CN1582337B - 丙型肝炎病毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Ad6载体和编码含有失活的NS5B RNA-依赖型RNA聚合酶区的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸。所述核酸特别适合用作提供多种抗原的腺病毒载体或DNA质粒疫苗的成分，用于产生针对HCV的HCV特异性细胞介导的免疫(CMI)反应。
Description
相关申请
本申请要求申请日为2002年3月13日的美国临时申请流水号60/363，774和申请日为2001年10月11日的美国临时申请流水号60/328，655的优先权，以上两份申请分别被收作本文参考。
发明背景
在本申请中所引用的参考文献并非承认是本发明的现有技术。
世界人口的大约3％受到了丙肝病毒(HCV)的感染(Wasley等，Semin.Liver Dis.20，1-16，2000)。接触HCV导致明显的急性疾病的只占很小的百分比，而在大多数情况下所述病毒会形成慢性感染，导致肝脏炎症并且缓慢发展成肝脏衰竭和硬化(Iwarson，FEMSMicrobiol.Rev.14，201-204，1994)。另外，流行病学调查表明，HCV在肝细胞癌的发病方面起着重要作用(Kew，FEMS Microbiol.Rev.14，211-220，1994，Alter，Blood 85，1681-1695，1995)。
在1992年对HCV进行常规血液筛查之前，大部分感染是通过意外接触受感染的血液、血液制品或移植器官而感染的。在进行HCV血液筛查的地方，HCV主要是通过直接透过皮肤接触受感染的血液，即静脉内用药而感染的。较少见的传播方法包括围产期接触，血液透析，以及与HCV感染患者的性接触(Alter等，N.Engl.J.Med.341(8)，556-562，1999，Alter，J.Hepatol.31Suppl.88-91，1999.Semin.Liver.Dis.201，1-16，2000).
HCV基因组由大约9.5kb的单链RNA组成，它编码具有大约3000个氨基酸的前体多蛋白(Choo等，Science 244，362-364，1989，Choo等，Science 244，359-362，1989，Takamizawa等，J.Virol.65，1105-1113，1991)。所述HCV多蛋白包括以下顺序的病毒蛋白：C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.
各个病毒蛋白是通过HCV多蛋白的蛋白水解而产生的。宿主细胞蛋白酶能释放推测的结构蛋白C，E1，E2，和p7，并且在810号氨基酸上产生NS2的N-末端(Mizushima等，J.Virol.68，2731-2734，1994，Hijikata等，P.N.A.S.USA90，10773-10777，1993)。
推测非结构蛋白NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B形成了病毒复制机制，并且是从所述多蛋白中释放出来的。与NS2和NS3的N-末端相关的锌-依赖型蛋白酶负责NS2和NS3之间的裂解(Grakoui等，J.Virol.67，1385-1395，1993，Hijikata等，P.N.A.S.USA 90，10773-10777，1993)。位于NS3的N-末端结构城中的一种特殊的丝氨酸蛋白酶，负责在NS3/NS4A，NS4A/NS4B，NS4B/NS5A和NS5A/NS5B接合处的蛋白水解裂解(Bartenschlager等，J.Virol.67，3835-3844，1993，Grakoui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，10583-10587，1993，Tomei等，J.Virol.67，4017-4026，1993)。NS4A提供了NS3活性的辅因子(Failla等，J.Virol.68，3753-3760，1994，De Francesco等，美国专利号5,739,002)。
NS5A是能产生干扰素抗性的高度磷酸化的蛋白(De Francesco等，Semin.Liver Dis.，20(1)，69-83，2000，Pawlotsky，ViralHepat.Suppl.1，47-48，1999)。
NS5B提供了一种RNA-依赖型RNA聚合酶(De Francesco等，国际公开号WO 96/37619，Behrens等，EMBO 15，12-22，1996，Lohmann等，Virology249，108-118，1998)。
发明概述
本发明涉及Ad6载体和编码含有失活的NS5B RNA-依赖型RNA聚合酶区的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸。所述核酸特别适合用作提供多种抗原的腺病毒载体或DNA质粒疫苗的成分，用于产生针对HCV的HCV特异性细胞介导的免疫(CMI)反应。
HCV特异性CMI反应表示能识别HCV抗原的细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞的产生。CMI反应还可以包括非HCV特异性免疫作用。
优选的核酸编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，它基本上与SEQ.ID.NO.1相似，并且具有足够的蛋白酶活性，以便对它自身进行加工，产生基本上相似于存在于SEQ.ID.NO.1中的NS5B区的至少一种多肽。所产生的相当于NS5B区的多肽是无酶促活性的。更优选的是，所述HCV多肽具有足够的蛋白酶活性，以便产生基本上相似于存在于SEQ.ID.NO.1中的NS3，NS4A，NS4B，NS5A，和NS5B区的多肽。
所提到的“基本上相似的序列”表示与参考序列的同一性至少为大约65％。因此，举例来说，具有基本上相似于SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列的多肽，与SEQ.ID.NO.1具有至少大约65％的总体氨基酸同一性。
相当于NS3，NS4A，NS4B，NS5A，和NS5B的多肽，与SEQ.ID.NO.1上的相应的区具有至少大约65％的氨基酸序列同一性。所述相应的多肽在本文中又被称为NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B多肽。
因此，本发明的第一方面披露了包括编码基本上相似于SEQ.ID.NO.1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列的核酸。所编码的多肽具有足够的蛋白酶活性，以便对它自身进行加工，产生无酶促活性的NS5B多肽。
在一种优选实施方案中，所述核酸是能够在需要的人细胞中表达Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的表达载体。在人细胞内的表达具有治疗作用，可以有效治疗HCV感染，并且预防性治疗HCV感染。
表述载体包括编码一种多肽的核苷酸序列以及进行正确转录和加工的调节元件。可以存在的调节元件包括与编码所述多肽的核苷酸天然相关的调节元件，以及不是与所述核苷酸序列天然相关的外源调节元件。诸如外源激发子的外源调节元件可用于在特定宿主中表达，如在人细胞中表达。可用于功能性表达的调节元件的例子包括激发子，终止子，核糖体结合位点和聚腺苷酸化信号。
本发明的另一方面，披露了包括能够在人细胞中表达基本相似于SEQ.ID.NO.1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表达盒的核酸。所述多肽能够对它自身进行加工，以便产生无酶促活性的NS5B蛋白。所述基因表达盒至少包括以下部分：
a)与编码多肽的核苷酸序列转录性偶联的激发子；
b)与所述核苷酸序列功能性偶联的5＇核糖体结合位点；
c)与所述核苷酸序列的3＇末端连接的终止子；和
d)与所述核苷酸序列功能性偶联的3＇聚腺苷酸化信号。
所提到的“转录性偶联”表示所述激发子的定位使得可以通过结合在所述激发子上的RNA聚合酶使核苷酸序列转录。转录性偶联并不要求被转录的序列靠近所述激发子。
所提到的“功能性偶联”表示介导一种对所述核苷酸序列的作用的能力。功能性偶联并不需要所偶联的序列彼此接近。与所述核苷酸序列功能性偶联的聚腺苷酸化信号有利于转录的RNA的裂解和聚腺苷酸化。与所述核苷酸序列功能性偶联的5’核糖体结合位点有利于核糖体结合。
在优选实施方案中，所述核酸是适合用于治疗HCV的治疗性用途或用作生产治疗载体的中间物的DNA质粒载体或腺病毒载体。治疗HCV，包括主动治疗HCV感染和预防性治疗HCV感染。
本发明的另一方面披露了包括能够表达基本上相似于SEQ.ID.NO.1的多肽的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的腺病毒载体，所述腺病毒载体是通过以下方法生产的，该方法包括(a)同源重组和(b)腺病毒载体回收(rescue)。所述同源重组步骤中产生了一种腺病毒基因组质粒。所述腺病毒载体回收步骤产生了来自所述腺病毒基因组质粒的腺病毒载体。
本文所披露的腺病毒基因组质粒包括一种重组腺病毒基因组，它具有一个在E1区上的缺失，和任选在E3区上的缺失，以及插入所述缺失区之一中的基因表达盒。所述重组腺病毒基因组是由基本上相似于一种或多种腺病毒血清型的区域组成的。
本发明的另一方面披露了包括SEQ.ID.NO.4的核酸序列的腺病毒载体或它的衍生物，其中，所述衍生物的存在于SEQ.ID.NO.4上的HCV多蛋白编码序列被SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.10或SEQ.ID.NO.11中任一个的HCV多蛋白编码序列所取代。
本发明的另一方面披露了一种包括含有编码基本上相似于SEQ.ID.NO.1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的序列的核酸的培养的重组细胞。所述重组细胞具有多种用途，如用于通过载体构建方法复制编码所述多肽的核酸。
本发明的另一方面披露了一种制备包括能够表达基本上相似于SEQ.ID.NO.1的多肽的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的腺病毒载体的方法。该方法包括以下步骤：(a)生产包括重组腺病毒基因组的腺病毒基因组质粒，它在E1和E3区具有缺失，并且具有插入所述缺失区之一中的基因表达盒，和(b)从所述腺病毒基因组质粒中回收腺病毒载体。
本发明的另一方面披露了包括用于表达基本上相似于SEQ.ID.NO.1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的载体和可以药用载体的药物组合物。所述载体适合给患者施用，并且在患者体内表达多肽。
“患者”表示能够感染HCV的哺乳动物。患者可能感染了或没有感染HCV。患者的例子有人和黑猩猩。
本发明的另一方面披露了一种治疗患者的方法，包括给所述患者施用有效量的表达基本上相似于SEQ.ID.NO.1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的载体的步骤。所述载体适合给患者施用，并且在患者体内表达多肽。
进行治疗的患者可能有或没有感染HCV。对于感染了HCV的患者来说，有效量足以获得以下作用中的一种或多种：减弱HCV复制的能力，减少HCV负荷，提高对病毒的清除，并且增强一种或多种HCV特异性CMI反应。对于没有感染HCV的患者来说，有效量是足以获得下列一种或多种效果的用量：增强产生针对HCV感染的HCV特异性CMI反应的一种或多种成分的能力，降低了对HCV感染的易感性，和减弱了传染性病毒建立导致慢性疾病的持久感染的能力。
本发明的另一方面涉及包括Ad6区和一个不存在于Ad6中的区的重组核酸。所提到的“重组”核酸表示存在两个或两个以上不是天然彼此相关的核酸区。所述Ad6重组核酸优选包括Ad6区和编码与Ad6异源的多肽的基因表达盒。
通过本文所提供的包括不同实施例的其他说明，可以理解本发明的其他特征和优点。所提供的实施例说明了用于实施本发明的不同成分和方法。这些实施例不构成对本发明的限定。根据本发明的说明，技术人员能够确定和采用可用于实施本发明的其他成分和方法。
附图的简要说明
图1A和1B表示SEQ.ID.NO.1。
图2A，2B，2C和2D表示SEQ.ID.NO.2。SEQ.ID.NO.2提供了编码SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列，同时提供了优化的内部核糖体进入位点和TAAA终止序列。1-6号核苷酸提供了优化的内部核糖体进入位点。7-5961号核苷酸编码HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，5137-5145号位置上的核苷酸提供了1711-1713号氨基酸位置上的AlaAlaGly序列，它使得NS5B失活。5962-5965号核苷酸提供了TAAA终止序列。
图3A，3B，3C和3D表示SEQ.ID.NO.3。SEQ.ID.NO.3是SEQ.ID.NO.2的密码子优化形式。7-5961号核苷酸编码HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽。
图4A-4M表示MRKAd6-NSmut(SEQ.ID.NO.4)。SEQ.ID.NO.4是包括一个表达盒的腺病毒载体，其中，SEQ.ID.NO.1的多肽是由SEQ.ID.NO.2编码的。碱基对1-450相当于Ad5的碱基对1-450；碱基对462-1252相当于人CMV激发子；碱基对1258-1267相当于Kozak序列；碱基对1264-7222相当于NS基因；碱基对7231-7451相当于BGH聚腺苷酸化信号；碱基对7469-9506相当于Ad5碱基对3511-5548；碱基对9507-32121相当于Ad6碱基对5542-28156；碱基对32122-35117相当于Ad6碱基对30789-33784；碱基对35118-37089相当于Ad5碱基对33967-35935。
图5A-50表示SEQ.ID.NOs.5和6。SEQ.ID.NO.5编码具有有活性的RNA依赖型RNA聚合酶的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽。SEQ.ID.NO.6提供了所述多肽的氨基酸序列。
图6A-6C提供了pV1JnsA的核酸序列(SEQ.ID.NO.7)。
图7A-7N提供了Ad6基因组的核酸序列(SEQ.ID.NO.8)。
图8A-8K提供了Ad5基因组的核酸序列(SEQ.ID.NO.9)。
图9表示Ad6基因组的不同的区。线性(35759 bp)ds DNA基因组用双平行线表示，并且被划分成100个作图单位。转录单位是以相对它们在基因组上的位置和方向形式示出的。早期基因(E1A，E1B，E2A/B，E3和E4)是通过灰色箭头表示的，通过黑色箭头表示的晚期基因(LI-L5)，是通过对由主要晚期激发子(MLP)产生的转录物的可变剪接而产生的，并且它们都包括位于5＇末端的三联前导序列(1，2，3)。E1区位于大约1.0-11.5的作图单位，E2区位于75.0-11.5的作图单位，E2位于76.1-86.7的作图单位，E4区位于99.5-91.2的作图单位。所述主要晚期转录单位位于16.0和91.2作图单位之间。
图10表示回收含有Ad6和Ad5区的pAdB1-E3+的同源重组。
图11表示回收包括Ad6区的pAdE1-E3+的同源重组。
图12表示来自用表达不同的HCV NS盒的质粒DNA转染的293细胞的全细胞提取物的Wes tern印迹。用特异性抗体检测成熟的NS3和NS5A产物。″pV1Jns-NS″表示pV1JnsA质粒，其中，Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽是由SEQ.ID.NO.5编码的，并且SEQ.ID.NO.5被插入SEQ.ID.NO.7的1881-1912号碱基之间。″pV1Jns-NSmut″表示pV1JnsA质粒，其中，SEQ.ID.NO.2被插入SEQ.ID.NO.7的1882-1925号碱基之间。″pV1Jns-NSOPTmut″表示pV1JnsA质粒，其中SEQ.ID.NO.3被插入SEQ.ID.NO.7的1881-1905号碱基之间。
图13A和13B表示通过IFNγ ELIspot显示的在C57black6小鼠(A)和Ba1bC小鼠(B)体内诱导的T细胞反应，包括用基因电转移装置(GET)分别注射25微克和50微克的编码不同HCV NS盒的质粒DNA。
图14表示在感染HeLa细胞之后，来自不同腺病毒载体的蛋白表达。MRKAdS-NSmut是基于Ad5序列的腺病毒载体(SEQ.ID.NO.9)，其中，Ad5基因组具有碱基对451-3510的E1缺失，碱基对28134-30817的E3缺失，并且具有插入450-3511号位置之间的SEQ.ID.NO.4的碱基对451-7468所提供的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒。Ad5-NS是基于Ad5主链的腺病毒载体，具有碱基对342-3523的E1缺失，和碱基对28134-30817的E3缺失，并且包括编码来自SEQ.ID.NO.5的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的表达盒。″MRKAd6-NSOPTmut″表示具有修饰过的SEQ.ID.NO.4序列的腺病毒载体，其中，SEQ.ID.NO.4的碱基对1258-7222被SEQ.ID.NO.3所取代。
图15表示由IFNγELIspot显示的通过两次注射109vp含有不同HCV非结构基因盒的腺病毒载体，在C57black6小鼠体内诱导的T细胞反应。
图16A-16D表示由IFNγELIspot显示的通过一次或两次注射1010vp(A)或1011vp(B)含有不同HCV非结构基因盒的腺病毒载体，在猕猴体内诱导的T细胞反应。
图17A和17B表示由IFNγELIspot显示的通过两次注射1010vp(A)或1011vp(B)编码不同HCV非结构基因盒的腺病毒载体，在猕猴体内诱导的CD8+T细胞反应。
图18A-18F表示由大量CTL分析显示的通过两次注射1011vp的Ad5-NS(A)，MRKAdS-NSmut(B)，或MRKAd6-NSmut(C)在猕猴体内诱导的T细胞反应。
图19表示质粒pE2。
图20A-D表示部分密码子优化序列NSsuboptmut(SEQ.ID.NO.10)。Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的编码序列是从7-5961号碱基。
本发明的详细说明
本发明涉及Ad6载体和编码含有失活的NS5B区的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸。提供失活的NS5B区，提供了NS5B抗原，同时降低了由活性病毒RNA聚合酶导致的不利副作用的可能性。所述核酸的用途包括用作疫苗成分，以便将HCV多肽导入细胞，它能提供用于产生针对HCV的CMI反应的多种抗原，并且用作用于生产所述疫苗成分的中间产物。
