CN1585651A - 将含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法 - Google Patents

将含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于将生物材料灭菌，以降低其中一种或多种活性生物污染物或病原体的含量的方法，所述活性生物污染物或病原体是例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSEs的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。这些方法涉及用辐射法将含有一种或多种非水性溶剂的生物材料灭菌。

Description

将含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法
发明领域
本发明涉及用于将生物材料灭菌，以降低其中一种或多种活性生物污染物或病原体的含量的方法，所述活性生物污染物或病原体是例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSEs的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。本发明特别涉及用辐射法将含有一种或多种非水性溶剂的生物材料灭菌的方法。
发明背景
很多为人、兽医、诊断和/或实验使用而制备的生物材料可能含有有害的和具有潜在危险的生物污染物或病原体，例如病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSEs的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。所以，在产品使用前将任何生物污染物或病原体进行灭活是极为重要的。当将物质直接给药于患者，例如在输血、血液因子替代治疗、器官移植和通过静脉内、肌内或其它形式的注射或输注来进行的人的治疗中，这是尤其关键的。对于含有各种血浆和/或血浆衍生物的在培养基中制备的或者经由细胞或重组细胞培养制备的生物材料或可能遭受支原体菌属、朊病毒、细菌、病毒和其它生物污染物或病原体污染的其它生物材料来说，这也是很关键的。
大多数生产生物材料的操作涉及将生物材料进行关于一种或多种特定生物污染物或病原体的筛选或测试，而不是将污染物或病原体从材料中除去或将之灭活。仅不使用对生物污染物或病原体测试呈阳性的材料。筛选操作的实例包括对来自献血者的人血中的特定病毒进行测试。然而，这样的操作并不总是可靠的，并且不能探测到某些病毒的存在，特别是以非常低的数目存在的病毒。鉴于假阴性结果所带来的后果，这降低了测试的价值或确定性。在某些情况下，例如在获得性免疫缺陷综合症(AIDS)情况下，假阴性结果能够对生命构成威胁。此外，在某些情况下，即使不需要数月，也需要数周才能确定物质是否被污染。此外，迄今为止，没有用于鉴定生物材料内的朊病毒的、适于筛选出潜在供体或感染材料的可靠测试或测定。这使得对于将生物材料内的朊病毒消灭，同时仍然保持材料所要求的活性的有效方法的需要提高了。因此，在制备生物材料的过程中和/或之后，需要使用一定的技术将污染物或病原体杀死或灭活。
这些技术的重要方面是明显不考虑生物材料来源。所有活细胞和多细胞生物体都有可能感染病毒和其它病原体。因此，单细胞天然或重组生物体或组织的产品具有病原体污染的危险性。除了生产性细胞或细胞培养物存在可能被感染的危险性以外，这些和其它生物材料的加工也产生了环境污染的机会。这种感染危险性对于多细胞天然和重组生物体例如转基因动物更明显。值得注意的是，即使是得自不同于人的物种例如转基因植物的产品也有这种危险性，这是由于如上所述的加工污染和在生长设施中的环境污染所致，其中生长设施可能被环境中的病原体或与所需植物一起存在于设施中的感染的生物体污染。例如，预计户外生长的转基因玉米作物在生长季节可能会接触啮齿动物例如小鼠。小鼠可携带严重的人病原体例如经常致命的汉坦病毒。因为这些动物在生长的作物中是不能检测到的，由这些动物散播的病毒可能在收割时进入转基因材料内。实际上，这样的啮齿动物非常难以防治，并且可能在播种、生长、收割或贮藏时接近农作物。同样，由飞行或栖息的鸟类带来的污染可能传播作为鹦鹉热病因物的严重的病原体。因此，无论其来源，任何生物材料都有可能携带严重的病原体，在将这样的材料施用给接受者之前必须将它们除去或灭活。
在进行测定灭活病毒的技术能力的实验过程中，很少使用有关的确切病毒。这是由于对进行试验的工作人员的安全考虑以及与防范设备和废物处理有关的困难和费用。在其场所，使用相同科和纲的模型病毒。一般说来，最难灭活的病毒是那些具有由蛋白质形成的外壳的病毒，而它们当中最难灭活的又是那些具有最小尺寸的病毒，这是大家公认的。这在γ辐射和大多数其它形式的辐射中已经得到证明，之所以如此是因为这些病毒的极小尺寸与很小的基因组有关。辐射到分子上的直接效果的大小与分子大小成正比，就是说，目标分子越大，效果就越好。作为必然的结果，在γ辐射中已经被证实，病毒的基因组越小，灭活病毒所需要的辐射剂量就越高。
在关系到得自人和动物的生物材料的病毒当中，最小的因而也就是最难灭活的病毒属于细小病毒(Parvoviruses)和稍大的包被蛋白质的肝炎病毒。在人中，细小病毒B19和甲型肝炎病毒是所担心的病毒。在得自猪的材料中，相应的最小病毒是猪细小病毒。因为这种病毒对人无害，所以经常被选择作为人B19细小病毒的模型病毒。这种模型细小病毒的灭活例证被看作这样的充分证据，即所使用的方法也会杀死人B19病毒和甲型肝炎病毒，并且通过引申，该方法也会杀死较大和较不难灭活的病毒如HIV、CMV、乙型和丙型肝炎病毒以及其它病毒。
最近的努力集中在将产品中的污染物除去或将之灭活的方法上。这样的方法包括加热处理、过滤和向产品中加入化学灭活剂或增敏剂。
目前的美国食品和药品监督管理局的标准要求是，生物材料的加热处理应当在约60℃加热最少10个小时，而这会对敏感的生物材料造成损害。事实上，加热灭活能够破坏某些生物材料的生物学活性的50％或更多。
过滤涉及对产品进行过滤以便用物理方式除去污染物。遗憾的是，这种方法也会将具有高分子量的产品除去。而且，在某些情况下，小的病毒可能不能通过滤器除去。
化学增敏操作涉及加入与病毒的DNA/RNA结合并通过UV或者其它射线激活的有毒物质。辐射产生反应中间体和/或自由基，其与病毒的DNA/RNA结合，将DNA/RNA骨架中的化学键打破，和/或将其交联或复合，使得病毒不再能够复制。该操作需要将未结合的增敏剂从产品中洗出来，因为增敏剂既使没有诱变和致癌作用，也是有毒性的，所以不能施用给患者。
用γ射线辐射产品是将产品灭菌的另一种方法。当给予高的总剂量时，γ射线能够有效地消灭病毒和细菌(Keathly等人，“辐射后还有生物吗？第2部分”BioPharm July-August，1993，和Leitman，“在预防输血后移植物对宿主疾病的过程中使用血细胞辐射”，TransfusionScience 10：219-239(1989))。然而，本领域发表的文献告戒，γ辐射会损害对辐射敏感的产品，例如血液、血液产品、蛋白质和含蛋白质的产品。特别是，已经证明，高辐射剂量对红细胞、血小板和粒细胞(Leitman)是有害的。美国专利4,620,908揭示，为了保持蛋白质产品的活力，辐射之前必须将蛋白质产品冷冻。该专利认为，“如果使用γ辐射而同时蛋白质材料处于例如室温，该材料也将会遭到彻底的破坏，就是说，材料的活性会变得如此低以至于事实上是无效的”。遗憾的是，很多敏感的生物材料，例如单克隆抗体(Mab)，如果为了辐射目的而经受冷冻然后在给药患者之前融化，就会丧失活力和活性。
鉴于上述困难，仍然需要能够有效地降低活性生物污染物或病原体的水平而同时对材料不造成不利影响的将生物材料灭菌的方法。
当适于作为另外或供选择的细节、特征和/或技术背景的教导时，上述参考文献引入本文以供参考。
发明概述
本发明的目的是解决至少上述问题和/或缺点，和提供至少下文所述的优点。
因此，本发明的目的是提供通过降低活性生物污染物或病原体的水平而同时对材料无不利影响来将生物材料灭菌的方法。本发明的其它目的、特征和优点将在随后的优选实施方案的详细描述中加以阐明，并且通过该描述将会部分地显而易见或通过本发明的实施来获悉。本发明的这些目的和优点可通过说明书和权利要求书中特别指出的组合物和方法来实现和达到。
根据这些和其它的目的，本发明的第一个实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：用射线以能将材料有效灭菌和保护材料免受辐射损害的辐射率将所述生物材料辐射能将材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)将至少一种稳定剂以有效保护所述生物材料免受辐射损害的量加到生物材料中；和(ii)用射线以有效辐射率将所述生物材料辐射能将材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)将生物材料的残余溶剂含量降低到有效保护所述生物材料免受辐射损害的水平；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)将生物材料的温度降低到有效保护生物材料免受辐射损害的水平；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将生物材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)给生物材料施加选自下列的稳定化处理：(a)降低生物材料的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到生物材料中；和(c)降低生物材料的温度；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将生物材料有效灭菌的时间，其中所述稳定化处理和辐射率一起有效地保护生物材料免受辐射损害。
本发明的另一个实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)给生物材料施加至少两种选自下列的稳定化处理：(a)降低生物材料的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到生物材料中；和(c)降低生物材料的温度；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将生物材料有效灭菌的时间，其中所述稳定化处理可以以任何次序进行，并且一起有效地保护生物材料免受辐射损害。
本发明还提供了包含生物材料和非水性溶剂的组合物，其中所述非水性溶剂的量能有效保护制剂在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用。
本发明还提供了包含至少一种生物材料、至少一种非水性溶剂和至少一种稳定剂的组合物，其中所述非水性溶剂和稳定剂以有效保护材料在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的量一起存在。
本发明的其它优点、目的和特征将在随后的描述中部分地提出，并且在进行下列测定后，对于本领域技术人员来说将变得显而易见，或者可通过本发明的实施来获悉。本发明的目的和优点可通过在权利要求书中特别指出的方案来实现和达到。
附图简述
通过下列附图来详细地描述本发明，在附图中，同样的参考数字是指同样的部分，其中：
附图1是表明γ辐射对干燥尿激酶的影响的图，其中所述尿激酶是悬浮在聚丙二醇(PPG)400或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
附图2是表明在不同形式的聚丙二醇存在下辐射后，固定的抗胰岛素单克隆抗体的活性的图。
附图3是表明γ辐射对胰蛋白酶的影响的图，其中所述胰蛋白酶在不同水平的残余溶剂(水)含量下悬浮在聚丙二醇中。
附图4(a)-4(d)表明了在聚丙二醇400(PPG400)和任选清除剂存在下接受γ辐射的猪心脏瓣膜所受的影响。
附图5(a)-5(e)表明了在50％DMSO和任选稳定剂存在下，并且在聚丙二醇400(PPG400)存在下，γ辐射对猪心脏瓣膜尖的影响。
附图6(a)-6(e)表明了γ辐射对冷冻的猪AV心脏瓣膜的影响，其中所述瓣膜浸泡在不同溶剂中，并且在-20℃以1.584kGy/小时的辐射率被辐射至30kGy的总剂量。
附图7(a)-7(h)表明了γ辐射对冷冻的猪AV心脏瓣膜的影响，其中所述瓣膜浸泡在不同溶剂中，并且在-70℃以约6kGy/小时的辐射率被辐射至45kGy的总剂量。
优选实施方案的详细描述
A.定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员所通常理解的相同含义。
除非另有说明，本文所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数含义。
本文所用术语“灭菌”意指将在依据本发明处理的生物材料中发现的至少一种活性生物污染物或病原体的水平降低。
本文所用术语“生物材料”意指任何由活的生物体衍生或获得的物质。生物材料的实例包括但不限于下列：细胞；组织；血液或血液组分；蛋白，包括重组蛋白和转基因蛋白，以及蛋白质性质的材料；酶，包括消化酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；免疫球蛋白，包括单和多免疫球蛋白；植物；食品等。优选的生物材料实例包括但不限于下列：韧带；腱；神经；骨，包括去除矿物质的骨基质、移植物、关节、股骨、股骨头等；牙齿；皮肤移植物；完整或加工过的骨髓，包括骨髓细胞悬浮液；心脏瓣膜；软骨；角膜；动脉和静脉；器官，包括移植器官，例如心脏、肝、肺、肾、肠、胰腺、肢和指；脂质；碳水化合物；胶原，包括天然的、无纤维的(afibrillar)、atelomeric、可溶的和不可熔的、重组和转基因的胶原，二者具有天然序列和改性序列；壳多糖及其衍生物，包括NO-羧基脱乙酰壳多糖(NOCC)；干细胞、朗罕氏细胞岛以及其它移植细胞，包括基因改变的细胞；红细胞；白细胞，包括单核细胞；和血小板。
本文所用术语“非水性溶剂”意指生物材料可溶解或悬浮在其中的除水以外的任何液体，包括无机溶剂和更优选有机溶剂。合适的非水性溶剂的实例包括但不限于下列：烷烃和环烷烃，例如戊烷、2-甲基丁烷(异戊烷)、庚烷、己烷、环戊烷和环己烷；醇，例如甲醇、乙醇、2-甲氧基乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、丁二醇、丙二醇和辛醇；酯，例如乙酸乙酯、乙酸2-甲氧基乙酯、乙酸丁酯和苯甲酸苄酯；芳族化合物，例如苯、甲苯、吡啶、二甲苯；醚，例如乙醚、2-乙氧基乙醚、乙二醇二甲醚和甲基叔丁基醚；醛，例如甲醛和戊二醛；酮，例如丙酮和3-戊酮(二乙基酮)；二醇，包括单体二醇，例如乙二醇和丙二醇，和聚合二醇，例如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，例如PPG 400、PPG 1200和PPG 2000；酸和酸酐，例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸和乙酸酐；油，例如棉籽油、花生油、培养基、聚乙二醇、罂粟籽油、红花油、芝麻油、豆油和植物油；胺和酰胺，例如哌啶、N，N-二甲基乙酰胺和N，N-二甲基甲酰胺；二甲亚砜(DMSO)；腈，例如苯甲腈和乙腈；肼；洗涤剂，例如聚氧乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯(Tween 20)和一油酸酯(Tween 80)、Triton和十二烷基硫酸钠；二硫化碳；卤代溶剂，例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯苯、1，2-二氯乙烷、四氯乙烯和1-氯丁烷；呋喃，例如四氢呋喃；噁烷类，例如1，4-二氧杂环己烷；和甘油/丙三醇。其它优选的非水性溶剂包括甲酰胺；solutol；甘露醇；普罗布考和肉豆蔻酸异丙酯。合适的非水性溶剂的特别优选的实例包括还起稳定剂功能的非水性溶剂，例如乙醇和丙酮。
本文所用术语“生物污染物或病原体”意指这样的生物污染物或病原体，其在直接或间接与生物材料接触时，可以对生物材料或其接受者产生有害的作用。这样的其它生物污染物或病原体包括本领域技术人员已知的通常存在于或感染生物材料的各种各样的病毒、细菌(包括细胞间和细胞内细菌，例如支原体属、尿原体属、nanobacteria、衣原体属、立克次氏体)、酵母、霉菌、真菌、朊病毒或单独或联合引起TSEs的类似物和/或单细胞或多细胞寄生物。其它生物污染物或病原体的实例包括但不限于下列：病毒，例如人免疫缺陷病毒和其它逆转录病毒、疱疹病毒、线状病毒、circoviruses、副粘液病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒(包括甲型、乙型和丙型肝炎病毒及其它们的变种)、痘病毒、披膜病毒、Ebstein-Barr病毒和细小病毒；细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、链球菌属(Streptococcus)以及葡糖球菌属(Staphalococcus)；nanobacteria；寄生虫，例如锥虫属和疟疾寄生虫，包括疟原虫属类；酵母；霉菌；真菌；支原体和尿原体属、衣原体属；立克氏体，例如Coxiella burnetti；和朊病毒以及已知在哺乳动物中单独或联合引起传播性海绵状脑病(TSEs)，例如瘙痒病、传播性貂脑病、慢性消耗病(通常见之于骡、鹿和麋鹿)、猫海绵状脑病、牛海绵状脑病(疯牛病)、Creutzfeld-Jakob病(包括变异的CJD)、致命性家族失眠症、Gerstmann-Straeussler-Scheinker综合症、kuru和Alpers综合症的类似物。本文所用术语“活性生物污染物或病原体”意指这样的生物污染物或病原体，其能够单独或与另一种因子，例如另一种生物污染物或病原体或天然蛋白(野生型或突变型)或抗体联合在生物材料和/或其接受者中产生有害的作用。
本文所用术语“血液组分”意指可以从全血中分离出来的一种或多种组分，包括但不限于下列：细胞血液组分，例如红细胞、白细胞和血小板；血液蛋白，例如血液凝固因子、酶、白蛋白、纤溶酶原、纤维蛋白原和免疫球蛋白；以及液态血液组分，例如血浆、血浆蛋白组分(PPF)、冷凝蛋白、血浆组分和含血浆的组合物。
本文所用术语“细胞血液组分”意指全血的一种或多种组分，包括细胞，例如红细胞、白细胞、干细胞和血小板。
本文所用术语“血液蛋白”意指通常在全血中发现的一种或多种蛋白。在哺乳动物，包括人中发现的血液蛋白的实例包括但不限于下列：凝血蛋白，包括维生素K依赖型，例如因子VII和因子IX，和非维生素K依赖型，例如因子VIII和von Willebrands因子；白蛋白；脂蛋白，包括高密度脂蛋白和低密度脂蛋白；补体蛋白；球蛋白，例如免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和IgE；等。优选的一组血液蛋白包括因子I(纤维蛋白原)、因子II(前凝血酶)、因子III(组织因子)、因子V(前促凝血球蛋白)、因子VI(促凝血球蛋白)、因子VII(前转变素，血清凝血酶原转化)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子XI(血浆促凝血酶原激酶前体)、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII(protransglutamidase)、von Willebrands因子(vWF)、因子Ia、因子IIa、因子IIIa、因子Va、因子VIa、因子VIIa、因子VIIIa、因子Ixa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。另一组优选的血液蛋白包括在红细胞内部发现的蛋白，例如血红蛋白和各种各样的生长因子，以及这些蛋白的衍生物。还有一组优选的血液蛋白类包括在市售的血浆蛋白组分产品例如Plasma-Plex(Centeon/AventisBehring)、Protenate(Baxter Laboratories)、Plasmanate(BayerBiological)和Plasmatein(Alpha Therapeutic)中发现的蛋白。
