CN1617669A - 组织工程支架 - Google Patents

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W·L·莫菲
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D·J·穆尼
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Abstract

本发明涉及用于生产支架的方法和组合物，所述支架可用于包括组织工程在内的多种目的。更具体地说，本发明涉及利用融合晶体如融合的盐晶体来形成骨架。与现有技术的方法相比，本发明支架的生产方法改善了孔隙率、互连性并且易于制备。

Description

组织工程支架
本发明的完成在部分程度上得到政府R01-DE-13349基金和T32GM 08353培训补助金的支持，这两者均来自国立卫生研究所。政府在本发明中享有某些权利。
发明领域
本发明涉及用于组织工程的支架的生产方法和组合物。更具体地说，本发明涉及控制多孔聚合物支架的孔结构。
背景
组织工程包括利用活细胞生产用于组织替换的生物替代品。然而，为了使组织工程能实际使用，必须生产出允许组织生长的支架，所述组织生长近似于天然组织生长。
业已采用了若干技术来生产组织工程支架，并取得了不同程度的成功。例如，业已发现，由生物可降解聚合物组成的多孔支架广泛应用于若干组织类型的工程中(Hutmacher，D.W.，″Scaffolds in tissueengineering bone and cartilage″Biomaterials 21：2529 2000；Chaignaud，B.E.等人，″The history of tissue engineering usingsynthetic biodegradable polymer scaffolds and cells″In：Atala，A.，Mooney，D.J.，eds.Synthetic biodegradable polymer scaffolds.Boston，MA：Birkhauser，1997，pp.1-14)。各种组织工程策略将支架材料用作三-维基材，所述基材或者用于体外细胞接种，然后是移植(基于细胞的方法)；或者作为传导和诱导的基材，用于体内直接移植(传导方法)(Murphy，W.L.和Mooney，D.J.，″Controlled delivery ofinductive proteins，plasmid，proteins DNA and cells from tissueengineering matrices″J Periodontal Res 34：413 1999)。这些方案成功的程度部分取决于支架体系的内部结构。许多应用要求在支架体系之内高度地互相连接的大孔结构，以便促进神经和纤维血管的向内生长，增进细胞接种的均匀性，并促进接种细胞和由邻近体内位置迁移来的细胞的迁移。
支架建立于骨架上。骨架有助于调节支架材料的互连性和孔径大小。在支架形成之后，骨架必须除去。上面所述形成组织工程支架的现行方法的困难包括：最终产品的一致性问题，难于控制支架的互连性和孔径大小，以及在形成支架之后除去骨架材料的问题。
目前所需的是形成功能性组织工程支架的经济方法，所述支架的生产是容易且廉价的，使支架互连性和孔径大小具有一致性，并且在形成支架之后能够容易地除去骨架材料。
发明概述
本发明涉及用于组织工程的支架的生产方法和组合物。更具体地说，本发明涉及控制多孔聚合物支架的孔结构。
本发明的实施方案总地涉及用于生产多孔材料的方法和组合物，所述多孔材料包括但不局限于组织工程支架。更特别地，本发明的实施方案涉及用于生产大孔的生物可降解组织工程支架的组合物和方法，所述支架具有受控的孔互连性和孔隙率，并且易于生产。更确切地说，本发明的实施方案涉及改进生物可降解聚合物的加工处理方法以控制孔径大小和孔互连程度的组合物和方法。
可以预期的是，孔通过可融合的颗粒的融合相连接(并且形状和大小确定)，所述颗粒包括但不局限于晶体和非晶体材料。在一实施方案中，可融合颗粒或粒子包含盐孔隙原(porogen)(例如盐晶体)。融合步骤预期可以在形成三维聚合物支架之前进行。本发明的实施方案不局限于任何特定的盐。任何盐都可以使用。尽管本发明的实施方案不局限于任何特定的盐，可以用于本发明的合适盐的例子是氯化钙、氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸钙和氯化镁。在本发明的优选实施方案中，使用氯化钠。
本发明的盐晶体可从市场上购得(例如，Mallinkrodt，Paris，Kentucky)。盐晶体可以不同的直径范围购买，并且例如可以过筛，从而获得希望的大小。
可以预期的是，本发明的盐晶体经受处理条件(例如湿度)一定时间，使盐晶体能够部分地融合在一起。本发明的实施方案既不局限于任何特定的百分湿度，也不局限于任何特定的时间长度，以及任何特定的融合程度。例如，在一实施方案中，盐晶体暴露于50％-100％的湿度中。在另一实施方案中，盐晶体暴露于75％-99％的湿度中。在另一实施方案中，盐晶体暴露于92％-98％的湿度中。同样地，在一实施方案中，盐晶体暴露于湿气中10分钟至48小时。在另一实施方案中，盐晶体暴露于湿气中12-36小时。在另一实施方案中，盐晶体暴露于湿气中18-30小时。在另一实施方案中，盐晶体暴露于湿气中22-26小时。
预期到除湿度以外的处理条件。例如，可用酸和碱以及有机溶剂来融合孔隙原(例如盐晶体)。
本发明的实施方案不局限于任何融合程度。本领域普通技术人员应当认识：特定目的所需的融合程度将根据所培养细胞的种类以及所需互连性程度和孔径大小而改变。在下文中将描述产生不同融合水平的条件。
在本发明的一实施方案中，打算将生物可降解或非-生物可降解的聚合物注入盐晶格中。在另一实施方案中，预期非-生物可降解的聚合物是热塑性塑料。另外，还打算使生物可降解或非-生物可降解的聚合物溶解于溶剂中以易化注入。本发明的实施方案不局限于任何特定的生物可降解或非-生物可降解的聚合物或溶剂。本发明的实施方案预期多种生物可降解或非-生物可降解的聚合物-溶剂组合，只要生物相容性聚合物-溶剂组合不溶解融合的盐晶格。例如，预期的聚合物包括但不局限于任何聚酯(包括聚(α-羟基酯)，聚醚(包括聚环氧乙烷)，聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。在一实施方案中，打算将热塑性塑料用作原料。在另一实施方案中，打算将非生物可降解的聚合物用于形成支架。在优选的实施方案中，由于其生物相容性、变成天然代谢物的可控生物可降解性以及先前用作大孔组织工程支架体系，因此选择共聚物聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)。