CN1849400A - 红细胞生成素基因的新的多核苷酸和多肽 - Google Patents

红细胞生成素基因的新的多核苷酸和多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN1849400A
CN1849400A CNA028089421A CN02808942A CN1849400A CN 1849400 A CN1849400 A CN 1849400A CN A028089421 A CNA028089421 A CN A028089421A CN 02808942 A CN02808942 A CN 02808942A CN 1849400 A CN1849400 A CN 1849400A
Authority
CN
China
Prior art keywords
disease
polypeptide
snp
epo
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028089421A
Other languages
English (en)
Inventor
J－L·伊斯卡利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GenOdyssee SA
Original Assignee
GenOdyssee SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GenOdyssee SA filed Critical GenOdyssee SA
Publication of CN1849400A publication Critical patent/CN1849400A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Abstract

本发明涉及来源于EPO基因核苷酸序列并包含新的SNP的新的多核苷酸、来源于天然EPO蛋白质并包含由本发明的SNP所致至少一个突变的新的多肽、及其治疗用途。

Description

红细胞生成素基因的新的多核苷酸和多肽
相关申请
本申请要求以下专利申请的优先权，2001-04-04提交的法国申请FR 0104603，题为《Nouveaux polynucléotides comportant despolymorphismes de type SNP fonctionnels dans la séquencenucléotidique du gène
Figure A0280894200101
(EPO)ainsi que denouveaux polypeptides codés par ces polynucléotides etleurs utilisations thérapeutiques》；2001-12-21提交的美国临时专利申请60/343163，题为Erythropoietin Related Moleculesand Single Nucleotide Polymorphisms；2002-01-04提交的美国临时专利申请60/345,440，题为Modified Erythropoietin RelatedMolecules and Single Nucleotide Polymorphisms；以及2002-02-21提交的美国临时专利申请60/358,598，题为NewPolynucleotides and Polypeptides of the EPO Gene。
发明背景
发明领域
本发明涉及来源于红细胞生成素基因(EPO)核苷酸序列并包含新的SNP的新的多核苷酸、来源于天然红细胞生成素蛋白质并包含由所述SNP所致突变的新的多肽、及其治疗用途。
相关技术
红细胞生成素基因，以下简称EPO，描述于文献Jacobs K.等人(1985)″Isolation and characterization of genomic and cDNAclones of human erythropoietin″；Nature 313(6005)，806-810。
该基因的核苷酸序列可得自GenBank数据库登录号X02158。
已知红细胞生成素蛋白质作用于红细胞生成造血祖细胞的增殖、分化和成熟。决定其分化并成熟为红细胞。
还已知EPO作为自分泌因子作用于某些红白血病细胞，并作为有丝分裂原和内皮细胞趋化因子(chemoattractant)。
还已知EPO刺激活化和分化的B细胞，并增强B细胞免疫球蛋白生成和增殖。
EPO的合成受连接肾和骨髓的反馈环路的复杂控制系统支配。其合成依赖于静脉氧分压，在低氧条件下升高。
EPO的生成还受其它多种体液因子的影响，例如睾丸素、甲状腺激素、生长激素和儿茶酚胺。相反，诸如IL-1、IL-6和TNF-α等几种细胞因子降低EPO的合成。
在细胞中EPO与其受体的结合可诱导：
-释放膜磷脂，
-合成二酰基甘油，
-增加细胞内钙的水平，
-提高细胞内pH，以及
-增加细胞内磷脂酶A2和磷脂酶C，后者可诱导fos和myc癌基因。
已知过量的EPO导致红细胞增多。伴有血液粘度和心输出量增加，并可能还导致心力衰竭和肺性高血压症。还观察到血小板显著减少。
EPO过量的另一副作用是血栓形成。
肺栓塞和脑栓塞，即血液转运的凝块或外来化合物突然堵塞血管，也构成与EPO消耗有关的严重副作用。
然而，如果EPO的合成量过低，例如在严重肾功能不全的情况下，常观察到贫血。因此，常将EPO给予血细胞比容低于0.3的严重肾功能不全的患者，特别是透析患者。
使用EPO治疗的最重要的并发症是张力过高、尿素、钾和磷酸盐水平增多、血液粘度增加、生成血小板的祖细胞和循环血小板扩增。
EPO还用于活化红细胞生成，能采集自体供体的血液。
此外，对于例如由慢性感染、炎性过程、放射治疗和抑制细胞生长的药物治疗诱导的非肾型贫血，建议也使用EPO。
在某种程度上，EPO还是巨核细胞生成的刺激因子。EPO活性由IL-4协同。
已经证明EPO保护神经元免受局部缺血诱导的细胞死亡，因此似乎EPO可能通过降低自由基产生并降低氧化应力效应，而具有神经保护能力。
众所周知，EPO基因与各种人类病症(disorder)和/或疾病有关，例如各种癌症，如恶性肿瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肿瘤、白血病和肝、颈、头和肾癌；心血管疾病，例如脑损伤；例如与免疫系统无关的代谢疾病，如肥胖症；传染病，特别是病毒性传染，例如乙型肝炎、丙型肝炎和AIDS；肺炎；溃疡性结肠炎；中枢神经系统疾病，例如阿尔茨海默氏病、精神分裂症和抑郁症；组织或器官移植排斥；创伤愈合；贫血；变态反应；哮喘；多发性硬化；骨质疏松症；银屑病；类风湿性关节炎；克罗恩氏病(Crohn’s disease)；自身免疫疾病和病症；生殖器或性疣；胃肠疾病；以及与化学治疗有关的疾病。
本发明人发现EPO基因的新的多肽和新的多核苷酸类似物，其能够具有不同于天然野生型EPO蛋白质的功能性。
这些新的多肽和多核苷酸可以特别用于治疗或预防前述病症或疾病，并避免其所带来的全部或部分害处。
发明简述
本发明的首要目的在于新的多核苷酸，因其包含一个或几个SNP(单核苷酸多态性)而不同于参考的野生型EPO基因核苷酸序列。
参考的野生型人EPO基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1由3398个核苷酸组成，包含核苷酸615(起始密码子)-2763(终止密码子)的2149个核苷酸的编码序列。
EPO基因由5个外显子组成，其在核苷酸序列SEQ ID NO.1中的位置如下：
外显子1：核苷酸397-627(包含位于615的起始密码子)。
外显子2：核苷酸1194-1339。
外显子3：核苷酸1596-1682。
外显子4：核苷酸2294-2473。
外显子5：核苷酸2608-3327(包含位于2763的终止密码子)。
申请人已经鉴定了参考的野生型EPO基因核苷酸序列中的12个SNP。
这12个SNP如下：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。
应当理解，在本发明意义上，上文确定的SNP位置的相应编号是相对于核苷酸序列SEQ ID NO.1的编号而言。
字母a、t、c和g分别对应于含氮碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤。
第一个字母表示野生型核苷酸，而最后一个字母表示突变的核苷酸。
因此，例如SNP g1644a表示参考的野生型EPO基因核苷酸序列SEQ ID NO.1中的1644位核苷酸g(鸟嘌呤)突变为核苷酸a(腺嘌呤)。SNP 465-486(缺失)表示一种突变，其中参考的野生型EPO基因核苷酸序列SEQ ID NO.1中465-486位的22个核苷酸已经缺失。
本申请人利用申请人于2000年12月6日提交的题为″Processfor the determination of one or several functionalpolymorphism(s)in the nucleotide sequence of a preselectedfunctional candidate gene and its applications″的专利申请FR00 22894中所述测定方法(在此引入以供参考)鉴定出了这些SNP。
该专利申请中所述方法可以从随机群体中的至少一个个体中鉴定一个(或几个)先前存在的SNP。
在本发明范围内，在随机选取的群体中的不同个体中分离EPO基因核苷酸序列片段(例如包含编码序列)。
在DHPLC分析(″变性高效液相层析″)之后，对某些具有异质双链性质(即性质不同于参考的野生型EPO基因序列)的样品进行这些片段的测序。
这样测序的片段然后与参考的野生型EPO基因片段的核苷酸序列作比较，并鉴定与本发明相符的SNP。
因此，该SNP是天然的，其中每一个均存在于世界人群的某些个体中。
参考的野生型EPO基因编码对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的193个氨基酸的未成熟蛋白质，通过断裂包括前27个氨基酸的信号肽而转变为166个氨基酸的成熟蛋白质。
天然野生型EPO蛋白质的结构包含称为A、B、C和D的四个螺旋。与EPO受体复合的EPO晶体结构表明，只有A、C、D三个螺旋与EPO结合其受体有关(Syed等人(1998).Efficiency of signalingthrough cytokine receptors depends critically on receptororientation.Nature 395：511-516)。此外，研究EPO活性部位的定点诱变证明，螺旋B中的氨基酸变化对EPO活性的影响有限(Eliott等人(1997).Mapping of the active site ofrecombinant human erythropoietin.Blood.89：493-502；Wen等人(1994).Erythropoietin structure-function relationships.Identification of functionally important domains.J.Biol.Chem.269：22839-22846)。
本发明的每一个编码SNP，即：g1644a、g2357a、c2621g，引起EPO基因核苷酸序列编码的蛋白质在氨基酸序列水平的改变。
这些氨基酸序列的改变如下：
编码SNP g1644a引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的EPO基因未成熟蛋白质的70位氨基酸天冬氨酸(D)突变为天门冬酰胺(N)，其位于成熟蛋白质的43位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为D43N或D70N。
编码SNP g2357a引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的EPO基因未成熟蛋白质的104位氨基酸甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)，其位于成熟蛋白质的77位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为G77S或G104S。
编码SNP c2621g引起对应于氨基酸序列SEQ ID NO.2的EPO基因未成熟蛋白质的147位氨基酸丝氨酸(S)突变为半胱氨酸(C)，其位于成熟蛋白质的120位。在本发明的说明书中，根据是否涉及成熟蛋白质抑或未成熟蛋白质，而分别将该SNP编码的突变称为S120C或S147C。
编码SNP g1644a、g2357a和c2621g引起本发明的多肽较之野生型参考EPO基因核苷酸序列编码的多肽，其空间构象改变。
按照本领域技术人员熟知的方法，通过计算机分子模建(modeling)，例如借助de novo(例如SEQFOLD/MSI)、同源性(例如MODELER/MSI)、最小化势场(force field)(例如DISCOVER、DELPHI/MSI)和/或分子动力学(例如CFF/MSI)模建工具，可以观察到这些改变。
下文实验部分给出了上述模型的实例。
1/计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的D43N突变涉及位于EPO蛋白质螺旋A和螺旋B之间的环状结构改变，以及在P129-I133氨基酸区域连接EPO蛋白质螺旋C和D的长环的结构变化。这些残基位于突变氨基酸N43之前。由于该突变位于接近与结合EPO受体有关的短螺旋F48-R53，可能影响EPO蛋白质与其受体的相互作用。在所有的EPO直向同源物(orthologues)中，D43残基高度保守。它可能与在EPO直向同源物中同样保守的带正电荷的残基(K45、R131)形成盐键。
因此，该突变蛋白质具有不同于野生型EPO基因编码的天然野生型EPO蛋白质的三维构象。
计算机分子模建还预测，43位氨基酸天门冬酰胺的存在涉及天然野生型EPO蛋白质结构和功能的重大改变。
2/计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的G77S突变涉及螺旋B的C端完全伸展，其起因于与螺旋D中183位苯丙氨酸残基的空间位阻以及螺旋A和螺旋B之间环上亲水性(77位丝氨酸)和疏水性(35位亮氨酸)氨基酸之间不利的相互作用。G77残基埋藏于野生型蛋白质结构中。
因此，该突变蛋白质具有不同于野生型EPO基因编码的天然野生型EPO蛋白质的三维构象。
计算机分子模建还预测，77位氨基酸丝氨酸的存在涉及天然野生型EPO结构和功能的重大改变，特别是通过改变EPO与其受体的亲合力。
3/计算机分子模建表明，成熟突变蛋白质的S120C突变涉及位于螺旋C和螺旋D之间、特别是116位赖氨酸和125位丙氨酸之间的环的结构改变。野生型EPO蛋白质结构S120和K116残基之间的氢键在突变蛋白质结构中断裂。
因此，该突变蛋白质具有不同于野生型EPO基因编码的天然野生型EPO蛋白质的三维构象。
计算机分子模建还预测，120位氨基酸半胱氨酸的存在涉及天然野生型EPO蛋白质结构和功能的重大改变有关。
本发明的其它SNP，即：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634a，并不涉及EPO基因核苷酸序列编码的蛋白质在氨基酸序列SEQ ID NO.2水平的改变。
SNP c1288t、t1607c、g2634a是沉默型，而SNP 465-486(缺失)、c577t、g602c、c1347t、g2228a、c2502t是非编码型。
本发明的多核苷酸可以按这种方式进行基因分型，以便确定这些多核苷酸在群体中的等位频率。下文实验部分给出了关于SNPg1644a和c2621g的两个基因分型的实例。
按照以下文献所述方法的生物活性实验，可以同样测定本发明多肽的功能性。
-Bittorf等人；″Rapid activation of the MAP kinasepathway in hematopoietic cells by erythropoietin，granulocyte-macrophage colony-stimulating factor andinterleukin-3″；Cell Signal；1994；Mar；6(3)：305-11.
-Chretien等人；″Erythropoietin-induced erythroiddifferentiation of the human erythroleukemia cell line TF-1correlates with impaired STAT5 activation″；EMBO J.；1996Aug 15；15(16)：4174-81.
