CN1726227A

CN1726227A - 与gd2结合的小鼠14.18抗体的人源化抗体(h14.18)以及其与il－2的融合

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Publication number: CN1726227A
Application number: CNA200380106522XA
Authority: CN
Inventors: S·D·吉利斯; 劳健明
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2002-12-17
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2006-01-25
Anticipated expiration: 2023-12-16
Also published as: ZA200505681B; US7767405B2; JP4494977B2; RU2005119305A; CA2510180A1; PL211180B1; ES2346205T3; US8470991B2; ATE471946T1; DK1572748T3; DE60333121D1; PT1572748E; PL377337A1; AU2003298187A1; CA2510180C; WO2004055056A1; BR0317376A; RU2366664C2; KR101086660B1; US20040203100A1

Abstract

本发明提供了能结合人细胞表面鞘糖脂GD2的人源化抗体H14.18。抗体包含当向人施用时降低它们的免疫原性的经修饰可变区，更具体地，为经修饰的构架区。所述抗体可与治疗剂如IL－2偶联并在治疗癌中应用。

Description

与GD2结合的小鼠14.18抗体的人源化抗体 (H14.18)以及其与IL-2的融合

本发明总体上涉及经修饰抗体。更具体地，本发明涉及特异结合人细胞表面鞘糖酯GD2的具有已降低免疫原性的经修饰抗体，以及它们作为治疗剂的用途。

发明背景

许多年来，在研发基于抗体的治疗中有很大进展。例如，研究者不仅鉴定了许多癌特异标记物，也鉴定了许多与此类标记物特异结合的抗体。抗体可用于向表达标记物的癌细胞递送特定的分子，例如毒素或免疫刺激物如细胞因子以选择性杀死癌细胞。

14.18抗体为针对细胞表面鞘糖脂GD2的小鼠来源单克隆抗体。GD2为通常只在神经元细胞外表面膜以显著水平表达的二唾液酸神经节苷酯，其中它暴露于免疫系统是受到血脑屏障限制的。

相反的，许多肿瘤细胞鞘糖酯细胞表面表达具有异常水平。例如，GD2在广泛的肿瘤细胞表面表达，所述肿瘤细胞包括成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、小细胞肺癌、骨肉瘤及其它软组织肉瘤。因此，GD2为用于将免疫刺激性蛋白质结构域靶向肿瘤细胞，以对肿瘤细胞引起有效的免疫反应而破坏它们的一种便利的肿瘤特异标记物。虽然14.18小鼠抗体(m14.18抗体)可有助于将此类蛋白质结构域靶向肿瘤细胞，但其小鼠来源的氨基酸序列可降低目的治疗作用。

当施用于患者时，抗体在宿主哺乳动物中具有伴随的免疫原性。当抗体不是自体的时，这更有可能发生。结果基于抗体治疗的有效性常常受到针对治疗性抗体的免疫原性反应的限制。当抗体整个或部分来自与宿主哺乳动物不同的哺乳动物，例如当抗体来自小鼠且受者为人时，免疫原性反应一般增加。

对于在人中的临床用途，将小鼠来源抗体修饰成与人抗体更接近，以将小鼠来源抗体的免疫原性降低或降到最小可能是有利的。小鼠来源抗体的免疫原性可通过制备嵌合抗体降低，所述嵌合抗体将人抗体的恒定区与小鼠可变结构域进行融合。然而，残留的小鼠可变结构域在人中一般仍具有免疫原性并因此可降低基于抗体治疗的功效。

降低免疫原性的一些方法，如“镶嵌术(veneering)”及“人源化”涉及导入许多氨基酸替代并可破坏抗体与抗原的结合。m14.18抗体与GD2的结合具有中等亲和力。因此，预计显著降低m14.18对GD2亲和力的突变使得m14.18在人中的治疗性目的的作用降低。因此，本领域需要可有效靶向GD2并在施用于人时具有降低免疫原性的治疗性抗体。

发明概述

总体上，本发明提供了在人中具有较低免疫原性但仍保持m14.18对人GD2结合亲和力的m14.18抗体的经修饰形式。

更具体地，本发明提供了m14.18抗体的人源化形式(hu14.18抗体)，其中一个或多个构架区的一些小鼠特异氨基酸用不同氨基酸替代以降低它们在人中的免疫原性。本发明也提供了hu14.18抗体与一种或多种非免疫球蛋白分子融合以增强靶向免疫治疗的作用。

一方面，本发明提供了包括定义了免疫球蛋白轻链可变区(V_L区)的SEQ ID N0：1所示氨基酸序列的抗体可变区。另一方面，本发明涉及包括定义了免疫球蛋白重链可变区(V_H区)的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗体可变区。在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NO：1所示氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列连接的抗体可变区。氨基酸序列可例如通过二硫键或肽键连接。

另一方面，本发明涉及与GD2特异结合并包括至少SEQ ID NO：1的第1-23位氨基酸、SEQ ID NO：2的第1-25位氨基酸或SEQ ID NO：2的第67-98位氨基酸的抗体可变区。此类序列定义了hu14.18抗体的免疫球蛋白可变区中的构架区。构架区在以下进行更详细的描述。

本发明的一方面涉及用于靶向表面具有GD2的细胞并包括向患者施用本发明所述抗体可变区的方法。在一个实施方案中，靶细胞为肿瘤细胞。本发明的另一方面包括编码抗体可变区的核酸或包括此核酸的细胞，所述核酸或包括此核酸的细胞可向患者施用或用于体外蛋白质产生。

本发明也提供了包括本发明所述抗体可变区及至少包含CH2结构域的Fc部分的多肽、编码多肽的核酸、包括核酸的细胞以及通过向患者施用多肽、核酸或细胞用于靶向表面具有GD2的细胞的方法。在本发明的一些实施方案中，Fc部分来自IgG1。

有或无插入Fc部分的抗体可变区可与非免疫球蛋白分子连接。具体地，非免疫球蛋白分子可为细胞因子，如白细胞介素、造血因子、淋巴因子、干扰素或趋化因子。白细胞介素可为例如白细胞介素-2或白细胞介素-12。造血因子及淋巴因子可分别为例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及淋巴毒素。干扰素可为例如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ。在本发明的一些实施方案中，融合蛋白包括第二种非免疫球蛋白分子，如第二种细胞因子。在具体的实施方案中，融合蛋白包括抗体可变区、IL-2及IL-12。