根据其溶解聚合物的特性和其不是孔隙原(例如盐晶体)的溶剂的特性，选择所使用的聚合物溶剂。另外，打算与不溶解聚合物支架的任何溶剂一起除去融合的颗粒组分(例如盐骨架)。在优选的实施方案中，溶剂是水。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，该方法包括：a)提供i)大量颗粒(例如可融合的微粒)，所述颗粒包含盐晶体，和ii)包含聚合物的溶液(例如溶解或悬浮于溶剂中的聚合物)；b)使所述颗粒暴露于一定条件使所述盐晶体融合在一起，从而产生骨架(或晶格)，所述骨架包含框架和在所述融合盐晶体之间的自由空间；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空间的条件下，使所述骨架与所述溶液接触；d)对所述溶液进行处理，以致使所述聚合物形成连续或半-连续的支架(即，对所述溶液进行处理以致使聚合物从溶液中出来并硬化)；和e)从所述支架中除去所述的融合盐晶体(所得的支架具有由在该方法中使用的融合盐晶体的自由空间限定的孔)。优选的是，大于75％并且在某些实施方案中甚至大于95％的自由空间在步骤c)中被填充。步骤(d)的优选处理方式包括使聚合物溶剂蒸发。步骤(e)的优选除去方式包括溶解所述融合盐晶体。步骤(b)的优选条件包括：使所述盐晶体暴露于约90％至约100％之间的相对湿度中约8-约28小时。
另外也优选的是，所采用的聚合物是生物相容的和/或生物可降解的。在一个所述的实施方案中，本发明涉及一种方法，该方法包括：a)提供i)大量颗粒，所述颗粒包含盐晶体，和ii)包含生物相容性聚合物的溶液；b)使所述颗粒暴露于使所述盐晶体融合至一起的足够的湿度条件下，从而产生骨架，所述骨架包含框架和在所述融合盐晶体之间的自由空间；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空间的条件下，使所述骨架与所述溶液接触；d)对所述溶液进行处理，以致使所述聚合物形成支架；和e)从所述支架中除去所述融合盐晶体(最终的支架也具有孔)。
当然，本发明也涉及根据上述方法生产的支架(以物质的组合物形式)。在一实施方案中，所述支架在步骤(e)之后包含细胞。
在一实施方案中，本发明的支架打算用于细胞和组织的培养。本发明实施方案的这种支架不局限于特定的细胞或组织类型。任何非-造血的和造血的组织或细胞类型均能够在本发明的组织工程支架上进行培养。在一实施方案中，本发明涉及在本发明的组织工程支架上使肌肉和神经细胞和组织进行生长。
除在神经系统应用中是至关重要的以外，在要求感觉控制的其它组织，如功能性骨骼肌，心脏和肾组织中，神经组织的向内生长也可能是至关重要的。纤维血管组织向内生长促进物质运输出入正在发育的组织，并且对于大块组织(即骨，肝，骨骼肌等等)的工程特别重要，在所述大块组织中，细胞没有用于氧和营养素获取和代谢废物排泄的通路。此外，均匀的细胞接种和轻易的细胞迁移，对于增进在传导性、诱导性和基于细胞的组织工程方法中产生的组织的均一性是十分重要的。
在其它的实施方案中，本发明打算在没有事先将细胞或组织添加至支架中的情况下将支架移植入生物体中。在一实施方案中，植入支架，并使细胞从周围组织迁移入支架中。在另一实施方案中，将支架设计成促进期望的细胞类型迁移并阻碍不希望细胞类型的迁移。例如，通过控制支架的孔隙率和孔径大小或通过对用于构建支架的材料的选择，而调节细胞类型迁移。在本发明中，支架的孔隙率和孔径大小将通过对所述盐的颗粒大小和在其上将构建支架的骨架构建期间所述盐颗粒所暴露的时间长度和百分湿度的选择来控制。
在另一实施方案中，本发明打算将支架设计成能使细胞诱导迁移入支架。例如，将支架设计成在移植之后能将细胞因子释放入周围环境中。细胞因子的释放将导致特定细胞类型迁移入支架。在另一实施方案中，支架将质粒DNA释放入局部环境中，由此使大量细胞在局部位置发生转染。
本发明涉及这样的实施方案，其中支架的孔隙率和孔径大小通过构建骨架中所用的盐粒大小，用来融合盐粒的百分湿度以及允许所述盐粒融合的时间长度来控制。在另一实施方案中，本发明打算控制孔的形状和方向。例如用长方形、正方形、球形或椭圆形盐颗粒(和在某些实施方案中，各形状盐颗粒的混合物)来控制孔的形状和方向。在另一发明中，本发明打算利用除水以外的溶剂来形成盐骨架。例如，可以预期的溶剂如酸、碱和有机溶剂。另外还可以预期的是，在聚合物骨架聚合之后用这些溶剂来溶解骨架。在另一实施方案中，作为形成盐骨架的方法，打算对盐颗粒进行加热，使盐颗粒经受压力以及经受电场或磁场。在另一实施方案中，在融合期间使颗粒骨架经受定向的机械力、电力或磁力，以控制孔方向和孔径大小。
在另一实施方案中，本发明打算将例如药物、生长因子、肽、抗体、抗生素、寡核苷酸、多核苷酸等等引入聚合物骨架中。尽管本发明不局限于任何特定的机理，但据信，引入的物质将从骨架中滤出并进入局部环境中，在其中，它们将有助于细胞趋化性，细胞转染，对抗疾病和感染等等。在本发明的一实施方案中，组织工程支架的生产方法预期将涉及四个步骤：1)生产起孔隙原作用的盐骨架，2)将聚合物溶液引入盐骨架中，3)使聚合物硬化成聚合物基质，和4)从聚合物基质中除去孔隙原，留下组织工程支架。在一实施方案中，聚合物是生物可降解的。
本发明的实施方案涉及一方法，该方法包括：a)提供i)盐晶体和ii)生物可降解的聚合物，b)使所述盐晶体暴露于使所述盐晶体融合在一起的条件下，以产生框架和自由空间，c)使所述生物可降解的聚合物与所述框架接触，其接触条件为所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空间，从而形成支架，和d)从所述支架中除去所述框架。
本发明的实施方案还打算利用氯化钙、氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸钙和氯化镁盐晶体以制备框架。
本发明的实施方案包括将聚酯、聚醚、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)用作生产支架的生物可降解的聚合物。另外，本发明的实施方案还预期的是，聚酯为聚(α-羟基酯)且聚醚为聚环氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)。在一实施方案中，生物可降解的聚合物是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
