CN1659288A - 利用寡核苷酸抑制细胞生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了治疗过度增殖性疾病，包括癌症的方法，它包括将有效量的含有pTT或组合物或一种含有一种或多种与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于受影响的哺乳动物(例如人)。本发明也公开了用于治疗或预防过度增殖性疾病或受癌前状态影响的上皮细胞，诸如牛皮癣、特应性皮炎或其它上皮的过度增殖性疾病的方法，以及减少光衰老或氧化性应激或用于预防或减少皮肤癌发展的可能性的方法。

Description

利用寡核苷酸抑制细胞生长的方法
相关申请
本申请是2002年4月12日提交的申请号10/122,630的部分继续，申请号10/122,630是2001年3月30日提交的国际申请号PCT/US01/10162的部分继续，其指定美国且公开语言为英语，国际申请号PCT/US01/10162是1998年3月26日提交的申请号09/048,927(现在为专利U.S.专利号6,146,056)的部分继续，申请号09/048,927是1996年6月3日提交的国际申请号PCT/US96/08386的美国国家阶段的部分继续，PCT/US96/08386公开语言为英语且指定了美国申请号08/952,697，所述的申请号08/952,697现在已被放弃，其是1995年6月6日申请的号08/467,012，现在为美国专利号5,955,059的部分继续。上述申请的全部教导在此处引入作为参考。
发明背景
哺乳动物细胞对DNA损伤以及复制型衰老的严谨调节程序具有复杂的反应，所有这些表明是对癌的基本防卫[Campisi，J.(1996).Cell84，497-500]。在哺乳动物中，端粒的严重缩短加速了细胞的衰老[Greider，C.W.(1996)Annu Rev Biochem 65，337-365]且随每一轮的DNA复制变得更短，其中端粒为覆盖染色体末端的DNA序列TTAGGG的串联重复。在生殖系细胞和大多数的癌细胞中，无限增殖与通过端粒酶维持端粒的长度相关联，所述端粒酶是一种由于染色体末端的3′末端而增加了TTAGGG重复序列的酶复合体[Feng，J.，等，Science269，1236-1241；Harrington，L.，等，(1997)Science 275，973-977；Nakamura，T.M.，等，(1997)Science 277，955-957]。端粒酶的催化亚基通常在正常体细胞中不表达[Greider，C.W.(1996)Annu RevBiochent 65，337-365]，并且在多轮细胞分裂之后，严重缩短的端粒通过细胞程序性死亡来引发复制型的衰老或死亡，这主要取决于细胞类型[de Lange，T.(1998)Science 279，334-335]，然而具体的机理尚未知。人们对通过端粒参与DNA损伤应答的机制目前仍知之甚少。
如同人口老化一样，在发达世界中人患癌症的频率增加了。在长期明显暴露于日光下的老年群体中，患黑色素瘤及其它的皮肤癌大为增加了。尽管进行了广泛的研究，但一些类型的癌症和诊断时的疾病阶段在最近几年的发病率和死亡率并没有显著地改善。
目前往往用高度毒性的治疗方法来治疗癌症。因此，那些能利用细胞修复环境损害的天然机理的治疗方法是人们所需求的。
发明概述
本发明的一个实施方案是治疗人的过度增生性疾病的方法，该方法包括将有效量的含有一种或多种寡核苷酸的组合物给药于人，其中寡核苷酸与人端粒突出端重复序列有至少50％的核苷酸序列同一性。在这里，所述的“寡核苷酸与端粒突出端重复序列同源”，是指寡核苷酸与人端粒突出端重复序列具有至少50％的核苷酸序列同一性。在此方法中，寡核苷酸可以为至少2个核苷酸长，例如2-200个核苷酸长，或至少3个核苷酸长，例如，3-20个寡核苷酸长，并且优选地可以是2-20个核苷酸长，且更优选地为5-11个核苷酸长。具有5′磷酸的寡核苷酸是优选的。其中5′磷酸是寡核苷酸的一部分，当表示序列时，其在5′到3′核苷酸序列前面用“p”表示。治疗过度增生性疾病的优选寡核苷酸为pTT、pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)、pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)、pGGGTTAGGTT(SEQ ID NO：13)以及pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)。本发明的方法可用于哺乳动物，但在更特定的实施方案中被用于人。
上述方法的一部分是一种用于抑制人癌细胞生长的方法，该方法包括将有效量的含有一种或多种寡核苷酸的组合物给药于人，其中的寡核苷酸与人端粒突出端重复序列有至少50％的核苷酸序列同一性。癌细胞可以来源于任意的细胞类型，但在特定的实施方案中来自淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、白血病或恶性肿瘤的细胞。
本发明的另一部分是促进哺乳动物中恶性细胞分化的方法，该方法包括向哺乳动物给药有效量的含有一种或多种寡核苷酸的组合物，其中的寡核苷酸与(TTAGGG)n具有至少50％的核苷酸序列同一性。
另一种用于治疗恶性肿瘤的方法为增强指示人体中癌细胞分化的一种或多种表面抗原的表达的方法，该方法包括将有效量的与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸给药于人。此方法中的细胞可以是，例如，黑色素瘤细胞，并且抗原可以是，例如MART-1、酪氨酸酶、TRP-1或gp-100。细胞可以是乳腺癌细胞并且抗原可以是雌激素受体α。用于此方法中的另一种寡核苷酸为pTT；一种或多种与端粒同源的寡核苷酸和pTT的混合物也可被使用。适用于此方法的一种寡核苷酸为pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
人们已经发现与人端粒突出端重复序列具有50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸减少了基因的表达，所述的基因通常主要或仅仅在胚胎发育中表达，且在正常的分化细胞中不表达或最低限度地表达，但在癌细胞中表达。例如，如实施例44所描述的，pGTTAGGGTTAG(SEQ IDNO：5)降低了活素/ML-IAP在黑色素瘤细胞系中的表达。
进一步地，本发明涉及一种用于诱导人的癌细胞中的细胞程序性死亡的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。此方法可应用于，例如，黑色素瘤和淋巴瘤。
在此描述的与端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸对癌细胞的进一步的作用为诱导衰老。如在实施例41、43和48中所描述的，用寡核苷酸治疗的乳腺癌细胞，卵巢癌细胞和纤维肉瘤细胞具有改变的形态学和典型衰老的β-半乳糖苷酶的表达。因此，本发明的另一种方法为诱导哺乳动物(例如，人)中癌细胞衰老的方法，该方法将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
本发明也提供了用于抑制人体中癌细胞生长的方法，该方法与癌细胞中端粒酶的存在与否或活性无关，包括步骤将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。
本发明进一步地提供了用于抑制人体中癌细胞生长的方法，该方法与癌细胞中p53基因产物的存在与否或活性无关，其中该方法包括下列步骤：将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。
本发明的进一步方面提供了一种抑制人体中癌细胞生长的方法，该方法导致了所述细胞S-期的停滞，包括将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。所使用的寡核苷酸可以为不同的长度，但在一个实施方案中该寡核苷酸可以是小于6个核苷酸的长度。
在这里，本发明也提供了用于预防哺乳动物的皮肤在暴露于紫外线后产生海绵样皮肤水肿、水泡或角化异常的方法，该方法包括将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。该方法可利用，例如，pGAGTATGAG(SEQ IDNO：1)或寡核苷酸pTT或寡核苷酸的混合物。
本发明也提供了一种降低人皮肤癌发生的方法，该方法包括将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。此种寡核苷酸可以是，例如，pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。pTT或寡核苷酸的混合物也可用于此方法中。
上述用于减少人皮肤癌发生的方法的特定方面为用于降低患有着色性干皮病或具有其它遗传决定的恶性肿瘤倾向的人的皮肤癌的发生，该方法包括将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。在一个方面，寡核苷酸为pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。
本发明的另一特定方面提供了一种用于降低具有着色性干皮病或其它遗传决定倾向的人的皮肤癌发生的方法，该方法包括将有效量的含有pTT的组合物施用于皮肤。
本发明也包括了用于增强对紫外线照射-诱导的皮肤损害的修复的方法，其中该方法包括将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。可以使用的特定寡核苷酸为pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。可用于该方法的另一种寡核苷酸为pTT。
作为本发明的另一个方面而包括进来的是一种用于降低哺乳动物中氧化性损伤的方法，该方法包括将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。其中一种这样的寡核苷酸为pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。可用于此方法的另一种寡核苷酸为pTT。在此方法的特定方面，组合物可给药于皮肤。
本发明的另一个目的是提供治疗哺乳动物黑色素瘤的方法，包括将有效量的含有与人端粒突出端重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。该方法适用于人。用于所述方法中的寡核苷酸包括与端粒同源的寡核苷酸pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。pTT也可以被使用。寡核苷酸的不同混合物也可以用于所述方法中。
本发明的另一个目的是提供一种用于降低人皮肤中角化细胞增殖的方法，所述方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。在该方法的特定应用中，被治疗的人患有脂溢性角化病、光化性角化病、博文氏病、鳞状细胞癌或皮肤基底细胞癌。在该方法的一个特定方面中，组合物含有pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。一种相关的方法为用于降低人皮肤中角化细胞增殖的方法，所述方法包括将有效量的含有pTT的组合物施用于皮肤。
另一个实施方案包括增加上皮细胞中的DNA修复，其包括下列步骤：用有效量的含有至少一种寡核苷酸的组合物接触所述细胞，其中该寡核苷酸含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12以及任意上述序列的连续部分的碱基序列。另一个实施方案包括抑制上皮细胞的增殖，包括下列步骤：用有效量的含有至少一种寡核苷酸的组合物接触所述细胞，其中该寡核苷酸含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12以及任意上述序列的连续部分的碱基序列。
由上述寡核苷酸获得的序列的平截形式也包括在本发明中。本发明的寡核苷酸可以在5′末端、3′末端或5′末端和3′末端被平截了的一个或多个核苷酸，只要至少保留未平截寡核苷酸的两个连续的核苷酸。优选地，被平截的寡核苷酸具有10，9，8，7，6，5，4，3或2个连续的核苷酸存在于未平截核苷酸中。
同样，本发明提供了在生理可接受的载体中包括一种或多种寡核苷酸的组合物，其中寡核苷酸包括碱基序列SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，8，11，12，13，14，16，17或18。此外，本发明提供了一种在生理可接受的载体中含有一种或多种寡核苷酸的组合物，其中寡核苷酸由碱基序列SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6，7，8，11，12，13，14，16，17或18组成。
优选地，对其中人们希望抑制细胞增殖的应用而言，寡核苷酸包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6，或寡核苷酸由SEQ ID NO：1或SEQID NO：6组成。优选的是，在期望细胞程序性死亡的应用中，寡核苷酸包括碱基序列SEQ ID NO：5，或寡核苷酸由碱基序列SEQ ID NO：5组成。
本发明也提供了一种含有寡核苷酸和生理可接受的载体的组合物，其中寡核苷酸为pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)，pCATAC(SEQ ID NO：6，pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)，pGGGTTAGGTT(SEQ ID NO：13)，pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)，pTTAGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：16.)，pTTAGAGTATGAG(SEQ ID NO：17)或pGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：18)。
附图的简要说明
图1是用水(稀释剂)、100μM pTpT(T2)或100μM pdApdA(A2)给药人鳞状细胞癌的细胞生长率的图示，其中0天表示在给药前，而1，3，4和5天为给药后的天数。
图2是用水(稀释剂)或100μM pTpT(T2)给药正常人成纤维细胞的细胞生长率，其中0天是在给药之前，而1，3，4和5天是给药后的天数，其中数值表示复制本培养物的平均值±标准偏差。
图3是用水(稀释剂)或100μM pTpT(T2)给药的人宫颈癌细胞的细胞生长率，其中0天是给药前，而1，4和6天是给药后的天数
图4是用稀释剂或100μM pTpT(T2)给药的人黑色素瘤细胞系的细胞产率的图示。
图5是用水(稀释剂)或100μMpTpT(T2)给药的正常人角化细胞的细胞生长率的图示，其中0天是给药前，而8，24，48和72是给药后的小时数，其中数值表示复制本培养物的平均值±标准偏差。
图6是用水、T2或A2给药的人新生的成纤维细胞的平均细胞数。
图7是用水、T2或A2给药的人新生成纤维细胞的平均细胞数。
图8是用水(稀释剂)或100μM pTpT(T2)给药的正常人成纤维细胞的细胞生长率，其中0天是在给药前，而其中数值表示复制本培养物的平均数±标准偏差。
图9是用水(稀释剂)或100μM pTpT(T2)给药的p53-null H1299肺恶性肿瘤细胞的细胞生长率的图示，其中0天是给药之前以及1，2，3和4为给药后的天数，并且其中数值表示复制本培养物的平均值±标准偏差。
图10是用pTpT处理的人角质细胞中报道分子质粒的DNA修复增强的图示，其中空白框表示假-照射的对照质粒，而实心框表示UV-照射的质粒。
图11是增强pTpT处理的人成纤维细胞中报道分子质粒的DNA修复的图示，其中空白框表示假-照射的对照质粒，而实心框表示紫外-照射的质粒。
图12是用100μM的寡核苷酸或等量的稀释剂处理5天的CloudmanS91细胞的黑色素含量，其中数据被表示为复制本培养物的平均值，其被计算为占稀释剂处理的对照的百分比。
图13显示了通过Northern印迹分析用100μM所述寡核苷酸或等量稀释剂处理48小时的SCC12F细胞检测到的p21表达的光密度分析。
图14显示了图13中样品的细胞产率，表示为平均值±标准偏差。
图15显示了用100μM寡核苷酸或等量的稀释剂处理5天的Cloudman S91细胞的黑色素含量，其被表示为占用稀释剂处理的3个独立实验的对照的百分比(平均值±标准偏差)。
图16显示了用图12所述的100μM的所示寡核苷酸或等量的稀释剂处理的Cloudman S91细胞的黑色素含量，其中该数值代表三个独立的实验并且其中*＝p＜0.004，**＝p＜0.03，双尾Student′s t检验。
图17显示了用所示的寡核苷酸处理的Cloudman S91细胞的黑色素含量。
图18显示了用所示的寡核苷酸处理的Cloudman S91细胞的黑色素含量。
图19A-19H显示了用碘化丙啶染色的Jurkat细胞(无限增殖的T淋巴细胞)的FACS(荧光激活细胞分拣器)分析，将所述细胞用稀释剂(图19A和19E)；40μM 11聚体-1 pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)(图19B和19F)；40μM 11聚体-2 pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)(图19C和19G)；40μM 11聚体-3pGATCGATCGAT(SEQID NO：10)(图19D和19H)处理。Jurkat细胞在分析之前用所述的试剂处理48小时(图19A-19D)或72小时(图19E-19H)。
图20A-20F为显示荧光激活细胞分选结果的分布图，在细胞中进行如下的添加：图20A，稀释剂；图20B，0.4μM 11聚体-1；图20C，0.4μM 11聚体-1-S；图20D，稀释剂；图20E，40μM 11聚体-1；图20F，40μM 11聚体-1-S。
图21A-21G为显示荧光激活细胞分选结果的分布图，在细胞中进行如下的添加：图21A，稀释剂；图21B，10μM 11聚体-1；图21C，10μM 11聚体-1和1μM 11聚体-1-S；图21D，10μM 11聚体-1和5μM 11聚体-1-S；图21E，10μM 11聚体-1和10μM 11聚体-1-S；图21F，20μM 11聚体-1-S；图21G，10μM 11聚体-1-S。
图22是显示用稀释剂、pTpT或pTspT处理的细胞的黑色素含量(pg/细胞)的柱状图。
图23是显示用稀释剂、11聚体-1或11聚体-1-S处理的细胞的黑色素含量(pg/细胞)的柱状图。
图24是显示细胞的黑色素含量(pg/细胞)的柱状图，其中细胞已被假-处理(没有照射，没有寡核苷酸)，或用紫外线(UV)处理，或未经照射但用pTspT处理，或用UV照射并用pTspT处理。
图25为活细胞计数的图表，表示为占相应的假-照射对照的细胞计数的百分比，显示为用稀释剂-处理(正方形)或pTpT-处理(菱形)的鳞状细胞癌细胞系SCC12F的细胞经紫外线照射后作为时间的函数。
图26为正常人成纤维细胞在UVA诱导损伤并且用pTpT处理后修复能力的柱状图，被显示为由基因在非-复制型载体pCMV-Luc中表达而产生的荧光素酶活性。被照射10或20分钟的成纤维细胞经稀释剂-处理(黑色条形图)和pTpT-处理(白色条形图)的荧光素酶活性占假-照射对照的荧光素酶活性的百分比被标绘在图中。参见实施例24。
图27是显示Jurkat细胞半胱氨酸蛋白酶-3活性的测定结果的柱状图，其中用下述物质对Jurkat细胞进行了处理(柱状图，从左到右显示)：稀释剂，与端粒序列同源的寡核苷酸，与端粒序列互补的寡核苷酸，或不相关的寡核苷酸。将细胞与寡核苷酸一起温育48、72和96小时的半胱氨酸蛋白酶-3活性(分析产生的pmol pNA/hr/μg蛋白质)被标绘在图上。
图28是描述注射了MM-AN细胞的产生SCID(重度联合免疫缺陷)小鼠的原代肿瘤的平均体积的柱状图，其中的MM-AN细胞经稀释剂、与序列pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)“互补”的寡核苷酸、或具有序列pGTTAGGGTTAG的(SEQ ID NO：5)“T-寡核苷酸”预处理。
图29是描述注射了经稀释剂、“互补的”寡核苷酸、或“T-寡核苷酸”预处理的MM-AN细胞的产生SCID小鼠的转移性肿瘤的平均体积的柱状图。参见实施例30。
图30A-30H是通过荧光激活细胞分术测定的荧光强度的分布图，下列物质被添加到Jurkat细胞中：图30A和30E，稀释剂；图30B和30F，10μM的pGGGTTAGGGTT(SEQ ID NO：13)；图30C和30G，10μM的pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)；图30D和30H，10μM的pCGGGCTTATTG(SEQ ID NO：15)。
收集细胞并在添加寡核苷酸72小时后(图30A、30B、30C和30D)或在添加寡核苷酸96小时后进行FACS作用(图30E、30F、30G和30H)。参见实施例31。
图31A-31E是通过荧光激活细胞分选术测定的荧光强度的分布图，下列物质被添加到Jurkat细胞中：图31A，稀释剂；图31B和31D，分别为20μm和5μM的pTT；图31C和31E，分别为20μm和5μM的pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。参见实施例31。
图32A-32D是通过荧光激活细胞分选术测定的荧光强度的分布图，下列物质被添加到融合前的正常新生的人成纤维细胞中：图32A，稀释剂；图32B，40μM的pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)；图32C，40μM的pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)；图32D，40μM的pGATCGATCGAT(SEQ ID NO：10)。在添加寡核苷酸或稀释剂24小时后通过FACS分析细胞。
图33A-33H是通过荧光激活细胞分选术测定的荧光强度的分布图，下列物质被添加到(图33A-33D)SCC12F细胞或(图33E-33H)Saos-2细胞中：图33A和33E，稀释剂；图33B和33F，pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)；图33C和33G，pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)；图33D和33H，pGATCGATCGAT(SEQ ID NO：10)。在添加40μM寡核苷酸或稀释剂24小时后通过FACS分析细胞。
图34A-34H是通过荧光激活细胞分选术测定的荧光强度的分布图，下列物质被添加到(图34A-34D)SCC12F正常对照成纤维细胞或(图34E-34H)NBS成纤维细胞中：图34A和34E，稀释剂；图34B和34F，pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)；图34C和34G，pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)；图34D和34H，pGATCGATCGAT(SEQ ID NO：10)。在添加40μM寡核苷酸或稀释剂48小时后通过FACS分析细胞。
图35是提出的通过暴露于单链端粒DNA序列诱导衰老、细胞周期停滞、适应性分化或细胞程序性死亡的机理的图解。3′端粒突出端通常隔离在被TRF2稳定化的环结构内，形成了“加帽的”或沉默的端粒。此环结构由于紫外线照射或化学加合物引起的DNA损伤的去稳定化、TRF2DN的表达或衰老过程中的渐渐侵蚀被假定曝露了此单链DNA(TTAGGG重复序列；SEQ ID NO：11)，“脱去”该端粒的帽。TRF2蛋白质在生理条件下的置换可能伴随或可能不伴随环的破裂。此单链DNA然后通过迄今未确定的传感器分子进行测定。这种具有3′突出端的传感器的相互作用启动了级联事件，包括ATM激活，继之以p53激活和p95/Nbsl修饰，导致细胞周期停滞。取决于细胞类型和/或信号的强度和持续时间，这些事件可导致最终诱导衰老、适应分化或细胞程序性死亡。与突出端序列同源的DNA寡核苷酸可以被相同的传感器分子识别，在没有端粒破裂的情况下引发级联反应。
图36是表示在添加了用寡核苷酸处理的Saos-2细胞的复制本培养物36小时后的细胞群体倍增的平均值与平均值标准误差的柱状图，如实施例40所述。
图37是显示用T-寡核苷酸(实心菱形)、对照寡核苷酸(实心正方形)或稀释剂(实心三角形)单剂量处理后MCF-7细胞的产率的图表，与细胞接触4天的时间。参见实施例41。
图38是显示用T-寡核苷酸(实心菱形)、对照寡核苷酸(实心正方形)或稀释剂(实心三角形)单剂量处理后BT-20细胞的产率的图表，与细胞接触4天的时间。参见实施例41。
图39是显示用T-寡核苷酸(实心菱形)、对照寡核苷酸(实心正方形)或稀释剂(实心三角形)处理后第1天和第3天MCF-7细胞的产率的图表。参见实施例41。
图40是通过荧光激活细胞分选测定的MCF-7细胞的荧光强度的分布图，其中在添加到T-寡核苷酸、对照寡核苷酸或稀释剂的培养物后将细胞培养72小时。参见实施例41。
图41是通过荧光激活细胞分选测定的BT-20细胞的荧光强度的分布图，其中在添加到T-寡核苷酸、对照寡核苷酸或稀释剂的培养物中后将细胞培养96小时。参见实施例41。
图42是描述MCF-7细胞的培养物中β-半乳糖苷酶活性阳性细胞染色的百分比的柱状图，其中将MCF-7细胞用40μM pGTTAGGGTTAG(SEQID NO：5)处理并在染色前在培养基中保养一周。参见实施例41。
图43是显示处理1、2、3、4和5天后保养在培养物中并补充稀释剂、T-寡核苷酸、顺氯氨铂、或ICI 182，780的MCF 7细胞的细胞产率的柱状图。参见实施例41。
图44是显示处理1、2、3、4和5天后保养在培养物中并补充了稀释剂、T-寡核苷酸、顺氯氨铂、或ICI 182，2080的BT-20细胞的细胞产率的柱状图。参见实施例41。
图45是描述HPAC细胞培养物的细胞产率的图表，其中将HPAC细胞用40μM pGTTAGGGTTAG[T-寡核苷酸；SEQ ID NO：5(实心正方形)]、40μM pCTAACCCTAAC[对照寡核苷酸；SEQ ID NO：9(实心三角形)]或单独的稀释剂(实心菱形)进行处理。参见实施例42。
图46是描述OVCAR5细胞培养物中细胞数目的图表，其中在0天用40μM T-寡核苷酸(实心正方形)、互补的寡核苷酸(实心三角形)或稀释剂(实心菱形)处理OVCAR5细胞。在处理后第3、4和5天进行细胞计数。参见实施例43。
图47是描述MCF-7细胞培养物中细胞数目的图表，其中在0天用40μM T-寡核苷酸(实心正方形)、互补的寡核苷酸(实心三角形)或稀释剂(实心菱形)处理MCF-7细胞。在处理后第3、4和5天进行细胞计数。参见实施例43。