-Porteu等人；″Functional regions of the mousethrombopoietin receptor cytoplasmic domain：evidence for acritical region which is involved in differentiation andcan be complemented by erythropoietin″；Mol.Cell.Biol.；1996 May；16(5)：2473-82.
-Pallard等人；″Thrombopoietin activates a STAT5-likefactor in hematopoietic cells″；EMBO J.；1995 Jun 15；14(12)：2847-56.
本发明目的还在于本发明的多核苷酸和多肽、以及由这些多核苷酸和多肽而获得和/或鉴定的治疗性分子的用途，特别是用于预防和治疗某些人类病症和/或疾病。
该分子特别用于预防或治疗贫血，特别是肾机能不全的透析患者，以及由慢性感染、炎性过程、放射治疗、化学治疗所致贫血，并用于预防脑损伤。
该分子更特别用于增加自体血液生成，特别是参与不同自体血液采集程序的患者，以避免使用他人血液。
附图简述
图1A代表本发明包含SNP D70N的编码蛋白质和天然野生型红细胞生成素的模建。图1B代表突变型和野生型蛋白质右侧部分的模建。
在图1A和1B中，黑色条带代表天然野生型红细胞生成素的结构，而白色条带代表突变的红细胞生成素(D70N)的结构。
图2A代表本发明包含SNP G104S的编码蛋白质和天然野生型红细胞生成素的模建。图2B代表突变型和野生型蛋白质下侧部分的模建。
在图2A和2B中，黑色条带代表天然野生型红细胞生成素的结构，而白色条带代表突变的红细胞生成素(G104S)的结构。
图3A代表本发明包含SNP S147C的编码蛋白质和天然野生型红细胞生成素的模建。图3B代表突变型和野生型蛋白质左上部分的模建。
在图3A和3B中，黑色条带代表天然野生型红细胞生成素的结构，而白色条带代表突变的红细胞生成素(S147C)的结构。
图4代表G104S突变的红细胞生成素和野生型红细胞生成素(包含于蛋白质提取物中)对稳定转染人红细胞生成素受体的32D小鼠细胞系的细胞增殖的影响。图4A和4B分别代表两次独立实验的结果。
图5代表纯化的G104S突变的红细胞生成素和纯化的野生型红细胞生成素对稳定转染人红细胞生成素受体的32D小鼠细胞系的细胞增殖的影响。图5A和5B分别代表两次独立实验的结果。
图6代表G104S突变的红细胞生成素(白色三角形)或野生型红细胞生成素(黑色方块)刺激后的红系集落形成。
图7代表G104S突变的红细胞生成素(圆圈)和野生型红细胞生成素(星形)对人EPO受体外部的结合能力。给出了利用两个浓度红细胞生成素得到的数据：7.5nM(白色)、15nM(黑色)。
发明详述
定义
″参考的野生型基因核苷酸序列″可理解为人EPO基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1，其可得自GenBank登录号X02158，并描述于Jacobs K.等人；″Isolation and characterization of genomicand cDNA clones of human erythropoietin″；Nature 313(6005)，806-810(1985)。
″天然野生型红细胞生成素蛋白质″可理解为由参考的野生型EPO基因的核苷酸序列编码的成熟蛋白质。天然野生型非成熟EPO蛋白质对应于肽序列SEQ ID NO.2。
″多核苷酸″可理解为可以是被修饰的或未修饰的DNA或RNA的多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸。
术语多核苷酸包括，例如单链或双链DNA、由一个或几个单链区以及一个或几个双链区的混合物组成的DNA、单链或双链RNA以及由一个或几个单链区以及一个或几个双链区的混合物组成的RNA。术语多核苷酸还可以包括包含一个或几个三链区的RNA和/或DNA。多核苷酸同样可理解为包含一个或几个修饰的碱基的DNA和RNA，从而因稳定性或其它原因而修饰骨架。修饰的碱基可理解为，例如诸如次黄苷等稀有碱基。
″多肽″可理解为包含通过正常或修饰的肽键(例如，诸如在同型空间配位肽的情况下)彼此互联的至少两个氨基酸的肽、寡肽、寡聚体或蛋白质。
多肽可以由除遗传密码定义的20个氨基酸以外的氨基酸组成。多肽同样可以由利用天然过程(诸如翻译后成熟过程)或本领域技术人员熟知的化学过程修饰的氨基酸组成。文献中充分详述了这些修饰。这些修饰可以出现在多肽的任何位置：肽骨架、氨基酸链乃至羧基或氨基末端。
多肽可以是泛素化之后的分支状，或者有或无分支的环状。这类修饰可以是本领域技术人员熟知的天然或合成的翻译后过程的结果。
例如，多肽修饰可理解为包括乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价固定、血红素的共价固定、核苷酸或核苷酸衍生物的共价固定、脂质或脂质衍生物的共价固定、磷脂酰肌醇的共价固定、共价或非共价交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化包括聚乙二醇化(pegylation)、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、seneloylation、硫酸酯化(sulfatation)、氨基酸加成，诸如精氨酸化或泛素化。文献中充分详述了这些修饰：PROTEINS-STRUCTUREAND MOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，New York，1993，POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983，Seifter等人″Analysis for protein modifications and nonproteincofactors″，Meth.Enzym0l.(1990)182：626-646 et Rattan等人″Protein Synthesis：Post-translational Modifications andAging″，Ann NY Acad Sci(1992) 663：48-62。
″超糖基化多肽″或″多肽的超糖基化类似物″可理解为其氨基酸序列已经改变为具有至少另一个增加的糖基化位点的多肽，或者氨基酸序列相同、但其糖基化水平已经提高的多肽。
″分离的多核苷酸″或″分离的多肽″可理解为如前文定义的分离自人体、或通过技术方法产生的多核苷酸或多肽。
″同一性″可理解为测定核苷酸或多肽序列的同一性。同一性是本领域技术人员熟知的术语，文献对其有详细描述。参见COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M.，Ed.，OxfordUniversity Press，New York，1998；BIOCOMPUTING INFORMATICSAND GENOME PROJECT，Smith，D.W.，Ed.，Academic Press，NewYork，1993；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffin，A.M.和Griffin H.G.，Ed，Humana Press，New Jersey，1994；et SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，1987。
文献中同样详述了常用来确定两个序列之间同一性和相似性的方法。参见GUIDE TO HUGE COMPUTER，Martin J.Bishop，Ed，Academic Press，San Diego，1994，以及Carillo H.和Lipton D.，Siam J Applied Math(1988)48：1073。
例如，与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性的多核苷酸是与该序列相比，每100个核苷酸中包含至多5个突变点的多核苷酸。
这些突变点可以是一个(或几个)核苷酸的一个(或几个)替换、添加和/或缺失。
同样，例如与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％同一性的多肽是与该序列相比，每100个氨基酸中包含至多5个突变点的多肽。
这些突变点可以是一个(或几个)氨基酸的一个(或几个)替换、添加和/或缺失。
本发明的多核苷酸和多肽并不完全分别等同于核苷酸序列SEQ IDNO.1或氨基酸序列SEQ ID NO.2，应当理解这些序列包含至少一个本发明的SNP，而被认为是这些序列的变体。
本发明的多核苷酸通常与包含至少一个本发明的SNP的核苷酸序列SEQ ID NO.1具有相同或几乎相同的生物活性。
同样，本发明的多肽通常与包含至少一个本发明的编码SNP的氨基酸序列SEQ ID NO.2具有相同或几乎相同的生物活性。
例如，通过定点诱变或直接合成，可以获得本发明的变体。
″SNP″可理解为核苷酸序列中碱基的任何天然变异。核苷酸序列的SNP可以是编码、沉默或非编码型。
编码SNP是包括在核苷酸序列的编码序列内一种多态性，其涉及该核苷酸序列所编码氨基酸序列中的氨基酸改变。在这种情况下，术语SNP经外延同样适用于氨基酸序列中的突变。
沉默SNP是包括在核苷酸序列的编码序列内一种多态性，其不涉及该核苷酸序列所编码的氨基酸序列中的氨基酸改变。
非编码SNP是包括在核苷酸序列的非编码序列中的一种多态性。该多态性特别发现于内含子、拼接区、转录启动子或增强子位点序列中。
″功能性SNP″可理解为如前文定义的、包括在核苷酸序列或氨基酸序列中的具有功能性的SNP。
″功能性″可理解为多肽或多核苷酸的生物活性。
本发明的多肽或多核苷酸的功能性可以是保留、增加、降低或抑制野生型参考基因的核苷酸序列编码的多肽或后者核苷酸序列的生物活性。
本发明的多肽或多核苷酸的功能性同样可以是野生型参考基因的核苷酸序列编码的多肽或后者核苷酸序列的生物活性的本质改变。
生物活性可以特别涉及本发明的多肽与受体有或没有亲合力。
多核苷酸
本发明的首要目的在于分离的多核苷酸，其包含：
a)与序列SEQ ID NO.1或其编码序列(核苷酸615-2763)具有至少80％同一性、优选至少90％同一性、更优选95％的同一性以及更优选至少99％同一性的核苷酸序列，应当理解该核苷酸序列包含至少一个以下编码SNP：g1644a、g2357a、c2621g，或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明同样涉及分离的多核苷酸，其包含：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或其编码序列，应当理解这些序列中每一个均包含至少一个以下编码SNP：g1644a、g2357a、c2621g，或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸优选由序列SEQ ID NO.1或其编码序列组成，应当理解这些序列中每一个均包含至少一个以下编码SNP：g1644a、g2357a、c2621g。
根据本发明，先前定义的多核苷酸包含选自g1644a、g2357a和c2621g单一的编码SNP。
如先前定义的多核苷酸同样可以包括至少一个以下非编码和沉默SNP：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634a。
本发明的目的同样在于分离的多核苷酸，其包含或由下列序列组成：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要时其编码序列，应当理解这些序列中每一个均包含至少一个以下非编码或沉默SNP：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g2228a、c2502t、g2634a，或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
应当理解，以下沉默SNP c1288t、t1607c、g2634a位于核苷酸序列SEQ ID NO.1的编码序列中。
本发明还涉及分离的多核苷酸，其由部分的下列序列组成：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要时其编码序列，应理解这些序列中每一个均包含至少一个下列SNP：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a，或
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
该分离的多核苷酸由至少10个核苷酸组成。
本发明的目的还在于分离的多核苷酸，其编码的多肽包含：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应理解a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：D70N、G104S、S147C。
应当理解，在本发明意义上，定位D70N、G104S、S147C SNP的相应编号是相对于氨基酸序列SEQ ID NO.2的编号而言。
根据本发明的优选目的，先前定义的多肽包含单个如上定义的编码SNP。
更优选地，本发明的目的还在于编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分的多肽、并具有SNP G104S的分离的多核苷酸。
本发明优选的多核苷酸由DNA或RNA分子组成。
本发明的多核苷酸可以由标准DNA或RNA合成方法获得。
利用定点诱变从EPO基因的核苷酸序列开始，通过核苷酸序列SEQ ID NO.1中每个SNP的突变核苷酸修饰野生型核苷酸，同样可以获得本发明的多核苷酸。
例如，利用定点诱变从EPO基因的核苷酸序列开始，通过在核苷酸序列SEQ ID NO.1中2357位用核苷a酸修饰核苷酸g，可以获得本发明包含SNP g2357a的多核苷酸。
可以这样实施的定点诱变方法为本领域技术人员熟知。特别提到的是文献TA Kunkel，1985″Proc.Natl.Acad.Sci.USA″82：488。
分离的多核苷酸同样可以包括，例如编码前(pre-)、原(pro-)或前原(pre-pro-)蛋白质氨基酸序列或诸如六组氨酸肽等标志氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸同样可以连接编码其它蛋白质或蛋白质片段的核苷酸序列，以获得融合蛋白质或其它纯化产物。
本发明的多核苷酸同样可以包括诸如5’和/或3’非编码序列的核苷酸序列，例如转录或非转录序列、翻译或非翻译序列、拼接信号序列、多腺苷酸化序列、核糖体结合序列乃至稳定mRNA的序列。
与核苷酸或多核苷酸序列互补的核苷酸序列可定义为可以在严格条件下与该核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
″严格杂交条件″一般但不一定理解为允许具有至少80％、优选大于或等于90％、更优选大于或等于95％、最优选大于或等于97％的同一性的核苷酸序列杂交的化学条件。
可以按照本领域技术人员熟知的方法获得严格条件，例如将多核苷酸在包含50％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH＝7.6)、5x Denhardt液、10％硫酸葡聚糖和20μg变性鲑精DNA的溶液中，于42℃温育，然后于0.1x SSC、65℃洗涤滤膜。
在本发明范围内，如果该严格条件允许具有100％同一性的核苷酸序列杂交，则认为该核苷酸序列与a)中所述核苷酸序列严格互补。
在本发明的涵义中可以理解，与一个核苷酸序列互补的核苷酸序列包含至少一个本发明的反义SNP。