本文所用术语“液态血液组分”意指全血的一种或多种液态非细胞组分，例如血浆(在凝固前发现的人或动物全血的液态非细胞部分)和血清(在凝固后发现的人或动物全血的液态非细胞部分)。
本文所用术语“生物相容性溶液”意指这样的溶液，生物材料可以暴露于其中，例如通过悬浮或溶解于其中来暴露于其中，并保持活性，即保持其本质的生物或生理特性。
本文所用术语“生物相容性缓冲液”意指具有适于维持其中的材料完整性的pH和渗透特性(例如张力、重量摩尔渗透压浓度和/或有效渗透压)的生物相容性溶液。适宜的生物相容性缓冲液具有4-8.5的pH值，并且是等渗的或仅仅适度低渗或高渗的。对于本领域技术人员来说，生物相容性缓冲液是已知和容易获得的。
本文所用术语“稳定剂”意指将接受辐射的生物材料的损害降低至不足以妨碍材料的安全和有效使用的水平。稳定剂的实例包括但不限于下列：抗氧化剂；自由基清除剂，包括自旋捕获剂，例如叔丁基亚硝基丁烷(tNB)、α-苯基叔丁基硝酮(PBN)、5，5-二甲基吡咯烷-N-氧化物(DMPO)、叔丁基亚硝基苯(BNB)、α-(4-吡啶基-1-氧化物)-N-叔丁基硝酮(4-POBN)和3，5-二溴-4-亚硝基苯磺酸(DBNBS)；联合稳定剂，即能有效猝灭I型和II型光动力反应的稳定剂；和能够稳定结合于其上的分子的配体，例如肝素。稳定剂的优选实例包括但不限于下列：乙醇；丙酮；脂肪酸，包括6，8-二巯基-辛酸(硫辛酸)及其衍生物和类似物(α，β，二氢，二去甲(bisno)和四去甲(tetranor)硫辛酸)，硫辛酸、6，8-二巯基-辛酸、二氢硫辛酸酯(dihydrolopoate)(DL-6，8-二巯基辛酸甲酯)、硫辛酰胺、二去甲甲酯和四去甲二氢硫辛酸、呋喃脂肪酸、油酸和亚油酸以及棕榈酸及其盐和衍生物；黄酮类、phenylpropaniods、和flavenols，例如栎精、芸香苷及其衍生物、芹黄素、氨基黄酮、儿茶素、橙皮苷和柚皮苷；胡萝卜素，包括β-胡萝卜素；Co-Q10；叶黄素；多元醇，例如甘油、甘露醇；糖，例如木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、果糖和海藻糖；氨基酸及其衍生物，例如组氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷氨酸、色氨酸、辛酸钠、N-乙酰色氨酸和蛋氨酸；叠氮化物，例如叠氮化钠；酶，例如超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化氢酶；尿酸及其衍生物，例如1，3-二甲基尿酸和二甲基硫脲；别嘌醇；硫醇，例如谷胱甘肽和还原的谷胱甘肽和半胱氨酸；微量元素，例如硒；维生素，例如维生素A、维生素C(包括其衍生物和盐，例如抗坏血酸纳和棕榈酰抗坏血酸)和维生素E(及其衍生物和盐，例如生育酚乙酸酯和α-tocotrienol)；色满醇-α-C6；6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸(Trolox)和衍生物；体外蛋白，例如明胶和白蛋白；三-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(MCI-186)；西替沃酮；puercetin；柯因；二甲亚砜(DMSO)；哌嗪二乙磺酸(PIPES)；咪唑；甲氧沙林(MOPS)；1，2-二噻烷-4，5-二醇；还原物质，例如丁基化羟基茴香醚(BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)；胆固醇；普罗布考；吲哚衍生物；硫汞撒；拉扎碱和甲磺酸替拉扎特；proanthenols；proanthocyanidins；硫酸铵；Pegorgotein(PEG-SOD)；N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)；4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-醇(Tempol)；抗坏血酸盐、尿酸盐和Trolox C的混合物(Asc/尿酸盐/Trolox C)；蛋白质和肽，例如甘氨酰基甘氨酸和肌肽，其中每一氨基酸可以呈D或L形式；地奥司明；pupurogalin；五倍子酸及其衍生物，包括但不限于五倍子酸丙酯、甲醛次硫酸钠和水飞蓟素。另外优选的稳定剂包括：丙二醇；丁二醇；甲酰胺；solutol；DMEM；五倍子酸丙酯；柠檬酸盐；丙烷二醇；肉豆蔻酸异丙酯；香豆酸；PVP及其混合物。特别优选的实例包括能有效猝灭I型和II型光动力反应的单一稳定剂或稳定剂的联合，以及能够被作为气体施用和/或易于通过蒸发、低压和类似的方法除去的挥发性稳定剂。这样的单一稳定剂或稳定剂的联合在本文中称为“联合稳定剂”。
本文所用术语“残余溶剂含量”意指生物材料中的可自由利用的液体的量或比例。可自由利用的液体意思是存在于被灭菌的生物材料中的、没有结合到或与生物材料一种或多种非液体组分络合的液体，例如水或有机溶剂(例如乙醇、异丙醇、丙酮、聚乙二醇等)。可自由利用的液体包括细胞内的水。本文中作为水提及的残余溶剂含量是指通过FDA批准、改进的Karl Fischer方法(Meyer和Boyd，AnalyticalChem.，31：215-219，1959；May，等人，J.Biol.Standcndization，10：249-259，1982；Centers for Biologics Evaluation and Research，FDA，Docket No.89D-0140，83-93；1990)或近红外线光谱法测定的水平。其它溶剂的残余水平的定量测定可以用本领域众所周知的方法来进行，这取决于所使用的溶剂。残余溶剂与溶质的比例也可以看作是溶质在溶剂内浓度的反映。当如此表示时，溶质的浓度越高，则残余溶剂的量就越低。
本文所用术语“增敏剂”意指这样的物质，其可以选择性地针对病毒、细菌、朊病毒和/或寄生性污染物，使它们对于辐射灭活更加敏感，因此与没有增敏剂相比，就使得有可能使用较低的辐射速度或较低的辐射剂量和/或较短的辐射时间。适宜的增敏剂的实例包括但不限于下列：补骨脂素及其衍生物和类似物(包括3-乙氧羰基补骨脂素)；inactines及其衍生物和类似物；含有卤素取代基和增加水溶性的基团例如季铵离子或磷离子的当归根素、凯林和香豆素；结合核酸的化合物；溴化血卟啉；酞菁染料；红紫素；卟啉；二血卟啉酯的卤化或由金属原子取代的衍生物、血卟啉衍生物；苯并卟啉衍生物、氢化二苯并卟啉二马来酰胺、氢化二苯并卟啉、二氰基二砜、四乙氧羰基氢化二苯并卟啉和四乙氧羰基氢化二苯并卟啉二丙酰胺；阿霉素和柔红霉素，其可以用卤素或金属原子进行修饰；力确兴；BD肽、S2肽；S-303(ALE化合物)；染料，例如金丝桃素、亚甲蓝、曙红、荧光素(及其衍生物)、黄素、份菁染料540；光敏化合物，例如佛手内酯；和SE肽。另外，也可以使用结合到朊病毒并因此增加它们的辐射敏感性的原子。这样的原子的实例是铜离子，其结合到朊病毒蛋白上，并且由于蛋白中Z数目高于其它原子，在辐射特别是γ辐射期间，增加了朊病毒蛋白吸收能量的概率。
本文所用术语“蛋白质性质的材料”意指，由活生物体产生或获得的包含至少一种蛋白质或肽的任何材料。蛋白质性质的材料可以是呈其自然状态，或加工/纯化和/或衍生化后的天然材料，或者是人工制得的材料，其由化学合成或重组/转基因技术制得，并任选经过加工/纯化和/或衍生化。蛋白质性质的材料的实例包括但不限于下列：从细胞培养物制得的蛋白质和肽；奶和其它奶制品；腹水；激素；生长因子；从动物组织提取或分离的材料，包括药物，例如肝素和胰岛素，或植物物质；血浆，包括新鲜的、冷冻的和冻干的血浆，以及血浆蛋白组分；纤维蛋白原及其衍生物、血纤蛋白、血纤蛋白I、血纤蛋白II、可溶性血纤蛋白和血纤蛋白单体、和/或血纤蛋白密封产品；全血；蛋白质C；蛋白质S；α-1抗-胰蛋白酶(α-1蛋白酶抑制剂)；丁基-胆碱酯酶；抗凝血剂，例如香豆素(华法林)；链激酶；组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)；红细胞生成素(EPO)；尿激酶；neupogen；抗-凝血酶-3；α-葡糖苷酶；(胎)牛血清/马血清；肉；免疫球蛋白，包括抗血清、单克隆抗体、多克隆抗体和通过基因工程或制得的抗体；白蛋白；α-球蛋白；β-球蛋白；γ-球蛋白；凝血蛋白；补体蛋白；和干扰素。
本文所用术语“辐射”意指辐射足够的能量，以将被辐射的生物材料中的至少一些组分灭菌。辐射的类型包括但不限于下列：(i)粒子辐射(亚原子粒子如中子、电子和/或质子流)；(ii)电磁辐射(发生于各种电磁场，例如无线电波，可见(单色和多色)和不可见光，红外线、紫外线，X-射线，以及γ射线及其混合物)；和(iii)声音和压力波。这样的射线经常被称做离子(在被辐射的材料中能够产生离子)射线，例如γ射线，和非离子射线，例如可见光。这样的射线源可以是多种多样的，通常，对具体的辐射源的选择并没有严格要求，只要在适当的时间以适当的速度发出足够的辐射来实现灭菌即可。在实践中，γ射线通常由钴和铯的同位素产生，而UV和X射线则分别由辐射UV和X-射线的机器产生，电子通常用于在经由机器产生被称做“E-射束”辐射的方法中灭菌材料。单色和多色的可见光都由机器产生，并且在实践中与由相同或不同机器产生的不可见光，例如红外线和UV联合使用。
本文所用术语“保护”意指将接受辐射的生物材料的任何损害减至不足以妨碍在辐射后安全和有效使用材料的水平。也就是说，与没有存在该物质或方法相比，如果存在的该物质或进行该方法使得材料受到较小的辐射损害，则该物质或方法“保护”生物材料免受辐射损害。因此，在“保护”材料的物质存在或保护材料的方法被实施的情况下，在辐射后可以安全和有效地使用生物材料，但是在同等情况下，如果没有该物质或未实施该方法，辐射后生物材料就不能安全和有效地使用。
如本文所用的，“可接受水平”的损害可根据所用的本发明特定方法的一些特征，例如所用特定生物材料和/或非水性溶剂的性质和特征，和/或接受辐射的生物材料的预期应用来改变，并且可由本领域技术人员凭经验来确定。因此，“不可接受水平”的损害是妨碍被灭菌的生物材料安全有效地使用的损害水平。在给定的生物材料中，特定的损害水平可用本领域技术人员已知的任何方法和技术来确定。
B.特别优选的实施方案
本发明的第一个优选实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：用射线以能将材料有效灭菌和保护材料免受辐射损害的辐射率将所述生物材料辐射能将材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)将至少一种稳定剂以有效保护所述生物材料免受辐射损害的量加到生物材料中；和(ii)用射线以有效辐射率将所述生物材料辐射能将材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)将生物材料的残余溶剂含量降低到有效保护所述生物材料免受辐射损害的水平；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)将生物材料的温度降低到有效保护生物材料免受辐射损害的水平；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将生物材料有效灭菌的时间。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)给生物材料施加选自下列的稳定化处理：(a)降低生物材料的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到生物材料中；和(c)降低生物材料的温度；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将生物材料有效灭菌的时间，其中所述稳定化处理和辐射率一起有效地保护生物材料免受辐射损害。
本发明的另一个优选实施方案涉及用于将对辐射敏感并且含有非水性溶剂的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：(i)给生物材料施加至少两种选自下列的稳定化处理：(a)降低生物材料的残余溶剂含量，(b)将至少一种稳定剂加到生物材料中；和(c)降低生物材料的温度；和(ii)用射线以有效辐射率将生物材料辐射能将生物材料有效灭菌的时间，其中所述稳定化处理可以以任何次序进行，并且一起有效地保护生物材料免受辐射损害。
本发明的另一个优选实施方案涉及包含生物材料和非水性溶剂的组合物，其中所述非水性溶剂的量能有效保护制剂在用辐射灭菌后仍保持其适当且有效的预期应用。
本发明的另一个优选实施方案涉及包含至少一种生物材料、至少一种非水性溶剂和至少一种稳定剂的组合物，其中所述非水性溶剂和稳定剂以有效保护材料在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的量一起存在。
非水性溶剂优选为在辐射下不易于形成自由基的非水性溶剂，更优选为在辐射下不易于形成自由基，并且具有很少或没有溶解氧或其它在辐射下易于形成自由基的气体的非水性溶剂。挥发性非水性溶剂是特别优选的，甚至更特别优选的是其为稳定剂的非水性溶剂，例如乙醇和丙酮。
依据本发明的某些实施方案里，生物材料可含有水与非水性溶剂例如乙醇和/或丙酮的混合物。在这样的实施方案中，非水性溶剂优选为在辐射下不易于形成自由基的非水性溶剂，最优选为在辐射下不易于形成自由基，并且具有很少或没有溶解氧或其它在辐射下易于形成自由基的气体的非水性溶剂。挥发性非水性溶剂是特别优选的，甚至更特别优选的是其为稳定剂的非水性溶剂，例如乙醇和丙酮。
按照本发明的一些方法，在用射线将含有非水性溶剂的生物材料辐射之前加入稳定剂。优选将稳定剂以有效保护生物材料免受辐射损害的量加到含有非水性溶剂的生物材料中。或者，将稳定剂以与非水性溶剂一起有效保护生物材料免受辐射损害的量加到含有非水性溶剂的生物材料中。适宜的稳定剂的量，可以根据所使用的本发明特定方法的某些特征而变化，例如根据所使用的特定的稳定剂和/或接受辐射的含有非水性溶剂的特定生物材料的性质和特征和/或其预期应用而变化，并且可以由本领域技术人员凭经验确定。
按照本发明的一些方法，在用射线将生物材料辐射之前将含有非水性溶剂的生物材料的残余溶剂含量降低。优选将残余溶剂的含量降至能有效保护生物材料免受辐射损害的水平。残余溶剂含量的适宜水平可以根据所使用的本发明特定方法的某些特征而变化，例如根据接受辐射的含有非水性溶剂的特定生物材料的性质和特征和/或其预期应用而变化，并且可以由本领域技术人员凭经验确定。对于有些生物材料，可能要求将残余溶剂含量保持在一个特定范围内，而不是一个具体的值。
根据本发明的一些实施方案，当含有非水性溶剂的生物材料还含有水时，可通过把含有非水性溶剂的生物材料溶解或悬浮于能够溶解水的非水性溶剂中来降低生物材料的残余溶剂(水)的含量。当生物材料是液相时，通过加入液体非水性溶剂将残余溶剂(水)稀释，也可以实现相同结果。优选地，这样的另一种非水性溶剂在辐射下不易于形成自由基，并且具有很少或没有溶解氧或在辐射下易于形成自由基的其它气体。
当含有非水性溶剂的生物材料是液相时，残余溶剂含量的降低可以通过多种方法来实现，例如通过增加溶质浓度来实现。以这种方法，溶解于溶剂内的含有非水性溶剂的生物材料的蛋白质浓度可以增加至一般至少约0.5％，典型地至少约1％，通常至少约5％，优选至少约10％，更优选至少约15％，甚至更优选至少约20％，还甚至更优选至少约25％，而最优选至少约50％。
在本发明的某些实施方案中，可以发现，含有非水性溶剂的特定生物材料的残余溶剂含量是在一个范围内，而不是一个具体值。对于含有非水性溶剂的特定生物材料的优选残余溶剂含量，这样的范围可以由本领域技术人员凭经验确定。
虽然不想受缚于任何可操作性理论，但是据信，残余溶剂含量的降低，降低了含有非水性溶剂的生物材料的自由度，降低了用于自由基产生的目标数目，并限制了这些自由基的溶解度。因此，通过将含有非水性溶剂的生物材料的温度降至低于它的低共熔点或低于它的冰点，或通过玻璃化同样降低生物材料的自由度，也可以达到类似的结果。与其它可以接受的结果相比，这些结果可以容许使用更高的辐射率和/或剂量。因此，本文所述方法可以在任何不导致含有非水性溶剂的生物材料受到不可接受的损害，即会妨碍安全和有效使用生物材料的温度下实施。优选地，本文所述方法在室温或低于室温，例如低于被辐射的含有非水性溶剂的生物材料的低共熔点或冰点的温度下进行。
可以用本领域技术人员已知的，用于从含有非水性溶剂的生物材料中减少溶剂，同时不给生物材料造成不可接受水平的损害的任何方法和技术将含有非水性溶剂的生物材料的残余溶剂含量降低。这样的方法包括但不限于加入溶质、蒸发、浓缩、离心浓缩、玻璃化和喷雾干燥。
用于降低含有非水性溶剂的生物材料的残余溶剂含量的特别优选的方法是冻干。
用于降低含有非水性溶剂的生物材料的残余溶剂含量的另一特别优选的方法是加入溶质。
用于降低含有非水性溶剂的生物材料的残余溶剂含量的另一特别优选的方法是喷雾干燥。
用于降低含有非水性溶剂的生物材料的残余溶剂含量的另一特别优选的方法是是玻璃化法，其可以用本领域技术人员已知的方法和技术来进行，包括加入溶质和/或附加溶质例如蔗糖，以提高含有非水性溶剂的生物材料的低共熔点，然后逐渐给含有非水性溶剂的生物材料施加降低的压力，以除去残余的溶剂。所得玻璃状材料将具有降低的残余溶剂含量。
按照本发明的某些方法，可以用任何本领域技术人员已知且可采用的方法，将欲灭菌的含有非水性溶剂的生物材料固定于固体表面上。例如，可以将欲灭菌的含有非水性溶剂的生物材料作为生物或非生物基质的包被或表面提供。
在本发明方法中使用的辐射可以是任何将被处理的含有非水性溶剂的生物材料有效灭菌的辐射。该辐射可以是粒子辐射，包括E-射束辐射。优选地，该辐射是电磁辐射，包括X-射线、红外线、可见光、UV光和各种波长电磁射线的混合物。特别优选的射线形式是γ射线。
按照本发明方法，用射线以有效灭菌生物材料，同时不对该材料造成不可接受水平的损害的辐射率将含有非水性溶剂的生物材料辐射。合适的辐射率可以根据所使用的本发明方法的某些特征而变化，例如根据被辐射的可含有非水性溶剂的特定生物材料的性质和特征，有关射线的特定形式和/或被灭活的特定的生物污染物或病原体而变化。合适的辐射率可以由本领域技术人员凭经验确定。优选地，辐射率在灭菌过程中是恒定的。当该辐射率不切实际或不符合要求时，可以使用变动的或不连续的辐射。
按照本发明方法，可以将辐射率进行优化以产生产品收率和完成操作所需时间的最有利组合。在本文所述方法中，使用低(≤3kGy/小时)和高(＞3kGy/小时)辐射率都可以达到这样的结果。对辐射率进行优选以优化含有非水性溶剂的生物材料的收率，而同时仍然使含有非水性溶剂的生物材料得以灭菌。虽然降低辐射率可减小对含有非水性溶剂的生物材料的损害，但其也会导致为达到特定要求的总剂量而需要较长的辐射时间。因此，在某些情况下可以优选较高剂量的辐射率，以例如将后勤问题和成本减到最小，并且当按照本文所述方法使用时，可保护含有非水性溶剂的生物材料免受辐射损害。
按照本发明特别优选的实施方案，辐射率不高于约3.0kGy/小时，更优选为约0.1kGy/小时-3.0kGy/小时，甚至更优选为约0.25kGy/小时-2.0kGy/小时，还甚至更优选为约0.5kGy/小时-1.5kGy/小时，最优选为约0.5kGy/小时-1.0kGy/小时。
按照本发明另一个特别优选的实施方案，辐射率为至少约3.0kGy/小时，更优选为至少约6kGy/小时，甚至更优选为至少约16kGy/小时，甚至更优选为至少约30kGy/小时，而最优选为至少约45kGy/小时或更高。
按照本发明方法，欲灭菌的含有非水性溶剂的生物材料是用射线对其辐射能有效将生物材料灭菌的时间。与辐射率相联合，适宜的辐射时间产生施用于含有非水性溶剂的生物材料的适当辐射剂量。适宜的辐射时间可以根据有关的特定辐射形式和辐射率和/或接受辐射的含有非水性溶剂的特定生物材料的性质和特征而变化。适宜的辐射时间可以由本领域技术人员凭经验确定。
按照本发明的方法，用射线将欲灭菌的含有非水性溶剂的生物材料辐射至能有效地将生物材料灭菌，而同时不给该材料造成不可接受水平的损害的总剂量。适宜的辐射总剂量可以根据所使用的本发明方法的某些特征而变化，例如根据被灭菌的含有非水性溶剂的特定生物材料的性质和特征，有关的特定辐射形式和/或被灭活的特定生物污染物或病原体而变化。适宜的辐射总剂量可以由本领域技术人员凭经验确定。优选地，辐射总剂量为至少25kGy，更优选为至少45kGy，甚至更优选为至少75kGy，而还更优选为至少100kGy或更高，例如150kGy或200kGy或更高。