图48是显示用寡核苷酸或稀释剂处理的MM-AN细胞的FACS分析结果的分布图。参见实施例44。
图49是显示用寡核苷酸或稀释剂处理的MM-AN细胞的TUNEL分析结果的分布图。参见实施例44。
图50是显示用寡核苷酸或稀释剂处理24小时和96小时后，MM-AN细胞和黑色素细胞的TUNEL分析结果的分布图。参见实施例44。
图51是显示在经稀释剂、互补寡核苷酸或稀释剂处理以前，注射MM-AN细胞40天后在SCID小鼠中产生的平均肿瘤体积的柱状图。参见实施例44。
图52是显示在经稀释剂、互补寡核苷酸或稀释剂处理以前，注射MM-AN细胞40天后在SCID小鼠中产生的肿瘤平均数的柱状图。参见实施例44。
图53是用硫代磷酸酯键合成的核苷酸序列SEQ ID NO：5的寡核苷酸的图示。参见实施例46。
图54是显示测定图53描述的硫代磷酸酯寡核苷酸1、2、3和4导致正常新生的人成纤维细胞培养物衰老的作用结果的柱状图，其通过用R-半乳糖苷酶活性的细胞染色阳性来指示。图54中的寡核苷酸“11-1”表示用完全用磷酸二酯键合成的pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)处理的成纤维细胞培养物。“Dil”在图54中表示用不含寡核苷酸的稀释剂处理的成纤维细胞培养物。参见实施例46。
图55是显示XPC+/-小鼠受到一周的每天局部pTT(或单独稀释剂)接着3周的每天紫外线照射的5个连续循环(150天)的实验结果的图表。标绘的数据为实验开始后，经pTT-或稀释剂-处理不含肿瘤的小鼠随着时间变化的百分比。参见实施例49。
图56是显示XPC+/-小鼠受到一周的每天局部pTT(或单独稀释剂)接着3周的每天紫外线照射的5个连续循环(150天)的实验结果的图表。标绘的数据为实验开始后所观察的每一XPC+/-小鼠的肿瘤平均数随着时间的变化。参见实施例49。
图57是显示实施例49中XPC+/-小鼠受到一周的每天局部pTT(或单独的稀释剂)接着3周的每天紫外线照射的5个连续循环(150天)的实验结果的柱状图。显示了用稀释剂或pTT处理的每一小鼠的肿瘤数目。(AK＝光化性角化病；SCC＝鳞状细胞性癌)
图58为显示在第0天用pTT注射经紫外线照射诱导的肿瘤的实验结果的柱状图。相对于第0天的肿瘤体积被标绘在图上。参见实施例50。
图59为显示在UVB照射质粒以及将照射的质粒转染到成纤维细胞中之后通过质粒pCMVluc进行DNA修复的测定结果的图表。在转染2天前，用40μM(●)T-寡核苷酸pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)、(◇)对照寡核苷酸pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)、(△)不相关的寡核苷酸pGATCGATCGAT(SEQ ID NO：10)或(□)稀释剂来处理细胞。
图60是显示用40μM寡核苷酸或稀释剂以及然后UVB照射进行预先处理的成纤维细胞中DNA光化产物的测定结果的图表。标记同上述图59。
发明详述
本发明基于发现了用DNA片段、寡核苷酸或类似的化合物处理细胞可在暴露于紫外线照射或致癌化学药品之后抑制细胞的增殖，或诱导DNA修复或激发保护性的应答。pTpT激发了皮肤中的黑色素生成(晒黑)反应(US专利5,643,556，其中的教导整体在此引入作为参考)，它是一种对紫外线照射的保护性反应。
更具体地，本发明涉及化合物诸如DNA片段、多核苷酸、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、或二核苷酸二聚体、或类似化合物在抑制细胞增殖或诱导DNA修复中的应用。在这里所用的，对细胞增殖的抑制包括根据本领域的标准试验以及实施例所述测定的细胞分裂的完全终止、细胞分裂的部分抑制以及细胞分裂的瞬时抑制。本发明同样也涉及过度增殖性疾病的预防和/或处理，包括但不限于癌症以及前癌状态，其中过度增殖性疾病影响任意器官的细胞以及任意胚胎来源的细胞。治疗后再生长或复发的转移性肿瘤和癌症以及原代肿瘤，可以通过本发明的方法进行治疗。在特定的实施方案中，欲治疗的疾病和病征包括哺乳动物，尤其是人的皮肤疾病诸如牛皮癣和过度增殖性的、前癌性的或UV诱导的皮肤病。
本发明进一步地涉及本发明的化合物在减少光衰老(部分地由累积的DNA损伤引起的作用)以及减少氧化性应激和氧化性损伤中的应用。本发明同样也涉及预防或减少哺乳动物皮肤癌产生的可能性。此外，本发明的化合物可用于诸如具有维持的遗传突变的细胞，诸如恶性的或癌细胞或来自光化性角化病的细胞中诱导细胞程序性死亡。本发明进一步提供了含有所述化合物的组合物。
各种类型的细胞，并且在特定的实施方案中，上皮细胞被期望对本发明的方法作出反应，这些正如在这里提供的体外和体内的实施例所证明的。适用于本发明方法的上皮细胞例如包括表皮细胞、呼吸性上皮细胞、鼻上皮细胞、口腔细胞、听觉上皮细胞、视觉上皮细胞、泌尿生殖道细胞和食道细胞。胃肠道细胞同样被考虑用于在此处描述的本发明方法中。
含有损伤或突变DNA的细胞包括，例如，光化性角化病细胞、癌细胞、已被例如用UV照射的细胞以及已经暴露于损伤DNA的化学药品或环境的细胞。如此处所描述的，过敏性介导的炎症包括病征诸如特应性皮炎、接触性皮炎、过敏性鼻炎以及变应性结膜炎。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括大约2-200个碱基长度的DNA寡核苷酸，其可以在合适的载体中给药于哺乳动物(例如，人)。在另一个实施方案中，DNA寡核苷酸为大约2到大约20个核苷酸的长度。在另一个实施方案中，DNA寡核苷酸为大约5到大约11个核苷酸的长度。在又一个实施方案中，DNA寡核苷酸为大约2-5个核苷酸的长度。此处所述的“DNA片段”是指单链DNA片段、双链DNA片段、或单链和双链DNA片段两种的混合物。
应当理解其它含有碱基的序列也可用于本发明中，其中碱基为，例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包括5′磷酸。一种或多种本发明的寡核苷酸的组合也可被使用。
如实施例所示，当细胞与本发明的DNA片段、寡核苷酸和核苷酸接触时，本发明的特定DNA片段、寡核苷酸和二核苷酸引起对细胞中增殖的抑制、黑色素生成、TNFα产生和细胞程序性死亡的诱导。例如，胸腺嘧啶二核苷酸(pTpT)抑制一些人细胞类型的增殖，包括鳞状细胞性癌细胞、宫颈癌细胞、黑色素瘤细胞、新生的角质细胞和正常新生的成纤维细胞(分别为实施例1-5)。pTpT同样降低了豚鼠模型体内的表皮增殖(实施例6)。此外，pTpT处理细胞导致了p53的核定位(实施例7)和对p53-调节的基因诸如与DNA修复有关的基因的诱导(实施例8)。用pTpT预处理细胞增强了它们修复紫外线照射以及通过化学致癌物苯并[α]芘形成的DNA损伤的能力(实施例8和9)。在处理的2天内，pTpT上调节p53、PCNA和XPA蛋白质的水平2到3倍(实施例9)。注意到已知XPA不被p53所调节，这证明了DNA修复能力的某些增强可能也存在于缺少p53的细胞中。用pTpT预处理老鼠皮肤也导致UV-诱导的体内DNA损伤水平(胸腺嘧啶二聚体)的降低(实施例14)。
胸腺嘧啶二核苷酸pTpT模拟紫外线灯的某些作用，包括诱导黑色素生成和刺激角质细胞产生TNFα(实施例4)。pTpT也诱导TNFα和降低体内接触的过敏性(实施例10)。UVB射线是接触过敏性(CH)诱发期的有效抑制因子，并且TNFα是这种抑制作用的介质。胸腺嘧啶二核苷酸(pTpT)，一种用于UV-诱导胸腺嘧啶二聚体形成的底物，能激活多种效应，包括培养的黑色素细胞中增加的酪氨酸酶的表达和黑色素含量以及豚鼠中的皮肤晒黑。如实施例10所示，本发明的化合物也在老鼠模型中模拟UVB对接触过敏性的抑制作用。如本发明所证明的，皮内注射或局部施用pTpT可以抑制接触过敏性的诱导并且可以激活体内的TNFα基因。
实施例10也证明了pTpT诱导IL-10 mRNA和蛋白质的产生，其中的蛋白质在异源混合的淋巴细胞测定中对于抑制T细胞增殖是活性的。在人皮肤中，IL-10也同TNFα一样诱导对接触过敏性和迟发型过敏性反应的特异耐受性。
因此，可以合理地期望本发明的DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸和二核苷酸二聚体具有体内免疫抑制作用，例如，抑制接触过敏性和迟发型过敏性。
在另一个实例中，9-核苷酸寡聚体GAGTATGAG(SEQ ID NO：1)刺激人黑色素细胞中的黑色素生成并诱导p21/Waf/Cip 1的表达，其中p21/Waf/Cip 1是鳞状细胞性癌细胞系中的生长抑制基因产物。此外，TAGGAGGAT(SEQ ID NO：2；与端粒突出端重复序列具有5/9的同一性)和原始9聚体的平截形式AGTATGA(SEQ ID NO：3)和GTATG(SEQ ID NO：4)，也激发人黑色素细胞中的黑色素生成(实施例11)。此外，序列pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)激发Cloudman S91黑色素瘤细胞中色素的形成(实施例12)并诱导人T细胞系中的细胞程序性死亡(实施例13)。如在此所显示的，pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)诱导人T细胞来发生细胞程序性死亡，而SEQ ID NOs：9和10(pCTAACCCTAAC和pGATCGATCGAT)并不显著地增加这些细胞中的细胞程序性死亡(实施例13)。具有序列SEQ ID NOs：6-12的寡核苷酸显示出至少一些诱导黑色素生成的能力(实施例11-13)。
如在此所证明的，也可以使用小寡核苷酸如二核苷酸(例如，pTpT)和大约20个核苷酸长度的寡核苷酸，因为已经证明这些长度的寡核苷酸被吸收到细胞中。在另一个实施方案中，可以使用大约11个核苷酸的寡核苷酸。在另一个实施方案中，5个核苷酸长度的寡核苷酸可以被用于穿透皮肤屏障并有效地诱导黑色素生成、抑制细胞生长以及诱导免疫抑制。在实施例25中，9-聚体显示出保护老鼠的皮肤避免受到光致损伤。
这些结果证明了当用本发明的化合物与目的细胞或组织接触时，这些化合物的体外作用也在体内发生。例如，如此处所证明的，对于细胞增殖、TNF-α产生以及黑色素产生的抑制作用而言，通过本发明化合物进行的这些活性的体外诱导指示了这些化合物在体内产生相同作用的能力。可以合理地期待任何适当的将本发明的化合物给药于生物体使得化合物接触目的细胞或组织的方法，是有效的。可利用常规的优化流程将该作用优化。
因此，本发明的化合物被用于一些方法中通过增强DNA修复来抑制细胞增殖、预防癌症、光衰老和氧化性应激的，以及在皮肤中，通过增加黑色素产生来增强色素的形成。已知黑色素在UV范围内吸收光电子并且因此降低了癌症和光衰老的危险。
DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸以及二核苷酸二聚体可获自任意合适的来源，或可合成产生。为了使DNA片段，例如鲑精DNA可溶于水，于是对混合物进行高压灭菌处理以断裂DNA片段。在一个实施方案中，DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸或二核苷酸二聚体含有一个5′磷酸。
本发明化合物也在UVA-诱导的对细胞的氧化性损伤中起保护性的作用(实施例15)。如实施例15所描述的，与用稀释剂处理的对照相比，用pTpT处理3天时间然后用5×10-5或5×10-4 H2O2刺激的原代新生的成纤维细胞具有更高的细胞产率。分析mRNA和蛋白质显示，在pTpT处理的细胞中，Cu/Zn过氧化物歧化酶增加了。这些酶参与氧自由基淬灭的过程。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物被给药于细胞来防止氧化性损伤。在一个实施方案中，这些化合物被局部给药于个体的表皮。
此处所用的“增加p53蛋白质活性的试剂”是那些增加p53蛋白质活性并且通过与DNA修复有关的蛋白质(诸如PCNA、XPB和p21蛋白)的诱导因此导致DNA修复机制诸如核苷酸切除修复增加的试剂(例如，一种药物、分子、核酸片段、寡核苷酸或核苷酸)。可通过下述方式增加p53蛋白的活性：直接刺激编码p53的DNA的转录或p53-特异性的mRNA的转录、增加p53蛋白的表达或产生、增加p53蛋白的稳定性、增加p53 mRNA或蛋白对降解的抗性、引起p53在细胞核中累积、增加p53存在的量、使p53中丝氨酸15残基磷酸化或通过其它能增强p53活性的方式。可以使用超过一种增加p53活性的试剂的组合。可选择地，增加p53活性的试剂可以与如上所述的DNA片段、脱氧核苷酸或二核苷酸的组合使用。
紫外线照射产生DNA光化产物，当其不被迅速地除去时，可引起突变和皮肤癌。UV诱导的DNA损伤的修复需要有效地去除光化产物以避免DNA复制过程中的差错。与年龄相关联的DNA修复能力的下降与除去UV-诱导光化产物所需要的p53及其它核切割修复(NER)蛋白组成水平的降低相关。如此处所证明的，当人的真皮细胞在紫外线照射之前用本发明的化合物处理时，这些化合物诱导这些细胞中的NER蛋白(实施例16)。当NER蛋白具有与年龄相关的降低时，来自从婴儿至90岁的各年龄供体细胞中的NER蛋白被诱导200-400％。随着细胞样品年龄的增加，胸腺嘧啶二聚体和光化产物的修复率显著下降；然而，用本发明的化合物预处理细胞然后UV照射，更有效地除去了30-60％的光化产物。因此，用小DNA寡核苷酸处理细胞部分补偿了与年龄相关的DNA修复能力的的降低。根据本发明化合物的体内作用，可合理地期望用本发明的化合物处理人皮肤增强了内源DNA的修复能力并降低了阳光UV照射致癌的危险。这些方法对于可能具有降低的细胞DNA修复能力的年长个体是尤其有用的。
用于皮肤来预防UV照射后遗症或减少皮肤癌的发生、减少氧化性损伤或增强UV诱导损伤修复方法中的DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸或二核苷酸二聚体，可以单独给药或与生理可接受的载体结合，所述载体包括溶剂、香料或着色剂、稳定剂、遮光剂或其它用于药物或化妆品的组分。它们可以在载体诸如水、盐或在另一中合适的传递载体中给药。传递载体可以是输送DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸或二核苷酸二聚体的任意合适的载体。在一个实施方案中，寡核苷酸的浓度可以为10μM-100μM。
为了使组合物的活性成分深深地进入皮肤内的细胞，改善通过皮肤外层例如角质层渗透性的载体是有用的。用于此目的的载体组分包括但不局限于乙醇、异丙醇、二甘醇醚诸如二甘醇-乙醚、氮酮(1-十二碳烷基氮杂环庚烷-2-酮)、油酸、亚油酸、丙二醇、高渗浓度的丙三醇、乳酸、羟基乙酸、柠檬酸以及苹果酸。在一个实施方案中，丙二醇被用作传递载体。在一个优选的实施方案中，使用含有3％苯甲基磺酸和5％油醇的丙二醇∶乙醇∶十四烷酸异丙酯(1∶2.7∶1)的混合物。
在另一个实施方案中，可以使用脂质体制品。脂质体制品可以包括能渗透目的细胞或角质层以及能与细胞膜熔合，使得脂质体的内容物传递到细胞中的脂质体。例如，可以使用描述在Yarosh的专利U.S.No.5,077,211、Redziniak等的U.S.No.4,621,023或Redziniak等的U.S.No.4,508,703中的脂质体。本发明的用于靶向皮肤病症的组合物可在哺乳动物暴露于UV或引起氧化性损伤的试剂之前、期间或之后给药。其它合适的制剂可以使用niosomes。Niosomes是类似于脂质体的脂囊泡，具有大体上由非离子脂类组成的膜，它的一些形式对于运输化合物穿过角质层是有效的。
其它合适的主要用于皮肤传递的方法包括使用除寡核苷酸之外的含有水性的或含水的乙醇培养基以及胶凝剂的水凝胶制剂。合适的胶凝剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆(聚羧乙烯)、hypan、聚丙烯酸酯以及甘油聚丙烯酸酯。
在一个实施方案中，DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体或含有一种或多种上述物质的组合物被局部施用于皮肤表面。在其它的实施方案中，DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体或含有其它一种或多种上述物质的组合物，被用于身体的其它细胞或组织，诸如上皮细胞。可以对被识别对这些物质的进入比皮肤具有更小的屏障的组织细胞进行处理，例如，口服到口腔；对呼吸上皮施用气雾剂；对膀胱上皮施用滴剂；对肠(上皮)施用滴剂或栓剂或对体内的其它细胞或组织采用局部的或表面施用的方式，包括滴眼剂、滴鼻剂以及使用血管成形术的应用。此外，本发明的寡核苷酸可以通过静脉注射或直接皮内、皮下、肌内注射或腹腔内注射到目的组织中。此外，对于血细胞处理来说，本发明的化合物可静脉内给药或在细胞的体外循环过程中，诸如通过光致迁动装置进行给药。如在此处所显示的，所有需要的是使本发明的寡核苷酸组合物接触目的细胞，其中接触细胞的寡核苷酸可以为小的如二核苷酸。
DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的试剂、增加p53活性的试剂或含有一种或多种上述物质的组合物，被以合适的方式给药(导入到或接触)于目的细胞。此处所用的“目的细胞”是那些受过度增殖性疾病或癌症前期病症影响或变得受其影响的细胞，或受氧化性应激、DNA损坏病症诸如UV照射或暴露于损伤DNA的化学药品诸如苯并[a]芘的影响的细胞。本发明特定地包括上皮细胞，包括黑色素细胞和角质细胞，以及其它的上皮细胞诸如口腔的、呼吸的、膀胱的和子宫颈的上皮细胞。如在这里所证明的，本发明的方法和组合物可以在众多来源的上皮细胞中抑制生长、诱导黑色素生成和诱导TNFα的产生。
寡核苷酸、DNA片段、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的试剂、增加p53活性的试剂或含有一种或多种上述物质的组合物，被以有效的量在合适的时间施用。“合适的时间”可以取决于寡核苷酸、DNA片段、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体或其它所用试剂的类型和分子量、要治疗或预防的病症、所欲实现的目的以及个体病人而变化。此处所述的“有效的量”，是指足以实现可测定目的结果的数量或浓度。有效的量取决于寡核苷酸、DNA片段、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体或其它所用试剂的类型和分子量、要治疗或预防的病症、所欲实现的目的以及个体病人。例如，对于牛皮癣、过度增殖、癌性的或前癌性的状况或UV诱导的皮肤病的治疗或预防而言，有效的量是降低或减轻任一疾病的症状，减少受疾病影响的细胞的体积、面积或数量，预防受影响区域的形成，或减少受过度增殖失调影响的细胞增长率所必需的量。
浓度可以大约为2-300μM。在另一个实施方案中，试剂(例如寡核苷酸)的浓度为大约50-200μM；在再一个实施方案中，浓度为大约75-150μM。在一些应用中，寡核苷酸的浓度可以是大约10-100μM。
在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸、DNA片段，诸如单链DNA片段、脱氧核苷酸、二核苷酸或二核苷酸二聚体、增加p53活性的药物，促进分化的药物或包括一种或多种上述物质的组合物，在合适的传递载体中给药于哺乳动物的目的细胞来治疗或预防影响上皮细胞的过度增殖性疾病。DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的药物、增加p53活性的药物或含有一种或多种上述物质的组合物，可以全身地给药，可直接给药于受影响的区域，或预防性的施用于通常受过度增殖性疾病影响的区域。
在另一个实施方案中，DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、增加p53活性的药物、促进分化的药物、含有一种或多种上述物质的组合物，被给药于表皮来用于氧化性应激的治疗或预防或用于过度增殖的、癌性的、前癌性的状况或UV-应答的皮肤病的治疗或预防。
在另一个实施方案中，DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的药物、增加p53活性的药物或含有一种或多种上述物质的组合物，可单独或在合适的传递载体中给药于表皮来减少光衰老或预防或减少皮肤癌发生的可能性。
寡核苷酸、DNA片段、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的试剂、增加p53活性的试剂或含有一种或多种上述物质的组合物，可以在合适的时间(在皮肤暴露于紫外线照射之前)  通过局部或皮内注射给药。寡核苷酸、DNA片段、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的试剂、增加p53活性的试剂或含有一种或多种上述物质的组合物，可在暴露于致癌物质诸如紫外线照射之前、期间或之后施用。它们可被天天施用或以有规则的或间歇的间隔进行施用。在一个实施方案中，DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的试剂、增加p53活性的试剂或含有一种或多种上述物质的组合物，可在暴露于日光的日子中天天施用于皮肤。
在本发明进一步的一个实施方案中，DNA片段、寡核苷酸、脱氧核苷酸、二核苷酸、二核苷酸二聚体、促进分化的试剂、增加p53活性的试剂，或含有一种或多种上述物质的组合物，在合适的传递载体中给药于个体(例如，个体的上皮细胞或其它细胞)来治疗或预防过度增殖、癌性的或前癌性的病症，或用于修复或预防由损伤DNA的化学药物，诸如苯并[a]芘所引起的DNA损伤。
如在这里所证明的，本发明化合物未修饰的形式例如，通过磷酸二酯键连接的未修饰的寡核苷酸序列，在体外和体内是有活性的。此处所用的术语“寡核苷酸”、“二核苷酸”、“DNA片段”等等，是指具有作为糖的脱氧核糖的分子，并且具有天然存在的磷酸二酯键(“磷酸主链”)，除非特定说明其具有不同的键或主链。
此外，尽管对于引发本发明的UV-模拟作用的能力而言并非所必需的，本发明的化合物可以被修饰、衍生或同其它试剂相结合来增加化合物在生物体内的半衰期和/或增加这些化合物被目的细胞的吸收。修饰试剂包括，例如，脂质或阳离子型的脂质。在一个实施方案中，本发明的化合物被亲脂性基团、刚性部分共价修饰。可以对本发明的化合物进行修饰来靶向体内的特异性组织。例如，可通过用生物素与化合物偶联以及利用与促进穿过血脑屏障进行传递的药物偶联来靶向脑组织，诸如与链霉亲和素偶联的抗转移受体抗体。
从实施例17-20中所描述的实验结果，可以断定pTpT的活性以及端粒突出端重复同系物寡核苷酸11聚体-1(SEQ ID NO：5)的活性要求它们可以被水解来诱导细胞程序性死亡、细胞周期停滞以及黑色素生成。这些寡核苷酸的非水解性的硫代磷酸酯形式具有抑制可水解的分子活性的能力并且可用于阻断体内和体外的细胞内应答。
实施例，尤其是实施例31，证明了与端粒同源但非互补的寡核苷酸或相同长度的无关DNA序列在建立的淋巴细胞系和在人黑色素瘤细胞系中诱导S期停滞和细胞程序性死亡。该作用不取决于对端粒同源性的选择性吸收，如同对照序列在本研究中被相当地吸收。部分同源于3′突出端序列的寡核苷酸在质量上产生相同类型的应答，但达到较小的程度或在更高的浓度下。因此，与端粒突出端重复序列端粒具有55％同一性的11碱基寡核苷酸是在产生细胞程序性死亡中的11聚体-1(与端粒重复具有100％核苷酸序列同一性)和11聚体-2(互补于端粒重复)或11聚体-3(与端粒重复无关的)之间的中间体。pTT，对应于TTAGGG(SEQ ID NO：11)重复序列的三分之一，两倍于11聚体-1对于细胞周期停滞的作用但在4倍的更高浓度下。在进行pTT与和(TTAGGG)n具有56％序列同一性的9碱基寡核苷酸的比较中，发现40μM具有56％序列同一性的寡核苷酸具有和100μMpTT相同的诱导p53和p53-调节基因的能力。
寡核苷酸pTT已经显示诱导和激活p53并转录上调控大量的基因，已知其中很多的但并非是所有的被p53调节。用完全同源的11聚体-1进行的实验证明了S期停滞诱导是由p95/Nbsl蛋白的磷酸化所导致的，其中p95/Nbsl蛋白的磷酸化在电离辐射之后也介导S期的停滞。值得注意的是，这降低了缺少功能性的p53的细胞的增殖。此外，如根据p95/Nbsl通过ATM激酶被磷酸化的事实所期望的(Gatei，M.，等，(2000)，Nat Genet 25，115-119；Wu，X.，等，(2000)，Nature 25，477-482；Lim，D.S，等，(2000)，Nature 404，613-617；Zhao，S，等，(2000)，Nature 405，473-477)，寡核苷酸的作用也需要ATM并且在其ATM激酶被突变的患有共济失调毛细血管扩张的病人的细胞中没有观察到。
已知加速早熟衰老的实验性端粒破裂[Karlseder，J.，等，1999，Science 283：1321-1325]和细胞操作诸如用ras致癌基因转染或暴露于氧化性应激，能降解3′端粒突出端和/或缩短总的端粒长度。相反，在本研究中，细胞暴露于端粒同源寡核苷酸增加了平均端粒长度(MTL)。当不希望被限制于单一机制时，这些数据强烈地暗示寡核苷酸可激活端粒酶，假定是通过诱导TERT而激活的，以及意味着端粒酶的瞬时激活可能是生理的基于端粒的DNA损伤的反应的一部分，所述的反应同时也包括用随后通过p53和p95/Nbsl的信号激活ATM激酶。在缺乏DNA损伤和端粒破裂的情况下，寡核苷酸诱导这些反应的明显能力提供了通过端粒延长使细胞返老还童的可能性，最近报道在人皮肤中含有TERT转染的成纤维细胞的构建体，甚至在异常表达端粒酶的正常细胞中没有增加的致癌性的危险。同样地，此现象暗示在p53超表达小鼠中观察到的强DNA损伤应答的优点可以与也在转基因动物中观察到的早熟衰老相分离(Tyner，S.D.，等，2002，Nature 415：45-523)。这些“返老还童”或在获得与严重的端粒缩短有关的衰老表现型方面的延迟将会获得其它好处，这些好处可以通过用与TTAGGG(SEQ ID NO：11)重复序列部分或完全同源的寡核苷酸处理来产生。基于在体内和在体外深入的研究工作，可以理解这些包括无日光晒黑和相关的光保护作用、增强的DNA修复能力、癌症预防和治疗以及免疫调节。
在正常情况下，认为3′端粒突出端DNA序列反向折回并隐藏在通过TRF2稳定化的环结构中[Griffith，J.D.，等，(1999)，Cell 97，503-514]。然而，如果端粒被扭曲，则这些序列可能被暴露，例如通过紫外(UV)-诱导的胸腺嘧啶二聚体或与鸟嘌呤残基有关的致癌物质加合物(如对于顺式铂氨或苯并[a]芘)可使环回结构不稳定。TTAGGG(SEQ ID NO：11)重复序列的暴露可作为导致各种取决于细胞类型和信号强度和/或持续时间的DNA损伤应答的起始信号。这些应答包括细胞周期停滞、细胞程序性死亡以及更加分化的间或适应表现型，例如，增加的黑色素产生(晒黑)。参见图35。
建议的模型预测对端粒DNA损伤的不能修复将导致放大的损伤应答，诸如p53诱导和细胞程序性死亡，如同已报道的UV照射的着色性干皮病细胞，其不能有效地去除DNA光化产物(Dumaz，N.，等，1998，Carcinogenesis 19：1701-1704)。这个模型进一步与新近关于具有超正常p53活性的转基因小鼠对肿瘤高度抗性然而早熟衰老的发现符合(Tyner，S.D.，等，2002，Nature 415：45-523)。
