CN1500150A - 在固相载体上扩增和检测多个多核苷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

为了检测和克隆多个靶多核苷酸，本发明提供了利用微阵列上的固定引物进行固相聚合酶介导的扩增的方法。本发明提供的这些方法、组合物及试剂盒可用于研究和临床应用，特别是用于大规模测定感兴趣生物样品中的遗传信息。

Description

在固相载体上扩增和检测多个多核苷酸的方法
相关申请的相互参考
本申请要求1999年12月29日提交的、申请号为60/173,618的临时申请的优先权。
发明技术领域
本发明一般涉及核酸生物学领域。更具体地说，本发明提供了为了诊断和治疗应用而对生物样品中的基因表达进行高通量扩增、检测和比较的方法及组合物。
背景技术
少量遗传材料的检测在生物研究和临床诊断中是一个主要的挑战。聚合酶链式反应(PCR)为高灵敏和高特异地在体外扩增特异性多核苷酸序列(例如基因组DNA、单链cDNA或mRNA)提供了一种有力的工具。该方法的一个应用是扩增来自例如环境、食品和医学等来源的生物样品中的靶基因序列，以便鉴定样品中存在的成因性、致病性、腐败性或指示性生物。
基础的PCR技术如US专利4,683,202、4,683,195和4,800,159(它们的公开在此一并作为本文的参考文献)所述，典型地包括利用两个寡核苷酸引物，该引物能够杂交到感兴趣的靶序列侧翼的特异性核酸序列上。通过将模板变性、引物退火和链延伸的循环重复多次，可获得靶序列的指数式复制。
标准的PCR法所伴随的主要技术问题是污染问题。虽然PCR提供了一种灵敏的用于检测和扩增少量靶多核苷酸的方法，但是该方法能够扩增非特异性核酸序列，因此将在最终的检测和测定中产生假阳性产物。在标准的液相PCR中，引物在溶液中结合到模板上并引发新生链的合成，为了最终的检测和测定，经常需要对反应混合物和产物进行若干次转移，从而增加了污染的机会。
Kohsaka和Carson(1994)J.Clin.Lab Anal 8：452-455描述了一种固相PCR法，该方法允许在同一微孔中扩增和检测靶基因序列而无需转移。两个寡核苷酸引物之一被共价附着到微量滴定板的若干个孔中，而另一引物保留在溶液中。被固定的引物与模板结合并引发新生互补链的延伸。在通过变性除去模板之后，新合成的链仍然附着在微量滴定板上，并且在PCR完成时可以利用标记探针来检测。通过在扩增之前加入已知量的内部竞争性DNA模板，这种固相PCR法也已用来定量测定靶核酸。参见例如，US专利5,747,251，这篇专利的公开在此一并作为本文的参考文献。Kohsaka等人的固相PCR局限于在96孔型微量滴定板的孔内检测一种单一的靶多核苷酸。采用竞争性模板的定量固相PCR局限于检测来自一种物种或组织的靶物。而且，为了通过与标记探针杂交来进行检测，附着到板上的扩增产物必须是单链的，因此限制了检测的灵敏度。
US专利5,641,658(Adams等人)描述了一种利用结合到一单个固相载体上的两个引物扩增核酸的方法。该方法需要选择位于靶序列侧翼的两个引物并将这两个引物都固定到一个固相载体上。利用引物对来检测和扩增载体上的靶多核苷酸。扩增产物被固定到载体上，并且如果两个相邻链彼此之间距离合适，它们还可以杂交到一起，从而形成一个“环”。虽然二引物扩增系统被预示在检测样品中特定靶核酸的存在或缺乏时是灵敏的，但是针对每个靶物使用两个固定引物，这就需要将引物仔细布置到载体上，以便引物阵列可以允许环的形成，并且还不干扰其它链的扩增。换言之，这些方法对于高密度、高通量的测定是不理想的。
特定生物样品的基因表达谱相当大程度地显示出了几乎所有生物功能和活性的分子基础。用于检测和比较不同生物源的基因表达水平的许多方法在本领域内都是公知的。用于这种比较的一个标准方法是Northern印迹法。在该技术中，按照标准方法(参见例如，Sambrook，J.，等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual.Cold Spring harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2nd ed.1989))，将RNA从样品中提取出来并加到适合RNA分析的多种凝胶的任一种上，然后电泳按大小来分离RNA。随后对凝胶进行印迹(如Sambrook中所述，参见上文)并与用于检测感兴趣的RNA的探针杂交。
Sutcliffe的US专利5,807,680教导了一种用于同时鉴定差异表达的mRNAs并测定其相对浓度的方法。这种包含在进行PCR之前利用锚定引物形成cDNA的技术，导致由组织表达的几乎每一个mRNA都可作为凝胶上的一个明显不同的条带而被观察到，其中条带的强度大致对应于mRNA的浓度。
另一组技术利用了对相对转录表达水平的分析。最近业已开发出四种这样的可进行广泛的高通量分析的方法。第一，可以由样品中的RNA进行反转录(正如以上的参考文献中所述的)产生cDNA，并对其进行5’和3’端的单向测序，以便定义测试和对照样品中所表达基因的已表达序列标志(expressed sequence tag)。对来自不同样品的标志的相对表现度进行计数，可近似提供样品内基因转录本的相对表现度。
第二，业已开发出EST的变异方法，称作基因表达的系列分析或“SAGE”，该方法允许定量和同时分析大量的转录本。这种技术利用对较短诊断序列标志的分离和测序，以揭示靶功能特异性的基因表达谱，而且该技术业已用来对例如正常和肿瘤细胞内的成千基因的表达水平进行比较(参见例如，Velculescu，等人，Science 270：368-369(1995)；Zhang，等人，Science 276：1268-1272(1997))。
第三，基于差异展示业已开发出若干方法。在这些方法中，由特异性序列分隔符(delimiter)规定的片段当与表达基因内的有关片段长度的信息偶联时，可用作基因的独特标识符(identifier)。然后，利用与表达基因有关的片段的相对表现度来评估细胞内该基因的相对表现度。为了发展这个观点而开发出的几种方法中的一些例子是，由Gene Logic，Inc.采用的差异表达序列的限制性酶分析(“READS”)，以及由Digital GeneTechnologies，Inc使用的总基因表达分析(“TOGA”)。例如，CLONTECH，Inc.(Palo Alto，CA)销售利用PCR鉴定差异表达基因的DeltaTM差异展示试剂盒。
第四，在优选实施方案中，利用许多杂交分析技术中的一种进行检测。在这些方法中，来自感兴趣的样品的RNA常要接受反转录，从而得到标记的cDNA。然后，使该cDNA典型地与以公知的顺序排列到芯片或其它表面上的已知序列的寡核苷酸或cDNA进行杂交。标记cDNA所杂交的寡核苷酸的位置提供了有关cDNA的序列信息，而所标记的杂交RNA或cDNA的量提供了感兴趣RNA或cDNA的相对表现度的估计值。另外，该技术允许与两个或多个不同的可检测标记物同时杂交。然后，杂交结果提供了对这些样品的相对表达量的直接比较。
最近对DNA微阵列技术的发展使得可在一个固相载体上进行许多靶分子的大规模测定。US专利5,837,832(Chee等人)以及相关的专利申请描述了固定一个用于杂交和检测样品中的特异性核酸序列的寡核苷酸探针阵列。微阵列分析的局限性包括难于检测到仅可以较小的体积和较小的量用于微阵列检测的核酸。与基于核酸杂交的任何技术一样，可获得的靶核酸数目即基因表达的丰度大大限制了微阵列杂交的灵敏度。目前，通过扩增附着到核酸靶物上的标记信号(例如来自荧光标志)，有时可以在一定程度上克服这些局限性。然而，开发更有效和更灵敏的在一个微阵列上检测多个靶多核苷酸的方法在本领域内将是非常有利的。
发明概述
