CN1655802B - 生物粘附性定向体细胞治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用含有生物粘附性材料的细胞组合物进行细胞介导的基因治疗。该生物粘附性材料能使治疗性体细胞靶向和定位于感兴趣部位。

Description

生物粘附性定向体细胞治疗

发明背景

发明领域

本发明涉及用于感兴趣基因，包括各种细胞因子基因定位表达的、生物粘附性定向基因治疗的组合物。本发明也涉及利用此组合物再生软骨的方法。此外，本发明涉及给予哺乳动物结缔组织注射该组合物治疗骨关节炎的方法。

相关领域简要描述

在矫形外科领域，退化性关节炎或骨关节炎是与软骨损伤相关的最常见疾病。机体的几乎每一个关节，如膝、髋、肩、甚至腕关节都可能受到影响。此病的病理进程是透明关节软骨发生退化(Mankin等，J Bone Surg，52A：460-466，1982)。关节的透明软骨变形、原纤维形成、和最终萎缩。如果退化软骨能有一些再生，大多数病人将能提高生活质量免除虚弱痛苦。

传统的药物递送途径，如口服、静脉内或肌肉内给药，对关节给药是无效的。而注射入关节内的药物半衰期通常很短。关节内注射药物的另一缺点是必须经常重复注射以获得关节腔内可接受的药物水平来治疗慢性病如关节炎。由于治疗药物本身不能选择性靶向关节，必须使哺乳动物宿主全身接触高浓度药物以获得持续的关节内治疗剂量。非目标器官以这种方式接触药物加剧了抗关节炎药物产生严重副作用，如哺乳动物宿主胃肠道紊乱，造血、心血管、肝肾系统发生变化的倾向。

矫形外科领域中，认为某些细胞因子可作为治疗矫形外科疾病的候选药物。认为骨形态发生蛋白是骨形成的一种有效剌激剂(Ozkaynak等，EMBO J.9：2085-2093，190；Sampath和Rueger，Complications in Ortho，101-107，1994)，据报导，TGF-β是骨形成和软骨形成的一种剌激剂(Joyce等，J.Cell Biology，北0：2195-2207，1990)。

认为转化生长因子(TGF-β)是一种多功能细胞因子(Sporn和Roberts，Nature(London)，332：217-219，1988)，在细胞生长、分化和胞外基质蛋白合成中起调节作用(Madri等，J Cell Biology，106：1375-1384，1988)。TGF-β能抑制体外上皮细胞和破骨细胞的生长(Chenu等，Proc Natl Acad Sci，85：5683-5687，1988)，在体内它能剌激软骨骨化甚至骨形成(Critchlow等，Bone，521-527，1995；Lind等，A Orthop Scand，64(5)：553-556，1993；和Matsumoto等，In Vivo，8：215-220，1994)。TGF-β诱导的骨形成是通过其剌激骨膜下的多能细胞最终分化成为软骨形成细胞而介导的(Joyce等，J Cell Biology，110：2195-2207，1990；和Miettinen等，J Cell Biology，127-6：2021-2036，1994)。

已报导了TGF-β在矫形外科中的生物作用(Andrew等，Calcif Tissue In.52：74-78，1993；Borque等，Int J Dev Biol.，37：573-579，1993；Carrington等，J Cell

Biology，107：1969-1975，1988；Lind等，A Orthop Scand，64(5)：553-556，1993；Matsumoto等，In vivo，8：215-220，1994)。小鼠胚胎染色显示TGF-β与间充质，如结缔组织、软骨和骨衍生的组织密切相关。除胚胎学发现外，TGF-β存在于骨形成和软骨形成的部位。它也可提高家兔胫骨骨折的愈合率。最近报导了TGF-β的治疗价值(Critchlow等，Bone，521-527，1995；和Lind等，A Orthop Scand，64(5)：553-556，1993)，但它作用时间短和价格高限制了其临床的广泛应用。

关节内注射TGF-β治疗关节炎效果不理想，因为注入的TGF-β作用时间短，如TGF-β可在体内降解成无活性形式。因此，透明软骨再生需要一种长期释放TGF-β的新方法。

已有采用自身软骨细胞移植再生关节软骨的报导(Brittberg等，New Engl Med331：889-895，1994)，但此法必须二次手术并广泛切除软组织。如果关节内注射足以治疗退化性关节炎，这将对病人具有极大的经济和生理利益。

基因治疗法是一种将特异性蛋白质转移到特定部位的方法，可能回答此问题(Wolff和Lederberg，Gene Therapeutics，Jon A Wolff编，3-25，1994；和Jenk，J Natl Cancer Inst，89(16)；1182-1184，1997)。

美国专利5,858,355和5,766,585描述了IRAP(白介素-1受体拮抗性蛋白质)基因的病毒或质粒构建物的制备；含此构建物的转染性合胞细胞(5，858，355)和骨髓细胞(5，766，585)；及将转染细胞注入家兔关节中，但没有提到采用属于TGF-β超家族的基因来再生结缔组织。

美国专利5,846,931和5，700，774描述了注射含有属于TGF-β“超家族”的骨形态发生蛋白(BMP)的组合物，与截短的甲状旁腺素相关肽一起，发挥了维持软骨组织形成和诱生软骨组织的作用，但没提到采用BMP基因的基因治疗法。

美国专利5,842,477描述了联合植入支架性骨膜/软骨膜组织和基质细胞包括软骨细胞到软骨缺损部位。因为该专利要求所有这三种成分都存在于该植入系统中，参考文献也未公开或提出采用本发明的简单基因治疗法，是不需要植入支架性或骨膜/软骨膜组织的。

美国专利6,315,992描述了将TGF-β1转染的成纤维细胞注射到缺损的膝关节中时，哺乳动物的缺损性关节产生了透明软骨。然而，该专利未提到采用如本发明所述的生物粘附性组合物的优点。

Lee等，Human Gene Therapy，12：1085-1813，2001描述了将TGF-β1转染的成纤维细胞注射到缺损的膝关节中时，哺乳动物的缺损性关节中产生了透明软骨。然而，Lee等未提到采用如本发明所述的生物粘附性组合物。

Mrowiec等，Blood Cell，Molecules，and Diseases 21(3)：25-33，显示了一种制备改进的暗黄层(buffy coat)血小板浓缩物的新技术。然而Mrowiec等未提到该纯化的暗黄层与细胞混合用于注射，作为基因治疗的组合物。

尽管本领域已有先前这些报导，但仍然极其需要将治疗性基因产物定位输送到需要的部位。具体说，需要开发更有效和更有力的治疗方法在哺乳动物宿主中再生结缔组织。

发明概述

本发明满足了上述需求。

本发明涉及由治疗有效量的受治疗性基因转染或转导的哺乳动物一体细胞群和粘附有效中的生物粘附材料组成的组合物。该粘附材料可以是纯化的暗黄层。治疗性基因可编码细胞因子。进一步说，该细胞因子可属于TGF-β超家族。不受限制地进一步说，该细胞因子可以是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7或BMP-9。更进一步说，该基因可编码TGF-β1或BMP-2。

上述组合物中，所述细胞可以是结缔组织细胞。不受限制所述结缔细胞可以是成纤维细胞或软骨细胞。所述成纤维细胞或软骨细胞可用任何治疗性基因转染或转导，包括细胞因子基因，如编码TGF-β超家族某成员的基因。

