CN1717581A - 波长可调谐表面等离子体激元谐振传感器 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于感测、成像和表征探针区组成变化的方法、器件和器件部件。更特别地，本发明提供了用于探测探针区折射系数变化的方法和器件，其中该探针区临近感测表面，优选地临近于由导电薄膜构成的支持表面等离子体激元形成的感测表面。此外，本发明提供了用于在探针区内产生表面等离子体激元并通过形成探针区的一个或多个表面等离子体激元谐振曲线和/或表面等离子体激元谐振图像表征探针区组成的方法和器件。

Description

波长可调谐表面等离子体激元谐振传感器

关于联邦政府资助研究或开发的声明

本工作由美国政府准予资助，NIDCR许可1UO1 DE14971-01。

背景技术

表面等离子体激元谐振(SPR)显微镜是一种通过激发表面等离子体激元(SP)来探测与感测表面相邻的被探测区域化学和物理变化的技术。已经开发出了多种基于SPR技术的传感器，为表征金属薄膜表面上存在的超薄膜的厚度和折射系数提供了一种灵敏的装置。近年来，SP传感器被广泛地用于表征各种生物材料的化学和物理性质以及实时地探测结合事件。例如，SP传感器已经被成功地用于表征大量表面的形态学，探测蛋白质之间、蛋白质与DNA之间以及蛋白质与小分子之间的动力学(kinetics)和动态学(dynamics)，监视抗体-抗原结合以及表征DNA杂交过程。

表面等离子体激元(surface plasmons)，也称作表面等离子体激元波(surface plasmon waves)或等离子体激元极化振子(plasmonpolaritons)，是电荷密度波，其平行于导电或半导电薄膜与电介质样品层之间的界面传播。SP是通过将入射光子的辐射能耦合到导电材料，例如金属，或者半导体材料内存在的自由电子的振荡模式中而产生的。SP高度集中在导电(或半导电)层的表面，且SP的电场强度在垂直于其传播平面的方向上成指数地衰减。SP的空间分布能够通过表征衰减长度加以量化地描述，衰减长度是指SP的强度衰减到其在导体(或半导体)-电介质样品层界面上的数值的e^-1倍的距离。衰减长度(L)由下式给出：

$L=\frac{1}{2\mathrm{Re}(k_{\mathrm{sp}}^2+k_s^2)}---\left(I\right)$

其中Re是圆括号内量的实部，k_sp是表面等离子体激元波矢，k_s是临近导体(或半导体)的电介质样品层的波矢。对于由水构成的电介质样品层和由金构成的导电薄膜，波长为大约632.8nm的光的衰减长度等于83.1nm。SP高度集中的特性使得它们完美地适合于探测位于感测表面附近(≤约300nm)的感测区域内折射系数的非常小的变化。

在传统的SPR方法中，SP是通过入射光束的全内反射产生的瞬时(evanescent)电磁波激发的。在Kretschmann-Raether几何布置中，瞬时电磁波透过位于较高和较低折射系数电介质层之间的金属薄膜(≈50nm)并激发SP，SP平行于位于较低折射系数层附近的金属膜的外表面传播。为了获得入射激发光和表面等离子体激元之间的波矢匹配条件，棱镜是必需的。对于给定的电介质样品，具有特定波长并且以特定角度入射的光子将产生瞬时波，其透过金属层并在金属-电介质样品界面激发表面等离子体激元。因此反射光的强度将减小并能够被监测作为SP发生的信号。选择地，在Otto SPR配置中，金属层和棱镜被空气隙隔离，SP在金属膜临近棱镜的一侧上被激发。Otto SPR配置的缺点是，在实验上难以保持非常薄而恒定的空气隙厚度。最后，在其他的SPR方法中，表面等离子体激元是通过当光沿着具有薄金属内层的光纤或者波导管传播时产生的瞬时场产生的。

通过全内反射激发SP是一种谐振现象，其取决于入射光的波矢(也就是，入射光束的波长和入射角)。此外，SP的激发取决于较高折射系数层、较低折射系数样品层和用于将辐射能耦合到导体自由电子振荡模式中的导电(或半导电)薄膜的折射系数和厚度。SP的色散方程由下式给出：

$k_{\mathrm{sp}}=k_0\sqrt{\frac{{\mathrm{\ϵ}}_c{\mathrm{\ϵ}}_d}{{\mathrm{\ϵ}}_c+{\mathrm{\ϵ}}_d}}---\left(\mathrm{II}\right);$

其中k₀是自由空间波矢(k₀＝ω/c)；ε_c和ε_d分别是导电(或半导电)薄膜和较低折射系数电介质样品层的复合介电常数，ω是角频率。激发SP的谐振条件是，入射波矢(k_par)的平行分量必须等于表面等离子体激元波矢(k_sp)：

k_par＝k_sp         (III)

入射波矢的平行分量可以用光所入射的介质的折射系数n、入射角θ和入射光束的波长λ通过形成SP的等式加以表示：

$k_{\mathrm{par}}=\frac{2\mathrm{\π}n\sin \left(\mathrm{\θ}\right)}{\mathrm{\λ}}---\left(\mathrm{IV}\right)$

将等式II和IV带入等式III给出了如下的关系，其根据入射角和入射波束的波长表达形成表面等离子体激元的谐振条件：

$\frac{2\mathrm{\π}n\sin \left(\mathrm{\θ}\right)}{\mathrm{\λ}}=k_0\sqrt{\frac{{\mathrm{\ϵ}}_c{\mathrm{\ϵ}}_d}{{\mathrm{\ϵ}}_c+{\mathrm{\ϵ}}_d}}---\left(V\right)$

由等式V可以显见，对于给定的金属膜厚度和电介质层折射系数设定，谐振条件可以通过改变入射角或者入射光束的波长或者同时改变两者加以满足。

在SP色散关系的推导中(等式II)，产生表面等离子体激元必须满足的两个附加条件变得显而易见。首先，SP被p-偏振所以只能被p-偏振的入射光激发。其次，SP只有在由具有实异号介电常数(realpermittivites of opposite sign)的介质构成的界面上才被支持。

如等式II-V所示，临近金属薄膜的电介质样品层折射系数的改变会改变产生SP的谐振条件。谐振条件的这一个变化能够通过测量反射入射波束的强度作为入射角、入射波束的波长或者两者的函数直接地加以监视。满足谐振条件会导致反射波束的强度急剧衰减，这是由于入射波束的辐射能在金属薄膜与较低折射系数层之间的界面上转变成了SP造成的。由于SP的空间定位特性，SP也被用于激发光致发光材料。明确地讲，是以激发电子跃迁产生荧光或光致发光的方式将SP的能量耦合到光致发光材料中。一个附加的探测器能够被设置成与感测表面光学联通，用于测量由SPR处理泵发的材料的荧光强度。衰减反射SPR方法与SPR诱导荧光的组合已经被示范地提供用于表征在传感器表面发生的化学和物理变化的灵敏装置。

基于SPR的传感器利用了SPR谐振条件对于位于金属(或半导体)薄膜附近的较低折射系数电介质样品层的折射系数改变的依赖。在典型的感测装置中，用于形成SP的谐振条件的变化被实时地监测并直接与金属(或半导体)薄膜附近的感测表面上发生的化学或物理变化相联系。基于SPR的传感器可以通过操作感测表面的化学或物理性质对材料和化合物进行灵敏的探测。在这些装置中，感测表面可以涂覆一种可显示选择性结合特性的材料，从而当存在待感测的特殊材料时折射系数会变化。例如，感测表面能够通过涂覆某种抗体的抗原而对特殊的抗体敏感。利用这些原理，SPR探测能够成功地结合于大量商业上可获得的生物传感器件中，包括BIAcore有限公司制造的传感器和扫描器件。

一般地，SPR光学配置包括(1)电磁辐射源，(2)具有第一折射系数的透光部件，(3)具有比透光部件的第一折射系数更小的第二折射系数的电解质样品层(探针区)，(4)位于透光部件和电解质样品层(探针区)之间的导电或半导电薄膜以及(5)探测器。在这一配置中，入射波束以一定的入射角度透过透明区域从而能够在透光部件与导电薄膜之间的表面上经历全内反射。反射的入射波束被收集和导向到探测器，该探测器能够测量其强度作为时间的函数。如果满足等式II-V列出的谐振条件，则辐射能量在导电或半导电薄膜与电介质样品层之间的界面上被转移给SP，导致被反射入射波束的强度产生可以测量的降低。

基于SPR的传感器可以采用多种不同的光学配置。示例光学配置在如下文献中有说明：Rothenhausler，B and W.Knoll(1988).“surface-plasmon microscopy.” Letters to Nature 332(14)：615-617，Hickel，W.and W.Knoll(1990).”surface plasmon microscopy of lipidlayers.” Thin Solid Films 187：349-356，Hickel，W.and W.Knoll(1991).“Time and spatially resolved surface plasmon optical investigation ofthe photodesorption of Langmuir-Blodgett multilayer assemblies.”Thin Solid Films 199：367-373，de Bruijn，H.E.，R.P.H.Kooyman，etal(1992)，”Choice of metal and wavelength for surface-plamonresonance sensors；some considerations.” Applied Optics31(4)：440-442，de Bruijn，H.E.，R.P.H.Kooyman，et al(1993)，“Surfaceplasmon resonance microscopy；improvement of the resolution byrotation of the object.” Applied Optics 32(13)：2426-2430，de Bruijn，H.E.，R.P.H.Kooyman，et al(1994)，“Resolution in surface plamonmicroscopy.” Review of Scientific Imstruments 65(9)：2829-2837和Brockman，J.M.，B.P.Nelson，et al.(2001)“Surface plasmon resonanceimaging measurements of ultrathin organic films.” Annual Reviews of Physical Chemistrv 51(1)：41-47，本文引用它们的内容作为与本专利申请的参考。

