CN1479870A - 利用硼酸加合物光学检测葡萄糖 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于测定体外和/或体内水性介质中的多羟基取代的有机分子水平的光学方法和光学传感装置。尤其是，该传感装置可被植入哺乳动物体内检测糖水平。具体而言，在存在果糖或葡萄糖之类的糖时，让染料与共轭的含氮杂环芳族硼酸取代的联鎓盐化合物结合。联吡啶鎓盐(viologen)优选为芳族共轭含氮硼酸取代的化合物。该方法可用于确定人体内的糖水平。
Description
发明背景
相关申请
本申请是2000年12月5日申请的US 09/731323的部分后续申请。在此将该申请完整引用作为参考。
发明领域
本发明涉及一种用于多羟基取代的有机分子的改进光学方法和/或传感器，它能测量水性或者有机介质中这些分子的浓度。在一个应用中，该方法和传感器能够监测
体外水溶液中的糖，即葡萄糖或者果糖的浓度。具体而言，该方法和传感器可以监测
体内水溶液中的糖，即葡萄糖或者果糖的浓度。检测
体外液体和
体内液体中的葡萄糖是很重要的。体内检测装置可植入人体中。就本身来说，这些光学方法和装置的一些新部件也可以认为是发明。
相关技术描述
多年来一直致力于利用荧光技术测量体液中的多羟基化合物(例如葡萄糖)的浓度。尽管此后使用术语“葡萄糖”，但要理解的是也可以测定溶液中大多数含多羟基的有机化合物(碳水化合物，1，2-二醇，1，3-二醇等)。但尽管有这么多努力，至今仍未开发出并商业化一种可用于
体 内监测的实用系统。已多次试图通过荧光法利用结合了硼酸基团的染料来检测葡萄糖。硼酸能可逆地与糖结合是公知的。当硼酸官能染料与糖结合时，会影响染料的特性。过去就是利用这种变化来测量糖浓度的。
Russell的US专利5137833(也可参见Russell与Zepp的US专利5512246)报道了将该方法用于葡萄糖传感器的例子，该专利公开了利用硼酸官能化的染料，该染料能与葡萄糖结合，且产生与葡萄糖浓度相关的信号。James等人的US专利5503770也利用了同一原理，但它将荧光染料、胺淬灭官能团、以及硼酸结合到一个络合物部分中，它们发出的荧光随葡萄糖的结合程度而变化。Van Antwerp等人的US专利6002954和US 6011984结合了前面所引参考文献的特征，还教导了制造一种声称可用于植入的装置。A.E.Colvin、Jr.在US专利6304766中披露了基于光学的传感器，它特别适合人体的原位检测。
感兴趣的专利包括但不限于：
Russell，US专利5,137,833(1992)
James等人，US专利5,503,770(1996)
Russell和Zepp，US专利5,512,246(1996)
Van Antwerp等人，US专利6,002,954(1999)
Van Antwerp和Mastrototaro，US专利6,011,984(2000)
感兴趣的相关US专利包括：
Wolfbeis等人，US专利4,586,518(1986)
Gallop和Paz，US专利4,659,817(1989)
Yafuso和Hui，US专利4,798,738(1989)
Yafuso和Hui，US专利4,886,338(1989)
Saaski等人，US专利5,039,491(1991)
Lanier等人，US专利5,114,676(1992)-
Wolfbeis等人，US专利5,232,858(1993)
Colvin，US专利5,517,313(1996)
Sundrehagen等人，US专利5,631,364(1997)
James等人，US专利5,763,238(1998)
Siegmund等人，US专利5,711,915(1998)
Bamard和Rouilly，US专利5,852,126(1998)
Colvin，US专利5,894,351(1999)
Alder等人，US专利5,922,612(1999)
Arnold等人，US专利6,063,637(2000)
Song等人，US专利6,046,312(2000)
Kimball等人，US专利6,139,799(2000)
Clark等人，US专利6,040,194(2000)
Schultz，US专利6,256,522(2001)
Walt等人，US专利6,285,807(2001)
Colvin，US专利6,304,266(2001)
Van Antwerp等人，US专利6,319,540(2001)
感兴趣的相关文章和出版物包括：
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Wolfbeis等人，
Analytica Chimica Acta(1995)，304，165-170
Wang等人，
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Chen等人，
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Hale博士等人，
Analytica Chimica Acta(1999)，248，155-161
A.E.Colvin，Jr.等人，
Johns Hopkins Technical Digest，第12卷，#17，第378页(1996)
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在此将本申请中所引用的所有专利、文章、参考文献、标准等完整引用作为参考。
所有这些现有技术的传感器在一个或多个方面存在不足，例如生理学条件下的可操作性、操作稳定性、设计简易性、可靠性、可植入性、以及灵敏度。本发明克服了这些缺陷。
发明概述
本发明涉及一种用于测定水性介质中多羟基化合物的浓度、尤其是测定
体内、特别是生理介质中的葡萄糖或果糖之类的糖的光学方法和光学系统。这些化合物、分析物处于带有荧光传感器的系统中，所述传感器包括光源、检测器和活性组分，而活性组分包括荧光团D(荧光染料)、淬灭剂和任选的聚合物基质M。某些组分就其本身来说就是发明。当荧光团受到适宜波长的光的激发时，它就会发光(荧光)。光强度与淬灭程度相关。荧光团和淬灭剂Q优选是独立的实体，任选的是它们可被固定或者以共价方式结合到聚合基质上，所述基质可让要检测和定量的感兴趣化合物渗透，或者与后者接触。
在本发明的一方面中，本发明包括一类荧光淬灭化合物，它能对处于或接近生理pH的水性介质中存在的葡萄糖类多羟基化合物产生响应。换句话说，淬灭效率受介质中这些化合物的浓度控制。淬灭剂包括一种被至少一个硼酸基团取代了的联吡啶鎓盐(viologen)，其中该加合物被固定到聚合物中，或者通过共价键与聚合物结合。淬灭剂、染料和聚合物还可通过共价键彼此结合。
硼酸与联吡啶鎓盐的结合以及对联吡啶鎓盐特性的最终影响都是本发明重要的实施方案。
在另一方面中，本发明是一类聚合荧光染料，它易被联吡啶鎓盐/硼酸的加合物淬灭。有用的染料包括嘧胺(pyranine)衍生物(例如羟基芘三磺酰胺衍生物等)。(见图1A、1B和1C)。
在一个实施方案中，染料包括与一种聚合物结合的羟基芘三磺酰胺部分。磺酸基团转换为磺酰胺基团能将嘧胺的pKa偏移到更适合在生理pH条件下进行测量的范围内。该转换还可将染料的吸光度偏移成更长的波长，从而能使其更有效地被来自兰LED的光激发，所述LED优选为适合植入式传感器的光源。这些衍生物通常是通过让三磺酰氯中间体与以下物质反应制得：1)聚胺，2)胺烯键官能化的不饱和单体，接着让该加合物聚合，3)或者胺官能聚合物。在一个实施方案中，染料是被完全取代了的衍生物，在芘环上未残留任何自由磺酸基。
在另一方面中，本发明是一种复合的可与水共存的聚合物基质，优选为水凝胶，它包含染料和淬灭剂部分。基质是可被水溶胀的共聚物，优选被交联，染料和淬灭剂部分通过连接基L与之以共价键方式结合。在一个实施方案中，基质是一种互穿聚合物网络(IPN)，在一个聚合物网络中结合了染料，而在另一个聚合物网络中结合了淬灭剂。在另一实施方案中，基质是半-IPN，其中染料组分是高分子量的水溶性或者水分散性聚合物，它陷在由淬灭剂单体和适宜的亲水共聚单体构成的交联网络中。任选的是，淬灭剂是可与水共存或可被水分散的成分，染料位于网络内。另外，染料和淬灭剂都可分别结合到水溶性或者水分散性聚合物中，其中染料和淬灭剂都陷在惰性聚合物基质中。任选的是，可通过不让这些成分透过但能让分析物透过的薄膜将这些成分与分析物溶液分离开。任选的是，基质以分子形式印制，以便能有助于染料与淬灭剂之间的结合，从而增加对例如葡萄糖的特定糖优于对其它多羟基化合物的选择性。增强染料与淬灭剂之间相互作用的优选方法是用带负电荷的基团对染料部分进行官能化，这些基团例如羧酸盐、磺酸盐、磷酸盐和膦酸盐。
在另一方面中，本发明涉及一种借助光学传感器检测
体内葡萄糖浓度的装置。该特定装置包括优选为兰色LED光源的可见光源、光电检测器、诸如光纤组件之类的光导管(光波导)、以及水不溶性聚合物基质，所述基质包括易被联吡啶鎓盐淬灭的荧光团、联吡啶鎓盐/硼酸淬灭剂、以及可透过葡萄糖的聚合物，其中基质与所述光路和含分析物的介质接触。
在另一实施例中，本发明涉及一种在大约430到600nm的检测范围内
体内检测作为分析物的多羟基取代有机分子的光学方法，该方法包括：
A.获得荧光团染料D，它能与分析物溶液共存，其中D选自：
(a)D1是一种具有以下特性的荧光团染料：
i.荧光团，
ii.在超过430且小于600nm的范围内激发，
iii.分析条件下能耐受光漂白，
iv.斯托克斯偏移约为或大于30nm，
v.能与所述分析物溶液共存，且其中所述
vi.染料D1能被甲基联吡啶鎓盐淬灭，产生能实验测量的大于或等于50的表观Stern-Volmer淬灭常数(Ksv)，
其中荧光团染料D1是中性或带负电，它是：
(i)分子量为1000道尔顿或以上的分散性化合物，但是，如果染料被带负电的基团取代，其分子量就是500道尔顿或以上；
(ii)水溶性或水分散性聚合物中的侧基或链单元，所述聚合物的分子量大于约10000道尔顿，以及
任选的是所述聚合物通过非共价键方式与水不溶性聚合物介质M1联合，它以物理方式固定在所述聚合物基质M1内，其中所述聚合物基质M1可让所述分析物溶液透过，或与之接触；以及
任选的是，在D1带负电荷，且聚合物被固定为与阳离子性的水溶性聚合物组成的络合物，形成的所述络合物对所述分析物溶液来说是可透的，或者与之接触；
(b)D2是具有以下特性的荧光团染料：
i.荧光团，
ii.能在超过430且小于800nm的范围内激发，
iii.斯托克斯偏移约为或大于30nm，
iv.分析条件下能耐受光漂白，
v.能与所述分析物溶液共存，其中所述
vi.所述染料D2能被甲基联吡啶鎓盐淬灭，产生大于或等于50的表观Stern-Volmer淬灭常数(Ksv)，其中D2通过共价键与不溶性聚合物基质M1键和，其中所述聚合物基质M1对所述分析物是可透的，或与之接触；其中所述荧光团染料D2是以下结构的一部分：M1-L1-D2，但前提条件是D2是多官能团的，它在一个、两个或三个位点与基质M1键和；
L1是水解稳定的共价键联接基团，它选自直接键和的有1到8个碳原子的低级亚烃基，任选的是它被选自以下物质的一种或多种二价连接基团封端或者包括这些基团：磺酰胺，酰胺，酯，醚，硫化物，砜，次苯基，脲烷，脲，胺，以及
B.与含硼酸的淬灭剂部分Q结合，其中Q包括共轭含氮杂环芳香族联鎓盐，该化合物具有能与所述分析物共存的特性，Q在存在所述分析物时产生可监测的染料发光变化，它选自：(i)淬灭剂Q1，它是分子量约为400道尔顿或以上的分散性化合物，或者它是分子量大于10000道尔顿的水溶性或水分散性聚合物中的侧基或者链单元，任选的是所述聚合物通过非共价键方式与任选存在的聚合物基质M1联接，它通过物理方式固定在所述聚合物基质中，或者任选的是所述聚合物被固定为与带负电的水溶性聚合物组成的络合物，或者
(ii)淬灭剂Q2，它通过连接基L2以共价键方式与M1或者与第二水不溶性聚合物基质M2键和，产生M2-L2-Q2，其中L2选自直接键和的有1到8个碳原子的低级亚烃基，任选的是它被选自以下物质的一种或多种二价连接基团封端或者包括这些基团：磺酰胺，酰胺，季铵，吡啶，酯，醚，硫化物，砜，次苯基，脲，硫脲，脲烷或胺，其中要让所述淬灭剂Q1或Q2与所述荧光团染料D1或D2在分子级的水平混合，但前提是，当Q2是多官能团时，它在一个或多个位点处与基质M2连接。
C.在
体内让含分析物的生理液体与染料和淬灭剂接触，并让激发光源与检测器耦合；
D.约在430到600nm的范围内产生可检测并可定量的信号；以及
E.测定所述生理液体中的所述多羟基取代分析物的浓度。
在另一实施方案中，本发明是一种结合了上面所列成分的装置，它们一起作用，用来测量分析物。
在本发明中，与D1和D2结合的术语“聚合物”排除了能与二羟基化合物反应或结合的那些聚合物。有用的聚合物可以是阴离子、阳离子、或者中性物质，它是水解稳定的，且能与
体内液体共存。
在本方法的另一方面中，染料D1选自具有以下结构的嘧胺衍生物的离散分子或聚合物：
其中R1、R2和R3每个都是-NH-CH2-CH2(-O-CH2-CH2)n-X1；
其中X1选自-CH2-OCH3，-CO2H，-CONH2，-SO3H，或者-NH2；以及
n介于约70到10000之间，优选介于100到1000之间。
在本方法的另一方面中，染料D1或D2是由具有以下结构的嘧胺衍生物制备得到的：或者由选自包括以下基团的染料单体制备得到：其中R4＝-H，以及R5选自：-R6-NH-(C＝O)-(C＝CH2)-R7，-R6-O-(C＝O)-(C＝CH2)-R7，-CH2-C6H4-CH＝CH2-或者-CH2-CH＝CH2-其中R6是2到6个碳原子的低级亚烃基，R7＝-H，或者-CH3其中Z是封端基团，它可通过水解去掉，它选自
-(C＝O)-R8-Y其中R8是选自1到4个碳原子的低级亚烃基，以及Y选自-H，-OH，-CO2H，-SO3H，-(C＝O)-NH-R9，或者-CO2-R9，其中R9是1到4个碳原子的低级亚烃基。优选的是染料部分D1作为分散性化合物或者侧基选自：
其中R18是-H或者L3-A，其中L3选自上面的L2，A选自-COOH和-SO3H；以及
R19是-H或者选自上面的R5，但前提是当染料是D2时，R18或R19中的至少一个是可聚合的基团，每个磺酰胺基团可被一个-H取代。
在另一方面中，Q1是分散性化合物，它的分子量(MW)至少是分析物MW的两倍，它是水溶性或者水分散性的，至少有一个硼酸取代基，其中所述化合物通过半透膜与身体隔离开。优选的是Q1作为分散性化合物含两个硼酸取代基。
在另一方面中，淬灭剂Q1选自：
或
其中硼酸基团处于间或邻位上。
在该方法的另一方面中，淬灭剂Q1或Q2由选自包括以下基团的淬灭剂前体制得：或
其中(V)2+是选自以下物质的异构体的含氮共轭杂环芳族基团：联吡啶，乙撑联吡啶，苯撑联吡啶，菲罗啉，或者二氮杂芴(diazafluorene)；其中两个氮原子分别位于不同的芳环中，并且氮位于能形成鎓盐的所有位置上，其中Z1或者Z2是氮上的取代基，它也是选自以下基团的可聚合烯键式不饱和基：
(i)-R10-CO2-C(R11)＝CH2，-R10-NH-(C＝O)-C(R2)＝CH2，或者-CH2-C6H4-CH＝CH2，
在此R10是2到6个碳原子的低级亚烃基或者羟基亚烃基，
其中R11＝-H或者-CH3；或者
(ii)配合基选自：-R12-Z3
其中R12是-CH2-C6H4-或者2到6个碳原子的亚烃基，而
Z3是-OH，-SH，-CO2H，或者-NH2。
Q1是分散性化合物，或者水溶性或水分散性聚合物的侧基或者链单元(线性或者分枝的)。不溶性聚合物基质M1-L2-D2优选是交联网络聚合物。
在另一方面中，Q1或者Q2由选自以下物质的前体来制备：
其中V3和Z4或者Z5是2，3或者4-(CH＝CH2)-吡啶；-N-(CH2)w-O(C＝O)C(CH3)＝CH2)；-O-(CH2)w，-O-CH2-(CH＝CH2)；-O-(CH2)w-O-(C＝O)CH(＝CH2)；以及-O-(CH2)w-O-(C＝O)C(CH3)＝CH2；w是2到6的整数，或者Z4和Z5的定义与上面Z1和Z2的相同。
对于染料D，要注意的是，D1和D2带有附带条件，即染料D1和D2不包括重氮键-N＝N-。
对于淬灭剂Q，Q1和Q2带有附带条件，即淬灭剂Q1和Q2不包括重氮键-N＝N-。
对于此处描述的
体内应用而言，排除了以聚合物形式存在的邻-苄基硼酸衍生物。
附图简述
图1A是(8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰胺)(HPTS-PEG)的结构式。
图1B是(8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰基丙酰胺基磺酰胺)(醋酸基HPTS-MA)的结构式。
图1C是(8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(羧基丙基磺酰胺)(HPTS-CO2)的结构式。
图2A到2G是作为二卤化物盐的淬灭剂Q1的示意性结构表达式。
图2A是反式-1，2-双(4，4’-N，N’-(苄基-4-硼酸)-吡啶)二溴化乙烯；
图2B是1，7-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴菲罗林；