因此，举例来说，如果该核苷酸序列包含SNP g1644a，则其互补核苷酸序列在相当于1644的位置包含核苷酸t。
包含SNP的多核苷酸的鉴定、杂交和/或扩增
本发明的目的还在于全部或部分的先前定义的多核苷酸的用途，以鉴定、杂交和/或扩增由核苷酸序列SEQ ID NO.1或必要时其编码序列(核苷酸615-2763)组成的全部或部分多核苷酸，这些序列中每个均包含至少一个下列SNP：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。
基因分型并测定SNP频率
本发明的目的同样在于本发明的全部或部分多核苷酸的用途，用于与EPO基因的核苷酸序列具有90-100％同一性、并包含至少一个下列SNP：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a的核苷酸序列的基因分型。
根据本发明，可以对个体或个体群进行基因分型。
在本发明的涵义中，基因分型可定义为用于测定个体或个体群基因型的方法。基因型由存在于一个或多个特定座位的等位基因构成。
″个体群″可理解为以随机或非随机方式选择的一群确定的个体。这些个体可以是人类、动物、微生物或植物。
该个体群一般包含至少10个成员，优选100-300个成员。
可以根据种族或表现型选择个体，特别是受以下病症和/或疾病影响的个体：癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤(carcinoid tumor)以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病(Crohn’s disease)以及溃疡性结肠炎。
所述心血管疾病可能包括脑损伤和贫血，其中包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
所述代谢疾病可能包括此类非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症可能还包括创伤愈合和骨质疏松症。
本发明的化合物可能优选用于制备意在增加自体血液生成、特别是参与不同自体血液采集程序的患者的的自体血液生成的治疗性化合物，以避免使用他人血液。
优选对个体群进行本发明功能性SNP的基因分型。
现有许多技术可以用来进行SNP基因分型(特别参见KwokPharmacogenomics，2000，卷1，95-100页。″High-throughputgenotyping assay approaches″)。这些技术基于以下四原理之一：等位基因特异性寡核苷酸杂交、任选在脱氧核苷酸存在下通过双脱氧核苷酸的寡核苷酸延伸、等位基因特异性寡核苷酸的连接或等位基因特异性寡核苷酸的断裂。其中每个技术都可与诸如直接或偏振荧光测定、或质谱分析等检测系统相连。
利用热ddNTP(由不同荧光团标记的两种不同的ddNTP)和冷ddNTP(两种不同的非标记的ddNTP)的微型测序，结合偏振荧光扫描仪，可以特别进行基因分型。利用读取偏振荧光的微型测序方法(FP-TDI技术或荧光偏振模板-直接染料-终止物参入)为本领域技术人员所熟知。
它可以对聚合酶链式反应(PCR)扩增每一个体DNA后获得的产物进行。选择包括含所研究SNP的多核苷酸基因区域的PCR产物。在PCR热循环仪的最后步骤之后，将平板置于偏振荧光扫描仪，利用荧光团特异性激发和发射滤片读取标记碱基。在图表上报告标记碱基的强度值。
就本发明SNP的PCR扩增而言，本领域技术人员很容易根据本发明SNP的定位，选择分别的有义和反义引物。
例如，用来PCR扩增包含SNP g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和/或g2634a的序列片段的有义和反义核苷酸序列分别为：
SEQ ID NO.3：有义引物(A)：TTGCATACCTTCTGTTTGCT
SEQ ID NO.4：反义引物(B)：CACAAGCAATGTTGGTGAG
上述核苷酸序列可以扩增核苷酸序列SEQ ID NO.1中2192-2817位核苷酸的626个核苷酸长度的片段。
然后对个体群中由包含SNP的基因编码的每个等位基因的频率(等位频率)进行统计分析，确定其影响的重要性及其在不同亚群、特别是必要时在构成该个体群的不同种群中的分布。
分析基因分型数据，估计在所研究群体中观察到的不同等位基因的分布频率。可借助于软件，例如SAS-suite(SAS)或SPLUS(MathSoft)，计算等位频率。利用软件ARLEQUIN和SAS-suite，可以比较本发明SNP在个体群中不同种群的等位分布。
本发明还涉及本发明多核苷酸在研究一个个体EPO核苷酸序列的一个变异中的用途。
本发明的SNP作为遗传标志
鉴于SNP修饰基因功能性序列(例如启动子、拼接位点、编码区)很可能与疾病易感性或抗性直接有关，所有SNP(不论功能性与否)均可能提供用于鉴定与疾病状态有关的一种或几种基因的重要标志，从而可能与该疾病状态间接相关。(参见Cargill等人(1999).Nature Genetics 22：231-238；Riley等人(2000).Pharmacogenomics 1：39-47；Roberts L.(2000).Science 287：1898-1899)。
因此，本发明还涉及数据库，其包含EPO基因多核苷酸中至少一个下列SNP的：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。
应当理解，该SNP按核苷酸序列SEQ ID NO.1编号。
可分析该数据库，确定以下两者之间的统计学相关性：
(i)EPO基因多核苷酸中的至少一个下列SNP：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a，以及
(ii)疾病或疾病抗性。
本发明还涉及EPO基因多核苷酸中至少一个下列SNP的用途：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a，用于开发疾病或疾病抗性的诊断/预后试剂盒。
诸如上文定义的本发明SNP可直接或间接与疾病或疾病抗性有关。
优选地，这些疾病可能是上文定义的疾病。
表达载体和宿主细胞
本发明目的还在于包含至少一种本发明多核苷酸的重组载体。
可以使用多种表达系统，例如染色体、附加体、衍生病毒。更特别而言，所用重组载体可来自于细菌质粒、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、诸如杆状病毒等病毒、诸如SV40等乳头状瘤病毒、痘苗病毒、腺病毒、福克斯痘病毒(fox pox viruse)、假狂犬病毒、逆转录病毒。
这些重组载体同样可以是粘粒或噬菌粒衍生物。可以利用本领域技术人员熟知的方法，将核苷酸序列插入重组表达载体，例如MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Sambrook等人，第二版，Co1d Spring Harbor Laboratory Press，Co1d Spring Harbor，N.Y.(1989)中所述的方法。
该重组载体可以包括控制多核苷酸表达调节的核苷酸序列、以及可表达和转录本发明多核苷酸、翻译本发明多肽的核苷酸序列，根据所用宿主细胞选择这些序列。
因此，例如可以将合适的分泌信号引入重组载体，以便将本发明多核苷酸编码的多肽导向内质网腔、周质间隙、膜或细胞外环境。
本发明目的还在于包含本发明重组载体的宿主细胞。
按照本领域技术人员已知的方法，例如BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，Davis等人，1986和MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL(同上)中所述诸如磷酸钙转染、DEAE葡聚糖转染、转染、显微注射、阳离子脂质转染、电穿孔、转导或感染等方法，可以将重组载体引入宿主细胞。
宿主细胞可以是例如细菌细胞诸如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌(E.coli)或枯草杆菌细胞(Bacillus subtilis)，真菌细胞诸如酵母细胞和曲霉菌属、链霉菌属细胞，昆虫细胞诸如果蝇S2(Drosophilia S2)和Spodoptera Sf9细胞，动物细胞诸如CHO、COS、HeLa、C127、BHK、HEK 293细胞，以及所治疗受试者的人类细胞乃至植物细胞。
例如可用来表达本发明多肽或作为药物组合物中活性产物的宿主细胞参见下文。
多肽
本发明目的还在于分离的多肽，其包含与以下序列具有至少80％同一性、优选至少90％同一性、更优选至少95％同一性、更加优选至少99％同一性的氨基酸序列：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应理解a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：D70N、G104S、S147C。
本发明的多肽同样可以包含：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应理解a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：D70N、G104S、S147C。
本发明的多肽可以更特别由下列序列组成：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193位之间所含氨基酸的氨基酸序列，
应理解a)和b)中的每个氨基酸序列均包含至少一个下列编码SNP：D70N、G104S、S147C。
优选地，本发明的多肽包含选自D70N、G104S和S147C中的单个编码SNP。
更优选地，本发明多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的氨基酸28-193、并具有SNP G104S。
本发明还涉及本发明多肽的超糖基化类似物，以便改进其治疗特性。
优选地，本发明涉及包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的氨基酸28-193、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物。
更优选地，本发明涉及包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的氨基酸28-193、并具有SNP G104S的多肽的聚乙二醇化类似物。
实际上，本领域已知，寡糖成分可以显著影响有关治疗性糖蛋白效力的特性，包括物理稳定性、蛋白酶攻击抗性、与免疫系统的相互作用、药代动力学和特定生物活性(例如参见Dube等人J.Biol.Chem.263，17516(1988)；Delorme等人Biochemistry 31，9871-9876(1992))。而野生型人尿源性EPO和重组野生型人EPO包含三个N-连接和一个O-连接寡糖链，共包含糖蛋白总分子量约40％，有可能增加蛋白质上糖链的数目。可增加蛋白质上糖链数目的方法为本领域技术人员熟知，包括如下：
-利用定点诱变产生氨基酸残基替换或添加引入可供糖基化的新位点(例如参见EP0640619以及公开号为20020037841的美国专利申请09/853731)。
-使用如WO9954342申请所示含有编码目的蛋白质的核酸以及至少一种编码修饰糖蛋白的糖基转移酶的核酸的宿主细胞，对蛋白质进行糖基化改造。
本发明的目的同样在于制备上述多肽的方法，其中在培养基中培养前面定义的宿主细胞，并从培养基中分离该多肽。
按照本领域技术人员熟知的方法，例如利用诸如盐、特别是硫酸铵、乙醇、丙酮或三氯乙酸等离液剂沉淀；酸提取；离子交换层析；磷酸纤维素层析；疏水作用层析；亲合层析；羟磷灰石层析或排阻层析，可以从宿主细胞的培养基中纯化多肽。
″培养基″可理解为从中分离或纯化本发明多肽的培养基。该培养基可以由细胞外培养基和/或细胞裂解物组成。如果该多肽的构象在分离或纯化期间改变，同样可以利用本领域技术人员熟知的方法恢复该多肽的活性构象。
抗体
本发明的目的还在于获得免疫特异性抗体的方法。
″抗体″可理解为包括单克隆、多克隆、嵌合、单链、人源化抗体以及Fab片段，包括Fab或免疫球蛋白表达文库产物。
利用本发明的多肽免疫动物，可以获得免疫特异性抗体。
本发明还涉及前面定义的本发明多肽的免疫特异性抗体。
本发明的多肽、其片段之一、类似物、其变体之一或表达该多肽的细胞，也可以用来产生免疫特异性抗体。
术语″免疫特异性″是指该抗体对于本发明的多肽比对于现有技术已知的其它多肽具有更好的亲合力。
按照本领域技术人员熟知的方法，将本发明的多肽、其片段之一、类似物或表位片段、或表达该多核苷酸的细胞给予哺乳动物、优选非人哺乳动物，可以获得免疫特异性抗体。
为制备单克隆抗体，可以从细胞系开始，使用抗体制备的典型方法，例如杂交瘤(trioma)技术(Kohler等人，Nature(1975)256：495-497)，三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today(1983)4：72)以及EBV杂交瘤技术(Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，77-96页，Alan R.Liss，1985)。
同样可以使用单链抗体制备技术，例如美国专利4,946,778所述。
诸如小鼠等转基因动物同样可以用来制备人源化抗体。
与本发明多肽相互作用的试剂(agent)
本发明的目的同样在于鉴定活化或抑制本发明多肽的试剂的方法，其包含：
a)制备包含本发明的含有至少一个编码SNP的多核苷酸的重组载体，
b)制备包含a)中重组载体的宿主细胞，
c)将b)中宿主细胞接触待测试剂，以及
d)确定待测试剂产生的活化或抑制作用。
本发明的多肽还可以用于筛选与其相互作用的化合物的方法。
这些化合物可以是本发明多肽固有活性的活化剂(激动剂)或抑制剂(拮抗剂)。这些化合物同样可以是本发明多肽的配基或底物。参见Coligan等人，Current Protocols in Immunology 1(2)，Chapter5(1991)。
一般而言，为实施上述方法，最理想的是制备表达本发明多肽的合适的宿主细胞。此类细胞可以是，例如哺乳动物、酵母、昆虫(例如果蝇)或细菌(例如大肠杆菌)的细胞。
将这些细胞或这些细胞的膜提取物置于待测化合物的存在下。
然后观察该待测化合物与本发明多肽的结合力以及对功能性反应的抑制或活化作用。
可以使用直接或间接标记的待测试剂进行上述方法的步骤d)。还可以包括一个使用标记或非标记的试剂以及标记的竞争剂的竞争试验。
同样可以利用根据待检信号而适当选择的检测方法，确定待检试剂是否对表达本发明多肽的细胞产生活化或抑制信号。
例如，上述活化或抑制剂可以是多核苷酸、在某些情况下是寡核苷酸或多肽，例如蛋白质或抗体。
本发明的目的还在于鉴定受本发明多肽活化或抑制的试剂的方法，其包含：
a)制备包含本发明的含有至少一个SNP的多核苷酸的重组载体，
b)制备包含a)中重组载体的宿主细胞，
c)将b)中宿主细胞置于待测试剂的存在下，以及
d)确定该多肽对待测试剂产生的活化或抑制作用。
受本发明多肽活化或抑制的试剂是在该多肽存在下，分别对活化或抑制反应的试剂。受本发明多肽直接或间接活化或抑制的试剂可以由多肽例如膜或核受体、激酶并更优选酪氨酸激酶、转录因子或多核苷酸组成。
疾病检测
本发明目的还在于分析受试者中本发明多核苷酸和/或本发明多肽的生物学特性的方法，其包含以下至少一项：
a)确定受试者基因组中存在或缺少本发明的多核苷酸；
b)确定受试者中本发明的多核苷酸的表达水平；
c)确定受试者中存在或缺少本发明的多肽；
d)确定受试者中本发明多肽的浓度；和/或
e)确定受试者中本发明多肽的功能性。
可分析受试者或受试者样品中这些生物学特性。