SPR感测装置中最普通的配置包括基本上单色的、相干入射光束的角度调制。在该技术中，通过在系统地改变入射角度的同时测量被反射的、基本上单色的相干入射波束的强度形成表面等离子体激元谐振曲线。满足SP谐振条件可导致入射波束的强度发生可测量的衰减，其相应于反射波束强度对入射角度的曲线的最小值。与该最小值相应的角度被称作谐振角(θ_sp)，其取决于导电层表面附近的折射系数。材料吸附或结合在导电层附近的感测区域内会改变感测区域的折射系数，导致θ_sp的数值发生可测量的偏移。因此，量化θ_sp的偏移为观察和表征感测区域材料的组成和浓度提供了一种灵敏的方法。例如，已经有研究证实，谐振角偏移与感测区域蛋白质浓度之间存在线性关系。

尽管已经证实了角度调制SPR技术的有效性，但是这些光学配置具有多种实际的限制。首先，角度调制光学配置需要使用复杂的光学部件旋转组件用于可选择地调节入射波束的入射角度。典型地，这种组件可以旋转光源、波束成形光学元件(beam shaping optics)和偏振光学元件的组合体和/或旋转光收集光学元件和探测器的组合体。需要使用这种复杂旋转组件的光学配置是不理想的，因为它们成本高昂、受空间限制并且需要频繁的维护和重校准。其次，使用复杂的光学部件旋转组件会增加器件对由于环境温度和压力的波动和变化导致的光学失准的敏感性。最后，在角度调制SPR技术中使用相干光源，例如激光器，会在反射波束部件中产生有害的光学干涉。这种光学干涉是不期望的，因为它会产生条纹图(fringe pattern)，显著降低由SPR技术获得的图像的光学品质。

SPR感测装置中的另一种普通光学配置是波长调制。在波长调制光学配置中，在系统地改变入射波束波长的同时监测以固定角度入射的入射波束的反射光强度。在这些技术中，在改变入射波束波长的同时，通过测量被反射入射波束的强度形成表面等离子体激元谐振曲线。相应于反射波束强度对波长的曲线的最小值的波长被称作谐振波长(λ_sp)，其指示谐振条件的满足并且取决于位于导电层表面附近感测区域的折射系数。因此，量化λ_sp的偏移为观察和表征感测区域材料的组成和浓度提供了一种灵敏的方法。SPR波长调制技术普遍地采用恒定的入射角，因此不需要使用庞大的光学旋转组件。

用SPR进行感测的另一种应用是SPR成像技术，其中入射波束反射率的空间变化被测量作为时间的函数。在该技术中，使用校准的单色光束激发SP，并通过二维阵列探测器，例如电荷耦合器件或照相机，监测相应于探针区的反射光。通过观察被测量反射光强度的二维分布实时地监测探针区域中成分的差异。吸附或者结合到探针区特定区域上的材料的厚度和折射系数可以满足SP谐振条件，从而有效地产生SP。因此，这些区域将显示反射光强度衰减。相对地，探针区的其他区域可以由折射系数不满足SP谐振条件从而不能有效形成SP的吸附或结合材料构成。因此，这些区域将显示出高入射波束反射率。具有不同化学和物理性质的区域的反射率的差异可以形成表征整个探针区的图像。通过改变成像角度或者SPR系统的波长能够获得探针区中各个区域的最大对比度。

Brockman，J.M.，B.P.Nelson，et al.(2001)“Surface plasmonresonance imaging measurements of ultrathin organic films.” Annual Reviews of Physical Chemistrv 51(1)：41-47描述了一种光学配置，据报道它能够提高由SPR成像技术生成的图像的质量和灵敏度。作者公开了一种光学配置，包括校准白色光源、偏振器、棱镜——金薄膜样品组件、窄带干涉滤光器和电荷耦合器件(CCD)相机。该参考文献显示了5个SPR图像，其相应于5种不同的干涉滤光器透过不同波长的激发光。尽管作者报道SPR图像质量可以通过选择具有合适透射性质的干涉滤光器加以优化，但是所公开的方法耗时，要通过人工除去和插入不同的干涉滤光器反复地调节图像质量。作者原理上依赖于角度扫描从而最佳地对比探针区的样品。而且，除去和插入光学干涉滤光器需要重复对准激发和探测光学配置。此外，参考文献的方法局限于提供离散探测波长选择的光学配置，且不能提供在连续的数值范围上调谐激发或探测波长的能力。最后，所公开的方法使样品暴露于波长不能用CCD相机探测的非常强的光下，这不利于SPR图像的形成并且可能破坏探针区的材料。

从上文可以意识到，非常需要有一种方法和器件，其不需要使用角度调制SPR，特别是具有复杂旋转组件的角度调制SPR光学配置，就能在薄导电(或半导电)膜中产生SP。进一步，需要有具有连续可调谐干涉光源的波长调制SPR感测和/或成像的方法和器件。最后，需要能够消除不理想光学干涉问题从而提供更高灵敏度和分辨率的可调谐SPR器件。

发明内容

本发明提供了用于感测、成像和表征探针区组成变化的方法、器件和器件部件。更特别地，本发明提供了用于探测位于感测表面附近的探针区折射系数变化的方法和器件，优选地，该感测表面由支持SP形成的导电薄膜构成。此外，本发明提供了用于在探针区产生表面等离子体激元并通过生成探针区的一个或多个表面等离子体激元谐振曲线和/或表面等离子体激元谐振图像表征探针区组成的方法和器件。本发明的方法和器件可以用于探测和表征化学物质，例如分子和离子，对探针区的吸附、吸收或结合，特别地该探针区具有选择性结合亲和性和/或其他选择性化学或物理性质。进一步，本发明提供了波长可调谐SPR感测器件和成像器件，其能够感测SPR发生和/或形成SPR所需的SP谐振波长随时间变化的函数，特别是对于正在发生物理和/或化学变化的探针区的变化。本发明的波长可调谐SPR感测器件可以用于探测与感测表面接触或临近的溶液中的物质。

本发明的一个目的是提供不需要角度调谐的可调谐SPR感测和成像器件，特别是提供不需要传统角度调制SPR光学配置中的用于改变入射角度的复杂光学旋转组件的器件。本发明进一步的目的是提供使光学干涉的发生最小的方法和器件，特别是消除使SPR图像质量恶化并使SPR感测结果模糊的条纹图和斑点的方法和器件。本发明的再一个目的是提供不需要预先探测标记处理，例如荧光标记或者放射性标记处理，的用于探测材料，例如原子、分子、离子或原子、分子及离子集合，的方法和器件。

在一个方面中，本发明提供了一种波长可调谐表面等离子体激元谐振传感器，用于感测、监视和表征探针区折射系数的改变。本发明的波长可调谐表面等离子体激元谐振传感器提供具有可选择调节波长分布的激发光和/或被探测光。一种示例性波长可调谐表面等离子体激元谐振传感器包括一个非相干、多色光源，一个偏振器，一个SPR光学组件、一个探测器和一个可选择调界波长选择器。在这些实施例中，多色光源布置成与偏振器和SPR光学组件光学联通。由光源产生的光沿着入射光传播轴传播，并被导向通过偏振器导致光具有选择性偏振方向，优选地基本上是p-偏振光或s-偏振光。优选地，本发明的偏振器提供了一种容易在具有p-偏振取向和s-偏振取向的入射光之间进行变换的装置。具有所选偏振取向的光被导向到SPR光学组件上。在一个示例性实施例中，SPR光学组件包括电介质层，电介质样品层和位于电介质层与电介质样品层之间的导电层。位于导电膜附近的电介质样品层构成探针区。本发明的示例性SPR传感器进一步包括一个或多个位于多色光源与SPR光学组件之间的光学准直元件用于准直导向到SPR光学组件的光波束。

SPR光学组件以产生全内反射的入射角进行照射产生沿着反射光传播轴传播的光。在示例性配置中，沿着入射光传播轴传播的光或者沿着反射光轴传播的光会通过位于光源和探测器之间的光路上的可选择调节波长选择器。在优选实施例中，可选择调节波长选择器透射的光具有所选的透射波长分布，从而在探针区附近的导电层表面上产生表面等离子体激元。通过探测器探测沿着反射光轴传播的光，借此感测探针区的折射系数。任意地，用光收集元件收集沿着反射光轴传播的光并聚焦到探测器以提高探测灵敏度和分辨率。

在一个实施例中，本发明提供了一种量化从SPR光学组件反射的p-偏振入射光百分比反射率的装置。在示例性实施例中，通过选择性调节偏振器，SPR光学组件用p-偏振光和s-偏振光交替照射。用波长满足SP谐振条件的p-偏振光照射SPR光学组件可将辐射能转变成SP，其会降低反射p-偏振光的强度。因为s-偏振光不形成SP，所以反射p-偏振光强度的降低可以通过比较所探测的p-偏振光与s-偏振光的强度用百分比反射率精确地加以表征，该p-偏振光与s-偏振光得自于用基本上p-偏振和s-偏振的光束交替地照射SPR光学组件。

