CN1729201A - 来自clytia gregaria的分离荧光蛋白质(cgfp)及其应用 - Google Patents
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Classifications
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
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- A01K2217/00—Genetically modified animals
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Abstract
本发明涉及核苷酸和氨基酸序列以及荧光蛋白质CGFP(来自clytia gregaria的荧光蛋白质)的活性和用途。
Description
本发明涉及核苷酸和氨基酸序列，以及荧光蛋白质CGFP(clytia gregaria的荧光蛋白质)的活性和应用。
荧光蛋白质
许多腔肠动物都是生物发光的(Morin等人，1974)并散发出蓝光或绿光。在1962年来自水母(Aequoria victoria)的水母发光蛋白质被证实为首个能发光的蛋白质(Shimomura等人，1962)，作为分离蛋白质发出的是蓝色光而不是水母的表型观察到的绿色光。后来可以从水母中分离出发绿色荧光的蛋白质(GFP)，这种蛋白质由于受到水母发光蛋白质的激发而使水母体的表型呈现绿色(Johnson等人，1962；Hastings等人，1969；Inouye等人，1994)。
绿色荧光蛋白质可从各种生物体中分离得到。属于这种生物体的有Hydozoa(aequoria，halistaura obelia)和Anthropode(acanthotilum，sea cactus，cavemularia，renila，ptilosarcus，stylatula)(Morin等人，1971；Morin等人，1971II，Wampler等人，1971，Wampler等人，1973，Cormier等人，1973，Cormier等人，1974，Levine等人，1982)。
在表1中概述了一些荧光蛋白质：
表1：
若干荧光蛋白质一览表。其中列举有名称，蛋白质所分离出的生物体和数据库登记号中的标识号(Acc.号)
| 名称 | 生物体 | 标识号 |
| 绿色荧光蛋白质 | Aequorea macrodactyla | AF435433 |
| 绿色荧光蛋白质 | Aequoria | L29345 |
| 类绿色荧光蛋白质的蛋白质 | Agaricia agaricites | AY037775 |
| 类绿色荧光蛋白质的蛋白质 | Agaricia fragilis | AY037765 |
| 绿色荧光蛋白质 | Dendronephthya | AF420591 |
| 红色荧光蛋白质 | Entacmaea quadricolor | AY130757 |
| 类绿色荧光蛋白质的蛋白质 | Caribbear anemone | AY037777 |
| 绿色荧光蛋白质 | Heteractis crispa | AF420592 |
| 类绿色荧光蛋白质的蛋白质 | Montastraea anrularis | AY037766 |
| 类绿色荧光蛋白质的蛋白质 | Montastraea cavernosa | AY037768 |
| 青色荧光蛋白质 | Montastraea cavernosa | AY056460 |
| 绿色荧光蛋白质 | Renilla muelleri | AY015996 |
| 绿色荧光蛋白质 | Renilla renoformis | AF372525 |
| 类绿色荧光蛋白质的蛋白质 | Ricordea florida | AY037774 |
