CN1523358A - 一种基于组织因子的凝血酶原时间试剂的制备方法 - Google Patents

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    • G01N2333/7454—Tissue factor (tissue thromboplastin, Factor III)

Abstract

一种基于组织因子的凝血酶原时间试剂的制备方法，包括混合预定量的组织因子(TF)、磷脂和含去污剂的缓冲液以生产一种TF/磷脂混合物。在该混合步骤中，TF的量是根据所测定的TF活性而预先确定的。然后，从TF/磷脂混合物去除去污剂以生成基本上不含有去污剂的TF/磷脂泡囊混合物，其可以作为一种基于组织因子的PT试剂。该方法还包括在磷脂回收率的基础上，使用预先筛选的疏水树脂去除去污剂。

Description

一种基于组织因子的凝血酶 原时间试剂的制备方法
发明背景
1.技术领域
本发明涉及凝血酶原时间(PT)试剂的领域，尤其是指一种PT试剂的制备方法。
2.背景技术
凝血试验的目的有很多，包括确定接受外科手术的病人的出血倾向，以及对接受抗凝血治疗的病人进行监测，防止血液凝集。目前，有许多凝血实验，其中之一为“凝血酶原时间(PT)”试验。PT试验是通过在需要进行PT试验的血样中加入凝血活酶，从而激活外源性凝血途径而进行的。外源性凝血途径的激活导致了凝血酶的产生，所述凝血酶是一种蛋白分解酶，其催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，其中该催化作用是凝血过程所必需的。
凝血活酶也称作组织因子(TF)，是一种膜相关蛋白，与因子VIIa形成复合物。因子VIIa/TF复合物启动凝血过程。一旦形成，所述因子VIIa/TF复合物就会激活一系列在凝血瀑布的外源性和内源性途径中所涉及的特异性酶，最后导致凝血酶和纤维蛋白的形成，血小板的激活，并最终形成血块。相关论述参见Nemerson，Yale的组织因子和止血，血液，71，pp1-8(1998)(Tissue Factorand Hemostasis，“Blood”)。
常规PT实验是在体外以及可控条件下，利用上述一系列酶反应，对病人凝血系统的障碍或缺陷进行诊断，血块形成所用的时间即为凝血酶原时间或PT值。
不同类型的凝血活酶能提高或降低PT试验区分具有不同凝血酶原时间的血样的能力。具有较强区分能力的凝血活酶被称作“高灵敏度酶”，液相凝血活酶试剂的灵敏度用国际灵敏度指数(ISI)来分级。用一种给定的凝血活酶所得到的凝血酶原时间对用标准凝血活酶参考试剂获得的凝血酶原在对数坐标上作图，得到ISI值。其中，所给定的凝血活酶的ISI值为所得到的直线的斜率值乘以所述凝血活酶标准参考试剂的ISI值。灵敏度越高的凝血活酶，其ISI值越低，在1.0左右。灵敏度越低的凝血活酶，其ISI值越高，通常为2.0到3.0。
在PT试验中，ISI值在1.0左右的高灵敏度PT试剂被认为是最有利而且最合适的，因为当ISI值为1.0时，国际标准化比率(INR)的计算比较简单、精确。本领域普通技术人员会认识到用INR可以补偿由于灵敏度不同而导致的凝血活酶的差异。INR的计算见下列方程式(参见Hirsh et al.，Oral Anticoagulants：Mechanism of Action，Clinical Effectiveness，and Optimal Therapeutic Range，Chest2001；119：8S-21S)：
INR＝(病人PT值/平均正常PT值)ISI
其中：
病人PT值＝病人血样的凝血酶原时间；
平均正常PT值(或MNPT)＝至少20个正常(参照)人的血样凝血酶原时间的平均值。
传统的制备PT试剂的方法通常使用自然来源或重组来源的TF，天然或合成的磷脂，钙和缓冲组合物。美国专利US5314695的内容在本文中引用，并作为参考。其公开了PT试剂的一种制备方法。所述试剂包括脂质体，其中天然或重组组织因子与所述脂质体的磷脂双层结合在一起，并插入磷脂双层中。在上述PT试剂的制备方法中，在制备PT试剂中所用TF量完全由质量/体积来确定。