在本发明中，可选择调节波长选择器提供了对于表征SP谐振条件和测量SP形成所需谐振波长有用的波长调谐功能。进一步，本发明的可选择调节波长选择器不再需要用于通过SPR方法感测探针区折射系数变化的角度调制。在本发明该方面的内容中，波长调谐是指以满足SP谐振条件并产生SP激发的方式选择性改变入射和/或被探测光。因为SP谐振条件取决于探针区的折射系数，所以本发明的波长可调谐SPR传感器提供了一种探测和监视探测区域物理和化学性质，例如成分、结合亲和性和反应，的装置。

优选地，波长选择器提供了一种可选择调节的透射波长分布。本发明的透射波长分布可以用中心波长、带宽和波长强度排布(profile)加以表征。本发明的示例性波长选择器能够在连续的数值上选择性调节透射波长分布的中心波长。在本发明中，可以选择可透过波长选择器的光的中心波长、带宽和/或波长强度分布，以提高SPR感测的选择性或者分辨率。选择地，可以选择可透过波长选择器的光的分布中心波长、带宽和/或波长强度排布(profile)，以提高SPR图像质量(也就是探针区内不同区域最佳折射系数对比度)。

为了观察SP形成、表征SP谐振条件或者测量SP谐振波长，本发明的示例性SPR传感器监视从SPR光学组件反射的光强度的降低。本发明的可选择调节波长选择器提供了一种调节被探测光波长的装置。这允许精确地测量谐振波长，还允许通过测量反射光强度作为波长选择器所透射光波长的函数描绘SP谐振曲线。可选择调节被探测光波长的能力提供了本发明波长可调谐SPR传感器的这一功能。因此，本发明的可选择调节波长选择器可以布置在从多色光源到探测器的校准光光路上的任何位置。在一个实施例中，可选择调节波长选择器位于多色光源与SPR光学组件之间，从而选择性调节被导向到SPR光学组件并随后被探测的激发光的波长分布。在另一个实施例中，可选择调节波长选择器布置在SPR光学组件与探测器之间，从而选择性调节被导向到探测器并被探测的激发光的波长分布。本发明还包括具有附加可选择调节波长选择器的实施例，该选择器可以位于多色光源与探测器之间光路上的任何位置。将可选择调节波长选择器布置在光源与SPR光学组件之间的一个优点是只有波长被探测器探测的光才暴露于SPR光学组件。降低导向到光学组件上的光强度有利于避免由于照射导致的光学组件的升温。光学组件的这种温度变化能够改变探针区的折射系数并使SPR感测结果和图像模糊。

本发明可用的可选择调节波长选择器可以包括任何能够透过所选分布透射波长并且基本上防止其它波长的光透过的器件或器件组件。在本发明的示例性实施例中，可选择调节波长选择器是光学干涉滤光器，其可以围绕垂直于入射平面的旋转轴(也垂直于入射光传播轴或反射光传播轴)旋转可调。在该实施例中，光学干涉滤光器的旋转可调节透过光学干涉滤光器的光波长分布，特别是透射波长分布的中心波长。本发明的示例性可选择调节波长选择器包括但不仅限于光学干涉滤光器、标准具(etalon)、Fabry-Perot标准具、单色器、分光计、棱镜、光栅和线性可变干涉滤光器。优选的可选择调节波长选择器在测量谐振波长所需的中心波长范围上提供基本上的相同的净透射。优选的可选择调节波长选择器具有关于s-和p-偏振光的良好表征的透射性质。在离散波长操作中，波长调谐可用于产生导致探针区内不同区域最佳对比度的SP。在波长扫描操作中，透射波长分布的中心波长可以连续变化，同时收集SPR测量结果或者图像。

在本发明的SPR传感器中使用可选择调节波长选择器提供了调谐激发光、探测光或者两者波长分布的能力。本器件和方法提供了连续调谐激发光、探测光或者两者的波长分布或者波长主体范围的能力，其优选地在至少60nm的范围上，更优选地在数百纳米的范围上进行调节。由本发明的这一属性提供的波长调谐能力允许SPR谐振条件改变，从而被探测和表征作为时间的函数。SPR谐振条件的改变可以直接与探针区的折射系数相关。因此，本发明的可选择调节波长选择器提供的波长可调谐能力允许精确地量化探针区的物理和化学特性。进一步，波长可调谐能力还提供了本发明SPR传感器的宽阔动态范围。特别地，本发明的波长可调谐SPR传感器和成像器件可以用于探测和表征非常宽范围的具有不同折射系数、厚度和化学成分的材料。此外，使用本发明SPR传感器的可选择调节波长选择器不需要用于探测SPR谐振条件变化或者确定谐振波长或谐振波长分布的角度调制。避免角度调制SPR光学配置是有利的，因为这些配置典型地需要空间上受限制的、成本昂贵的、对由环境压力和温度波动和变化导致的失准敏感的复杂旋转光学组件。进一步，避免具有复杂旋转组件的光学几何布置(geometry)是有利的，因为这种组件需要频繁的校准和重校准。

在本发明中使用非相干、多色光源具有多种优点。首先，使用非相干光源避免了由从激发和反射波束产生的波束成分的光学干涉引发的问题。光学干涉会由于形成条纹图和斑点而显著恶化SPR感测结果和图像。此外，非相干光源，例如卤灯，价格低廉，显示高度可重复的强度和容易光学对准。

本方法和器件能够广泛地应用于任何SPR光学组件配置。本发明可使用的示例性SPR光学组件包括一个金属薄膜，其与布置在Kretchmann光学几何布置或Otto光学几何布置中的棱镜和电介质样品层接触。选择地，本发明的传感器可以包括SPR光学组件，其包括波导管、光纤器件、光栅或者这些部件的任意组合。

本发明的方法和器件中可以使用任何能够产生SP的光波长。一些SPR成像装置优选地使用波长接近电磁光谱红外区(大约800nm-1200nm)的光，因为能够提供与使用较高频率的可见光的技术相比更高的折射系数灵敏度。此外，使用近红外可以有利于某些应用，其中被询问的探针区含有在可见光区有吸收的物质。在优选实施例中，本发明SPR传感器和/或成像器件采用的光波长在大约845nm-857nm的范围上选择。

本发明的波长可调谐SPR传感器可以用各种不同的操作模式加以操作。SPR操作模式相应于不同类型的SPR测量、这些器件的不同功能方面和使用这些器件的不同方法。本发明的示例性SPR传感器能够以多种操作模式操作。

在一个可操作模式中，本发明的SPR传感器能够测量导致SP形成的谐振波长的分布。在一个示例性实施例中，可选择调节波长选择器被调节以一种方式系统地改变被探测光的波长分布从而产生SPR谐振曲线。由本发明的方法和器件形成的优选SP谐振曲线构成百分比折射率对波长选择器所透过波长分布中心波长的二维图。量化谐振波长或谐振波长的分布可提供有关探针区组成的信息，因为谐振条件强烈地依赖于探针区的折射系数。

在另一种操作模式中，本发明的SPR传感器能够监视形成SP所需的谐振波长或者谐振波长分布的变化。监视谐振波长分布的变化是有利的，因为能提供有关探针区内折射系数和组成变化的信息，例如由于化学物质与探针区的某些部分结合导致的变化。在一个实施例中，SPR传感器通过选择透射波长的分布加以波长调谐，导致SP形成和反射光的衰减。反射光的强度和/或百分比折射率作为一定观察间隔内时间的函数加以监视。相应于探针区折射系数和化学组成改变的谐振条件的变化通过测量反射光的强度和/或百分比折射率的变化加以观察和表征。选择地，本发明的SPR传感器能够通过生成多个相应于不同观察间隔和/或不同实验条件的谐振曲线来测量谐振波长或者谐振波长的分布的变化。测量得到的谐振波长或谐振波长分布的偏移可能直接与探针区组成的相应变化有关。在这些实施例中使用可选择调节波长选择器有利于精确地量化谐振波长或谐振波长分布的偏移。

在另一个实施例中，本发明的波长可调谐SPR传感器能够作为SPR成像器件加以操作。在该实施例中，SPR传感器包括一个二维探测器，例如电荷耦合器件或者二维二极管阵列。在优选实施例中，具有能够激发一个或多个SP的波长分布的p-偏振光束被导向到SPR光学组件，并测量反射光强度的第一二维分布。该反射光强度的第一二维分布构成探针区的图像。在一些实施例中，反射p-偏振光强度的分布必须被标准化以获得最佳的SPR图像，因为本发明的光源与波长选择器的组合产生了波长依赖的透射强度。在本发明修正该效应的方法中，一束s-偏振光被导向到SPR光学组件，并测量反射光强度的第二二维分布。p-和s-偏振取向之间的转换优选地通过调节位于多色光源与SPR光学组件之间的偏振器加以实现。比较第一和第二二维反射光强度分布可产生一个SPR图像，其表征探针区。由本方法和器件产生的优选SPR图像由被测量百分比折射率的二维分布构成。在一个示例性实施例中，SPR图像被修正用于区分本发明所用波长选择器的s-和p-偏振透射性能，特别是作为旋转角度的函数变化的透射性能。使用本发明的可选择调节波长选择器SPR成像器件有利于透过具有所选透射波长分布的光，从而提供具有更高光学质量和清晰度的图像。进一步，本发明的SPR成像器件和方法能够产生在高反射区域与衰减反射区域之间显示高对比度的图像。

