CN1991365A - 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法 - Google Patents

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Abstract

一种控制HIV阳性病人化疗的方法，包括用一个序列，优选来自从病人获得的HIV pol基因的编码RT和蛋白酶的序列和已缺失该序列的HIV－DNA构建体转染对HIV感染敏感的细胞系，培养转染的细胞以产生嵌合病毒的原种，评价嵌合病毒对HIV pol基因编码的酶的抑制剂的表型敏感性并对其指定一个值，构建含有嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相应值的数据组，重复至少二个其它的抑制剂的敏感性评价从而构建总共至少三个该数据组，以二维或三维图解形式表示该数据组使各数据组中嵌合型和野生型敏感性之间的区别提供嵌合原种对所述抑制剂处理的抗性的肉眼测量值，根据所测量的抗性图示选择最适抑制剂。该方法经济而快捷地得到大量不同的HIV感染的病人的表型信息。该方法可应用于所有目前可得到的化疗方案且预期同样可应用于将来的化疗方案。

Description

根据人类HIV病毒株的表型药物敏感性控制HIV阳性病人化疗的方法
本申请为国际申请PCT/IB97/00071于1998年7月27日进入中国国家阶段、申请号为97191904.6、发明名称为“根据人类HIV病毒株的表型药物敏感性控制HIV阳性病人化疗的方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种控制HIV阳性病人化疗的方法，以及医生根据人类HIV病毒株对HIV pol基因的一种或多种酶的抑制剂的表型药物敏感性用于治疗该病人的临床控制仪器，以及同时确定HIV pol基因的二种或多种酶对其抑制剂的表型药物敏感性的方法。
背景技术
迄今，已形成了一些化疗方案用于治疗HIV感染的病人。其中某些方案已获批准用于临床，其余的则是不断进行的临床试验的主题。可以设想将被批准的化疗方案的数目在不久的将来将稳定地增加。而且，由于在治疗期间形成了药物抗性HIV变异体而使用组合治疗或多种药物治疗的方案持续增加。尽管已显示这些化疗方案对HIV疾病的病毒学(病毒负荷)，免疫学及临床参数产生影响，但是实践经验告诉我们这些影响是短暂的。特别是，发现了感染某个病人的HIV病毒株在很短的时间后开始表现出对治疗所述病人的药物和药物组合的敏感性降低。化疗的效力丧失情况随病人，药物或药物组合的不同而变化。已公认对特定类型的化疗的效力丧失与感染病人的HIV病毒株的基因组中氨基酸改变的基因型相关。这可能使得这些HIV病毒株对化疗的敏感性降低。由于HIV感染的病人在较长的时间内接受一些化疗方案，在感染的HIV病毒株基因组中出现更复杂的氨基酸改变形式，这导致目前对感染的病人的进一步治疗的理性探索失败。正如以前的解释所暗示的，可按常规确定涉及单个或多个抗HIV药物的不同化疗方案的HIV病毒株中出现的基因型改变，但因此更证实了从这些数据信息很难使负责安排化疗的医生确定开始或持续特定的化疗方案是否合理。换句话说，在有限规模上获得的基因型信息不能按常规翻译成使负责医生能对病人应优先进行何种化疗作出关键的决定的表型信息。对于被抗药性HIV病毒株感染的未用药的病人也存在该问题。
病毒负荷监测已变成HIV治疗的一个常规方面。然而，仅病毒负荷数不能用作决定单独或者结合使用何种药物的基础。
结合化疗越来越多地成为化疗方案的选择。当使用结合药物的病人开始经历药物失败时，不可能确切的知道哪一种药物在结合中不再有活性。人们不可能简单地替代所有的药物，因为目前可使用的药物数有限。而且如果替换全部化疗方案，可能会失去一种或多种对特定病人有活性的药物。另外，对于对特定抑制剂表现出抗性的病毒也可能表现出对其它抑制剂不同程度的交叉抗性。
因此，理想的是，每次进行病毒负荷试验并检测到病毒负荷增加时，也应进行药物敏感/抗性试验。除非形成了有疗效的治疗方案，HIV疾病的处理将仍需要这种试验。
目前确实存在确定表型方法，它基于从存在供体外周血单核细胞(PBMCs)的血浆的病毒分离和在所说细胞中的随后表型(Japour，A.J.等，(1993)抗微生物试剂和化疗；Vol.37，No.5，p1095-1101)。由AIDS临床试验组(ACTG)提倡的这种共同培养方法，特别是对于确定AZT(本文与叠氮胸苷/Retrovir同义(Retrovir是商标))抗性的表型，对于在常规基础上使用则是费时，昂贵且太复杂。
Kellam，P.和Larder，B.A.(抗微生物试剂和化疗，(1994)Vol.38，No.1，p23-30)已建立了表型重组病毒试验以评价HIV 1型分离株对逆转录酶(RT)抑制剂的药物敏感性。该方法允许经过将PCR产生的RT编码序列库同源重组进RT缺失的非感染性原病毒克隆，pHIVΔRTBstEII中来增殖活病毒。对两个在叠氮胸苷疗程期间的病人的分析表明该方案产生与原始感染的PBL DNA表现出完全相同的基因型和表型的病毒。然而，该方法涉及经过共同培养病人血浆或病人PBMCs与供体PBMCs分离病人病毒。这种以前的病毒培养可能改变了原始的病毒组成。而且，该方法尽管允许确定分离株对各种抑制剂的敏感性，但是不能给医生提供是继续目前的化疗方案还是改变疗法的信息。
另外，当仅研究pol基因的一种酶时，该方法不容易使其产生按常规涉及使用一种蛋白酶和两种RT抑制剂的组合疗法的常规表型评价。
在重组病毒试验中使用的嵌套式PCR(聚合酶链式反应)方法可产生的情况是重组病毒不能真实地反应所研究的感染病人的HIV病毒株的情况。该问题起因于DNA序列的同源性和在哺乳动物细胞中同源重组所需的最小同源量(C.Rubnitz，J.和Subramini，S.(1984)分子和细胞生物学Vol.4，No.11，p2253-2258)。因此，以重组病毒研究为基础的任何表型试验应努力保证尽可能多地扩增病人的物质且有最大的重组。
因此，采用的RNA提取和嵌套式PCR方法应确保病毒的遗传物质被扩增，使扩增的物质最大地反应在调查中病人的病毒遗传多样性。
因此，在目前的临床实践中迫切需要(a)迅速且按常规确定感染特定病人的HIV病毒株的表型药物敏感性，(b)把由此获得的数据处理成容易理解的信息，及(c)根据所述信息开始，继续或调整对所述病人实施的化疗。
本发明的公开内容
根据本发明的第一个方面，提供了一种控制HIV阳性病人HIV化疗的方法，包括用一个经过从病人的生物学材料的样品分离病毒RNA并逆转录所述pol基因的所需区域获得的HIV pol基因的序列和已缺失该序列的HIV-DNA构建体转染对HIV感染敏感的细胞系，培养所述转染的细胞以创造提供循环病毒抗性情况的指示的嵌合病毒的原种，评价所述嵌合病毒对HIV pol基因编码的所述酶的抑制剂的表型敏感性并对其指定一个值，构建含有所述嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相应值的数据组，重复至少二个其它的抑制剂的敏感性评价从而构建总共至少三个该数据组，以二维或三维图解形式表示该数据组使各数据组中嵌合型和野生型敏感性之间的区别提供嵌合原种对所述抑制剂处理的抗性的肉眼测量值，以及根据所测量的抗性图示选择最佳抑制剂。