图2C是苄基联吡啶鎓盐(BV)-对比淬灭剂；
图2D是4，4’-N，N’-双(苄基-2-硼酸)-二溴联吡啶(o-BBV)；
图2E是4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴联吡啶(m-BBV)；
图2F是4，4’-N，N’-双(苄基-4-硼酸)-二溴联吡啶(p-BBV)；
图2G是N，N’-双(苄基-(2，3，或4)-硼酸)-4，7-卤代菲罗林(4，7-苯基-o，m，或者p-BBV)；
图3A是响应葡萄糖的不对称联吡啶鎓盐，图3B到3I是淬灭剂前体的示意性表达结构：
图3A是4-N-(苄基-2-硼酸)-4’-N’-(苄基)-溴氯代联吡啶；
图3B是4-N-(苄基-3-硼酸)4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(m-SBBV)；
图3C是4-N-(苄基-2-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(o-SBBV)；和
图3D是4-N-(苄基-4-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(p-SBBV)；
图3E是反式-1，2-二-4-N-(苄基-4-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-联吡啶-4-二溴化乙烯；
图3F是4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-3-乙烯基)-3二溴菲罗林；
图3G是4，4’-N，N’-双-〔苄基-(3-亚甲基-4-乙烯基-溴化吡啶)-5-(硼酸)〕-二溴联吡啶(m-BBVBP)；
图3H是4-N-(苄基-3-硼酸)-7-n-〔苄基-3-(亚甲基-(1-氧代-3-(氧代苄乙烯)-丙烷))-5-硼酸〕-4，7-二溴菲罗林；
图3I是4，4’-N，N-双-〔苄基-(3-亚甲基-4-乙烯基溴化吡啶)-5-(硼酸)〕-4，7二溴菲罗林；
图4A和4B分别是本发明的互穿聚合物网络(IPN)聚合物和半-IPN聚合物的结构的示意性表示图。
图5是苄基联吡啶鎓(0.001M)和4，4’-N，N’-双-(苄基-3-硼酸)-二溴联吡啶(m-BBV)的响应的曲线表示图，它表示m-BBV对HPTS-PEG(1×10-5M)的淬灭效率的调制，该淬灭效率是葡萄糖浓度的函数。
图6是对、间、和邻苄基硼酸联吡啶鎓(BBV)(0.001M)的响应曲线表示图，它表示对HPTS-PEG(1×10-5M)的淬灭效率的调制，该淬灭效率是葡萄糖浓度的函数。
图7是用m-BBV淬灭pH为7.4的磷酸缓冲液中的HPTS-PEG的Stern-Volmer曲线。
图8是用于工艺液流的
体外探针的一个实施方案的示意性表示图，并且它还是说明传感聚合物组合体的应用的实施方案。
图9是
体外探针的第二个实施方案的示意性表示图，它将用于工艺液流中监测例如为葡萄糖或果糖的多羟基有机化合物。
图10是图9的
体外探针的示意性横截面表示图。它还是图9的体内传感聚合物组合体的表示图。
图11是双组分系统4，7-苯基m-SBBV和HPTS-MA的曲线表示图，它描述了在pH为7.4的缓冲液中荧光强度对以秒为单位的时间的曲线。
图12A是随着m-BBV的增加，8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-(羧基丙基磺酰胺)(HPTS-CO2)的荧光发射光谱的曲线图。它描述了0到1mM情况下荧光强度对波长(nm)的曲线。
图12B是8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-(羧基丙基磺酰胺)(HPTS-CO2)/m-BBV对葡萄糖的荧光发射响应的曲线图。它描绘了0到1800mg/dL时荧光强度对波长(nm)的曲线。
图13是8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-(羧丙基磺酰胺)(HPTS-CO2)与m-BBV对葡萄糖的响应曲线表示图。它描绘了F/F0对葡萄糖(mg/dL)的曲线。
图14是双组分系统m-BBVBP和HPTS-MA的荧光强度对时间(秒)的曲线表示图。
发明详述和优选实施例
定义
按照此处所用的：
“硼酸”是指结构-B(OH)2。本领域普通技术人员可以认识到，在合成本发明的淬灭剂过程中，在不同阶段硼酸可以硼酸酯的形式存在。硼酸意味着包括这些酯。
“检测器”是指用于监测光电二极管之类的光强度的装置。
“荧光团”或“荧光团染料”或者“染料”是指这样一种化合物，当它们暴露在适当波长的光条件下时，芳香基或者杂环芳基就会发光，即它发出荧光。荧光团D选自分散性化合物或者可变成第二分散性化合物或者可聚合化合物的反应中间体；或者D是由所述反应中间体或可聚合化合物制备的聚合物中的侧基或者链单元，该聚合物是水溶性或者水分散性聚合物，或者它是水不溶性聚合物，任选的是所述聚合物是交联的。
“HEMA”是指2-羟乙基甲基丙烯酸酯。
“光源”或者“激发光源”是指能发出电磁辐射的装置，例如氙灯、中压汞灯、发光二极管(LED)，所有这些都是商业可得的。
“连接基”是指L、L1或者L2，它们是二价部分，能通过共价键将传感部分连接到聚合物或基质上。L、L1或者L2的例子包括可独立选自直接键合或者带有1到8个碳原子的低级亚烃基的基团，任选的是它被一个或多个二价连接基封端或阻断，这些连接基选自磺酰胺(-SO2NH-)、酰胺-(C＝O)N-、酯-(C＝O)-O-、醚-O-、硫醚-S-、砜(-SO2-)、亚苯基-C6H4-、脲烷-NH(C＝O)-O-、脲-NH(C＝O)NH-、硫脲-NH(C＝S)-NH-、酰胺-(C＝O)NH-、胺-NR-(其中将R定义为具有1到6个碳原子的烷基)等。
“淬灭剂”是指在它出现时能减少荧光团的发射的化合物。淬灭剂Q选自分散性化合物、能转换成第二种分散性化合物或者可聚合化合物的反应中间体，或者Q是由所述反应中间体或者可聚合化合物制备的聚合物中的侧基或者链单元，该聚合物是水溶性或水分散性聚合物，或者它是水不溶性聚合物，所述聚合物任选是交联的。
“
体内”是指活的哺乳动物中的分析，优选是人。
体内测量是在人体内的温度、压力、介质、分析物浓度和pH的生理条件下进行的测量。
“IPN”或“互穿聚合物网络”是指以交叉方式合成的两种或多种网络聚合物的结合(参见L.H.Sperling，Interpenetrating Polymer Networks，ACS Advances in Chemistry Series 239，1994，from August 25-30，1991NewYork ACS Meeting)。
“吡啶盐”是指包括在吡啶环的氮上以及任选地在其它位置的碳上发生了取代的单元、即吡啶环的连接基或者侧基结构。碳上的取代基包括乙烯基，氮上的取代基包括苄基硼酸的亚甲基基团。
“半-IPN”或者“半互穿聚合物网络”是指一种聚合物组合，其中一种组分可溶，而另一种组分是网络(见上面的Sperling)。
“鎓盐”是指杂芳族离子化合物，它的杂原子上带有整齐的正电荷，在联吡啶鎓盐情况下是氮带有正电荷。
“PEG”或者“聚乙二醇”是指含氧乙烯(-OCH2-CH2-)重复单元的聚合物或者链段。
“PEGDMA”指用两个甲基丙烯酸酯基封端的聚乙烯醇。
“PEGMA”是指用一个甲基丙烯酸酯基封端的聚乙烯醇。
“生理pH”是指一般在活的人血液中存在的pH范围7.3-7.5。
“可见光范围”是指谱线介于约400到800nm之间的光。
“联吡啶鎓盐”一般是指基础结构为含氮的共轭N-取代杂环芳族二鎓盐的化合物，例如4，4’-N，N-双-(苄基)二卤代(即二氯、溴氯)联吡啶等。联吡啶鎓盐还包括菲罗啉化合物。
本发明涉及到许多重要的进步。它们包括但不限于一种方法和体内装置，可用于检测分别选自水性或者有机液或者它们组合的液体中的、或者生理液体中的碳水化合物、1，2-二醇或者1，3-二醇的水平。本发明使用了一系列荧光团染料、一系列硼酸取代的淬灭剂、以及相互作用的与水共存的、水溶性的、与有机溶剂共存的、可溶于有机溶剂的有机聚合物的组合。这些方面将在下面详细讨论。首先将讨论这些组分，然后讨论将它们组合成下面的方法和装置。
淬灭剂
在本发明中提供对葡萄糖的识别的部分是芳族硼酸。具体而言，本发明的硼酸能以共价键与共轭的含氮杂环芳族二鎓结构、例如联吡啶鎓盐键合(参见图3A到3I中的例子)，其中硼酸的pKa约小于7，它与水性介质中的葡萄糖可逆反应生成硼酸酯。反应程度与介质中的葡萄糖浓度相关。
本发明的联鎓盐由共轭的杂环芳族二氮化合物制得。共轭杂环芳族二氮化合物选自：联吡啶、乙撑联吡啶，苯撑联吡啶，菲罗啉，或者二氮杂芴；其中氮原子位于不同的芳环上，它们能形成鎓盐。要理解的是，本发明还可以使用所述共轭杂环芳族二氮化合物的所有异构体，其中两个氮都可被取代。由4，4’-联吡啶和4，7-菲罗林衍生出来的联鎓盐是优选的。联吡啶鎓盐硼酸加合物是分散性化合物，或是分子量大于10000的水溶性或水分散性聚合物链中的可与水共存的侧基或单元，或者它能与水不溶聚合物基质键合。在联吡啶鎓盐部分结合了一个或多个硼酸基团。
至于聚合的淬灭剂前体，可存在三种选择将硼酸部分结合到位于基团中央的杂芳族上的两个不同氮上。它们是：
a)让位于第一芳族部分的可聚合基团与一个氮结合，让至少含一个-B(OH)2基团的第二芳族基团与第二个氮结合；
b)让一个或多个硼酸基团结合到与一个氮和一个硼酸结合的第一芳族部分上，让可聚合的基团与第二芳族基团结合，该第二芳族基团与第二个氮结合；以及
c)让一个硼酸基团和一个可聚合基团与第一芳族部分聚合，该第一芳族部分与一个氮结合，硼酸基团和可聚合基团与第二芳族部分结合，该第二芳族部分与第二个氮结合。
带有一个硼酸基团的代表性联吡啶鎓盐包括以下结构：
1.具有如下结构的硼酸取代联吡啶鎓盐：
其中n＝0-3，优选n为1，其中L是连接基，即此处所定义的L1或L2，M是此处所定义的聚合物基质，以及
其中Y2是苯硼酸(m-和p-异构体)或者萘硼酸，优选是苯硼酸，以及
2.作为联吡啶鎓盐杂环上的取代基。
可以预料到联吡啶鎓盐是以上物质的组合。衍生出联吡啶鎓盐/硼酸的前体是不对称取代的联吡啶鎓盐，例如它的一端为硼酸官能团，另一端为乙烯基团之类的可聚合官能团(见图3A-3I)。联吡啶鎓/硼酸部分是水溶性聚合物或者水分散性聚合物的侧基或链单元，或者是足能让葡萄糖透过从而建立起平衡的交联亲水聚合物或水凝胶。
荧光团染料
本发明中使用的染料(见图1A、1B、1C)可被波长约为或大于430nm的光激发，它的斯托克斯偏移足够大，这样激发和发射波长至少能分开10nm，优选能分开大于或等于30nm。这些染料易被联吡啶鎓盐之类的电子受体分子淬灭，并能耐受光漂白，对光氧化、水解和生物降解都很稳定。在用甲基联吡啶鎓盐检测时，本发明中所用染料的表观Stern-Volmer淬灭常数约等于或大于50，优选大于100。在下面的制备过程A中可以找到Stern-Volmer检测的概略描述。优选的染料包括羟基芘三磺酸的聚合衍生物。某些情况下，染料通过磺酰胺官能团与聚合物键合。聚合染料是水溶性的、水不溶但能溶胀的，或者可在水中分散，或者是交联的。例如，优选染料作为聚合物是8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰胺)的水溶性PEG加合物(通过让醋酸基芘三磺酰氯与氨乙酸PEG一甲基醚反应制得)。所得染料聚合物的分子量至少约为10000，这样当它陷在水凝胶或者网络聚合物基质中时，它不能从基质中扩散到周围的水性介质中。
分散性化合物的代表性染料是通过让8-醋酸基芘-1，3，6-三磺酰氯(HPTS-C1)与氨基丁酸类的氨基酸反应制得的三组分加合物(trisadducts)。与一种聚合物键合并带有一个或多个阴离子基团的羟基芘三磺酰胺染料是最优选的，例如8-羟基芘-1-N-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)-N’，N”-3，6-双(羧丙基磺酰胺)HPTS-CO2-MA与HEMA、PEGMA的共聚物等。
其它例子包括8-醋酸芘-1，3，6-N，N’，N”-三(甲基丙烯酰胺基丙基亚磺酰胺)与HEMA、PEGMA或者其它亲水共聚单体的可溶性共聚物。在聚合过程中要利用封端基团保护染料中的酚取代基，该封端基团可通过聚合完成后的水解操作去除。适合的封端基例如醋酸基、三氟醋酸基等，它们都是本领域所公知的。
必不可少的是，为了能进行检测，必需让检测部分(分析物、染料、淬灭剂)紧密地物理接近，以便能相互作用，即以分子的水平混合，并与要检测的物种平衡。虽然大多数情况下没有任何理论或机理的约束，但为了发生淬灭，这些分子必需碰撞，或者分子中心的距离小于10埃。然而，如果分子再远一些，与距离相关的淬灭就会迅速下降。显然，当联吡啶鎓/硼酸加合物和染料紧密接近时，染料发出的荧光强度因光引发的分子内电子从染料转移到联吡啶鎓盐而被削弱。但葡萄糖与硼酸键合时，硼酸酯与联吡啶鎓盐相互作用，从而会根据葡萄糖键合的程度改变它的淬灭效率。虽然还未建立该相互作用的专有特征，但它涉及到电子从硼酸盐转移到联吡啶鎓盐，或者形成硼酸盐，这能让联吡啶鎓盐的还原电位发生偏移。还原电位是淬灭剂接受电子能力的指示。
传感器的聚合物基质
对于
体内应用而言，传感器要用于含一种或多种多羟基有机化合物的生理流体的移动液流中，或者要植入含所述化合物的肌肉类的组织中。因此，必要的是，任何传感部分都不能从传感器组件中脱离出去。于是，对于
体内应用来说，传感成分是有机聚合物传感组合件部分。可溶染料和淬灭剂被半透膜限制住，该半透膜仅让分析物通过，但能阻挡检测部分通过。这可通过利用基本上大于分析物分子的可溶分子(它的分子量至少是分析物的两倍，或者大于1000，优选大于5000)作为检测部分；采用诸如透析或者超滤薄膜作为选择性半透膜，它的特效分子量介于分析物的分子量与检测部分的分子量之间，于是就能定量地留住检测部分。
优选的是，参见图8，检测部分固定在不溶性聚合物基质中，该基质能让葡萄糖自由透过。聚合物基质包括有机物、无机物或者两种聚合物的组合。基质包括生物相容材料。可以选择的是，基质上涂覆了一种能让感兴趣分析物透过的第二生物相容聚合物。
聚合物基质的功能是将荧光团和淬灭剂部分保持并固定在一起，同时让它们与分析物接触，让分析物与硼酸键合。为了达到这种效果，基质必需不溶于介质，并能通过在基质与分析物溶液之间形成高的接触表面积而与介质紧密关联。例如，可以使用超薄薄膜或者微孔支持基质。可以选择的是，基质可在分析物溶液中溶胀，例如可将水凝胶基质用于水性系统。在某些例子中，传感聚合物与诸如光导管表面之类的表面结合，或者浸到微孔薄膜中。所有情况下，基质必需不能干扰分析物向结合位置的传递，这样就能在两相之间建立平衡。在本领域已经创立了制备超薄薄膜、微孔聚合物、微孔溶胶凝胶以及水凝胶的技术。
对于本发明来说，水凝胶聚合物是优选的。此处所用的术语--水凝胶是指在水中基本上能溶胀但不会溶解的聚合物。该水凝胶可以是线性、接枝、或者网络聚合物，或者是高分子电解质络合物，前提是它们不含可溶的或者可浸出的组分。一般而言，可通过在水溶性聚合物上实施的交联步骤来制备水凝胶网络，这样它们能在水性介质中溶胀但不会溶解。可以选择的是，水凝胶聚合物是通过让亲水且交联的单体化合物共聚来制备，从而获得水溶胀的网络聚合物。该聚合物还可通过加成或者缩聚、或者这两种工艺的组合来制备。这些情况下，通过利用单体衍生物结合网络形成单体进行共聚，从而将检测部分结合到聚合物中。可以选择的是，可利用后聚合反应将反应部分结合到已制备好的基质中。所述检测部分是聚合物链中的单元，或者是与这些链结合的侧基。
本发明所使用的水凝胶还可以是单一聚合物，例如单网络，染料和淬灭剂都以共价键与之键合，或者该水凝胶是多组分水凝胶。多组分水凝胶包括互穿网络、高分子电解质络合物、以及两种或两种聚合物的各种其它混合物，由此可以获得能被水溶胀的组合物，它包括分散在水凝胶基质中的第二聚合物，从而改变了微层结构。
单一水凝胶一般通过亲水单体混合物的自由基共聚制得，这些单体包括但不限于：HEMA，PEGMA，甲基丙烯酸，丙烯酸羟乙基酯，N-乙烯基吡咯烷酮，N，N’-二甲基丙稀酰胺等；离子性单体包括：甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵，己二烯二甲基氯化铵，苄乙烯三甲基氯化铵，硫代丙基甲基丙烯酸钠等；交联剂包括：乙二醇二甲基丙烯酸酯，PEGDMA，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯等。利用本领域以形成的原理选择单体比例，以优化网络特性，这些特性包括：渗透性、溶胀指数，凝胶强度。在一个实施方案中，染料部分是从染料分子的烯键式不饱和衍生物衍生而来，例如8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)，淬灭剂部分是从诸如4-N-(苄基-3-硼酸)-’-N’-(苄基-4-乙烯基)-二卤代联吡啶(m-SBBV)之类的烯键式不饱和联吡啶鎓盐衍生而来，基质由HEMA和PEGDMA制得。为了优化发射强度，要对染料浓度进行选择。调节淬灭剂对染料的比例，以实现足以产生理想的可测信号的淬灭。