被辐射的含有非水性溶剂的生物材料的特定几何形状，例如厚度和离辐射源的距离可以由本领域技术人员凭经验确定。优选的实施方案是在整个制剂中提供均匀辐射速度的几何形状。特别优选的实施方案是这样的几何形状，其在整个制剂中带来短的辐射路径长度，由此将在制剂的前面与后面之间的辐射剂量差异减至最小。在某些优选的几何形状中，特别是其中制剂沿着与辐射源垂直的其轴具有恒定半径的几何形状，可通过利用将制剂沿着所述轴旋转的手段来将这样的差异进一步减小。
类似地，按照本发明的某些方法，用于在辐射期间包含制剂的有效包装是合并了在辐射影响下的稳定性，并且将包装与辐射之间的相互作用降至最小的包装。优选的包装在辐射之前、期间和之后保持了抗外部环境的封闭，不与其中所包含的制剂反应，它们不产生可与其中所包含的制剂相互作用的化学物质。特别优选的实例包括但不限于这样的容器，它们包含在辐射时稳定的玻璃，通过用橡胶制成的塞子来塞住，所述橡胶在辐射期间比较稳定，并从中释放出极小量的化合物，通过用铝或具有较低Z数目的其它适当材料制成的金属卷曲封条密封。合适的材料可通过测定其物理性能，辐射后反应性可沥滤化合物的量和类型，以及通过由本领域技术人员凭经验测定已知对于生物材料的防范很重要的其它特征来确定。
按照本发明的某些方法，在辐射之前，可以任选将有效量的至少一种增敏化合物加到含有非水性溶剂的生物材料中，以例如提高辐射对生物材料中的生物污染物和病原体的作用效果，同时用本文所述方法将辐射将对生物材料的有害作用降至最小。适宜的增敏剂是本领域技术人员已知的，包括补骨脂素及其衍生物和inactines及其衍生物。
按照本发明的方法，含有非水性溶剂的生物材料的辐射可以在对被辐射的生物材料无害的任何温度下进行。按照一个优选的实施方案，将含有非水性溶剂的生物材料在室温下进行辐射。依据另一个优选的实施方案，将含有非水性溶剂的生物材料在低温下，即低于室温的温度下，例如在0℃、-20℃、-40℃、-60℃、-78℃或-196℃温度下进行辐射。按照本发明的该实施方案，优选在生物材料的冰点或低共熔点温度下或低于所述冰点或低共熔点的温度下对含有非水性溶剂的生物材料进行辐射。按照另一个优选的实施方案，在高温下，即高于室温的温度下，例如在37℃、60℃、72℃或80℃下对含有非水性溶剂的生物材料进行辐射。虽然不希望受缚于任何理论，但是据信，使用高温可以增强辐射对生物污染物或病原体的作用效果，并因此可以使用较低的辐射总剂量。
最优选地，含有非水性溶剂的生物材料的辐射在保护制剂免受辐射损害的温度下进行。适宜的温度可以由本领域技术人员凭经验确定。
在本发明的某些实施方案中，进行辐射的温度可在一个范围内，而不是在一个具体值上。对于含有非水性溶剂的特定生物材料的辐射来说，这样的优选温度范围可由本领域技术人员凭经验确定。
按照本发明的方法，含有非水性溶剂的生物材料的辐射可以在不对被灭菌的含有非水性溶剂的生物材料造成损害的任何压力下进行。按照一个优选的实施方案，将含有非水性溶剂的生物材料在高压下进行辐射。更优选地，将含有非水性溶剂的生物材料在由于施用声波或使用挥发物而造成的高压下进行辐射。虽然不希望受缚于任何理论，但是据信，使用高压可增强辐射对生物污染物或病原体的作用效果和/或增强由一种或多种稳定剂提供的保护作用，并因此可以使用较低总剂量的辐射。适宜的压力可由本领域技术人员凭经验确定。
一般地，按照本发明方法，进行灭菌的含有非水性溶剂的生物材料的pH值为约7。然而，在本发明的某些实施方案中，含有非水性溶剂的生物材料可以具有小于7，优选小于或等于6，更优选小于或等于5，甚至更优选小于或等于4，最优选小于或等于3的pH值。在另外的本发明实施方案中，含有非水性溶剂的生物材料可以具有大于7，优选大于或等于8，更优选大于或等于9，甚至更优选大于或等于10，最优选大于或等于11的pH值。按照本发明的某些实施方案，进行灭菌的制剂的pH值在生物材料的一个组分的等电点或接近等电点。适宜的pH水平可由本领域技术人员凭经验确定。
同样地，按照本发明方法，含有非水性溶剂的生物材料的辐射可以在不对被处理的生物材料造成损害的任何气氛下进行。按照一个优选的实施方案，将含有非水性溶剂的生物材料置于低氧或惰性气氛下。当使用惰性气氛时，该气氛优选由稀有气体，例如氦或氩，更优选高分子量稀有气体，最优选氩组成。按照另一个优选的实施方案，在辐射时将含有非水性溶剂的生物材料置于真空下。按照本发明特别优选的实施方案，在辐射之前将含有非水性溶剂的生物材料(冻干的、液体的或冷冻的)贮藏在真空或惰性气氛(优选稀有气体，例如氦或氩，更优选高分子量稀有气体，最优选氩)下。按照本发明另一优选的实施方案，在辐射前，将含有非水性溶剂的液体生物材料置于低压下，以减少溶于液体中的气体特别是氧气的量，同时采用或不采用减少溶剂的先前步骤例如冻干。这样的除气法可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
在另一个优选的实施方案中，当含有非水性溶剂的生物材料包含有溶解于其中或与之结合的氧或其它气体时，可以用本领域技术人员已知的任何方法和技术，例如通过有控制地降低装有被处理制剂的容器(刚性或柔性)内的压力，或者通过将制剂置于大致相等体积的容器中，来将制剂内的或与制剂结合的这些气体的量降低。
在本发明的某些实施方案中，当欲处理的含有非水性溶剂的生物材料是组织时，按照本领域技术人员已知的任何方法和技术，将至少一种稳定剂引入其中，包括把组织在含有稳定剂的溶液中浸泡，优选在压力、高温和/或在渗透促进剂例如二甲亚砜存在下进行浸泡。将至少一种稳定剂引入组织内的其它方法包括但不限于施加含有稳定剂的气体，优选在压力和/或高温度下施加；将稳定剂或含有稳定剂的溶液直接注射到组织中；把组织置于低压下，然后引入含有稳定剂的气体或溶液；以及两种或多种这些方法的组合。按照这样的方法，可以将一种或多种稳定剂引入到组织内。
应当理解，本文所描述的一个或多个特征的组合的使用，会进一步将由辐射所造成的对含有非水性溶剂的生物材料的有害作用减至最小，而同时保持辐射操作对生物污染物或病原体的充分作用效果。例如，除了使用稳定剂以外，在辐射之前，还可以把含有非水性溶剂的特定生物材料冻干，置于降低的温度下和贮存于真空中，以便进一步使有害作用减至最小。
特定生物污染物或病原体对射线的敏感性一般是通过确定灭活或杀死样本中约37％的目标物所需的剂量来计算的，其称为D37值。生物材料的所需组分也可以被看作具有与消除约37％其所需生物和生理特征所需的辐射剂量相等的D37值。
按照本发明的某些优选方法，含有非水性溶剂的生物材料的灭菌，是在导致生物污染物或病原体的D37值下降，而同时不降低生物材料的D37值的条件下进行的。按照本发明的其它优选方法，含有非水性溶剂的生物材料的灭菌是在导致生物材料的D37值增加的条件下进行的。按照本发明的最优选方法，含有非水性溶剂的生物材料的灭菌是在导致生物污染物或病原体的D37值降低，而同时生物材料的D37值增加的条件下进行的。
实施例
下面的实施例是对本发明的举例说明而不是限制。其它适当的修正和改进是本领域技术人员所通常遇见的变化，并完全在本发明的实质和范围内。除非另有说明，否则全部辐射皆使用60Co源来实现。
实施例1
在该实验中，测定γ辐射对悬浮在聚丙二醇(PPG)400或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的干燥尿激酶的影响。
方法
制备如下表中所示的含有尿激酶和PPG400(管2和5)、PBS(管3和6)或单独的干燥尿激酶(管1和4)的6个1.5ml微型聚丙烯离心管。将管4-6在4℃以45kGy(1.9kGy/小时)进行γ辐射。管1-3是对照(4℃)。
管 样本 干燥尿激酶的重量(mg) PPG400的体积(μl) PBS的体积(μl)
  1   单独的干燥尿激酶   3.2   0  0
  2   悬浮在PPG400中的尿激酶   3.16   126  0
  3   悬浮在PBS中的尿激酶   3.08   0  123
  4   单独的干燥尿激酶   3.38   0  0
  5   悬浮在PPG400中的尿激酶   3.3   132  0
  6   悬浮在PBS中的尿激酶   3.52   0  141
辐射后，将样本在室温以14k RPM离心5分钟。将PPG400溶剂从管2和5中除去，向这两个管中加入120μl PBS。向管1和4中分别加入128μl和135μl PBS(尿激酶浓度为40,000IU/ml)。然后用PBS将所有样本进行50倍稀释，测定在280nm的吸收度。然后将50μl各个稀释的样本加到96-孔微量滴定板中，然后加入50μl 3mM在2×测定缓冲液中的底物。将平板在摇动下于37℃培养，从加入底物后5分钟开始，每隔20分钟读取一次在405和620nm的吸收度。将在630nm的吸收度(背景吸收)从在405nm的值中减去以获得校正的吸收值。尿激酶的终浓度为1000IU/ml。
材料
尿激酶-Sigma cat.#U-5004，lot 29H1054；2.5mg＝4000IU尿激酶。
PPG400-Fluka cat.#81350。
底物-尿激酶底物1，比色测定-Calbiochem.cat.#672157，lotB23901，5mg小瓶，终浓度1.5mM。
2×测定缓冲液-100mM Tris(pH 8.8)，100mM NaCl，0.2％PEG8000。
结果
悬浮在PPG400中，然后接受45kGy的总剂量的γ辐射的尿激酶保持与γ辐射的干燥粉末尿激酶相同的百分活性(80％)。与其相反，悬浮在PBS中接受相同γ辐射的尿激酶仅保持6％的活性。该实验的结果在附图1中给出。
实施例2
在该实验中，测定在不同形式的聚丙二醇(分子量为400、1200和2000)存在下辐射后，固定的抗胰岛素单克隆抗体的活性(通过与抗原结合的能力表示)。
方法
在两个96-孔微量滴定板(falcon板-ProBind聚苯乙烯cat.#353915)中，将孔用全体积的PBS(pH 7.4)洗涤4次。一旦如上所述制得这两个平板，即在包被缓冲液中将它们用100μl/孔的新制备的2μg/ml抗胰岛素包被，然后在4℃放置过夜。然后将平板用PBS(pH 7.4)简单地洗涤3次，向特定的孔中加入100μl PPG400、PPG1200或PPG2000，每一溶液被制成1升，即用PBS进行2-倍系列稀释。用盖垫(Greiner盖垫cat.#381070(USA Scientific))将这两个平板紧密覆盖，在4℃以0kGy/小时或45kGy(1.92kGy/小时)辐射。
辐射后，向所有孔中加入约380μl全体积的封闭缓冲液，将平板在37℃培养2小时。将平板用TBST洗涤4次，向每个孔中加入100μl50ng/ml生物素标记的胰岛素在结合缓冲液中的溶液。将平板用平板密封器(Dynatech乙酸酯平板密封器)覆盖，在摇动下(设置为3的LabLine Titer Plate Shaker)于37℃培养1.5小时。将平板用TBST洗涤4次，向每个孔中加入100μl 0.5μg/ml磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白在结合缓冲液中的溶液。将平板用平板密封器覆盖，在摇动下于37℃培养1小时。将平板用TBST洗涤4次，向每个孔中加入100μl 1mg/ml磷酸酶底物在DEA缓冲液中的溶液，将平板在摇动下于37℃培养。按照需要以5分钟的间隔读取在405和620nm的吸收度。将在630nm的吸收度(背景吸收)从在405nm的值中减去以获得校正的吸收值。
材料
封闭缓冲液-2％BSA/PBS(pH 7.4)。
TBST-含有0.05％Tween 20的Tris缓冲盐水(pH 7.4)。
生物素标记的胰岛素-得自牛胰腺-Sigma I-2258lot 11OH8065，5mg胰岛素，1.2mol FITC/摩尔胰岛素，以1.0mg/ml在5ml无菌水中重新配制，在4℃贮藏。
结合缓冲液-0.25％BSA/PBS(pH 7.4)。
磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白-KPL cat.#15-30-00；0.5mg/ml在50％甘油/H2O中的溶液(1∶1000稀释的贮备液)。
DEA缓冲液-每1L-97ml二乙醇胺(SigmaD-8885)，0.1gMgCl2.6H2O，0.02％叠氮化钠，在4℃贮藏。
磷酸酶底物-磷酸对硝基苯酯-Sigma 104-105，5mg/片。磷酸酶底物新配制成1mg/ml在磷酸酶底物缓冲液，即DEA缓冲液中的溶液。该溶液是光敏感的，因此必须将其在黑暗中贮藏直至准备配送。
单克隆IgG1抗人胰岛素-Biodesign Int.cat.#E86102M，lot8J2877。
包衣缓冲液-碳酸盐/碳酸氢盐(pH 9.4)。
聚丙二醇P400-Fluka cat.#81350。
聚丙二醇P1200-Fluka cat.#81370。
聚丙二醇P2000-Fluka cat.#81380。
结果
含有PPG的被辐射的样本表现出的结合活性是未辐射对照样本的约50-63％。与其不同，含有PBS的辐射样本没有表现出结合活性。结果在附图2中给出。
实施例3
在该实验中，用不同的辐射总剂量辐射含有50％甘油并掺加猪细小病毒(PPV)的液体凝血酶。
方法
1.向Wheaton 3ml管(一式两份)中加入100μl 100％甘油、掺加50μl PPV的20μl凝血酶(100U/ml凝血酶)和任选作为稳定剂的20μl(200mM)抗坏血酸钠(用H2O将总体积调节至1ml)，在4℃以1.8kGy/小时辐射至10、30或45kGy的总剂量。
2.将96-孔细胞培养板标记和加入细胞，使得每次稀释4个孔(在接种前一天加入细胞)。向每个孔中加入浓度为4×104/ml的200μl细胞悬浮液。使用相同细胞培养基来在病毒接种后进行细胞生长和保持。
3.当细胞达到70-90％铺满时，进行病毒接种。在该实验中，首先将800μl PK-13生长培养基加到200μl样本中。
4.用PK-13生长培养基制备样本的稀释液(1∶5)，然后使用低蛋白结合盘式滤器将滤器灭菌。
5.将50μl预稀释的样本加到96孔板的柱1中。在柱1中，通过上下吸移4-5次将培养基与样本混和在一起。用新鲜的柱尖将所需量(50μl)转移到下一个柱上，重复该混和操作。将所有液体从柱尖中排出来，使用同一组柱尖，将样本转移到下一个柱上。在每个柱中重复该操作直至到达柱12。当把柱12中的样本混和时，将液体从柱尖中排出来，抽出样本量，将额外的液体置于废瓶内。获得了12次样本稀释。
6.将平板放回37℃的培养器中。
7.在第4-5和7天，用显微镜观察，并记录接种的培养基中的细胞病变作用。依据Karber的方法，从CPE读数计算TCID50。
8.通过加入50μl PPV感染贮备液来制备阳性对照，通过加入50μl PK-13生长培养基，然后进行系列1∶5稀释来制备阴性对照。
材料
Wheaton管-玻璃血清瓶，Wheaton#223684，lot#1154132-02。
凝血酶-来源于牛，5000US单位(5000U/ml贮备液)。
抗坏血酸钠-Aldrich Chem.Co.cat.#26，855-0(Milw，WI53201)。
猪细小病毒(PPV)-ATCC#VR-742；PPV感染贮备液是用PEG8000制备的，其中将1/5体积的PEG8000(20％在2.5M NaCl中的溶液)加到PPV中，在冷冻温度培养24小时，然后在Beckman SW-28转筒中以15,000rpm将PPV离心45分钟，重悬在1/10体积的PEG缓冲液中。通过TCID50确定猪细小病毒的PPV效价，其效价为约9.0log/ml(032301贮备液)。PPV在液体凝血酶中的掺入比例为1∶4(50μlPPV贮备液与150μl蛋白溶液混和)。
PEG缓冲液-0.1M NaCl，0.01M Tris(pH 7.4)，1mM EDTA。
在该实验中使用的硅氧烷化塞子得自American Stemli(Princeton，N.J.)，6720GC橡胶，lot#G009/7202。
Cells-PK-13(ATCC#CRL-6489)，#14代。将细胞保持在PK-13生长培养基(补充10％FBS和1×青霉素/链霉素/L-谷酰胺的Dulbecco改进的Eagle培养基)。
结果
样本                         每0.05ml的TCID50效价            Log的减
                                                              少
0kGy/+200mM抗坏血酸钠                 6.29
0kGy/无稳定剂                         6.375
10kGy/+200mM抗坏血酸钠                4.97                    1.32
10kGy/无稳定剂                        2.97                    3.405
30kGy/+200mM抗坏血酸钠                3.05                    3.24
30kGy/无稳定剂                        2.35                    4.025
45kGy/+200mM抗坏血酸钠                3.05                    3.24
45kGy/无稳定剂                        3.05                    3.325
有和没有抗坏血酸钠存在下，采用10kGy的总剂量，使PPV水平分别有了1.32log和3.405log的减少。类似地，有和没有抗坏血酸钠存在下，采用30kGy的总剂量，使PPV水平分别有了3.24log和4.025log的减少。有和没有抗坏血酸存在下，采用45kGy的总剂量，使PPV水平分别有了3.24log和3.325log的减少。该实验证实了，在非水性溶剂存在下，使用和不使用有效的稳定剂，能有效灭活非常小的未包膜病毒。
实施例4
在该实验中，在不同水平的残余溶剂(水)含量下，将悬浮在聚丙二醇400中的胰蛋白酶进行γ辐射。
方法
以约20,000U/ml的浓度将胰蛋白酶悬浮在聚丙二醇400中，并分成多个样本。向每份样本中加入固定量的水(0％、1％、2.4％、4.8％、7％、9％、10％、20％、33％)；还制备不含PPG 400的100％水样本。
在4℃以1.9kGy/小时的速度将样本辐射至总剂量为45kGy。辐射后，将每份样本离心以让未溶解的胰蛋白酶沉淀。取出PPG/水溶性级份，将离心沉淀团重悬在单独的水中以进行活性测试。
分析条件：将5U/孔胰蛋白酶(50U/ml)+BAPNA底物(0.5mg/ml)系列稀释(3倍稀释)到96-孔板中。在两个96-孔板中进行测定，在第5和20分钟读取在405和620nm的吸收度。将在630nm的吸收度(背景吸收)从在405nm的值中减去以获得校正的吸收值。将在第5分钟与第15分钟反应时间之间该值随着时间的变化绘制曲线，使用双曲线矩形方程在Sigma Plot中确定Vmax和Km。
结果
含有聚丙二醇(PPG 400)与水(最高达33％水)的混合物的被辐射的样本保持了未被辐射的胰蛋白酶对照的约80％活性，并且活性等于在同样条件下辐射的干燥(冻干)胰蛋白酶对照的活性。在辐射至45kGy的100％水样本中没有检测到活性。该实验的结果以图的方式在附图3中表示。
实施例5
在该实验中，在聚丙二醇400(PPG400)存在下，并任选在清除剂存在下，将猪心脏瓣膜辐射至总剂量为30kGy(1.584kGy/小时，在-20℃)。
材料：
组织-猪肺瓣膜(PV)，在使用前割下心脏瓣膜并贮藏。
组织制备试剂
聚丙二醇400.Fluka，cat#81350lot#386716/1
TroloxC.Aldrich，cat#23，881-3lot#02507TS
香豆酸.Sigma，cat#C-9008lot#49H3600
五倍子酸正丙酯.Sigma，cat#P-3130lot#117H0526
α-硫辛酸.CalBiochem，cat#437692lot#B34484
Dulbecco’s PBS.Gibco BRL cat#14190-144lot#1095027
2.0ml螺口管.VWR Scientific Products，cat#20170-221lot#0359
组织水解试剂