本发明提供了一种新的用于以高通量方式扩增和检测多个多核苷酸的方法。一方面，这些方法包括通过利用适合固相核酸扩增的固相引物微阵列来检测样品中的多个靶多核苷酸。每一引物特异于特定的靶序列，而不同的引物组被固定在微阵列的不连续位置上。所固定的引物使得可在一个固相载体上进行特异性靶多核苷酸的“原位”杂交和扩增。利用在扩增过程中并入链中的标记物可定量检测每个引物位点处的新生链。在一优选实施方案中，用于实施本发明的扩增方式是PCR。固相载体上的微阵列可包含高达大约100,000组的引物。于是，该方法可用来检测样品中高达大约100,000个的靶多核苷酸。虽然很显然，可以存在于载体上的引物组的数目没有低限，但是对于大多数应用，需要大量的引物组。
按照本发明的一个实施方案，所固定的引物可单独用于特定靶多核苷酸的不对称PCR，这将导致在每一引物位点有一单个的互补链附着到固相上并且可任选地利用并入链内的标记物对其进行检测。按照本发明的另一个实施方案，用于每一靶多核苷酸的另一引物存在于溶液内，从而为了增强检测可以合成靶多核苷酸的两个链并且使这两个链保留在每一引物位点上。液相引物可以特异于特定的靶多核苷酸，或者是，可以是能够结合到所有或一个亚群的靶多核苷酸上的通用引物。
本发明还提供了用于检测和比较来自至少两个不同生物源的多个靶多核苷酸的表达谱的方法，这些方法包括以下步骤：a)使包含来自至少两个不同生物源的多个靶多核苷酸的样品与固定到一个固相载体上的具有多组寡核苷酸引物的阵列接触，每组寡核苷酸引物均是针对特定的靶多核苷酸选择的并包含与靶多核苷酸序列互补的引物，其中来自每一生物源的所述靶多核苷酸含有共价连接的对于生物源是独特的序列标志；b)在适合多核苷酸杂交和扩增的条件下进行第一轮聚合酶介导的多核苷酸扩增，由此，来自不同生物源的靶多核苷酸作为合成互补的新生多核苷酸链的起始模板，而这些新生的多核苷酸链从固定引物延伸出来；c)在可与每一生物源所独特的序列标志杂交的液相引物存在下，进行第二轮聚合酶介导的多核苷酸扩增，其中序列标志用作引物而来自步骤b)的固定新生多核苷酸链用作模板以合成新的扩增产物，新的扩增产物从液相序列标志中延伸出来；以及d)对来自不同生物源的靶多核苷酸的固定扩增产物进行检测和比较。
本发明还提供了利用对称的PCR或不对称的PCR(如本文所公开的)检测多个靶多核苷酸的试剂盒。这些试剂盒包括PCR引物微阵列和PCR反应和检测所需的试剂。引物微阵列可包含高达大约100,000组的为特定靶多核苷酸序列定制的引物。在本发明的一个实施方案中，这些试剂盒包含能够在PCR反应的过程中并入合成链内的标记核苷酸。
附图简述
图1(1A-1E)示意性绘出了用于扩增和检测靶多核苷酸(A，B，C)的固相扩增方法，该方法采用了固定引物。
图2(2A-2E)示意性绘出了用于扩增和检测靶多核苷酸(A，B，C)的固相扩增方法，该方法采用了固定引物以及液相通用引物。
图3(3A-3E)示意性绘出了用于扩增、检测和比较来自两个不同生物源的靶多核苷酸(A，B，C)的固相扩增方法，该方法采用了固定引物以及作为液相引物的差异标记的序列标志。
图4(4A-4C)显示出了利用四个靶cDNA作为模板的固相扩增试验的结果。
图5显示出了靶mRNA的固相扩增结果。
图6表示出在杂交之前由固相PCR扩增导致的杂交信号的增强。图6A表示出标准方案之后的杂交信号，而图6B表示出固相PCR反应后的杂交结果。图6C表示出与包含胎脑cDNA靶物的微阵列进行杂交之后的信号，而图6D表示出固相PCR反应之后的杂交结果。
图7表示出利用G3PDH靶cDNA作为模板进行固相扩增之后的杂交的特异性。
图8表示出利用G3PDH和c-Raf靶cDNAs作为模板进行固相扩增之后的杂交的特异性。
图9表示出利用四个不同的靶cDNA作为模板进行固相扩增之后的杂交的特异性。
图10表示出利用四个不同的靶cDNA作为模板对来自胎脑文库的靶mRNA进行固相扩增之后的杂交的特异性。
图11表示出利用三个不同的靶cDNA作为模板对来自OVC1.1细胞的靶mRNA进行固相扩增之后的杂交的特异性。
优选实施方案详述
本发明提供了用于以高通量方式灵敏而简单地扩增和检测核酸靶物的新方法及组合物。本发明可用于基因组分析的多个方面，该分析在基础生物研究和医学诊断及治疗领域是有用的。
“多核苷酸”是任何长度的核苷酸聚合形式，该核苷酸既可是核糖核苷酸也可是脱氧核糖核苷酸。该术语仅仅指分子的一级结构。于是，该术语包括双链和单链的DNA及RNA。它还包括已知类型的修饰例如本领域内公知的标记、甲基化、“戴帽”、用类似物替代一个或多个天然核苷酸；核苷酸间修饰例如那些具有不带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、那些含有侧部分诸如蛋白质(包括例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、那些具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、那些含有螯合剂(例如金属、放射性金属等)的修饰、那些含有烷化剂的修饰、那些具有修饰键(例如α端基异构核酸等)的修饰；以及多核苷酸的未修饰形式。
术语“引物”正如本文所用的，是指这样一种寡核苷酸：即，当这种寡核苷酸被置于催化合成与多核苷酸互补的引物延伸产物的条件下时，它能够用作沿互补链进行多核苷酸合成的起始点。这些催化条件包括在适当的缓冲液(“缓冲液”包括作为辅因子或影响pH、离子强度等的成份)中和适当的温度下存在四种不同的三磷酸核苷酸或核苷类似物以及一种或多种用于聚合的试剂例如DNA聚合酶和/或反转录酶。引物必须长得足以在用于聚合酶的试剂存在时引发延伸产物的合成。典型的引物含有长至少大约5个核苷酸的基本上与靶序列互补的序列，但是在某种程度上较长的引物是优选的。引物通常含有大约15-26个核苷酸，但也可以采用更长的引物即高达35个核苷酸的引物。
引物总是含有基本上与靶序列(即引物可以与之退火的待扩增的特异性序列)互补的序列。除了与靶序列互补的序列之外，引物还可任选地包含其它序列。这些序列优先位于引物中靶互补序列的上游(即，在5’端)。例如，包含一个或多个限制性酶识别位点(“接头”或“衔接子”)的序列，当在引物中存在于靶互补序列上游时，将利于对扩增产物进行克隆和后序操作。引物中所包含的其它有用序列包括那些与测序引物互补的序列以及那些规定启动子序列的序列。术语“启动子序列”定义为，由RNA聚合酶特异性识别的核酸序列单链，其中RNA聚合酶结合到所识别的序列上并引发产生RNA转录本的转录过程。原则上，可以采用任何启动子序列，只要对于该启动子具有已知的可获得的能够识别起始序列的聚合酶即可。已知的有用启动子是那些由某些噬菌体聚合酶(例如噬菌体T3、T7或SP6)识别的序列。
正如本文所用的，术语“标志”、“序列标志”或“引物标志序列”是指具有特异性核酸序列的寡核苷酸，该核酸序列可用来鉴定其中带有这些标志的一批多核苷酸。利用特异性序列标志共价标记来自相同生物源的多核苷酸，以便在后序的分析中，多核苷酸可以按照其原始来源来鉴别。这些序列标志还可用作核酸扩增反应的引物。
“微阵列”是在固相载体表面上形成的具有优选不连续区域(每一区域具有规定的面积)的线性或二维阵列。由单个固相载体的表面上待检测的靶多核苷酸的总数来确定微阵列上不连续区域的密度，优选的是至少大约50/cm2，更优选的是至少大约100/cm2，甚优选的是至少大约500/cm2，并且更甚优选的是至少大约1,000/cm2。正如本文所用的，DNA微阵列是置于芯片或其它表面上的用来扩增或克隆靶多核苷酸的寡核苷酸引物阵列。由于每个特定引物组在阵列中的位置是已知的，因此基于靶多核苷酸与微阵列中特定位置的结合，可以确定它们的特性。
“接头”是含有限制性位点的合成的寡脱氧核糖核苷酸。接头可以平端连接到DNA片段的端部，以便产生可以用于将片段后序克隆在载体分子中的限制性位点。
