CN1475135A - 虾饲料添加剂 - Google Patents

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    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Abstract

本发明的主要涉及水产养殖业中所使用的虾饲料添加剂。本发明提供了一种生产包含酵母细胞的生物组合物的方法，所述的酵母细胞具有改善养殖虾类免疫功能的作用。本发明还涉及该生物组合物的生产方法，及将其作为饲料添加剂的使用方法。

Description

虾饲料添加剂
                    1.发明领域
本发明涉及包含酵母细胞的生物组合物，所述的酵母细胞具有能提高养殖虾群的免疫功能的作用。本发明还同时涉及该生物组合物的生产方法及作为饲料添加剂的使用方法。
                    2.背景技术
在水产养殖业高速发展的同时，越来越多的感染性及非感染性疾病也随之而来，从而使得水产养殖业的产量大大下降。随着孵化密度及产量的提高，孵化池中的真菌(如链壶菌属(Lagenidium)、高壶菌属(Sirolpidium))、细菌(如弧菌(Vibrio)、气单孢菌(Aeromonas))甚至病毒(如杆状病毒(Baculovirus))感染也越来越常见。这对水生动物的影响包括对易感因素易感性的增高、抗病能力的下降、以及生长速度的减缓。许多引起这些感染的病原体都是全球性分布的，在世界主要水产养殖地区如日本、韩国、台湾、菲律宾、印度尼西亚、泰国、马来西亚、印度、加勒比海地区、巴西、墨西哥、巴拿马、厄瓜多尔、哥伦比亚、美国、以及澳大利亚等都已有所发现。
这些问题的产生主要是由于缺乏类似在陆生养殖业中广泛使用的卫生步骤，以及对养殖系统控制不足引起的，这主要包括了对消毒过程、常规排空措施、每个容器的独立设备以及各自独立的成熟、产卵、孵化间等的控制。
尽管抗真菌药如氟乐灵(trifluralin)、孔雀绿(Malachite green)以及抗生素的使用也有一定的成效，但是在生产过程中每6到8周就必须将虾池排空一次以除去逐渐耐药的菌株这一措施对生产仍具有极大的破坏性。
自二十世纪四十年代以来，陆生动物的饲料中就已经开始加入抗生素了。其目的主要在于治疗患病动物、预防在同一封闭畜棚或鸡舍饲养的动物被感染、以及加快动物的生长速度。农民通过每天在饲料中加入小剂量抗生素以使得家畜/禽保持健康。抗生素还同时提高了动物对营养成分的吸收，在减少饲料的同时加快生长速度，因而也大大提高了利润。这在密集养殖业中的好处尤为明显。但是，在水产养殖，尤其是开放性设备中预防性使用抗生素却不太可行。更为重要的是，抗生素的使用可能会促使耐药微生物的产生。
正是出于这种对产生耐药微生物的忧虑，美国及欧盟的管理机构已经开始禁止或打算禁止在动物饲料中添加某些作为生长促进剂使用的抗生素。然而，随着水产养殖业所占比例的提高以及养殖密度的增加，找出一种能够减少水生动物感染性疾病发生的替代方法已经迫在眉睫。本项发明，即通过使用经特殊处理的酵母细胞来提高水生动物的免疫功能，就不失为一种解决之道。
将酵母作为营养成分加入到水产养殖的饲料中在过去早已有过记载。现举例如下：
美国专利号第3,923,279号：由海生或嗜盐酵母(球拟酵母属，红酵母，酵母属)组成的水产养殖饲料，这些酵母是在含有废糖蜜和一种无机氮化合物的海水中培养出来的。
美国专利号第5,047,250号所公开的将面包酵母和鱼油混合加热至80℃，制造出可以直接用于喂养鱼苗、贝类及软体动物的饲料的生产方法。
美国专利号第5,158,788号所公开的将酵母细胞的外壁用化学物质或酶水解，使其更易被软体动物、甲壳类动物及其幼体消化的饲料生产方法。
申请人在此引用上述材料并非意味着本项发明与上述任何一种已有的生产工艺相关，也不意味着上述材料对于本项发明的权利要求书能否取得专利具有决定性的影响。申请人所引用的所有内容，包括声明日期或方法描述及材料内容都是基于申请人能够得到的信息总结而来的，申请人并不对上述材料的声明日期或内容的正确性负责。
                    3.发明内容
本项发明涉及一种能够作为饲料成分的生物组合物。该生物组合物能减少养殖虾类感染性疾病的发病率。
在一个实施方案中，本项发明提供了包含大量活酵母细胞的生物组合物，所述的酵母细胞经养殖虾类摄取后可以提高其免疫功能，并/或减少感染性疾病的发病率。在另一个实施方案中，本项发明提供了所述的生物组合物的生产方法，以及将其作为保持养殖虾类健康的饲料添加剂的使用方法。
具体而言，本发明的方法包含在一系列的电磁场中培养酵母细胞以使其具有代谢活性，并能够有效地刺激动物免疫系统。该生物组合物最多可由四种不同的酵母细胞成分组成。其生产方法包括在活化条件下酵母细胞的培养、混合、干燥和包装。在优选的实施方案中，酵母细胞原料是商品化产品，并/或能够为公众所获得，例如但不限于酿酒酵母。
该生物组合物可直接用于喂养动物，也可作为添加剂加入到常规动物饲料中。包含本发明的活化酵母细胞的动物饲料组合物也属于本项发明。
                   4.附图说明
图1：酵母细胞的活化和处理。1.酵母细胞培养物；2.容器；3.电磁场源；4.电极
                 5.具体实施方式
本发明涉及一种能够提高水生动物免疫功能，并/或减少感染性疾病发病率的生物组合物。本发明提供了该生物组合物的生产方法，以及将其作为水产养殖饲料添加剂的使用方法。此外，包含该生物组合物的改良水产养殖饲料也是本发明的内容组成部分。
本发明的生物组合物包含酵母。与将酵母作为水生动物饲料主要营养成分的传统方法不同的是，本发明是将酵母细胞作为一种补充物加入到饲料中，以达到替代或减少化学物质以及抗生素用量的目的。这些酵母细胞以活菌的形式为水生动物所摄取，一旦进入到动物的消化道，即能刺激动物的免疫系统，达到提高动物免疫功能，因而减少感染性疾病发病率的目的。该生物组合物的使用能减少水产养殖业防病的总费用，并且使得将饲料中的化学物质及抗生素的用量最小化甚至零化成为可能。
尽管下列术语在本领域中已经广为人知，但为了便于理解，我们仍将对这些术语进行一些简要的解释。
本文中，“饲料”是指用于给水生动物提供营养的，以及使得处于幼体、幼苗及发育中任何一阶段的动物保持正常或加速生长的任何形态(固、液态均可)的物质。
本文中，“水生动物”是指各种海水及淡水虾、对虾及其类似物。其中包括(但不仅限于)对虾科、Pendalus科(甜虾？)、长臂虾科及Caridea科。具体而言包括但不限于日本对虾、Oriental shrimps、giant tiger shrimp、日本沼虾、基围虾、短沟对虾等。
本文中，“免疫功能”是指水生动物的特异性及非特异性免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫两方面。动物的免疫功能使其具有能在病原体感染后存活和/或恢复的能力，这些病原体主要包括细菌、病毒、原生动物、蠕虫及其他寄生虫等。免疫功能还使得动物能够预防感染，尤其是预防曾经接触过的病原体的感染。包括某些种类的血细胞(如无颗粒细胞，小颗粒细胞，大颗粒细胞)在内的多种免疫细胞都参与了动物的免疫功能。关于甲壳类动物免疫系统的具体内容请参见《无脊椎动物血液学：细胞及血清因子》(Cheung(ed)，Perseus Books，1984年出版)，以及《无脊椎动物免疫反应》(Springer Verlag New YorkIncorporated，1986年出版)。
在一个实施方案中，本发明提供了生物组合物，所述生物组合物包含至少一种酵母细胞。每种酵母成分包含一定数量的该种活酵母细胞，这些细胞都是在特定条件下培养出来的，从而具有提高水生动物免疫功能的能力。在优选的实施方案中，本发明的组合物包含最多四种酵母细胞成分。
