了用于本发明的适当的重组乳清酸，并且该乳清酸被发现可通过阻断vWF同胶原的结合而发挥活性并且有效地防止了血小板同胶原在高度剪切条件下的粘附。乳清酸剂量依赖性地抑制纯化的人类vWF对人类I型和III型胶原(IC50＝0.23±0.004和0.81±0.04μgml-1)的结合以及对小牛皮肤胶原(IC50＝0.44±0.008μgml-1)的结合。进一步，乳清酸针对人类、啮齿类和猪血浆vWF同这些胶原的结合表现出类似的抑制活力。在高度剪切条件(2700s-1)下的一个流体腔室内，乳清酸剂量依赖性地强效抑制胶原包被表面上的血小板聚集(IC50＝0.96±0.25μgml-1)，但在较低的剪切的情况(1300s-1)下可发现该剂量依赖曲线的右移(IC50＝5.2±1.4μgml-1)。表面等离子共振分析揭示了乳清酸对III型人类胶原的高亲合性和低亲和性结合位点(分别为Kd＝5×10-8M和2×10-6M)，并且尽管在高度剪切下抑制血小板粘附的低浓度(即，高亲和结合位点饱和)乳清酸对于不依赖于vWF的胶原诱导的血小板聚集没有效果，但高浓度(即，低亲和位点饱和)下被发现可抑制血小板聚集。这些数据表明乳清酸为血小板同胶原依赖于vWF的粘附的一种强力抑制剂，这构成了其作为抗血栓剂的疗效的基础。
该研究进一步展示，乳清酸不仅剂量依赖性地强效地抑制vWF同小牛皮肤胶原的结合，而且抑制其同人类I型和III型胶原的结合，这两种胶原均在动脉壁内皮下层含量丰富并且被认为在血小板-血管壁相互作用中十分重要(Thromb Haemost 1997，78(1)：434-438)。由于胶原-vWF-GP Ib/IX/V相互作用仅仅发生在充分的高度剪切情况下，因此本发明的一个重要方面是证明乳清酸不仅在静态条件下具有效力，并且在更加接近于体内所面临的环境中也具有效力。在一种可以改变剪切力以模拟这种环境的流体腔室中，乳清酸明显地抑制了血小板向胶原的聚集，特别是在高度剪切的情况下。低度剪切的结果是剂量反应曲线的右移，这是值得注意的，因为这意味着乳清酸的体内效能可能定位于高度剪切的区域，在该情况下血液层流的打乱是由在血液中内膜表面的变化所导致，例如在动脉粥样硬化斑存在的情况下或者在机械介入之后。
以乳清酸进行的表面等离子共振揭示，胶原可能具有两种独立的乳清酸结合位点，一个具有高亲和性，另一个具有低亲和性。乳清酸对vWF同胶原的结合的抑制可解释为高亲和性位点的饱和，其IC50值为约5×10-8M，即，等于该位点的解离常数。由于胶原所诱导的不依赖于vWF的血小板聚集仅仅在很高剂量乳清酸下被抑制(高于100μM)，看起来低亲和性胶原结合位点相关于直接的胶原-胶原受体相互作用的抑制。
本发明的另一个目标是乳清酸影响经动脉内膜切除处理的血管的局部环境的效果，该影响效果并不需要全身的分布并且并不改变血小板的功能或者改变其凝聚，这使它成为一种理想的用于在血管手术和介入放射性程序过程中的表面应用的药征。
在本发明的这方面中，使用先前所描述的大鼠颈动脉切除术(CEA)模型(J.Vasc.Surg.1998，28：909-918)对乳清酸疗效进行了研究。PLT激活被认为是I H所导致的CEA后血栓形成和再狭窄的初始步骤。经观察，乳清酸在腔室表面的表面应用将减低血小板同经内膜切术的动脉的粘附，并且由此而降低手术后的血栓形成和IH。
概括这些实验结果，在两个不同的手术后时间对乳清酸的抗血小板粘附效果进行的评估表明，在经过乳清酸处理的大鼠体内在颈动脉内膜切除后的3个小时(图4)和24个小时(图5)的粘附血小板数量同对照大鼠相比较明显降低。
血小板粘附在第3个小时时降低了59％(每格64±17.2比155±33.4PLT，P＝0.05)，在第24个小时时降低了77％(每格35±11.3比149±36.6PLT每格，P＝0.0110)。在对照组中，在第3个小时和第24个小时的血小板粘附很接近，但在经乳清酸处理的组中，所述的两个时间的血小板粘附从每格64个血小板降至每格35个血小板。
图6和图7显示的是使用扫描电镜在2000×放大下观察的在具有和不具有表面的乳清酸的情况下颈动脉内膜切除表面的典型代表。图6A显示的是在颈动脉内膜切除后3个小时的对照表面，注意所标记的细胞物质纤维蛋白链、大量的红细胞以及大量的血小板的明显富集。图6B显示的是在颈动脉内膜切除后3个小时的乳清酸处理表面。注意细胞成分的缺乏以及近乎空白的胶原表面。图7A显示的是在颈动脉内膜切除后24个小时的对照表面，血小板作为小白点十分明显。图7A显示的是在颈动脉内膜切除后24个小时的乳清酸处理表面。经乳清酸处理后的血小板粘附明显减少了。