可以理解文中描述的多种实施方案的特征不是互相排斥的并可以多种组合及互换存在。

附图描述

图1A显示根据本发明所述的免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列。

图1B显示根据本发明所述的免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列。

图2A-D显示表达载体的核苷酸序列，包括编码根据本发明所述的免疫球蛋白轻链及免疫球蛋白重链-IL-2融合蛋白的核酸构建体。

图3A显示根据本发明所述的免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。

图3B显示根据本发明所述的免疫球蛋白重链的氨基酸序列。

发明详述

本发明提供了在人中具有较低免疫原性但仍能特异结合人GD2的m14.18抗体的经修饰形式。降低的免疫原性是由免疫球蛋白可变结构域中一个或多个经改变氨基酸序列提供的。抗体用于治疗GD2阳性肿瘤，特别是当与细胞因子或其它免疫调节剂融合时，抗体用于治疗GD2阳性肿瘤。

如文中应用的，术语“抗体”及“免疫球蛋白”理解为表示(i)完整抗体(例如，单克隆抗体或多克隆抗体)，(ii)其抗原结合部分，包括例如Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段、单链抗体结合部位、sFv，(iii)双特异抗体及其抗原结合部分，和(iv)多特异性抗体及其抗原结合部分。

如文中应用的，术语“特异结合”及“特异性结合”理解为表示抗体对特定抗原具有至少约10⁶M^-1，更优选地至少约10⁷M^-1，更优选地至少约10⁸M^-1及最优选地至少约10¹⁰M^-1的结合亲和力。

如文中应用的，术语“构架区”及“FR”理解为表示与互补性决定区(CDR)相邻的免疫球蛋白可变区的区域。CDR为与抗原主要相互作用的免疫球蛋白部分。如图1中显示的，V_H及V_L区域均包含四个FR并位于氨基酸序列的加框部分。

特别地，对于图1A(SEQ ID NO：1)显示的氨基酸序列，轻链FR由自Aspl至Cys23(huV_LFR1)、自His39至His54(huV_LFR2)、自Gly62至Cys93(huV_LFR3)及自Phe104至Lys113(huV_LFR4)的氨基酸序列定义。对于图1B(SEQ ID NO：2)中显示的氨基酸序列，重链FR由自Glu1至Ser25(huV_HFR1)、自Trp36至Gly49(huV_HFR2)、自Arg67至Ser98(huV_HFR3)及自Trp103至Ser113(huV_HFR4)的氨基酸序列定义。

本发明的蛋白质序列

本发明以与人细胞表面鞘糖酯GD2结合优选地特异结合、并具有衍生自m14.18抗体的经修饰区域的抗体为特征。将V_H或V_L氨基酸序列(或两者的氨基酸序列)进行修饰或人源化以在向人施用时，降低它们的免疫原性。根据本发明，m14.18抗体例如可用去免疫化(deimmunization)的方法进行人源化，所述去免疫化的方法为将潜在的T细胞表位通过导入降低肽表位与MHC II类分子结合的突变去除或减弱(参见，例如，WO98/52976和WO00/34317)。备选地，将非人T细胞表位突变以便它们与在人抗体中存在的人自身表位相对应(参见，例如，美国专利号5,712,120)。本发明提供了具有包括至少一个人源化FR序列的V_L及V_H区域的GD2抗体，因此在向人施用时降低了免疫原性。

I.重链及轻链可变区

如以上谈及的，hu14.18包括衍生自m14.18抗体的与人GD2抗原保持特异结合性的人源化可变区。在本发明的一些实施方案中，hu14.18抗体的V_L区域包括以下多肽：

D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C-R-S-S-Q-S-L-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-H-W-Y-L-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-H-K-V-S-N-R-F-S-G-V-P-D-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-K-I-S-R-V-E-A-E-D-L-G-V-Y-F-C-S-Q-S-T-H-V-P-P-L-T-F-G-A-G-T-K-L-E-L-K(SEQ ID NO：1)。

在具体的实施方案中，hu14.18抗体包括由SEQ ID NO：1的1至23位残基即D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C(huV_LFR1)定义的轻链FR1。

在本发明的其它实施方案中，hu14.18抗体的V_H区域包括以下多肽：

E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S-G-S-S-F-T-G-Y-N-M-N-W-V-R-Q-N-I-G-K-S-L-E-W-I-G-A-I-D-P-Y-Y-G-G-T-S-Y-N-Q-K-F-K-G-R-A-T-L-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-L-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S-G-M-E-Y-W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S(SEQ ID NO：2)。

在具体的实施方案中，hu14.18抗体包括由SEQ ID NO：2的第1至25位残基即E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S(huV_HFR1)定义的重链FR1。在本发明的又一实施方案中，hu14.18抗体包括由SEQ ID NO：2的第67至98位残基即R-A-T-I-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-I-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S(huV_HFR3)表示的重链FR3。

前述实施方案的多种组合也在本发明的范围内。例如，hu14.18抗体可包括SEQ ID NO：1所示V_L序列及SEQ ID NO：2所示V_H序列。取决于V_L及V_H区域的核酸序列是如何构建的，它们可通过二硫键或肽键连接。一般地，当V区的序列是由分别的DNA构建体编码时，它们通过二硫键连接。相反地，当V区的序列在单链DNA构建体上编码时，它们一般通过肽键连接。

本发明也考虑与GD2特异结合并至少包括部分人源化V区的抗体。例如，hu14.18抗体可包括由SEQ ID NO：1定义的V_L区域及具有至少一个人源化FR如huV_HFR1或huV_HFR2的V_H区域。备选地，本发明的抗体可包括由SEQ ID NO：2定义的V_H区域及具有至少一个人源化FR如huV_LFR1的V_L区域。hu14.18抗体也可具有包括至少一个人源化FR的V_H区域和/或至少一个人源化FR的V_L区域。

在本发明的某些实施方案中，轻链可变区及重链可变区可分别与免疫球蛋白的轻链恒定区及重链恒定区偶联。免疫球蛋白轻链具有称为κ链或λ链的恒定区。在本发明的具体实施方案中，轻链恒定区为κ链。重链恒定区以及其多种修饰及组合在以下进行详细讨论。

II.Fc部分

本发明所述的抗体可变区任选的与Fc部分融合。如文中应用的，Fc部分包含来自免疫球蛋白优选人免疫球蛋白的重链恒定区的结构域，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。免疫球蛋白的重链恒定区定义为与重链的至少部分C-端区域同源的天然存在或人工产生的多肽，包括CH1、铰合部、CH2、CH3及对于某些重链类包括CH4结构域。“铰合部”区域连接Fc部分的CH1结构域与CH2-CH3区域。所有哺乳动物免疫球蛋白重链的恒定区显示广泛的氨基酸序列相似性。此类免疫球蛋白区域的DNA序列是本领域公知的。(参见，例如，Gillies等人，(1989)J.Immunol.Meth.125：191)。

在本发明中，Fc部分一般包括至少CH2结构域。例如，Fc部分可包括完整的免疫球蛋白重链恒定区(CH1-铰合部-CH2-CH3)。备选地，Fc部分可包括所有或部分铰链区、CH2结构域及CH3结构域。

免疫球蛋白的恒定区负责许多重要的抗体效应子功能，包括Fc受体(FcR)结合及补体固定。重链恒定区主要有五类，即IgA、IgG、IgD、IgE及IgM，每类具有通过同种型定义的特征性效应子功能。

例如，IgG分为四个γ同种型：γ1、γ2、γ3及γ4，也分别称为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgG分子可与多类细胞受体相互作用，所述多类细胞受体包括三类对抗体IgG类特异的Fcγ受体(FcγR)，即FcγRI、FcγRII及FcγRIII。据报道对IgG与FcγR受体结合重要的序列在CH2及CH3结构域中。

抗体的血清半衰期是受抗体与Fc受体(FcR)结合能力的影响。同样，免疫球蛋白融合蛋白的血清半衰期也受其不能与此类受体结合的影响(Gillies等人，Cancer Research(1999)59：2159-66)。与IgG1相比，IgG2及IgG4的CH2与CH3结构域与Fc受体的结合亲和力不能检测到或结合亲和力降低。因此，特征性抗体的血清半衰期可用来自IgG2或IgG4同种型的CH2和/或CH3结构域延长。备选地，抗体可包括来自IgG1或IgG3的CH2和/或CH3结构域，在所述此类结构域的一个或多个氨基酸进行修饰以降低对Fc受体的结合亲和力(参见，例如，美国专利申请09/256,156，作为美国专利申请公开2003-0105294-Al而公开)。

Fc部分的铰链区一般与重链恒定区CH1结构域的C-端连接。当包括在本发明的蛋白质中时，铰合部与天然存在的免疫球蛋白区域同源并一般包括半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基如在天然免疫球蛋白中那样通过二硫键连接两条重链。人及小鼠免疫球蛋白铰链区的代表性序列可在ANTIBODY ENGINEERING，a PRACTICAL GUIDE，(Borrebaeck编辑，W.H.Freeman and Co.，1992)一书中找到。

本发明的合适铰链区可衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其它免疫球蛋白同种型。IgG1同种型在铰链区具有允许形成强效及坚固二硫键的两个二硫键。因此，本发明优选的铰链区来自IgG1。任选地，将IgG1铰合部的第一个最N-端半胱氨酸突变以增强本发明所述抗体或抗体融合蛋白的表达及装配(参见，例如，美国专利申请10/093,958，作为美国专利申请公开2003-0044423-Al而公开)。

与IgG1相反，IgG4的铰链区已知低效形成链间二硫键(Angal等人，(1993)，Mol.Immunol.30：105-8)。同样，IgG2铰链区具有四个二硫键，所述四个二硫键在重组系统分泌时趋向于促进寡聚化并可能形成不正确的二硫键。本发明的一个合适的铰链区可衍生自IgG4铰链区，优选地包含增强来自重链的部分之间正确形成二硫键的突变(Angal等人，(1993)，Mol.Immunol.30(1)：105-8)。另一优选的铰链区衍生自IgG2铰合部，其中最初的两个半胱氨酸均突变为另一氨基酸，例如，按一般优选的顺序，突变为丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或硒代半胱氨酸(参见，例如，美国专利申请公开2003-0044423-Al)。

与本发明抗体可变区融合的Fc部分可包含衍生自不同抗体同种型的CH2和/或CH3结构域及铰链区。例如，Fc部分可包含IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域及IgG1的铰链区。此类杂化(hybrid)Fc部分的装配在美国专利申请公开2003-0044423-Al中已有描述。

当与本发明所述的抗体可变区融合时，Fc部分优选包含通常用于延长Fc融合蛋白血清半衰期的一个或多个氨基酸修饰。此类氨基酸修饰包括基本降低或去除Fc受体结合或补体固定活性的突变。例如，一类此种突变去除免疫球蛋白重链Fc部分的糖基化位点。在IgG1中，糖基化位点为Asn297(参见，例如，美国专利申请10/310,719，作为美国专利申请公开2003-0166163-Al而公开)。

III.融合连接区(junction region)

本发明的抗体可变区可任选地与非免疫球蛋白部分直接或间接地例如通过接头肽(例如，(Gly₄-Ser)₃(SEQ ID NO：3))连接或融合。如在美国专利申请公开2003-0166877-Al中描述的，所公开融合蛋白的免疫原性可通过损坏融合接头或接头表位与T细胞受体的相互作用而降低。甚至在两种人蛋白质如人Fc及人IL-2之间的融合中，融合接头或接头表位周围的区域包括通常在人身体中不存在的肽序列，并因此可具有免疫原性。接头表位的免疫原性，例如可通过在融合接头附近导入一个或多个糖基化位点而降低，或如在美国专利公开2003-0166877-A1中描述的通过鉴定跨越接头的候选T细胞表位以及改变接头附近的氨基酸以降低候选T细胞表位与T细胞受体相互作用的能力而降低。

蛋白质的血清半衰期也可通过将突变导入到融合连接区而增加。例如，在与非免疫球蛋白部分融合的包括CH3结构域蛋白质中，CH3结构域的C-端赖氨酸可改变为另一个氨基酸如丙氨酸，如此可使所产生融合蛋白的血清半衰期相当程度的延长。

在某些实施方案中，融合接头的蛋白酶切割是令人希望的。因此，基因间区域可包括编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列。可将介于免疫球蛋白与细胞因子之间的此位点设计为在靶位点提供细胞因子蛋白水解释放的位点。例如，纤溶酶及胰蛋白酶在赖氨酸及精氨酸残基后的蛋白酶可接近的位点处切割是公知的。其它位点特异性内切蛋白酶及其识别的氨基酸序列是公知的。

IV.用hu14.18抗体融合蛋白治疗人疾病

本发明所述的抗体可变区可与诊断剂和/或治疗剂连接。所述制剂可与抗体融合以产生融合蛋白。备选地，所述制剂可与抗体化学偶联以产生免疫偶联物(immuno-conjugate)。例如，所述制剂可为毒素、放射标记、显像剂、免疫刺激物等。

本发明所述的抗体可变区可与细胞因子连接。优选的细胞因子包括白细胞介素如白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16及IL-18、造血因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)如TNF、淋巴因子如淋巴毒素、代谢过程的调节剂如瘦素(leptin)、干扰素如干扰素α、干扰素β、干扰素γ以及趋化因子。优选地，抗体-细胞因子融合蛋白或免疫偶联物显示细胞因子生物学活性。在一个实施方案中，抗体可变结构域与IL-2融合。优选地，如在美国专利申请公开2003-0166163-A1中描述的，将在IL-2分子内的几个氨基酸进行突变以降低毒性。

例如，图3A及3B显示根据本发明所述抗体融合蛋白具体实施方案的氨基酸序列。具体地，图3A显示包括可变区及恒定区的人源化免疫球蛋白轻链的肽序列。图3B显示与IL-2连接的人源化免疫球蛋白重链的肽序列。所述多肽提供了能特异结合GD2并刺激免疫系统的人源化抗体融合蛋白。