Nerl H2O.NERL Diagnostics cat#9800-5lot#03055151
丙酮.EM Science cat#AX0125-5，lot#37059711
6N恒沸HCl.Pierce cat#24309，lot#BA42184
Int-Pyd(乙酰化吡啶啉醇(Pyridinoline))HPLC内标.MetraBiosystems Inc.cat#8006，lot#9H142 expiration 2/2002 Store@≤-20℃
盐酸.VWR Scientific cat#VW3110-3，lot#n/a
七氟丁酸(HFBA)Sigma cat#H-7133，lot#20K3482 FW 214.0，在2-8℃贮藏
SP-Sephadex C-25树脂.Pharmacia cat#17-0230-01，lot#247249(按照制造商的说明用NaCl充满)
水解瓶-10mm×100mm真空水解管.Pierce cat#29560，lot#BB627281
加热组件-Pierce，Reacti-therm.Model#18870，S/N1125000320176
Savant-Savant Speed Vac System：
1.Speed Vac Model SC110，#SC110-120型，#SC110-SD171002-1H系列
a.Refrigerated Vapor Trap Model RVT100，#RVT100-120V型，#RVT100-58010538-1B系列
b.真空泵，VP 100 Two Stage Pump Model VP100，#93024系列
柱-Phenomenex，Luna 5μ C18(2)100，4.6×250mm.Part#00G-4252-E0，S/N#68740-25，B/N#5291-29
HPLC系统：Shimadzu系统控制器SCL-10A
    Shimadzu自动样本注射器SIL-10A(50μl回路)
    Shimadzu分光荧光检测器RF-10A
    Shimadzu泵LC-10AD
    软件-Class-VP版本4.1
低结合管-MiniSorp 100×15Nunc-Immunotubc.Batch#042950，cat#468608
方法
A.制备稳定剂溶液
Trolox C：
MW＝250；因此，对于1M，需要250mg/ml，对于0.5M，需要125mg/ml
实际重量＝250.9mg
250÷125mg/ml＝2.0ml
不溶；因此加入2ml of PPG。水浴超声处理和计时后，Trolox C在125mM溶解。
香豆酸：
MW＝164；因此，对于1M，需要164mg/ml
实际重量＝164.8mg
164.8mg÷164mg/ml＝1.0ml
水浴超声处理约15分钟-不是100％溶解。加入1ml PPG，再次水浴超声处理。
五倍子酸正丙酯：
MW＝212.2；因此，对于1M，需要212mg/ml，对于0.5M，需要106mg/ml
实际重量＝211.9mg
211.9mg÷106mg/ml＝2.0ml
水浴超声处理20-30分钟后溶解。
1M α-硫辛酸：
MW＝206；因此，206mg/ml
实际重量＝412mg
412mg÷206mg/ml＝2.0ml
水浴超声处理10分钟后，溶解性非常好
清除剂的最终贮备液：
125mM Trolox C-4ml
1M硫辛酸-2ml
0.5M香豆酸-2ml
0.5M五倍子酸正丙酯-2ml
B.在γ辐射之前处理瓣膜
1.将PV心脏瓣膜在湿冰上融化。
2.将瓣膜尖从每个瓣膜上切下来，合并到含有冷的Dulbecco’sPBS的50ml锥形管内。
3.将瓣膜尖在PBS中于4℃洗涤约1.5小时；在洗涤期间更换PBS总共6次。
4.将2个瓣膜尖分别置于2ml螺口管中。
5.将1.2ml下列物质加到2个管中(对于0和30kGy)：
    PPG
    125mM Trolox C在PPG中的溶液
SCb稳定剂混合物：包含1.5ml 125mM Trolox C、300μl 1M硫辛酸、600μl 0.5M香豆酸和600μl 0.5M五倍子酸正丙酯(终浓度分别为：62.5mM、100mM、100mM和100mM)。
6.在摇动下将管在4℃培养。
7.将稳定剂溶液和瓣膜尖转移到用于γ辐射的2ml玻璃瓶内。
8.将所有玻璃瓶在干冰上冷冻。
9.将对照样本在室内于-20℃培养。
C.组织的γ辐射
在-20℃将样本以1.584kGy/小时的辐射率辐射至总剂量为30kGy。
D.用于水解/提取的组织加工
1.因为PPG是粘性的，所以加入PBS以使得组织易于转移。
2.将每对瓣膜尖(每个条件下2个)置于填充有冷PBS的50mlFalcon管中，在冰上培养-定期将管反转。
3.1小时后，将PBS从含有在PPG/0和30中的瓣膜尖的管中倾析出来，用新鲜的冷PBS再充满。对于含有Trolox C或稳定剂混合物的PPG样本，准备填充有冷PBS的新的50ml Falcon管，并将瓣膜尖转移。
4.进行另外3次洗涤。
5.将一个瓣膜尖转移到用于提取的填充有冷PBS的2mlEppendorf管中。准备用于水解的其它瓣膜尖。
E.组织水解
组织水解：
1.在Eppendorf管中将每个瓣膜尖用丙酮洗涤6次(约1.5ml/洗涤)。
2.给每个瓣膜尖施以SpeedVac(不加热)15分钟或直至变干。
3.称重样本，转移到水解瓶中，以20mg组织/ml HCl的体积加入6N HCl：
样本ID                  干重(mg)                μl 6N HCl
1.PPG/0                 6.49                    325
2.PPG/30                7.26                    363
3.PPG T/0               5.80                    290
4.PPG T/30              8.20                    410
5.PPG SCb/0            6.41                       321
6.PPG SCb/30           8.60                       430
4.将样本在110℃水解约23小时。
5.将水解产物转移到Eppendorf管中，以12,000rpm离心5分钟。
6.将上清液转移到干净的Eppendorf中。
7.将50μl水解产物在8ml Nerl H2O中稀释(将HCl稀释至约38mM)。
8.在200μl 2×int-pyd中掺加。通过反转混和(对于1600μl2×int-pyd：160μl 20×int-pyd+1440μl Nerl H2O)。
9.将样本负载到已在水中平衡的SP-Sephadex C25柱(约1×1cm填充层体积)上。(用NaCl预先填充该柱)
10.将流出液再次负载到柱上。
11.用20ml 150mM HCl洗涤。
12.用5ml 2N HCl将交联物洗脱到低结合管内。
13.在Savant中将整个样本干燥。
F.分析水解产物
准备下列：
样本                      μl         μl H2O         μl HFBA
1.PPG/0kGy                18          180              2
2.PPG/30kGy               59          139              2
3.PPG T/0kGy              67          171              2
4.PPG T/30kGy             64          134              2
5.PPG SCb/0kGy            10          188              2
6.PPG SCb/30kGy           32          16               2
结果：
HPLC结果如附图4A-4C所示。在PPG 400存在下，无论心脏瓣膜是否已经被辐射过，结果几乎相同。加入一种稳定剂(trolox C)或稳定剂混合物产生了更有效的结果。附图4D所示的凝胶分析证实了这些条件所提供的保护有效性。
实施例6
在该实验中，确定在50％DMSO和任选稳定剂存在下，并且在聚丙二醇400(PPG400)存在下，γ辐射对猪心脏瓣膜尖的影响。
制备用于辐射的组织：
1.将5个PV瓶和3个心房瓣膜(AV)在冰上融化。
2.除去融化培养基，将瓣膜在填充有PBS的烧杯中洗涤。
3.将每个瓣膜转移到含有PBS的50ml锥形瓶中。通过反转洗涤，并取出。
4.反复洗涤3次。
5.将3个瓣膜尖(瓣膜)切下来。
6.贮藏在2ml顶端螺口Eppendorf瓶(Eppendorfs)内的PBS中，并在冰上保持。
制备稳定剂：
制备所有稳定剂，使得DMSO的终浓度为50％。
1M抗坏血酸盐在50％DMSO中的溶液：
Aldrich cat#26，855-0lot#10801HU
将200mg溶解在300μl H2O中。加入500μl DMSO。用水将体积调节至1ml，最终的pH约为8.0
1M香豆酸：
Sigma cat#C-9008lot#49H3600.MW 164.2
将34.7mg溶解在106μl DMSO中pH＝≈3.0
加入138μl H2O。将样本粉碎。
一旦用1N NaOH将pH调节至7.5，即将香豆酸加到溶液中。
1M五倍子酸正丙酯：
Sigma cat#P-3130lot#117H0526.MW 212.2
将58.2mg溶解在138μl DMSO中。
加入138μl H2O。最终的pH为6.5或稍微更低一些。
稳定剂混合物：
1.0ml 500mM抗坏血酸盐
500μl 1M香豆酸
300μl 1M五倍子酸正丙酯
1.2ml 50％DMSO
3.0ml
方法
将1.6ml溶液(稳定剂混合物或PPG400)加到每份样本中，然后将样本在4℃培养2.5天。然后将瓣膜与1ml培养它们的溶液转移到2ml辐射瓶中。在3.6℃用γ射线以1.723kGy/小时的速度将每份样本辐射至总剂量为25kGy。
组织水解：
1.在2ml Eppendorf瓶中用丙酮将每个瓣膜尖洗涤6次。
2.最后一次丙酮洗涤后，将样本在Savant中(不加热)干燥约10-15分钟或直至变干。
3.称重样本，将其转移到水解瓶中，然后加入20mg组织/ml HCl的6N HCl：
样本ID                 干重(mg)          μl 6NHCl
1.PBS/0kGy             11.4              570
2.PBS/25kGy            6.0               300
3.DMSO/OkGy            6.42              321
4.DMSO/25kGy           8.14              407
5.DMSO/SC-a/0kGy       8.7               435
6.DMSO/SC-a/25kGy      8.15              408
7.PPG/OkGy             13.09             655
8.PPG/25kGy            10.88             544
5.将样本在110℃水解约23小时。
6.将水解产物转移到Eppendorf管中，以12,000rpm离心5分钟。
7.将上清液转移到干净的Eppendorf中。
8.将50μl水解产物在8ml Nerl H2O中稀释(将HCl稀释至约37mM)。
9.在200μl 2×int-pyd中掺加。通过反转混和(对于2000μl2×int-pyd：200μl 20×int-pyd+1.8ml Nerl H2O)。
10.将样本负载到已在水中平衡的SP-Sephadex C25柱(约1×1cm填充层体积)上。(用NaCl预先填充该柱)
11.将流出液再次负载到柱上。
12.用20ml 150mM HCl洗涤。
13.用5ml 2N HCl将交联物洗脱到低结合管内。50ml 2 NHCl：用Nerl H2O将8.6ml浓HCl调节至体积为50ml。
14.在Savant中干燥整个样本。
蛋白聚糖的胍盐酸盐提取和DEAE-琼脂糖纯化：
4M胍盐酸盐提取：
1.将所有3个瓣膜尖从γ辐射瓶中取出来，转移到单独的50ml锥形管中。
2.用50ml dPBS将瓣膜尖洗涤5次(在4℃洗涤约5小时)，在Kimwipe上加湿后测定一个瓣膜尖的湿重。
3.将每组中的一个瓣膜尖转移到5ml微型离心管中，加入适当体积的含有2μg/ml蛋白酶抑制剂(抑酶肽、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂A)的4M胍盐酸盐/150mM乙酸钠缓冲液，pH 5.8，使体积与组织比例为15(参见Methods in Enzymology Vol.144 p.321-关于15-20的最佳收率使用比例)。
4.用剪刀将瓣膜尖切成小片。
5.在4℃振摇约48小时。
6.在Hermle Z-252M上以16,500RPM于4℃离心10分钟。
7.收集胍可溶性级份，在10K MWCO Slide-A-Lyzer中用5LPBS透析过夜(具有一个5L的3个slide-a-lyzer和在另5L中的5个slide-a-lyzer)以除去胍。
8.更换PBS，在搅拌下于4℃再透析9小时。
9.收集透析液，在4℃贮藏。
10.在Hermle Z-252M上以16,500RPM于4℃离心5分钟。
11.取出PBS可溶性级份来用于DEAE-琼脂糖色谱。
DEAE-琼脂糖色谱
1.将500μl PBS可溶性胍提取液的NaCl浓度增加至300mMNaCl(假定的PBS可溶性级份已经具有约～150mM的NaCl，因此向每500μl样本中加入15μl 5M NaCl贮备液)。
2.将～1ml填充的DEAE-琼脂糖(预先用1M NaCl/PB pH 7.2洗涤过)平衡到300mM NaCl/PB pH 7.2(注意：为了制备300mMNaCl/PB pH7.2-将3ml 5M NaCl贮备液加到100ml PBS中)。
3.将200μl 1：μl树脂浆液加到515μL GuHCl提取液中(都具有300mM NaCl)。
4.在室温振摇1小时。
5.轻微离心以让树脂沉降。
6.取出“未结合”的样本，在-20℃贮藏。
7.将树脂用～1.5ml 300mM NaCl/PBS pH7.2洗涤5次。
8.最后一次洗涤之后，用100μl Hamilton注射器取出所有额外的缓冲液。
9.在室温用三份100μl体积的1M NaCl/PB pH 7.2洗脱。在-20℃贮藏。
SDS-PAGE：
用于分析PBS可溶性胍盐酸盐提取物和进行DEAE-琼脂糖色谱的5-20％梯度凝胶。
1.Gel#l：GuHCl提取物/PBS可溶性级份-依次用甲苯胺蓝和考马斯蓝染色。
2.Gel#2：DEAE-琼脂糖洗脱级份#1-依次用甲苯胺蓝和考马斯蓝染色。
通过HPLC定量测定胶原交联：
1.制备100-200μl在1％七氟丁酸(HFBA)中的1×溶液。
2.在用流动相平衡的C18 HPLC柱上注射50μl。
3.将分光荧光计设定为在295nm激发，在395nm发射。
4.计算每1μl 1×Int-Pyd溶液内吡咯醇啉(Int-Pyd)的整合荧光。
结果：
HPLC结果如附图5A-D所示。主峰代表内吡咯醇啉(Int-Pyd)峰。在含水环境(PBS)中的辐射使得较小峰显著减少(附图5A)。通过加入非水性溶剂(PPG 400)来减少水含量产生了几乎重叠的曲线(附图5B)。在保持主峰方面，DMSO的有效性较小(附图5C)，而DMSO加稳定剂混合物(附图5D)具有较大的有效性，虽然某些次要峰具有些许增加。如下表所示，计算关于每个样本的pyd峰下的面积。这些结果证实了上述结论，并且表明，在含有PPG和DMSO以及清除剂混合物的样本中，在成熟胶原里发现的氨基酸交联(pyd)被有效地保持。凝胶分析在附图5E中显示，并且反映了由HPLC分析得到的主要结论，其中在PBS中看见的谱带显著减少，在非水性溶剂存在下，保持了主要谱带。
    样本     Pyd峰面积
    PBS/0kGy     94346
    PBS/25kGy     60324
    DMSO/0kGy     87880
    DMSO/25kGy     49030
    DMSO/SCa/0kGy     75515
    DMSO/SCa/25kGy     88714
    PPG/0kGy     99002
    PPG/25kGy     110182
实施例7
在该实验中，在-20℃以1.584kGy/小时的速度将浸泡在不同溶剂中的冷冻的猪AV心脏瓣膜γ辐射至总剂量为30kGy。
材料：
1.获得了猪心脏瓣膜，在低温保护溶液(含有胎牛血清、青霉素-链霉素、M199培养基和约20％DMSO)中于-80℃贮藏。
2.Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水：Gibco BRL cat#14190-144lot1095027
3.2ml带螺口盖的瓶：VWR cat#20170-221lot#0359
4.2ml玻璃瓶：Wheaton cat#223583lot#370000-01
5.13mm堵塞器：Stelmi 6720GC lot#G006/5511
6.DMSO：JT Baker cat#9224-01 lot#H40630
7.抗坏血酸钠：Aldrich cat#26，855-0 lot10801HU；制成2M在Nerl水中的贮备液。
8.胎牛血清
9.青霉素-链霉素
10.M199培养基
11.DMSO
方法：
低温保存操作：
制备溶液：
冷冻培养基：
胎牛血清(FCS)(10％)＝50ml
青霉素-链霉素＝2.5ml
M199＝QS 500ml
2M DMSO
DMSO＝15.62g
冷冻培养基＝QS 100ml
3M DMSO
DMSO＝23.44g
冷冻培养基＝QS 100ml
1.将切割的心脏瓣膜(具有少量连接的导管/肌肉)放置在冷冻玻璃管(用色笔标记)内。
2.加入2ml冷冻培养基。
3.在21℃加入1ml 2M DMSO溶液。
4.在第5分钟加入1ml 2M DMSO溶液。
5.在第30分钟加入4ml 3M DMSO溶液。
6.在第45分钟于4℃将冷冻管置于冰上。
7.在第50分钟于-7.2℃接种浴。
8.在第55分钟于-7.2℃成核。
9.在第70分钟以1℃/分钟冷却至-40℃。从浴中取出，置于液氮罐中，在低温贮藏容器中贮藏。
将心脏瓣膜辐射的操作：
1.将AV心脏瓣膜尖在湿的冰上融化。
2.将瓣膜尖合并到50ml管中。
3.在摇动下于4℃用～50ml dPBS洗涤瓣膜尖。在5小时期间更换5次PBS。
4.将瓣膜尖转移到2ml带螺口盖的管中(2个瓣膜尖/管)。
5.将1.0ml下列物质加到两个管当中的每个管内：dPBS，50％DMSO和含有200mM抗坏血酸钠的50％DMSO(如下所述将2M抗坏血酸钠贮备液稀释：400μl(2M)+1.6ml水+2ml 100％DMSO)。
6.在振摇下将管在4℃培养～46小时。
7.将溶液和瓣膜尖转移到2ml玻璃瓶中，堵塞并盖上盖子。
8.将所有瓶在干冰上冷冻。
10.然后在-20℃以1.584kGy/小时的速度将冷冻的样本辐射至总剂量为30kGy。
结果：
HPLC分析结果如附图6A-D所示。在含水环境(PBS)中的辐射使得较小峰显著减少(附图6A)。通过加入非水性溶剂(20％DMSO)来减少水含量使得这些峰更可靠(附图6B)。在保持主峰和次要峰方面，将DMSO浓度增加至50％稍微更有效(附图6C)，而DMSO加稳定剂混合物(附图6D)非常有效(另外的新峰是由于稳定剂自身所致)。凝胶分析在附图6E中显示，并且反映了由HPLC分析得到的主要结论，其中在PBS中看见的谱带显著减少，在非水性溶剂存在下，以及有和没有稳定剂存在下，保持了主要谱带。
实施例8
在该实验中，在-70℃以约6kGy/小时的速度将浸泡在不同溶剂中的冷冻的猪AV心脏瓣膜γ辐射至总剂量为45kGy。
材料：
1.获得猪心脏瓣膜尖，并且在低温保护溶液(与实施例7中所述相同的溶液)于-80℃贮藏。
2.Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水：Gibco BRL cat#14190-144lot1095027
