CN1636566A - 与脱氢表雄酮或类似物组合的选择性雌激素受体调节剂 - Google Patents

与脱氢表雄酮或类似物组合的选择性雌激素受体调节剂 Download PDF

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Abstract

用于易感温血动物包括人，药物治疗和/或预防骨质疏松、乳房癌、高胆固醇血症、高脂血症或动脉粥样硬化的新方法，包括给予选择性雌激素受体调节剂，尤其是具有通式(I)的化合物，和选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄－5－烯－3β，17β－二醇的许多性类固醇前体，和在体内能转化成上述前体之一的化合物。另外，对药物治疗和/或预防骨质疏松症出现，公开了将二膦酸盐与选择性雌激素受体调节剂和/或性类固醇前体联合给予。也包括了用于本发明活性组分输送和药盒的药物组合物。

Description

与脱氢表雄酮或类似物组合的选择性雌激素受体调节剂
本申请是1999年6月10日提交的申请号为99809572.9，名为与脱氢表雄酮或类似物组合的选择性雌激素受体调节剂的分案申请。
发明领域
本发明涉及用于易感温血动物包括人的新联合治疗，来治疗骨质疏松、高胆固醇血症、高脂血症或动脉粥样硬化或减少上述疾病的发病的方法。具体地说，联合包括给予选择性雌激素受体调节剂(SERM)，提高患者的性类固醇前体水平，所述的前体选自脱氢表雄酮(DEHA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)和雄-5-烯-3β，17β-二醇(5-DIOL)。本发明也涉及用于上述联合(治疗)的药盒和药物组合物。
相关领域背景
人和一些其它的灵长类动物独特地具有肾上腺，肾上腺分泌大量的前体类固醇硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)和脱氢表雄酮，它们转化成雄烯二酮(4-二酮)，然后再转化成活性雄激素和/或雌激素(在周围组织)(Labrie等人，肿瘤学的重要进展，由V.T.de Vita、S.Hellman、S.A.Rosenberg、J.B.Lippincott编辑，Philadelphia，193-217，1985；Labrie，Mol.Cell.Endocrinol，78：C113-C118，1991；Labrie等人，睾丸细胞中的信号传导，Ernst Schering ResearchFoundation Workshop.由V.Hansson、F.O.Levy、K.Tasken编辑，Springer-Verlag，Berlin-New York(Suppl.2)，第185-218页，1996；Labrie等人，Steroids，62：148-158，1997)。在最近的研究中(Labrie等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，82：2403-2409，1997)，我们发现在20-80岁女性和男性中脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸-DHEA(DHEA-S)、雄-5-烯-3β，17β-二醇(5-二醇)、5-二醇-S、5-二醇脂肪酸酯和雄烯二酮循环水平显著减少。
尽管随着衰老女性内源雄激素显著下降，因惧恐心血管病的风险，更年期后女性使用雄激素也十分有限，因为以前的研究表明雄激素有不良的脂肪代谢特性。最近的研究显示，与单用雌激素相比，组合雌激素和雄激素治疗对血清胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL和HDL/LDL比例没有明显的作用(Sherwin等人，Am.J.Obstet.Gynecol.，156：414-419，1987)。与这些观察相一致，我们也指出DHEA(一种主要具有雄激素作用的化合物)对血清脂类显然地无有害作用(Diamond等人，J.Endocrinol.，150：S43-S50，1996)。类似地，用雌二醇+睾丸酮植入治疗6个月后单用雌二醇治疗期间，没有发现胆固醇、其亚组分或甘油三酯的浓度有改变(Burger等人，Br Med.J.Clin.Res.Ed.，294：936-937，1987)。需要指出的是人体研究显示血清DHEA-S与低密度的脂蛋白呈负相关(Parker等人，Science，208：512-514，1980)。最近，发现低血清睾丸酮和DHEA与增加的内脏脂肪(较高心血管风险的参数)之间有关联(Tchernof等人，Metabolism，44：513-519，1995)。
5-二醇是通过还原性17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)作用从DHEA生物合成的一种化合物，而且是一种弱雌激素。其与大鼠垂体前叶胞质中的雌激素受体的亲和力比17β-雌二醇(E2)低85倍(Simard和Labrie，J.Steroid Biochem.，26：539-546，1987)，进一步证实了从人子宫肌层和乳房癌组织中得到的同一参数的数据(Kreitmann和Bayard，J.Steroid Biochem.，11：1589-1595，1979；Adams等人，Cancer Res.，41：4720-4926，1981；Poulin和Labrie，Cancer Res.，46：4933-4937，1986)。然而，在成年女性中发现的血浆水平范围内的浓度，5-二醇能提高人乳房肿瘤ZR-75-1细胞的细胞增殖和黄体酮受体水平(Poulin和Labrie，Cancer Res.，46：4933-4937，1986)和增加MCF-7细胞中52kDa糖蛋白的雌激素依赖性合成(Adams等人，Cancer Res.，41：4720-4926，1981)。
如上所述，已知随着年龄的增加，血清DHEA、DHEA-S和5-二醇水平下降，而且相应的周围组织中雄激素和雌激素的形成也显著地随着年龄减少。DHEA-S和DHEA分泌改变导致由性类固醇刺激的生化和细胞功能显著的减少。结果，最近已将DHEA和DHEA-S用于治疗各种与性类固醇水平下降和/或失衡相关的病症。
骨质疏松，这种影响男性和女性的疾病，也与雄激素和雌激素的减少有关。已知雌激素减少骨骼降解的速率，而雄激素增加骨量。然而，通常用于抗骨质疏松的雌激素代替治疗，需要添加孕激素以中和子宫内膜的增生和由雌激素诱导的患子宫内膜癌的危险。另外，由于认为雌激素和孕激素都增加患乳房癌的危险性(Bardon等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，60：692-697，1985；Colditz等人，N.Engl.J.Med.，332：1589-1593，1995)，所以只有有限的女性愿意接受雌激素-孕激素代替治疗，而且通常是短期的治疗。
一些研究提出在男性中骨质疏松为雄激素缺乏的临床表现(Baran等人，Calcif.Tissue Res.26：103-106，1978；Odell和Swerdloff，West J.Med.124：446-475，1976；Smith和Walker，Calif.Tissue Res.22(Suppl.)：225-228，1976)。雄激素治疗，如用癸酸诺龙所观察到的，已发现能增加更年期后女性的脊椎骨矿物质密度(Need等人，Arch.Intern.Med.，149：57-60，1989)。更年期后女性用诺龙治疗能增加骨密度矿物质含量(Need等人，clin.Orthop.225：273-278，1987)。但在50％患者中发现了雄激素副作用。由于几乎现有的所有治疗仅限于减少骨丢失，而用促蛋白合成的类固醇诺龙却发现骨量有增加，所以这些数据是令人感兴趣的。已提出对性腺功能减退的男性可用雄激素来类似的刺激骨形成(Baran等人，Calcif，Tissue Res.26：103，1978)。Labrie等人报道，用DHEA治疗更年期后女性12个月，刺激了骨形成(J.Clin.Endocrinol.82：3498-3505，1997)。
DHEA(450mg/kg，b.w.，每周三次)能显著延缓经遗传育种会出现乳房癌的C3H小鼠乳房癌的产生(Schwartz，Cancer Res.39：1129-1132，1979)。另外，在较低血清DHEA水平的男性中发现形成膀胱癌危险性的增加(Gordon等人，CancerRes.51：1366-1369，1991)。
美国专利申请U.S.5,550,107涉及易患乳房和子宫内膜癌温血动物的治疗方法，包括用外科手术方法(切除卵巢)或化学方法(用LHRH促效剂，如[D-Trp6，des-Gly-NH2 10]LHRH乙基酰胺，或拮抗剂)来抑制卵巢激素的分泌，作为联合治疗的一部分。讨论了抗雌激素、雄激素、孕激素、性类固醇形成抑制剂(尤其是17β-羟类固醇脱氢酶或芳香酶催化的性类固醇的产生)，催乳素的分泌和生长激素分泌以及ACTH分泌的抑制剂。其公开副本的国际公开号为WO 90/10462。
另外，已发现心血管病和减少的血清DHEA和DHEA-S水平相关，已提出将DHEA和DHEA-S用于预防或治疗这些病症(Barrett-Connor等人，N.Engl.J.Med.315：1519-1524，1986)。
在老年Sprague-Dawley大鼠中，Schwartz(Kent郡，Geriatrics 37：157-160，1982)已发现用DHEA能不影响食物摄入而将它们的体重从600g减至550g。Schwartz(Cancer 39：1129-1132，1979)观察到接受DHEA(450mg/kg，每周三次)的C3H小鼠比对照小鼠体重明显减少、长得较老，而且身体脂肪较少也更具活力。这些体重的减少不是由胃口不佳或食物受限产生的。另外，DHEA可以预防被喂养增肥的动物在成年期增加体重而变肥(Kent郡，Geriatrics，37：157-160，1982)。
将DHEA给予瘦的Zucher大鼠，尽管食物摄入的增加，它们的体重却减轻了。被处理的动物的脂垫较小，所以表明DHEA增加了食物的代谢，导致较低的增重和脂肪蓄积(Svec等人，Proc.2ndInt.Conf.Cortisol and Anti-Cortisols，LasVegas，Nevada，USA，p.56 abst.，1997)。
在AVY突变小鼠(Yen等人，Lipids 12：409-413，1977)和Zucker大鼠(Cleary和Zisk，Fed.Proc.42：536，1983)中发现肥胖得到好转。用DHEA治疗的C3H大鼠比对照动物外貌更年轻(Schwartz，Cancer Res.39：1129-1132，1979)。
DHEA减少了用胆固醇喂养的兔动脉粥样硬化的发生(Gordon等人，J.Clin.Invest.82：712-720，1988；Arad等人，Arteriosclerosis 9：159-166，1989)。另外，已报道了高血清DHEA-S浓度能预防男性因心血管病而死亡(Barrett-Connor等人，N.Engl.J.Med.315：1519-1524，1986)。因此，发现DHEA和DHEA-S的循环水平与心血管病的死亡率成负相关(Barrett-Connor等人，N.Engl.J.Med.315：1519-1524，1986)且平行地减少免疫活性(Thoman和Weigle，Adv.Immunol.46：221-222，1989)。人体研究显示胎儿血清DHEA-S和低密度的脂蛋白(LDL)水平成负相关(Parker等人，Science 208：512，1980)。
国际专利公开物WO94/16709公开了DHEA的用途以及雄激素和雌激素治疗的益处。
据信先前领域发现的关联并未像本发明所公开的联合治疗那样，提出有效的、无不良副作用的治疗和预防方法。
发明概述
本发明的目的是提供一种有效的方法，以治疗骨质疏松、高胆固醇血症、高脂血症、动脉粥样硬化、乳房癌、子宫内膜癌、卵巢癌和子宫癌，并使不良副作用减至最小。
本发明的另一目的是提供减少患上述疾病危险性的方法。
本发明的另一目的是提供适合用于上述方法的药盒和药物组合物。
在一实施例中，本发明涉及治疗骨质疏松或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)和雄-5-烯-3β，17β-二醇(5-二醇)，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂(SERM)作为联合治疗的一部分。选择性雌激素受体调节剂是具有以下通式的苯并吡喃衍生物：
Figure A20041009746600131
其中G3选自氢、甲基和乙基，
D选自-OCH2CH2N(R3)R4，其中R3和R4和它们连接的氮一起为哌啶子基；
其中R1和R2分别选自氢、羟基、和在体内转化成羟基的部分，或其选自以下酸的盐：醋酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、延胡索酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、氢氯噻嗪、羟萘甲酸、乳酸、顺丁烯二酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、软脂酸、新戊酸、磷酸、丙酸、丁二酸、硫酸、酒石酸、对苯二酸、对-甲苯磺酸和戊酸。
在另一实施例中，本发明提供治疗高胆固醇血症或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂作为联合治疗的一部分。
