CN1527943A - 过敏原微阵列分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测样品中与过敏原结合的免疫球蛋白的方法，其中将一种或多种过敏原固定于微阵列芯片上，其后将样品与所述经固定的过敏原进行孵育，由此使得对所述过敏原具有特异性的免疫球蛋白与所述特异性过敏原相结合，其后对与所述经固定的特异性过敏原相结合的免疫球蛋白进行检测，本发明还提供了一种用于在体外诊断病人的过敏症的方法。

Description

过敏原微阵列分析
本发明涉及一种用于检测样品中的与过敏原相结合的免疫球蛋白的方法以及一种用于在体外诊断过敏症(allergy)患者的方法。
过敏症是由机体的免疫系统针对一种物质产生的反应，该物质通常被认为是无害的。正是这种反应导致了被称为过敏反应的一类症状。因此，过敏症的产生并非是由于免疫系统的衰竭，而是免疫系统的过度激活。过敏症患者对一种过敏原的反应可以产生很宽泛的症状。例如，一些人的症状可以表现为哮喘、湿疹、皮疹、眼部发痒、鼻窦炎、鼻塞或流涕，以及枯草热，但是也会出现更为严重的症状。而由诸如蛇毒、坚果和贝类所引起的过敏则有可能导致一种称之为“过敏性休克”的危急情况发生。这是由于当机体产生的反应如此强烈以至于引起喉头水肿、血压下降和呼吸困难。某些情况下，此类反应是致命的。
在发达国家(即欧洲、北美和日本)，过敏症的发病率越来越高，估计有20-50％的人口受到影响。现在已经知道，过敏症是免疫系统的T细胞成分的失衡所导致的结果。更确切地讲，过敏症患者的T辅助细胞2型(Th2)相对于T辅助细胞1型(Th1)而言活性是增高的，这引起IgE的产生增加。
IgE(免疫球蛋白E)至少是引起过敏反应的物质之一。正常情况下，在血液中检测不到对一种过敏原具有特异性的IgE，其仅在人体被一种物质致敏后产生。引起过敏反应的物质(称为过敏原)可诱导产生一种特异性的IgE，其只与该物质发生反应。IgE与过敏原之间的反应就像是锁和钥匙，IgE与过敏原结合后会引起细胞释放化学物质(例如组织胺)，后者可引起过敏症状。人可能会对不只一种的物质产生特异性IgE，因此可以对不只一种的物质发生过敏反应。IgE的检测结果以梯度表示，以示出血液中所检测的特异于该物质的IgE的量。梯度越高，病人越可能出现过敏情况。在过去的几十年中，诊断过敏性疾病仅使用得自主要过敏原来源的几乎未经纯化的提取物。显然，这些粗提纯的混合物的组分复杂而不稳定。结果造成这些提取物的诊断效力时常变化并导致产生假阴性结果。后者主要是由提取物中的过敏原不稳定引起。使用提取物来诊断过敏的另一个缺点在于目前的产品在免疫原组合物方面缺乏标准化。市场上各个公司产品的效力单位以及计算方法均各不相同。其结果是各个公司的诊断产品之间缺乏可比性。
过去的几十年间已经鉴定出了最重要的疾病相关的成分——主要过敏原，但尚未将其量化用作过敏原提取物的标准化基础。针对大多数主要过敏原的单克隆抗体已经出现。
根据已知方法对过敏症进行检测并非是一个简单的过程，假如采集病史以鉴定哪一种检测方法是最为合适的，那么这些方法将十分有用。但是，目前仅有很少几种能够鉴定过敏症的医学检查方法，并且此类检查方法通常仅限于在临床实验室和专科中心使用。同时，尽管执业人员或过敏症的专科医生可相对容易地做出遗传性过敏症或过敏症的诊断，但通常仍然需要进一步检查来加以证实。
各种类型的过敏症检查方法有：
1.皮肤针刺试验
将疑似过敏原注射到紧邻皮肤表面的下方，其反应由具有资格的护士或医生进行观察。如果反应呈阳性，会出现局部皮肤发红，反应越强，则该发红的区域越大。皮肤试验具有很高的敏感性，尽管该方法并不能对所有类型的过敏症进行判定。
2.皮肤接触试验
皮肤接触试验可用于诊断接触性皮炎。所检测的物质通常用贴片覆盖在皮肤上，并在原位保留48小时。阳性反应者会出现一小片湿疹，同样，其反应由具有资格的护士或医生进行观察。
3.其他的过敏症检测方法
其他类型的过敏症检测方法还有很多，但均不够精确或未被医学界所认可，这些检测方法通常既不准确又十分昂贵。
4.Vega试验
Vege试验是属于生物能调节技术(bioenergetic regulatorytechnique)的电检测方法(electrical test)。该仪器通过惠斯通电路(Wheatstone circuit)来测定电导。检测时将电极连接于针刺部位或由病人手持电极，然后将各种溶液放入一个金属槽内。然后将一个装有毒物的玻璃小瓶置于槽内对仪器进行校对，小瓶引起导电性下降，再将其他物质置于槽内，如果其能产生相近的读数，即可视为过敏反应或“敏感(sensitive)”反应。该技术被广泛应用于健康食品店，但其价值并未得到认可，也没有有效的试验对其加以证实。
5.白细胞毒性试验
白细胞毒性试验包括将病人的白细胞与特定食物的提取物相混合，然后通过不同途径观察细胞的一些改变形式来进行测定。因其具有很高的假阳性和假阴性反应率，美国变态反应疾病协会(AmericanAcademy of Allergy)认为没有证据显示其对食物和吸入性过敏症的诊断有帮助。
6.毛发分析
另一种检测方法是毛发分析。毛发分析可发现体内是否存在有毒金属例如铅、汞以及镉，或是否缺乏硒、锌、锰和镁。司法界关于重金属中毒有很多记载，其中毛发分析可用于证实是否存在有毒金属接触。但是，毛发分析这种类似于“探询水源(dowsing)”的方法作为诊断过敏症的手段，还从未被证明是有效的。
7.应用性运动机能学(Applied kinesiology)
将食物样品放置于病人的舌下或放入玻璃容器内由病人手持，然后请病人用不持容器的手臂用力推检测者的手臂，过敏反应被检测到的表现为病人的肌肉反应性下降以及手臂上举困难。但该项检测技术经双盲试验证实是无效的。
此外，尚有各种通过检测来自病人的血液样品中存在的IgE或IgG抗体来诊断过敏症的体外检测方法：
8.传统的方法如ELISA或蛋白印迹借助于(重组)免疫原来检测病人血清中存在的抗体(IgE)。
9.放射免疫吸附试验(Radioallergosorbent test(RAST))：
其过程为将特异性免疫原偶联于纸盘上；如果待检测的(病人)血清中存在免疫特异性的IgE，其将结合于盘上；然后通过放射性标记的抗IgE实施检测。各种不同的评分体系均将所得检测结果与阴性对照的绝对结合进行比较。通常而言，改良的RAST方法采用孵育过夜以获得更高的敏感性。
10.基于RAST的定量IgE抑制实验，其中将过敏原提取物点到硝酸纤维素条上，将测定量的血清与特异性重组过敏原的混合物进行预孵育，然后再将此混合物置于所述硝酸纤维素条上进行孵育，通过抗人IgE抗体对结合的IgE进行检测，最后计算经重组过敏原预吸附后的、IgE与天然提取物的结合抑制百分数。
11.细胞抗原刺激试验(CAST)，其中将病人的嗜碱性细胞用白细胞介素-3(IL-3)和过敏原进行刺激，继而用ELISA测定新产生并释放的硫化白三烯(sulfidoleukotriene(SLT))。
12.UniCAP：将重组过敏原固定于固相支持物上，然后检测存在于病人血清中的抗体与所述过敏原的结合。