根据本发明的方法经济而快捷地得到大量不同的HIV感染的病人的表型信息。该方法可应用于所有目前可用的化疗方案且预期同样可应用于将来的化疗方案。
根据本发明的方法给医生提供了病人HIV病毒株的表型数据，该数据可立即用于确定是否应开始，继续或调整特定的化疗方案。
优选的是，数据组在多边形或准圆形图上表示，该图含有：
(a)多个从原点放射延生的标准化轴，每个轴相应于一个数据组或抑制剂或其组合；
(b)轴被标准化使野生型HIV对各种抑制剂的敏感性值在各轴上相等，任选表示野生型HIV的数据点并连接起来形成规则多边形，其顶点在轴上，其中心由原点限定；
(c)在各轴上描绘出相应于所述轴的表示嵌合HIV原种对抑制剂敏感性值的数据点，任意连接嵌合数据点以形成规则或不规则的多边形，其形状表示嵌合原种对抑制剂范围的抗性。
多边形或准园形图提供的优点是根据表示病人嵌合HIV原种的多边形与表示野生型病毒株的多边形之间差异程度确定病人对许多药物的抗性。多边形的面积一般在某些区域比在其它区域差别更大，表明在每种情况下对其轴通过所述区域的抑制剂的抗性程度更大或更小。
因此，根据本发明的方法获得了嵌合HIV原种并提供了该原种对一定范围的抑制剂的抗性图谱。以这种方式该图谱或图形提供了以常规测量不能获得的该嵌合原种的一个方面的技术特征。
在一个优选的实施方案中，标准化轴互相间等角。
另外，优选的是，各轴具有对数刻度。
进而，优选的是，在嵌合多边形中如果表示了偏心数据点，则鉴定的抑制剂可假定其对病人具有很小或没有用处，而位于野生型多边形内，其上或靠近其外侧的数据点鉴定的抑制剂可假定其对病人具有很大的用处。
当最坏情况值与嵌合和野生型HIV一起表示时，通常不规则多边形包围嵌合和野生型多边形。上文使用的术语“偏心”的意义是指数据点位于离最坏边界相当近且离野生型多边形相当远。同样术语“靠近野生型多边形外侧”指与离最坏边界的距离相比离野生型多边形相当近。
上文所限定的方法限制的意义在于可测量的对抑制剂的抗性依赖于所用的抑制剂浓度的具体范围。还必须努力减小生物学可变性的影响。因此，需要获得最大抗性值或假定给定的抑制剂无效时最坏情况可测量的抗性值。该浓度，例如，100μM，一般是实践上可试验的最大浓度，但是也可从，例如，药理学，毒理学或药物动力学研究获得。对研究中病人的抗性水平与最大可测量的抗性的比较决定什么是研究中病人的明显抗性水平。在下文所述的线段图中可适当地显示最大可测量抗性和实际抗性。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述的三个或更多个数据组中的每一个还含有对所述抑制剂最坏情况可测量抗性的值，在所述的图示中表示所述的最坏情况值使嵌合原种的数据点可与野生型和最坏情况HIV相比，从而提供对特定情况中抑制剂相对值的评价。
用超过150个病人的样品进行的实验揭示了抗性形成与治疗史之间的密切关系，如下文在实施例中进一步所述。已发现了根据本发明获得的数据与经典病毒分离和表型确定技术之间的密切关系。
因此根据本发明的方法可用于个体化且更理性地控制HIV化疗。因此使用根据本发明的方法结合适当施用抗HIV药物应最终导致感染HIV病毒的病人得到更好的治疗并存活。
根据本发明的方法特别应用于个别病人已接受了许多不同的药物且护理医生不易解释其突变方式的情况。
根据本发明的另一个方面，提供了一种控制HIV阳性病人的HIV化疗的方法，它包括如下步骤：
(a)以上文所述的方法定期评价病人HIV病毒株的表型敏感性；
(b)用选定的抑制剂维持化疗，而病人的HIV病毒株保持对选定的化疗敏感；
(c)如果且当原始抑制剂的敏感性降低时，选择不同的抑制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于控制HIV阳性病人化疗的临床控制仪器，所述仪器带有如上文所限定的多个数据组的图示。
我们给根据本发明的临床控制仪器创造了术语“抗病毒图”(antivirogram)，且该术语在下文的说明书中使用。该仪器给医生提供了不同抑制剂相对变化和敏感性的清楚图示，可用于不同HIV感染的病人的临床控制。
优选的是，同时评价所述的嵌合病毒对HIV pol基因所编码的至少两个酶的抑制剂的表型敏感性。
在本发明的另一个方面，提供了一种测定病人中个体HIV病毒株对HIV pol基因编码的至少两个酶的抑制剂的表型药物敏感性的方法，它包括用一个经过从病人的生物学材料的样品分离病毒RNA并逆转录所述pol基因的所需区域获得的HIV pol基因的序列和已缺失该序列的HIV-DNA构建体转染对HIV感染敏感的细胞系，培养所述转染的细胞以创造提供循环病毒抗性情况的指示的嵌合病毒的原种，以及评价所述嵌合病毒对HIV pol基因编码的所述酶的抑制剂的表型敏感性。
所述来自pol基因的序列从其表型药物敏感性已被测定的病人获得的生物材料的样品中分离。许多种类的生物材料可用于分离所需序列。
因此，可从血浆，血清或选自精液和阴道液的无细胞体液选择生物材料。血浆是特别优选的且相对于上述现有技术所用的PBMCs的应用而言特别具有优势。
或者，生物材料可以是加入了RNA稳定剂的全血。
在另一个实施方案中，生物材料可以是选自脑组织或淋巴结组织，或活体解剖获得的其它组织的固体组织材料。
如下文所示，当诸如血浆的生物材料用于分离所需的序列时，可使用最小体积的血浆，典型地是大约100-250μl，更具体的是约200μl。
另外，优选所选的两种酶选自HIV RT，蛋白酶和整合酶。
以本来已知的方法，例如Boom，R.等的方法(临床微生物学杂志(1990)Vol.28，No.3，p495-503)根据本发明可较方便地分离病毒RNA。
如果是血浆，血清和无细胞体液，也可以使用Qiagen集团公司投放市场的QIAamp病毒RNA试剂盒。
优选的是，对HIV感染敏感的细胞系是CD4+T-细胞系。
另外，优选的是，CD4+T-细胞系是MT4细胞系或HeLa CD4+细胞系。
可使用诸如Perkin Elmer投放市场的GeneAmp逆转录酶试剂盒的商用试剂盒进行逆转录。
所需的病人pol基因的区域优选使用特定的下游引物逆转录。
如果需要逆转录的序列是编码逆转录酶或逆转录酶与蛋白酶的序列，则下游引物优选OUT3：5’-CATTGCTCTCCAATTACTGTGATATTTCTCATG-3’(SED ID NO：1)。
在特别优选的实施方案中，病人的HIV RT基因和HIV蛋白酶基因使用HIV-1特异性的OUT3引物和遗传改造的丧失了RNA酶H活性的逆转录酶进行逆转录，使待转录的总RNA转变成cDNA而不被降解。这种遗传改造的逆转录酶，Expand(Expand是商标)逆转录酶，可从Boehringer Mannheim GmbH获得。