当采用纯化的暗黄层作为生物粘附剂时，暗黄层的量与所述细胞的体识比例可约为1-5比1。此外，该比例可约为1-3比1。进一步说，该比例可约为1比1。

上述组合物中，所述细胞可经放射照射。所述细胞可与未经任何DNA转染或转导的细胞混合。这两种细胞可以彼此组织相容，此时所述细胞可衍生自同一生物来源。所述细胞也可衍生自不同生物来源。

本发明也涉及可将上述细胞贮藏在约-70℃至-196℃温度下的贮存容器。

本发明也涉及将基因表达定位于哺乳动物靶部位的方法，该方法包括：将粘附有效量的生物粘附性材料与治疗性体细胞混合形成一种组合物，并将该组合物给予需要它的部位。此方法中，所述生物粘附性材料可以是纯化的暗黄层。此方法中，所述体细胞可用含有治疗性基因的重组载体转染或转导。该治疗性基因可以是细胞因子，例如但不限于编码TGF-β超家族某成员的基因。

在上述方法中，靶部位可以是关节腔，所述基因可编码TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7或BMP-9。具体说，该基因可编码TGF-β1或BMP-2。

在上述方法中，所述细胞可经放射照射。上述方法中，所述细胞可以是受体宿主的同基因型或同种异体型。

本发明还包括上述的方法和体细胞，所述体细胞含有用编码治疗基因DNA转染或转导的第一种细胞，和未用编码治疗基因DNA转染或转导的第两种细胞的混合物。此方法中，所述细胞被保存直到移植。具体说，所述细胞保存在冰冻保存剂中直到移植。此外，所述转染或转导可通过脂质体包裹、磷酸钙钙沉淀、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导或病毒介导。

另一实施方式中，本发明涉及在哺乳动物中产生透明软骨的方法，该方法包括：a)制备含有操作性连接于一启动子的编码转化生长因子-β(TGF-β)或骨形态生成蛋白(BMP)的DNA序列的重组载体；b)用所述重组载体体外转染或转导一群成纤维细胞或软骨细胞；和c)在哺乳动物关节腔中注射一种可注射的混合细胞组合物，该组合物包含有效产生透明软骨量的：i)用编码TGF-β或BMP的基因转染或转导的一群成纤维细胞或软骨细胞；ii)粘附有效量的生物粘附性材料；和iii)其药学上可接受的运载体，编码TGF-β或BMP的DNA序列在关节腔中表达导致在该关节腔中产生透明软骨。

本发明另一实施方式中，本发明涉及在哺乳动物中产生透明软骨的方法，该方法包括：a)制备含有操作性连接于一启动子的编码转化生长因子-β(TGF-β)或骨形态生成蛋白(BMP)的DNA序列的重组载体；b)用所述重组载体体外转染或转导一群成纤维细胞或软骨细胞；和c)在哺乳动物关节腔中注射一种可注射的混合细胞组合物，该组合物包含有效产生透明软骨量的：i)用编码TGF-β或BMP的基因转染或转导的一群成纤维细胞或软骨细胞；ii)未用编码TGF-β或BMP的基因转染或转导的一群成纤维细胞或软骨细胞；iii)粘附有效量的生物粘附性材料；(iv)其药学上可接受的运载体，编码TGF-β或BMP的DNA序列在关节腔中表达导致在该关节腔中产生透明软骨。

本发明另一实施方式中，本发明涉及治疗骨关节炎的方法，该方法包括：a)制备含有操作性连接于一启动子的编码转化生长因子-β(TGF-β)或骨形态生成蛋白(BMP)的DNA序列的重组载体；b)用所述重组载体体外转染或转导一群成纤维细胞或软骨细胞；和c)在哺乳动物关节腔中注射一种可注射的混合细胞组合物，该组合物包含有效产生透明软骨量的：i)用编码TGF-β或BMP的基因转染或转导的一群成纤维细胞或软骨细胞；ii)粘附有效量的生物粘附性材料；和iii)其药学上可接受的运载体，编码TGF-β或BMP的DNA序列在关节腔中表达导致在该关节腔中产生骨和透明软骨。

本发明还有一实施方式中，本发明涉及治疗骨关节炎的方法，该方法包括：a)制备含有操作性连接于一启动子的编码转化生长因子-β(TGF-β)或骨形态生成蛋白(BMP)的DNA序列的重组载体；b)用所述重组载体体外转染或转导一群成纤维细胞或软骨细胞；和c)在哺乳动物关节腔中注射一种可注射的混合细胞组合物，该组合物包含有效产生透明软骨量的：i)用编码TGF-β或BMP的基因转染或转导的一群成纤维细胞或软骨细胞；ii)未用编码TGF-β或BMP的基因转染或转导的一群成纤维细胞或软骨细胞；iii)粘附有效量的生物粘附性材料；(iv)其药学上可接受的运载体，编码TGF-β或BMP的DNA序列在关节腔中表达导致在该关节腔中产生骨和透明软骨。

从本发明以下的描述、附属的参考附图和权利要求书中可更全面了解本发明的这些和其它内容。

附图简要说明

从以下给出的详细描述和附图可更全面了解本发明，但这些描述和附图只是为了说明而不是限制本发明。

图1A-1C显示TGF-β1mRNA(A)和BMP2(B和C)的表达。图1A中从培养在缺乏或含有锌的NIH 3T3细胞或稳定转染了pmTβ1(一种TNF-β1表达载体)的NIH 3T3细胞分离获得总RNA。用TGF-β1cDNA或作为对照的β肌动蛋白cDNA，探测总RNA(15mg)。图1B和1C显示NIJ3T3-BMP2细胞中的BMP2表达。图1B和1C显示对照NIH3T3-金属硫蛋白(B)NIH3T3-BMP2细胞(C)。图(C)中的兰色显示表达的BMP2蛋白。

图2A-2B显示再生软骨的粗略外观。图2A显示在股骨髁部上制作的方形部分软骨缺损，该膝关节中注入了未经TGF-β1转染的NIH3T3细胞。软骨缺损未被覆盖。图2B显示注射NIH3T3-TGF-β1细胞后6周，缺损已被新形成的组织覆盖。再生组织的颜色与周围软骨几乎相同。

图3A-3D显示再生软骨的显微镜观察(×200)。图3A和3B显示注射对照细胞后4和6周缺损区域的苏木精-伊红(H&E)染色分析。没有组织覆盖先前的缺损区。图3C和3D显示注射TGF-β1转染细胞后4和6周缺损区的苏木精-伊红(H&E)分析。注射后4周和6周，再生组织变得更厚，6周时其高度几乎与正常软骨相同。组织学分析，可见再生软骨(箭头)与周围透明软骨相同。

图4A-4B显示在家兔关节中TGF-β1表达的免疫组化分析×200。棕色的免疫过氧化物酶反应产物表明重组TGF-β1在NIH3T3-TGF-β1细胞中高水平表达(图4B)。图4A显示注射对照细胞兔关节中的透明软骨。

图5A-5B显示用H&E(A)染色和番红-0(Safranin-O)染色(B)的再生组织的显微镜观察(×200)。图5A显示在部分缺损区域中，H&E显现的再生软骨(黑色箭头)。图5B显示在完全裸露的软骨区域中再生的组织是纤维性胶原(白色箭头)。

图6A-6F和6A’-6F’显示用照射过的NIH3T3-TGF-β1成纤维细胞再生的软骨。

图7A-7H显示用能产生TGF-β1的人包皮成纤维细胞再生的软骨。图8A-8D显示用混合的细胞(人软骨细胞和人软骨细胞-TGF-β1细胞)注射部分缺损的家兔后再生的软骨。