这些生物学特性可遗传诊断和/或确定受试者是否患有与存在本发明多核苷酸和/或本发明多肽有关的疾病、不适或病症，或具有患有疾病、不适或病症的危险，或反之具有对疾病、不适或病症形成的部分抗性。这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述心血管疾病可能包括脑损伤和贫血，其中包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症可能还包括创伤愈合和骨质疏松症。
该方法还可遗传诊断受试者中与存在本发明SNP编码的突变的等位基因有关的疾病或疾病抗性。
优选在步骤a)中检测包含前面定义的至少一个编码SNP的多核苷酸的存在与否。
可以从所研究的受试者的生物样品(例如细胞、血液、尿、唾液)、或其活检或尸检样品开始，进行该多核苷酸的检测。例如，可使用基因组DNA直接或于PCR扩增后进行检测。同样可按类似方式使用RNA或cDNA。
然后有可能将本发明多核苷酸的核苷酸序列与受试者基因组中检测到的核苷酸序列作比较。
可以通过测序、DNA杂交方法、DNA片段在有或无变性剂的电泳凝胶中的迁移率差异、或解链温度差异，进行核苷酸序列的比较。参见Myers等人，Science(1985)230：1242。利用核酸酶保护试验(例如RNase和S1核酸酶)或化学裂解剂，同样可以揭示核苷酸序列精确位点的上述结构改变。参见Cotton等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(1985)85：4397-4401。同样可以利用包含本发明多核苷酸片段的寡核苷酸探针进行筛选。
许多为本领域技术人员所熟知的方法可用于确定本发明多核苷酸的表达，并鉴定该多核苷酸的遗传变异性(参见Chee等人，Science(1996)，Vol 274，610-613页)。
在步骤b)中，按照本领域技术人员熟知的方法，例如PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹及其它杂交方法，定量该多核苷酸编码的RNA(及编码多肽)的水平，可测定该多核苷酸的表达水平。
在步骤c)和d)中，利用公知的方法，例如放射免疫测定、竞争性结合试验、Western印迹和ELISA试验，可以测定本发明多肽在受试者或受试者样品中的存在与否及其浓度。
步骤d)之后，测定的本发明多肽的浓度可与通常在受试者中发现的天然野生型EPO蛋白质的浓度相比。
本领域技术人员借助于现有技术文献或诸如前述常规试验或测定，可以确定对以上所致疾病、不适或病症表现出敏感性或反之抗性的高低阈值。
在步骤e)中，利用本领域技术人员熟知的方法，例如上述体外试验，或使用表达本发明多肽的宿主细胞，可以测定本发明多肽的功能性。
治疗性化合物及疾病治疗
本发明的目的还在于包含本发明多肽和/或包含氨基酸序列SEQ
ID NO.2中28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物作为活性剂的治疗性化合物。
本发明还涉及包含本发明多肽和/或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物的用途，用于制备意在预防或治疗不同的人类病症和/或疾病的治疗性化合物。这些疾病可以是病症和/或人类疾病，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述心血管疾病可能包括脑损伤和贫血，其中包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症可能还包括创伤愈合和骨质疏松症。
本发明的化合物可能优选用于制备意在增加自体血液生成、特别是参与不同自体血液采集程序的患者的自体血液生成的治疗性化合物，以避免使用他人血液。
优选地，本发明的多肽和/或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物还可以用于制备治疗性化合物，用于：
-预防或治疗贫血，特别是肾机能不全的透析患者，以及由慢性感染、炎性过程、放射治疗、化学治疗所致贫血，和/或
-增加自体血液生成，特别是参与不同自体血液采集程序的患者中的自体血液生成，以避免使用他人血液，和/或
-预防脑损伤。
可以获得本发明多肽的某些化合物以及通过或由该多肽获得或鉴定的化合物同样可以作为治疗性化合物，用于治疗人体。
正因为如此，本发明的目的还在于治疗性化合物，其包含含有至少一个前面定义的SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体作为活性剂。
本发明还涉及包含至少一个前面定义的SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体的用途，用于制备意在预防或治疗不同的人类病症和/或疾病的治疗性化合物，例如癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述心血管疾病可能包括脑损伤和贫血，其中包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症可能还包括创伤愈合和骨质疏松症。
本发明的化合物可能优选用于制备意在增加自体血液生成、特别是参与不同自体血液采集程序的患者的自体血液生成的治疗性化合物，以避免使用他人血液。
本发明优选涉及包含至少一个前面定义的SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体的用途，用于制备治疗性化合物，用于：
-预防或治疗贫血，特别是肾机能不全的透析患者的贫血，以及由慢性感染、炎性过程、放射治疗、化学治疗所致贫血，和/或
-增加自体血液生成，特别是参与不同自体血液采集程序的患者的自体血液生成，以避免使用他人血液，和/或
-预防脑损伤。
用作活性剂的本发明多肽和其它化合物的剂量取决于所选择的化合物、治疗适应症、给药方式、制剂性质、受试者性质及医生的判断。
用作活性剂时，一般按1-300单位/千克受试者的剂量给予本发明的多肽。
本发明的目的还在于药物组合物，其包含至少一种上述化合物，例如本发明的多肽；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物；包含至少一种前面定义的SNP的本发明多核苷酸、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体作为活性剂，以及药物可接受的赋形剂。
这些药物组合物中该活性剂有利地以生理有效剂量存在。
这些药物组合物可以是例如固体或液体，并以目前用于人类医学的药物形式存在，例如简单或包衣片剂、软胶囊(gelcaps)、颗粒剂、焦糖剂、栓剂、优选可注射制剂和可注射用粉末。可以按照常用方法制备这些药物形式。
活性剂可以掺入通常用于药物组合物的赋形剂，例如滑石粉、阿拉伯胶、乳糖、淀粉、葡萄糖、甘油、乙醇、硬脂酸镁、可可脂、含水或无水载体、动物或植物来源的脂质、石蜡衍生物、乙二醇、各种湿润剂、分散剂或乳化剂、防腐剂。
本发明的活性剂可以单独使用或与其它化合物例如治疗性化合物，诸如白细胞介素或干扰素等其它细胞因子联用。
根据给药方式，调整该药物组合物的不同剂型。
可以通过本领域技术人员已知的不同给药途径，给予该药物组合物。
本发明的目的同样在于诊断性组合物，其包含至少一种上述化合物(例如本发明的多肽、本发明多核苷酸的全部或部分、前面定义的重组载体、前面定义的宿主细胞、和/或前面定义的抗体)作为活性剂、以及合适的药物可接受的赋形剂。
该诊断性组合物可包含，例如一般用于诊断性组合物的合适的赋形剂，诸如缓冲液和防腐剂。
本发明的目的同样在于下列物质的用途：
a)治疗有效量的本发明多肽，和/或
b)本发明的多核苷酸，和/或
c)前面定义的来自所需治疗受试者的宿主细胞，
制备意在增加本发明多肽在受试者中表达或活性的治疗性化合物。
因此，为治疗需要增加本发明多肽表达或活性的受试者，可能有几种方法。
有可能给予受试者治疗有效量的本发明多肽；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物；和/或诸如前面定义的活化剂和/或被活化剂，可能联用，药物可接受的赋形剂。
同样有可能通过给予受试者本发明的多核苷酸，以增加本发明多肽的内源性生成。例如，可以将该多核苷酸插入逆转录病毒表达载体。利用包含编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体感染细胞，以使转导细胞产生包含目的基因的感染性病毒颗粒，可以从该细胞中分离上述载体。参见Human Molecular Genetics，Strachan和Read，第20章，Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches，BIOS Scientifics PublishersLtd(1996)。
根据本发明，优选使用如上定义的包含至少一个编码SNP的多核苷酸。
同样有可能给予受试者属于自身的宿主细胞(自体细胞)，预先取出这些宿主细胞，并如前所述进行修饰，使其表达本发明多肽。
本发明同样涉及下列物质的用途：
a)治疗有效量的前面定义的免疫特异性抗体，和/或
b)可抑制本发明多核苷酸表达的多核苷酸，和/或
c)如前定义的来自欲治疗的受试者的宿主细胞，
以便制备意在降低受试者中本发明多肽的表达或活性的治疗性化合物。
因此，可给予受试者治疗有效量的如前定义的抑制剂和/或抗体，可能联用，药物可接受的赋形剂。
同样也可通过给予受试者可抑制本发明多核苷酸表达的本发明的互补多核苷酸，降低本发明多肽的内源性生成。
优选使用如上定义的包含至少一个编码SNP的互补多核苷酸。
本发明还涉及红细胞生成素蛋白质和/或超糖基化类似物在制备治疗性化合物中的用途，用于预防或治疗EPO变体所致病症或疾病的患者，其与所述患者基因组中存在与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有至少95％同一性(优选97％同一性、更优选99％同一性、特别优选100％同一性)的核苷酸序列有关，只要该核苷酸序列包含下列SNP之一：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。
所述治疗性化合物优选用于预防或治疗选自下列之一的疾病：癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤在内的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述心血管疾病可能包括脑损伤和贫血，其包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和病症可能还包括创伤愈合和骨质疏松症。
本发明的化合物可能优选用于制备意在增加自体血液生成、特别是参与不同自体血液采集程序的患者的自体血液生成的治疗性化合物，以避免使用他人血液。
包含SNP G104S的EPO多肽的类似(mimetic)化合物
本发明还涉及具有与下列多肽基本类似、或更高的生物活性的新化合物：
a)氨基酸序列SEQ ID NO.2，或
b)包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193位之间所含氨基酸的氨基酸序列；
只要a)和b)中所述氨基酸序列包含G104S SNP。
例如通过测定对来自过表达EPO受体的小鼠32D细胞系细胞的细胞增殖活性、红系集落形成或与EPO受体的结合能力，可评价所述的生物活性。
如实验部分所述，G104S突变的EPO对过表达EPO受体的小鼠32D细胞系的细胞增殖作用比野生型EPO增强2-5倍。
如实验部分所述，G104S突变的EPO刺激红系集落形成的能力高于野生型EPO。
如实验部分所述，G104S突变的EPO与EPO受体的结合能力高于天然野生型EPO。
如前定义的本发明的新化合物可具有与G104S突变的EPO基本相似的生物活性，即高于天然野生型EPO。
所述化合物可能还具有甚至高于G104S突变的EPO的生物活性。
本发明化合物可能具有至少一种与EPO作用于EPO受体有关的功能，并且其活性基本类似于包含G104S SNP的氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽。
根据通过在EPO受体产生变化而诱导的活性基本类似于包含G104S SNP的氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽诱导的对该EPO受体的作用，所述化合物可能还具有至少一种与EPO作用于EPO受体有关的功能。
所述化合物可能是生物化学化合物，例如多肽或肽，或有机化学化合物，例如合成的肽类似物。
本发明还提供了新化合物，其对来自过表达EPO受体的小鼠32D细胞系的细胞的细胞增殖活性比野生型EPO高2-5倍。
本发明还提供了其刺激红系集落形成能力高于野生型EPO的新化合物。
本发明还提供了其对EPO受体的结合能力高于野生型EPO的新化合物。
本发明还涉及包含G104S SNP的本发明多肽在鉴定如上所述化合物中的用途。
本发明还涉及鉴定本发明化合物的方法，其包含以下步骤：
a)确定生物活性，例如对过表达人EPO受体的32D细胞系细胞增殖的刺激作用、对红系集落形成的刺激作用、和/或与EPO受体的结合能力；
b)比较：
i)步骤a)测定的待测化合物的活性，与
ii)氨基酸序列SEQ ID NO.2的多肽的活性，或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2中28-193位氨基酸的氨基酸序列的多肽的活性；只要该氨基酸序列包含G104S SNP；以及
c)根据步骤b)中进行的比较，确定该待测化合物是否具有与氨基酸序列SEQ ID NO.2或包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193位氨基酸的氨基酸序列的多肽基本类似或更高的活性；只要所述氨基酸序列包含G104S SNP。
优选地待测化合物可能先前鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或通过计算机辅助药物设计而设计，以具有与氨基酸序列SEQID NO.2的多肽、或与包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193位氨基酸的氨基酸序列的多肽相同的三维结构和/或化学效应，只要该氨基酸序列包含G104S SNP。
鉴定和设计化合物的方法为本领域技术人员所熟知。
例如，关于这些方法的文献可能有：
-Silverman R.B.(1992).″Organic Chemistry of DrugDesign and Drug Action″.Academic Press，1st edition(January 15，1992).
-Anderson S和Chiplin J.(2002).″Structural genomics；shaping the future of drug design？Drug Discov.Today.7(2)：105-107.
-Selick HE，Beresford AP，Tarbit MH.(2002).″Theemerging importance of predictive ADME simulation in drugdiscovery″.Drug Discov.Today.7(2)：109-116.
-Burbidge R，Trotter M，Buxton B，Holden S.(2001).″Drug design by machine learning：support vector machinesfor pharmaceutical data analysis″.Comput.Chem.26(1)：5-14.
-Kauvar L.M.(1996).″Peptide mimetic drugs：a commenton progress and prospects″14(6)：709.