根据本发明，在特定培养条件下培养出来的酵母细胞能够具有代谢活性，从而能够有效地刺激和提高摄入该酵母细胞的动物的免疫功能。发明者不受任何理论或机制的束缚，提出该培养条件将酵母细胞中某一个或一组基因激活，并/或使其表达扩增，从而使得酵母细胞能高效地刺激动物免疫系统。并且设想，由于在下文所描述的特定环境中培养出来的酵母细胞的基因产物大大增加，该产物与动物免疫系统之间的相互作用也随之大大增加。我们将通过动物实验的结果对使用该生物组合物的益处进行论证。这些实验动物都表现出高度的抗病性，或是疾病后的快速恢复性。
在一个实施方案中，本发明的生物组合物可直接用于喂养动物，在另一个实施方案中，其也可作为添加剂加入到饲料中。对于相关领域的技术人员而言，他们可采用多种方法将该生物组合物与饲料进行混合。在特定的实施方案中，可在投放饲料前将本发明的酵母的肉汤培养物直接加入饲料，或是在投放饲料前加入酵母的干粉制剂，在本发明的另一个实施方案中，还可将该制剂与饲料的原料直接混合以使酵母细胞能够完全地与饲料结合。总而言之，该生物组合物可用各种不同的自动化的机械方法加入和/或混入饲料。
该生物组合物的用量部分取决于饲料的配方和种类，并且可以根据经验调整。例如，该生物组合物与水生动物饲料干重比例的有效范围为0.1％到1％，优选地为0.3％到0.8％，最优选地为0.5％。该制剂还可与其他添加剂，例如但不限于化学物质、维生素、矿物质等联合使用或轮换使用，但这并不是必需的。
在5.1和5.2中我们将对本发明的四种酵母细胞成分及其制备方法进行描述。在5.3中我们将具体描述包含至少一种上述酵母细胞的生物组合物的生产方法。
               5.1酵母细胞的培养
本发明提供了能够通过经口摄取以提高水生动物免疫功能的酵母细胞。可用多达四种不同的酵母细胞混合成该生物组合物。
所述的生物组合物的每种酵母细胞成分都是通过培养基培养而得到的，在培养期间培养基必需置于交变电磁场中。在培养过程中，酵母孢子得以发芽，酵母细胞得以生长和分裂。该过程既可以是批次生产，也可以是连续培养。在本文中，“交变电磁场”和“电磁场”为同义词。本发明中所使用的电磁场可用多种不同的方法产生。图1就是其中的一种方法的图解。电磁波源产生具有合适频率和场强的电磁场，该波源由一个或多个信号发生器组成，可产生出多种电磁波。我们推荐使用正弦波，频率范围为1500MHZ～15000MHZ。波源信号频率范围较窄的信号发生器也是可以使用的。如果需要的话，还可通过使用信号放大器以增加输出信号和电磁场的场强。
将电磁场加诸于细胞培养的方式也是多种多样的，例如可将酵母细胞放置在与电磁波源相连的信号发射器附近，也可将信号发射器以电极的形式浸入培养基中(1)。在优选的实施方案中，将一个金属板电极置于非导电容器的底部，而另一个由导线或导电管组成的电极以合适的方式置于容器中，以保证电磁场能量均匀地分布于整个培养基。以直立培养容器为例，导线或导电管的顶部应置于距容器底部3～30cm的位置(即距容器底部的距离大约应为容器高度的2～10％)。导线的数量取决于培养罐容量和导线直径。举例来说，对于一个10升或10升以下的培养罐来说，应使用2至3根直径为0.5～2mm的导线。对于一个容量在10升至100升之间的培养罐来说，导线或导电管的直径可在3.0～5.0mm之间。对于一个容量在100升至1000升之间的培养罐来说，导线或导电管的直径可在6.0～15.0mm之间。1000升以上的培养罐可使用直径在20.0～25.0mm之间的导线或导电管。
根据不同需要，本发明的生物组合物可使用的酵母种类包括酵母属，念珠菌属，Crebrothecium，地霉属，汉逊酵母属，克勒克酵母属，油脂酵母属，毕赤酵母属，红冬孢属，红酵母属，球拟酵母属，丝孢酵母属，以及威克酵母属。
这些非限制性酵母细胞株包括酿酒酵母Hansen株，ACCC2034，ACCC2035，ACCC2036，ACCC2037，ACCC2038，ACCC2039，ACCC2040，ACCC2041，ACCC2042，AS2.1，AS2.4，AS2.11，AS2.14，AS2.16，AS2.56，AS2.69，AS2.70，AS2.93，AS2.98，AS2.101，AS2.109，AS2.110，AS2.112，AS2.139，AS2.173，AS2.174，AS2.182，AS2.196，AS2.242，AS2.336，AS2.346，AS2.369，AS2.374，AS2.375，AS2.379，AS2.380，AS2.382，AS2.390，AS2.393，AS2.395，AS2.396，AS2.397，AS2.398，AS2.399，AS2.400，AS2.406，AS2.408，AS2.409，AS2.413，AS2.414，AS2.415，AS2.416，AS2.422，AS2.423，AS2.430，AS2.431，AS2.432，AS2.451，AS2.452，AS2.453，AS2.458，AS2.460，AS2.463，AS2.467，AS2.486，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.516，AS2.535，AS2.536，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，AS2.576，AS2.593，AS2.594，AS2.614，AS2.620，AS2.628，AS2.631，AS2.666，AS2.982，AS2.1190，AS2.1364，AS2.1396，IFFI 1001，IFFI 1002，IFFI1005，IFFI 1006，IFFI 1008，IFFI 1009，IFFI 1010，IFFI 1012，IFFI 1021，IFFI 1027，IFFI 1037，IFFI 1042，IFFI 1043，IFFI 1045，IFFI 1048，IFFI1049，IFFI 1050，IFFI 1052，IFFI 1059，IFFI 1060，IFFI 1063，IFFI 1202，IFFI 1203，IFFI 1206，IFFI 1209，IFFI 1210，IFFI 1211，IFFI 1212，IFFI1213，IFFI 1215，IFFI 1220，IFFI 1221，IFFI 1224，IFFI 1247，IFFI 1248，IFFI 1251，IFFI 1270，IFFI 1277，IFFI 1287，IFFI 1289，IFFI 1290，IFFI1291，IFFI 1292，IFFI 1293，IFFI 1297，IFFI 1300，IFFI 1301，IFFI 1302，IFFI 1307，IFFI 1308，IFFI 1309，IFFI 1310，IFFI 1311，IFFI 1331，IFFI1335，IFFI 1336，IFFI 1337，IFFI 1338，IFFI 1339，IFFI 1340，IFFI 1345，IFFI 1348，IFFI 1396，IFFI 1397，IFFI 1399，IFFI 1411，IFFI 1413；Saccharomyces cerevisiae Hansen Var.ellipsoideus(Hansen)Dekker，ACCC2043，AS2.2，AS2.3，AS2.8，AS2.53，AS2.163，AS2.168，AS2.483，AS2.541，AS2.559，AS2.606，AS2.607，AS2.611，AS2.612；Saccharomyces chevalieri Guillermond，AS2.131，AS2.213；Saccharomyces delbrueckii，AS2.285；Saccharomyces delbrueckiiLindner var.mongolicus Lodder et van Rij，AS2.209，AS2.1157；Saccharomyces exiguous Hansen，AS2.349，AS2.1158；Saccharomycesfermentati(Saito)Lodder et van Rij，AS2.286，AS2.343；Saccharomyceslogos van 1aer et Denamur