在本文中引用并参考的美国专利US5625036公开了用于PT试验的一种PT试剂以及制备含有组织因子的脂质泡的方法。所述PT试剂包括人的重组组织因子、天然或合成磷脂、一种缓冲组合物和钙离子。该PT试剂中同时还含有稳定剂和盐。
美国专利US5418141及申请号为2002/0110922的美国专利申请中描述了在PT试验装置中使用干的凝血活酶。上述两篇文献均在本文中引用，并作为参考。US5418141描述了在干试剂PT检验中使用重组凝血活酶，其目的在于提高检测的精确度。另外，该专利在干试剂PT检测中，对重组凝血活酶和天然凝血活酶进行了比较，其中天然凝血活酶具有较低的灵敏度，其ISI值也较低。申请号为2002/0110922的美国专利申请描述了一种流体检测装置，在三个测量区域中加入凝血活酶，其中一个区域用于测量血样的PT时间，另外两个区域作为对照区，用所述流体装置对PT时间进行检测，增加了结果的可靠性。除了凝血活酶之外，上述对照区域还含有其它成分，其目的是部分或完全地消除血样中存在的抗凝剂所导致的效应。
总结上述经验，PT试剂的传统制备方法显然不能重复生产出较为灵敏的PT试剂。因而，在这一领域需要有一种可以重复生产具有较好灵敏度的PT试剂的方法。此外，该方法还应当简单、易于接受。
发明概要
本发明提供了一种制备基于组织因子的凝血酶原时间(PT)测定试剂的方法，该方法能够重复生产具有适当灵敏度的基于组织因子的PT试剂。另外，该方法非常简单、并且生产出的基于组织因子的PT试剂在测定中易于接受。
在得到本发明的过程中，我们已经认识到基于组织因子的PT试剂的重复性(组与组之间的差异)以及适宜性(例如，灵敏度)是由制备过程中的许多之前未被认识到的关键因素所决定的。这些关键因素包括：(i)制备过程中所使用的组织因子的特异性活性；(ii)在制备过程中以及在最终的基于组织因子的PT试剂中磷脂的浓度。由于TF的活性和磷脂浓度都是关键因素，因此在制备过程中活性TF(活性单位)与磷脂浓度之间的比率也是值得注意的。因此，本发明方法的实施方案包括对一个或多个关键因素进行控制的步骤。上述控制提供了一种可以重复生产具有适当灵敏度的基于组织因子的PT试剂的制备方法(过程)。
本发明的一个实施方案中所述的基于组织因子的PT试剂的制备方法包括，将预定量的组织因子(TF)、磷脂及含有去污剂的缓冲液混合，从而得到TF/磷脂混合物。在该混合步骤中，TF的量是通过所测得的TF的活性预先确定的。然后，去除TF/磷脂混合物中的去污剂，以得到基本上不含有去污剂的TF/磷脂泡囊(vesicle)混合物。所述不含有去污剂的TF/磷脂泡囊混合物即被用作基于组织因子的PT试剂。
附图的简要说明
参照下文对具体实施方案的详尽说明可以对本发明的特点和优点达到更好的理解。在这些实施方案中采用了本发明的原理。以下是附图说明：
图1、本发明一个实施方案的流程图，描述了生产过程中的步骤顺序；
图2、用来表明磷脂浓度对ISI影响的图形；
图3、用来表明磷脂浓度对MNPT影响的图形。
发明的详细说明
图1是本发明的一个实施例的流程图，其中附图标记100是指基于组织因子的PT试剂的制备过程。该过程100包括将预定量的组织因子(TF)、磷脂及含去污剂的缓冲液混合以获得TF/磷脂混合物，该步骤为图中所示的110。在该步骤中，TF的量是通过测定TF的活性而预先确定的。
在本发明的包括过程100在内的生产过程中，所使用的组织因子可以是任意一种本领域普通技术人员所公知的、适当的组织因子，例如，天然的或人工合成的组织因子。在制备基于组织因子的PT试剂中，使用例如在干燥条件下具有高灵敏度的重组组织因子(rTF)尤其有利。
可以使用任何一种本领域普通技术人员所公知的、适当的TF活性测定方法，和/或特别研究出的、与本发明中的方法结合使用的测定TF活性的方法，以测量预定量的组织因子的TF活性。