在另一实施例中，本发明提供治疗高脂血症或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂作为联合治疗的一部分。
在另一实施例中，本发明提供治疗动脉粥样硬化或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂作为联合治疗的一部分。
在另一实施例中，本发明提供治疗乳房癌或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂作为联合治疗的一部分。
在另一实施例中，本发明提供治疗子宫内膜癌或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂作为联合治疗的一部分。
在另一实施例中，本发明提供治疗子宫癌或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂作为联合治疗的一部分。
在另一实施例中，本发明提供治疗卵巢癌或减少该疾病发病的危险性的方法，包括在需要上述治疗或上述减少的患者中，增加以下性类固醇前体的水平：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，还包括给予所述的患者治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂作为联合治疗的一部分。
在另一实施例中，本发明提供一种药盒，其所包括的第一容器中含有治疗有效剂量的至少一种选自以下的性类固醇前体：脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，和任何在体内能转化成上述前体的前体药物；还包括另一容器，其含有治疗有效剂量的至少一种选择性雌激素受体调节剂。
在另一实施例中，本发明提供一种药物组合物，其含有：a)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；b)至少一种治疗有效剂量的性类固醇前体，选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇，和在体内能转化成任一上述性类固醇前体的前体药物；和c)至少一种治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂。
在另一实施例中，本发明提供一种减少患乳房癌危险性的方法，包括给予需要这种减少的患者预防有效剂量的选择性雌激素受体调节剂。
在减少患乳房癌可能性的实施例中，希望将SERM给药与性类固醇前体给药组合。然而，本发明也包括单给药SERM，例如图1和图2所示，即使没有给予前体也提供显著的预防效果。用于该目的的优选SERM与上所述相同。优选的剂量和给药方法也是相同的。
如本文所述，选择性雌激素受体调节剂(SERM)是一种化合物，其直接或通过它的活性代谢物在乳房组织中作为雌激素受体拮抗剂(“抗雌激素”)起作用，也对骨组织和血清胆固醇(即减少血清胆固醇)水平提供雌激素或类雌激素作用。在体外或人或大鼠乳房组织中具有雌激素受体拮抗剂功能的非类固醇化合物(尤其是对人乳房癌细胞作用为抗雌激素的化合物)的功能与SERM类似。相反，类固醇抗雌激素的功能趋于不象SERM，因为它们对血清胆固醇没有表现出任何有益作用的倾向。我们测试并发现具有SERM功能的非类固醇抗雌激素包括EM-800、EM-01538、雷洛昔芬、他莫昔芬和屈洛昔芬。我们也测试了类固醇抗雌激素ICI 182，780，发现不像SERM那样起作用。本发明中的SERM可按本领域已知的这些化合物作为抗雌激素用时的剂量进行给药。
我们注意到SERM对血清胆固醇的有益作用和对骨和血清脂类的雌激素和类雌激素有益作用之间的关联。在我们的研究中，SERM显示出对所有这些参数的有益作用，包括骨量、胆固醇和甘油三酯水平。不希望束缚于理论，据信SERM(许多更可取的SERM具有通过1-2个碳原子连接的两个芳香环)通过该分子上述的部分(受体极易识别)与雌激素受体反应。优选的SERM具有侧链，该侧链将在乳房组织中产生选择性拮抗作用，而在其它组织中没有明显的拮抗特性。因此，SERM在乳房中可理想地具有抗雌激素功能，而在骨或血液(在其中有利地影响脂类和胆固醇的浓度)中具有惊人的和理想的雌激素功能(或提供类雌激素活性)。对类固醇和脂类的有益作用将转化成抗动脉粥样硬化(已知会受不适合的胆固醇和脂类水平的不利作用)的有益作用。
所有用本发明治疗的疾病都对雄激素有良好反应。申请者用的是性类固醇前体如DHEA、DHEA-S、5-二醇或能转化成上述任何性类固醇前体的前体药物，而不是雄激素本身。在体内，DHEA-S转化成DHEA，然后DHEA再转化成5-二醇。据信对一种反应良好的任何组织，对其它种很可能也有良好的反应。活性代谢产物的前体药物形式是本领域熟知的，可参见H.Bundgaard的“前体药物的设计和运用”(A Textbook of Drug Design and Development，由H.Bundgaard和P.Krogsgaard-Larsen编辑；Harwook Academic Publishers GmfH，Chur：Switzerland，1991)，其内容本文全部纳入作为参考。具体地说，第154-155页描述了活性代谢物的各种官能团，和在体内能转化成每一官能团的相应的适当前体药物基团。当按本发明将患者的性类固醇前体水平提高时，可通过给予这种前体或给予这种前体的前体药物实现。通过用前体(而不是雄激素)减少了除靶组织以外的组织中的不良雄激素作用。组织仅通过天然而且有较多调节的途径将前体(如DHEA)转化成雄激素。在周围组织局部产生大百分比的雄激素，而且不同组织程度不同。
按本发明治疗的癌症对雌激素活性反应不佳。另一方面，骨质疏松、高胆固醇血症、高脂血症和动脉粥样硬化对雌激素或类雌激素活性有良好反应。通过用本发明的SERM，在靶组织中得到有利的作用而在其它某些组织没有不良作用。例如，SERM可对骨骼(或对脂类或胆固醇)起有益效果，同时避免了对乳房起不良的雌激素作用。
前体和SERM都对靶组织提供有益的效果，同时对某些其它组织不良作用极小。另外，按本发明将它们一起使用时还有很大协同作用。例如，通过不同的机制(雌激素减少骨吸收，雄激素促进骨形成)，雌激素和雄激素能有效地抗骨质疏松。本发明的组合，通过SERM的活性对骨骼提供有益的雌激素或类雌激素作用，同时也通过在骨骼中将前体局部转化成雄激素提供有益的雄激素。据信前体也提供雌激素。当控制脂类或胆固醇(用于治疗或预防动脉粥样硬化)时情况就是这样。也可提供类似的协同作用，用于抗乳房、子宫内膜、卵巢或子宫癌，其中SERM提供所需的抗雌激素作用，前体提供所需的雄激素作用(抗雌激素还减少前体偶然转化为雌激素)。用本发明组合协同方法也减少了不良作用。
对上述所有的疾病，通过SERM在乳房组织中的抗雌激素作用，减少了任何其它的可能由雌激素(由前体产生的)产生的对乳房组织的作用(当按本发明，前体是用于促进雄激素作用时)。
在一些实施例中，添加孕激素以进一步提供雄激素作用。可按本领域已知的低剂量使用孕激素，对雄激素受体以外的受体(如糖皮质激素受体)不产生不良作用。它们相对地也没有不良的雄激素副作用(如女性患者面部生须)。
本文所述的优选SERM涉及：(1)所有对本发明而言敏感的疾病；(2)治疗和预防运用；和(3)优选的药物组合物和药盒。
在一实施例中，前体是DHEA。
在另一实施例中，前体是DHEA-S。
在另一实施例中，前体是5-二醇。
需要治疗或减少其病发病危险性的患者，是被诊断出患有该疾病或易患该疾病的人。
除非特别指出，本发明活性化合物的优选剂量(浓度和给药模式)对治疗和预防目的是相同的。无论运用治疗何种疾病(或减少疾病的发病)本文所用的每种活性化合物的剂量都是相同的。
除非特别指出或在上下文中是显然的，本文所用的剂量是不受药物学赋形剂、稀释剂、载体或其它成分影响的活性化合物的重量，虽然这些添加的成分是需要包括的，如实施例中所述。任何通常用于药物生产的剂型(胶囊、片剂、注射剂等)都适于本发明，且术语“赋形剂”、“稀释剂”或“载体”和工业上这些剂型的活性组分一起包括这些非活性成分。例如，包括普通的胶囊、小丸、肠溶衣、固态或液态稀释剂或赋形剂、调味剂、防腐剂等。
用于本文所述治疗的活性组分可配制在药物组合物中，该药物组合物还有一种或多种其它活性组分。另外，它们可分开给予，但要充分及时的同时，以保证最终患者的血液水平被提高或同时能获益于每种活性组分(或策略)。在本发明的优选实施例中，例如可将一种或多种活性组分配制在单种药物组合物中。在本发明的其它实施例中，提供了一种包括至少两个独立的容器的药盒，其中至少一个容器的内容物全部或部分地不同于(至少)另一个容器所含的活性组分。
本文所述的联合治疗，也包括在制造用于治疗本文所述的疾病的药物时用一种活性组分(组合中的)，治疗或预防还包括本发明组合中的另一种活性组分。例如在一实施例中，本发明提供将SERM和性类固醇前体组合来制备药物，这些性类固醇前体选自：DHEA、DHEA-S、5-二醇和可在体内转化成任一上述性类固醇前体的前体药物，用于治疗本发明可有效治疗的疾病(即乳房癌、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫癌、骨质疏松、高胆固醇血症、高脂血症和动脉粥样硬化)。在另一实施例中，本发明提供用性类固醇前体来制备药物，该性类固醇前体选自DHEA、DHEA-S、5-二醇和可在体内转化成任一上述性类固醇前体的前体药物，并与SERM组合用于治疗相同的疾病。
在本发明的一实施例中，DHEA不作为前体。在另一实施例中，EM-800不作为SERM。在另一实施例中，不用DHEA和EM-800的组合。
在一优选实施例中，DHEA和EM-1538组合使用。
附图简述
图1显示了单用DHEA(10mg，透皮，每天一次)或EM-800(75μg，口服，每天一次)或它们联合治疗9个月，对大鼠用DMBA诱导的乳房癌的发生率的作用，观察期为279天。显示的数据为每组动物总数的平均百分数。
图2显示了单用DHEA(10mg，透皮，每天一次)或EM-800(75μg，口服，每天一次)或它们联合治疗9个月，对每只患肿瘤动物的平均肿瘤数量(A)和每只患肿瘤大鼠的平均肿瘤大小(B)的作用，观察期为279天。显示的数据为平均值±SEM。
图3显示了单用DHEA(10mg，透皮，每天一次)或EM-800(75μg，口服，每天一次)或它们联合治疗9个月，对大鼠血清甘油三酯(A)和胆固醇(B)水平的作用。显示的数据为平均值±SEM。**：P＜0.01试验组与对照组比较。
图4显示了A)透皮给药(每天两次)递增剂量的DHEA(0.3mg，1.0mg或3.0mg)对切除卵巢(OVX)的裸小鼠(以雌酮补充)平均ZR-75-1肿瘤大小的作用。单接受载体的对照OVX小鼠作为辅助对照。初始肿瘤大小计为100％。将用0.02ml 50％乙醇-50％丙二醇溶液配制的DHEA透皮给药于背部皮肤。B)单用递增剂量的DHEA或EM-800或它们组合治疗9.5个月，对OVX裸小鼠(以雌酮补充)的ZR-75-1肿瘤重量的作用。**：p＜0.01，处理组与用雌酮补充的OVX小鼠对照组比较。
图5显示了增加剂量的口服抗雌激素EM-800(15μg，50μg或100μg)(A)或透皮给予的增加剂量的DHEA(0.3、1.0或3.0mg)与EM-800(15μg)组合或单用EM-800(B)治疗9.5个月，对切除卵巢的裸小鼠(以雌酮补充)的平均ZR-75-1肿瘤大小的作用。初始肿瘤大小计为100％。仅接受载体的对照OVX小鼠作为辅助对照。以0.5μg的剂量透皮给予雌酮(每天一次)，DHEA溶解在50％乙醇-50％丙二醇中并以0.02ml剂量涂覆到背部皮肤区域(每天两次)。同样与仅接受载体的OVX动物作比较。
图6显示了单用脱氢表雄酮(DHEA)或与氟他胺或EM-800联合治疗12个月对切除卵巢大鼠的骨小梁量的作用。完整的动物作为辅助对照。数据代表平均值±SEM。**：p＜0.01，与OVX对照组比较。
图7显示了单用脱氢表雄酮(DHEA)或与氟他胺或EM-800联合治疗12个月对切除卵巢大鼠的小梁数的作用。完整的动物作为辅助对照。数据代表平均值±SEM。**：p＜0.01，与OVX对照组比较。
图8显示了完整对照组(A)的、切除卵巢的对照组(B)的和单用DHEA处理的切除卵巢大鼠(C)的或DHEA与氟他胺(D)或DHEA与EM-800(E)组合治疗的切除卵巢大鼠的近端胫骨干骺端。在卵巢切除对照动物(B)中观察到骨小梁量的减少(T)，和给予DHEA后(C)诱导的骨小梁量(T)的明显增加。添加氟他胺到DHEA能部分阻断DHEA对骨小梁量(D)的作用，而DHEA和EM-800的组合能完全防止与切除卵巢相关的骨损失。改进的三色染色Masson-Goldner，放大倍数×80。T：小梁，GP：生长骨板。
图9显示了给予增加剂量的(0.01，0.03，0.1，0.3和1mg/kg)EM-800、EM-1538和雷洛昔芬(EM-1105)(每天口服一次，共4天)，对切除卵巢大鼠胆固醇水平的作用。
图10显示了单用脱氢表雄酮(DHEA)或与EM-1538(EM-652·HCl)组合治疗34星期对切除卵巢大鼠的脊柱腰段BMD的作用。以完整动物为辅助对照。数据代表平均值±SEM。**：p＜0.01，与OCX对照组比较。
图11显示了SERM(EM-652)和DHEA对绝经参数的联合效果。没有发现任何负作用。