适应性细胞免疫反应，由于主要组织相容性复合物(MHC)I型和II型表达的普遍分布，起着能够在整体身体内的HCV感染的细胞中识别病毒抗原的作用，以便诱导免疫学记忆，并且保持免疫学记忆。上述功能是由抗原特异性CD4+T辅助细胞(Th)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)提供的。
在通过它们的特异性T细胞受体激活之后，HCV特异性Th细胞实现了多种免疫调控功能，其中大部分功能是通过Th1和Th2细胞因子介导的。HCV特异性Th细胞有助于B细胞的激活和分化，并且有助于病毒特异性细胞毒性T细胞的诱导和刺激。Th细胞与CTL一起还能分泌能抑制若干病毒的复制和基因表达的IFN-γ和TNF-α。另外，Th细胞和CTL即主要效应细胞，可以诱导病毒感染过的细胞的程序凋亡和裂解。
HCV特异性CTL是由专门的抗原呈递细胞(pAPCs)加工的抗原产生的。抗原可以是在pAPCs内合成的或者是导入的。PAPC中的抗原合成，可以通过将编码序列所述抗原的表达盒导入所述细胞而完成。
施用核酸疫苗的一种优选途径是肌内途径。肌内施用似乎会导致将核酸导入体细胞和pAPCs，并且在那里表达。在所述体细胞中产生的HCV抗原可以转移到pAPCs，以便在I类MHC分子中呈递(Donnelly等，Annu.Rev.Immunol.15：617-648，1997)。
PAPCs在蛋白酶体复合物中将较长的抗原加工成较小的肽抗原。所述抗原被转运到内质网/高尔基复合体分泌途径中，以便与I类MHC蛋白结合。CD8+T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)和CD8细胞表面蛋白识别与I类MHC结合的抗原。
用编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸作为疫苗成分，可以从一种单一载体生产多种能够产生CMI反应的抗原。所述多肽应当能够对它自身进行充分加工，以便产生至少一个相当于NS5B的区。优选的核酸编码基本上相似于SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列，它具有足够的蛋白酶活性，以便对它自身进行加工，产生基本上相似于存在于SEQ.ID.NO.1上的NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B的各个HCV多肽。
基本上相似于SEQ.ID.NO.1的多肽，具有足够的蛋白酶活性，在细胞中对它自身进行加工，给所述细胞提供存在于若干不同HCV菌株中的T细胞表位。蛋白酶活性是由NS3和NS3/NS4A蛋白提供的，在合适的裂解位点上消化Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，以便释放相当于NS3，NS4A，NS4B，NS5A，和NS5B的多肽。Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的自我加工，产生了接近天然存在的HCV多肽的多肽。
根据本文所提供的指导，可以产生足够强的免疫反应，以便在患者体内获得有益作用。所提供的指导包括与HCV序列选择，载体选择，载体生产，组合治疗和施用相关的信息。
I.HCV序列
可以将多种不同的核酸序列用作疫苗成分，以便给细胞提供HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，或作为生产疫苗成分的中间物。用于获得合适核酸序列的起点，优选是被修饰而产生失活的NS5B的天然存在的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽。
在以下文献中披露了利用HCV核酸序列提供HCV非结构抗原，以便产生CMI反应：Cho等，Vaccine17：1136-1144，1999，Paliard等，国际公开号WO01/30812(并不被认为是本发明的现有技术)，和Coit等，国际公开号WO01/38360(并不被认为是本发明的现有技术)。例如，所述文献没有披露对它自身进行加工以便产生失活的NS5B的多肽，特别是没有披露HCV序列与本文所采用的递送载体的组合。
对HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽序列的修饰，可以通过改变其编码核酸而产生。可以进行改变，以便产生缺失，插入和取代。
可以在NS5B上进行小的修饰，以便通过导向于复制所必需的基序产生失活的聚合酶。NS5B活性所必需的基序的例子，以及为了生产失活的NS5B而可以进行的修饰披露于以下文献中：Lohmann等，Journal of Virology71：8416-8426，1997，和Kolykhalov等，Journal of Virology74：2046-2051，2000。
在产生对HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的修饰时需要考虑的其他因素，包括保持自身加工的能力和保持T细胞抗原。HCV多肽进行自身加工的能力，在很大程度上是通过功能性NS3蛋白酶确定的。能保持NS3活性蛋白酶活性的修饰，可以通过NS3蛋白，用作NS3的辅因子的NS4A，和存在于NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽中的NS3蛋白酶识别位点而获得。
可以对天然存在的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽序列进行不同的修饰，以便产生能够诱导多种T细胞反应的多肽。影响一种多肽诱导多种T细胞反应的能力的因素，包括HCV特异性T细胞抗原区的保存或导入，以及不同T细胞抗原区在不同HCV分离物中的优势。
天然存在的HCV分离物的多种例子为本领域所熟知。HCV分离物可以划分成以下六种包括一种或多种亚型的主要基因型：HCV-1/(1a，1b，lc)，HCV-2/(2a，2b，2c)，HCV-3/(3a，3b，10a)，HCV-4/(4a)，HCV-5/(5a)和HCV-6/(6a，6b，7b，8b，9a，11a)(Simmonds，J.Gen.Virol.，693-712，2001)。诸如HCV-BK，HCV-J，HCV-N，HCV-H的特定HCV序列的例子，业已在GenBank保藏，并且在多个文献中披露(例如，参见Chamberlain等，J.Gen.Virol.，1341-1347，1997)。
例如，HCV T细胞抗原可以通过经验性实验鉴定。鉴定T细胞抗原的一种方法包括用较大长度的多肽产生一系列重叠的短肽，然后从受感染的患者中筛选T细胞群体的阳性克隆。阳性克隆是通过特定肽激活/激发的。可以将诸如IFNγ-ELISPOT，IFNγ-细胞内染色和大量(bulk)CTL分析的技术用于测定肽活性。由此鉴定的肽可以视为代表了各病原体的T细胞表位。
例如，通过生产包括来自两种或两种以上天然存在的序列的区域的杂合NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，可以将来自不同HCV分离物的HCV T细胞抗原区导入一种单一序列。所述杂合体可以包括其他修饰，所述修饰优选不会减弱所述多肽产生HCV CMI反应的能力。
可以用本文所披露的或为本领域所熟知的技术，确定修饰过的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽对它自身进行加工，并且产生CMI反应的能力。所述技术包括使用IFNγ-ELISPOT，IFNγ-细胞内染色和大量CTL分析，测定HCV特异性CMI反应。
A.Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B序列
SEQ.ID.NO.1提供了优选的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B序列。SEQ.ID.NO.1包括大量的HCV特异性T细胞抗原，这些抗原存在于若干不同的HCV分离物中。SEQ.ID.NO.1与HCV BK菌株核苷酸序列(GenBank保藏号M58335)的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B部分相似。
在SEQ.ID.NO.1中，对于I类MHC分子识别来说，重要的锚定位点是保守的或代表HCV多蛋白的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B部分上的20种已知T细胞表位中的18种的保守性取代。就其余两种已知的T细胞表位而言，一种在SEQ.ID.NO.1上具有一个非保守性锚定取代，该取代仍然能被不同的HLA超类型识别，而一种表位具有一个不是保守的锚定残基。HCV T-细胞表位披露于以下文献中：Chisari等，Curr.Top.Microbiol Immunol.，242：299-325，2000，和Lechner等J.Exp.Med.9：1499-1512，2000。
HCV-BKNS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B核苷酸序列和SEQ.ID.NO.1之间的差别包括在5’末端引入一个甲硫氨酸，以及修饰过的NS5B活性位点残基在SEQ.ID.NO.1上的存在。所述修饰将GlyAspAsp换成了AlaAlaGly(1711-1713号残基)，以便使NS5B失活。
所编码的HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，优选具有基本上相似于SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列。在不同的实施方案中，所编码的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，与SEQ.ID.NO.1的氨基酸同一性为至少65％，至少75％，至少85％，至少95％，至少99％或100％；或与SEQ.ID.NO.1具有1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15，1-16，1-17，1-18，1-19，或1-20个氨基酸的差别。
Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽和SEQ.ID.NO.1之间的氨基酸差别，是通过确定两种序列不同的氨基酸修饰的最低数量计算的。氨基酸修饰可以是缺失，添加，取代或它们的任意组合。
氨基酸序列同一性，是通过本领域众所周知的方法确定的，所述方法将一种多肽的氨基酸序列与第二种多肽的氨基酸序列进行比较，并且产生一种序列比对。氨基酸同一性是通过所述比对计算的，包括统计具有相同氨基酸的比对的残基对的数量。
用于确定序列同一性的方法包括披露于以下文献中的方法：Schuler，G.D.in Bioinformatics：A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins，Baxevanis，A.D.和Ouelette，B.F.F.，eds.，John Wiley & Sons，Inc，2001；Yona，等，in Bioinformatics：Sequence，structure and databanks，Higgins，D.and Taylor，W.eds，Oxford University Press，2000；and Bioinformatics：Sequence and Genome Analysis，Mount，D.W.，ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001。确定氨基酸序列同一性的方法，在可公开获得的计算机程序中进行了汇编，如GAP(Wisconsin Package Version 10.2，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，Wisc)，BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215(3)：403-10，1990)，和FASTA(Pearson，Methods in Enzymology183：63-98，1990，R.F.Doolittle，ed)。
在本发明的一种实施方案中，两种多肽之间的序列同一性是通过使用GAP程序确定的(Wisconsin Package Version10.2，GeneticsComputer Group (GCG)，Madison，Wisc)。GAP采用了Needleman和Wunsch的比对方法(Needleman，等，J.Mol.Biol.48：443-453，1970)。GAP考虑了两种序列之间的所有可能的比对和空位位置，并且产生一种将匹配的残基数量最大化以及将空位的数量和大小最小化的总体比对。利用一种评分距阵确定符号匹配值。另外，为了限制向所述比对中插入空位，需要空位产生罚分和空位延伸罚分。利用GAP进行多肽比较的默认程序参数是BLOSUM62(Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)氨基酸评分距阵(MATrix＝blosum62.cmp)，空位产生参数(GAP权重＝8)，而空位延伸参数(LENgth权重＝2)。
更优选的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，除了在它们的整个长度上基本上相似于SEQ.ID.NO.1之外，还能产生基本上相似于存在于SEQ.ID.NO.1上的相应的区域的各个NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B区，SEQ.ID.NO.1上的相应的区是以如下形式提供的：Met-NS3的1-632号氨基酸；NS4A的633-686号氨基酸；NS4B的687-947号氨基酸；NS5A的948-1394号氨基酸和NS5B的1395-1985号氨基酸。
在不同实施方案中，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和/或NS5B区与SEQ.ID.NO.1上的相应区域的氨基酸同一性为至少65％，至少75％，至少85％，至少95％，至少99％或100％；或具有1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15，1-16，1-17，1-18，1-19，或1-20个氨基酸的氨基酸差别。
SEQ.ID.NO.1的氨基酸修饰，优选保持了所有的或大部分的T细胞抗原区。天然存在的氨基酸差别，是由于不同的氨基酸侧链(R基团)产生的。R基团能影响氨基酸的不同的性质，如物理尺寸，电荷，和疏水性。可以将氨基酸划分成以下不同类型：中性和疏水性(丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，和甲硫氨酸)；中性和极性(甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺)；碱性(赖氨酸，精氨酸，和组氨酸)；和酸性(天冬氨酸和谷氨酸)。
一般，在取代不同的氨基酸时，优选用具有相似性质的氨基酸取代。在特定类型内部取代不同的氨基酸，如用缬氨酸取代亮氨酸，用精氨酸取代赖氨酸，和用天冬酰胺取代谷氨酰胺是不会导致多肽三级结构改变的很好的候选取代。
基于特定的氨基酸序列和已知的遗传密码的间并性，可以获得大量不同的编码核酸序列。遗传密码的间并性是由于几乎所有氨基酸都是由核苷酸三联体或＂密码子＂的不同组合编码的。特定密码子翻译成特定氨基酸为本领域所熟知(例如，参见Lewin GENESIV，p.119，Oxford University Press，1990)。氨基酸是由以下密码子编码的：
A＝Ala＝丙氨酸∶密码子GCA，GCC，GCG，GCU
C＝Cys＝半胱氨酸∶密码子UGC，UGU
D＝Asp＝天冬氨酸∶密码子GAC，GAU
E＝Glu＝谷氨酸∶密码子GAA，GAG
F＝Phe＝苯丙氨酸∶密码子UUC，UUU
G＝Gly＝甘氨酸∶密码子GGA，GGC，GGG，GGU
H＝His＝组氨酸∶密码子CAC，CAU
I＝Ile＝异亮氨酸∶密码子AUA，AUC，AUU
K＝Lys＝赖氨酸∶密码子AAA，AAG
L＝Leu＝亮氨酸∶密码子UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUU
M＝Met＝甲硫氨酸∶密码子AUG
N＝Asn＝天冬酰胺∶密码子AAC，AAU
P＝Pro＝脯氨酸∶密码子CCA，CCC，CCG，CCU
Q＝Gln＝谷氨酰胺∶密码子CAA，CAG
R＝Arg＝精氨酸∶密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGU
S＝Ser＝丝氨酸∶密码子AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCU
T＝Thr＝苏氨酸∶密码子ACA，ACC，ACG，ACU
V＝Val＝缬氨酸∶密码子GUA，GUC，GUG，GUU
W＝Trp＝色氨酸∶密码子UGG
Y＝Tyr＝酪氨酸∶密码子UAC，UAU。
可以优化核酸序列，以便增强在宿主中的表述。要考虑的因素包括C：G含量，优选的密码子，以及避免抑制性二级结构。所述因素能够以不同的方式组合，以便获得在特定宿主中具有增强了的表达的核酸序列(例如，参见Donnelly等，国际公开号WO 97/47358)。
特定序列在特定宿主中具有增强了的表达的能力涉及某些经验实验。所述实验包括测定保护性核酸序列的表达，以及，如果必要的话，改变所述序列。
B.编码核苷酸序列
SEQ.ID.NOs.2和3提供了编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B序列的核苷酸序列的两种例子。SEQ.ID.NO.2的编码序列，与天然存在的HCV-BK序列(GenBank保藏号M58335)的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B区相似(核苷酸序列同一性为99.4％)，SEQ.ID.NO.3是SEQ.ID.NO.2的密码子优化形式。SEQ.ID.NOs.2和3具有78.3％的核苷酸序列同一性。
HCV-BK NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B核苷酸(GenBank保藏号M58335)和SEQ.ID.NO.2之间的差别，包括SEQ.ID.NO.2具有一个核糖体结合位点，一个ATG甲硫氨酸密码子，一个编码修饰过的NS5B催化结构域的区，一种TAAA终止信号和另外30个核苷酸的差别。编码AlaAlaGly(1711-1713号残基)的修饰过的催化结构域取代了GlyAspAsp，以便使NS5B失活。
编码HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列，优选基本上相似于SEQ.ID.NO.2的编码区。在不同实施方案中，编码HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列，与SEQ.ID.NO.2编码区的核苷酸序列的同一性为至少65％，至少75％，至少85％，至少95％，至少99％，或100％；或与SEQ.ID.NO.2具有1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15，1-16，1-17，1-18，1-19，1-20，1-25，1-30，1-35，1-40，1-45，或1-50个核苷酸的差别。