与本发明同一天申请的美国未决专利申请(申请号：，公司代理号为NO.MBHB-02-1049，在本文中结合并参照该申请)中描述了一种更加有利并且简单的TF活性测定方法。该申请的发明名称为“组织因子和因子VIIa的测定”。该TF活性测定方法利用荧光团底物测量TF作为因子VIIa的辅助因子的能力。在该测定方法中，在有组织因子存在的情况下，检测因子VIIa分解荧光团底物(例如，美国专利US5399487中公开的荧光团底物6-肽氨基-1-萘磺酰胺，在本文结合并参照该申请)的能力。在该测定中，当因子VIIa结合于TF时，这种能力增加了大约100倍。通过对待测TF试剂与标准TF试剂(例如，可以从世界卫生组织WHO标准获得)进行比较，能够确定待测TF试剂的活性。有关TF活性测定的详细内容参见上述美国专利申请(申请号：，公司代理号为NO.MBHB-02-1049)。
采用美国专利申请(申请号：，公司代理号为NO.MBHB-02-1049)所公开的TF活性测定方法对TF活性进行测定时，我们已经确定，通过加入TF使TF/磷脂混合物中的TF活性在9000-18000单位/升时，在提供重复性好、灵敏的基于组织因子的PT试剂中是非常有利的。在这种情况下，根据WHO的指导，TF活性单位定义为WHO标准凝血活酶的TF活性为1单位/ml。本领域普通技术人员将认识到9000-18000单位/升是针对TF/磷脂混合物而制定的，而不是针对不含去污剂的TF/磷脂泡囊混合物。
在步骤110中所使用的含有去污剂的缓冲液可以是本领域技术人员所公知的任何一种合适的含去污剂的缓冲溶液。例如，所述含有去污剂的缓冲液可以是100mM 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS)缓冲液和/或CHAPS/牛γ球蛋白(BGG)缓冲液。在步骤110中也可以使用任何一种本领域技术人员所公知的适宜的磷脂或磷脂混合物。例如，可以使用包含卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸的混合物。
混合步骤110可以包括，例如，将预定量的TF加入磷脂和含去污剂的缓冲液的混合物中。该混合步骤可以非常容易并成功地将TF与磷脂和含去污剂的缓冲液的混合物混合在一起。在本领域公知的PT试剂的制备方法中，将TF加入上述磷脂和含去污剂的缓冲液的混合物是完全基于质量体积比(例如，参见US5314695)。采用上述传统方法，在PT试剂的制备过程中，TF的质量是已知的，但是所加入的TF的功能质量(即活性)是未知的。
下一步，将TF/磷脂混合物中的去污剂去除，以获得基本上不含有无去污剂的TF/磷脂泡囊混合物，如图1中步骤120所示。本领域普通技术人员将认识到上述不含去污剂的TF/磷脂泡囊混合物可以用作基于组织因子的PT试剂。
可以使用本领域技术人员所公知的、任何一种适当的技术去除去污剂。所述技术包括，如，在TF/磷脂混合物中加入一种疏水性树脂(如XAD-16疏水树脂)，温育TF/磷脂混合物和加入的树脂，直至TF/磷脂混合物中基本上不含有去污剂；然后，从TF/磷脂混合物中去除上述疏水树脂。其余适宜的技术还包括用透析或切向流过滤的方法逐步去除去污剂。
基本上不含有去污剂的TF/磷脂泡囊混合物中可以含有少量的、功能上可忽略的去污剂，此时，该混合物仍被认为是“基本上不含有去污剂”。本领域技术人员可以通过常规试验确定功能上可忽略的去污剂的浓度。例如，在本发明的实施例中，0.2mM或更少的CHAPS可被认为是功能上可忽略的去污剂。
如上所述，本发明的实施例包括将预定量的TF加入磷脂和含去污剂的缓冲液的混合物中。在这些实施例中，磷脂可以与未变性的两性离子去污剂混合，从而产生磷脂和含有去污剂的缓冲液混合物，该混合物中含有磷脂和去污剂的混合胶束。其中，未变性两性离子去污剂可以是3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS)。