Expand逆转录酶是一种RNA指导的DNA聚合酶。该酶是莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶(M-MuLV-RT)的遗传改造形式。RNA酶H序列内的点突变将RNA酶H活性降低到可检测的水平之下。使用该遗传改造的逆转录酶使得能够获得更大量的全长cDNA转录子。
逆转录后，使用PCR技术扩增转录的DNA。
优选的是，逆转录产物使用嵌套式PCR技术扩增。
优选的是，如果感兴趣的区域是RT区域，按Kellam，P.和Larder，B.A.(1994，出处同上)所述使用内部和外部引物来应用嵌套式PCR技术。当感兴趣的区域是跨越RT和蛋白酶基因的区域时，使用的特定引物优选是OUT3/IN3(下游)和RVP5(上游)的组合。
引物RVP5(Maschera，B.等，病毒学杂志，69，5431-5436)具有序列5’-GGGAAGATCTGGCCTTCCTACAAGGG-3’(SEQ ID NO：2)。
图3提供了扩增的图示且在实施例2中进行更详细的描述。
蛋白酶cDNA的扩增实际上涉及半嵌套式PCR方法，这从图3可明显地看出。
嵌套式PCR技术相对于已知的简单PCR技术的优势在于它能够获得最特异性的PCR产物。
然而，为了在PCR期间获得更高的保真性和产率，可利用热稳定性聚合酶的混合物(Barnes，W.M.(1994)美国科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A，)91，2216-2220)。这种聚合酶混合物可从BoehringerMannheim GmbH获得，即Expand(Expand是商标)高保真PCR系统。使用该系统我们获得了提高的敏感性，即比单独使用Taq聚合酶的常规PCR方法获得的高10倍或更高的敏感性。
当pol基因的区域是包括RT和蛋白酶基因的区域时，优选HIV-DNA构建体是RT和蛋白酶基因已缺失的构建体且是以保藏号LMBP3590于1996年11月8日保藏在Belgian Coordinated Collectionsof Microorganisms-BCCM LMBP-Collection的质粒pGEMT3ΔPRT。
然而，可采用一些研究产生含具有蛋白酶以及RT基因缺失的HIV-1原病毒的质粒。一种可能性是借助于寡核苷酸介导的诱变导入所需缺失。然而，下文实施例2中采用的方法涉及利用特定限制性酶和亚克隆方法产生所需构建体，如下文所述。尽管最终结果取决于可获得的限制性位点，但该方法的主要优势在于可迅速获得最终结果。
为了保证最有效的转染结果，被转染的PCR产物理想地应以本身已知的方式经阴离子交换旋转柱纯化。合适的试剂盒是Qiagen集团公司投放市场的QIAquick PCR纯化试剂盒。
转染可经电穿孔，或者另选经过使用脂类，特别是阳性脂类，DEAE葡聚糖，CaHPO4等实现。
在脂类转染的例子中，可利用荷兰的Invitrogen B.V.of Leek，投放市场的PERFECT(PERFECT是商标)转染试剂盒。
因此，为进行转染，已缺失了选自pol基因的一个或多个基因的HIV-DNA构建体用于与扩增后获得的产物连结。
如果缺失的只是RT基因，则构建体可以是质粒pHIVΔRT(可从医学研究理事会(MRC)获得)。当RT和蛋白酶基因都缺失时，合适的HIVDNA构建体是本文所述的质粒pGEMT3-ΔPRT，且它是高拷贝的载体。该质粒在转染前根据本身已知的方法线性化。
使用编码超过一个pol基因酶的构建体，例如ΔPRT构建体，的特殊优势在于在构建体中包括更多的原始病人物质的可能性比使用单个基因时更大，使扩增的物质更大程度地反映所研究的特定病人的病毒遗传多样性。
可以理解优选所选定的用于嵌套式PCR的特异性引物位于待扩增和研究的靶酶主体序列外侧。还可预料的是RT和蛋白酶的结合很可能比单独的RT提供更好的研究RT的结果，因为相对于仅用RT的情况病人产生了多出40个的氨基酸。为研究蛋白酶，应知道蛋白酶的前9个氨基酸仍来自构建体(pGEMT3-ΔPRT)的野生型骨架。
当通过电穿孔实现细胞的转染时，优化所选的参数以实现较好的细胞生长和病毒生产。以大约250μF和300V可较方便地进行电穿孔。优选的是，在大约10μg线型化质粒，例如pHIVΔRTBstEII和大约5μg扩增的PCR产物，例如RT PCR产物存在的条件下进行电穿孔。当成功地进行细胞内同源重组时，在5至10天内形成新嵌合HIV。在形成嵌合HIV前用已知技术的典型培养时间是12-14天。在-70℃或更低温度下储存培养上清等分试样。
显而易见的是，可使用上述方法分离和扩增其它HIV基因，例如整合酶基因，或一个以上的其它HIV基因，例如，RT和整合酶基因，且用各自的整合酶或RT/整合酶的PCR产物与缺失了相关基因(或多个基因)的合适的线型化的HIV-DNA构建体结合转染CD4+T细胞。
滴定新形成的嵌合病毒，然后分析其对不同pol基因酶抑制剂的表型敏感性(敏感性)，优选在自动的细胞基础试验中进行。
优选的是，嵌合病毒和野生型HIV病毒株(它是适当的重组野生型HIV病毒株)对一种或多种RT，蛋白酶或整合酶抑制剂的表型药物敏感性被表达为抑制剂浓度(IC值)。
嵌合病毒和野生型HIV病毒株对一种或多种RT抑制剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂和/或一种或多种整合酶抑制剂的敏感性表达为例如50％或90％的抑制剂浓度(IC50或IC90值)。
优选的是，RT抑制剂选自核苷RT抑制剂，例如AZT，ddI(2’，3’-双脱氧肌苷/Videx(Videx是商标))，ddC(2’，3’-双脱氧胞苷)，3TC(lamivudine)，d4T(双脱氧胸苷)，非核苷RT抑制剂，例如delavirdine(U9051125(BMAP)/Rescriptor(Rescriptor是商标))，loviride(α-APA)，nevirapine(B1-RG-587/Viramune(Viramune是商标)和tivirapine(8-C1-TIBO(R86183))，蛋白酶抑制剂，例如saquinavir，indinavir和ritonavir，整合酶抑制剂，例如咖啡酸苯基乙酯(CAPE)。
合适的RT和/或蛋白酶抑制剂和/或整合酶抑制剂选自核苷RT抑制剂，例如AZT，ddI，ddC，3TC，d4T，1592U89和类似物，非核苷RT抑制剂，例如loviride，nevirapine，delaviridine，ateviridine，和tivirapine(8-C1-TIBO)和类似物，蛋白酶抑制剂，例如saquinavir，indinavir和ritonavir和类似物，整合酶抑制剂，例如咖啡酸苯基乙酯(CAPE)以及在WO95/08540和GB2271566中所述类型的HIV整合酶抑制剂。
根据本发明的方法包括用一种或多种RT抑制剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂和/或一种或多种整合酶抑制剂比较病人HIV病毒株与野生型HIV病毒株的表型药物敏感性的步骤。为便于理解所试验的不同药物化合物(或组合)的敏感性相对变化的表示，构建了一种抗病毒图。