可以选择的是，单一水凝胶是通过缩聚反应制得。例如，让醋酸芘三磺酰氯与过量的PEG二胺反应，获得溶解在未反应的二胺中的三-(氨基PEG)加合物。让过量氯代trimesoyl和酸中和剂的溶液与4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(2羟乙基)-二卤代联吡啶反应，获得带有酰基氯官能团的联吡啶鎓酯。例如通过浇铸一种混合物的薄膜，然后将它浸到另一种混合物中，从而让这两种反应混合物彼此接触，进行反应生成水凝胶。
在该方法的条件下能与硼酸反应生成硼酸酯的聚合物并不用作基质聚合物。这样的聚合物带有1，2-或者1，3-二羟基取代基，其包括但不限于纤维素聚合物、多糖、聚乙烯醇和它们的共聚物等。
对于制造本发明的传感器来说，在一个组分中结合染料、在另一组分中结合淬灭剂的多组分水凝胶是优选的。另外，任选的是以分子方式印刷这些系统，以增强组分之间的相互作用，并提供对葡萄糖超越其它多羟基分析物的选择性。优选地，多组分系统是互穿聚合物网络(IPN)或者半-互穿聚合物网络(半-IPN)。
IPN聚合物一般是通过连续聚合来制备。首先，形成含淬灭剂的网络。然后用含染料单体的混合物将网络溶胀，进行第二次聚合，由此获得IPN水凝胶。
半-IPN水凝胶是通过将含染料部分的可溶聚合物溶解到含淬灭剂单体的混合物中，然后聚合得到的。可以选择的是，将可溶淬灭剂聚合物溶解在含染料单体的单体混合物中，然后让混合物聚合。在任何一种情况下，可溶组分的分子量必需足够高(约等于或大于10000)，这样它才不会从网络中扩散出去，即它物理地结合在或陷在基质中。
在图4A中，有一组聚合物链41、42、43和44含淬灭剂，例如淬灭剂Q2。第二组聚合物链45、46和47含染料，例如染料D2，它们可同时或先后形成。将聚合物的交联点指定为48和49。在图4B中，有一组聚合物链51、52、53和54含淬灭剂，例如淬灭剂Q2。染料D1是第二聚合物56上的侧基。将交联点指定为57。
分子印刷
任选的是，可通过分子方式印刷本发明的聚合物。在一个实施方案中，由感压淬灭剂阳离子和感压染料阴离子制备出有机盐。然后在离子对至少部分保持关联的条件下让有机盐共聚，生成单一水凝胶基质。可以选择的是，让淬灭剂单体聚合，生成第一聚合物，然后让该聚合物与相反的阴离子染料进行离子交换，得到高分子电解质。然后让后者与适宜的单体共聚，形成通过离子键与淬灭剂聚合物联合的互穿染料聚合物。其结合既可以是IPN聚合物，也可以是半-IPN聚合物。在另一实施方案中，以分子方式印刷本发明的聚合物，它通过首先形成葡萄糖与可聚合的硼酸联吡啶鎓的双硼酸酯，增强了相对果糖之类的其它多羟基混合物对葡萄糖的选择性。然后让该酯共聚，水解，获得印刷了葡萄糖的聚合物。然后让该聚合物与染料聚合物一起形成IPN。
在一个方面中，在含水有机溶剂中让m-SBBV和葡萄糖以约2∶1的摩尔比混合，有机溶剂例如水/二氧六环。通过在真空条件下蒸掉溶剂回收产物双硼酸酯。然后让产物与HEMA和PEGDMA共聚，得到符合实施例14中描述的前体的第一水凝胶。然后通过稀盐酸的调节，从水凝胶中滤除葡萄糖。在用去离子水调节后，让水凝胶与实施例28的染料单体反应，生成阴离子染料与阳离子淬灭剂聚合物之间的络合物。然后用另一些HEMA和PEGDMA进行第二阶段聚合，生成分子形式印刷的IPN水凝胶。
通过相同或不同的聚合模式制备出多-组分水凝胶中的各个组分。例如，在IPN聚合物中，通过自由基聚合形成第一网络，通过缩聚形成第二网络。同样，在半-IPN聚合物中，通过缩聚聚合制出可溶组分，通过自由基聚合形成网络。例如，通过让4，4’-联吡啶与3，5-二-溴甲基苯基硼酸缩聚成诸如聚4，4’-N，N’-双(1，3-亚二甲苯基-5-硼酸)二卤代联吡啶的淬灭聚合物。淬灭剂聚合物可溶解到含上述8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)的反应混合物中，然后让溶液聚合，得到半-IPN水凝胶。
将此处所述各组分结合起来，提供了用于测量生理液体中的多羟基取代的有机分子的装置。
在具体实施方案中，通过让醋酸基芘三磺酰氯与氨乙酸PEG单甲基醚缩合生成8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰胺)，以此制得高分子量的水溶性染料。将PEG染料聚合物溶解到包括HEMA、PEGDMA、4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-二卤代联吡啶(m-SBBV)、含水乙醇和自由基引发剂的混合物中，让它们聚合获得半-IPN水凝胶。在用稀碱水解并用去离子水浸提后，将水凝胶添附到分叉的光纤光导管中，这样水凝胶就暴露给体液，并与之均衡。让光导管连同适宜的过滤器一起与兰光发光二极管(LED)光源、硅光电检测器以及电子控制器、相关的测量仪器相连。将传感器置于插入人体理想位置的导液管顶端。传感器受到约为475nm的光激发，约在520nm处监测荧光强度。由发光强度测得体液中的葡萄糖水平。
单组分联吡啶鎓盐传感器
在本发明的另一实施方案中，本发明是与荧光团以共价键结合的硼酸取代的联吡啶鎓盐。作为分散性化合物的单组分联吡啶鎓盐传感器的例子如例39所示。优选地，该加合物是可聚合的化合物，或者是聚合物中的一个单元。一种这样的加合物可通过以下步骤制得：首先利用4，4’-联吡啶，通过让苄基-3-硼酸基团与一个氮结合，让氨乙酸基团与另一个氮结合，由该联吡啶形成不对称的联吡啶鎓盐，从而制得该加合物。然后首先让联吡啶鎓盐与8-醋酸基芘-1，3，6-三磺酰氯以1∶1的摩尔比缩合，接着与过量的PEG二胺反应，得到预聚物混合物。在两个步骤中都要引入酸中和剂，以便清除副产物酸。通过让预聚物混合物与聚异氰酸酯反应，获得水凝胶。用碱对该产物进行处理，以清除保护基。在进一步使用之前，用去离子水对水凝胶进行彻底提取，从而从中滤除不完全反应产物和未反应的起始材料。在将该产物用作此处所述的检测成分时，它就能对葡萄糖作出响应。
可以选择的是，所述加合物是烯键式不饱和单体，例如，二甲基二-溴甲基苯硼酸酯与过量的4，4-联吡啶反应，生成半联吡啶鎓盐加合物。在去除多余的联吡啶后，让加合物进一步与过量的盐酸溴乙胺反应生成二联吡啶鎓盐加合物。在存在酸中和剂的条件下通过让该加合物与8-醋酸基芘三磺酰氯以1∶1的摩尔比反应，从而与嘧胺染料结合，接着与过量的氨丙基甲基丙烯酰胺反应。最后，让所有残余的氨基与甲基丙烯酰(methacrylol)氯反应。经纯化后，让染料/联吡啶鎓盐单体与HEMA和PEGDMA共聚，得到水凝胶。
该组联吡啶鎓盐的优点在于，可通过共价键将染料和淬灭剂保持在紧密接触的位置，这提高了灵敏度。缺点在于，制备这样的加合物是令人生畏的合成挑战，并且很难改变成分。该产物的表征和纯化同样困难。因此，染料和淬灭剂是独立实体的实施方案是优选的。
成批分析葡萄糖的光学方法
在传统的发光光谱仪中进行测量。制备含本发明的染料和淬灭剂的溶液，将pH缓冲至7.4，然后将它们装到比色杯中。让样品受到波长适合所用染料和的光的激发，测量荧光强度。将固定量的含未知葡萄糖的溶液加到该溶液中，重复测量。参照通过单独测量一系列标准葡萄糖溶液、并绘制出强度随浓度函数变化的曲线而确定的校正曲线，利用强度变化计算葡萄糖浓度。在该方法中，检测成分需要仅在检测时是稳定的，它与葡萄糖的反应不需要可逆。
工艺流体分析的光学方法
制造一种用于发光光谱仪的流通池。将传感聚合物置于流通池内，这样它在一个表面上暴露给激发光，在另一表面暴露给工艺流体。通过让无葡萄糖的工艺流体通过流通池并测量稳态荧光，由此形成基线。然后让工艺流体通过流通池，监测荧光强度，将其作为时间的函数。通过参照上述校正曲线确定葡萄糖浓度。在该方法中，传感器必需在操作时间内保持稳定，它与葡萄糖的反应必需是可逆的。另外，传感部分必需被固定，它不能浸析到工艺流体中。
装置结构
图8是某时或连续监测糖、即葡萄糖的装置的示意性表示图。含染料和淬灭剂的传感聚合物81与任选的支持件82结合。对于某些实施方案，存在着任选的可半透的聚合物薄膜83A。对于其它应用，让可生物相容的最佳涂层83B覆盖组件是有用的。光源84与滤光器85相连，然后与光纤86、传感聚合物81相连。检测器87与光纤88、光纤89相连，光纤89与传感聚合物81相连。光源84和检测器87都与电子控制器90相连。于是该系统能基于生理液体中的葡萄糖含量检测传感聚合物的变化。在图9和10中示出了用于工艺流体和
体内植入的装置。图9示出了光学装置。图10是该探针的横截面表示图。对于图9，光源11(可见)通过光纤12与活性池13相连。半透膜14能让分析物从活性池13中自由进出。光纤15将变化的光传送给滤光器16和任选的光电倍增器17，产生分析用的分析物光谱。
正如图9和10所示，池13包括选择性渗透膜，这样分析条件下聚合物21、染料22和淬灭剂23的混合物被保留在池13内。光通过光纤12进入池14。在池14的活性部分14A中，聚合物21、染料22和淬灭剂33与经选择进入该池的分析物24接触，引起光谱定量和可重复地变化。该改变了的光信号穿过光纤15到达光电倍增器17进行分析。本领域普通技术人员可以认识到，本发明的服务部分可用于本领域已知的其它可植入荧光传感器中。
实验
除非另有指明，使用能从商业供应者处获得的试剂和溶剂。(见每年出版的
Chem Source USA)。
提供以下仅作为说明性和示范性的实施例。不能以任何方式或形式将它们解释为一种限制。
步骤A
利用荧光染料对甲基联吡啶鎓
盐的表观Stern-Volmer淬灭常数进 行荧光光谱分析
由相对荧光强度(F0/F)对淬灭剂浓度(M)的Stern-Volmer曲线的斜率导出表观Stern-Volmer淬灭常数。参见J.R.Lakowicz(1999)的Principles of Fluorescence Spctroscopy Second Edition，KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York，第237-289页。本领域普通技术人员一般能对具体感兴趣溶液中的任何荧光染料/淬灭剂对进行这种分析。这一普通的Stern-Volmer分析可用于确定离子强度为0.1、pH为7.4的磷酸盐缓冲液中的Stern-Volmer淬灭常数。
为了避免浓度淬灭效应，一般要对染料浓度进行调节，以便让染料的光密度为激发λ最大＜＝0.5个吸收单位。一旦确定了理想的染料浓度，就要制备储备染料溶液，其中它的浓度要5倍于最终测量时的理想浓度。例如，如果能让激发λ最大＜＝0.5个吸收单位的光密度的染料的理想最终浓度是1×10-5M，就需要让储备染料的浓度是5×10-5M。
正如上面所描述的，一旦确定了储备染料浓度，就称出适宜质量的染料，将它们置于容量为10mL的烧瓶中，制备出10mL浓度适当的染料储备溶液。然后用离子强度为0.1、pH为7.4的磷酸盐缓冲液将烧瓶充至10mL标志线。
在容积为10mL的烧瓶中用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(离子强度为0.1)制备甲基联吡啶鎓盐的储备溶液(25ml，0.0025M)。按照下面表1中所述，在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中制备7份含甲基联吡啶鎓盐的不同溶液。
表1
| 体积染料标准(mL) | 体积猝灭剂标准(mL) | 体积缓冲液(mL) | 最终(燃料)(M) | 最终(猝灭剂)(M) |
| 1 | 0.00 | 4.00 | 1.00E-05 | 0.00E+00 |
| 1 | 0.20 | 3.80 | 1.00E-05 | 1.00E-04 |
| 1 | 0.30 | 3.70 | 1.00E-05 | 1.50E-04 |
| 1 | 0.50 | 3.50 | 1.00E-05 | 2.50E-04 |
| 1 | 1.00 | 3.00 | 1.00E-05 | 5.00E-04 |
| 1 | 1.50 | 2.50 | 1.00E-05 | 7.50E-04 |
| 1 | 2.00 | 2.00 | 1.00E-05 | 1.00E-03 |
然后在已设定了适宜的激发波长和适合对应染料的发射波长范围的发光光谱仪中依次分析每个样品。在分析这一系列样品的过程中，仪器的设置(狭缝宽度，扫描速度，光纤，激发波长，发射波长范围)要保持恒定。然后通过梯形法则逼近法将发射荧光强度定义为荧光强度在发射波长范围上的积分。将积分值绘制到y轴上，淬灭剂浓度绘制在x轴上，通过线性回归计算所得曲线的斜率，将其作为Stern-Volmer常数。本领域普通技术人员可以认识到，基于淬灭机理，Stern-Volmer曲线不会产生线性关系。但是通过利用本领域普通技术人员所公知和理解的适当数学关系式，可以计算出表观Stern-Volmer淬灭常数，将其用作对比。
制备A
二甲基-(4-溴甲基)-苯硼酸的合成
在氩气条件下让安装了磁力搅拌棒的电炉烘干的100ml圆底烧瓶冷却，装入(4-溴甲基)-苯硼酸(12.49mmol，2.684g)。用隔膜板密封烧瓶，装入戊烷(55ml)。在室温下搅拌悬浮液，一加入新蒸馏的CH3OH(3.16g，4ml，97mmol)，溶液立即澄清。搅拌20分钟后，用MgSO4干燥溶液，然后用CaCl2干燥(以去除过量的CH3OH)。在氩气条件下用插管将上清液引过玻璃烧结漏斗(介质)，然后在真空条件下除掉戊烷。在减压条件下让剩下的黄色油状物进一步干燥(0.1托，1小时)。产生：1.6g，6.59mmol(56％)。1H-NMR(CD3OD，ppm)：4.5(s，2H)，7.4(d，2H)，7.55(d，2H)。11B-NMR(CH3OH，ppm)：29(s)。可利用类似过程制备对应的2-和3-异构体。利用这些产物制备实施例1-3、5和6的硼酸-联吡啶鎓化合物。
制备B
8-醋酸基-芘-1，3，6-三磺酰氯的合成
将8-醋酸基-芘-1，3，6-三磺酸三钠(醋酸基HPTS，11.33g，20mmol)悬浮于30ml已加了5滴二甲基甲酰胺的亚硫酰氯中。让悬浮液回流3小时，在此期间它变成棕色溶液。然后在氩气气氛中让溶液冷却到25℃。然后在真空条件下(2托)蒸掉亚硫酰氯，剩下黄色残余物。然后将该黄色残余连同60ml二氯甲烷转移到三个独立的离心管中。然后对悬浮物进行离心，将上清夜转移到干燥的园底烧瓶中。每次用10mL二氯甲烷清洗离心管内剩下的残余4次。合并上清夜，在氩气气氛下过夜，观察到一些沉淀。将二氯甲烷溶液加到250mL的戊烷中，产生大量黄色固态沉淀。利用双端针(double ended needle)去掉上清液，然后让黄色固体在高真空条件下(0.2托)干燥。产率：8.62g，15.5mmol(78％)，1H-NMR(500MHZ，CDCl3，ppm)：2.682(s，3H)，8.833，(d，J＝10Hz，1H)，8.915(s，1H)，9.458(d，J＝10Hz，1H)，9.509(d，J＝10Hz，1H)，9.630(s，1H)，9.685(d，J＝10Hz，1H)。该产物用于实施例7、9、13、14和15中。
制备C
4-(4-吡啶)-N-(苄基-4-乙烯基)-氯代吡啶的合成
在氩气条件下让安装了磁力搅拌棒的电炉烘干的100ml园底烧瓶冷却，装入4，4’-联吡啶(12.50g，80mmol)。用隔膜板密封烧瓶，装入CH3OH(20ml)。在室温下搅拌均质液，同时借助注射器逐滴加入4-(氯甲基)苯乙烯(2.82，20mmol)。在室温搅拌该溶液48小时后，通过真空除去溶剂。借助插管将干燥的四氢呋喃(50ml)加到反应烧瓶中，然后让混合物静置3天，此时要停止搅拌，让固体沉淀，然后通过插管尽可能地除去溶剂。该过程要重复两次以上，每种情况下混合时间都要减为24小时。经过第三次捣碎后，在氮气条件下过滤混合物，然后通过插管用干燥的二乙酯(200ml)清洗。在压力下，让干燥的氮气通过滤饼1小时，最后施加真空(0.1托，1小时)，由此让滤饼干燥。产率：5.56g，18mmol(90％)。1H-NMR(D2O，ppm)；9.12(d，2H)，8.86(d，2H)，8.48(d，2H)，7.98(d，2H)，7.67(d，2H)，7.57(d，2H)，6.87(dd，1H)，5.92(s，2H)，5.45(d，1H)。将该化合物用于实施例5和6。
制备D
N-苄基-4-乙烯基-4，7-氯代菲罗林(4，7-苯SV)的合成
在氩气条件下，让装备了磁力搅拌棒的火焰干燥的100ml侧臂圆底烧瓶冷却，然后装入4，7-菲罗林(2.14g，11.86mmol)。为烧瓶装上与氩气管线相连的回流冷凝器，通过侧臂装入4-(氯甲基)苯乙烯(0.905g，0.836ml，5.93mmol)和无水CH3CN(20ml)。加热溶液，让它在氩气条件下回流17小时，然后冷却到室温，用二乙醚(30ml)沉淀。让悬浮液沉淀，通过插管除去上清夜。通过插管将剩下的残余物连同15ml溶剂一起转移到离心管内，用丙酮(20ml)捣碎，然后离心(该过程重复4次)。用二乙醚(3×20ml)将粉/褐色固体弄碎，然后在减压条件下干燥。产率：0.367g，1.13mmol(19％)。1H NMR(250MHZ，CD3OD，ppm)：5.266(d，1H，11Hz)，5.80(d，1H，J＝17.75Hz)，6.482(s，2H)，6.708(dd，1H，J1＝11Hz，J2＝17.75Hz)，7.374(d，1H，J＝8Hz)，7.496(d，1H，J＝8Hz)，8.00(dd，1H，J1＝4Hz，J2＝8.5Hz)，8.453(dd，1H，J1＝6Hz，J2＝8.5Hz)，8.60(d，1H，J＝10Hz)，8.697(d，1H，J＝10Hz)，9.20(d，1H，J＝4Hz)，9.50(d，1H，J＝8.25Hz)，9.65(d，1H，J＝5.75Hz)，10.188(d，1H，J＝8.5Hz)。13CNMR(62.5MHz，CD3OD)；62.40，121.344，124.899，126.023，128.454，129.031，130.778，132.161，133.893，134.242，137.205，139.848，140.410，140.699，144.041，147.976，149.541，154.661。