术语“标记物”是指能够产生指示测定样品中存在靶多核苷酸的可检测信号的组合物。适宜的标记物包括放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、磁性颗粒、生物发光部分以及类似物质。于是，标记物是可以由分光的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电子的、光学的或化学的工具检测的任何组合物。
术语：“载体”是指常规的载体例如珠状载体、颗粒状载体、(dipstick)棒状载体、纤维状载体、过滤器样载体、膜载体以及硅烷或硅酸盐载体(诸如玻片)。
术语“扩增”广义上是指产生扩增产物，其中扩增产物可包括例如其它靶分子，或者靶样分子或者与靶分子互补的分子，即由于样品中靶分子的存在而产生的分子。在靶物是核酸的情形中，利用DNA或RNA聚合酶或转录酶可以酶促产生扩增产物。
正如本文所用的，“生物样品”是指从个体中分离出来的组织或体液样品，它包括(但不限于)例如血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液；皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外分泌物；泪液、唾液、乳液、细胞(包括(但不限于)血细胞)、肿瘤、器官以及体外细胞培养物成分的样品。
本文所用的术语“生物源”是指靶多核苷酸来自的来源。这个来源可以是如上所述的任何形式的“样品”，它包括(但不限于)细胞、组织或体液。“不同的生物源”是指相同个体的不同细胞/组织/器官，或者来自相同物种的不同个体的细胞/组织/器官，或者来自不同物种的细胞/组织/器官。
本发明的一个方面是，对来自一个生物样品的靶多核苷酸进行固相扩增，其中多组寡核苷酸引物被固定到一个固相载体上。在一优选的实施方案中，一组内的引物在序列上是相同的，并经选择和设计，以便与一个特定靶多核苷酸的确定序列互补，而且在适宜的条件下能够杂交到靶多核苷酸上，并适合作为核酸合成(即链延长或延伸)的起始引物。将所选择的用于每一靶多核苷酸的引物以组的形式固定到固相载体的不连续位置上。优选的是，组与组之间的距离大于将要用于检测扩增产物的检测工具的分辨率。在一优选的实施方案中，固定引物，以便形成通过自动化过程可被处理和分析的微阵列或芯片。所固定的引物在适合核酸扩增工具的条件下可用于固相扩增靶多核苷酸。
按照本发明的一个方面，起始靶多核苷酸是具有有义链(“正链”)和互补链(“负链”)的双链形式。在进行扩增之前，靶多核苷酸发生变性(例如热变性)，由此使这两个链在反应液中变性和分离。优选的是，本发明中所用的引物是以大大超过靶多核苷酸的估计浓度的摩尔数存在的，从而阻碍了这两个靶多核苷酸链的复性。或者是，起始靶多核苷酸是单链的，即，是单链DNA或RNA。
在本发明的一个优选实施方案中，核酸扩增是由聚合酶介导的。更优选的是，扩增是在适合PCR反应的条件下进行的。正如本领域内的技术人员所理解的，PCR反应一般包括在变化的反应温度下进行的退火-延伸-变性步骤的多次循环，在循环过程中，基于作为模板的起始靶多核苷酸合成了多个拷贝的新生链。结果，根据PCR反应的条件和约束，起始靶序列被线性或指数式地扩增。
在按照本发明的PCR反应过程中，使固定引物阵列与反应混合物中的靶多核苷酸接触，随后，如果靶多核苷酸是双链形式的，就进行变性。在适合退火的条件下，使单链靶多核苷酸杂交到所固定的单个引物上，该引物含有与单链靶多核苷酸内的确定序列区互补的序列。在适合链延伸的条件下(包括(但不限于)DNA聚合酶和游离核苷酸dNTPs的存在)，每一靶多核苷酸链用作新生互补链合成的起始模板，并且新生链从退火引物的3’羟基端被引发并延伸到靶模板的5’端。链延伸完成之后，改变反应条件，以便允许变性，在该过程中，使靶链与新生链分离，以便将靶链释放到样品液中，而新生链通过所固定的引物保留在固相载体上。
在实施本发明时，可以单独使用固定的单个引物，或者和反应液中与新生固定链的3’端序列互补的引物一起使用。而且，液相引物既可是能够扩增所有靶多核苷酸的通用引物，也可是一个特异性引物库，库中的每一引物都特异于特定的靶序列。
在本发明的一个方面，没有使用液相引物。因此，如上所述的起始扩增反应产生在每一引物位点处固定到固相载体上的新生链，该链根据延伸之后是否引入变性步骤而或者成为单链形式或者与起始靶多核苷酸链退火。并且利用适当的检测工具可以检测这些新生链的存在(如下所述)。
本发明的另一方面是，为了扩增多个靶多核苷酸，液相引物与固相固定引物一起使用。起始扩增反应之后，进行另一轮扩增反应，在该过程中，以前形成的在其3’端与液相引物互补的新生链将与液相引物退火，并用作其后合成基本上与靶多核苷酸相同的第二新生链的模板。结果，双链的新生多核苷酸形成并固定到每一引物位点处的固相载体上。
图1和2绘出了本发明的固相扩增方法的例子。
图1绘出了三个靶基因(A、B、C)在具有三组固定的5’端引物的固相载体上的扩增和检测，每一组引物都特异于特定的靶基因。在溶液中不存在其它引物。在图1A中，用闭合箭头绘出了特异于基因A、B和C的固定引物阵列。在图1B中，在退火条件下，单链靶多核苷酸与所固定的5’端引物在它们的互补序列区杂交。然后，在图1C中，条件被改变以适合延伸，在延伸过程中，5’端引物用作利用靶多核苷酸作为模板合成新生链的起始位点。利用可并入其中的标志物即生物素-dCTP来合成新生链，以便随后可以检测到新生链。在延伸完成时，将条件改变以适合变性，在变性过程中，原始的靶模板链从阵列上被释放到溶液中，并且标记的新生单链通过所固定的5’端引物被共价连接到载体上。在图1D中，第二轮退火发生了，从而靶模板链杂交到其它固定引物上用于进一步的扩增。图1E显示出了在固定引物位点处生成的扩增产物，一些产物是单链的生物素标记的多核苷酸，而其它产物是双链的，这是因为靶模板仍旧与新生链退火而没有变性。因为固定引物的摩尔数远远超过靶模板的估计浓度，所以这导致甚至在不存在液相引物时也同时存在单链和双链扩增产物。
图2绘出了利用固定的特异性5’端引物和液相3’端引物进行的靶基因(A、B和C)的扩增和检测。3’引物可以是用于结合到聚腺苷酸化mRNA模板上的通用引物。图2A-2C实质上对应于图1A-1C，它显示出了每一固定5’端引物位点上发生的第一轮PCR以及所生成的可以用并入的生物素标记物来检测的单链新生链。变性之后，使靶模板与新生链分离并释放到溶液中。图2D绘出了第二轮PCR，在该过程中用每一新生链作为由液相通用引物引发的另一新生链合成的模板。同时，原始靶模板杂交到其它固定的5’引物位点上用于进一步扩增。其结果是，在固定引物位点上生成了双链扩增产物，并且每一链都是生物素化的(如图2E所示)。
本发明的固相扩增方法可用来检测和比较不同生物源中的基因表达。在这方面，为了进行扩增反应，固定引物与液相引物一起使用。根据一个实施方案，不同源可以是同一对象的不同组织或细胞。或者是，不同源是同一物种的两个或多个不同对象的对应组织，例如一个来自于健康的对照体，而另一个来自于患者。在又一实施方案中，不同源是指来自两个或多个不同物种或不同动物，诸如一个来自人，而另一个来自小鼠。
通过一起扩增引物固相阵列上的来自不同生物源的靶多核苷酸，实质上完成了按照本发明的基因表达差异分析。在该实施方案中，用寡核苷酸序列差异标志每一来源的成批起始靶多核苷酸，以便使最终的扩增产物携带这些序列标志，从而指示出起始靶物的来源。通过检测和比较用“源标志”标记的扩增产物，可以确定和比较不同源中靶多核苷酸的存在和相对丰度。
作为本发明的这个实施方案的举例说明，来自不同生物源的原始靶多核苷酸是其中所表达的总mRNA。本领域内公知的方法和材料都可用来从每一来源中分离出总的mRNA。然后，从每一生物源中分离出的mRNA的这一总集合体可用来制备一批特异性标志的cDNA，而后者将用作后序扩增的“靶多核苷酸模板”。在一实施方案中，每批反转录的cDNA在其3’端为特异性序列标志所标志。该特异性序列标志不存在于任何未修饰的靶多核苷酸中。例如，如果待检测的靶多核苷酸来自于人类细胞/组织，那么该序列标志可源于细菌或病毒基因组，并且该序列在杂交/扩增条件下不会与转录成mRNA的人类序列退火。以这种方式，来自一批的序列标志将不会由于交叉杂交的作用导致另一批的错误扩增。