该图应解释如下：抗病毒图中的偏心数据点认定为不可能再有利于HIV感染的病人的化疗方案，而在参考多边形内或其上，或仅略微在参考多边形外的数据点认定为可能有利于HIV感染的病人的化疗方案。
根据本发明的方法与施用正确的抗HIV药物结合应最终导致更好的治疗，改进生活质量且提高HIV感染的病人的存活率；即，可防止或阻止无效治疗(由于存在或出现抗性HIV病毒株)，以及可即时开始有效化疗。
本发明还涉及医生用于治疗HIV感染的病人的临床控制仪器，它包括以上文所述的方法可获得的抗病毒图。
附图的简要描述
图1是质粒pGEMT3-ΔPRT之构建的图示；
图2是质粒pGEMT3-ΔPRT之构建的进一步和补充图示；
图3是含蛋白酶和RT基因的HIV-HXB2D序列的该部分的图示；
图4A-H是含蛋白酶和RT基因的HIV-HXB2D序列的该部分的完整序列；
图5是携带实施例5所述的3TC抗性HIV病毒株的病人的抗病毒图；
图6是携带实施例6所述的野生型HIV病毒株的未用药的病人的抗病毒图；
图7A是显示实施例7的病人药物敏感性相对变化的线段图；
图7B是实施例7的受试者病人的抗病毒图；
图8A是显示实施例8的病人药物敏感性相对变化的线段图；
图8B是实施例8的受试者病人的抗病毒图；
图9A是显示实施例9的病人药物敏感性相对变化的线段图；
图9B是实施例9的受试者病人的抗病毒图；
图10A是显示实施例10的病人药物敏感性相对变化的线段图；
图10B是实施例10的受试者病人的抗病毒图；
图11A是显示实施例11的病人药物敏感性相对变化的线段图；
图11B是实施例11的受试者病人的抗病毒图；
图12A是显示实施例12的病人药物敏感性相对变化的线段图；以及
图12B是实施例12的受试者病人的抗病毒图。
本发明将以下列实施例进一步说明。
实施本发明的方式
实施例1
方案
1.病毒RNA的提取和扩增。
RNA根据Boom，R.(1990，出处同上)所述的方法从100μl血浆中分离并按制造商所述用GeneAmp逆转录酶试剂盒(Perkin Elmer)及使用HIV-1特异性下游引物OUT3：5’-CATTGCTCTCCAATTACTGTGATATTTCTCATC-3’(SED ID NO：1)进行逆转录。按Kellam，P.和Larder，B.A.(1994，出处同上)所述用内部和外部引物对逆转录的RNA进行PCR。氯仿提取并在Centricon 100柱上离心或在阴离子交换旋转柱(Quiagen)上离心后，分离的PCR产物准备用于转染反应。
2.质粒的生产和分离。
在大肠杆菌中进行pHIVΔRT(MRC)质粒的生产。按制造商所述利用Qiagen柱从过夜培养物中分离质粒DNA。经过A260/280测量(在λ＝260和280nm时的光密度测量)以分光光度法测定分离的质粒产率。从500ml细菌培养物中获得了大约250μg超纯的质粒DNA。以限制性分析证实分离的质粒的同一性。随后用BstEII使分离的质粒线型化并再用经典的酚/氯仿提取纯化。
3.细胞的转染。
转染前以250,000个细胞/ml的密度传代培养MT4细胞(指数生长期)。沉淀细胞并以3.1 10E6个细胞/ml的浓度重悬于磷酸盐缓冲溶液中。每次转染使用0.8ml的部分(2.510E6个细胞/ml)。用Bio-Rad Gene脉冲仪，利用0.4cm的电极杯进行转染。在10μg线型化的pHIVΔRT质粒和大约5μgRT PCR产物存在的条件下以250μF和300V电穿孔细胞，随后在室温下培养30分钟。随后向细胞悬液中加入10ml新鲜培养基并在37℃下在5％CO2的加湿空气中进行培养。
4.转染细胞的培养和跟踪。
转染后7至10天期间，监测细胞的细胞致病作用(CPE)的表现。如果不存在，在不同烧瓶中传代培养细胞。随后转染细胞的培养上清液用于产生重组病毒的原种并以1.5ml的等分试样储存于-70℃。
5.来自病人病毒RNA的重组病毒的分析。
滴定新病毒后，在系列稀释的不同HIV抑制剂存在下将原种用于抗病毒实验。以MT4细胞中病毒的有限系列稀释滴定测定收获的上清液滴定度。
具有有用滴定度的病毒用于抗病毒实验。为达到该目的，用100μl完全培养基充满96-孔微滴定板。随后以25μl的体积将化合物储液加入系列重复孔中。每种药物(或药物组合)包括HIV-和伪-感染的细胞样品。然后将指数生长的MT4细胞以150,000个细胞/ml的密度转移到微滴定板上。然后将细胞培养物在37℃下在5％CO2的加湿空气中培养。感染5天后，以在下文第6部分所述的MTT方法(Pauwels，R.等，病毒学方法杂志(1988)，20：309-321)经分光光度法测定伪感染和HIV感染的细胞的存活。
6.MTT测定。
向微滴定板的每孔中加入20μl的MTT溶液(以7.5mg/ml溶于PBS中)。平板在37℃再培养1小时。然后取出150μl培养基而不扰乱含甲
晶体的MT4细胞簇。经过加入100μl在酸化异丙醇(每升溶剂5ml浓HCL)中的5％Triton X-100实现甲晶体的溶解。将平板在平板摇床上放置10分钟后获得甲晶体的完全溶解。最后在两个波长(540和690nm)下读取吸光率。从这些光密度(OD)数据产生50％抑制(IC50)和50％细胞毒性(CC50)浓度。
实施例2
具有HIV-1蛋白酶和逆转录酶基因缺失的pHIVΔRTBstEII变异体的构建
重复实施例1所述的方案，除了感兴趣的HIVpol基因的序列是编码RT和蛋白酶的序列且制备的构建体是下文所述的pGEMT3-ΔPRT。相对于实施例1所述程序的其它修改在下文列出。
为了扩增病毒RNA，用OUT3引物再进行从RNA逆转录成DNA。然而，为了进行嵌套式PCR程序，所用的引物如图3所示。因此，该嵌套式程序在效果上是半嵌套式PCR程序。
pGEMT3-ΔPRT的生产和分离
最终的pGEMT3-ΔPRT构建体是pGEM9-Zf(-)(Promega)的衍生物。
简单地说，经过将所需的插入片断HIV-HXB2(蛋白酶和逆转录酶缺失的原病毒HIV-1克隆，包括侧翼的人序列)导入载体pGEM9-Zf(-)的Xbal限制性位点来构建pGEMT3-ΔPRT构建体。原病毒基因组从蛋白酶基因内的AhdI位点(围绕9号氨基酸)到pHIVΔRT BstEII构建体(MRC保藏参考：ADB231)的BstEII位点已缺失。SmaI和BstEII位点位于ΔProRT缺失的接头处，它们可用于在转染前将原病毒构建体线型化。pGEMT3-ΔPRT的构建在图1和图2中图示。在500ml细菌培养物中，pGEMT3-ΔPRT的产率是大约1mg。
如上文所述，质粒pGEMT3-ΔPRT以保藏号LMBP3590于1996年11月8日保藏在Belgian Coordinated Collections ofMicroorganisms-BCCM LMBP-Collection。