但是，使用这些方法对大量(如100种)过敏原进行检测需要重复大量的实验步骤。此外，上述这些检测方法并未显示出足够的敏感性和可靠性，并且十分费时。同时进行此类检测需要大量的样品量(如病人的血清)以及大量的纯化的、很可能是昂贵的重组过敏原。
美国专利4,444,879涉及用于测定总免疫球蛋白和IgE的免疫分析的方法和装置。其将提取的过敏原固定于包被了聚合物的微滴定板的孔内，然后将待测样品加入到孔内，进行传统的免疫分析。
欧洲专利0,556,745A1描述了一种用于检测体液中的抗小麦蛋白IgE抗体的方法，其中小麦免疫原提取物被固定于固相支持物的表面，所述固相支持物例如为层析和毛细材料或纤维、玻璃、尼龙、纤维素或它们的衍生物，其形式可以为玻璃珠、微颗粒、膜或是微滴定板的孔。同样用传统的免疫分析方法来检测来自病人的样品。
美国专利3,720,760涉及用于分析体液内的免疫球蛋白的方法。其同样将购得的含有免疫原的提取物结合到不溶于水的聚合物上，然后进行传统的免疫分析。
美国专利4,849,337涉及通过将血清中的IgE结合到吸附于不溶性支持物上的免疫原而鉴定病人血清中的免疫原特异性IgE水平的方法。同样，免疫原可以是直接来自于花粉、灰尘、动物等的提取物或免疫原。
但是，这些传统的免疫分析方法对于检测病人的过敏症并不很有效，因为各种过敏症的数量已经超过数百种，并且仍在稳定增加。对于每天要对数百个病人的样品进行检测的实验室而言，若对病人的样品进行分析以便认定所有可能存在的以及罕见的过敏症，其所需花费的时间和工作量十分巨大，因此无法进行。
因此，本发明的目的是提供一种用于检测可结合于样品中的过敏原的免疫球蛋白的方法，所述方法能克服上述缺点，操作时间短，仅需要少量的样品和过敏原，并且具有高度的可靠性和敏感性，最重要的是，其可以在一次检测中对几乎是无数种的过敏原进行检测。
本发明的另一个目的是提供一种能够克服上述缺点的、用于在体外对病人的过敏症进行诊断的方法。
上述方法的特征在于将一种或多种过敏原固定于微阵列芯片上，其后将样品与所述固定的过敏原进行孵育，使得具有过敏原特异性的免疫球蛋白能够与所述特异性过敏原相结合，并由此对结合了所述的特异性的、固定的过敏原的免疫球蛋白进行检测。
微阵列芯片已经在一系列的科学领域内沿用已久DNA操作技术中得到应用。此类DNA芯片已经有多种不同的形式，并将最终改变现有的普通实验室工作中的实验设计方式。由于这一新型的体外DNA技术能够以“高通量的方式(high-throughput format)”进行复杂的检测分析，因此使得体外DNA诊断变得更加省时、省力。在“蛋白质组(proteome)”研究领域中，一些经典的固相底物，例如微滴定板、滤膜以及显微镜玻片等，也随之在转变为高密度的微阵列形式。这一新型的、多用途的蛋白分析技术最终使得对基因表达和分子相互作用的高通量的筛选成为可能(Walter等，Curr Opin Microbiol 2000Jun；3(3)：298-302；Emili和Cagney，Nat Biotechnol 2000Apr；18(4)393-7)。最近，蛋白微阵列的构想已经开始应用于免疫分析中。
生物芯片被认为能够支持高通量(HT)的多元酶联免疫吸附试验(ELISA)。这些生物芯片可由例如96孔光学平面玻璃板组成，其孔内涂有疏水性Teflon涂层；但是，其他材料和形式的生物芯片已知也有应用。试验证明，对排列于玻璃底物上的抗原进行特异性的多元检测是可行的。这一新型的高通量筛选(HTS)方式的其他应用还包括直接细胞蛋白表达分析法、感染原的多元检测方法以及对肿瘤的诊断(Mendoza LG等，Biotechniques 1999 Oct；27(4)：778-80)。
但是，在此类已知的微阵列芯片蛋白分析方法中，是将抗体固定于微阵列芯片上。令人惊异的是，不仅抗体可被结合于微阵列芯片，甚至作为相应于此类特异性抗体的抗原，特别是IgE和IgG的抗原的过敏原也可被结合于微阵列芯片。其尤其令人惊异的是，功能性过敏原在以高密度结合于例如微阵列芯片的固相支持物时，其可呈现出一种特别的被修饰的二级结构。过敏原的结构的这种修饰可能会影响抗体与过敏原的结合，由此可能会导致出现假阴性的结果。抗体、抗体或肽的片段相对较小且具有高稳定性，因此抗体在溶液中相对于其同源抗原而言具有更高的稳定性。但当固定于固相支持物上时，既便是抗体也仅有一小部分能保持完好和活性。
2000年11月9日被接受的Haab等的文章(Genom Biology 2000，I(6)：pre-print 0001，1-0001，22)涉及检测和定量溶液中的蛋白和抗体的蛋白微阵列。根据该文献进行分析的结果显示，仅有50％的阵列中的抗原以及20％的阵列中的抗体对同源过敏原做出了特异和精确的测定结果。
此外，就蛋白处理而言，特别是对于一系列在结构上不同的过敏原进行固定和染色，过敏原的差异当然较抗体的差异性高得多。但是，令人惊异的发现，在用于检测样品中的免疫球蛋白方面，固定于微阵列芯片的过敏原具有很高的可靠性和敏感性。
这一方法可以在一个实验步骤中对多种可与一种特异性过敏原相结合的免疫球蛋白进行分析，而该分析还可更为微细化(atomised)：即对超过100种的不同的过敏原进行检测而无需进行如传统的微滴定方法中所需的大量的实验步骤。此外，该方法具有高度的敏感性和可靠性。同时，该方法可在短时间内得到检测结果，如大约3个小时，相对于传统的RAST或ELISA检测缩短了检测时间。
不仅如此，在用含有来自不同病人的样品的芯片进行重复实验时，如通过在微滴定板样涂层的每个孔中包含一定数量的不同过敏原的点，再将一个病人的样品加入到每个孔中，微阵列分析具有高度的可重复性。本发明的方法的另一个优势在于，大量的不同的探针仅占据了一个相对较小的区域，因此其密度很高。很小的微阵列的表面区域使得结合条件(温度调节、盐浓度等)达到很高的均一性，而极大的探针数量使得杂交得以大量地平行进行。由于此高密度的微阵列含有如此大量的探针数量，其有可能提供大量的对照，包括例如一种特异的过敏原的变异或突变对照、总体杂交条件对照、样品制备条件对照、以及针对非特异性结合或交叉杂交的错配对照(mismatchcontrol)。
另外，与传统检测体系相比，此分析方法仅需要最低量的材料(过敏原以及样品)。这意味着使用微阵列方法时，使用等量的原材料可以制造出更多的检测试剂盒，而使用较小量的样品便能对更大量的可结合于过敏原的免疫球蛋白进行检测。同样，在小体系中结合能够很快地进行。
天然的完整“免疫球蛋白”或抗体包含一种通常为Y形的四聚体分子，其在每一“上臂”的末端具有抗原结合部位。抗原结合部位由一条重链的可变区与一条轻链的可变区共同组成。更精确地说，抗体的抗原结合部位本质上是由一条重链的可变区(V.sub.H)的3个CDR(互补决定簇)和一条轻链的可变区(V.sub.L)的3个CDR形成的。
通常，术语“抗原”指的是一种能够引发免疫应答的物质，一般而言，使用该物质可通过现有的、用于证实抗原抗体相互作用的多种体外和体内的免疫学方法之一来检测相应的抗体。
类似地，术语“过敏原”是指能够诱导并结合特异性抗体(如IgE)的抗原，该抗体引起一般意义上的过敏症；但后者的定义并不排除过敏原也诱导反应性抗体的可能性，其可以包括IgE以外的其他类型的免疫球蛋白。