图8A-8H显示在狗模型中用NIH3T3-TGF-β1细胞再生的软骨。

图9A-9C显示注射产生TGF-β1的成纤维细胞后3周用TGF-β1抗体染色再生软骨的免疫组化分析。

图19A-10E显示用产生TGF-β1的人软骨细胞再生的软骨。

图11A-11D显示部分缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-TGF-β1细胞)后再生的软骨。图11A和11C显示注射hChon(人软骨细胞)和NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(A)或单独hChon细胞(C)后6周股骨髁部的照片。图11B和11D显示注射hChon和NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(B)或单独hChon细胞(D)后股骨髁部切片的Mason三色染色。[最初放大率：(B&D)×12.5]。

图12A-12E显示全层缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-TGF-β1细胞)后再生的软骨。图12A和12D显示注射hChon和NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(A)或单独hChon细胞(D)后12周股骨髁部的照片。图12B和12E显示注射hChon和NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(B和C)或单独hChon细胞(E)后股骨髁部切片的Mason三色染色，图12C显示番红-O染色。[最初放大率：(B&D)×12.5]。

图13A-13D显示部分缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-BMP-2细胞)后再生的软骨。图13A和13C显示注射hChon和NIH3T3-BMP-2细胞混合物(A)或单独hChon细胞(C)后6周股骨髁部的照片。图13B和13D显示注射hChon和NIH3T3-BMP-2细胞混合物(B)或单独hChon细胞(D)后股骨髁部切片的Mason三色染色。[最初放大率：(B&D)×12.5]。

图14A-14E显示全层缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-BMP-2细胞)后再生的软骨。图14A和14D显示注射hChon和NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(A)或单独hChon细胞(D)后12周股骨髁部的照片。图14B和14E显示注射hChon和NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(B％C)或单独hChon细胞(E)后股骨髁部切片的Mason三色染色，图14C显示番红-O染色。[最初放大率：(B、C&D)×12.5]。

图15A-15D显示全层缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和人软骨细胞-TGF-β1细胞)后再生的软骨。图15A和15C显示注射hChon和hChon-TGF-β1细胞混合物(A)或单独hChon细胞(C)后6周股骨髁部的照片。图15B和15D显示注射hChon和hChon-TGF-β1细胞混合物(B)或单独hChon细胞(D)后股骨髁部切片的Mason三色染色。[最初放大率：(B&D)×12.5]。

图16A-16F显示部分缺损的家兔膝关节注射人暗黄层和NIH3T3-TGF-β1细胞混合物后再生的软骨。

图17A-17D显示部分(A)或全层(C)缺损家兔注射hChon和hChon-TGF-β1细胞混合物后6周股骨髁部的照片。图17B和17D显示部分(B)或全层(D)缺损家兔注射hChon和hChon-TGF-β1细胞混合物后股骨髁部切片的Mason三色染色。[最初放大率：(B&D)×12.5]。

发明详述

如本文所用，“生物粘附性”或“生物-粘附的”组合物、制剂、材料等，指能与生物组织，包括但不限于结缔组织，具体是骨和软骨粘着、结合或相互作用的天然产生的或合成的化合物。本发明所用的生物粘附剂可导致延长治疗性体细胞在接触部位的停留时间。一般将粘附性材料与体细胞混合可产生能有效粘附的混合物。

如本文所用，“生物衍生的载体分子”指天然见于哺乳动物中用作运载体的分子。其例子包括白蛋白、

最初合成的TGF-β家族蛋白是大的前体蛋白，然后在距其C-未端约110-140个氨基酸的碱性残基聚集处经历蛋白酶水解切割。该家族蛋白质的C-未端区结构上都相关，可根据它们的同源性程度将不同家族成员分为不同亚组。虽然具体亚组内氨基酸序列相同性在70％至90％，但亚组之间的同源性显著低下，通常只有20％至50％。各自情况下，活性蛋白质是C-未端片段经二硫键连接的二聚体。已研究了该家族的大多数成员，发现同质二聚体才有生物活性，但也检测到其它家族成员，如抑制素(Ung等，Nature，321：779，1986)和TGF-β类(Cheifetz等，Cell，48：409，1987)的异质二聚体，它们看来有着不同于各同质二聚体的生物学性能。

TGF-β基因超家族的成员包括：TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(鸡)、TGF-β1、TGF-β5(非洲蟾蜍)、BMP-2、BMP-4、果蝇DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蝇60A、GDF-1、非洲蟾蜍VgF、BMP-3、抑制素βA、抑制素βB、抑制素-α和MIS。这些基因在Massague，Ann.Rev.Biochem.67：753-791，1988中有描述，其内容纳入本文作参考。

优选的TGF-β基因超家族成员是TGF-β和BMP。更优选的成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。最优选的成员是人或猪的TGF-β1或BMP-2。

如本文所用，“可选择性标记”，包括能稳定维持导入的DNA的细胞所表达的，能使细胞表达改变的表型(如形态转化或酶活性)的基因产物。可任选地在同一细胞中导入能编码一可选择性标记(如具有能赋予对抗生素或其它药物抗性的酶活性的标记)的第二基因，从而可分离得到表达转染或转导基因的细胞。选择性标记的例子包括但不限于：胸苷激酶、二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶(其可赋予对氨基糖苷类抗菌素如卡那霉素、新霉素和遗传霉素的抗性)、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶、CAD(一种具有尿苷从头合成前三个酶活性：氨甲酰基磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰基酶和二氢乳清酸酶，的蛋白质)、腺苷脱氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等，Molecular Cloning，16章，1989，其内容纳入本文作参考)。应知道采用可选择性标记不是实施本发明所必需。事实上在一实施例中，未将可选择性标记掺入本发明的基因构建物中。

如本文所用，“启动子”可以是在真核细胞中具有活性和能控制转录的任何DNA序列。启动子可在真核和原核细胞之一或二者中均有活性。优选启动子在哺乳动物细胞中有活性。启动子可以组成性或可诱导性表达。优选启动子是可诱导启动子。优选启动子可受外来剌激的诱导。更优选启动子可受激素或金属的诱导。最优选该启动子是金属硫蛋白启动子或糖皮质激素可诱导的启动子。同样，可将也可控制转录的“增强子元件”插入DNA载体构建物中，利用本发明的构建物来提高感兴趣基因的表达。

如本文所用，术语“DC-chol”意为含阳离子胆固醇衍生物的阳离子脂质体。“DC-chol”分子包括三级氨基、中等长度的间隔臂(二个原子)和氨甲酰基接头键(Gao等，Biochem Biophys Res Commun.，179：280-285，1991)。

如本文所用，“SF-chol”定义为阳离子脂质体型。

如本文所用，与脂质体相关时用的术语“生物活性”，指其将功能性DNA和/或蛋白质导入靶细胞的能力。

如本文所用，用于核酸、蛋白质、蛋白质片段或其衍生物的术语“生物活性”，定义为该核酸或氨基酸序列模拟其野生型所诱导的已知生物学功能的能力。

如本文所用，术语“维持”，当用于脂质体递送时，指其将导入的DNA保持在细胞中的能力。当用于其它段落中，指其将靶向的DNA维持在靶细胞或组织中从而影响到治疗效果的能力。

生物粘附性材料

治疗性体细胞可用生物粘附性材料完全或部分包裹。所述生物粘附性材料可影响到治疗性物质的释放方式，因此混合的生物粘附性材料的量应不妨碍或不会有害地改变治疗细胞所需的释放方式。