DNA损伤识别机制可发展为主要地包含胸腺嘧啶和鸟嘌呤碱基。TTAGGG(SEQ ID NO：11)重复序列是DNA损伤的最佳的靶位，因为二胸腺嘧啶位点最通常参与UV光化产物的形成(Setlow，R.B.和W.L.Carrier.1966，J Mol Biol 17：237-254)而鸟嘌呤既是形成8-氧化鸟嘌呤的氧化性损伤的主要位点[Kasai，H.和S.Nishimura，1991“氧化性应激：氧化剂和抗氧化剂，”pp.99-116，H.Sies(ed.)(伦敦，学院出版社有限公司)]，又是大多数致癌物质形成加合物的碱基[Friedberg，E.C.，等，1995，pp.1-58，E.C.Friedberg，G.C.Walker和W.Siede，eds.(华盛顿，D.C.，ASM出版社)]。
推测的端粒-引发的信号转导途径将在高等生物体中提供抗癌变的几个不同的防御机制的单个进化出发点：单独在统计学基础上期望的细胞中增殖能力(衰老)的持久损失在延长的环境曝露和DNA复制和细胞分裂的连续循环过程的整个基因组中累积多个突变；瞬时的细胞周期停滞增加了在重新开始DNA复制之前可用于修复的时间；如果损伤超过了修复能力，则激活细胞自杀程序来从组织中除去细胞，因为可以期望急性的端粒损伤反映整个基因组DNA损伤的程度；并且经过几天的适应性应答的诱导，诸如晒黑，来减少DNA光化产物的形成和/或增加预防以后类似损伤的DNA修复能力。
本发明包括治疗哺乳动物过度增殖失调的方法，其中该治疗方法包括将有效量的含有一种或多种寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物，其中的寡核苷酸与脊椎动物端粒突出端重复序列有至少50％的核苷酸序列同一性。这些方法可应用于尤其是受试验的人。过度增殖失调的特征为细胞的良性生长超出了正常的范围，其有时可导致良性肿瘤或大面积的表皮变厚，如在牛皮癣中。同样在用这些方法治疗的不同过度增殖失调之中有癌症，它表现为不同的形式且在身体的不同细胞类型和器官中产生，例如子宫颈癌、淋巴瘤、骨肉瘤、黑色素瘤及其它在皮肤中产生的癌症以及白血病。同样对其中各种癌细胞进行直接治疗的是乳房、肺、肝脏、前列腺、胰腺、卵巢、膀胱、子宫、结肠、脑、食管、胃以及甲状腺。
可在此处所述的治疗方法中给药的寡核苷酸可以为单一类型的寡核苷酸或在含有一种或多种不同寡核苷酸的组合的形式。没有5′磷酸的寡核苷酸可被用于任意用于治疗的方法，或用于减少此处所述的疾病或失调的发生率。然而，具有5′磷酸的寡核苷酸是优选的，因为已经表明5′磷酸提高了寡核苷酸到细胞中的吸收。寡核苷酸可以至少为两个核苷酸长，优选2-200个核苷酸，且更优选地为从2到20个核苷酸长。5-11个核苷酸的寡核苷酸是更优选的。
脊椎动物的端粒突出端重复序列为(TTAGGG)n。本发明包括一种方法，其中用于给药治疗的寡核苷酸与端粒重复序列具有至少50％的核苷酸序列同一性。优选的为具有至少60％核苷酸序列同一性的寡核苷酸。更优选的为具有至少70％核苷酸序列同一性的寡核苷酸。进一步更优选的为具有至少80％核苷酸序列同一性的寡核苷酸。更加高度优选的为具有至少90％核苷酸序列同一性的寡核苷酸。最优选的为与(TTAGGG)n具有100％核苷酸序列同一性的寡核苷酸。特定的端粒重复同源物pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)、pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5；也称为“11聚体-1”和“T-寡核苷酸”)、pGGGTTAGGGTT(SEQ ID NO：13)以及pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)是尤其优选的，其中人们希望使用与端粒重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸。与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的其它寡核苷酸可被用作抗增殖的药物，例如pTAGGAGGAT(SEQ ID NO：2)、pAGTATGA(SEQ ID NO：3)、pGTATG(SEQ ID NO：4)、pTTAGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：16)、pTTAGAGTATGAGSEQ ID NO：17)和pGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：18)。
寡核苷酸为相对短的多聚核苷酸。多核苷酸是核苷酸单体的线性聚合物，其中核苷酸在一个核苷酸的3′位置和邻近核苷酸的5′位置之间通过磷酸二酯键连接。除非另有说明，本发明的“寡核苷酸”具有一个磷酸二酯主链。
为了增强穿过皮肤的传递，本发明的寡核苷酸可被修饰来屏蔽或降低它们的负电荷或相反地改变它们的化学特性。这些可以例如，通过利用本领域公知的有效试剂和方法来制备寡核苷酸的铵盐来实现。优选的寡核苷酸的铵盐包括三甲基-、三乙基-、三丁基-、四甲基-四乙基-和四丁基-铵盐。铵基及其它带正电的基团可以共价结合于寡核苷酸来促进其穿过角质层，当到达表皮的活性层的细胞内部时可利用酶降解键来释放寡核苷酸。
另一种降低或屏蔽寡核苷酸负电荷的方法包括利用本领域公知的方法和试剂将一个聚氧化乙烯间隔区加入到寡核苷酸的5′磷酸基团中和/或寡核苷酸的内磷酸酯中。这事实上将6-或12-碳调节剂(接头)加入到磷酸中使净负电荷降低了+1并使得寡核苷酸较少的亲水。通过加入一个氨基亚磷酸酯到聚氧化乙烯接头的末端由此提供额外的中和正电荷来实现负电荷进一步的减少。
本发明寡核苷酸的磷酸二酯主链还可以被修饰或合成来减少负电荷。一种优选的方法涉及甲基磷酸类(或手性的甲基磷酸酯)的应用，从而使磷酸中一个带负电荷的氧原子被一个甲基取代。这些寡核苷酸类似于具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸，所述具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸含有一个取代甲基的硫酸并且其也包含在本发明的范围内。
本发明的寡核苷酸也可以采用肽核酸(PNAs)的形式，其中核苷酸的碱基彼此通过一个肽主链相连接。
寡核苷酸的其它修饰诸如，例如，在US专利No.6,537,973和6,506,735(此两个专利通过引用作为参考)中所描述的，以及其它修饰对本领域技术人员来说是显而易见的。
寡核苷酸也可以为“嵌合的”寡核苷酸，其可被合成为具有两种或多种化学上不同的主链键的组合，其中一种是磷酸二酯。在一个实施方案中为在3′末端具有一个或多个磷酸二酯键的嵌合寡核苷酸。在另一个实施方案中为在3′和5′末端具有一个或多个磷酸二酯键的嵌合寡核苷酸。
如实施例46中所述的，具有序列SEQ ID NO：5的11-聚体寡核苷酸被合成为含有全部为磷酸二酯键、全部为硫代磷酸酯键或这些键的组合。一个寡核苷酸在5′末端具有两个硫代磷酸酯键；另一个寡核苷酸在3′末端具有两个硫代磷酸酯键；另一个在每一末端具有两个硫代磷酸酯键。人们发现3′末端具有磷酸二酯键的寡核苷酸在与成纤维细胞衰老有关的刺激反应中是最有效的。因此，寡核苷酸3′末端的酶催化裂解可能是诱导衰老反应的一个步骤。
通过所述的寡核苷酸与(TTAGGG)n的最佳比对来测定序列的同一性。在每一位置上对序列进行比较，并在每一核苷酸位置上进行“匹配”或“不匹配”的测定，并且不考虑任一序列中的缺失或插入，匹配的百分比为沿着所述寡核苷酸计算的序列同一性的百分比。因此，通过图示，SEQ ID NO：5与(TTAGGG)n具有100％的序列同一性。SEQID NO：1与(TTAGGG)n具有5/9的序列同一性。SEQ ID NO：4与(TTAGGG)n具有3/5的序列同一性。pTT与(TTAGGG)n具有100％的序列同源性。
具有抗增殖作用因此适用于在方法中来减少哺乳动物中细胞增殖的特定分子的实例为寡核苷酸胸腺嘧啶二核苷酸(“pTpT”或“pTT”或“T2”)和pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
本发明的另一部分是促进哺乳动物中恶性细胞分化的方法，该方法包括将有效量的含有一种或多种寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物，其中的寡核苷酸与(TTAGGG)n具有至少50％的核苷酸序列同一性。分化状态可在许多方面被认为是恶性状态的相反状态。取决于细胞的类型，分化可涉及许多不同基因的表达调控从而导致特定的酶活性或细胞表面蛋白的增加或减少。例如，黑色素细胞对寡核苷酸的应答伴随着酪氨酸酶表达的增加。
在这里，已经发现了在癌细胞的生长抑制和分化细胞而非癌细胞的细胞表面典型抗原的增加之间的关联，其中癌细胞的生长抑制是由吸收了与端粒重复序列具有序列同一性的寡核苷酸的细胞而引起的。
因此，本发明进一步的方法是增强一种或多种显示哺乳动物癌细胞分化的表面抗原的表达，所述方法包括将有效量的一种或多种所述的寡核苷酸给药于哺乳动物，例如，一种或多种与脊椎动物端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸。
这些细胞对更分化状态的诱导，或赋予一种或多种分化的特性，可被利用在免疫治疗方法中。与分化状态相关联的表面抗原、其片段或从对于表面抗原的外暴露环的研究中获得的合成肽，可被整合到疫苗中以诱导癌症病人产生细胞毒素的T淋巴细胞来抵抗显示细胞表面抗原的细胞。例如，在黑色素瘤细胞中，当细胞吸收与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸时，在细胞表面上的细胞表面抗原MART-1、酪氨酸酶、TRP-1或gp-100或其组合增加了。参见实施例29。这些细胞表面抗原可以成为免疫治疗的靶，例如通过接种具有分离的细胞表面抗原或具有获自抗原表面环的氨基酸序列的肽。参见，例如，Jager，E.等，Int.J.Cancer 66：470-476，1996；Kawakami，Y.等，J.immunol.154：3961-3968，1995；以及de Vries，T.J.等，J.Pathol.193：13-20，2001。
根据利用反义寡核苷酸结合于酶的RNA部分的理论，端粒酶已成为抗增殖方法的一个靶。然而，可以采用在此处描述的治疗方法而不需考虑靶细胞中端粒酶的存在或功能。端粒重复突出端同源物pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)引起正常成纤维细胞和骨肉瘤细胞系Saos-2细胞中S-期细胞周期性停滞，所述的两种细胞中都没有端粒酶活性。参见实施例32和34。因此，对于癌细胞而言，其大多数具有端粒酶活性，但其中有一些没有端粒酶活性，本发明的方法可以被应用而不管是否具有端粒酶活性。癌细胞生长抑制的特征在于细胞周期停滞、细胞程序性死亡、和/或对更分化状态的分化。一种抑制哺乳动物(例如，人)中癌细胞生长的方法，其操作上与癌细胞的端粒酶(+)或端粒酶(-)的状态无关，是将有效量的包括一种或多种与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
实施例34中所描述的实验证明了野生型p53蛋白的功能对于引起使用与端粒重复序列具有至少50％序列同一性的寡核苷酸治疗的肿瘤或肿瘤细胞中的S-期细胞周期停滞也并非是必需的。p53-null骨肉瘤细胞系被显示通过在S期停滞对添加pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)产生应答。因此，可以使用抑制哺乳动物(例如，人)中癌细胞生长的方法而不论是否靶细胞具有正常的p53功能，该方法包括将有效量的包括一种或多种与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
本发明进一步地包括一种用于防止哺乳动物在暴露于紫外线后形成后遗症-海绵样水肿、水泡或角化异常或其任意组合的方法，所述方法将有效量的含有一种或多种与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。此方法的步骤还可以被用于减少人皮肤癌的发生率，尤其适用于降低具有着色性干皮病或其它皮肤癌遗传倾向性的病人出现皮肤癌。将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤的方法，也是一种增强紫外线照射-诱导皮肤损伤的修复的方法。此处描述的任意的寡核苷酸其特征在于与在人类中发现的端粒重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性--例如，寡核苷酸pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)、pCATAC(SEQ ID NO：6)、pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)、pGGGTTAGGGTT(SEQ ID NO：13)或pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)可用于该方法中。此外，寡核苷酸pTT和pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)也可用于所述方法中。
氧化性损伤的特征为在具有活性氧物质诸如过氧化氢、羟基和过氧化物的细胞中存在分子反应的反应产物。氧化性损伤可产生于，例如正常的细胞代谢、UVA照射、电离辐射或暴露于各种化学制剂。活性氧物质可以通过许多方式进行测定。一种测定方法使用探针二氯荧光素二乙酸酯(Molecular Probes，Inc.)，其是一种被细胞吸收的无色试剂并当被ROS氧化时成为发荧光的。荧光的水平与胞内的ROS水平相关联。
申请人也描述了用于降低哺乳动物氧化性损伤的方法，所述方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于哺乳动物，尤其是施用于哺乳动物的皮肤。优选的实施方案为其中的寡核苷酸是pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。pTT在该方法也是有效的。参见实施例15，21，22，23和52的结果，表明寡核苷酸治疗增强了细胞对氧化性DNA损伤的修复能力。
申请人此外描述了一种用于治疗哺乳动物中黑色素瘤的方法，包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。在特定情况下，寡核苷酸可以是pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)；pTT也可用于所述方法中。申请人在小鼠模型中显示了寡核苷酸治疗人黑色素瘤细胞的效果。参见实施例30，49，50和51。
在本发明的另一个方面涉及一种降低人皮肤中角质细胞增殖的方法，其中所述方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。所述方法适用于皮肤病，皮肤病的特征在于皮肤中的角质细胞增殖，诸如脂溢性角化病、光化性角化病、博文氏病、鳞状细胞性癌或皮肤基底细胞癌。pTT在该方法中是有效的。
本发明包括治疗哺乳动物中的疾病的方法，其中疾病的特征为细胞的不正常增殖，包括但不限于癌症、固体肿瘤、血源性肿瘤(例如，白血病)、肿瘤转移、良性肿瘤(例如血管瘤、听觉神经瘤、神经纤维瘤、粒性结膜炎和脓性肉芽肿)以及牛皮癣。过度增殖失调的特征还在于成纤维细胞的过量或异常激发，诸如硬皮病，以及增殖性关节炎癜痕(即，瘢痕瘤)。
用于治疗来减轻过度增殖失调诸如癌症的寡核苷酸可被用于组合物中与药学上或生理上可接受的载体相组合。此类组合物也可另外含有稀释剂、填料、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂及其它本领域公知的物质。阳离子型脂质诸如DOTAP[N-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵盐可与寡核苷酸一起使用来增强稳定性。寡核苷酸可以与PLGA/PLA共聚物、壳聚糖或延胡索酸/癸二酸共聚物形成复合体来提高生物利用率{其中PLGA是[聚(丙交酯-共-乙交酯)]；PLA是聚(L-丙交酯)}。术语“药学上可接受的”以及“生理上可接受的”是指一种无毒的物质，其不干扰活性成分的生物活性的效力。载体的特性将取决于给药的途径。
用于抗增殖药物的组合物可以进一步地含有其它能增强寡核苷酸活性或与其活性或治疗中的用途互补的药物，诸如化学治疗的药物或放射性的药物。这些附加的因子和/或药物可被包含在组合物中来与寡核苷酸产生协同效应，或使副作用最小化。另外，本发明组合物的给药可以与其它的治疗方法同时给药，例如，与化学疗法或放射治疗处方共同给药。
此处描述的寡核苷酸可以与其它的组合物和方法结合来用于疾病的治疗。例如，肿瘤通常通过传统的外科、放射、化学疗法或免疫治疗与寡核苷酸治疗相结合进行治疗，然后将寡核苷酸给药于病人来延长微小转移的休眠期并稳定和抑制任何残余的原代肿瘤的生长。
本发明的组合物可以为脂质体的形式，其中除其它药学上可接受的载体之外，寡核苷酸与两亲性药物诸如以聚集形式如胶束、不溶性单分子层、液态结晶或水溶液中的薄片层形式存在的脂类相结合。合适的用于脂质体制剂的脂类包括但不限于甘油一酯、甘油二酯、硫脑苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、胆汁酸等。
药物组合物可以含有用于抗增殖治疗的寡核苷酸。这些药物组合物的给药可通过本领域的普通技术人员公知的各种常规的方式来进行，诸如口腔吞咽、吸入，例如气雾剂的吸入、局部或皮肤施用、或颅内、脑内、阴道内、子宫内、口腔、直肠或非肠道的给药(例如，静脉内、脊柱内的、皮下的或肌内的)途径，或皮肤的、皮下的、腹膜内的、非肠道或静脉注射的途径。给药途径可以根据肿瘤的位点、生长或要靶向的损伤来决定。
为了将包括有效量的一种或多种寡核苷酸的组合物传递到生长或肿瘤的位点，可以使用直接的位点注射。可选择地，对于易受影响的粘膜位点而言，可以通过弹道传递、涂敷寡核苷酸到微米直径的磁珠上或通过口内的喷射注入装置来进行。
在基因治疗中用于传递DNA的病毒载体已经成为多年来研究的主题。逆转录病毒、腺病毒、与腺相关的病毒、牛痘病毒以及植物特异性病毒可被用作系统来包装并传递用于癌症或其它肿瘤治疗的寡核苷酸。腺相关病毒载体已被改进得无法复制，但仍保留侵染细胞的能力。其优点是低免疫原性，允许重复给药。传递系统已被综述在，例如，Page，D.T.和S.Cudmore，Drug Discovery Today 6：92-1010，2001中。
人们利用寡核苷酸进行对其抑制目的核酸(反义寡核苷酸)功能的理论的研究，这些研究中大多数是用硫代磷酸寡核苷酸进行的，发现了有效的传递到靶细胞的方法。在临床试验中，反义寡核苷酸在盐水溶液中给药而无需特定的传递载体(综述在Hogrefe，R.I.的Antisense and Nucleic Acid Drug Development 9：351-357，1999中)。
适于非肠道给药的制剂包括含水的和无水的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和能使制剂与目的预定的接受者的体液等渗的溶质；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的含水的和无水的无菌悬浮液。制剂可存在于单位-剂量或多-剂量容器中，例如，密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，仅刚好在使用之前需添加无菌液体载体例如注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可通过上述的无菌粉末、颗粒和片剂来配制。优选的用于静脉内的、皮肤的或皮下注射的药物组合物应含有，除本发明的寡核苷酸之外，等渗的载体诸如氯化钠注射液、Ringer′s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸盐的Ringer′s注射液或其它的本领域已知的载体。本发明的药物组合物也可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或其它本领域技术人员公知的添加剂。
定时释放或持续释放的传递系统的应用也包括在本发明中。这种系统在外科手术是困难的或不可能的情况下，例如，在因衰老或疾病过程本身导致虚弱的病人，或其中危险-益处分析显示控制大于治愈的情况下是非常需要的。一种方法是利用可植入的泵在一段时间内来传递测定剂量的制剂，例如，在肿瘤的位点处。
持续-释放的基质可被用作含有寡核苷酸的药物组合物的传递方法，尤其是用于生长或肿瘤的局部治疗。它是一种由材料，通常为聚合物制成的基质，其是可被酶催化或酸/碱水解或可被溶解而降解的。一旦被插入到身体中，基质被酶和体液作用。理想的持续释放的基质选自生物相容性的材料诸如脂质体、聚交酯(聚乳酸)、聚糖脂(羟基乙酸的聚合物)、聚交酯共乙交酯(乳酸和羟基乙酸的共-聚合物)聚酐、聚(正)酯、多蛋白、透明质酸、骨胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅树脂。优选的生物可降解的基质为聚交酯、聚糖脂或聚交酯共乙交酯(乳酸和羟基乙酸的共-聚合物)中的一种。
在本发明的药物组合物中的本发明寡核苷酸的量取决于所治疗病征的特性和严重程度，以及进行治疗前病人的特性。对病人而言，主治医师将决定用本发明寡核苷酸来治疗每一个体病人的寡核苷酸的剂量，主治医师可给药低的剂量并观察病人的反应。可给药较大的剂量直至该病人获得最佳的治疗作用，并且在这时剂量不再进一步地增加。使用本发明的药物组合物进行治疗的持续时间，将依据待治疗疾病的严重性以及每一个体患者的状况和可能的特殊反应而变化。
通过下面的非限制性的实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例
实施例1：应用于人鳞状癌细胞
人鳞状癌细胞系SCC12F细胞培养在原代角质化细胞培养基(300ml DME、100ml F-12培养基、50ml 10x腺嘌呤、50ml胎牛血清、5ml青霉素/链霉素原液以及0.5ml的10μg/ml表皮生长因子和终浓度1.4μg/ml的氢化可的松)中，并用水(稀释剂)、100μM pTpT(T2，Midland Certified Reagent Company，Midland，TX)或者100μM pdApdA(A2)进行给药。给药前(第0天)以及给药后第1，3，4和5天收集细胞并用CoulterTM计数器计数。收集以后，分离细胞的总RNA并通过Northern印迹进行分析。如图1所示向人鳞状癌细胞中添加pTpT引起细胞生长率的显著降低。添加对照脱氧腺嘌呤二核苷酸(pdApdA)没有影响，所述pdApdA是一种非常类似于pTpT的化合物，并且不容易由紫外线照射二聚化，因此在UV-诱导DNA修复的过程中很少被切除。
在第二个实验中，如上所述培养SCC12F细胞。
接种两三天后，给预融合培养物提供添加有100μM T2或者作为对照的稀释剂的新鲜培养基。每日通过胰蛋白酶消化收集细胞并用计数器计数。5天后与相对的对照培养物相比，用T2处理的培养物中的细胞产率减少了75％(图2)。这相当于与T2处理的细胞倍增相比，本实验中对照细胞为原来的2.3倍。这些结果进一步说明施加T2 DNA片段抑制了细胞增殖，包括癌细胞的增殖。
在第三个实验中，证实了添加T2到人鳞状癌细胞24-72小时引起至少三种基因的上调节：生长抑制和DNA损伤(GADD 45)、源于衰老的抑制剂(Sdi I)，以及切除修复交叉-互补(ERCC-3)。将成对的SCC12F细胞的培养物培养在Dulbecco′s改性的基于伊格尔培养基的角质化细胞生长培养基(DMEM；GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)中，所述培养基补充有10％胎牛血清(Hyclone Labs，Logan，UT)以及表皮生长因子(Hollander，M.C.等人，J.Biol.Chem.268：328-336(1992))。预融合的培养物中添加补充了100μM T2或者等量稀释剂的新鲜培养基。
添加后每日收集细胞，并根据厂商的说明书利用Tri-Reagent提取法分离总RNA(Molecular Research Center，Cincimiati，OH)。将10微克每个样品的RNA进行凝胶电泳，转移到尼龙滤光器并如前所述标记探针(Nada，A.等，Exp.Cell Res.211：90-98(1994))。利用基于人GADD 45基因序列的引物由PCR产生GADD 45的cDNA(Mitsudomi，T.等人，Oncogene 7：171-180(1992))。ERCC 3的cDNA购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。SDI 1 cDNA由J.Smith博士赠送并先前已经描述过(Walworth，N.C.和Bernard，R，Science 271：353-356(1996))。
与稀释剂对照相比，在T2-处理的细胞中早在24小时时GADD 45、ERCC 3和SDI 1的mRNAs就已经上调节并持续升高几天。添加对照A2诱导这些基因的效果较差或无效。在S91黑素瘤细胞和正常人成纤维细胞的实验中已经获得了类似的数据。
诱导的时间过程类似于已经研究过的两个基因[GADD 45和p21(也称作Sdi I)]并且还类似于黑素细胞和黑素瘤细胞中T2诱导酪氨酸酶基因的时间过程。已知Sdi 1参与细胞周期调节并具体地参与阻断细胞分裂。GADD 45和ERCC-3-一种人DNA修复酶，已知参与UV-诱导的DNA损伤的修复。对T2的反应与紫外线照射这些细胞系后观察到的结果相同，并且也类似于对诸如氨甲蝶呤的各种抗代谢物的反应，所述抗代谢物在治疗过度增殖性皮肤失调中具有临床效果。
实施例2：应用于人宫颈癌细胞
将人宫颈癌细胞(HeLa细胞)培养在DME+10％小牛血清中并添加水(稀释剂)或者100μM T2。给药1、4和6天后收集细胞并用CoulterTM计数器计数。如图3所示，向人宫颈癌细胞添加T2引起细胞生长率的显著降低。
实施例3：应用于人黑素瘤细胞
人黑素瘤细胞系CRL1424，Malma，Sk Me12和Sk Mel 28从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。将细胞系培养在DME+2％小牛血清中，并添加含有DME的水(稀释剂)溶液或者DME中的100μM T2。给药后一个星期，收集细胞并用Coulter计数器计数。
如图4所示，向四种不同的人黑素瘤细胞系中的任意一种中添加T2引起细胞产率的显著降低。
实施例4：应用于人角质化细胞
如实施例1对于SCC12F细胞培养的描述，培养正常人的新生角质化细胞，并用100μM T2或者作为对照的稀释剂进行处理。收集细胞用于细胞计数。3天后用T2处理的培养物中的细胞产率与成对的对照培养物相比减少了63％(图5)。这对应于此时对照细胞的数量翻了1倍，而T2-处理的细胞数保持不变。这些结果说明施加DNA片段抑制了细胞增殖。