文中的蛋白或肽的“固定”是指蛋白/肽以传统方式结合于固相支持物，在固相支持物与过敏原之间可有或没有间隔物。将蛋白/肽固定于支持物为本领域所熟知；在本发明的范围内，任何的固定包含以例如共价、非共价特别是通过疏水作用，分别与例如膜和合成表面等的相互作用。
“微阵列”是要素(feature)(如“点”)的一种排列方式，其非连续性要素的密度为至少大约16/cm2、优选地为至少大约64/cm2、更优选地为大约96/cm2、最优选地为至少大约1000/cm2。微阵列上的要素具有典型的尺度(typical dimension)，例如直径的范围在大约10-2000微米之间，优选地在大约50-500微米之间，更优选地在大约150-250微米之间，并在微阵列上以与此相同的距离与其他要素相隔离。因此，可用于进行常规性大规模筛选的本发明的微阵列可以具有至少500个、优选地具有至少1000个不同的、包含过敏原、标准和对照的点。
本发明的“芯片”实际上可以具有任何形状，例如玻片、微滴定板的孔、甚至是众多的表面，尽管优选地为平坦的阵列表面。
检测步骤可通过本领域人员已知的传统方法进行，例如物理性、酶性、化学性反应等。
根据本发明的一个优选实施方案，IgE可作为免疫球蛋白来检测。已知IgE是一种引起过敏反应的物质，其仅由对一种物质(即过敏原)过敏的人产生。因此，若要检测一个样品是否是来自于对特定过敏原过敏的病人，可对该样品的IgE作为免疫球蛋白来检测。样品中的IgE的量越高，该病人越有可能对该特异性过敏原过敏。
优选地可将IgG作为免疫球蛋白进行检测。已知IgG可出现于对食物过敏的病人的样品中，因此对IgG的检测可用于食物过敏的指标。
可将一种或多种天然的过敏原固定于微阵列芯片上。这些单一过敏原例如可纯化自过敏原提取物，例如来自特定的食物或植物。可同时对一种或多种特定类型的过敏原进行分析。
纯化的方法大体上为本领域人员所熟知，例如层析纯化、大量分离纯化、通过过敏原与固相的特异性结合(例如通过抗体)进行纯化等，但将高度纯化的过敏原应用于过敏症检测方法的大量生产尚未被提出过。
“纯化的”过敏原与提取物不同，其涉及的是单一的过敏原，例如天然的、重组的或合成的过敏原。这些固定于固相支持物上的纯化的过敏原与过敏原提取物相比具有很多优点：由于所有的提取物均为多种蛋白的混合物，其中待检测的过敏原浓度较纯化的单一过敏原制剂要低得多。因此，纯化的单一过敏原能以很高的浓度被固定于微阵列上。由于包含纯化的过敏原的制剂中的分子是被限定的，因此只有经限定的过敏原才有可能被固定于微阵列上。所以，微阵列以及借助于纯化的过敏原来检测抗体的方法可以做到标准化和精确定量对照分析。
此外，由于组合物中存在高浓度的纯化的过敏原，过敏原能以较高的密度固定于微阵列上，因此使得借助于此微阵列的任何检测方法与使用包含过敏原的提取物的微阵列相比具有更高的敏感性。纯化的单一过敏原相对于过敏原提取物的另一个优势在于，经固定的纯化的过敏原是精确限定的。与纯化的过敏原不同，过敏原提取物包含例如两种、三种和更多的不同的微生物或对象过敏原。例如就苹果而言，提取物可包含各种苹果过敏原的混合物，而本发明的组合物则包含一种纯化的苹果过敏原或，视用途而定，一种经限定的两种或多种苹果或其他过敏原的混合物。
纯化的过敏原相对于非纯化的过敏原(如混合物)的另一个优势在于，由于提取物中存在其他的杂质，提取物经过一段时间后会变得不稳定，例如会发霉。而这将会影响对过敏症的检测，因为在这种情况下，对霉菌的过敏可以引起假阳性的结果。
此外，由于提取物中存在蛋白酶，提取物是不稳定的，而纯化的过敏原则不会如此。
同样的，由于目前存在借助于纯化的过敏原的治疗方法，因此经同一过敏原成分确定的诊断相对于经非纯化的过敏原确定的诊断而言具有很大的优点。当使用纯化的过敏原对治疗效果进行跟踪以及判断病人对特异性治疗的反应时，前一种诊断具有特别的优势，并能由此为病人提供所谓“量体裁衣的(patient tailored)”的治疗。
鉴于上述原因，通过将一种或多种纯化的过敏原固定于微阵列芯片上，并由此对样品中的可结合该过敏原的免疫球蛋白进行检测的方法具有特别的优势。
优选地，可将一种或多种重组的过敏原固定于微阵列芯片上。在过去的数年间，已经生产出大量的重组的过敏原。重组过敏原的生产大体上也为本领域所知，但对常规的过敏原检测方法几乎未产生影响。应用重组的过敏原，可以提供大量的一种或多种特异性过敏原。此外还可以对重组过敏原进行特异性的修饰，以产生用于检测特定的免疫球蛋白的变异过敏原。不仅如此，就检测的稳定性以及诊断的标准化而言，大量使用重组蛋白作为过敏原提供了一种可替代基于提取物的检测方法的另一种方法。重组的(或合成的)过敏原就其生产方式而言也更利于进行标准化。此外，重组的(或合成的)过敏原较天然来源的过敏原在不同的生产批次之间的差别更小。本发明令人惊异地显示，这些重组的过敏原在本发明的常规体外诊断检测中的用途等同于或优于传统的基于提取物的检测体系。与现有的常规系列检测不同，使用重组过敏原的本过敏原检测方法，在标准化、可控制性、可重复性等方面，为标准的过敏原检测带来了一种全新的质量保证。
重组过敏原的实例见下述出版物中所述：Chapman等，Allergy，52：374-379(1997)、Laffer等，J Allergy Clin Immunol Vol 98 Number2 652-658(1996)、Mller等，Clinical和Experimental Allergy Vol 27 9.915-920(1997)、Niederberger等，J Allergy Clin Immunol Vol 102Number 4，Part 1 579-591(1998)、Menz等，Clinical and ExperimentalAllergy Vol 26，50-60(1996)，这些已作为参考并入本文。其他(重组)过敏原例如但不限于rBetv1、rBetv2、rBetv4、rJunO2、Cass1、rPhlp1、rPhlp2、rPhlp4、rPhlp5a、rPhlp6、rPhlp7、rPhlp11、rPhlp12、rParj2、Artv1a、Mugwort profilin、Apig1、Apig1.0201、Dauc1.2、rArah2、rArah5、Mald1、Mald2、rPena1、recCarp、rDerp1、rDerp2.0101、rDerp2、rDerp2b、rDerp5、rDerp5a、rDerp7、rDerp8、rDerp10、rTyrp2、rLepd2.01、rLepd13、rEurm2.0101、rFeld1、rFeld1a、rBosd2、来自猫的代表性过敏原、来自狗的代表性过敏原、来自BSA的代表性过敏原、来自小鼠的代表性过敏原、来自大鼠的代表性过敏原、来自猪的代表性过敏原、来自绵羊的代表性过敏原、来自鸡的代表性过敏原、来自兔的代表性过敏原、来自仓鼠的代表性过敏原、来自马的代表性过敏原、来自鸽子的代表性过敏原、来自Guineaalbumin的代表性过敏原、HSA、a-NAC、rPenc3、Penn13、rPenc19a、rPenc19b、rAspf1、rAspf1a、rAspf3、rAspf3a、rAspf4、rAspf4a、rAspf6、rAspf6a、rAspf7、rAspf8、rAlta1、rAlta2、rMalf1、rMalf5、rMalf6、rMalf7、rMalf8、rMalf9、rHevb1、rHevb1a、rHevb3、rHevb8、rHevb9、rHevb10、rHevb11、rAK、rBlag2、rBlag4、rBlag5、磷脂酶A、透明质酸酶、rVesv5、rVesg5。