任选地，蛋白质复合体可进一步包括第二种试剂，如第二种细胞因子。在一个实施方案中，hu14.18抗体融合蛋白包括IL-12及IL-2。包含免疫球蛋白结构域及两种不同细胞因子的蛋白质复合体的构建在美国专利号6,617,135中进行了详细描述。

本发明的融合蛋白在治疗人疾病如癌中是有用的。在治疗人肿瘤时，每个患者用0.1至100毫克/平方米的剂量，通过输注或皮下注射施用包含本发明所述V区的抗体-IL-2融合蛋白是特别有用的。在优选的实施方案中，每个患者用1至10毫克/平方米，以及更优选地，每个患者用约3至6毫克/平方米的剂量，通过输注或皮下注射施用包含本发明所述V区的抗体-IL-2融合蛋白是特别有用的。

临床研究显示在施用hu14.18-IL-2后，融合蛋白保留通过IL-2受体活化IL-2反应性细胞的能力并保留结合GD2-阳性肿瘤细胞并向它们的表面递呈IL-2的能力。此外，向癌患者施用hu14.18-IL-2融合蛋白导致令人惊讶的大量患者疾病进展的稳定(参见实施例1)。

本发明的药学组合物可以固体、半固体或液体剂型的形式，例如丸剂、胶囊剂、粉剂、液体剂、悬液剂等等应用，优选适合用于施用精确剂量的单位剂型。组合物包括常规药学载体或赋形剂，此外，可包括其它医学试剂、药学试剂、载体、佐剂等。此类赋形剂可包括其它蛋白质，例如人血清白蛋白或血浆蛋白质。制备此类剂型的实际方法是已知的或对本领域技术人员是显然的。在任何情况下，预施用的组合物或剂型包含对需要治疗的受试者达到预期效应的有效量的活性组分。

对所述组合物的施用可通过施用显示此类活性的制剂所采用的任何公认方式进行。此类方法包括经口、肠胃外或局部施用以及全身形式施用。可药用载体的静脉内注射是优选的施用方法(参见实施例1)。

当然，施用的活性化合物的量取决于需要治疗的受试者、所受痛苦的严重度、施用方式及开处方医生的诊断。

本发明的核酸

I.hu14.18抗体构建体

本发明也以能表达每种以上蛋白质的核酸为特征。例如，它们包括这样的核酸，所述核酸编码SEQ ID NO：1列出的氨基酸序列；SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；包括huV_LFR1氨基酸序列的hu14.18抗体V_L区域；包括huV_HFR1氨基酸序列的hu14.18抗体V_H区域；包括huV_HFR3氨基酸序列的hu14.18抗体V_H区域以及包含含有至少一个前述人源化FR序列的hu14.18抗体和一种或多种治疗剂的融合蛋白。

本发明所述的hu14.18抗体可通过基因工程技术产生；即通过形成编码包含本发明所述目的FR的GD2特异抗体的核酸构建体。在一个实施方案中，编码特征性抗体的基因构建体自5’至3’方向包括编码包括至少一个人源化FR的重链可变区的DNA片段及编码重链恒定区的DNA片段。在另一实施方案中，编码细胞因子的另一DNA片段与编码重链恒定区的DNA片段的3’端融合。在不同的实施方案中，基因构建体自5’至3’方向包括：编码包括至少一个人源化FR的重链可变区的DNA片段及编码细胞因子的DNA片段。备选地，本发明所述的核酸自5’至3’方向可包括：编码包括至少一个人源化FR的轻链可变区的DNA片段及编码细胞因子的DNA片段。在一些实施方案中，编码细胞因子的核酸与编码恒定区基因(例如CH3外显子)的3’端符合读框地直接连接或通过基因间区域(例如，通过适当接头，如通过编码(Gly₄-Ser)₃的DNA(SEQ ID NO：3))连接。

II.hu14.18抗体构建体的表达

将编码本发明蛋白质的核酸装配或插入到一个或多个表达载体用于导入到在其中表达的适当受体细胞。核酸导入到表达载体可通过标准分子生物学技术完成。优选的表达载体包括来自在细菌或哺乳动物细胞中可表达所编码蛋白质的载体。

根据本发明，抗体可变区重链优选与对应的轻链在同一细胞中共表达。对包含多个多肽链的融合蛋白，可应用多个表达载体。例如，用两个表达载体的共转染方法常常导致将两个载体均递呈到一个靶细胞。备选地，用编码多个多肽的单一载体在同一细胞中共表达有时是有用的。

例如，图2A-D显示均编码根据本发明所述的免疫球蛋白重链及轻链的单一载体的核酸序列。该载体也包括与免疫球蛋白重链3’端融合的编码IL-2的核酸。因此，当导入到细胞中时，仅此载体即可提供特异与GD2结合并刺激免疫功能的人源化抗体-IL-2融合蛋白。

此外，以单链分子表达本发明所述的蛋白质是方便的。例如，抗体可变区可作为单链抗体或任选地与非免疫球蛋白融合的sFv而表达。在另一实施方案中，将重链(有或无经融合的细胞因子)与轻(或重)链配对物(有或无经融合的细胞因子)组合以形成单价及二价免疫偶联物。

受体细胞系优选为淋巴样细胞，如骨髓瘤(或杂交瘤)。骨髓瘤可合成、装配并分泌由经转染基因编码的免疫球蛋白并可使蛋白质糖基化。特别优选的受体细胞为一般不产生内源性免疫球蛋白的Sp2/0骨髓瘤。当转染时，细胞只产生通过由经转染基因构建体编码的免疫球蛋白。经转染骨髓瘤可在培养液中生长或在小鼠的腹膜内生长，其中可自腹水获得经分泌的免疫偶联物。其它淋巴样细胞如B淋巴细胞也可用作受体细胞。

用包含编码嵌合Ig链的核酸构建体的载体转染淋巴样细胞有几种方法。向淋巴样细胞导入载体的优选途径为通过球芽融合(参见，例如，Gillies等人，(1989)Biotechnol.7：798-804)。备选的方法包括电穿孔或磷酸钙沉淀。产生免疫偶联物的其它有用方法包括制备编码RNA序列的构建体以及它在适当的体内或体外系统中的翻译。本发明所述的蛋白质一旦表达，可通过标准蛋白质纯化步骤进行收获(参见，例如，美国专利号5,650,150)。