本发明的化合物可用于制备治疗性化合物，用于预防或治疗选自下列的疾病：癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管疾病、代谢疾病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及与化学治疗有关的疾病。
所述癌症和肿瘤包括，包含转移的肾癌、黑色素瘤的恶性肿瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
所述传染病包括病毒性传染，包含慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS，传染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
所述免疫和自身免疫相关疾病可能包括组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
所述心血管疾病可能包括脑损伤和贫血，其中包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
所述代谢疾病可能包括上述非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
所述中枢神经系统疾病可能包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症和抑郁症。
所述疾病和异常可能还包括创伤愈合和骨质疏松症。
本发明的化合物可能优选用于制备意在增加自体血液生成、特别是参与不同自体血液采集程序的患者的自体血液生成的治疗性化合物，以避免使用他人血液。
实验部分
实施例1：包含SNP g1644a、g2357a或c2621g的核苷酸序列的多核苷酸编码的蛋白质以及野生型参考基因的核苷酸序列编码的蛋白质的模建。
第一步，从可获得的PDB数据库(编码lEER)开始，并利用软件Modeler(MSI San Diego，CA)，构建红细胞生成素的三维结构。然后修饰该成熟的多肽片段，以便复制突变D70N、G104S或S147C。利用程序AMBER和DISCOVER(MSI：Molecular SimulationsInc.)，对该突变片段进行1000次分子最小化步骤。然后利用相同程序和相同势场(force field)，进行两次分子动力学计算运行。在每种情况下，在300°K计算50，000个步骤，结束于300个平衡步骤。模建结果如图1、2和3所示。
实施例2：个体群中SNP g1644a和c2621g的基因分型。
SNP的基因分型是根据微型测序原理，其中通过读取偏振荧光进行产物检测。该技术由荧光微型测序(FP-TDI技术或荧光偏振模板直接染料终止物参入)组成。对群体中每一个体基因组DNA的PCR扩增产物进行微型测序。选择PCR产物，使其包括含待基因分型的SNP的基因区域。去除PCR引物和未掺入的dNTPs之后，进行微型测序。微型测序包含利用聚合酶和荧光标记的双脱氧核苷酸，延伸位于SNP位点紧上游的寡核苷酸引物。通过读取偏振荧光，直接分析该延伸过程产生的产物。所有这些步骤及读取，均在同一PCR平板上进行。
因此，基因分型需要5个步骤：
1)PCR扩增
2)利用酶促消化纯化PCR产物
3)寡核苷酸引物延伸
4)读取
5)解读
步骤1)PCR扩增。
从来自不同种族起源的268位个体的基因组DNA开始，进行EPO基因核苷酸序列的PCR扩增。美国Coriell Institute提供了这些基因组DNA。该268位个体分布如下：
  系统发生的群体                                特定种族的群体                             总计                     ％
  非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人东北亚人非欧洲高加索人东南亚人南美人 非裔美国人                                  50                       100.0小计                 50                       18.7南美安迪斯人                                10                       66.7西南美国印地安人                            5                        33.3小计                 15                       5.6加勒比人                                    10                       100.0小计                 10                       3.7北美高加索人                                79                       79.8伊比利亚人                                  10                       10.1意大利人                                    10                       10.1小计                 99                       36.9墨西哥人                                    10                       100.0小计                 10                       3.7中国人                                      10                       50.0日本人                                      10                       50.0小计                 20                       7.5希腊人                                      8                        21.6印度-巴基斯坦人                             9                        24.3中东人                                      20                       54.1小计                 37                       13.8太平洋岛民                                  7                        41.2南亚人                                      10                       58.8小计                 17                       6.3南美人                                      10                       100.0小计                 10                       3.7
                                                                       总计                 268                      100
*系统发生的群体来自：
Cavalli-Sforza，P.Menozzi和A.Piazza.1994.″TheHistory and Geography of Human Genes.″Princeton：Princeton University Press.80页。
来自其中每一个体的基因组DNA形成一个样品。
利用本领域技术人员根据核苷酸序列SEQ ID NO.1轻易设计的引物，进行PCR扩增。
为了g1644a的基因分型利用下列引物进行PCR扩增：
SEQ ID NO.5：有义引物：TTCAGGGACCCTTGACTC
SEQ ID NO.6：反义引物：GATCATTCTCCCTTTCATCC
上述核苷酸序列可以扩增核苷酸序列SEQ ID NO.1中1557-1764位核苷酸的208个核苷酸长度的片段。
为了c2621g的基因分型利用下列引物进行PCR扩增：
SEQ ID NO.7：有义引物：TTGCATACCTTCTGTTTGCT
SEQ ID NO.8：反义引物：CACAAGCAATGTTGGTGAG
上述核苷酸序列可以扩增核苷酸序列SEQ ID NO.1中2192-2817位核苷酸的626个核苷酸长度的片段。
对于每个需要基因分型的SNP，均以PCR产物作为微型测序的模板。
每个样品PCR反应的总体积为5μl。该反应体积由下表所示试剂组成：
供应商 参考 反应物 初浓度   体积/管(μl) 终浓度
  LifeTechnology   附送w/Taq   缓冲液(X)   10   0.5   1
  LifeTechnology   附送w/Taq   MgSO4(mM)   50   0.2   2
  AP Biotech   27-2035-03   dNTPs(mM)   10   0.1   0.2
  函索   有义引物(μM)   10   0.1   0.2
  函索   反义引物(μM)   10   0.1   0.2
  LifeTechnology   11304-029   Taq platinum   5U/μl   0.02   0.1U/rxn
  H2O   Qsp 5μl   1.98
  DNA(样品)   2.5ng/μl   2   5ng/rxn
  总体积   5μl
这些试剂分布于ABGene提供的具有384孔的黑色PCR平板中(ref：TF-0384-k)。将该平板密封、离心，然后置于用于384孔平板的热循环仪(MJ Research的Tetrad)，进行下列温育：PCR循环：94℃1分钟，继之以3个步骤的36个循环(94℃15秒、56℃30秒、68℃1分钟)。
步骤2)利用酶促消化纯化PCR产物
然后利用两种酶：虾碱性磷酸酶(SAP)和核酸外切酶I(Exo I)纯化PCR扩增产物。第一种酶使PCR扩增期间未掺入的dNTP去磷酸化，第二种酶去除遗留的单链DNA，特别是PCR期间未使用的引物。在PCR平板的每个孔中，每种样品加入5μl反应混合物，进行消化。
该反应混合物由以下试剂组成：
供应商 参考 反应物 初浓度   体积/管(μl) 终浓度
  AP Biotech   E70092X   SAP   1U/μl   0.5   0.5/rxn
  AP Biotech   070073Z   Exo I   10U/μl   0.1   1/rxn
AP Biotech 提供w/SAP   缓冲液SAP(X) 10 0.5 1
  ，   H2O   Qsp 5μl   3.9
  PCR产物   5μl
  总体积   10μl
加样后，将平板密封、离心，然后置于用于384孔平板的热循环仪(MJ Research的Tetrad)，进行下列温育：SAP-EXO消化：37℃45分钟、80℃15分钟。
步骤3)寡核苷酸引物延伸
然后每个制备的样品加入5μl如下表所示反应混合物，对消化的PCR产物进行延伸或微型测序：
供应商 参考 反应物 初浓度   体积/管(μl) 终浓度
  Ownpreparation 延伸缓冲液1(X) 5 1 1
  LifeTechnologies 函索  微型测序引物(μM)A或B 10 0.5 1
AP Biotech   27-2051(61，71，81)-01 ddNTPs2(μM)2个未标记 各2.5 0.25 各0.125
NEN   Nel 472/5如Nel 492/5  ddNTPs2(μM)2个标记Tamra和R110 各2.5 0.25 各0.125
  AP Biotech   E79000Z  热测序酶   3.2U/μl   0.125   0.4U/反应
 H2O   Qsp 5μl   3.125
 消化的PCR产物   10
 总体积   15
1 5X延伸缓冲液由250mM Tris-HCl pH 9、250mM KCl、25mM NaCl、10mM MgCl2和40％甘油组成。
2对于ddNTP，根据研究的多态性使用4种碱基的混合物。只有构成功能性SNP的2种目的碱基(g1644a反义读取的C/T、或c2621g的C/G)标记Tamra或R110。
对于g1644a的基因分型，ddNTP混合物由以下组成：
-2.5μM未标记ddGTP，
-2.5μM未标记ddATP，
-2.5μM ddTTP(1.875μM未标记ddTTP以及0.625μM Tamra标记的ddTTP)，
-2.5μM ddCTP(1.875μM未标记ddCTP以及0.625μM R110标记的ddCTP)。
对于c2621g的基因分型，该ddNTP混合物由以下组成：
-2.5μM未标记ddATP，
-2.5μM未标记ddTTP，
-2.5μM ddGTP(1.875μM未标记ddGTP以及0.625μM Tamra标记的ddGTP)，
-2.5μM ddCTP(1.875μM未标记ddCTP以及0.625μM R110标记的ddCTP)。
对应于位于本发明SNP位点上游的核苷酸序列，确定基因分型所需的两个微型测序引物的序列。包含该SNP的PCR产物是双链DNA产物，因此可以对有义链或反义链进行基因分型。所选引物由LifeTechnologies Inc制备。
对于SNP g1644a，测试的微型测序引物如下：
SEQ ID NO.9：有义引物(A)：tgcagcttgaatgagaatatcactgtccca
SEQ ID NO.10：反义引物(B)：cctcttccaggcatagaaattaactttggtgt
首先利用48个样品验证SNP g1644a的微型测序，然后对由268位个体和11个阴性对照组成的一组个体群进行基因分型。测试了几种微型测序条件，g1644a的基因分型维持下列最适条件：
反义引物+ddCTP-R110+ddTTP-Tamra
对于SNP c2621g，测试的微型测序引物如下：
SEQ ID NO.11：有义引物(A)：ttggcagaaggaagccatct
SEQ ID NO.12：反义引物(B)：ctgaggccgcatctggaggg
首先利用48个样品验证SNP c2621g的微型测序，然后对由268位个体和10个阴性对照组成的一组个体群进行基因分型。测试了几种微型测序条件，c2621g的基因分型维持下列最适条件：
有义引物+ddCTP-R110+ddGTP-Tamra
加样后，将平板密封、离心，然后置于用于384孔平板的热循环仪(MJ Research的Tetrad)，进行下列温育：延伸循环：93℃1分钟、继之以由2个步骤组成的35个循环(93℃10秒、55℃30秒)。
在热循环仪最后步骤之后，将平板直接置于LJL Biosystems Inc的Analyst HT型偏振荧光阅读仪。利用Criterion Host软件，通过两种方法读取平板。第一种方法可利用该荧光团特异性的发射和激发滤片(激发550-10nm、发射580-10nm)读取Tamra标记的碱基，第二种方法可利用该荧光团特异性的发射和激发滤片(激发490-10nm、发射520-10nm)读取R110标记的碱基。两种情况均使用二色性的双反射镜(dichroic double mirror)(R110/Tamra)，其它的阅读参数为：
Z-高度：1.5mm
衰减器：关断
积分时间：100,000微妙
原始数据单位：计数/秒
偏振转换：按孔
平板稳定时间：0毫秒
PMT设置：精确读取(+)、灵敏度2
动态起偏镜：发射
静态起偏镜：S
从而获得包含Tamra滤片和R110滤片的mP(毫偏振度)计算值的文件结果。利用平行面(//)和垂直面(⊥)所得强度值，按照下列公式，计算这些mP值：
mP＝1000(//-g⊥)/(//+g⊥).