编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的序列和SEQ.ID.NO.2编码区之间的核苷酸差别，是通过确定两种序列差别的核苷酸修饰的最低数量计算的。核苷酸修饰可以是缺失，添加，取代或它们的任意组合。
核苷酸序列同一性，是通过本领域熟知的方法确定的，该方法比较了一种序列的核苷酸序列和另一种序列的核苷酸序列，以便产生一种序列比对。序列同一性是根据所述比对，通过统计具有相同核苷酸的比对位置的数量确定的。
用于确定两种多核苷酸之间的核苷酸序列同一性的方法，包括披露于以下文献中的方法：Schuler，in Bioinformatics：A PracticalGuide to the Analysis of Genes and Proteins，Baxevanis，A.D.和Ouelette，B.F.F.，eds.，John Wiley & Sons，Inc，2001；Yona等，.in Bioinformatics：Sequence，structure anddatabanks，Higgins，D.和Taylor，W.eds，Oxford UniversityPress，2000；and Bioinformatics：Sequence and GenomeAnalysis，Mount，D.W.，ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001。确定核苷酸序列同一性的方法，在可公开获得的计算机程序中进行了汇编，如GAP(Wisconsin Package Version 10.2，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc)，BLAST(Altschul等，J.Mol.Biol.215(3)：403-10，1990)，和FASTA(Pearson，W.R.，Methods in Enzymology 183：63-98，1990，R.F.Doolittle，ed)。
在本发明的一种实施方案中，两种多核苷酸之间的序列同一性，是通过采用GAP确定的(Wiscons in Package Version 10.2，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，Wisc)。GAP采用了Needleman和Wunsch的比对方法(Needleman等，J.Mol.Biol.48：443-453，1970)。GAP考虑了两种序列之间所有可能的比对和空位位置，并且产生了使匹配的残基数量最大化，并且使空位的数量和大小最小化的总体比对。用一种评分距阵确定符号匹配值。另外，需要用空位产生罚分和空位延伸罚分来限制将空位插入所述比对中。采用GAP的多核苷酸比较的默认程序参数是nwsgapdna.cmp评分距阵(MATrix＝nwsgapdna.cmp)，空位产生参数(GAP权重＝50)和空位延伸参数(LENgth权重＝3)。
更优选的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B核苷酸序列，除了在其整个长度上基本上相似之外，产生了基本上相似于存在于SEQ.ID.NO.2中的相应区域的各个NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B区。SEQ.ID.NO.2上的相应的编码区是以如下形式提供的：Met-NS3的7-1902号核苷酸；NS4A的1903-2064号核苷酸；NS4B 2065-2847号核苷酸；NS5A的2848-4188号核苷酸；NS5B的4189-5661号核苷酸。
在不同实施方案中，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和/或NS5B编码区与SEQ.ID.NO.2上的相应的区域上的核苷酸序列同一性为至少65％，至少75％，至少85％，至少95％，至少99％，或100％；或与SEQ.ID.NO.2具有1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15，1-16，1-17，1-18，1-19，1-20，1-25，1-30，1-35，1-40，1-45，或1-50个核苷酸的差别。
C.基因表达盒
基因表达盒包括多肽表达所需要的元件。所提到的“多肽”没有提供大小限制，并且包括蛋白。存在于基因表达盒中的调节元件通常包括：(a)与编码所述多肽的核苷酸序列转录性偶联的激发子，(b)与所述核苷酸序列功能性偶联的5′核糖体结合位点，(c)与所述核苷酸序列的3′末端连接的终止子，和(d)与所述核苷酸序列功能性偶联的3′聚腺苷酸化信号。还可以存在用于增强或调控基因表达或多肽加工的其他调节元件。
激发子是由RNA聚合酶识别，并且介导下游区域转录的遗传元件。优选的激发子是强激发子，它能提供较高水平的转录。强激发子的例子包括立即早期人巨细胞病毒激发子(CMV)，和具有内含子A的CMV(Chapman等，Nucl.Acids Res.19：3979-3986，1991)。激发子的其他例子包括天然存在的激发子，如EF1α激发子，鼠CMV激发子，Rous肉瘤病毒激发子，和SV40早期/晚期激发子和β-肌动蛋白激发子；以及人工激发子，如合成的肌肉特异性激发子和嵌合型肌肉-特异性/CMV激发子(Li等，Nat.Biotechnol.17：241-245，1999，Hagstrom等，Blood95：2536-2542，2000)。
所述核糖体结合位点位于起始密码子上或靠近起始密码子。优选的核糖体结合位点的例子包括CCACCAUGG，CCGCCAUGG，和ACCAUGG，其中AUG是起始密码子(Kozak，Cell44：283-292，1986)。核糖体结合位点的另一种例子是GCCACCAUGG(SEQ.ID.NO.12)。
聚腺苷酸化信号负责裂解转录的RNA，并且在所述RNA上添加poly(A)尾。高等真核生物中的聚腺苷酸化信号包括AAUAAA序列，距离聚腺苷酸化添加位点大约11-30个核苷酸。AAUAAA序列参与RNA裂解的信号传递(Lewin，Genes IV，Oxford University Press，NY，1990)。poly(A)尾对于mRNA加工来说是重要的。
可以用作基因表达盒的一部分的聚腺苷酸化信号，包括最小兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号和牛生长激素聚腺苷酸化(BGH)(Xu等，Gene272：149-156，2001，Post等，美国专利U.S.5,122,458)。其他例子包括合成的聚腺苷酸化信号(SPA)和SV40聚腺苷酸化信号。所述SPA序列如下：AAUAAAAGAUCUUUAUUUUCAUUAGAUCUGUGUGUUGGUUUUUUGUGUG(SEQ.ID.NO.13)。
可以存在的用于增强或调控基因表达或多肽加工的其他调节元件的例子，包括增强子，前导序列和操纵子。增强子区能增强转录。增强子区的例子包括CMV增强子和SV40增强子(Hitt等，Methods inMolecular Genetics7：13-30，1995，Xu，等，Gene272：149-156，2001)。增强子区可以与激发子结合。
前导序列是多肽上的氨基酸区，它能引导所述多肽进入蛋白酶体。编码序列所述前导序列的核酸是结构基因的5′末端，并且是随所述结构基因一起转录的。前导序列的例子是tPA。
可以用操纵子序列调控基因表达。例如，可以利用Tet操纵子序列抑制基因表达。
II.治疗性载体
可以用适合治疗性施用的载体将编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸导入患者体内。合适的载体能够将核酸递送到靶细胞中，而又不会导致不可接受的副作用。
细胞表达是利用编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表达盒实现的。所述基因表达盒包括用于在靶细胞内产生并且加工足够数量的核酸，以便获得有利效果的调节元件。
可用于治疗性用途的载体的例子包括第一和第二代腺病毒载体，辅助依赖型腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体，α病毒载体，Venezuelan马脑炎病毒载体，和质粒载体(Hitt等，Advancesin Pharmacology 40：137-206，1997，Johnston等，美国专利号6,156,588，和Johnston等，国际公开号WO 95/32733)。用于将Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽导入对象体内的优选载体，是第一代腺病毒载体和质粒DNA载体。
A.第一代腺病毒载体
用于表达基因表达盒的第一代腺病毒载体，包括B1和任选的E3缺失重组腺病毒基因组内的表达盒。E1区上的缺失足够大，以便去除腺病毒复制所必需的元件。
用于表达Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的第一代腺病毒载体，包括E1和E3缺失的重组腺病毒基因组。E1区的缺失足够大，以便去除腺病毒复制所必需的元件。E1和E3区缺失的组合足够大，以便能容纳编码Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表达盒。
所述腺病毒具有双链线性基因组，在两端具有反向末端重复。在病毒复制期间，将所述基因组包装在病毒衣壳内，以便形成毒粒。所述病毒通过病毒附着以及随后的内化，进入它的靶细胞(Hitt等，Advances in Pharmacology40：137-206，1997)。
腺病毒栽体可以基于不同的腺病毒血清型，如出现在人或动物体内的血清型。动物腺病毒的例子包括牛，猪，黑猩猩，鼠，犬和禽(CELO)腺病毒。优选的腺病毒载体是基于人血清型的，更优选基于B，C或D型血清型。人腺病毒B，C，D或E血清型的例子包括2型(″Ad2″)，4型(″Ad4″)，5型(″Ad5″)，6型(″Ad6″)，24型(″Ad24″)，26型(″Ad26″)，34型(″Ad34″)和35型(″Ad35″)。腺病毒载体可以包括来自单一腺病毒或来自两种或两种以上腺病毒的区域。
在不同的实施方案中，腺病毒是基于Ad5，Ad6，或它们的组合的。Ad5披露于以下文献中：Chroboczek等，J.Virology186：280-285，1992。Ad6披露于图7A-7N中。包括Ad5区的基于Ad6的载体披露于下面所提供的实施例部分。
腺病毒载体不一定完全去掉了它们的E1和E3区。相反，去掉了足够数量的E1区，使得在缺乏E1蛋白的条件下，不能复制的载体是以反式形式提供的；并且E1缺失和E1或E3缺失的组合大到足够容纳一个基因表达盒。
E1缺失可以从Ad5的大约碱基对342开始一直进行到大约碱基对3523，或相当于来自其他腺病毒的区域。所缺失的区域包括去掉从Ad5的大约碱基对450到大约碱基对3511的区域，或来自其他腺病毒的相应区域。始于大约碱基对341的较大的E1区缺失，去掉了有利于病毒包装的元件。
E3缺失能够从Ad5的大约27865号碱基对到大约30995号碱基对，从或者其他腺病毒载体的相应的区域获得。所述缺失区优选包括去掉了从Ad5的大约28134号碱基对到大约30817号碱基对的区域，或其他腺病毒载体的相应的区域。
E1区以及任选的E3区的缺失的组合应当足够大，以便包括所述基因表达盒的重组基因组的总体大小，不超过野生型腺病毒基因组的大约105％。例如，当重组腺病毒Ad5基因组的大小增加超过大约105％时，所述基因组会变得不稳定(Bett等，Journal of Virology 67：5911-5921，1993)。
包括所述基因表达盒的重组腺病毒基因组的大小优选为野生型腺病毒基因组的大约85％-大约105％。在不同实施方案中，包括所述表达盒的重组腺病毒基因组的大小为野生型基因组大小的大约100％-大约105.2％，或大约100％。
可以将大约7,500kb插入具有E1和E3缺失的腺病毒基因组中。在没有任何缺失的情况下，Ad5基因组为35,935个碱基对，而Ad6基因组为35,759个碱基对。
第一代腺病毒载体的复制可以通过提供反式E1基因产物而实现。E1基因产物能够以反式形式提供，例如，通过使用业已用腺病毒E1区转化过的细胞系。用腺病毒E1区转化过的细胞和细胞系的例子有HEK293细胞，911细胞，PERC.6TM细胞和转染过的原代人aminocytes细胞(Graham等，Journal of Virology 36：59-72，1977，Schiedner等，Human Gene Therapy11：2105-2116，2000，Fallaux等，HumanGene Therapy9：1909-1917，1998，Bout等，美国专利号6,033，908)。
应当将Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒插入重组腺病毒基因组的相当于缺失的E1区或缺失的E3区的区域。所述表达盒可以具有平行的或反向平行的取向。在平行取向中，所述插入基因的转录方向与缺失的E1或E3基因的方向相同。在反向平行取向的转录中，将相反的链用作模板，而转录方向是沿相反方向进行的。
在本发明的一种实施方案中，所述腺病毒载体具有插入到E1缺失区的基因表达盒。该载体包括：
a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的E1平行或E1反向平行取向的基因表达盒；
c)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548的第二腺病毒区或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；
d)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；
e)与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。
在本发明的另一种实施方案中，所述腺病毒载体具有插入到E3缺失区的表达盒。该载体包括：
a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；
c)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；
d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；
e)与所述基因表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。
在涉及腺病毒区的优选的不同实施方案中，存在：(1)相当于Ad5的第一，第二，第三，第四，和第五区；(2)相当于Ad6的第一，第二，第三，第四，和第五区；和(3)相当于Ad5的第一区，相当于Ad5的第二区，相当于Ad6的第三区，相当于Ad6的第四区，和相当于Ad5的第五区。
B.DNA质粒载体
DNA疫苗质粒载体包括一个基因表达盒和有利于复制并且优选有利于载体选择的元件。优选的元件提供了用于在非哺乳动物细胞中复制的元件和选择标记。所述载体应当不包括提供在人细胞中复制的元件或用于整合到人核酸中的元件。
有利于核酸选择的选择标记包括所述标记。优选的选择标记是能产生抗生素抗性的标记。抗生素选择基因的例子，包括编码氨苄青霉素，新霉素，和卡那霉素抗性的核酸。
可以用含有细菌复制起点和选择标记的质粒起始生产合适的DNA疫苗载体。能提供较高产量的细菌复制起点的例子，包括ColE1质粒-衍生的细菌复制起点(Donnelly等，Annu.Rev.Immunol.15：617-648，1997)。
细菌复制起点和选择标记的存在，使得能够在诸如大肠杆菌的细菌菌株中生产DNA载体。利用选择标记排除不包括DNA载体的细菌。
III.AD6重组核酸
Ad6重组核酸包括基本上相似于存在于SEQ.ID.NO.8中的Ad6区的Ad6区，和不存在于Ad6核酸中的区域。包括Ad6区的重组核酸具有不同的用途，如用于生产不同的Ad6区，作为生产基于Ad6的载体的中间物，以及用作递送重组基因的载体。
如图9所示，Ad6的基因组组构与Ad5的基因组组构非常相似。Ad5和Ad6之间的同源性大约为98％。
在不同实施方案中，Ad6重组核酸包括基本上相似于E1A，E1B，B2B，E2A，E3，E4，L1，L2，L3，或L4的核苷酸区，或它们的任意组合。与Ad6区基本上相似的核酸区具有至少65％，至少75％，至少85％，至少95％，至少99％或100％的核苷酸序列同一性；或具有1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15，1-16，1-17，1-18，1-19，1-20，1-25，1-30，1-35，1-40，1-45，或1-50个核苷酸的核苷酸差别。在上文的I.B.节中披露了用于确定基本上相似的核酸序列的技术和实施方案。
重组Ad6核酸优选包括编码不存在于Ad6中的多肽的表达盒。表达盒的例子包括编码HCV区的表达盒，和编码其他类型多肽的表达盒。
可以采用不同量的Ad6生产不同类型的腺病毒载体，如第一代和第二代腺病毒载体。正如在上文的II.A.节中所指出的，第一代腺病毒栽体是E1缺陷型的，并且在提供反式E1时能够复制。
第二代腺病毒载体包括比第一代载体少的腺病毒基因组，并且可用于与互补的细胞系和/或补充腺病毒蛋白的辅助载体连接。在不同的参考文献中，披露了第二代腺病毒载体，如Russell，Journal ofGeneral Virology 81：2573-2604，2000；Hitt等，1997，HumanAd vectors for Gene Transfer，Advances in Pharmacology，Vol40Academic Press。
在本发明的实施方案中，Ad6重组核酸是E1缺陷型腺病毒载体，它能够在补充反式E1时复制。可以将表达盒插入缺失的E1区和/或缺失的E3区。
具有在缺失的E1区提供的表达盒的基于Ad6的腺病毒载体的例子包括以下成分或由其组成：
a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的E1平行或E1反向平行取向的基因表达盒；
c)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；
d)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；
e)与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对28134到大约碱基对30817或从相当于Ad6的大约碱基对28157到大约碱基对30788的任选存在的第四个区；
f)从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第五腺病毒区，其中，如果存在第四区，所述第五区与所述第四区连接，或如果不存在所述第四区，所述第五区与第三区连接；和
g)与所述第五区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第六腺病毒区；
其中，存在至少一个Ad6区。
在本发明的不同实施方案中，以上所有区都来自Ad6；除第一和第二区外所有的区都来自Ad6；而选自第二，第三，第四，和第五区的1，2，3或4个区来自Ad6.