在另一个方面中，本发明提供探测和表征探针区化学物质之间化学或物理相互作用的方法。特别地，本发明的SPR传感器可以采取具有在操作上与一个反应器，例如流动池(flow cell)或流动反应器，偶连的电介质样品层，该反应器能够有效地将化学物质，例如原子、分子或离子，引入到样品电介质层和探针区内。示例性反应器能够在与探针区接触的其他传输介质溶液中产生化学物质流。探针区可以以如下的方式加以构建，即显示选择性化学和/或物理性质，例如选择性结合亲和性、化学反应性和/或物理性质。例如，第二探针区可以包括一个反应器，其具有一个或多个固定在反应器表面上的靶化学物质，例如生物聚合体。在一个示例性实施例中，薄导电层的感测表面被化学改性以提供选择的亲和性、反应性、结合或其他的化学和/或物理性质。将被选择材料直接沉积在导电层的表面上，例如羧甲基葡聚糖，可以有利于生物聚合体，例如蛋白质或寡核苷酸，共价附着在本发明的感测表面上。在这些实施例中，向反应器引入一种或多种相互作用物质可以产生靶与相互作用物质之间的结合、化学反应或物理相互作用，借此改变探针区的折射系数。使用本发明的SPR传感器可以用于探测探针折射系数的变化，借此表征靶化学物质和相互作用物质的化学特性或者物理相互作用。

在示例性实施例中，在引入相互作用物质之前，SPR传感器产生至少一个相应于探针区折射系数的参考测量结果。相互作用物质被引入到反应器中，并允许与探针区的靶物质相互作用。SPR传感器产生至少一个分析测量结果，其与参考测量结果进行比较从而探测出所述探针区折射系数的变化。在示例性实施例中，要重复地获取分析测量结果并彼此进行比较以表征折射系数作为时间函数的变化。该变化可能与相互作用物质与靶物质之间相互作用的化学和物理本质相关。本发明的示例性方法能够确定表征靶物质与相互作用物质之间相互作用的结合亲和性、速度常数、平衡常数和热力学参数。

本发明的SPR感测和成像方法和器件可广泛地用于探测和可视化表征任何能够改变折射系数的材料。特别地，本发明特别有利于探测化学物质，包括但不仅限于，生物聚合体，例如蛋白质、多肽、寡核苷酸、糖蛋白、DNA、RNA、多聚糖、以及脂类及其集合体。本发明方法和器件的一个优点是它们提供了灵敏的探测方法，其不需要耗时、成本昂贵和可能严重影响标记化学物质化学和/或物理性质的预探测化学标记处理。本感测和成像方法的其它优点是它们提供了非常高的时间分辨率，高达大约100fM的灵敏度，和需要非常小的样品体积。

本发明提供了可广泛应用于任何测量技术或其它涉及SP形成的处理的方法和器件。特别地，本发明的波长可调谐器件提供了有效的SP激发。例如，本发明的波长可调谐器件可以用于有效地激发SPR探针区中的光致发光材料。在示例性实施例中，本发明的器件用于产生能够激发探针区化学物质，特别是结合于探针区的化学物质，荧光或者磷光发射的SP。这些器件可以包括与该荧光材料光学联通的第二探测器，其能够量化SP诱发荧光的强度。选择地，本发明的波长可调谐SP器件可以提供将能量传递到反应区域材料的装置，以诱发该材料中的化学或物理改变。

在另一个方面中，本发明体提供了一种感测探针区折射系数的方法，包括如下的步骤：(i)使光从多色光源传播通过偏振器，借此产生沿入射光传播轴传播的光；(ii)将所述光导向到光学组件上，该光学组件包括电介质层、样品电介质层和位于电介质层和电介质样品层之间的导电层，借此产生沿着反射光传播轴传播的光，其中所述电介质样品层临近所述导电层的部分构成探针区；(iii)使所述光通过位于所述光源与探测器之间光路上的可选择调节波长选择器；(iv)用所述探测器探测所述光，借此感测探针区的折射系数，和(v)调节所述可选择调节波长选择器透过具有所选波长分布的光从而在与所述电介质样品层接触的所述导电层的表面上产生表面等离子体激元。

在另一个方面中，本发明提供了一种产生探针区图像的方法，包括如下步骤：(i)使光从多色光源传播通过偏振器，借此产生沿入射光传播轴传播的光；(ii)将所述光导向到光学组件上，该光学组件包括电介质层、样品电介质层和位于电介质层和电介质样品层之间的导电层，借此产生沿着反射光传播轴传播的光，其中所述电介质样品层临近所述导电层的部分构成探针区；(iii)使所述光通过位于所述光源与探测器之间光路上的可选择调节波长选择器；(iv)用所述探测器探测所述光，借此产生所述探针区的所述图像，和(v)调节所述可选择调节波长选择器透过具有所选波长分布的光从而在与所述电介质样品层接触的所述导电层的表面上产生表面等离子体激元。

在另一个方面中，本发明提供了一种探测探针区折射系数变化的方法，包括如下步骤：(i)使光从多色光源传播通过偏振器，借此产生沿入射光传播轴传播的光；(ii)将所述光导向到光学组件上，该光学组件包括电介质层、样品电介质层和位于电介质层和电介质样品层之间的导电层，借此产生沿着反射光传播轴传播的光，其中所述电介质样品层临近所述导电层的部分构成探针区；(iii)使所述光通过位于所述光源与探测器之间光路上的可选择调节波长选择器，其中所述可选择调节波长选择器被调节透过具有所选波长分布的入射光从而在与所述电介质样品层接触的所述导电层的表面上产生表面等离子体激元；(iv)用所述探测器探测所述光，借此产生至少一个参考测量结果，(v)用所述探测器探测所述光，借此产生至少一个分析测量结果，和(vi)比较所述参考测量结果与所述分析测量结果从而探测所述探针区折射系数的所述变化。

附图说明

图1是显示本发明SPR成像器件侧视图的示意图，该器件在多色光源和SPR光学组件之间具有一个可选择调节波长选择器。

图2是显示本发明SPR成像器件侧视图的示意图，该器件在SPR光学组件与探测器之间具有一个可选择调节波长选择器。

图3是显示由光学干涉滤光器构成的示例性可选择调节波长选择器侧视图的示意图。如图3所示，该光学干涉滤光器能够选择地围绕垂直于入射面的旋转轴旋转。

图4是中心波长作为两个干涉滤光器倾斜角函数的图示，两个干涉滤光器的垂直入射中心波长为大约850nm(填色菱形)和大约880nm(空白菱形)。

图5是基于Kretschmann SPR配置的示例性SPR成像器件的照片。

图6是用于修正由偏振依赖地透过光学干涉滤光器的光获得的SPR图像的校准曲线。

图7是示例性SPR成像器件对样品折射系数变化的预期响应。

图8显示了最佳中心成像波长作为折射系数与水的基准折射系数之间差异的函数。

图9显示了蔗糖溶液的一系列标准化图像，该溶液具有一定范围的通过本发明示例性传感器测量的不同折射系数。

图10显示了示例性SPR传感器实验响应的图示。如图所示，该系统的响应与小于3×10^-3的折射系数的变化呈线性。

图11显示了信噪比作为未经修正(A，下图)和已修正(B，上图)SPR数据平均像素数目的函数。

图12显示了用以多个不同倾斜角布置的光学干涉滤光器获得的硫醇图(pattern)和水图(pattern)的系列图像。图12A相应于857nm的中心波长，图12B相应于852nm的中心波长，图12C相应于845nm的中心波长，图12D相应于830nm的中心波长和图12E相应于814nm的中心波长。

图13A和B显示了硫醇图(pattern)的图像，它们具有通过本发明示例性SPR传感器产生的大约100μm(图13A左侧)和大约50μm(图13B右侧)的最小外形尺寸。

图14A-D显示了当牛血清白蛋白(BSA)吸附到金表面上时产生的图像。图14A的图像显示了以水为背景的反应器的小区域。图14B的图像显示了具有2mg ml^-1BSA磷酸缓冲盐溶液(PBS)的反应器的相同区域。图14C的图像显示了在泵唧水通过反应器除掉所有未结合蛋白质之后以水为背景的相同区域。图14D的图像显示了图14A的图像减去图14C的图像之后产生的差异图像。

具体实施方式

参考附图，类似的数字表示类似的元件，在多个附图中出现的相同数字表示相同的元件。此外，下文中，应用如下的定义：

“化学物质”一般和广义地指一种或多种原子、分子和/或高分子的集合，无论其是中性还是被离子化。特别地，本发明所指的化学物质包括但不仅限于生物聚合物。液态样品中的化学物质可以以多种形式存在，包括酸、碱、分子、离子、配位及溶剂化(solvated)形式。化学物质还包括分子的非共价结合聚合体。化学物质包括生物分子，也就是，来自生物源的分子，包括生物聚合物，以上的任何一种或者全部都可以处于上述的形式，或者作为两个或多个分子的聚合体存在。

“透射波长分布”是指由波长选择器，如光学干涉滤光器、单色器或者分光计，透射的不同波长光强度的二维分布。透射波长分布可以根据中心波长、带宽和透射波长的强度排布加以表征。在本发明中，由探测器探测的透射波长分布通过组合光源与可选择调节波长选择器的光学性质加以确定。在示例性实施例中，被导向到SPR光学组件上的和/或通过探测器探测的光的透射波长分布基本上具有高斯强度分布和中心波长，其相应于具有最大强度的光的波长。