在该运算中，值⊥利用因子g权重。这是必须由预实验确定的机器参数。
步骤4)和5)解读并确定基因型。
利用Microsoft Inc.Excel软件、和/或LJL Biosystems Inc开发的Allele Caller软件，图解报告mP值。
横坐标表示Tamra标记碱基的mP值，纵座标表示R110标记碱基的mP值。强mP值表示掺入了该荧光团标记的碱基，反之，弱mP值表明该碱基未掺入。
获得了多达三个同源组的具有不同基因型的核苷酸序列。
一旦对不同组进行了鉴定，便可以使用Allele Caller软件，以表格形式直接获取所确定的每一个体的基因型。
SNP g1644a和c2621g的微型测序结果。
基因分型过程完成以后，针对此处所研究的两个功能性SNP，使用上述图形确定个体群中个体的基因型。
对于SNP g1644a，理论上所测试个体的基因型为纯合子GG、或杂合子GA、或纯合子AA。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型AA。
同样，对于SNP c2621g，理论上所测试个体的基因型为纯合子CC、或杂合子CG、或纯合子GG。实际上，如下所示，在个体群中未检测到纯合子基因型GG。
针对这两个功能性SNP，阴性对照、个体群中所测基因型分布以及计算不同等位基因的频率的结果如下表所示：
       个体数         对照数   成功率
  测试   基因分型   测试   基因分型
  g1644a   268   267   11   11   99.6
  c2621g   268   250   10   10   93.5
  系统发生的群体   总计                  g1644a(D70N)
  f     (95% CI)              GG  ％       GA ％          AA ％            总计
  非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人   501510991037201017 0.5    (0，1.5) 50  10015  10010  10097  99.0      1              1.010  10037  10020  10010  10017  100   50151098l037201017
  总计   268  0.2    (0，0.6) 266 99.6      1              0.4   267
  系统发生的群体   总计                     c2621g(S147C)
  f       (95％ CI)           CC  ％          CG  ％     GG ％                总计
  非裔美国人美洲印第安人加勒比人欧洲高加索人墨西哥人非欧洲高加索人东北亚人南美人东南亚人   501510991037201017 0.5     (0，1.6) 50  10015  10010  10091  98.9        1           1.18   10032  10019  1008   10016  100   5015109283219816
  总计   268   0.2     (0，0.6) 249 99.6       1            0.4   250
在上表中
-N代表个体数目。
-％代表特定亚群中个体的百分比。
-等位基因频率代表特定亚群中突变等位基因的百分比。
-95％IC代表最小和最大的95％置信区间。
按群体考查这些结果可以看出，就SNP g1644a而言，唯一的杂合子个体GA来自该个体群中欧洲高加索人亚群。
同样，按群体考查这些结果可以看出，就SNP c2621g而言，唯一的杂合子个体CG来自该个体群中欧洲高加索人亚群。
实施例3：研究G104S突变的红细胞生成素相比天然野生型红细胞生成素的生物功能
第一步包括制备突变和野生型EPO蛋白质
a)在携带遗传霉素抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1/His-Topo中克隆天然野生型红细胞生成素和突变的红细胞生成素(g2357a)
与SwissProt发布的红细胞生成素蛋白质序列相比，来自Genestorm克隆(H-XO2158M-Invitrogen)的多聚组氨酸标签的EPOcDNA带有K143E(G427AG)突变(下标数字表示该核苷酸在cDNA序列中的定位)。因此，我们首先使用Exsite PCR试剂盒(Stratagene)和下列引物恢复了天然野生型的E143(A427AG)序列：
SEQ ID NO.13：有义引物：CCAGAAGGAAGCCATCTCCCCT
SEQ ID NO.14：反义引物(5’端磷酸化)：GCTCCCAGAGCCCGAAGCAG
同时，使用Exsite PCR试剂盒(Stratagene corp.)和下列引物获得G104S(G310GC＝＞AGC)突变的红细胞生成素：
SEQ ID NO.15：有义引物：CGGAGCCAAGCCCTGTTGGTCA
SEQ ID NO.16：反义引物(5’端磷酸化)：CAGGACAGCTTCCGACAGCA
为去除多聚组氨酸尾并分离对应于完整EPO蛋白质(即天然信号肽和成熟蛋白质)的核苷酸序列，不论突变或野生型形式，使用下列引物进行PCR扩增：
SEQ ID NO.17：有义引物：ATGGGGGTGCACGAATGTCC
SEQ ID NO.18：反义引物：TCATCTGTCCCCTGTCCTGC
将该PCR产物插入真核表达载体pcDNA3.1/GS/HisTopo(TOPOTM-cloning；Invitrogen Corp.)，位于CMV启动子控制之下。该载体可使蛋白质在真核细胞系中组成型表达。
在核对编码重组蛋白质的载体区核苷酸序列之后，使用Superfect(QIAgen)将不同的重组表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
b)选择过表达天然野生型或突变EPO的克隆
利用各种EPO构建体转染两天之后，将CHO细胞置于包含800μg/ml遗传霉素(Invitrogen)的培养基中。通过在该培养条件下生长2周，选择过表达EPO的稳定细胞。然后利用有限稀释法克隆细胞。利用EPO ELISA(R&D Systems)筛选来自野生型或突变EPO转染细胞的30个克隆的EPO蛋白质表达。挑选几个表达EPO的克隆，冻存。其中，将野生型或突变EPO产量最高的克隆用于大量生产EPO。
c)EPO蛋白质的纯化
在CHO培养物中表达EPO之后，将培养基1500转/分离心20分钟，回收上清液。然后使用Labscale(Millipore膜5Kda)对3升缓冲液Tris 50mM、NaCl 25mM pH 9透析，将上清液浓缩10倍，利用阴离子交换柱(Pharmacia，HiprepQ)纯化。使用200mM NaCl洗脱蛋白质之后，利用缓冲液NaH2PO4 50mM、NaCl 25mM、pH 7将蛋白质脱盐，用Heparine HP(Pharmacia)纯化。然后利用150mMNaCl进行蛋白质洗脱。最后，通过SDS-PAGE凝胶定性分析EPO蛋白质，然后利用光密度法(Biorad光密度计GS800)定量。
第二步包括制备过表达EPO受体的32D小鼠细胞。
d)在携带zeocyn抗性基因的真核表达载体pcDNA3.1/GS/HisTopo中克隆天然EPO受体：
为进一步在V5表位和多聚组氨酸尾的框架内插入该cDNA，利用下列引物PCR扩增来自Genestorm克隆(H-M60459M-Invitrogen)的天然人EPO受体cDNA的完整序列：
SEQ ID NO.19：有义引物：ATGGACCACCTCGGGGCGTC
SEQ ID NO.20：反义引物：AGAGCAAGCCACATAGCTGGGGG
将该PCR产物插入真核表达载体pcDNA3.1/GS/HisTopo(TOPOTM-cloning；Invitrogen Corp.)，位于CMV启动子控制之下。该载体可使蛋白质在真核细胞系中组成型表达。在这种情况下，该EPO受体带有外加的包含多聚组氨酸尾和V5表位的C末端序列。核实编码该重组受体的载体区域的核苷酸序列之后，将该构建体电穿孔转入小鼠32D细胞系(ATCC)
e)选择过表达EPO受体的稳定细胞。
为选择过表达人EPO受体的稳定细胞，由编码EPO受体的构建体电穿孔转入的32D细胞系在200μg/mL Zeocin(Invitrogen)存在下培养5周，然后评价其在商品化人EPO(R&D Systems)存在下的增殖能力。
最后，利用两个不同试验测定突变EPO和野生型EPO的生物效应：评价不同EPO蛋白质诱导过表达EPO受体的小鼠32细胞增殖的能力，以及测定突变EPO和野生型EPO与EPO受体的直接结合。
f)评价野生型和突变G104S EPO诱导过表达EPO受体的小鼠32D细胞增殖的能力。
评价野生型EPO和G104S突变的EPO诱导过表达EPO受体的小鼠32D细胞(32D-EPOR细胞)的细胞增殖能力。首先测试前面步骤产生的包含不同EPO蛋白质的蛋白质提取物，其次测试前述获得的纯化的EPO蛋白质。
原理在于，将32D-EPOR细胞按2×104细胞/孔的细胞密度接种于96孔板包含10％胎牛血清的200μl最终培养基中。将32D-EPOR细胞与系列稀释的野生型或者突变EPO(对于蛋白质提取物为0.024-140ng/ml，对于纯化的EPO则为0.76×10-3-400ng/ml)于37℃培养5天，然后培养物中加入Uptiblue(Uptima)。对于蛋白质提取物再温育24小时，对于纯化的EPO则再温育4小时，然后测定590nm处发射的荧光(激发560nm)，定量细胞增殖速率。
天然野生型和突变EPO的增殖活性基于EC50值的测定，即细胞增殖达到50％所对应的EPO浓度(ng/ml)。
首先，利用包含EPO的蛋白质提取物进行上述两个实验，每个实验重复3次。实验结果分别如图4A和图4B所示。在图4中，对于每个蛋白质浓度，数据点表示3次测定的平均值，标准差(standarddeviation)代表3次重复之间的差异。
由曲线获得的EC值如下：
-第一个实验中：野生型EPO为24.22ng/ml，G104S突变的EPO为4.68ng/ml
-第二个实验中：野生型EPO为5.24ng/ml，G104S突变的EPO为3.7ng/ml
因此，图4A和4B以及EC50值表明，G104S突变的EPO对过表达人EPO受体的32D细胞系的细胞增殖的刺激作用比天然野生型EPO高2-5倍。
其次，利用纯化的EPO蛋白质进行类似实验。一式三份进行的两个实验的结果分别如图5A和图5B所示。在图5中，对于每个蛋白质浓度，数据点表示3次测定的平均值，标准差代表3次重复之间的差异。
由曲线获得的EC50值如下：
-第一个实验中：野生型EPO为2.38ng/ml，G104S突变的EPO为0.58ng/ml
-第二个实验中：野生型EPO为2.57ng/ml，G104S突变的EPO为1.12ng/ml。
因此，图5A和5B以及EC50值表明，纯化的G104S突变的EPO对过表达人EPO受体的32D细胞系的细胞增殖的刺激作用比纯化的天然野生型EPO高2-5倍，证实了由蛋白质提取物所得结果。
g)G104S突变的红细胞生成素刺激红系集落形成
评价G104S突变的红细胞生成素刺激红系集落形成的能力，并与野生型红细胞生成素相比较。
为此，收集健康个体的人骨髓细胞，并利用聚蔗糖梯度分离。将有核细胞(2.5×105细胞)铺于半固体甲基纤维素中。然后将0.25-10ng/ml的突变或野生型红细胞生成素加入培养基中。培养10天后计数红系集落。
该实验进行两次，下表汇集了其平均结果，并如图6所示。
            集落数
  EPO(ng/mL)   野生型EPO   G104S EPO
  0.25   170   230
  0.5   505   685
  1   540   810
  2.5   620   860
  5   670   855
  10   715   950
这些数据清楚表明，G104S突变的红细胞生成素刺激红系集落形成。更具体而言，G104S突变的红细胞生成素刺激红系集落形成比野生型红细胞生成素高30-50％。
h)EPO和EPO受体之间的相互作用
利用表面胞质团共振(Surface Plasmon Resonance)技术(Biacore，SPR)测定EPO及其受体(EPO-R)之间的相互作用。
为比较G104S突变的EPO和野生型EPO的亲合力，利用固定化于检测器芯片表面的EPO-R靶配体，然后在芯片上流过不同浓度包含待测EPO蛋白质的分析物，定量测定EPO与EPO-R细胞外部分结合的相互作用。
将芯片的羧甲基化葡聚糖层设计为与镍结合，以便通过多聚组氨酸尾的金属螯合作用而介导配体捕获。
为此，我们设计了对应于成熟人受体(氨基酸25-247)细胞外部分的EPO受体，后接C末端V5表位和多聚组氨酸尾(KGFSFNWGGKPIPNPLLGLDSTGVDHHHHHH-C-ter)。利用下列特定寡核苷酸，将相应的cDNA片段插入巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)载体pPICZalpha his-topo(Invitrogen)中：
SEQ ID NO.21：有义引物：GCGCCCCCGCCTAACCTC
SEQ ID NO.22：反义引物：GTCGCTAGGCGTCAGCAGCGA
将包含编码天然野生型EPO或G104S EPO的克隆的两个50mlBMGY培养基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、1％甘油、100mM磷酸钾、0.4mg/L生物素pH 6.8)的饱和前培养物(saturatedpre-cultures)在30℃、200转/分(rpm)振荡培养24小时。
当培养物的细胞密度达到波长600nm下所测光密度5.0时，用于按1/5接种到200ml BMMY培养基(2％蛋白胨、1％酵母抽提物、1.34％YNB、0.5％甲醇、100磷酸钾、0.4mg/L生物素pH6.8)。
然后利用终浓度0.5％的甲醇，在30℃、培养瓶于200转/分振荡下诱导蛋白质表达2-5天。
利用labscale装置(截留5000Da)超滤浓缩包含约10mg/mLEPO-R的上清液，并通过对磷酸钠50mM、Tris(Cl)10mM(pH8.0)、NaCl 150mM、咪唑10mM的透析交换缓冲液。然后利用预装硫酸镍的Hi-Trap(Amersham Pharmacia)捕获多聚组氨酸EPO-R。利用凝胶过滤柱(缓冲液Tris(Cl)pH 9、NaCl 50mM)将包含蛋白质的组分脱盐，然后利用阴离子交换层析纯化为约95％。利用SDS-PAGE凝胶估计纯度和浓度。
然后流过20μl/分钟的500μM硫酸镍，活化检测器芯片NTA。然后利用流速为10μl/分钟、浓度为50nM的HBS-P缓冲液(10mMHEPES、NaCl 150mM、0.005％P20EDTA 50μM)，在表面上捕获EPO-R。浓度为0.45-15nM的野生型EPO和G104S突变的EPO然后流过检测器芯片。每次浓缩试验后利用HBS-P、EDTA 0.35M再生。自动方法可以评价上述范围内6个浓度的野生型EPO和G104S突变的EPO的结合相互作用。
图7显示两个浓度(7.5和15nM)的G104S突变EPO和野生型EPO的结合测定结果。
这些结果表明，G104S突变的EPO与其受体结合比野生型EPO更快，证实了在细胞水平观察到的作用(参见3f和3g所述实施例)。从而证明，G104S突变的EPO对过表达EPO受体的小鼠32D细胞的增殖的强烈正效应至少部分和G104S突变的EPO与其受体的较高亲合力有关。
影响不成熟EPO蛋白质序列104位氨基酸的突变对EPO效应的作用非常出人意外。实际上，与EPO受体复合的EPO晶体结构表明，只有EPO(从四个螺旋A、B、C和D当中)的A、C和D三个螺旋与结合EPO受体有关(Syed等人Efficiency of signaling throughcytokine receptors depends critically on receptororientation.Nature 395：511-516(1998))。此外，分析EPO结构功能关系的定点诱变证明，位于77位残基附近的螺旋B的氨基酸的改变对EPO活性基本没有影响(Eliott等人Mapping of the activesite of recombinant human erythropoietin.Blood.89：493-502(1997)；Wen等人Erythropoietin structure-functionrelationships.Identification of functionally importantdomains.J.Biol.Chem.269：22839-22846(1994))。
上述有关EPO结构/功能的新信息还可以用于鉴定、设计和开发模拟EPO对其人类受体活性的新EPO样实体(化学的或肽的)。
                         序列表
<110>Escary，Jean-Louis
<120>红细胞生成素基因的新多核苷酸和多肽
<130>021349/0037
<150>FR 0104603
<151>2001-04-04
<150>US 60/343163
<151>2001-12-21
<150>US 60/345,440
<151>2002-01-04
<150>US 60/358,598
<151>2002-02-21
<160>22
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3398
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
agcttctggg cttccagacc cagctacttt gcggaactca gcaacccagg catctctgag      60
tctccgccca agaccgggat gccccccagg aggtgtccgg gagcccagcc tttcccagat     120
agcagctccg ccagtcccaa gggtgcgcaa ccggctgcac tcccctcccg cgacccaggg     180
cccgggagca gcccccatga cccacacgca cgtctgcagc agccccgtca gccccggagc     240
ctcaacccag gcgtcctgcc cctgctctga ccccgggtgg cccctacccc tggcgacccc     300
tcacgcacac agcctctccc ccacccccac ccgcgcacgc acacatgcag ataacagccc     360
cgacccccgg ccagagccgc agagtccctg ggccaccccg gccgctcgct gcgctgcgcc     420
gcaccgcgct gtcctcccgg agccggaccg gggccaccgc gcccgctctg ctccgacacc     480
gcgccccctg gacagccgcc ctctcctcca ggcccgtggg gctggccctg caccgccgag     540
cttcccggga tgagggcccc cggtgtggtc acccggcgcc ccaggtcgct gagggacccc     600
ggccaggcgc ggagatgggg gtgcacggtg agtactcgcg ggctgggcgc tcccgcccgc     660
ccgggtccct gtttgagcgg ggatttagcg ccccggctat tggccaggag gtggctgggt     720
tcaaggaccg gcgacttgtc aaggaccccg gaagggggag gggggtgggg cagcctccac     780
gtgccagcgg ggacttgggg gagtccttgg ggatggcaaa aacctgacct gtgaagggga     840
cacagtttgg gggttgaggg gaagaaggtt tggggggttc tgctgtgcca gtggagagga     900
agctgataag ctgataacct gggcgctgga gccaccactt atctgccaga ggggaagcct     960
ctgtcacacc aggattgaag tttggccgga gaagtggatg ctggtagcct gggggtgggg    1020
tgtgcacacg gcagcaggat tgaatgaagg ccagggaggc agcacctgag tgcttgcatg    1080
gttggggaca ggaaggacga gctggggcag agacgtgggg atgaaggaag ctgtccttcc    1140
acagccaccc ttctccctcc ccgcctgact ctcagcctgg ctatctgttc tagaatgtcc    1200
tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct ctgggcctcc cagtcctggg    1260
cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctgcag aggtacctct tggaggccaa    1320
ggaggccgag aatatcacgg tgagacccct tccccagcac attccacaga actcacgctc    1380
agggcttcag ggaactcctc ccagatccag gaacctggca cttggtttgg ggtggagttg    1440
ggaagctaga cactgccccc ctacataaga ataagtctgg tggccccaaa ccatacctgg    1500
aaactaggca aggagcaaag ccagcagatc ctacgcctgt ggccagggcc agagccttca    1560
gggacccttg actccccggg ctgtgtgcat ttcagacggg ctgtgctgaa cactgcagct    1620
tgaatgagaa tatcactgtc ccagacacca aagttaattt ctatgcctgg aagaggatgg    1680