III.通过基因治疗治疗癌

本发明所述的核酸可用作基因治疗剂用于治疗癌及其它疾病，其中定向免疫系统至特异细胞型是令人希望的。例如，细胞可自人或动物中取出，并且可将编码本发明所述抗体的一个或多个核酸转染到细胞中。然后将细胞重新导入到人或动物中。经转染细胞可为正常细胞或癌细胞。备选地，核酸可原位导入到细胞中。然后人或动物对癌细胞产生免疫反应，所述免疫反应可治愈或减轻癌的严重度。与适当调节元件偶联以促进在哺乳动物细胞中表达的本发明抗体可变区，可通过任何多种技术转染到细胞中，所述多种技术包括通过磷酸钙、“基因枪”、腺病毒载体、阳离子脂质体、反转录病毒载体或任何其它有效的转染方法。

在本发明的具体实施方案中，hu14.18抗体用于体内选择性地向靶细胞递送细胞因子，从而细胞因子可产生局部生物学效应如局部炎症反应、刺激T细胞的生长及活化或ADCC活性。将治疗有效量的抗体施用到具有靶细胞的受试者的循环系统中。

本发明进一步通过非限制性实施例进行阐述。

实施例

实施例1

hu14.18-IL2的纯化及制剂

在一个研究中，hu14.18-IL2自NS/0细胞表达，将组织培养上清液收获，并将hu14.18-IL2蛋白质依次进行纯化，所述次序为Abx经混合树脂柱层析、重组A蛋白层析及Q琼脂糖柱层析，接着通过Pellicon 2切向流透析渗滤将缓冲液交换为制剂缓冲液。此纯化的步骤在以下详细描述。病毒失活及去除步骤穿叉在这些纯化步骤中，在以下进行描述。病毒失活及除去步骤对纯化本身不是必需的，但用于满足调控原因。

将包含hu14.18-IL2的两升NS/0组织培养上清液用1M醋酸将pH调整到5.9并用于Abx柱(J.T.Baker)；用10mM MES、100mM醋酸钠pH 6.2洗；并用500mM醋酸钠pH 7洗脱。将此材料装到重组A蛋白柱(Pharmacia)上；用100mM磷酸钠、150mM NaCl pH 7洗；用100mM磷酸钠、150mM NaCl pH 6洗；用10mM磷酸钠pH 7洗；并用100mM磷酸钠、150mM NaCl pH 3.5洗脱。经洗脱材料的pH为4.2。为促进病毒失活，将此pH降到3.8并将此制备物孵育30分钟，然后将pH用1MNaOH中和到7。为去除核酸，将此材料装到Q琼脂糖柱(Pharmacia)上并用100mM磷酸钠、150mM NaCl pH 7洗。核酸结合到柱上，而蛋白质在流出液及洗液中发现，将此步骤重复直到A280返回到基线。按照制造者说明，进行Pellicon 2渗滤(Millipore)，以便将最终hu14.18-IL2材料置于以下剂型中。

1甘露醇 4％

2盐酸精氨酸USP/NF 100mM

3.柠檬酸USP-FCC 5mM

4.多乙氧基醚 0.01％(w.v)

将制剂缓冲液的pH用1M NaOH调整到7。

作为最终步骤，将制备物通过具有分子量截筛(cutoff)为180,000道尔顿的Viresolve 180膜(Millipore)过滤。这具有“磨光”材料的效应，结果去除了聚集的二聚体及较高数量级的寡聚物。

实施例2

hu14.18-IL-2融合蛋白的抗肿瘤活性

I期临床试验中观察到的

为评估hu14.18-IL-2的安全性及效力，进行了I期临床试验。适应症患者组织学上确定为外科上及医学上不能治愈的黑素瘤。这些患者可患有可测定的或可评估的转移性疾病，或他们在远端转移或区域再发性疾病的外科切除术后无疾病征象。只包括具有多发性(两次或多次)局部或区域性再发的患者，如果患者以前具有淋巴结参与的征象以及如果每次复发间隔为至少2个月。所有患者需要具有足够的骨髓功能(由白细胞总数(WBC)＞3,500/ml，或有粒白细胞总数＞2000/ml，血小板＞100,000/ml及血红蛋白＞10.0g/dl定义)，足够的肝功能[由天冬氨酸转氨酶(AST)＜3x正常值及总胆红素＜2.0mg/dl定义]以及足够的肾功能(由血清肌酸酐＜2.0mg/dl或肌酸酐清除率＞60毫升/分钟定义)。所有患者通过皮质脑电描记(ECOG)行为表现状态为0或1且寿命至少12周。在研究前4周内，接受化学治疗、放射治疗或其它免疫抑制治疗的患者除外。患者以前可患有中枢神经系统(CNS)转移，如果已经过了治疗，则在开始本研究前，必需至少稳定4周。征得了所有患者的同意。

将此I期临床设计为标签公开、非随机剂量按比例上升研究，其中3至6患者的组每天按以下剂量水平：0.8、1.6、3.2、4.8、6.0或7.5mg/m²接受hu14.18-IL-2。在每个疗程的第一周，连续3天对住院患者进行4小时静脉内(IV)输注施用hu14.18-IL-2。hu14.18-IL-2融合蛋白以包含4％甘露醇；盐酸精氨酸，100mM；柠檬酸，5mM及0.01％吐温80的剂型以pH 7向患者施用。完成第三次输注后大约24小时，如果稳定，患者自医院出院。副作用及毒性按NCI Common Toxicity Criteria(第2.0版)及威斯康辛大学综合性癌中心用于IL-2分级量表(行为表现状态、体重增加及温度)进行分级。剂量限制性毒性(Dose-limiting toxicity；DLT)按发生3级或4级毒性而不是3级淋巴细胞减少、高胆红素血症、低磷酸盐血或高血糖定义。最大耐受剂量(MTD)由在第1疗程中六个患者中两个患有DLT的剂量水平定义。3级治疗相关毒性的患者在第2疗程以50％剂量降低继续治疗前，需要恢复到至少1级。具有≥25％疾病进展的患者自研究中去除。具有稳定疾病的患者施用第2疗程。

在患者中评估了hu14.18-IL-2的药物代谢动力学特性。在最初4小时输注(第1疗程，第1天)后立即对来自所有33个患者的系列样本的hul4.18-IL-2水平进行评估时，发现半衰期为3.7小时(+/-SD为0.9小时)。这介于它的2个组分的半衰期之间(对IL-2大约为45分钟及对嵌合m14.18抗体约为3天)，并与在小鼠中观察到的嵌合m14.18-IL-2的半衰期是可比较的。自这些患者血清中清除hu14.18-IL-2后，不能检测到IL-2及hu14.18抗体组分。第1疗程期间，血清峰及曲线下面积(AUC)显示显著的剂量依赖性升高(p＜0.001)。