该化合物用于实施例25。
实施例1
4，4’-N，N’-双-(苄基-3-硼酸)二溴代联吡啶的合成
在氩气条件下，让安装了磁力搅拌棒的电炉干燥的50ml离心管冷却，然后装入4，4’-联吡啶(0.469g，3mmol)。用隔膜板密封烧瓶，装入CH3OH(7ml)。在室温下搅拌均质液，同时借助注射器加入新制备的二甲基-(3-溴甲基)-苯硼酸酯(1.82g，7.5mmol)。搅拌该溶液15小时后，对反应容器进行离心(3200RPM下4分钟)，借助插管将CH3OH转移到另一烧瓶中。用丙酮∶水(24∶1，V/V，25ml)捣碎剩下的黄色固体，然后在涡流混合器上用力搅拌并离心。通过插管去除丙酮溶液，捣碎过程要重复两次以上。然后用二乙醚经相同过程捣碎固体。然后在高真空度(0.6托，2小时)下干燥离心管中的浅黄固体。产率：0.956g，1.63mmol(54％)。MP：分解＞230℃。1H-NMR(D2O，ppm)：6.093(s，4H)，7.715(dd，2H，J1＝7.5Hz，J2＝7.5Hz)，7.788(d，1H，J＝7.5Hz)，7.984(s，1H)，8.002(d，1H，J＝7.5Hz)，8.662(d，4H，J＝7Hz)，9.293(d，4H，J＝7Hz)，11B-NMR(CH3OH，ppm)：29(s)。
将该化合物用于下面的实施例16-18和图6。
实施例2
4，4’-N，N’-双-(苄基-4-硼酸)二溴代联吡啶的合成
在氩气条件下，让安装了磁力搅拌棒的电炉干燥的50ml离心管冷却，然后装入4，4’-联吡啶(0.234g，1.5mmol)。用隔膜板密封烧瓶，装入无水CH3OH(7ml)。在室温下搅拌均质液，同时借助注射器加入新制备的二甲基-(4-溴甲基)-苯硼酸酯(1.09g，4.5mmol)。搅拌该溶液15小时后，对反应容器进行离心(3200RPM下4分钟)，借助插管将CH3OH转移到另一烧瓶中。用丙酮∶水(24∶1，V/V，25ml)捣碎剩下的黄色固体，然后在涡流混合器上用力搅拌并离心。通过插管去除丙酮溶液，捣碎过程要重复两次以上。然后用二乙醚经相同过程捣碎固体。然后在减压条件(0.6托，2小时)下干燥离心管中的浅黄固体。产率：0.723g，1.63mmol(82％)。MP：高于230℃分解。1H-NMR(D2O，ppm)：6.116(s，4H)，7.670(d，4H，J＝8.25Hz)，8.017(d，4H，J＝8.25Hz)，8.698(d，4H，J＝6.5Hz)，9.325(d，4H，J＝6.5Hz)，11B-NMR(CH3OH，ppm)：29(s)。参见实施例17和18以及图6。
实施例3
4，4’-N，N’-双-(苄基-2-硼酸)二溴代联吡啶的合成
(a)在氩气条件下，让电炉干燥的50ml离心管冷却，安装磁力搅拌棒。然后称出4，4’-联吡啶(0.234g，1.5mmol)，将它们装到离心管中，然后用隔膜板密封离心管，加入CH3OH(7ml)。在室温下搅拌均质液，同时进行混合。借助注射器加入新制备的二甲基-(2-溴甲基)-苯硼酸酯(1.09g，4.5mmol，1.2ml)，然后在室温(环境温度)下搅拌所得的褐/橙色溶液15小时。对反应容器进行离心(3200RPM下4分钟)，借助插管将CH3OH转移到另一烧瓶中。用二乙醚(25ml)捣碎剩下的黄色固体，然后在涡流混合器上用力搅拌并离心。通过插管去除二乙醚溶液，捣碎过程重复三次以上。然后在减压条件下干燥离心管中的浅黄固体(0.6托，2小时)。产率为70％。1HNMR(D2O，ppm)：6.21(s，2H)，7.72(m，3H)，7.91(d，1H)，8.60(d，2H)，9.18(d，2H)。11BNMR(CH3OH，ppm)30.2(宽s)。
已发现，该化合物能淬灭实施例8的染料的荧光，并对葡萄糖产生响应。参见实施例17。
实施例4
1，7’-N，N’-双-(苄基-3-硼酸)二溴代菲罗林的合成
在氩气条件下，让安装了磁力搅拌棒的电炉干燥的50ml离心管冷却，装入1，7-菲罗林(0.288g，1.6mmol)。用隔膜板密封离心管，装入CH3OH(4ml)，然后借助注射器加入新制备的二甲基-(3-溴甲基)-苯硼酸酯(0.972g，4mmol)。在室温下搅拌均质液15小时，然后回流2小时。在氩气条件下让反应混合物冷却到室温，通过真空除掉CH3OH。用丙酮∶水(40ml，24∶1，V/V)捣碎剩下的黄/橙色固体一整夜，然后用二乙醚(2×40ml)捣碎。通过玻璃烧结的漏斗(介质)过滤悬浮液，在氩气气氛中离析固体。产率：0.495g，0.812mmol(51％)。MP：＞230℃。1H-NMR(D2O，ppm)：6.504(1H)，7.638(1H)，8.025(m，2H)，8.2505(d，1H，8.5Hz)，8.483(in，6H)，8.738(d，1H，J＝8.5Hz)，9.315(d，1H，J＝5.75Hz)，9.605(d，1H，J＝5.75Hz)，10.098(d，1H，J＝8.5Hz)，10.269(d，1H，J＝8.5Hz)11B-NMR(CH3OH，ppm)：28(s)。
已发现该化合物能够淬灭实施例8的染料的荧光，并对葡萄糖作出响应。
实施例5
4-N-(苄基-4-硼酸-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)溴氯代联吡啶(p-SBBV)
的合成
在氩气条件下，让安装了磁力搅拌棒的电炉干燥的50ml离心管冷却，装入4-(4-吡啶)N-(苄基-4-乙烯基)-氯代吡啶(0.463g，1.5mmol)。用隔膜板密封离心管，装入乙腈(6ml)。在室温下搅拌所得粉/橙色悬浮液，同时借助注射器加入新制备的二甲基-(4-溴甲基)-苯硼酸酯(0.486g，2mmol)。将悬浮液搅拌23小时之后，对反应容器进行离心(3200RPM下4分钟)，借助插管将乙腈转移到另一烧瓶中。用丙酮∶水(25ml，24∶1，V/V)捣碎剩下的黄色固体，然后在涡流混合器上用力搅拌并离心。通过插管去除丙酮溶液，捣碎过程重复两次以上。然后用二乙醚以相同过程捣碎该固体。接着在减压条件下(0.5托，1小时)下干燥离心管中的浅黄色固体。产率：0.431g，0.824mmol(55％)。MP：＞200℃。1H-NMR(D2O，ppm)：5.405(d，1H，J＝11.5Hz)，5.929(d，2H，J＝17.5Hz)，5.934(s，2H)，5.981(s，2H)，6.832(dd，2H，J1＝17.5Hz，J2＝11Hz)，7.523(d，2H，J＝9Hz)，7.562(d，2H，J＝8Hz)，7.626(d，2H，J＝8Hz)，7.8815(d，2H，J＝8.5Hz)，8.566(dd，4H，J1＝3.6Hz，J2＝1.5Hz)，9.1855(dd，4H，J1＝6.5Hz，J2＝6Hz)。11B-NMR(CH3OH，ppm)：28(s)。
该化合物能淬灭实施例8的染料的荧光，并对葡萄糖作出响应。
实施例6
4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)溴氯代联吡啶(m-SBBV)
的合成
在氩气条件下，让安装了磁力搅拌棒的电炉干燥的50ml离心管冷却，然后装入4-(4-吡啶)-N-(苄基-4-乙烯基)-氯代吡啶(0.463g，1.5mmol)。用隔膜板密封离心管，装入乙腈(6ml)。在室温下搅拌所得粉/橙色悬浮液，同时借助注射器加入新制备的二甲基-(3-溴甲基)-苯硼酸酯(0.486g，2mmol)。将悬浮液搅拌23小时之后，对反应容器进行离心(3200RPM下4分钟)，借助插管将乙腈转移到另一烧瓶中。用丙酮∶水(25ml，24∶1，V/V)捣碎剩下的黄色固体，然后在涡流混合器上用力搅拌，让它们静置过夜。通过插管去除丙酮溶液，然后用二乙醚(3×25ml)捣碎该固体。每次捣碎都要借助插管除去捣碎剂。接着在减压条件下让浅黄色固体在离心管中干燥(0.015托，3小时)。产率：0.584g，1.12mmol(74％)。MP：高于150℃分解。1H-NMR(D2O，ppm)：5.5165(d，1H，J＝10.75Hz)，6.0435(d，1H，J＝17.8Hz)，6.095(s，2H)，6.049(s，2H)，6.9433(dd，1H，J1＝11.5Hz，J2＝17.9Hz)，7.626(m，4H)，7.724(m，2H)，7.979(s，1H)，7.994(d，1H，J＝7.5Hz)，8.648(d，4H)，9.280(d，4H)。11B-NMR(CH3OH，ppm)：28(s)。
该化合物能用于制备实施例10、11、12和14的聚合物。
实施例7
8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰
胺)的合成
为250ml的园底烧瓶装上磁力搅拌棒，然后装入170ml的干四氢呋喃(THF)。将甲氧基-聚乙二醇(PEG)-胺(5.65g，5630g/mol，1mmol)连同0.5克粒状CaH2一起加到该烧瓶中。在搅拌的同时将混合物加温到30℃达24小时。往烧瓶中加入二异丙基乙胺(0.6ml，129.24MW，0.742g/ml，3.4mmol)，让混合物再次静置1小时。使烧瓶冷却至室温，通过气敏玻璃烧结过滤装置进行过滤，除掉剩余的CaH2和Ca(OH)2。将THF溶液放回250ml的带有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，在搅拌的同时加热到30℃。往温热的THF溶液中加入8-醋酸基-芘-1，3，6-三磺酰氯(0.185g，624.8g/mol，0.3mmol)。该溶液立即变成深蓝色，15分钟后褪为酒红色。在30℃搅拌该反应24小时。通过旋转蒸发除掉溶剂，将残渣溶解于100ml的1M HCl中。用二氯甲烷(3×100ml)萃取该水溶液。合并二氯甲烷组分，通过减压蒸发去除溶解，产生红色固体化合物。产率：约5.5g(～97％)。FTIR(KBr小球，cm-1)：842，963，1060，1114，1150，1242，1280，1343，1360，1468，1732，2525，2665，2891.1。该产物用于实施例8、11、16和17中。
实施例8
8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰
胺)
将8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰胺)溶解在100ml的1M NaOH中，搅拌2小时。将水溶液中和到pH7，然后用二氯甲烷(3×100ml)萃取。合并二氯甲烷组分，通过旋转蒸发减至大约10ml。然后将浓缩后的二氯甲烷溶液逐滴地加到三角烧瓶内正用力搅拌着的400ml二乙醚中。利用Buchner漏斗过滤二乙醚。析出橙色粉末状产物。产率：5.425g，0.31mmol(94％)。FTIR(KBr小球，cm-1)：842，963，1060，1110，1150，1242，1281，1343，1360，1468，2888。通过傅立叶变换红外光谱(FTIR)鉴定，该化合物是三元取代的磺酰胺衍生物。磺酸的IR伸展发生于1195.7cm-1处。在该化合物的FTIR中却没有1195.7cm-1处的伸展。相反，观察到指定给磺酰胺的1110cm-1伸展。在将该化合物溶解在pH为7.4的缓冲液中时，它的荧光可被甲基联吡啶鎓盐淬灭，其表观Stern-Volmer淬灭常数为319M-1。
它的荧光能被实施例1、2和3的产物淬灭，它用于实施例11、16、17、18和19中。
实施例9
8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)(醋酸
基-HPTS-MA)
为100ml的圆底烧瓶装入氨丙基-3-甲基丙烯酰胺-HCl盐(2.68g，15mmol)、50ml乙腈，得白色悬浮液。在搅拌的同时逐滴加水，直至所有白色悬浮液消失，产生两层。加入碳酸钾，将悬浮液搅拌15分钟。将上清液转移到500ml的圆底烧瓶中，用50ml的乙腈冲洗，然后将其合并到500ml的圆底烧瓶中。在氩气条件下往该500ml的在乙腈中含自由胺的圆底烧瓶中加入醋酸基-HPTS-Cl(1.03g，1.8mmol)的黄色溶液、200ml的乙腈、以及20ml的二氯甲烷，让溶液变为黑红，并有沉淀产生。将溶液搅拌1小时，转移上清液，在真空下浓缩，得黑色残渣。用水(1000ml)和50∶50的乙腈/乙酸乙酯溶液(700ml)对残渣进行萃取。再用1000ml的水洗涤有机提取物。让有机提取物在硫酸镁上干燥，然后在旋转蒸发器上浓缩，产生红色残渣，将它溶解到甲醇中。对甲醇溶液进行浓缩，然后在高真空条件下让所得红色残渣干燥，得红色固体，它就是未保护的HPTS-MA。产率：420mg，0.5mmol，28％。1H-NMR(500 MHZ，D4-甲醇，ppm)：1.617(p，J＝6.5Hz，8H)，1.781(s，3H)，1.767(s，6H)，2.934(p，J＝6.5Hz，9H)，3.158(mult，8H)，5.211(t，J＝1.5Hz)，5.229(t，J＝1.5Hz)，5.448(s，1H)，5.510(s，2H)，8.290(s，1H)，8.837(d，J＝9.5Hz，1H)，8.913(d，J＝9.5Hz，1H)，8.988(d，J＝1.5Hz，1H)，9.201(d，J＝9.5Hz，111)，9.222(s，1H)。然后让未保护的HPTS-MA(100g，0.1mmol)悬浮在10ml乙酸酐中，加入催化剂量的醋酸钠，让悬浮液回流2小时。在真空条件下去除醋酸酐和醋酸，用20ml乙腈对所得褐色残渣进行萃取。将提取物滴到150ml的二乙醚中，产生褐色固体沉淀。产生：75mg，0.09mmol(86％)。
该化合物用于实施例13、14和15。
实施例10
4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶共聚成水
溶性聚合物
为50ml的锥形圆底烧瓶装入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(1.50g，11.5mmol)、4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(0.1g，0.191mmol)、和3-((甲基丙稀酰胺)丙基)三甲基氯化铵(0.50g，2.27mmol)。在用隔膜板将烧瓶密封后，用涡流混合器用力搅拌溶液。然后为容器装入异丙醇∶水(8ml，1∶1，V/V)，用氩气脱氧1小时。同时，在另一100ml的侧臂圆底烧瓶中，制备2，2’-偶氮双异丁腈(AIBN，100mg，0.609mmol)的异丙醇∶水(5ml)溶液。为烧瓶装上磁力搅拌棒和冷凝器，然后用氩气脱氧1小时。用注射器吸取全部感压溶液，通过侧臂向AIBN溶液中加入1ml。然后将AIBN的反应容器置于70℃的油浴中，在6小时(1.5ml/hr)内通过注射泵加入剩余的感压化合物要维持。让所得橙色液体在氩气条件下冷却至室温，在真空条件下小心地除掉溶剂。将该非晶固体溶解到CH3OH(20ml)中，借助插管将其定量地转移到离心管中。在加入二乙醚(20ml)并形成白色沉淀后，借助离心(在3200RPM下4分钟)分离出产物。用二乙醚(30ml)清洗该产物，然后在减压条件下干燥(0.5托3小时)，在氩气的惰性气氛中离析。产率：1.345g，(67Wt％)。通过UV吸收确定结合到该聚合物上的联吡啶鎓盐部分的量，它高于期望值的99％。
该产物用于实施例19。
实施例11
半-IPN：利用了HPTS-PEG的4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙
烯基)-溴氯代联吡啶的薄膜共聚
为10ml体积的烧瓶装入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(3.525g，27.08mmol)、4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(0.039g，0.075mmol)、和3-((甲基丙烯酰胺)丙基)三甲基氯化铵(0.3g，1.36mmol)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(1.11g，1.11mmol)、2，2’-偶氮双(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(0.025g，0.077mmol)、以及8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰胺)(0.013g，7.5×10-4mmol)；用异丙醇∶水(1∶1，V/V)将它填充到10ml的标志处。在用涡流混合器用力搅拌该溶液后，用吸液管将它转移到到50ml的锥形圆底烧瓶中，用氩气脱氧1小时。用注射器吸取单体溶液，让注射器固定到聚合腔上。然后在氩气条件下将溶液注入池中，让它们充满池的整个空腔。用Teflon塞封住腔室，封到两层ZIPLOC冷冻袋中。将整个单元浸在40℃的水浴中，加热17小时。从水浴和冷冻袋中取出聚合腔，拆开，得到浅绿色聚合薄膜。对聚合薄膜进行浸提，然后将其存储在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中。该产物用于实施例12。