ex Jorgensen，AS2.156，AS2.327，AS2.335；Saccharomyces mellis Lodder et Kreger Van Rij，AS2.195；Saccharomyces microellipsoides Osterwalder，AS2.699；Saccharomycesoviformis Osterwalder，AS2.100；Saccharomyces rosei(Guilliermond)Lodder et kreger van Rij，AS2.287；Saccharomyces rouxii Boutroux，AS2.178，AS2.180，AS2.370，AS2.371；Saccharomyces sake Yabe，ACCC2045；Candida arborea，AS2.566；Candida Krusei(Castellani)Berkhout，AS2.1045；Candida lambica(Lindner et Genoud)van.Uden etBuckley，AS2.1182；Candida lipolytica(Harrison)Diddens et Lodcer，AS2.1207，AS2.1216，AS2.1220，AS2.1379，AS2.1398，AS2.1399，AS2.1400；Candida parapsilosis(Ashford)Langeron et Talice，AS2.590；Candida parapsilosis(Ashford)et Talice Var.intermedia VanRij et Verona，AS2.491；Candida pulcherriman(Lindner)Windisch，AS2.492；Candida rugousa(Anderson)Diddens et Loddeer，AS2.511，AS2.1367，AS2.1369，AS2.1372，AS2.1373，AS2.1377，AS2.1378，AS2.1384；Candida tropicalis(Castellani)Berkout，ACCC2004，ACCC2005，ACCC2006，AS2.164，AS2.402，AS2.564，AS2.565，AS2.567，AS2.568，AS2.617，AS2.1387；Candida utilis HennebergLodder et Kreger Van Rij，AS2.120，AS2.281，AS2.1180；Crebrotheciumashbyii(Guillermond)Routein，AS2.481，AS2.482，AS2.1197；Geotrichum candidum Link，ACCC2016，AS2.361，AS2.498，AS2.616，AS2.1035，AS2.1062，AS2.1080，AS2.1132，AS2.1175，AS2.1183；Hansenula anomala(Hansen)H et P sydow，ACCC2018，AS2.294，AS2.295，AS2.296，AS2.297，AS2.298，AS2.299，AS2.300，AS2.302，AS2.338，AS2.339，AS2.340，AS2.341，AS2.470，AS2.592，AS2.641，AS2.642，AS2.635，AS2.782，AS2.794；Hansenula arabitolgens Fang，AS2.887；Hansenula jadinii Wickerham，ACCC2019；Hansenulasaturnus(Klocker)H et P sydow，ACCC2020；Hansenula schneggii(Weber)Dekker，AS2.304；Hansenula subpelliculosa Bedford，AS2.738，AS2.740，AS2.760，AS2.761，AS2.770，AS2.783，AS2.790，AS2.798，AS2.866；Kloeckera apiculata(Reess emend.Klocker)Janke，ACCC2021，ACCC2022，ACCC2023，AS2.197，AS2.496，AS2.711，AS2.714；Lipomyces starkeyi Loder et van Rij，ACCC2024，AS2.1390；Pichia farinosa(Lindner)Harsen，ACCC2025，ACCC2026，AS2.86，AS2.87，AS2.705，AS2.803；Pichia membranaefaciens Hansen，ACCC2027，AS2.89，AS2.661，AS2.1039；Rhodosporidium toruloidesBanno，ACCC2028；Rhodotorula glutinis(Fresenius)Harrison，ACCC2029，AS2.280，ACCC2030，AS2.102，AS2.107，AS2.278，AS2.499，AS2.694，AS2.703，AS2.704，AS2.1146；Rhodotorula minuta(Saito)Harrison，AS2.277；Rhodotorula rubar(Demme)Lodder，ACCC2031，AS2.21，AS2.22，AS2.103，AS2.105，AS2.108，AS2.140，AS2.166，AS2.167，AS2.272，AS2.279，AS2.282；Saccharomycescarlsbergensis Hansen，AS2.113，ACCC2032，ACCC2033，AS2.312，AS2.116，AS2.118，AS2.121，AS2.132，AS2.162，AS2.189，AS2.200，AS2.216，AS2.265，AS2.377，AS2.417，AS2.420，AS2.440，AS2.441，AS2.443，AS2.444，AS2.459，AS2.595，AS2.605，AS2.638，AS2.742，AS2.745，AS2.748，AS2.1042；Saccharomyces uvarum Beijer，IFFI1023，IFFI 1032，IFFI 1036，IFFI 1044，IFFI 1072，IFFI 1205，IFFI 1207；Saccharomyces willianus Saccardo，AS2.5，AS2.7，AS2.119，AS2.152，AS2.293，AS2.381，AS2.392，AS2.434，AS2.614，AS2.1189；Saccharomyces sp.，AS2.311；Saccharomyces ludwigii Hansen，ACCC2044，AS2.243，AS2.508；Saccharomyces sinenses Yue，AS2.1395；Schizosaccharomyces octosporus Beijerinck，ACCC 2046，AS2.1148；Schizosaccharomyces pombe Linder，ACCC2047，ACCC2048，AS2.248，AS2.249，AS2.255，AS2.257，AS2.259，AS2.260，AS2.274，AS2.994，AS2.1043，AS2.1149，AS2.1178，IFFI 1056；Sporobolomyces roseusKluyver et van Niel，ACCC 2049，ACCC 2050，AS2.619，AS2.962，AS2.1036，ACCC2051，AS2.261，AS2.262；Torulopsis candida(Saito)Loddeer，ACCC2052，AS2.270；Torulopsis famta(Harrison)Lodder et vanRij，ACCC2053，AS2.685；Torulopsis globosa(Olson et Hammer)Lodderet van Rij，ACCC2054，AS2.202；Torulopsis inconspicua Lodder et vanRij，AS2.75；Trichosporon behrendii Lodder et Kreger van Rij，ACCC2055，AS2.1193；Trichosporon capitatum Diddens et Lodder，ACCC2056，AS2.1385；Trichosporon cutaneum(de Beurm et al.)Ota，ACCC2057，AS2.25，AS2.570，AS2.571，AS2.1374；Wickerhamiafluoresens(Soneda)Soneda，ACCC2058，AS2.1388。在上述种类中，酵母属类的酵母细胞通常是优选的，其中又优选酿酒酵母Hansen株。