aggtgagttc cttttttttt ttttttcctt tcttttggag aatctcattt gcgagcctga    1740
ttttggatga aagggagaat gatcgaggga aaggtaaaat ggagcagcag agatgaggct    1800
gcctgggcgc agaggctcac gtctataatc ccaggctgag atggccgaga tgggagaatt    1860
gcttgagccc tggagtttca gaccaaccta ggcagcatag tgagatcccc catctctaca    1920
aacatttaaa aaaattagtc aggtgaagtg gtgcatggtg gtagtcccag atatttggaa    1980
ggctgaggcg ggaggatcgc ttgagcccag gaatttgagg ctgcagtgag ctgtgatcac    2040
accactgcac tccagcctca gtgacagagt gaggccctgt ctcaaaaaag aaaagaaaaa    2100
agaaaaataa tgagggctgt atggaatacg ttcattattc attcactcac tcactcactc    2160
attcattcat tcattcattc aacaagtctt attgcatacc ttctgtttgc tcagcttggt    2220
gcttggggct gctgaggggc aggagggaga gggtgacatc cctcagctga ctcccagagt    2280
ccactccctg taggtcgggc agcaggccgt agaagtctgg cagggcctgg ccctgctgtc    2340
ggaagctgtc ctgcggggcc aggccctgtt ggtcaactct tcccagccgt gggagcccct    2400
gcagctgcat gtggataaag ccgtcagtgg ccttcgcagc ctcaccactc tgcttcgggc    2460
tctgggagcc caggtgagta ggagcggaca cttctgcttg ccctttctgt aagaagggga    2520
gaagggtctt gctaaggagt acaggaactg tccgtattcc ttccctttct gtggcactgc    2580
agcgacctcc tgttttctcc ttggcagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca    2640
gctgctccac tccgaacaat cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc    2700
aatttcctcc ggggaaagct gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggacaga    2760
tgaccaggtg tgtccacctg ggcatatcca ccacctccct caccaacatt gcttgtgcca    2820
caccctcccc cgccactcct gaaccccgtc gaggggctct cagctcagcg ccagcctgtc    2880
ccatggacac tccagtgcca ccaatgacat ctcaggggcc agaggaactg tccagagagc    2940
aactctgaga tctaaggatg tcacagggcc aacttgaggg cccagagcag gaagcattca    3000
gagagcagct ttaaactcag ggacagaccc atgctgggaa gacgcctgag ctcactcggc    3060
accctgcaaa attgatgcca ggacacgctt tggaggcgat ttacctgttt tcgcacctac    3120
catcagggac aggatgacct ggagaactta ggtggcaagc tgtgacttct ccaggtctca    3180
cgggcatggg cactcccttg gtggcaagag cccccttgac accggggtgg tgggaaccat    3240
gaagacagga tgggggctgg cctctggctc tcatggggtc caacttttgt gtattcttca    3300
acctcattga caagaactga aaccaccaat atgactcttg gcttttctgt tttctgggaa    3360
cctccaaatc ccctggctct gtcccactcc tggcagca                            3398
<210>2
<211>193
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
            20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
        35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
    50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
                85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
            100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
    130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
                165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
            180                 185                 190
Arg
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>3
ttgcatacct tctgtttgct                                                20
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人类
<400>4
cacaagcaat gttggtgag                                                 19
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>5
ttcagggacc cttgactc                                                  18
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>6
gatcattctc cctttcatcc                                                20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>7
ttgcatacct tctgtttgct                                                20
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人类
<400>8
cacaagcaat gttggtgag                                                 19
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人类
<400>9
tgcagcttga atgagaatat cactgtccca                                     30
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人类
<400>10
cctcttccag gcatagaaat taactttggtgt                                   32
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>11
ttggcagaag gaagccatct                                                20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>12
ctgaggccgc atctggaggg                                                20
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人类
<400>13
ccagaaggaa gccatctcccct                                              22
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>14
gctcccagag cccgaagcag                                                20
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人类
<400>15
cggagccaag ccctgttggt ca                                             22
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>16
caggacagct tccgacagca                                                20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>17
atgggggtgc acgaatgtcc                                            20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>18
tcatctgtcc cctgtcctgc                                            20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>19
atggaccacc tcggggcgtc                                            20
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人类
<400>20
agagcaagcc acatagctgg ggg                                        23
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>21
gcgcccccgc ctaacctc                                              18
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>22
gcgcccccgc ctaacctc                                              18

Claims (59)

1.包含以下全部或部分的分离的多核苷酸：
a)核苷酸序列SEQ ID NO.1，只要该核苷酸序列包含至少一个选自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a的SNP；或者
b)与a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO.1的615-2763位核苷酸，只要该序列包含至少一个选自g1644a、g2357a和c2621g的编码SNP。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸由至少10个核苷酸组成。
4.分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有选自至少一个D70N、G104S和S147C的编码SNP的多肽。
5.分离的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分的多肽，该多肽具有SNP G104S。
6.鉴定或扩增与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的方法，其包含该多核苷酸在合适的杂交条件下与权利要求1的多核苷酸杂交。
7.基因分型与核苷酸序列SEQ ID NO.1具有80-100％同一性的多核苷酸的全部或部分的方法，其包含以下步骤：扩增受试者或受试者群体基因组DNA的目的区域，并确定位于核苷酸序列SEQ ID NO.1至少一个下列位置的等位基因：465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g、g2634a。
8.权利要求7的方法，其中基因分型通过微型测序进行。
9.包含权利要求1的多核苷酸的重组载体。
10.包含权利要求9的重组载体的宿主细胞。
11.分离多肽的方法，其包含在培养基中培养权利要求10的宿主细胞，并从培养基中分离该多肽。
12.由权利要求1的分离的多核苷酸编码的多肽。
13.分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自D70N、G104S和S147C的编码SNP。
14.权利要求12的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193氨基酸、并具有至少一个选自D70N、G104S和S147C的编码SNP。
15.权利要求12的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193氨基酸、并具有SNP G104S。
16.包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物。
17.获得免疫特异性抗体的方法，其包含利用权利要求12的多肽免疫动物，并从该动物中收集所述抗体。
18.权利要求17的方法所产生的免疫特异性抗体。
19.在一种或多种待测化合物中鉴定活化或抑制分离多肽活性的试剂的方法，所述的分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自D70N、G104S和S147C的编码SNP，该方法包含：
a)提供包含权利要求9的重组载体的宿主细胞；
b)使该宿主细胞接触待测化合物，
c)确定对该多肽活性的活化或抑制作用，从而鉴定所述的活化或抑制剂。
20.在一种或多种待测化合物中鉴定其活性受分离多肽增强或抑制的试剂的方法，该分离的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自D70N、G104S和S147C的编码SNP，该方法包含：
a)提供包含权利要求9的重组载体的宿主细胞；
b)使该宿主细胞接触待测化合物，
c)确定对所述试剂活性的增强或抑制作用，从而鉴定所述的被增强或抑制的试剂。
21.分析受试者生物学特征的方法，其包含进行至少一个以下步骤：
a)确定受试者基因组中存在或缺少权利要求1的多核苷酸；
b)确定受试者中权利要求1的多核苷酸的表达水平；
c)确定受试者中存在或缺少由权利要求1的分离的多核苷酸所编码的多肽；
d)确定受试者中由权利要求1的分离的多核苷酸所编码多肽的浓度；或
e)确定受试者中由权利要求1的分离的多核苷酸所编码多肽的功能性。
22.包含选自以下的一种或多种化合物的治疗剂：
-包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分离的多核苷酸，只要该核苷酸序列包含至少一个选自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列；
-包含所述多核苷酸的重组载体；
-包含所述重组载体的宿主细胞；
-分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自D70N、G104S和S147C的编码SNP；
-包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193氨基酸、并具有SNPG104S的多肽的超糖基化类似物；以及
-所述多肽的特异性抗体。
23.用于预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管病、代谢病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及化学治疗相关疾病，该方法包含给予所述个体治疗有效量的权利要求22的治疗剂，和药物可接受的赋形剂。
24.权利要求23的方法，其中所述癌症和肿瘤包含转移的肾癌、黑色素瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
25.权利要求23的方法，其中所述代谢疾病包含非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
26.权利要求23的方法，其中所述传染病包含病毒性传染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
27.权利要求23的方法，其中所述中枢神经系统疾病包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症以及抑郁症。
28.权利要求23的方法，其中所述免疫和自身免疫相关疾病包含组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
29.权利要求23的方法，其中所述心血管疾病包括脑损伤和贫血，其中包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
30.预防或治疗个体选自创伤愈合和/或骨质疏松症的疾病的方法，包含给予该个体治疗有效量的权利要求22的治疗剂和药物可接受的赋形剂。
31.提高自体血液产生、特别是参与不同的自体血液采集程序的患者自体血液产生的方法，其包含给予该个体治疗有效量的权利要求22的治疗剂，和药物可接受的赋形剂。
32.提高或降低受试者中权利要求12的多肽活性的方法，其包含给予治疗有效量的一种或多种：包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分的分离的多核苷酸或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列，只要该核苷酸序列包含至少一个选自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP；包含该多核苷酸的重组载体；包含该重组载体的宿主细胞，其中该宿主细胞可能得自需要治疗的受试者；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自D70N、G104S和S147C的编码SNP的分离的多肽；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物；该多肽的特异性抗体，和药物可接受的赋形剂。
33.预防或治疗个体与该个体基因组中存在权利要求1的多核苷酸有关的病症或疾病的方法，其包含给予治疗有效量的一种或多种：包含核苷酸序列SEQ ID NO.1的全部或部分、并具有至少一个选自465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP的分离的多核苷酸，或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列；包含所述多核苷酸之一的重组载体；包含该重组载体的宿主细胞；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的全部或部分、并具有至少一个选自D70N、G104S和S147C的编码SNP的分离的多肽；包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193氨基酸、并具有SNP G104S的多肽的超糖基化类似物；所述多肽之一的特异性抗体，和药物可接受的赋形剂。
34.确定至少一个选自EPO基因465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的SNP与疾病或疾病抗性之间的统计学相关性的方法，该方法包含以下步骤：
a)对一组个体进行基因分型；
b)确定所述疾病或疾病抗性在该组个体中的分布；
c)将基因型数据与所述疾病或疾病抗性的分布作比较；以及
d)对上述比较进行统计学相关性分析。
35.诊断或确定疾病预后或疾病抗性的方法，其包含检测选自EPO基因465-486(缺失)、c577t、g602c、c1288t、c1347t、t1607c、g1644a、g2228a、g2357a、c2502t、c2621g和g2634a的至少一个SNP。
36.在一种或多种待测化合物中鉴定具有与G104S突变的EPO基因产物的活性基本类似或更高的生物活性的化合物的方法，该方法包含以下步骤：
a)确定该化合物的生物活性，例如对过表达人EPO受体的32D细胞系细胞增殖的刺激作用、对红系集落形成的刺激作用、和/或与人EPO受体的结合能力；