但本发明并不局限于特定的聚合物或聚合物源。本发明涉及均聚物、共聚物和/或聚合物的混合物。在一实施方案中，聚合物源是比浓对数粘度约1.6的聚(L-乳酸)(PLLA)。在另一实施方案中，聚合物是比浓对数粘度约0.5-0.6的聚(D，L-乳酸-共聚-羟基乙酸)(PLGA)。在另一实施方案中，聚合物是分子量约103,000的聚(d，l-乳酸)(PDLLA)。所述聚合物可从市场上得到，并且可以购自BoehringerIngelheim(Ingelheim，Germany)和/或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。在特定的实施方案中，聚合物是比浓对数粘度为0.78的85∶15聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)共聚物。另外，在不经进一步提纯的情况下使用这些聚合物。
另外也不打算将本发明局限于特定的溶剂。在一实施方案中，溶剂是二噁烷(D)。在另一实施方案中，溶剂是二噁烷和水(D/W)的溶液。在另一实施方案中，溶剂是四氢呋喃(THF)。在另一实施方案中，溶剂是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在另一实施方案中，溶剂是吡啶。在另一实施方案中，溶剂是甲醇。在另一实施方案中，溶剂是丙酮。在另一实施方案中，溶剂是氯仿。
本发明的实施方案涉及一方法，该方法包括：a)提供i)盐晶体和ii)生物可降解的聚合物，b)使所述盐晶体暴露于使所述盐晶体融合在一起的湿度下，以产生框架和自由空间，c)使所述生物可降解的聚合物与所述框架接触，其接触条件为所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空间，从而形成支架，和，d)从所述支架中除去所述框架。
本发明的实施方案还打算用于盐晶体融合的湿度处于约90％和100％之间。在一实施方案中，使孔隙原暴露至湿气中小于24小时，更优选小于10小时。在一实施方案中，，本发明还打算使盐晶体暴露于湿气中约20-28小时。另外，本发明的实施方案还涉及使支架形成条件包含气体发泡。另外，本发明的实施方案还涉及使支架形成条件包含溶剂浇铸。
本发明的实施方案涉及由下述方法生产的支架：a)提供i)盐晶体和ii)聚合物，b)使所述盐晶体暴露至所述盐晶体融合在一起的条件下，以产生框架和自由空间，c)使所述生物可降解的聚合物与所述框架接触，其接触条件为所述生物可降解的聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空间，从而形成支架，和，d)从所述支架中除去所述框架。
本发明的实施方案预期：盐晶体是氯化钙、氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸钙和氯化镁。在其它的实施方案中，本发明预期：支架由聚合物制成，所述聚合物选自聚酯、聚醚、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。在一实施方案中，聚合物是生物可降解的。
在另外的实施方案中，本发明预期，支架的聚合物选自聚(α-羟基酯)，聚醚聚环氧乙烷或聚乙二醇。
本发明的实施方案涉及由下述方法生产的支架：a)提供i)盐晶体和ii)聚合物，b)使所述盐晶体暴露至所述盐晶体融合在一起的湿度下，以产生框架和自由空间，c)使所述聚合物与所述框架接触，其接触条件为所述聚合物填充或基本上填充所述框架中的自由空间，从而形成支架，和d)从所述支架中除去所述框架。在一实施方案中，湿度在约90％和100％之间。在另一实施方案中，使盐晶体暴露于湿气中约20-28小时。
本发明的实施方案涉及通过气体发泡和溶剂浇铸而生产的支架。
本发明的实施方案涉及由本发明的实施方案制得的支架，其中支架还包含细胞。本发明并不局限于细胞来源。例如，细胞可以为任意多细胞生物体的细胞。在一实施方案中，细胞选自植物和动物。在另一实施方案中，细胞为哺乳动物的。在另一实施方案中，细胞为人类的。
本发明的一实施方案涉及一种方法，该方法包括：a)提供i)大量颗粒，所述颗粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述颗粒暴露至所述孔隙原融合在一起的条件下，以产生包含框架和在所述融合孔隙原之间的自由空间的骨架；c)在使所述溶液基本上填充所述自由空间的条件下，使所述骨架与所述溶液接触；d)对所述骨架和溶液进行压缩，以便形成固态物质；e)使所述固态物质暴露至高压气体；f)使气体压力减至环境压力；和g)从所述支架中除去所述融合的孔隙原。在另一实施方案中，所述方法预期在100和2000psi之间进行压缩。在另一实施方案中，所述方法预期气体压力在400和1200psi之间。在另一实施方案中，所述方法打算固态物质为半-固体。
附图说明
图1a和1b示出了：通过在95％湿度下进行a)12小时或b)24小时处理而融合的盐晶体的NaCl基质横截面的电子显微照片。
图2a，2b，2c，2d和2e示出了：利用盐融合法制得的溶剂浇涛组织工程支架横截面的电子显微照片。一小时的盐融合将在孔壁(A，C)中形成低密度的孔(31±10微米直径)，而24小时的融合处理将在孔壁(B，D)中形成高密度的更大孔(78±21微米)。另外，24小时盐融合的支架还示出了有轮廓的孔壁，其中厚的环直接与互连的孔(B，D)邻接，在更高放大率(E)时这将特别明显。
图3a和3b示出了通过在富含溶剂(约95％湿度)气氛中固相扩散而进行的盐融合过程。(A)在融合之前，盐颗粒间具有小区域的接触以及在边缘和棱角处尖锐的半径。(B)在暴露于95％湿度之中24小时之后，在接触点附近的扩散在颗粒之间形成厚的盐桥，并且在每个盐颗粒的边缘和棱角处使曲率半径增加。
图4示出了在溶剂浇铸/颗粒滤出方法中，在添加聚合物之前盐晶体边缘曲率半径的增加。根据融合0、12和24小时的盐晶体的电子显微照片测量半径。基于ANOVA，随后进行组平均值之间的对比(Bonferroni t检验)，0-12小时平均边缘半径改变不显著(p＞0.05)，然而，12-24小时的改变却极其明显(p＜0.001)。
图5a，5b，5c和5d示出了：利用盐融合法制得的气体发泡的组织工程支架横截面的电子显微照片。一小时的盐融合将在孔壁(A，C)中形成一些很小的孔，其类似于溶剂浇铸支架中的那些。24小时盐融合的支架显示出无组织的孔结构，其中邻接的孔似乎彼此进入(B，D)。
图6a和6b示出了经受不同时间盐融合、且通过溶剂浇铸(a)或气体发泡(b)制得的支架的压缩模量。数值表示平均值和标准偏差(n＝4)，并且*表示相对于对照有统计学上显著的差异(p＜0.05)。
定义
为了更好地理解本发明，提供如下定义。
“生物相容性聚合物”应该定义为与生物学体系相容(即无毒性)的合成或天然材料。
“生物可降解的生物相容性聚合物”应该定义为当暴露或置于生物学体系中时将发生降解(即分解)的生物相容性聚合物。降解速率不以任何方式受本发明实施方案的限制，并且可以是快速的(例如可以在几分钟之内发生降解)或慢速的(例如降解可以发生若干小时，若干天，若干周或若干月)。