本发明所使用的酵母细胞株都可从包括下列机构在内的各私立或公共实验室，以及公共细胞培养库中获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209；和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国科学院微生物研究所，北京市海淀区，邮政信箱2714，邮编100080。
尽管用纯化的酵母细胞株来制备酵母细胞成分是优选的，但本发明所使用的酵母细胞成分仍可从不同种类的酵母或同种不同株的酵母细胞混合培养而产生。所获细胞成分的组成可通过本领域所熟知的酵母细胞鉴定技术进行鉴定。
在本发明的各种实施方案中，本发明都使用标准的酵母细胞操作、转运和储存技术。尽管无菌条件或清洁环境并不是必需的，我们仍然推荐在生产过程中能达到该两者的要求。生产过程中还需要使用动物体液及免疫细胞标准操作技术，以及动物免疫功能标准研究技术。详情请参阅《现代免疫学实验技术》(Coligan，et al(ed)，JohnWiley & Sons，Inc.，1991年出版)，上述文献的全文已收入本申请作为参考。
在一个实施方案中，第一种酵母细胞成分是在至少一个交变电磁场(EM)存在的环境下培养得到的，该电磁场频率范围为7497～7516MHZ。也可使用在规定范围内具有不同频率、不同场强、或不同频率及场强的一系列的电磁场进行培养。尽管只要频率和场强在规定范围之内，电磁场数目可以任意决定，但优选地将该酵母培养物置于总数为2～10(含)个的系列电磁场中，其可以通过本领域已知的任何方式产生，其频率可为7497～7516MHZ(含)中的任意整数值。
电磁场场强范围为3.5～200mV/cm。在优选的实施方案中，系列电磁场中前一个电场的场强低于随后的电磁场，这使得加诸于酵母细胞培养物的场强可逐渐增大。比如，先将酵母细胞在较低场强(如50～80mV/cm)的电磁场中培养26至70小时，再将其置于较高场强(如100～180mV/cm)的电磁场中培养28至70小时。在改变电磁场时，并不需要更换培养容器，也不需要更换电磁波发生器及信号发射器。
开始培养时，可将1ml酵母细胞种液接种入100ml培养基中，使得酵母细胞密度在105/ml左右。在将该培养瓶置于电磁场中之前，应先在25～35℃(优选地在28～32℃)培养24至48小时。培养基中的氧气浓度应该在0.025～0.08mol/m3之间(优选地在0.04mol/m3)。氧气浓度的控制方法可为包括搅拌法和/或通入法在内的本领域的任何常规方法。
所使用的培养基最优选含有动物血清及酵母细胞可同化营养素的液态培养基。表1为培养该生物组合物第一种酵母细胞成分可使用的一个培养基范例。表1
培养基成分 各成分使用量
蔗糖或葡萄糖  20.0g
 K2HPO4  0.25g
 MgSO4.7H2O  0.2g
 NaCl  0.22g
 CaSO4.2H2O  0.5g
 CaCO3  6.0g
尿素  0.2-5.0g
虾类体液  2-5ml
灭菌水  1000ml
琼脂(固态培养基需要)  10-20g
在这里必须说明的是，表1中列出的培养基成分并不受任何限制。本领域技术人员可根据培养及经济需要将培养基成分按比例增减，以对培养水平进行控制和调节。
培养基中的碳源可为包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖、糖类似物及淀粉在内的各种碳水化合物。碳水化合物的用量部分取决于培养基中的其他成分，但总的来说碳水化合物的量应为培养基总重量的0.1％～5％，优选为0.5％～2％，最优选为0.8％左右。上述碳源既可单独使用，也可数种合用。培养基中的无机盐可使用各种常用的钠盐、钙盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。
虾类体液是将虾在锐缘(如竹刀)上刮擦，收集其产生的分泌物而获得的。用500到2000尾重各5～10g的淡水虾可获得10至20ml体液。用同样的方法也可制得海水虾的体液。用500到1000尾各重10～100g的海水虾可获得10至20ml体液。在使用前，虾类体液可根据需要进行混合、稀释或是浓缩。
尽管酵母细胞在电磁场中培养数小时即可得到活化，但是也可以将其在电磁场中培养的时间延长一段时间(如一至数周)。培养结束后，作为本发明第一种酵母细胞成分的酵母细胞可用多种不同的方法进行收获，并在0～4℃的条件下保存。收获的酵母细胞也可进行干燥并以干粉的形式进行保存。
下文中的第6节即对以酿酒酵母AS2.502株作为第一种酵母细胞成分的培养过程进行了详细的说明。
在另一个实施方案中，第二种酵母细胞成分的酵母细胞也是在至少一个交变电磁场存在的环境下培养得到的，该电磁场频率范围为6800～6820MHZ。也可使用在规定范围内具有不同频率、不同场强、或不同频率及场强的一系列的电磁场进行培养。尽管只要频率和场强在规定范围之内，电磁场数目可以任意决定，但优选地将该酵母培养物置于总数为2～10(含)个的系列电磁场中，其可以通过本领域已知的任何方式产生，其频率可为6800～6820MHZ(含)中的任意整数值。
电磁场场强范围为4.5～190mV/cm。在优选的实施方案中，系列电磁场中前一个电场的场强低于随后的电磁场，这使得加诸于酵母细胞培养物的场强可逐渐增大。比如，先将酵母细胞在较低场强(50～80mV/cm)的电磁场中培养20至60小时，再将其置于较高场强(120～190mV/cm)的电磁场中培养20至60小时。在改变电磁场时，并不需要更换培养容器，也不需要更换电磁波发生器及信号发射器。
开始培养时，可将1ml酵母细胞种液接种入100ml培养基中，使得酵母细胞密度在105/ml左右。在将该培养瓶置于电磁场中之前，应先在25～35℃培养24至48小时。培养过程中的氧气浓度优选在0.025～0.08mol/m3之间(优选地在0.04mol/m3)。氧气浓度的控制方法可为包括搅拌法和/或通入法在内的本领域的任何常规方法。
培养最优选地在含有动物血清及酵母细胞可同化营养素的液态培养基中进行。表2为培养本发明的第二种酵母细胞成分可使用的一个培养基范例。表2
培养基成分 各成分使用量
蔗糖或可溶性淀粉  20.0g
 K2HPO4  0.25g
 MgSO4.7H2O  0.2g
 NaCl  0.22g
 CaCO3  0.5g
尿素  2.0g
虾类体液  2-5ml
灭菌水  1000ml
琼脂(固体培养基需要)  15g
在这里必须说明的是，表2中列出的培养基成分并不受任何限制。本领域技术人员可根据培养及经济需要将培养基成分按比例增减，以对培养水平进行控制和调节。
培养基中的碳源可为包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖、糖类似物及淀粉在内的各种碳水化合物。碳水化合物的用量部分取决于培养基中的其他成分，但总的来说碳水化合物的量应为培养基总重量的0.1％～5％，优选地为0.5％～2％，最优选地为0.8％左右。上述碳源既可单独使用，也可数种合用。培养基中的无机盐可使用各种常用的钠盐、钙盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。虾类体液的制备方法如前述。