用T224-72小时处理的正常人角质化细胞的Northern印迹分析显示对肿瘤坏死因子α基因(TNFα)的诱导。因此已知UV照射诱导的免疫诱导细胞因子可以受T2诱导。局部施用DNA片段、脱氧核苷酸、二核苷酸或二核苷酸二聚物可用于皮肤反应的免疫调节和治疗或预防疾病或病征中。
实施例5：由DNA片段抑制正常的新生的成纤维细胞的细胞生长
正常人新生的成纤维细胞以9×104细胞/平皿的密度铺板在FalconP35培养皿中。培养基是DME+10％小牛血清，每平板2ml。铺板1天后，给培养物补充100μM T2的DME溶液或100μMA2的DME溶液或水(对照)。在添加以给出开始或“第0天”读数前收集两个平板并计数。在添加补充物并确定细胞数之后，在5天中收集每个条件下的两个平皿。所有的细胞计数都通过CoulterTM计数器进行。两个实验的结果显示在图6和7中。结果显示DNA片段的施加抑制了细胞增殖。在第二个试验中，并如实施例1对于SCC12F细胞一样将正常人新生的成纤维细胞铺板进行培养。给培养物添加以100μM T2或水(对照物)，并收集细胞用于细胞计数。3天后，用T2处理的成纤维细胞培养物中的细胞产率与成对的对照培养物相比减少了40％(图8)。
与T2处理细胞的3.6倍相比，这相当于对照细胞群体倍增的4倍。这些结果进一步说明将目的细胞与本发明的DNA片段接触抑制了细胞增殖。
实施例6：施加pTpT对表皮细胞增殖的影响
豚鼠每日接受一次或者两次局部施用100μM pTpT或作为对照的单独的载体共3天。在第4天，获得打孔活组织并在原代角质化细胞培养基中培养7或8小时，所述培养基补充有10μCi/ml3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(比活性为9.0Ci/m mole，NEN)。期望增殖细胞以便把3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入新合成的DNA中。然后用冷培养基清洗组织并在10％磷酸缓冲的福尔马林中固定。在一系列脱水步骤后，将组织包埋在石蜡中。切割成6μm的切片并固定在载玻片上，浸泡在NTB-2核示踪乳剂中并在4℃黑暗条件下保存7天。在柯达D-19显影剂中对切片显色并用苏木精和曙红染色。通过计算100个基底角质化细胞中标记核的百分比来测定标记指数、DNA复制以及细胞增殖的测量值。结果显示在表1中。
                     表1
                     标记指数
                     每日施用2次
载体对照                                 pTpT
4±1.4                                   1.5±0.7
                     每日施用1次
载体对照                                 pTpT
4.5±2.1                                 2±0
显示了平均值±SD。
在两个实验中，pTpT-处理的皮肤中的标记指数(表皮细胞增殖的测量值)小于载体-处理的皮肤的标记指数(p＜0.03成对t检验)。
这些结果进一步说明将目的细胞与本发明的DNA片段接触抑制了细胞增殖。
实施例7：p53在DNA修复中的作用
已知GADD 45和SDI 1基因由肿瘤抑制剂蛋白质p53进行转录调节。在UV-和γ射线照射后，以及用损伤DNA的化学试剂处理细胞后，p53快速地稳定化、磷酸化以及核累积，随后这种蛋白结合到特异性的启动子共有序列并调控调节基因的转录。最近的数据表明p53还可以由小的单链DNA以及某些肽和抗体与这种蛋白的羧基末端结构域的结合而进行活化。为了确定二核苷酸pTpT对细胞增殖的抑制作用是否部分地通过p53介导，检测了p53裸细胞系、H1299肺癌细胞的生长应答。将p53-null H1299细胞(Sanchez，Y.等，Scierace 271：357-360(1996))培养在具有10％小牛血清的DMEM中。向预汇合的培养物中添加补充有100μM pTpT或者稀释剂的新鲜培养基。连续多日通过胰蛋白酶消化作用收集细胞，并通过CoulterTM计数器对细胞计数。如图9所示，与稀释剂处理的对照物相比对pTpT-处理的H1299细胞的增殖没有抑制作用。
在另一实验中，发现pTpT以依赖于p53的方式诱导SDI1mRNA的表达。将H1299细胞的预融合培养物用含有野生型人p53cDNA的表达载体在人巨细胞病毒启动子/增强子的控制下进行转染(BertVogelstein博士，Johns Hopkins Oncology Center)。利用除去p53cDNA的载体进行对照转染。转染利用Lipofectin试剂盒(GIBCO/BRL)来进行。
转染后一天，如前所述(Yasr，M.J.Clin.Invest.94：1550-1562(1994))利用20μg总蛋白收集细胞进行Western印迹分析。利用mAb 421、与辣根过氧化酶连接的抗小鼠Ig(Amersham，ArlingtonHeights，IL)以及ECL-试剂盒(Amersham)参照厂商的说明书检测p53。收集蛋白时，给用p53表达载体(称为″p53″)或对照载体(″Ctrl″)转染的H1299细胞的两份培养物提供稀释剂(DMEM)或者100μM pTpT。24小时后，收集细胞，进行RNA分离并用SDI 1cDNA探针进行Northern印迹分析。利用Macintosh IIsi计算机和Macintosh One扫描仪扫描放射自显影照片，调节光亮度和对比度以最大限度地显示放射自显影照片的信号。结果显示p53-null H1299细胞表示非常低水平的SDI 1转录本并且这个水平不受添加pTpT的影响。用野生型p53表达载体转染这些细胞增强了SDI 1的水平并且使这种转录本可以受到添加pTpT的诱导。Western分析证实H1299细胞通常不表达p53而且转染的H1299细胞表示高水平的p53。这些数据显示pTpT增加了p53的转录活性。
在正常新生的成纤维细胞中pTpT对p53的水平和胞内分布的影响通过利用p53特异性单克隆抗体(mAb 421，Oncogene，Cambridge，MA)的免疫过氧化物酶染色进行检测。
在细胞染色以前，预融合培养物用100μM的pTpT或者稀释剂处理24小时。首先将细胞固定在Histochoice固定剂(Amresco，Solon，OH)中1分钟，继之以用PBS漂洗5-分钟。利用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)以及p53-特异性单克隆抗体mAb 421检测p53。在24小时以内，与稀释剂-处理的细胞相比，在pTpT-处理的细胞中检测到细胞核内p53的增加，类似于已经报道的紫外线照射后的情况。这些结果与成纤维细胞中以及SCC12F细胞中pTpT对p53-调节的基因GADD 45和SDI1(p21)的诱导一致。
实施例8：DNA修复的增强
以前显示，在SV40启动子和增强子序列控制下的含有细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的UV-损伤报告质粒的表达能检测人淋巴细胞中与衰老和早期-出现的皮肤癌相关的DNA修复能力的降低。这种报告质粒被用于测定由正常新生的人皮肤衍生的成纤维细胞和角质化细胞的DNA的修复能力。
如前所述，利用Rheinwald和Green的改良的方法(Gilchrest，B.A.等，J.Invest.Dermcltol.101：666-672(1993))从新生儿构建角质化细胞(Stanulis-Praeger，B.M.和Gilchrest，B.A.，J；Cell.Physiol.139：116-124(1989))。将第一代角质化细胞培养在非分化的低Ca2+培养基中(K-Stim，Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，MA)。如前所述从皮肤外植体构建成纤维细胞(Rheinwald，J.G.和Green，J.Cell 6：331-343(1975))并培养在补充有10％牛血清的DMEM中。在转染前用100μM pTpT或等量的稀释剂(DMEM)处理细胞5天。利用Lipofectin Kit(GIBCO/BRL)和5μg报告DNA、pCAT-对照载体(Promega，Madison，WI)对在每个条件下培养的倍增培养物进行转染。在转染以前，载体DNA被假照射或者如前所述(Yaar，M.等，J.Invest.Dermatol.85：70-74(1985))暴露于来自1KW氙电弧太阳模拟器(XMN 1000-21，OpticalRadiation，Azuza，CA)的100mJ/cm2UVB辐射，利用研究辐射计(IL1700A International Light，Newburyport，MA)设定在285+5纳米。转染后24小时根据厂商提供的方案将细胞收集在提供于CAT酶活性测定系统(Promega，Madison，WI)的消化缓冲液中。利用液体闪烁计数方案和分析系统试剂盒的组分测定CAT酶活性。标记的氯霉素[50-60mCl(1.85-2.22GBq)mmol]购自New England Nuclear(Boston，MA)。细胞提取物中的蛋白浓度由Bradford(Anal.Biochem.72：248(1986))的方法进行确定。CAT活性可以表示为c.p.m./100μg蛋白并由用假辐射的非损伤质粒转染的细胞的百分比活性表示。
在初步试验中，在转染之前将质粒暴露于一定剂量的模拟太阳的照射(100mJ/cm2，在285nm处测定)被鉴定为导致与被转染到成对培养物中的假辐射的质粒相比，在转染后16-24小时在细胞裂解物中分析的CAT活性减少大约75％。然而，转染前用100μM pTpT预处理5天的角质化细胞(图10)和成纤维细胞(图11)显示的CAT活性比假辐射的转染的对照高50％。因为报告质粒是非复制的，所以CAT的活性水平直接反映了对UV-损伤的CAT基因的DNA修复恢复其生物活性的程度。这些数据指示在24小时的时间段内，pTpT对正常人成纤维细胞和角质化细胞的处理比细胞修复UV-诱导的DNA损伤的细胞能力的两倍还多。在pTpT-处理的细胞中UV-辐射的质粒表达量的提高没有引起这些细胞中质粒转录的总体增加，因为假辐射的质粒的表达不高于非pTpT处理的细胞。
实施例9：p53的激活和苯并[a]嵌二萘DNA加合物的修复细胞培养。
利用Rheinwald和Green的方法(Cell 6：331-343(1975))的改良(Stanislus等，J.Invest.Dermatol.90：749-754(1998))建立新生儿人角质化细胞。将第一代角质化细胞培养在低浓度钙离子(K-Stim，Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)的非分化培养基中。将p53-null H1299肺癌细胞系(美国典型培养物保藏中心，ATCC，Rockville，MD)培养在补充有10％牛血清(HycloneLabs，Logan，UT)的Dulbecco改性的伊格尔培养基中(DMEM；GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)。
用p53表达载体转染H1299细胞。
将H1299细胞的预融合培养物用含有野生型人p53cDNA的表达载体在人巨细胞病毒启动子/增强子的控制下进行转染(Bert Vogelstein博士，Johns Hopkins Oncology Center)。利用缺失p53cDNA的相同载体进行对照转染。如前所述进行转染。
转染后一天，如前所述收集细胞利用20μg总蛋白用于western印迹。利用已知用于检测蛋白活性和无活性形式(Oncogene，Cambridge，MA)的单克隆抗体DO-1(Ab-6)与辣根过氧化酶连接的抗小鼠Ig(Amersham，Arlington Heights，IL)和ECL-试剂盒(Amersham)根据厂商的说明书测定p53。
利用hGH报告质粒分析p53。
根据厂商的说明书，用人生长激素(hGH)报告质粒(pPG-GH)，利用Lipofectamine试剂盒(GIBCO/BRL)和加入到每个p35培养皿的0.5μg pPG-GH转染正常人角质化细胞。pPG-GH含有胸苷激酶(TK)启动子控制下的hGH编码区和p53共有序列，并且已知hGH蛋白质的产生与p53活性(Kemet等，1992)成正比。在存在100μM pTpT(MidlandCertified Reagent Company，Midland，TX)或等量稀释剂的情况下进行转染。同时，对PSV-p-半乳糖苷酶对照载体(Promega，Madison，WI)进行共转染以确定转染效率(Norton和Coffin，1985)。
在转染后4小时，除去培养基并用含有或者不含有100μM pTpT的K-Stim培养基替换。如前所述，在转染并用pTpT处理后24小时，从每个35mm培养皿收集400μl的培养基，并加入100μl的125I-hGH抗体溶液(Nichols institute Diagnostics，San Juan Capistrano，CA)以检测分泌的hGH。利用厂商的方案将细胞收集在报告裂解缓冲液中(Promega)，利用β-半乳糖苷酶分析试剂盒(Promega)对这种150μl的溶解产物进行β-半乳糖苷酶分析。分析三份培养皿中的每一样品中hGH和β-半乳糖苷酶的合成。
同样用p53表达载体或对照载体转染H1299细胞。在这些细胞转染后2天用pPG-GH和PSV-β-半乳糖苷酶对照载体进行共转染，并用100pM pTpT处理。24小时后，如上所述收集250μl的培养基和细胞裂解物并进行分析。
CAT分析。
如前所述(Athas等人，Cancer Res 1991)，用苯并[a]嵌二萘-7，8-二醇-9，10-环氧化物(BP)处理pCAT载体(Promega)以产生较少损伤和更多损伤的质粒，这些质粒从前被证明对于检验人细胞中不同修复能力的研究具有指导作用。根据将3H-BPDE掺入DNA中，较少损伤的质粒含有25个加合物/每5kb质粒并且更多损伤的质粒含有50个加合物。非复制载体含有SV40启动子以及增强子序列控制下的氯霉素乙酰转移酶基因。将人角质化细胞和p53-转染的H1299细胞用100μM pTpT或单独的等量稀释剂(DMEM)预处理48小时，然后用BP-改性的pCAT-对照载体(0.5μg/ml)或者改性的载体(0.5μg/ml)连同PSV-β-半乳糖苷酶对照载体(0.5μg/ml)转染。转染后24小时将细胞收集在报告裂解缓冲液(Promega)中。利用液体闪烁计数方案和分析系统试剂盒(Promega)的组分确定CAT酶活性。14C-标记的氯霉素[50-60mCi(1.85-2.22GBq)/mmol]购自New England Nuclear(Boston，MA)。用半乳糖苷酶活性将CAT活性标准化。
Western印迹分析。
用100μM pTpT或单独的等量稀释剂处理细胞48小时。将总细胞的蛋白收集在由0.25M Tris HCl(pH7.5)、0.375M NaCl、2.5％脱氧胆酸钠、1％Triton X-100、25mM MgCl2、1mM苯甲基磺酰氟化以及0.1mg/ml抑蛋白酶肽组成的缓冲液中。由7.5-15％SDS PAGE分离蛋白(每个样品100μg)并转移到硝酸纤维薄膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上。转移后，用考马斯亮蓝对凝胶染色以检验通过残余的高分子量蛋白观察到的均匀负载。将薄膜在含有5％乳液的0.05％Tween-20/PBS(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中封闭。利用下列抗体进行抗体反应：抗p53(AB-6)、抗PCNA(Ab-2)(Oncogene Science)以及抗XPA(FL-273)(Santa CruzBiotechnology)。与辣根过氧化酶连接的绵羊抗小鼠Ig(Amersham，Arlington Heights，IL)(p53和PCNA的抗体)以及山羊抗-兔IgG(Bio-Rad)(对于XPA)被用作次级抗体。由ECL检测试剂盒测定结合(Amersham)。
为了测定BP DNA加合物的修复，将含有细菌氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的非复制BP-损伤的报告质粒系统如实施例8进行应用。由共转染β-半乳糖苷酶表达载体测定的第一代人角质化细胞的转染效率为40-70％。与稀释剂处理的细胞相比，当用较少BP-损伤(-25加合物/质粒)或者较多BP-损伤(～50加合物/质粒)的载体转染时，用pTpT处理的人角质化细胞显示了相对于用未受损伤的对照物CAT载体转染的成对培养物约计两倍的CAT表达量。
在第二个分析中，为了证实pTpT对p53的激活，使用了在p53可诱导的启动子影响下的表达人生长激素(hGH)基因的报告质粒。对p53的激活增加了其与质粒中共有序列的结合，引起hGH编码序列的转录作用并最终将hGH分泌到培养基中。与稀释剂处理的细胞相比pTpT-处理的人角质化细胞分泌的hGH增加了45％±25％。这些数据显示pTpT激活正常人角质化细胞中以及p53-转染的H1299细胞中的p53。
为了证实pTpT加强对BP-DNA加合物的修复，通过p53激活，将至少部分p53-null H1299细胞用p53表达载体转染，并在转染后48小时通过western印迹分析证实p53蛋白表达。在p53+H1299细胞中，修复可以与正常角质化细胞中观察到的修复相当；而且含有低水平BP损伤的质粒修复80％±50％，pTpT-预处理的细胞比稀释剂预处理的细胞更有效；并且含有高水平BP损伤的质粒修复效率高3倍。然而在p53-H1299细胞中，在两个处理组中修复能力相同。这些数据证明了通过pTpT增强的BP-DNA加合物的修复涉及p53。
用p53-应答的-hGH瞬时转染的H1299细胞中pTpT对p53的激活与稀释剂-处理的细胞相比导致hGH分泌增加40％。这些数据进一步地说明pTpT通过加强与其DNA共有序列的结合而增强p53的转录活性。
Western印迹分析被用于检验pTpT处理对已知参与DNA修复的选择的基因的表达的影响。收集细胞蛋白前，将正常人角质化细胞用pTpT处理2天。在处理2天内pTpT把p53、PCNA和XPA蛋白的水平上调2到3-倍。
实施例10：对鼠模型中接触超敏反应的免疫抑制以及抑制。
用变态反应原DNFB进行致敏作用前对C57B16小鼠施用如下处理：局部施用腹部皮肤；没有预处理，UVB照射(200J/m2/d×4d)，pTpT、pApA或单独的载体(30μl的100μM BID×5d)。与未处理或载体处理的动物相比(4.3±0.6以及3.3±0.2)，用UVB或pTpT预先处理的小鼠显示了对DNFB攻击应答(0.6±0.2以及0.9±0.3)的受到显著抑制的耳朵肿胀，而pApA-处理的小鼠显示出中等程度的应答(2.5±0.6)。
利用人角质化细胞在体外试验pTpT的免疫调节作用。用pTpT、稀释剂或UVB照射(200J/m2)或假照射处理原代人角质化细胞的倍增培养物。处理后在不同的时间点收集细胞并由ELISA分析IL-10蛋白以及由RT-PCR分析IL-10 mRNA。6小时后在辐射的细胞中以及48小时后在pTpT处理的细胞中测定IL-10 mRNA的增加。照射后24小时测定到IL-10蛋白增加18pg/ml并且用pTpT处理72小时后增加15±2pg/ml。上述的工作已经证明了IL-10对异源的混合淋巴细胞反应(MLR)分析的功能性抑制。在异源MLR中，通过3H-胸苷掺入测定将T细胞激活测量为淋巴细胞增殖。通过加入＞10kD的组分(含有18kDIL-10蛋白)测定来自72小时pTpT样品的培养基的IL-10活性。与来自稀释剂-处理的对照培养物的8％+3抑制相比，证明T细胞增殖减少80±5％。因此与UVB照射相似，pTpT诱导人角质化细胞中的IL-10，所述IL-10很可能与TNFα合作以抑制pTpT处理的皮肤中的接触超敏反应。
在另一个实验中，通过利用携带CAT报告转基因的小鼠测定TNFα基因的活化，所述的报告转基因含有全部的TNFα启动子以及3′-非翻译区。在进行用于分析CAT表达的皮肤测试前对转基因小鼠进行下列处理：UVB照射(200-700J/m2)，皮内注射pTpT(100μM)；脂多糖(LPS 1μg/ml)作为阳性对照，或单独的载体。在用UVB、LPS或pTpT处理(而非用单独的介质)的皮肤内检测CAT活性。
实施例11：寡核苷酸依赖的模拟UV的活性：
黑色素生成以及p21/Waf1/Cip1表达
检验了由5-核苷酸寡聚物CATAC(SEQ ID NO：6)以及9-核苷酸低聚物，GAGTATGAG(SEQ ID NO：1)诱导的Cloudman S91小鼠黑色素瘤细胞中黑色素的生成。将两份Cloudman S91鼠科黑色素瘤细胞与100μM寡核苷酸或者等量稀释剂(H2O)一起温育5天。然后收集细胞，计数，并将等量的细胞做成片状用于黑色素分析。在三个试验中，用9-聚体，5-聚体以及pTpT一起温育后色素含量分别比对照物水平增加418％±267％，61％±60％以及155％±60％。9-聚体，而非5-聚体也激化人黑色素细胞中的黑色素生成，一周后培养物中黑色素生成增加51-62％。评价这种低聚核苷酸的变化：不规则的9-聚体(TAGGAGGAT；SEQ ID NO：2)以及2种平截形式，一种7-聚体(AGTATGA；SEQ ID NO：3)以及第二种5-聚体(GTATG；SEQ ID NO：4)。两种9-聚体都同样是活化的，诱导黑色素含量增加800％。
平截形式(SEQ ID NOs：3和4)也是活性的，分别诱导增加640％和670％。对于pTpT而言，SEQ ID NO：1(9-聚体)寡核苷酸，而非SEQ ID NO：6(5-聚体)在48小时内诱导鳞状细胞癌系中p21/Waf1/Cip1基因的表达，与pTpT增加100-150％相比，这种mRNA的水平增加200-300％。
同时，这些数据显示寡核苷酸pTpT的模拟UV的活性可以很迅速地被其它寡核苷酸加倍。
实施例12：黑色素生成
用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、作为阳性对照的pTpT或作为阴性对照的等量稀释剂处理Cloudman S91鼠科黑色素瘤细胞的培养物5天。在寡核苷酸处理后对S91细胞颗粒的分光光度分析显示pTpT处理的细胞的黑色素含量是对照细胞的255+/-60％。SEQ ID NO：6产生了黑色素的轻微增加，达到对照物水平的165+/-77％。SEQ ID NO：1将黑色素含量激发到对照物水平的平均600+/-260％。
如实施例11所述，将每个包括5′磷酸的寡核苷酸5′pGTTAGGGTTAG3′(SEQ ID NO：5)、5′pCTAACCCTAAC3′(SEQ ID NO：9)或5′pGATCGATCGAT3′(SEQ ID NO10)添加到Cloudman S91黑色素瘤细胞的培养物中。以前显示激活这些细胞中色素沉着的pTpT被用作参考处理，单独的稀释剂被用作阴性对照。用寡核苷酸处理5天后，收集细胞，计数，并将等量的细胞造粒用于黑色素分析。图17显示的数据证明10μM pTpT使黑色素含量比对照稀释剂-处理的细胞增加3倍。也在10μM浓度时表示端粒突出端的序列的SEQ ID NO：5使黑色素水平比对照细胞增加10倍。SEQ ID NO：9(端粒突出端的互补序列)和SEQ ID NO：10(不相关的序列)在浓度最高达10μM时不产生颜料成分的显著变化。包括TTAGGG(SEQ ID NO：11)的平截形式也是高度黑色素生成的，而反向的互补序列CCCTAA(SEQ ID NO：12)活性较低(图18)，其中两个寡核苷酸都含有5′磷酸。
试验本发明化合物的经皮感染和体内生成黑色素的活性。用荧光标记的pTpT或丙二醇中的SEQ ID NO：1(包括5′磷酸)处理小鼠4小时，然后对耳朵皮肤切片并通过共聚焦显微镜进行检测。用任一寡核苷酸处理引起表皮和毛囊的亮染色。因此pTpT和SEQ ID NO：1可相当地穿透皮肤屏障。
在另一实验中，每天用100μM pTpT或含有5′磷酸的SEQ ID NO：1的丙二醇溶液处理小鼠的一只耳朵1次，或用单独的载体处理小鼠的另一只耳朵。15天后，当对耳朵进行切片并用Fontana Masson染色以检测黑色素与介质对照相比，在pTpT-处理的耳朵中色素沉着增加70％并且SEQ ID NO：1处理的耳朵中色素沉着增加250％。因此，包含少至2并且多至9个核苷酸的两种化合物在体外产生模拟体内的UV效果中是有效的。
p53激活和细胞增殖
早先发现pTpT抑制细胞周期进展，至少部分地通过激活p53以及随后的对依赖于细胞周期素的激酶抑制剂p21的上调节进行。将人角质化细胞系SCC12F的培养物用pTpT、SEQID NO：1、SEQ ID NO：6或单独作为阴性对照的稀释剂处理，48小时后收集细胞并计数并进行p21 mRNA表达的Northern印迹分析。结果发现SEQ ID NO：1使p21mRNA的水平比稀释剂对照物的水平增加几乎3倍，而pTpT-处理的细胞显示出的p21mRNA水平为对照细胞的两倍(图13)。用SEQ ID NO：6处理的细胞显示的p21mRNA的水平增加10-20％。在这些成对的平皿中，2天后SEQ ID NO：1也使细胞数减少大约50％，而pTpT和SEQ ID NO：6分别引起40％和25％的减少(图14)。因此，本发明的序列激活p53并抑制细胞增殖类似于pTpT的影响。
大小和序列的影响
在单独的稀释剂、pTpT p9聚体(SEQ ID NO：1)、p7聚体(AGTATGA；SEQ ID NO：7)或p5聚体#2(SEQ ID NO：4)的存在下培养S91细胞。5天后，收集细胞，计数，并将等量的细胞造粒用于黑色素分析(图15)。pTpT引起黑色素含量的中度增加以及SEQ ID NO：1的大量增加。另外，SEQ ID NOS：4和7也显著地激发黑色素的生成。SEQ IDNOS：4和7都刺激黑色素增加7-8倍。因为一个p5聚体在诱导黑色素生产方面更有效(与SEQ ID NO：4和6的比较结果)，这些数据显示寡核苷酸序列在确定其黑色素生成活性中起一定作用。
用4-碱基序列GCAT的3个重复，继之以2个重复的TACG合成p20聚体(pGCATGCATGCATTACGTACG；SEQ ID NO：8)。带有内部pTpT的寡核苷酸TACG与在真核细胞中胸腺嘧啶二聚体的切除修复期间切除的27-29碱基片段类似。这种寡核苷酸激发的色素沉着两倍于对照细胞的水平(图16)。
5′磷酸化的影响
在存在胸腺嘧啶脱氧核苷二核苷酸或带有或者不带有5′磷酸的SEQ ID NO：1或者作为阴性对照的单独稀释剂存在的条件下培养S91细胞5天。移去5′磷酸显著地将pTpT的黑色素生成活性减小了80％以及将9聚体的黑色素生成活性减小了60％(双尾Student′s t-测验分别为：p＜0.04和p＜0.03，图16。这些数据与这些寡核苷酸的胞内活性位点与报道的高效的细胞吸收所需要的5′磷酸一致。
5′磷酸化增加了寡核苷酸的吸收。
将荧光素氨基亚磷酸(FAM)标记的寡核苷酸加入到S91细胞的培养物4小时，然后准备细胞进行共聚焦显微镜观察。用碘化丙啶将细胞核染色标记的核呈红色，FAM-标记的寡核苷酸呈绿色。用计算机将红色和绿色信号的共同的区域标记成黄色。带有5′磷酸的寡核苷酸比那些缺少这部分的寡核苷酸显示更高的细胞吸收。共焦显微镜没能检测到TpT的吸收和对这些细胞的荧光激活细胞分类术(FACS)分析，给出了类似于用未处理的细胞所看到的分布图。pTpT-处理的细胞在细胞质中显示出强烈的绿色荧光，但是只有少量的细胞核定位。