具有在缺失的E3区提供的表达盒的基于Ad6的腺病毒载体的例子包括以下成分或由其组成：
a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；
c)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；
d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；
e)与所述基因表达盒连接的相当于从Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区；
其中，存在至少一个Ad6区。
在本发明的不同实施方案中，以上所有区都来自Ad6；除第一和第二区外所有的区都来自Ad6；而选自第二，第三，第四，和第五区的1，2，3或4个区来自Ad6.
IV.载体生产
可以用重组核酸技术生产载体，如包括使用限制酶，核酸连接，和同源重组的技术。重组核酸技术为本领域所熟知(Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-1998，和Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2＇dEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
利用中间载体驱动治疗性载体，或将表达盒或它的一部分从一种载体转移到另一种载体。中间载体的例子包括腺病毒基因组质粒和穿梭载体。
中间载体上的有用元件包括复制起点，选择标记，同源重组区，和常见的限制位点。可以利用常见的限制位点促进核酸序列的克隆或释放。
同源重组区提供了与另一种核酸分子上的目标区同源的核酸序列区。该同源区位于要插入所述目标区的核酸序列侧翼。在不同实施方案中，同源区的长度优选为大约150-600个核苷酸，或长度为大约100-500个核苷酸。
本发明的一种实施方案披露了包括Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒，选择标记，细菌复制起点，导向于要插入或取代E1区的表达盒的第一腺病毒同源区和第二腺病毒同源区的穿梭载体。所述第一和第二同源区位于所述表达盒侧翼。第一同源区包括至少大约100个碱基对，它们基本上与野生型腺病毒区的大约碱基对4-450的至少右侧末端(3′末端)同源。第二同源区包括至少大约100个碱基对，它们基本上与Ad5的大约碱基到3511-5792的至少左侧末端(5’末端)或来自另一种腺病毒的相应区同源。
所提到的“基本上同源”表示与目标区特异性重组的足够的同源性程度。在不同实施方案中，基本上同源表示至少85％，至少95％或100％的序列同一性。序列同一性可以按照上文I.B.节中所披露的方法进行。
生产腺病毒载体的一种方法是通过产生包括一个表达盒的腺病毒基因组质粒。前腺病毒质粒包括在需要的互补细胞系中复制所需要的所有腺病毒序列。然后用限制酶消化所述前腺病毒质粒，以便释放病毒ITR′s，并且转染到所述互补细胞系中，进行病毒回收。ITR′s必须从质粒序列上释放，以便能够进行复制。腺病毒载体回收导致了含有所述表达盒的腺病毒载体的产生。
A.腺病毒基因组质粒
腺病毒基因组质粒包括存在于较大长度质粒(它可以是粘粒)上的腺病毒载体序列。所述较大长度的质粒可以包括其他元件，如根据生产和保持所述质粒所采用的方法，有助于真核细胞或细菌细胞生长和选择的元件。用于生产腺病毒基因组质粒的技术，包括与使用穿梭载体和同源重组相关的技术，和与将基因表达盒插入腺病毒粘粒相关的技术(Hitt等，Methods in Molecular Genetics 7：13-30，1995，Danthinne等，Gene Therapy7：1707-1714，2000)。
腺病毒基因组质粒优选具有插入E1或E3缺失区的基因表达盒。在本发明的一种实施方案中，所述腺病毒基因组质粒包括插入E1缺失区的基因表达盒，复制起点，选择标记，和重组腺病毒区，该腺病毒区由以下成分组成：
a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的E1平行或E1反向平行取向的基因表达盒；
c)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；
d)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；
e)与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；
f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区；和
g)相当于存在于Ad5或Ad6中的E3区的全部或一部分的任选存在的E3区，根据需要的腺病毒载体的总体大小，可以提供较小的插入片段。
在本发明的另一实施方案中，所述重组腺病毒基因组质粒具有插入到E3缺失区的基因表达盒。所述载体包括复制起点，选择标记，和以下部分：
a)从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述表达盒连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；
c)与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；
d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；
e)与所述基因表达盒结合的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。
在不同实施方案中，存在相关的腺病毒区：
(1)相当于Ad5的第一，第二，第三，第四和第五区；
(2)相当于Ad6的第一，第二，第三，第四和第五区；和
(3)相当于Ad5的第一区，相当于Ad5的第二区，相当于Ad6的第三区，相当于Ad6的第四区和相当于Ad5的第五区。
本发明的一种实施方案披露了一种制备腺病毒载体的方法，包括生产腺病毒基因组质粒的同源重组步骤和腺病毒回收步骤。所述同源重组步骤包括使用其侧翼为腺病毒同源区的包括Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的穿梭载体。所述腺病毒同源区将表达盒导向于E1或E3缺失区。
在本发明的一种实施方案中，涉及生产腺病毒基因组质粒，将基因表达盒插入载体，包括：从相当于Ad5或Ad6的大约碱基对1到大约碱基对450的第一腺病毒区；与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对3511到大约碱基对5548或从相当于Ad6的大约碱基对3508到大约碱基对5541的第二腺病毒区；与所述第二区连接的从相当于Ad5的大约碱基对5549到大约碱基对28133或从相当于Ad6的大约碱基对5542到大约碱基对28156的第三腺病毒区；与所述第三区连接的从相当于Ad5的大约碱基对30818到大约碱基对33966或从相当于Ad6的大约碱基对30789到大约碱基对33784的第四腺病毒区；和与所述第四区连接的从相当于Ad5的大约碱基对33967到大约碱基对35935或从相当于Ad6的大约碱基对33785到大约碱基对35759的第五腺病毒区。所述腺病毒基因组质粒应当包括复制起点和选择标记，并且可以包括Ad5或Ad6的B3区的全部或一部分。
在涉及腺病毒区的不同实施方案中，存在：(1)相当于Ad5的第一，第二，第三，第四和第五区；(2)相当于Ad6的第一，第二，第三，第四和第五区；和(3)相当于Ad5的第一区，相当于Ad5的第二区，相当于Ad6的第三区，相当于Ad6的第四区，和相当于Ad5的第五区。
B.腺病毒载体回收
可以用本领城已知的或本文所披露的技术，从重组腺病毒基因组质粒中回收腺病毒载体。用于回收腺病毒的技术的例子为本领域所熟知，并且披露于以下文献中：Hitt等，Methods in Molecular Genetics7：13-30，1995，和Danthinne等，Gene Therapy7：1707-1714，2000.
回收本文所披露的腺病毒载体的优选方法，包括加强腺病毒复制。例如，加强腺病毒复制可以通过在独立的载体上补充腺病毒功能，如E2蛋白(聚合酶，前末端蛋白和DNA结合蛋白)以及E4或f6进行。下面的实施例10披露了加强腺病毒复制，以便回收包括密码子优化的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒的腺病毒载体。
V.部分优化的HCV编码序列
HCV多蛋白编码核酸的部分优化提供了优化用于在人体内表达的较少量的密码子而不是全面优化。总体目标是提供由于密码子优化而产生的增强表达的优点，同时有利于生产包括具有优化密码子的HCV多蛋白编码核酸的腺病毒载体。
HCV多蛋白编码序列的完全优化，提供了每一种氨基酸的最常见的人密码子。完全优化可以用本领域所熟知的密码子频率表进行，并且使用诸如BACKTRANSLATE的程序(Wisconsin Package version 10，Genetics Computer Group，GCG，Madison，Wisc.)。
部分优化可以对所存在的完整HCV多蛋白编码序列(例如，NS3-NS5B)进行，或对存在的一个或多个局部区域进行。在不同实施方案中，所存在的完整HCV编码多肽的GC含量不超过至少大约65％；并且一个或多个局部区域的GC含量不超过大约70％。
局部区域是存在于HCV编码核酸中的区域，并且其大小可以改变。例如，局部区域的长度可以为大约60，大约70，大约80，大约90或大约100个核苷酸。
部分优化可以通过首先构建要根据天然存在的序列部分优化的HCV编码多蛋白序列而实现。另外，可以将优化的HCV编码序列用作比较的基础，以便产生部分优化的序列。
VI.HCV组合治疗
可以使用HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B疫苗本身来治疗患者，可以与其他HCV治疗剂组合使用，并且可以与针对其他类型疾病的试剂一起使用。其他治疗剂包括治疗HCV和具有高的HCV感染倾向人体内的疾病的其他治疗剂。针对其他类型疾病的试剂包括针对HIV和HBV的疫苗。
用于治疗HCV的其他治疗剂，包括疫苗和非疫苗制剂(Zein，Expert Opin.Investig.Drugs 10：1457-1469，2001)。其他HCV疫苗的例子包括为了诱导针对HCV核心抗原和HCV E1，E2或p7区的免疫反应而设计的疫苗。疫苗成分可以是天然存在的HCV多肽，HCV模拟表位(mimotope)多肽或编码序列所述多肽的核酸。
HCV模拟表位多肽包括HCV表位，但是具有与天然存在的HCV抗原不同的序列。HCV模拟表位可以与天然存在的HCV抗原融合。在以下文献中，提供了披露用于生产模拟表位的一般性技术的参考文献，并且披露了不同的HCV模拟表位：Felici等，美国专利号5,994，083和Nicosia等，国际申请号WO 99/60132。
VII.药物施用
可以采用本文所提供的说明以及本领城所熟知的技术，制备并且给患者施用HCV疫苗。例如，一般性药物施用的指南披露于以下文献中：Modern Vaccinology，Ed.Kurstak，Plenum Med.Co.1994；Remington′s Pharmaceutical Sciences 18thEdition，Ed.Gennaro，Mack Publishing，1990；和Modern Pharmaceutics2＂dEdition，Eds.Banker和Rhodes，Marcel Dekker，Inc.，1990，其中的每一份文献都被收作本文参考。
HCV疫苗可以通过不同途径施用，如静脉内，腹膜内，皮下，肌内，真皮内，通过皮肤的按压或鼻内途径。优选的途径是肌内途径。
肌内施用可以使用不同的技术进行，例如通过使用或不用一个或多个电脉冲注射。电介导的转移，可能有利于通过刺激体液和细胞免疫反应进行遗传学免疫。
疫苗注射可以用不同的技术进行，如通过采用针头注射系统或无针头注射系统。无针头注射系统的例子是喷射注射装置(Donnelly等，国际公开号WO 99/52463)。
A.电介导的转移
电介导的转移或基因电-转移(GET)，可以通过在核酸注射之后输送合适的电脉冲进行(参见Mathiesen，国际公开号WO98/43702)。质粒注射和电穿孔可以用不锈钢针头进行。针头是成对的，三联的或更复杂的形式的。在一种设计中，将所述针头焊接在印刷电路板上，所述电路板是机械支持物，并且通过合适的电缆将针头与电场发生器连接在一起。
以电脉冲形式提供电刺激。脉冲可以具有不同的形式(矩形，正弦，三角形，指数衰减)和不同的极性(具有阳性或阴性极性的单极，双极)。脉冲可以以稳定的电压或稳定的电流形式输送。
可以利用不同形式的电治疗，将包括HCV的核酸疫苗和其他核酸疫苗导入患者体内。可行的电治疗方式包括以下方案：
治疗1：每隔1秒钟输送10串1000个矩形双极脉冲，脉冲长度为0.2毫秒/相，频率为1000Hz，稳定电压模式，45伏/相，浮动电流。
治疗2：每隔1秒钟输送2串100个矩形双极脉冲，脉冲长度为2毫秒/相，频率为100Hz，稳定电流模式，100毫安/相，浮动电压。
治疗3：2串双极脉冲，脉冲长度为大约2毫秒/相，总长度为大约3秒钟，其中，穿过组织的实际电流固定在大约50毫安。
电脉冲是通过电场发生器输送的。合适的发生器可以包括3个独立的硬件部件，它们组装于一个共同的底盘，并且通过便携式PC运行驱动程序驱动。所述软件同时管理基础功能和辅助功能。该装置的部件包括：(1)通过微处理器驱动的信号发生器，(2)电放大器和(3)数字示波器。