荧光蛋白质之间的区别不仅在于它们的核苷酸序列和氨基酸序列，还在于它们的生化物理性质。荧光蛋白质的光谱性质既可以从激发也可以从发射性方面进行区别。表2中对荧光的光谱和激发波长做了概括。
表2：
若干荧光蛋白质一览表。其中列举有蛋白质所分离出的生物体、在光谱分析中测定的激发波长和发射波长。
| 生物体 | 激发 | 荧光 |
| Aequoria | 465-498nm | 509nm |
| Halistaura | 465nm | 497nm |
| Phialidium | 485nm | 498nm |
| Renilla | 498nm | 508nm |
荧光蛋白质的应用先前已有记述。在表3中同样做了概述：
表3：
若干荧光蛋白质一览表。其中列举有蛋白质所分离出的生物体、荧光蛋白质的名称和选出的专利或申请。
| 生物体 | 荧光蛋白质 | 专利/申请 |
| Renilla mulleri | GFP | 美国专利号6436682WO200168824WO200257451WO200134824WO9949019美国专利号6232107 |
| Aequoria | GFP | WO200071565WO9711094WO9623898美国专利号5958713美国专利号6172188 |
表中显示，通过改变荧光蛋白质的氨基酸序列就能改变物理和生化性质。经诱变处理的荧光蛋白质的例子记载在一些文献中(Delagrave等人，1995；Ehrig等人，1995；Heim等人，1996)。
荧光蛋白质在各种领域内都有应用。在一些文献中记载了荧光蛋白质在荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)和其它能量转移方法中的应用(Mitra等人，1996；Ward等人，1978；Cardullo等人，1988；美国专利号4777128；美国专利号5126508；美国专利号4927923；美国专利号5279943)。其它借助于GFP进行的能量转移的非放射性方法也同样已有记载(PCT申请号WO98/02571和WO97/28261)。
报道系统
人们通常标记基因作为报道基因或报告基因，借助于简单的生化或组织化学方法能够简便地验证到这些基因产物。人们试验了至少2种报道基因。
1.抗性基因。所谓抗性基因，指该基因的表达能够赋予细胞耐受抗生素或其它物质的抵抗力，且当缺少抗性基因时，上述抗生素或其它物质在培养介质的存在会导致细胞死亡。
2.报道基因。在基因工程中，报道基因的产物可用作融合或不融合的报道剂。属于最常用的报道基因的是β-半乳糖苷酶(Alam等人，1990)、碱性磷酸酶(Yang等人，1997；Cullen等人，1992)，荧光素酶和其它发光蛋白质(Shinomura，1985；Phillips GN，1997；Snowdowne等人，1984)。
人们将可见光谱范围内的光子的发射称作发光，其中，该过程通过激发的发射分子来进行。与荧光不同，这里的能量并不是以短波辐射的形式从外部导入的。
化学发光和生物发光是有区别的。所谓化学发光是一种化学反应，该反应会生成受激分子，当受激的电子回复到基态时，该分子自身就会发光。如果该反应是通过酶催化的，则人们称为生物发光。反应中所涉及的酶通常指荧光酶。
物种Clytia gregaria的分类
刺胞动物门→薄水母目(Leptomedusae)→Campanulariidae→Clytiagregaria物种Clytia gregaria属于刺胞动物门，特别是属于水母属。生物发光或荧光的表型在1998年已有记载(Ward等人，1998)。
cDNA的分离
为进行物种Clytia gregaria荧光活性的研究，在华盛顿州(USA)的Friday港曾捕捉到一些样本，并将它们保存在液氮中。为了建造cDNA文库，专门使用一种水母样本的生物发光环。为制作Clytia gregaria的cDNA文库，则要根据Krieg(Krieg等人，1996)的方法通过异硫氰酸盐来分离RNA。