“盐晶体”和“盐孔隙原”是用于本发明实施方案中的盐晶体，用以形成构建聚合物组织工程支架的骨架。
“融合(fusion)”应该定义为汇合并连接结合在一起。在本发明的一实施方案中，盐晶体通过在局部环境或气氛中的湿气并且有时通过加热而融合在一起。在另一实施方案中，本发明还打算，通过酸、碱或有机溶剂而使孔隙原(例如盐晶体)融合。
“可融合的颗粒”应该定义为：当暴露至导致颗粒熔融的条件时融合在一起的颗粒，以便当除去导致所述熔融的条件时，所述颗粒基本上彼此连接并具有引入融合颗粒基质内的自由空间。通过颗粒最长的度量，可融合颗粒约为0.02mm至5mm。可融合颗粒由如上所述发生反应的任何物质构成。可以一起使用多于一种类型的可融合颗粒。
对于基质，“半连续”应该定义为这样的基质，其具有与基质的其它部分是连续的(即在两处或更多处连接的)基质部分，但其中并不要求所有基质部分与基质的其它部分是连续的(即仅一处连接)。
“湿度”和“相对湿度”应该定义为在盐晶体的局部气氛(空气)中的水分。湿度测量与在该温度和大气压力下空气能够保持的水蒸汽最大量相比，在所述气氛中水蒸汽的量。用水蒸汽充分饱和的空气的相对湿度为100％。
“组织培养”和“细胞培养”应该定义为在体外无菌条件下细胞的生长。
“支架”应该定义为在其上细胞可以生长的三维结构。
“基本上填充”应该定义为填充自由空间的区域至满负载或近乎满负载。在一实施方案中，基本上填充应当指：大于约50％的自由空间被填充(例如被聚合物或聚合物溶液填充)。在另一实施方案中，基本上填充应当指：大于约75％的自由空间被填充。在另一实施方案中，基本上填充应当指：大于约90％的自由空间被填充。在另一实施方案中，基本上填充应当指：大于约95％的自由空间被填充。
在此将“自由空间”定义为：在本发明中实施的盐晶体框架(例如，融合孔隙原)之间的区域。在此将“框架”定义为：在内部有开放空间(即自由空间)的固态或半固态材料。
“传导迁移”应该定义为：在没有利用细胞因子或已知或怀疑会诱导细胞迁移的其它生物活性剂(例如，肽或DNA)的情况下细胞迁移入支架中。
“诱导迁移”应该定义为：在细胞因子或已知或怀疑会诱导细胞迁移的其它生物活性剂(例如肽或DNA)的帮助下细胞迁移入支架中。
在此“孔隙原”应该定义为：通过使聚合物溶液分布遍及整个孔隙原之中，可用于在基质中形成孔的物质。所述聚合物(或聚合物溶液)的所述分布可以在孔隙原融合成为骨架之前或之后。所述孔隙原可以是但不是必须是结晶物质。
“溶剂”应该定义为：使另一物质保持溶解状态的液体或气体(例如CO2)。在本发明的一实施方案中，溶剂应该是使聚合物保持溶解状态的液体，包括但不局限于生物相容的(和生物可降解的)聚合物。另外也不打算将本发明局限于特定的溶剂。在一实施方案中，溶剂是二噁烷(D)。在另一实施方案中，溶剂是二噁烷和水(D/W)的溶液。在另一实施方案中，溶剂是四氢呋喃(THF)。在另一实施方案中，溶剂是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。在另一实施方案中，溶剂是吡啶。在另一实施方案中，溶剂是甲醇。在另一实施方案中，溶剂是丙酮。在另一实施方案中，溶剂是氯仿。在另一实施方案中，溶剂是液体如水，其用来溶解聚合物溶液被引入其中和其后聚合物硬化的融合盐骨架。
在此“聚合物”定义为由重复(单体)单元或多体组成的大分子。在本发明的上下文中，将聚合物溶解或悬浮于合适的“溶剂”中，以形成“聚合物溶液”。在一实施方案中，通过除去溶剂使聚合物进行聚合。在另一实施方案中，除去溶剂简单地造成从液态聚合物溶液至固态连续聚合物基质的相变。
“聚合”应该定义为：形成多于一个单体的链。
在此，“聚合物溶液”应该定义为包含溶解或悬浮的聚合物(例如溶解或悬浮于溶剂中)的溶液。
在此“聚合物溶剂”应该定义为：其中可以溶解聚合物但同时不会明显地溶解用作孔隙原的物质的溶剂。
“热塑性塑料”应该定义为：当加热至指定温度以上时将熔融并且当冷却至该温度以下时将固化的一类聚合物。
在本发明中，“固态”应该是定义刚性量度的相对术语。术语“固态”应该包括术语“半固态”。半固体应该是保持可延展特性的固体。
发明总述
本发明涉及用于组织工程的支架的生产方法和组合物。更具体地说，本发明涉及在各种条件下利用氯化钠晶体及其他盐来形成其上可以构建支架(包括但不局限于组织工程支架)的骨架。然而，本发明的方法不局限于利用结晶物质。另外，非晶态的物质预期也可以用于生产支架。与现有技术的方法相比，本发明的用于生产组织工程支架的新颖方法改善了孔隙率，互连性并且易于制造，而且还能够更好地控制这些性质。
组织工程是在合成的、生物可降解的支架上由细胞生长新的结缔组织或器官，从而生产出用于移植回至供体宿主的部分或完全功能性的组织或器官。在一实施方案中，该技术涉及由植入(而不是移植)而生长的器官，并因此没有免疫排斥。在另一实施方案中，该技术涉及由供体移植细胞。在另一实施方案中，该技术涉及植入组织工程支架，使细胞在体内迁移入支架内。在某些实施方案中，可以预期的是，任何组织工程器官的起始点是收获来自组织工程器官的未来接受者的少量组织。对于有些应用，这可以小至2mm的钻孔活检组织。
当在二维表面上生长时，细胞相互作用并自己组织成功能性组织的能力是有限的。相比之下，三维骨架使细胞能够成长并组装成更接近类似其体内相应物的组织。
在正常生长和发育中，身体利用特化的结缔组织细胞以形成给各器官提供三维结构的“基质”或活基质。基质还提供附着位点并产生促进器官细胞成长发育成为有功能组织的生长因子。尽管基质的具体组分和构造对于各器官可以各不相同，但三维基质支持的基本原理可应用于体内绝大多数的器官。
简言之，所述方法将从支架着手，根据需要进行成型，用活细胞对其接种，并用培养基和生长因子对其浸泡。当细胞繁殖时，它们将填充支架并生长成为三维组织，并且一旦植入体内，细胞将再现其预定的组织功能。血管附着至新的组织上，支架溶解，并且新生长的组织最终将融入其周围环境。
在一实施方案中，器官特异性细胞可以在模拟体内环境的密闭生物反应体系中接种至三维支架上。例如，在皮肤组织工程中，细胞将附着、分裂、并分泌胞外基质蛋白质和生长因子，形成完全人类的功能性组织。
组织工程常常涉及干细胞，这是在1992年首先被分离出的一种成熟前的细胞。根据它们在培养皿或体内接触的生长因子，细胞将分化成特异性细胞类型，因此将干细胞植入合适的位置可产生从骨至肌腱至软骨的一切。