意想不到的是将原病毒基因组导入另一载体(pGEM9-Zf(-)代替pIB120)会引起主要问题。pIB120是pEMBL8(-)的衍生物(根据柯达科学成相系统提供的信息)，且pGEM9-Zf(-)是相似载体。然而原病毒载体pIB120HIV在recA+大肠杆菌宿主细胞中可能不稳定(Maschera，B.等，病毒学杂志，(1995)，69，5431-5436)。因此每次新制备质粒后应证实pGEMT3-ΔPRT构建体的稳定性。
HIV-HXIB2序列
HIV-HXB2D序列内感兴趣的区域(核苷酸1800-4400)在图3(示意图)和图4(完全序列)中表示。还显示了一些基因，限制性位点，引物和缺失(ΔPro，ΔRT，ΔProRT)的位置。
HIV-1的序列(分离株HXB2，参考基因组，9718bp)从国家生物技术信息中心(NCBI)，国家医学实验室，国家卫生所经ENTREZ文件检索系统获得。
Genbank名称：HIVHXB2CG
Genbank登记号：3455
NCBI Seq.ID No：327742
重组区域：
与RVP5和OUT3/IN3引物产生的RT-PCR片断组合，pGEMT3-ΔPRT载体可用于按实施例1，第3部分所述转染MT4细胞。ΔProRT 5’-端的重组区域含188个核苷酸。ΔProRT 3’-端的重组区域与以前所述(Kellam，P.和Larder，B.A.(1994)，出处同上)相似且含有130个核苷酸。
这些重组区域的长度并不是不重要的。以前的资料(Bandyopadhyay，P.K.等，美国科学院学报，(1984)81，3476-3480；Rubnitz，J.和Subramani，S.(1984)出处同上)证实当序列同源性从214减少到163个碱基对时，重组频率减少10倍。而且在电穿孔的细胞内应发生足够的重组事件以保证产生的病毒表型可靠地反映所治疗的HIV阳性病人中存在的类似种类。可经过调节用于电穿孔靶细胞的线型化原病毒载体与RT-PCR片断的比率首先实现重组事件的最优化。因此具有典型结果的标准方法以前由Kellam，P.和Larder，B.A.(1994出处同上)描述。结果确定将大约2μg的PCR产物(与10μg载体)的起始输入量增加到大约5μg或更多。其结果是在转染的细胞培养物中反映出更快的可见病毒生长表现(细胞致病作用)。
重组事件最优化的另一选择是设计产生更长重组序列的引物。
然而，转染反应中的实际输入量常常取决于PCR后的产率。一些样品具有较高的产率，结果在转染反应中具有更高的扩增物质输入量(具有更好的重组效率结果)。然而，尽管重组效率更低，当也可转染具有较低产率的样品且样品会产生具有可信反映病毒群体的活病毒。
实施例3
用于ProRT序列RT-PCR的选择引物
相对于实施例2中所用的引物设计了新的引物且应在ProRT区域的5’和3’端都产生更长的重组序列。在各自区域的5’和3’端设计了两个引物以允许进行嵌套式PCR。如图3和图4所示，设计各自的引物时考虑到在ProRT区域的5’端存在直接重复。新的引物如下：
A PRTO-5：5’-GCCCCTAGGA-AAAAGGGCTG-TTGG(SEQID NO：3)
B PRTI-5：5’-TGAAAGATTG-TACTGAGAGA-CAGG(SEQ IDNO：4)
C PRTI-3：5’-GATATTTCTC-ATGTTCATCT-TGGG(SEQ IDNO：5)
D PRTO-3：5’-AGGTGGCAGG-TTAAAATCAC-TAGC(SEQ IDNO：6)
实施例4
另一ΔProRT载体的构建
如上所述，以寡聚核苷酸介导的诱变可实现另一ProRT缺失的载体的构建。然而也可将ProRT缺失从目前的3’-端扩大到RT基因中的下一个KpnI位点(再向下游的40个碱基对)。Klenow处理的KpnI位点与Klenow处理的BstEII位点的连接可恢复起始BstEII识别序列。这样，该另选的载体行为相似于实施例2所述的pGEMT3-ΔPRT载体，但具有略大的RT缺失。
实施例5
从1989年12月到未提供文件记载的后期接受AZT及转换成从1994年2月到1995年10月接受AZT+3TC(1∶1)的组合化疗的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照上文实施例1所述的方案测定其对多种RT抑制剂的敏感性。重组野生型HIV病毒株recIIIB在所述的方案中用作参考HIV病毒株。表1显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。抗病毒图在图5中显示。
表1
  药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1   试验2   平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
  loviridetivirapineAZT3TCd4TddIddCAZT+3TC(1∶1)   0.10.0190.00131.60.072.00.20.001   0.120.0180.0021000.490.80.20.001   0.110.0190.00265.80.061.40.20.001   0.050.010.0040.560.122.830.380.002   21.50.41180.50.50.50.5
从这些数据可确定用3TC的单一疗法不可能有利于该特定病人。然而，AZT+3TC的组合疗法(目前的疗法)仍可能产生正面效果。
实施例6
未用药的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照上文实施例1所述的方案测定其对多种RT抑制剂的敏感性。重组野生型HIV病毒株recIIIB在所述的方案中用作参考HIV病毒株。表2显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。制备了抗病毒图并在图6中显示。
表2
  药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1   试验2   平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
  3TCddIddCAZTd4TAZT+3TC(1∶1)ddC+D4T(1∶1)3TC+d4T(1∶1)   1.813.071.450.041.310.050.620.42   2.024.471.470.050.970.040.440.44   1.913.771.460.051.140.050.530.43   3.088.582.210.061.740.020.771.11   10.4111310.4
从这些数据可确定病人被非常相似于野生型HIV的HIV病毒株感染。没有一个药物方案被排除，因此可用诸如AZT的具有阳性记录的药物开始化疗。
实施例7