进行RT-PCR以制备cDNA。为此，根据下表用逆转录酶(Superscribt GoldII)孵育10μg的RNA：
PCR 1. 30秒 95℃
2. 6分 68℃
3. 10秒 95℃
4. 6分 68℃
进行17次步骤3后步骤4的循环
为使聚合酶失活，在37℃下用蛋白酶K孵育反应产物30分钟，并以乙醇沉淀cDNA。将cDNA溶于水中，并用SfiI在37℃下孵育1小时。凝胶过滤反应产物，除去小的片段。分离的cDNA接着与SfiI切割的且脱磷的λTriplEx2载体连接。为制备λ-噬菌体表达库，接着要通过体外包装系统SMART cDNALibrary Construction Kits(Clontech)而将克隆的cDNA片段包装到λ-噬菌体中。
重组的噬菌体含有具有荧光蛋白质潜在表达的cDNA插入体，为辨别这种噬菌体就要进行一种“文库筛选”过程。
为此，将转化的大肠杆菌(E.Coli)XL1-Blue的细菌菌苔涂布在90mm的培养皿上，并在31℃下孵育12-15小时。将60μl的20mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)溶液添加到培养皿中，从而开始诱导蛋白质表达。在室温下孵育24小时后，将培养皿在4℃下存放72小时。接着测量荧光。
为此，用100mV的氩激光灯(LGN502)在488nm或366nm(UVL21)处辐射细菌。在使用510nm ZSV过滤器的情况下测量荧光。
为分离克隆体和进行光谱分析，将荧光阳性的克隆体的生物材料从培养皿中去除，并再悬浮于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中。用超声波使细胞破碎。在通过离心法将裂解产物澄清之后，在荧光计中确定上清液的荧光。
鉴别出荧光蛋白质。将荧光蛋白质记作CGFP(clytia gregaria的荧光蛋白质)。以下将详述荧光蛋白质CGFP。
CGFP
荧光蛋白质CGFP在氨基酸水平与水母GFP具有最高同源性，其同源性为44％(实施例8中所示；图5)。核酸水平的同源性低于30％(实施例9中所示；图6)。为进行序列比较，使用BLAST法(Altschul等人，1997)。
本发明还涉及CGFP的功能等同物。功能等同物是那些具有可类比的物理化学性质且同源性至少70％的蛋白质。优选同源性为80％或90％。特别优选同源性95％。
荧光蛋白质CGFP适合作为细胞体系，特别是受体、离子通道、转运蛋白、转录因子或可诱导系统的报道基因。
荧光蛋白质CGFP适合作为细菌和真核体系中，特别是哺乳动物细胞，细菌，酵母，杆状(Baculo)和植物中的报道基因。
荧光蛋白质CGFP适合作为结合了生物发光或化学发光系统，特别是含有荧光素酶、氧酶、磷酸酶系统的细胞体系的报道基因。
荧光蛋白质CGFP适合作为标记蛋白质，特别是在FACS(荧光活化细胞筛选机)筛选中。
荧光蛋白质CGFP适合作为特别是受体，离子通道，转运蛋白，转录因子，蛋白酶，激酶，磷酸二酯酶，水解酶，肽酶，转移酶，膜蛋白和糖蛋白的融合蛋白质。
荧光蛋白质CGFP适用于特别是通过抗体、生物素、磁性或可磁化载体进行的固定化过程。
荧光蛋白质CGFP适合作为用于能量转移系统的蛋白质，特别是FRET(荧光共振能量转移)，BRET(生物发光共振能量转移)，FET(场效应晶体管)，FP(荧光偏振)，HTRF(均匀时间分辨荧光)系统。
荧光蛋白质CGFP适合于标记特别是蛋白酶，激酶，转移酶的底物或配位体。
荧光蛋白质CGFP适用于在特别是用于滴定测定的细菌体系中的表达，适合用作特别是蛋白酶和激酶的生化系统的底物。
荧光蛋白质CGFP适用作标记体，特别优选地结合在抗体上，结合在酶、受体、离子通道和其它蛋白质上。
荧光蛋白质CGFP适合用作药理活性筛选中的报道基因，特别是在HTS(高通过量筛选)中。
荧光蛋白质CGFP适合作为特别是用于ELISA(酶联免疫吸附实验)、免疫组织化学、蛋白质印迹、共焦显微术的检测系统的成分。