除具有粘附性性能外，合适的生物粘附性材料应是生物相容的，即所用的量应无毒性、无致炎性、基本上无免疫原性和血液相容性。

生物粘附性材料可具有非特异性或特异性结合性能：具有非特异性结合性能的生物粘附性材料通常能通过，例如电荷相互作用，粘附治疗部位的细胞和组织的胞外基质组分。具有非特异性结合性能的生物粘附性材料的例子，包括但不限于：CARBOPOL(BF Goodrich Performance Materials Cleveland，OH)聚合物、均聚物和共聚物。CARBOPOL聚合物包括高分子量交联的丙烯酸聚合物。CARBOPOL均聚物包括丙烯酸和丙烯基蔗糖或丙烯基五赤藓醇的聚合物。CARBOPOL共聚物包括经长链(C10-C30)烷基丙烯酸酯修饰并与丙烯基五赤藓醇交联的聚合物。其它例子包括：卡巴浦尔-泊洛沙姆凝胶(Carbopol-poloxamer gel)、羟丙基甲基纤维素、氨甲酰基纤维素钠、瓜尔胶、聚乙烯吡咯烷酮、壳多糖、聚丙烯酸、羟丙基纤维素、聚丙烯酸树脂、淀粉甘醇酸酯钠、藻酸盐和它们的混合物和/或共聚物，以及与聚乙二醇的混合物、共聚物或移植构建物。

具有特异性结合性能的生物粘附性材料，在治疗部位可通过与暴露在细胞表面的分子和组织基质的特异性分子间相互作用粘附于组织。具有特异性结合性能的生物粘附性材料的例子，包括但不限于凝集素、配体和受体蛋白的抗体，如细胞粘附分子、整合素和白蛋白。

具体的生物粘附性材料取决于所用目的和体细胞的位置，具体说，需要细胞粘附治疗部位的特征。例如，在软骨或骨区域，可有效利用暗黄层作为粘附性材料，其能优先粘附于固体或半固体表面。也可考虑如果靶组织区域具有阳电荷，那么采用阴电荷聚合物分子可能有助于治疗性体细胞粘附该靶组织，反之亦然。

如需要使体细胞更特异性的定向附着于特定治疗部位，可在运载组合物中选用具有特异性结合性能的生物粘附性材料。例如，可采用仅能结合暴露于机体特定区域组织上分子的生物粘附性材料，而使体细胞定向结合于那些组织。或者，如果治疗部位是患病或受伤的组织区域，可采用能结合暴露于该患病或受伤组织区域中的分子的生物粘附性材料，使体细胞能靶向该治疗部位。

许多细胞表面成分是糖基化的，具有暴露的糖部分。凝集素是能结合糖部分的蛋白质或糖蛋白偶联物，因而凝集素可结合于糖基化的细胞表面。如果要治疗的靶部位是含糖丰富的细胞，可采用能粘附该组织的凝集素作为生物粘附性材料。凝集素的另一优点是它们通常无免疫原性。凝集素的例子包括但不限于番茄凝集素、荨麻凝集素、麦芽凝聚集素、花生凝集素、土豆凝集素和乌乐树同种凝集素。

称为粘附分子的受体蛋白也暴露在细胞表面。粘附分子通过特异性识别和结合其它细胞表面的分子而介导细胞-细胞间结合。因此，能结合特定治疗部位细胞表面暴露的粘附分子的配体或抗体，可用作该治疗部位的特异性生物粘附性材料。

一实施例中，可从那些具有非特异性结合性能的和那些具有特异性结合性能的生物粘附性材料制备生物粘附性混合物。这类混合物可通过生物粘附性材料和治疗部位组织之间的非特异性电荷相互作用及特异性分子间相互作用，促进治疗性体细胞-生物粘附性混合物对特定治疗部位的粘附。

本发明一实施例中，可将上述生物粘附性-体细胞混合物输送到需要治疗的部位，此部位通常是体内组织，包括但不限于关节腔。可用任何装置或技术，如注射，输送该生物粘附性-体细胞，只要所述成分能有效输送到靶组织或附近。

另一方面，本发明涉及采用由血纤蛋白原和凝血酶(优选人血清来源的)组成的组合物。当血纤蛋白原与凝血酶混合时，该组合物可象胶水那样起作用。另外，如果血纤蛋白原和凝血酶分离得自人血清，该组合物应无毒性。这类组合物可通过例如Greenplast^TM(Greencross，Korea)获得商品。不受任何特定加工的限制。不受制备该组合物任何具体工艺的束缚，其例子如下：

1.用无菌针筒混合血纤蛋白原粉(126-256mg)和抑蛋白酶肽(aprotinin)溶液(1.1ml)。

2.用无菌针筒混合凝血酶粉(5-11mg)和NaCl溶液(2.5ml)。

3.各溶液溶解血纤蛋白原和凝血酶后，按1∶1比例混合两种溶液，形成该组合物。

将该组合物高达至少1∶100的稀释液，与能影响软骨再生的注射或加载用细胞相混合，产生粘附性材料。

暗黄层(Butty Coat)

可将暗黄层与治疗性体细胞混合，然后将该混合物给予能从该治疗性体细胞表达的治疗性基因产物中获益的机体部位。暗黄层具有粘附固体物质，如骨和软骨，以及半固体物质如肌肉和其它组织的物理性能，可用于提供一类暂时性“胶水”将治疗性体细胞保留在给药部位，以实现治疗性基因产物的定位输送。

本发明一具体实施例中，可将暗黄层与结缔组织细胞混合注入关节腔中，从而治疗基因，如细胞因子基因的表达可导致该基因产物的长期有效输送，使软骨或骨再生。此法对治疗骨关节炎有效。

暗黄层是血液样品离心时离心管中的中间一层。上层是血浆，底层含红细胞，而暗黄层含白细胞和血小板。有各种方法可纯化暗黄层的各成分。按本发明，从血液样品中提取此层，与用于体细胞治疗方案的细胞混合。不受任何作用机制理论的限制，相信将纯化的暗黄层与细胞混合给予哺乳动物宿主，将导致在给药部位更有效地表达所述基因，因为暗黄层有助于细胞结合于、固定于或保留于哺乳动物宿主中的生理结构中，如骨或软骨中，致使这些细胞表达。

关于可将多少纯化暗黄层加入细胞中再将该组合物给予哺乳动物宿主没有限制，只要给予的量能有效地实质上提高治疗效果。一实施方式中，所述细胞是软骨产生相关细胞，加入细胞中的暗黄层量应能有效产生软骨。因而暗黄层与细胞的比例可以是该可注射组合物体积百分比的大约1-5比1。通常此范围可以是约1-3比1。具体说，暗黄层与侍注射细胞的比例范围是约1比1。

不受暗黄层制备方法的限制，一种方法是，暗黄层可通过在狭窄试管中离心抗凝血，小心去除尽可能多的血浆不要搅乱暗黄层而制得。将缓冲液配制的2％戊二醛非常轻地叠加在顶部，静置试管在冰箱中几小时。这导致暗黄层埋在固态血浆中，可在细木杆或类似物的帮助下从试管中取出。然后修剪得到的园盘状物，加工成可用于正常组织的树脂状。然后用剃须刀上下修剪暗黄层块(在一片Parafilm膜上)细管，制成两头开口的短棒。然后用一纸夹或涂抹器杆(取决于管子的直径)推出包裹的暗黄层块。有时用1％融化的琼脂将其保持在一起，然后加工凝块。暗黄层的组成尚未很好分析，但本发明的暗黄层含离心血样品的中间层。