3.2ml带螺口盖的瓶：VWR cat#20170-221 lot#0359
4.2ml玻璃瓶：Wheaton cat#223583 lot#370000-01
5.13mm堵塞器：Stelmi 6720GC lot#G006/5511
6.DMSO：JT Baker cat#9224-01 lot#H40630
7.抗坏血酸钠：Aldrich cat#26，855-0 lot10801HU；制成2M在Nerl水中的贮备液。
8.聚丙二醇400(PPG400)：Fluka cat#81350 lot#386716/1
方法：
低温保存方法与实施例7相同。
1.将AV心脏瓣膜尖在湿的冰上融化。切下瓣膜尖，将合并的瓣膜尖用冷PBS洗涤6次。
2.将每一瓣膜尖干燥，将瓣膜尖转移到2ml带螺口盖的管(2个瓣膜尖/管)。
3.将1.2ml下列物质加到两个管当中的每个管内：dPBS，含有200mM抗坏血酸钠的dPBS，PPG400，用于再水合的PPG400，50％DMSO和含有200mM抗坏血酸钠的50％DMSO(如下所述将2M抗坏血酸钠贮备液稀释：400μl(2M)+1.6ml水+2ml 100％DMSO)。
4.在振摇下将管在4℃培养～46小时。
5.用新鲜的溶液替换所有溶液(具有下列例外：对于一个PPG400组，除去PPG400，将瓣膜尖用PBS+200mM抗坏血酸盐洗涤，然后将所述抗坏血酸盐除去，并用新鲜的PBS+200mM抗坏血酸盐替换)。
6.在振摇下将管在4℃培养～46小时。
7.将在步骤5)中制备的PPG400脱水/PBS+抗坏血酸盐再水合瓣膜尖的溶液更换。
8.在振摇下将管在4℃培养～6小时。
9.将溶液和瓣膜尖转移到2ml玻璃瓶中，堵塞并盖上盖子。
10.将所有瓶在干冰上冷冻。
11.然后在-70℃以6kGy/小时的速度将冷冻的样本辐射至总剂量为45kGy。
结果：
HPLC结果如附图7A-F所示。在含水环境(PBS)中的辐射使得次要峰改变，并且主峰右移。加入各种非水性溶剂，减少残余水含量和加入稳定剂产生了与相应对照更匹配的特征。凝胶分析在附图7G-7H中显示，并且显示了PBS中的谱带显著失去，而其它组表现出显著保留了这些失去的谱带。
当将实施例8中的结果与实施例5、6和7中的结果比较时，显然，对于γ辐射，降低温度通常导致对胶原交联的改变和破坏量下降。该温度依赖性的一个例证是含有50％DMSO和抗坏血酸盐的样本，其中随着温度从-20℃降至-80℃，另外的峰显著减少。
实施例9
在该实验中，评价有或没有稳定剂混合物(100mM海藻糖、150mM甘露醇、3.1M DMSO、2.2M丁二醇和3.1M甲酰胺)存在下，辐射至25kGy或50kGy总剂量的γ辐射对人股骨的机械完整性的影响。
材料：
甲酰胺(EM Science #4650，lot3631B33)；密度＝1.13g/mL
2，3-丁二醇(Aldrich #B8，490-4，lot K023119BO)；密度＝0.995g/mL
海藻糖(Sigma T-9531，lot 61K7026)；0.5M在水中的贮备液
甘露醇(Sigma M-8429，lot 106H00842)；0.5M在水中的贮备液
二甲亚砜(JT Baker #9224-01)
Wheaton 5mL血清瓶(Wheaton #223685，lot 1165122-01)
堵塞器(Stelmi，C14046720GC 6TP，lot G005/3768)
人股骨，得自Comprehensive Tissue Centre via RadTag
具有强力金钢石刀片(Marmed，#75H)的Diamond Band SawModel #80(Marmed Inc.，Cleveland，OH)
3％过氧化氢，购自local drug store
中子生成辐照器
操作：
1.用剃刀片将保留的软组织和骨膜从骨头上刮下来。
2.将股骨切成～2cm片段。
3.在搅拌下在温热的去离子水中将片段洗涤2小时。
4.在搅拌下将片段用3％过氧化氢处理0.5小时。
5.用几份更换的水洗涤片段。
6.在搅拌下于4℃将片段在水中洗涤过夜。
7.将股骨片段切成5mm×5mm×1cm的小块。
8.将股骨小块在水中保持直至放置在清除剂溶液。
9.将股骨小块随机取出，并置于一个下列组中：
a.无稳定剂混合物/未辐射
b.无稳定剂混合物/辐射至25kGy
c.无稳定剂混合物/辐射至50kGy
d.有稳定剂混合物/未辐射
e.有稳定剂混合物/辐射至25kGy
f.有稳定剂混合物/辐射至50kGy
在-72℃以约2.5kGy/小时的速度将样本辐射至总剂量为25kGy或50kGy。
10.将含有稳定剂混合物的组置于5mL稳定剂混合物中，将未处理的组置于5mL 3.1M DMSO中。
11.将样本在4℃搅拌24小时。
12.将样本置于用于辐射的小瓶中，在干冰乙醇浴中迅速冷冻。
13.将样本在-80℃保持直至进行辐射。
14.辐射后，将样本在-80℃贮藏直至进行机械测试。
将样本在三点弯曲试验中测试。
结果：
用稳定剂混合物预处理的骨导致弯曲应力显著恢复。与所有其它测试的处理相比，仅在低温下辐射表现出弯曲应力恢复的显著改善。下面所示结果是基于与对照相比的平均弯曲应力计算的：
a.无稳定剂混合物/辐射至25kGy：9％下降
c.无稳定剂混合物/辐射至50kGy：26％下降
e.有稳定剂混合物/辐射至25kGy：5％下降
f.有稳定剂混合物/辐射至50kGy：14％下降
实施例10
目的：测定进行或未进行如下处理的骨的机械完整性：用聚丙二醇处理，然后用稳定剂混合物(200μM TroloxC、100mM香豆酸、100mM硫辛酸、100mM五倍子酸丙酯)处理，然后冷冻干燥，最后辐射至25kGy或50kGy。
材料：
香豆酸(Sigma C-4400，lot 51K3660)，0.5M在乙醇中的贮备液
五倍子酸丙酯(Sigma P-3130，lot 60K0877)，0.5M在乙醇中的贮备液
α-硫辛酸(Calbiochem 437692，lot B34484)，0.5M在乙醇中的贮备液
TroloxC(Aldrich 23，881-3，lot 02507TS)2mM在DPBS中的贮备液
DPBS(Sigma D-8662，lot 70K2343)
聚丙二醇P400(Fluka #81350，lot 386716)
Wheaton 5mL血清瓶(Wheaton#223685，lot 1165122-01)
堵塞器(Stelmi，C14046720GC 6TP，lot G005/3768)
通过Maestro软件进行分析的VirTis Genesis 25EL冷冻干燥器
人股骨，得自Comprehensive Tissue Centre via RadTag
具有强力金钢石刀片(Marmed，#75H)的Diamond Band SawModel #80(Marmed Inc.，Cleveland，OH)
3％过氧化氢，购自local drug store
中子生成辐照器
操作：
1.用剃刀片将保留的软组织和骨膜从骨头上刮下来。
2.将股骨切成约2cm片段。
3.在搅拌下在温热的去离子水中将片段洗涤2小时。
4.在搅拌下将片段用3％过氧化氢处理0.5小时。
5.用几份更换的水洗涤片段。
6.在搅拌下于4℃将片段在水中洗涤过夜。
7.将股骨片段切成5mm×5mm×1cm的小块。
8.将股骨小块在水中保持直至放置在稳定剂混合溶液中。
9.将股骨小块随机取出，并置于下列6个组中之一(-CK是指样本未用稳定剂混合物处理，+CK是指样本用稳定剂混合物处理，并且辐射剂量如后面所示)：
a.-CK/0kGy
b.-CK/25kGy
c.-CK/50kGy
d.+CK/0kGy
e.+CK/25kGy
f.+CK/50kGy
10.将所有样本在PPG中于4℃培养过夜。
11.取出样本，用Kimwipe轻拍以除去过量PPG。
12.将4mL稳定剂混合物加到指定为+CK的样本中，而未处理的-CK保持不处理。
13.将+CK样本在4℃搅拌过夜，而将-CK样本在4℃放置相同时间。
14.将样本置于辐射小瓶中，进行冷冻干燥。
15.冷冻干燥后，将样本在4℃保持直至进行辐射。
16.辐射后，将样本在4℃贮藏直至进行机械测试。
将样本在三点弯曲试验中测试。
结果：
三点弯曲试验结果证实了与未预处理的样本相比，加入稳定剂混合物在辐射后提供了更好的弯曲应力恢复。下面所示结果是基于与对照相比的平均弯曲应力计算的：
+CK/25＝10％弯曲应力下降
+CK/50＝30％弯曲应力下降
-CK/25＝42％弯曲应力下降
-CK/50＝22％弯曲应力下降
实施例11
在该实验中，评价在抗坏血酸盐(200mM)或稳定剂混合物(2.2M丁二醇、3.1M DMSO、3.1M甲酰胺、150mM甘露醇和100mM海藻糖)存在下，γ辐射对人骨样本的影响。处理或未处理的样本未辐射或辐射至总剂量为50kGy。测定胍和胃蛋白酶提取物。
方法：
1.将人骨片用200mM抗坏血酸盐或稳定剂混合物(2.2M丁二醇、3.1M DMSO、3.1M甲酰胺、150mM甘露醇和100mM海藻糖)于4℃处理过夜。
2.将骨片浸泡在液氮在，用锤粉碎。
3.将粉碎的样本置于eppendorf管中(10-40mg/管)
4.进行胍和胃蛋白酶提取。通过SDS-PAGE分析结果。
结果：
根据SDS-PAGE分析，与用抗坏血酸盐处理的样本相比，稳定剂混合物处理的样本表现出改善的结果。
实施例12：
目的：测定不同的稳定剂混合物对辐射至50kGy的人骨的保护作用。
材料：
1.5mm×5mm×30mm骨密质杆(得自Comprehensive TissueCentre via RadTag Technologies的人股骨)。
2.稳定剂混合物
a.CK2-f：
150mM甘露醇(Sigma M-8429，lot 106H00842)
100mM海藻糖(Sigma T＝9531，lot 61K7026)
2.2M丁二醇(Aldrich #B8，490-4，lot K023119BO)
3.1M DMSO(JT Baker #9224-01)
b.CK1-fd：
100mM香豆酸(Sigma C-4400，lot 51K3660)，0.5M在乙醇中的贮备液
100mM硫辛酸(Calbiochem#437692，lot B34484)，0.5M在乙醇中的贮备液
100mM五倍子酸丙酯(Sigma P-3130，lot 60K0877)，0.5M在乙醇中的贮备液
200μM TroloxC(Aldrich 23，881-3，lot 02507TS)2mM在PBS中的贮备液
3.聚丙二醇P400(Fluka #81350，lot 386716)
4.30mL血清瓶(Wheaton)
5.堵塞器(Stelmi#C1404 6720GC 6TP，lot G005/3768)
操作：
1.在摇动下将10个骨密质杆在50mL聚丙二醇(PPG)P400中于37℃浸泡2小时。
2.将骨密质杆从PPG中取出，用Kimwipe轻轻吸干以除去过量PPG，然后在搅拌下于4℃在50mL CK1-fd中浸泡过夜(～16小时)。
3.将12个骨杆置于50mL CK2-f中，在搅拌下于4℃浸泡过夜(～16小时)。将另外10个骨杆置于去离子水中，如关于其它骨杆所述浸泡过夜。
4.在第二天的早晨，将骨杆取出，置于30mL用于辐射的小瓶中。
5.将小瓶在-80℃保持直至进行辐射。
6.将样本在干冰上以约4.7kGy/小时的速度辐射至总剂量为约50kGy。
7.使用三点弯曲试验评价骨的机械强度。
结果：
弯曲试验分析表明，与未用稳定剂混合物处理的辐射的样本(相应对照的73％)相比，用CK2-f和CK1-fd处理的辐射的样本表现出改善的结果(分别是相应对照的86％和85％)。
实施例13：
目的：测定不同的稳定剂混合物对辐射至50kGy的骨的保护作用。
材料：
1.3mm×3mm×25mm骨密质杆(得自Comprehensive TissueCentre via RadTag Technologies的人股骨)。
2.稳定剂混合物
a.CK2-f：
150mM甘露醇(Sigma M-8429，lot 106H00842)
100mM海藻糖(Sigma T＝9531，lot 61K7026)
2.2M丁二醇(Aldrich #B8，490-4，lot K023119BO)
3.1M DMSO(JT Baker #9224-01)
b.10-DM：
10％DMSO，USP(Spectrum#D1258，lot RP0915)
150mM甘露醇，USP(Spectrum#MA165，lot RM0418)
3.聚丙二醇P400(Fluka #81350，lot 386716)
4.30mL血清瓶(Wheaton)
5.堵塞器(Stelmi#C1404 6720GC 6TP，lot G005/3768)
操作：
1.每个处理使用12个骨密质杆-6个用于辐射的样本，6个用于未辐射的样本。
2.将骨质放在5mL锥形瓶中，用一种下列液体处理：
a.3mL水；
b.3mL CK2-f；或
c.3ml 10-DM。
3.将样本在4℃超声处理约20分钟。
4.超声处理后，在搅拌下将骨在室温浸泡约2小时40分钟。
5.浸泡后，将骨从液体中取出，置于用于辐射的小瓶中，在约-80℃贮藏。
6.将样本在干冰上以约2.6kGy/小时的速度辐射至总剂量为约55kGy-60kGy。
7.使用三点弯曲试验评价骨的机械强度。
结果：
弯曲试验分析表明，用CK2-f处理的辐射的样本表现出的强度是相应对照强度的82％，用10-DM处理的辐射的样本表现出的强度是相应对照强度的73％。
实施例14
目的：测定稳定剂混合物对辐射至50kGy的猪ACL样本的保护作用。
材料：
1.猪ACL：RadTag Technologies，Inc.
2.稳定剂混合物：
3.1M DMSO；
2.2M 2，3-丁二醇
150mM甘露醇；和
100mM海藻糖。
操作：
1.将猪ACL(10个)在-80℃贮藏，在37℃的水浴中融化约30分钟；
2.将每个ACL置于单独的50mL锥形管中；
3.在摇动下将样本用50mL PBS洗涤4次，每次洗涤约5分钟；
4.在摇动下将样本用水(各50mL)洗涤1次(5分钟)；
5.将每个韧带切成约4-5个小片(直径约3mm)；
6.将样本置于2mL小瓶(1个/瓶)中；
7.向每个小瓶中加入1mL稳定剂混合物或水；
8.将橡胶堵塞器和盖子盖住小瓶；
9.将样本在4℃摇动过夜；
10.将样本辐射至总剂量为约50kGy；
11.通过SDS-PAGE分析样本。
结果：根据SDS-PAGE，与未处理的对照相比，用稳定剂混合物处理的样本表现出改善的性质。
实施例15
目的：测定不同的稳定剂混合物对辐射至50kGy的牛胫骨的保护作用。
材料：
牛胫骨，得自屠宰场(Mt.Airy Meat Locker)，研磨至3mm×3mm×42mm的片段
丁二醇(Aldrich B8，490-4，lot K023119B0)
丙二醇(Sigma，P-4347，lot 111K1658)
DMSO，USP(Spectrum，D1258，lot RE0754)
甘露醇，USP(Spectrum，MA165，lot RE1020)
海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)
五倍子酸(Sigma，G-7384，lot 111K0103)
抗坏血酸钠，USP(Spectrum S1349，lot RM0398)
Branson 2710水浴超声器
30mL血清瓶(Kimble Glass 62121D-30)
20mm堵塞器(Stelmi C1404 6720GC 6TP，lot G005/3758)
稳定剂混合物：
F1(BDGT)：
2.2M丁二醇
3.1M DMSO
100mM五倍子酸
50mM海藻糖
F2(ABMT)：
200mM抗坏血酸盐
2.2M丁二醇
150mM甘露醇
50mM海藻糖
F3(ABDM)：
200mM抗坏血酸盐
1.66M丁二醇
0.33M DMSO
125mM甘露醇
F4(BGMT)：
2.2M丁二醇
50mM五倍子酸
150mM甘露醇
50mM海藻糖
F5(BDG)：
2.2M丁二醇
3.1M DMSO
100mM五倍子酸
F6(AMPT)：
200mM抗坏血酸盐
150mM甘露醇
2.2M丙二醇
50mM海藻糖
操作：
1.将研磨的骨密质片置于大的烧杯中并混和。
2.随机选择10个骨片，置于50mL锥形瓶中。
3.将上述稳定剂混合物加至锥形瓶的40mL标志。
4.将锥形瓶放置在浮床上，然后置于水浴超声器中。
将水浴中的水预先冷却至4℃
在4个小时期间内，每隔约15分钟用冰冷却的水替换水浴中的水。
5.超声处理后，将锥形瓶置于固定架上，在4℃轻微搅拌24小时。
6.将骨片从锥形瓶中取出，除去过量稳定剂混合物，将样本置于25mL用于辐射的血清瓶中。
7.将血清瓶堵塞，盖上盖子，在-80℃贮藏直至进行辐射。
8.将样本在干冰上辐射至总剂量为约50kGy。
9.通过三点弯曲试验测定骨的机械强度。
结果：
三点弯曲试验分析给出了关于辐射的样本的机械强度的下列结果(相对于未辐射的对照的平均值)：
BDGT：75％
ABMT：66％
ABDM：60％
BGMT：68％
BDG：59％
AMPT：61％
无稳定剂：56％
实施例16
目的：测定不同的稳定剂混合物对在干冰温度下辐射至50kGy的猪ACL胶原的保护作用。
材料：
猪ACL(在2002年6月25日收获的)，得自RadTag Technologies
盐水[0.9％NaCl(VWR#VW6430-5，lot 41240202)]
丙二醇(Sigma P-4347，lot 111K1658)
二甲亚砜，USP(Spectrum，D1258，lot RE0754)
甘露醇，USP(Spectrum，MA165，lot RE1020)
海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)
DMEM(Quality Biological 112-103-101，lot 710850)
普罗布考(Sigma P-9672，lot 128H0695)
Trolox(Aldrich 23，881-3，lot 02507TS)
1M五倍子酸丙酯(Sigma，P-3130，lot 60K0877)贮备液，在200耐性乙醇(Aldrich E702-3，lot 012I3740)中制得的
3mL血清瓶(Wheaton#223648)
Stelmi堵塞器(#C1503 6720GC 6DT)
操作：
1.将七个猪ACL融化，在PBS中洗涤5次。
2.将整个ACL在一种下列溶液中于40℃浸泡4小时，然后在4℃浸泡过夜(约15小时)：
a.盐水；
b.2.2M丙二醇、3.1M DMSO、150mM甘露醇和100mM海藻糖，用盐水调节至所需体积；
c.2.2M丙二醇、3.1M DMSO、150mM甘露醇、100mM海藻糖、1％solutol，用盐水调节至所需体积；
d.DMEM；
e.DMEM、2.2 M丙二醇、150mM甘露醇；
f.DMEM、50μM普罗布考、2％DMSO；或
g.DMEM、50mM trolox、100mM五倍子酸丙酯；
3.将ACL从溶液中取出来。观察到腱性质的改变，并且在下面记录(在该部分中的字母与在上面2中用相同字母表示的溶液相对应)
4.将ACL切成两半，将末端修剪以与3mL小瓶相适合(一半用于0kGy对照，另一半用于50kGy)。将样本在-80℃贮藏直至用于辐射包装。
5.将样本在干冰上辐射至总剂量为约50kGy。
结果：
与其它稳定剂混合物相比，用稳定剂混合物d、e和f处理的辐射的样本表现出改善的结果。
实施例17
目的：测定不同的稳定剂混合物对辐射至50kGy的牛胫骨的保护作用。
材料：
牛胫骨，得自屠宰场(Mt.Airy Meat Locker)，洗涤并研磨至3mm×3mm×42mm的片段
丁二醇(Aldrich B8，490-4，lot K023119B0)
丙二醇(Sigma，P-4347，lot 111K1658)
DMSO，USP(Spectrum，D1258，lot RE0754)
甘露醇，USP(Spectrum，MA165，lot RE1020)
海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)
五倍子酸(Sigma，G-7384，lot 111K0103)
抗坏血酸钠，USP(Spectrum S1349，lot RM0398)
Branson 2710水浴超声器