荧光蛋白质CGFP适合作为标记体，用以分析相互作用，特别是针对蛋白质-蛋白质相互作用，DNA-蛋白质相互作用，DNA-DNA相互作用，RNA-RNA相互作用，RNA-蛋白质相互作用(DNA：脱氧核糖核酸；RNA：核糖核酸)。
荧光蛋白质CGFP适合作为标记体或融合蛋白质用于转基因生物体表达，特别是在小鼠、大鼠、仓鼠和其它哺乳动物中，在灵长类动物、鱼、蠕虫和植物中。
荧光蛋白质CGFP适用作标记体或融合蛋白质，用于对胚胎发育进行分析研究。
荧光蛋白质CGFP适合作为通过偶联介质的标记体，特别是通过生物素，NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)和CN-Br。
荧光蛋白质CGFP适合作为报告体连接在核酸上，特别是连接在DNA、RNA上。
荧光蛋白质CGFP适合作为报告体连接在蛋白质或肽上。
连接在核酸或肽上的荧光蛋白质CGFP适合作为探针，特别用于Northem-印迹、Southern印迹、Western-印迹、ELISA、核酸测序、蛋白质分析、芯片分析中。
荧光蛋白质CGFP适合标记特别是传染性药剂、抗体、“小分子”的药物制剂。
荧光蛋白质CGFP适合用于地质勘测，特别是检测海洋、地下水和流动水。
荧光蛋白质CGFP适用于在表达系统中进行表达，特别是在体外翻译系统、细菌系统、酵母系统、杆状系统、病毒系统和真核细胞系统中。
荧光蛋白质CGFP适合在外科手术时，特别是在侵入、非侵入、最小侵入时观看组织和细胞。
荧光蛋白质CGFP还适用于标记出癌组织和其它表型改变的组织，特别是在进行组织检测或实施外科手术时。
本发明还涉及到提纯荧光蛋白质CGFP，特别优选将其作为野生型的蛋白质，作为融合蛋白质，作为诱变处理的蛋白质。
本发明还涉及到将荧光蛋白质CGFP用于美容领域，特别是沐浴用品、洗剂、皂类、油彩、牙膏、爽身粉。
本发明还涉及将荧光蛋白质CGFP特别用于对食品、沐浴用品、油墨、织物、塑料进行染色。
本发明还涉及将荧光蛋白质CGFP用于对纸张，特别是名片、纸制品、壁纸和手工艺品进行染色。
本发明涉及将荧光蛋白质CGFP用于对液体，特别是水枪、喷水池、饮料和冰淇淋进行染色。
本发明还涉及将荧光蛋白质CGFP用于制备玩具，特别是指甲油、胭脂。
因此本发明还涉及到核酸分子，其选自如下组成的一组：
a)对SEQ ID NO：2公开的多肽进行编码的核酸分子；
b)含有SEQ ID NO：1中所述序列的核酸分子；
c)其互补链在苛刻条件下与选自a)或b)的核酸分子杂交，并具有荧光蛋白质的生物功能的核酸分子；
d)由于基因编码的简并而与c)所述核酸分子不同的核酸分子；
e)序列与SEQ ID NO：1至少95％同源且具有荧光蛋白质生物功能的核酸分子；和
f)序列与SEQ ID NO：1至少65％同源且具有荧光蛋白质生物功能的核酸分子。
本发明涉及上述核酸分子，其序列含有该序列的5’端功能启动子。
本发明还涉及如上所述的核酸分子，其是重组的DNA或RNA载体的组成部分。
本发明涉及含有这种载体的生物体。
本发明涉及低聚核苷酸，其具有10个以上连续的与CGFP分子序列的DNA或RNA一致或互补的核苷酸。
本发明涉及由上述核苷酸序列编码的荧光蛋白质。
本发明还涉及用在细菌、真核细胞或体外表达系统中表达本发明的荧光多肽的方法。
本发明还涉及用于提纯/分离本发明的荧光多肽的方法。
本发明涉及肽，其具有5个以上连续的被本发明的荧光蛋白质的抗体免疫识别的氨基酸。
本发明涉及将本发明的荧光蛋白质用作特别是药物活性筛选和诊断的标记基因和报道基因的用途。
本发明荧光蛋白质的表达
人们将在基因插入到合适的宿主细胞中之后，能够允许克隆在表达载体中的外来基因进行转录和翻译的分子的产生称作表达。表达载体含有对于原核细胞或真核细胞中基因的表达所必需的控制信号。
表达载体原则上可以两种不同的方式构建。在所谓的转录融合过程中，克隆的外来基因编码的蛋白质作为可信的生物活性蛋白质合成。为此，表达载体载有所有对于表达所必需的5’-和3’-控制信号。