FACS分析显示与TpT-处理的细胞相比荧光强度峰的迁移，所述TpT处理的细胞是显示更强烈着色的细胞。同样，在SEQ ID NO：1的5′端处磷酸的存在大大加强了其吸收进入S91细胞中。没有5′磷酸化的SEQ ID NO：1仅仅显示中度的吸收并且主要定位在细胞质中，仅仅在一些细胞中具有微弱的核染色，而具有5′磷酸化的SEQ ID NO：1显示强烈定位于细胞核的强烈着色。
没有5′磷酸化的SEQ ID NO：1的FACS分析显示2个主要细胞群的广泛的着色强度，与共聚焦图像一致。含有磷酸化的SEQ ID NO：1的细胞也显示一定范围的着色强度，但是更多的细胞显示较高的荧光强度。用磷酸化的SEQ ID NO：8处理的细胞显示非常类似于通过共聚焦显微镜和FACS分析观察到的磷酸化的SEQ ID NO：1的结果，显示其在黑色素生成分析中的较低活性不能归于较差的吸收。这些数据显示S91细胞对这些寡核苷酸的吸收由于5′磷酸的存在而被大大促进，而且虽然与核活性位点一致，但是黑色素生成活性不只取决于核定位。
同样，虽然总的胞内荧光没有随着试验的DNAs中寡核苷酸长度的增加而显著增加，但是较大的寡核苷酸更容易聚集在细胞核中。在6和24小时以后，寡核苷酸的吸收分布图没有变化。
实施例13：寡核苷酸可以诱导细胞程序性死亡
将与端粒突出端重复序列(TTAGGG；SEQ ID NO：11)同源的寡核苷酸、与这个序列(11聚体-2：pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：9)互补的(11聚体-1：pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)以及与端粒序列(11聚体-3：pGATCGATCGAT；SEQ ID NO：10)不相关的序列加入到Jurkat细胞的培养物中，所述Jurkat细胞是人T细胞系，据报道应答端粒分裂的细胞类型之一经历了细胞程序性死亡。在48小时内，与对照细胞的25-30％聚集在S期相比用40μMSEQ ID NO：5处理的细胞的50％聚积在S期(p＜0.0003，非配对的T检验；参见图19A-19D)，到72小时，与对照的2-3％细胞程序性死亡相比，由sub-G0/G1 DNA含量确定，13％的这些细胞程序性死亡(p＜0.007，非配对的T检验；参见图19E-19H)。在第96小时，与对照的3-5％细胞程序性死亡相比，20±3％的11聚体处理的细胞程序性死亡(p＜0.0001，非对偶T检验)。为了排除11聚体的优先吸收作为对其单独作用的解释，用在3′端上用荧光素氨基亚磷酸标记的寡核苷酸处理Jurkat细胞，然后进行共聚焦显微观察并进行FACS分析。在所有处理后4小时和24小时，细胞的荧光强度是一样的。Western分析显示在添加11聚体-1而非11聚体-2或-3后24小时后p53增加，同时伴随着E2F1转录因子水平的增加，已知所述的E2F1转录因子与诱导细胞程序性死亡的p53合作并以依赖于p53的方式诱导人的成纤维细胞衰老表型以及调节S期关卡。
实施例14：活体内DNA片段对DNA突变频率的影响。
使用携带LacZ报告质粒的多基因组拷贝的转基因小鼠。每日将100μM的pTpT聚乙二醇溶液施加到一个耳朵并且将单独的载体施加到另一个耳朵，共4天。在第5天，将两只耳朵暴露于100mJ/cm2 UVB灯。一周一次重复这个过程共3、5或7周(3只小鼠/组)。在最终照射后1周，从耳朵表皮收集LacZ质粒。利用本领域公知的方法，从基因组DNA经过限制酶消化并特异性结合到Lad蛋白来回收质粒。经过转染到细菌中并在选择培养基上生长对突变株LacZ质粒进行阳性选择，并确定突变频率。3、5以及7周后，pTpT-处理的皮肤显示出比稀释剂处理的皮肤低20-30％的突变频率(分别为200对293、155对216以及261对322)。
这些数据显示pTpT-增强的DNA修复减小了体内UV-的诱变，而且表明了局部施用可用于降低暴露于致癌物质的人皮肤的突变率。
实施例15：DNA片段的抗氧化损伤的保护作用
用10μM pTpT或作为对照物的稀释剂处理原代新生儿的成纤维细胞3天，然后用5×10-5或5×10-4M H2O2处理。在H2O2暴露的72小时内，pTpT预处理的培养物的细胞产率分别比稀释剂预处理的对照样品高45±1％和139±5％。在暴露于低剂量H2O2后72小时，只有9.6±2.4％的稀释剂预处理的细胞幸存。相反，在5×10-4M H2O2下pTpT预处理使细胞的存活率增加2-9倍，而且在低剂量下赋于细胞完全的保护。Cu/Zn过氧化物歧化酶的mRNA水平，参与氧自由基淬灭的酶在pTpT处理后48和72小时增加了3倍以上，并在停止服用pTpT后(当实验终止时)保持升高至少24小时。
实施例16：寡核苷酸逆转了与衰老相关的DNA修复能力的下降
将来源于新生儿、青年人(25-35岁)和老年人(65-90岁)的人皮肤成纤维细胞(fb)用10μM pTpT或含有5′磷酸的SEQ ID NO：1或作为对照的稀释剂预处理24小时。然后用5、10和30m/cm2的紫外线照射样品。在UV照射后0时间点和24小时时收集DNA和蛋白。在组成型和UV-诱导的p53、p21、XPA、RPA ERCC/PF和PCNA的蛋白水平方面存在与衰老相关的降低。然而，在所有年龄组中，用寡核苷酸预处理引起这些蛋白的组成型和UV-诱导性水平上调200-400％。此外，胸腺嘧啶二聚体和(6-4)光化产品的特异性缝隙印迹分析显示在UV辐射后的第一个16小时内随DNA修复状态的衰老而显著降低。用寡核苷酸预处理使光化产品的去除而增加了30-60％。
实施例17：端粒突出端同源11聚体的硫代磷酸酯形式不诱导细胞的程序性死亡。
将Jurkat人T细胞的培养物用稀释剂、11聚体-1(SEQ ID NO：5)或者硫代磷酸酯11聚体-1(11聚体-1-S)处理96小时，然后收集细胞并用于FACS分析。试验两个浓度的寡核苷酸，0.4μM(图20A-20C)和40μM(图20D-20F)。在0.4μM浓度，两种中没有一种寡核苷酸影响所希望的Jurkat细胞的按指数规律生长的细胞周期图谱。在40μM时，11聚体-1诱导了由sub-Go/G1峰值显示的这些细胞的广泛的细胞程序性死亡，而11聚体-1-S没有影响。
实施例18：11聚体-1的硫代磷酸酯形式阻断由磷酸盐骨架11聚体-1诱导的S期停滞
仅仅用11聚体-1(SEQ ID NO：5)或用11聚体-1在逐渐增加浓度的11聚体-1-S的存在条件下处理角质化细胞的细胞系培养物(SSC12F，100,000个细胞/38cm2)48小时。如前面实施例13所示，11聚体-1诱导如FACS显示的S-期停滞(Becton-DickinsonFacScan)。与26％的对照物-稀释剂处理的细胞相比，43％的细胞处于S期。然而，当浓度逐渐增加的硫代磷酸酯11聚体1也被加入到这些培养物中时，有更少的细胞停滞(图21A-21G)。使用2∶1的11聚体1∶11聚体-1-S可以观察到完全抑制了停滞。11聚体1-S自身不诱导S-期停滞。
实施例19：端粒寡核苷酸的硫代磷酸酯形式降低组成型和UV诱导的色素沉着而且不刺激黑色素的生成
将S91小鼠黑色素瘤细胞的培养物(100,000个细胞/38cm2)用100μMpTpT或硫代磷酸酯pTpT(pTspT)(图22)或40μM11聚体-1或硫代磷酸酯11聚体-1(11聚体-1-S)处理6天，然后收集并计数，并且分析黑色素的含量。虽然pTpT和11聚体-1(分别为图22和图23)刺激这些细胞中的黑色素生成，但是pTspT和11聚体-1-S却不刺激黑色素的生成(分别为图22和图23)。此外，pTspT(图22)和11聚体-1-S(图23)减少了这些细胞中组成型的色素沉着。
实施例20：硫代磷酸酯pTspT抑制UV-诱导的黑色素生成
将S91细胞的倍增培养物(100,000个细胞/39cm2)假-照射或者用5mJ/cm2来自1kW氙电弧太阳模拟器的模拟太阳光(XMN 1000-21，Optical Radiation，Azuza，CA)进行辐射，所述太阳模拟器利用研究辐射计(IL1700A型号，International Light，Newburyport，MA)设定在285±5nm处。然后给两个假辐射的平皿补充100μM的pTspT而且同样用pTspT处理这两种放射培养物。一个星期后，收集细胞，计数并经过将细胞球粒溶解在1N NaOH中并在475纳米处测定光密度来分析黑色素含量。紫外线照射引起这些细胞中黑色素含量增加大约40％。然而，通过添加pTspT(图24)阻断了UV-诱导的黑色素的增加。此外，这些细胞的组成型色素沉着因假放射的培养物中的pTspT而得以减少，与图22和23中所示的数据一致。
实施例21：pTpT诱导成纤维细胞中的SOD2蛋白水平
将成纤维细胞(新生儿)培养在补充了10％小牛血清(CS)和100μM pTpT或作为对照的稀释剂的Dulbecco′s改性的Eagle培养基(DMEM)中。刺激后在不同的时间间隔收集总细胞蛋白并进行western印迹分析。印迹与抗SOD2(结合部位，Inc.San Diego，CA)的抗体反应。虽然新鲜的培养基添加物瞬时诱导稀释剂处理的对照培养物中的37kDa SOD2，当实验终止时，在pTpT处理的培养物中持续诱导SOD2至少32小时。凝胶上考马斯亮蓝染色的残余条带证实不同泳道的均匀负载。
实施例22：用pTpT预处理抗氧化损伤的保护作用
将来自良好分化的鳞状细胞癌系SCC12F(James Rheinwald博士赠送，Harvard University)的细胞用100μM的pTpT或作为对照物的稀释剂处理3天。然后将细胞重新铺板在缺乏pTpT的培养基中，然后用10J/cm2 UVA(Sellas Sunlight UVA灯)照射或者假照射。在UV照射后以不同的时间间隔确定细胞产率。图25表示UVA处理的细胞的产率，将所述的UVA处理的细胞用pTpT或者用稀释剂预先处理，各自表示为其自身的假照射对照物的百分比。pTpT预处理提高了UVA辐射的细胞的产率。
实施例23：pTpT诱导成纤维细胞中的脱嘌呤核酸的核酸内切酶-1(APE-1)蛋白
将成纤维细胞(人新生儿)培养在含有100 pTpT、10μM或60μM寡核苷酸pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)，或作为对照的稀释剂的补充有10％CS-的DMEM中。补充养分后在不同的时间间隔收集总细胞蛋白并进行western印迹分析。研究修复8-氧代鸟嘌呤(氧化DNA损伤的主要形式)中的限速酶。用抗APE-1的抗体(APE/Ref 1单克隆IgG2b，Novus Biologicals，Inc.Littleton，CO)温育印迹。在添加pTpT或核苷酸序列为SEQ ID NO：5的11聚体寡核苷酸的24小时内，用与稀释剂对照相当的寡核苷酸刺激样品来诱导37kDa APE-1蛋白。当实验终止时持续诱导至少48小时。凝胶上的考马斯亮蓝染色的残余物条带证实了不同泳道的均匀负载。
实施例24：pTpT诱导对pCMV-Luc质粒的UVA损伤的修改
质粒pCMV-Luc是含有强组成型巨细胞病毒启动子调控下的荧光素酶报告基因的非复制性载体(由Hedayati博士赠送，Johns HopkinsUniversity)。在光敏剂亚甲基蓝存在的条件下通过用可见光在不同的时间间隔(0分钟、10分钟和20分钟)辐射质粒来产生质粒单线态氧诱导的DNA损伤。将用100μM pTpT或单独的稀释剂预先处理48小时的成纤维细胞(新生儿)用0.5μg的pCMV-Luc利用LipofectAmineTM(Promega，Madison，WI)进行转染。2天后，测定细胞抽提物(Promega luciferase assay)中质粒编码的荧光素酶的活性。在10mJ/cm2和20mJ/cm2的UV照射后，用pTpT预处理分别把单线态氧-诱导DNA损伤的修复增强了179％和228％。图26表示在用假辐射的质粒转染的成纤维细胞中分析的作为荧光素酶活性百分比的荧光素酶活性。
实施例25：DNA寡核苷酸保护鼠皮肤免于光致损伤
具有突变的着色性干皮病组A(XPA)基因的病人具有超过1000倍的增加的UV-诱导皮肤癌的危险性。XPA-/-小鼠模拟人的综合症[Kraemer，K.等256-261 Molecular Biology of Aging(Bohr，V.A等编辑)Munksgaard，Copenhagen，1999]。我们在前面证实了作为端粒突出端串联重复TTAGGG(SEQ ID NO：11)的部分同源物的寡核苷酸，尤其是胸腺嘧啶脱氧核苷二核苷酸(pTT)和pGAGTATGAG(SEQ IDNO：1)提高了参与核苷酸切除修复的蛋白的水平并增强了DNA修复率。
为了确定体内寡核苷酸的作用，用100μM pTT、40μM pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)或单独的稀释剂每日处理XPA+/+和XPA-/-小鼠共4天。将90％丙二醇/10％DMSO中的30μl体积的寡核苷酸或稀释剂施用于沿着小鼠脊骨皮肤的3cm2区域。在第5天用以前确定的引起红斑的UVB剂量的UV辐射小鼠。治疗过程：施加寡核苷酸(或稀释剂)4天，从每个星期的第1天的寡核苷酸开始，在第5天采用UV照射，重复总共4星期。在最后剂量的紫外线照射后72小时，对小鼠皮肤进行组织学处理以评定综合的形态学、增殖(Ki-67)[Ohike N.和TMorohoshi，Pathol Int(2001)，51：770-777；Billgren，A.M.等，Breast CancerRes Treat(2002)，71：161-170]，由特异性抗体结合测定环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)，以及正在进行的DNA修复[增殖细胞核的抗原(PCNA)；参见Savio，M.等，Carcinogeiiesis(1998)19：591-596；Rudolph，P.等，Hum Pathol(1998)29：1480-1487]。
稀释剂处理的XPA+/+以及XPA-/-皮肤显示海绵样皮肤水肿、水泡以及角化异常，而寡核苷酸-处理的样品缺乏这些特征。72小时后，只有XPA-/-稀释剂-处理的样品每个400x显微镜视野含有CPDs；15A 5(+)细胞，相比之下用pTT或SEQ ID NO：1(p＜0.0001)处理的小鼠的样品中没有所述细胞。没有XPA+/+样品含有CPDs。UVB损伤后，在稀释剂处理的样品中Ki67(+)细胞比寡核苷酸-处理的XPA-/-皮肤中数量更多，与过度增殖的″回弹″一致：14±4对比5±2(p＜0.005)。然而，在XPA+/+和XPA-/-寡核苷酸-处理的皮肤中PCNA(+)细胞更多：38±2对比52±6(p＜0.01)以及125±8对比89±11(p＜0.001)，与正在进行的DNA修复中的PCNA的作用，以及以前报道的体外寡核苷酸上调节PCNA相一致。这些数据说明局部施用端粒同源寡核苷酸部分大通过提高的DNA修复能力加强了皮肤修复重复的UVB损伤的能力。在能有效修复的以及具有严重的修复缺陷的动物中观察到光保护作用，显示了其在防癌中的治疗性作用。
实施例27：与3′突出端端粒序列同源的单链DNA模拟UV对线粒体基因表达的影响
将角质化细胞暴露于UVB照射影响参与细胞周期停滞的基因表达、DNA修复以及细胞因子产生。当与端粒3′突出端同源的单链寡核苷酸共用序列被导入细胞时会模拟这些紫外线的作用。为了鉴定其它可能被类似调节的基因，角质化细胞来源的细胞(SCC 12F；由HarvardUniversity的James Rheinwald博士赠送的人表皮鳞状细胞癌系)暴露于模拟太阳的照射(SSR)(20mJ/cm2，在285±5nm处测定，暴露于与端粒突出端重复序列(T-寡核苷酸)同源的11碱基寡核苷酸(pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)，或暴露于作为对照的互补序列[pCTAACCCTAAC；(SEQ ID NO：9)的对照寡核苷酸]。类似于SSR，与＜23％的对照细胞相比，T-寡核苷酸显著地抑制了细胞增殖并使＞43％的细胞停滞在细胞周期的S-期。利用含有已知由年龄和应激状态调节的＞700基因的DNA微阵列芯片，我们鉴定到8个能被SSR和T-寡核苷酸处理下调＞50％的基因，但是不被假照射或对照寡核苷酸处理下调。具体地，调节的基因编码线粒体酶ATP酶和细胞色素C氧化酶的亚基，所述酶已知由UV和NADH脱氢酶下调转录。这些是所编码蛋白参与细胞呼吸的线粒体转录的基因。半定量的RT-PCR和northern印迹分析证实上述数据而且显示分别早在24小时和48小时基因相应地被SSR和T-寡核苷酸处理下调。同时利用提供许多基因表达快速分析装置的微阵列芯片，证实了参与呼吸的线粒体编码的基因产物同样由与端粒3′突出端同源的紫外线照射和DNA调节。数据暗示，由端粒同源性DNA模拟的DNA损伤应答包括临时降低细胞的能量消耗。
实施例28：由端粒突出端寡核苷酸诱导S-期停滞以及细胞程序性死亡
用于实施例28-37的材料和方法
寡核苷酸
最初设计三种DNA寡核苷酸：一种与端粒突出端(11聚体-1：pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)同源、一种与这种序列(11聚体-2：pCTAACCCTAAC；SEQ ID NO：9)互补的和一种不相关的(11聚体-3：pGATCGATCGAT；SEQ ID NO：10)。实验以后，设计其它的11碱基寡核苷酸：一种是11聚体-1(pGGGTTAGGGTT；SEQ ID NO：13)的简单置换，一种具有相同数目的G残基但是大致50％而非100％与突出端(pTAGATGTGGTG；SEQ ID NO：14)同源，以及一种大致有50％的突出端同源性并且含有胞嘧啶碱基(pCGGGCTTATTG；SEQ ID NO：15)(Midland Certified Reagent Company，Midland，Texas)。
细胞来源和培养
如前所述(Eller，M.S.等，1997，ProcNatl Acad Sci USA 94：12627-12632)建立和培养人新生的成纤维细胞。
来自奈梅亨损伤综合症(NBS)病人(#GM07166)和衰老-对比对照(GM03399)的成纤维细胞购自NIGMS(人细胞贮藏所，CoriellInstitute for Medical Research，Camden，NJ)并培养在DMEM/15％FBS中。Saos-2细胞购自美国典型培养物培养中心((ATCC；Manassas，VA)。SCC12F细胞由哈佛大学的James Rheinwald博士友情赠送。
细胞周期分析
建立的人T淋巴细胞系，称为Jurkat细胞(180,000细胞/ml)，在补充有3％FBS的RPMI培养基1640中(两种都来自GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)铺板。用终浓度为40μM的寡核苷酸或作为对照物的等量稀释剂(水)处理倍增培养物。处理后96小时收集细胞，用碘化丙锭染色并利用Becton-Dickinson FacsScan和CellQuest软件由FACS进行分析。
胱冬蛋白酶(胱冬蛋白酶)活性
培养Jurkat细胞的倍增培养物并如上所述用寡核苷酸进行处理。在处理的第48、72和96小时，经离心作用收集细胞并漂洗然后由重复循环的冻结熔化来裂解离心获得的颗粒。然后经离心作用澄清溶解产物而且上清液被用于蛋白质分析，利用购自Promega(Madison，Wisconsin)的比色CaspACE分析系统的说明书分析胱冬蛋白酶-3的活性。所述分析利用底物Ac-DEVD-pNA并且比色测量释放的游离pNA。胱冬蛋白酶的活性被表示为pmol的pNA/小时/μg蛋白。
TUNEL分析检测程序性死亡的细胞
以180,000细胞/ml的密度将细胞铺板在补充有3％FBS的RPMI1640培养基中。用40μM的任意一种寡核苷酸处理细胞72小时。然后收集细胞，漂洗并在4％低聚甲醛中固定30分钟，然后用0.1％TritonX-100透化处理2分钟。利用来自Boehringer Mannheim的荧光素标记的dUTP通过原位细胞死亡检测试剂盒中的组分和说明书进行TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶调节的dUTP-生物素缺口-末端标记)分析。由FACS分析和共聚焦显微检测TUNEL-阳性细胞。
寡核苷酸的细胞吸收
为了进行共聚焦分析，将Jurkat细胞在Permanox盒载片上铺板(Lab-Tek，Naperville，IL)，并用荧光素磷酸酰胺(FAM)-标记的寡核苷酸(Research Genetics，Inc.Huntsville，AL)处理4小时。将粘附细胞固定在PBS中的4％多聚甲醛中，用碘化丙锭(PI)染色以鉴定用Slowfade试剂(Molecular Probes，Eugene，OR)固定并用盖玻片并储存在黑暗条件下用盖玻片覆盖的4℃的核。用Carl ZeissLSM510共焦点激光显微镜估计5-10μm切片的寡核苷酸的吸收。计算机图像给FAM-寡核苷酸分配绿色，给PI分配红色，给共定位的信号分配黄色。在同样用FAM-寡核苷酸处理的Jurkat细胞上进行FACS分析4小时，然后在4℃下固定在0.5ml的4％低聚甲醛中过夜。在FL-1通道中测量荧光。
Western印迹分析和抗体
如前所述[Eller，M.S.等，(1996)，Proc Natl Acad Sci USA 93，1087-1092]进行Western印迹分析。抗体Ab-6(DO-1克隆，OncogeneResearch Products，Cambridge，MA)检测p53；抗体KH95(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)检测E2F1；抗体Ab-4(OncogeneResearch products)测定p73。利用#9284多克隆抗体检测磷酸-p53(丝氨酸15)并且用磷酸-p95/Nbsl-特异性多克隆抗体检测磷酸-p95/Nbsl(丝氨酸343)，这两种抗体都来自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。也使用p95/Nbsl抗体(#NB-100-143，NovusBiologicals，Littleton，CO)和肌动蛋白抗体(I-19，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)。
p95/Nbsl的修饰
如上所述，培养Jurkat和SCC12F细胞并用寡核苷酸处理。在所指定的时间后，收集总蛋白并用8％PAGE分析而且利用p95/Nbsl(#NB-100-143，Novus Biologicals，Littleton，CO)的多克隆抗体进行western印迹。如前Lim等人[Lim，D.S.等，Nature 404：613-617，2000]所述进行免疫沉淀并用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶处理。
TRF2DN的瞬时转染和表达
AdTRF2表达载体由Titia deLange博士(RockefellerUniversity)友情赠送。对照载体pCMV LUC由Johns HopkinsUniversity的M.Hedayati博士赠送。以3.5×103细胞/cm2的密度将细胞铺板。1天以后，利用Fugene 6转染试剂(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)根据生产商提供的方案以1μg质粒DNA/35mm培养皿转染培养物。转染后在显示的时间点收集细胞并通过所描述的western印迹测定p95/Nbsl。
端粒长度
在稀释剂或40μM11聚体-1、-2或者-3存在的条件下将正常人成纤维细胞培养5天。然后收集细胞并利用DNeasy组织试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离基因组DNA。大体上根据van Steensel和de Lange(van Steensel，B.和T.de Lange.1997，Nature385：740-743)所描述的利用从Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，Indiana)获得的Telo TAGGG Telomere Length Assay并根据厂商的说明测定端粒长度。通过密度测定法并利用Harley等人的方法(Harley，C.B.等，1990，Nature 345：458-460)计算平均端粒长度(MTL)。
3′突出端分析
在40μM11聚体-1存在的条件下培养正常人成纤维细胞最高达7天。在处理前(时间点0)和在处理的第3、5和7天收集细胞。利用DNeasy试剂盒分离基因组DNA。根据van Steensel，Smogorzewska和de Lange在(van，B.等人，1998，Cell 92：401-413)中所描述的方法进行3′突出端的检测。
将探针([TTAGGG]4)与基因组DNA杂交来控制与端粒双链DNA的杂交。试验引物([CCCTAA]4)被用于测定突出端。
合成与3′突出端序列同源的寡核苷酸(11聚体-1：pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)、与这个序列互补的序列(11聚体-2：pCTAACCCTAAC；SEQ ID NO：9)和与端粒序列不相关的序列(11聚体-3：pGATCGATCGAT；SEQ ID NO：10)。将两种11聚体寡核苷酸加入到Jurkat细胞的培养物中，所述Jurkat细胞是建立的人T淋巴细胞细胞系，据报道是一种应答端粒分裂[Karlseder J等人，(1999)Science 283，1321-1325]以及DNA损伤电离辐射(IR)[Vigorito，E.等人(1999)，Hematol CellTher 41，153-161]的发生细胞程序性死亡的细胞类型。将Jurkat细胞的复制本培养物用终浓度40μM的11聚体-1，-2或-3寡核苷酸，或作为对照的等量稀释剂(水)处理。处理后96小时收集细胞，用碘化丙锭染色并通过FACS进行分析。同样参见实施例13和图19A-19H。
同样通过DNA末端-标记的TUNEL分析测定细胞程序性死亡。用40μM寡核苷酸处理Jurkat细胞72小时。然后收集细胞并进行TUNEL分析。如FACS分析和共聚焦显微术所见，只有用突出端同源性SEQ IDNO：5处理的Jurkat细胞由于掺入了末端-标记结合而显示了荧光增加。也测定作为细胞程序性死亡的另一标记的胱冬蛋白酶-3的活化。如上所述培养Jurkat细胞的倍增培养物并用寡核苷酸处理48、72和96小时并测量胱冬蛋白酶-3活性。用与对照物同源的端粒突出端处理48小时后胱冬蛋白酶-3的活性在72和96小时时比这些细胞高3-4倍(图27)。因此，与端粒3′突出端同源的寡核苷酸特异性地诱导S期停滞以及这些细胞中的细胞程序性死亡。
实施例29：证实p73在细胞程序性死亡中的作用