尽管本发明的实施方案不局限于特定的用途，但组织工程支架和组织工程可以用来再造许多组织和器官。一个例子是软骨修复。每年发生约900,000例关节软骨外伤损伤。在运动损伤及其他导致并发症的身体损伤之后，成人软骨通常不会再生。另一例子是骨修复。仅在美国估计每年有800,000个患者因严重骨折而住院，其中一半患者需要切开骨折复位操作。相当大部分的这些骨折不能适当地愈合，因此需要辅助程序，如骨移植。其它骨折对于任何努力都是无响应的，但它们可能是组织工程的理想候选者。另一例子是皮肤伤口愈合。皮肤伤口不能适当地愈合在美国每年影响估计2,600,000个患者。这些伤口常常是其它病症如糖尿病、循环疾病和制动的并发症。这些伤口甚至在若干月或若干年之后还不愈合，因此将导致严重的且危及生命的并发症如感染。患病肢体常常需要截肢。
优选实施方案的详细说明
A.溶剂浇铸和气体发泡。
传统上，组织工程支架通过溶剂浇铸法(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的制备和表征″Polymer 35：1068，1994)和气体发泡法(Harris，L.D.等人，″利用气体发泡形成的开孔生物可降解基质″JBiomed Mater Res 42：396，1998)制得。在溶剂浇铸法(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的制备和表征″Polymer 35：1068，1994)中，将聚合物溶解于合适的溶剂中，添加至含孔隙原的模具中并使孔隙原分散。然后，在环境条件下使溶剂从混合物中蒸发出，留下包含孔隙原的聚合物基质，然后可将孔隙原在合适的溶剂中滤出(leachedout)。在气体发泡法中(Harris，L.D.等人，″利用气体发泡形成的开孔生物可降解基质″J Biomed Mater Res 42：396，1998)，聚合物颗粒与孔隙原颗粒混合，并将该混合物压成散布有孔隙原的不连续聚合物的固体混合物。然后，使得到的粒料暴露于高压二氧化碳气体，并且在使压力平衡一段时间之后，迅速释放压力，从而使所述混合物的聚合物组分产生热力学不稳定性。所述不稳定性将使聚合物发泡，并且初始不连续的聚合物颗粒将融合在一起，从而形成在散布孔隙原颗粒周围的连续聚合物基质，然后将孔隙原颗粒在溶剂中滤出。在这些方法的每一种方法中，在得到的支架中孔之间的互相连接程度分别由溶剂蒸发或聚合物发泡步骤期间孔隙原颗粒的互相连接来确定。由于在融合之前孔隙原分散在聚合物内部，因此，孔隙原颗粒之间的互相连接程度不能主动地控制，并且在最终支架产品中孔的互连性也未受到控制。
考虑到支架内部孔互连性的相当大的益处，在各种组织工程策略中，对孔隙原互连性的增强和控制将是十分重要的。本发明的某些实施方案解决了控制支架孔隙率和互连性的这些问题。在本发明的优选实施方案中，孔隙原不是分散的，而是融合从而产生一骨架(或晶格)并将聚合物溶液引至该骨架上和其中。
B.细胞培养
并不打算使本发明受限于细胞来源。在一实施方案中，用于组织工程的细胞来自活检。然后使来自活检的细胞由外植体或胶原蛋白酶消化而培养，从而产生“细胞库”。然后，在合适的生理条件下，在基质和支架上进一步对这些细胞进行培养，从而形成用于植入的组织工程构建构。该方法在组织培养装置中进行以维持无菌环境。细胞的生物化学和物理活性可通过添加生长因子或细胞因子以及通过利用物理刺激而增强。在某些应用中，施加小物理负载的装置刺激存在于支架中的细胞群成为通常与器官发生和组织修复有关的生物-化学和生物-物理活性。在合适条件下进一步组织培养之后，该构建物然后可植回最初从其上取下细胞的患者。该技术将消除对抗排异反应药物的需要，这是因为组织工程组织由患者自己的细胞生长，因此，将作为患者身体的天然部分而被接受。
C.孔隙原融合
在本发明的实施方案中，盐晶体可通过暴露至某些条件(例如约95％湿度)而融合，从而增加溶剂浇铸和气体发泡PLG支架内的孔互连性。在溶剂浇铸之前盐基质的融合将在孔壁中形成洞孔，并且这些洞孔的直径和球形度将随盐融合处理的增加而增加。盐融合处理将使溶剂浇铸支架的压缩模量增加，这可能是由于孔壁中洞孔的邻近形成厚的环形支柱的缘故。在各种组织工程应用中，增加的孔互连性可能是有用的，特别是那些要求密切的细胞-细胞接触的应用(即神经和肌肉应用)。另外，由于盐融合法不仅在溶剂浇铸法而且在气体发泡方法中均赋予了改善的孔互连性，因此该构思可应用于其它基于固体孔隙原的方法，以生产具有高度互连性的大孔或微孔材料体系。
在溶剂浇铸，颗粒滤出方法中采用融合盐模具将在支架中的孔壁之间形成洞孔。随着盐融合时间增加，在支架横截面内的孔结构变得组织条理性下降。明显缺乏有组织条理的孔结构是由于盐融合试样优异的互连性，这将减少组织化良好的、大部分关闭的孔的存在。当支架对切开时，许多孔由于其缺乏连续的孔壁，因此将变平。实际上，融合盐基质增加的连续性在聚合物基质中将产生相应的不连续性，从而导致在孔之间的大通道和优异的互连性。另外，利用48小时或更长的盐融合时间不能制备出完整的试样。这进一步支持了盐基质连续性和组织工程支架连续性之间的相反关系。利用盐分散于其中的溶剂浇铸颗粒滤出法的先前的研究不能够控制根据本研究中所显示出的孔壁中的洞孔的孔互连性(Mikos，A.G.等人，″聚(L-乳酸)泡沫材料的制备和表征″Polymer 35：1068，1994；Kaufmann，P.M.等人，″Highlyporous polymer matrices as a three-dimensional culture system forhepatocytes″Cell Transplant 6：463，1997；Murphy，W.L.等人，″连续骨样矿物质在体外在多孔聚(丙交酯-共聚-乙交酯)支架内的生长″JBiomed Mater Res 50：50，2000)。在近来的研究中，研究人员利用热在溶剂浇铸之前使聚合孔隙原颗粒融合在一起(Ma，P.X.和Choi，J.“具有良好限定互连球形孔网络的生物可降解的聚合物支架”TissueEng 7：23，2001)。尽管利用加热可以证明在若干组织工程应用中是有用的，但在此所述的局部溶解方法可持有更宽的适用性，这是因为其可在室温融合若干类型的孔隙原颗粒(有机的和无机的)，以及其可能添加至包括生物活性诱导因子的处理技术(即气体发泡/颗粒滤出)。
在气体发泡之前，在PLG/NaCl混合物内NaCl晶体的融合对孔结构也具有显著的影响。在24小时盐融合(SF)、气体发泡支架内的孔似乎直接互相进入，这意味着很高的互连性而没有大大减小支架压缩模量(例如，参见图6b)。气体发泡法先前已用来加工处理包含生物活性血管内皮生长因子的支架(Sheridan，M.等人，″Bioabsorbablepolymer scaffolds for tissue engineering capable of sustained growthfactor delivery″J Control Rel 64：91，2000；Murphy，W.L.等人，″Sustained release of vascular endothelial growth factor frommineralized poly(lactide-co-glycolide) scaffolds for tissueengineering″Biomaterials 21：2521，2000)和包含编码血小板衍生生长因子的质粒DNA的支架(Shea，L.D.等人，″DNA delivery frompolymer matrices for tissue engineering″Nat Biotech 17：551，1999)以促进血管组织的向内生长。将本发明的新颖的盐融合方法添加至气体发泡法和溶剂浇铸法，将在组织工程支架整个内部形成高度互相连接的血管供应。在支架体系内使血管向内生长达到最大深度是大块组织工程策略中重大的目标，而本发明高度互连的孔结构对于最佳的血管组织向内生长是有利的。