在颈动脉内膜切除术后的乳清酸表面应用同对照组相比较明显地降低了内膜增生的发展。度量I H所用的腔狭窄百分比经应用乳清酸后同对照相比明显降低。这种IH形成的降低同PLT粘附的抑制相对应。对于腔狭窄，对照大鼠为29.8±6.8％，p＝0.0042的腔狭窄，而在经乳清酸处理的组中为10.9±1.8％的腔狭窄(图6)。经乳清酸处理的大鼠的腔直径高出对照大鼠18.9％。在颈动脉内膜切除术后2周，15只对照大鼠中的5只(15％)经组织学分析出现了颈动脉的完全血栓，而15只经乳清酸处理的大鼠中无一产生颈动脉血栓。可能性Chi平方分析显示可能性比为16.238，这说明对照组发生阻塞性血栓形成的可能性高出经乳清酸处理的大鼠16倍，P＝0.0156。
在乳清酸组中，沿着动脉缝合线未遇到出血增加的现象。在动脉内膜切除术后3和24小时，同对照大鼠相比较在经乳清酸处理的大鼠体内未发现出血时间和全身血小板计数的变化。
CEA模型很接近地模拟了人类CEA手术，因此其结果提出了一种机制，该机制针对在不影响血小板系统功能或者减弱止血效果的情况下减少血小板在动脉内膜切除位点的粘附和聚集的不良影响的降低。乳清酸在大鼠CEA中的简单表面应用降低了血小板的粘附、聚集以及随后的由于内膜增生所导致的颈动脉床再狭窄。
表3所示为出血时间和血小板计数的结果。在手术前和手术后的出血时间上未观察到明显的统计学变化。在乳清酸和对照大鼠之间未发现到血小板计数在统计学上有显著的变化。
我们已经证明了在类似于动脉内膜切除术的血管损伤中血小板粘附和聚集有明显的降低。这种降低的血小板粘附在动脉内膜切除术之后立即(3小时)可见，在24小时后也可见到。在24小时的效果很有意义，这是因为我们相信这种效果并非由于乳清酸在胶原上的直接抑制效应所造成(乳清酸的血浆半衰期是90分钟)，而是由于对血小板聚集的初始抑制以及随后对血小板激活级联的破坏所导致。一旦血小板经初始抑制而不粘附于暴露的胶原，该血小板级联则无以为继。图4和图5表明乳清酸在新近受损的血管上的表面应用可以在很大程度上抑制了血小板的粘附。在第3和第24小时时乳清酸分别抑制了血小板粘附的60％和75％。这种抑制从在第3和第24小时对照组和乳清酸处理的动脉之间在细胞成分沉积上的明显差异可以看出(图7和8)。我们所提出的这种细胞反应上的缺乏是由于血小板粘附的抑制所造成。这是一种独特的治疗模型，该治疗用于抑制血小板对受损血管的粘附。在颈动脉内膜切除术后2星期，同经乳清酸处理的大鼠相比对照大鼠具有明显减少的管腔直径(图9)。在经乳清酸处理的大鼠体内，内膜增生的发展量明显降低，这同血小板粘附和聚集的降低相对应。同血小板粘附的减少相关的内膜增生和血栓形成的减少的发现提供了血小板粘附降低的临床上实质性的终点以及结果。这表明对血小板聚集和粘附的位点特异性的非全身抑制导致了血栓形成和阻塞率的降低，因此而降低了颈动脉内膜切除术后相关的脑血管事件的发生率。内膜增生的水平和管腔狭窄的改善由一个明显的发现进一步证明，该发现为在经乳清酸处理的大鼠体内血栓形成率有所降低。占全体33％的对照大鼠表现出血形成，而经乳清酸处理的颈动脉无一形成血栓。该药物缺乏全身效果具有特别的临床意义。乳清酸的局部应用并不影响全身出血时间或血小板计数。这暗示血小板粘附和随后的血栓形成以及内膜增生的减少是局部效应的结果。这些涉及乳清酸的新的发现特别地重要，这是因为对于能够局部地抑制血小板粘附和激活的不良效应而不干扰全身的止血机制的模式，其临床用途范围十分广泛。
先前已经指出，多种治疗性介入所诱导的局部损伤在理想的情况下应立即接受局部的处理。余留未经处理的受损细胞启动了一系列的进程，这些进程涉及到凝血、补体激活以及针对细胞因子的释放的细胞反应、增生的诱导以及其它的生物活性进程。这些复杂的、相互关联的进程一旦开始则终止十分困难。
因此，本发明的一个重要方面是将乳清酸直接定位于经受操作的组织。该局部应用的另一个方面是最小化了涉及到用于介入的药物的全身作用的潜在问题。
在理想的情况下乳清酸处理可以与适当的治疗介入同步进行给予，这可以通过将乳清酸掺入诸如球囊导管这样的手术设备或者其它设备或其一部分的包被物中来完成。另一个方面还涉及到以乳清酸进行的对受损血管的直接包被。