未用药的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照实施例1所述的方案测定其对多种RT抑制剂的敏感性。重组野生型HIV病毒株recIIIB用作参考HIV病毒。表3显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。显示药物敏感性的相对变化的线段图在图7A中表示。还制备了抗病毒图并在图7B中显示。
表3
  药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1   试验2   平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
  AZT3TCddIddCd4Tloviridetivirapine   0.0522.1730.4751.0421.1420.0350.042   0.050ND0.4291.3891.6570.0250.049   0.0512.1730.4521.2161.3990.0300.046   0.0231.3810.6481.6161.3680.0240.021   220.70.8112
从这些数据可确定病人被非常相似于野生型HIV的HIV病毒株感染。没有一个药物方案被排除，因此可用诸如AZT，3TC或其它具有阳性记录的药物开始化疗。
实施例8
具有包括AZT，3TC和loviride治疗史的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照实施例1所述的方案测定其对许多RT抑制剂的敏感性。重组野生型HIV病毒株recIIIB用作参考HIV病毒。表4显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。显示药物敏感性的相对变化的线段图在图8A中表示。还制备了抗病毒图并在图8B中显示。
表4
  药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1   试验2   平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
  AZT3TCddIddCd4Tloviridetivirapine   18.264＞100.00026.8619.2907.500＞100.0001.626   22.251＞100.00015.4358.5067.097＞100.0001.604   20.257＞100.00021.1488.8987.298＞100.0001.615   0.0846.3041.5861.9315.4650.0370.021   241＞161351＞271778
从这些数据可确定病人被表现出对大多数所检查的核苷和非核苷抗逆转录病毒的药物的敏感性降低的HIV病毒株感染。仍可用D4T或DDC开始治疗。可考虑在治疗中包括蛋白酶抑制剂的可能性。
实施例9
具有包括多种核苷类似物RT-抑制剂治疗史的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照实施例1所述的方案测定其对许多RT抑制剂的敏感性。重组野生型HIV病毒株recIIIB用作参考HIV病毒。表5显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。显示药物敏感性的相对变化的线段图在图9A中表示。还制备了抗病毒图并在图9B中显示。
表5
  药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1  试验2   平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
  AZT3TCddIddCd4Tloviridetivirapine   ＞100.000＞100.000＞100.00060.079＞100.0000.0640.052  ND＞100.000＞100.00073.049＞100.0000.0580.043   ＞100.000＞100.000＞100.00066.564＞100.0000.0610.048   0.29116.6704.7573.44412.0300.0650.042   ＞344＞6＞2119＞80.91
从这些数据可确定病人被表现出对所有核苷类似物抗逆转录病毒的药物的敏感性降低的HIV病毒株感染。非核苷抗逆转录病毒药物应未从治疗中排除。这里也可考虑在治疗中包括蛋白酶抑制剂的可能性。
实施例10
未用药的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照实施例1所述的方案测定其对许多RT抑制剂和蛋白酶抑制剂的敏感性。重组野生型HIV病毒株recIIIB用作参考HIV病毒。表6显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。显示药物敏感性的相对变化的线段图在图10A中表示。还制备了抗病毒图并在图10B中显示。
表6
  药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1   试验2   平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
  AZT3TCsaquinavirritonavirindinavir   0.0191.5250.0030.0220.013   0.0191.7180.0030.0170.013   0.0191.6220.0030.0190.013   0.0414.6080.0060.0330.016   0.50.40.40.60.8
从这些数据可确定病人被非常相似于野生型HIV的HIV病毒株感染。没有一个药物方案被排除，因此可用诸如AZT，3TC或其它具有阳性记录的药物开始化疗。
实施例11
具有包括RT和蛋白酶抑制剂治疗史的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照实施例1所述的方案测定其对许多RT抑制剂和蛋白酶抑制剂的敏感性。重组野生型HIV病毒株recIIIB用作参考HIV病毒。表7显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。显示药物敏感性的相对变化的线段图在图11A中表示。还制备了抗病毒图并在图11B中显示。
表7
 药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1   试验2   平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
 AZT3TCsaqumavirritonavirindinavir   ND＞100.0000.0141.1980.229   0.01593.9620.0151.7390.416   0.01596.9810.0141.4680.323   0.0475.1780.0120.0620.027   0.31912412