所述信号发生器，在特定范围内在软件控制下输送具有任意频率和形状的信号。所述相同的软件具有用于要输送的波形的相互作用编辑器，所述发生器涉及一种数字控制的电流限制装置(控制最大电流输出的安全装置)。所述电力放大器可以将所产生的信号放大到+/-150V。所述示波器是数字化的，并且能够对由所述放大器输送的电压和电流进行取样。
B.药用载体
可以药用的载体有利于疫苗的保存和给对象施用。在本文中披露了可以药用的载体的例子。其他可以药用的载体为本领域所熟知。
可以药用的载体可以包括不同的成分，如缓冲液，普通盐水或磷酸缓冲的盐水，蔗糖，盐和聚山梨酸酯。可以药用的载体的例子如下：2.5-10mMTRIS缓冲液，优选大约5mM TRIS缓冲液；25-100mM NaCl，优选大约75mM NaCl；2.5-10％蔗糖，优选大约5％蔗糖；0.01-2mMMgCl2；和0.001％-0.01％聚山梨醇酯80(来自植物的)。PH优选为大约7.0-9.0，更优选大约8.0。载体的一种具体例子包括5mMTRIS，75mM NaCl，5％蔗糖，1mM MgCl2，0.005％聚山梨醇酯80，pH8.0。
C.用药方案
可以根据特定疫苗效力和诸如患者年龄，体重，性别和医学状况等因素；施用途径；需要的效果；以及用药次数，确定合适的用药方案。特定疫苗的效力取决于不同因素，如特定疫苗产生多肽的能力，所述多肽是在细胞中表达和加工的，并且以I类和II类MHC复合物的形式出现。
给患者施用的HCV编码核酸可以是包括病毒载体在内的不同类型载体的一部分，如腺病毒载体，和DNA质粒疫苗。在涉及施用DNA质粒的不同实施方案中，给患者施用大约0.1-10mg质粒，以及给患者施用大约1-5mg质粒。在涉及施用病毒载体，优选腺病毒载体的不同实施方案中，给患者施用大约105-1011病毒颗粒，以及给患者施用大约107-1010病毒颗粒。
病毒载体疫苗和DNA质粒疫苗可以单独施用，或者可以作为激发和加强施用方案的一部分。激发和加强接种的一种混合形式，包括用DNA激发和用病毒载体疫苗加强，或用病毒载体疫苗激发和用DNA疫苗加强。
可以使用多次激发，例如大约2-4次或更多次。激发和加强之间的时间长度，通常从大约4个月到1年，不过，可以采用其他时间方案。采用DNA疫苗的激发方案，可优选用于患有以前存在的腺病毒免疫反应的患者的场合。
在本发明的一种实施方案中，将1×107-1×1012腺病毒载体颗粒，优选大约1×1010-1×1011腺病毒载体颗粒直接施用于肌肉组织中。在初次接种之后，用腺病毒载体或DNA疫苗进行加强。
在本发明的另一种实施方案中，初次的接是通过直接进入肌肉组织中的DNA疫苗进行的。在初次免疫之后，用腺病毒载体或DNA疫苗进行加强。
可以同时施用诸如白介素-12，GM-CSF，B7-1，B7-2，IP10，Mig-1的试剂，以便加强免疫反应。所述试剂可以作为蛋白施用，或者通过使用核酸载体施用。
D.异源激发-加强
异源激发-加强是一种混合形式，它包括使用一种类型的病毒载体进行激发，而用另一种类型的病毒载体进行加强。所述异源激发-加强可包括相关的载体，如基于不同腺病毒血清型的载体，以及关系更远的病毒，如腺病毒和痘病毒。在以下文献中披露了利用痘病毒和腺病毒载体防止小鼠出现疟疾：Gilbert等，Vaccine20：1039-1045，2002。
涉及激发和加强的不同实施方案，包括表达所需抗原的以下类型的载体，如Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B：Ad5载体，随后是Ad6载体；Ad6载体，随后是Ad5载体；Ad5载体，随后是痘病毒载体；痘病毒载体，随后是Ad5载体；Ad6载体，随后是痘病毒载体；和痘病毒栽体，随后是Ad6载体。
激发和加强之间的时间长度，通常为大约4个月到1年，不过，可以使用其他时间方案。最低时间方案应当足够允许免疫学休息。在一种实施方案中，这种休息是为期至少6个月的时间。激发可能包括用一种类型的载体多次激发，如激发2-4次。
存在于水痘病毒载体中的表达盒，应当包括一个激发子，该激发子是天然的，或源于感兴趣的痘病毒或其他痘病毒成员。构建和使用不同类型的痘病毒型载体的不同方法，包括基于痘苗病毒，修饰过的痘苗病毒，禽痘病毒，浣熊痘病毒，修饰过的痘苗病毒Ankara，金丝雀痘病毒(如ALVAC)，禽痘病毒，牛痘病毒，和NYVAC的载体是本领域所熟知的(Moss，Current Topics in Microbiology andImmunology 158：25-38，1982；Earl等，In Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等eds.，New York：GreenePublishing Associates & Wiley Interscience；1991：16.16.1-16.16.7，Child等，Virology 174(2)：625-9，1990；Tartaglia等，Virology 188：217-232，1992；美国专利号4,603,112，4，722，848，4,769,330，5,110,587，5,174,993，5,185,146，5,266,313，5,505,941，5,863,542，和5,942,235)。
E.佐剂
HCV疫苗可以与佐剂一起配制。对于DNA质粒疫苗来说，佐剂是特别有用的。佐剂的例子包括明矾，A1PO4，alhydrogel，脂质-A及其衍生物或变体，弗氏不完全佐剂，中性脂质体，含有疫苗和细胞因子的脂质体，非离子型嵌段共聚物和趋化因子。
含有聚环氧乙烷(POE)和聚环氧丙烷(POP)的非离子型嵌段聚合物，如POE-POP-POE嵌段共聚物可以用作佐剂(Newman等，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems15：89-142，1998)。可以用与阴离子型表面活性剂组合的非离子型嵌段共聚物增强核酸的免疫反应。
佐剂制剂的一种具体例子是含有CRL-1005(CytRx ResearchLaboratories)，DNA，和benzylalkonium chloride (BAK)的制剂。该制剂可以通过使用正位移移液管将纯的聚合物添加到溶解在PBS中的质粒DNA的冷却(<5℃)溶液中而制备。然后对该溶液进行涡旋搅拌，以便使所述聚合物溶解。在所述聚合物完全溶解之后，在低于所述聚合物的絮凝点(大约6-7℃)的温度下获得了透明溶液。然后通过缓慢添加溶解在PBS中的BAK的稀释溶液，将大约4mMBAK添加到溶解在PBS中的DNA/CRL-1005溶液中。在添加聚合物和BAK之前，最初DNA浓度为大约6mg/mL，而最终DNA浓度为大约5mg/mL。在添加BAK之后，对该制剂进行充分涡旋搅拌，然后使它的温度提高到高于絮凝点大约2℃.冷却和混合同时使它的温度提高到高于絮凝点大约2℃，重复进行若干次，直到该制剂的粒度为大约200-500nm，该粒度是通过动态光学散射测定的。然后将该溶液保存在冰上一直到该溶液透明，然后放在-70℃下保存。在使用之前，让该溶液在室温下解冻。
F.疫苗保存
可以利用不同类型的缓冲液保存腺病毒载体和DNA疫苗。例如，可以用下面的实施例9中所披露的缓冲液A105保存载体。
通过清除或螯合微量金属离子，可以改善对DNA的保存。可以将琥珀酸或苹果酸的试剂和螯合剂用于改善DNA疫苗的稳定性。螯合剂的例子包括多种磷酸配体和BDTA。添加诸如乙醇或甘油的非还原性自由基清除剂还可以防止因为自由基的产生对DNA质粒的破坏。另外，在所述制剂中可以控制缓冲液的类型，pH，盐浓度，光照，以及消毒方法的类型，以便优化所述DNA疫苗的稳定性。
VII.实施例
提供下面的实施例是为了进一步说明本发明的不同特征。这些实施例还说明了可用于实施本发明的方法。这些实施例没有限定要求保护的本发明。
实施例1：Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表达盒
根据1b亚型HCVBK菌株构建了编码HCV NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的不同的基因表达盒。所编码的序列具有下列任一种序列：(1)活性NS5B序列(″NS″)，(2)失活的NS5B序列(″NSmut″)，(3)具有失活的NS5B序列的密码子优化序列(″NSOPTmut″)。所述表达盒还包括CMV激发子/增强子和BGH聚腺苷酸化信号。
NS核苷酸序列(SEQ.ID.NO.5)与HCV BK菌株GenBank保藏号M58335相比，在5952个核苷酸中有30个核苷酸不同。NS氨基酸序列(SEQ.ID.NO.6)与相应的1b基因型HCV BK菌株在1984个氨基酸中有7个氨基酸不同。为了能够起始翻译，在NS序列的5＇末端存在一个ATG密码子。在NS序列的3′末端存在一个TGA终止序列。
NSmut核苷酸序列(SEQ.ID.NO.2，图2)与NS序列相似。NSmut和NS之间的差别包括NSmut具有改变了的NS5B催化位点；在5＇末端具有一个最佳核糖体结合位点；以及在3′末端具有一个TAAA终止序列。NS5B上的改变包括5138-5146号碱基，这些碱基编码1711-1713号氨基酸。所述改变导致了氨基酸GlyAspAsp改变成AlaAlaGly，并且产生了失活形式的NS5B RNA-依赖型RNA-聚合酶NS5B.
NSOPTmut序列(SEQ.ID.NO.3，图3)是根据由NSmut编码的氨基酸序列设计的。使用GCG(Wisconsin Package version 10，Genetics Computer Group，GCG，Madison，Wisc)BACKTRANSLATB程序将NSmut氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列。为了制备NSOPTmut核苷酸序列，其中的每一种氨基酸是由相应的最常见的人密码子编码的，该程序是这样进行的：选择最可能的氨基酸序列的产生作参数，并且规定在GCG软件包内可获得的高度表达的人基因(human-high.cod)的密码子频率表作为翻译方案。
实施例2：制备具有NS，NSmut或NSOPTmut序列的pVlJns质粒
含有NS，NSmut或NSOPTmut序列的pV1Jns质粒是通过以下方法制备和表征的：
具有NS序列的pV1Jns质粒
将来自HCV BK型菌株的编码区Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A和编码区Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B(Tomei等，J.Virol.67：4017-4026，1993)克隆到pcDNA3质粒(Invitrogen)上，分别制备pcD3-5a和pcD3-5b载体。用HindIII消化PcD3-5A，用Klenow填充片段补平末端，随后用XbaI消化，以便产生相当于Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A的编码区的片段。将该片段克隆到pVlJns-poly上，用Bg1II消化，用Klenow填充片段补平末端，随后用XbaI消化，制备pV1JnsNS3-5A。
pV1Jns-poly是pV1JnsA质粒的衍生物(Montgomery等，DNA andCell Biol.12：777-783，1993)，通过将含有XbaI，PmeI，PacI的识别位点的多接头插入独特的BglII和NotI限制位点进行修饰。具有NS序列的pVlJns质粒(pV1JnsNS3-5B)是通过以下方法获得的：同源重组到细菌菌株BJ5183中，用通过XbaI和NotI消化线性化的pV1JNS3-5A和含有大约200 bp的NS5A，NS5B编码序列和大约60 bp的BGH聚腺苷酸化信号共转化。所得到的质粒被称为pV1Jns-NS.
pV1Jns-NS可以归纳如下：
碱基 pV1JnsA的1-1881号碱基
一个额外的 AGCTT
随后是 Met-NS3-NS5B序列(SEQ.ID.NO.5)
然后是 wt TGA终止子
一个额外的 TCTAGAGCGTTTAAACCCTTAATTAAGG(SEQ.ID.NO.14)
碱基 pV1JnsA的1912-4909号碱基
具有NSmut序列的pV1Jns质粒
通过添加完整Kozak序列修饰V1JnsNS3-5A质粒的5＇末端的NS3编码序列。该质粒(V1JNS3-5Akozak)是通过重组到细菌菌株BJ5183中，用通过A/HI消化线性化的V 1JNS3-5A和包括内含子A的近端部分，限制位点BglII，完整的Kozak翻译起始序列和NS3编码序列的一部分的PCR片段共转化获得的。
通过用Xba I消化使所得到的质粒(V1JNS3-5Akozak)线性化，并且与包括大约200bp的NS5A，NS5B突变序列，强翻译终止序列TAAA和大约60 bp的BGH聚腺苷酸化信号的PCR片段一起共转化到细菌菌株BJ5183中。所述PCR片段是通过组装两个22bp的重叠片段获得，其中，通过用于扩增它们的寡核苷酸引入了突变。所得到的质粒被称pV1Jns-NSmut。
pV1Jns-NSmut可以归纳如下：
碱基 pV1JnsA的1-1882号碱基
随后是 kozak Met-NS3-NS5B(mut)TAAA序列(SEQ.ID.NO.2)
一个额外的 TCTAGA
碱基 pV1JnsA的1925-4909号碱基
具有NSOPTmut序列的pVIJns质粒
通过位于该基因5’和3’末端的BamHI和SalI限制位点消化人密码子优化的合成基因(NSOPTmut)，它具有突变的NS5B，以便破坏酶促活性，完整的Kozak翻译起始序列和强翻译终止序列。然后将该基因克隆到存在于V1JnsA质粒的多接头上的Bg1II和SalI限制位点上，以便产生V1Jns-NSOPTmut.