当暴露于潮湿环境中时，在所谓“结块”的过程中相邻盐晶体将融合，这常常会形成岩盐或不适当贮存的食盐的大结块(将抗-结块剂如硅酸钙添加至食盐中，以防止结块，其主要是通过吸收在包装内的水分，否则这些水分会被吸入盐颗粒的表面内)。在优选的实施方案中，本发明不打算利用抗结块剂。在固态盐晶格内原子的扩散速率通过吸收水的存在而增加。增加的扩散使得接触的盐颗粒的表面能够结合，从而以类似于用于非-玻璃状陶瓷材料固态烧结法的过程在颗粒之间形成桥连。由于在所述过程中，盐颗粒的总表面积减少，从而降低表面能，因此单独的颗粒将开始融合(Van Vlack，L.H.“Elements ofMaterials Science and Engineering，”第4版，Addison-WesleyPublishing Company，Reading，MA，PP.120 & 316，1980)。各盐颗粒增加的球形度也是热力学有利的，因为这也降低各颗粒的总表面能。
D.支架模制
在盐融合24小时之后，溶剂浇铸支架具有明显增加的压缩模量，而气体发泡支架却没有。对于溶剂浇铸支架，PLG材料的更厚支柱在盐颗粒的圆角和边缘所空出的空间中形成，其形成更硬的结构，而PLG在支架中的体积分数不增加。随着NaCl融合时间的增加，气体发泡支架模量不发生类似的增加。这可能是由于在气体发泡法中盐融合期间存在着PLG颗粒的缘故。无庸置疑的是，甚至在两种类型颗粒(NaCl和PLG)都存在的情况下，在相邻NaCl晶体之间也会存在一些互相作用的空隙空间。由于扩散所造成的盐表面的位移限于在可利用的空隙空间内的移动。支持所述情况的证据在图5(b & d)中是显而易见的，其中支架由微多孔片材组成，而这在溶剂浇铸支架中却不存在，提示在NaCl融合过程期间，移动的盐晶体表面被更小的PLG颗粒所妨碍并可能在其周围流动。因此，尽管在相邻盐颗粒之间形成了桥连，但结晶表面的移动却由于PLG颗粒的存在而受到约束。这可能阻止了盐结构中空隙空间的生长，而其会导致在PLG支架中形成厚截面支柱，这就是对为什么在气体发泡支架中孔互连性增加而压缩模量不增加的解释。
E.举例性的应用
尽管不局限于任何特定的应用，但本发明实施方案的盐融合方法可应用于神经和肌肉组织的工程，这是因为所述组织对孔互连性的依赖性所致。桥接神经组织缺损(轴突延伸)和功能性骨骼肌组织的形成(成肌细胞融合)中的再生过程是需要密切细胞-细胞相互作用的生理学过程的例子。利用各种天然和合成支架材料进行神经间隙桥连的策略甚至在间隙长度小于10毫米的情况下也只取得了适度的成功(Valentini，R.F.等人，″Collagen-and laminin-containing gels impedeperipheral nerve regeneration through semipermeable nerve guidancechannels″Exp Neurol 98：350，1987；Aldini，N.N.等人，″Effectivenessof a bioabsorbable conduit in the repair of peripheral nerves″Biomaterials 17：959，1996)，在许多情况下失败的原因包括：导管缺乏足够的孔互连性以及不足的机械完整性。
利用多孔聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)(Evans，G.R.D.等人，″Tissueengineered conduits：the use of biodegradable poly(D，L-lactic-co-glycolic acid)scaffolds in peripheral nerveregeneration″In：Stark，G.E.，Horch，R.，Tanczos，E.，Eds.BiologicalMatrices and Tissue Reconstruction.Berlin：Springer，1998，pp.225-235)和聚(L-乳酸)(Evans，G.R.D.等人，″In vivo evaluation ofpoly(L-lactic acid)porous conduits for peripheral nerveregeneration″Biomaterials 20：1109，1999)支架用于神经再生的最近研究已在大鼠坐骨神经模型中在12毫米神经缺损中显示出希望。将该基本构思延伸至更大的关键神经缺损要求控制孔互连性从而使血管能够向内生长，避免在轴突延伸期间再生纤维的修剪并保证延伸轴突到达其靶器官。
为了促进成功的成肌细胞融合，增加且受控的孔互连性是必需的支架特征。此外，在功能性肌肉类器官内细胞的存活是扩散限制性的(Dennis，R.G.和Kosnik，P.E.，″Excitability and isometric contractileproperties of mammalian skeletal muscle constructs engineered invitro″In Vitro Cell Dev Biol-Animal 36：327，2000)，因此血管组织的向内生长对于增加功能性肌肉构建物的最大直径以便增强可收缩性能是必要的。尽管不局限于任何特定的应用，但本发明的某些实施方案(例如盐融合方法)特别适用于制备用于神经和肌肉应用的高度互相连接的支架。尽管本发明不局限于任何特定的理论，但据信，在促进三维细胞-细胞相互作用中孔互连性的重大优点有助于神经和肌肉组织在组织工程支架中的生长。
实验
下面实施例将用来解释本发明的某些优选的实施方案和方面，但这些并不构成对本发明范围的任何限定。
在下面的实验中，应用下列缩略语：eq(当量)、M(摩尔的)、μM(微摩尔的)、N(当量的)、mol(摩尔)、mmol(毫摩尔)、μmol(微摩尔)、nmol(毫微摩尔)、g(克)、mg(毫克)、μg(微克)、L(升)、dl(分升)、ml(毫升)、μl(微升)、cm(厘米)、mm(毫米)、μm(微米)、nm(纳米)、℃(摄氏度)、RDA(代表性差异分析)、nts(核苷酸)、kV(千伏)。