从这些数据可确定病人被表现出对RT抑制剂3TC和蛋白酶抑制剂indinavir及ritonavir敏感性降低的HIV病毒株感染。因此可用诸如AZT或saquinavir的具有阳性记录的药物调节化疗。
实施例12
具有包括RT和蛋白酶抑制剂治疗史的HIV感染的病人捐赠出血浆，按照实施例1所述的方案测定其对许多RT抑制剂和蛋白酶抑制剂的敏感性。表8显示了测量的IC50值(μM)和所述值的比率。显示药物敏感性的相对变化的线段图在图12A中表示。还制备了抗病毒图并在图12B中显示。
表8
  药物   抗-HIV-1的活性IC50(μM)
  试验1   试验2  平均(1)   recIIIB ref(2)   比率(1)/(2)
  AZT3TCsaqumavirritonavirindinavir   3.833＞100.0000.3501.6100.124   3.355＞100.0000.3521.530ND  3.594＞100.0000.3511.5700.124   0.0414.6080.0060.0330.016   882256478
从这些数据可确定病人被表现出对RT抑制剂3TC及AZT和蛋白酶抑制剂indinavir，ritonavir及saquinavir的敏感性降低的HIV病毒株感染。
实施例13
表型与基因型的相对比较
从接受非核苷RT抑制剂(NNRTI)长期单一治疗的HIV感染的个体获得血浆样品。按实施例1所述提取HIV-RNA，逆转录并扩增。从阳性样品的外部PCR物质开始，扩增RT基因的前785个核苷酸且该物质进一步用于测基因型。
简单地说，使用来自Amersham(目录号RPN2438)带有7-deaze-dGTP的TermoSequenase(TermoSequenase是商标)荧光标记的引物循环测序试剂盒对该785个核苷酸的片断进行循环测序反应。选择4个测序引物使得在RT基因核苷酸27至核苷酸681的两个方向进行序列测定，这些引物用于每个样品。反应物在ALF(ALF是商标)自动测序仪(Pharmacia)上分析。产生的序列输出到Power Macintosh上并用GeneWorks 2.5软件(牛津分子集团公司)进一步分析。将所得的氨基酸序列与实验室HIV-1克隆HXB2D的相应序列及病人物质中鉴定的抗性相关突变进行比较。结果在表9中显示，其中使用单字母氨基酸代码。
表9
  P   抗性相关性突变   抗性倍数
  M41   D67   K70   A98   K101   K103   V108   E138   Y181   M184   G190   T215   K219   AZT   3TC   NNRTI1   NNRTI2
  1   N   1   1   56   437
  2   S   1   0.4   102   53
  3   N   0.4   1   36   87
  4   0.3   0.1   1   0.4
  5   1   0.4   4   3
  6   N   1   0.3   103   245
  7   S   1   0.04   112   57
  8   N   1   1   30   81
  9   C   2   1   ＞1432   12
  10   N   0.4   0.1   53   172
  11   L   N   R   N   V   F   Q   94   ＞8   321   669
  12   L   Y   28   2   1   3
  13   E   K/N   A   G/A   NotDet   1   1   ＞1466   455
  14   N   1   1   93   349
  15   N   2   1   ＞2424   449
  16   N   V   1   ＞8   21   115
  17   N   1   1   29   102
  18   S   1   1   95   181
  19   N   1   1   78   260
  20   G   0.4   1   22   25
  21   N   1   0.4   47   68
  22   I   1   0.4   3   3
  23   N   0.2   0.2   9   9
  24   Q   1   1   7   59
P＝病人
表9的顶行显示了在野生型序列中发现的氨基酸(AA)序列及其位置。在下面各行中显示了各病人在这些位置上的氨基酸改变。仅显示了在病人物质中观察到改变的位置。表9的右部分表示对各病人样品以根据本发明的方法测定的对不同RT抑制剂的抗性倍数。NNRTI1是给病人施用的非核苷RT抑制剂。NNRTI2是另一个非核苷RT抑制剂，观察到它与第一个具有一定程度的交叉抗性。
对于核苷类似物RT抑制剂的抗性的基因型测定结果如下：
-M41L，D67N，K70R，T215F/Y和K219Q/E是AZT抗性相关性突变(Larder，B.和Kemp，S.(1989)，科学246，1155-1158；Kellam，P.等PNAS89，1934-1938)。其在从病人物质分离的HIV基因组中单独或以不同组合的存在与产生的抗病毒图(病人11和12)确定的表型抗性相关。
-同样适用于与M184V突变相联系的对3TC的抗性(Tisdale，M.等(1993)PNAS90，5653-5656)，仅在显示出对该药物的表型抗性的病人(病人11和16)中观察到该突变。
关于NNRTIs抗性的基因型测定结果如下：
-三个病人(3，4和12)没有与突变相关的NNRTI抗性且在表型上对该药物敏感。
-大多数显示出对NNRTIs的表型抗性的病人具有与在位置103突变(K103N/S)相关的NNRTI抗性。
-一个病人(9)具有与突变相关的Y181C NNRTI抗性且显示出对NNRTI1的高表型抗性(＞1432倍)。
-病人13具有一些与突变相关的NNRTI抗性(K101E，部分K103N和部分G190A)。该病人也显示出对NNRTI1的高表型抗性(＞1466倍)。在该样品中观察到的E138A突变至今未与抗性相联系。然而，在这一相同位置的另一突变，即，E138K，已证实在对TSAO化合物的抗性中起重要作用(Balzarini，J.等，(1993)PNAS 90，6952-9656)。E138A突变的作用仍需测定。
-病人20具有与突变相关的A98G NNRTI抗性且显示出对所试验的NNRTIs的表型抗性。
-病人22具有与突变相关的V108I NNRTI抗性但不显示出对所试验的NNRTIs的任何表型抗性。
-病人24显示出没有与突变相关的NNRTI抗性(在一些HIV-1野生型基因组中发现K101Q突变)但对所试验的NNRTIs具有表型抗性。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)名称：VIRCO N.V.