pV1Jns-NSOPTmut可以归纳如下：
碱基 pV1JnsA的1-1881号碱基
一个额外的 C
然后是 kozak Met-NS3-NS5B(optmut)TAAA序列(SEQ.ID.NO.3)
一个额外的 TTTAAATGTTTAAAC(SEQ.ID.NO.15)
碱基 pV1JnsA的1905-4909号碱基
质粒表征
通过转染在补充了L-谷氨酰胺(最终浓度4mM)的10％FCS/DMEM中生长的SEK293细胞，测试HCV NS蛋白的表述。在转染之前24小时，将细胞铺平板到直径35毫米的6个孔中，以便在转染的当天到达90％-95％的铺满度。使用LIPOFECTAMINE 2000试剂，用40纳克质粒DNA(事先确定为非饱和DNA用量)和100纳克含有Rous肉瘤病毒激发子控制的荧光素酶报导基因的pRSV-Luc质粒共转染。在37℃下，将细胞保持在CO2培养箱中48小时。
用1％ Triton/TEN缓冲液制备细胞提取物。将所述提取物的荧光素酶活性标准化，并且在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上对系列稀释液进行电泳。将蛋白转移到硝酸纤维素上，并且用针对NS3，NS5A和NS5B的抗体分析，以便评估表达强度和正确的蛋白水解裂解。用模拟转染的细胞作为阴性对照。在图12中示出了来自测试pV1JnsNS，pV1JnsNSmut和pV1JnsNSOPTmut的典型实验的结果。
实施例3：用质粒DNA载体对小鼠进行免疫
将DNA质粒pV1Jns-NS，pV1Jns-NSmut和pV1JnsNSOPTmut注射到不同的小鼠株中，以便评估它们诱导抗HCV免疫反应的潜力。两个不同的株(Balb/C和C57Black6，N＝9-10)用25或50μg的DNA进行肌内注射，随后进行电脉冲。每一只动物每隔3周接受2个剂量。
在两次用药之后，通过对细菌表达的NS3蛋白酶结构域进行ELISA，测定在C57BIack6小鼠体内诱导的针对NS3蛋白的体液免疫反应。在用所有三种载体免疫的动物体内检测到对测试抗原特异的抗体，几何平均效价(GMT)在94000-133000范围内(表1-3)。
表1：pV1jns-NS
表2：pV1jns-NSmut
表3：pV1jns-NSOPTmut
在以3周的间隔2次肌内注射25μg质粒DNA免疫的C57BIack6小鼠体内检测到T细胞反应。进行定量ELIspot分析，以便测定对二十聚体肽的五种合并物有反应的IFNγ分泌T细胞的数量，所述肽有10个残基的重叠，包括NS3-NS5B序列。通过用包括针对C57BIack6小鼠的CD8+表位的二十聚体肽(pep1480)进行相同的测定，分析特异性CD8+反应。
用标准ELIspot分析，检测以抗原特异性形式分泌IFNγ的细胞。通过相同的ELIspot测定分析，以三周的间隔用50μg质粒DNA进行2次肌内注射免疫的C57BIack6小鼠体内的T细胞反应，测定对二十聚体肽的五种合并物有反应的IFNγ分泌T细胞的数量，所述肽具有10个残基的重叠，包括NS3-NS5B序列。
用免疫过的小鼠制备脾细胞，并且重悬浮在R10培养基中(RPMI
1640，补充了10％ FCS，2mM L-谷氨酰胺，50U/ml-50μg/ml青霉素/链霉素，10mM Hepes，50μM2-巯基乙醇)。用纯化的大鼠抗小鼠INFγ抗体(PharMingen，Cat.No.18181D，PharmiMingen，10975Torreyana Road，San Diego，California92121-1111USA)对Multiscreen96-孔过滤平板(Millipore，Cat.No.MAIPS4510，Millipore Corporation，80 Ashby Road Bedford，MA)进行包被。在培养过夜之后，用PBS1X/0.005％Tween洗涤平板，并且用250μl/孔的R10培养基封闭。
用免疫过的小鼠制备脾细胞，并且在存在或不存在10μM肽的条件下，以2.5X105/孔或5×105/孔的密度将它培养24小时。在充分洗涤(PBS1X/0.005％ Tween)之后，添加生物素化的大鼠抗小鼠IFN
γ抗体(PharMingen，Cat.No.18112D，PharMingen，10975TorreyanaRoad，San Diego，California 92121-1111USA)，并且在4℃下培养过夜。为了显影，添加链亲和素-AKP(PharMingen，Cat.No.13043E，PharMingen，10975Torreyana Road，San Diego，California92121-1111USA)和1-StepTMNBT-BCIP显影溶液(Pierce，Cat.No.34042，Pierce，P.O.Box117，Rockford，IL61105USA)。
利用包括HCV BK菌株NS3-NS5B的完整序列的二十聚体重叠肽的合并物显示HCV-特异性IFNγ-分泌T细胞。同样，将包括针对C57Black6小鼠的CD8+表位的单一的二十聚体肽用于检测CD8反应。在图13A和13B中示出了来自通过两次注射25或50μg质粒载体pV1Jns-NS，pV1Jns-NSmut和pV1Jns-NSOPTmut免疫的C57Black6和Balb/C小鼠(N＝9-10)组的代表性数据。
实施例4：猕猴的免疫
通过肌内注射溶解在7.5mg/ml CRL1005，洁尔灭0.6mM中的5mg质粒pV1Jns-NSOPTmut对猕猴(N＝3)进行免疫。在0和4周在每只动物的三角肌注射两剂。
通过IFN-γ ELISPOT在不同的时间点测定CMI。该分析测定了HCV抗原特异性CD8+和CD4+T淋巴细胞反应，并且可用于多种哺乳动物，如人，猕猴，小鼠和大鼠。
特定肽或肽合并物的使用可以简化在CTL细胞毒性分析，干扰素-γ ELISPOT分析和干扰素-γ细胞内染色分析中的抗原呈递。制备基于各种HCV蛋白的氨基酸序列的肽(核心，E2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)，以便用于在所述分析中测定在HCV DNA和腺病毒载体免疫的猕猴和HCV-感染的人体内的免疫反应。各个的肽是重叠的20-聚体，错开10个氨基酸。可以将肽的大的合并物用于检测对HCV蛋白的总体反应，而将较小的合并物和各个肽用于确定一种反应的表位特异性。
IFNγELISPOT
IFNγ-BLISPOT分析能提供HCV特异性T淋巴细胞反应的定量测定。对PBMC进行系列稀释，并且放入用抗猕猴IFN-γ抗体(MD-1 U-Cytech)包被的微量滴定板的孔中。用HCV肽合并物将它们培养20小时，导致了前体细胞和IFN-γ分泌的再刺激。洗掉所述细胞，留下与细胞附着的浓集区上的抗体包被的孔结合的分泌的IFN。用生物素化的抗猕猴IFN抗体(detector Ab U-Cytech)，随后用碱性磷酸酶偶联的链亲和素(Pharmingen13043E)检测捕获的IFN。添加不溶性碱性磷酸酶底物，导致了在所述孔中细胞所在的位置出现暗斑，为分泌IFN-γ的每一个T细胞留下一个斑点。
每个孔的斑点的数量与抗原特异性T细胞的前体频率直接相关。在该分析中选择干扰素γ作为观察的细胞因子(使用物种特异性抗γ干扰素单克隆抗体)，因为它是最常见的，并且是由激活的T淋巴细胞合成和分泌的最丰富的细胞因子之一。对于该分析来说，在存在和不存在(培养基对照)肽抗原的情况下，测定样品的每一百万PBMCs中成斑细胞(SFC)的数量。在表4中示出了在施用两种物质之后来自猕猴的PBMC的数据。
表4
来自通过两次注射5mgDNA/剂免疫的猕猴的PBMC的INFγBLISPOT，存在于质粒pV1Jns-NSOPTmut的OPTIVAX/BAK中。数据是以SFC7106PBMC形式表达的。
实施例5：Ad6前-腺病毒质粒的构建
Ad6前-腺病毒质粒是通过以下方法获得的：
构建pAd6E1-E3+前-腺病毒质粒
利用Ad5和Ad6之间的广泛序列同一性(大约98％)或仅包括Ad6区，构建可用于制备第一代Ad6载体的基于Ad6的前-腺病毒质粒。利用同源重组将wtAd6序列克隆到细菌质粒中。
在图10中示出了用于以含有Ad5和Ad6区的细菌质粒形式回收pAd6E1-E3+的一般方法。用纯化的wtAd6病毒DNA和被称为Ad5ITR盒的第二种DNA片段共转化BJ5183细菌，导致了通过同源重组产生的病毒基因组环化。ITR盒包括来自由包括细菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因的质粒序列隔开的Ad5基因组的右侧末端(碱基对33798-35935)和左侧末端(碱基对1-341和碱基对3525-5767)序列。ITR盒包括来自Ad5342-3524的E1序列的缺失。ITR盒中的Ad5序列提供了与纯化的Ad5病毒DNA同源的区，其中，在该区可以发生重组。
通过限制分析，筛选潜在克隆，并且选择一个克隆作为pAd6E1-E3+。然后对该克隆进行全面测序。pAd6E1-E3+包括从碱基对1-341和碱基对3525-5548的Ad5序列，Ad6碱基对5542-33784，Ad5碱基对33967-35935(对于Ad5和Ad6来说，碱基编号是相对wt序列而言的)。pAd6E1-E3+包括所有Ad6毒粒结构蛋白的编码序列，构成了它的野生型特异性。
在图11中示出了用于以含有Ad6区的细菌质粒形式回收pAd6E1-E3+的一般方法。用纯化的wt Ad6病毒DNA和被称为Ad6 ITR盒的第二种DNA片段共转化BJ 5183细菌，导致了通过同源重组产生的病毒基因组环化。ITR盒包括来自由包括细菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因的质粒序列隔开的Ad6基因组的右侧末端(碱基对35460-35759)和左侧末端(碱基对1-450和碱基对3508-3807)序列。这三种片段是通过PCR产生的，并且随后克隆到NEB193中，产生了pNEBAd6-3(ITR盒)。ITR盒包括Ad5的451-3507的E1序列的缺失。ITR盒中的Ad6序列提供了与纯化的Ad6病毒DNA同源的区，其中，可以发生重组。
pAd6E1-E3-前-腺病毒质粒的构建
用含有Ad5区的pAd6E1-E3+作起点，构建了含有Ad5区，并且在E3区有缺失的Ad6型载体。将含有E3区(Ad6碱基对25871-31192)的pAd6E1-B3+的5322bp的亚片段亚克隆到pABS.3上，产生pABSAd6E3。然后在该质粒上产生3个E3缺失，产生了三种新的质粒pABSAd6E3(1.8Kb)(缺失了Ad6的碱基对28602-30440)，pABSAd6E3(2.3Kb)(缺失了Ad6的碱基对28157-30437)和pABSAd6E3(2.6Kb)(缺失了Ad6的碱基对28157-30788)。然后利用细菌重组将3个E3缺失取代返回到pAd6E1-E3+中，产生Ad6基因组质粒pAd6E1-E3-1.8Kb，pAd6E1-E3-2.3Kb和pAd6E1-B3-2.6Kb.
实施例6：制备具有NS序列的Ad5基因组质粒
通过XmnI和NruI限制位点消化含有编码区NS3-NS4A-NS4B-NS5A的pcDNA3质粒(Invitrogen)，并且将含有CMV激发子，NS3-NS4ANS4B-NS5A编码序列和牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号的DNA片段克隆到穿梭载体pDelElSpa的独将的EcorV限制位点上，产生了Sva3-5A载体。
用XmnI和EcorI消化(部分消化)含有编码区NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的pcDNA3质粒，并且将含有部分NS5A，NS5B基因和BGH聚腺苷酸化信号的DNA片段克隆到Sva3-5A载体上，用EcorI和BglII消化，用Klenow补平末端，产生了Sva3-5B载体。
最后通过SspI和Bst1107I限制位点消化Sva3-5B载体，并且将含有其侧翼为腺病毒序列的表达盒(CMV激发子，NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B编码序列和BGH聚腺苷酸化信号)的DNA片段与Ad5HVO(E1-，B3-)ClaI线性化的基因组质粒一起共转化到细菌菌株BJ5183中，产生pAd5HVONS。pAd5HVO包括Ad5碱基对1-341，碱基对3525-28133和碱基对30818-35935.
实施例7：制备具有Nsmut序列的腺病毒基因组质粒
在Ad5或Ad6背景中，制备含有NS-mut序列的腺病毒基因组质粒。Ad6背景包括Ad5区的1-450，3511-5548和33967-35935号碱基。
用BglII和XbaI限制酶消化pV1JNS3-5Akozak，并且将含有Kozak序列和编码NS3-NS4A-NS4B-NS5A的序列的DNA片段克隆到BglII和XbaI消化过的polypMRKpdelE1穿梭载体中。所得到的载体被命名为shNS3-5Akozak.
PolypMRKpdelE1是RkpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVmin+BGHpA(str)的衍生物。通过在CMV激发子下游的独特BglII限制位点上插入包括BglII，PmeI，SwaI，XbaI，SalI识别位点的多接头进行过修饰。MRKpdelE1(Pac/pIX/pack450)+CMVmin+BGHpA(str)包括Ad5序列的碱基对1-5792，具有E1序列的碱基对451-3510的缺失。将人CMV激发子和BGH聚腺苷酸化信号以E1平行取向插入E1缺失区，通过一个独特的BglII位点分隔它们。
通过组装PCR并且通过同源重组插入shNS3-Sakozak载体，获得了NS5B片段，该片段发生了突变以便破坏了酶促活性，并且在3’末端具有强的翻译终止序列，产生了polypMRKpdelE1NSmut。在polypMRKpdelB1NSmut中，NS-mut编码序列受CMV激发子的控制，并且BGH聚腺苷酸化信号存在于下游。
通过用PadI和Bst1107I限制酶切除所述基因表达盒和包括可以进行同源重组的腺病毒序列的侧翼区，并且与pAd5HVO(E1-，E3-)或pAd6E1-E3-2.6Kb ClaI线性化的基因组质粒共同转化细菌菌株BJ5183，以便分别产生pAd5HVONSmut和pAd6E1-，E3-Nsmut。
pAd6E1-E3-2.6Kb包括Ad5碱基对1-341和碱基对3525-5548，Ad6碱基对5542-28157和碱基对30788-33784，和Ad5碱基对33967-35935(对于Ad5和Ad6来说，碱基对编号是相对wt序列而言)。在这两种质粒上，病毒ITR＇s是通过包括细菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因的质粒序列连接的。
实施例8：具有NSOPTmut的腺病毒基因组质粒的制备
用BamH1和SalI限制酶消化由克隆到pCRBlunt载体(Invitrogen)上的SEQ.ID.NO.3提供的人密码子优化的合成基因(NSOPTmut)，并且克隆到存在于穿梭载体pMRKpdelE1上的BglII和SalI限制位点上。所得到的克隆(polypMRKpdelE1NSOPTmut)用PacI和Bst1107I限制酶消化，并且与pAd5HVO(E1-，E3-)或pAd6B1-E3-2.6KbClaI线性化的基因组质粒一起共同转化到细菌菌株BJ5183中，分别产生pAd5HVONSOPTmut和pAd6E1-，E3-NSOPTmut。
实施例9：腺病毒载体的回收和扩增
在Per.6细胞中回收腺病毒载体。Per.C6是在补充了L-谷氨酰胺(最终浓度为4mM)，青霉素/链霉素(最终浓度为100IU/ml)和10 mMMgCl2的10％ FCS/DMEM中生长的。在感染之后，将细胞保持在补充了5％马血清(HS)的相同培养基中。为了进行病毒回收，将2.5×106Per.C6铺平板到直径为6cm的Petri培养皿中。
在铺平板24小时之后，通过磷酸钙方法，用10μg的Pac I线性化的腺病毒DNA转染细胞。将所述DNA沉淀留在细胞上4小时时间。去掉所述培养基，并且添加5％HS/DMEM.