30mL血清瓶(Kimble Glass 62121D-30)
20mm堵塞器(Stelmi C1404 672GC 6TP，lot G005/3758)
在水中的柠檬酸钠二水合物(Mallinkrodt #0754，lot 0754T51H28)
稳定剂混合物：
a.F1(BDGT)：
2.2M丁二醇
3.1M DMSO
100mM五倍子酸
50mM海藻糖
b.F4(BGMT)：
2.2M丁二醇
50mM五倍子酸
150mM甘露醇
50mM海藻糖
c.F4-prop(GMPT)：
50mM五倍子酸
150mM甘露醇
2.2M丙二醇
50mM海藻糖
d.F4+pH(BGMTc)：
2.2M丁二醇
50mM五倍子酸
150mM甘露醇
50mM海藻糖
200mM柠檬酸钠
e.CK2(BDMT)
2.2M丁二醇
3.1M DMSO
150mM甘露醇
100mM海藻糖
操作：
1.将研磨的骨密质片置于大的烧杯中并混和。
2.随机选择6个骨片，置于50mL锥形瓶中以用一种上述稳定剂混合物处理。
3.将上述稳定剂混合物加至锥形瓶的40mL标志处。
4.将锥形瓶放置在浮床上，然后置于水浴超声器中。
将水浴中的水预先冷却至4℃
在4个小时期间内，每隔约15分钟用冰冷却的水替换水浴中的水。
5.超声处理后，将锥形瓶置于固定架上，在4℃轻微搅拌24小时。
6.将骨片从锥形瓶中取出，除去过量稳定剂混合物，将6个骨片置于25mL用于辐射的血清瓶中。
7.将血清瓶堵塞，盖上盖子，在-80℃贮藏直至进行辐射。
8.将样本在干冰上辐射至总剂量为约50kGy。
9.通过三点弯曲试验测定骨的机械强度。
结果：
三点弯曲试验分析给出了关于辐射的样本的机械强度的下列结果(相对于未辐射的对照的平均值)：
无稳定剂：62％
CK2：78％
F1：77％
F4：67％
F4+pH：71％
F4-prop：62％
实施例18
目的：测定不同的稳定剂混合物对辐射至50kGy的牛胫骨的保护作用。
材料：
牛胫骨，得自屠宰场(Mt.Airy Meat Locker)，洗涤并研磨至3mm×3mm×42mm的片段
DMSO(Spectrum，D1258，lot RE0754)
海藻糖(Sigma T-9531，lot 062K7302)；0.5M在水中的贮备液
五倍子酸(Sigma，G-7384，lot 111K0103)
丁二醇(Aldrich B8，490-4，lot K023119B0)
丙二醇(Sigma，P-4347，lot 111K1658)
柠檬酸钠二水合物(Mallinkrodt 0754，lot 0754T51H28)；2M在水中的贮备液
具有Maestro软件的VirTis Genesis 25EL冷冻干燥器
    o 08.16.02-08.19.02 freeze dry 1-Teri Bone cycle
稳定剂混合物：
a.BDGT：
2.2M丁二醇
3.1M DMSO
100mM五倍子酸
50mM海藻糖
b.BDGT+C：
2.2M丁二醇
3.1M DMSO
100mM五倍子酸
50mM海藻糖
200mM柠檬酸盐
c.PDGT：
2.2M丙二醇
3.1M DMSO
100mM五倍子酸
50mM海藻糖
d.PDGT+C：
2.2M丙二醇
3.1M DMSO
100mM五倍子酸
50mM海藻糖
200mM柠檬酸盐
在加入组织之前将五倍子酸轻微加热。
操作：
1.随机选择6个骨片，置于50mL锥形瓶中。称重骨片，然后将稳定剂混合物或水加至40mL标志，记录重量。如下所述在每个条件下使用2个样本(1组是用于冷冻，另一组是用于冷冻干燥)：
    样本     骨湿重(g)     +制剂(g)
    0     4.29/4.39     41.35/41.21(水)
    50     4.35/4.33     41.20/41.16(水)
    BDGT     4.22/4.28     43.35/43.03
    BDGT+C     4.34/4.32     44.85/44.66
    PDGT     4.34/4.28     43.68/43.54
    PDGT+C     4.46/4.45     44.83/45.18
    *BDGT+C     4.24/4.28     44.59/44.46
2.将含有骨的50mL锥形瓶放置在超声器中，在4个小时的超声总时间内，每隔约15分钟用冰冷却的水替换水浴中的水。
3.超声处理后，将样本在Styrofoam盒子中于4℃放置24小时。然后将样本置于30mL用于辐射的血清瓶中，并在-80℃冷冻，或者置于玻璃板上，并放到冷冻干燥器中。
4.冷冻干燥后，将骨置于30mL血清瓶中，盖上盖子，在-80℃贮藏。
5.将样本辐射至总剂量为约50kGy。
6.通过三点弯曲试验分析样本。
结果：
对于辐射至50kGy的冷冻干燥的样本，与未用稳定剂混合物处理的样本相比，用BDGT和BGDT+C处理的样本的机械强度平均增加了约1.6倍。加入柠檬酸盐没有影响机械强度。
虽然已充分描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，可在不背离本发明范围或其任何实施方案的情况下，用宽且等同的条件、制剂以及其它参数范围来实施本发明方法。
在本文中引用的所有专利和出版物都全文引入本文以供参考。任何出版物的引用是由于其在本申请提交日期之前公开，而不应当解释为承认这样的出版物是现有技术，或者本发明没有权力依靠在先的发明让这样的出版比实际日期早。
上述实施方案和优点仅是举例说明，而不是对本发明的限制。本发明的教导易于应用其它类型的装置。本发明的描述是说明性的，不限制权利要求的范围。许多替代方案、改变和变型对于本领域技术人员来说是显而易见的。

Claims (90)

1.用于将含有非水性溶剂并且对辐射敏感的生物材料灭菌的方法，所述方法包括用射线以能将所述生物材料有效灭菌和保护所述生物材料免受所述辐射损害的辐射率将所述生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间。
2.用于将含有非水性溶剂并且对辐射敏感的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：
(i)将至少一种稳定剂以有效保护所述生物材料免受所述辐射损害的量加到所述生物材料中；和
(ii)用合适的射线以有效辐射率将所述生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间。
3.用于将含有非水性溶剂并且对辐射敏感的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：
(i)将所述生物材料的残余溶剂含量降低到有效保护所述生物材料免受所述辐射损害的水平；和
(ii)用合适的射线以有效辐射率将所述生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间。
4.用于将含有非水性溶剂并且对辐射敏感的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：
(i)将所述生物材料的温度降低到有效保护所述生物材料免受所述辐射损害的水平；和
(ii)用合适的射线以有效辐射率将所述生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间。
5.用于将含有非水性溶剂并且对辐射敏感的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：
(i)给所述生物材料施加至少一种选自下列的稳定化处理：
(a)降低所述生物材料的残余溶剂含量，
(b)降低所述生物材料的温度；和
(c)将至少一种稳定剂加到所述生物材料中；和
(ii)用合适的射线以有效辐射率将所述生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间，其中所述至少一种稳定化处理和辐射率一起有效地保护所述生物材料免受所述辐射损害。
6.用于将含有非水性溶剂并且对辐射敏感的生物材料灭菌的方法，所述方法包括：
(i)给所述生物材料施加至少两种选自下列的稳定化处理：
(a)降低所述生物材料的残余溶剂含量，
(b)降低所述生物材料的温度；和
(c)将至少一种稳定剂加到所述生物材料中；和
(ii)用合适的射线以有效辐射率将所述生物材料辐射能将所述生物材料有效灭菌的时间，其中所述至少两种稳定化处理一起有效地保护所述生物材料免受所述辐射损害，并且其中所述至少两种稳定化处理可以以任何次序进行。
7.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述非水性溶剂是有机溶剂。
8.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率不超过约3.0kGy/小时。
9.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率不超过约2.0kGy/小时。
10.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率不超过约1.0kGy/小时。
11.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率不超过约0.3kGy/小时。
12.权利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率超过约3.0kGy/小时。
13.权利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率是至少约6.0kGy/小时。
14.权利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率是至少约18.0kGy/小时。
15.权利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率是至少约30.0kGy/小时。
16.权利要求2、3、4、5或6的方法，其中所述有效辐射率是至少约45kGy/小时。
17.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶剂的生物材料保持在低氧气氛中。
18.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶剂的生物材料保持在含有至少一种稀有气体或氮气的气氛中。
19.权利要求18的方法，其中所述稀有气体是氩。
20.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶剂的生物材料保持在真空中。
21.权利要求3、5或6的方法，其中用选自下列的方法将所述残余溶剂含量降低：冻干、干燥、浓缩、加入溶质、蒸发、化学萃取、喷雾干燥和玻璃化。
22.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量小于约15％。
23.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量小于约10％。
24.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量小于约3％。
25.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量小于约2％。
26.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量小于约1％。
27.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量小于约0.5％。
28.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量小于约0.08％。
29.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中在辐射所述生物材料的所述步骤之前，把至少一种稳定剂加到所述含有非水性溶剂的生物材料中。
30.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述含有非水性溶剂的生物材料含有至少一种选自下列的生物污染物或病原体：病毒、细菌、酵母、霉菌、真菌、寄生虫和朊病毒或单独或联合引起TSEs的类似物。
31.权利要求2、5或6的方法，其中所述至少一种稳定剂是抗氧化剂。
32.权利要求2、5或6的方法，其中所述至少一种稳定剂是自由基清除剂。
33.权利要求2、5或6的方法，其中所述至少一种稳定剂是联合稳定剂。
34.权利要求2、5或6的方法，其中所述至少一种稳定剂是配体。
35.权利要求37的方法，其中所述配体是肝素。
36.权利要求2、5或6的方法，其中所述至少一种稳定剂减轻归因于反应性氧物质的损害。
37.权利要求2、5或6的方法，其中所述至少一种稳定剂选自：抗坏血酸或其盐或酯；谷胱甘肽；6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸；尿酸或其盐或酯；蛋氨酸；组氨酸；N-乙酰半胱氨酸；α-硫辛酸；甲醛次硫酸钠；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯，香豆酸，和它们两种或多种的混合物。
38.权利要求37的方法，其中所述两种或多种稳定剂的混合物选自：抗坏血酸、或其盐或酯与尿酸、或其盐或酯的混合物；抗坏血酸、或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；抗坏血酸、或其盐或酯、尿酸、或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；尿酸、或其盐或酯；α-硫辛酸；甲醛次硫酸钠；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯、香豆酸与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；和乙醇与丙酮的混合物。
39.权利要求2、5或6的方法，其中所述至少一种稳定剂是二肽类稳定剂。
40.权利要求39的方法，其中所述二肽类稳定剂选自甘氨酰基-甘氨酸(Gly-Gly)、肌肽和鹅肌肽。
41.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射是粒子辐射或电磁辐射或它们的混合物。
42.权利要求41的方法，其中所述电磁辐射选自无线电波、微波、可见或不可见光、紫外线、X-射线辐射、γ辐射和它们的联合。
43.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是γ辐射。
44.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是E-射束辐射。
45.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是可见光。
46.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是紫外线。
47.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是X-射线辐射。
48.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是多色可见光。
49.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是红外线。
50.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射物是一种或多种波长的可见光与紫外线的联合。
51.权利要求1、2、3、5或6的方法，其中所述辐射是在室温进行的。
52.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射是在低于室温的温度进行的。
53.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射是在低于所述含有非水性溶剂的生物材料的冰点的温度进行的。
54.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述辐射是在低于所述含有非水性溶剂的生物材料的低共熔点的温度进行的。
55.权利要求1、2、3、5或6的方法，其中所述辐射是在高于室温的温度进行的。
56.组合物，其中包含至少一种含有非水性溶剂的生物材料和一定量的至少一种稳定剂，其中所述量的稳定剂能有效保护所述生物材料在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用。
57.包含至少一种含有非水性溶剂的生物材料的组合物，其中所述生物材料的残余溶剂含量处于能有效保护所述生物材料在用辐射灭菌后仍可实现其预期应用的水平上。
58.权利要求57的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约15％。
59.权利要求57的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约10％。
60.权利要求57的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约5％。
61.权利要求57的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约2％。
62.权利要求57的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约1％。
63.权利要求57的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约0.5％。
64.权利要求57的组合物，其中所述残余溶剂含量低于约0.08％。
65.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料是玻璃状或玻璃化的。
66.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约0.5％。
67.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约1％。
68.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约5％。
69.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约10％。
70.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约15％。
71.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约20％。
72.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约25％。
73.权利要求56或57的组合物，其中所述含有非水性溶剂的生物材料的蛋白总浓度为至少约50％。
74.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述非水性溶剂选自甘油、DMSO、乙醇、丙酮和PPG。
75.权利要求74的方法，其中所述PPG是PPG 400、PPG 1200或PPG 2000。
76.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约0％。
77.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约1％。
78.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约2.4％。
79.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约4.8％。