另外，普通的乳清酸递送方式也可被用于该发明，例如游离的流体形式，包括同其它的治疗药物组合应用。但是，聚合物/水凝胶基质与游离流体递送相比具有特别的优势。已被掺入聚合物基质的试剂的递送并不需要在支持导管中具有额外的腔以将游离流体药物溶液运入或者运出处理部位。
另外，该聚合物基质消除了药物溶液的下游渗漏的危险，该危险是由球囊在血管节段的密封缺陷所导致，这样就避免了将非靶定组织暴露于高浓度的药物的危险。
用在治疗设备上或者将之作为包被物将乳清酸局部应用于受损血管的常用技术方案的例子是将乳清酸掺入聚合物或者水凝胶包被物中。
关于聚合物组合物，此处使用的术语“水凝胶”包括具有不同大小和容量的微孔或者间隙的合成聚合物，这些聚合物具有不同的生理化学性质，特别是凝胶基质的电荷或者亲水/疏水特性，这些性质可在制造包被物或者被包被的设备时被引入。多种合成的高弹体和天然的聚合物材料为该领域的技术人员所已知。乳清酸可在聚合物生产时被掺入基质，或者在对该聚合物进行包被或者成形时为所需形状时被添加入。另外，多种不同聚合物材料和制造方法可被用于本发明的聚合物基质。适当的聚合物材料的或者聚合物材料的组合的例子包括生物相容性和/或可生物降解的聚合物，但不限于此。
多种烷基烷基和氰基丙烯酸酯已被研究用于外科应用，并且一些异丁基氰基丙烯酸酯已被发现特别地适用。
典型的水凝胶聚合物可由单体混合物进行制造，该混合物含有40-60重量份的羟烷基烷基丙烯酸酯的某种纯化的单酯，该单酯具有一个烯双键，该混合物还含有40-60重量份的具有一个烯双键的甲基丙烯酸单体以及0.001-5重量份的聚合引发剂。聚合可通过传统的大规模聚合、溶液聚合、悬浮物聚合或者乳剂聚合工艺来完成。所使用的聚合工艺根据所需的聚合物体积以及所制造的最终产物的性质来决定。一种典型的水凝胶产物可通过单酯和甲基丙烯酸单体的摩尔比进行描述，该比例在1∶1到2.3∶1，在优选的情况下为1.5∶1，其中该聚合物的孔直径大于90埃。
作为具有一个烯双键的羟烷基甲基丙烯酸酯的单酯，可接受的化合物包括，但不限于2-羟乙基甲基丙烯酸酯、甘油基甲基丙烯酸酯、2-羟丙基甲基丙烯酸酯、缩水甘油基甲基丙烯酸酯、2-羟乙基丙烯酸酯和2-羟丙基丙烯酸酯。可接受的甲基丙烯酸单体为甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺5以及甲基丙烯酸腈。
聚合引发剂可根据聚合方法或者该聚合物的最终应用目的来决定。例如，当该聚合物用于形成某种固体时可使用自由基引发剂。
这种类型的优选的引发剂包括双官能的聚酯，如2，5-二甲基-2，5-双(2乙基己基过氧)己烷或者叔丁基过氧新戊酸酯。在替代情况下，当该聚合物以单体混合形式使用并在原位进行聚合最终被作为一种包被物时，该引发剂可为放射活化，例如UV催化剂2，2偶氮双(2-甲基丙腈)或者偶氮双丁腈(AIBN)。该引发剂并不限于应用于特定的聚合方法或者特定的终产物。例如，自由基引发剂可被应用于包被物，并且放射活化引发剂可被用于固体颗粒的形成。
除了基本上类似的单酯和甲基丙烯酸单体成分之外，该单体混合物可由痕量的较长链烷基丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯共聚单体进行增强，如环己基甲基丙烯酸、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或者乙二醇二甲基丙烯酸酯。这样的额外的共聚单体在需要提高聚合物强度的情况下增强了聚合物的交联。痕量的这些共聚单体通常低于单体混合物总重量的0.1％。
在本发明中所使用的水凝胶聚合物可经成形以产生一种制品，该制品通过内在活动进行交联，这样所产生的制品不需要额外的交联单体。
可生物降解的聚合物的其它例子为聚丙交酯、聚乙醇酸交酯、聚酐、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及这些化合物的共聚物和聚乙二醇。这些化合物可形成共聚物水凝胶或者交联聚合物网状物，聚合期间在其中可掺入用于增强的局部递送的药物，对于某些水凝胶可将药物在聚合后装入。根据药物的分子性质可对优选的基质进行调整以控制向外的自由扩散。