在所谓的翻译融合过程中，克隆的外来基因编码的蛋白质与另一种蛋白质一起表达作为杂交蛋白，其可容易地检测。表达所需的5’-和3’-控制信号包括起始密码子和可能的一部分对将形成的杂交蛋白的N端区域进行编码的序列，其来源于载体。另外所引入的蛋白质部分，在许多情况下不仅会稳定由克隆的外来基因编码的蛋白质，防止其由于细胞蛋白酶而分解，而且也能用来检测和分离所形成的杂交蛋白。表达过程既可以瞬时进行，也可以稳定进行。适合作为宿主生物体的是细菌、酵母、病毒以及真核细胞体系。
本发明荧光蛋白质的提纯
蛋白质的分离(也在过表达后)常常称作蛋白质提纯。提纯蛋白质可以使用多种方式和方法。
固液分离在蛋白质分离中是基本操作。不管是在从培养介质中分离细胞的过程中，还是在细胞破碎和去除细胞片段后的澄清粗制提取物的过程中，或是在沉淀后分离沉淀物等的过程中，都需要进行该方法步骤。其可通过离心和过滤来进行。
要获得细胞内蛋白质必须破坏细胞壁或使细胞壁。为此就要根据规模和生物体使用高压匀浆器或者搅拌球磨机或玻璃珠研磨机。在实验室规模下尤其可以使用机械细胞合并和超声波处理过程。
对于细胞外蛋白质和细胞内蛋白质(细胞破碎后)来说，使用盐(特别是硫酸铵)或有机溶剂(醇、酮)进行的各种沉淀方法都是快速的但是并不完善的用以浓缩蛋白质的方法。在提纯细胞内蛋白质时，有必要去除溶解的核酸(例如用链霉素硫酸盐或精蛋白硫酸盐进行沉淀)。在细胞外蛋白质的回收过程中，常常要在添加沉淀剂之前加入载体(例如淀粉、硅藻土)，以得到可更好操作的沉淀。
为进行精细提纯，可使用许多色谱法和分配法(吸收和离子交换色谱法，凝胶过滤法，亲和色谱法，电泳法)。在工业规模中也可使用柱色谱法。而对于实验室规模，首选提纯因子可以高至每步数百的亲和色谱法。
细胞外蛋白质产生于相对较稀的溶液中。它们同样如细胞外蛋白质一样，必须在进行其他使用之前进行浓缩。除了上述那些方法外——也是在工业规模下——超滤法也是合适的。
在特殊应用场合下常常不希望出现有作为蛋白质的杂质的无机盐。它们可以比如通过凝胶过滤、透析和透滤法除去。
有许多蛋白质都可作为干燥制剂使用。真空干燥、冷冻干燥和喷雾干燥都是非常重要的干燥方法。
核苷酸和氨基酸序列
荧光蛋白质CGFP通过以下核苷酸序列编码(SEQ ID NO：1)：
5`-
atgactgcacttaccgaaggagcaaaactgttcgagaaagaaattccctacattaca
gagttggaaggagacgttgaaggaatgaaattcatcatcaaaggtgaaggtactggc
gacgctaetactggcaccatcaaagcgaaatatatttgcacaactggtgaccttcct
gtaccatgggctaccatcttgagtagtttgtcgtatggtgttttctgtttcgctaag
tatccacgccacattgccgactttttcaagagcacacaaccagatggttattcacaa
gacagaatcattagttttgacaatgatggacaatacgatgtcaaagccaaggttact
tatgaaaacggaacactttataatagagtcacagtcaaaggtaetggcttcaaatca
aacggcaacatccttggtatgagagttctctaccattcaccaccacacgctgtctac
atccttcctgaccgtaaaaatggtggcatgaaaattgaatacaataaggctttcgac
gttatgggcggtggtcaccaaatggcgcgtcacgcccaattcaataaaccactagga
gcctgggaagaagattatccgttgtatcatcatcttaccgtatggacttctttcgga
aaagatccggatgatgatgaaactgaccatttgaccatcgtcgaagtcatcaaagct
gttgatttggaaacataccgttga-3`.