在端粒环破裂后，p53转录因子和肿瘤抑制蛋白特异性地与细胞程序性死亡相关[Karlseder，J.，等，(1999)，Science 283，1321-1325]。然而，虽然端粒环破裂后p53在鼠科胚胎成纤维细胞的细胞程序性死亡中具有一定作用已经得到了试验证实，但是p53在相同研究中含有假设受损害的p53的的细胞程序性死亡中的隐含作用并未被谈到[Karlseder，J.等，(1999)，Science 283，1321-1325]。因为p53的同源物p73也显示可以介导几种细胞类型的细胞程序性死亡[Lissy，N.A.等人，(2000)，Nature 407：642-644，Irwin，M.等(1997)，Nature 407：645-648]，而且因为端粒同源性DNA诱导这两种蛋白，因此设计试验来测定这种蛋白在寡核苷酸-诱导的细胞死亡中的作用。
因为HTLV-1传染已经显示出损害p73途径[Lemasson，I.和Nyborg，J.K.(2001，JBiol 2001，J Biol Chem 276，15720-15727，Kaida，A.等(2000)，Oncogene 19，827-830]以及p53途径[Akagi，T.等，(1997)，FEBS Lett 406，263-266]，选择已知表达野生型p53的人黑色素瘤系MM-AN进行研究。人色黑素瘤细胞系MN-AN(获自H.R.Beyers，Boston University)的匹配培养物被培养在在具有5％FBS的DMEM中，并用40μM的11聚体-1，11聚体-2或单独的稀释剂处理24-48小时并以一定的时间间隔收集细胞用于FACS分析和western印迹。
与Jurkat细胞类似，如sub-G0/G1 DNA含量所示，MM-AN细胞首先进入S-期停滞，而且72小时时大部分的细胞发生了细胞程序性死亡。利用10％聚丙烯酰胺进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析蛋白，用E2F1-特异性的单克隆抗体进行western印迹分析(KH95 Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，并且利用多克隆抗体(来自Oncogene Research Products，San Diego，CA的AB-4)分析p73。
Western印迹分析显示，E2F1和p73的诱导模式与在Jurkat细胞中观察到的相同，这些与所观察到的细胞程序性死亡中的蛋白作用相一致。为了测定p73对细胞死亡的作用，将MM-AN黑色素瘤细胞用显著阴性的p73(p73DN)稳定地转染(Irwin等，Nature 402：645-648)构建体或作为对照的空的载体(p73DN-含有载体，Dr.William Kaelin赠与，Dana Farber Institute，波士顿)并且给倍增培养物补充40μM11聚体-1或单独的稀释剂，然后在72小时收集用于FACS分析。表达p73DN的细胞以对照细胞的一半速率产生细胞程序性死亡，这证实了p73蛋白在该过程中的基本的、而不是唯一的作用。此外，通过Western印迹，分化标记Mart-1、酪氨酸酶、TRP-1和gp-100在T-寡核苷酸处理MM-AN黑色素瘤细胞48-72小时后被上调控。
上述的分化标记在正常人黑色素细胞中表达。看来好像这些抗原表达的损失是人黑色素瘤用于逃避免疫监视防御的一个机制。来自这些抗原的一些肽是肿瘤渗透细胞毒素胸腺依赖性细胞的靶。利用上述抗原的抗原肽的不同疫苗接种策略已经在体内获得了令人鼓舞的结果。
实施例30：T-寡核苷酸对SCID小鼠中MM-AN细胞致肿瘤性的作用
为了研究T-寡核苷酸(pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)对MM-AN细胞致肿瘤性的作用，将细胞培养在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM中并用40μM的T-寡核苷酸、互补的或单独的稀释剂处理48小时。然后用胰蛋白酶/EDTA收集细胞并通过台盼蓝排除法染色测定活力百分比。所有的细胞群体在注射时具有大于90％的活力。通过将1×106个活细胞的平衡盐溶液皮下注射到SCID小鼠(3组，5小鼠/组)的右边肩胛区产生肿瘤来测定这些黑色素瘤细胞的致肿瘤性。处埋18天后，通过吸入CO2对动物实施安乐死并用卡尺评价肿瘤的大小。将肿瘤进行苏木精和曙红染色并且肿瘤的黑素细胞来源得到了利用识别gp-100的HMB-45单克隆抗体对损伤进行免疫组织化学染色的证实，其中gp-100是人黑色素瘤的一个常规标记。
在另一个组中，在用稀释剂注射预处理10天和12天的细胞的位点处肿瘤是明显的。在第18天，动物被处死，切掉所有的肿瘤并测定。稀释剂处理组中的平均肿瘤体积为322±45mm3，相比之下T-寡核苷酸处理组中的为56±13mm3(p＝0.04)。用对照寡核苷酸处理的动物具有238±50mm3的肿瘤体积，在统计学上并不小于稀释剂对照的(图28)。苏木精和曙红染色显示大的肿瘤存在于由大的上皮细胞与大量着色的细胞质和大的证明是着色过度的不规则核以及大的核仁组成的下皮层内。肿瘤被通过用HMB-45进行的阳性免疫组织化学染色鉴定为黑色素瘤，证明了它们的来源。
为了研究T-寡核苷酸对黑色素瘤细胞的转移潜力的作用，将MM-AN细胞的培养物用T-寡核苷酸、互补的或单独的稀释剂处理48小时并如上所述进行收集。1×106细胞的平衡盐溶液被注入5周龄SCID小鼠的侧面尾部静脉中(3组，5鼠/组)。40天后，通过吸入CO2对小鼠实施安乐死，进行尸体解剖并且宏观检验器官的明显的转移性损伤。
对所有的五个动物用单独稀释剂或对照寡核苷酸处理来产生多重转移，与T-寡核苷酸处理组的五个动物中的一个相比较。转移被发现在肾上腺、骨、脑、肩胛间腺、肾脏、肝脏、肺、胰腺和对照动物的其它位点中。T-寡核苷酸预处理组的每一动物的明显肿瘤的平均数为0.8，而稀释剂和对照寡核苷酸预处理组中的分别为15.8(p＝0.003)和9.6(p＝0.05)。T-寡核苷酸处理动物的肉眼可见转移肿瘤的平均体积与稀释剂处理和互补处理动物的相比，分别显著地降低了大约85％和80％(图29)。
                        表2：T-寡核苷酸对肉眼可见的肿瘤转移的作用
位点  具有肿瘤的动物：稀释剂     总的肿瘤：稀释剂     具有肿瘤的动物：对照寡核苷酸   总的肿瘤：对照寡核苷酸   具有肿瘤的动物：T-寡核苷酸   总的肿瘤：T-寡核苷酸
肾上腺骨脑棕色脂肪肾脏肝脏肺胰腺混杂的总的肿瘤负载(5个动物)  1/54/53/55/53/51/51/53/53/5     31082113934879     2/51/53/53/54/52/53/54/51/5   33387467748   1/50/51/50/50/50/50/50/50/5   2020000004
每一动物的平均肿瘤数     15.8   9.6   0.8
无肿瘤转移的  0/5     0/5   4/5
实施例31：活性取决于与端粒突出端序列的同源性
为了进一步证实这些对端粒突出端序列应答的特异性，测定了三种变体。如同11聚体-1那样，其置换排列pGGGTTAGGGTT(SEQ ID NO：13)是突出端的精确同源物并且因此被预测有相同的活性。第二种寡核苷酸，pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)同11聚体-1一样富含G(5G/11碱基)并且与突出端具有55％的同源性，类似于9-聚体寡核苷酸pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)，最近显示其诱导p53和色素形成，并增强DNA的修复能力(参见实施例12)。第三种寡核苷酸，pCGGGCTTATTG(SEQ ID NO：15)，与突出端也具有55％的同源性，但不同于另一个寡核苷酸，因为其含有18％的在突出端序列中不存在的胞嘧啶碱基。这些寡核苷酸被分别以10μM的终浓度加入到Jurkat细胞的培养物中。72小时后收集细胞并用于FACS分析。每一实验条件被重复进行三次。显示于图30A-30H的数据是来自两个实验中的一个典型实验。通过FACS分析，通过72小时，2％的稀释剂处理细胞并且用含有胞嘧啶的寡核苷酸处理的细胞是细胞程序性死亡的。然而，13％的同源物处理的和10％的部分同源物处理的细胞是细胞程序性死亡的。
与16％的部分同源物处理的细胞程序性死亡，以及2-4％的用含有胞嘧啶的寡核苷酸或单独的稀释剂处理的培养物中的细胞程序性死亡相比，同源物处理96小时后，28％的细胞是细胞程序性死亡的。在分离的成对的培养物中，两个完全的端粒突出端同源物[pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)和pGGGTTAGGGTT(SEQ ID NO：13)]被证明具有相同的活性。数据表明，寡核苷酸活性主要是端粒同源性的函数而不是，例如，G含量的函数。此外，寡核苷酸中胞嘧啶的存在大大减少了与同源性程度无关的活性。尽管pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)和pCGGGCTTATTG(SEQ ID NO：15)与端粒突出端具有类似的同源性，但是后一寡核苷酸不能诱导细胞程序性死亡并且仅仅诱导适度的S-期停滞。这与实施例12中所描述的2-20个碱基寡核苷酸的诱导其它模拟UV的DNA损伤应答的能力的比较是一致的。
为了测定表示33％的6碱基端粒串联重复序列的pTT是否以与完全的端粒重复序列相同的方式诱导Jurkat细胞的S-期停滞，我们比较了pTT和11聚体-1对Jurkat细胞的作用。为了测定pTT和11聚体-1的相对效力，用稀释剂、20μM或5μMpTT或11聚体-1处理Jurkat细胞的培养物72个小时并收集进行FACS分析。对每一实验条件进行三次重复。将细胞周期中每一阶段的细胞的百分比表示为平均数和标准偏差，根据三次重复的结果来测定。典型的实验显示于图31A-31E中。在20μM的浓度下，pTT-和11聚体-1-处理的Jurkat细胞的细胞周期分布图几乎是相同的，分别占在第72小时S期中的处理细胞的53±1％和58±1％。然而，在5μM下，与pTT处理的细胞的45％和稀释剂处理的细胞的36％相比，61％的11聚体-1处理的细胞在72小时时积累在S-期。尽管用较高的11聚体-1剂量(40μM，图19F)处理的Jurkat细胞也在72小时S期显示出类似的细胞百分比(38％)，但是这些培养物另外具有13％的细胞程序性死亡(＜G0)的细胞。在用20μM pTT甚至处理96小时的Jurkat培养物中没有发现细胞程序性死亡。因此，pTT和端粒突出端同源物对Jurkat细胞的细胞周期具有类似的影响，尽管较高浓度的不完全的序列是所需要的。这些数据，和在图30中的数据，以及其它2-20碱基长的寡核苷酸的其它数据(实施例12)一起进一步表明了寡核苷酸诱导DNA损伤应答的能力与它们和端粒重复序列的同源性程度是直接相关的，尽管许多仅仅具有部分同源的序列也具有有益的作用。
实施例32：正常人成纤维细胞中S-期停滞、E2F1和p53蛋白水平以及p53磷酸化的诱导
用单独的寡核苷酸(40μM)或稀释剂处理正常的新生的人成纤维细胞的预融合培养物，在24小时后收集用于FACS分析(图32A-32D)或Western印迹。图32A-32D中的平均数和标准偏差是测定一式三份的样品获得的。进行一个典型的三个一组的实验。正常的新生人成纤维细胞在24小时内对端粒突出端同源物寡核苷酸-11聚体-1产生应答，通过激活S-期关卡，但在处理后直至72小时也没有检测到程序性死亡的细胞。互补于端粒突出端的对照11-碱基寡核苷酸(11聚体-2)或与端粒突出端不相关的(11聚体-3)寡核苷酸对细胞没有影响。端粒同源性寡核苷酸的选择性作用不能归结于选择性的吸收，因为相同长度的寡核苷酸中存在类似的吸收而与序列无关。
通过Western印迹分析测定对丝氨酸-15磷酸化所指示的p53的激活，使用磷酸-p53(丝氨酸-15)的特异性抗体16G8。然后剥离印迹并与泛嗜性p53 DO-1再次进行探针反应。将含有来自成纤维细胞的蛋白的凝胶泳道用单独的稀释剂、11聚体-1或11聚体-2处理，在24、48或72小时时收集。如同阳性对照一样，来自另一供体的成纤维细胞被假照射或X射线照射(10Gy)并在3小时后收集。光密度分析显示，11聚体-1处理的成纤维细胞的E2F1与稀释剂或11聚体-2处理24小时的对照相比显示出170-250％的增加。与稀释剂或11聚体-2处理的对照相比，在用11聚体-1处理48小时后p53增加60-300％且处理72小时后增加240-380％。依据β-肌动蛋白并基于两个独立实验校正所有的值。Western分析处理的成纤维细胞显示了p53和E2F1被端粒突出端同源物选择性地诱导。
在添加11-聚体-1 4小时后观察到E2F1的增加，在12-24小时达到最大值并且随后恢复到对照的水平。已知E2F1转录因子与p53在诱导细胞程序性死亡中协同作用(Kowalik，T.F.，等，1995，J Virol69：2491-2500，Kowalik，T.F.，等，1998，Cell growth Differentiation9：113-118)并且以依赖于p53的方式诱导人成纤维细胞中衰老的表现型(Dimri，G.P.，等，2000，Mol Cell Biol 20：273-285)。此外，E2F1被通过来自IR的DNA损伤以取决于ATM激酶的方式进行诱导(Lin，W.C.，等，2001，Gene sand Dev.15：1833-1844)。为了测定是否11聚体-1，像pTT一样(Eller，M.S.，等，1997，Proc NatlAcad Sci USA 94：12627-12632，Maeda，T.，等，1999，Mutat Res 433：137-145)激活和诱导p53，我们也研究了p53的磷酸化，一种在不同形式的DNA损伤后p53转录激活的标记(Lambert，P.F.，等，1998，J biol Cliem 273：33048-33053，Dumaz，N.和D.W.Meek.1999.EMBOJ 18：7002-7010，Tibbetts，R.S.，等，1999，Genes Dev 13：152-157，Caspari，T.，2000，Curr Biol 10：315-317，Unger，T.，等，1999，Oncogene 18：3205-3212)。对11聚体产生应答的在丝氨酸15处磷酸化的p53蛋白具有惊人的和选择性的增加，首先在第4小时时检测到并且持续至少48个小时。
实施例33：p53的磷酸化和E2F1的诱导取决于ATM
因为已知p53上的丝氨酸15位点在暴露于电离辐射(IR)后以ATM依赖的方式被磷酸化，我们希望研究在应答11聚体-1的E2F1诱导和p53丝氨酸15磷酸化中ATM的作用。已知患有共济失调毛细血管扩张(AT)的病人的成纤维细胞缺少功能性的ATM蛋白，并且用稀释剂、40μM 11聚体-1、假照射或IR(10Gy)处理年龄匹配的正常对照成纤维细胞(N)。收集3小时(假或IR)或48小时(稀释剂，11聚体-1)的细胞用于Western印迹分析来检测丝氨酸15-磷酸化的p53和总的p53。在正常的成纤维细胞中，与稀释剂处理的对照相比，11聚体-1诱导了10-15倍的丝氨酸15上p53磷酸化水平的增加。相比之下，用11聚体-1处理AT成纤维细胞产生不到50％的增加。
与在新生儿成纤维细胞中p53的诱导相比，年轻成熟供体的正常成纤维细胞中的11聚体-1最低限度地诱导总p53的水平，其与以前所述的与新生儿细胞相比，成人对UV诱导的DNA损伤有较低的应答相一致。正如所预料的，AT成纤维细胞仅仅显示出最低程度的对IR应答的p53丝氨酸15的磷酸化。11聚体-1也是同样的。在正常对照成纤维细胞中而不是在AT成纤维细胞中诱导E2F1的水平。这些数据证明了在这些对端粒突出端DNA的应答中需要ATM激酶并且与通过TRF2进行的依赖于ATM的p53诱导一致(Karlseder，J.等，1999，Science 283：1321-1325)。
实施例34：细胞周期停滞不依赖于p53
为了测定是否这些寡核苷酸可以类似地影响其它类型的人细胞以及为了研究p53的作用，我们用单独的稀释剂、11聚体-1、11聚体-2或11聚体-3处理了鳞状细胞癌细胞系(SCC12F)(Rheinwald，J.G.，等，1983，Human carcinogenesis.pp.86-96.学院出版社(New York))，其超表达推测的突变的p53(Eller，M.S.和B.A.Gilchrest.2000，Pigment Cell Res.13：94-97)以及一种p53-null骨肉瘤细胞系(Saos-2)(Wang，L.H.，等，1998，Anticancer Res 18：321-325)。48小时后通过FACS分析培养物(图33A-33H)。如同Jurkat细胞和正常的成纤维细胞一样，端粒突出端同源物在48小时内在这两个细胞类型中选择性地诱导S-期停滞。尽管11聚体-1处理的SCC12F和Saos-2细胞中S期细胞的百分比大体上是相同的(分别为53±6％和52±1％)，但是这两个细胞类型的G0/G1和G2/M含量有些不同。这些可以反映出导致剂量依赖性差异的对寡核苷酸的不同吸收，和/或这些细胞调控细胞周期的不同作用途径。在72小时内的任一细胞类型中没有检测到对寡核苷酸的细胞程序性死亡应答。这些数据证明了11聚体-1影响上皮和间质来源的两种细胞而且11聚体-1应答中的S期停滞不依赖于p53。然而，因为许多具有野生型p53的细胞类型在DNA损伤后对细胞程序性死亡有相对的耐性(Sionov，R.V.和Y.Haupt.1999.Oncogene18：6145-6157)，数据没有揭示p53在对11聚体-1的细胞程序性死亡应答中的作用，其显著地存在于表达推测受损害的p53的Jurkat细胞中。(Akagi，T.，等，1997，FEBS 406：263-266)。
实施例35：缺少功能性p95/Nbsl的细胞在对端粒突出端同源物的应答中不激活S-期关卡
因为证明了p95/Nbsl在S-期停滞中对IR应答的作用并且已知其与端粒DNA相关联，我们紧接着研究其在对端粒突出端同源物的应答中观察到的S期停滞中到的作用。成纤维细胞获自NBS(奈梅亨损伤综合症)病人，其p95/Nbsl低于检测的水平。
用40μM的寡核苷酸处理预融合培养物或正常的(对照)成纤维细胞和NBS成纤维细胞，并且在48小时后收集用于FACS分析(图34A-34H)。由每一状况的一式三份培养物计算平均数和标准偏差。来自三个一组的典型实验的FACS分布图被显示出来。如同所预料的，11聚体-1处理的正常细胞在24小时内具有S期生长停滞，而用单独的稀释剂、11聚体-2或11聚体-3处理的相同细胞未受影响。
用无关的寡核苷酸处理的和稀释剂处理的NBS细胞显示出类似于处于S期停滞的正常细胞的FACS分布图，并且与稀释剂处理的NBS细胞相比，它们的增殖受11聚体-1最低限度的影响。这些数据表明了p95/Nbsl具有以前未确定的在S期正常发育中的作用，而且在缺乏功能性p95/Nbsl的情况下DNA合成被延长了。同样，与稀释剂处理的细胞相比，11聚体-1处理的NBS培养物中的S期细胞数目增加了8％，尽管在统计学上是不显著的(p＜0.08)，这表明了除了p95/Nbsl外的因子有助于DNA损伤或11聚体-1处理后的停滞。例如，已表明S期中计划外的E2F1活性导致了S期关卡的激活(Krek，W.，等，1995，Cell 83：1149-1158)。
p95/Nbsl通过ATM发生的磷酸化，其在DNA损伤后引起了与S期关卡相关的激活，可以通过PAGE由于在凝胶中蛋白迁移的细微变缓而被检测(Lim，D.S.，等，2000，Nature 404：613-617，Zhao，S.，等，2000，Nature 405：473-477，Wu，X.，等，2000，Nature 405：477-482)。Western印迹分析检测这种通过给Jurkat细胞添加11聚体-1而不是11聚体-2或11聚体-3经48、72和96小时后获得的蛋白在p95/Nbsl迁移中的移动。p95/Nbsl表观分子量的改变，推测是由于蛋白的共价修饰，这与通过分析测定的S期停滞相符合。这些在p95/Nbsl迁移中的移动同样也出现在IR后的细胞中，如同以前报道的并且归因于蛋白质的磷酸化(Lim，D.S.，等，2000，Nature 404：613-617，Zhao，S.，等，2000，Nature 405：473-477，Wu，X.，等，2000，Nature 405：477-482)。SCC12F细胞应答与添加了11聚体-1的相同，再次在时间框架中与它们的S-期关卡的激活相符合。对于来自11聚体-1处理的和照射细胞的免疫沉淀的p95/Nbsl，SCC12F细胞中的移动更明显，并且通过用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶处理免疫沉淀的蛋白而被消去，正如同对IR应答的p95/Nbsl磷酸化的报道(Lim，D.S.，等，2000，Nature 404：613-617)。用磷酸p95/Nbsl-特异性抗体对来自稀释剂和寡核苷酸处理的成纤维细胞的蛋白质进行Western印迹探针检测，进一步证明了p95/Nbsl的磷酸化被端粒突出端同源物寡核苷酸11聚体-1所诱导。
实施例36：通过TRF2DN产生的端粒破裂导致了对p95/Nbsl的修饰
Karlseder等(Karlseder，J.，1999，Science 283：1321-1325)以前证明了TRF2DN的异位表达，其破坏端粒环并且暴露出3′突出端，诱导了p53的增加和特定细胞类型中的细胞程序性死亡。为了确定是否p95/Nbsl修饰同样被端粒破裂诱导，用TRF2DN表达载体或没有TRFDN插入的(对照)载体瞬时转染新生的人成纤维细胞。
转染后最多收集细胞40小时并通过Western印迹利用磷酸-p95-特异性抗体分析p95/Nbsl。转染后经过24小时，检测到不同的p95/Nbsl迁移率，类似于暴露于IR(10Gy)后所观察到的。这些相对于高分子量的移动在40小时后仍然很明显。这些数据证明端粒破裂以及用端粒3′突出端的同源物处理均诱导了对p95/Nbsl的修饰并且因此支持了我们关于3′突出端的暴露是端粒经不同操作后观察到的DNA损伤应答的原始信号的假说。
实施例37：端粒突出端寡核苷酸不降低端粒长度或改变3′突出端
为了消除11聚体-1寡核苷酸间接地通过破坏端粒环结构，如所报道的TRF2DN转染后导致严重的端粒缩短和/或3′突出端降解的可能性(Karlseder，J.，1999，Science 283：1321-1325)，我们分析了正常人成纤维细胞在用寡核苷酸处理5天后的平均端粒长度，其比诱导p53和S期关卡所必需的更长。将正常的人成纤维细胞用单独的稀释剂、40μM 11聚体-1、11聚体-2或11聚体-3处理5天。收集成纤维细胞并分离基因组DNA。对稀释剂处理的细胞、11聚体-1处理的细胞、11聚体-2处理的细胞、11聚体-3处理的细胞以及晚期通道成纤维细胞(群体倍增＞50)端粒长度分析，并与高分子量和低分子量的端粒标记相比较。每一实验条件的MTL值(以千碱基)，按照Harley等(Harley，C.B.等，Nature 345：458-460，1990)所述计算如下：10.59(稀释剂)、12.25(11聚体-1)、10.45(11聚体-2)、10.22(11聚体-3)、8.86(衰老的)、10.19(高分子量标准)、4.04(低分子量标准)。对于用40μM11聚体-1处理3、5或7天的新生儿成纤维细胞进行3′突出端测定。
没有任何寡核苷酸的平均端粒长度(MTL)降低。实际上，11聚体-1处理的细胞在5天实验的过程中显示出MTL大约有20％的适度的增加。此外，用11聚体-1寡核苷酸处理的成纤维细胞最多至7天也没有导致端粒3′突出端的降解，如通过TRF2DN产生的端粒破裂后所观察到的(Karlseder，J.，1999，Science 283：1321-1325)。这些数据强烈地表明了11聚体-1没有影响端粒的完整性，但可能模拟这些过程产生的信号。类似地，11聚体-1的作用不能归因于对端粒酶的抑制，例如通过作为假底物由此阻止端粒延长，因为正常人的成纤维细胞(其中作用很容易被观察的细胞)不表达催化亚单位TERT(Greider，C.W.1996，Annu Rev Bio chem 65：337-365)。此外，端粒酶抑制导致的端粒侵蚀被期望仅在延长一段时间后发挥作用，在上述报道中超过50的群体发生倍增(Naka，K.，等，1999，BiochemBiophys Res Comm 255：753-758，Marusic，L.，等，1997，Mol CellBiol 17：6394-6401，Hande，M.P.，等，1999，J Cell Bio 144：589-601)，远远大于在这里报道的24-48小时，并且在任何情况下都没有观察到。
实施例38：通过不同的传递方法对SCID小鼠中的黑色素瘤进行原位寡核苷酸处理(推测的)
将MM-AN细胞培养在含有5％FBS的DMEM中，然后用胰蛋白酶/EDTA收集细胞，并通过台盼蓝排除法测定活力百分比。仅仅将具有90％或更大活力的细胞群体用于实验。通过皮下注射1×106在平衡盐溶液中的活细胞到SCID小鼠的后肢中产生皮下肿瘤来测定这些黑色素瘤细胞的致肿瘤性。将3组小鼠(5个小鼠/组)用于这些研究。组1被每周5次给药200μg T-寡核苷酸的IP注射液，在注射细胞24小时后，每周5次向组2给药含有200μg对照寡核苷酸的IP注射液而组3被注射稀释剂。
传递寡核苷酸的IP被发现有效地减小了小鼠皮下黑色素瘤的大小(Massod，R.，等，Blood 96：1904-1913，2001)。通过对小鼠进行每周两次的检验来监控肿瘤的大小并用卡尺测定肿瘤。在注射4周后杀死小鼠并将肿瘤进行苏木精和曙红染色。
如上所述处理和收集MM-AN黑色素瘤细胞。传递寡核苷酸的IP可以通过Alzet泵传递来替换。注入500μg/天的T-寡核苷酸或对照寡核苷酸或稀释剂并持续4周的时间。如上所述评价肿瘤的大小。
发现Alzet泵在小鼠皮下黑色素瘤肿瘤的治疗中是有效的(Hijiya，N.，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：4499-4503，1994)。
如上所述处理和收集MM-AN黑色素瘤细胞。组1被每周3次给药200μg T-寡核苷酸的IV注射液，每周3次给药组2的含有200μg对照寡核苷酸的IV注射液，而组3被注射稀释剂。如上所述在注射4周后杀死小鼠并评价肿瘤的大小。
实施例39：寡核苷酸对黑色素瘤转移和致瘤性的影响(推测的)
将对产生最大肿瘤衰退的先导试验流程进行选择。如上所述处理和收集MM-AN黑色素瘤细胞。将1×106个在平衡盐溶液中的细胞注入到4周龄SCID小鼠的侧面尾部静脉中。3个由25个小鼠组成的组分别用于上述的试验组。组1被注射T-寡核苷酸；组2被注射了对照寡核苷酸以及组3被注射了稀释剂。所有处理在注射细胞24小时后开始。6周后，通过吸入CO2杀死小鼠，进行尸体解剖并且宏观检验器官的明显损伤。特别重点研究肝脏、胰腺和脑，因为这些器官已经被证明是MM-AN细胞转移的初始位点。为了检验和切片，在PBS中冲洗器官并在10％福尔马林中固定48小时。在解剖显微镜下检验器官并且计算肿瘤小瘤的数目。将用福尔马林固定并包埋在石蜡中的组织切片用苏木精和曙红染色以测定肿瘤的组织特性。