而且，每一批cDNA靶物的序列标志与另一批cDNA靶物的序列标志不同，从而可以对它们进行比较。通过利用专门设计的用于反转录的引物，可以将序列标志引入反转录的cDNA内。例如，一个引物可以在其3’端具有寡dT部分，而在其5’端具有细菌SP6序列。在反转录过程中，mRNAs用作模板，从与mRNA模板的寡A尾退火的5’端寡dT起始合成cDNA。然后，所生成的cDNA产物在其5’端具有对于这批cDNAs是独特的SP6“序列标志”。同样，可以利用不同的序列标志例如细菌T7序列来“标志”来自另一源的不同批的cDNAs。
将用例如SP6和T7所差异标志的这两批cDNA混合到一起，以便进行扩增和检测。扩增反应混合物中存在被差异标记的游离SP6和T7序列标志。例如，可以用能够进行直接检测的两种不同的荧光染料(例如一个是红色染料，一个是绿色染料)或者用能够进行后序颜色检测的两种化学部分(例如一个是生物素，一个是洋地黄毒苷)来标记这两个序列标志。重要的是，不在序列标志的3’端进行标记，以便使序列标志随后可用作扩增反应中的引物。
用于本发明的优选扩增方式是PCR反应。将两批差异标志的cDNA的混合物与具有多组特异性引物的固相阵列接触，其中每一组引物都对应于特定的靶cDNA(如上所述)。在最初一轮的PCR中，固定引物与来自这两个源的靶多核苷酸退火，并在足以进行链延伸的条件下合成新生的互补链。新生的互补链跨越靶序列区，并在其3’端含有与靶cDNA模板端部的序列标志互补的序列。例如，如果在来自源1的SP6标志的cDNA模板上扩增第一新生链，那么它具有与SP6序列互补的3’端；而如果在来自源2的T7标志的cDNA模板上扩增第二新生链，那么它具有与T7序列互补的3’端。于是，固定在固相阵列上的每一新生链都“遗传”其来源所特异的序列标志。
在后序PCR循环中，因不同来源而标志的第一组新生链可用作合成第二组新生链的模板。这次，PCR的起始引物是溶液中差异标记的游离序列标志，例如荧光标记的SP6引物和丽丝胺标记的T7引物。因此，从标记的序列标志延伸的第二组新生链将相应于最初一轮PCR反应中的靶cDNA模板的原始来源被差异标记。在不变性的条件下洗除未结合的试剂和原始模板之后，每一固定引物位点处都将具有双链的多核苷酸，这个多核苷酸在一个链上具有指示出原始生物源的标记物。于是，不同标记物的最终检测将揭示出不同生物源中特定靶多核苷酸的存在和丰度。
本领域内的技术人员应该理解，为了实施本发明，不需要对来自每一生物源的基因表达进行精确定量，虽然这种准确测定也是可能的。更确切地，本发明提供的是用于比较分析不同源的基因表达的方法。在阵列的每一引物点上对不同标记物的检测可用来确定来自不同生物源的每一靶多核苷酸的比例，以及相对丰度。
图3显示出了不同生物源的差异表达分析的一个例子。
图3绘出了来自两个不同样品的靶基因的扩增和检测，其中每个靶基因用样品特异性序列标志来标志。在差异标记的液相序列标志(例如Cy3-序列标志1和Cy5-序列标志2)存在下进行扩增反应。在图3A中，特异于每一基因的5’端引物被成组固定到固相载体上。在图3B中，之前5’端用序列标志进行标志的靶链被退火到所固定的5’端引物上并用作PCR扩增的模板。在图3C中，与靶模板互补的新生链从每一固定的引物位点起始并跨越靶序列到达与序列标志互补的3’端。于是，也可用互补标志序列标志每一新生链。在完成第一轮扩增时，在变性过程中从新生链中释放出原始的靶模板。其次，图3D绘出了第二轮PCR，在该过程中，每一固定的新生链用作模板，而Cy3-或Cy5-标记的液相序列标志用作引物，合成另一新生链。结果，每一新链根据相应的靶序列所来自的样品来源，或者承载Cy3标记物或者承载Cy5标记物。还是在图3D中，原始的靶模板退火到其它固定的5’端引物位点上，以便开始新一轮扩增。在完成第二轮PCR时，不进行变性，从而Cy3或Cy5标记的新生链仍旧退火到所固定的新生链上。因此，如图3E所示，可以检测所固定的扩增产物中Cy3或Cy5的存在，从而指示出原始靶基因的来源。
本发明的差异表达分析在生物学研究以及临床应用的多个方面是有用的。例如，可以在一个样品混合物内比较多个系统中的特定感兴趣基因的表达谱，从而使偏差最小。这使得能够比较例如不同物种之间的某些基因的表达水平，并由此评估感兴趣的基因的功能。而且，通过将靶基因的表达水平与健康个体进行比较，本发明在患者的某些遗传缺陷的临床诊断中是有用的。再者，利用本发明，可以对不同细胞/组织/有机体的基因表达水平进行比较，以评估某些基因在特定生物途径中的作用。
上述的扩增方法可用于在一单个固相载体上高通量测定多个靶多核苷酸。将单个形式或成对形式的多组引物固定到固相载体上，以便形成具有预定图案的微阵列。每组引物对应于特定的靶多核苷酸并占据微阵列内的不连续位置。当在如上所述的适合PCR反应的反应条件下使含有或怀疑含有多个靶多核苷酸的样品与微阵列接触时，每个靶多核苷酸将被扩增并固定到其上固定有相应引物的微阵列的不连续位置上。
按照本发明，潜在靶多核苷酸的数目仅受到用于制备和分析低密度微阵列的现有技术的限制。例如，利用公知的技术，可以按如下在一单个固相载体上分析高达大约100,000个的多核苷酸：首先，在固相载体的不连续位置上提供高达大约100,000个不同的引物对群体，然后使载体与PCR溶液及包括至少一个靶多核苷酸拷贝的样品接触，其中该引物是设计以检测所述靶多核苷酸的。
方法和材料
1、靶多核苷酸
为了本发明的目的，靶多核苷酸可以是双链DNA、单链DNA，或RNA。靶多核苷酸的例子包括(但不限于)基因组DNA、cDNA、mRNA、线粒体DNA、病毒DNA、扩增的DNA以及病毒RNA。双链的靶多核苷酸在扩增反应开始时发生变性，从而提供单链模板。
mRNA靶多核苷酸可直接用作由反转录酶介导的扩增的模板。在起始于每一固定引物位点的链延伸完成之后，可以通过例如RNAse H破坏杂交的RNA模板链，使新生互补DNA链固定在固相载体上。如果第二引物(或者是特异性的或者是通用的)存在于液相中，那么第一新生cDNA链将用作合成另一新生链的模板，借此在每一固定引物位点处形成双链的新生DNA分子或者结合两个固定引物。
或者是，样品中的mRNA靶多核苷酸首先可以被反转录成互补的DNA，而该DNA又用作本发明的固相PCR反应的起始模板。可从例如寡dT通用引物引发反转录，而该引物还可用作按照本发明的PCR扩增反应的液相通用引物。寡dT引发的cDNA产物将在其3’端与固定在固相载体上的特异性引物退火，并用作其后合成在其3’端具有寡A序列的新生互补链的模板。变性步骤之后，所固定的单个新生链能够与液相中的寡dT通用引物杂交并用作其后一轮PCR扩增形成固定到固相载体上的双链新生多核苷酸的模板。
本发明的多个多核苷酸可来自于一单个生物源或者来自多个生物源(例如不同的物种和组织)。例如，可以在利用本领域内公知的检测方法可以区分两个来源的扩增产物的条件下，将从健康个体中分离出来的靶多核苷酸群体与另一群从患有目的疾病的患者体内分离出来的靶多核苷酸在一个PCR反应中混合(如上详细描述)。因此，本发明可用于靶多核苷酸的交叉物种比较分析。
2、寡核苷酸引物
本发明提供了包含若干分离的固定寡核苷酸引物组的制备好的固相载体。每一引物适合对特定的靶多核苷酸进行扩增。于是，可以利用诸如标准的PCR引物选择程序例如Massachusetts Institute of Technology(MIT)的Primer3、基于靶多核苷酸中的已知序列区来选择或设计这些引物。
固相载体可提供大约5-大约100平方微米的面积，在其上可以将大约高达100,000组单个引物按照预定图案固定在不连续的区域中。该制备好的固相载体带有有关载体上任何给定位置的引物或引物对序列的相关书写或电子记录，因此，也可以鉴定所扩增的靶物在载体上的位置。