包被以乳清酸的多种类型的导管和其它治疗设备可根据它们经设计所面向的治疗需求，或者根据用于局部递送装载有乳清酸的聚合物的更为具体的目的来进行构建和使用；本发明已经通过名为Bluemedical Devices BV GO的球囊导管进行了测试，该设备来自Bulemedical，但并不限于该型导管。
进一步的例子
实施例1
纯化的vWF和血小板与胶原在静态条件下的结合
在微量滴定板中对结合于胶原的vWF进行了研究，该研究主要根据其它描述(Blood 1995，85(3)：709-711)。以多种胶原，人类I型、III型胶原或者小牛皮肤胶原(Sigma)进行过夜包被，该包被通过将以125μg ml-1溶解于50mM乙酸的50μl胶原加至96孔微量滴定板中的200μl PBS内，以此促进复性。在以BSA封闭非包被位点之后，将纯化的人类vWF(对于以小牛皮肤和I型胶原包被的板为1.25μgml-1；对于以III型胶原包被的板为0.625μgml-1)或者稀释的普通血浆(人类血浆：对于I和III型胶原为1/80；对于I型和小牛皮肤胶原为1/40；仓鼠、小鼠和猪血浆：对于III型胶原为1/80；对于I型胶原和小牛皮肤胶原为1/20)在存在乳清酸的情况下加至孔中并且孵育2小时(稀释的血浆)或者1小时(纯化的vWF)。在进一步的洗涤步骤之后使用兔抗vWF抗血清(Dako，Copenhagen，Denmark)测定残存的vWF同胶原的结合，该抗血清偶联以辣根过氧化物酶，进行显色后在492nm下测定所产生的光吸收。
当以人类I型胶原、人类III型胶原或者小牛皮肤胶原对微滴度板进行预孵育时，纯化的vWF在存在乳清酸的情况下进行的随后孵育伴随着vWF-胶原结合的剂量依赖性抑制，其IC50值分别为0.23±0.004、0.81±0.04以及0.44±0.008μg ml-1(图1)。当以稀释的普通人类血浆代替纯化的vWF时维持了乳清酸的这种抑制能力(表1)。乳清酸还抑制了vWF在稀释的猪、仓鼠和鼠类血浆中与不同的被测胶原的结合，其对I型胶原具有一致的最高效力(表1)。
实施例2
血小板在高度剪切下的粘附
根据剪切力在控制血小板与胶原之间的依赖于vWF的粘附中具有重要作用的观点(J.Lab.Clin.Med.1974，83(2)：296-300)，进行了流体腔室灌注研究以检测乳清酸在类似于受损或者病变动脉所遇到的流动条件下的抑制活性。如前所述(Blood 1995，85(3)：709-711)，将小牛皮肤胶原包被于塑料盖玻片之上。灌注在具有两个盖玻片支持物的平行板灌注腔中进行，该腔高0.4、0.6或者1.0mm，宽1.0cm，处于剪切速率分别约为2700、1300和300s-1的脉冲流之中(roller pump，Watson Marlow 603S，VEL，Leuven，Belgium)。以经抗凝处理的全血(0.2IU ml-1低分子量肝素，Clexane)对经胶原包被的盖玻片灌注5分钟，随后以Grünwald-Giemsa对经漂洗的盖玻片进行染色并且根据描述(Blood 1995，85(3)：709-711)通过光学显微镜和成像分析估测血小板沉积，该估测使用表面覆盖率作为定量参数。
在2700s-1的剪切速率下，乳清酸根据其剂量而抑制血小板粘附，其IC50＝0.96±0.25μg ml-1(图2)。但是，在1300s-1的较为温和剪切速率下观察到了剂量反应曲线的明显右移，其IC50＝5.2±1.4μg ml-1(图2)。在300s-1的静脉剪切速率下，乳清酸在高达10μg ml-1下不能抑制所灌注的血小板的粘附(数据未示出)。
实施例3
通过表面等离子共振(SPR)进行的结合分析
使用一种BIAcore 3000设备(BIAcore，Freiburg，Germany)通过SPR对蛋白质的相互作用进行了鉴定和性质测定。根据供应商所开发的方案使用偶联试剂。同CM5传感器芯片的偶联通过激活的羧基同人类III型胶原(Sigma)的游离氨基之间进行。pH监测和偶联化学在标准条件下进行(Anal Biochem.1991，198(2)：268-277，JAIPressLtd.，1992)。为进行偶联，将该胶原在10mM乙酸缓冲液(pH4.5)中稀释至0.125μg ml-1，这产生了331共振单位(RU)的固定化材料。该基质被用于研究纯化的重组乳清酸的结合，该乳清酸被稀释入20mM Hepes(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.005％Tween20。所有的结合实验均在20℃下进行。以乳清酸进行的滴定在浓度范围从7.8nM到10μM之间。根据以下方程对所产生的实验RU平台值进行作图：
Req/乳清酸浓度＝(-KA×Req)+(KA×Rmax)
乳清酸对固定化的胶原表面进行的滴定产生了依赖于浓度的结合。进一步，与胶原结合的乳清酸的最高量所产生的信号高于1∶1结合模型的计算最大值。该结果指出在III型胶原上存在多于一个乳清酸结合位点，这进一步为一个观察所证实，该观察发现将数据对根据Langmuir的1∶1结合模型进行拟合给不出满意的结果。
对SPR数据进行的Scatchard分析表明了两个不同的结合位点的存在(图3)，这两个位点对于乳清酸具有显著差异的亲和性。平衡常数的计算结果是对于高亲和性位点解离常数为5×10-8M，对于低亲和性位点解离常数为2×10-6M。
实施例4
血小板聚集
乳清酸对血小板功能的特异性通过使用胶原、ADP、瑞斯西丁素、花生四烯酸或者血栓烷模拟物U46619作为激动剂在富含血小板的血浆中进行聚集研究来估测。将来自未用药的健康志愿者的柠檬酸处理的血液(3.13％)进行离心(15分钟，100g)以获得富含血小板的血浆，在诱导血小板聚集之前1分钟加入乳清酸(终浓度为0-200μgml-1)，该诱导以胶原(0.5μgml-1)、ADP(2.5μM)、瑞斯西丁素(0.9μgml-1)、花生四烯酸(1.0mM)或者U46619(1.3μM)进行。对于各激动剂，在5分钟期间均观察到了最大聚集(幅度)。
乳清酸在终浓度高达40μgml-1的情况下仍不能抑制针对包括胶原在内的各种被测激动剂的最大聚集(表2)。然而，乳清酸能够在100μgml-1的情况下部分地抑制胶原所诱导的血小板聚集(未示出)，在200μgml-1的情况下完全抑制，而由ADP诱导的聚集则不受影响，甚至在200μgml-1的乳清酸的情况下亦是如此。
实施例5
大鼠CEA模型
使用了一种大鼠CEA模型，该模型使用了以动脉切开术进行的开放技术、内膜和部分中膜的直接去除以及动脉的缝合。一组大鼠接受了乳清酸而另一组大鼠作为对照。终点测量包括，1)PLT粘附，2)成血栓速率，3)内膜增生的发展。在缝合前乳清酸被直接应用于经动脉内膜切除的颈动脉表面。经制备的颈动脉电子显微照片(2000×放大)被用于PLT聚集的定量分析。使用一种标准化的覆盖网格计算总PLT数量。通过对经弹性蛋白染色的颈动脉切片进行计算机辅助的形态分析以及IH区域的直接测量来测定IH和血栓形成。
实施例6
颈动脉内膜切除术
以异氟醚在钟形皿中镇静小鼠，称重并且随后以氯胺酮(100mg/kg)以及乙酰丙嗪(1mg/kg)的组合进行腹膜内麻醉。根据对后爪刺激缺乏反应来确认充分的麻醉之后，将4cc的生理盐水进行在后背中上部区域进行皮下注射以作为液体药剂(10cc/kg)来补偿手术内血液的损失。随后在颈部区域剃毛并以7％的异丙醇进行备皮。使用无菌技术和解剖显微镜(×40，sz4001ympus，Olympus America Inc.，Melville，NY)产生一个中线颈部切口。将表层肌肉分开并将切割进行至右侧颈动脉水平。将该区域中的颈神经分离以保护咽功能并且防止手术后的呼吸损害。
在颈动脉充分暴露之后，使用3-0丝线止血带进行对约1.5cm远的分叉处的近端和远端控制。使用一个角膜刀进行了一处动脉切开并且用微型剪将之扩展至长6mm。使用一个27号针头以两条相距约2mm的平行线在血管内膜上横向刻痕。以微型镊子除去内膜和中膜层。乳清酸组的大鼠接受了5μl的乳清酸溶液，该溶液被直接应用于经过动脉内膜切除处理的表面。以running 10-0单丝尼龙缝合线(MS/9，Ethilon，Ethicon Inc.，Somerville，NJ)从远侧端开始将该动脉切口封闭。首先除去远端的止血带以估测缝合沿线的止血程度，随后除去近端的止血带。施用乳清酸的时间为5分钟，该时间为动脉闭合的时间。以无菌药棉敷药器轻轻填压缝合沿线的出血处直至达到止血。以便携多普勒仪估测颈动脉内膜切除的颈动脉以证实其开放性。随后以running 3-0可吸收缝合线缝合表层肌肉和皮肤。
实施例7
血小板粘附