在另一个有利的实施方案中，将一种或多种合成的过敏原固定于微阵列芯片上。前面提及的重组过敏原对于过敏原提取物以及纯化的天然过敏原所具有的优势在此同样存在。用于合成肽或蛋白的方法是现有技术领域熟知的；通过合成过敏原，可以低成本提供大量的高度纯化的过敏原，这是由于此类生产方法是高度自动化的。此外还可提供经过修饰或未经修饰的任何过敏原的精确序列，由此增加本方法对免疫球蛋白的检测的敏感性和可靠性。
其还可以在本发明的检测方法中仅使用特定过敏原的过敏原性决定簇或过敏原性结构域。这可以避免在大分子量蛋白质操作中的危险和缺点，因为在常规的生物芯片的生产中，较短的肽结构较易于操作。这一点适用于所有纯化的天然过敏原、重组过敏原以及合成过敏原。其进一步可对单个的肽表位进行检测，特别是就特异性而言，这将使诊断试验和治疗更加优化。
在同一芯片中同时提供天然形式的过敏原和合成或重组形式的过敏原具有特别的优势。而优选地是主要应用重组的或合成的过敏原。天然形式的过敏原至少可以为芯片提供对照或附加的质量信息。因此本发明的一种优选的芯片包含至少一种过敏原的一种天然形式和一种合成或重组形式。这同样可改善不同批次的过敏原的质量对照和标准化。
优选地，将一种或多种半抗原作为过敏原固定于微阵列芯片上。“半抗原”是一种低分子量(典型地为低于7000 Dalton)的物质，在施用于动物体内、包括人体内后，通常其自身不能引起显著的抗体产生。这是由于半抗原太小而不能被机体的免疫系统所识别。但当半抗原偶联于一种较大的载体分子后，半抗原便可获得抗原性。换言之，半抗原与载体分子的结合(形成分析物-载体分子复合物(analyte-carrier molecule combination))使得所结合的半抗原能够被动物的免疫系统所识别。在半抗原(偶联了载体分子)与相应的抗体之间可发生免疫沉淀反应。通过使用固定于微阵列芯片的半抗原，可在芯片上达到更高的密度。
当然，上述不同形式的过敏原可以组合使用，例如同时使用重组的和(纯化的)天然过敏原。通过将这些不同的形式进行组合，可以对它们进行比较，并可对例如重组过敏原进行对照，还可为各种批次的天然过敏原作为对照，后者因生物来源、制备方法、纯度等方面的不同而存在差异。
对于高效的检测方法，所使用的过敏原优选地具有最佳的特征，例如高结合力。但是对于低结合效率的过敏原变体的检测，则优选地使用活性较低或不同的抗原，如在脱敏治疗(hyposensitizationtherapy)中的用途。
在本发明的一个优选的实施方案中，过敏原被固定于微阵列芯片上直径为10-2000微米、优选地直径为50-500微米、更优选地直径为150-250微米的点上。由于这些点的直径很小，因此可以在微阵列芯片的分离的点上固定大量的不同中种类的过敏原以及各种浓度的特异性过敏原，从而可以提供能够在一个自动化步骤中对大量的过敏原或大量的过敏原浓度进行分析的一种微阵列芯片。
优选地过敏原被固定于固相支持物，优选地可以分别是玻璃载体、合成载体、硅晶片以及膜。这些芯片可根据例如下列所述的方法生产：Ge，H.(2000)，Nucleic Acids Research，28，e3(i-vii)；Qian W.等，(2000)，Clinical Chemistry，46(1456-1463)；MacBeath G.等，(2000)，Science，289，(1760-1763)，这些出版物所公开的内容在此作为参考。这些材料各自的特征和优点为本领域人员所熟知。因此，用于微阵列芯片的材料将根据所要检测的过敏原、用于检测结合形式的免疫球蛋白的方法、所用的缓冲液等进行选择。此外，经济问题也是选择材料的一个因素。
优选地微阵列芯片是经过化学修饰的，优选地分别为氨基反应修饰和羧基反应修饰。这样可以精确地确定过敏原结合于微阵列芯片的方式。
优选地过敏原共价结合于微阵列芯片。这样可提供稳定结合于微阵列芯片的过敏原，由此提供了一种特别可靠的方法。
在本发明的另一个优选的实施方案中，对作为样品的血清中的免疫球蛋白进行检测。对过敏原过敏的病人，免疫球蛋白主要出现于血清中，因此对血清进行分析是检测免疫球蛋白的一种可靠方法。此外，病人的血清易于通过简单的途径采集，样品的采集甚至可以在病人的家中进行。
优选地，血清以1∶1-1∶15稀释，优选为1∶5。可用任何适当的溶液对其进行稀释，例如1xTBST(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，0.5％TWEEN 20)。
优选地将样品与过敏原孵育1分钟到24小时，优选地为1-2小时。当然，也可以将样品与过敏原孵育数日。但这并不能信号强度或特异性。通常而言，孵育1小时足以获得可靠而敏感的结果。
此外，样品与过敏原优选地在0-60℃之间孵育，优选为37℃。较低的孵育温度不能增加信号，反而可能增加非特异性结合及本底。在37℃孵育对检测人的过敏原而言可得到准确可靠的结果。
优选地，通过至少一种标记的抗免疫球蛋白抗体对结合的免疫球蛋白进行检测。在此使用的术语“抗体”指的是完整的分子以及其片段，例如Fa、F(ab).sub.2、和Fv，其均可结合表位决定簇。制备抗体可使用含有作为免疫原的所需小肽的完整的多肽和片段。用于免疫动物的多肽或肽可由RNA的翻译获得，也可化学合成，如果需要，可以连接上载体蛋白。通常用于与肽进行化学偶联的载体包括牛血清白蛋白和甲状腺球蛋白。然后用偶联的肽来免疫动物(例如小鼠、大鼠或兔)。
在本发明的范围内，术语抗体指单克隆或多克隆抗体，其中单克隆抗体可由任何在培养的连续细胞系中产生抗体分子的技术进行制备。这包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术以及IBV杂交瘤技术。此外尚有嵌合抗体、单链抗体以及合成抗体。
抗体可用任何已知方法进行标记，从而可对结合的抗体进行定性，并优选地进行定量。适合用于本发明的可检测的标记物包括任何可由分光光度计、光化学方法、生化方法、免疫化学方法、电学方法、光学方法或化学方法检测的组合物。有用的标记物包括以标记的抗生物素缀合物进行染色的生物素、磁珠、荧光染料(如荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等等)、放射性标记(如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及其他在ELISA中常用的酶)、以及比色标记物如胶体金或彩色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯乳胶等)珠。