根据后序计划在微阵列上进行的扩增反应的需要，可以确定并限制每一组内对应于特定靶核苷酸的引物的数目。于是，例如，据信在微阵列上的特定位点进行PCR(特别是给定了反应体积和靶模板多核苷酸分子的预期数目)所需的引物数目和PCR循环的建议次数将帮助精确确定，为了确保反应成功要将多少寡核苷酸引物拷贝作为一个组施加到载体的每一位置上。优选的是，引物的量(即引物的分子数或引物浓度)在给定固相载体的每一提供引物的位置上都将大致相同(例如在DNA微阵列格式中，具有1000至10,000及大约高达100,000个的引物群用以扩增或检测大约高达100,000个的靶多核苷酸)。
可由基于待测多核苷酸的用于特定应用的引物序列制备固相载体。这些寡核苷酸引物可以具有适合特定PCR的任何长度，特别是在考虑到待扩增的靶多核苷酸的序列和质量的情况下。作为一个例子，引物可具有大约4-大约30个核苷酸的长度。
应该理解，本发明的核酸引物可在一定程度上含有次要核酸碱基缺失、添加和/或替代，以便这些变化不会对所获得的产率或产物具有显著程度的负面影响。
寡核苷酸引物可包括一般在核酸中发现的天然杂环碱基(尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤)，以及修饰碱基和碱基类似物。与引物和靶序列的杂交相容的任何修饰碱基或碱基类似物都可用于本发明的实施中。引物的糖或糖苷部分可包含脱氧核糖、核糖以及/或者这些糖的修饰形式诸如2’-O-烷基核糖。在一优选实施方案中，糖部分是2’-脱氧核糖；然而，可以采用与引物杂交到靶序列上的能力相容的任何糖组分。
在一实施方案中，引物的核苷单元由磷酸二酯主链连接(正如本领域所公知的)。在其它实施方案中，核苷间键可包括本领域内技术人员公知的与引物的特异性杂交相容的任何键，这些键包括(但不限于)硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磺酸酯(例如US专利5,470,967)和聚酰胺(即肽核酸)。肽核酸在Nielsen等人(1991)Science 254：1497-1500；US专利5,714,331；以及Nielsen(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10：71-75中有所描述。
在某些实施方案中，引物可以是嵌合分子；即，可以包含一种以上类型的碱基或糖亚单元，以及/或者在同一引物中键可以多于一种类型。正如本领域内所公知的，例如通过并入嵌入剂和/或小沟结合剂，引物可包含利于其杂交到靶序列上的部分。
碱基、糖及核苷酸间主链的变异以及引物上任何侧基的存在，应与引物以序列特异性方式结合其靶序列的能力相容。大量的结构修饰(公知的和待开发的)在这些结合中都是可能的。而且，用于制备形成引物的多种杂环碱基、糖、核苷及核苷酸的合成方法、以及具有预先确定的特异性序列的寡核苷酸的制备方法都已得到很好的发展并且在本领域内是公知的。一种寡核苷酸合成的优选方法收编在US专利5,419,966的教导中。
可以利用将有助于和促进特定PCR或随后操作(例如所扩增的靶多核苷酸的分离)的任何特异性添加组分或序列来设计寡核苷酸引物。例如，除了那些与靶序列互补的序列之外，引物还可包括若干序列。这些序列通常在引物中靶互补序列的上游(即在5’侧)。例如，当包括一个或多个限制性酶识别位点(所谓的“接头”或“衔接子”)的序列存在于引物内靶互补序列上游时，其促进扩增产物的克隆和后序操作。引物中所包括的其它有用序列包括，与测序引物互补的那些序列和规定启动子使用噬菌体RNA聚合酶(例如T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶)的那些序列。
当液相引物也用来进行PCR扩增时，这些液相引物可以是通用引物。不同的通用引物可用于待比较的组织或物种样品。可差异标记这些不同的引物(例如一个是绿的，一个红的)，以便在检测过程中，来自一个物种或组织样品的靶物可以与来自另一物种或组织样品的相应靶物区分开。
而且，可以设计本发明的寡核苷酸引物，以便检测或克隆与其野生型对应物相比含有特异性核苷酸突变的突变多核苷酸。可以基于野生型多核苷酸的序列设计3’端的最后核苷酸不同的引物。于是，这些3’端替代的引物不能结合并PCR扩增野生型靶多核苷酸。但，它们将识别并扩增具有与核苷酸替代相匹配的序列突变的那些突变体。通过利用跨越感兴趣区域的具有3’端替代的引物阵列，可检测该区域内的突变。
3、固相载体
本发明的固相载体可以是适合支持核苷酸杂交与合成的任何固体材料和结构。优选的是，该固相载体包含至少一个基本上坚硬的表面，在该表面上可以固定引物并进行PCR反应。固相载体可由例如玻璃、合成聚合物、塑料、硬性非网状尼龙或陶瓷制成。其它适宜的固相载体材料对于本领域内的技术人员来说是公知的并容易得到的。固相载体的尺寸可以是可用于DNA微阵列技术的任何标准的微阵列尺寸，并且可以特制该尺寸，以便适合用来进行本发明反应的特定机器。为了达到固定寡核苷酸的目的，用于固相载体衍生化的方法和材料对于本领域内的技术人员来说是公知的并且在US专利5,919,523中有所描述，该专利的公开文本在此一并作为本文的参考文献。
固相载体可在含有流体的容器内或作为其中的一部分提供。例如，可以将固相载体放在一个具有若干侧面的室中，这些侧面沿固相载体边缘形成了密封，以便包含载体上的聚合酶链式反应(PCR)。在一个特定例子中，该室在矩形载体的每一边上都具有壁，从而确保PCR混合物保留在载体上并且还使整个表面可以用来提供引物。
4、引物固定
利用将寡核苷酸固着、固定、提供和/或施加在固相载体的特定部位上的任何已有手段，将本发明的寡核苷酸引物固着、固定、提供和/或施加在固相载体表面上。例如，照相平版印刷术(Affymetrix，Santa Clara，CA)可用来将寡核苷酸引物施加到芯片或固相载体的特定位置上(正如美国专利USPN 5,919,523、USPN 5,837,832、USPN 5,831,070和USPN 5,770,722所述的，这些专利在此一并作为本文的参考文献)。如Brown和Shalon，USPN 5,807,522(1998)所述，还可将寡核苷酸引物施加到固相载体上。另外，可以利用诸如由Genetic MicroSystems(Woburn，MA)、GeneMachines(San Carlos，CA)或Cartesian Technologies(Irvine，CA)制造的机器人系统，将引物施加到固相载体上。
5、PCR反应
在本发明的实施中，使包含与进行聚合酶链式反应(PCR)所需的试剂混合的适宜靶多核苷酸的反应混合物与固相载体上的每一固定引物对或单个引物群接触。适当的靶多核苷酸可以是双链DNA、由RNA模板的反转录产生的单链cDNA，或者mRNA群体。反应混合物含有利于合成与靶链互补的多核苷酸链的酶。适当的聚合酶包括耐热的聚合酶例如Taq DNA聚合酶、TthI DNA聚合酶、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或任何其它的耐热的DNA聚合酶。反应混合物还可含有能够在聚合酶链式反应过程中并入新生链内的标记分子，以便在PCR之后能够在固相载体上检测到所扩增的产物。按照本领域内熟知的方法可直接或间接检测标记物。用于直接检测的适当标记物可以是任何荧光分子例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红或罗丹明。还可以将利于间接检测的分子例如生物素或洋地黄毒苷在PCR过程中并入新生链内。生物素可以通过与标记的链霉抗生物素蛋白或标记的抗生物素抗体结合而随后被检测到。同样，可以利用标记或未标记的抗洋地黄毒苷抗体来检测并入的洋地黄毒苷，并且未标记的抗洋地黄毒苷抗体可以通过结合标记的抗抗洋地黄毒苷抗体而被检测到。