在本研究中对三十三个患者进行了治疗。表1列出了临床结果。两个患者(6％)只完成第1疗程3天中的前2天。在治疗的第2天，这些患者中的一个(剂量水平3)患3级高胆红素血症，另一个患者(剂量水平6)患需要继续治疗的3级缺氧和低血压。这两个患者疾病有所发展，没有接受治疗的第二疗程。十九个患者(58％)在治疗的第一疗程后疾病稳定并接受治疗的第二疗程。由于第1疗程的有害作用，五个患者(所有患者的15％)在第2疗程需要降低50％剂量。十七个患者(所有患者的52％)完成了第2疗程。一个患者(剂量水平4)在第2疗程期间拒绝接受最终输注，在第2疗程期间一个患者(剂量水平6)由于低血压保持最终输注。在治疗的第二疗程后，八个患者(所有患者的24％)具有稳定的疾病。结果表明在令人惊讶的大量患者中hu14.18-IL-2稳定了疾病进程。

在治疗的第2疗程后，33个患者中八个疾病稳定，在完成方案治疗后，此8个患者中4个持续为无进展性疾病征象(1个疾病稳定及3个无疾病征象)达20-52个月。

在复发或转移的外科切除术后，参与研究的33个患者中5个无可检测的疾病。此五个患者中的两个有疾病进展，而其余3个患者持续无疾病征象(20-52个月)。此发现与低荷瘤患者中最可能自免疫治疗介入中获得临床益处的假设一致。在治疗的两个疗程后，另一患者在肺小结中具有客观降低，但由于在远结中的生长，总的疾病反应分类为疾病进展。在hu14.18-IL-2治疗后将结切除并且患者在3年期间没有疾病进展。

表1

临床结果

	患者数
	患者数	完成第1疗程的患者	31
第1疗程后疾病稳定	19	完成第1疗程的患者	31
第1疗程后疾病稳定	19	降低50％剂量用于第2疗程	5
完成第2疗程的患者	17	降低50％剂量用于第2疗程	5
完成第2疗程的患者	17	第2疗程后疾病稳定	8

I期临床试验中通过hu14.18-IL-2的体内免疫刺激

对用hu14.18-IL-2治疗的患者的免疫刺激指征也进行检查。在第2-4天发生外周血淋巴细胞减少，接着在第5-22天恢复到淋巴细胞增多。此两种变化为剂量依赖性(分别为p＜0.01及p＜0.05)。对第1疗程在5、8、15及22天淋巴细胞计数显著高于基线。对第2疗程(疗程1的29天)基线淋巴细胞计数比第1疗程基线淋巴细胞计数升高，表明治疗的第一疗程的作用在29天仍存在。此外，对此12个患者，在第2疗程期间的5、8及15天淋巴细胞计数高于在第1疗程期间的5、8及15天的对应值。

hu14.18-IL-2治疗第一周后，淋巴细胞表面表型显示CD16+及CD56+淋巴细胞(自然杀伤(NK)细胞标记)增多。在第1疗程的第29天(第2疗程第1天)此作用仍存在。对于第19-33号患者(每天接受4.8-7.5mg/m²)，除第1天及第8天外，还在第15天及第22天，对淋巴细胞表面表型进行确定。此分析证明在第8、15及22天，CD56及CD56/CD16共表达细胞的增加保持显著升高(p＜0.01)。

作为免疫活化的测量标记，获得了第13-33号患者的C-反应性蛋白(CRP)水平并获得了完成第1疗程的31个患者的可溶性IL-2受体(sIL-2R)水平。与每个疗程的基线相比，在第1疗程及第2疗程治疗的第3-5天，存在平均CRP的显著增加。到每个治疗疗程的第8天，此CRP的增加复原到基线水平。在第1疗程及第2疗程期间，hu14.18-IL-2输注后开始24小时，sIL-2R水平比基线显著增加，此增加持续到第8天。发现sIL-2R的增加是剂量依赖性的(p＝0.014)。对两个疗程中接受同样剂量的患者，对第2疗程的sIL-2R值与第1疗程中的对应值相比增加1-5天(p＜0.05)。

将表达GD2并结合hu14.18-IL-2的LA-N-5成神经细胞瘤细胞系用于评估来自完成第1疗程的31个患者的外周血单核细胞(PBMC)中IL-2活化的NK功能及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。对此两次测定，与第1天相比，自第8天通过淋巴细胞介导的杀伤显著增加。接受如第1疗程相同剂量的第2疗程的12个患者，显示与在第1疗程期间获得的ADCC结果非常相似。发现第2疗程与第1疗程不同的唯一参数为第1天在存在IL-2时杀伤增强，表明此测定中杀伤增强在第29天(第2疗程，第1天)保持升高。

由于LA-N-5靶对新鲜NK细胞具有相对抗性，它用于测定IL-2增强的杀伤及ADCC。然而，由培养基(体外不添加IL-2)中新鲜PBMC介导LA-N-5的弱杀伤在第8天并不比第1天显著地大。

在第1、8、15及22天，用NK易感的K562靶细胞系对第19-33号患者进行了标准NK测定。与第1天相比，在第8天及第22天，观察到当在培养基中或在存在时IL-2检测时，NK裂解K562靶细胞显著增加。对来自经选择患者的血清样本也进行评估以确定功能性IL-2活性及功能性抗-GD2抗体。

用hu14.18-IL-2输注后获得的患者血清显示其对IL-2反应性Tf-lb细胞系存在经IL-2诱导的增殖。在输注4小时后，最初4小时期间看到增殖的进展性增加。到此输注后16小时，值复原到基线，与hu14.18-IL-2大约4小时的血清半衰期一致。通过流式细胞术对来自此时间点的血清样本也检查保留IL-2组分及其抗GD2抗体活性的完整hu14.18-IL-2免疫细胞因子(IC)的存在。在IC输注后，在患者血清样本中可检测到能结合M21细胞系(GD2阳性)的hu14.18-IL-2。在4小时输注后的最初4小时期间，能结合M21的IC量进行性增加，然后降低，也与约4小时的半衰期一致。最后，用来自患者的样本进行体外测定以确定施用hu14.18-IL-2导致的体内情况是否与需要实现ADCC一致。当将hu14.18-IL-2加入到细胞毒性测定时，来自第8天的PBMC显示对GD2+靶细胞的ADCC增强。来自第8天的PBMC进行与此相同的ADCC测定，然而，不是向测定中加入hu14.18-IL-2，而是加入在hu14.18-IL-2施用前或施用后获得的来自患者的血清。与在输注前获得的血清观察到的结果相比，在经施用hu14.18-IL-2后获得的血清中存在时，第2疗程第8天获得自患者的PBMC能介导杀LA-N-5细胞系作用增强。因此IV施用后，患者中循环的hu14.18-IL-2能通过来自同一患者的hu14.18-IL-2体内活化的PBMC促进ADCC。