如上所述处理和收集MM-AN黑色素瘤细胞。将选择产生最大肿瘤衰退的先导试验流程。通过皮内注射1×106在平衡盐溶液中的活细胞到SCID小鼠的后肢区域中产生皮下肿瘤来测定这些黑色素瘤细胞的致肿瘤性。通过每周两次检查小鼠来监控肿瘤的大小并用卡尺测定肿瘤。在注射4周后，杀死小鼠并切掉肿瘤，测定和进行苏木精和曙红染色。使用三组小鼠。组1用T-寡核苷酸处理、组2用对照寡核苷酸处理以及组3用稀释剂处理。通过上述所讨论的小鼠组中的TUNEL测定肿瘤内的细胞程序性死亡。同样也在上述三组小鼠肿瘤中进行研究分化标记gp-100、TRP-1和Mart 1的表达。
实施例40：小于6个核苷酸长度的端粒同源物寡核苷酸抑制人骨肉瘤细胞系
将人Saos-2细胞铺板在含有10％胎儿牛血清的DME中的p35培养皿中，并加有40μM 5聚体(TTAGG)、3聚体(TTA)11聚体-1(GTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)或单独的作为对照的稀释剂，添加寡核苷酸或稀释剂后继续培养36个小时。然后通过胰蛋白酶消化收集细胞并通过Coulter计数器计数。图36的图表表示添加后复制本培养物细胞群体倍增的平均数，带有平均数的标准误差。
实施例41：T-寡核苷酸通过诱导细胞程序性死亡和衰老而抑制乳腺癌的细胞增殖
通过暴露于T-寡核苷酸而抑制乳腺癌增殖
一次性地给乳腺癌细胞提供40μM的T-寡核苷酸(pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)、对照寡核苷酸(pCTAACCCTAAC；SEQ ID NO：9)或单独的稀释剂。经过4天时间，与对照寡核苷酸或单独的稀释剂相比，用单独的T-寡核苷酸进行的处理显著地降低了MCF-7(p＜0.006)(图37)和BT-BT-20(p＜0.006)(图38)细胞的细胞产量。
在铺板一天后给MCF-7细胞补充T-寡核苷酸(40μM)，然后在第3天提供新鲜的培养基和单独的稀释剂或含有T-寡核苷酸的新鲜培养基。连续地给复制本培养物补充培养基和单独的稀释剂并且在第7天形成融合。甚至在除去T-寡核苷酸后，当实验终止时，处理的MCF-7细胞至少有14天的时间没有重新生长(图39)。
暴露于T-寡核苷酸诱导细胞程序性死亡和衰老。
把MCF-7(图40)和BT-20(图41)细胞保养在存在T-寡核苷酸、对照寡核苷酸或单独的稀释剂的条件下。在两种细胞系中，TUNEL分析显示了在T-寡核苷酸处理的培养物中荧光峰值发生了移动，这表示DNA链断裂了。T-寡核苷酸处理的MCF-7细胞显示出与β-半乳糖苷酶(S.A.β-gal)活性关联的衰老的显著增加(图42)，其中β-半乳糖苷酶(S.A.β-gal)活性是一种已知在体内和体外鉴定衰老的细胞和非增殖性细胞的特征性标记。(Dimri，G.P.，等，Mol Cell Biol.20：273-285，2000)。
T-寡聚体诱导p53水平和活性。
如上所述将MCF-7细胞与T-寡核苷酸一起保养。对总的细胞蛋白进行蛋白质印迹。污点最初与磷酸-p53(丝氨酸-15)的抗体进行反应，蛋白形式被认为指示激活。切取后，将印迹与识别总p53的抗体反应，然后与抵抗p21的抗体-p53转录调节的基因产物进行反应。在48小时内，T-寡核苷酸诱导p53并且通过p53磷酸化和p21诱导测定p53的活性。用BT-20细胞得到了类似的结果。
T-寡核苷酸与顺式铂氨和ICI 182，780在抑制乳腺癌细胞增殖上是类似的。
如上所述培养MCF-7和BT-20细胞。给细胞补充T-寡核苷酸(40μM)、顺式铂氨(10μM)(Rudin，C.M.，等，Cancer Res.63：312-318，2003以及Deng，X.等Biochem Biophys Res Commun.296：792-798，2002)、抗雌激素ICI182，780(10-6M，仅仅MCF-7细胞)(Varma，H.，等，Cancer Res.62：3985-3991，2002和Sun，J.，等，Endocrinology，143：941-947，2002)或单独的稀释剂。T-寡核苷酸与顺式铂氨对细胞增殖的作用是类似的，其中顺式铂氨是一种通常用于治疗卵巢和乳腺癌的化学治疗剂(Burstein，H.J.，等，Semin.Oncol.28：344-358，2001；JakeszR.，等，Eur.J.Cancer 38：327-332，2002；Otto，A.M.，等，J Cancer Res Clin Oncol.122：603-612，1996；以及Sauter，C.，等，Oncology 43：46-49，1986)。T-寡核苷酸对于细胞增殖的影响与用于控制类雌激素受体蛋白阳性细胞MCF-7的抗雌激素的作用是类似的。(Otto，A.M.，等，J Cancer ResClin Oncol.122：603-612，1996)。参见图43和图44。
实施例42：T-寡核苷酸体外抑制人胰腺癌细胞的生长
HPAC细胞是一种获自患有中度的排泄管来源高度分化的胰腺癌的妇女的人胰腺癌上皮细胞细胞系，购自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚；ATCC序号No.CRL-2119)。将细胞铺板在35mm平皿中并且培养在Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基(DMEM)和含有1.2g/L碳酸氢钠的Ham′s培养基的1∶1混合物中，其中Ham′s培养基补充有15mM HEPES、0.002mg/ml的胰岛素、0.005mg/ml的铁传递蛋白、40ng/ml的氢化可的松、10ng/ml的表皮生长因子和5％的FBS。铺板24小时后，组三个一组的平皿补充40μM pGTTAGGGTTAG(T-寡核苷酸；SEQ ID NO：5)，40μM pCTAACCCTAAC(对照寡核苷酸；SEQ ID NO：9)或单独的稀释剂。每日测定细胞的产量。从绘制在图45中的结果可知，T-寡核苷酸显著地抑制HPAC细胞的生长。
实施例43：T-寡核苷酸抑制乳腺癌细胞和卵巢癌细胞的生长
设计两种用于实验的DNA寡核苷酸并购自Midland Certified试剂公司，Midland Texas：一个同源于端粒突出端重复序列(T-寡核苷酸：pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)，而另一个与用作对照的序列(pCTAACCCTAAC；SEQ ID NO：9)互补。
这些寡核苷酸的等分试样于-20℃储存，直至细胞处理之前立即在培养基中稀释。
癌细胞细胞系
人卵巢癌细胞系OVCAR5(获自Dr.Tayyaba Hasan，Harvard MedicalSchool)和乳腺癌细胞系MCF-7(获自ATCC人细胞库)被用于我们的研究中。将这些细胞在37℃培养在补充10％小牛血清(CS)的RPMI 1640培养基以及含有5％CO2的湿润空气中，然后转入实验用平皿并培养24小时。24小时后，将细胞进行处理。
细胞的培养
RPMI 1640培养基和胰蛋白酶-EDTA(10x；0.5％胰蛋白酶，5.3mMEDTA)获自Life Technologies，Rockville，MD，小牛血清(CS)获自Whittaker Bioproducts，Walkersville，MD。
将癌细胞单层培养在补充了10％小牛血清(CS)的RMPI 1640培养基中。所有细胞被37℃培养在5％CO2和100％湿度的环境中。
首先用与真空瓶相连的玻璃移液管转移培养基。加入磷酸盐缓冲的盐水(PBS)10分钟然后除去。用EDTA冲洗平皿两次，随后通过加入1ml的0.5％胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化并温育直至细胞分离。加入1ml的10％CS来终止胰蛋白酶的作用并作为养分的来源。然后除去溶液，同时将悬浮细胞冲洗到试管中。将这些悬浮液在3,500RPM下离心5分钟并随后除去上清液。然后重新将细胞团粒悬浮在2ml的新鲜培养基中。进行细胞计数，并将细胞分配到30个培养皿中。将含有10％CS的培养基加到新的平皿中，然后温育24小时。
细胞的处理
铺板24个小时后，将40μMT-寡核苷酸、对照互补的寡核苷酸、或等量的稀释剂加到2ml含有10％CS的培养基中处理细胞。然后将细胞温育3、4和5天的时间。
试验设计
如表3和4所示，进行两个独立的系列实验，一个用于跟踪细胞生长，另一个染色用于测定作为衰老标记的半乳糖苷酶活性的染色。
细胞生长的测定
通过利用Coulter细胞计数器测定OVCAR5和MCF-7细胞的生长抑制。收集处理3、4和5天后的细胞，造粒并重新悬浮在1ml的培养基中。将50μl的此种细胞悬液加至等渗的盐溶液中并利用细胞计数器计算此溶液中细胞。每一样品分别进行两次并计算这些值的平均数和标准偏差。
与β-半乳糖苷酶相关联的衰老的组织化学染色
将另一组细胞染色来检测与衰老-相关联的β-半乳糖苷酶(S.A.P-gal)活性。衰老的细胞表达β-半乳糖苷酶，其中β-半乳糖苷酶将X-gal底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷)裂解为具有蓝颜色的产物。
用PBS溶液冲洗细胞两次并用由2.7ml 2％甲醛和4ml 0.2％戊二醛在43ml PBS中反应5分钟制备的溶液来进行固定。染色剂是每天利用1ml的1mg/ml X-gal在二甲基甲醛、4ml的pH值为6.0的0.2M柠檬酸/磷酸钠缓冲液、1ml的100mM六氰基高铁酸钾(III)溶液、1ml的100mM六氰基高铁酸钾(IV)溶液、600μl的5M氯化钠、40μl的1M氯化镁以及13.4ml的蒸馏水新鲜制备的。
将2ml的染色剂加至每一平皿中。随后用石蜡密封平皿以防止染色剂的蒸发，37℃温育直至3天。每天加入新鲜的染色剂溶液。为了进行分析，用PBS将细胞冲洗两次并测定阳性染色细胞的百分比。
细胞计数的数据
从获自OVCAR5细胞计数的数据分析可见，用T-寡核苷酸处理与用稀释剂处理的对照平皿相比，其卵巢癌细胞数量减少了，这证明了T-寡核苷酸诱导与衰老相关联的复制型停滞(表5和图46)。
用对照互补寡核苷酸处理的培养基中的细胞数量也有轻微的减少。这些生长抑制的原因还不清楚，但其可能是由一些细胞类型对培养基中DNA的敏感性所引起的。
从获自MCF-7细胞的数据分析可见，用T-寡核苷酸处理与用稀释剂处理的对照平皿相比乳腺癌细胞数减少了。同样对照互补寡核苷酸对细胞生长有轻微的抑制(表6和图47)。
S.A.β-半乳糖苷酶染色结果
表达作为衰老标记的β-半乳糖苷酶的细胞典型地是尺寸较大的和多核的，这两种都是衰老的形态特征指示。在T-寡核苷酸处理后，正常人成纤维细胞的S.A.β-gal染色是阳性的。在OVCAR5细胞中，可以看到用稀释剂和互补寡核苷酸处理的细胞经染色没有由β-半乳糖苷酶染色产生的蓝色，也不表达任何衰老的表现型。仅仅有一种用T-寡核苷酸处理的细胞染色呈蓝色。然而，当在10×放大率下观察时，可观察到这些细胞与用对照处理的细胞相比具有较大的尺寸且这些细胞中的很多也是多核的。
在MCF-7细胞中，对照(稀释剂-处理的)平皿蓝色染色细胞的百分比为5.975％，而用T-寡核苷酸处理的平皿的为66.75％，用互补寡核苷酸处理的平皿的百分比为6.675％。T-寡核苷酸处理平皿中的细胞同样被观察到是多核的和较大的，而其它两个平皿中的细胞不表达这些指示衰老的形态。
概括地说，T-寡核苷酸抑制细胞生长并在所研究的卵巢癌和乳腺癌细胞两种中诱导较大的，扁平的、多核的形态。
此外，T-寡核苷酸诱导MCF-7乳腺癌细胞中S.A.p-gal的表达。
实施例44：T-寡聚体对黑色素瘤细胞的作用
寡聚核苷酸
设计实验来测定3个具有5′磷酸基团和磷酸二酯键的寡核苷酸的作用：一个同源于3′端粒突出端重复序列(T-寡核苷酸：pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)，一个与此序列互补(pCTAACCCTAAC；SEQ ID NO：9)以及一个与端粒序列无关的(pGATCGATCGAT；SEQ ID NO：10)(Midland Certified试剂公司，Midland，Texas)。
细胞培养和细胞周期分析。
把MM-AN、MU、PM-WK、MM-RU、MM-MC和RPM-EP黑色素瘤细胞培养在具有10％FBS的Minimum Essential Medium Eagle(MEM)中(两个都来自Gibco BRL，Gaithersberg，MD)。建立正常的新生儿人黑色素细胞并如前所述培养作为对照(Gilchrest，B.A.，等，J lnvestDermatol 83：370-376，1984)。复制本黑色素瘤细胞培养物被培养在具有5％FBS的MEM中并用终浓度为40μM的与端粒3′突出端序列同源的、互补的或无关的11-聚体寡核苷酸处理，或用等量的稀释剂(水)处理作为对照，处理96个小时。收集细胞，用碘化丙啶染色并通过BectonDickinson FACS扫描和CellQuest软件分析。
TUNEL分析
为了通过DNA末端标记检测细胞程序性死亡，培养细胞并用上述的寡核苷酸处理。处理72小时后，将细胞固定在4％多聚甲醛中30分钟并用0.1％Triton X-100浸透2分钟。通过使用荧光素标记的dUTP的来自BoehringerMannheim(Indianapolis，IN)的细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL分析。通过FACS检测TUNEL阳性的细胞。
Western印迹分析及其抗体。
将黑色素瘤细胞培养在含有5％FBS的MEM中并用40μM T-寡核苷酸、互补寡核苷酸、无关的寡核苷酸或等量的稀释剂(水)处理不同的次数。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-AGE)以及前面所述的Western印迹分析(Eller，M.S.，等，Proc Natl Acad Sci USA 93：1087-1092，1996)分析蛋白质，其中Western印迹分析利用抗酪氨酸酶单克隆抗体(克隆T311，Nova-castra，New Castle upon Tyne，UK)；抗-TRP-1单克隆抗体克隆(Ta99，Signet，Dedham，MA)；抗gp100单克隆抗体(MO 634，Dako公司，Carpinteria，CA)以及抗-MART-1/Melan-A单克隆抗体(克隆M2-7C10，Signet，Dedham，MA)；抗-活素/ML-IAP山羊多克隆抗体(AB798 Novus Biologicals Inc，Littleton，CO)。
动物
严重的联合免疫缺陷(SCID)小鼠购自Fox-Chase癌症中心，费城，PA且饲养在波士顿大学医疗中心的无病原体动物研究所。
T-寡核苷酸对黑色素瘤转移的作用。
在40μM下，T-寡核苷酸(pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)在72-96小时内诱导6种人黑色素瘤细胞系(MM-AN、MU、PM-WK、MM-RU、MM-MC和RPM-EP)30％-70％细胞的细胞程序性死亡，这是通过FACS分析和TUNEL染色测定的，而具有互补或无关序列的11-碱基寡核苷酸没有作用。
为了研究T-寡核苷酸对MM-AN细胞转移潜力的作用，在具有5％FBS的MEM中用40μMT-寡核苷酸、互补寡核苷酸或稀释剂处理这些细胞48小时。然后用胰蛋白酶/EDTA收集细胞并通过台盼蓝排除染色法测定活力百分比。仅具有90％或更大活力的细胞群体被用于此研究。在平衡盐溶液中的1×10细胞被注射到5周龄SCID小鼠的侧面尾部静脉中。使用三组小鼠。给组1被注射用T-寡核苷酸处理的细胞，给组2注射用互补对照寡核苷酸处理的细胞，以及给组3注射用稀释剂处理的细胞。40天后，通过吸入CO2对小鼠实施安乐死，进行尸体解剖并且宏观检验明显的器官损伤。同样用卡尺测量损伤。特别重点研究肺、胰腺、脑、棕色脂肪、肾脏以及骨，因为这些器官已经被证明是MM-AN细胞转移的初始位点。(Byers，H.R.，等，Melanoma Res 3：247-253，1993)。为了检验和切片，器官在PBS中冲洗并在10％福尔马林中固定48小时。在解剖显微镜下检验器官并计算肿瘤小瘤的数目。为了进行组织学检验，将肿瘤固定在福尔马林中并包埋在石蜡中。用苏木精和曙红将切片染色。转移的黑色素细胞来源通过黑色素的存在得到证实。
用于T-寡核苷酸致肿瘤性作用研究的SCID小鼠的处理
把MM-AN黑色素瘤细胞培养在含有5％FBS的MEM中并用胰蛋白酶/EDTA进行收集。通过皮内注射2×106在平衡盐溶液中的活细胞到SCID小鼠的侧腹区域中产生皮下肿瘤来测定这些黑色素瘤细胞的致肿瘤性。研究了每组6个小鼠的三组小鼠。注射黑色素瘤细胞72小时后开始每日两次肿瘤内注射寡核苷酸。给组1给药T-寡核苷酸，给组2给药互补对照寡核苷酸，给组3注射单独的稀释剂。在最后一次24小时处理后的22天后，小鼠被安乐死。用卡尺测量肿瘤，在10％福尔马林中固定，并用苏木精和曙红染色。利用gp-100和TRP-1单克隆抗体进行肿瘤的免疫组织化学染色。因为技术原因，酪氨酸酶和MART-1的表达不能在肿瘤中进行评价。
使用来自Intergen的ApopTag试剂盒(Purchase，NY)对肿瘤横切面进行TUNEL分析来测定细胞程序性死亡。
T-寡核苷酸在黑色素瘤细胞中诱导细胞程序性死亡。
用稀释剂、40μM T-寡核苷酸、40μM互补寡核苷酸或40μM无关的寡核苷酸处理MM-AN黑色素瘤细胞。在96小时后收集细胞，用碘化丙啶染色并通过FACS进行分析。以对数刻度显示数据，其使得细胞程序性死亡的群体被更好地直观化(图48)。用T-寡核苷酸处理之后，如通过细胞的亚G0/G1群体所显示的，65％的细胞进入细胞程序性死亡。如上所述处理MM-AN并用于TUNEL分析。荧光显示了作为细胞程序性死亡标记的片段DNA在T-寡核苷酸处理的细胞中的选择性标记(图49)。如上所述用稀释剂或寡核苷酸处理正常人黑色素细胞并在处理后24以及96小时收集细胞用于FACS分析。在线性刻度上的数据显示了S-期停滞(图50)。类似处理并显示在图48对数刻度上的MM-AN细胞同样在相同的FACS分布图上显示成白色，用于进行比较。
如同以前所报道的其它细胞类型一样，用T-寡核苷酸处理MM-AN细胞24和48小时后在S期被阻断(Eller，M.S.，等，Exp Cell Res276：185-193，2002；Eller，M.S.，等，Faseb J 17：152-162，2003)。在S-期停滞第72小时仍持续，但22％的出现在FACS分布图亚G0/G1区域上的MM-AN细胞显示出细胞程序性死亡，并且经过96小时细胞程序性死亡的细胞的百分比增加到65％(图48)。在72小时内的TUNEL分析证明了T-寡核苷酸处理的细胞的荧光强度有不同的增加，证实了普遍的细胞程序性死亡(图49)。对照寡核苷酸与稀释剂均不能单独影响细胞。MM-AN细胞不表达可检测水平的p53，但如以前所报道的(Eller，M.S.等，Exp Cell Res，276：185-193，2002)，T-寡核苷酸诱导的细胞程序性死亡是在E2F1和p73转录因子的增加之前，并且在异常表达的p73显著-阴性形式的MM-AN细胞中有50％被抑制，这表明了细胞程序性死亡至少在某种程度上受E2F1和p53同源物p73相互作用的介导。相比之下，T-寡核苷酸在96小时内在正常人黑色素细胞中不诱导细胞程序性死亡，尽管其的确在第24小时最显著地诱导S-期停滞(图50)，如以前所报道的关于这些细胞中的2-碱基胸腺嘧啶二核苷酸(Pedeux，R.，等，J Invest Dermatol 111：472-477，1998)和其它原代细胞类型和建立的细胞系中的11-碱基T-寡核苷酸(Eller，M.S.，等，Exp Cell Res 276：185-193，2002；Eller，M.S.，等，Faseb J 17：152-162，2003)。为了测定是否MM-AN细胞应答是独特的，检测了5个其它的黑色素瘤细胞系。其中的四个在用T-寡核苷酸处理96小时后产生细胞程序性死亡，通过FACS分析测定的细胞程序性死亡率在30％到60％的范围内。
蛋白活素，也称为ML-IAP或细胞程序性死亡蛋白的抑制剂，是通常在黑色素瘤细胞中被上调节的蛋白家族的一个成员并在至少一些细胞系中主要赋予对化学疗法诱导的细胞死亡的抗性(Kasof，G.M.等，J.Biol.Chem.276：3238-3246，2001；Vucic，D.等，Curr.Biol10：1359-1366，2000；Li，J.等，Endocrinology 142：370-380，2001；Sasaki，H.等，Cancer Res.60：5659-5666，2000)。
T-寡核苷酸减少活素/ML-IAP的表达。
用40μM的T-寡核苷酸、互补寡核苷酸、无关的寡核苷酸或等量的单独稀释剂处理MM-AN细胞，持续24、48或72小时。收集细胞并利用活素/ML-IAP的抗体进行蛋白质印迹。MM-AN细胞表达高度组成性水平的活素/ML-IAP，用T-寡核苷酸处理选择性地并显著地减少72小时内的表达。因此，在这些细胞类型中对T-寡核苷酸的细胞程序性死亡应答可能不仅通过前细胞程序性死亡蛋白E2F1和p73的诱导被调节，如以前所报道(Eller，M.S.等，Exp.Cell.Res.276：185-193，2002)，而且通过活素/ML-IAP被下调节。
黑色素瘤的发展通常与黑色素细胞特异性抗原的损失相关联，假定使肿瘤细胞逃避免疫监视并在免疫治疗的尝试中失败(Slingluff，C.L.，Jr.等，Cancer Immunol.Immunother 48：661-672，2000)。因为黑色素细胞分化与减慢细胞增殖相关联，如用T-寡核苷酸处理后所观察到的(Eller，M.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1087-1092，1996；Hadshiew，I.M.，等，J.Dermatol.Sci.25：127-138，2001；Pedeux，R.等，J.Invest.Dermatol.111：472-477，1998)，并且因为与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸增强人黑色素细胞和S91鼠黑色素瘤细胞的分化(黑化)(Eller，M.S.等，Nature 372：413-414，1994；Eller，M.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1087-1092，1996；Pedeux，R.等，J.Invest.Dermatol.111：472-477，1998)，我们检验了已被靶向用于免疫治疗的黑色素细胞分化抗原的表达。
T-寡核苷酸诱导黑色素细胞分化的标记
如上所述处理细胞并分析TRP-1、gp-100、酪氨酸酶和melan-A/MART-1的蛋白表达。
T-寡核苷酸诱导与黑色素细胞关联的分化标记物，与酪氨酸酶-相关的蛋白质(TRP-1或gp75)和醣蛋白100(gp100)，这两种频繁表达的抗原在更具侵害性的、分化不良的黑色素瘤中丢失了(Slingluff，C.L.，Jr.等，Cancer Immunol.Immunother 48：661-672，2000)。T-寡核苷酸也诱导黑色素生成中的酪氨酸酶，酪氨酸酶是速率限制性酶，之前已显示它在正常人黑色素细胞中通过其它具有与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性序列的寡核苷酸而被诱导(Eller，M.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1087-1092，1996)以及在人和鼠的黑色素瘤细胞中(Eller，M.S.等，Nature 372：413-414，1994；Eller，M.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1087-1092，1996；Pedeux，R.等，J.Invest.Dermatol.111：472-477，1998)以及一种在黑色素细胞和黑色素瘤中表达的蛋白MART-1，其是黑色素瘤免疫治疗中淋巴细胞亚组的识别目标(Rivoltini，L.等，J.Immunol.154：2257-2265，1995)。
上述数据表明与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸可以减少MM-AN肿瘤的形成和体内转移。为了研究这些可能性，将MM-AN细胞用40μMT-寡核苷酸、互补的寡核苷酸或单独的稀释剂处理48小时，然后收集、冲洗并置于不含寡核苷酸的培养基中。然后用寡核苷酸或单独的稀释剂处理48小时的细胞被注射到SCID小鼠(5个小鼠每组)的尾部静脉中，每次注射106个活细胞，通过台盼蓝排除法测定活力。注射40天后，接受了互补寡核苷酸的对照小鼠初始体重减少了大约12％，显示出有限的运动，并出现严重的疾病；T-寡核苷酸处理的动物体重增加了27％并表现健康。
注射40天后，小鼠被实施安乐死，进行尸体解剖，并通过肉眼观察器官以测定在脑、肝脏、胰腺和骨中肉眼可见的肿瘤转移的平均数和大小。与注射对照细胞的动物相比，注射了用T-寡核苷酸处理的细胞的动物事实上是无肿瘤的，在5个小鼠的4个中没有可检测的转移。与对照组(图51)相比，在注射之前用T-寡核苷酸处理MM AN细胞也减小了85％转移的平均体积，并且转移性肿瘤的平均数也减少了90-95％(图52)。尽管恶性细胞的预处理与体内已经建立的处理转移不相等，但是这些数据证明了相对短时间的暴露于T-寡核苷酸可以对这些不能通过组织环境逆转的细胞产生持久的影响。因为该大小的具有生理磷酸二酯键的寡核苷酸在培养中具有大约4-6小时的半衰期(Wright，W.E.等，EMBO J.15：1734-1741，1996)，在这些实验中，MM-AN细胞对T-寡核苷酸的有效曝光时间可能远小于48小时。
为了测定是否T-寡核苷酸能影响肿瘤发生前的生长，将2×106个MM-AN细胞皮下注射到SCID小鼠的侧腹中(6个小鼠/组)。开始72小时后，当小的肿瘤小结开始明显时，每天给位点注射两次60nmole的T-寡核苷酸(150μl的0.4mM溶液)、作为对照的互补寡核苷酸或等量的单独稀释剂。22天后，动物被实施安乐死并测定肿瘤的大小。在稀释剂和对照寡核苷酸处理的小鼠之间的肿瘤大小没有显著的差异，但T-寡核苷酸处理分别减少了84％和88％的肿瘤体积(p＜0.05)，如通过卡尺对肿瘤测定的。对照小鼠产生了大的肿瘤，但T-寡核苷酸处理的小鼠产生的肿瘤非常的小(3个小鼠)或检测不到(3个小鼠)。如同在最后一次注射24小时后获得的组织横切片上所测定的，在最后一次注射24小时后T-寡核苷酸诱导与在第22天通过TUNEL分析所观察到的相同的肿瘤细胞细胞程序性死亡。T-寡核苷酸处理也大大增强了在小的残留小结中的与蛋白gp100和TRP-1相关联的分化。在所有的动物中注射的肿瘤小结周围的组织显现为正常的，如在免疫染色切片中所示的。
MM-AN细胞体外初始接触48小时后，T-寡核苷酸作用在体内持续了至少40天；并且在T-寡核苷酸接触然后进行每天两次的局部注射之前，可以观察到与在体内建立的MM-AN细胞中类似的程度。
实施例45：寡核苷酸序列对诱导黑色素瘤细胞中细胞程序性死亡的影响
                       表7 程序性死亡的细胞％
 SEQ ID NO：  72小时  96小时
 稀释剂  2.8±0.3  2.3±0.4
 TTA GAGTATGAGTTA  16  8.5±0.6  22±1
 TTA GAGTATGAG  17  13.6±1.3  33.1±2.8