基因治疗

可将本发明的生物粘附性材料与能给予哺乳动物宿主作体细胞基因治疗的任何细胞混合。具体说，该暗黄层可与结缔组织细胞，具体是软骨形成细胞，如成纤维细胞和软骨细胞一起使用。可将本发明的生物粘附性材料与已用或未用编码细胞因子基因转染或转导的工程改造细胞的混合物相混合。

本文中，采用暗黄层与细胞因子生成细胞一起治疗软骨缺损，该种组合比单用细胞更能粘附于缺损部位。因此暗黄层提供了定位给予细胞-暗黄层组合物和缺损部位之间的更大自主性。

细胞-暗黄层组合物在动物试验中还提供了再生软骨更高的成功率。另外，新产生的软骨质量大大优于单独注射细胞时。换言之，当采用该细胞-暗黄层组合物时，产生的正常软骨更多。因而该细胞-暗黄层组合物观察到的纤维状软骨量低于单用细胞的。

本发明公开了递送感兴趣的DNA序列给哺乳动物宿主结缔组织细胞的活体外和体内技术。活体外技术包括培养靶结缔组织细胞、体外转染或转导该DNA序列、将DNA载体或其它感兴趣的递送载体导入结缔组织细胞中，然后将该修饰的结缔组织细胞植入哺乳动物宿主的靶关节中，在体内表达该感兴趣基因的产物而发挥作用。

应知道，虽然在本发明的基因治疗方案中可一起植入支架或框架及各种外来组织等物质，但也可在本发明的注射系统中不包括这类支架或组织。在细胞介导的基因疗法或体细胞疗法的优选实施例中，本发明涉及一种将转染或转导的结缔组织细胞群注射到关节腔的简单方法，可使外源性TGF超家族蛋白质在该关节腔中表达。

通过本说明书公开的一种治疗结缔组织疾病的活体外方法，包括先产生含有编码蛋白质或其生物活性片段的DNA序列的重组病毒或质粒载体。然后用此重组载体感染或转染体外培养的结缔组织细胞群，导致该结缔组织细胞群含该载体。然后将这些结缔组织细胞与暗黄层一起植入哺乳动物宿主的靶关节腔，可注入转染和转导细胞的混合物，或分别注入关节腔内使各类细胞混合，然后在该关节腔内表达此蛋白质或蛋白质片段而发挥作用。可利用此感兴趣DNA序列的表达来实质性减轻该结缔组织疾病相关的至少一种有害的关节病变。

本领域普通技术人员知道用于治疗病人的细胞来源可以是病人自身的结缔组织细胞，如自身的成纤维细胞或软骨细胞，但也可采用同种异体细胞或异种细胞而不论该细胞的组织相容性。

更具体说，此方法包括采用编码转化生长因子TGF-β超家族某成员，或其生物活性衍生物或片段和一可选择标记的基因，或其生物活性衍生物或片段的基因。

本发明的另一实施例包括采用编码转化生长因子TGF-β超家族至少一个成员，或其生物活性衍生物或片段的基因，和采用的DNA质粒载体是本领域普通技术人员知道的能稳定维持在递送的靶细胞中或组织中而不论所用的递送方法的任何DNA质粒载体。

本发明的另一实施例提供在至少一种结缔组织细胞中导入至少一种用于治疗哺乳动物宿主的产物编码基因的方法。此方法包括采用非病毒方式将编码该产物的基因导入结缔组织细胞中。更具体说，此方法包括脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电穿孔和DEAE-葡聚糖介导，包括采用编码转化生长因子TGF-β超家族某成员，或其生物活性衍生物或片段和一可选择标记的基因，或其生物活性衍生物或片段的基因。

本发明的另一实施例提供在至少一种结缔组织细胞中导入至少一种用于治疗哺乳动物宿主的产物编码基因的另一种方法。此另一种方法包括采用病毒作为生物工具将DNA载体分子递送给靶组织或细胞。优选的病毒是假病毒，其基因组已被改变，因而此假病毒只能递送并在靶细胞中稳定维持，但在该靶细胞或组织中不能保留其复制的能力。通过重组DNA技术进一步操纵此改变的病毒基因组，使该病毒基因组成为含有要在靶细胞或组织中表达感兴趣异源基因的DNA载体分子。

本发明的一优选实施例是通过采用逆转录病毒和本说明书中公开的活体外技术，将TGF-β或BMP基因递送给哺乳动物宿主结缔组织从而将TGF-β或BMP递送给靶关节腔的方法。换句话说，将编码功能性TGF-β或BMP蛋白或蛋白片段的DNA序列亚克隆到所选的逆转录病毒载体中。培养该重组病毒载体至足够滴度用来体外感染培养的结缔组织细胞。将被转导的结缔组织细胞，优选自身移植细胞，与暗黄层混合，与任选的非转染的结缔组织细胞样品，如软骨细胞为优选，通过关节腔内注射，一起植入感兴趣的关节中。

在一优选实施例中，体外培养成纤维细胞，随后利用基因疗法的递送系统。显然本申请人不限于采用本文公开的特定结缔组织，也可采用体外培养技术来源的其它组织。可采用本发明的基因方法来预防和治疗骨关节炎。显然本发明人也不限于仅对膝关节治疗的预防性和治疗性应用。可预防性或治疗性利用本发明来处理任何易感关节的关节炎。

本发明的另一实施例中，向病人提供治疗有效量的胃肠道外给药的化合物，其含有编码TGF-β超家族蛋白质的基因和适当的药物运载体。

本发明的另一实施例向病人提供预防有效量的胃肠道外给药的化合物，其含有编码TGF-β超家族蛋白质的基因和适当的药物运载体

本发明的另一实施例中，在注射入关节腔前保存所述细胞。转染或转导的细胞可单独贮藏，或任选地，未转染的辅助细胞也可单独贮藏，或可贮藏混合的细胞但不需同时贮藏。此外，不需要贮藏相同的时间。可任选在注射前混合分别贮藏的细胞。或者细胞可分别贮藏和分别注射，在关节腔中形成细胞混合物。本领域技术人员知道，这些细胞可冻存在约10％的DMSO中置于液氮中。另一实施例中，可将暗黄层包含在贮存组合物中。

本发明的另一实施例包括将编码某产物的至少一个基因导入哺乳动物宿主至少一种结缔组织中的方法，用于治疗上述的哺乳动物宿主，该方法包括体内直接导入哺乳动物宿主含该产物编码基因的病毒载体来感染细胞。优选该方法包括经关节内注射直接导入哺乳动物宿主中而起作用。该方法包括采用能基本上防止极易发生关节炎的哺乳动物宿主产生关节炎的方法。该方法还包括采用治疗患关节炎哺乳动物宿主的方法。另外，该方法还包括采用修复和再生上述结缔组织的方法。

本领域技术人员知道采用脂质体的病毒载体，不受逆转录病毒感染并整合结缔组织细胞所需细胞分裂的限制。此法采用上述非病毒法，包括采用编码TGF-β超家族某成员的基因和任选含有一可选择性标记的基因，如抗菌素抗性基因。还知道可选择性标记基因不是实施本发明所必须。

本发明的另一实施例是通过本说明书公开的方法，将编码TGF-β超家族某成员的DNA序列递送给哺乳动物宿主的结缔组织，而在体内表达胶元再生结缔组织，如软骨。

结缔组织是难以靶向治疗的器官。本领域已知的静脉内和口服途径给药很难到达这些结缔组织，具有使哺乳动物机体全身接触该治疗药物的缺点。更具体说，已知的关节内注射可使蛋白质直接进入关节。然而，以包裹蛋白质形式注入的大多数药物关节内的半衰期短。本发明通过在哺乳动物宿主的结缔组织中导入可用于治疗哺乳动物宿主的蛋白质的编码基因解决了此问题。更具体说，本发明提供了向哺乳动物宿主结缔组织导入具有抗关节炎性能的蛋白质编码基因的方法。