本发明的方法中可以采用任意一种适宜的疏水树脂去除去污剂，包括但不局限于XAD-16，该物质可从Sigma Chemicals，St.Louis，Missouri处购得。本领域技术人员将认识到，在本发明的过程中，去除去污剂可以导致磷酯形成单层泡囊，从而TF通过TF的膜结合区域结合于所述单层泡囊上。所产生的基本上不含有去污剂的TF/磷脂泡囊混合物为均匀的、含有TF的单层泡囊的混合物，其中一些TF定位于暴露在单层泡囊表面的活性部分。上述以组织因子为基础的PT试剂作为因子VIIa的辅助因子的效果被认为是取决于泡囊表面上功能性TF分子的数量。基于常规的质量/体积比所加入的TF量仅仅保证了TF的数量，而没有保证TF的功能质量。而通过加入以活性为基础的预定量的TF，可以更加精确地对泡囊表面上功能性TF的量进行控制，而且，实际上可以对成组的以组织因子为基础的PT试剂进行“标准化”。
除功能性TF的量外，人们也认识到，在基于组织因子的PT试剂的制备过程中，所使用的磷脂的量也对制备方法的适宜性和重复性有影响。而且，人们还进一步地认识到，在基本上不含有去污剂的TF/磷脂泡囊混合物中所存在的磷脂量与在去除去污剂的过程中丢失的磷酯量有关。
为了控制所述的基于组织因子的PT试剂中所存在的磷脂的量，在本发明的制备过程中，进行了磷脂浓度的接受性实验。例如，所述制备过程可以采用以下步骤进行：(i)测量基本上不含去污剂的TF/磷脂泡囊混合物中磷脂的总浓度；(ii)在测量的磷脂总浓度的基础上，确定所述基本上无去污剂的TF/磷脂泡囊混合物用作组织因子的可接受性。
磷脂总浓度的测定可以用例如本领域已知的无机磷酸盐的测定方法进行测定，其操作过程简单易行(参见Chen et al.，Microdetermination of Phosphorus，Analytical Chemistry，28(11)，1756-1758(1956))。由于在本发明的制备过程中，磷脂是无机磷酸盐的唯一可能来源，磷酸盐的摩尔浓度正比于试样中的磷脂摩尔浓度。在基本上无去污剂的TF/磷脂泡囊混合物中非常有利的磷脂浓度(以无机磷酸盐测定)范围为2.5-5.0mM。更有利的磷脂浓度为≥3.0至≤5.0mM，特别有利的磷脂浓度是3.8mM。
在本发明方法的另一实施方案中，在去除去污剂的过程中使用的树脂在使用前要进行预筛选。所述预筛选以磷脂的回收率为基础(参见下述实施例1)，可以采用如上所述的无机测定方法。本发明实施例中的预筛选可以有效地控制在去污剂的去除步骤中磷脂的损失，并且保证在基本上无去污剂的TF/磷脂泡囊混合物中含有控制浓度的磷脂。
实施例1：对在制备基于组织因子的PT试剂的过程中使用的疏水层析树脂进行预筛选
下述试验描述了一示范技术。在本发明制备组织因子PT试剂的过程中，以磷脂回收率为基础，通过该技术成功地对多种疏水性树脂进行预筛选。为了对上述疏水树脂进行预筛选，将4.95mM的可溶性磷脂混合物(含有卵磷脂，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，可以从Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama购得)，以及30克Amberlite XAD-16疏水树脂(可以从Sigma ChemicalCompany，St.Louis，MO购得)与100ml的20mM Tris和150mM NaCl(TBS)缓冲液混合，所述缓冲液包括0.8％氨基乙酸、150mM的海藻糖、100mM CHAPS和0.05％叠氮钠，其pH为7.4。
在室温下将磷脂和疏水树脂混合约1小时后，收集混合物的上清液并测定磷脂(用常规的无机磷酸盐测定方法测量无机磷酸盐)，从所述无机磷酸盐的测定结果计算磷脂的回收率。通过表1所示的六组疏水树脂的实验数据看出，其中用第2种树脂制备的以组织因子为基础的PT试剂在最终的交付(release)试验中各组均不成功。根据表1的数据和基于回收百分率的测量准确性，只有那些磷脂回收率在75％-95％之间的疏水树脂才能用于制备以组织因子为基础的PT试剂。