尽管酵母细胞在电磁场中培养数小时即可得到活化，但是也可以将其在电磁场中培养的时间延长一段时间(如一至数周)。培养结束后，作为本发明的第二种酵母细胞成分的酵母细胞可用多种不同的方法进行收获，并在0～4℃的条件下保存。收获的酵母细胞也可进行干燥并以干粉的形式进行保存。
下文中的第6节即对以酿酒酵母AS2.562株作为第二种酵母细胞成分的培养过程进行了详细的说明。
在另一个实施方案中，第三种酵母细胞成分的酵母细胞同样是在至少一个交变电磁场存在的环境下培养得到的，该电磁场频率范围为8300～8320MHZ。也可使用在规定范围内具有不同频率、不同场强、或不同频率及场强的一系列的电磁场进行培养。尽管只要频率和场强在规定范围之内，电磁场数目可以任意决定，但优选地将该酵母培养物置于总数为2～10(含)个的系列电磁场中，其可以通过本领域已知的任何方式产生，其频率可为8300～8320MHZ(含)中的任意整数值。
电磁场场强范围为11～290mV/cm。在优选的实施方案中，系列电磁场中前一个电场的场强低于随后的电磁场，这使得加诸于酵母细胞培养物的场强可逐渐增大。比如，先将酵母细胞在较低场强(如120～150mV/cm)的电磁场中培养26至60小时，再将其置于较高场强(如200～290mV/cm)的电磁场中培养25至60小时。在改变电磁场时，并不需要更换培养容器，也不需要更换电磁波发生器及信号发射器。
开始培养时，可将1ml酵母细胞种液接种入100ml培养基中，使得酵母细胞密度在105/ml左右。在将该培养瓶置于电磁场中之前，应先在25～35℃培养24至48小时。优选地，培养在氧气浓度为0.025～0.08mol/m3之间(优选为0.04mol/m3)进行。氧气浓度的控制方法可为包括搅拌法和/或通入法在内的本领域的任何常规方法。
培养最优选地是在含有动物血清及酵母细胞可同化营养素的液态培养基中进行。表3为培养本发明的第三种酵母细胞成分可使用的一个培养基范例。表3
培养基成分 各成分使用量
蔗糖或可溶性淀粉  20.0g
 MgSO4.7H2O  0.25g
 NaCl  0.2g
 Ca(H2PO4)  0.22g
 CaCO3  0.5g
(NH4)2HPO4  2.0g
 K2HPO4  0.3g
虾类体液  2-5ml
灭菌水  1000ml
琼脂(固态培养基需要)  15g
在这里必须说明的是，表3中列出的培养基成分并不受任何限制。本领域技术人员可根据培养及经济需要将培养基成分按比例增减，以对培养水平进行控制和调节。
培养基中的碳源可为包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖、糖类似物及淀粉在内的各种碳水化合物。碳水化合物的用量部分取决于培养基中的其他成分，但总的来说碳水化合物的量应为培养基总重量的0.1％～5％，优选地为0.5％～2％，最优选为0.8％左右。上述碳源既可单独使用，也可数种合用。培养基中的无机盐可使用各种常用的钠盐、钙盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。虾类体液的制备方法如前述。
尽管酵母细胞在电磁场中培养数小时即可得到活化，但是也可以将其在电磁场中培养的时间延长一段时间(如一至数周)。培养结束后，作为本发明的第三种酵母细胞成分的酵母细胞可用多种不同的方法进行收获，并在0～4℃的条件下保存。收获的酵母细胞也可进行干燥并以干粉的形式进行保存。
下文中的第6节即对以酿酒酵母AS2.982株作为第三种酵母细胞成分的培养过程进行了详细的说明。
在另一个实施方案中，第四种酵母细胞成分的酵母细胞仍然是在至少一个交变电磁场存在的环境下培养得到的，该电磁场频率范围为8425～8445MHZ。也可使用在规定范围内具有不同频率、不同场强、或不同频率及场强的一系列的电磁场进行培养。尽管只要频率和场强在规定范围之内，电磁场数目可以任意决定，但优选地将该酵母培养物置于总数为2～10(含)个的系列电磁场中，其可以通过本领域已知的任何方式产生，其频率可为8425～8445MHZ(含)中的任意整数值。
电磁场场强范围为14～320mV/cm。在优选的实施方案中，系列电磁场中前一个电场的场强低于随后的电磁场，这使得加诸于酵母细胞培养物的场强可逐渐增大。比如，先将酵母细胞在较低场强(如150～180mV/cm)的电磁场中培养25至70小时，再将其置于较高场强(如180～320mV/cm)的电磁场中培养25至70小时。在改变电磁场时，并不需要更换培养容器，也不需要更换电磁波发生器及信号发射器。
开始培养时，可将1ml酵母细胞种液接种入100ml培养基中，使得酵母细胞密度在105/ml左右。在将该培养瓶置于电磁场中之前，应先在25～35℃培养24至48小时。优选地，培养在氧气浓度为0.025～0.08mol/m3之间(优选为0.04mol/m3)进行。氧气浓度的控制方法可为包括搅拌法和/或通入法在内的本领域的任何常规方法。
培养最优选地是在含有动物血清及酵母细胞可同化营养素的液态培养基中进行。表4为培养本发明的第四种酵母细胞成分可使用的一个培养基范例。表4
 培养基成分 各成分使用量
 淀粉  20.0g
 (NH4)2HPO4  0.25g
 K2HPO4  0.2g
 MgSO4.7H2O  0.22g
 NaCl  0.5g
 CaSO4.2H2O  0.3g
 CaCO3  3.0g
 虾类体液  2-5ml
 灭菌水  1000ml
 琼脂(固态培养基需要)  15g
在这里必须说明的是，表4中列出的培养基成分并不受任何限制。本领域技术人员可根据培养及经济需要将培养基成分按比例增减，以对培养水平进行控制和调节。
培养基中的碳源可为包括蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖、糖类似物及淀粉在内的各种碳水化合物。碳水化合物的用量部分取决于培养基中的其他成分，但总的来说碳水化合物的量应为培养基总重量的0.1％～5％，优选地为0.5％～2％，最优选地为0.8％左右。上述碳源既可单独使用，也可数种合用。培养基中的无机盐可使用各种常用的钠盐、钙盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐，例如(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl、CaSO4等。虾类体液的制备方法如前述。
尽管酵母细胞在电磁场中培养数小时即可得到活化，但是也可以将其在电磁场中培养的时间延长一段时间(如一至数周)。培养结束后，作为本发明的第四种酵母细胞成分的酵母细胞可用多种不同的方法进行收获，并在0～4℃的条件下保存。收获的酵母细胞也可进行干燥并以干粉的形式进行保存。
下文中的第6节即对以酿酒酵母AS2.406株作为第四种酵母细胞成分的培养过程进行了详细的说明。
             5.2酵母细胞的驯化培养
在本发明的另一方面，若能在培养基中加入所需养殖动物消化道提取物，则活化酵母细胞能够更好地适应和耐受该类动物的消化道环境，因而也能够取得更好的效果。
按照前文5.1中所述方法培养得到的活化酵母细胞可在表5列举的成分所组成的培养基中进行进一步的混合培养。表5(每1000ml培养基)
培养基成分 各成分使用量
虾类消化道提取物 300ml，储存于4℃
野枣汁 300ml
野山楂汁 320ml
(NH4)2HPO4 0.25g
K2HPO4 0.2g
MgSO4.7H2O 0.22g
NaCl 0.5g
CaSO4.2H2O 0.3g
CaCO3 3.0g
酵母细胞培养基(最多可有4种不同的酵母细胞培养基，细胞密度为1×108/ml) 每种20ml
各成分可根据需要按比例进行增减。
野枣汁的制备方法为按照每个研碎的野枣中加入5ml水的比例，将水与野枣混合，再进行过滤得到的。用同样的方法可制得野山楂汁。