在用于进行PCR的试剂与微阵列上的固定引物接触之后，利用诸如自动化系统例如原位PCR机，使微阵列置于利于发生PCR的条件下。用于PCR过程的反应条件可以正如原位PCR机手册所推荐的那样，并可以考虑到所用的模板性质或者预期在引物和模板杂交中将出现的任何其它困难，进行适当改变。根据推荐并考虑到引物选择和模板序列以及任何其它相关因素适当地选择循环的温度和次数。基本上如以下文献中所述的那样，进行微阵列上的原位型PCR反应：例如，Embretson等人，Nature 362：359-362(1993)；Gosden等人，BioTechniques 15(1)：78-80(1993)；Heniford等人Nuc.Acid Res.21(14)：3159-3166(1993)；Long等人，Histochemistry 99：151-162(1993)；Nuovo等人，PCR Methods andApplications 2(4)：305-312(1993)；Patterson等人Science 260：976-979(1993)。
6、标记与检测
本发明的PCR法可用于检测样品中的多个靶多核苷酸。在适宜的标记试剂的存在下完成PCR之后，可以在微阵列上的每一原始引物位置检测扩增和标记的靶多核苷酸。利用检测标记序列的标准方法可进行扩增或标记的靶多核苷酸的检测，该标准方法包括例如检测已经并入扩增的或新合成的DNA链内的标记物。于是，例如可以直接检测荧光标记物或放射性标记物。其它标记技术可能要求，在链合成过程中并入DNA内的标记物(诸如生物素或洋地黄毒苷)被或者是标记的、或者是本身可以结合标记分子的抗体或其它结合分子(例如链霉抗生物素蛋白)检测到，例如标记分子可以是诸如与荧光分子(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红或罗丹明)或可酶促活化分子缀合的抗链霉抗生物素蛋白抗体或抗洋地黄毒苷抗体。无论新合成分子上的标记物是什么，以及标记物是直接在DNA内的还是缀合到结合DNA的分子上的(或者结合与DNA结合的分子)，均可以根据标记物，利用激光扫描仪或CCD摄像机或X射线胶片，或者用于检测特定标记物的其它适宜工具(例如荧光的、酶的、化学发光的、或显色的)来检测这些标记物。
通过利用在PCR过程中并入扩增DNA内的标记核苷酸(例如用于直接标记的dNTP-荧光标记物；用于间接标记的dNTP-生物素或dNTP-洋地黄毒苷)，可以检测靶多核苷酸。对于间接标记的DNA，利用荧光或其它酶缀合的链霉抗生物素蛋白或抗洋地黄毒苷抗体来完成这个检测。通过检测并入多核苷酸靶物的新合成互补物内的标记物，该PCR法对多核苷酸进行检测。为了达到这个目的，正如以上所述，可以使用在DNA合成时能够并入其中的任何标记物例如荧光-dNTP、生物素-dNTP或洋地黄毒苷-dNTP，而且它们是本领域内公知的。利用溶液中的一个或多个通用引物进行的PCR扩增提供了通过检测通用引物而检测固相载体各位置上的扩增靶物的可能性。于是，当使用一个以上的通用引物时，可以在固相载体上差异检测来自不同源的靶链。
在差异表达系统内，通过基于其来源来差异标记扩增链，可以检测来自不同生物源的扩增产物，这正如在“C.比较来自不同生物源的基因的差异表达”之下的部分中所描述的。一方面，本文使用的检测方法不同于用于单源靶物的检测方法，因为在本文使用的检测方法中，差异标记物(例如红色染料和绿色染料)是预先并在溶液内的引物标志上的，而不是在扩增过程中并入新生链内的。或者是，除了差异标记物之外，在扩增过程中还可以并入第三标记物，以便增加差异标记比较的整个灵敏度。
7、检测试剂盒
本发明提供了用于实施本发明方法的试剂盒。该试剂盒可包含例如用于检测否则在固相载体上难以检测的多个靶多核苷酸的材料和试剂。该试剂盒可包括例如固相载体、用于特异靶多核苷酸组的寡核苷酸引物、用于DNA合成的聚合酶链式反应试剂以及组分例如酶、标记材料以及用于洗涤的其它缓冲液和试剂。该试剂盒还可包括如何使用试剂盒以便在固相载体上扩增特异性靶物的说明书。当试剂盒含有制备好的固相载体(具有例如用于扩增特定靶多核苷酸组的已经固定到固相载体上的引物组)时，这样的制备好的固相载体的设计和结构如上所述。可以根据消费者需要检测的靶多核苷酸为个别试剂盒定制这些固相载体。该试剂盒还包括例如利用原位型或固相型PCR程序(其中载体能够利用原位型PCR机进行PCR扩增)在固相载体上进行PCR所需的试剂。载体可与这些试剂接触来进行PCR。将潜在地含有多个靶多核苷酸的样品在反应之前加入到PCR试剂混合物中。PCR试剂包括常用的PCR缓冲液、耐热的聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)、核苷酸(例如dNTPs)以及其它组分和标记分子(例如用于如上所述的直接或间接标记)。固相载体提供了固定在固相载体的指定部位的引物。为了进行PCR，具有固定引物的载体与反应混合物中用于进行PCR的试剂以及靶多核苷酸模板接触并置于PCR(例如原位型或固相型PCR)条件下。试剂盒的使用说明书可包括诸如以上方法描述中所指出的过程的细节。可以组装该试剂盒，以便支持PCR扩增方法的实施，在该方法中，固定引物单独使用或者与液相引物一起使用。
实施例
实施例1、四个靶DNA模板在微阵列上的扩增
选择四个cDNA靶多核苷酸即人的G3PDH、PKC-α、c-Raf以及Cyclin A，以便通过在微阵列上或者通过对称PCR或者通过不对称PCR扩增来进行检测，其中在对称PCR中，引物对的两成员都固定在载体上，而在不对称PCR中，引物对中的一成员被固定，而另一成员在溶液中。
a、G3PDH的对称扩增
基于这些靶多核苷酸的推测的或推导的序列，为四个靶物中的每一个设计并合成引物对群体。合成5’端用胺修饰的引物，以便有助于引物固定到固相载体上。以不同的浓度，将引物成对地或以单个引物的形式点加在从Sigma Chemicals(St.Louis，MO)购得的硅酸盐玻片上。
在室温下使具有所提供的引物的硅酸盐玻片在饱和NaCl的室内水合过夜。水合玻片用4XSSC漂洗5分钟，然后用水洗涤。玻片在50℃下用SurModics(Madison，WI)封闭液(具有0.1％的SDS)封闭15分钟，然后用水漂洗两次并进行空气干燥。随后玻片即可使用。
制备PCR反应溶液，以便使最终浓度为dATP、dGTP和dTTP各200μM；100μM的dCTP和100μM的生物素-14-dCTP。反应溶液还含有1X Taq反应缓冲液(具有1.5mMMgCl2)；作为DNA模板的人类G3PDH基因质粒(100ng的噬菌粒DNA或500ng的ss-cDNA文库)以及2.5单位的Taq酶。如下制备70μl的反应溶液：
7μl        2mM d3TP(dATP、dGTP和dTTP)
12.5μl     0.4mm dCTP
12.5μl     0.4mM生物素-14-dCTP
7μl        10X反应缓冲液(w/15 mM MgCl2)
5μl        DNA模板
25.5μl     水
0.5μl      5单位/μl的Taq DNA聚合酶
总体积70μl
将HyBaid室(Franklin，MA)置于玻片上，以便使所排列的位置保持在中心，并且将反应液转移到室中并用塑料盖密封。预热PCR机并实施以下的循环方案：
开始          -----94℃     5分钟
主循环：     (步骤1-3)重复35X
-1            -----94℃     30秒
-2            -----55℃     30秒
-3            -----72℃     30秒
最后的延伸    -----72℃     7分钟
终止          -----4℃      维持