总之，这些结果表明存在与此hu14.18-IL-2治疗相关的免疫学变化，所述免疫学变化包括淋巴细胞计数增加、CD16+及CD56+PBMC的百分数增加、NK裂解增加及ADCC增加。免疫活化的其它证据包括CRP及sIL-2R的血清水平增加。血清及PBMC的实验室分析显示IV施用后，患者血清中循环的hu14.18-IL-2分子保持通过IL-2受体活化IL-2反应性细胞的能力、保持结合GD2阳性肿瘤细胞的能力以及向它们表面递送IL-2的能力，如通过流式细胞术检测到的。NK细胞的体内活化是基于它们体外介导NK及ADCC功能的能力。此外，由施用于这些患者的hu14.18-IL-2体内活化的NK细胞能通过这些同一患者血清中循环的hu14.18-IL-2的促进而介导ADCC。因此，在此研究中在所有患者中达到了达到免疫活化的情况。

序列表

<110>默克专利有限公司

<120>与GD2结合的小鼠14.18抗体的人源化抗体(H14.18)以及其与IL-2的融合

<130>LEX-023

<150>US 60/433,945

<151>2002-12-17

<160>6

<170>patentIn版本3.1

<210>1

<211>113

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化免疫球蛋白轻链可变区

<400>1

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg

20 25 30

Ash Gly Ash Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Ash Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210>2

<211>113

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化免疫球蛋白重链可变区

<400>2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>连接子序列

<400>3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210>4

<211>10531

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有人源化免疫球蛋白轻链和重链以及IL-2的载体

<400>4

gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata

60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc

120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag

180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac

240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg

300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg

360

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat

420

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt

480

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc

540

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta

600

cagaacccac tgcttaactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagaccctc

660

tagaatgaag ttgcctgtta ggctgttggt gctgatgttc tggattcctg gtgaggagag

720

agggaagtga gggaggagaa tggacaggga gcaggagcac tgaatcccat tgctcattcc

780

atgtatctgg catgggtgag aagatgggtc ttatcctcca gcatggggcc tctggggtga

840

atacttgtta gagggaggtt ccagatggga acatgtgcta taatgaagat tatgaaatgg

900

atgcctggga tggtctaagt aatgccttag aagtgactag acacttgcaa ttcacttttt

960

ttggtaagaa gagattttta ggctataaaa aaatgttatg taaaaataaa cgatcacagt

1020

tgaaataaaa aaaaaatata aggatgttca tgaattttgt gtataactat gtatttctct

1080

ctcattgttt cagcttcctt aagcgacgtg gtgatgaccc agacccccct gtccctgccc

1140

gtgacccccg gcgagcccgc ctccatctcc tgcagatcta gtcagagtct tgtacaccgt

1200

aatggaaaca cctatttaca ttggtacctg cagaagccag gccagtctcc aaagctcctg

1260

attcacaaag tttccaaccg attttctggg gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca

1320

gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga gtggaggctg aggatctggg agtttatttc

1380

tgttctcaaa gtacacatgt tcctccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg

1440

aaacgtatta gtgtgtcagg gtttcacaag ag ggactaaa gacatgtcag ctatgtgtga

1500

ctaatggtaa tgtcactaag ctgcgggatc ccgcaattct aaactctgag ggggtcggat

1560

gacgtggcca ttctttgcct aaagcattga gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa

1620

gccctcagaa tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag

1680

ggggaagcta ggaagaaact caaaacatca agattttaaa tacgcttctt ggtctccttg

1740

ctataattat ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc cctaacatgc cctgtgatta

1800

tccgcaaaca acacacccaa gggcagaact ttgttactta aacaccatcc tgtttgcttc

1860

tttcctcagg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt

1920

tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca

1980

aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag

2040

agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag

2100

actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg

2160

tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agagggagaa gtgcccccac ctgctcctca

2220

gttccagcct gaccccctcc catcctttgg cctctgaccc tttttccaca ggggacctac

2280

ccctattgcg gtcctccagc tcatctttca cctcaccccc ctcctcctcc ttggctttaa

2340

ttatgctaat gttggaggag aatgaataaa taaagtgaat ctttgcacct gtggtttctc

2400

tctttcctca atttaataat tattatctgt tgtttaccaa ctactcaatt tctcttataa

2460

gggactaaat atgtagtcat cctaaggcgc ataaccattt ataaaaatca tccttcattc

2520

tattttaccc tatcatcctc tgcaagacag tcctccctca aacccacaag ccttctgtcc

2580

tcacagtccc ctgggccatg gtaggagaga cttgcttcct tgttttcccc tcctcagcaa

2640

gccctcatag tcctttttaa gggtgacagg tcttacggtc atatatcctt tgattcaatt

2700

ccctgggaat caaccaaggc aaatttttca aaagaagaaa cctgctataa agagaatcat

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tcattgcaac atgatataaa ataacaacac aataaaagca attaaataaa caaacaatag

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ggaaatgttt aagttcatca tggtacttag acttaatgga atgtcatgcc ttatttacat

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ttttaaacag gtactgaggg actcctgtct gccaagggcc gtattgagta ctttccacaa

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cctaatttaa tccacactat actgtgagat taaaaacatt cattaaaatg ttgcaaaggt

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tctataaagc tgagagacaa atatattcta taactcagca atcccacttc tagggtcgat

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cgacgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt

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catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga

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ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca

3240

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca

3300

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg

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cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc

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tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt

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ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt

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ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg

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acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta

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actacagaac ccactgctta actggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac

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ccaagctcct cgaggctaga atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga

3780

ttcctggtga ggagagaggg aagtgaggga ggagaatgga cagggagcag gagcactgaa

3840

tcccattgct cattccatgt atctggcatg ggtgagaaga tgggtcttat cctccagcat

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ggggcctctg gggtgaatac ttgttagagg gaggttccag atgggaacat gtgctataat

3960

gaagattatg aaatggatgc ctgggatggt ctaagtaatg ccttagaagt gactagacac

4020

ttgcaattca ctttttttgg taagaagaga tttttaggct ataaaaaaat gttatgtaaa

4080

aataaacgat cacagttgaa ataaaaaaaa aatataagga tgttcatgaa ttttgtgtat

4140

aactatgtat ttctctctca ttgtttcagc ttccttaagc gaggtgcagc tggtgcagtc

4200

cggcgccgag gtggagaagc ccggcgcctc cgtgaagatc tcctgcaagg cctccggctc

4260

ctccttcacc ggctacaaca tgaactgggt gcgccagaac atcggcaagt ccctggagtg

4320

gatcggcgcc atcgacccct actacggcgg cacctcctac aaccagaagt tcaagggccg

4380

cgccaccctg accgtggaca agtccacctc caccgcctac atgcacctga agtccctgcg

4440

ctccgaggac accgccgtgt actactgcgt gtccggcatg gagtactggg gccagggcac

4500

ctccgtgacc gtgtcctccg gtaagctttt ctggggcagg ccaggcctga ccttggcttt

4560

ggggcaggga gggggctaag gtgaggcagg tggcgccagc caggtgcaca cccaatgccc

4620

atgagcccag acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg

4680

ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcctcc

4740

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca

4800

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac

4860

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc

4920

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc

4980

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca

5040

gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc gctcctgcct ggacgcatcc

5100

cggctatgca gtcccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag

5160

gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc cccaggctct

5220

gggcaggcac aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg

5280

gctcagacct gccaagagcc atatccggga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca

5340

aaggccaaac tctccactcc ctcagctcgg acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac

5400

tcccaatctt ctctctgcag agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg

5460

cccaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt

5520

agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct

5580

cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca

5640

ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag

5700

accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa

5760

agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc

5820

accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag

5880

cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac

5940

atggacagag gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct

6000

gtccctacag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc acgggaggag

6060

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc

6120

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg

6180

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg

6240

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg

6300

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa gccccaactt caagttctac aaagaaaaca

6360

cagctgcaac tggagcatct cctgctggat ctccagatga ttctgaatgg aattaacaac

6420

tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc acattcaagt tctacatgcc caagaaggcc

6480

acagagctca aacatctcca gtgtctagag gaggaactca aacctctgga ggaagtgcta

6540

aacctcgctc agagcaaaaa cttccactta agacctaggg acttaatcag caatatcaac

6600

gtaatagttc tggaactaaa gggatccgaa acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag

6660

acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga tggattacct tttgtcaaag catcatctca

6720

acactaactt gataattaag tgctcgaggg atccagacat gataagatac attgatgagt

6780

ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg

6840

ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca

6900

ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc

6960

tctacaaatg tggtatggct gattatgatc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga

7020

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg

7080

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat

7140

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag

7200

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa

7260

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg

7320

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg

7380

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag

7440

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga

7500

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct

7560

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc

7620

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg

7680

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc

7740

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca

7800

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag

7860

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct

7920

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc

7980

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga

8040

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca

8100

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat

8160

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac

8220

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt

8280

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt

8340

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag

8400

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct

8460

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt

8520

gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc

8580

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt

8640

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg

8700

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg

8760

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct

8820

tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc

8880

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt

8940

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt

9000

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg

9060

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat

9120

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg

9180

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta

9240

acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaattccg atccagacat

9300

gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt

9360

tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca

9420

agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt

9480

tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtatggct gattatgatc taaagccagc

9540

aaaagtccca tggtcttata aaaatgcata gctttcggag gggagcagag aacttgaaag

9600

catcttcctg ttagtctttc ttctcgtaga ccttaaattc atacttgatt cctttttcct

9660

cctggacctc agagaggacg cctgggtatt ctgggagaag tttatatttc cccaaatcaa

9720

tttctgggaa aaacgtgtca ctttcaaatt cctgcatgat ccttgtcaca aagagtctga

9780

ggtggcctgg ttgattcatg gcttcctggt aaacagaact gcctccgact atccaaacca

9840

tgtctacttt acttgccaat tccggttgtt caataagtct taaggcatca tccaaacttt

9900

tggcaagaaa atgagctcct cgtggtggtt ctttgagttc tctactgaga actatattaa

9960

ttctgtcctt taaaggtcga ttcttctcag gaatggagaa ccaggttttc ctacccataa

10020

tcaccagatt ctgtttacct tccactgaag aggttgtggt cattctttgg aagtacttga

10080

actcgttcct gagcggaggc cagggtcggt ctccgttctt gccaatcccc atattttggg

10140

acacggcgac gatgcagttc aatggtcgaa ccatgagggc accaagctag ctttttgcaa

10200

aagcctaggc ctccaaaaaa gcctcctcac tacttctgga atagctcaga ggccgaggcg

10260

gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat ggggcggaga atgggcggaa

10320

ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa

10380

ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacacctg

10440

gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac

10500

tttccacacc ctaactgaca cacattccac a

10531

<210>5

<211>220

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化免疫球蛋白轻链

<400>5

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

85 90 95

Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210>6

<211>575

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人源化免疫球蛋白重链和IL-2

<400>6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Sar Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Ash Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser

435 440 445

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

450 455 460

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

465 470 475 480

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

485 490 495

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

500 505 510

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

515 520 525

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

530 535 540

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

545 550 555 560

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

565 570 575

Claims

1.抗体可变区，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.抗体可变区，其包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的抗体可变区，其进一步包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

4.权利要求3所述的抗体可变区，其中氨基酸序列通过二硫键连接。

5.权利要求3所述的抗体可变区，其中氨基酸序列通过肽键连接。

6.包含氨基酸序列的抗体可变区，其中所述氨基酸序列选自SEQ IDNO：1的第1-23位氨基酸、SEQ ID NO：2的第1-25位氨基酸及SEQ IDNO：2的第67-98位氨基酸，其中抗体可变区与GD2特异结合。

7.权利要求6所述的抗体可变区，其中氨基酸序列包括SEQ ID NO：1的第1-23位氨基酸。

8.权利要求6所述的抗体可变区，其中氨基酸序列包括SEQ ID NO：2的第1-25位氨基酸。

9.权利要求6所述的抗体可变区，其中氨基酸序列包括SEQ ID NO：2的第67-98位氨基酸。

10.多肽，其包含根据前述权利要求中任意一项所述的抗体可变区和至少含有CH2结构域的Fc部分。

11.权利要求10所述的多肽，其中Fc部分衍生自IgG1。

12.核酸，其编码根据权利要求1-9中任意一项所述的抗体可变区或根据权利要求10或11所述的多肽。

13.细胞，其包含权利要求12所述的核酸。

14.用于靶向在其表面具有GD2的细胞的方法，所述方法包括：施用根据权利要求1-9中任意一项所述的抗体可变区或根据权利要求10或11所述的多肽。

15.权利要求14所述的方法，其中细胞为肿瘤细胞。

16.融合蛋白，其包含与非免疫球蛋白部分连接的根据权利要求1-9中任意一项所述的抗体可变区或与非免疫球蛋白部分连接的根据权利要求10或11所述的多肽。

17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中非免疫球蛋白部分为细胞因子。

18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中细胞因子选自白细胞介素、造血因子、淋巴因子、干扰素及趋化因子。

19.权利要求18所述的融合蛋白，其中白细胞介素选自白细胞介素-2(IL-2)及白细胞介素-12(IL-12)。

20.权利要求18所述的融合蛋白，其中造血因子为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

21.权利要求18所述的融合蛋白，其中淋巴因子为淋巴毒素。

22.权利要求18所述的融合蛋白，其中干扰素选自干扰素-α、干扰素-β及干扰素-γ。

23.权利要求16所述的融合蛋白，其进一步包含第二种非免疫球蛋白部分。

24.权利要求23所述的融合蛋白，其中融合蛋白包含IL-2及IL-12。

25.权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的细胞的用途，用于制备药物。