图12显示了雄性大鼠中血浆DHEA浓度(ng/mL)(Y轴)作为在单剂口服吸收本发明的优选性类固醇前体(150μmol/大鼠)后的时间(X轴)的函数。在图框中，是以下化合物诱导的DHEA 24小时的AUC。
EM-760       脱氢表雄酮
EM-900       雄-5-烯-3β，17β-二醇
EM-1304      雄-5-烯-3β，17β-二醇3-乙酸酯
EM-1305-CS   雄-5-烯-3β，17β-二醇双乙酸酯
EM-1397    雄-5-烯-3β，17β-二醇3-乙酸酯17-苯甲酸酯
EM-1400    雄-5-烯-3β，17β-二醇双苯甲酸酯
EM-1410    雄-5-烯-3β，17β-二醇二丙酸酯
EM-1474-D  雄-5-烯-3β，17β-二醇双半琥珀酸酯
图13显示了雄性大鼠中血浆雄-5-烯-3β，17β-二醇的浓度(ng/mL)(Y轴)作为在单剂口服吸收本发明的性类固醇前体(150μmol/大鼠)后的时间(X轴)的函数。在图框中，是以下化合物诱导的雄-5-烯-3β，17β-二醇24小时的AUC。
EM-760     脱氢表雄酮
EM-900     雄-5-烯-3β，17β-二醇
EM-1304    雄-5-烯-3β，17β-二醇3-乙酸酯
EM-1305-CS 雄-5-烯-3β，17β-二醇双乙酸酯
EM-1397    雄-5-烯-3β，17β-二醇3-乙酸酯17-苯甲酸酯
EM-1400    雄-5-烯-3β，17β-二醇双苯甲酸酯
EM-1410    雄-5-烯-3β，17β-二醇二丙酸酯
EM-1474-D  雄-5-烯-3β，17β-二醇双半琥珀酸酯
发明详述
熟知雌激素能刺激乳房上皮细胞的增殖，而细胞增殖本身又因为累积随机的遗传错误(可能导致形成肿瘤)增加了患癌症的危险性(Preston Martin等人，Cancer.Res.50：7415-21，1990)。按该理论，以降低由雌激素刺激的细胞分裂速率为目的，引入抗雌激素来预防乳房癌。
发现大于10月龄的Sprague-Dawley雌性大鼠，血清雌激素和催乳素水平的增加和血清雄激素和孕酮浓度的减少伴随有排卵周期的丧失(Lu等人，61st AnnualMeeting of the Endocrine Society 106(abst.#134)，1979：Tang等人，Biol.Reprod.31：399-413，1984；Russo等人，Monographs on Pathology of LaboratoryAnimals：Integument and Mammary Glands 252-266，1989；Sortino和Wise，Endocrinology 124：90-96，1989；Cardy，Vet.Pathol.28：139-145，1991)。在老年雌性大鼠中这些激素的自发性改变与多病灶的增殖、腺泡/肺泡组织分泌活性的增加以及乳腺管扩张和囊肿的形成有关(Boorman等人，433，1990；Cardy，Vet.Pathol.28：139-145，1991)。值得一提的是，大鼠雌激素和催乳素水平的增加常常伴随有乳腺增生和形成瘤的改变(Meites，J.Neural.Transm.48：25-42，1980)。用EM-800(本发明的一种SERM)治疗诱导乳腺的萎缩(可由大小和小叶结构数量的减少鉴定)，而且没有促分泌活性，表明在乳腺中EM-800有强抗雌激素活性(Luo等人，Endocrinology 138：4435-4444，1997)。
用DHEA(本发明的一种性类固醇前体)治疗，导致血清DHEA和5-二醇的增加，而血清4-二酮、睾丸酮、二氢睾丸酮和雌二醇水平仅略增加或常常保持不变，这表明在周围组织中该前体类固醇发生细胞内生物转化(Labrie等人，Mol.Cell.Endocrinol.78：C113-C118，1991)。然而，口服DHEA对血清雄激素(如睾丸酮和二氢睾丸酮)的刺激作用程度大于对血清雌激素的作用，表明在这些动物中DHEA主要被转化成雄激素。这一观察与在女性(由DHEA形成雄激素的途径比将DHEA转化成雌激素重要)中得到的数据相一致(Morales等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.78：1360-1367，1994；Labrie等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.774：16-28，1995；Labrie等人，Steroids 62：148-158，1997)。
由上述已知的强抗雌激素活性导致乳腺萎缩和DHEA对乳腺的主要呈雄激素作用，可用DHEA在大鼠乳腺中的非对抗性雄激素作用很好地解释在用SERM和性类固醇前体联合治疗动物时发现的组织形态学改变。
最重要的是，已观察到体外雄激素对ZR-75-1人乳房癌细胞的生长起直接的抗增殖作用，而且这种雄激素的抑制作用与抗雌激素的作用相加(Poulin和Labrie，Cancer Res.46：4933-4937，1986；Poulin等人，Breast Cancer Res.Treat.12：213-225，1988)。在体内对裸小鼠的ZR-75-1异种移植物也发现了类似的抑制作用(Dauvois等人，Cancer Res.51：3131-3135，1991)。雄激素也显示出对大鼠DMBA诱导的乳房癌的抑制，该抑制可通过同时给予纯抗雄激素氟他胺反转(Dauvois等人，breast Cancer Res.Treat.14：299-306，1989)。综上所述，已有的数据表明雄激素受体参与DHEA对乳房癌的抑制作用。
由于抗雌激素和性类固醇前体通过不同的机理对乳房癌抑制，本发明显示SERM(EM-800)和性类固醇前体(DHEA)组合比单用每一化合物，对DMBA诱导的大鼠乳房癌进展具有更强的抑制作用，如图1和2所示。事实上，到试验结束时，在接受DHEA和EM-800的动物中也未发现DMBA诱导的肿瘤。
本发明描述了性类固醇前体(DHEA)和SERM(EM-800)组合，维持了DHEA对骨形成的刺激作用，并加强了单用SERM(EM-800)时对骨周转和吸收的抑制作用(这由尿羟基脯氨酸和钙排泌的减少进一步证明)。
我们显示DHEA对雌大鼠(Luo等人，Endocrinology 138：4435-4444，1997)和更年期后的女性(Labrie等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.82：3498-3505，1997)的骨具有有益作用。因此，用DHEA处理完整的雌大鼠，增加了总骨骼、脊柱腰段和股骨的骨矿物密度(BMD)(Luo等人，Endocrinology138：4435-4444，1997)。
另一方面，用EM-800处理对完整动物的BMD没有明显的作用，虽然在切除卵巢的大鼠中观察到强刺激作用(Martel等人，未发表资料)。由于EM-800对切除卵巢的大鼠的总骨骼、脊柱腰段和股骨的BMD有强刺激作用，则EM-800对完整动物缺乏明显的刺激作用可能是由于在完整雌大鼠中存在的性类固醇对BMD有极大的作用(Luo等人，Endocrinology 138：4435-4444，1997)。类似地，EM-800对已接受过DHEA的切除卵巢的大鼠缺少明显的作用，可能是由于在骨细胞中从外源DHEA合成的雄激素(也可能有雌激素)有极大的刺激作用。
已知雌激素降低血清胆固醇，但增加血清甘油三酯水平或无作用(Love等人，Ann.Intern.Med.115：860-864，1991；Walsh等人，New Engl.J.Med.325：1196-1204，1991；Barrett-Connor，Am.J.Med.95(Suppl.5A)：40S-43S，1993；Russell等人，Atherosclerosis 100：113-122，1993；Black等人，J.Clin.Invest.93：63-69，1994；Dipippo等人，Endocrinology 136：1020-1033，1995；Ke等人，Endocrinology 136：2435-2441，1995)。图3显示了EM-800对大鼠具有降低血胆固醇和降低血中甘油三酯的作用，并对血清脂类具有独特的作用，这不同于其它SERM，如它莫西芬(Bruning等人，Br.J.Cancer 58：497-499，1988；Love等人，J.Natl.Cancer Inst.82：1327-1332，1990；Dipippo等人，Endocrinology136：1020-1033，1995；Ke等人，Endocrinology 136：2435-2441，1995)、屈洛昔芬(Ke等人，Endocrinology 136：2435-2441，1995)和雷洛昔芬(Black等人，J.Clin.Invest.93：63-69，1994)。用DHEA和EM-800组合保留了EM-800的降低血胆固醇和降低血中甘油三酯的作用，这提示这种组合对血清脂类有有益作用。
值得指出的是，大鼠和人的血清脂类特点显著不同。然而，由于雌激素受体调节机制参与雌激素和抗雌激素的降低血胆固醇的作用(Lundeen等人，Endocrinology 138：1552-1558，1997)，大鼠依旧可作为研究人体中雌激素和“抗雌激素”降低胆固醇作用的模型。
简而言之，上述数据清楚地表明SERM(EM-800)和性类固醇前体(DHEA)组合，对由DMBA诱导的乳房癌出现的作用，和该组合对骨量和血清脂类的保护性作用。这些数据提示用于治疗或预防骨质疏松的这种组合在改善脂类时的其它有益作用。
我们已通过给予以下两种药物，研究了新抗雌激素(EM-800)和性类固醇前体(DHEA)对裸小鼠的人ZR-75-1乳房癌异种移植物生长的抑制作用的潜在相互作用。图4和图5显示，在所用的剂量，DHEA其自身抑制了50-80％的肿瘤生长，而由低剂量抗雌激素实现的几乎对肿瘤生长的完全抑制则不受DHEA影响。
熟知骨矿物质密度(BMD)测定有局限性。例如，BMD测试显示用类固醇抗雌激素ICI 182780处理的大鼠没有变化(Wakeling，Breast Cancer Res.Treat.25：1-9，1993)，而组织形态学测定发现有抑制性变化(Gallagher等人，Endocrinology133：2787-2791，1993)。他莫昔芬也报道了类似的差异(Jordan等人，BreastCancer Res.Treat.10：31-35，1987；Sibonga等人，Breast Cancer Res.Treatm.41：71-79，1996)。
需要指出的是，骨矿物质密度减少并非是唯一相关于骨骼强度减小的异常(用于预防或治疗更年期后骨质疏松的药物的临床前和临床评价的准则，Division ofMetabolism and Endocrine Drug Products，FDA，May 1994)。因此分析由各种化合物和治疗诱导的骨代谢的生化参数的变化以较好的了解它们的作用是非常重要的。
特别重要的是，显示出DHEA和EM-800的组合对骨代谢的重要生化参数产生的出乎意料的有利作用。事实上，单用DHEA对尿羟基脯氨酸/肌酸酐的比例(骨吸收的标记)没有作用。另外，没有检测出DHEA对每天尿钙或磷排泄有作用(Luo等人，Endocrinology 138：4435-4444，1997)。另一方面，EM-800减少尿羟基脯氨酸/肌酸酐的比例达48％，而EM-800与DHEA类似也对尿钙或磷排泄没有作用。另外，EM-800对血清碱性磷酸酶活性(骨形成的标记)没有作用，而DHEA提高了该参数值约75％(Luo等人，Endocrinology 138：4435-4444，1997)。
DHEA和EM-800组合的一个出乎意料的作用是，当用DHEA和EM-800组合时尿羟基脯氨酸/肌酸酐比例(骨吸收的标记)减少了69％，该值在统计学上与由单用EM-800产生的48％抑制有差异，而单用DHEA则没有显示任何作用。因此，将DHEA加入到EM-800时，增加了EM-800对骨吸收的抑制作用的50％。更重要的是，添加DHEA到EM-800时有另一出乎意料的作用，即分别减少了84％尿钙(从23.17±1.55减少到3.71±0.75μmol/24小时/100g(p＜0.01))和55％尿磷(从132.72±0.08减少到59.06±4.76μmo1/24小时/100g(p＜0.01))(Luo等人，Endocrinology138：4435-4444，1997)。
                                     表    1
试验组                             尿 血清
钙(μmol/24小时/100g)   磷(μmol/24小时/100g)   HP/Cr(μmol/mmol) tALP(IU/L)
对照 23.17±1.55   132.72±6.08   13.04±2.19 114.25±14.04
DHEA(10mg) 25.87±3.54   151.41±14.57   14.02±1.59 198.38±30.76*
EM-800(75μg) 17.44±4.5   102.03±25.13   6.81±0.84** 114.11±11.26
HEA+EM-800 3.71±0.75**   59.06±4.76**   4.06±0.28** 204.38±14.20**
同样有趣的是，同时用DHEA处理不妨碍EM-800对血清胆固醇的强抑制作用(Luo等人，Endocrinology，138：4435-4444，1997)。