在完成PCR之后，在室温下用来自Boehringer Mannheim(Indianapolis，Indiana)的洋地黄毒苷封闭液封闭玻片30分钟。在室温并轻轻摇动下用链霉抗生物素蛋白(5μg/μl)(在洋地黄毒苷封闭液中1∶250稀释)染色玻片30分钟。在室温下，使用洋地黄毒苷洗涤缓冲液洗涤玻片15分钟、两次。然后，在室温下用洋地黄毒苷封闭液封闭玻片30分钟。
在室温下玻片与在洋地黄毒苷封闭液中以1∶100的比例稀释的第一抗体(兔抗链霉抗生物素蛋白)一起孵育1小时。然后，在室温下，用洋地黄毒苷洗涤缓冲液洗涤玻片15分钟、两次。在室温下玻片与在洋地黄毒苷封闭液中以1∶100的比例稀释的第二抗体(Cy3缀合的羊抗兔抗体)一起孵育30分钟。在室温下，用洋地黄毒苷洗涤缓冲液洗涤玻片15分钟、两次。用来自Genetic MicroSystem，GMS418的绿色光束扫描玻片。
图4A显示出了对称PCR的结果。发亮的点表示hu G3PDH模板在固定有人G3PDH引物的点上成功扩增。相反，在固定有其它非人的G3PDH引物的任何点上没有检测到靶人G3PDH模板。
b、hu G3PDH的不对称扩增
利用用于四个靶物cDNAs、hu G 3PDH、PKC-α、c-Raf以及Cyclin A的每一个的引物组进行不对称PCR反应。微阵列上的每一点含有确定浓度的特异于靶cDNA的一组引物，如图4B中所标注的。除了固定引物之外，25pmol的hu G3PDH反义引物也包括在反应液内。在上述条件下利用1pg hu G3PDHcDNA作为模板进行PCR扩增。
图4B显示出了hu G 3PDH cDNA的不对称PCR结果。点加的引物浓度从栏1至6分别为：3.125、6.25、12.5、25、50和100pmol/μl。发亮的点表示在含有hu G3PDH引物的点上仅仅可检测到hu G3PDH的扩增产物，这暗示测定具有较强的特异性。而且，不对称PCR结果的分辨率要比图2A中所示的对称PCR结果高，这暗示不对称方法具有较好的灵敏度。
c.四个靶cDNAs在一个微阵列上的不对称扩增
通过在一单个微阵列上检测多个靶多核苷酸来测试本发明的不对称方法。
微阵列以及其上的引物与1b中的相同，并且每一点都含有特异于靶cDNA的一组单引物并且有确定的浓度。反应液含有用于四个靶cDNA的每一个的反义链引物(每一个引物具有25pmol)。反应液还含有作为PCR扩增模板的四个cDNAs的每一个。象例1a所述的那样进行PCR反应。
图4C显示出的结果表示，成功地扩增了所有的靶模板，甚至在具有最低引物浓度的点上也是如此。
实施例2、RNA靶物的固相扩增
在该实施例中，通过检测生物样品中的mRNA表达来测试不对称PCR方法。
从OVC 1.1细胞中分离出5μg的mRNA并用于单链cDNA的反转录。利用SuperScript II试剂盒(Life Technology Inc.)来完成反转录反应。用0.5μg制备好的cDNA作为模板，以便用反应液中的25pMol通用引物(Uni-1)进行不对称PCR，将不同浓度的用于四个靶基因即hu G3PDH、PKC-α、c-Raf以及Cyclin A的特异性引物固定到微阵列的不同点上。按照以上的例1(a)中所述的条件和过程来进行PCR反应。
结果如图5所示。四个靶基因的表达谱显示出了表达的不同丰度，其中hu G3PDH具有最大丰度，而c-Raf具有最小丰度。
实施例3、杂交之前的固相扩增使信号增强
在该实施例中，对单独杂交所产生的信号与在杂交之前进行PCR的固相扩增所产生的信号进行比较。如图6所示，在微阵列上杂交之前实施固相PCR和未实施固相PCR这两种情况下，比较来自卵巢癌细胞系OVC 1.1和胎脑的基因表达分析的信号。
图6A-6B显示出了含有来自OVC 1.1细胞的与荧光探针杂交的阵列元素的cDNA微阵列，其中探针是按照标准方法通过酶标记从总的mRNA制备的(参见，Schena M.，和Davis R.W.，(1998).Genes，Genomes and Chips.In DNA Microarrays：A Practical Approach(ed.M.Schena)，OxfordUniversity Press，Oxford，U.K.)。图6A显示出了标准方案之后的杂交信号，而图6B显示出了按照以上的例1(a)所述的条件和过程进行固相PCR反应之后的杂交结果。
图6C-6D显示出了沿相同路线的另一试验的结果。图6C显示出了荧光标记的细胞mRNA探针与包含胎脑cDNA靶物的微阵列杂交之后的信号，而图6D显示出了在按照本发明的固相PCR反应之后的杂交结果。
实施例4、固相扩增之后杂交信号的特异性
在以下实施例中，测试固相PCR反应之后杂交反应的特异性。选择四个cDNA靶多核苷酸人基因G3PDH、PKC-α、c-Raf和Cyclin A，以便通过在微阵列上扩增来进行特异性检测。
a.G3PDH的特异性扩增
用来自人基因G3PDH、PKC-α、c-Raf和Cyclin A的四个不同的有义链引物点加胺包被的玻璃芯片。在利用1pg(大约4×105拷贝)的来自pG3PDH的单链噬菌粒DNA以及溶液中的25pMol G3PDH反义引物进行DNA聚合酶链式反应之后，人G3PDH基因被特异性扩增和检测。
从OVC 1.1细胞中分离出5μg的mRNA并用于单链cDNA的反转录。利用SuperScript II试剂盒(Life Technology Inc.)来完成反转录反应。用0.5μg制备好的cDNA作为模板，以便用反应液中的25pMol通用引物(Uni-1)进行不对称PCR，并将不同浓度的用于四个靶基因即hu G3PDH、PKC-α、c-Raf以及Cyclin A的特异性引物固定到微阵列的不同点上。按照以上的例1(a)中所述的条件和过程来进行PCR反应。
结果如图7所示。点加的引物浓度从栏1至6分别为：3.125、6.25、12.5、25、50和100pmol/μl。发亮的点表示仅可以在含有hu G3PDH引物的点上检测到hu G3PDH的扩增产物，这暗示测定具有较强的特异性。
b.G3PDH和c-Raf的特异性扩增
用来自人基因G3PDH、PKC-α、c-Raf和Cyclin A的四个不同的有义链引物点加胺包被的玻璃芯片。在利用100ng的c-Raf DNA和1pg(大约4×105拷贝)的来自pG3PDH的单链噬菌粒DNA以及溶液中的25pMol G3PDH反义引物(但没有c-Raf反义引物)进行DNA聚合酶链式反应之后，人G3PDH基因被特异性扩增和检测。
将不同浓度的用于四个靶基因即hu G3PDH、PKC-α、c-Raf以及CyclinA的特异性引物固定到微阵列的不同点上。按照以上的例1(a)中所述的条件和过程来进行PCR反应。结果如图8所示。点加的引物浓度从栏1-6分别为：3.125、6.25、12.5、25、50和100pmol/μl。发亮的点表示在含有hu G3PDH引物的点上可检测到hu G3PDH的扩增产物，并且信号强于在含有c-Raf引物的点上所检测的c-Raf，这暗示测定具有较强的特异性以及对于G3PDH不对称PCR的灵敏度增强。
c.G3PDH、PKC-α、c-Raf和Cyclin A的特异性扩增
用来自人基因G3PDH、PKC-α、c-Raf和Cyclin A的四个不同的有义链引物点加胺包被的玻璃芯片。在利用作为模板的四个基因群体以及溶液中的四个反义链引物(每个具有25pMol)进行DNA聚合酶链式反应之后，四个基因全部被特异性扩增和检测。
结果如图9所示。点加的引物浓度从栏1至6分别为：3.125、6.25、12.5、25、50和100pmol/μl。发亮的点表示四个扩增产物全部可以被检测到。
d.在胎脑cDNA文库基因表达分析中测试特异性扩增
利用人胎脑cDNA文库(Stratagene)作为模板在微阵列芯片上进行DNAPCR的。用0.05μg制备好的cDNA作为模板，以便在点加有不同浓度的用于四个靶基因即hu G3PDH、PKC-α、c-Raf以及Cyclin A的特异性引物的微阵列上用反应液中的25pMol通用引物(Uni-1)进行PCR扩增。按照以上的例1(a)中所述的条件和过程来进行PCR反应。