本领域已知检测此类标记物的方法。因此，例如放射性标记物可通过显影胶片或闪烁计数器进行检测，荧光标记物可通过检测发射光的光检测器来检测。酶标记物可典型地可通过将底物提供给酶然后检测酶与底物的反应产物来检测，而比色标记物可通过简单地观察有色标记物来检测。
优选地，结合的免疫球蛋白通过至少一种分别用荧光和放射性标记的抗免疫球蛋白抗体来检测。这些用于定性和定量分析结合的抗体的经典方法十分特异可靠。
其他优选的用于微阵列的检测体系例如见下列所述：Schult K.等，(1999)，Anal Chem，71(5430-5435)；Vo-Dinh T.等，(1999)，AnalChem，71(358-363)；Brignac SJJr.等，(1999)，IEEE Eng Med Biol Mag，18(120-122)；Otamiri M.等，(1999)，Int J Biol Macromol，26(263-268)；Wright，GL Jr.(2000)，Prostate Cancer and Prostatic Diseases，2(264-276)；Nelson RW等，(2000)，Electrophoresis 21(1155-1163)；RichRL.等，(2000)，Curr Opin Biotechnol 11(54-61)；Chen JJ.等，(1998)，Genomics，51(313-324)，其出版物在此并入作为参考。
优选地，将一种或多种室内过敏原作为过敏原进行固定。这些可以是但不限于螨(Mites)、Tyr.put、Lep.dest.或Lep.mayrei、Felis、Bos、Albumine、Pen.cit.、Pen.not.、Asp.fumigatus、Alt.alt.、Malasseziafurfur、胶乳(Latex)、Plodia、Blatella。
在本发明的一个更加优选的实施方案中，将一种或多种户外过敏原作为过敏原进行固定。这些可以是但不限于Betula、Juniperus、Phleum、Parietaria judicea。
进一步地，将一种或多种食物过敏原作为过敏原进行固定。例如sellerie、karott、花生、苹果、虾、鱼。
进一步地，将一种或多种毒物过敏原作为过敏原进行固定。这些可以是但不限于蜜蜂或黄蜂。
同样地，将一种或多种自体过敏原作为过敏原进行固定。这些自体过敏原可以是例如肝细胞膜抗原、ssDNA抗原、骨骼肌细胞内或表面抗原等。
本发明的另一方面涉及在体外诊断病人的过敏症的方法，其中包括采集病人的血清样品，然后按照上述的本发明的方法分析样品中的可结合于过敏原的免疫球蛋白，在该方法中将至少10种、优选至少50种、更加优选至少90种不同的过敏原固定于微阵列芯片上，然后将样品与固定的过敏原之间出现阳性反应者诊断为过敏症。与已知诊断过敏症的方法相比，上述定义的用于体外诊断过敏症的本方法具有优势。本发明的方法的优势在于，由于所有待测的过敏原均被固定于一个微阵列芯片上，因此仅用一份样品便可同时对大量的过敏症进行诊断。每一步均在同一个芯片上进行，而此芯片还包含未固定过敏原的点，因此同时可进行阴性检测。待测过敏原的数量并无限定，当然还可以使用两个或更多的微阵列芯片。
本发明的另一方面涉及其上固定了一种或多种过敏原的微阵列芯片。上述的定义和优势也同样应用于本方面。
优选地，过敏原被固定于直径为100-500微米、优选直径为200-300微米的点上。
优选地微阵列芯片分别为玻璃载体、合成载体、硅晶片以及膜。
优选地，微阵列芯片是经过化学修饰的，优选地分别经过氨基反应和羧基反应修饰。
优选地，过敏原共价结合于微阵列芯片上。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包含上述的本发明的微阵列芯片和一种第一试剂以及可能的一种第二试剂，所述第一试剂包含至少一种免疫球蛋白检测试剂，优选地为抗免疫球蛋白抗体，优选地为已知浓度，所述第二试剂作为阳性样品包含至少一种可结合于过敏原的免疫球蛋白。所述第一试剂包含至少一种免疫球蛋白检测试剂，优选地为可用于检测结合的免疫球蛋白的抗免疫球蛋白抗体，其中的抗免疫球蛋白抗体优选地按上述进行标记。优选地第一试剂的抗体是已知浓度的，由此可提供具有可重复性的结果。此外，此试剂盒优选地包含一种第二试剂作为阳性样品，其包含至少一种可结合于过敏原的免疫球蛋白。同样地，第二试剂中的该免疫球蛋白优选地是已知浓度的，由此通过将所得的病人样品的结果与阳性样品(第二试剂)的结果进行比较可以对样品中的免疫球蛋白进行定量。
优选地，所提供的该试剂盒用于如上所述的本发明的方法。为此，所述第一试剂与第二试剂被设计为用于检测病人的可结合于特定过敏原的特异性免疫球蛋白，或者是检测病人的一种特定的过敏症。但该试剂盒也被设计为用于检测病人的可结合于多种过敏原的多种免疫球蛋白，或者是用于诊断多种过敏症。
现就下列实施例和附图对本发明进行更为详细的描述，本发明当然不限于此。
图1显示的为一种过敏原微阵列的示意图；
图2显示来自过敏病人的血清经过敏原微阵列分析后的扫描图像；
图3a-3c显示的为得自一次三重分析的散点图。
图4a-4c显示对固定的提取物和固定的重组过敏原所检测到的荧光强度％。
实施例1
过敏原点样(Allergen spotting)
使用Genetic Microsystems的GMS 417点样仪(spotter)来排列过敏原。蛋白被点到衍生化的(derivatized)玻璃片上。将每一种过敏原在一个圆点上点一次，共点3个圆点。该圆点(要素(features))的直径为大约200微米。
过敏原的功能组合方式如下：
(A)户外(I.树木[1＝rBetv1，2＝rBetv2、3＝rBetv4、4＝rJunO2、5＝Cass1]、II.草[6＝rPhlp2、7＝rPhlp4、8＝rPhlp5a、9＝rPhlp1、10＝rPhlp6、11＝rPhlp7、12＝rPhlp11、13＝rPhlp12]、III.种子[14＝rParj2、15＝Arty1a、16＝Mugwort profilin])，
(C)食物过敏原(X.蔬菜[17＝Apig1、18＝Apig1.0201、19＝Dauc1.2、20＝rArah2、21＝rArah5]、XI.水果[22＝Mald1、23＝Mald2]、XII.虾[24＝rPena1]、XIII.鱼[25＝recCarp])，