在血小板粘附亚组中，在颈动脉内膜切除后3小时或者24小时将大鼠重新麻醉并且收集经动脉内膜切除处理的颈动脉并将其在4％的glutaldehyde溶液中固定。在收集过程中，沿着缝合位置将颈动脉纵向打开，由此而暴露经过动脉内膜切除的区域。随后以四氧化锇对动脉进行后固定，在级进醇系列(graded alcohol series)中脱水，以CO2进行临界点干燥(1072psi和31.1℃)，以金钯包被，并将之置于扫描电镜中(JEOL JSM 5410，JEOL，USA Peabody，MA)。在2000×放大倍数下扫描经动脉内膜切除的区域并且获取照片。匹配这些照片图像并将之排列于一幅拼贴图中以进行对一个区域的可视化处理，该区域大于扫描电镜的监视器的单视野。一旦组成照片的拼贴图便以一个透明的覆盖网格将其覆盖。对所有标本的照片使用同一个覆盖网格。使用116个方块以计算各张照片中的血小板总数。116是在所有的照片拼贴图中可被一致计数的最大方块数。由两名相互隔离的观察者来进行血小板计数。
实施例8
内膜增生
在颈动脉内膜切除两周后，将内膜增生组中的大鼠麻醉并且暴露经动脉内膜切除的颈动脉。沿中线打开腹部并且暴露远端主动脉和下腔静脉。横切该静脉腔并将20号导管插入远端主动脉以灌注100毫米汞柱的生理盐水直至该静脉腔流出物流尽。下一步，将相同体积的10％的缓冲福尔马林以100毫米汞柱进行灌注以完成灌注-固定工艺。将受操作的颈动脉切除一个一厘米的片段并且置于10％的福尔马林中至进一步的组织学处理。该动脉经石蜡封闭、切片、并且以Verhoeff’s和Van Gieson’s染液进行弹性蛋白染色。以3毫米的间隔切取多个切片以使切片区域标准化，各个切片沿连着10-0尼龙缝合动脉切口的封闭处。使用KODAK DC 120 Zoom数码相机(Eastman KODAK Company，Rochester，NY)对弹性蛋白染色的切片进行照相。任何形成血栓的切片均在此时注出。未形成血栓的图像被下载至一台计算机并且使用National Institute of Health(Bethesda，MD)的ImageJ Software程序0.99i版对颈动脉的管腔面积进行分析。该软件包使我们勾绘出内膜增生的内部面积并且由此而完成对血管腔的横切面的精确测量。同样对内膜增生的外部面积进行测定。测定这两个面积之间的差异(内膜增生的外部面积减去实际管腔)以作为内膜增生的绝对面积。由于动脉的横切面具有各自不同的形状，所以该值以内膜增生的绝对面积同内膜增生的外部界限的比例来表示，并且以管腔狭窄百分比进行报道。该比例代表了该管腔面积被内膜增生所占据的比例并且可进行对不同大小的动脉横切片之间的比较(4)。在两名相互隔离的观察者之间观察到了测量值之间的最小变异。
实施例9
出血时间和血小板计数
为估测乳清酸对于全身血小板计数和出血时间的影响，对12只大鼠的血小板计数和出血时间进行了测定。如果有必要从各只大鼠中获取约1-1.5cc的手术前血样，这是大鼠总血量的相当大的一部分。有鉴于此，可以预期在手术后对照组和乳清酸组大鼠的血小板计数应有所减低。为估测乳清酸对血小板计数的影响，我们通过从手术后血小板计数中减去手术前血小板计数以获得差值来测定各大鼠在血小板计数上的差异。使用一个2×2的系数排列ANOVA模型以分析血小板计数的差异。该分析显示在对照组和乳清酸处理大鼠之间的血小板计数差异上没有统计学意义。所有的大鼠均在手术前接受了血小板计数和出血时间测定。六只大鼠进行了颈动脉内膜切除术并且在手术后3个小时进行收集同时测定出血时间和血小板计数，剩下的6只大鼠在手术后24小时进行收集同时测定出血时间和血小板计数。各时间组中有3只接受了表面乳清酸处理，其余3只作为对照。
通过在大鼠尾部末端2mm处进行横切并将约4厘米的尾部浸入37℃的磷酸缓冲液来测定出血时间。测定从尾部横切直至出血停止所耗的时间并作为出血时间。通过从颈静脉取1-1.5cc的血样来测定血小板计数，该血样在Coulter STKS血液分析仪中进行分析，以×103的方式表达结果。
实施例10
统计方法
所报道的为平均值±误差。使用StatView程序(SAS InstituteInc.Cary，NC 27513)5.0版进行非成对t检验分析以比较乳清酸处理和对照组的粘附血小板数量、管腔狭窄百分比和出血时间。使用可能性Chi平方分析以估测在颈动脉内膜切除术后2周的血栓形成发生的几率。使用一个2×2的系数排列来处理ANOVA模型以估测手术前和手术后血小板计数的差异。