在本文提供的实施例中，各种细胞因子产生细胞，如成纤维细胞和软骨细胞及各种类型细胞的混合物剌激了关节中胶元的合成。含有暗黄层的组合物也显示能剌激胶元合成。这些实施例中，关节中通常注射浓度约10⁶细胞/ml的细胞。注射后2-12周收集标本。细胞能在关节中自游活动，活动到对这些细胞的特殊亲和力的区域。滑膜、间充质和软骨缺损区可能是细胞粘附的部位。注射后2-12周，在部分或完全受损软骨的缺损区域均观察到再生的组织。这种对受损区域的特殊亲和力是临床应用混合细胞的另一优点。如果退化性关节炎可通过在关节中注射细胞而治愈，无须各种物理器材如支架或任何其它三维结构，那么病人无须大手术即可方便地治愈。

无论其作用机制如何，也不受作用机制任何具体理论的束缚，采用本发明含有细胞因子产生细胞、混合的细胞组合物和暗黄层的组合物后，发现了透明软骨，表明长期维持TGF-β或BMP高浓度可剌激透明软骨再生。通过组织学方法测定了新形成组织的性能。通过H&E染色、Mason的三色染色和番红-O，表明新形成的组织与周围的透明软骨相同(图3-7)。

给予以下实施例是为了阐明本发明，而不是限制本发明。

实施例

实施例1-材料和方法

质粒构建

为产生金属硫蛋白表达构建物(pM)，通过基因组DNA的聚合酶链扩增反应产生了金属硫蛋白I启动子(-660/+63)，在用于扩增的寡核苷酸中构建了Xba I和Bam HI限制性位点。将扩增片段亚克隆到pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)的Xba

I-Bam HI位点中。将含有TGF-β1编码序列和生长激素聚A位点的1.2-kb Bgl II片段亚克隆到pM的Bam HI-SalI位点，产生质粒pmT β1。将含有BMP2编码序列的1.2-kb Sal I-Not I片段亚克隆到pMTMLV的Sal I-Not I位点中，产生质粒pMTBMP2。pMTMLV载体衍生自缺失了gag和env序列以及一些ψ包装序列的逆转录病毒载体MFG。

细胞培养和转染-将TGF-β1cDNA转染到成纤维细胞(NIH3T3-TGF-β1)、人包皮成纤维细胞(人包皮-TGF-β1)和软骨细胞(hChon-TGF-β1)中。在含10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(GIBCO-BRL，Rockville，MD)中培养它们。将TGF-β1cDNA序列加入到含金属硫蛋白基因启动子的pm T β1载体中。还在该载体中插入新霉素抗性基因序列。

用磷酸钙法将此载体插入细胞。选择含转染了基因序列的细胞，在培养液中加入新霉素(300mg/ml)。然后挑出存活菌落，用Northen分析和TGF-β1ELISA试验(R$D系统)验证TGF-β1mRNA的表达。将表达TGF-β1的细胞贮藏在液氮中，培养直到到注射。

Northen印迹分析-用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿分离得到细胞的总RNA。在含0.66M甲醛的1％琼脂糖凝胶中电泳10mgRNA，转移到DURALON-UV膜上，与UV STATALINKER(STRATAGENE)交联。在含1％牛血清白蛋白、7％(w/v)SDS、0.5M磷酸钠和1mM EDTA的溶液中65℃预杂交和杂交该印迹物。50℃用0.1％SDS、1×SSC洗涤杂交印迹物20分钟然后暴光此膜。使RNA印迹物与³²P-标记的检测人TGF-β1的cDNA探针杂交。用β肌动蛋白的探针控制样品加载。

给家兔注射细胞-选择重2.0-2.5公斤的新西兰白兔作为动物模型。用开他敏和roumpun麻醉后，以无菌方法固定每只家兔。暴露膝关节，用手术刀制作部分和完全软骨缺损。小心地在透明软骨层上制作部分缺损而不暴露软骨下骨。或去除所有透明软骨暴露软骨下骨制作完全缺损。闭合手术创口后，关节内注射10⁶细胞/ml浓度的细胞，在测定携带TGF-β1的细胞时饮水中加入硫酸锌。

组织学检查-收获膝关节后，福尔马林固定标本，用硝酸脱钙。将标本包埋在石蜡块中，切成0.8mm厚的切片。用苏木精-伊红、番红-O和Mason多种颜色染色，显微镜观察再生的组织。

暗黄层的制备-离心抗凝血后，尽可能多地小心去除血浆。不搅乱底层而取出暗黄层到一洁净的试管中，用1×PBS洗3-4次。

实施例II-实验方法和结果

稳定的细胞系-用磷酸钙共沉淀法进行转染(图1A-1C)。大约80％存活的集落表达该转基因mRNA。在硫酸锌溶液中培养这些选出的TGF-β1产生细胞。当细胞培养在100mM硫酸锌溶液中时，它们产生了mRNA。TGF-β分泌率约32ng/10⁶细胞/24小时。

为测定和验证经含有BMP2cDNA的逆转录病毒载体感染的NIH3T3成纤维细胞所产生的生物活性BMP2蛋白质，用对照NIH3T3-金属硫蛋白(图1B)和NIH3T3-BMP2细胞(图1C)进行了碱性磷酸酶(ALP)试验。图1C中的兰色显示表达的BMP2蛋白。

在6孔组织培养板中培养1.5×10⁶NIH3T3细胞过夜。将0.5×10⁶指示细胞(MC3T3E1)置于组织培养插片中培养过夜。吸去培养插片上的培养液，将插片转移到6孔板中培养48-72小时。吸去培养插片的培养液。加入5ml的1×磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。每张插片加入4ml 3.7％甲醛/1×PBS液，4℃固定细胞20分钟。用1×PBS洗细胞2次。每张培养插片中加入3ml ALP染色液，室温黑暗中培育20分钟至1小时，显现兰色。ALP染色液是用0.1M Tris-HCl，pH8.5液配的0.1mg/ml萘酚AS-MX磷酸(Sigma N5000)、0.5％，N-二甲基甲酰胺(Sigma D8654)、2mMMgCl₂、0.3mg/ml FastBlue BB盐(Sigma F3378)。

家兔关节软骨缺损的再生-制作部分和完全软骨缺损后，在膝关节中注入0.3ml的10⁶细胞/ml的NIH3T3-TGF-β1细胞。注射后2-6周检查关节。在部分损伤的软骨中可见新形成的透明软骨；注射2周后出现透明软骨，注射6周后软骨缺损区被透明软骨覆盖(图2)。随时间推移再生软骨的厚度增厚(图3)。注入细胞分泌的TGF-β1可用TGF-β1抗体免疫组化染色观察到(图3)。注射未用TGF-β1转染的正常成纤维细胞的对侧无透明软骨覆盖。在部分缺损区域再生的透明软骨番红-O染色为红色(图4)。新形成的软骨厚度几孚与缺损相同。此发现提示注射的细胞通过旁分泌作用方式激活了周围的正常软骨细胞。

当只采用NIH3T3-TGF-β1的细胞时，完全缺损的软骨中再生的组织不是透明软骨而是纤维性胶元。它们在番红-O染色中的颜色是白色而不是透明软骨的红色(图5)。被纤维性组织覆盖的软骨意味着这些细胞只能被自分泌方式所激活。可被TGF-β1激活的周围骨细胞看来因存在厚的钙化骨基质而阻断了TGF-β1的激活作用。因为此屏障的阻挡，注入的细胞已不能剌激骨细胞。