(B)室内(IV.Mites[26＝rDerp1、27＝rDerp2.0101、28＝rDerp2、29＝rDerp2b、30＝rDerp5、31＝rDerp5a、32＝rDerp7、33＝rDerp8、34＝rDerp10、35＝rTyrp2]、V.动物[36＝rLepd2.01、37＝rLepd13、38＝rEurm2.0101、39＝rFeld1、40＝rFeld1a、41＝rBosd2、42＝来自猫的代表性过敏原、43＝来自狗的代表性过敏原、44＝BSA、45＝来自小鼠的代表性过敏原、46＝来自大鼠的代表性过敏原、47＝来自猪的代表性过敏原、48＝来自绵羊的代表性过敏原、49＝来自鸡的代表性过敏原、50＝来自兔的代表性过敏原、51＝来自仓鼠的代表性过敏原、52＝来自马的代表性过敏原、53＝来自鸽子的代表性过敏原、54＝来自Guineaalbumin的代表性过敏原、VI.霉菌[55＝rPenc3、56＝rPenc19a、57＝rPenc19b、58＝Penn13、59＝rAspf1、60＝rAspf3、61＝rAspf4、62＝rAspf6、63＝rAspf1a、64＝rAspf3a、65＝rAspf4a、66＝rAspf6a、67＝rAspf7、68＝rAspf8、69＝rAlta1、70＝rAlta2]、VII.酵母[71＝rMalf7、72＝rMalf1、73＝rMalf5、74＝rMalf6、75＝rMalf8、76＝rMalf9]、VIII.乳酸[77＝rHevb1、78＝rHevbla、79＝rHevb3、80＝rHevb8、81＝rHevb9、82＝rHevb10、83＝rHevb11]、IX.Insects[84＝rAK、85＝rBlag2、86＝rBlag4、87＝rBlag5.]]，
(D)毒物(XIV.蜜蜂[88＝Ag5、89＝磷脂酶A、90＝透明质酸酶、91＝rVesv5、92＝rVesg5]、XV.黄蜂[93＝Ag5])，
(E)自体过敏原(94＝HSA、95＝a-NAC)
此外，将缓冲液圆点散布于过敏原的亚组之间作为背景对照，以″X″标出，″ab″为标记的抗体。(图1：1864×1182象素、1.86×1.18cm、1000象素/cm、象素深度/色彩8/256、1.象素对应于10微米)。
100微升测定用量的过敏原分配至96孔微滴定板的孔内，其在点样缓冲液(300mM磷酸钠pH8.5)内的浓度为大约200纳克/微升。固定过敏原所用的最佳浓度由滴定实验计算得出，所述实验使用了数种不同缓冲液内的过敏原和不同的玻片。当浓度达到或超过100纳克/微升时，所分析的蛋白显示出饱和性，用GMS扫描仪进行扫描时变为持续的强烈的白色信号。在此浓度下，过敏原的结合性与储存的组合物(the composition of the storage)以及点样缓冲液无关。
实施例2
SOPHIA(固相免疫吸附试验)
购自CEL A ssociates(乙醛玻片(aldehyde slides))或自制的玻片经孵育过夜后，将其在Falcon管中、在环境温度下用1xTBST(10mM Tris pH8.0/150mM NaCl/0.5％Tween 20)震荡洗涤。然后将玻片转移至含有0.01％BSA的1xTBST溶液中，在环境温度中封闭2小时。接下来将玻片在1xTBST中洗涤15分钟，并用蒸馏水略加冲洗。
将过敏原微阵列与稀释的血清(以1xTBST按1∶5稀释)在37℃孵育(至少)60分钟，并震荡。已经对多种稀释程度的血清进行过测试，范围在1∶1-1∶15。通常按1∶5稀释可得到最佳的结果。将30微升稀释的血清加到购自SIGMA Technologies的加压密封盒(PressSeal Chamber)内的玻片上。加压密封盒的使用参照厂家提供的方案。与血清一同孵育时间的范围为60分钟到过夜，对此范围内的多种孵育时间进行了分析。但延长与血清一同孵育的时间不能增加信号强度或特异性。与血清一同孵育后，用1xTBST洗涤玻片(15分钟，环境温度)并震荡。
选取5份取自曾经用传统的诊断方法(皮肤针刺试验、RAST、ELISA)检测过的不同病人的血清和1份取自非遗传性过敏症病人的血清用于进行过敏原微阵列的基准测试。每份血清用不同批次的过敏原微阵列分析至少2次。
将0.01％BSA/1xTBST溶液内的、依照生产商提供的方案用AlexaFluor荧光染料标记的荧光标记的αIgE抗体加入到过敏原微阵列中，在环境温度下孵育60分钟。依据标记的时间和效率，抗体的工作稀释浓度的范围在1∶1000-1∶5000之间。免疫分析后，在环境温度下，将玻片以1xTBST洗涤15分钟并震荡，然后用蒸馏水略加冲洗。
免疫吸附分析后，使用GMS双色扫描仪对玻片进行评价。通常不同的分析和不同的玻片之间的信号强度仅存在轻微的差别。但所使用的玻片的类型会造成背景值的不同。图2显示的是对一个过敏症病人的血清用过敏原微阵列分析后的扫描图像的实例。该病人对Phleum、Mite、Felis和蜜蜂有很强的反应(参见图1)。没有发现由于缓冲液圆点或自身过敏原的非特异性反应引起的背景信号。经过对过敏症病人的血清进行充分的评价后，所得结果与使用RAST方法检测同一份血清所得到的初步数据进行比较。用本发明的方法得到的结果与已有的数据具有良好的一致性。
实施例3：
可重复性检测分析病人C的血清
使用分别制备的过敏原微阵列对病人C的血清进行了3次分析。
实验步骤与上述基本一致。
分析后，将玻片用同一硬件设施进行扫描。使用GenePix软件包进行数据分析。计算3次重复实验所得到的数据，对每一种过敏原的3次实验的信号强度的平均值进行比较。
只有比缓冲液点的信号的平均值高出至少1.5倍的信号的相应的值才用于最后的分析。表1显示的为相应的信号的平均值、标准差以及标出差百分数。
表1
过敏原     检测1      检测2       检测3      平均值       标准差％      平均
rBet v1    20731      21325       25060      22372.00     1916.11       8.56
rPhl p2    17176      15529       14227      15644.00     1206.67       7.71
rPhl p4    36134      33511       29328      32991.00     2802.76       8.50
rPhl p5a   56600      53068       55594      55087.33     1485.77       2.70
rPhl p6    56244      51359       37625      48409.33     7882.14       16.28
rPhl p12   6291       7003        12289      8527.67      2675.50       31.37
rPar j2    7552       7678        9444       8224.67      863.73        10.50
Artv 1a    6997       7931        11258      8728.67      1828.70       20.95
Mugwort-   7901       7669        9260       8276.67      701.74        8.48
profilin
Mal d1     9890       15295       8176       11120.33     3033.74       27.28