虾类消化道提取物是将虾的消化道成分与蒸馏水混合而制成的。500至1000尾各重10～30g的虾可得到10～30g的消化道成分，可与1000至2000ml蒸馏水混合。混合物经过滤后储存于4℃或-20℃条件下。
混合酵母细胞应在一系列电磁场中培养48～96小时。根据所含酵母细胞株的不同，每个电磁场的频率可在5.1中所列举的4个频率范围中的任意一个之间。如果混合酵母细胞中含有所有4种酵母细胞成分，则下列4个电磁场频率范围都可供使用：7497～7516MHZ、6800～6820MHZ、8300～8320MHZ、8425～8445MHZ。不同的电磁场可同时使用，也可序贯使用。其场强范围为85mV/cm～320mV/cm。
在酵母细胞暴露于电磁场的同时，培养温度应在5～35℃之间循环，使得酵母细胞得以进行孵化。举例来说，一个标准的循环可从35℃开始，培养温度逐渐下降至5℃，然后再逐渐上升至35℃，开始另一个循环。每次循环大约耗时3小时，如此周而复始直到酵母细胞收获。所收获的酵母细胞可储存在4℃的条件下。
                 5.3生物组合物的生产
本发明的内容还包括了包含上述酵母细胞成分的生物组合物的生产方法。优选地，本发明的生物组合物所包含的酵母细胞用5.1中所述的方法进行活化，并用5.2中所述的方法进行驯化适应性培养。最优选地，所述的生物组合物包含了所有4种酵母细胞成分。
如想大规模生产本发明的生物组合物，细胞培养应按照比例相应放大。下文即以生产1000kg的所述的生物组合物为例对此进行说明。
先将每一种经活化和驯化的酵母细胞1000ml(细胞密度约为1×1010/ml)各自接种于含有100kg淀粉、250升洁净水(储存于20～45℃的条件下)以及其他活化酵母细胞所需成分(即表1、2、3、4中所列举的培养基成分20～40g)的培养基中。再将这4种培养基混合在一起，在35～37℃的条件下进行培养。同时还要使用频率在5.1中所列举的4个频率范围中的电磁场，电磁场的场强范围为120～450mV/cm。这4种不同频率的电磁场可同时使用，也可序贯使用。这个培养过程可持续48至96小时，或是持续到酵母细胞密度大于等于2×109/ml的时候。此时的酵母细胞应储存于15～20℃的条件下。如果不立即使用的话，则应在24小时内进行干燥以便储存。
制备好的酵母细胞和生物组合物可分两步进行干燥。第一步是将酵母细胞在温度不超过65℃的干燥机中进行干燥，时间不超过10分钟，这样使得酵母细胞迅速进入休眠期。第二步是将酵母细胞在温度不超过70℃的干燥机中进行干燥，时间不超过30分钟，以进一步除去其中的水分。经过这两个步骤以后，水分含量应小于5％。优选地，在上述两个干燥步骤中，温度及时间应保持恒定，以免酵母细胞失去活性和功能。经干燥的酵母细胞冷却至室温后，即可进行分装。在分装前，还可用分离器对酵母细胞进行筛选，以获得所需大小的酵母细胞。
                      6.实施例
在下文中，我们就实施例说明这种可作为饲料添加剂的生物制剂的生产方法。
该生物组合物包含以下四种酵母细胞成分：酿酒酵母AS2.502株，AS2.562株，AS2.982株及AS2.406株。其中的任何一种酵母都具有加快养殖虾生长速度，和/或改善养殖虾健康状况的能力。上述四种酵母细胞成分的具体制备方法如下：
将细胞密度为105/ml的AS2.502种液加入如图1所示的容器中(2)，并加入按表1配制的培养基。首先，将酵母细胞在没有电磁场存在的情况下，在28℃的条件下培养33小时。然后在不更换培养基、不改变培养温度的前提下，按照下列顺序将酵母细胞在8个不同的电磁场中进行培养：频率为7500MHZ，场强为68mV/cm，时间为8小时；频率为7507MHZ，场强为68mV/cm，时间为8小时；频率为7511MHZ，场强为68mV/cm，时间为26小时；频率为7515MHZ，场强为68mV/cm，时间为26小时；频率为7500MHZ，场强为176mV/cm，时间为8小时；频率为7507MHZ，场强为176mV/cm，时间为8小时；频率为7611MHZ，场强为176mV/cm，时间为28小时；频率为7515MHZ，场强为176mV/cm，时间为28小时。接下来再按5.2中所述的方法对酵母细胞进行驯化培养，即将酵母细胞接种于含有虾类消化道提取物、野枣汁和野山楂汁的培养基中，先后在频率为7511MHZ、场强为176mV/cm和频率为7515MHZ、场强为176mV/cm的两个电磁场中分别培养28小时。在上述最后一个培养步骤完成后，酵母细胞可在24小时内直接用于制备所述的生物组合物，也可按5.3中所述方法进行干燥和储存。
我们通过下述实验方法对所制备的第一种酵母细胞成分对动物的益处进行了验证。选用的实验动物为中国虾，平均起始身长为1.6±0.1cm。每次实验使用4个虾池，实验共重复3次，即一共使用了12个虾池。每池虾苗初始总重量相差小于等于1％。第一个虾池的虾苗(A组)的饲料中添加了按表6A配制的抗生素，且养殖用水中也用表6B中所列的化学物质进行了处理。表6A：含抗生素的虾饲料配方
成分 每吨饲料中的含量 备注
基础饲料 1000kg 由山东省海洋生物养殖所生产，其中不含有抗生素
磺胺嘧啶 60g/吨
链霉素 100g/吨 107国际单位
红霉素 100g/吨 107国际单位
氯霉素 100g/吨 107国际单位
土霉素 100g/吨 107国际单位
磺胺胍 60g/吨
呋喃西林 70g/吨
呋喃唑酮 50g/吨
表6B：用于清洁水环境的传统化学物质
成分 每立方米水中的含量 备注
氧化钙 40g/m3 每月一次
漂白粉 20g/m3 每月一次
硫酸铜 2.0g/m3 每月两次
硫酸亚铁 2.0g/m3 每月两次
敌百虫 0.2g/m3 每月一次
呋喃西林 70g/吨 每月一次
呋喃唑酮 50g/吨 每月一次
B组虾苗的饲料中加入了活化的AS2.502酵母细胞株。将干燥的活化酵母细胞与小于200孔的沸石粉按照109～1010个酵母细胞：1g沸石粉的比例进行混合，制成添加剂。然后在每995kg饲料中加入5kg添加剂，使添加剂占饲料重量的0.5％，即每1000kg饲料中含有5×1012～5×1013个酵母细胞。C组虾苗的饲料中同样加入了按照B组所用方法制得的添加剂，但是该添加剂使用的AS2.502酵母细胞株是未经活化的。D组虾苗仅用基础饲料进行喂养，其中既不加入抗生素，也不加入酵母细胞添加剂。B、C、D组虾苗所使用的虾池或养殖用水都没有用表6B中所列举的化学物质进行处理。经过5个月的养殖后，4组实验动物的健康状况如表7所示。表7：不同饲料喂养的虾产量比较
组别 3池虾的总重量 与A组相比的相对重量％
 A  63.5kg  100
 B  70.2kg  110.5
 C  27.6kg  43.5
 D  25.3kg  39.8
第二种酵母细胞成分的制备方法为：将细胞密度为105/ml的AS2.562种液加入如图1所示的容器中(2)，并加入按表2配制的培养基。首先，将酵母细胞在没有电磁场存在的情况下，在31℃的条件下培养32小时。然后在不更换培养基、不改变培养温度的前提下，按照下列顺序将酵母细胞在8个不同的电磁场中进行培养：频率为6801MHZ，场强为75mV/cm，时间为18小时；频率为6807MHZ，场强为75mV/cm，时间为18小时；频率为6810MHZ，场强为75mV/cm，时间为11小时；频率为6815MHZ，场强为75mV/cm，时间为11小时；频率为6801MHZ，场强为185mV/cm，时间为21小时；频率为6807MHZ，场强为185mV/cm，时间为21小时；频率为6810MHZ，场强为185mV/cm，时间为9小时；频率为6815MHZ，场强为185mV/cm，时间为9小时。接下来再按5.2中所述的方法对酵母细胞进行驯化培养，即将酵母细胞接种于含有虾类消化道提取物、野枣汁及野山楂汁的培养基中，先后在频率为6801MHZ、场强为185mV/cm和频率为6807MHZ、场强为185mV/cm的两个电磁场中分别培养21小时。在上述最后一个培养步骤完成后，酵母细胞可在24小时内直接用于制备所述的生物组合物，也可按5.3中所述方法进行干燥和储存。