雷洛昔芬和类似化合物预防骨丧失并减少血清胆固醇一样(如雌激素)，但需要指出当雷洛昔芬与结合型雌激素(Premarin)比较BMD时，雷洛昔芬对BMD的作用不如结合型雌激素强(Minutes of the Endocrinology and Metabolism DrugsAdvisory Committee，FDA Thursday，Meeting#68，November 20th 1997)。
本发明在大鼠中得到的结果明确显示DHEA可提供有益作用，而这是单用选择性雌激素受体调节剂(SERM)(如EM-800、雷洛昔芬等)所缺乏的。SERM的作用仅限于抑制骨吸收，据信添加DHEA、5-二醇、DHEA-S能刺激骨形成(一种用SERM或雌激素没有发现过的效果)并在EM-800达到的作用之上进一步减少骨骼吸收。
重要的是，用EM-800和DHEA联合治疗切除卵巢的大鼠12个月，对骨形态具有有益效果。骨小梁的量对骨强度和预防骨折非常重要。因此，在上述研究中，单用DHEA治疗的切除卵巢大鼠胫骨骨小梁量从4.1±0.7％增加到11.9±0.6％(p＜0.01)，而在DHEA添加EM-800治疗的则增加到14.7±1.4％，该值于完整对照中得到的类似(图6)。
在切除卵巢大鼠中得到的值0.57±0.08/mm，用DHEA处理，与切除卵巢的对照相比骨小梁数增加了137％。在骨小梁量上，DHEA的刺激作用达到1.27±0.1/mm，而用EM-800和DHEA同时处理与单用DHEA相比增加了28％(p＜0.01)(图7)。类似地，将EM-800添加到DHEA的治疗，导致与单用DHEA相比骨小梁分离减少15％(p＜0.05)，从而与在完整对照中观察到的没有区别。
作为图6和图7数据的补充，图8显示了与切除卵巢的对照(B)相比，用DHEA处理的切除卵巢动物(C)近端胫骨干骺端中骨小梁量的增加，以及在DHEA治疗中添加氟他胺(D)后DHEA刺激作用的部分抑制。另一方面，EM-800联合DHEA给药完全预防了切除卵巢诱导的骨质减少(E)，骨小梁量与完整对照(A)得到的数据相当。
据信在更年期女性中观察到的骨丧失是与骨吸收率的增加(其不能由次级骨形成增加完全补偿)相关的。事实上，用雌激素替补治疗增加了骨质疏松症中骨形成和骨吸收的参数并抑制了骨吸收和形成。据信雌激素替补治疗产生的对骨形成的抑制是由骨吸收和骨形成的偶联机制造成的，结果骨吸收由初级雌激素诱导的减少导致骨形成的减少(Parfitt，Calcified Tissue International 36Suppl.1：S37-S45，1984)。
松质骨的强度和其对骨折的耐性不仅取决于松质骨的总量，也取决于小梁的微观结构，如小梁的数量、大小和分布的测定值。更年期后女性卵巢功能的丧失伴随有总骨小梁量的明显下降(Melsen等人，Acta Pathologica & MicrobiologicaScandinavia 86：70-81，1978：Valkamatsou等人，Calcified TissueInternational 37：594-597，1985)，主要是小梁数量的减少和小梁宽度的变小(Weinstein和Hutson，Bone 8：137-142，1987)。
本研究观察了DHEA对几乎所有骨组织形态学参数的雄激素刺激作用。DHEA导致骨小梁量以及小梁数量的明显增加，并减少了小梁间的区域。
为了便于本文所述的本发明的联合治疗，本发明考虑对所讨论的所有适应症将药物组合物，其包括SERM或双膦酸盐化合物和性类固醇前体(DHEA、DHEAS、5-二醇)制成单个组合物用于同时给药。该组合物可适于任何通常的给药形式包括，但并不限制于，口服、皮下注射、肌肉内注射或透皮给药。在其它实施例中，提供一种药盒，其中在分开的或同一容器中带有一种或多种SERM或双膦酸盐和性类固醇前体。该药盒可包括适当的材料用于口服，如片剂、胶囊、糖浆等和用于透皮给药，如软膏、洗剂、凝胶、乳膏、缓释贴片等。
申请者相信SERM和性类固醇前体的给药可用于治疗和/或预防骨质疏松、乳房癌、高胆固醇血、高脂血症或动脉粥样硬化。本发明的活性组分(SERM或前体或双膦酸盐等)可以各种形式制得和给药。
用于透皮或透粘膜的活性组分较佳地占药物组合物总重的约0.5％-20％，更佳的是在2-10％之间。用于透皮给药的DHEA或5-二醇的浓度至少为7％。另外，可将活性组分置于本领域已知结构的透皮贴片中，例如欧洲专利No.0279982中公开的结构。
当制成软膏、洗剂、凝胶、乳膏等时，活性组分与适合的载体混合，这些载体与人皮肤或粘膜相容而且能提高化合物穿透皮肤的透皮或透粘膜的渗透率。适合的载体是本领域已知的，包括但并不限制于Klucel HF和Glaxal基质。有些是可以购得的，如Glaxal基质可从Glaxal Canada Limited Company购得。其它适合的载体可见Koller和Buri，S.T.P.Pharma 3(2)，115-124，1987。适合的载体是能在环境温度在所用的活性组分的浓度下溶解活性组分的载体。适合的载体应具有足够的粘度以使抑制剂维持在涂用组合物的皮肤或粘膜区域上，而在一段时间内不会流掉或蒸发，足以使前体充分渗透皮肤或粘膜上涂药的区域，并进入血流产生所需的临床效果。载体通常为若干组分的混合物，如药学上可接受的溶剂和增稠剂。有机和无机溶剂的混合物能辅助亲水性和亲脂性的溶解，例如水和醇(如乙醇)。
优选的性类固醇前体是脱氢表雄酮(DHEA)(可从Diosynth Inc.Chicago，Illinois，USA购得)、其前体药物(可从Steraloids，Wilton，New Hampshire，USA购得)、5-雄烯-3β，17β-二醇和其前体药物EM-1304和EM-01474-D(可从Steraloids，Wilton，New Hampshire USA购得)。
Figure A20041009746600261
较佳地，性类固醇前体制成含醇凝胶，其含有2.0-10％辛酸-癸酸甘油三酯(Neobee M-5)；10-20％己二醇；2.0-10％二乙二醇单甲醚(Transutol)；2.0-10％cyclomethicone(Dow Corning 345)；1.0-2％苯甲醇和1.0-5.0％羟丙基纤维素(Klucel HF)。
载体也可包括各种通常添加到软膏、洗剂以及化妆品和药物领域熟知的载体。例如，可存在香料、抗氧剂、芳香剂、胶凝剂、增稠剂(如羧甲基纤维素)、表面活性剂、稳定剂、润肤剂、着色剂等。当用于治疗全身疾病时，皮肤上涂药的位点较佳地应周期性地变化，以避免局部活性组分的过量和可能由性类固醇前体的雄激素代谢物对皮肤和皮脂腺的过度刺激。
用于口服的药物组合物中，较佳地DHEA或其它前体占该组合物总重的5-98％之间，更佳的是50-98％之间，尤其是80-98％之间。单种前体(如DHEA)可作为唯一的活性组分，或可用多种前体和/或它们的类似物(如DHEA、DHEA-S、5-二醇的组合，或两种或多种在体内转化成DHEA、DHEA-S或5-二醇的化合物的组合，或DHEA或5-二醇和一种或多种类似物(在体内转化成DHEA或5-二醇)的组合等)。血浆DHEA水平是最终判断剂量足够的标准，它与个人吸收和代谢的变化有关。
较佳地，临床医生(尤其在治疗初期)监测患者DHEA的血清水平和总反应(与上述优选的血清浓度相比)，并监测患者对治疗的总反应，当患者对治疗的反应或代谢异常时，调节剂量。
本发明的治疗可无期限的延长。预期DHEA和/或5-二醇治疗将简单地维持DHEA水平于类似于更年期前女性的自然水平(血清浓度在每升4-10微克之间)，或年轻男性的自然水平(血清浓度在每升4-10微克之间)。
也可通过口服给予SERM化合物或双膦酸盐和/或性类固醇前体，也可与普通的药物赋形剂(如喷雾干燥的乳糖、微晶纤维素和硬脂酸镁)一起配制成口服的片剂或胶囊。
可通过与固态、粉状载体物质(如柠檬酸钠、碳酸钙或磷酸氢钙)和粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、明胶或纤维素衍生物)混合，也可通过加入润滑剂(如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、“Carbowax″或聚乙二醇)，将活性物质制成片剂或糖衣丸芯。当然，在口服药物中也可加入调味材料。
其它剂型，可用插入式胶囊如硬明胶的，和含有软化剂或增塑剂(如甘油)的封闭的软明胶胶囊。插入式胶囊含有的活性物质较佳是颗粒的形式，如与填充剂的混合物，填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉(如马铃薯淀粉或支链淀粉)、纤维素衍生物或高度分散的硅酸。在软明胶胶囊中，该活性物质较佳地是溶解或悬浮在适合的液体中，如植物油或液态聚乙二醇。
洗剂、软膏、凝胶或乳膏应彻底擦入皮肤从而没有清晰可见的过量物质，而且不能冲洗该区域的皮肤直到完成了大部分的经皮渗透，较佳地为至少4小时，更佳的是至少6小时。
按已知的技术，可用透皮贴片送递前体。其通常是用于较长的时间，如1-4天，通常将活性组分与较小的表面区域接触，使得活性组分缓慢持续的递送。
已开发并投入使用的大量透皮药物送递系统，适合送递本发明的活性组分。通常由骨架扩散或使活性组分透过控制膜控制释放速率。
透皮装置的机械方面是本领域熟知的，并可由如美国专利No5,162,037、5,154,922、5,135,480、4,666,441、4,624,665、3,742,951、3,797,444、4,568,343、4,064,654、5,071,644、5,071,657解释，上述专利本文全部引用作为参考。欧洲专利0279982和英国专利申请2185187提供其它背景资料。
该装置可是任何本领域已知的通常类型，包括粘合剂骨架和储库类型的透皮装置。该装置可包括含有药物的骨架，其混有能吸收活性组分和/或载体的纤维。在储库类型装置中，储库为一不能透过载体和活性组分的聚合物膜所限定。
透皮装置，其本身维持活性组分与所需的皮肤表面接触。在这种装置中，活性组分的载体粘度的重要性比乳膏或凝胶少。透皮装置的溶剂系统可包括，例如油酸、线性醇乳酸酯和二丙二醇或其它本领域已知的溶剂系统。活性组分可溶解或悬浮在载体中。
为了粘附在皮肤上，可将透皮贴片置于在中间穿有一孔的外科用橡皮膏上。较佳地，在使用前用一可剥离衬底覆盖以保护粘合剂。通常适合于剥离的材料包括聚乙烯和涂聚乙烯的纸，较佳地是涂聚硅氧烷的纸以便于剥离。在用该装置时，可轻易地将剥离层剥离，将粘合剂粘结到患者的皮肤上。Bannon等人的美国专利No.5,135,480(本文全部纳入作为参考)公开了一种不带粘合剂的装置将该装置固定到皮肤上。
本发明的透皮或透粘膜传递系统也可作为新的改进的传递系统，用于预防和/或治疗骨质疏松或其它对雄激素和/或雌激素治疗反应良好的疾病。
本发明的选择性雌激素受体调节剂的分子式具有以下特性：a)两个芳环，被1-2个插入的碳原子隔开，这两个芳环可以是未取代的，也可被羟基或在体内转化成羟基的基团取代；和b)有芳环和叔胺官能团或其盐的一个侧链。
本发明优选的SERM是PCT/CA96/00097(WO96/26201)公开的EM-800。EM-800的分子结构为：
Figure A20041009746600291
本发明另一优选的SERM为EM-01538：
Figure A20041009746600292
EM-1538(也称为EM-652HCL)是强抗雌激素EM-652的盐酸盐，与EM-800相比，EM-1538制备更简单而且更容易。其也易于分离、纯化、结晶，而且具有很好的固体稳定性。给予EM-800或EM-1538，据信在体内能得到相同的活性化合物。
本发明的其它优选SERM包括他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)]-N，N-二甲基乙胺)(可从Zeneca，UK购得)、托瑞米芬(可从Orion-FarmosPharmaceuticla，Finland或Schering-Plough购得)、屈洛昔芬和CP-336，156(顺-1R-[4’-吡咯烷子基-乙氧苯基]-2S-苯基-6-羟基-1，2，3，4，-四氢萘D-(-)-酒石酸盐(Pfizer Inc.，USA)，雷洛昔芬(Eli Lilly and Co.，USA)、LY335563和LY 353381(Eli Lilly and Co.，USA)、iodoxifene(SmithKline Beecham，USA)、公开于Shalmi等人的WO 97/25034、WO 97/25035、WO 97/25037、WO 97/25038和Korsgaard等人的WO 97/25036的levormeloxifene(3，4-反式-2，2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基)]-7-甲氧基苯并二氢吡喃)(NovoNordisk，A/S，Denmark)、GW5638(见Willson等人，Endocrinology，138(9)，3901-3911，1997)和吲哚衍生物(Miller等人公开的欧洲专利EP0802183A1)和由Wyeth Ayers(USA)开发的并公开于JP10036347的TSE 424(美国家用产品公司)和WO 97/32837公开的非甾类雌激素衍生物。
可用任何SERM来满足所需的效力(如制造商所推荐的)。本领域已知其合适的剂量。本发明中可用任何其它可购得的非甾类抗雌激素。可用任何具有与SERM类似活性的化合物(如雷洛昔芬)。