实施例III

用6000rad照射对照NIH3T3或NIH3T3-TGF-β1细胞(5-7×10⁵)，再将其注射入兔膝关节中。这些照射过的细胞在组织培养皿中3周内全部死亡。注射程序与未处理细胞的先前方案相同。注射后3或6周收获膝关节。用福尔马林固定硝酸脱钙。制作标本切片石蜡包埋，然后切成0.5mm厚切片。图6中在切片上进行番红-O(A-D&A’-D’)和苏木精-伊红染色(E-F&E’-F’)，显微镜观察到再生的软骨组织(最初放大率：(A、B、A’和B)×12.5；(C-F他C’-F’)×400)。

实施例IV

将对照人包皮成纤维细胞(hFSF)或hFSF-TGF-β1细胞注入含部分软骨缺损的兔膝关节(3mm×5mm，1.5mm深)股骨髁部处。按上述方案将这些细胞(0.5ml，2×10⁶细胞/ml)注入，或将相同浓度的20-25ml细胞加到缺损顶部。后一情况下，让细胞留在缺损处15-20分钟使其沉降到缺损底部然后缝合。注射后6周收取标本显微镜观察。图7A和B显示注射hFSF(A)或hFSF-TGF-β1细胞(B)后6周股骨髁部的照片。C、E和G显示注射hFSF-TGF-β1细胞股骨髁部切片的番红-O染色(D和F)和H&E染色(H)。(最初放大率：(C和D)×12.5；(E-H)×400)。

实施例V

将对照NIH3T3或NIH3T3-TGF-β1细胞注射入部分软骨缺损(6mm×6mm，2mm深)的狗膝关节股骨髁部处。按上述方案注射细胞(4ml，2×10⁶细胞/ml)，或将相同浓度的30-35ml细胞加载到缺损顶部。后一情况下，让细胞留在缺损处15-20分钟使其沉降到缺损底部然后缝合。两种情况下获得了相同水平的软骨再生。注射后6周收取标本显微镜观察。图8A和B显示注射NIH3T3细胞(A)或NIH3T3-TGF-β1细胞(B)后6周股骨髁部的照片。C、E和G显示注射对照NIH3T3细胞股骨髁部切片的番红-O染色(C和E)和H&E染色(G)。D、F和H显示注射NIH3T3-TGF-β1细胞股骨髁部切片的番红-O染色(D和F)和H&E染色(H)。(最初放大率：(C和D)×12.5；(E-H)×400)。

实施例VI

为研究再生软骨组织中TGF-β1蛋白的表达，用TGF-β1抗体进行了注射3周后修复组织的免疫组化染色。结果显示TGF-β1蛋白只高水平表达在再生的软骨细胞中，许多细胞看来是新形成的软骨细胞(图9A和B)。只用第二抗体检测同一组织的切片中未见染色(图9C)(最初放大率：A×12.5；(B-C)×40)。

收集兔膝关节，福尔马林固定硝酸脱钙。制作标本切片石蜡包埋然后切成0.8mm厚切片。将切片相继用二甲苯和乙醇培育脱蜡和脱水。1×PBS洗涤2分钟后用3％双氧水封闭19分钟。切片加入抗TGF-β1蛋白第一抗体培育1小时。此步对照切片用1×PBS培育不加第一抗体。洗涤切片用5％牛奶1×PBS封闭20分钟，然后与HRP-偶联的第二抗体一起培育。显色反应用含0.05％二氨基联苯胺(DAB)1×PBS进行5分钟。然后用苏木精染色并固定。

此研究中的免疫组化染色资料和狗模型研究资料提示，透明软骨再生的分子机制可能与此前采用的细胞治疗法有关。注入膝关节的成纤维细胞可能有一些通过未知途径分化成为软骨细胞，类似于此过程的“逆向分化”过程。此途径可能由体内注入的成纤维细胞分泌的TGF-β1所引起，其导致此途径中居留的软骨细胞和成纤维细胞，如通过TGF-β1作用的旁分泌或自分泌方式释放各种因子。

实施例VII

将hFSF-TGF-β1或对照hFSF细胞注射入部分软骨缺损(3mm×5mm，1.5mm深)家兔的膝关节股骨髁部处。将细胞(15-20微升，2×10⁶细胞/ml)加载在缺损处。让细胞留在缺损处15-20分钟使其沉降到缺损底部然后缝合。注射后6周收取标本显微镜观察。图10A和D显示注射hFSF-TGF-β1细胞(A)或对照hFSF细胞(D)后6周股骨髁部的照片。图10B、C和E显示注射hFSF-TGF-β1细胞(B和C)或对照hChon细胞(E)股骨髁部切片的Mason三色(B和E)染色和番红-O染色(C)。(最初放大率：(B、C和、E)×12.5)。

实施例VIII

家兔关节软骨缺损的再生-选择重2.0-2.5公斤的新西兰白兔作为动物模型。这些家兔已成熟具有商标。暴露膝关节，用手术刀在股骨髁部的透明软骨层上制作部分(3mm×6mm，1-2mm深)或全层(3mm×6mm，2-3mm深)缺损。将对照人软骨细胞(hChon)、或hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞的混合物、或NIH3T3-BMP-2细胞注射入家兔的缺损膝关节。将这些细胞(15-20微升，2×10⁶细胞/ml)加载在缺损顶部，使细胞留在缺损处15-20分钟使其渗入伤口然后缝合。在采用hChon和NIH3T3-BMP-2细胞的混合物实验中，制作缺损后3周将这些细胞注入缺损处。注入细胞后6或12周收集股骨髁进行检查。

实施例IX

部分缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-TGF-β1细胞)的软骨再生-将对照hChon或hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞的混合物注射入家兔部分软骨缺损(3mm×5mm，1-2mm深)膝关节的股骨髁部。将细胞混合物(15-20微升，2×10⁶细胞/ml，hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞为10比1)加载在缺损处，留在缺损处15-20分钟使细胞渗入伤口然后缝合。注射后6周收取标本显微镜观察。图11A和C显示注射hChonGN NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(A)或单独hChon细胞(C)后6周股骨髁部的照片。图11B和D显示注射hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(B)或单独hChon(D)的股骨髁部切片的Mason三色染色。(最初放大率：(B和D)×12.5)。          

实施例X

全层缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-TGF-β1细胞)的软骨再生-将对照hChon或hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞的混合物注射入家兔全层软骨缺损(3mm×5mm，2-3mm深)膝关节的股骨髁部。将细胞混合物(20-25微升，2×10⁶细胞/ml，hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞为10比1)加载在缺损顶部，留在缺损处15-20分钟使细胞渗入伤口然后缝合。注射后12周收取标本显微镜观察。图12A和D显示注射hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(A)或单独hChon细胞(D)后12周股骨髁部的照片。图12B、C和E显示注射hChon与NIH3T3-TGF-β1细胞混合物(B和C)或单独hChon(E)的股骨髁部切片的Mason三色染色(B和E)和番红-O染色(C)。(最初放大率：(B、C和E)×12.5)。