将细胞保持在CO2培养箱中，直到出现细胞致病作用(1周)。回收细胞和上清液，并且进行3次冷冻/解冻循环(液氮/37℃的水浴)。在-4℃下，以3000 rpm的速度对裂解物进行离心20分钟，并且以每个培养皿1毫升的用量，使用所回收的上清液(相当于包括仅在细胞上传代1次的病毒的细胞裂解液；P1)，以便感染在直径10厘米的Petri培养皿中达到80％-90％铺满度的Per.C6。培养感染的细胞，直到出现细胞致病作用，回收细胞和上清液，并且按上述方法制备裂解液(P2)。
将P2裂解液(4ml)用于感染2×15cm的Petri培养皿。将从该感染中回收的裂解液(P3)，以等份样品形式在-80℃下保存，作为病毒的原种，以便用作大规模病毒制备的原材料。在这种情况下，1ml的原种就足以感染直径为2×15cm的Petri培养皿，并且将所得到的裂解液(P4)用于感染要进行大规模感染的Petri培养皿。
进一步的扩增是用P4裂解液进行的，该裂解液用不含FCS的培养基稀释，并且用于以每个培养皿10ml的用量感染30×15cm的Petri培养皿(Per.C6达到80％-90％的铺满度)。在CO2培养箱中培养细胞1小时，每隔20分钟进行轻微混合。在每个培养皿中添加12ml5％HS/DMEM，并且培养细胞直到出现细胞病理效应(大约48小时)。
收集细胞和上清液，并且在4℃下以2K rpm的速度离心20分钟。将沉淀重新悬浮在15ml0.1 M Tris，pH＝8.0中。通过3次冷冻/解冻循环裂解细胞(液氨/37℃的水浴)。添加150μl的2MMgCl2和75μl的DNAse(溶解在10ml的20mM Tris-HCl pH＝7.4中的10mg牛胰腺脱氧核糖核酸酶I，50mM NaCl，1mM二硫苏糖醇，0.1mg/ml牛血清白蛋白，50％甘油)，在37℃的水浴中培养1小时之后(每隔15分钟涡旋搅拌1次)，在4℃下以4K rpm的速度对裂解液进行15分钟的离心。所回收的上清液可以加样到CsCl梯度上。CsCl梯度是按以下方法在SW40超透明试管中制备的：
0.5ml的1.5d CsCl
3ml的1.35d CsCl
3ml的1.25d CsCl，在每个试管中加样5ml的病毒上清液。
如果必要的话，在所述试管上面放置0.1M tris-Cl，pH＝8.0。用转子SW40，在10℃下以35Krpm将试管离心1小时。用注射器收集病毒带(位于1.25/1.35的界面上)。
将所述病毒转移到新的SW40超透明试管中，并且将1.35dCsCl添加在试管的顶部。用转子SW40，在10℃下以35K rpm将试管离心24小时，然后以尽可能小的体积收集病毒，并且用缓冲液A105(5mMTris，5％蔗糖，75mMNaCl，1mM MgCl2，0.005％聚山梨醇酯80，pH＝8.0)充分透析。在透析之后，以10％的最终浓度添加甘油，并且在-80℃下，以等分样品的形式保存病毒。
实施例10：改善了的腺病毒载体回收
发现具有HCV NSOPTmut转基因的第一代Ad5和Ad6载体难以回收。回收过程的一个可能的障碍可能是因为质粒DNA不能有效复制，它是腺病毒复制机制的一种亚最佳模板。与DNA的5’末端连接的末端蛋白的缺乏(通常存在于病毒DNA中)，与插入所述载体的E1区中的转基因的极高G-C含量相关，可能导致质粒衍生的腺病毒复制速度的显著降低。
为了建立回收Ad载体的更有效的和可再现的方法，采用了包括受tet-诱导型激发子控制的所有E2蛋白(聚合酶，前末端蛋白和DNA结合蛋白)，以及E4orf6的表达载体(pE2；图19)。PE2的转染与PerC6和293中的正常前腺病毒质粒的组合，导致了Ad DNA复制的显著增强，并且导致了完整感染性腺病毒颗粒的更有效的产生。
质粒构建
pE2是基于克隆载体pBII(CLONTECH)的，具有两个附加元件，以便能够进行附加型复制，并且在细胞培养物中选择：(1)EBV-OriP(EBV[nt]7421-8042)区，当EBNA-1表达时，使得质粒能够与细胞周期同步复制，和(2)潮霉素-B磷酸转移酶(HPH)-抗性基因，使得能够阳性选择转化过的细胞。按以下方法构建了腺病毒基因E2a和b以及E4-Orf6的两个转录单位，并且在pE2中进行组装。
Ad5-聚合酶ClaI/Sphl片段和Ad5-pTPAcc65/EcoRV片段是从pVac-Pol和pVac-pTP获得的(Stunnemberg等，NAR16：2431-2444，1988)。用Klenow补平这两个片段，并且克隆到pBI的SalI(补平的)和EcoRV位点上，分别获得了pBI-Pol/pTP。
通过将它克隆到pJC13-1的BamHI位点上，首先将来自pCEP4(Invitrogen)的EBV-OriP元件插入β-珠蛋白绝缘体二聚体中(Chung等，Cell74(3)：505-14，1993)。然后将来自pJC13-OriP的HS4-OriP片段克隆到pSAlmv(一种含有tk-Hygro-B抗性基因表达盒和Ad5复制起点的质粒)内部，通过PCR由pFG140获得了首尾连接排列的ITR＇s(Graham，EMBO J.3：2917-2922，1984)，用以下引物：5＇-TCGAATCGATACGCGAACCTACGC-3＇(SEQ.ID.NO.16)和5＇-TCGACGTGTCGACTTCGAAGCGCACACCAAAAACGTC-3＇(SEQ.ID.NO.17)，因此产生了pMVHS40rip。然后将来自pMVHS40rip的包括绝缘的OriP，Ad5ITR连接和tk-HygroB盒的DNA片段插入pBI-Pol/pTP载体限制的AseI/AatII，产生了pBI-Pol/pTPHS4.
为了构建能表达Ad5-Orf6和Ad5-DBP的第二种转录单位，首先将通过PCR获得的B4orf6(Ad 5 [nt] 33193-34077)插入pBI载体，产生了pBI-Orf6。然后，将DBP编码DNA序列(Ad5[nt]22443-24032)插入pBI-Orf6，获得了第二种双向Tet-调节的表达载体(pBI-DBPB4orf6)。用BGH和SV40polyA取代存在于pBI中的原始polyA信号。
然后通过插入包括Adeno5-ITRs的DNA片段，修饰pBI-DBP/E4orf6，它们是以首尾连接形式排列的，还包括从质粒pSA-1mv中获得的潮霉素B抗性基因。然后将新的质粒pBIDBP/E4orf6shuttle用作供体质粒，以便用大肠杆菌菌株BJ5183进行同源重组，将第二种tet-调节的转录单位插入pBI-Pol/pTPHS4中，获得pE2。
细胞系，转染和病毒扩增
在补充了10％胎牛血清(FBS)，10mMMgCl2，青霉素(100U/ml)，链霉素(100ug/ml)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基(DMEM)中培养PerC6细胞。
所有瞬时转染都是按照生产商披露的方法用Lipofectamine2000(Invitrogen)进行的。用PacI消化过的3.5μg的Ad5/6NSOPTmut前-腺病毒质粒自身或与5μg pE2加1μg pUHD52.1组合转染生长在6cm平板上的铺满度为90％的PERC.6TM.pUHD52.1是反向tet反式激活蛋白2(rtTA2)的表达载体(Urlinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(14)：7963-7968，2000)。在转染时，细胞是在存在1μg/ml多西环素的条件下培养的，以便激活pE2表达。在转染之后7天收获细胞，并且通过3次冷冻/解冻循环获得细胞裂解液。将2ml细胞裂解液用于感染第二个6cm培养皿的PerC6。培养感染的细胞，直到出现完整的CPE，然后收获。按上述方法让病毒顺序传代5次，然后在氯化铯梯度上纯化。纯化病毒的DNA结构是通过内切核酸酶消化和琼脂糖凝胶电泳分析控制的，并且与原始前腺病毒质粒限制图谱进行比较。
实施例11：HCV多蛋白编码核酸的部分优化
进行HCV多蛋白编码核酸的部分优化，以便促进包括用于在人宿主中表达的优化密码子的腺病毒载体的产生。总体目标是提供由于密码子优化而产生的增强的表达，同时促进编码HCV多蛋白的腺病毒载体的产生。
在生产编码HCV多蛋白的具有在人宿主中表达的优化密码子的腺病毒载体时，遇到了若干种难题。发现包括优化序列(SEQ.ID.NO.3)的腺病毒载体，比包括非优化序列(SEQ.ID.NO.2)的腺病毒载体更难以合成和回收。
生产包括SEQ.ID.NO.3腺病毒载体的难题是由于高的GC含量。特别有问题的区域是在NSOPTmut(SEQ.ID.NO.3)的大约3900号位置。
设计了另一种版本的优化HCV编码核酸序列，以便有利于它在腺病毒载体上的应用。与NSOPTmut相比，将所述另一种版本设计成具有较低的总体GC含量，以便减轻/避免连续的G或C的潜在的有问题的基序的出现，同时保持高水平的密码子优化，以便能够改善所编码的多蛋白和各个裂解产物的表达。
用于制备亚最佳密码子优化序列的起点是NSOPTmut核苷酸序列的编码区(SEQ.ID.NO.3的7-5961号碱基)。密码子使用频率的值(将每一种氨基酸标准化为总共1.0)是从在Wisconsin PackageVersion 10.3中提供件human_high.Cod中获得的(AccelrysInc.，awholly owned subsidiary of Pharmacopeia，Inc)。
为了降低局部和总体GC含量，人工制备了确定每一种氨基酸的优选密码子取代的表格。对于每一种氨基酸来说，所述密码子1)与最常见的密码子相比，具有更低的GC含量，和2)选择出现较高的密码子使用频率(如在human_high.Cod中所定义的)作为取代密码子。例如，对于Arg来说，最高频率的密码子是CGC。在编码Arg的其他五种替代密码子(CGG，AGG，AGA，CGT，CGA)中，有三个(AGG，CGT，CGA)将GC含量降低了1个碱基，有1个(AGA)降低了2个碱基，并且有一个(CGG)降低了0个碱基。由于在human high.Cod中所列举的AGA密码子具有较低的使用频率(0.1)，因此，取代CGC的密码子选择为具有0.18的相对频率的AGG。采用相似的标准，以便建立其他氨基酸的密码子取代，得到表5所示的清单。在以下优化方法中采用的参数是评经验确定的，以便所得到的序列保持显著改善了的密码子使用(对于每一种氨基酸而言)，并且降低GC含量(总体上和连续G和/或C的局部片段形式)。
部分优化的HCV编码序列的两种例子是由SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.11提供的。SEQ.ID.NO.10提供了整体上部分优化的HCV编码序列。SEQ.ID.NO.11提供了密码子使用完全优化的HCV编码序列，只有部分优化的区域例外。
密码子优化是通过以下方法进行的：
步骤1)使用3个密码子的滑动窗口(9个碱基)，每一次循环后使所述窗口移动一个密码子，分析输入的完全优化的NSOPTmut序列的编码区。无论何时在所述窗口中检测到含有5个或5个以上连续C和/或G的片段，都采用以下取代规则：用N表示以前进行的密码子取代的数量。如果N是奇数的话，使用在表5中规定的密码子取代所述窗口中的中间密码子，如果N是偶数的话，使用在诸如human_high.cod.密码子优化表中规定的密码子取代窗口中的第三个末端密码子。如果在第二或第三个密码子存在Leu或Val，不进行任何取代，以便不导入具有很低相对密码子使用频率的Leu或Val密码子(例如，参见human_high.Cod)。在随后的循环中，对包括以前循环的取代的序列进行移动窗口分析。
根据经验发现所述3个密码子窗口中的中间和末端密码子的其他取代，提供了更令人满意的优化密码子使用的总体保持，同时还降低了GC含量(在该方法之后根据最终序列判断)。不过，一般来说，正确的取代方法取决于由接受分析的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，并且必须凭经验确定。
步骤2)然后使用长度为21个密码子(63个碱基)的滑动窗口，对包括在步骤1)中进行的所有密码子取代的序列进行其他分析：根据可判断的参数，确定该窗口中总体GC含量。如果所述窗口中GC含量高于70％的话，就进行以下密码子取代方法：在所述窗口中，用表5中所提供的密码子取代氨基酸Asn，Asp，Cys，Glu，His，Ile，Lys，Phe，Tyr的密码子。对这一组氨基酸的取代的限制受到了以下事实的驱动：a)所述取代密码子仍然具有可接受的在human_high.Cod中的高的使用频率，和b)取代密码子的CUTG中的平均总体人密码子使用几乎与最常见的密码子一样高。在以下循环中，对包括前面循环的取代的序列进行移动窗口的分析。
通过GC含量总体上的降低和各个氨基酸的高密码子优化的保持之间的折中，凭经验确定70％的阈值。与步骤1)一样，确切的取代方法(氨基酸和GC含量阈值的选择)，同样取决于由接受分析的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，并且必须凭经验确定。
步骤3)然后人工编辑通过步骤1)和2)产生的序列，并且按照以下标准改变其他密码子：人工检查在具有21个密码子的窗口上GC含量仍然高于70％的区域，并且按照表5中提供的方案再次取代少数密码子。
进行随后的步骤，以便提供有用的限制位点，去掉互补链上的可能的开放读框，添加同源重组区，添加Kozac信号，并且添加一个终止子。这些步骤的编号为4-7。
步骤4)检查步骤3)中所产生的序列的某些限制位点(BglII，PmeI和XbaI)的缺乏和仅有一个StuI位点的存在，以便可以进行随后的使用一小类显著酶的克隆策略。通过取代作为相应识别位点的一部分的密码子，从所述序列中去掉两个位点(一个BglII位点，以及一个StuI位点)。
步骤5)然后相应修饰通过步骤1)-4)制备的序列，以便随后产生修饰过的NSOPTmut序列(通过同源重组)。在通过步骤1)-4)获得的序列中，包括3556-3755号碱基的片段和包括4456-4656号碱基的片段被来自NSOPTmut的相应的片段所取代。包括SEQ.ID.NO.10的3556-4656号碱基的片段可用于通过同源重组取代NSOPTmut上的有问题的区域(3900号位置附近)，由此产生了具有SEQ.ID.NO.11的序列的NSOPTmut的变体。
步骤6)分析在步骤1)-5)产生的序列，发现了一个潜在的、几乎跨越互补链上的完整片段的开放读框。从所述有义链上去掉所有密码子CTA和TTA(Leu)和TCA(Ser)，能够有效除去所述互补链上的一个读框中的所有终止密码子。尽管转录该互补链开放读框，以及随后翻译成蛋白的可能性非常小，为了排除对有义链上的编码的序列的转录和随后翻译的潜在的干扰，大约每隔500个碱基，将编码Ser的TCA密码子导入所述有义链。在步骤5)中导入的片段中没有引入变化，以便可以进行同源重组。编码Ser的TCA密码子优于编码Leu的CTA和TTA密码子，因为与human_high。Cod中的CTA(0.02)和TTA(0.03)相比，TCA具有更高的相对频率(0.05)。另外，来自CUTG的平均人密码子使用，倾向于TCA(对于CTA和TTA来说为0.14和0.07)。
步骤7)在最后一个步骤中，将GCCACC添加到该序列的5’末端，以便产生一个优化的内部核糖体进入位点(Kozak信号)，并且在3’末端添加一个TAAA终止信号。为了保持NSsuboptmut的翻译特性的激发，所述编码区的前8个密码子保持与NSOPTmut序列相同。再次检查所得到的序列上BglII，PmeI和XbaI识别位点的缺乏，和仅有一个StuI位点的存在。
与NSOPTmut(70.3％)相比，NSsuboptmut序列(SEQ.ID.NO.10)具有总体上较低的GC含量(63.5％)，并且保持密码子使用优化的良好优化水平。NSsuboptmut与NSmut的核苷酸序列同一性为77.2％。
表5：在步骤1)和步骤2)期间进行的密码子取代的定义
实施例12：病毒表征
通过以下方法表征腺病毒载体：(a)测定物理学颗粒/ml；(b)进行TaqMan PCR分析；和(c)在感染HeLa细胞之后检查蛋白表达。
a)物理颗粒测定
以1/10和1/100的比例用0.1％SDS PBS稀释氯化铯纯化的病毒。作为对照，使用缓冲液A105。在55℃下将所述稀释液培养10分钟，在对所述试管进行短时间离心之后，测定260nm下的O.D.。按以下方法计算病毒颗粒的数量：1OD260nm＝1.1X1012物理颗粒/ml。以上结果通常在5×1011和1×1012物理颗粒/ml范围内。
b)TaqMan PCR分析
将TaqMan PCR分析用于进行腺病毒载体基因组定量(Q-PCR颗粒/ml)。用ABI Prism 7700-序列检测仪进行TaqMan PCR分析。该反应是在50μl的最终体积中，在存在寡核苷酸(最终浓度200nM)和对腺病毒主链特异的探针(最终浓度200μM)的条件下进行的。用0.1％SDSPBS以1/10的比例稀释所述病毒，并且在55℃下培养10分钟。在对所述试管进行简单离心之后，制备系列的1/10稀释液(用水稀释)。将10μl的10-3，10-5和10-7稀释液用作PCR测定的模板。
根据在相同实验中产生的标准曲线，计算存在于每一种样品中的颗粒的数量。典型的结果为1×1012至3×1012Q-PCR颗粒/ml。
c)HCV非结构蛋白的表达
通过感染HeLa细胞检测HCV NS蛋白的表达。在感染前一天，以1.5×106细胞/皿(直径10 cm的Petri培养皿)的密度将细胞铺平板。将相当于m.o.i.50，250和1250pp/细胞的不同数量的氯化铯纯化的病毒稀释在培养基(无FCS)中，达到5ml的最终体积。将稀释过的病毒添加到所述细胞上，并且在37℃下，在CO2培养箱中培养1小时(每隔20分钟进行轻柔混合)。添加5ml 5％HS-DMEM，并且在37℃下将所述细胞培养48小时。