对本发明而言，较佳地以0.01-10mg/kg体重/天的剂量范围给予SERM(较佳的是0.05-1.0mg/kg)，对普通体重的人以5mg/天，更佳的是10mg/天，口服给药，分两次相等的剂量给予；或较佳地以0.003-3.0mg/kg体重/天的剂量范围给予SERM(较佳的是0.015-0.3mg/ml)，即普通体重的人以1.5mg/天，更佳的是3.0mg/天，经非肠道给药(即肌肉内、皮下或透皮给药)，分两次相等的剂量给予。较佳地，SERM与本文下述的药学上可接受的稀释剂或载体一起给予。
本发明优选的双膦酸盐包括可从Merck Shape and Dohme购得的商品名为Fosamax的Alendronate[(4-氨基-1-羟基亚丁基)双膦酸二钠盐水合物]，可从Procter and Gamble购得的商品名为Didrocal和Didronel的Etidronate(1-羟基亚乙基)双膦酸、2，2’-亚氨基双乙醇]、可从Rhone-Poulenc Rorer购得的品名为Bonefos或可从Boehringer Mannheim购得的品名为Ostac的Clodronate[(二氯亚甲基)双膦酸二钠]、和可从Geigy购得的品名为Aredia的Pamidronate[(3-氨基-1-羟基亚丙基)双膦酸二钠]。Risedronate(1-羟基-2-(3-吡啶基)亚乙基双膦酸一钠)正进行临床开发。本发明也可用其它可购得的双膦酸盐，都用制造商推荐的剂量。同样地，以先前本领域所推荐的剂量使用性类固醇前体，较佳地是能恢复到20-30岁男性或更年期前成年女性的循环水平的剂量。
对本文所推荐的所有剂量，临床医生都应监测每个患者的反应并作相应调整。
实施例
实施例1
材料和方法
动物
从Charles River Canada Inc.(St-Constat，Quebec)得到44-46日龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)Br)，每笼关养两只，环境控制在12小时明亮/天(07：15明亮)，温度22±2℃。动物以Purina鼠食喂养，任意饮水。动物研究在加拿大动物管理委员会(CCAC)批准的机构按CCAC管理和使用试验动物的指南进行。
用DMBA诱导乳房肿瘤
在50-52日龄时，以单剂量胃内给予20mg以1ml玉米油配制的DMBA(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)诱导乳房癌。两个月后，每两周进行肿瘤测定一次。如Asselin等人，(Endocrinology101：666-671，1977)所公开的用测径器测定肿瘤大小来记录每个肿瘤的两个最大垂直直径。记录肿瘤的位置、大小和数量。
处理
除了40只大鼠为对照组外，将动物随机分成各组，每组20只大鼠。按以下处理这些动物282天：(1)DHEA和EM-800的对照载体；(2)在0.5ml 4％甲醇、4％聚乙二醇-600、1％明胶、0.9％NaCl悬浮液中的EM-800((+)-7-新戊酰氧-3-(4’-新戊酰氧苯基)-4-甲基-2-(4”-(2-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-苯并吡喃)(75μg，口服，每天一次)；(3)在0.5ml 50％乙醇、50％丙二醇中的DHEA(10mg，透皮，每天一次)；和(4)EM-800和DHEA。在口服DMBA前三天开始处理。EM-800是在我们实验室的药物化学部门合成的，DHEA则是从Steraloids Inc.，Wilton，NH购得的。
由于肿瘤过大，许多对照动物和一些EM800或DHEA处理的动物在给予DMBA后6个月，在异氟烷诱导麻醉下断颈处死。肿瘤大小值和这些处死动物的数量，以及后来从存活动物测到的数据都用于以后对肿瘤发生率、每只患肿瘤大鼠的平均肿瘤数和每只患肿瘤大鼠的平均肿瘤大小的分析。剩下的动物(对照9只，其它组为每组13-19只)继续接受3个月的处理，以观察单用DHEA和EM-800或其联用的长期预防性效果。给予DMBA后的第279天处死大鼠。迅速取出子宫、阴道和卵巢(除去结缔组织和脂肪组织)并称重。
样品的收集和处理
在试验结束时转移到代谢笼(Allentown Caging Equipment Co.，Allentown，NJ)，然后从每组的9只大鼠收集24小时尿样。收集并分析每只动物不同日的两次尿样，以减小因每天变化造成的影响。因此，每个值为不同的两天测定的平均值。在尿样管中加入0.5ml甲苯以防止尿蒸发和细菌生长，并记录尿量。处死(大鼠)时收集躯干的血，在3000rpm离心30分钟之前，在4℃凝块过夜。
尿和血清生化参数的分析
将新鲜样品用于分析尿肌酸酐、钙和磷，以及血清总碱性磷酸酶(tALP)活性、胆固醇和甘油三酯。在Good Laboratory Practice条件下，用Monarch 2000Chemistry System(Instrumentation Laboratory Co.Lexington，MA)自动测定这些生化参数。如Podenphant等人，(Clinica Chimica Acta 142：145-148，1984)所述测定尿羟基脯氨酸。
骨量的测定
分别以50和4mg/kg体重的剂量，以腹膜内注射盐酸氯胺酮和安定麻醉大鼠。用装有局部高分辨软件的双能X-射线吸收测定仪(DEXA；QDR 2000-7.10C，Hologic，Waltham，MA)扫描整个骨骼和右股骨。整个骨骼和股骨的扫描区域大小分别为28.110×17.805cm和5.0×1.902cm，分辨率为0.1511×0.0761cm和0.0254×0.0127cm，扫描速度为0.3608和0.0956mm/秒。在整个骨骼和股骨的扫描图像上测定整个骨骼、脊柱腰段和股骨的骨矿物含量(BMC)和骨矿物密度(BMD)。
统计分析
由Duncan-Kramer的多范围检验(Biometrics 12：307-310，1956)确定统计显著性。用Fisher的精确性检验(Conover，Practical nonparametric statistics，2nd Edition 153-170，1980)分析乳房肿瘤的发生率。显示的数据为平均值±S.E.M.。
试验结果
对DMBA诱导的乳房癌发生的作用
如图1所示，给予DMBA后的第279天，95％对照动物发生了可触及的乳房肿瘤。用DHEA或EM-800处理部分防止了DMBA诱导的乳房癌的发生，而且发生率分别减少到57％(p＜0.01)和38％(p＜0.01)。有趣的是，这两种化合物的联合可比单用每种化合物具有明显较高的抑制作用(对单用DHEA或EM-800的p＜0.01)。事实上在试验结束前，在用这两种化合物处理的一组动物中仅有的两个肿瘤消失了。
用DHEA或EM-800处理，减少了每只患肿瘤动物的平均肿瘤数，从对照动物4.7±0.5个肿瘤/动物分别减少到3.4±0.7(N.S.)和1.4±0.3(p＜0.01)个肿瘤/动物，而在试验结束时接受两种药物的动物中没有发现肿瘤(对其它三组为p＜0.01)(图2A)。这两个最终消失的肿瘤中的一个存在于给予DMBA后的79-201天，另一个则在179-257天是可触及的。从图2B可见单用DHEA或EM-800减少了每只患肿瘤动物的平均肿瘤面积，从12.8±1.3cm2在试验结束后分别减至10.2±2.1cm2(N.S.)和7.7±1.8cm2(N.S.)，而联合处理导致零值(对其它三组为p＜0.01)。用DHEA和EM-800处理的动物组中发生的两个肿瘤长得不大于1cm2。需要指出的是，对照组中每只患肿瘤动物的平均肿瘤面积和平均肿瘤数的真实值要大于图2中所示的值，因为由于肿瘤过大许多动物在试验结束前就死了。因此在死亡时测得的值包括在后来的计算中，来减小对照组的偏性，无论如何它仍显著高于其它组。
对骨的作用
长期对雌性大鼠透皮给予DHEA，诱导了整个骨骼、脊柱腰段和股骨的骨矿物密度(BMD)分别增加了6.9％(p＜0.01)、10.6％(p＜0.05)和8.2％(p＜0.01)(表2)。另一方面，在用EM-800处理的动物中没有发现明显的变化。另外，同时给予这两种药物时，得到的值与单用DHEA得到的值相当。
用DHEA处理增加了血清总碱性磷酸酶(tALP)的活力74％(p＜0.05)，但对每天尿中钙和磷的排泄以及尿中羟基脯氨酸与肌酸酐的比例均没有影响(表3)。另一方面，用EM-800治疗，使尿中羟基脯氨酸与肌酸酐的比例减少48％(p＜0.01)，但每天的尿钙和磷排泄以及血清tALP活力没有统计学显著性。DHEA和EM-800组合增加了血清tALP活力(p＜0.01)(类似于单用DHEA达到的)，并减少了尿羟基脯氨酸与肌酸酐的比例69％(p＜0.01)(该值明显低于单用EM-800达到的值)(p＜0.01)。另外，这两种药物组合明显减少了每日尿钙和磷的排泄，分别为84％(p＜0.01)和56％(p＜0.01)，而单用这两种药物都没有观察到显著的变化(表3)。
对血清脂类水平的作用
长期用EM-800处理使血清甘油三酯和胆固醇水平分别减少了72％(p＜0.01)和45％(p＜0.01)，而长期给予DHEA能减少血清甘油三酯水平60％(p＜0.01)，但对血清胆固醇水平没有影响。此外，用EM-800和DHEA处理，测定到血清甘油三酯和胆固醇浓度分别减少了42％(p＜0.01)和52％(p＜0.01)(图3)。
表2单用DHEA(10mg，透皮，每天一次)或EM-800(75μg，口服，每天一次)或它们的组合治疗9个月，对雌大鼠的股骨、脊柱腰段和总骨骼骨矿物密度(BMD)的作用。测定在每组9只大鼠中进行，*：p＜0.05，**：p＜0.01，实验组与对照组比较。
  组别   BMD(g/cm2)
  总骨骼   脊柱腰段   股骨
  对照   0.1371±0.0025   0.1956±0.0067   0.3151±0.0063
  DHEA(10mg)   0.1465±0.0010**   0.2163±0.0049*   0.3408±0.0038**
  EM-800(75μg)   0.1356±0.0017   0.1888±0.0045   0.3097±0.0047
  DHEA+EM-800   0.1498±0.0019**   0.2108±0.0061   0.3412±0.0056**
表3单用DHEA(10mg，透皮，每天一次)或EM-800(75μg，口服，每天一次)或它们的组合治疗9个月，对大鼠骨代谢参数的作用：每天尿钙和磷的排泄、尿羟基脯氨酸与肌酸酐(HP/Cr)的比例和血清总碱性磷酸酶的活力(tALP)。样品从每组9只大鼠中收集，*：p＜0.05，**：p＜0.01，实验组与对照组比较。
 组别                                   尿   血清
  钙(μmol/24小时/100g)   磷(μmol/24小时/100g)   HP/Cr(μmol/mmol)   tALP(IU/L)
 对照   23.17±1.55   132.72±6.08   13.04±2.19   114.25±14.04
 DHEA(10mg)   25.87±3.54   151.41±14.57   14.02±1.59   198.38±30.76*
 EM-800(75μg)   17.44±4.5   102.03±25.13   6.81±0.84**   114.11±11.26
 DHEA+EM-800   3.71±0.75**   59.06±4.76**   4.06±0.28**   204.38±14.20**
实施例2
摘要
在乳腺中，雄激素是从前体类固醇脱氢表雄酮(DHEA)形成的。临床证据显示雄激素对乳房癌有抑制作用。另一方面，雌激素刺激乳房癌的发生和生长。我们研究了单用DHEA或将其与新描述的纯抗雌激素EM-800组合，对切除卵巢的裸小鼠中由人乳房癌细胞系ZR-75-1形成的肿瘤异种移植物生长的作用。
紧接着切除卵巢，小鼠每天接受皮下注射0.5μg雌酮(一种雌激素)。每天口服EM-800(15、50或100μg)一次。每天两次在背部皮肤上单独涂敷DHEA(总量为0.3、1.0或3.0mg)，或与EM-800(每天15μg口服)组合。定期评估相应治疗的肿瘤大小的改变，与第一天测到的值相比。在实验结束时，解剖肿瘤并称重。
在第9.5个月，与未接受雌酮的小鼠相比，单接受雌酮的切除卵巢的小鼠中观察到肿瘤大小增加了9.4倍。对补充雌酮的切除卵巢小鼠给予15、50或100μgEM-800分别抑制了88％、93％和94％肿瘤大小。另一方面，用剂量为0.3、1.0或3.0mg的DHEA分别抑制了67％、82％和85％的肿瘤重量。每天用15μg口服剂量的EM-800有或无不同剂量的透皮DHEA达到对肿瘤大小相当的抑制。
DHEA和EM-800分别单独抑制裸小鼠中雌酮刺激的ZR-75-1小鼠异种移植肿瘤的生长。给予规定剂量的DHEA不会改变EM-800的抑制作用。
材料和方法
ZR-75-1细胞
从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得ZR-75-1人乳房癌细胞，在加湿气氛(95％空气/5％CO2)37℃，将其在RPMI 1640培养基中单层常规培养，该培养基补充有2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清(Poulin和Labrie，Cancer Res.46：4933-4937，1986；Poulin等人，Breast Cancer Res.Treat.12：213-225，1988)。用0.05％胰蛋白酶：0.02％EDTA(w/v)处理后，每周将细胞传代一次。用于本文所述实验的细胞培养物为细胞系ZR-75-1的第93代。
动物