HAS        9868       8732        10708      9769.33      809.71        8.29
绵羊白蛋白 9858       8295        10222      9458.33      835.92        8.84
马白蛋白   9602       9061        10559      9740.67      619.37        6.36
rAsp f1(b) 12216      10129       10781      11042.00     871.77        7.90
rMal f5    13459      11018       12035      12170.67     1001.14       8.23
rAK        20680      14202       19978      18286.67     2902.48       15.87
由3次独立实验分析所得到的值计算出的平均标准差为12.36％。这说明基于芯片的免疫学分析方法对于检测病人血清中的IgE具有良好的可重复性。这一点从三重分析之3中得到的散点图中也可看出，见图3a-3c，其中图3a显示了测试1对测试3的散点图，图3b为测试2对测试3的散点图，而图3c为测试1对测试2的散点图；
A代表过敏原，而FI代表荧光强度。
实施例4：
不同微阵列的比较
为检测用于本发明的最佳的玻片，按照下述标准对分别制备的玻片进行评价：
—生产方法：根据一些参数，例如有害化学品含量以及生产时间对制备的玻片做出评价。
—生产成本：比较自制的和购买的玻片的成本。
—结合能力：根据不同的玻片与荧光标记的蛋白的结合能力对其做出评价。
—可重复性：用经过不同预处理的玻片进行系列实验，根据总体的分析表现对其做出评价。
—总体背景：在进行过敏症分析前后，对所有的玻片就其有可能降低信号/噪音比的系统性表面背景做出评价。
—检测极限：评价所有玻片在过敏症筛选分析中每个点所能检测到的最小蛋白浓度。
—血清耐受性：通常，病人的血清是一种复杂的蛋白混合物，不同批次的病人血清对基于微阵列的免疫分析常会产生负性干扰。
—封闭：评价所有玻片在进行过敏症分析前是否有必要进行封闭步骤。
—储存：过敏原芯片制备好后，评价所有玻片的长期存放的情况。
表2所示为上述评价研究的结果：
表2
  反应性化学表面/玻片类型   生产   成本   结合能力   特异性   重复性   总体背景   检测极限   过敏原筛选   封闭/偶联   储存
  ProteoBind   +   ++   ++   ++   ++   ++   ++   ++   否   -
  CEL(1)   /   ++   ++   ++   -   -   +   ++   是   ++
  3D-Link(2)   /   --   ++   ++   +   +   +   -   是   -
  Superaldehyde(1)   /   --   +   +   ++   -   +   +   是   ++
  Aminosifane(3)   +   ++   +   +   --   -   +   +   否   ++
  乙二醛   -   +   ++   ++   --   -   +   ++   是   ++
  EGS(3)   -   +/-   ++   ++   --   -   +   +   否   -
  Sulfo KMUS(3)   -   +/-   ++   +   /   -   /   /   否   /
  Glutaraldehyde(3)   -   +/-   /   /   --   -   /   /   /   ++
光交联剂(3) - +/- + + / - / / / /
  PEI/EGS(3)   -   --   ++   +   +   +   /   /   /   /
  FAST玻片(4)   /   --   +   --   -   --   --   --   否   ++
  CAST玻片(4)   /   --   +   +   +   --   --   --   是   ++
  未修饰玻璃   +   ++   -   /   --   ++   --   /   /   /
表2所示为文中描述的评价研究的结果。下列符号及其意义分别为(++)优，(+)好，(-)较差，(--)差。(/)代表没有就此项对该玻片进行分析。(1)具有含醛基的功能性表面的玻片。(2)具有氨基反应表面的玻片，其确切的化学性质不明。(3)自制的玻片，具有如表2所示的官能团。(4)具有固定蛋白所需的膜的玻片。其所采用的表面衍生物的工作名称为ProteoBind，其在基于微阵列的过敏症诊断中具有最佳的表现，并包含(1-[3”-[三甲氧基甲硅烷基]丙基]-1’(4”-异硫代氰酰苯基)硫脲)，根据Chen等的方法(Nucleic Acids Research，199，vol.27，No.2)制备，将其并入作为参考。
根据上述评价研究，选择ProteoBind作为用来生产过敏原微阵列的优良表面衍生物。
实施例5：
比较使用固定的重组过敏原与使用固定的提取物对样品中的免疫球蛋白的检测
为测定固定于微阵列的纯化的重组过敏原与固定于微阵列的过敏原提取物的敏感性以及诊断的相关信息，将同一来源的特异性过敏原与过敏原提取物进行比较。
过敏原组合物固定于微阵列后，将包含所述特异性血清的不同样品加入到微阵列中，然后检测相当于结合了过敏原的抗体的量的荧光。结果显示于表3、4和5以及图4a、4b和4c，其中“FL”代表荧光％。这些结果清楚地表明使用重组过敏原较使用过敏原提取物可获得更敏感的检测和定量结果。单一重组过敏原的荧光强度明显高于提取物的荧光强度。此外，与使用重组过敏原的检测不同，使用提取物仅能检测出提取物的来源，而无法确定究竟是其中的哪一种特异性抗原引起了过敏症。
因此，使用单一纯化的过敏原、特别是重组的过敏原的本发明的方法优于使用包含过敏原的提取物的方法。
表3
  图表1     血清1-Sp     血清4-Sp     血清19-Sp     血清30-Sp
  Bet v1a     52028     62529     62932     18847
  Bet v1a Mut     6590     237     905     139
  Bet v1d     1576     14352     252     89
  Bet v2     2196     1408     273     1253
  BP-提取物     21013     39438     11390     3174
表4
 图表2   血清5-Sp   血清7-Sp   血清9-Sp   血清17-Sp 血清18-sp 血清40-Sp
 Phl pI   45611   12148   21588   5838 23497 23424
 Phl pII   209   52043   814   2562 10984 14753
 Phl pV   64005   63481   62953   40770 63530 62029
 Phl-提取物   63987   40318   14504   10183 44405 19798
表5
图表3     血清11-Sp   血清16-Sp   血清39-sp   血清40-Sp
Hev b3 416 387 108 235
Hev b5-Mal     350   519   30601   63897
Hev b8     11146   7977   134   853
Hev b9     460   631   105   188
Hev b10     360   429   73   152
乳胶B-提取物 264 202 80 3426
乳胶C-提取物     769   866   5343   30970

Claims (37)

1.一种用于检测样品中与过敏原结合的免疫球蛋白的方法，其特征为将一种或多种过敏原固定于微阵列芯片上，其后将样品与所述经固定的过敏原进行孵育，由此使得对所述过敏原具有特异性的免疫球蛋白与所述特异性过敏原相结合，其后对与所述经固定的特异性过敏原相结合的免疫球蛋白进行检测。
2.权利要求1的方法，其特征为所检测的免疫球蛋白为IgE。
3.权利要求1的方法，其特征为所检测的免疫球蛋白为IgG。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其特征为将一种或多种纯化的过敏原固定于所述微阵列芯片上。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其特征为将一种或多种重组的过敏原固定于所述微阵列芯片上。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其特征为将一种或多种合成的过敏原固定于所述微阵列芯片上。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其特征为将一种或多种半抗原作为过敏原固定于所述微阵列芯片上。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其特征为将所述过敏原固定于所述微阵列芯片上的直径为10-2000微米、优选地直径为50-500微米、更优选地直径为150-250微米的点上。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其特征为将所述过敏原固定于用作所述微阵列芯片的固相支持物上。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其特征为将所述过敏原分别固定于用作所述微阵列芯片的玻璃和合成载体上。
11.权利要求1-8中任一项的方法，其特征为将所述过敏原固定于用作所述微阵列芯片的硅晶片上。
12.权利要求1-8中任一项的方法，其特征为将所述过敏原固定于用作所述微阵列芯片的膜上。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其特征为所述微阵列芯片是经过化学修饰的，优选地分别为氨基反应和羧基反应修饰。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其特征为所述过敏原共价结合于所述微阵列芯片。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其特征为检测血清样品中的所述免疫球蛋白。
16.权利要求15的方法，其特征为将所述血清按1∶1-1∶15、优选地按1∶5进行稀释。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其特征为将所述样品与所述过敏原孵育1分钟-24小时、优选地为孵育1-2小时。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其特征为将所述样品与所述过敏原在0-60℃、优选地在37℃进行孵育。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其特征为用至少一种经过标记的、特异性抗免疫球蛋白抗体对所述已结合的免疫球蛋白进行检测。
20.权利要求19的方法，其特征为用至少一种经过荧光标记的、特异性抗免疫球蛋白抗体对所述已结合的免疫球蛋白进行检测。
21.权利要求19的方法，其特征为用至少一种经过放射性标记的、特异性抗免疫球蛋白抗体对所述已结合的免疫球蛋白进行检测。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其特征为将一种或多种室内过敏原作为过敏原进行固定。
23.权利要求1-21中任一项的方法，其特征为将一种或多种室外过敏原作为过敏原进行固定。
24.权利要求1-21中任一项的方法，其特征为将一种或多种食物过敏原作为过敏原进行固定。
25.权利要求1-21中任一项的方法，其特征为将一种或多种毒液过敏原作为过敏原进行固定。
26.权利要求1-21中任一项的方法，其特征为将一种或多种自体过敏原作为过敏原进行固定。
27.一种用于在体外诊断病人的过敏症的方法，其特征为自病人取得血清样品，其后按权利要求1-26中任一项的方法对所述样品中的与过敏原结合的免疫球蛋白进行分析，其中使用了微阵列芯片，所述微阵列芯片上固定了至少10种、优选地至少50种、更优选地至少90种不同的过敏原，其后将所述样品与所述固定的过敏原之间出现的阳性反应诊断为过敏症。
28.其上固定了一种或多种过敏原的微阵列芯片。
29.权利要求28的微阵列芯片，其特征为将所述过敏原固定于直径为100-500微米、优选地直径为200-300微米的点上。
30.权利要求28或29的微阵列芯片，其特征为其是一种玻璃载体。
31.权利要求28或29的微阵列芯片，其特征为其是一种合成载体。
32.权利要求28或29的微阵列芯片，其特征为其是一种硅晶片。
33.权利要求28或29的微阵列芯片，其特征为其是一种膜。
34.权利要求28-33中任一项的微阵列芯片，其特征为其经过化学修饰、优选地分别为氨基反应和羧基反应修饰。
35.权利要求28-34中任一项的微阵列芯片，其特征为将所述过敏原与其共价结合。
36.一试剂盒，其特征为包含权利要求28-35中任一项的微阵列芯片和一种第一试剂以及可能地一种第二试剂，所述第一试剂包含至少一种免疫球蛋白检测试剂、优选地为一种抗免疫球蛋白抗体、且优选地为已知浓度，所述第二试剂用作阳性样品，其包含至少一种与过敏原结合的免疫球蛋白。
37.权利要求36的试剂盒，其用于进行权利要求1-27中任一项的方法。
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