80.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约7％。
81.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约9％。
82.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约10％。
83.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约20％。
84.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量为约33％。
85.权利要求3、5或6的方法，其中所述残余溶剂含量低于约33％。
86.权利要求56的组合物，其中所述至少一种稳定剂选自：抗坏血酸或其盐或酯；谷胱甘肽；6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸；尿酸或其盐或酯；蛋氨酸；组氨酸；N-乙酰半胱氨酸；α-硫辛酸；甲醛次硫酸钠；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯，香豆酸，和它们两种或多种的混合物。
87.权利要求86的组合物，其中所述两种或多种稳定剂的混合物选自：抗坏血酸、或其盐或酯与尿酸、或其盐或酯的混合物；抗坏血酸、或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；抗坏血酸、或其盐或酯、尿酸、或其盐或酯与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；尿酸、或其盐或酯；α-硫辛酸；甲醛次硫酸钠；五倍子酸或其衍生物；五倍子酸正丙酯、香豆酸与6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸的混合物；和乙醇与丙酮的混合物。
88.预防或治疗哺乳动物中感染或疾病的方法，包括给有此需要的哺乳动物施用有效量的依据权利要求1-6任一项的方法制得的生物材料。
89.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中所述生物材料选自尿激酶、免疫球蛋白、凝血酶、胰蛋白酶、白蛋白、纯化的蛋白因子和组织。
90.权利要求89的方法，其中所述组织选自心脏瓣膜和脱矿质的骨基质。
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WO (1) WO2003026703A1 (zh)
ZA (1) ZA200401975B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101366954B (zh) * 2008-09-19 2013-03-20 乐普（北京）医疗器械股份有限公司 一种生物涂层医疗装置的灭菌处理方法
CN103446600A (zh) * 2012-05-31 2013-12-18 通用电气公司 为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法和相应的生物传感器
CN103619365A (zh) * 2011-05-09 2014-03-05 艾博特心血管系统公司 使聚合物支架的分子量在灭菌后稳定的方法
CN104587505A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 江苏省农业科学院 原位对基质快速消毒的方法
CN106794270A (zh) * 2014-05-23 2017-05-31 4I有限公司 闭路式无菌设备及整个无菌链中的收集、运输和处理方法
CN107454849A (zh) * 2015-03-27 2017-12-08 萨卢庞特咨询有限公司 S‑亚硝基硫醇的灭菌方法
CN109475482A (zh) * 2016-03-21 2019-03-15 西姆莱斯股份公司 药物

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030031584A1 (en) * 2001-08-10 2003-02-13 Wilson Burgess Methods for sterilizing biological materials using dipeptide stabilizers
US7252799B2 (en) * 2001-08-31 2007-08-07 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations containing albumin
US20030185702A1 (en) * 2002-02-01 2003-10-02 Wilson Burgess Methods for sterilizing tissue
US20110091353A1 (en) * 2001-09-24 2011-04-21 Wilson Burgess Methods for Sterilizing Tissue
US20030180181A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-25 Teri Greib Methods for sterilizing tissue
FR2870458B1 (fr) * 2004-05-24 2008-10-03 Centre Nat Rech Scient Cnrse Produits et procede pour la decontamination des prions
WO2005120591A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-22 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Method for sterilization of biological preparations
JP2006289071A (ja) * 2005-03-18 2006-10-26 Toray Ind Inc 化合物の滅菌方法
US20060270571A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Burke Peter A Deactivation of mineral encapsulated nanobacteria
US20070134814A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Kajander E O Methods and compositions for the detection of calcifying nano-particles, identification and quantification of associated proteins thereon, and correlation to disease
US8580192B2 (en) 2006-10-31 2013-11-12 Ethicon, Inc. Sterilization of polymeric materials
US20090081785A1 (en) 2007-09-24 2009-03-26 Hememics Biotechnologies, Inc. Desiccated Biologics And Methods Of Preparing The Same
US20100086576A1 (en) 2008-10-06 2010-04-08 Myntti Matthew F Antimicrobial composition and methods of making and using same
US20120270293A1 (en) * 2009-12-07 2012-10-25 Wei-Sing Chu Standardization of tissue specimen preservation by ultrasound and temperature control
EP2547760A4 (en) 2010-02-17 2014-01-01 Hememics Biotechnologies Inc CONSERVATION SOLUTIONS FOR BIOLOGICAL AGENTS AND METHODS RELATING THERETO
US10653133B2 (en) 2011-05-10 2020-05-19 Next Science IP Holdings Pty Ltd Antimicrobial solid and methods of making and using same
DE102011051692A1 (de) * 2011-07-08 2013-01-10 Peter Brehm Chirurgie-Mechanik e.K. Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide und/oder Nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten Oberflächen
US9696324B2 (en) * 2011-12-27 2017-07-04 L'université Catholique De Louvain Method for measuring nitric oxide in blood
PL2846845T3 (pl) * 2012-05-09 2017-07-31 Icrom Spa Wytwarzanie sterylnego, farmaceutycznego brynzolamidu
CN103446601A (zh) 2012-05-31 2013-12-18 通用电气公司 为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法和相应的生物传感器
TWI709570B (zh) 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析法及製法
TWI709569B (zh) 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途
JP6653654B2 (ja) * 2014-01-17 2020-02-26 レプリゲン・コーポレイションＲｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ クロマトグラフィーカラムの滅菌
BR112021003420A2 (pt) 2018-08-31 2021-05-18 Genzyme Corporation resina cromatográfica estéril e uso da mesma em processos de manufatura
WO2022217041A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Hyalo Technologies, LLC Method of sterilization of biologics
WO2023200689A1 (en) * 2022-04-11 2023-10-19 Epirus, Inc. Systems and methods for neutralizing matter

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US23195A (en) * 1859-03-08 John l
DE280466C (zh)
USRE23195E (en) 1950-02-07 Preserving
US2832689A (en) * 1952-01-24 1958-04-29 Research Corp Preservation of organic materials by irradiation
US2920969A (en) * 1954-08-25 1960-01-12 Gen Electric Method and means for irradiating foods
US2962380A (en) * 1956-10-08 1960-11-29 Research Corp Radiation sterilization of fluid food products
US3620944A (en) * 1967-09-09 1971-11-16 Osaka Prefecture Process of purifying water by irradiating it
US3743480A (en) * 1971-04-09 1973-07-03 Allied Chem Sterilization of biological fluids
US3779706A (en) * 1971-10-04 1973-12-18 Energy Sciences Inc Process for bulk sterilization, minimizing chemical and physical damage
US3962038A (en) * 1972-03-09 1976-06-08 Director Of National Food Research Institute Preparation of water-insoluble enzymes
US4136094A (en) * 1977-08-31 1979-01-23 The Regents Of The University Of Minnesota Preparation of intravenous human and animal gamma globulins and isolation of albumin
US4282863A (en) * 1978-07-20 1981-08-11 Beigler Myron A Methods of preparing and using intravenous nutrient compositions
US4336247A (en) * 1978-09-05 1982-06-22 Eriksen Arthur E Body system nutrient material
IL58541A (en) * 1978-11-01 1982-02-28 Nordisk Insulinlab Antihemophilic factor preparation from human blood plasma and a process for producing it
US4330626A (en) * 1980-03-19 1982-05-18 The Enzyme Center, Inc. Method of preparing high-activity, low-bacteria, urease enzyme
DE3033932C2 (de) * 1980-09-10 1984-05-24 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verfahren zur Kaltsterilisation von Blutgerinnungsfaktor VIII enthaltenden Präparaten
JPS57103649A (en) * 1980-12-18 1982-06-28 Asahi Chemical Ind Sterilized gamma-globulin fixing column
US4472840A (en) * 1981-09-21 1984-09-25 Jefferies Steven R Method of inducing osseous formation by implanting bone graft material
US4963356A (en) * 1982-10-13 1990-10-16 Minnesota Mining And Manufacturing Company Stable antigenic extracts methods
US4727027A (en) * 1983-05-02 1988-02-23 Diamond Scientific Co. Photochemical decontamination treatment of whole blood or blood components
US4620908A (en) * 1983-10-03 1986-11-04 Biocell Laboratories, Inc. Method for destroying microbial contamination in protein materials
JPH0687062B2 (ja) * 1985-05-10 1994-11-02 株式会社京都医科学研究所 血液中の解糖阻止方法
SU1321420A1 (ru) 1985-06-19 1987-07-07 Московский научно-исследовательский институт микрохирургии глаза Способ изготовлени коллагенового покрыти дл использовани в офтальмологии
US4784850A (en) * 1985-09-04 1988-11-15 Mutzarei Maabarot Process for preparing antibodies against E. Coli K-99 antigen from bovine milk
US5185371A (en) * 1986-03-10 1993-02-09 University Of Southern California Method for disinfecting red blood cells
US4894253A (en) * 1986-08-12 1990-01-16 University Of Cincinnati Method for production of coated electrode
US4798611A (en) * 1986-10-14 1989-01-17 Hancock Jaffe Laboratories Enhancement of xenogeneic tissue
JPH0611290B2 (ja) * 1986-11-05 1994-02-16 住友ベークライト株式会社 ポリビニルアルコ−ルゲルのγ線滅菌法
US4865602A (en) * 1986-11-06 1989-09-12 Collagen Corporation Gamma irradiation of collagen/mineral mixtures
DE3640513A1 (de) 1986-11-27 1988-06-09 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur herstellung eines virussicheren, lagerstabilen und intravenoes vertraeglichen immunglobulin-g-praeparates
US5000951A (en) * 1987-03-09 1991-03-19 Diamond Scientific Company Multivalent canine distemper virus vaccine
DE3730533A1 (de) * 1987-09-11 1989-03-30 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur sterilisation von plasma oder plasmafraktionen
ZA887196B (en) 1987-09-28 1989-07-26 Beecham Inc Novel vaccine