从HSD(Indianapolis，Indiana，USA)得到雌性纯合Harlan Sprague-Dawley(nu/nu)无胸腺小鼠(28到42天龄)。将小鼠关养在乙烯笼(在层流气流通分橱中带有空气过滤顶)中，并维持病原体限制的条件。在使用前笼子、铺垫和食物以蒸汽灭菌。高压热灭菌水，并酸化至pH2.8，随意提供。
细胞接种
在接种肿瘤细胞前1周从两侧切除小鼠的卵巢(OVX)，通过腹腔内注射阿弗丁(Avertin)(0.25ml/动物)(戊醇：0.8g/100ml 0.9％NaCl；和2，2，2-三溴乙醇；2g/100ml 0.9％ NaCl)进行麻醉。用0.05％胰蛋白酶/0.02％ EDTA(w/v)处理单层后，收获处于对数生长期的ZR-75-1细胞(1.5×106)，悬浮在0.1ml含有25％Matrigel的培养基中，如以前所述用1英寸长20号针头皮下接种动物的两肋(Dauvois等人，Cancer Res.51：3131-3135，1991)。为了便于肿瘤的生长，每只动物每天接受皮下注射10μg雌二醇(E2)(含在由0.9％NaCl、5％乙醇、1％明胶组成的载体中)共5周。当存在可触及的ZR-75-1肿瘤后，用测径器测定肿瘤直径，选出肿瘤直径范围在0.2和0.7cm的小鼠用于本研究。
激素处理
所有动物(除了对照OVX组外)每天接受皮下注射0.5μg雌酮(E1)(用0.2ml0.9％NaCl、5％乙醇、1％明胶配制的)。在指出的各组中，在肿瘤生长区域之外的背部皮肤经皮每天给予两次体积为0.02ml的DHEA(剂量为0.3、1.0或3.0mg/动物)。DHEA溶解在50％乙醇50％丙二醇中。如早期(Gauthier等人，J.Med.Chem.40：2117-2122，1997)在CHUL研究中心的分子内分泌实验室的药物化学部门合成EM-800、((+)-7-新戊酰氧-3-(4’-新戊酰氧苯基)-4-甲基-2-(4”-(2-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-苯并吡喃)。将EM-800溶解在4％(v/v)乙醇、4％(v/v)聚乙二醇(PEG)600、1％(w/v)明胶、0.9％(w/v)NaCl中。指定的各组动物每天单次口服15μg、50μg或100μg EM-800，单用或与DHEA组合给予，而OVX组每天仅接受载体(0.2ml 4％乙醇、4％PEG600、1％明胶、0.9％NaCl)。每周一次用游标卡尺测定肿瘤。记录两个垂直直径(单位为cm)(L和W)，以公式：L/2×W/2×π计算肿瘤面积(单位为cm2)(Dauvois等人，Cancer Res.51：3131-3135，1991)。将处理第一天测得的面积计为100％，肿瘤大小的变化以初始肿瘤面积的百分比表示。通常皮下肿瘤难以测得肿瘤的精确三维直径，因此仅可测得肿瘤面积。处理第291天后(或9.5个月)，处死动物。
如(Dauvois等人，Breast Cancer Res.Treat.14：299-306，1989；Dauvois等人，Eur.J.Cancer Clin.Oncol.25：891-897，1989；Labrie等人，BreastCancer Res.Treat.33：237-244，1995)所述评估反应的类型。简单地说，肿瘤的部分消退为消退初始肿瘤大小的50％或大于50％；反应稳定是指肿瘤消退小于初始大小的50％或进展小于初始大小的50％；完全消退是指在处理结束时未能检出肿瘤。进展是指与初始大小相比肿瘤进展大于50％。实验结束时，断头处死所有动物。迅速取出无结缔组织和脂肪组织的肿瘤、卵巢和阴道，并称重。
统计分析
用方差分析(ANOVA)评估DHEA、EM-800和时间的作用，测得处理以及对同一动物在处理的开始和结束时进行重复测量(组内对象因子)对肿瘤大小的作用的统计显著性。在处理的第0月和9.5月的重复测量构成了动物的随机区组。因此将时间作为区组内作用，而两种处理则作为区组间作用进行分析。所有主要作用间的相互作用都包括在模型中。对处理因子和它们的相互作用的显著性的分析以对象组内因子作为误差项。将数据对数化。对ANOVA的基础假设假定残差具正态性，以及方差具同质性。
对最小显著差用Fisher检验进行后验成对比较。用考虑交叉作用的标准双向ANOVA与交互作用分析主作用以及处理对体重和器官重量的交互作用。用SAS程序(SAS Institute，Cary，NC，USA)进行所有的ANOVA。用双拖尾检验揭示差异的显著性(总体水平的5％)。
用有序的分类反应变项的Kruskall-Wallis检验(完全反应、部分反应、稳定反应和肿瘤进展)分析分类数据。对处理作用作总体评估后，调整多重比较临界p值对表4中显示的结果子集进行分析。用StatXact程序(Cytel，Cambridge，MA，USA)计算确切的p值。
数据用每组中12-15只小鼠的平均值±平均值的标准误差(SEM)表示。
结果
如图4A所示，用每天皮下给药0.5μg雌酮处理的切除卵巢裸鼠，291天(9.5个月)后人ZR-75-1肿瘤增加了9.4倍，而仅接受载体的对照OVX小鼠在研究过程中肿瘤大小与初始值相比减少36.9％。
透皮给予递增剂量的DHEA处理，逐级抑制E1刺激的ZR-75-1肿瘤生长。每天用剂量为0.3mg、1.0mg和3.0mg/动物的DHEA处理，9.5个月分别抑制了50.4％、76.8％和80.0％(如4A)。这与总肿瘤负荷的减小相一致，用DHEA处理明显减少了在实验结束时的肿瘤重量的平均值。事实上，从对照的补充E1的切除卵巢裸鼠平均肿瘤重量的1.12±0.26g分别减至，每天接受0.3、1.0和3.0mg剂量DHEA处理的各组动物的0.37±0.12g(P＝0.005)、0.20±0.06g(P＝0.001)和0.17±0.06g(P＝0.0009)(图4B)。
与9.5月时对照动物的肿瘤大小相比，每天剂量为15μg、50μg和100μg抗雌激素EM-800分别抑制了87.5％(P＜0.0001)、93.5％(P＜0.0001)和94.0％(P＝0.0003)受雌激素刺激的肿瘤大小(图5A)。
用三种剂量的EM-800达到的肿瘤大小减小彼此间的差异不显著。如图4B所示，在9.5月实验结束时，肿瘤重量从对照的补充E1的OVX小鼠的1.12±0.26g分别减至，每天接受15μg、50μg和100μg剂量EM-800处理动物中的0.08±0.03g、0.03±0.01g和0.04±0.03g(EM-800的所有剂量对补充E1的OVX的P＜0.0001)。
如上所述，每天口服15μg抗雌激素EM-800，在9.5月测得抑制了87.5％受雌酮刺激的肿瘤生长。以三种剂量添加的DHEA对已显著受抑的肿瘤大小(由每天15μg剂量抗雌激素EM-800实现的)没有明显作用(图5B)。因此，平均肿瘤重量从对照的补充雌酮的小鼠的1.12±0.26g明显减至，每日单接受15μg抗雌激素或与0.3、1.0和3.0mg剂量DHEA组合的动物中的0.08±0.03g(P＜0.0001)、0.11±0.04g(P＝0.0002)、0.13±0.07g(P＝0.0004)和0.08±0.05(P＜0.0001)(这四组间没有显著的差异)(图4B)。
同样令人感兴趣的是观察上述处理的反应的分类。用递增剂量的DHEA处理，进展的肿瘤数从对照的OVX动物(补充雌酮)的87.5％分别减至(虽然未达统计显著性水平(P＝0.088))，每天用剂量为0.3、1.0或3.0mg DHEA处理的动物的50.0％、53.3％和66.7％(表4)。另一方面，完全反应也从补充雌酮的小鼠0％分别增至，每天接受剂量为0.3、1.0和3.0mg透皮DHEA动物的28.6％、26.7％和20.0％。另外，在对照补充E1的小鼠和接受上述剂量DHEA的三组动物中也分别测得12.5％、21.4％、20.0％和13.3％有稳定反应。在对照的切除卵巢的小鼠中，完全、部分和稳定反应的比例测得分别为68.8％、6.2％和18.8％，而仅观察到6.2％肿瘤进展(表4)。
在单接受抗雌激素EM-800(P＝0.0006)15μg或将其与0.3mg、1.0mg或3.0mgDHEA组合的动物，分别实现了29.4％、33.3％、26.7％和35.3％完全反应或肿瘤消失(表4)。另外，在上述相同的各组动物中也分别观察到35.3％、44.4％、53.3％和17.6％肿瘤进展。单接受EM-800或与DHEA组合处理之间没有显著的差异。
未观察到DHEA或EM-800处理对经肿瘤重量调整的体重有明显作用。用雌酮处理OVX小鼠，使子宫重量从OVX对照小鼠的28±5mg增至132±8mg(P＜0.01)，而递增剂量的DHEA导致对雌酮的刺激作用有渐进的但相对较小的抑制，在所用的最高DHEA剂量达到26％(P＝0.0008)。从同一张图可看出受雌酮刺激的子宫重量从对照补充雌酮的小鼠的132±8mg分别减至，每天口服15μg、50μg或100μgEM-800(总P＜0.0001)小鼠的49±3mg、36±2mg和32±1mg(所有剂量与对照比较p＜0.0001)。每天将剂量为15微克(15μg)EM-800与0.3mg、1.0mg或3.0mg DHEA组合，分别测得子宫重量为46±3mg、59±5mg和69±3mg。
另外，用雌酮处理使OVX动物的阴道重量从14±2mg增至31±2mg(P＜0.01)，而添加DHEA没有明显作用。每天用15μg、50μg或100μg剂量的EM-800处理，使阴道重量分别减至23±1mg、15±1mg和11±1mg(所有剂量与对照组相比较总p和配对P＜0.0001)。将EM-800与0.3mg、1.0mg或3.0mg剂量的DHEA组合，分别测得阴道重量为22±1mg、25±2mg和23±1mg(N.S.所有组与15μg EM-800)。需要指出，所用的最高剂量(即每天100μg)EM-800使补充雌酮的OVX动物的子宫重量减少到与OVX对照组的值没有差异，而阴道重量减少到低于在OVX对照组中测得的值(P＜0.05)。可能是由于雄激素作用，DHEA部分抵消了EM-800对子宫和阴道重量的作用。
表4透皮给予DHEA或口服EM-800或它们的组合9.5个月，对裸小鼠中人ZR-75-
1乳腺瘤异种移植物反应(完全、部分、稳定和进展)的作用。
  组 动物总数   反应分类
  完全   部分   稳定   进展
  数量和(％)
  OVX 16   11(68.8)   1(6.2)   3(18.8)   1(6.2)
  OVX+E1(0.5μg) 16   0(0)   0(0)   2(12.5)   14(87.5)
  OVX+E1(0.5μg)+DHEA    0.3mg1.0mg3.0mg 141515   4(28.6)4(26.7)3(20.0)   0(0)0(0)0(0)   3(21.4)3(20.0)2(13.3)   7(50.0)8(53.3)10(66.7)
  OVX+E1(0.5μg)+EM-800  15μg50μg100μg 171616   5(29.4)4(25.0)8(50.0)   1(5.9)3(18.8)0(0)   5(29.4)5(31.2)3(18.8)   6(35.3)4(25.0)5(31.2)
  OVX+E1(0.5μg)+        0.3mgEM-800+DHEA            1.0mg3.0mg 181517   6(33.3)4(26.7)6(35.3)   0(0)0(0)0(0)   4(22.2)3(20.0)8(47.1)   8(44.4)8(53.3)3(17.6)
E1＝雌酮；DHEA＝脱氢表雄酮；OVX＝切除卵巢的
实施例3
本发明的优选化合物对雌性切除卵巢大鼠胆固醇水平的作用
动物和处理
用50-60天龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(Crl：CD(SD)Br)(Charles RiverLaboratory，St-Constant，Canada)，在切除卵巢时重量为190g。在手术前使动物驯化于环境条件(温度：22±3℃；湿度：50±20％；12小时明亮-12小时黑暗，07：15起明亮)1周。将动物3只/笼关养，不限制它们对自来水的饮用，用丸状啮齿动物食物(Lab Diet 5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)喂养。实验进行依据加拿大动物管理委员会(CCAC)在CCAC试验动物管理和使用指南中认可的装置进行。
在研究的第0天将136只雌大鼠切除卵巢(异氟烷麻醉)，随机分成17组进行如下研究：
组1：OVX对照
组2：OVX+EM-800(0.01mg/kg，po，ID)
组3：OVX+EM-800(0.03mg/kg，po，ID)
组4：OVX+EM-800(0.1mg/kg，po，ID)
组5：OVX+EM-800(0.3mg/kg，po，ID)
组6：OVX+EM-800(1mg/kg，po，ID)
组7：OVX+EM-01538(0.01mg/kg，po，ID)
组8：OVX+EM-01538(0.03mg/kg，po，ID)
组9：OVX+EM-01538(0.1mg/kg，po，ID)
组10：OVX+EM-01538(0.3mg/kg，po，ID)
组11：OVX+EM-01538(1mg/kg，po，ID)
组12：OVX+雷洛昔芬(EM-1105)(0.01mg/kg，po，ID)
组13：OVX+雷洛昔芬(EM-1105)(0.03mg/kg，po，ID)
组14：OVX+雷洛昔芬(EM-1105)(0.1mg/kg，po，ID)