表1：树脂的磷脂回收率
    树脂组   最终无机磷酸盐浓度(mM)     ％回收率
    1     4.6     93
    2     3.3     67
    3     4.4     88
    4     4.4     88
    5     4.1     82
    6     3.9     79
实施例2：制备基于组织因子的PT试剂的过程
从Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)获取冻干的磷脂(1.5g)其摩尔比为67∶16∶10∶7(卵磷脂∶磷脂酰甘油∶磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰丝氨酸)，将其溶于100ml的TBS缓冲液中，该缓冲液含有0.8％的氨基乙酸、150mM的海藻糖、100mM CHAPS和0.05％叠氮化钠。在该实施例的所有步骤中，在30-37℃条件下对试剂溶液进行混合。根据对所述可溶性磷脂所测定的无机磷酸盐浓度，移出2.25mmol的可溶性磷脂用于以下过程。
在含有移出的用于以下过程的2.25mmol磷脂的溶液体积中加入TBS缓冲液，将其体积调整至100ml，所述TBS缓冲液含0.8％的氨基乙酸、150mM的海藻糖、100mM CHAPS和0.05％叠氮化钠。并将50ml牛γ球蛋白溶液(0.1％BGG的TBS溶液，其中含20mM CHAPS、0.8％的氨基乙酸、150mM的海藻糖和0.05％叠氮化钠)加入上述可溶性磷脂的混合物中。接着，将rTF(含10mM CHAPS的TBS溶液)和缓冲液(含0.8％的氨基乙酸、150mM的海藻糖和0.05％叠氮化钠TBS缓冲液)加入所述磷脂混合物中，即可获得500mlTF/磷脂混合物，其中rTF的浓度为13500单位/L。
将rTF/磷脂混合物混合1小时后，加入预先筛选和清洗过的XAD-16疏水树脂150g(如上述实施例所示)。混合3.5小时后，过滤去除疏水树脂并将rTF/磷脂混合物在2-8℃下贮存。通过加入树脂、温育及去除树脂得到基本上不含有去污剂的rTF/磷脂泡囊混合物(即，基于组织因子的PT试剂)。
接着对以组织因子为基础的PT试剂进行测定，以确定磷脂的最后浓度(以无机磷酸盐测定)。将所述以组织因子为基础的PT试剂包被于试验条上，并干燥。用至少100份全血毛细管血样检测试验条，并确定多组以组织因子为基础的PT试剂的ISI和MNPT，所述血样中，至少有20份来自正常病人，而至少80份来自口服抗凝剂的病人。在对数坐标上，将标准仪器上所得到的每组PT试剂的凝血酶原时间与用标准凝血活酶所得到的PT值进行比较并作图，得到ISI值。其中，ISI值为所得到的直线的斜率乘以标准凝血活酶的ISI值。MNPT是指至少20份正常人血样测得的凝血酶原时间的均值。
表2是多组基于组织因子的PT试剂的ISI和MNPT值，在所述试剂的制备方法中所加入的rTF在一个相对较宽的范围内，而且采用了未经预筛选的树脂。ISI和MNPT的可接受范围分别为1.0-1.3和7.0-9.0秒。表2数据显示，TF和磷脂的某些组合导致多组试剂不符合ISI和MNPT的交付标准。例如，用低浓度的TF和磷脂来制备PT试剂，结果得到的ISI值超出了可接受的范围。
表2：用没有经过预筛选的树脂制备基于rTF的PT试剂的ISI和MNPT值
  基于rTF的PT试剂组号 在TF/磷脂混合物中的rTF的浓度(U/L) 无机磷酸盐浓度(mM)   ISI   MNPT(秒) 合格(pass)/不合格(fail)
    1     9250     1.93   1.37   8.88     F
    2     9250     2.56   1.36   9.72     F