EP0309602B1 (de) * 1987-09-30 1993-03-24 MUCOS EMULSIONSGESELLSCHAFT m.b.H. Verwendung katabolischer Enzyme zur Herstellung eines Medikaments zum Bekämpfen der erworbenen Immunschwäche (AIDS) und deren Vorstadien (LAS, ARC)
US4994237A (en) * 1987-10-02 1991-02-19 The Beth Israel Hospital Association Microwave preservation of bioprostheses
US4887866A (en) * 1987-11-12 1989-12-19 Dexta Corporation Adjustable armrest
GB8807187D0 (en) 1988-03-25 1988-04-27 Harrison J F Improvements in/relating to inactivation of infectious agents
DE3817603A1 (de) 1988-05-24 1989-11-30 Michael Stieglitz Extrakorporale-hyperthermie-geraet
US4931361A (en) * 1988-11-18 1990-06-05 California Institute Of Technology Cryoprotective reagents in freeze-drying membranes
US5643464A (en) * 1988-11-21 1997-07-01 Collagen Corporation Process for preparing a sterile, dry crosslinking agent
JPH07116022B2 (ja) * 1989-04-18 1995-12-13 三共株式会社 凍結乾燥製剤の製法
US5283034A (en) * 1989-06-29 1994-02-01 Applied Immune Sciences, Inc. Stabilization of sterilized surfaces for research and medical use
US5226065A (en) * 1989-10-13 1993-07-06 Stericycle, Inc. Device for disinfecting medical materials
JP3373201B2 (ja) 1990-04-16 2003-02-04 バクスター インターナショナル インコーポレーテッド ウイルス及び細菌の血液夾雑物の失活方法
US5418130A (en) * 1990-04-16 1995-05-23 Cryopharm Corporation Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants
US6187572B1 (en) * 1990-04-16 2001-02-13 Baxter International Inc. Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants
DE4012398A1 (de) * 1990-04-19 1991-10-24 Waelischmiller Hans Dipl Ing F Bestrahlungsvorrichtung
US5658722A (en) * 1990-05-15 1997-08-19 New York Blood Center, Inc. Process for the sterilization of biological compositions using UVA1 irradiation
US5712086A (en) * 1990-05-15 1998-01-27 New York Blood Center, Inc. Process for transfusing cell containing fractions sterilized with radiation and a quencher of type I and type II photodynamic reactions
US5981163A (en) * 1990-05-15 1999-11-09 New York Blood Center, Inc. Process for the sterilization of biological compositions using irradiation and quenchers of type I and type II photodynamic reactions
US5360605A (en) * 1990-09-04 1994-11-01 Edward Shanbrom Preservation of blood, tissues and biological fluids
US5336616A (en) 1990-09-12 1994-08-09 Lifecell Corporation Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation
JPH0898688A (ja) 1991-02-25 1996-04-16 Takeda Chem Ind Ltd ブロメライン溶液の安定化法
US5618662A (en) * 1992-03-02 1997-04-08 Cerus Corporation Intravenous administration of psoralen
US5641518A (en) 1992-11-13 1997-06-24 Purdue Research Foundation Method of repairing bone tissue
US5362442A (en) * 1993-07-22 1994-11-08 2920913 Canada Inc. Method for sterilizing products with gamma radiation
US5460962A (en) * 1994-01-04 1995-10-24 Organogenesis Inc. Peracetic acid sterilization of collagen or collagenous tissue
US6203755B1 (en) * 1994-03-04 2001-03-20 St. Jude Medical, Inc. Electron beam sterilization of biological tissues
ES2242189T3 (es) * 1994-05-13 2005-11-01 Miltenyi Biotec Gmbh Columna esteril y apirogena copulada a una proteina con miras a la fijacion y extraccion de sustancias dadas de la sangre.
SE9401986D0 (sv) * 1994-06-08 1994-06-08 Pharmacia Ab New process for sterilization and articles sterilized thereby
US5510122A (en) * 1994-09-28 1996-04-23 The Research Foundation Of State University Of New York Preparation and use of whole saliva
US5603894A (en) * 1994-10-31 1997-02-18 Abbott Laboratories Method of sterilizing a pharmaceutical composition
US5548066A (en) * 1994-12-02 1996-08-20 Central Biomedia, Inc. Failure of passive transfer immune serum and method of making same
US6485723B1 (en) * 1995-02-10 2002-11-26 Purdue Research Foundation Enhanced submucosal tissue graft constructs
US5637451A (en) * 1995-03-29 1997-06-10 New York Blood Center, Inc. Photodynamic treatment of red blood cells with phthalocyanines and red light at higher light fluence rates is protective of red blood cells
DE69622548T2 (de) 1995-04-07 2003-09-18 Purdue Research Foundation West Lafayette Gewebetransplantat zur blasenrekonstruktion
US5837313A (en) * 1995-04-19 1998-11-17 Schneider (Usa) Inc Drug release stent coating process
JP3799626B2 (ja) * 1995-04-25 2006-07-19 有限会社ナイセム 心臓血管修復材及びその製造方法
US5674292A (en) * 1995-06-07 1997-10-07 Stryker Corporation Terminally sterilized osteogenic devices and preparation thereof
US6235508B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-22 Baxter International Inc. Method of inactivation of viral and bacterial blood contaminants
US6049025A (en) * 1995-09-15 2000-04-11 Stone; Kevin R. Articular cartilage xenografts
US5691152A (en) * 1995-11-09 1997-11-25 E. R. Squibb & Sons, Inc. Stable avidin composition
US5730933A (en) * 1996-04-16 1998-03-24 Depuy Orthopaedics, Inc. Radiation sterilization of biologically active compounds
US6060233A (en) * 1996-06-14 2000-05-09 Biostore New Zealand, Ltd Methods for the lyophilization of platelets, platelet membranes or erythrocytes
US5945128A (en) * 1996-09-04 1999-08-31 Romano Deghenghi Process to manufacture implants containing bioactive peptides
US5985565A (en) * 1996-10-09 1999-11-16 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Chronic fatigue syndrome diagnosis
US6190855B1 (en) * 1996-10-28 2001-02-20 Baxter International Inc. Systems and methods for removing viral agents from blood
JP4046358B2 (ja) * 1996-12-10 2008-02-13 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 粘膜下組織抽出物
US6696270B2 (en) * 1996-12-10 2004-02-24 Purdue Research Foundation Gastric submucosal tissue as a novel diagnostic tool
JP4084420B2 (ja) * 1996-12-10 2008-04-30 パーデュー・リサーチ・ファウンデーション 管状粘膜下組織移植片構成物
US5856172A (en) * 1997-01-03 1999-01-05 Quality Technologies, Llc Preservation of microorganisms in a vial with a cap comprising an immobilized desiccant
JP4271262B2 (ja) * 1997-02-10 2009-06-03 バイオメディカル デザイン インコーポレイテッド 滅菌法
US6383810B2 (en) * 1997-02-14 2002-05-07 Invitrogen Corporation Dry powder cells and cell culture reagents and methods of production thereof
CA2217437A1 (fr) * 1997-04-25 1998-10-25 Mohamed Ressouany Films biodegradables a base de caseinate et leur procede de fabrication par irradiation
US5958669A (en) * 1997-05-02 1999-09-28 St. Jude Medical, Inc. Apparatus and method for crosslinking to fix tissue or crosslink molecules to tissue
US6197207B1 (en) * 1997-05-21 2001-03-06 Baxter International Inc. Method of reducing the possibility of transmission of spongiform encephalopathy diseases by blood products
US6010719A (en) * 1997-09-16 2000-01-04 Universiteit Gent Freeze-dried disintegrating tablets
US6066626A (en) * 1997-10-29 2000-05-23 Genzyme Corporation Compositions and method for treating lysosomal storage disease
DE19751284A1 (de) 1997-11-19 1999-05-27 Leo Prof Dr Gotzen Fixationselement
US6000044A (en) 1997-11-26 1999-12-07 Digital Equipment Corporation Apparatus for randomly sampling instructions in a processor pipeline
US6383732B1 (en) * 1999-02-11 2002-05-07 Crosscart, Inc. Method of preparing xenograft heart valves
US6157028A (en) * 1998-05-28 2000-12-05 Jrh Biosciences, Inc. Method for dose mapping to ensure proper amounts of gamma irradiation
US20030068815A1 (en) * 1999-02-11 2003-04-10 Stone Kevin R. Sterilized xenograft tissue
US6214221B1 (en) * 1999-02-22 2001-04-10 Henry B. Kopf Method and apparatus for purification of biological substances
US6258821B1 (en) * 1999-04-26 2001-07-10 Medimmune Oncology, Inc. Compositions comprising trimetrexate and methods of their synthesis and use
US6312931B1 (en) * 2000-02-11 2001-11-06 Purepulse Technologies, Inc. Protecting molecules in biologically derived compositions while treating with high intensity broad-spectrum pulsed light
US20030143106A1 (en) * 2000-03-23 2003-07-31 Kent Randall S. Methods and sterilizing biological materials
AU2002310364B2 (en) * 2001-06-08 2006-02-23 Morris Innovative Research, Inc. Method and apparatus for sealing access
US7252799B2 (en) * 2001-08-31 2007-08-07 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations containing albumin

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101366954B (zh) * 2008-09-19 2013-03-20 乐普（北京）医疗器械股份有限公司 一种生物涂层医疗装置的灭菌处理方法
CN103619365A (zh) * 2011-05-09 2014-03-05 艾博特心血管系统公司 使聚合物支架的分子量在灭菌后稳定的方法
CN103619365B (zh) * 2011-05-09 2015-09-30 艾博特心血管系统公司 使聚合物支架的分子量在灭菌后稳定的方法
CN103446600A (zh) * 2012-05-31 2013-12-18 通用电气公司 为含有葡萄糖氧化酶的膜杀菌的方法和相应的生物传感器
CN106794270A (zh) * 2014-05-23 2017-05-31 4I有限公司 闭路式无菌设备及整个无菌链中的收集、运输和处理方法
CN106794270B (zh) * 2014-05-23 2020-06-09 4I有限公司 闭路式无菌设备及整个无菌链中的收集、运输和处理方法
CN104587505A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 江苏省农业科学院 原位对基质快速消毒的方法
CN104587505B (zh) * 2015-02-02 2017-05-31 江苏省农业科学院 原位对基质快速消毒的方法
CN107454849A (zh) * 2015-03-27 2017-12-08 萨卢庞特咨询有限公司 S‑亚硝基硫醇的灭菌方法
CN109475482A (zh) * 2016-03-21 2019-03-15 西姆莱斯股份公司 药物

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