*聚合腔包括以下部件：(1)IR吸收池架：两块适合容纳吸收池和LUER LOC接口的不锈钢板；(2)吸收池：两块玻璃板，在它们之间容纳着TEFLON0.02”的隔板，在顶板和隔板上钻了些孔；以及(3)垫圈：精密切割的橡胶隔离物，用于将吸收池密封到吸收池架上。
实施例12
对利用了HPTS-PEG的4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-
溴氯代联吡啶(m-SBBV)的半-IPN共聚物进行荧光光谱分析
为两端开口、通道长10mm、5ml的玻璃试管装上两个一次性聚乙烯试管帽。在帽上钻些孔，使其螺纹为10/32的标准螺纹，内径为1/8”。将末端为软管的接头拧到位。然后将塑料薄板切成35×9mm的长方形，在它们中心切出6×15mm的窗孔。由小隔膜板构成两个配件，以便向塑料罩施压，将聚合物固定在试管内。隔膜板的高度为9mm。然后装配流通池，让聚合物薄膜位于试管中心，塑料罩直接位于它上方，这有效地将薄膜与它的窗孔构造在一起。然后用镊子将压力配件固定到位，使它们一个位于流通池底部，一个位于顶部。为位于试管内部的试管帽外壁涂覆真空脂，将其插到试管中密封流通池。将流通池置于装配了正面适配器的Perkin-Elmer LS50B分光光度计上。对流通池进行定位，使它与聚合物接触的侧壁面向仪器的激发光束(首先面向正面适配器)。让1/8”的TYGONPTFE管与流通池的软管接头相接。优化正面适配器的方位，使发射检测器只能检测聚合物表面。利用蠕动泵让pH为7.4的磷酸盐缓冲液(离子强度为0.1)以每分钟30ml的速率通过流通池循环。利用Perkin-Elmer LS50B软件的时间驱动函数，每隔10秒采集积分时间为2秒的荧光强度读数。将激发频率设为475nm，发射狭缝宽度为536nm。将激发与发射狭缝设定为2.5nm。利用缓冲液建立值为358(荧光强度)的基线。停止蠕动泵，将泵送溶液改为溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中的1800mg/dl的葡萄糖。
对应于信号增加35％(S/N比＝72)，荧光强度增加127个单位，达到值485。在切回缓冲液后，信号接近期望的基线值358。
实施例13
8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)水凝胶
聚合物
为利用了内螺纹的14/20磨口玻璃接头改进的16mm NMR管装入异丙醇/水(1∶1，1.5ml)、HEMA(750ml)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(PEGMA，n～25)(200mg)、3-(甲基丙烯酰胺)丙基三甲基氯化铵(TMAC)(50mg)、8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)(醋酸基-HPTS-MA)(1mg，1.2×10-6mol)、以及(2，2’-偶氮双-2(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(VA-044自由基引发剂)(5mg)。借助涡流混合器让所有固体溶解。然后为NMR管装上外螺纹的14/20磨口玻璃接头TEFLON旋塞，连接真空接头。然后借助四次冷冻/泵送/解冻循环(-78℃，1托，5分钟，在氮气条件下解冻)为混合物脱氧。接着在40℃(±0.5℃)的水浴中加热NMR管12小时。小心的打破玻璃NMR管，取出聚合物栓。在200ml的去离子水中用三乙胺(5-滴)透析聚合物(去离子水与胺溶液每24小时变一次，长达7天)，以去除醋酸基-HPTS-MA上的醋酸基保护基团。将所得聚合物栓切成约为5mm的片，用荧光光谱进行分析。
该凝胶的激发和发射谱图基本上类似于用PEG加合物(实施例12)得到的谱图。在日光下检测时，悬浮在pH7.4的缓冲液中的聚合物凝胶样品发出可见荧光。在往水相里加入了m-SBBV、o-SBBV、p-SBBV时，荧光显著消失。在往溶液中加入葡萄糖时，又能恢复荧光。利用浓度为0.05到5mg/g聚合物(干重)的染料可以制备出类似凝胶。所有这些都是黄绿色到橙色，在日(自然)光下检测时，它们能发出可见荧光。
但让水凝胶暴露在水性o-、m-、p-BBV(苄基硼酸联吡啶鎓)中时，荧光被淬灭。
实施例14
IPN：使用了HPTS-MA聚合物的4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-
乙烯基)-溴氯代联吡啶(m-SBBV)共聚物
感压淬灭溶液：为10ml容积的烧瓶装入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(27.08mmol，3.525g)、4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(0.197mmol，0.103g)、3-((甲基丙烯酰胺)丙基)三甲基氯化铵(1.36mmol，0.30g)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(1.11mmol，1.11g)、以及2，2’-偶氮双(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(0.077mmol，0.025g)；用异丙醇∶水(1∶1，V/V)将其填充到10ml的标记处。在涡流混合器上用力搅拌该溶液，直至它均匀。
聚合染料粉末：为10ml体积的烧瓶装入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(27.08mmol，3.525g)、3-((甲基丙烯酰胺)丙基)三甲基氯化铵(1.36mmol，0.3g)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(1.11mmol，1.11g)、以及2，2’-偶氮双(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(0.077mmol，0.025g)、以及8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)(7.5×10-4mmol，6.6×10-4g)；用异丙醇∶水(1∶1，V/V)将它填充到10ml的标志处。在用涡流混合器用力搅拌该溶液后，用吸液管将它们转移到50ml的圆底烧瓶中，用橡胶隔膜板密封烧瓶。用氩气脱氧30分钟。用注射器吸取感压溶液，用橡胶塞把针头盖上。然后将它们连同聚合腔一起转移到充满氩气的手套箱中。将注射器固定到聚合腔上，然后在氩气条件下把溶液注入池内，让它们充满这个池。用Teflon塞封住腔室，封到两层ZIPLOC冷冻袋中。将整个单元转移到烘箱中，加热到40℃14小时。从烘箱和袋中取出聚合腔，接着拆开，得到浅绿色聚合薄膜。用500ml的蒸馏水(pH 5)浸提聚合薄膜6小时；每两小时换一次新鲜水。然后在减压条件下让薄膜干燥(40℃，20mmHg，3小时)，让其降到-196℃，利用研钵和杵把它们压成细粉。
互穿网络聚合物：为50ml的圆底烧瓶装入感压淬灭溶液(5.2ml)和聚合染料粉末(0.169g)。在涡流混合器上用力将混合物搅拌10分钟，让液体被染料颗粒吸收，然后用氩气脱氧15分钟。用注射器吸取该多相溶液，用橡胶塞盖封住针头。然后将它连同聚合腔一起转移到充满了氩气的手套箱内(*见实施例11)。将注射器固定到聚合腔上，在氩气条件下往池内注入溶液，使其充满这个腔室。用TEFLON塞封住腔室，然后封到ZIPLOC冷冻袋中。将整个单元转移到烘箱中，加热到40℃14小时。从烘箱和袋中取出聚合腔，接着拆开，得到浅绿色聚合薄膜。将薄膜置于pH等于8的NaOH溶液中12小时，然后浸析，置于pH等于7.4的磷酸盐缓冲液中存储。
将该产物用于实施例20。
实施例15
双组分系统：利用了HPTS-MA的4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基
-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(m-SBBV)共聚物
为10ml体积的烧瓶2-羟乙基甲基丙烯酸酯(27.08mmol，3.525g)、4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(0.039g，0.075mmol)、3-((甲基丙烯酰胺)丙基)三甲基氯化铵(1.36mmol，0.3g)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(1.11mmol，1.11g)、以及2，2’-偶氮双(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(0.077mmol，0.025g)、以及8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺基丙基磺酰胺)(7.5×10-4mmol，6.6×10-4g)；用异丙醇∶水(1∶1，V/V)填充到10ml的标志处。在用涡流混合器用力搅拌该溶液后，用吸液管将它们转移到50ml的锥形圆底烧瓶中，用橡胶隔膜板密封烧瓶；用氩气脱氧30分钟。用注射器吸取感压溶液，橡胶塞封住针头。然后将它们连同聚合腔一起转移到充满氩气的手套箱中*(*见实施例11)。将注射器固定到聚合腔上，然后在氩气条件下把溶液注入池内，让它们充满这个池。用Teflon塞封住腔室，封到两层ZIPLOC冷冻袋中。将整个单元转移到40℃的水浴中加热14小时。从烘箱和袋中取出聚合腔，接着拆开，得到浅绿色聚合薄膜。将薄膜置于pH等于8的NaOH溶液中12小时，然后浸析，置于pH等于7.4的磷酸盐缓冲液中存储。该产物用于实施例21。
实施例16
利用8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺
酰胺)HPTS-PEG对4，4’-N，N’-二(苄基-2，3或4-硼酸)-二溴代联吡啶进行
荧光光谱分析
在10ml体积的烧瓶中用pH等于7.4的磷酸盐缓冲液(0.1离子强度)制备HPTS-PEG(10ml，5×10-5M)的储备溶液。类似地，制备出m-BBV溶液(25ml，0.0025M)。然后按照下面的表2所描述的，在pH7.4的磷酸盐缓冲液中制备出7份含HPTS-PEG和m-BBV的不同溶液。
表2体积 体积 体积 最终 最终HPTS-PEG 标准(mL) 缓冲液(mL) (HPTS-PEG) BBV(m-BBV)标准(M) (M) (M)(mg/DL)1 0.00 4.00 1.00E-05 0.00E+001 0.20 3.80 1.00E-05 1.005-041 0.30 3.70 1.00E-05 1.505-041 0.50 3.50 1.00E-05 2.505-041 1.00 3.00 1.00E-05 5.005-041 1.50 2.50 1.00E-05 7.505-041 2.00 2.00 1.00E-05 1.005-03
然后在Perkin-Elmer LS50-B发光光谱仪上分析每个样品。仪器设置为：
激发波长：473nm
发射波长范围：480-630nm
激发狭缝宽度：0nm(仪器相关性最小)
发射狭缝宽度：0nm(仪器相关性最小)
光纤：无
扫描速度：100nm/sec
在整个系列分析过程中，仪器设置(狭缝宽度、扫描速度、光纤、激发波长、发射波长范围)都要保持恒定。然后通过对480和630nm之间的荧光强度曲线进行积分(梯形法则逼近法)，实现对发射荧光的定量。确定表观Stern-Vlmer淬灭常数为520M-1(见图7)。
实施例17
利用8-羟基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺 酰胺)HPTS-PEG通过荧光光谱法分析4，4’-N，N’-二(苄基-2，3或4-硼酸)- 二溴代联吡啶的葡萄糖检测能力(a)在10ml体积的烧瓶中用pH等于7.4的磷酸盐缓冲液(0.1离子强度)制备HPTS-PEG(10ml，5×10-5M)的储备溶液。类似地，制备出m-BBV溶液(25ml，0.0025M)和a-D葡萄糖(10ml，0.250M)溶液。然后按照下面表3的描述，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中制备出7份含HPTS-PEG、m-BBV和a-D-葡萄糖的不同溶液。
表3体积 体积 体积 体积 最终 最终 最终HPTS-PE m-BB 葡萄糖 缓冲液 (HPTS-P (m-BBV) (葡萄糖)G储备 V储备 储备 (mL) EG)(M) (M) (mg/dL)(mL) (mL) (mL)1 2 0 2 1.00E-05 1.00E-03 0.001 2 0.02 1.98 1.00E-05 1.00E-03 18.021 2 0.04 1.96 1.00E-05 1.00E-03 36.031 2 0.2 1.8 1.00E-05 1.00E-03 180.161 2 0.4 1.6 1.00E-05 1.00E-03 360.321 2 1 1 1.00E-05 1.00E-03 900.801 2 2 0 1.00E-05 1.00E-03 1801.60
利用pH计分别确定每个样品的pH，以保证该系列中pH恒定在±0.02个pH单位的范围内。
然后在Perkin-Elmer LS50-B发光光谱仪上分析每个样品。仪器设置与实施例16的相同。
接着利用相对积分值构造校正曲线：绘制F/F0对葡萄糖浓度(mg/dl)的曲线，其中F0是表3中含0mg/dl葡萄糖的第一个样品的积分荧光强度。
(a)用HPTS-PEG评价葡萄糖灵敏度。在存在HPTS-PEG染料的情况下，将苄基联吡啶鎓盐的葡萄糖检测能力与4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴代联吡啶的检测能力作对比。按照过程A描述的方式确定HPTS-PEG存在时苄基联吡啶鎓盐的表观Stern-Vlomer淬灭常数，发现它是559M-1。以相同方式确定存在HPTS-PEG时的苄基联吡啶鎓盐的葡萄糖灵敏度。苄基联吡啶鎓盐/HPTS-PEG溶液的信号对葡萄糖的浓度变化不反应。在图5中示出了4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴代联吡啶的葡萄糖灵敏度以及苄基联吡啶鎓盐的葡萄糖灵敏度。
(b)类似地，除了用4，4’-N，N’-二(苄基-4-硼酸)-二溴代联吡啶代替4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴代联吡啶外，重复(a)。以相同方式分析邻位和对位异构体。它们对葡萄糖灵敏度的结果类似。结果绘于图6中。
实施例18
HPTS-PEG存在时苄基联吡啶鎓盐与4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴代联吡啶的葡萄糖灵敏度对比
在存在HPTS-PEG染料的条件下，将苄基联吡啶鎓盐的葡萄糖检测能力与4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴代联吡啶的检测能力作对比。按照过程A的描述确定存在HPTS-PEG时的苄基联吡啶鎓盐的表观Stern-Volmer淬灭常数，发现它是559M-1。按照与实施例17相同的方式确定存在HPTS-PEG时的苄基联吡啶鎓盐的葡萄糖灵敏度。苄基联吡啶鎓盐/HPTS-PEG溶液的信号对葡萄糖的浓度变化不反应。在图5中示出了4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴代联吡啶的葡萄糖灵敏度以及苄基联吡啶鎓盐的葡萄糖灵敏度。
实施例19
4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(m-SBBV)
的水溶性共聚物的荧光光谱分析
在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中制备实施例10的m-SBBV共聚物(50ml，2.5mM)，并用NaOH溶液平衡pH(±0.02pH单位)。然后制备六份含HPTS-PEG(染料，1×10-5)的不同聚m-SBBV(分析物，0，0.10，0.15，0.25，0.50，0.75，1.0mM)溶液。然后在分光光度计上进行分析。把分析物/染料溶液装在标准的10mm光路长度的石英比色杯中，将分光光度计设定成激发和发射频率分别为473和533。将激发和发射狭缝宽度设定成0nm。在得到上面提到的溶液的荧光光谱后，获得存在和不存在葡萄糖和果糖条件下的分析物/染料溶液的辅助光谱。将光谱的表观差异定量为曲线下方的面积。然后将面积差定义为聚合物对葡萄糖或果糖、即不存在葡萄糖或果糖条件下的响应表达，确定该曲线下的代表面积为26479.45。一加入浓度不同的葡萄糖，面积就按照表4所示的方式改变。