    3     9250     2.78   1.27   8.82     P
    4     9218     3.02   1.18   8.17     P
    5     9248     3.80   1.23   8.36     P
    6     9000     5.20   1.10   8.03     P
    7     11500     2.42   1.25   8.62     P
    8     13250     3.00   1.23   7.95     P
    9     13856     3.40   1.08   8.12     P
    10     13500     3.60   1.11   7.66     P
    11     13500     3.90   1.16   7.84     P
    12     17000     1.92   1.32   7.92     F
    13     17244     3.60   1.09   7.39     P
    14     18000     3.80   1.12   7.42     P
表3为根据实施例(如上所述)所制备的多组基于组织因子的PT试剂的ISI和MNPT，其中rTF和磷脂浓度不同。表3的结果显示，用本发明制备的基于组织因子的PT试剂中含有恒定的(可重复)rTF和磷脂，而且其ISI和MNPT值比用常规的方法制备的PT试剂具有更好的重复性和适宜性，表3中的各组均符合ISI和MNPI的标准。
表3：采用本发明的方法所制备的多组基于rTF的PT试剂的ISI和MNPT值
  基于rTF的PT试剂的组号  在TF/磷脂合物中的rTF的浓度(U/L) 无机磷酸盐浓度(mM)   ISI   MNPT(秒)  合格/不合格
    15     9056     2.5   1.18   7.93     P
    16     9056     2.5   1.15   7.80     P
    17     9056     2.5   1.15   8.07     P
    18     13500     3.9   1.11   7.39     P
    19     13500     3.2   1.16   7.42     P
    20     13500     3.9   1.09   7.44     P
    21     13500     3.9   1.11   7.88     P
    22     13500     3.6   1.14   7.59     P
    23     13500     3.6   1.11   7.71     P
    24     13500     3.2   1.19   7.72     P
    25     18000     3.8   1.10   7.48     P
    26     13500     3.2   1.15   7.64     P
    27     13500     3.7   1.14   7.93     P
    28     13500     3.9   1.11   7.58     P
    29     13500     3.4   1.13   7.65     P
基于表3的数据，适宜的rTF活性浓度范围是9000-13500，而适宜的磷脂浓度范围是2.5-3.9mM。本领域技术人员可能感兴趣的、加入的rTF的活性和磷酸盐浓度之间的各种比率，可以由表2和3的数据得出。然而，就重复生产出具有适当灵敏度的基于TF的PT试剂而言，我们相信，采用预定浓度范围内的加入的TF活性和磷脂就已经足够了。