组15：OVX+雷洛昔芬(EM-1105)(0.3mg/kg，po，ID)
组16：OVX+雷洛昔芬(EM-1105)(1mg/kg，po，ID)
组17：INT对照
在研究的第10天开始给药处理，进行口服管饲每日1次直到研究的第13天。在0.4％甲基纤维素中制备药物悬浮液，按研究第10天记录的该组平均体重调节浓度，给每只大鼠0.5ml药物悬浮液。最后一次给药约24小时后，异氟烷麻醉下通过腹部主动脉放血处死禁食过夜的动物，并收集血样用于制备血清。取出子宫，剥去其上的脂肪并称重。
血清胆固醇和甘油三酯的分析
用Boehringer Mannheim实验室诊断系统测定总血清胆固醇和甘油三酯水平。
实施例4
雄烯-3β，17β-二醇(5-二醇)具有固有的雌激素活性。另外，作为前体性类固醇，其在周围组织内分泌可转化成活性雄激素和/或其它雌激素。为了评估5-二醇雄激素和雌激素组分对骨量的相对重要性，将21周龄的大鼠切除卵巢，每天单用透皮给予的2、5、或12.5mg 5-二醇或与抗雄激素氟他胺(FLU，10mg，s.c.，每天一次)及/或抗雌激素EM-800(100μg，s.c.，每日一次)组合处理共12个月。处理11个月后，测定骨矿物密度(BMD)。切除卵巢(OVX)导致股骨BMD减少12.8％(p＜0.01)，而用最高剂量的5-二醇处理恢复了34.3％在OVX后的11个月中流失的股骨BMD(p＜0.01)。同时给予FLU完全阻止了5-二醇对股骨BMD的刺激作用，而添加EM-800与单用5-二醇相比增加了28.4％刺激作用。同时给予5-二醇、FLU和EM-800仅表现出EM-800(27％)的作用，因为5-二醇的作用完全被FLU阻断了。在脊柱腰段的BMD上得到可比的结果，虽然单接受12.5mg 5-二醇、12.5mg 5-二醇+EM-800或5-二醇+FLU+EM-800的OVX大鼠脊柱腰段的BMD的数据与完整动物的数据没有显著差异。组织形态学分析显示5-二醇对骨量、小梁数的刺激作用和对近端胫骨的干骺端区域的次级松质小梁分离的抑制作用都被FLU抵消了，但被EM-800进一步提高。用5-二醇处理后得到的对血清碱性磷酸酶活性的显著刺激被同时给予的FLU逆转了57％(p＜0.01对单用12.5mg 5-二醇)。用5-二醇处理对尿钙与肌酸酐的比例没有统计学显著抑制作用。5-二醇的最高剂量显著减少了23％(p＜0.01)血清胆固醇，而添加EM-800减少62％(p＜0.01)血清胆固醇。
本文的数据清楚地显示5-二醇对骨形成的刺激作用，并表明虽然5-二醇是一种弱雌激素，其对骨形成的刺激作用主要起因于受雄激素作用。另外，附加的EM-800和5-二醇对骨量的刺激作用证明大鼠中抗雌激素EM-800的骨保护作用。5-二醇和EM-800的降胆固醇活性可用于预防心血管病。
                                                     实施例5
    组别   血清碱性磷酸酶   尿OH-脯氨酸/肌酸酐   LH   GnRH mRNA水平   胆固醇   甘油三酯
  IU/L   μmol/mmol   ng/ml   银粒(silver grain)/细胞   mmol/L   mmol/L
    完整对照   30±3**   15.4±1.3   0.09±0.03**   33.7±0.7**   2.28±0.12   1.4±0.2
OVX对照 51±4 11.7±1.2 3.55±0.50 44.0±0.9 2.29±0.16 1.1±0.1
    OVX+MPA   57±4   11.7±1.2   2.51±0.20*   35.5±0.7**   2.55±0.14   1.3±0.1
    OVX+E2   41±5   9.2±0.9   2.37±0.45**   40.4±0.8**   2.02±0.15   0.8±0.1
    OVX+DHT   56±5   7.8±0.7*   1.55±0.27**   38.8±0.7**   2.44±0.16   0.9±0.1
    OVX+DHEA   201±25**   7.3±1.0*   0.02±0.01**   34.5±0.7*   1.78±0.16*   0.8±0.1
    OVX+DHEA+FLU   103±10**   14.5±1.2   1.13±0.24**   41.5±0.7*   2.27±0.15   0.8±0.1
    OVX+DHEA+EM-800   202±17**   6.4±1.0**   LD**   39.2±0.7**   0.63±0.09**   1.0±0.2
LD：检测限：0.01ng/ml
*p＜0.05；**p＜0.01与OVX对照比较
实施例6
合成本发明优选化合物的示例
(S)-(+)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐EM-01538(EM-652·HCl)
                                   流程1
Figure A20041009746600431
步骤A：BF3·Et2O，甲苯；100℃；1小时。
步骤C：3，4-二氢吡喃、对-甲苯磺酸一水合物、乙酸乙酯；25℃氮气下，16小时，然后在异丙醇中结晶。
步骤D、E和F：
(1)哌啶、甲苯、Dean & Stark装置，氮气下回流；
(2)1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯，DMF，回流3小时；
(3)CH3MgCl，THF，-20到0℃，然后室温24小时；
步骤G、H：(1S)-(+)-10-樟脑磺酸，丙酮、水、甲苯、室温，48小时。
步骤HH：95％乙醇，70℃，然后室温，3天。
步骤HHR：步骤HH的母液和洗液再循环，(S)-10-樟脑磺酸，回流；36小时，然后室温16小时。
步骤I：
(1)DMF aq.，Na2COC3、乙酸乙酯；
(2)乙醇、稀HCl；
(3)水。
2-四氢吡喃氧基(pyranyloxy)-4-羟基-2’-(4”-四氢吡喃氧基苯基)乙酰苯(4)的合成。在约25℃，用对-甲苯磺酸一水合物(0.03g，0.158mmol)处理用3，4-二氢吡喃(218ml，3.39mol)和乙酸乙酯(520ml)配制的2，4-二羟基-2’-(4”-羟基苯基)乙酰苯3(97.6g，0.4mol)(可从Chemsyn ScienceLaboratories，Lenexa，Kansas购得)悬浮液。氮气下搅拌反应混合液(无需外部加热)约16小时。然后用以水(100ml)配制的碳酸氢钠(1g)和氯化钠(5g)溶液洗涤混合液。使两相分离，用盐水(20ml)洗涤有机相。每次洗涤都用50ml乙酸乙酯反萃取。混合所有有机相，用硫酸钠过滤。
在大气压下蒸馏除去溶剂(约600ml)，加入异丙醇(250ml)。大气压下蒸馏所加的溶剂(约300ml)，加入异丙醇(250ml)。大气压下蒸馏所加的溶剂(约275ml)，加入异丙醇(250ml)。在25℃搅拌冷却溶液，12小时后过滤出结晶的固体，用异丙醇洗涤，干燥(116.5g，70％)。
4-羟基-4-甲基-2-(4’-[2”-哌啶子基]-乙氧基)苯基-3-(4-四氢吡喃氧基)苯基-7-四氢吡喃氧基-苯并二氢吡喃(10)的合成。氮气下用Dean & Stark装置回流2-四氢吡喃氧基-4-羟基-2’-(4”-四氢吡喃氧基苯基)乙酰苯4(1kg，2.42mol)、4-[2-(1-哌啶子基)乙氧基]苯甲醛5(594g，2.55mol)(可从ChemsynScience Laboratories，Lenexa，Kansas购得)和哌啶(82.4g，0.97mol)(可从Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis购得)在甲苯(8L)中的溶液，直到收集到1摩尔的水(44ml)。
大气压下蒸馏从溶液中除去甲苯(6.5L)。加入二甲基甲酰胺(6.5L)和1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯(110.5g，0.726mol)。室温搅拌溶液约8小时，使苯并烯酰苯8异构化成苯并二氢吡喃-4-酮9，然后加至水和冰(8L)和甲苯(4L)的混合物中。将两相分离，用水(5L)洗涤甲苯层。用甲苯(3×4L)提取混合的水洗液。最后甲苯提液合并，用盐水(3×4L)洗涤，大气压下浓缩到5.5L，然后冷却到-10℃。
保持外部冷却和搅拌(氮气下)，加入3M用THF(2.5L，7.5mol)配制的甲基氯化镁溶液(可从Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis购得)，维持温度低于0℃。添加完所有Grignard试剂后，撤掉外部冷却装置，让温度上升到室温。在该温度搅拌混合液约24小时。
再次将混合物冷却到约-20℃，并在外部冷却和搅拌下，缓慢加入饱和的氯化铵溶液(200ml)，将温度维持在20℃以下。搅拌混合液2小时，然后加入饱和的氯化铵溶液(2L)和甲苯(4L)，搅拌5分钟。使两相分离，用甲苯(2×4L)提取水层。用稀盐酸洗涤合并的甲苯提取物，直到溶液均质，然后用盐水(3×4L)洗涤。最终于大气压下将甲苯溶液浓缩到2L。本溶液可直接用于下一步骤。
(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(±12)的合成。在4-羟基-4-甲基-2-(4’-[2”-哌啶子基]-乙氧基)-苯基-3-(4-四氢吡喃氧基)苯基-7-四氢吡喃氧基苯并二氢吡喃(10)的甲苯溶液中加入丙酮(6L)、水(0.3L)和(S)-10-樟脑磺酸(561g，2.42mol)(可从Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis购得)。氮气下搅拌混合液48小时，此后过滤固体(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(12)，用丙酮洗涤，干燥(883g)。无需进一步纯化就可用于下一(HH)步骤。
(2S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐(13，(+)-EM-652(1S)-CSA盐)的合成。将在95％乙醇中的(2R，S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐±12(759g)悬浮液搅拌加热到约70℃，直到固体溶解。搅拌下让溶液冷却到室温，然后投入少量(2S)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟脑磺酸盐13晶种。室温搅拌溶液共约3天。过滤晶体，用95％乙醇洗涤，干燥(291g，76％)。产物的de为94.2％，纯度为98.8％。
(S)-(+)-7-羟基-3-(4’-羟基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃盐酸盐EM-01538(EM-652，HCl)的合成。用0.5M碳酸钠水溶液(7.0ml，3.6mmol)处理用二甲基甲酰胺(11μl，0.15mmol)配制的化合物13(EM-652(+)-CSA盐，500mg，0.726mmol)的悬浮液，搅拌15分钟。用乙酸乙酯(7.0ml)处理悬浮液，搅拌4小时。然后用饱和碳酸钠水溶液(2×5ml)和盐水(1×5ml)洗涤有机相，以硫酸镁干燥，浓缩。用2N盐酸(400μl，0.80mmol)处理在乙醇(2ml)中的生成的粉红色泡沫(EM-652)的溶液，搅拌1小时，用蒸馏水(5ml)洗涤，并搅拌30分钟，过滤生成的悬浮液，用蒸馏水(5ml)洗涤，在空气中和高真空下干燥(65℃)，得到乳色粉末(276mg，77％)：灰白色粉末；扫描量热法；熔融峰为219℃，
ΔH＝83J/g；[α]24 D＝154°甲醇中
10mg/ml.；1H NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.6(宽2H，H-4)，1.85(宽，4H，H-3””和5””)，2.03(s，3H，CH3)，3.0和3.45(宽4H，H-2””和6””)，3.47(t，J＝4.9Hz，2H，H-3)，4.26(t，J＝4.9Hz，2H，H-2)，5.82(s，1H，H-2)，6.10(d，J＝2.3Hz，1H，H-8)，6.35(dd，J＝8.4，2.43Hz，1H，H-6)，6.70(d，J＝8.6Hz，2H，H-3′，和H-5′)，6.83(d，J＝8.7Hz，2H，H-3″和H-3″)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H，H-2′和H-6′)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H，H-5)，7.24(d，J＝8.6Hz，2H，H-2″和H-6″)；13C RMN(CD3OD，75MHz)δppm 14.84，22.50，23.99，54.78，57.03，62.97，81.22，104.38，109.11，115.35，116.01，118.68，125.78，126.33，130.26，130.72，131.29，131.59，134.26，154.42，157.56，158.96，159.33.组成元素C，H，N，Cl：
理论值70.51，6.53，2.84，7.18，％，实际值70.31，6.75，2.65，6.89％.