  GAGTATGAGTTA  18  12.2±2.5  22.8±1.5
 GTTAGGGTTAG  5  18.5±1  43.4±1
合成具有与端粒突出端重复有至少50％核苷酸序列同一性的序列的寡核苷酸(全部具有5′磷酸基)。将人黑色素瘤细胞系MM-AN的培养物用这些寡核苷酸以40μM的浓度处理72和96小时，并且通过FACS分析测定程序性死亡的细胞的百分比。所有的寡核苷酸都诱导细胞程序性死亡(表7)。
实施例46：T-寡核苷酸的水解是活性所必需的
合成SEQ ID NO：5的寡核苷酸。全合成具有一个硫代磷酸酯主链的寡核苷酸1。寡核苷酸2在每一末端具有两个硫代磷酸酯键，并且在中间的其它键是磷酸二酯键。寡核苷酸3在5′末端(5′末端阻断)具有两个硫代磷酸酯键，并且其它的键是磷酸二酯键。寡核苷酸4在3′末端(3′末端阻断)具有两个硫代磷酸酯键，并且其它的键是磷酸二酯键。参见图53。
这些寡核苷酸被添加到正常新生的成纤维细胞的培养物中。48小时后，收集细胞通过Western印迹分析其p53丝氨酸15的磷酸化和p95/Nbsl的磷酸化。在存在寡核苷酸的条件下将其它的培养物保留一周时间然后将细胞染色来分析与衰老相关联的β-半乳糖苷酶的活性(S.A.p-Gal)。记录β-半乳糖苷酶阳性的细胞并显示为总细胞的百分比(图54)。
具有易受核酸酶影响的3′末端的寡核苷酸在刺激“早期”应答诸如p53和p95/Nbsl的磷酸化时是最有效的。然而，具有易受核酸酶影响的5′末端的寡核苷酸在一周后还可以诱导衰老的表现型，而在第48小时的磷酸化反应却不能，此暗示3′→5′核酸酶敏感性是诱导衰老的活性所优选的。
实施例47：T-寡核苷酸诱导分化
BT-20细胞，人乳腺癌雌激素受体蛋白阴性的细胞，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC登记号：HTB-19被保养在含有2mM L-谷氨酰胺的极限必需培养基(Eagle)中并且调整后的Earle′s BSS含有1.5g/L的碳酸氢钠、0.1mM的非必需的氨基酸和90％的1.0mM丙酮酸钠、10％的胎儿牛血清。铺板24小时后，给平皿补充40μMpGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)、40μM的pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)对照寡核苷酸；或单独的稀释剂。7天后收集总的细胞蛋白质并用于Western印迹分析。印迹与作为抗体的抗雌激素受体蛋白反应。与稀释剂处理的或pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)处理的细胞中的受体水平相比，40μM的pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)显著地诱导雌激素受体α的水平。这些实验表明了用与端粒突出端重复序列具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸处理诱导了乳腺癌细胞的分化，并且可赋予它们对用抗雌激素处理的敏感性。
实施例48：T-寡核苷酸诱导了人纤维肉瘤细胞中与衰老-相关联的-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性
用单独的稀释剂、40μMT-寡核苷酸(pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)或互补的寡核苷酸pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)处理人纤维肉瘤细胞4天时间，然后根据Dimri等所描述的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9363-9367，1995)用X-gal染色来分析SA-β-Gal活性。
在另一实验中，将平行的培养物用单独的稀释剂或40μM T-寡核苷酸(pGTTAGGGTTAG；SEQ ID NO：5)或互补的寡核苷酸pCTAACCCTAAC(SEQ IDNO：9)处理4天时间。用PBS冲洗细胞一次并且用完全培养基重新培养24小时或48小时，然后用X-gal染色来分析SA-β-Gal活性。
T-寡核苷酸处理的纤维肉瘤细胞丧失了产克隆能力
用稀释剂、40μM T-寡核苷酸或互补的寡核苷酸处理人纤维肉瘤细胞一周时间，然后用胰蛋白酶消化并计数。三百个细胞被一式三份地接种到60mm培养皿中，然后在4ml的完全培养基中温育2周；每周两次更换培养基。随后，除去培养基，将细胞在4ml的甲醇中固定5分钟。除去甲醇，用水简单地冲洗培养皿，将细胞克隆在4ml的4％(w/v)PBS的亚甲蓝溶液中染色10分钟，用水再次冲洗，然后计数。集落的产量，作为铺板细胞的百分比，稀释剂处理的细胞的集落产量为～100％，用T-寡核苷酸处理的细胞的集落产量为～6％，以及用互补寡核苷酸处理的细胞的集落产量为～91％。
T-寡核苷酸激活p53和pRb的途径
将人纤维肉瘤细胞用稀释剂、40μM T-寡核苷酸或互补的寡核苷酸处理4天，然后收集，通过每种条件下使用30μg总蛋白/状况的Western印迹进行蛋白质分析，以及探针检测总p53、磷-p53(丝氨酸15)和磷-pRb(丝氨酸780)的。为了进行p53检测，首先对印迹进行磷-p53(丝氨酸-15)的探针检测，然后剥离并用泛嗜性p53抗体DO-1再次进行探针分析。
来自所有三种蛋白制剂的蛋白被p53抗体DO-1结合。通过抗体将来自稀释剂处理的细胞以及来自互补寡核苷酸处理的细胞的蛋白被结合于丝氨酸780被磷酸化的pRb上。仅仅来自T-寡核苷酸处理的细胞的蛋白被通过抗体结合于在丝氨酸15被磷酸化的p53上。
实施例49：用pTT预处理延迟肿瘤的形成并减少XPC+/-小鼠中UVB诱导的肿瘤的数量
将SKH1无毛野生型(WT)和XPC+/-敲除(KO)的小鼠(每试验组8个动物)用胸腺嘧啶二核苷酸(pTT，100μM)或单独的稀释剂(丙二醇75％/DMSO 25％)一天一次地持续5天时间进行局部的预处理，然后UVB照射3周时间，一天一次地持续5天时间(WT小鼠用30mJ/cm2，而KO用5mJ/cm2在285±5nm处模拟日光的计量的UV)。
一周每天给小鼠局部施用pTT(或单独的稀释剂)，接着是3周的每天紫外线照射的5个连续的循环(150天)。预处理一周，然后是三周的UVB，将这指定为一个周期。随着循环最初25mJ/cm2的UVB剂量被增加1.5倍。最初UVB照射160天后，小鼠被处死。以最初的UVB照射后以周为基础在第5周评价肿瘤的发病率和重复次数。
在第6周时，25％的稀释剂处理的小鼠在UVB照射区域上产生了肿瘤，而所有pTT处理的小鼠无肿瘤直至UVB后第12周。在第12周时，75％的稀释剂处理的小鼠已经有已经具有肿瘤。
在最初始的UVB照射后160天，当所有小鼠被处死时，所有稀释剂处理的小鼠产生了一种或多种肿瘤，而33％的pTT-处理的小鼠继续没有肿瘤。参见图55。
与稀释剂处理相比，pTT处理将最初UVB照射160天后WT和XPC小鼠的肿瘤平均数减少了一半，7.25±0.87比3±0.94(分别为稀释剂对pTT，p＜0.006)。pTT处理对稀释剂处理小鼠在肿瘤/动物平均数方面的统计学上显著的差异也可在第12到第16周之间检测到(p＜0.05)，尽管实验动物的数量小。参见图56。
所有的被照射小鼠的皮肤表面上至少1mm2大小的肿瘤在实施安乐死的时侯被切除、经福尔马林固定、包埋、纵向切片并且用苏木精和曙红染色。然后由皮肤病专家以不受抑制的方式在光学显微镜(40×)下检查每一肿瘤的切片，不知道其中产生肿瘤的试验组(pTT或载体对照)。使用诊断正常的、恶变前的和恶性损伤的常规的病理学标准并且包括核异型的程度、细胞分化失败以及细胞穿过基底膜侵入到真皮中。如所期望的，恶变前的光化性角化病比侵袭性的鳞状细胞性癌更多，但在稀释剂处理中两种典型的损伤比在pTT处理动物中的大两倍。参见图57。
实施例50：肿瘤内注射pTT后UV诱导的肿瘤退化
将无毛XPC纯合的敲除(KO)小鼠每周UVB照射5天持续1周。第一个UV诱导肿瘤在7周后开始显现，并且在经过最初的UVB照射后的第160天，大多数的肿瘤在表面外形上大于2-4mm2。四个动物被分成两个组，每一组中有2个动物。选择每个动物的三个大小和外观相同的肿瘤用于稀释剂和pTT的肿瘤内注射。
用15-20μl的pTT(40μM)或稀释剂注射肿瘤，一周三次，持续两周。在第一个肿瘤内注射11和19天后测定肿瘤。
评价每种处理状况的总共六个肿瘤在肿瘤内注射稀释剂或pTT后生长模式的改变。在第11天，pTT注射导致UV诱导的肿瘤大小在统计学上显著地减小。在第19天，一些肿瘤完全地消失(p＜0.003)。在稀释剂注射的肿瘤中没有检测到对恶性生长的抑制。在第19天，这些试验组中肿瘤的大小约有25％的增加。参见图58。
实施例51：pTT处理减少了单剂量和长期紫外线照射后野生型和XPC敲除小鼠皮肤中UV-诱导的突变
同样对无毛野生型(WT)和纯合的XPC敲除(KO)小鼠进行转基因改造使其含有LacZ/pUR288突变指示基因(2-5个动物/试验组)，用胸腺嘧啶二核苷酸(pTT，100μM)或单独稀释剂预处理小鼠，一天一次持续10天。将小鼠用UVB照射一次(WT小鼠用25mJ/cm2，而KO小鼠用5mJ/cm2计量的285±5nm处的模拟日光UV)。14天后，动物被实施安乐死。分离表皮DNA并用于分析LacZ基因中产生的突变。
两种基因型小鼠中的基态突变频率是类似的。紫外线照射导致用稀释剂预处理的小鼠(分别为WT和KO)表皮中的LacZ基因突变频率增加了大约10倍。对pTT处理的WT小鼠皮肤的变异分析显示出突变频率降低了31±5％(p＜0.05)。与稀释剂-预处理的对照KO小鼠相比，pTT-预处理的KO小鼠显示了26％的较低的突变频率，尽管这些在统计学上是不显著的。
小鼠接受5个连续的循环(150天)，每个循环为一周的每天局部施用pTT或单独的稀释剂的处理，接着是3周时间的每天紫外线照射。160天后，对小鼠进行突变频率的评价。在长期的UV照射后，小鼠皮肤中的突变频率比单剂量UV辐射后的突变频率高10倍。与稀释剂处理相比，pTT处理使照射的WT和KO小鼠皮肤中的突变频率降低了28％和31％(分别为p＜0.08和p＜0.04)。培养的小鼠LacZ转基因成纤维细胞的早期数据显示了T-寡核苷酸预处理降低了UV-诱发的突变频率。
实施例52：与端粒3′突出端同源的寡核苷酸刺激依赖于p21的对氧化性损伤的适应性应答。
成纤维细胞暴露于40μMT-寡核苷酸pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)激活了p53，如通过p53丝氨酸15的磷酸化测定的，经过24和48小时，具有比由pTT产生的高3倍的应答(100μm)(Western印迹)。二氯荧光素二乙酸酯分析显示用pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)和pTT处理与用对照寡核苷酸pCTAACCCTAAC(SEQ ID NO：9)和pCC或单独稀释剂处理相比较，在36小时内活性氧物质增加了(p＜0.002)。特异性的NADPH氧化酶抑制剂氯化二苯碘阻断活性氧的产生，并且与野生型对照细胞相比较，T-寡核苷酸不能在p21-null小鼠胚胎的成纤维细胞中诱导活性氧物质。在48和72小时内，pGTTAGGGTTAG(SEQ IDNO：5)，而不是pTT适度地诱导与衰老相关联的β-半乳糖苷酶染色，这与延长T-寡核苷酸处理(≥7天)诱导成纤维细胞衰老的能力相符合。在成纤维细胞中，产生的作用看上去取决于与端粒的3′突出端同源的程度以及取决于处理的持续时间：仅仅延长的接触导致衰老，而≤72小时的接触以p53-和p21-依赖的方式诱导活性氧物质的水平以及诱导过氧化物歧化酶(SOD)的水平。
将正常的新生的成纤维细胞用pTT或用作为对照的稀释剂处理最多4天，并且收集用于RNA分离。Northern印迹分析显示SOD2 mRNA被pTT诱导。
将正常的新生的成纤维细胞用pTT或用作为对照的稀释剂处理直至32小时，并且收集来提取蛋白质用于Western印迹分析。结果表明SOD2蛋白被pTT诱导。
将正常的新生的成纤维细胞用pTT或用作为对照的稀释剂处理最多4天，并且被收集用于RNA分离。Northern印迹分析显示SOD1 mRNA被pTT诱导。
将正常新生的成纤维细胞被用pTT或用作为对照的稀释剂处理最多32小时，并且收集来提取蛋白质用于Western印迹分析。结果表明SOD1蛋白被pTT诱导。
将新生的成纤维细胞用40μM T-寡核苷酸pGTTAGGGTTAG(SEQ IDNO：5)或用作为对照的稀释剂处理直至72小时，并收集细胞用于RNA分离和Northern印迹分析。两个已知的SOD2的转录本在T-寡核苷酸处理的过程中被诱导。
将正常的新生的成纤维细胞用pTT或用作为对照的稀释剂处理3天，重新接种到相同的密度，并暴露于50μM在DME中的过氧化氢溶液或作为对照的单独的DME。然后在8、24、48和72小时时收集细胞用于通过Coulter计数器测定细胞的产率。观察到用pTT预处理激发对过氧化氢的抗性。
将新生的成纤维细胞用pTT或用作为对照的稀释剂处理两天，用10J/cm2UVA照射。将细胞重新铺板在200个细胞/100mm的平皿上，培养15天。细胞菌落被固定，用亚甲基蓝染色以及计数。在由UVA照射产生氧化性应激后，用pTT预处理增加了细胞活力，如通过菌落形成率所测定的。
实施例53：T-寡核苷酸增加了DNA的修复能力并促进成纤维细胞中DNA光化产物的去除
两种不同的DNA修复分析被用于评价用T-寡核苷酸(40μM)、两种不同的对照寡核苷酸(40μM)或稀释剂对照预处理两天后培养的初级新生人成纤维细胞中的DNA修复。
第一个分析是利用质粒pCMVluc进行的宿主细胞重激活分析。在此分析中，用UVB体外照射质粒，并且随后利用脂转染胺转染到人成纤维细胞中。UVB诱导的DNA损伤(DNA光化产物；主要为胸腺嘧啶二聚体和6，4-光化产物)在质粒编码的荧光素酶可被表达之前，必须由细胞的DNA修复酶进行修复。因此，转染两天后的细胞提取物中的荧光素酶活性反映出宿主细胞修复DNA光化产物的效率。
将宿主细胞再激活(其反映DNA修复能力)表示为荧光素酶活性，相对于用未经照射的对照质粒转染的平行样品中的荧光素酶活性。图59显示了一个三个一组样品的典型实验的结果；平均值±标准偏差。用来自不同供体的细胞进行的重复实验产生了类似的结果。T-寡核苷酸增加了成纤维细胞中的DNA修复能力。
第二分析测定了在照射后不同时间时所分析的成纤维细胞样品中DNA光化产物的量。用2J/m2 UVB照射细胞并立即溶解或2、4或6小时后进行溶解。在T4核酸内切酶V存在下对细胞DNA进行碱性洗脱，T4核酸内切酶在具有嘧啶二聚体的位点裂解DNA。为了定量评价T4核酸内切酶V位点的数目(＝嘧啶二聚体的数目)，将具有已知DNA损伤数目的标准样品用于校准。图60中显示了3到5个成纤维细胞独立样本的结果；平均值±标准偏差。T-寡核苷酸加速了成纤维细胞中DNA光化产物的去除。
等价物
虽然已经显示了本发明并且参考其优选的实施方案对本发明进行了描述，但本领域的技术人员可以理解，在不偏离包含在所附的权利要求书中的本发明范围的情况下可以在形式和细节上作各种变化。

Claims (70)

1.一种用于治疗哺乳动物的过度增殖性疾病的方法，所述方法包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物是人。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的组合物包括一种或多种选自下列的寡核苷酸：
a)2-200个核苷酸长度的寡核苷酸；
b)2-20个核苷酸长度的寡核苷酸；
c)5-11个核苷酸长度的寡核苷酸；和
d)2-5个核苷酸长度的寡核苷酸。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的寡核苷酸含有一个或多个非-磷酸二酯键但可以通过酶催化裂解方式来释放3′末端的核苷酸。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的组合物含有寡核苷酸pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)、pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)、pGGGTTAGGGTT(SEQ ID NO：13)、pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)或pTT。
6.根据权利要求1的方法，其中所述的组合物含有寡核苷酸pTTAGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：16)、pTTAGAGTATGAG(SEQ ID NO：17)或pGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：18)。
7.一种抑制人癌细胞生长的方法，包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列有至少50％的核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的组合物含有一种寡核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18。
9.根据权利要求7的方法，其中所述的癌细胞选自淋巴瘤细胞、骨肉瘤细胞、黑色素瘤细胞、白血病细胞、子宫颈癌细胞以及鳞状细胞瘤细胞。
10.根据权利要求7的方法，其中所述的癌细胞选自乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞和纤维肉瘤细胞。
11.一种促进哺乳动物中恶性细胞分化的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n具有至少50％的核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
12.一种用于增强指示人癌细胞分化的一种或多种表面抗原表达的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n具有至少50％的核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的癌细胞为黑色素瘤细胞。
14.根据权利要求12的方法，其中所述的抗原为MART-1、酪氨酸酶、TRP-1或gp-100。
15.根据权利要求12的方法，其中所述的组合物含有pTT。
16.根据权利要求12的方法，其中所述的组合物含有包含SEQ IDNO：5的寡核苷酸。
17.根据权利要求12的方法，其中所述的癌细胞为乳腺癌细胞。
18.一种用于诱导人体癌细胞的细胞程序性死亡的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。
19.根据权利要求18的方法，其中所述的寡核苷酸含有一个或多个非-磷酸二酯键但可以通过酶催化裂解方式来释放3′末端的核苷酸。
20.根据权利要求18的方法，其中所述的癌细胞是黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞或乳腺癌细胞。
21.根据权利要求18的方法，其中所述的寡核苷酸包括SEQ IDNO：5、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18。
22.一种抑制哺乳动物中癌细胞生长的方法，所述的方法不依赖于所述细胞中端粒酶的存在或活性，它包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
23.一种抑制哺乳动物中癌细胞生长的方法，所述的方法不需要所述细胞中p53正常功能的存在或活性，它包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
24.一种抑制哺乳动物中癌细胞生长的方法，所述的方法导致所述细胞中S-期的停滞，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于人。
25.根据权利要求24的方法，其中组合物包括一种或多种小于6个核苷酸长度的寡核苷酸。
26.一种用于防止哺乳动物的皮肤在暴露于紫外线后形成海绵样皮肤水肿、水泡或角化不良症的方法，所述方法包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n具有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的组合物含有pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。
28.根据权利要求26的方法，其中所述的组合物含有pTT。
29.一种用于减少人的皮肤癌发生的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。
30.根据权利要求29的方法，其中所述的组合物含有pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。
31.根据权利要求29的方法，其中所述的组合物含有pTT。
32.一种用于减少具有着色性干皮病或其它皮肤癌遗传倾向性的人的皮肤癌发生的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。
33.根据权利要求32的方法，其中所述的组合物含有pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。
34.根据权利要求32的方法，其中所述的组合物含有pTT。
35.一种用于增强人修复紫外线照射-诱导的皮肤损伤的方法，所述方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复序列有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。
36.根据权利要求35的方法，其中所述的组合物含有pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)。
37.根据权利要求35的方法，其中所述的组合物含有pTT。
38.一种用于减少哺乳动物的氧化性损伤的方法，所述方法包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
39.根据权利要求38的方法，其中将所速的组合物给药于皮肤。
40.根据权利要求38的方法，其中所述的组合物含有pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
41.根据权利要求38的方法，其中所述的组合物含有pTT。
42.一种用于治疗哺乳动物黑色素瘤的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与(TTAGGG)n有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物给药于哺乳动物。
43.根据权利要求42的方法，其中所述的哺乳动物是人。
44.根据权利要求42的方法，其中所述的组合物含有pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
45.根据权利要求42的方法，其中所述的组合物含有pTT。
46.一种用于减少人的皮肤中角质细胞增殖的方法，所述的方法包括将有效量的含有一种或多种与人端粒突出端重复有至少50％核苷酸序列同一性的寡核苷酸的组合物施用于皮肤。
47.根据权利要求46的方法，其中所述的人患有脂溢性角化病、光化性角化病、博文氏病、鳞状细胞癌或基底细胞癌。
48.根据权利要求46的方法，其中所述的组合物含有pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
49.根据权利要求46的方法，其中所述的组合物含有pTT。
50.一种含有寡核苷酸的组合物，其中所述的寡核苷酸为pGAGTATGAG(SEQ ID NO：1)、pCATAC(SEQ ID NO：6)、pGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)、pGGGTTAGGGTT(SEQ ID NO：13)或pTAGATGTGGTG(SEQ ID NO：14)。
51.一种含有寡核苷酸的组合物，其中所述的寡核苷酸为pTTAGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：16)、pTTAGAGTATGAG(SEQ ID NO：17)或pGAGTATGAGTTA(SEQ ID NO：18)。
52.一种用于抑制哺乳动物中上皮细胞增殖的方法，包括将有效量的含有至少一种寡核苷酸的组合物给药于上皮细胞，其中该寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12的碱基序列以及任意的上述序列的连续部分。
53.根据权利要求52的方法，其中所述的寡核苷酸是单链的。
54.根据权利要求52的方法，其中所述的寡核苷酸包括5′磷酸。
55.根据权利要求52的方法，其中所述的组合物包含大约1μM到大约500μM浓度的寡核苷酸。
56.根据权利要求52的方法，其中所述的寡核苷酸被紫外线照射。
57.根据权利要求52的方法，其中所述的组合物含有在脂质体中的寡核苷酸。
58.根据权利要求52的方法，其中所述的组合物含有丙二醇。
59.根据权利要求52的方法，其中所述的组合物是通过口服给药的。
60.根据权利要求52的方法，其中所述的组合物是通过气雾剂给药的。
61.根据权利要求52的方法，其中所述的哺乳动物是人。
62.根据权利要求52的方法，其中所述的上皮细胞是恶性肿瘤细胞。
63.一种用于防止或减少哺乳动物的细胞中DNA损伤的方法，其中所述的DNA损伤是由射线或损伤DNA的化学试剂导致的，它包括用有效量的含有至少一种寡核苷酸的组合物接触所述的细胞，其中该寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12的碱基序列以及任意的上述序列的连续部分。
64.根据权利要求63的方法，其中所述的细胞是上皮细胞。
65.根据权利要求63的方法，其中所述的寡核苷酸是单链的。
66.根据权利要求63的方法，其中所述的寡核苷酸包括5′磷酸。
67.根据权利要求63的方法，其中所述的组合物含有大约1μM到大约500μM浓度的寡核苷酸。
68.根据权利要求63的方法，其中所述的组合物包含一种生理上可接受的载体。
69.一种含有至少一种寡核苷酸的组合物，其中所述的寡核苷酸包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13 NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的碱基序列。
70.根据权利要求69的组合物，其中所述的寡核苷酸包括5′磷酸。
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