本发明的波长可调谐SPR传感器和成像器件提供具有可选择调节透射波长分布的激发光和/或探测光。

“中心波长”是光透射波长分布的特性。在一些实施例中，中心波长是指透射波长分布的中点波长。在其他实施例中，中心频率是指波长分布中具有最大强度的透射波长。在其他实施例中，中心波长是指透射波长分布的平均波长。对于具有高斯或者洛伦兹强度排布的波长分布，中心波长典型地相应于透射波长分布中具有最大强度的波长。

“光源”是指能够产生电磁辐射的任何器件或材料，或者多个能够产生电磁辐射的任何器件或材料。本发明优选的光源能够产生处于电磁频谱近红外区(大约800nm-1200nm)的光。在示例性实施例中，本发明的光源产生非相干光，用于避免在SPR成像和感测应用中受到光学干涉的影响。在本发明的方法和器件中使用的光源包括卤灯、发光二极管、荧光灯、钨丝极灯、灰体光源(grey body light source)和黑体光源(black body light source)。

“带宽”是光反射波长分布的特性。带宽可以根据透射波长分布的强度排布最大值一半处的全宽加以定义，其是指透射率等于最大透射率一半处的全宽度。在本发明的示例性实施例中，探测光的带宽主要由可选择调节波长选择器，例如光学干涉滤光器，的透射性质确定。本发明的示例性可选择调节波长选择器的透射带宽在大约1nm-100nm的范围上，在一些实施例中更优选地在大约1-20nm的范围上选择。使用能够提供具有大带宽(＞10nm)特征的透射波长分布的波长选择器，在一些实施例中有利于提高信噪比。

“导电层”是指由导体材料，例如金属，或者半导体材料构成的层。导电层支持表面等离子体激元的形成，并用作本发明的感测表面。本发明优选的导电层是薄(＜50nm)金或银层。

“电介质样品层”是指位于导电层表面附近的电介质层，该导电层表面上具有表面等离子体激元。本发明的电介质样品层包括靠近导电层感测表面的探针区。本发明的探针区包括临近上面具有表面等离子体激元的导电层表面(感测表面)的体积(volume)，其深度由表面等离子体激元在电介质样品层中的衰减长度加以定义。本发明的SPR传感器和成像器件能够感测、监视和调整探针区折射系数的变化。电介质样品层和探针区可以在操作上与流动池和/或流动反应器相连，用于将材料引入到电介质样品层和/或探针区。在这些实施例中，选择流动池或流动反应器的流动条件可以调节电介质样品层和探针区的组成。选择地，电介质样品层和探针区可以在操作上与静止池和/或静止反应器相连。

“可选择调节波长选择器“是指能够选择透过波长选择器的光波长分布的器件、器件部件或者光学部件的组合。“可选择调节波长选择器”还指能够选择基本上被阻止透射通过波长选择器的光波长分布的器件、器件部件或者光学部件的组合。本发明的可选择调节波长选择器可以透过以中心波长、带宽和强度分布为特征的透射波长分布。本发明的示例性可选择调节波长选择器包括，但不仅限于，光学干涉滤光器、标准具、Fabry-Perot标准具、光纤干涉滤光器、光纤器件、纤维Fabry-Perot滤光器、单色器、分光计、光栅和/或棱镜、狭缝或者其任意组合。本发明的示例性光学干涉滤光器通过围绕垂直于反射波束轴的旋转轴旋转能够可选择调节透射波长的分布。

“表面等离子体激元谐振传感器”或者“SPR传感器”可以同义地使用，指任何能够通过激发表面等离子体激元监视、探测或者表征探针区折射系数变化的器件或器件部件。在一个示例性实施例中，SPR传感器探测位于上面集中有表面等离子体激元的感测表面附近的探针区折射系数的变化。示例性SPR传感器包括SPR成像器件，其能够产生相应于探针区折射系数和/或组成的探针区图像。选择地，本发明的SPR传感器产生能够激发位于导电层一个或多个表面附近的光致发光材料的表面等离子体激元。

“SPR光学组件”是指能够将辐射能耦合到表面等离子体激元中的光学部件的任意组合。在示例性实施例中，本发明的SPR光学组件包括以Kretschmann光学配置或者Otto光学配置布置的电介质层、电介质样品层和导电层。选择地，本发明的SPR光学组件可以包括多个光学部件，包括但不仅限于，棱镜、金薄膜、银薄膜、半导体薄膜、流动反应器、静止反应器、微流器件、流体通道、光对准系统、旋转台或者这些部件的任意组合。

“倾斜角”是旋转位置的特征。在示例性实施例中，倾斜角是指光学干涉滤光器相对于入射光传播轴或反射光传播轴入射法线的旋转方向。明确地讲，倾斜角是指在相对于入射光传播轴或反射光传播轴进行测量时，被旋转光学部件，例如光学干涉滤光器，的角度偏移。本发明示例性光学干涉滤光器的表面可以在0°到大约60°的倾斜角范围内，优选地在0°到大约35°的倾斜角范围内取向。

在随后的说明中，将阐述本发明器件、器件部件和方法的众多特殊细节，以便对本发明的精确特性进行完全的解释。然而本领域的技术人员显然能够不利用这些特殊的细节实践本发明。

本发明提供了用于感测感测表面附近探针区折射系数和组成变化的方法、器件和器件部件。特别地，提供了波长可调谐SPR感测器件和成像器件，其能够以恒定的入射角度探测SPR条件并产生SP谐振曲线。进一步，本发明提供了产生样品电介质层内探针区SPR图像的方法和器件。

图1示意性图解了本发明SPR成像器件的侧视图，其在多色光源和SPR光学组件之间具有可选择调节波长选择器。示例性SPR成像器件100包括与偏振器130光联通的多色光源110，光学干涉滤光器140，SPR光学组件150和二维探测器155。如图1所示，示例性SPR成像器件100在光源110和偏振器130之间可以选择地包括光准直元件170，其包括棱镜175和针孔177。进一步，SPR成像器件在光学组件150和探测器155之间可以选择地包括收集和成像光学元件158。

来自光源110的入射光160通过准直元件170加以准直并沿着入射光传播轴180传播。入射光160通过被布置成与光传播轴180交叉的偏振器130，其能够选择入射光160的偏振状态。偏振器130优选地能够选择入射光160的基本上p-偏振或s-偏振的取向，并能够在所选p-偏振和s-偏振取向之间进行快速转换。具有所选透射波长分布的偏振入射光160通过被布置成与光传播轴180相交的光学干涉滤光器140。在图1所示实施例中，光学干涉滤光器140可以围绕垂直于入射光传播轴180的旋转轴旋转(由于图1是透视的，所以光学干涉滤光器140的旋转轴没有显示，而是被定向为从附图平面凸出)。图1显示了光学干涉滤光器140的两个不同旋转方向。在该实施例中，透射光的波长分布可以通过光学干涉滤光器140的旋转可选择地调节。在优选实施例中，光学干涉滤光器140安装在选转台(图1未显示)上，从而使滤光器相对于入射光传播轴的角度可选择地变化，进而改变通过滤光器的光波长。因此，光学干涉滤光器140的旋转位置确定了被导向到光学组件150并随后被探测器155探测到的光的波长分布。

具有所选波长的光200被导向到SPR光学组件150上，其包括以Kretschmann光学配置布置的棱镜210、导电薄膜220和电介质样品层230。本发明的优选导电薄层220是厚度为大约30nm-60nm的金或银层。优选的电介质样品层230包括探针区270，其在操作上偶连于反应器或池，例如流动池、静止池、流动池反应器或静止池反应器，该反应器或池能够将材料引入到导电薄层220表面附近的探针区270。以产生全内反射的角度照射SPR光学组件150可产生沿着反射光传播轴250传播的光240并被二维探测器155探测。选择地，来自光学组件150的光在探测之前可以用光收集和聚焦元件158加以收集以提高探测的灵敏度和分辨率。

至少有一部分波长满足SPR谐振条件的光不会被光学组件150反射。而是，该入射能量被转变成感测表面260上的SP，其中该感测表面由与电介质样品层230接触的导电层220的表面构成。控制辐射能转变成表面等离子体激元的谐振条件强烈依赖于感测表面260附近探针区270的折射系数。探测被光学组件150反射到探测器155上的光能够表征哪些光波长被转变成为SPR以及这一过程的范围。如图1所示，本发明SPR传感器和成像器件的优选光学几何布置(geometry)具有恒定的入射角，当入射波束照射SPR光学组件时，选择入射角以产生全内反射。然而，本发明还包括如下的实施例，其中入射角可选择地调节。这些实施例相应于角度和波长均可调的SPR传感器和成像器件。

图2显示了具有另一种光学配置的SPR成像器件300。在该光学配置中，光学干涉滤光器140被布置成与反射光传播轴250相交。类似于图1所示的光学配置，光学干涉滤光器可以围绕旋转轴旋转。在示例性SPR成像器件300中，光学干涉滤光器140可围绕垂直于反射光传播轴250定向的旋转轴旋转(由于图2是透视的，所以光学干涉滤光器140的旋转轴没有显示，而是被定向为从附图平面凸出)。在该实施例中，透射光的波长分布可以通过光学干涉滤光器140的旋转选择地调节。图2只显示了光学干涉滤光器140的一个旋转方向。在示例性实施例中，光学干涉滤光器140安装在选转台(图2未显示)上，从而使滤光器相对于反射光传播轴的角度可选择地改变，进而改变通过滤光器的光波长。因此，光学干涉滤光器140的旋转位置确定了被探测器155探测到的光的波长分布。如图2所示，SPR成像器件300可以选择地包括位于光源110和光学组件150之间的切断滤光器(cutofffilter)302。在示例性实施例中，切断滤光器302是700nm长透过滤光器(700nm long pass filter)和/或1000nm短透过滤光器(1000nm shortpass filter)，其降低了波长小于700nm的光的强度从而使入射光对光学组件150的加热最小化。