实施例1
在本实施例中，生产NaCl框架和生物可降解聚合物支架。对盐颗粒(Mallinkrodt，Paris，Kentucky)进行过筛以获得一定大小范围。使用约250-425微米直径的NaCl晶体。
利用NaCl作为颗粒孔隙原，通过溶剂浇铸/颗粒滤出方法或气体发泡/颗粒滤出方法制备多孔支架。基本上如Mikos，A.G.等人所述制备溶剂浇铸支架(″聚(L-乳酸)泡沫材料的制备和表征″Polymer 35：1068，1994；在此将其引入作为参考)。通过使NaCl晶体(直径约250-425微米)经受95％湿度为期0-24小时，从而在溶剂浇铸之前使NaCl晶体融合，而制备NaCl模子。使用保持在37℃的密闭的、水夹套细胞培养器(Forma Scientific，Inc.)形成用于NaCl晶体融合的95％湿度环境。
由Medisorb，Inc.(特性粘度(I.V.)＝0.78dl/g)和Boehringer-Ingelheim Inc.(I.V.＝1.5dl/g)获得丙交酯∶乙交酯比为85∶15的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLG)粒料。将高比浓对数粘度PLG用于溶剂浇铸方法中，以保证支架尽管其相对高的孔隙率(～97％)还会保持适当足够的机械完整性。将PLG粒料溶解于氯仿中(Mallinkrodt，Paris，Kentucky)从而获得10％(w/v)的溶液。然后，将聚合物溶液倒入如上所述其中盐晶体已融合的含NaCl模子中。在溶剂蒸发之后，通过在蒸馏水中浸约48小时而除去盐。
基本上如Harris，L.D.等人所述制备气体发泡的支架(″Open porebiodegradable matrices formed with gas foaming″J Biomed MaterRes 42：396，1998；在此将其引入作为参考)。通过使NaCl晶体(直径约250-425微米)经受95％湿度为期0-24小时，从而在溶剂浇铸之前使NaCl晶体融合，而制备NaCl模子。在95％湿度中处理之后，在进一步处理之前，在真空干燥器中对试样干燥48小时。使用保持在37℃的密闭的、水夹套细胞培养器(Forma Scientific，Inc.)形成用于NaCl晶体融合的95％湿度环境。将(如上制得的)PLG粒料溶解于氯仿中。将与PLG混合的融合NaCl的框架装载入铝模具中(1.35cm直径；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin)并利用CarverLaboratory Press(Fred S.Carver，Inc.，Menominee Falls，Wisconsin)在1500Psi下压制1分钟，从而获得固态圆片(厚度约3.4mm)。然后，将该试样暴露于高压CO2气体(800psi)24小时，从而用气体饱和聚合物。然后通过使气压降至环境压力而造成热力学不稳定性。这将导致二氧化碳气孔在聚合物基质内的成核和生长。然后，通过在蒸馏水中对基质浸滤48小时而从基质中除去NaCl颗粒。所有处理步骤均在室温下进行。
支架是圆形片，其直径约12毫米且厚度约为3毫米。在处理中，通过利用直径约250-425微米的NaCl颗粒来控制孔大小范围。利用固态聚合物已知的密度，测量的支架的聚合物质量，以及测量的支架的外部体积，来计算支架的总孔隙率。
实施例2
在本实施例中，将对支架进行表征。在95％湿度中温育NaCl晶体导致晶体的融合，从而形成高度互相连接的NaCl基质(图1a-b)。在溶剂浇铸之前，将融合盐模对切并成像，以观察NaCl晶体融合的程度。此外，在制备之后通过冷冻断裂将聚合物支架二等分。将碳涂层蒸发至各二等分盐模和聚合物支架的表面上，并利用在20-30kV操作的Hitachi S-3200N SEM在高真空下使试样成像。在添加在氯仿中的PLG(溶解浇铸)之前盐晶体的融合在支架内造成增加的孔互连性。象期望的那样，在支架内的孔结构(图2)类似于融合盐基质的结构(图1a-b)。在1小时盐融合(SF)试样的横截面内的孔显示出了在孔壁中具有间断洞孔的限定的孔结构(图2a，2c)，而24小时SF试样所产生的支架的横截面显示出了组织条理性差得多的孔结构，并且在孔壁中洞孔的密度很大(图2b，2d)。随着融合时间的增加，孔径尺寸将从1小时融合之后31±10微米的平均直径明显增加至24小时融合之后78±21微米(p＜0.05)。此外，在24小时SF支架中的孔壁显示出厚度轮廓线，因此在邻近孔壁中洞孔和沿着壁外径的区域中，孔壁似乎更厚(图2d)。更高放大率观察在24小时SF支架内的孔壁进一步显示出孔壁起伏状的结构(图2e)。盐融合过程对支架的孔隙率没有影响，并且对于每一盐融合时间，溶剂浇铸支架的计算的总孔隙率为97±1％。
对NaCl融合1小时和24小时之后形成的溶剂浇铸支架的电子显微照片的仔细观察表明：暴露至95％湿度中使盐颗粒的结构产生若干重大的改变。除了在接触点处颗粒间形成桥连以外，盐的单独颗粒中，边缘和棱角的曲率半径增加了(图1a和1b)。这些改变由图表示(图3)。利用MicrosoftTM PaintTM软件，根据电子显微照片计算盐晶体的曲率半径。对各图像的象素大小进行校准，并用铅笔工具在结晶边缘上标记相切点。然后用校准值和象素坐标来计算相切点之间的弦线长度，将其乘以(2/2，以便获得晶体的曲率半径。利用microsoft paint测量各洞孔主要的和次要的直径轴，并取平均值，来确定孔壁中洞孔的直径。在盐的各颗粒的边缘和棱角处曲率半径的增加使各颗粒的球形度增加(图4)，并因此使支架中每个所得的孔的球形度得以增加。晶体边缘的平均曲率半径从19±10微米增加至暴露至95％湿度12小时之后的32±15微米，然后增加至完整24小时暴露之后的62±18微米(图4)。结果，在24小时融合之后，许多较小的晶体变成几乎为球形。一个另外的结果是，在由各盐晶体的棱角和边缘所空出的空间中可以形成更厚的聚合物支柱，这可能会导致如上所述孔壁中的厚度轮廓线，并导致变化的机械性能。
在气体发泡之前在PLG/NaCl粒料中盐晶体的融合也导致孔结构的明显变化。1小时SF试样的横截面(图5a，5c)示出了类似于溶剂浇铸1小时SF试样的孔壁中的小洞孔。24小时盐融合的试样缺乏限定的孔结构，并且孔看来似乎简单地彼此进入(图5b，5d)。气体发泡的SF支架没有显示出在溶剂浇铸SF试样中观察到的在孔壁中的任何轮廓线。同样，盐融合过程对总支架孔隙率也没有影响。对于各种盐融合时间，气体发泡支架的总孔隙率为94±1％。