结果如图10所示。点加的引物浓度从栏1至6分别为：3.125、6.25、12.5、25、50和100pmol/μl。该数据与利用相同DNA样品在HO1ExpressChipTM(Mergen，Ltd.，San Leandro，California)上的杂交结果吻合，这表明由固相扩增导致的相对信号的失真非常小。
e、在OVD1.1细胞基因表达分析中测试特异性扩增
用来自人基因G3PDH、PKC-α、c-Raf和Cyclin A的四个不同的有义链引物点加胺包被的玻璃芯片。在利用1pg(大约4×105拷贝)的来自pG3PDH的单链噬菌粒DNA以及溶液中的25pMol G3PDH反义引物进行DNA聚合酶链式反应之后，人类G3PDH基因获得特异性扩增和检测。
从OVC 1.1细胞中分离出5μg的mRNA并利用SuperScript II试剂盒(Life Technology Inc.)反转录为单链cDNA。用0.05μg cDNA作为模板，以便用反应液中的25pMol通用引物(Uni-1)，及不同浓度的固定到微阵列不同点上的用于靶基因即hu G3PDH、PKC-α和Cyclin A的有义链寡核苷酸，进行PCR反应。
结果如图11所示。点加的引物浓度从栏1至6分别为：3.125、6.25、12.5、25、50和100pmol/μl。发亮的点表明由固相扩增导致的相对信号的失真非常小。
就象专门并单独指出每一单个出版物或专利申请作为参考文献并入本文一样，本说明书中提到的所有出版物和专利申请都作为参考文献并入本文。
虽然为了清楚地理解本发明，业已借助于举例说明和实施例一定程度地详细描述了上述发明，但是按照本发明的教导，本领域的普通技术人员易于明了，可以在其上作出某些改变和修改而不脱离后面所附的权利要求的精髓或范围。

Claims (33)

1、一种用于检测样品中多个靶多核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供寡核苷酸引物阵列，其中每个阵列含有固定在固相载体的不连续区域上的一组或多组寡核苷酸引物，每组寡核苷酸引物可以针对特定的靶多核苷酸选择并包含与特定的靶多核苷酸序列互补的引物序列；
b)使阵列与包含样品的反应混合物接触，所述样品含有或怀疑含有多个靶多核苷酸，所述反应混合物还包含适合多核苷酸杂交和扩增的试剂；
c)进行至少两轮聚合酶介导的多核苷酸扩增，由此靶多核苷酸用作合成可检测的新生多核苷酸的起始模板，其中所述新生多核苷酸从固定引物延伸出来；以及
d)检测通过相应的固定引物而捕获在固相载体的不连续区域上的合成多核苷酸的存在和量。
2、权利要求1的方法，其中所述反应混合物还包含一群液相引物。
3、权利要求2的方法，其中所述液相引物是通用引物。
4、权利要求3的方法，其中所述通用引物是寡dT引物。
5、权利要求3的方法，其中所述通用引物包含SP6启动子、T3启动子或T7启动子。
6、权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含可并入新生多核苷酸内的可检测标记物，借此使新生多核苷酸可以得到检测。
7、权利要求6的方法，其中所述可检测标记物是荧光分子。
8、权利要求6的方法，其中所述可检测标记物是生物素化-dNTP或洋地黄毒苷-dNTP。
9、权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含特异地与可并入新生多核苷酸内的第二标记物结合的第一可检测标记物，借此使新生多核苷酸可以得到检测。
10、权利要求9的方法，其中所述第二标记物是生物素化-dNTP，而第一可检测标记物是缀合到荧光分子或可酶促活化分子上的链霉抗生物素蛋白。
11、权利要求9的方法，其中所述第二标记物是洋地黄毒苷-dNTP，而第一可检测标记物是缀合到荧光分子或可酶促活化分子上的抗洋地黄毒苷抗体。
12、权利要求1的方法，其中所述阵列包含至少大约100至大约100，000组固定的寡核苷酸引物。
13、权利要求12的方法，其中所述阵列包含至少大约1,000组固定的寡核苷酸引物。
14、权利要求13的方法，其中所述阵列包含至少大约10,000组固定的寡核苷酸引物。
15、权利要求1的方法，其中所述固相载体是由选自以下的材料制成的：玻璃、塑料、合成聚合物、陶瓷和尼龙。
16、权利要求1的方法，其中所述聚合酶是Taq DNA聚合酶、TthI DNA聚合酶、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或任何其它耐热的DNA聚合酶。
17、一种用于检测和比较来自至少两个不同生物源的多个靶多核苷酸的表达谱的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供固定在固相载体上的具有多组寡核苷酸引物的阵列，每组寡核苷酸引物都是针对特定的靶多核苷酸而选择的并包含与靶多核苷酸序列互补的引物，其中来自每个生物源的靶多核苷酸含有共价连接的生物源所独特的序列标志；
b)使阵列与样品接触，所述样品包含来自至少两个不同生物源的多个靶多核苷酸；
c)在适合多核苷酸杂交和扩增的条件下进行第一轮聚合酶介导的多核苷酸扩增，由此来自不同生物源的靶多核苷酸用作合成互补新生多核苷酸链的起始模板，其中所述新生多核苷酸链从固定引物延伸出来；
d)在每一生物源所独特的液相序列标志存在下进行第二轮聚合酶介导的多核苷酸扩增，其中所述液相序列标志用作引物并且来自步骤c)的固定的新生多核苷酸链用作模板以合成新的扩增产物，其中所述新的扩增产物从液相序列标志延伸出来；以及
e)对来自不同生物源的靶多核苷酸的固定扩增产物进行检测和比较。
18、权利要求17的方法，其中所述不同生物源是不同的细胞。
19、权利要求17的方法，其中所述不同生物源是不同的组织。
20、权利要求17的方法，其中所述不同生物源是不同的个体。
21、权利要求17的方法，其中所述不同生物源是不同的物种。
22、权利要求17的方法，其中利用不同标记物检测来自不同生物源的靶多核苷酸的扩增产物。
23、权利要求22的方法，其中所述标记物是荧光分子。
24、权利要求22的方法，其中所述标记物是生物素或洋地黄毒苷。
25、权利要求17的方法，其中所述序列标志是通用引物。
26、权利要求2 5的方法，其中所述通用引物包含SP6启动子、T3启动子或T7启动子。
27、一种用于检测样品中多个靶多核苷酸的试剂盒，包含：
a)固相载体，其包含多个固定且分离的寡核苷酸引物群体，每一引物群体经选择与不同的靶多核苷酸杂交，其中每一引物均适合于与特异性靶多核苷酸进行聚合酶链式反应以扩增该多核苷酸；
b)在固相载体上进行聚合酶介导的扩增反应所需的试剂；以及
c)用于检测载体上的扩增的多核苷酸的检测工具。
28、权利要求27的试剂盒，其中所述检测工具包含可在扩增反应过程中并入扩增的多核苷酸内的标记物。
29、权利要求27的试剂盒，其中所述检测工具包含特异地与第二标记物结合的第一标记物，而该第二标记物可在扩增反应过程中并入扩增的多核苷酸内。
30、一种用于检测和比较来自至少两个不同生物源的多个靶多核苷酸的表达谱的阵列，该阵列包含：
至少两组固定到固相载体的不连续区域上的寡核苷酸引物，每一组寡核苷酸引物都是针对特定的靶多核苷酸而选择的并包含与特定靶多核苷酸的序列互补的引物，其中每一组引物都可以由其在固相载体上的位置来鉴定，而且，其中每一组引物包含可用于检测来自单个生物源的靶多核苷酸的表达谱的引物。
31、权利要求30的阵列，其中所述阵列包含至少大约100至大约100,000组固定的寡核苷酸引物。
32、权利要求31的阵列，其中所述阵列包括至少大约1,000组固定的寡核苷酸引物。
33、权利要求32的阵列，其中所述阵列包括至少大约10,000组固定的寡核苷酸引物。
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