实施例7
雄-5-烯-3β，17β-二醇前体药物生物利用度的体内测定
1)原理
单次口服化合物后测定血浆化合物的浓度，分析在雄性Sprague Dawley大鼠中性类固醇前体的前体药物的生物利用度。
a)动物和处理
从Charles-River Canada Inc.得到重量为275-350g的雄性Sprague Dawley大鼠[Crl：CD(SD)Br]，在适应环境阶段每笼关养两只，研究过程中则单独关养。保持动物12小时明亮：12小时黑暗(08:00起明亮)的规律。用标准啮齿动物饲料(Lab Diet#5002，丸粒)喂养动物，任意给自来水。在给药的前夜开始让大鼠禁食(只给水)。
每种化合物都以0.4％甲基纤维素配制悬浮液，剂量为150μmg/大鼠，通过口服管饲法给予三只动物。在管饲后的第1、2、3、4和7小时，从用异氟烷诱导麻醉的大鼠颈静脉收集血样(～0.7ml)。迅速将血样转移到冷冻的含有EDTA的0.75ml微容器(Microtainer)中，置于冰水浴中，直到3000rpm离心10分钟。收集血样后，立即(少于50分钟)进行血浆分离。然后将每份为0.25ml的血浆转移到硼硅玻璃管(13×100)中，在干冰上迅速冷冻。将血浆样品置于-80℃直到用GC-MS来测定血浆中性类固醇或性类固醇前体的浓度。
结果：
图12和13显示了口服吸收和AUC的结果。
药物组合物实例
如下所示，为一些用优选的活性SERM EM-800或EM-1538和优选的活性性类固醇前体DHEA、EM-1304或EM-01474-D的药物组合物(仅起说明作用，无任何限制)。本发明的其它化合物或它们的组合可取代(或添加到)EM-800或EM-1538、DHEA、EM-1304或EM-01474-D。如本文所述，活性组分的浓度范围可很广。可包括的其它组分的用量和类型是本领域所熟知的。
实施例A
片剂
    组分     重量％(占组合物的总重)
    EM-800     5.0
    DHEA     15.0
    明胶     5.0
    乳糖     58.5
    淀粉     16.5
实施例B
明胶胶囊
    组分     重量％(占组合物总重)
    EM-800     5.0
    DHEA     15.0
    水合乳糖     65.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
    硬脂酸镁     0.4
药盒实例
如下所示，为一些用优选的活性SERM EM-800或EM-1538和优选的活性性类固醇前体DHEA、EM-1304或EM-01474-D的药盒(仅起说明作用，无任何限制)。本发明的其它化合物或它们的组合可取代(或添加到)EM-800或EM-1538、DHEA、EM-1304或EM-01474-D。如本文所述，活性组分的浓度范围可很广。可包括的其它组分的用量和类型是本领域所熟知的。
实施例A
口服给予SERM，透皮给予性类固醇前体
用于口服给药的SERM组合物(胶囊)
    组分     重量％(占组合物总重)
    EM-800     5.0
    水合乳糖     80.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
    硬脂酸镁     0.4
用于局部给药的性类固醇前体组合物(凝胶)
    组分   重量％(占组合物总重)
    DHEA   10.0
    辛酸-癸酸甘油三酯(Neobee M-5)   5.0
    己二醇   15.0
    Transcutol(二乙二醇单甲醚)   5.0
    苯甲醇   2.0
    Cyclomethicone(Dow Corning 345)   5.0
    乙醇(无水)   56.0
    羟丙基纤维素(1500cps)(KLUCEL)   2.0
实施例B
口服给药的SERM和性类固醇前体
用于口服的非类固醇抗雌激素组合物(胶囊)
    组分     重量％(占组合物总重)
    EM-800     5.0
    水合乳糖     80.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
硬脂酸镁 0.4
用于口服的性类固醇前体组合物(明胶胶囊)
    组分     重量％(占组合物总重)
    DHEA     15.0
    水合乳糖     70.0
    淀粉     4.8
    微晶纤维素     9.8
    硬脂酸镁     0.4
在上述配方中，可用其它SERM替代EM-800或EM-01538，其它性类固醇抑制剂也可替代DHEA、EM-1304或EM-01474-D。可包括多种SERM或多种前体，此时总重量百分比宜为上述实例所给出的单种前体或单种SERM的重量百分比。
本发明以优选实施例和实例的形式表述，但并非对其限制。本领域技术人员易实现更多的运用，本发明的的权限仅受权利要求书的限制。

Claims (25)

1.选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇的性类固醇前体和体内能转化成任何上述性类固醇前体的前体药物，联合选择性雌激素受体调节剂的用途，其特征在于，用于制备治疗以下疾病：乳房癌、子宫内膜癌、子宫癌、卵巢癌的药物，其中：所述选择性雌激素受体调节剂是2S构型的具有光学活性的苯并吡喃，或其药物学上可接受的盐，所述化合物具有分子结构：
其中G3选自氢、甲基和乙基；
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4，其中R3和R4分别选自C1-C4烷基，或R3、R4和它们连接的氮一起为以下环状结构：吡咯烷子基、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚胺基、吗啉代；
其中R1和R2分别选自氢、羟基、和在体内转化成羟基的部分；和其中苯并吡喃化合物不是EM-800。
2.2S构型的具有光学活性的苯并吡喃，或其药物学上可接受的盐的用途，所述化合物具有分子结构：
Figure A2004100974660002C2
其中G3选自氢、甲基和乙基；
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4，其中R3和R4分别选自C1-C4烷基，或R3、R4和它们连接的氮一起为以下环状结构：吡咯烷子基、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚胺基、吗啉代；
其中R1和R2分别选自氢、羟基、和在体内转化成羟基的部分；和其中苯并吡喃化合物不是EM-800，其特征在于，用于制备治疗选自：乳房癌、子宫内膜癌、子宫癌和卵巢癌的疾病的药物，其中该药物还包括一种性类固醇前体，选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇的性类固醇前体和体内能转化成任何上述性类固醇前体的前体药物。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的苯并吡喃具有结构：
Figure A2004100974660003C1
其中R1和R2分别选自羟基和在体内转化成羟基的部分；
其中R3选自饱和的或未饱和的吡咯烷基，饱和的或未饱和的的哌啶子基，饱和的或未饱和的哌啶基，饱和的或未饱和的吗啉代，含氮环部分，含氮多环部分和NRaRb，其中Ra和Rb分别选自氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C2-C6烯基和直链或支链C2-C6炔基。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的选择性雌激素受体调节剂选自：
EM-01520
EM-01533
Figure A2004100974660004C2
EM-01518
Figure A2004100974660004C3
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的苯并吡喃是以下酸的盐：醋酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、延胡索酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、氢氯噻嗪、羟萘甲酸、乳酸、顺丁烯二酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、软脂酸、新戊酸、磷酸、丙酸、丁二酸、硫酸、酒石酸、对苯二酸、对-甲苯磺酸和戊酸。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的酸是盐酸。
7.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的选择性雌激素受体调节剂是：
EM-1538
8.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的性类固醇前体是脱氢表雄酮。
9.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述选择性雌激素受体调节剂是：
EM-1538
所述性类固醇前体是脱氢表雄酮。
10.一种药物组合物，包括：
a)药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；
b)至少一种治疗有效剂量的性类固醇前体，该前体选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇和体内能转化成任何上述性类固醇前体的前体药物；和
c)至少一种治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂，所述调节剂是2S构型的具有光学活性的苯并吡喃化合物，或其药物学上可接受的盐，所述化合物具有分子结构：
Figure A2004100974660005C2
其中G3选自氢、甲基和乙基；
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4，其中R3和R4分别选自C1-C4烷基，或R3、R4和它们连接的氮一起为以下环状结构：吡咯烷子基、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚胺基、吗啉代；
其中R1和R2分别选自氢、羟基、和在体内转化成羟基的部分；和
其中苯并吡喃化合物不是EM-800。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的苯并吡喃具有结构：
Figure A2004100974660006C1
其中R1和R2分别选自羟基和在体内转化成羟基的部分；
其中R3选自饱和的或未饱和的吡咯烷基，饱和的或未饱和的的哌啶子基，饱和的或未饱和的哌啶基，饱和的或未饱和的吗啉代，含氮环部分，含氮多环部分和NRaRb，其中Ra和Rb分别选自氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C2-C6烯基和直链或支链C2-C6炔基。
12.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的选择性雌激素受体调节剂选自：
EM-01520
Figure A2004100974660006C2
EM-01533
Figure A2004100974660006C3
EM-01518
Figure A2004100974660006C4
13.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述的苯并吡喃是以下酸的盐：醋酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、延胡索酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、氢氯噻嗪、羟萘甲酸、乳酸、顺丁烯二酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、软脂酸、新戊酸、磷酸、丙酸、丁二酸、硫酸、酒石酸、对苯二酸、对-甲苯磺酸和戊酸。
14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述的酸是盐酸。
15.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的选择性雌激素受体调节剂是：
EM-1538
16.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的性类固醇前体是脱氢表雄酮。
17.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的选择性雌激素受体调节剂是：
EM-1538
Figure A2004100974660007C2
所述的性类固醇前体是脱氢表雄酮。
18.一种药盒，包括在第一容器中含有至少一种治疗有效剂量的性类固醇前体，选自脱氢表雄酮、硫酸脱氢表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇和体内能转化成任何上述性类固醇前体的前体药物；还包括在第二容器中含有至少一种治疗有效剂量的选择性雌激素受体调节剂，所述化合物是2S构型的具有光学活性的苯并吡喃化合物，或其药物学上可接受的盐，所述化合物具有分子结构：
Figure A2004100974660007C3
其中G3选自氢、甲基和乙基；
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4，其中R3和R4分别选自C1-C4烷基，或R3、R4和它们连接的氮一起为以下环状结构：吡咯烷子基、二甲基-1-吡咯烷子基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亚甲基亚胺基、吗啉代；
其中R1和R2分别选自氢、羟基、和在体内转化成羟基的部分；和
其中苯并吡喃化合物不是EM-800。
19.如权利要求18所述的药盒，其特征在于，所述的苯并吡喃具有结构：
Figure A2004100974660008C1
其中R1和R2分别选自羟基和在体内转化成羟基的部分；
其中R3选自饱和的或未饱和的吡咯烷基，饱和的或未饱和的的哌啶子基，饱和的或未饱和的哌啶基，饱和的或未饱和的吗啉代，含氮环部分，含氮多环部分和NRaRb，其中Ra和Rb分别选自氢、直链或支链C1-C6烷基、直链或支链C2-C6烯基和直链或支链C2-C6炔基。
20.如权利要求19所述的药盒，其特征在于，所述的选择性雌激素受体调节剂选自：
EM-01520
Figure A2004100974660008C2
EM-01533
EM-01518
Figure A2004100974660008C4
21.如权利要求19所述的药盒，其特征在于，所述的苯并吡喃是以下酸的盐：醋酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、延胡索酸、氢碘酸、氢溴酸、盐酸、氢氯噻嗪、羟萘甲酸、乳酸、顺丁烯二酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、软脂酸、新戊酸、磷酸、丙酸、丁二酸、硫酸、酒石酸、对苯二酸、对-甲苯磺酸和戊酸。
22.如权利要求21所述的药盒，其特征在于，所述的酸是盐酸。
23.如权利要求18所述的药盒，其特征在于，所述的选择性雌激素受体调节剂是：
EM-1538
Figure A2004100974660009C1
24.如权利要求18所述的药盒，其特征在于，所述的性类固醇前体是脱氢表雄酮。
25.如权利要求18所述的药盒，其特征在于，所述选择性雌激素受体调节剂是：
EM-1538
Figure A2004100974660009C2
所述性类固醇前体是脱氢表雄酮。
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