从中得到氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：
MTALTEGAKLFEKEIPYITELEGDVEGMKFIIKGEGTGDATTGTIKAKYICTTGDLP
VPWATILSSLSYGVFCFAKYPRHIADFFKSTQPDGYSQDRIISFDNDGQYDVKAKVT
YENGTLYNRVTVKGTGFKSNGNILGMRVLYHSPPHAVYILPDRKNGGMKIEYNKAFD
VMGGGHQMARHAQFNKPLGAWEEDYPLYHHLTVWTSFGKDPDDDETDHLTIVEVIKA
VDLETYR
这些序列也能在序列表中找到。
附图说明
图1所示为载体pTriplEX2-CGFP的质粒图。
图2所示为载体pcDNA3-CGFP的质粒图。
图3所示为表达载体pcDNA3-CGFP中的CGFP在CHO细胞中的瞬时表达。该图所示为在480nm的激发和520nm的发射时，瞬时转染的细胞的显微镜照片。
图4所示为CGFP和对照裂解物的激发。
图5所示为CGFP和对照裂解物的发射。
图6所示为氨基酸水平的CFGP、GFP(水母)和GFP(Renilla)的比对。
CGFP_Cly：来自Clytia gregaria的CGFP
GFP_Ren：来自Renilla的GFP
GFP_Aeq：来自水母的GFP
图7所示为核酸水平的CFGP、GFP(水母)和GFP(Renilla)的比对。
CGFP_Cly：来自Clytia gregaria的CGFP
GFP_Ren：来自Renilla的GFP
GFP_Aeq：来自水母的GFP
实施例
实施例1
选用Clontech公司的质粒pTriplEx2作为制备下述构建体的载体。载体衍生物记做pTriplEx2-CGFP。将载体pTriplEx2-CGFP用在细菌系统中表达CGFP。
图1所示为载体pTriplEX2-CGFP的质粒图。
实施例2
采用Clontech公司的质粒pcDNA3.1(+)作为制备下述构建体的载体。载体衍生物记做pcDNA3-CGFP。将载体pcDNA3-CGFP用在真核系统中表达CGFP。
图2所示为载体pcDNA3-CGFP的质粒图。
实施例3
细菌表达
在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中通过用表达质粒pTrilEX2-CGFP和pTriplEX2转化细菌来进行细菌表达。在37℃下将转化的细菌置于LB培养基中孵育3小时并通过添加IPTG至最终浓度为1mM诱导表达4小时。被诱导的细菌通过离心分离得到，将其再悬浮于PBS中并通过超声波使其破碎。借助于荧光计来确定荧光。
实施例4
真核表达
在瞬时试验中，通过用表达质粒pcDNA3-CGFP和pcDNA3.1(+)转染细胞在CHO细胞中进行组成型真核表达。为此，要将DMEM-F12培养基中的每孔10000细胞涂覆到96孔微量滴定板上并在37℃下孵育过夜。根据生产商的信息利用Fugene6试剂盒(Roche)进行转染。将转染的细胞放置在DMEM-F12培养基中在37℃下孵育过夜。在荧光计中于室温下测量荧光。
图3所示为CHO细胞中CGFP的表达。
实施例5
荧光蛋白质CGFP的光谱
为测量发射光谱，用质粒pTriplEX2-CGFP和pTriplEX2来转化大肠杆菌BL21(DE3)。诱导过程通过添加1mM的IPTG和37℃下4小时的孵育来进行。接着收获细菌并将其再悬浮于PBS中。通过超声波进行细胞裂解。然后在荧光计中测量荧光。
图4所示为CGFP和对照裂解物的激发。
图5所示为CGFP和对照裂解物的发射。
实施例6
BLAST
氨基酸水平的CFGP的BLAST分析结果。
>AA2002：ABB06186 Abb06186 绿色荧光蛋白 GFPxm19 SEQ ID，NO：15.5/2002，长度＝271，得分＝219比特(558)，期望值＝3e-56，一致性 ＝102/228(44％)，阳性＝l51/228(65％)，间隔＝3/228(1％)
>gb|AAK02065.1| 变异 绿色荧光蛋白 [合成构建体]，长度＝238，得分＝219比特(557)，期望值＝4e-56，一致性＝102/227(44％)，阳性＝150/227(65％)，间隔＝3/227(1％)
>gb|AAL33915.1|AF435430_1 绿色荧光蛋白 [Aequorea macrodactyla]，长度＝238，得分＝218比特(556)，期望值＝5e-56，一致性＝102/227(44％)，阳性＝150/227(65％)，间隔＝3/227(1％)
>gb|AAL33918.1|AF435433_1 绿色荧光蛋白 [Aequorea macrodactyla]，长度＝238，得分＝218比特(555)，期望值＝7e-56 一致性＝101/227(44％)，阳性＝149/227(65％)，间隔＝3/227(1％)
>gb|AAL33916.1|AF435431_1 绿色荧光蛋白 [Aequorea macrodactyla]，长度＝ 238，得分＝218比特(554)，期望值＝9e-56一致性＝102/227(44％)，阳性＝150/227(65％)，间隔＝3/227(1％)
>gb|AAL33917.1|AF435432_1 橙色荧光蛋白 [Aequoreamacrodactyla]，长度＝238，得分＝218比特(554)，期望值＝9e-56，一致性＝101/227(44％)，阳性＝149/227(65％)，间隔＝3/227(1％)
>AA2002：AB806185 Abb06185 绿色荧光蛋白 GFPxm18 SEQ ID，N0：13.5/2002，长度＝271，得分＝217比特(552)，期望值＝1e-55，一致性＝101/228(44％)，阳性＝151/228(65％)，间隔＝3/228(1％)
>AA2002：ABB06184 Abb06184 绿色荧光蛋白GFPxm16 SEQ ID，NO：11.