我们通过下述实验方法对所制备的第二种酵母细胞成分对动物的益处进行了验证。选用的实验动物为中国虾，平均起始身长为1.6±0.1cm。每次实验使用4个虾池，实验共重复3次，即一共使用了12个虾池。每池虾苗初始总重量相差小于等于1％。第一个虾池的虾苗(A组)的饲料中添加了按表6A配制的抗生素，且养殖用水中也用表6B中所列的化学物质进行了处理。
B组虾苗的饲料中加入了活化的AS2.562酵母细胞株。将干燥的活化酵母细胞与小于200孔的沸石粉按照1×109个酵母细胞：1g沸石粉的比例进行混合，制成添加剂。然后在每995kg饲料中加入5kg添加剂，使添加剂占饲料重量的0.5％。C组虾苗的饲料中同样加入了按照B组所用方法制得的添加剂，但是该添加剂使用的AS2.562酵母细胞株是未经活化的。D组虾苗仅用基础饲料进行喂养，其中既不加入抗生素，也不加入酵母细胞添加剂。经过5个月的养殖后，4组实验动物的健康状况如表8所示。表8：不同饲料喂养的虾产量比较
组别 3池虾的总重量 与A组相比的相对重量％
 A  65.6kg 100
 B  70.9kg 108.1
 C  28.1kg 42.8
 D  25.1kg 38.3
第三种酵母细胞成分的制备方法为：将细胞密度为105/ml的AS2.982种液加入如图1所示的容器中(2)，并加入按表3配制的培养基。首先，将酵母细胞在没有电磁场存在的情况下，在29℃的条件下培养26小时。然后在不更换培养基、不改变培养温度的前提下，按照下列顺序将酵母细胞在8个不同的电磁场中进行培养：频率为8301MHZ，场强为135mV/cm，时间为26小时；频率为8307MHZ，场强为135mV/cm，时间为26小时；频率为8311MHZ，场强为135mV/cm，时间为10小时；频率为8318MHZ，场强为135mV/cm，时间为10小时；频率为8301MHZ，场强为256mV/cm，时间为15小时；频率为8307MHZ，场强为256mV/cm，时间为15小时；频率为8311MHZ，场强为256mV/cm，时间为10小时；频率为8318MHZ，场强为256mV/cm，时间为10小时。接下来再按5.2中所述的方法对酵母细胞进行驯化培养，即将酵母细胞接种于含有虾类消化道提取物、野枣汁及野山楂汁的培养基中，先后在频率为8301MHZ、场强为256mV/cm和频率为8307MHZ、场强为256mV/cm的两个电磁场中分别培养15小时。在上述最后一个培养步骤完成后，酵母细胞可在24小时内直接用于制备所述的生物组合物，也可按5.3中所述方法进行干燥和储存。
我们通过下述实验方法对所制备的第三种酵母细胞成分对动物的益处进行了验证。选用的实验动物为中国虾，平均起始身长为1.6±0.1cm。每次实验使用4个虾池，实验共重复3次，即一共使用了12个虾池。每池虾苗初始总重量相差小于等于1％。第一个虾池的虾苗(A组)的饲料中添加了按表6A配制的抗生素，且养殖用水中也用表6B中所列的化学物质进行了处理。
B组虾苗的饲料中加入了活化的AS2.982酵母细胞株。将干燥的活化酵母细胞与小于200孔的沸石粉按照1×109个酵母细胞：1g沸石粉的比例进行混合，制成添加剂。然后在每995kg饲料中加入5kg添加剂，使添加剂占饲料重量的0.5％。C组虾苗的饲料中同样加入了按照B组所用方法制得的添加剂，但是该添加剂使用的AS2.982酵母细胞株是未经活化的。D组虾苗仅用基础饲料进行喂养，其中既不加入抗生素，也不加入酵母细胞添加剂。经过5个月的养殖后，4组实验动物的健康状况如表9所示。表9：不同饲料喂养的虾产量比较
组别 3池虾的总重量 与A组相比的相对重量％
 A  66.2kg  100
 B  71.9kg  108.6
 C  28.3kg  42.7
 D  24.8kg  37.4
第四种酵母细胞成分的制备方法为：将细胞密度为105/ml的AS2.406种液加入如图1所示的容器中(2)，并加入按表4配制的培养基。首先，将酵母细胞在没有电磁场存在的情况下，在32℃的条件下培养18小时。然后在不更换培养基、不改变培养温度的前提下，按照下列顺序将酵母细胞在8个不同的电磁场中进行培养：频率为8426MHZ，场强为169mV/cm，时间为25小时；频率为8432MHZ，场强为1 69mV/cm，时间为25小时；频率为8438MHZ，场强为169mV/cm，时间为10小时；频率为8443MHZ，场强为169mV/cm，时间为10小时；频率为8426MHZ，场强为287mV/cm，时间为19小时；频率为8432MHZ，场强为287mV/cm，时间为19小时；频率为8438MHZ，场强为287mV/cm，时间为9小时；频率为8443MHZ，场强为287mV/cm，时间为9小时。接下来再按5.2中所述的方法对酵母细胞进行驯化培养，即将酵母细胞接种于含有虾类消化道提取物、野枣汁及野山楂汁的培养基中，先后在频率为8426MHZ、场强为287mV/cm和频率为8432MHZ、场强为287mV/cm的两个电磁场中分别培养19小时。在上述最后一个培养步骤完成后，酵母细胞可在24小时内直接用于制备所述的生物组合物，也可按5.3中所述方法进行干燥和储存。
我们通过下述实验方法对所制备的第四种酵母细胞成分对动物的益处进行了验证。选用的实验动物为中国虾，平均起始身长为1.64±0.1cm。每次实验使用4个虾池，实验共重复3次，即一共使用了12个虾池。每池虾苗初始总重量相差小于等于1％。第一个虾池的虾苗(A组)的饲料中添加了按表6A配制的抗生素，且养殖用水中也用表6B中所列的化学物质进行了处理。
B组虾苗的饲料中加入了活化的AS2.406酵母细胞株。将干燥的活化酵母细胞与小于200孔的沸石粉按照1×109个酵母细胞：1g沸石粉的比例进行混合，制成添加剂。然后在每995kg饲料中加入5kg添加剂，使添加剂占饲料重量的0.5％。C组虾苗的饲料中同样加入了按照B组所用方法制得的添加剂，但是该添加剂使用的AS2.406酵母细胞株是未经活化的。D组虾苗仅用基础饲料进行喂养，其中既不加入抗生素，也不加入酵母细胞添加剂。经过5个月的养殖后，4组实验动物的健康状况如表10所示。表10：不同饲料喂养的虾产量比较
组别 3池虾的总重量 与A组相比的相对重量％
 A  61.7kg  100
 B  71.4kg  115.7
 C  26.7kg  42.3
 D  25.6kg  41.5
为了进一步提高酵母细胞在体内的活性，还需将按上述方法制备的四种活化酵母细胞进行进一步的驯化。将四种酵母细胞培养基各取10ml(细胞密度均为4×106/ml)，加入至500ml按表5配制的培养基中去。将该混合物(13)置于如图2所示的容器(11)中，并在四个具有不同频率范围的电磁场中进行培养。这四个电磁场的频率范围分别为：7497～7516MHZ、6800～6820MHZ、8300～8320MHZ、8425～8445MHZ，其场强范围均为260mV/cm～320mV/cm。将该混合物在孵箱中培养48小时，孵箱温度设定为在5℃、室温、35℃之间进行循环。每次循环历时3小时，周而复始直至48小时结束为止。然后再将活化酵母细胞进行分离，并在0～4℃的条件下储存。
将四种干燥的活化酵母细胞与小于200孔的沸石粉按照1×109个酵母细胞：1g沸石粉的比例进行混合，制成含有四种酵母细胞成分的生物添加剂。然后在每995kg饲料中加入5kg该种添加剂，使添加剂占饲料重量的0.5％。这次选用的实验动物为中国虾类中的一种，平均起始体长为1.6±0.1cm。每次实验使用4个虾池，实验共重复3次，即一共使用了12个虾池。每池虾苗总重量相差小于等于1％。第一个虾池的虾苗(A组)的饲料中添加了按表6A配制的抗生素，且养殖用水中也用表6B中所列的化学物质进行了处理。
B组虾苗的饲料中加入了按上述方法制备的生物添加剂。C组虾苗的饲料中同样加入了按照B组所用方法制得的添加剂，但是该添加剂使用的酵母细胞是未经活化的。D组虾苗仅用基础饲料进行喂养，其中既不加入抗生素，也不加入酵母细胞添加剂。经过5个月的养殖后，4组实验动物的健康状况如表11所示。表11：不同饲料喂养的虾产量比较