为了产生SPR图像，调节偏振器130使之透过p-偏振光，并调节光学干涉滤光器140使之透过波长分布满足特殊探针区组成和折射系数之SP谐振条件的光。探测器155探测从光学组件150反射的光，借此产生相应于p-偏振光的反射光强度的第一二维分布。在一些实施例中，反射p-偏振光的二维分布提供了探针区的SPR图像。利用强度随波长变化的光源和波长选择器的组合常常需要将测得的p-偏振反射光强度标准化，以便根据百分比反射率计算图像。为了将相应于p-偏振光的反射强度转变成百分比反射率，需要调节偏振器130透过s-偏振光，从而产生相应于s-偏振光的反射光强度的第二二维分布。通过获取每个象素位置处p-偏振强度与s-偏振强度的比值产生根据百分比反射率的探针区图像。

在更大的滤光器旋转角上，干涉滤光器的偏振依赖透射效应变得显著。明确地讲，与透射p-偏振光通过相同的干涉滤光器相比，透射s-偏振光的强度降低，中心波长偏移到更短的波长。结果，在更大的滤光器旋转角度，标准化图像必须包括这一效应的修正因子。任何成像角度的修正因子都能够通过在不产生表面等离子体激元的情况下测量通过滤光器的p-偏振和s-偏振光的强度简单地加以确定。(p-偏振强度)/(s-偏振强度)比值本身能够用于修正干涉滤光器的偏振依赖透射效应。例如，所测得的每个百分比反射率数值可以除以相应于透射光分布中心波长的p-偏振光强度与s-偏振光强度的比值，以修正偏振依赖透射效应。在一个实施例中，(p-偏振强度)/(s-偏振强度)修正因子以多个不同的成像角度加以测量，并用三次多项式函数加以匹配从而产生系统的修正曲线。然后使用修正曲线获得透射波长任意分布的修正因子。

图3是光学干涉滤光器140的放大图，显示了多个相对于入射光传播轴180或反射光传播轴250发现入射的旋转方向。明确地讲，显示了相应于第一倾斜角350和第二倾斜角360的旋转方向。第一倾斜角350小于第二倾斜角360。如图3所示，在本发明一些实施例的内容中，倾斜角是指光学干涉滤光器的角度方向与垂直于入射光传播轴或反射光传播轴的方向的角度偏差。另一种表达是，倾斜角是90度减去由滤光器表面定义的平面法线与入射波束轴之间的夹角。在一个示例性实施例中，光学干涉滤光器透过的光，具有以中心波长、带宽和波长强度排布为特征的波长分布。优选的带宽范围为大约1nm-30nm，优选的波长强度排布基本上为高斯形或者洛伦兹形。示例性光学干涉滤光器提供的中心频率在大约60nm的范围上，优选地在大约100nm的范围上可调谐。

在一个实施例中，光滤光器140的旋转将透射波长分布的中心波长向较短的波长偏移。在示例性实施例中，其中光学干涉滤光器包括Fabry-Perot标准具，且光学干涉滤光器的中心波长由下式给出：

${\mathrm{\λ}}_{\mathrm{center}}\left({\mathrm{\θ}}_{\mathrm{titlt}}\right)={\left({\mathrm{\λ}}_{\mathrm{center}}\left(0\right)\right)(1-\left(\frac{{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{tilt}}}{n^2}\right))}^{0.5};---\left(\mathrm{VI}\right)$

其中λ_center是透射光分布的中心波长，θ_tilt是倾斜角，λ_center(0)是相对于反射或入射光传播轴垂直入射的中心波长，n是光学干涉滤光器的折射系数。对于由Fabry-Perot标准具构成的光学干涉滤光器，n是滤光器的半波长厚层(half wavelength thick layer of the filter)。

一种在本发明SPR传感器和成像器件中可用的示例性光学干涉滤光器，当垂直入射时(滤光器表面法线与入射光轴之间的角度)在大约10nm的半最大带宽上具有全宽度。图4显示了对于两个垂直入射的中心波长为大约850nm(填充菱形)和大约880nm(空白菱形)的干涉滤光器，中心波长作为倾斜角函数的图示。如图4所示，当倾斜角从0°变到35°时，通过滤光器的中心波长偏移大了约65nm。中心波长的改变与用等式VI预测的数值一致。波长的强度分布在倾斜角高达大约35°时仍基本上保持高斯强度排布。然而，随着滤光器从0°倾斜到大约20°，高斯强度分布的宽度增加了大约4％。倾斜角超过大约20°时，强度分布的宽度随角度增加得更快，另外增加达20％。

获得最佳图像样品所需的波长调谐范围用3层SPR模型加以估计，其中最佳图像样品的折射系数从裸金上的水的水线改变大约5×10^-5-3×10^-3(在大约850nm，折射系数等于1.328)。这些计算的结果表明，用于表征SP谐振波长预期改变的最佳波长范围为大约845-857nm。该范围跨度小于15nm，因此容易被单个光学干涉滤光器提供的波长偏移范围所覆盖。

本发明的SPR传感器和成像器件可以由孤立装置(stand-alone)构成。选择地，本发明的SPR传感器和成像器件可以集成到其他器件中，或者用作装置中的器件部件。本发明的传感器可以偶连于反应器、流动池、静止池、流动池反应器、静止池反应器、微流器件、生物系统分析仪、用于表征分子间相互作用的装置和药物扫描装置。流动池在操作上与本发明的传感器和成像器件偶连，用于将化学物质传送到探针区。例如，本发明的SPR传感器可以和微流液体传送器件相结合将材料引入到探针区内。在一个示例性实施例中，本发明传感器的感测表面包括一个微流流动池壁。在液流连续流过表面的条件下或者静止流动条件下可以进行SPR感测测量。利用微流流动系统是有利的，因为它能对样品传递到探针区的时间点和持续时间提供精确的控制。

这里引用本专利申请所引用的全部参考文献的全部内容作为参考，这些内容与本专利申请的公开内容一致。本领域的技术人员显然可知，除了本文特殊说明的之外，其他的方法、器件、器件元件、材料、处理程序和技术也能够应用于实践本文广义公开的本发明，而无需进行过多的实验。所有在技术上已知的与本文特别说明的在功能上等价的方法、器件、器件元件、材料、程序和技术都包含在本发明的范围内。

实例1：示例性SPR传感器的表征

本发明SPR传感器感测探针区折射系数变化的能力通过实验和计算研究加以证实。明确地讲，本发明的一个目的是提供能够灵敏地探测和表征探针区折射系数变化的SPR传感器。进一步，本发明的一个目的是提供具有大动态范围的SPR传感器，其能够探测具有宽范围折射系数的材料。

为了获得前述目标，示例性SPR传感器的探测灵敏度和动态范围用计算机建模，并通过监视低浓度蔗糖溶液的折射系数加以估计。这些研究中采用的示例性SPR传感器是基于Kretschmann配置并且如图5所示。多色光源是150W石英卤灯(Dolan-Jenner，Lawrence，MA)，其偶连于多光纤导管(multi-fiber light pipe)(Edmund IndustrialOptics，Barrington，NJ)。来自光源的光通过消色差透镜(EdmundIndustrial Optics，Barrington，NJ)加以收集并聚焦在针孔处(直径100μm，Edmund Industrial Optics，Barrington，NJ)。第二消色差透镜(Edmund Industrial Optics，Barrington，NJ)收集来自针孔的光并形成校准波束。该经过扩展和校准的波束通过偏振器(Edmund IndustrialOptics，Barrington，NJ)。该偏振器安装在机动化旋转台上(NewportCorporation，Irvine，CA)，从而能够方便地获得p-偏振和s-偏振图像。该光随后通过干涉滤光器(Edmund Industrial Optics，Barrington，NJ)，其在近红外选择一个窄带(10nm FWHM)的工作波长从而最佳地对比样品中的折射系数范围。滤光器安装在机动化旋转台上(NewportCorporation，Irvine，CA)从而可以改变滤光器表面相对于准直源波束的角度，进而改变通过滤光器的光波长。将滤光器从垂直入射旋转大约35°的倾斜角，使通过滤光器的波长向较短波长改变大约70nm。

SPR光学组件包括棱镜、金薄膜和流动反应器。棱镜的进入和离开表面被定制打磨(custom ground)(Matthew’s Optical，Poulsbo，WA)从而与以64.8°的入射角入射到金属表面的源波束垂直。从SPR光学组件反射的光通过成像透镜(Edmund Industrial Optics，Barrington，NJ)，从而在CCD探测器(Retiga EX，QImaging，Burnaby，Canada)上形成聚焦图像(放大率＜1)。样品询问的区域是圆形的，直径为大约16mm。用Labview 6.1(National Instruments，Austin，TX)书写在机器内部的软件执行数据获取。

使用光源与干涉滤光器的组合，其提供随中心波长改变的入射光强度，需要通过s-偏振信号将p-偏振信号标准化。进一步，干涉滤光器的偏振依赖透射效应在较大的滤光器旋转角度处变得显著。与透射p-偏振光相比，透射s-偏振光的强度降低，且中心波长随着倾斜角增加偏移到较短的波长。结果，在较大的滤光器旋转角度处，标准化图像必须包括这一效应的修正因子。修正因子通过在不形成表面等离子体激元的情况下测量通过光学干涉滤光器的p-偏振和s-偏振光的强度加以确定。(p-偏振强度)/(s-偏振强度)比值本身能够用于修正干涉滤光器的偏振依赖透射效应。每个测得的百分比反射率数值除以修正因子以修正偏振依赖透射效应。