5/2002， 长度＝271，得分＝216比特(551)，期望值＝2e-55，一致性＝101/228(44％)，阳性＝150/228(65％)，间隔＝3/228(1％)
>AA2002：AB806181 Abb06181 绿色荧光蛋白 GFPxm SEQ ID，NO：5.5/2002， 长度＝271，得分＝216比特(551)，期望值＝2e-55，一致性＝101/228(44％)，阳性＝150/228(65％)，间隔＝3/228(1％)
>gb|AAL33912.1|AF435427_1 绿色荧光蛋白 [Aequorea macrodactylal，Length＝238，得分＝216比特(551)，期望值＝2e-55，一致性＝101/227(44％)，阳性＝150/227(65％)，间隔＝3/227(1％)
>gb|AAK02064.1| 变异 绿色荧光蛋白 [合成构建体]，长度＝238，得分＝216比特(551)，期望值＝2e-55， 一致性＝101/227(44％)，阳性＝150/227(65％)，间隔＝3/227(1％)
实施例7
BLAST
核酸水平的CFGP的BLAST分析结果。
>gb|AF468563.1|Crassostrea gigas克隆c077微卫星序列，长度＝415，得分＝41.1比特(21)，期望值＝1.4，一致性＝25/27(92％)＞gb|AC079685.2| 稻染色体 10 clone OSJNBb0012A20，完整序列，长度＝131599，得分＝41.1比特(21)，期望值＝1.4，一致性＝27/30(90％)
>gb|AF427906.1|AF427906 Solenopsis globularia littoralis 推定的气味物质结合蛋白，前体(Gp-9)基因，完整cds，长度＝1767，得分＝41.1比特(21)，期望值＝1.4，一致性＝23/24(95％)
>gb|AF297617.1|AF297617 Echinococcus granulosus 基因型1线粒体，完整基因组，长度＝13588，得分＝41.1比特(21)，期望值＝1.4，一致性＝23/24(95％)
实施例8
图6所示为氨基酸水平的CFGP、GFP(水母)和GFP(Renilla)的比对。
实施例9
图7所示为核酸水平的CFGP、GFP(水母)和GFP(Renilla)的比对。
参考文献/专利
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序列表
<110>Bayer AG，BHC
<120>分离的荧光蛋白质CGFP及其用途
<130>Le A 36 493
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>708
<212>DNA
<213>Clytia gregaria
<400>1
atgactgcac ttaccgaagg agcaaaactg ttcgagaaag aaattcccta cattacagag 60
ttggaaggag acgttgaagg aatgaaattc atcatcaaag gtgaaggtac tggcgacgct 120
actactggca ccatcaaagc gaaatatatt tgcacaactg gtgaccttcc tgtaccatgg 180
gctaccatct tgagtagttt gtcgtatggt gttttctgtt tcgctaagta tccacgccac 240
attgccgact ttttcaagag cacacaacca gatggttatt cacaagacag aatcattagt 300
tttgacaatg atggacaata cgatgtcaaa gccaaggtta cttatgaaaa cggaacactt 360
tataatagag tcacagtcaa aggtactggc ttcaaatcaa acggcaacat ccttggtatg 420
agagttctct accattcacc accacacgct gtctacatcc ttcctgaccg taaaaatggt 480
ggcatgaaaa ttgaatacaa taaggctttc gacgttatgg gcggtggtca ccaaatggcg 540
cgtcacgccc aattcaataa accactagga gcctgggaag aagattatcc gttgtatcat 600
catcttaccg tatggacttc tttcggaaaa gatccggatg atgatgaaac tgaccatttg 660
accatcgtcg aagtcatcaa agctgttgat ttggaaacat accgttga 708