表4
加入葡萄糖后的1.0mM聚m-SBBV/HPTS-PEG溶液的荧光强度变化；它被表示为曲线下方的面积
葡萄糖(mg/dl) 曲线下方的面积
0 26479.45
18 26934.93
36 27163.92
180 27988.86
360 28221.08
900 28810.57
1800 29434.23
于是，一加入1800mg/dl的葡萄糖，荧光强度就增加11％，一加入1800ml/dl的果糖，它就增加14.6％。
实施例20
利用分散的HPTS-MA水凝胶对下述IPN进行荧光光谱分析：
4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(m-SBBV)的共
聚物
过程参见实施例12。
用蠕动泵让pH为7.4的磷酸盐缓冲液(离子强度0.1)以每分钟30ml的速率循环过流通池。
利用Perkin-Elmer LS50B软件的时间驱动函数，每隔10秒采集积分时间为2秒的荧光强度读数。将激发频率设为475nm，发射频率设定为536nm。分别将激发与发射狭缝设为15和20nm。利用缓冲液建立基线值249(荧光强度)。停止蠕动泵，将泵送溶液改为溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中的1800mg/dl的葡萄糖。
对应于信号增加10％(S/N比率＝43)，荧光强度增加25个单位，达到值274。在切回缓冲液后，信号达到期望的基线值249。
实施例21
利用醋酸基-HPTS-MA对以下双组分系统进行荧光光谱分析：
4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(m-SBBV)的薄
膜共聚水凝胶
分析过程参见实施例12。
用蠕动泵让pH为7.4的磷酸盐缓冲液(离子强度0.1)以每分钟30ml的速率循环过流通池。利用Perkin-Elmer LS50B软件的时间驱动函数每隔10秒采集积分时间为2秒的荧光强度读数。将激发频率设为475nm，发射频率设定为536nm。激发和发射狭缝设为7nm。利用缓冲液建立基线值490(荧光强度)。停止蠕动泵，将泵送溶液改为溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中的400mg/dl的葡萄糖。
对应于信号增加1.5％(S/N比率＝6.5)，荧光强度增加9个单位，达到值499。重复切换溶液的过程。缓冲液给出期望的基线值490。在换回溶解在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中的1800mg/dl的葡萄糖溶液后，荧光强度增加35个单位，达到525，相应信号增加7.6％(S/N＝15.0)。最后，在将缓冲液泵送过系统时，基线跌落到期望的基线值490。
实施例22
利用4，4’-N，N’-双(苄基-3-硼酸)-二溴代联吡啶(m-BBV)和(8-羟基
芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲氧基聚乙氧基乙基(n～125)磺酰胺)(HPTS-PEG)
对水溶液中的葡萄糖的浓度进行荧光分光光度检测
在10ml体积的烧瓶中用pH等于7.4的磷酸盐缓冲液(0.1离子强度)制备HPTS-PEG(10ml，5×10-5M)的储备溶液。类似地，制备出m-BBV(25ml，0.0025M)溶液、a-D-葡萄糖(10ml，0.250M)溶液。然后按照下面的表5的描述，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中制备出7份含HPTS-PEG、m-BBV和a-D-葡萄糖的不同溶液。
表5体积 体积 体积 体积 最终 最终 最终HPTS-P m-BBV 葡萄糖 缓冲液 (HPTS-P (m-BBV) (葡萄糖)EG储备 储备 储备 (mL) EG)(M) (M) (mg/dl)(mL) (mL) (mL)1 2 0 2 1.00E-05 1.00E-03 0.001 2 0.02 1.98 1.00E-05 1.00E-03 18.021 2 0.04 1.96 1.00E-05 1.00E-03 36.031 2 0.2 1.8 1.00E-05 1.00E-03 180.161 2 0.4 1.6 1.00E-05 1.00E-03 360.321 2 1 1 1.00E-05 1.00E-03 900.801 2 2 0 1.00E-05 1.00E-03 1801.60
利用pH计分别确定每个样品的pH，以保证整个系列中pH恒定在±0.02个pH单位的范围内。
分析过程参见实施例17。
将2ml未知浓度的葡萄糖水溶液置于5ml体积的烧瓶中，再往烧瓶中加入1ml的HPTS-PEG储备溶液和2ml的m-BBV储备溶液。让样品混合，将其置于适宜的比色杯中，按照前面所述方式分析样品的荧光发射强度。然后通过对480和630nm之间的荧光发射强度曲线进行积分(利用梯形规则逼近法)，实现对荧光发射强度的定量。将该未知葡萄糖浓度样品的荧光发射强度定量值与y轴上的校验曲线比较，读取x轴上的对应葡萄糖浓度，以此确定未知的葡萄糖浓度。然后相对5/2的稀释因子调整校验曲线上读出的葡萄糖浓度，从而确定出未知样品的葡萄糖浓度。
实施例23
利用使用了HPTS-PEG的4-N-(苄基-3-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯
基)-溴氯代联吡啶的薄膜共聚物(半-IPN薄膜)通过荧光分光光度法测
量水性样品中的葡萄糖浓度
按照实施例11的描述制备薄膜共聚物，将其安装在实施例12所述的荧光分光光度计内。然后制备出溶解在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中的7份100ml的a-D-葡萄糖储备溶液(0，18，36，180，360，900和1800ml/dl)。让这7份溶液依次循环过流通池，按照实施例13的描述分析荧光发射强度。每种情况下，都要在改变溶液之前让荧光发射强度稳定。建立校验曲线，绘出稳定后的荧光强度值对相应葡萄糖浓度的曲线。利用pH计测定葡萄糖浓度未知的样品的pH值，并利用浓酸或碱将其调节为7.4±0.02。让未知样品循环过流通池，观察它的荧光发射强度，直至它稳定下来。让葡萄糖浓度未知的样品循环过流通池，观察它的荧光发射强度，直至它稳定下来。通过将它的稳定荧光发射强度定量值与y轴上的校验曲线比较，在x轴上读取对应的葡萄糖浓度，由此确定出未知的葡萄糖浓度。相对因调节样品pH而产生的任何稀释因子调整最终确定的未知样品的葡萄糖浓度。
实施例24
4，N-(苄基-3-硼酸)-4，7-溴代菲罗林(4，7-phen-m-BV)的合成
在氩气条件下，让安装了磁力搅拌棒的电炉干燥的250ml圆底烧瓶冷却，然后装入4，7-菲罗林(6.16g，34.2mmol)。为烧瓶装上与氩气干线相接的回流冷凝器，再装入N，N-二甲基甲酰胺(80ml)。加热悬浮液并保持90℃，让它溶解，同时借助注射器加入新制备的二甲基-(3-溴甲基)-苯硼酸酯(5.562g，22.8mmol)。用TLC监测反应，3小时后，硼酸酯消失。在氩气条件下让反应混合物冷却至室温，通过插管将橙色悬浮液转移到水敏烧结漏斗中。收集橙红色固体，用丙酮(4×50ml)洗涤，然后在减压条件下干燥过夜。产率：3.652g，17.7mmol(78％)。1H-NMR(500MHz，CD3OD，ppm)：3.31(s，6H)，6.487(s，2H)，7.427(mult.，2H)，8.002(dd，1H，J＝10Hz)，8.451(dd，1Hm，J1＝6Hz，J2＝8.5Hz)。13CNMR(125MHz，CD3OD)：61.48，119.825，123.258，124.429，124.493，128.279，128.472，129.194，132.161，132.707，133.990，138.161，139.107，142.428，146.358，147.947，153.080，163.379。11B-NMR(80MHz，MeOH，ppm)：27.4(s，宽)。
该化合物用于实施例31。
实施例25
4-N-(苄基-3-硼酸)-N，7-(苄基-4-乙烯基)-4，7-溴氯代菲罗林
(4.7-phen-m-SBBV)的合成
将N-苄基-4-乙烯基-4，7-氯代菲罗林(0.243g，0.730mmol)悬浮在火焰干燥的、25ml的侧臂圆底烧瓶内的CH3CN(2ml)中，所述烧瓶安装了磁力搅拌棒和回流冷凝器。借助注射器通过侧臂加入二甲基-(3-溴甲基)-苯硼酸酯(2.8g，11.5mmol)，在氩气条件下加热悬浮物，让它回流64小时。让溶液冷却至室温，用二乙醚(10ml)沉淀。让悬浮液静置，借助插管去除上清液。将剩余残渣连同3ml的溶剂一起转移到离心管中，用丙酮水(50/50，V/V，20ml)捣碎，然后离心(该过程重复4次)。用二乙醚(3×20ml)捣碎米/黄色固体，在减压条件下干燥。产率：0.354g，0.615mmol(84％)。1H-NMR(250MHz，D2O，ppm)：5.223(d，1H，11.25Hz)，5.715(d，1H，J＝17.75Hz)，6.434(d，4H)，6.605(dd，1H，J1＝11.25Hz，J2＝17.75Hz)，7.446(mult.，8H)，8.604(mult.，1H)，8.92(d，2H，J＝3.5Hz)，9.698(d，2H，J＝5.75Hz)，10.214(d，2H，J＝9Hz)。CH3OH，ppm)：29.5(s，宽)。
该化合物用于实施例26。
实施例26
双组分系统：4-N-(苄基-3-硼酸)-7-N’-(苄基-4-乙烯基)-4，7-溴氯代
菲罗林(4，7-PHEN-m-SBBV)与醋酸基-HPTS-MA薄膜共聚
为容积为10ml的烧瓶装入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(3.525g，27.08mmol)、4，7-菲罗林-(苄基-3-硼酸)-N’-(苄基-4-乙烯基)溴氯(m-SBBV)(0.086g，0.15mmol)、3-((甲基丙烯酰胺)丙基)三甲基氯化铵(0.3g，1.36mmol)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(1.11g，1.11mmol)、2，2’-偶氮双(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(0.025g，0.077mmol)、以及8-醋酸基芘-1，3，6-N，N’，N”-三-(甲基丙烯酰胺丙基磺酰胺)(6.6×10-4g，7.5×10-4mmol)；用异丙醇∶水(1∶1，V/V)填充到10ml标志处。在用涡流混合器用力搅拌该溶液后，将其连同聚合腔一起转移到手套箱中*。(*参见实施例11)。把注射器固定到聚合腔上，然后在氩气条件下将溶液注入流通池中，让它们充满池的整个空腔。用LUER-LOC塞封住腔室，封到两层ZIPLOC冷冻袋中。将整个单元浸在40℃的烘箱中，加热18小时。从烘箱中取出聚合腔，让它达到室温。接着拆开，用pH为8的NaOH溶液浸析橙色薄膜7小时，让它完全变成绿色。把该绿色薄膜存储在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中。该聚合物的特征在实施例32中。
实施例27
制备8-醋酸基-1，3，6-芘-三羧丙基-磺酰胺(HPTS-CO2)氢二钠盐
为安装了搅拌棒和橡胶隔膜板的100ml圆底烧瓶装入1-醋酸基-3，6，8-芘三磺酰氯(0.5mmol，272.91mg)和40ml THF。将4-氨基-丁酸钠(1mmol，125.10mg)置于含2ml THF和0.26ml去离子水的小试管中。让该悬浮液产生短时间的涡流，然后吸到3ml的塑料注射器中。将N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺HCl的样品置于含5ml THF和0.55ml 1M的NaOH水溶液的小试管中。让该悬浮液产生短时间的涡流，然后吸到10ml的塑料注射器中。迅速搅拌100ml圆底烧瓶内的溶液，然后加入5.2ml去离子水，接着逐滴加入4-氨基-丁酸钠悬浮液，产生大红色溶液，在搅拌下10分钟后它褪成黄色。然后再次为烧瓶逐滴加入N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺HCL悬浮液，产生红色溶液，它又褪成黄色。将溶液搅拌4小时。之后，通过旋转蒸发然后经过高真空，除掉溶剂。将烧瓶内固体放到极少量甲醇中，用二乙醚沉淀。通过离心收集沉淀，重复沉淀，得到最终产物。1H-NMR(500MHz，CD3OD，ppm)：1.601(M，J＝8Hz)，1.829(Q，J＝5Hz)，2.392(T，J＝2.5Hz)，2.584(S)，2.890（T，J＝7.5Hz)，2.933(T，MHz)，5.519(1)，J＝176.5Hz)，8.306(S)，8.526(S)，8.616(1)，J＝9.5Hz)，9.062(13，J＝9.5Hz)，9.130(13，J＝9.5Hz)，9.225(1)，J＝10Hz)，9.305(S)，9.317(S)，9.338(S)，9.358(S)，9.440(S)。它们是特定异构体的混合物。
该产物用于实施例37。
实施例28
制备-8-醋酸基-1，3，6-芘-三羧丙基-磺酰胺(醋酸基-HPTS-CO2)
为圆底烧瓶装入4-氨基丁酸(5.156g，50mmol)。加入甲醇(50ml)，然后加入氢氧化钠(2g，50mmol)。搅拌溶液，直至它变均匀，此时在旋转蒸发器上除掉甲醇。利用乙腈通过共同蒸发作用进一步干燥棕褐色固体，从而除掉水。
制备HPTS-CO2
：在氩气条件下，让装备了磁力搅拌棒的烘箱烘干的圆底烧瓶冷却，装入8-醋酸基-1，3，6-芘三磺酰氯(460mg，0.83mmol)，然后用隔膜板密封。加入DMSO(20ml)，获得均匀的黄色溶液。在氩气条件下让装备了磁力搅拌棒的第二个烘箱烘干的圆底烧瓶冷却，装入4-氨基丁酸钠(415mg，3.32mmol)，并用隔膜板密封。接着通过双头针加入DMSO(20ml)，搅拌几分钟后，用插管逐滴加入在DMSO中含8-醋酸基-1，3，6-芘-三磺酰氯的第一溶液，得到深红色均匀溶液。大约6小时后，去掉三分之一的溶液，在真空条件下蒸掉DMSO。用少量乙腈洗涤所得棕色物质，让它通过棉花过滤，滴到Et2O中，沉淀出少量(48mg)棕/红色吸湿性固体。1H-NMR(250MHz，D2O，ppm)：2(p，6H)，2.4(t，6H)，2.61(s，3H)，3(t，6H)，8.2(d，1H)，8.4(s，1H)，8.6(d，1H)，9.2(d，1H)，9.4(s，1H)。
用NaOH水溶液进行处理，以去除醋酸基保护基。然后确定pKa值为6.8左右，其Stern-Volmer淬灭常数为25419。
接着将HPTS-CO2/m-BBV组合的Stern-Volmer研究结果用于葡萄糖响应研究。该组合表现出对葡萄糖浓度微小变化的灵敏度，并在生理范围(0-400(0-400mg/dl))内具有良好的线性响应。参见图14。
利用Ocean Optics Inc.的Model#SF2000、光纤、380 Main Street、Dunedin、F134698、带有计算机控制器ADC1000 Rev B的荧光光谱仪，使用含4，7-苯-BBV的HPTS-CO2进行葡萄糖浓度研究，再次观察到葡萄糖浓度升高使得荧光强度提高。
实施例29
2-(3，5-二-溴乙基-苯基)-(1，3，2)-二噁硼烷(dioxaborinane)的制备
制备硼酸酯：在氩气条件下，让烘箱烘干的带侧臂的圆底烧瓶冷却，安装磁力搅拌棒，装入3，5-二甲基苯基硼酸酯(5g，33mmol)，接着装入戊烷，得到0.5M的不均匀溶液。然后为烧瓶装上烘箱烘干的回流冷凝器，用隔膜板密封，用氮气吹扫。搅拌溶液，同时借助双头针加入1，3-丙二醇(14.5ml)，然后加热溶液进行回流，直至它变均匀(约20分钟)。在氮气气氛下让溶液冷却到室温。迅速加入硫酸镁和氯化钙，用氮气吹扫装置，然后缓缓加热溶液1小时。然后在氮气条件下让溶液冷却到室温，停止搅拌。将上清液转移到已在氮气条件下冷却到室温且用隔膜板密封的另一烘箱烘干的圆底烧瓶中。加热剩余的固体1小时。然后在氮气气氛中让溶液冷却到室温，停止搅拌。将上清液转移到另一个已在氮气条件下冷却到室温且用隔膜板密封的烘箱烘干的圆底烧瓶中。用戊烷洗涤剩下的固体，将它与第一戊烷层合并。真空条件下在旋转蒸发器上除掉戊烷，放出氩气，产生黄色固体。MP：58～60℃。