实施例XI

部分缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-BMP-2细胞)的软骨再生-将对照hChon或hChon与NIH3T3-BMP-2细胞的混合物注射入家兔部分软骨缺损(3mm×5mm，1-2mm深)膝关节的股骨髁部。将细胞混合物(15-20微升，2×10⁶细胞/ml，hChon与NIH3T3-BMP-2细胞为10比1)加载在缺损顶部，留在缺损处15-20分钟使细胞渗入伤口然后缝合。注射后6周收取标本显微镜观察。图13A和C显示注射hChon与NIH3T3-BMP-2细胞混合物(A)或单独hChon细胞(C)后6周股骨髁部的照片。图13B和D显示注射hChon与NIH3T3-BMP-2细胞混合物(B)或单独hChon细胞(D)的股骨髁部切片的Mason三色染色。(最初放大率：(B和D)×12.5)。

实施例XII

全层缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和NIH3T3-BMP-2细胞)的软骨再生

将对照hChon或hChon与NIH3T3-BMP-2细胞的混合物注射入家兔全层软骨缺损(3mm×5mm，2-3mm深)膝关节的股骨髁部。此例在制作缺损后3周注射细胞。将细胞混合物(20-25微升，2×10⁶细胞/ml，hChon与NIH3T3-BMP-2细胞为10比1)加载在缺损顶部，留在缺损处15-20分钟使细胞渗入伤口然后缝合。注射后6周收取标本显微镜观察。图14A和D显示注射hChon与NIH3T3-BMP-2细胞混合物(A)或单独hChon细胞(D)后12周股骨髁部的照片。图14B、C和E显示注射hChon与NIH3T3-BMP-2细胞混合物(B和C)或单独hChon细胞(E)的股骨髁部切片的Mason三色染色(B和E)及番红-0染色(C)。(最初放大率：(B、C和E)×12.5)。

实施例XIII

全层缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和人软骨细胞-TGF-β1细胞)的软骨再生-将对照人软骨细胞(hChon)或hChon与hChon-TGF-β1细胞的混合物注射入家兔全层软骨缺损(3mm×5mm，2-3mm深)膝关节的股骨髁部。将细胞混合物(20-25微升，2×10⁶细胞/ml，hChon与hChon-TGF-β1为10比1)加载在缺损顶部，留在缺损处15-20分钟使细胞渗入伤口然后缝合。注射后6周收取标本显微镜观察。图15A和15C显示注射hChon与hChon-TGF-β1细胞混合物(A)或单独hChon细胞(C)后6周股骨髁部的照片。图15B和15D显示注射hChon与hChon-TGF-β1细胞混合物(B)或单独hChon细胞(D)的股骨髁部切片的Mason三色染色。(最初放大率：(B和D)×12.5)。

实施例XIV

部分软骨缺损家兔注射兔暗黄层和NIH3T3-TGF-β1细胞的软骨再生-选择重2.0-2.5公斤的新西兰白兔作为动物模型。这些家兔已成熟具有商标。暴露膝关节，用手术刀在股骨髁部的透明软骨层上制作部分(3mm×6mm，1-2mm深)缺损。将对照兔暗黄层(rBC)、或兔暗黄层与TGF-β1产生细胞(NIH3T3-TGF-β1，15-20微升，2×10⁶细胞/ml)的混合物加载在缺损处，使细胞留在缺损处15-20分钟使混合物渗入伤口然后缝合。注入细胞后6或8周收集股骨髁。

加载后6或8周周收集标本进行组织学检查。图16A、C和E显示加载rBC与NIH3T3-TGF-β1细胞的混合物(A和C)或单独暗黄层(E)后6或8周股骨髁部的照片。图16B、D和F显示加载rBC与NIH3T3-TGF-β1细胞的混合物(B和D)或单独rBC(F)股骨髁部切片的Mason三色染色。(最初放大率：(B、D和F)×12.5)。

注射兔暗黄层与NIH3T3-TGF-β1细胞混合物的家兔在注射后6或8周获得了再生的透明软骨。相反，只注射暗黄层的家兔在注射后8周未见显著的透明软骨再生。

实施例XV

部分或全层缺损家兔注射混合细胞(人软骨细胞和人软骨细胞-TGF-β1细胞)及Greenplast(GP)的软骨再生-将hChon与hChon-TGF-β1细胞混合物注入家兔部分或全层软骨缺损(3mm×5mm，1-2mm深，或2-3mm深)的膝关节股骨髁部。将细胞混合物(10-15微升或20-25微升，2×10⁶细胞/ml，hChon与hChon-TGF-β1细胞比例为1比1，及1∶100稀释的GP)加载到缺损顶部，留在缺损处15-20分钟使细胞渗入伤口然后缝合。注射后6周收取标本显微镜观察。图17A和17C显示在部分缺损(A)或全层缺损(C)处注射hChon与hChon-TGF-β1细胞细胞混合物(A)后6周股骨髁部的照片。图17B和17D显示在部分(B)或全层(D)缺损处注射hChon与hChon-TGF-β1细胞合物的股骨髁部切片的Mason三色染色。(最初放大率：(B和D)×12.5)。

所有引用的参考文献其内容纳入本文作参考。

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本发明上述具体实施例目的是阐明本发明，本领域技术人员明白可对本发明的细节作多种修改但不脱离本发明权利要求所确定的范围。

Claims (19)

1.一种组合物，其特征在于，该组合物含有治疗有效量的经某治疗基因转染或转导的成纤维细胞群或软骨细胞群和粘附有效量的纯化的暗黄层，可给予哺乳动物中需要其的部位，其中所述治疗基因是TGF-β1或BMP-2。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述暗黄层的量与细胞的比例为1-5比1。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述比例为1-3比1。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述比例为1比1。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细胞与未经任何DNA转染或转导的细胞相混合。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细胞是彼此组织相容的。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述细胞衍生自同一来源的生物。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述细胞衍生自不同来源的生物。

9.一种可在约-70℃至-196℃的温度下贮存细胞的贮存容器，其特征在于，该容器包含权利要求1所述的组合物。

10.一种组合物在制备用于将基因表达定位于哺乳动物靶部位的物质中的应用，所述组合物包含粘附有效量的纯化的暗黄层与治疗性体细胞，所述体细胞是成纤维细胞或软骨细胞，所述细胞已用含有治疗基因的重组载体转染或转导，所述治疗基因是TGF-β1或BMP-2。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述靶部位是关节腔。

12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述细胞与宿主受体是同基因型。

13.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述细胞与宿主受体是同种异体型。

14.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述体细胞含有用编码治疗基因的DNA转染或转导的第一种细胞和未用编码治疗基因的DNA转染或转导的第二种细胞组成的混合物。

15.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述细胞在移植前被保存。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述细胞在移植前被冷冻保存。

17.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述转染或转导通过脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导或病毒介导来实现。

18.一种组合物在制备用于在哺乳动物关节腔中表达DNA序列并在关节腔中产生透明软骨的药物中的应用，所述组合物包含产生透明软骨有效量的：(i)成纤维细胞或软骨细胞群，所述细胞群经重组载体体外转染或转导，所述重组载体包含操作性连接于一启动子的编码TGF-β1或BMP-2的DNA序列；ii)粘附有效量的纯化的暗黄层；和iii)其药学上可接受的运载体。

19.一种组合物在制备用于在哺乳动物关节腔中表达DNA序列并在关节腔中产生透明软骨的药物中的应用，所述组合物包含产生透明软骨有效量的：(i)成纤维细胞或软骨细胞群，所述细胞群经重组载体体外转染或转导，所述重组载体包含操作性连接于一启动子的编码TGF-β1或BMP-2的DNA序列；ii)未用编码TGF-β或BMP的基因转染或转导的一群成纤维细胞或软骨细胞；iii)粘附有效量的纯化的暗黄层；和iv)其药学上可接受的运载体。

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