(B)街道：Drie Eikenstraat 661
(C)城市：Edegem
(E)国家：比利时
(F)邮编(ZIP)：B-2650
(A)名称：DE BETHUNE，Marie-Pierre
(B)街道：Tweeleeuwenstraat 15
(C)城市：Everburg
(E)国家：比利时
(F)邮编(ZIP)：B-3078
(A)名称：HERTOGS，KURT
(B)街道：Sint Vincentiusstraat 53
(C)城市：Antwerpen
(E)国家：比利时
(F)邮编(ZIP)：B-2018
(A)名称：PAUWELS，Rudi
(B)街道：Damstraat 166
(C)城市：Weerde
(E)国家：比利时
(F)邮编(ZIP)：B-1982
(ii)发明名称：根据人类HIV病毒株的表型药物敏感性控制HIV阳性病人化疗的方法
(iii)序列数：6
(iv)计算机可读形式：
(A)媒体类型：Floppy软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)
(vi)在先申请资料：
(A)申请号：EP 96200175.6
(B)申请日：1996年1月26日
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：33个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假定：无
(vi)原始来源：
(A)生物：人类免疫缺陷病毒1型
(xi)SEQ ID NO：1的序列描述：
CATTGCTCTC CAATTACTGT GATATTTCTC ATG
(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假定：无
(vi)原始来源：
(A)生物：人类免疫缺陷病毒1型
(xi)SEQ ID NO：2的序列描述：
GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG
(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假定：无
(vi)原始来源：
(A)生物：人类免疫缺陷病毒1型
(xi)SEQ ID NO：3的序列描述：
GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG TTGG
(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假定：无
(vi)原始来源：
(A)生物：人类免疫缺陷病毒1型
(xi)SEQ ID NO：4的序列描述：
TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG
(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假定：无
(vi)原始来源：
(A)生物：人类免疫缺陷病毒1型
(xi)SEQ ID NO：5的序列描述：
GATATTTCTC ATGTTCATCT TGGG
(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假定：无
(vi)原始来源：
(A)生物：人类免疫缺陷病毒1型
(xi)SEQ ID NO：6的序列描述：
AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC

Claims (4)

1.一种临床控制系统，用于控制HIV阳性病人的HIV化疗，所述系统包括在多边形或准圆形图上图示多个数据组，其中所述数据组的生成方法是以来自HIV pol基因的序列和已缺失该序列的HIV-DNA构建体体外转染对HIV感染敏感的细胞系，所述序列通过从病人的生物学材料的样品分离病毒RNA并逆转录所述pol基因的所需区域而获得的；培养所述转染的细胞以产生嵌合病毒的原种，评价所述嵌合病毒对HIV pol基因编码的所述酶的抑制剂的表型敏感性并对其指定一个值，构建含有所述嵌合病毒敏感性值及HIV嵌合野生型病毒株的相应值的数据组，重复至少二个其它抑制剂的敏感性评价从而构建总共至少三个该数据组，以二维或三维图解方式图示该数据组，由此
(a)多个从原点放射延伸的标准化轴，每个轴相应于一个数据组或抑制剂或其组合；
(b)轴被标准化使野生型HIV对各种抑制剂的敏感性值在各轴上相等，任选表示野生型HIV的数据点并连接起来形成规则多边形，其顶点在轴上，而其中心由原点限定；
(c)在各轴上描绘出相应于所述轴的表示嵌合HIV原种对抑制剂敏感性值的数据点，任意连接嵌合数据点以形成规则或不规则的多边形，其形状表示嵌合原种对一定范围的抑制剂的抗性；以便各数据组中嵌合型和野生型敏感性之间的区别提供嵌合原种对所述抑制剂处理的抗性的肉眼测量值。
2.根据权利要求1的临床控制系统，其中各轴上有对数刻度。
3.根据权利要求1或2的临床控制系统，其中在嵌合多边形中如果表示了偏心数据点，则认定的抑制剂可认为其对病人具有很小或没有用处，而位于野生型多边形内，其上或靠近其外侧的数据点认定的抑制剂可认为其对病人具有实质性用处。
4.根据前面任一权利要求的临床控制系统，其中所述的三个或更多个数据组中的每一个还含有对所述抑制剂最坏情况可测量抗性的值，在所述的图示中表示所述的最坏情况值，使嵌合原种的数据点可与野生型和最坏情况HIV相比，从而提供对特定情况中抑制剂相对值的评价。
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