二溴化处理：在氮气条件下让烘箱干燥的带有侧臂的圆底烧瓶冷却到室温，安装磁力搅拌棒，装入N-溴代琥珀酰亚胺(13.4g，73.26mmol)和AIBN(1.094g，6.6mmol)，装上回流冷凝器，用隔膜板密封，用氮气吹扫几分钟。将硼酸酯溶解在氯仿(250ml，在CaH2上蒸馏)中，用插管将其导入含N-溴代琥珀酰亚胺和AIBN的圆底烧瓶中。通过与包括亚硫酸钠的HBr阱相连的氮气鼓泡器为装置排气，在搅拌的同时，加热溶液，让它激烈回流。3.5小时后，在氮气下通过加热去除浅黄色溶液，在氮气气氛中让它冷却到室温。真空条件下在吹送氩气的同时于旋转蒸发器上浓缩溶液，获得橙色溶液，在氩气气氛中通过过滤从中除去琥珀酰亚胺副产物。在旋转蒸发器上在吹扫氩气的同时进一步浓缩滤出物，获得粘稠的深橙色液体。向该粘稠液体中缓慢加入戊烷(～250ml)，同时搅拌，沉淀出半成品。滤掉戊烷上清液，在氩气气氛中，于介质玻璃烧结过滤器上收集固体。在60微托的真空条件下干燥固体。产率：71％。MP：124-125℃。1H-NMR(500MHz，CDCl3)：2.059-2.081(quint，2H，J＝5.5Hz)，4.163-4.185(t，4H，J＝5.5Hz)，4.5(s，4H)，7.479(t，1H)，7.721-7.725(d，2H，J＝2Hz)。13C-NMR(500MHz，CDCl3，ppm)：27.476，33.262，62.162，131.845，134.459，137.694。11B-NMR(250MHz，CDCl3，ppm)：25.52。
该化合物用于实施例30和35。
实施例30
3-(3-溴甲基-5-(1，3，2)二噁硼烷-2-基-苄氧基)-丙-1-醇
在氩气条件下让装有磁力搅拌棒和回流冷凝器的烘箱烘干的250ml圆底烧瓶冷却，装入NaH(0.800g，在矿物油中占60％，20mmol)。用戊烷(3×100ml)洗涤粉末，在真空条件下干燥。通过注射器加入乙腈(50ml)，在室温下搅拌混合物。逐滴加入1，3-丙二醇(10ml)10分钟以上，形成白色不溶沉淀。用力搅拌悬浮液1小时，此时通过注射器吸取20ml逐滴加到装有2-(3，5-二-溴甲基-苯基)-(1，3，2)二噁硼烷(2.865g，8.2mmol)和乙腈(50ml)的250ml圆底烧瓶中。在室温下将混合物搅拌12小时。安装回流冷凝器以及真空接头，加热反应混合物，让它在氩气气氛中回流2小时。在真空条件下除掉乙腈，通过快速色谱(EtOAC∶己烷2∶1)纯化残渣。除去溶剂，获得白色固体的黄色油悬浮液，在用薄层色谱分析时，不表现为起始材料。可以使用含1，3-丙二醇的半成品混合物，而不需进一步纯化。
该化合物用于实施例31中。
实施例31
4-N-(苄基-3-(二甲基)硼酸酯)-7-N-(苄基-3-(1，3，2))二噁硼烷-2-
基)-5-甲氧基-丙醇-4，7-二溴代菲罗林(4，7-PHEN-m-BBVOH)
让来自实施例30的物质留在带侧臂的100ml圆底烧瓶中，为烧瓶装上磁力搅拌棒和回流冷凝器。向烧瓶中装入4-N-(苄基-3-(二甲基)硼酸酯)4，7-溴代菲罗林(4，7-Phen-m-BV)(0.797，1.88mmol)、DMF(4ml)、以及CH3OH(3ml)。将悬浮液加热到100℃达48小时，在整个反应过程中要将其保持在氩气的覆盖之下。在氩气气氛中将反应混合物冷却到室温，持续搅拌。用插管将悬浮液导入冰冷的二乙醚(100ml)中，让它们沉淀1小时以上。用插管将上清液导入另一容器中，用THF(50ml)捣碎米/红色残渣。在40℃条件下超声波处理化合物120分钟，用二乙醚(3×50ml)洗涤所得细粉。在氩气气氛中用玻璃烧结的漏斗收集固体，让它在减压条件下干燥(0.929g，产率49.4％)。
该化合物用于实施例34。
实施例32
对下述双组分系统进行荧光光谱分析：利用了HPTS-MA的
4-N-(苄基-3-硼酸)-7-N-(苄基-4-乙烯基)-4，7-溴氯代菲罗林
(4，7-PHEN-m-SBBV)的薄膜共聚物水凝胶
根据实施例17的过程测量荧光。
利用缓冲液建立基线值441(荧光强度)。停止蠕动泵，把泵送液体换成溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲液中的400mg/dl葡萄糖。对应于信号增加2.7％，荧光强度增加12个单位，数值达453。重复溶液变换过程。将溶液换回溶解在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中的400mg/dl葡萄糖。缓冲液给出基线值443。对应于信号增加3.2％，荧光强度增大14个单位，达到457。最后，将pH为7.4的磷酸盐缓冲液泵送过系统，获得基线446。
可在图11中看到这些结果。
实施例33
合成4，7-N，N-双(苄基-3-硼酸)-4-7-二溴代菲罗林
(4，7-PHEN-m-BBV)
在氩气气氛中让装有磁力搅拌棒和回流冷凝器的烘箱烘干的100ml圆底烧瓶冷却，装入4，7-phen-m-BV(0.814g，1.92mmol)和3-溴甲基苯基硼酸(1.77g，8.24mmol)。用氩气吹扫系统，装入干DMF(35ml)。在氩气覆盖下将悬浮液加热到80℃长达48小时。让混合物在氩气气氛中冷却到室温，滴入含1M HCl(10滴)的冰冷二乙醚∶丙酮(1∶1，500ml)。滤出沉淀，用冷丙酮洗涤多次，接着在减压条件下干燥。产率：0.913g，1.50mmol(78％)。1H-NMR(250MHz，CD3OD，ppm)：6.526(s，4H)，7.668(m，4H)，7.426(m，4H)，8.660(q，2H，J＝4.5Hz)，9.833(d，2H，J1＝6Hz)，9.117(s，2H)，10.387(d，2H，J＝9Hz)。11B-NMR(80MHz，CD3OD，ppm)：30(s，宽)。该化合物可淬灭实施例28的染料，并能对葡萄糖作出响应。
可按照实施例17的过程评价该化合物。其Stern-Volmer淬灭常数为2589M-1。
利用180mg/dl测量葡萄糖响应，荧光强度由257变为291。
实施例34
合成4-N-(苄基3-(硼酸)-7-N〔苄基-3-(亚甲基)-(1-氧-3(氧苄基乙烯
基)-丙烷)-5-硼酸〕-4，7-二溴菲罗林
为装有磁力搅拌棒的烘箱烘干的100ml圆底烧瓶装入4，7-phen-m-BBVOH(0.491g，0.641mmol)和4-乙烯基苄氯(0.137g，0.9mmol)。将新活化的NaH(0.048g，2mmol)悬浮在DMF(10ml)中，然后用插管导入该100ml的烧瓶中。在室温下将混合物搅拌46小时，然后用丙酮(30ml)和1M的HCl(10滴)淬灭，让它静置过夜(～20小时)。将该悬浮液滴入冷二乙醚(200ml)中，让沉淀稳定。离心后去掉上清液，将残渣溶解到最少量的甲醇中。加入丙酮∶二乙醚(1∶1，20ml)，将沉淀保持在4℃过夜。过滤悬浮液，用二乙醚洗涤多次，然后在减压条件下干燥。产率：0.201g，0.247mmol，38.5％)。1H-NMR(500MHz，D2O，ppm)：1.73(d，2H)，3.581(d，2H)，3.707(d，2H)，4.7(s，4H)，5.565(d，1H)，6.090(d，1H)，6.554(m，8H)，6.980(dd，1H)，7.66(m，7H)，8.150(d，1H)，8.737(d，1H)，8.804(d，1H)，9.261(d，1H)，9.5 15(d，1H)，9.605(d，1H)，10.024(d，1H)。11B-NMR(80MHz，CD3OD，ppm)：30(s，宽)。该化合物可以淬灭实施例28的染料，并能对葡萄糖作出响应。
实施例35
4，4’-N，N-双-〔苄基-(3-溴甲基)-5-(硼酸)〕-二溴联吡啶(m-BBVBBr)
的制备
在氩气气氛中让装有磁力搅拌棒的烘箱烘干的100ml圆底烧瓶冷却，装入4，4’-联吡啶(0.394g，2.52mmol)和2-(3，5-二-溴甲基-苯基)-〔1，3，2〕二噁硼烷(2.63g，7.56mmol)，用隔膜板密封。用氩气吹扫烧瓶，装入N，N-二甲基甲酰胺(10ml)。在室温下将溶液搅拌72小时，然后借助塑料插管将所得悬浮液导入丙酮∶二乙醚溶液(1∶1，300ml)中。通过气敏烧结漏斗过滤出沉淀，在氩气的覆盖下用二乙醚洗涤多次。在减压条件下让浅黄色固体干燥，并在氩气的气氛中离析。产率：1.632g，1.92mmol，76％。
该化合物用于实施例36中。
实施例36
4，4’-N，N-双-〔苄基-(3-亚甲基-4-乙烯基-溴代吡啶)-5-(硼酸)-二溴联
吡啶(m-BBVBP)的合成
在氩气气氛中让装有磁力搅拌棒和回流冷凝器的烘箱烘干的50ml圆底烧瓶冷却，装入m-BBVBBr(500mg，0.587mmol)。将该固体溶解在最少量的无水CH3OH(6ml)中，通过侧臂加入4-乙烯基吡啶(63g，0.60mmol)。在室温下搅拌该溶液15小时，然后加热，回流6小时。再次加入4-乙烯基吡啶(63mg，0.60mmol)，让混合物回流4天。在氩气气氛中让深绿色溶液冷却至室温，真空条件下除掉CH3OH。用丙酮∶水(40∶1)以及1M的HCl(5滴)4×30ml用力搅拌原油10分钟，轻轻倒出上清液。利用沸腾的甲醇∶乙醇(1∶1，50ml)让残渣再结晶，产生深绿色晶体。将固体收集到烧结漏斗上，用冰冷的乙醇(在水中占95％)和二乙醚洗涤。接着在减压条件下干燥，获得豆绿色粉末。产率：0.446g，0.506mmol，86％。1H-NMR(500MHz，D2O，ppm)：5.87(m，2H)，6.055(m，8H)，6.400(m，2H)，7.44(d，2H)，7.899(m，6H)，8.612(d，8H)，9.225(d，8H)。11B-NMR(80MHz，CD3OD，ppm)：30ppm(s，宽)。
该化合物用于实施例37和40。
实施例37
双组分系统：m-BBVBP与HPTS-CO2MA水凝胶的薄膜共聚物
为10ml体积的烧瓶装入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(3.525g，27.08mmol)、m-BBVBP(0.617mg，7.5×10-4mmol)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(1.11g，1.11mmol)、2，2’-偶氮双(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(0.025g，0.077mmol)、以及HPTS-CO2 MA(1.26mg，1.5×10-3mmol)；用甲醇∶水(1∶1，V/V)填充到10ml的标志处。在涡流混合器上用力搅拌该溶液之后，将其转移到50ml的圆底烧瓶内，用橡胶隔膜板密封烧瓶。用氩气为它脱氧20分钟。通过注射器吸取该感压溶液，用橡胶塞盖住针头。然后将它连同实施例16中描述的聚合腔一起转移到充满氩气的手套箱中。
将绿色薄膜存储在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，直至用于实施例38。
实施例38
对以下双组分系统进行荧光光谱分析：利用了HPTS-CO2 MA的4，4’-N，N-双-〔苄基-(3-亚甲基-4-乙烯基-溴代吡啶)-5-(硼酸)-二溴联吡啶
依照实施例12的过程测量荧光。
利用Perkin-Elmer LS50B软件的时间驱动函数，每隔10秒采集积分时间为2秒的荧光强度读数。将激发频率设为463nm，发射频率设定为518nm。激发狭缝宽度设为15nm，发射狭缝宽度设为4.3nm。利用缓冲液建立基线值451(荧光强度)。停止蠕动泵，将泵送溶液改为溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中的360mg/dl的葡萄糖。对应于信号增加1.6％，荧光强度增加29个单位，达到值458。重复溶液切换过程。缓冲液给出期望的基线451。
实施例39
单组分联吡啶鎓盐传感器HPTS-BV
(a)--在氩气气氛中让安装了磁力搅拌棒的烘箱烘干的圆底烧瓶冷却，装入4-氯甲基苯酰氯(1.89g，10mmol)，用橡胶隔膜板密封。加入二氯甲烷(25ml)，搅拌溶液，让它在冰水浴中冷却。逐滴加入1，3-丙烷阱(0.89g，12mmol)，立即产生白色沉淀。在氩气气氛中在介质烧结玻璃过滤器上收集白色固体，用冷二氯甲烷洗涤。在真空条件下干燥白色固体(100微托，3小时)，得到2.61克(产率99％)的4-氯甲基苯酰-(1-氨丙基-3-氯化铵)。1H-NMR(500MHz，D2O，ppm)：1.7-1.8(m)，2.5，2.8(t)，3.3(q)，4.8(s)，7.5(d)，7.8(d)，8.6(t)。
(b)
(m-BV)--在氩气气氛中让安装了磁力搅拌棒的烘箱烘干的圆底烧瓶冷却，装入3-溴甲基苯硼酸(0.64g，3mmol)，用橡胶隔膜板密封。加入THF(50ml)，获得略为浑浊的黄色溶液。在氩气气氛中让安装了磁力搅拌棒的烘箱烘干的第二圆底烧瓶冷却，装入4，4’-联吡啶(1.87g，12mmol)，用橡胶隔膜板密封。借助双头针加入THF(5ml)，搅拌几分钟后，往3-溴甲基苯基硼酸溶液中逐滴加入溶解在THF中的4，4’-联吡啶。30分钟后开始形成黄色沉淀，让溶液在室温下静置过夜，形成大量沉淀。然后对溶液进行离心，借助双头针转移上清液。用THF(3×10ml)洗涤黄色固体，然后在真空条件下干燥(100微托，3小时)，获得0.88克(79％的产率)mBV。1H-NMR(500MHz，CD3OD，ppm)：5.9(s)，7.46(m)，7.6(m)，8.0(m)，8.5，8.7，9.2；11B-NMR(250MHz，CD3OD，ppm)：30.8。
(c)
m-ABBV--在氩气气氛中让安装了磁力搅拌棒的烘箱烘干的圆底烧瓶冷却，装入4-氯甲基苯酰-(1-氨丙基-3-氯化铵)(263mg，1mmol)，用橡胶隔膜板密封。加入甲醇(30ml)，搅拌溶液。将mBV(371mg，1mmol)溶解在甲醇(10ml)中，然后将其逐滴加入到含4-氯甲基苯酰-(1-氨丙基-3-氯化铵)的溶液中。将溶液加热到回流。48小时后，在氩气的气氛中让溶液冷却到室温。利用注射器取出10ml溶液，让它在丙酮(100ml)中沉淀。轻轻倒出上清液，收集白色沉淀，让它在真空条件下干燥，得到44mg m-ABBV。1H-NMR(500MHz，D2O，ppm)：2.1，2.2，3.45，4.9，6.0，7.6，8.6，9.2。11B-NMR(250MHz，CD3OD，ppm)：31.7。
(d)
AIO--在氩气气氛中让安装了磁力搅拌棒的烘箱烘干的圆底烧瓶冷却，装入m-ABBV(44mg，0.075mmol)，用橡胶隔膜板密封。加入甲醇(10ml)，接着加入水(2ml)。加入K2CO3，然后搅拌溶液。将1-醋酸基-3，6，8-三磺酰氯(醋酸基-HPTS-Cl)(38mg，0.068mmol)溶解到甲醇(15ml)中，得黄色悬浮液，加入丙酮(5ml)，得均质溶液。借助注射器向m-ABBV中逐滴加入(醋酸基-HPTS-C1)溶液。溶液立即变成红色，静置几分钟后，有沉淀形成。让溶液在室温下静置过夜，然后转移到离心管中。离心后，将上清液转移到圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上浓缩。通过与乙腈的协同蒸发作用除掉残余的水，在真空条件下让所得黑色固体干燥，得到55mg(70％产率)8-醋酸基-1-m-ABBV-芘-3，6-双磺酸(AIO)。1H-NMR(500MHz，D2O，ppm)：2.01-2.08，2.14，2.8，3.1，3.4，5.7，5.88，7.45；7.55，7.7，7.8，7.99，8.07，8.17，8.6，8.7，8.8，8.9，9.05。
(e)然后将最后的离析物用于实施例17所述的葡萄糖研究。实现在25ml体积的烧瓶中制备5×10-4M的AI
O储备溶液，但要在用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(离子强度为0.1)彻底稀释之前让溶液变为碱性(pH为10)，以保证除掉所有的醋酸保护基。然后将溶液调回pH7.4，稀释到25ml。接着利用5×10-5M的储备溶液制备出7份葡萄糖量不同的5ml样品。在Perkin-Elmer LS50-B荧光分光光度计上利用以下设定进行分析：
激发波长：463nm
发射波长范围：450-650nm
激发狭缝宽度：15nm
发射狭缝宽度：15nm
发射滤光器：1％T衰减器
扫描速度：100nm/sec
该化合物对葡萄糖具有很高的响应性。加入18mg/dl可让信号从827增加到908。参见图14。由于材料被少量葡萄糖饱和，因此加入更浓的葡萄糖浓液也不会让荧光强度产生任何额外变化。
实施例40
双组分系统：m-BBVBP与HPTS MA的薄膜共聚物
为10ml体积的烧瓶装入2-羟乙基甲基丙烯酸酯(3.525g，27.08mmol)、m-BBVBP(12.3mg，0.015mmol)、聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(1.11g，1.11mmol)、2，2”-偶氮双(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二氢氯(0.025g，0.077mmol)、以及HPTS MA(1.32mg，1.5×10-3mmol)。用甲醇∶水(1∶1，V/V)将它填充到10ml的标志处。在用涡流混合器用力搅拌该溶液后，将它转移到50ml的锥形圆底烧瓶中，用橡胶隔膜板密封烧瓶；用氩气脱氧20分钟。用注射器吸取感压溶液，为针头盖上橡胶塞。然后将它连同聚合腔一起转移到充满氩气的手套箱中*。(*见实施例11)。在氩气的气氛中，将注射器连接到聚合腔上，把溶液注入池中充满整个腔室。用LUER-LOCK塞封住腔室，把它们封到两层ZIPLOC冷冻袋中。将腔室转移到40℃的烘箱中，加热10小时。从烘箱中取出聚合腔，让它达到室温。把它拆开，用pH为8的NaOH溶液浸析4小时。然后将薄膜储存在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中，直至用于实施例41中的分析。
实施例41
对以下双组分系统进行荧光光谱分析：利用了HPTS-MA的
4，4’-N，N-双-〔苄基-(3-亚甲基-4-乙烯基-溴代吡啶)-5-(硼酸)-二溴联吡啶
(m-BBVBP)的薄膜共聚物水凝胶
分析过程参见实施例12。
用蠕动泵让pH为7.4的磷酸盐缓冲液(离子强度0.1)以每分钟30ml的速率循环过流通池。利用Perkin-Elmer LS50B软件的时间驱动函数每隔10秒采集荧光强度读数。利用脉冲函数(每次2秒)照射样品，每隔10分钟捕捉积分时间为2秒的读数。激发频率设为475nm，发射频率设定为525nm。激发狭缝宽度为15nm，发射狭缝宽度设为4nm。利用缓冲液建立基线值464(荧光强度)。停止蠕动泵，把泵送溶液改为溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中的360mg/dl的葡萄糖。对应于信号增加6.3％，荧光强度增加29个单位，达到值493。重复切换溶液的过程。缓冲液给出期望的基线值464。在变回溶解在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中的100mg/dl的葡萄糖溶液后，对应于信号增加4.3％，荧光强度增加20个单位，达到484。最后，在将缓冲液泵送过系统时，基线跌到期望的基线值464。
结果参见图14。
虽然在此仅示出并描述了本发明的几个实施例，但对本领域普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对监测含多羟基的有机分析物、主要是监测
体内葡萄糖的葡萄糖传感器及其组分作出各种改进和变化，所述组分包括荧光染料、淬灭剂和最佳聚合物基质。因此试图认为借此实现了落在所附权利要求范围内的所有改进和变化。
Claims (29)
1.一种光学方法，用于在430和600nm的检测范围内对作为分析物的多羟基取代的有机分子进行
体内检测，所述方法包括：
A.获得荧光团染料D，它能与分析物溶液共存，其中D选自：
(a)D1，它是具有以下特性的一种荧光团染料：
i.荧光团，
ii.在超过430且小于600nm的范围内激发，
iii.分析条件下能耐受光漂白，
iv.斯托克斯偏移约为或大于30nm，
v.能与所述分析物溶液共存，其中所述
vi.染料D1能被甲基联吡啶鎓盐淬灭，产生能通过实验测量的大于或等于50的表观Stern-Volmer淬灭常数(Ksv)，
其中荧光团染料D1是中性或者带负电的，它是：
(i)分子量为1000道尔顿或以上的分散性化合物，前提是如果染料被带负电的基团取代，其分子量就在500道尔顿或以上；
(ii)水溶性或水分散性聚合物中的侧基或链单元，该聚合物的分子量约大于10000道尔顿，以及
任选的是所述聚合物通过非共价键与水不溶性聚合物基质M1联合，它以物理方式固定在所述聚合物基质M1内，其中所述聚合物基质M1可让所述分析物溶液透过，或与之接触；以及
任选的是，在D1带负电荷且聚合物被固定为与阳离子性的水溶性聚合物组成的络合物时，形成的所述络合物对所述分析物溶液是可透的，或者与之接触；
D2是具有以下特性的荧光团染料：
i.荧光团，
ii.能在超过430且小于800nm的范围内激发，
iii.斯托克斯偏移约等于或大于30nm，
iv.分析条件下能耐受光漂白，
v.能与所述分析物溶液共存，其中所述
vi.所述染料D2能被甲基联吡啶鎓盐淬灭，产生大于或等于50的表观Stern-Volmer淬灭常数(Ksv)，其中D2通过共价键与不溶性聚合物基质M1键和，其中所述聚合物基质M1可让所述分析物溶液透过，或者与之接触；其中所述荧光团染料D2是以下结构的一部分：M1-L1-D2，前提是D2是多官能团的，它在一个、两个或三个位点与基质M1键和；
L1是水解稳定的共价键联接基团，它选自直接键和的具有1到8个碳原子的低级亚烃基，任选的是它被选自以下物质的一种或多种二价连接基团封端或者包括这些基团：磺酰胺，酰胺，酯，醚，硫化物，砜，次苯基，脲烷，脲和胺，以及
B.与含硼酸的淬灭剂部分Q结合，其中Q包括以下物质：具有能与所述分析物溶液共存之特性的共轭含氮杂环芳香族联鎓盐，Q在出现所述分析物时产生可测得到的染料发光变化，它选自：(i)淬灭剂Q1，它是分子量约400道尔顿或以上的分散性化合物，或者它是分子量大于10000道尔顿的水溶性或水分散性聚合物中的侧基或者链单元，任选的是所述聚合物通过非共价键与任选存在的聚合物基质M1连接，它通过物理方式固定在所述聚合物基质中，或者任选的是所述聚合物被固定成与带负电的水溶性聚合物组成的络合物，或者
(ii)淬灭剂Q2，它通过连接基L2以共价键与M1或者与第二个不溶于水的聚合物基质M2键和，产生M2-L2-Q2，其中L2选自直接键合的具有1到8个碳原子的低级亚烃基，任选的是它被选自以下物质的一种或多种二价连接基团封端或者包括这些基团：磺酰胺，酰胺，季铵盐，吡啶，酯，醚，硫化物，砜，次苯基，脲，硫脲，脲烷，或胺，其中所述淬灭剂Q1或Q2与所述荧光团染料D1或D2在分子级的水平混合，前提是当Q2是多官能团时，它在一个或两个位置与基质M2连接。
C.在
体内让含分析物的生理液体与染料和淬灭剂接触，并让激发光源与检测器耦合；
D.约在430到600nm的范围内产生可检测并可定量的信号；以及
E.测定所述生理液体中的所述多羟基取代的分析物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述染料D1选自具有以下结构的嘧胺衍生物：
其中其中R1、R2和R3每个都是-NH-CH2-CH2(-O-CH2-CH2)n-X1；
其中X1选自-OH，-OCH3，-CO2H，-CONH2，-SO3H，或者-NH2；和
n介于约70到10000之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述D1选自具有以下结构的嘧胺衍生物：
其中其中R1、R2和R3每个都是-NH-CH2-CH2(-O-CH2-CH2n)-X1；
其中X1选自-OH，-OCH3，-CO2H，-CONH2，-SO3H，或者-NH2，n约为100到10000。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述染料D1或D2是由具有以下结构的嘧胺衍生物制备得到的：
或者是由选自以下结构的染料单体制备得到的：
其中R4＝-H，以及
R5选自：-R6-NH-(C＝O)-(C＝CH2)-R7，-R6-O-(C＝O)-(C-R7＝CH2)，或-CH2-C6H4-CH＝CH2或者-CH2-CH＝CH2，
其中R6是2到6个碳原子的低级亚烃基，
其中R7是-H，或者-CH3以及
Z是封端基团，它可通过水解来去除，它选自
-(C＝O)-R8-Y
其中R8是带有1到4个碳原子的低级亚烃基，Y选自-H，-OH，-CO2H，-SO3H，-(C＝O)-NH-R9，或者-CO2-R9，
其中R9是带有1到4个碳原子的低级亚烃基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述淬灭剂Q1和Q2的前体选自由以下基团组成的组中：或
其中(V)2+是选自以下物质的异构体的含氮共轭杂环芳族基团：联吡啶，乙撑联吡啶，苯撑联吡啶，菲罗啉，或者二氮杂芴；其中Z1或者Z2任一个也是选自以下基团的可聚合的烯键式不饱和基：
(i)-R10-CO2-C(R11)＝CH2，-R10-NH-(C＝O)-C(R2)＝CH2，或者-CH2-C6H4-CH＝CH2，
在此R10是2到6个碳原子的低级亚烃基或者羟基亚烃基，
其中R11＝-H或者-CH3；或者
(ii)配合基选自：-R12-Z3
其中R12是-CH2C6H4-或者2到6个碳原子的亚烃基，而
Z3是-OH，-SH，-CO2H，或者-NH2。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述前体选自：
其中X是氯化物、溴化物或者它们的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在子步骤B中，Q1或Q2是由选自以下物质的前体制备的：
其中V3和Z4或者Z5是2，3或者4-(CH＝CH2)-吡啶；-N-(CH2)w-O(C＝O)C(CH3)＝CH2；-O-(CH2)w-O-CH2-(CH＝CH2)；-O-(CH2)w-O-(C＝O)CH(＝CH2)；以及-O-(CH2)w-O-(C＝O)C(CH3)＝CH2；w是2到6的整数，或者Z4和Z5的定义与上面1Z和Z2的相同。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在子步骤A中，荧光团是D1。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在子步骤A中，荧光团是D2。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在子步骤B中，淬灭剂Q是Q1。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在子步骤A中，D是D1，在子步骤B中，Q是Q1。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在子步骤A中，荧光团D1选自具有以下结构的嘧胺衍生物：
其中n约介于70到200之间。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在子步骤A中，聚合染料D2的前体是：
在步骤B中，淬灭剂是由以下物质制备的：或
其中X是溴化物或氯化物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中多羟基取代的有机分子是选自葡萄糖和果糖的糖。
15.根据权利要求14所述的方法，其中染料D1选自以下物质：
其中n约在70到200之间。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述淬灭剂Q2是由一种淬灭剂前体制备得到的，而该前体选自以下基团：
其中X是溴化物或者氯化物。
17.一种光学装置，用于在大约430到600nm的检测范围内对作为分析物的多羟基取代的有机分子进行
体内检测，该装置包括：
A.荧光团染料D，它能与分析物溶液共存，其中D选自：
(a)D1，它是具有以下特性的一种荧光团染料：
i.荧光团，
ii.在超过430且小于600nm的范围内激发，
iii.分析条件下能耐受光漂白，
iv.斯托克斯偏移约等于或大于30nm，
v.能与所述分析物溶液共存，其中所述
vi.染料D1能被甲基联吡啶鎓盐淬灭，产生可实验测量的大于或等于50的表观Stern-Volmer淬灭常数(Ksv)，
其中荧光团染料D1是中性或者带负电，它是：
(i)分子量为1000道尔顿或以上的分散性化合物，前提是如果染料被带负电的基团取代，其分子量就在500道尔顿或以上；
(ii)水溶性或水分散性聚合物中的侧基或链单元，该聚合物的分子量约大于10000道尔顿，以及
任选的是所述聚合物通过非共价键与水不溶性聚合物基质M1联合，它以物理方式固定在所述聚合物基质M1内，其中所述聚合物基质M1可让所述分析物溶液透过，或与之接触；以及
任选的是，在D1带负电荷且聚合物被固定为与阳离子性的水溶性聚合物组成的络合物时，形成的所述络合物对所述分析物溶液是可透的，或者与之接触；
(b)D2是具有以下特性的荧光团染料：
i.荧光团，
ii.能在超过430且小于800nm的范围内激发，
iii.Stoke偏移约等于或大于30nm，
iv.分析条件下能耐受光漂白，
v.能与所述分析物溶液共存，其中
vi.所述染料D2能被甲基联吡啶鎓盐淬灭，产生大于或等于50的表观Stern-Volmer淬灭常数(Ksv)，其中D2通过共价键与不溶性聚合物基质M1键和，其中所述聚合物基质M1可让所述分析物溶液透过，或者与之接触；其中所述荧光团染料D2是以下结构的一部分：M1-L1-D2，前提是D2是多官能团的，它在一个、两个或三个位点与基质M1键和；
L1是水解稳定的共价键连接基团，它选自直接键和的具有1到8个碳原子的低级亚烃基，任选的是它被选自以下物质的一种或多种二价连接基团封端或者包括这些基团：磺酰胺，酰胺，酯，醚，硫化物，砜，次苯基，脲烷，脲，胺，以及
B.含硼酸的淬灭剂部分Q，其中Q由以下物质组成：具有能与所述分析物溶液共存之特性的共轭含氮杂环芳香族联鎓盐，Q在出现所述分析物时产生可测的染料发光变化，它选自：(i)淬灭剂Q1，它是分子量约为400道尔顿或以上的分散性化合物，或者它是分子量大于10000道尔顿的水溶性或水分散性聚合物中的侧基或者链单元，任选的是所述聚合物通过非共价键与任选存在的聚合物基质M1联接，它通过物理方式固定在所述聚合物基质中，或者任选的是所述聚合物被固定成与带负电的水溶性聚合物组成的络合物，或者
(ii)淬灭剂Q2，它通过连接基L2以共价键与M1或者与第二个不溶于水的聚合物基质M2键和，产生M2-L2-Q2，其中L2选自直接键构成的具有1到8个碳原子的低级亚烃基，任选的是它被选自以下物质中的一种或多种二价连接基团封端或者包括这些基团：磺酰胺，酰胺，季铵盐，吡啶，酯，醚，硫化物，砜，次苯基，脲，硫脲，脲烷，或胺，其中所述淬灭剂Q1或Q2与所述荧光团染料D1或D2在分子级的水平混合，前提是当Q2是多官能团时，它在一个或多个位置与基质M2连接。
其中，当染料和淬灭剂与
体内含分析物的生理液体接触时，它与和检测器耦合的激发光源接触；
C.约在430到600nm的范围内产生可检测并可定量的信号；以及
D.测定所述生理液体中的所述多羟基取代的分析物的浓度，
其中染料D组分和淬灭剂Q组分可固定或者连接在聚合物基质M1、M2上，或者是其组合上，以及
所述装置可周期性或连续地测量含多羟基的分子的浓度。
18.根据权利要求17所述的装置，其中所述染料选自权利要求2、3和4中所描述的染料。
19.根据权利要求17所述的装置，其中所述淬灭剂选自权利要求6、7和16中所描述的猝灭剂。
20.根据权利要求17所述的装置，其中所述聚合物基质由选自HPTS-MA和HPTS-CO2-MA的单体制备。
21.根据权利要求17所述的装置，其中所述淬灭剂选自权利要求2、3、4、6、7和16中所描述的猝灭剂，其中所述聚合物由选自HPTS-CO2-MA和HPTS-MA的单体来制备。
22.根据权利要求17所述的装置，其中所述染料是权利要求2所述的染料，其中权利要求16所述的淬灭剂选自：
其中聚合物是HPTS-MA。
23.一种组合物，它选自以下结构的化合物：或
其中(V)2+是选自以下物质的异构体的含氮共轭杂环芳族基团：联吡啶，乙撑联吡啶，苯撑联吡啶，菲罗啉，或者二氮杂芴；其中两个氮原子都位于不同的芳环上，氮原子在环上的所有位置都能形成季盐；以及
Z1或者Z2任一个是选自以下基团的可聚合的烯键式不饱和基：-R15-CO2-C(R16)＝CH2，-R15-NH-(C＝O)-C(R16)＝CH2，-CH2-C6H4-CH＝CH2；
R15是2到6个碳原子的低级亚烃基或者羟基亚烃基，
R16＝-H或者-CH3；或者是选自-R17-Z3的配合基，其中R17是-CH2C6H4-或者2到6个碳原子的亚烃基，而
Z3选自-OH，-SH，-CO2H，或者-NH2-。
24.一种组合物，所述组合物包括能响应葡萄糖的聚合物组合，它本身包括：可被430-800nm的光激发的荧光团，该荧光团易被联吡啶鎓盐淬灭；作为淬灭剂的联吡啶鎓盐，它至少包括一个硼酸官能团；以及可让葡萄糖透过的聚合物基质。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述荧光团是N，N’，N”-三-(1-氨乙基-2-聚乙二醇(n～125)-甲氧基)-8-羟基芘-1，3，6-三磺酰胺，或者是N，N’，N”-三-(1-氨丙基-3-甲基丙烯酰胺丙基)-8-醋酸基-芘-1，3，6-三-磺酰胺的聚合物。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述包括硼酸官能团的联吡啶鎓盐是4-N-(苄基-3或4-硼酸)-4’-N’-(苄基-4-乙烯基)-溴氯代联吡啶(m-或p-SBBV)的聚合物。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述聚合物基质是包括2-羟乙基甲基丙烯酸酯聚合物、聚乙烯醇聚合物或它们的组合的水凝胶。
28.一种Q1或Q2前体组合物，其选自以下物质：
其中X是溴化物或氯化物。
29.一种具有以下结构的组合物：
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