组别 3池虾的总重量 与A组相比的相对重量％
 A  64.6kg  100
 B  87.9kg  136.1
 C  28.4kg  43.9
 D  26.1kg  40.4
上述结果表明，本发明的生物组合物一种极其有效的饲料添加剂，其作用包括使养殖动物保持健康，以及使养殖动物在被感染后尽快恢复。
本发明并不局限于上述特定的实施方案的范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的生产过程进行详细地说明，而具有相等功能的生产方法和成分也是属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述和附图，就能够根据各自需要找到很多不同的调整方法。这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

Claims (24)

1.一种生物组合物，其包含至少一种下列酵母细胞成分：
(a)  第一种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在7497～7516MHZ之间、场强在3.5～200mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞；
(b)  第二种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在6800～6820MHZ之间、场强在4.5～190mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞；
(c)  第三种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在8300～8320MHZ之间、场强在11～290mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞；以及
(d)  第四种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在8425～8445MHZ之间、场强在14～320mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞。
2.权利要求1的生物组合物，其包含(a)、(b)、(c)和(d)的酵母细胞成分。
3.权利要求1或2的生物组合物，其中所述的酵母细胞为酵母属细胞。
4.权利要求1或2的生物组合物，其中所述的酵母细胞成分为酿酒酵母细胞。
5.权利要求1或2的生物组合物，其中所述的酵母细胞为干燥酵母细胞。
6.一种动物饲料组合物，其包含权利要求1或2的生物组合物及水产养殖饲料。
7.权利要求6的动物饲料组合物，其中所述的生物组合物进一步包含沸石粉，所述的沸石粉的比例为大约每109个酵母细胞中添加1g沸石粉。
8.权利要求7的动物饲料组合物，其中权利要求1或2的生物组合物和沸石粉所占的重量比例为0.5％。
9.制备生物组合物的方法，所述方法包含在一个或一系列的频率在7497～7516MHZ之间、场强在3.5～200mV/cm之间的电磁场中培养大量的酵母细胞。
10.权利要求9的方法，其中进一步包含在一个或一系列的电磁场中，用包含虾类消化道提取物、野山楂汁和野枣汁的培养基培养大量的酵母细胞。
11.制备生物组合物的方法，所述方法包含在一个或一系列的频率在6800～6820MHZ之间、场强在4.5～190mV/cm之间的电磁场中培养大量的酵母细胞。
12.权利要求11的方法，其中进一步包含在一个或一系列的电磁场中，用包含虾类消化道提取物、野山楂汁和野枣汁的培养基培养大量的酵母细胞。
13.制备生物组合物的方法，所述方法包含在一个或一系列的频率在8300～8320MHZ之间、场强在11～290mV/cm之间的电磁场中培养大量的酵母细胞。
14.权利要求13的方法，其中进一步包含在一个或一系列的电磁场中，用包含虾类消化道提取物、野山楂汁和野枣汁的培养基培养大量的酵母细胞。
15.制备生物组合物的方法，所述方法包含在一个或一系列的频率在8425～8445MHZ之间、场强在14～320mV/cm之间的电磁场中培养大量的酵母细胞。
16.权利要求15的方法，其中进一步包含在一个或一系列的电磁场中，用包含虾类消化道提取物、野山楂汁和野枣汁的培养基培养大量的酵母细胞。
17.生产虾饲料组合物的方法，所述的方法包含：
(a)培养权利要求1的一种或多种酵母细胞成分，
(b)将(a)得到的酵母细胞成分进行干燥，以及
(c)将干燥的酵母细胞与沸石粉及虾饲料进行混合。
18.权利要求17的方法，其中的干燥步骤包含：(i)将酵母细胞在不超过65℃的条件下干燥一段时间，以使所述酵母细胞进入休眠期；以及(ii)将酵母细胞在不超过70℃的条件下干燥一段时间，以使所述酵母细胞中所含水分少于5％。
19.减少水产养殖业中感染性疾病发生率的方法，其包含使用虾饲料组合物喂养虾一段时间，所述的虾饲料组合物包含至少一种下列酵母细胞成分：
(a)第一种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在7497～7516MHZ之间、场强在3.5～200mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞；
(b)第二种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在6800～6820MHZ之间、场强在4.5～190mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞；
(c)第三种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在8300～8320MHZ之间、场强在11～290mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞；以及
(d)第四种酵母细胞成分，其包含在一个或一系列的频率在8425～8445MHZ之间、场强在14～320mV/cm之间的电磁场中培养而制备的大量酵母细胞。
20.权利要求19的方法，其中的动物饲料组合物包含(a)、(b)、(c)和(d)的酵母细胞成分和沸石粉。
21.权利要求19的方法，其中的酵母细胞为酿酒酵母细胞。
22.权利要求19的方法，其中酵母细胞成分和沸石粉占所述动物饲料组合物的重量比例为0.5％。
23.权利要求1或2的组合物，其中用于制备第一种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.502株的细胞，其中用于制备第二种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.562株的细胞，其中用于制备第三种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.982株的细胞，以及其中用于制备第四种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.406株的细胞。
24.权利要求6的动物饲料组合物，其中用于制备第一种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.502株的细胞，其中用于制备第二种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.562株的细胞，其中用于制备第三种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.982株的细胞，以及其中用于制备第四种酵母细胞成分的大量酵母细胞包含酿酒酵母AS2.406株的细胞。
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