图6是用于修正由偏振依赖地透过干涉滤光器的光获得的SPR图像的校正曲线。图6中的菱形数据点显示了在不形成表面等离子体激元的情况下对于10个不同的滤光器旋转角度，p-偏振光强度的总和除以s-偏振光强度的总和。为了估计修正程序中的可变性，数据从源波束的5个不同区域获得。图6所示图示的每个点是400个像素的平均值。数据点的误差随着倾斜角的增加而增加，当旋转角度小于24°时，≤1％，角度为36°时为6％。不同次运行之间的变化相当的小，对于所有的滤光器倾斜角≤0.6％。此外，图6还显示了由数据获得的3次多项式修正曲线。从图示可以明显看出，旋转角度小于25°时的修正因子较小(小于1.3)，但对于较大的旋转角度则快速增加，在36°时高达2.3。使用3层菲涅耳模型，为跨度为4个数量级，1×10^-6-1×10^-2，的探针区折射系数计算了示例性SPR传感器的预期响应。该计算假定水的基准折射系数在大约850nm等于1.328。SPR传感器对样品折射系数改变的预期响应如图7所示。图7所示的数据考虑到我们的滤光器其实验测得的透射带为大约10nm。每个菱形数据点相应于装置对于给定的样品折射系数在样品折射系数变化的最佳中心成像波长处改变的预期响应。方形数据点相应于装置在设定为853nm的单一中心波长下的预期响应。SPR传感器预期在高达大约3×10^-3的折射系数变化上具有线性响应(作为对比，单层牛血清白蛋白在Au表面上的吸附相应于大约1×10³的折射系数变化)。还要注意，当以853nm的单一中心波长获取数据时对传感器响应的影响。图8显示了最佳中心成像波长作为从水的基准折射系数的折射系数改变的函数。853nm的成像波长只对大约3×10³的折射系数变化是最佳的。然而，对于＜3×10³的折射系数变化，在853nm的中心成像波长处测得的响应接近在最佳中心成像波长处的预期。对于更大的折射系数变化，在853nm的中心成像波长处测得的响应显著小于在最佳中心成像波长处的预期，对于0.01的样品折射系数变化，降低高达大约10％。

示例性SPR传感器的实验响应用一系列低浓度蔗糖(Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO)溶液加以研究。每种蔗糖溶液的折射系数用折射计(Milton Roy Company，Ivyland，PA)加以测量。该系统使用标准尺寸钠石灰玻璃显微镜载玻片(slides)(Fisher Scientific，Hampton，NH)，在Nanostrip^TM溶液中清洗，然后沉积1nm Cr和450nm Au。在成像系统上使用之前，在1∶1∶5的30％过氧化氢、氨水和ddI水溶液中清洗涂布了Au的载玻片。然后在黑暗、氮气氛下将载玻片放置在0.2mM乙烯基乙二醇端接的硫醇溶液(ethyleneglycol-terminated thiol solution)中24-72小时以形成无污垢自组装单层。图9显示了各种折射系数溶液的一系列标准化图像。所有的图像都是用大约850nm的中心成像波长获取的。图像A-D显示了溶液折射系数分别为1.3338、1.3343、1.3346和1.3354的流动反应器的相同区域。在引入每种蔗糖溶液之后，用ddI水冲洗反应器和系统。每次ddI水冲洗之后，区域的信号分析显示有微小的非特异吸附，信号的变异≤7％。图10显示了示例性SPR传感器实验响应的图示。如图所示，系统的响应对于＜3×10³的折射系数变化是线性的。

示例性SPR传感器的探测极限用ddI水样品加以研究。在大约3分钟的周期上以2s的间隔和1.2s的曝光时间获取图像。p-偏振图像用s-偏振图像加以标准化，从而用s-偏振图像和100象素区域上的平均数据获得百分比反射率。水样品显示出50％的反射率，标准偏差为0.13％。因此，该装置的探测极限大约为该标准偏差的4倍，或者说是0.5％。该反射率相应于在大约5×10^-5的折射系数内可探测变化的下限。

通过在＞100个象素上取平均获得的信噪比(SNR)没有进一步增加，除非对SPR传感器中暂时变化的信号也进行标准化。然而使用适当的参考标准化，SNR如预期地随信号强度的平方增加。图11显示了SNR比值作为未经修正(A，下图)和已经修正(B，上图)SPR数据平均象素数目的函数。该数据由以2s间隔获取的源波束的100个图像(800ms曝光时间)构成。明确地讲，我们的信号强度增加10²的因子将使SNR或者大约5×10^-6的探测极限增加10的因子。此外，SNR可以通过对系统进行硬件改性使源强度增加而进一步增加。

实例2：硫醇图的SPR图像和金表面上的牛血清白蛋白

为了估计本发明SPR成像器件的灵敏度和空间分辨率，通过示例性SPR传感器产生硫醇图的SPR图像。金表面(包括从FisherScientific电子波束沉积到标准显微镜载玻片上的大约1nm的Cr和大约45nm的金)上的硫醇图用聚二甲基硅氧烷(PDMS)印记规程(stamping protocol)制得。将所采用的规程最佳化，从而使材料从PDMS印记向表面的转移最小，并在表面上产生单层的硫醇。所有的图像都用p-偏振光获取。图12显示了一系列用处于多个不同倾斜角的光学干涉滤光器获取的硫醇和水图的图像。图12A相应于857nm的中心波长，图12B相应于852nm的中心波长，图12C相应于845nm的中心波长，图12D相应于830nm的中心波长和图12E相应于814nm的中心波长。十六烷硫醇(hexadecanethiol)层相应于图像的光亮区域，水层相应于黑暗区域。通过与印记接触产生的方形区域大约为500μm×212μm。如图12A-12E所示，随着滤光器从该样品的最佳位置偏离，不同折射系数区域之间的对比度降低。如图12A所示，本发明的SPR传感器能够产生具有折射系数的探针区域的高视觉品质图像。

为示例性SPR传感器实验地确定了小于大约50μm的横向分辨率上限。图13显示了最小外形尺寸为大约100μm(A，左侧)和大约50μm(B，右侧)的硫醇图的图像。该图像显示了一维透视缩小(foreshortened)了因子为0.43的图像。在表面等离子体激元传播方向上，确定出横向分辨率的下限为＞50μm。这与已知的表面等离子体激元在近红外区金上的传播长度一致。

图14A-D显示了当牛血清白蛋白(BSA)吸附到金表面上时产生的图像。所有的图像都用p-偏振光和大约853nm的中心波长获取。图14A显示了以水为背景的反应器的小区域的图像(RI_water在大约850nm为大约1.328)。图14B显示了具有2mg ml^-1BSA磷酸缓冲盐溶液(PBS)的反应器的相同区域的图像。图14C显示了在泵唧水通过反应器除掉所有未结合蛋白质之后以水为背景的相同区域的图像。图14D显示了图14A的图像减去图14C的图像之后产生的差异图像。折射系数的变化是由于蛋白质吸附到Au表面上(对于水中的BSA单层，RI为大约1.331)。该折射系数变化相应于大约26％的百分比反射率变化。这些测量结果显示，本发明的SPR传感器能够灵敏地探测由于蛋白质吸附到探针区内导致的折射系数变化。

Claims (64)

1.一种表面等离子体激元谐振传感器，用于感测探针区的折射系数，其包括：

多色光源，用于产生沿着入射光传播轴传播的光；

偏振器，其与所述多色光源光联通，用于选择所述光的偏振状态；

光学组件，其与所述多色光源光联通，所述光学组件包括一个电介质层、一个电介质样品层和一个位于所述电介质层和所述电介质样品层之间的导电层，其中用所述光的所述光学组件的照射可以产生沿着反射光传播轴传播的光，其中所述电介质样品层临近所述导电膜的部分构成探针区；

探测器，其与所述光学组件光联通，用于探测沿着所述反射光轴传播的所述光，借此感测所述探针区的折射系数；和

可选择调节波长选择器，其位于所述光源与所述探测器之间的光路上，用于透射光，该光具有选择的透射波长分布从而在与所述电介质样品层接触的所述导电层表面上产生表面等离子体激元。

2.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，进一步包括一个位于所述光学组件与所述探测器之间的光收集与聚焦元件，所述光收集与聚焦元件用于收集沿着反射光传播轴传播的所述光并将沿着反射光传播轴传播的光聚焦在所述探测器上。

3.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，进一步包括一个用于准直来自所述多色光源的光的准直光学元件，其中所述准直光学元件位于所述多色光源与所述光学组件之间。

4.根据权利要求3的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述准直光学元件包括第一棱镜、针孔和第二棱镜，其每一个都位于所述多色光源与所述光学元件之间。

5.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述可选择调节波长选择器位于所述光学组件与所述探测器之间。

6.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述可选择调节波长选择器位于所述多色光源与所述光学组件之间。

7.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述可选择调节波长选择器是光学干涉滤光器。

8.根据权利要求7的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器是Fabry-Perot标准具。

9.根据权利要求7的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器是线性可变干涉滤光器。

10.根据权利要求7的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器能够可调节地围绕垂直于所述入射光传播轴的轴线旋转，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择地调节透射波长的分布。