实施例11
实验动物
根据两个主要目标将Sprague-Dawley大鼠(350-400g)编入颈动脉内膜切除组中。1)血小板粘附的评估以及2)对由于内膜增生所造成的管腔狭窄以及成血栓速率的评估。大鼠以这两个目标分成对照组和乳清酸处理动物组。所有的大鼠均进行了颈动脉内膜切除术(见下文)，乳清酸处理组大鼠在除去内膜/中膜之后立即接受了5μl乳清酸溶液在颈动脉管腔表面的表面施用。血小板粘附组包括在颈动脉内膜切除术后3个小时(n＝17)和24个小时(n＝19)的电子显微评估。内膜增生组(n＝25)在进行颈动脉内膜切除术后两周进行收集。
实施例12
乳清酸包被的水凝胶导管的制备
基于PA-12材料的表面已经通过将该设备浸没入一种溶液而激活，该溶液含2mol-％的大分子引发剂(聚(十八烯-alt-马来乙酸酐))以及溶于异丙醇的过酸酯(11-16mol-％)和0.5mol二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)/1mol大分子引发剂。在对大分子引发剂-/EGDMA包被物进行干燥后，在120℃下将该包被物退火5个重复10分钟(5bis10min)，这有助于提高该大分子引发剂在表面的固定程度由此而改善了交联。
为最优化包被条件而使用了产生于PA-12载体片的水凝胶包被物。在包被之前，以异丙醇或者丙酮洗涤该片并进行干燥。
由Vestamid(PA-12)组成的Blue Medical Devises GO型球囊导管(RX PTCA导管)被用于水凝胶包被。将100ml的5mol-％丙烯酸水溶液和0.2∶0.8mol-％的亚甲基∶丙烯酸进行混合并且用于包被这些片或者导管。在聚合化之后以水洗涤该包被设备并且在PBS缓冲液中再放置24小时。
此后，将该聚合物在60-80℃的烘箱中退火0.5到3个小时。
干燥的水凝胶包被物的厚度在1到4μm之间，水凝胶在水溶液中的膨胀度为10到50g水凝胶湿重/1g水凝胶干重。
当浸没于pH7.4的PBS缓冲乳清酸溶液时(30分钟)，所使用的浓度为50μg/ml。
有机溶剂被用于制备该包被物溶液，此时使用标准的小规模喷雾包被装置将之喷洒于球囊导管之上，该装置可购自EFD。
附图说明
图1.乳清酸对于纯化的人类vWF与人类I型(圆形)和III型(方形)胶原以及小牛皮肤胶原(三角形)的结合的影响。对I型的IC50＝0.23±0.004μgml-1，对III型的IC50＝0.81±0.04μgml-1，对小牛皮肤胶原的IC50＝0.44±0.008μgml-1。
图2.剪切力对于乳清酸在体外流动腔室内对血小板在人类III型胶原上形成聚集的抑制的影响。圆形所示为2700s-1的剪切速率(IC50＝0.96±0.25μgml-1)，而方形所示为1300s-1的剪切速率(IC50＝5.2±1.4μgml-1)。
图3.对表面等离子共振所检测出的乳清酸同固定化的人类胶原的结合的Scatchard分析，显示了在III型胶原上存在高亲和性(Kd＝5×10-8M，实线)以及低亲和性(Kd=2×10-6M，虚线)乳清酸结合位点。
图4.在颈动脉内膜切除后3小时同暴露的内皮下层表面粘附的血小板数量，比较乳清酸施用组(n＝7)和对照组(n＝10)。数据为平均值±SE。乳清酸组接受了5μl的乳清酸溶液向暴露的内皮下表面的表面施用。星号所示为0.05的P值。
图5.在颈动脉内膜切除后24小时同暴露的内皮下层表面粘附的血小板数量，比较乳清酸施用组(n＝9)和对照组(n＝10)。数据为平均值±SE。使用扫描电子显微镜对血小板进行计数。乳清酸组接受了5μl的乳清酸溶液向暴露的内皮下表面的表面施用。星号所示为0.01的P值。
图6.在颈动脉内膜切除后3小时的经内膜切除的大鼠颈动脉电子显微照片(2000×)。A，对照表面。B，接受表面乳清酸(5μl)的表面。对照表面显示出大量的细胞成分，包括纤维蛋白链、红细胞和血小板。经乳清酸处理的表面显示出细胞成分的明显减少。
图7.在颈动脉内膜切除后24小时的经内膜切除的大鼠颈动脉电子显微照片(2000×)。A，对照表面。B，接受表面乳清酸(5μl)的表面。对照表面显示出大量的红细胞和血小板。经乳清酸处理的表面显示出血小板粘附的明显减少。