图2和3分别显示了当rTF的浓度一定时，磷脂的浓度(以无机磷酸盐测定)对ISI和MNPT的影响。图2显示，当无机磷酸盐的浓度约为2.5-3.9mM时，ISI值在所要求的1.0-1.3范围内。图3显示，相同的无机磷酸盐浓度范围，其所得的MNPT值也在所要求的7.0-9.0秒范围内。
应当理解在实施本发明时，可以采用本文中所描述的实施例的各种变形。下面的权利要求详细说明了本发明的范围，同样，该权利要求保护范围内的方法及其等同物也落在该范围内。

Claims (16)

1.一种制备基于组织因子的凝血酶原时间(PT)试剂的方法，该方法包括：
混合预定量的组织因子(TF)、磷脂和含去污剂的缓冲液，从而得到TF/磷脂的混合物，其中预定的TF量是以所测量的TF活性为基础的；和
从所述TF/磷脂混合物中去除去污剂，以产生基本上不含有去污剂的TF/磷脂泡囊混合物，从而得到一种基于组织因子的PT试剂。
2.如权利要求1所述方法，所述混合步骤包括向磷脂和含去污剂的缓冲液的混合物中加入预定量的TF。
3.如权利要求1所述方法，所述混合步骤包括加入预定量的重组组织因子(rTF)。
4.如权利要求1所述方法，所述去除步骤是通过一种技术完成的，其包括：向TF/磷脂混合物中加入一种疏水树脂；温育TF/磷脂混合物以及所加入的树脂，直至TF/磷脂混合物中基本上不含有去污剂；从TF/磷脂混合物中去除上述疏水树脂。
5.如权利要求4所述方法，所述去除步骤通过一种技术完成的，其进一步包括在加入之前预先筛选疏水树脂的步骤。
6.如权利要求5所述方法，该预先筛选的步骤包括，基于可溶性磷脂的回收率，对疏水树脂进行预先筛选。
7.如权利要求5所述方法，该预先筛选步骤包括在可溶性磷脂的回收率为75％-95％的基础上，预先筛选疏水树脂。
8.如权利要求1的方法，其进一步包括以下步骤：
测量基本上不含有去污剂的TF/磷脂泡囊混合物中磷脂的总浓度；和
基于所测量的磷脂总浓度，确定基本上不含去污剂的TF/磷脂泡囊混合物作为基于组织因子的PT试剂的可接受性。
9.如权利要求8所述方法，所述测量步骤根据无机磷酸盐的浓度测量磷脂浓度，所述确定步骤包括根据无机磷酸盐的浓度所测量的磷脂总浓度为2.5-5.0mM时，接受其作为基于组织因子的PT试剂。
10.如权利要求1所述方法，其TF活性是通过一种荧光团TF活性检测方法进行测定的。
11.如权利要求10所述方法，该荧光团TF活性检测方法中使用6-肽氨基-1-萘磺酰胺荧光团底物。
12.如权利要求11所述方法，该混合步骤混合了预定量的TF，从而使TF/磷脂混合物中的TF的活性为9000-18000单位/升。
13.一种制备基于重组组织因子的凝血酶原时间(PT)试剂的方法，该方法包括：
通过将预定量的rTF加入磷脂和含去污剂缓冲液的混合物中，将预定量的重组组织因子(rTF)与磷脂和含去污剂的缓冲液相混合，从而生成rTF/磷脂混合物，其中：
预定的rTF量以所测定的rTF活性为基础，所述rTF活性的测量采用一种基于荧光团的rTF测量方法，其中使用了6-肽氨基-1-萘磺酰胺荧光团底物；
向rTF/磷脂混合物中加入一种预先筛选的疏水树脂；
温育rTF/磷脂混合物以及所加入的预先筛选的树脂，直至rTF/磷脂混合物中基本上不含有去污剂；
从rTF/磷脂混合物中去除上述疏水树脂，从而获得一种基本上不含有去污剂的rTF/磷脂泡囊混合物；
测量基本上不含有去污剂的rTF/磷脂囊泡混合物的磷脂总浓度；和
在所测量的磷脂总浓度的基础上，确定所述基本上不含有去污剂的rTF/磷脂混合物作为基于重组组织因子的PT试剂的可接受性。
14.如权利要求13所述方法，所述混合步骤中混合了预定量的rTF，使得所述rTF/磷脂混合物中rTF的活性为9000-18000单位/升。
15.如权利要求13所述方法，所述预先筛选步骤包括在可溶性磷脂回收率的基础上预先筛选疏水树脂。
16.如权利要求14所述方法，所述预先筛选步骤包括在可溶性磷脂的回收率为75％-95％基础上预先筛选疏水树脂。
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