11.根据权利要求10的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择调节透射波长分布的中心波长。

12.根据权利要求11的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述透射波长分布的中心波长由下式给出：

${\mathrm{\λ}}_{\mathrm{center}}\left({\mathrm{\θ}}_{\mathrm{titlt}}\right)=\left({\mathrm{\λ}}_{\mathrm{center}}\left(0\right)\right){(1-\left(\frac{{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{tilt}}}{n^2}\right))}^{0.5},$

其中λ_center是透射波长分布的所述中心波长，θ_tilt是倾斜角，λ_center(0)是相对于反射或入射光传播轴垂直入射的中心波长，n是光学干涉滤光器的折射系数。

13.根据权利要求7的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器能够可调节地围绕垂直于所述反射光传播轴的轴线旋转，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择地调节透射波长的分布。

14.根据权利要求13的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择调节透射波长分布的中心波长。

15.根据权利要求14的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述透射波长分布的中心波长由下式给出：

${\mathrm{\λ}}_{\mathrm{center}}\left({\mathrm{\θ}}_{\mathrm{titlt}}\right)=\left({\mathrm{\λ}}_{\mathrm{center}}\left(0\right)\right){(1-\left(\frac{{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_{\mathrm{tilt}}}{n^2}\right))}^{0.5},$

其中λ_center是透射波长分布的所述中心波长，θ_tilt是倾斜角，λ_center(0)是相对于反射或入射光传播轴垂直入射的中心波长，n是光学干涉滤光器的折射系数。

16.根据权利要求7的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器能够可调节地围绕垂直于所述入射光传播轴的轴线旋转，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择地调节基本上被阻止透过所述光学干涉滤光器的波长的分布。

17.根据权利要求7的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器能够可调节地围绕垂直于所述反射光传播轴的轴线旋转，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择地调节基本上被阻止透过所述光学干涉滤光器的波长的分布。

18.根据权利要求7的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光学干涉滤光器具有第一和第二基本上平行的端部，且所述第一端部的倾斜角在0°到大约35°的范围上选择。

19.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述透射波长的分布用中心波长加以表征，且所述中心波长可以在大约65nm的范围上加以调谐。

20.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述透射波长的分布用带宽加以表征，且所述带宽的数值从大约1nm-大约100nm的范围内选择。

21.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述可选择调节波长选择器由一个单色器构成。

22.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述可选择调节波长选择器由一个分光计构成。

23.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述可选择调节波长选择器由一个棱镜构成。

24.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述可选择调节波长选择器由一个光栅构成。

25.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述探测器是一个电荷耦合器件。

26.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述电介质层具有第一折射系数，其中所述电介质样品层具有小于第一折射系数的第二折射系数，且其中沿着所述入射光传播轴传播的所述光在与所述光学组件相互作用时经历了全内反射。

27.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述电介质层是一个棱镜。

28.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，进一步包括一个流动池，其在操作上与所述光学组件相连用于将样品引入到所述探针区。

29.根据权利要求28的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述电介质样品层是由所述流动池提供的样品。

30.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述导电层由金膜构成。

31.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述第一折射系数层和所述导电层构成一个波导管。

32.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述第一折射系数层和所述导电层构成一个光纤。

33.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，包括一个表面等离子体激元成像器件。

34.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述光源是非相干光源。

35.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，进一步包括一个在操作上与所述光学组件相连的微流流动池，用于将样品引入到所述探针区。

36.根据权利要求35的表面等离子体激元谐振传感器，其中与所述第二层相接触的所述导电层的所述表面构成所述微流流动池的一个侧面。

37.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中所述导电层的所述表面被改性以提供可选择的结合亲和性。

38.根据权利要求1的表面等离子体激元谐振传感器，其中与所述电介质样品层接触的所述导电层的所述表面被改性以提供可选择的吸附特性。

39.一种感测探针区折射系数的方法，包括如下的步骤：

使光从多色光源通过偏振器，借此产生沿着入射光传播轴传播的光；

将所述光导向到光学组件上，所述光学组件包括电介质层、电介质样品层和位于所述电介质层和所述电介质样品层之间的导电层，借此产生沿着反射光传播轴传播的光，其中所述电介质样品层临近所述导电层的部分构成所述探针区；

使光通过位于所述光源和探测器之间的光路上的可选择调节波长选择器；

用所述探测器探测所述光，借此感测所述探针区的所述折射系数，和

调节所述可选择调节波长选择器以透射具有所选波长分布的光，从而在与所述电介质样品层接触的所述导电层表面上产生表面等离子体激元。

40.根据权利要求39的方法，其中所述调节步骤包括系统地改变由所述可选择调节波长选择器透射的波长分布的步骤。

41.根据权利要求39的方法，其中所述调节步骤包括如下步骤：

透射光通过具有第一波长分布的所述可选择调节波长选择器，借此产生所述探针区的第一图像；

透射光通过具有第二波长分布的所述可选择调节波长选择器，借此产生所述探针区的第二图像；

比较所述第一和第二图像的光谱品质；和

选择由所述可选择调节波长选择器透射的所述入射光的波长分布以提高所述图像的光谱品质。

42.根据权利要求39的方法，其中所述可选择波长选择器位于所述光源与所述光学组件之间。

43.根据权利要求39的方法，其中所述可选择波长选择器位于所述光源与所述探测器之间。

44.根据权利要求39的方法，其中所述可选择波长选择器是一个光学干涉滤光器。

45.根据权利要求44的方法，其中所述光学干涉滤光器是Fabry-Perot标准具。

46.根据权利要求44的方法，其中所述调节步骤包括围绕垂直于所述入射光传播轴的轴线调节所述光学干涉滤光器的步骤，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择调节透射光波长的分布。

47.根据权利要求44的方法，其中所述调节步骤包括围绕垂直于所述反射光传播轴的轴线调节所述光学干涉滤光器的步骤，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择调节透射光波长的分布。

48.根据权利要求44的方法，其中所述调节步骤包括围绕垂直于所述入射光传播轴的轴线调节所述光学干涉滤光器的步骤，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择调节基本上被阻止透过所述光学干涉滤光器的波长分布。

49.根据权利要求44的方法，其中所述调节步骤包括围绕垂直于所述反射光传播轴的轴线调节所述光学干涉滤光器的步骤，其中所述光学干涉滤光器的旋转可选择调节基本上被阻止透过所述光学干涉滤光器的波长分布。

50.根据权利要求39的方法，其中所述使光通过偏振器的步骤产生沿着所述入射光传播轴传播的具有p-偏振状态的光。

51.根据权利要求39的方法，其中沿着所述入射光传播轴传播的所述光在与所述光学组件相互作用时经历了全内反射。

52.根据权利要求39的方法，进一步包括校准来自所述多色光源的光的步骤。

53.根据权利要求39的方法，进一步包括将沿着所述反射光传播轴传播的所述光聚焦到所述探测器的步骤。

54.根据权利要求39的方法，其中所述光具有电磁波谱近红外区内的波长。

55.根据权利要求39的方法，其中所述光学组件包括一个在操作上与所述探针区相连的流动池，用于将化学物质传递到所述探针区内。

56.根据权利要求55的方法，进一步包括使化学物质流动通过所述流动池的步骤，借此改变所述探针区的组成。

57.根据权利要求55的方法，进一步包括使化学物质流动通过所述流动池的步骤，借此改变所述探针区的折射系数。

58.使化学物质流动通过所述流动池的步骤，借此改变所述探针区的厚度。

59.根据权利要求55的方法，其中所述流动池使一个微流流动池。

60.一种产生探针区图像的方法，包括如下步骤：

使光从多色光源通过偏振器，借此产生沿着入射光传播轴传播的光；

将所述光导向到光学组件上，所述光学组件包括电介质层、电介质样品层和位于所述电介质层和所述电介质样品层之间的导电层，借此产生沿着反射光传播轴传播的光，其中所述电介质样品层临近所述导电层的部分构成所述探针区；

使光通过位于所述光源和探测器之间的光路上的可选择调节波长选择器；

用所述探测器探测所述光，借此产生所述探针区的所述图像，和

调节所述可选择调节波长选择器以透射具有所选波长分布的光，从而在与所述电介质样品层接触的所述导电层表面上产生表面等离子体激元。

61.根据权利要求60的方法，其中所述探测器是电荷耦合器件。

62.一种探测探针区折射系数改变的方法，包括如下步骤：

使光从多色光源通过偏振器，借此产生沿着入射光传播轴传播的光；

将所述光导向到光学组件上，所述光学组件包括电介质层、电介质样品层和位于所述电介质层和所述电介质样品层之间的导电层，借此产生沿着反射光传播轴传播的光，其中所述电介质样品层临近所述导电层的部分构成所述探针区；

使光通过位于所述光源和探测器之间光路上的可选择调节波长选择器，其中所述可选择调节波长选择器被调节透射具有所选波长分布的入射光，从而在与所述电介质样品层接触的所述导电层的表面上产生表面等离子体激元；

用所述探测器探测所述光，借此产生至少一个参考测量结果，

用所述探测器探测所述光，借此产生至少一个分析测量结果，和

比较所述参考测量结果和所述分析测量结果，从而探测所述探针区折射系数的所述变化。

63.根据权利要求62的方法，其中所述光学组件进一步包括一个流动池，用于将化学物质引入到所述探针区。

64.根据权利要求63的方法，进一步包括将化学物质引入到所述探针区的步骤。

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