盐晶体融合24小时造成溶剂浇铸支架的压缩模量增加2倍(图6a)。支架的压缩模量利用MTS Bionix 100机械测试体系来测量。利用1mm/min的恒定变形速率，在压盘之间对试样进行压缩。压板的直径为45毫米，因此将覆盖支架的整个12毫米直径的表面。将小的预载荷施加至各试样上，以保证整个支架表面在测试之前与压板接触，并且在每次测试之前板间距等于所测试的支架的测量厚度。对未经盐融合的支架以及各盐融合时间的四个试样的每一个测量压缩模量。在图中的值表示平均值和标准偏差。利用InStatTM软件(2.01版)进行统计分析。在每个时间点，通过Student′s t-检验，将试验模量与对照模量进行对比，从而揭示出压缩模量的显著差异。在盐融合1小时或12小时之后，没有观察到明显的模量改变。另外，当与对照支架相比较时，利用盐融合处理的气体发泡支架的压缩模量存在统计学上显著的减小(图6b)。
实施例3
在本实施例中，本发明的支架用来培养细胞。通过γ照射，环氧乙烷或冷杀菌剂对支架进行灭菌。如果需要的话利用任何必需的生长因子，在合适的培养基中，将细胞接种至支架上。细胞培养基可以借助分批补料或借助灌注的方法来更换。不论何时总是保持无菌。
实施例4
在本实施例中，用本发明的支架将组织植入试验受试者的体内。在其它的实施例中，在没有组织或细胞的情况下支架用于直接植入，以使得细胞能够从身体进行传导性和诱导性迁移。从16只小鼠取活组织检查。从任何非造血组织或造血组织取活检。活组织检查取自所有试验动物的同一组织源。本实施例可以根据所需在许多种组织类型上进行。通过胶原蛋白酶处理将细胞与基底膜和合胞体解离。将来自8只小鼠的细胞在培养皿中进行培养。从另8只老鼠得到的细胞在本发明的支架上进行培养。在约7-21天的培养之后，将细胞或带有细胞的支架再植回至各小鼠身上。追踪观察表明，本发明的细胞/支架植入物中有血管陷入并且维持三维结构。追踪观察表明，在没有本发明支架的情况下所培养的细胞散入宿主动物中，并且既没有血管陷入，也没有维持可识别的三维结构。在其中细胞从周围组织迁移入支架的实施例中，追踪观察表明，支架中细胞的建立伴有循环血管的陷入。
正如由前述很明显的是，本发明涉及用于生产组织工程支架的新颖的组合物和方法。这些新颖的组合物和方法能够有效生产孔径大小和互连性一致的生物相容的结构。

Claims (27)

1.一种方法，包括：
a)提供i)大量颗粒，所述颗粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述颗粒暴露于所述孔隙原融合在一起的条件下，以产生包含框架和在所述融合孔隙原之间的自由空间的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空间的条件下，使所述骨架与所述溶液接触；d)对所述溶液进行处理，以使所述聚合物形成支架；和e)从所述支架中除去所述融合的孔隙原。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(c)中填充大于75％的自由空间。
3.权利要求1的方法，其中所述孔隙原由盐晶体组成。
4.权利要求3的方法，其中所述盐晶体选自氯化钙、氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸钙和氯化镁。
5.权利要求1的方法，其中在所述聚合物溶液中的所述聚合物选自聚酯、聚(α-羟基酯)、聚醚、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
6.权利要求5的方法，其中所述聚酯是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
7.权利要求5的方法，其中所述聚醚是聚环氧乙烷或聚乙二醇。
8.权利要求1的方法，其中所述步骤(d)的处理包括使聚合物溶剂蒸发。
9.权利要求1的方法，其中所述步骤(e)的除去包括溶解所述融合的盐晶体。
10.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)的条件包括使所述盐晶体暴露于约90％和约100％之间的相对湿度中约8-约28小时。
11.权利要求1的方法，其中所述支架在步骤(e)之后包含细胞。
12.一种方法，包括：
a)提供i)大量颗粒，所述颗粒包含孔隙原，和ii)包含生物相容性聚合物的溶液；b)使所述颗粒暴露于所述孔隙原融合在一起的湿度下，以产生包含框架和在所述融合孔隙原之间的自由空间的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空间的条件下，使所述骨架与所述溶液接触；d)对所述溶液进行处理，以使所述聚合物形成支架；和e)从所述支架中除去所述融合的孔隙原。
13.权利要求12的方法，其中在步骤(c)中填充大于75％的自由空间。
14.权利要求12的方法，其中所述孔隙原包含盐晶体。
15.权利要求14的方法，其中所述盐晶体选自氯化钙、氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸钙和氯化镁。
16.权利要求12的方法，其中在所述聚合物溶液中的所述聚合物选自聚酯、聚(α-羟基酯)、聚醚、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯。
17.权利要求16的方法，其中所述聚酯是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
18.权利要求16的方法，其中所述聚醚是聚环氧乙烷或聚乙二醇。
19.权利要求12的方法，其中所述步骤(d)的处理包括使聚合物溶剂蒸发。
20.权利要求12的方法，其中所述步骤(e)的除去包括溶解所述融合的盐晶体。
21.权利要求12的方法，其中所述步骤(b)的条件包括使所述盐晶体暴露于约90％和约100％之间的相对湿度中约8-约28小时。
22.权利要求12的方法，其中所述支架在步骤(e)之后包含细胞。
23.权利要求12的方法，其中所述步骤b)另外还包括将所述孔隙原暴露于正压，以使所述融合孔隙原之间的所述自由空间得以控制。
24.一种方法，包括：
a)提供i)大量颗粒，所述颗粒包含孔隙原，和ii)包含聚合物的溶液；b)使所述颗粒暴露于所述孔隙原融合在一起的条件下，以产生包含框架和在所述融合孔隙原之间的自由空间的骨架；c)在所述溶液基本上填充所述自由空间的条件下，使所述骨架与所述溶液接触；d)对所述骨架和溶液进行压缩，以形成固态物质；e)使所述固态物质暴露于高压气体；f)使气体压力减至环境压力；和g)从所述支架中除去所述融合的孔隙原。
25.权利要求24的方法，其中所述的压缩在100和2000psi之间。
26.权利要求24的方法，其中所述的气体压力在400和1200psi之间。
27.权利要求24的方法，其中所述固态物质是半固体。
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