用 1 ％ Triton/TEN缓冲液制备细胞提取物。在10％ SDS-丙烯酰胺凝胶上对提取物进行电泳，吸印到硝酸纤维素膜上，并且用针对NS3，NS5a和NS5b的抗体分析，以便检查正确的多蛋白裂解。将模拟感染的细胞用作阴性对照。在图14中示出了来自测试Ad5-NS，MRKAd5-NSmut，MRKAd6-NSmut和MRKAd6-NSOPTmut的典型实验的结果。
实施例13：用编码不同NS盒的腺病毒栽体对小鼠进行免疫
将腺病毒载体Ad5-NS，MRKAd5-NSmut，MRKAd6-NSmut和MRKAd6-NSOPTmut注射到C57Black6小鼠株中，以便评估它们诱导抗HCV免疫反应的潜力。用109pp的CsCl纯化的病毒肌内注射各组动物(n＝9-10)。每只动物以三周的间隔接受两剂。
通过在用药之后对细菌表达的NS3蛋白酶结构域进行ELISA分析，测定在用药之后来自C57Black6免疫小鼠的两种血清中针对NS3蛋白的体液免疫反应。检测的对测试抗原特异的抗体的几何平均效价(GMT)为100-46000(表6，7，8和9)。
表6：Ad5-NS
表7：Ad5-Nsmut
表8：MRKAd5-Nsmut
表9：MRKAd6-NSmut
通过定量ELISPOT测定分析TC57Black6小鼠体内的T细胞反应，其中测定对20聚体的五种合并物(从F到L+M命名)的反应的IFN-γ分泌T细胞的数量，所述肽有10个残基的重叠，包括NS3-NS5B序列。通过相同的测定，使用包括C57Black6小鼠的CD8+表位(pep1480)的20聚体肽，分析在C57Black6小鼠体内诱导的特异性CD8+反应。通过标准ELIspot测定，检测以抗原特异性方式分泌IFNγ的细胞。
按上面实施例3所示方法生产并且处理脾细胞和肽。在图15中示出了来自通过两次注射109载体Ad5-NS，MRKAd5-Nsmut和MRKAd6-Nsmut的病毒颗粒免疫的C57BIack6小鼠组(N＝9-10)的代表性数据。
例14：用腺病毒载体对猕猴进行免疫
通过肌内注射氯化铯纯化的Ad5-NS，MRKAd5-NSmut，MRKAd6-Nsmut或MRKAd6-NSOPTmut病毒，对猕猴(N＝3-4)进行免疫。在第0和第4周，每只动物在三角肌处接受两剂1011或1010vp。
在不同的时间点通过以下方法测定CMI：a)IFN-γ ELISPOT(参见上文的实施例3)，b)IFN-γ ICS，和c)大量CTL分析。以上分析方法确定了HCV抗原特异性CD8+和CD4+T淋巴细胞反应，并且可用于多种哺乳动物，如人，猕猴，小鼠和大鼠。
特定肽或肽合并物的使用，可以简化在CTL细胞毒性分析，干扰素-γELISPOT分析，和干扰素-γ细胞内染色分析中的抗原呈递。制备基于各种HCV蛋白的氨基酸序列的肽(核心，E2，NS3，NS4A，NS4B，NS5a，NS5b)，以便在所述分析中用于测定HCVDNA和腺病毒载体免疫的猕猴，以及HCV感染的人体内的免疫反应。所述各个肽是重叠的20聚体，错开10个氨基酸。可以将大的肽合并物用于检测对HCV蛋白的总体反应，同时，可以将较小的合并物和各个肽用于确定一种反应的表位特异性。
IFN-γ1CS
对于IFN-γICS来说，用肽合并抗原刺激存在于1mlR10(补充了10％FCS的RPMI培养基)中的2×106PBMC。每一种肽的最终浓度为2μg/ml。在37℃下，在CO2培养箱中将细胞培养1小时，然后以10
μg/ml的最终浓度添加BrefeldinA，以便抑制可溶性细胞因子的分泌。在37℃下将细胞再培养14-16小时。
在存在以下共刺激抗体的条件下进行刺激：CD28和CD49d(抗人CD28BD340975和抗人CD49d BD340976)。在培养之后，用表面抗原的荧光染料偶联的抗体对细胞进行染色：抗-CD3，抗-CD4，抗-CD8(CD3-APC Biosource APS0301，CD4-PE BD345769，CD8-PerCPBD345774)。
为了检测细胞内细胞因子，用FACS透化缓冲液2(BD340973)，2x最终浓度处理细胞。一旦固定和透化，用抗人IFN-γ，IFN-γFITC(Biosource AHC4338)的抗体培养细胞。
将细胞重新悬浮在用PBS制备的1％甲醛中，并且在24小时之内，在FACS上分析。在装有两种激光的FACSCalibur仪器(BectonDickinson)上进行四色FACS分析。通过门控与CD3，CD8阳性细胞群偶联的正向与侧向散射中的淋巴细胞群获得数据。获得了所述门的至少30,000个事件。阳性细胞是以106淋巴细胞中IFN-γ表达细胞的数量形式表达的。
在图16A-16D，17A和17B中，报导了在一次或两次注射1010或1011vp不同腺病毒载体之后从免疫过的猴获得的IFN-γELISPOT和IFN-γICS数据。
大量CTL分析
T淋巴细胞的区分效应物功能，是这种细胞群体的亚型直接裂解具有合适的MHC-相关抗原肽的细胞的能力。这种细胞毒性活性最常见的是与CD8+T淋巴细胞相关。
在体外用能表达HCV抗原的重组疫苗病毒感染PBMC样品大约14天，以便提供记忆T细胞的抗原再刺激和扩增。测试了针对用肽抗原合并物处理过的自体B细胞系的细胞毒性。
所述培养物的裂解功能，是以在用CTL效应细胞培养4小时期间，由靶细胞释放的铬导致的特异性裂解的百分比形式测定的。测定特异性细胞毒性，并且与不相关的抗原或赋形剂处理过的B细胞系进行比较。这种分析是半定量的，并且是确定CTL反应是否是由疫苗引起的优选方式。在图18A-18F中示出了在两次注射1011vp/剂和腺病毒载体Ad5-NS，MRKAd5-Nsmut和MRKAd6-Nsmut之后，来自免疫过的猴的数据。
其他实施方案在以下权利要求范围内。尽管业已示出了和说明了若干种实施方案，在不超出本发明构思和范围的前提下，可以进行各种改进。
Claims (42)
1.一种编码SEQ ID NO：1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列。
2.如权利要求1的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQID NO：2的编码序列。
3.如权利要求1的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQID NO：3，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的编码序列。
4.如权利要求1的核酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQ IDNO：3的编码序列。
5.一种表达载体，其包含权利要求1-4中任意一项的核苷酸序列，其中所述表达载体能够在人细胞中由所述核苷酸序列表达所述多肽。
6.一种核酸，包括能够表达SEQ.ID.NO.1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表达盒，所述基因表达盒包括：
a)与编码所述多肽的核苷酸序列转录性偶联的启动子；
b)与所述核苷酸序列功能性偶联的5′核糖体结合位点；
c)与所述核苷酸序列的3′末端连接的终止子；和
d)与所述核苷酸序列功能性偶联的3′聚腺苷酸化信号。
7.如权利要求6的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
8.如权利要求7的核酸，其中，所述核酸是适合给人施用的质粒，并且还包括原核复制起点和编码选择标记的基因。
9.如权利要求8的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的编码序列。
10.如权利要求9的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的编码序列。
11.如权利要求8的核酸，其中，所述启动子是包含内含子A的人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5’核糖体结合位点为SEQ IDNO：12，并且所述3’聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
12.如权利要求7的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因组质粒，它的组成是选择标记，复制起点，和包括E1缺失，E3缺失和所述表达盒的重组腺病毒载体基因组。
13.如权利要求7的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因组质粒，它的组成选择标记，复制起点，和
a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的E1平行或E1反向平行取向的基因表达盒；
c)与所述表达盒连接的从Ad5的碱基对3511到碱基对5548的第二腺病毒区或从Ad6的碱基对3508到碱基对5541的第二腺病毒区；
d)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542到碱基对28156的第三腺病毒区；
e)与所述第三区连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
14.如权利要求13的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是Ad5，所述第四区是Ad5，并且所述第五区是Ad5。
15.如权利要求14的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5’核糖体结合位点为SEQ ID NO：12，并且所述3’聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
16.如权利要求15的核酸，其中，所述表达盒是E1反向平行取向的，并且所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：10或SEQ ID NO：11。
17.如权利要求13的核酸，其中，所述第一区为Ad5或Ad6，所述第二区为Ad5或Ad6，所述第三区为Ad6，所述第四区为Ad6，并且所述第五区为Ad5或Ad6。
18.如权利要求17的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5′核糖体结合位点为SEQ ID NO：12，并且所述3′聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
19.如权利要求18的核酸，其中，所述表达盒是E1反向平行取向的，并且所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：10或SEQ ID NO：11。
20.如权利要求18的核酸，其中，所述表达盒是E1反向平行取向的，并且所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
21.如权利要求7的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因组质粒，它包括复制起点，选择标记，和
a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的Ad5的碱基对3511到碱基对5548或从Ad6的碱基对3508到碱基对5541的第二腺病毒区；
c)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542到碱基对28156的第三腺病毒区；
d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；
e)与所述基因表达盒连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
22.如权利要求21的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是Ad5，所述第四区是Ad5，所述第五区是Ad5。
23.如权利要求22的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5′核糖体结合位点为SEQ ID NO：12，并且所述3′聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
24.如权利要求21的核酸，其中，所述第一区是Ad5或Ad6，所述第二区是Ad5或Ad6，所述第三区是Ad6，所述第四区是Ad6，所述第五区是Ad5或Ad6。
25.如权利要求24的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5′核糖体结合位点为SEQ ID NO：12，并且所述3′聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
26.如权利要求7的核酸，其中，所述核酸是由包括E1缺失、E3缺失、和所述表达盒的腺病毒载体基因组组成的腺病毒载体。
27.如权利要求7的核酸，其中，所述核酸是腺病毒载体，它包括：
a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的E1平行或E1反向平行取向的基因表达盒；
c)与所述表达盒连接的从Ad5的碱基对3511到碱基对5548或从Ad6的碱基对3508到碱基对5541的第二腺病毒区；
d)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542到碱基对28156的第三腺病毒区；
e)与所述第三区连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
28.如权利要求27的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是Ad5，所述第四区是Ad5，所述第五区是Ad5。
29.如权利要求28的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5′核糖体结合位点为SEQ ID NO：12，并且所述3′聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
30.如权利要求29的核酸，其中，所述表达盒是E1反向平行取向的，并且所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：10或SEQ ID NO：11。
31.如权利要求27的核酸，其中，所述第一区是Ad5或Ad6，所述第二区是Ad5或Ad6，所述第三区是Ad6，所述第四区是Ad6，所述第五区是Ad5或Ad6。
32.如权利要求31的核酸，其中，所述启动子是人立即早期巨细胞病毒启动子，所述5′核糖体结合位点为SEQ ID NO：12，并且所述3′聚腺苷酸化是牛生长激素聚腺苷酸化信号。
33.如权利要求32的核酸，其中，所述表达盒是E1反向平行取向的，并且所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：10或SEQ ID NO：11。
34.如权利要求32的核酸，其中，所述表达盒是E1反向平行取向的，并且所述核苷酸序列是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
35.如权利要求7的核酸，其中，所述核酸是腺病毒载体，它包括：
a)从Ad5或Ad6的碱基对1到碱基对450的第一腺病毒区；
b)与所述第一区连接的从Ad5的碱基对3511到碱基对5548或从Ad6的碱基对3508到碱基对5541的第二腺病毒区；
c)与所述第二区连接的从Ad5的碱基对5549到碱基对28133或从Ad6的碱基对5542到碱基对28156的第三腺病毒区；
d)与所述第三区连接的E3平行或E3反向平行取向的基因表达盒；
e)与所述基因表达盒连接的从Ad5的碱基对30818到碱基对33966或从Ad6的碱基对30789到碱基对33784的第四腺病毒区；和
f)与所述第四区连接的从Ad5的碱基对33967到碱基对35935或从Ad6的碱基对33785到碱基对35759的第五腺病毒区。
36.如权利要求35的核酸，其中，所述第一区是Ad5，所述第二区是Ad5，所述第三区是Ad5，所述第四区是Ad5，所述第五区是Ad5。
37.如权利要求35的核酸，其中，所述第一区是Ad5或Ad6，所述第二区是Ad5或Ad6，所述第三区是Ad6，所述第四区是Ad6，所述第五区是Ad5或Ad6。
38.一种由SEQ ID NO：4或它的衍生物的核酸序列组成的腺病毒载体，其中，所述衍生物具有存在于SEQ ID NO：4中的HCV多蛋白编码序列，该序列被SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11的HCV多蛋白编码序列所取代。
39.一种培养的重组细胞，其包括权利要求5的表达载体。
40.一种培养的重组细胞，其包括权利要求8-25和26-38中任意一项的核酸。
41.一种药物组合物，包括权利要求8-11和26-38中任意一项的核酸，以及可以药用的载体。
42.有效量的如权利要求8-11和26-38中任意一项的核酸在制备治疗HCV感染的药物中的用途。
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