<210>2
<211>235
<212>PRT
<213>Clytia gregaria
<400>2
Met Thr Ala Leu Thr Glu Gly Ala Lys Leu Phe Glu Lys G1u Ile Pro
1 5 10 15
Tyr Ile Thr Glu Leu Glu Gly Asp Val G1u Gly Met Lys Phe Ile Ile
20 25 30
Lys Gly Glu Gly Thr Gly Asp Ala Thr Thr Gly Thr Ile Lys Ala Lys
35 40 45
Tyr Ile Cys Thr Thr Gly Asp Leu Pro Val Pro Trp Ala Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Ser Leu Ser Tyr Gly Val Phe Cys Phe Ala Lys Tyr Pro Arg His
65 70 75 80
Ile Ala Asp Phe Phe Lys Ser Thr Gln Pro Asp Gly Tyr Ser Gln Asp
85 90 95
Arg Ile Ile Ser Phe Asp Asn Asp Gly Gln Tyr Asp Val Lys Ala Lys
100 105 110
Val Thr Tyr Glu Asn Gly Thr Leu Tyr Asn Arg Val Thr Val Lys Gly
115 120 125
Thr Gly Phe Lys Ser Asn Gly Asn Ile Leu G1y Met Arg Val Leu Tyr
130 135 140
His Ser Pro Pro His Ala Val Tyr Ile Leu Pro Asp Arg Lys Asn Gly
145 150 155 160
Gly Met Lys Ile Glu Tyr Asn Lys Ala Phe Asp Val Met Gly Gly Gly
165 170 175
His Gln Met Ala Arg His Ala Gln Phe Asn Lys Pro Leu Gly Ala Trp
180 185 190
Glu Glu Asp Tyr Pro Leu Tyr His His Leu Thr Val Trp Thr Ser Phe
195 200 205
Gly Lys Asp Pro Asp Asp Asp Glu Thr Asp His Leu Thr Ile Val Glu
210 215 220
Val Ile Lys Ala Val Asp Leu Glu Thr Tyr Arg
225 230 235
Claims (10)
1.核酸分子，其选自如下组成的一组：
a)对SEQ ID NO：2公开的多肽进行编码的核酸分子；
b)含有SEQ ID NO：1中所述序列的核酸分子；
c)其互补链在苛刻条件下与选自a)或b)的核酸分子杂交，并具有荧光蛋白质的生物功能的核酸分子；
d)由于基因编码的简并而与c)所述核酸分子不同的核酸分子；
e)序列与SEQ ID NO：1至少95％同源且具有荧光蛋白质生物功能的核酸分子；和
f)序列与SEQ ID NO：1至少65％同源且具有荧光蛋白质生物功能的核酸分子。
2.如权利要求1所述的分子，其中序列含有序列5’端功能启动子。
3.如权利要求2所述的分子，其是重组的DNA或RNA载体的组成部分。
4.含有如权利要求3所述载体的生物体。
5.低聚核苷酸，其具有10个以上连续的与权利要求1所述的DNA或RNA序列一致或互补的核苷酸。
6.如权利要求1所述的核苷酸序列编码的肽。
7.在细菌、真核细胞或体外表达系统中表达如权利要求6所述的CGFP多肽的方法。
8.提纯/分离如权利要求6所述的CGFP多肽的方法。
9.肽，其具有5个以上连续的被荧光蛋白质CGFP的抗体免疫识别的氨基酸。
10.如权利要求1至7所述的荧光蛋白质CGFP用作标记基因和报道基因的用途。
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Effective date of registration: 20130327 Address after: German Monheim Patentee after: BAYER INTELLECTUAL PROPERTY GmbH Address before: Berlin Patentee before: BAYER PHARMA AG |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080430 Termination date: 20181126 |