图8.在颈动脉内膜切除后两周的继发于内膜增生的管腔狭窄百分比。所示为乳清酸(n＝15)和对照组(n＝10)。乳清酸组接受了5μl的乳清酸溶液向暴露的内皮下表面的表面施用。星号所示为0.004的P值。
图9.通过颈动脉的横切片，该图显示，同未经处理的对照组(A)相比较，在乳清酸处理过的动脉中(B)的内膜增生的降低。IH＝内膜增生。
表1.用于抑制血小板在来自于多种物种的PRP中同人类I型和III型胶原以及小牛皮肤胶原的粘附所必需的乳清酸的IC50浓度。
表2.乳清酸对于PRP中的由多种激动剂诱导的最大血小板聚集(％)的影响，显示了这些试剂的终浓度。
表3.手术前和手术后的出血时间和血小板计数。
表1
  血浆来源             乳清酸IC50(μg ml-1)
   I型胶原   III型胶原 小牛皮肤胶原
    人     0.2     0.9     0.3
    猪     0.2     0.5     0.5
    仓鼠     0.4     n.t.     7.0
    小鼠     0.1     0.6     0.3
表2
激动剂             在所示的乳清酸浓度(μgml-1)时的聚集(％)
    0    10    20    40     200
  胶原(0.5μgml-1)     62    67    63    64     0
  ADP(2.5μM)     66    64    69    82     88
  瑞斯西丁素(0.9mg ml-1)     61    67    75    63     n.t.
  花生四烯酸(1.0mM)     66    66    67    57     n.t.
   U46619(1.0μM)     66    65    57    56     n.t.
表3
    时间    条件       血小板计数        出血时间
   手术前    对照     752±36.05×103     11.9±.91分钟
   手术前    乳清酸     829±33.85×103     8.6±.62分钟
   3小时    对照     604±34.2×103     10.8±.9分钟
   3小时    乳清酸     590±76×103     9.1±.5分钟
   24小时    对照     694±117×103     12.9±1.1分钟
   24小时    乳清酸     729±19×103     11.5±1.3分钟

Claims (10)

1.多肽乳清酸在制造一种药物中的用途，该药物用于在血管损伤或者动脉内膜切除术之后抑制血小板的聚集，该用途包括以一种治疗有效量的防止血小板粘附的乳清酸对血管组织进行给药，由此而抑制血栓形成以及再狭窄。
2.权利要求1的方法的用途，其中该血管损伤相关于动脉粥样硬化、心脏移植血管病变、冠状动脉介入后的冠状动脉再狭窄、球囊血管成形术、支架置入、旋切术、包括颈动脉内膜切除术在内的动脉内膜切除术，透析植入分流器以及其它移植物吻合、不稳定心绞痛、急性心肌梗塞、中风、良性增生或良性前列腺增生。
3.具有覆盖以水凝胶的表面和与包被物相关的用于提供一种抗血栓发生表面的工具的设备，该水凝胶掺入了一定量的生物活性的乳清酸以用于从该水凝胶中的局部递送。
4.权利要求1的方法的用途，其中该乳清酸通过一种导管进行局部递送，或者其中该乳清酸被掺入导管的腔内铺面，该导管直接地局部导向组织。
5.权利要求1的方法的用途，其中该乳清酸被掺入一种局部给药的聚合物，该聚合物允许了乳清酸的局部持续释放。
6.权利要求5的方法的用途，其中该聚合物制剂化的乳清酸通过一种导管进行局部给药。
7.一种导管设备，其特征在于一种聚合物材料为该设备的一部分并且含有乳清酸。
8.权利要求1的方法的用途，其中乳清酸被掺入一种支架或者支架的包被物，该支架被局部置于该组织内或组织上。
9.权利要求1的方法的用途，其中乳清酸被掺入一种血管内移植物或者一种血管内移植物的包被物，该血管内移植物被局部置于该组织内或组织上。
10.一种包含权利要求1-9任意一项的试剂盒。
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