b)将由步骤a)确定的该化合物活性与G104S突变的EPO基因产物活性作比较。
c)根据步骤b)进行的比较确定该化合物是否具有与G104S突变的EPO基因产物相比基本类似或更高的活性。
37.权利要求36的方法，其中所述待测化合物鉴定自合成肽组合文库、高通量筛选、或通过计算机辅助药物设计而设计，以具有与SEQ ID NO.2的多肽、或与包含氨基酸序列SEQ ID NO.2的28-193位氨基酸的氨基酸序列相同的三维结构，只要该氨基酸序列包含G104S SNP。
38.通过权利要求36的方法鉴定的化合物。
39.用于预防或治疗个体疾病的方法，所述疾病选自癌症和肿瘤、传染病、性病、免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和病症、心血管病、代谢病、中枢神经系统疾病、胃肠疾病以及化学治疗相关疾病，其包含给予个体治疗有效量的权利要求38的药剂和药物可接受的赋形剂。
40.权利要求39的方法，其中所述癌症和肿瘤包含转移的肾癌、黑色素瘤、包含滤泡性淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的淋巴瘤、包含慢性淋巴细胞性白血病和慢性骨髓白血病的白血病、肝癌、颈癌、头癌和肾癌、多发性骨髓瘤、类癌瘤以及包含AIDS情况下的Kaposi肉瘤的伴随免疫缺陷出现的肿瘤。
41.权利要求39的方法，其中所述代谢疾病包含非免疫相关性疾病，例如肥胖症。
42.权利要求39的方法，其中所述传染病包含病毒性传染，包括慢性乙型和丙型肝炎以及HIV/AIDS、感染性肺炎以及性病，例如生殖器疣。
43.权利要求39的方法，其中所述中枢神经系统疾病包含阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、精神分裂症以及抑郁症。
44.权利要求39的方法，其中所述免疫和自身免疫相关疾病包含组织或器官移植排斥、变态反应、哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎。
45.权利要求39的方法，其中所述心血管疾病包括脑损伤和贫血，其中包括肾机能不全的透析患者的贫血以及慢性感染、炎性过程、放射治疗和化学治疗所致贫血。
46.预防或治疗个体创伤愈合和/或骨质疏松症疾病的方法，包含给予该个体治疗有效量的权利要求38的药剂和药物可接受的赋形剂。
47.提高自体血液产生、特别是参与不同的自体血液采集程序的患者的自体血液产生的方法，其包含给予该个体治疗有效量的权利要求38的药剂和药物可接受的赋形剂。
48.以具有与野生型人红细胞生成素至少相同的细胞增殖功能特征、并能够结合红细胞生成素受体的螺旋A、B、C和D为特征的分子，其螺旋B的氨基酸序列具有至少一个改变，以致与红细胞生成素受体结合的亲合力高于野生型人红细胞生成素。
49.提高具有野生型红细胞生成素螺旋B的相应部分、并能够结合红细胞生成素受体的红细胞生成素样分子的细胞增殖功能性的方法，其包含修饰该红细胞生成素样分子对应于野生型红细胞生成素螺旋B部分的氨基酸序列。
50.治疗性化合物，包含权利要求48的分子以及药物可接受载体。
51.治疗方法，包含给予患者治疗有效量的权利要求50的化合物。
52.提高具有螺旋A、B、C和D的野生型人红细胞生成素分子的功能性的方法，其包含修饰该分子或编码该分子的基因，从而改变螺旋B的氨基酸序列，以提高该分子与红细胞生成素受体结合的亲合力。
53.权利要求52的方法，其中改变了对应于SEQ ID NO.2中甘氨酸104的氨基酸。
54.权利要求53的方法，其中将对应于SEQ ID NO.2中甘氨酸104的氨基酸替换为丝氨酸。
55.通过权利要求52的方法产生的化合物。
56.通过权利要求53的方法产生的化合物。
57.通过权利要求54的方法产生的化合物。
58.通过权利要求49的方法产生的化合物，其中改变了对应于SEQ ID NO.2中甘氨酸104的氨基酸。
59.利用权利要求49的方法产生的化合物，其中将对应于SEQID NO.2中甘氨酸104的氨基酸替换为丝氨酸。
CNA028089421A 2001-04-04 2002-03-29 红细胞生成素基因的新的多核苷酸和多肽 Pending CN1849400A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR01/04603 2001-04-04
FR0104603A FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2001-04-04 Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
US60/343,163 2001-12-21
US60/345,440 2002-01-04
US60/358,598 2002-02-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1849400A true CN1849400A (zh) 2006-10-18

Family

ID=8861954

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028089421A Pending CN1849400A (zh) 2001-04-04 2002-03-29 红细胞生成素基因的新的多核苷酸和多肽

Country Status (4)

Country Link
US (2) US7041794B2 (zh)
CN (1) CN1849400A (zh)
FR (1) FR2823220B1 (zh)
ZA (1) ZA200307642B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106075447A (zh) * 2016-06-24 2016-11-09 中国人民解放军第二军医大学 一种epo受体及其在伴红细胞增多症的肝细胞癌中的应用
CN114606325A (zh) * 2022-01-11 2022-06-10 佛山科学技术学院 与牛血小板生成相关的snp标记位点与应用

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20030072737A1 (en) 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
FR2822845B1 (fr) * 2001-03-30 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides comportant des polymorphismes de type snp fonctionnels dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-21 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques
AU2003273615B2 (en) * 2002-06-11 2010-07-29 Brigham And Women's Hospital Neuroprotective synergy of erythropoietin and insulin-like growth factor
ES2343518T3 (es) * 2002-09-09 2010-08-03 Hanall Biopharma Co., Ltd. Polipeptidos interferon alfa modificados resistentes a proteasas.
OA13164A (en) * 2003-05-12 2006-12-13 Affymax Inc Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor.
KR101227666B1 (ko) * 2003-05-12 2013-01-31 아피맥스, 인크. 에리스로포이에틴 수용체에 결합하는 펩티드
WO2004100997A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly(ethylene glycol) -modified peptides
MXPA05012315A (es) * 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Compuestos poli(etilenglicol) modificados novedosos y usos de los mismos.
US7405043B2 (en) * 2004-06-29 2008-07-29 Vita Genomics, Inc. Responsiveness to therapy for liver disorders
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
EA200700990A1 (ru) * 2004-11-11 2008-04-28 Афимакс, Инк. Новые пептиды, которые связывают рецептор эритропоэтина
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
JP2010510794A (ja) 2006-11-28 2010-04-08 ハナル ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途
US20100028868A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-04 Yuchi Hwang Responsiveness to Therapy for Liver Disorders
US20120020974A1 (en) * 2008-10-17 2012-01-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Optimizing erythropoietin therapy
MX368067B (es) 2012-12-05 2019-09-18 Novartis Ag Composiciones y métodos para dirigir anticuerpos a la eritropoyetina (epo).
JP2018525389A (ja) 2015-08-12 2018-09-06 ノバルティス アーゲー 眼障害を治療する方法
WO2022159414A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 University Of Rochester Erythropoietin for gastroinfestinal dysfunction

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES498343A0 (es) 1980-01-08 1983-09-01 Biogen Nv Un metodo de producir un polipeptido que exhibe actividad inmunologica o biologica del interferon de leucocitos humanos.
CH651308A5 (de) 1980-07-01 1985-09-13 Hoffmann La Roche Interferone und deren herstellung.
US4414150A (en) 1980-11-10 1983-11-08 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
ES8302778A1 (es) 1980-11-10 1983-02-01 Genentech Inc Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral.
US4678756A (en) 1981-02-09 1987-07-07 Antek Instruments, Inc. Chemiluminescent sulfur detection apparatus and method
EP0062971B1 (en) 1981-03-27 1990-03-07 Imperial Chemical Industries Plc Genetically modified microorganisms
US4810645A (en) 1981-08-14 1989-03-07 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
US4801685A (en) 1981-08-14 1989-01-31 Hoffmann-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferon K and L
DK368882A (da) 1981-08-25 1983-02-26 Alan John Kingsman Expessions vektorer
US4975276A (en) 1982-01-15 1990-12-04 Cetus Corporation Interferon-alpha 54
US4973479A (en) 1982-01-15 1990-11-27 Cetus Corporation Interferon-α61
US4748233A (en) 1982-03-23 1988-05-31 Bristol-Myers Company Alpha-interferon Gx-1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
DE3220116A1 (de) 1982-05-28 1983-12-01 Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung
FR2541579B1 (fr) 1983-02-24 1987-12-18 Inst Organicheskogo Sinteza Ak Interferon n leucocytaire humain et procede d'obtention de celui-ci dans les cellules bacteriennes
IL71951A0 (en) 1983-06-01 1984-09-30 Hoffmann La Roche Polypeptides having interferon activity,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US4816566A (en) 1983-06-01 1989-03-28 Hoffmann-La Roche, Inc. Polypeptides having interferon activity
GB8315980D0 (en) 1983-06-10 1983-07-13 Biogen Nv Producing hybrid dna sequences
JPS6156199A (ja) 1984-08-27 1986-03-20 Shionogi & Co Ltd 新規ヒトインタ−フエロンα類
DE3685044D1 (de) 1985-02-01 1992-06-04 Ici Plc Analoge interferon-polypeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen.
US4885166A (en) 1985-06-11 1989-12-05 Ciba-Geigy Corporation Hybrid interferons
DE3607835A1 (de) 1986-03-10 1987-09-24 Boehringer Ingelheim Int Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
AU648214B2 (en) 1991-12-31 1994-04-14 Lucky Limited Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc.
US6153407A (en) * 1992-07-28 2000-11-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics
CN1057534C (zh) * 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6555343B1 (en) * 1999-05-07 2003-04-29 Genentech Inc. Chimpanzee erythropoietin (CHEPO) polypeptides and nucleic acids encoding the same
JP5480458B2 (ja) 1999-08-09 2014-04-23 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト 自己タンパク質分解切断によるタンパク質の製造
NZ522030A (en) 2000-05-15 2004-11-26 F Erythropoietin composition with a multiple charged inorganic anion i.e. a sulfate a citrate or a phosphate to stabilize the composition

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106075447A (zh) * 2016-06-24 2016-11-09 中国人民解放军第二军医大学 一种epo受体及其在伴红细胞增多症的肝细胞癌中的应用
CN106075447B (zh) * 2016-06-24 2018-07-10 中国人民解放军第二军医大学 一种epo受体及其在伴红细胞增多症的肝细胞癌中的应用
CN114606325A (zh) * 2022-01-11 2022-06-10 佛山科学技术学院 与牛血小板生成相关的snp标记位点与应用
CN114606325B (zh) * 2022-01-11 2024-03-15 佛山科学技术学院 与牛血小板生成相关的snp标记位点及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20060211618A1 (en) 2006-09-21
FR2823220B1 (fr) 2003-12-12
ZA200307642B (en) 2005-01-03
FR2823220A1 (fr) 2002-10-11
US20030050269A1 (en) 2003-03-13
US7041794B2 (en) 2006-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1849400A (zh) 红细胞生成素基因的新的多核苷酸和多肽
CN1094446A (zh) Eck受体配体
CN1531600A (zh) IFNα-21基因的新的多核苷酸和多肽
CN1509337A (zh) IFNα-17基因的新的多核苷酸和多肽
CN1170931C (zh) 血管发生相关分子
CN1390256A (zh) 新型蛋白质及其dna
CN1708589A (zh) Cns中crh应答基因
CN1765925A (zh) 肝癌中上调表达的两种新的人蛋白及其编码序列和另外二十种人蛋白在肝癌诊断中的新用途
CN1900279A (zh) 诱导细胞凋亡的多核苷酸及其编码的多肽和用途
CN1229386C (zh) 具有抑癌功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1199998C (zh) 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1209373C (zh) 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1708511A (zh) 对促肾上腺皮质激素释放激素刺激的应答而表达增加的基因
CN1222616C (zh) 具有抑癌功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1229387C (zh) 具有抑癌功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1169958C (zh) 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸
CN1249082C (zh) 促凋亡基因bnipl及其编码蛋白和用途
CN1199997C (zh) 具有促进小鼠nih/3t3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1194010C (zh) 具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白及基编码序列
CN1661069A (zh) 血管紧张素i转换酶基因与原发性高血压的相关性
CN1155616C (zh) 具有促进癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1169833C (zh) 具有抑癌功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1199994C (zh) 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1190446C (zh) 具有促进小鼠nih/3t3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列
CN1155614C (zh) 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication