DE10061968A1

DE10061968A1 - Vitrification of cornea, employs tissues of rear cornea lamellae including the stroma, Descemet membrane and endothelium

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Publication number: DE10061968A1
Application number: DE2000161968
Authority: DE
Inventors: Friedrich Hoffmann; Dirk Hincha; Christian Meltendorf
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-12-13
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2002-06-20

Abstract

Tissues of the rear cornea (1) lamellae are used for vitrification, comprising sections of the stroma (supportive tissue), Descemet's membrane and the endothelium (inner lining). An Independent claim is also included for corresponding vitrification apparatus for corneal tissue.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vitrifikation von Hornhautgewe be, wobei das Hornhautgewebe in einem Behälter mit einer Vitrifikati onslösung auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei der das Hornhaut gewebe vitrifiziert.The invention relates to a method for vitrification of corneal tissue be, the corneal tissue in a container with a vitrificati solution is cooled to a temperature at which the cornea vitrified fabric.

Gegenwärtig sind Erkrankungen, die eine Narbenbildung oder Trübung der Hornhaut bedingen, weltweit die häufigste Ursache für eine Erblin dung. Mit einer Hornhauttransplantation ist bei einem großen Teil die ser Patienten eine Erblindung vermeidbar. Der Mangel an Spender- Hornhäuten erklärt den großen personellen und technischen Aufwand, der betrieben wird, um jede zur Verfügung stehende Hornhaut zu transplantieren. Die Auswahl und Einbestellung eines geeigneten Empfängers, die serologischen Untersuchungen zum Ausschluß über tragbarer Erkrankungen durch die Transplantation und die weiteren Vorbereitungen für die Operation machen eine Lagerung der Hornhäute unumgänglich. Mit den heute zur Verfügung stehenden Konservie rungsmöglichkeiten ist eine Lagerung von maximal vier Wochen mög lich.At present there are diseases that cause scarring or clouding cause the cornea, the most common cause of an Erblin worldwide dung. With a corneal transplant, that's a big part this patient avoidable blindness. The lack of donor Corneas explains the great human and technical effort, which is operated to close every available cornea transplant. Choosing and ordering a suitable one Recipient, the serological examinations to exclude portable diseases through the transplant and the others Preparations for the operation make storage of the corneas unavoidable. With the conservie available today storage options for a maximum of four weeks is possible Lich.

Die Gefrierkonservierung stellt von allen Konservierungsverfahren als einzige die Möglichkeit einer unbegrenzten Lagerung von Organen in Aussicht. Die Lagerung einer Spenderhornhaut in flüssigem Stickstoff bei -196°C sorgt für einen effektiven Stillstand aller Stoffwechselvor gänge. Bei solchen Temperaturen laufen die normalen zellulären che mischen Reaktionen nicht ab, da das Energieniveau zu niedrig ist, um die für einen Ablauf der Reaktion ausreichende molekulare Bewegung zuzulassen.Freeze preservation is considered by all preservation processes only the possibility of unlimited storage of organs in View. Storage of a donor cornea in liquid nitrogen at -196 ° C ensures an effective shutdown of all metabolism transitions. At such temperatures the normal cellular che run do not mix reactions because the energy level is too low to the molecular movement sufficient for the reaction to proceed permit.

Allerdings gehört die Hornhaut zu den Organen, für die trotz zahlreicher Untersuchungen bisher keine geeignete Methode zur Gefrierkonservie rung entwickelt wurde. Dabei bietet die Hornhaut den großen Vorteil, daß die Einfrierbedingungen ganz auf die Bedürfnisse des innenliegen den Hornhautendothels abgestimmt werden können, da die anderen Bestandteile der Hornhaut - von außen nach innen Epithel, Bowman- Membran, Stroma, Descemet-Membran - entweder gegenüber dem Einfrierprozeß unempfindlich sind (Stroma) oder durch einwandernde Zellen des Empfängers nach der Transplantation ersetzt werden (Epit hel). Es gibt zudem Hinweise, daß die Gefrierkonservierung der Horn haut zu einer Abnahme der Immunogenität des Gewebes führt. Dies wäre neben der zeitlich unbegrenzten Lagerung ein weiterer Anreiz zur Etablierung eines Verfahrens zur Kryo- bzw. Gefrierkonservierung.However, the cornea is one of the organs for which, despite numerous Studies to date have not been a suitable method for preserving frozen foods tion was developed. The cornea has the great advantage that the freezing conditions are entirely based on the needs of the interior the corneal endothelium can be tuned as the others Components of the cornea - from outside to inside epithelium, Bowman- Membrane, stroma, Descemet membrane - either opposite Freezing process are insensitive (stroma) or by immigrants Cells of the recipient are replaced after the transplant (Epit hel). There is also evidence that cryopreservation of the horn skin leads to a decrease in the immunogenicity of the tissue. This would be a further incentive in addition to the unlimited storage Establishment of a cryopreservation process.

Die ersten Versuche zur Gefrierkonservierung von isolierten Hornhäu ten bei -196°C wurden in den sechziger Jahren entwickelt, wobei lang same Einfrierraten unter Einsatz von Gefrierschutzmitteln bzw. Kryo protektoren verwendet wurden. Unter Kryoprotektoren (cryoprotective agents; CPA's) versteht man Chemikalien, die das Überleben von Zel len während des Einfrier- und Auftauprozesses fördern. Insbesondere regulieren oder verhindern sie eine Bildung von Eiskristallen, die für die Zelle letal wären. The first attempts at freezing preservation of isolated corneas at -196 ° C were developed in the 1960s, although long same freezing rates using antifreeze or cryo protectors were used. Among cryoprotectors (cryoprotective agents; CPA's) are chemicals that are essential for the survival of Zel promote len during the freezing and thawing process. In particular regulate or prevent the formation of ice crystals that are responsible for the Cell would be lethal.

Alle Kryoprotektoren sind gut wasserlöslich; viele von ihnen sind Alko hol- oder Zuckerderivate. Das momentan am weitesten verbreitete Ge frierschutzmittel ist Dimethylsulfoxid.All cryoprotectors are readily water-soluble; many of them are Alko wood or sugar derivatives. The most widespread Ge at the moment Freeze protection is dimethyl sulfoxide.

Es werden zwei große Gruppen an Kryoprotektoren unterschieden, ei nerseits membrangängige (sog. intrazelluläre) Kryoprotektoren, die auch intrazellulär wirken können, und andererseits nicht membrangän gige (sog. extrazelluläre) Kryoprotektoren. Der kryoprotektive Effekt der intrazellulären Kryoprotektoren, aber auch deren unerwünschte toxi sche und osmotische Wirkung steigt mit der Konzentration des Kryo protektors. Auch eine Erhöhung der Temperatur und der Expositions dauer der Zellen gegenüber dem Kryoprotektor führt zu einer stärkeren Schädigung.There are two large groups of cryoprotectors, ei on the other hand membrane-permeable (so-called intracellular) cryoprotectors, which can also act intracellularly, and on the other hand not membrane-compatible common (so-called extracellular) cryoprotectors. The cryoprotective effect of intracellular cryoprotectors, but also their undesirable toxi ces and osmotic effects increase with the concentration of the cryo protector. Also an increase in temperature and exposure Duration of the cells compared to the cryoprotector leads to a stronger one Damage.

Zwar konnten in einigen der Versuche in den sechziger Jahren klare Hornhäute in Transplantationsexperimenten wie auch in limitierten kli nischen Versuchen erhalten werden, allerdings streute die Erfolgsquote sehr stark. Diese Probleme bei der langsamen Einfrierung von Horn häuten hat man bis heute nicht gelöst.In some of the experiments in the 1960s, it was clear Corneas in transplant experiments as well as in limited cli trials, but the success rate was scattered very strong. These problems with the slow freezing of horn To this day, skinning has not been solved.

Wenn Zellen unter Verwendung relativ langsamer Kühlraten in einer wässrigen Lösung eingefroren werden, bildet sich das Eis zunächst im extrazellulären Medium. Die Bildung von Eis hinterläßt notwendigerwei se einen Rest einer extrazellulären Lösung, deren Volumen sich zu nehmend verringert und deren Konzentration an gelösten Stoffen konti nuierlich ansteigt. Die Zellen, die zunächst mit der umgebenden Lösung im osmotischen Gleichgewicht standen, verlieren nun über ihre semi permeable Zellmembran Wasser und beginnen zu schrumpfen (Kryo dehydratation). Da auch Wasser die Zellmembran nicht ungehindert passieren kann, hängt das Ausmaß der Zellschrumpfung vom zeitlichen Verlauf der Abkühlung ab. Bei sehr langsamer Abkühlung kann viel Wasser die Zelle verlassen, wodurch es zu einer starken Zellschrump fung und damit verbunden zu hohen zellschädigenden Salzkonzentra tionen im Zellinnern kommt. Bei schnellerer Abkühlung verbleibt wenig Zeit für eine osmotische Wasserabgabe. Durch den dann hohen intra zellulären Wassergehalt wird die Bildung von intrazellulärem Eis wäh rend des weiteren Abkühlens sehr wahrscheinlich. Die Eisbildung bei schnellerer Abkühlung ist ebenso wie die hohen intrazellulären Salz konzentrationen bei zu langsamer Abkühlung für die Zelle letal. Diese beiden Schädigungsmechanismen wurden von Mazur als Zwei-Faktor- Hypothese beschrieben (Mazur, P., Leibo; S. P., Chu, E. H. Y., A two factor-hypothesis of freezing injury, Exp. Cell Res. 1977, 71, 343-355). Diese Schädigungsmechanismen können durch ein erfolgversprechen des alternatives Einfrierverfahren, die sogenannte Vitrifikation, vermie den werden.If cells are using relatively slow cooling rates in one frozen aqueous solution, the ice initially forms in the extracellular medium. The formation of ice necessarily leaves behind a residue of an extracellular solution, the volume of which increases increasingly reduced and their concentration of solutes continued increases gradually. The cells initially with the surrounding solution were in osmotic balance, now lose over their semi permeable cell membrane water and begin to shrink (cryo dehydration). Because water does not hinder the cell membrane the extent of cell shrinkage depends on the time Course of cooling down. A lot can happen with very slow cooling Water will leave the cell, causing severe cell shrinkage fung and associated with it to high cell-damaging salt concentration ions inside the cell. With faster cooling, little remains Time for osmotic water delivery. Due to the high intra cellular water content is the formation of intracellular ice very likely after further cooling. The ice formation at Faster cooling is just like the high intracellular salt Concentrations lethal for the cell if cooling is too slow. This Mazur described the two damage mechanisms as two-factor Hypothesis described (Mazur, P., Leibo; S. P., Chu, E. H. Y., A two factor-hypothesis of freezing injury, Exp. Cell Res. 1977, 71, 343-355). These damage mechanisms can be promised of the alternative freezing process, the so-called vitrification, that will.

Vitrifikation ist ein Abkühlungsvorgang, bei dem wässrige Lösungen so schockartig abgekühlt werden, daß für eine Ausbildung von Eiskristal len im intra- und extrazellulären Raum keine Zeit bleibt. Hierbei werden die wässrigen Lösungen bei der sog. Glasübergangstemperatur Tg (im strengeren Sinn ein Temperaturbereich) in einen Glaszustand über führt. Geeignete Lösungen verhalten sich dabei wie weit unter den Ge frierpunkt unterkühlte Flüssigkeiten sehr hoher Viskosität.Vitrification is a cooling process in which aqueous solutions be cooled in a shock-like manner for the formation of ice crystal There is no time in intracellular and extracellular space. Here are the aqueous solutions at the so-called glass transition temperature Tg (in strict sense a temperature range) into a glass state leads. Suitable solutions behave as far below the Ge freezing point supercooled liquids of very high viscosity.

Eine Vitrifikation von wäßrigen Lösungen bei Kühlraten, die in der Pra xis erreichbar sind, ist nur durch Verwendung der erwähnten Gefrier schutzmitteln möglich, welche für die Vitrifikation in erheblich höheren Konzentrationen erforderlich sind als bei den herkömmlichen Einfrier techniken. Ein besonderes Problem dieses Verfahrens stellt daher die erhöhte Toxizität der Kryoprotektoren dar. Es ist deshalb unabdingbar, eine optimale Einstellung der Konzentration des oder der verwendeten Kryoprotektoren in Abhängigkeit vom Gefrierpunkt, der Kristallisation und der Glasübergangstemperatur der Lösung zu finden. In der Publi kation "Vitrification as an Approach to Cryopreservation" von G. M. Fahy in Cryobiology 21, 407-426 (1984) ist diese komplexe Abhängig keit im Detail beschrieben.Vitrification of aqueous solutions at cooling rates that can be achieved in practice is only possible by using the anti-freeze agents mentioned, which are required for vitrification in considerably higher concentrations than with conventional freezing techniques. A particular problem of this method is therefore the increased toxicity of the cryoprotectors. It is therefore essential to find an optimal setting for the concentration of the cryoprotector (s) used, depending on the freezing point, the crystallization and the glass transition temperature of the solution. This complex dependency is described in detail in the publication "Vitrification as an Approach to Cryopreservation" by GM Fahy in Cryobiology 21, 407-426 ( 1984 ).

Mittels des Vitrifikationsverfahrens wurden beispielsweise schon erfolg reich Erythrozyten, Mäuseembryonen, Langerhans-Inseln, menschliche Monozyten und Oozyten vitrifiziert. Bei der Tiefkühlkonservierung von größeren Organen und Organismen treten bisher weitgehend ungelöste Probleme dahingehend auf, daß die Erzeugung von beliebigen, überall im Gefriergut gleichen Kühl- und Heizraten mit zunehmender Zellver bandgröße immer schwieriger wird.The vitrification process has already been used, for example rich erythrocytes, mouse embryos, islets of Langerhans, human Vitrified monocytes and oocytes. With the deep freeze preservation of Larger organs and organisms have so far largely remained unresolved Problems in that the generation of any, anywhere in the frozen food, cooling and heating rates are the same with increasing cell ver band size is becoming increasingly difficult.

Die Hornhaut ist aufgrund ihrer geringen Größe und der guten Erreich barkeit ihrer oberflächlichen Zellen theoretisch gut für eine Vitrifikation geeignet. In den dennoch bislang nur wenigen Arbeiten über Vitrifikati onsversuche von Hornhäuten wurden verschiedene Kryoprotektoren in unterschiedlichen Behältern mit einem Volumen von 3 ml aufwärts aus Glas oder Polypropylen verwendet (s. "Human Corneal Studies with a Vitrification Solution Containing Dimethylsulfoxide, Formamide, and 1,2-Propanediol" von W. M. Bourne und L. R. Nelson, Cryobiology, 31, 522-530 (1994), und "Vitrification of Organized tissues" von J. M. Ar mitage und S. J. Rich, Cryobiology 27, 483-491 (1990)). Polypropylen erwies sich hierbei als schonender für die Zellen als Glas. Die auftre tenden vielfältigen Probleme bestanden insbesondere darin, daß sich inter- und intrazelluläre Vakuolen bildeten, die Hornhäute keine ausrei chende Funktion besaßen, sich Risse bildeten, der Zellkontakt zwi schen Endothel und Descemetscher Membran zerstört war, eine Eisbildung im Bereich der Sklera und der dickeren peripheren Hornhaut zu beobachten war oder die toxischen Schäden zu groß waren.Due to its small size and the easy accessibility of its superficial cells, the cornea is theoretically well suited for vitrification. In the few studies on vitrification experiments on corneas, however, various cryoprotectors in different containers with a volume of 3 ml upwards made of glass or polypropylene were used (see "Human Corneal Studies with a Vitrification Solution Containing Dimethylsulfoxide, Formamide, and 1,2 -Propanediol "by WM Bourne and LR Nelson, Cryobiology, 31, 522-530 ( 1994 ), and" Vitrification of Organized tissues "by JM Ar mitage and SJ Rich, Cryobiology 27, 483-491 ( 1990 )). Polypropylene proved to be gentler on the cells than glass. The various problems that occurred were, in particular, that inter- and intracellular vacuoles formed, the corneas had no sufficient function, cracks formed, the cell contact between the endothelium and Descemet's membrane was destroyed, ice formation in the area of the sclera and the thicker peripheral cornea or the toxic damage was too great.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren der eingangs genannten Art weiterzubilden bzw. eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, so daß größere Erfolgsraten bei der Vitrifizierung von Hornhautgewebe erreicht werden.The object of the present invention is a method of the type mentioned at the outset or a device for To provide so that greater success rates in vitrification of corneal tissue.

Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art in einem ersten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß als zu virtrifizie rendes Hornhautgewebe Gewebe von hinteren Hornhautlamellen (Teile des Stroma, die Descemet-Membran, das Endothel) verwendet wird.This task is in the process of the type mentioned in solved a first aspect of the invention in that as too virtrifikie corneal tissue tissue from posterior corneal lamellae (parts des stroma, the Descemet membrane, the endothelium) is used.

Die genannte Aufgabe wird zudem bei dem Verfahren der eingangs genannten Art in einem zweiten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß weniger als 1 ml Vitrifikationslösung in den Behälter gefüllt werden.The above task is also used in the procedure of the beginning in a second aspect of the invention, that less than 1 ml of vitrification solution is filled into the container.

Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Art in einem dritten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß als Behälter ein solcher mit gegenüber dem Hornhautgewebe im wesentlichen inertem Material auf der Behälterinnenseite verwendet wird.This task is in the process of the type mentioned in solved a third aspect of the invention in that as a container those with essentially inert to the corneal tissue Material is used on the inside of the container.

Weiterhin wird diese Aufgabe bei dem Verfahren der eingangs ge nannten Art in einem vierten Aspekt der Erfindung dadurch gelöst, daß die Lösung schockartig auf eine Temperatur Ts geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg und dann weiter in kleineren Tempe raturschritten auf eine tiefer liegende Endtemperatur Tt abgekühlt wird.Furthermore, this task is in the process of the beginning ge mentioned type in a fourth aspect of the invention in that the solution shocked to a temperature Ts slightly below the glass transition temperature Tg and then further in smaller tempe rature steps is cooled to a lower final temperature Tt.

Die Aufgabe wird bei der Vitrifikationsvorrichtung gelöst durch ein der art ausgebildetes erstes Gefäß zur Aufnahme eines ersten Kühlmediums, daß in dem ersten Kühlmedium ein Behälter mit einer Vitrifikati onslösung und dem darin befindlichen Hornhautgewebe auf eine Tem peratur geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg der Vi trifikationslösung abkühlbar ist, ein zweites Gefäß zur Aufnahme eines zweiten Kühlmediums und eine Vorrichtung zur Wärmeübertragung von dem zweiten Kühlmedium auf das erste Kühlmedium.The object is achieved by one of the vitrification devices type of first vessel for receiving a first cooling medium, that in the first cooling medium a container with a vitrificati solution and the corneal tissue in it to a tem temperature slightly below the glass transition temperature Tg of Vi Trification solution is coolable, a second vessel to hold a second cooling medium and a device for heat transfer from the second cooling medium to the first cooling medium.

Die Vorteile gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bestehen insbe sondere darin, daß die Masse des einzufrierenden Hornhautgewebes wesentlich geringer ist als bei den Versuchen gemäß dem Stand der Technik. Ermöglicht wird eine derartige Präparation des zu transplantie renden Hornhautgewebes beispielsweise durch die Verwendung eines speziellen Mikrokeratoms. Eine solche Schneidevorrichtung ist in der DE 34 33 581 beschrieben, deren Offenbarung hiermit durch Bezug nahme eingeschlossen ist. Die mit diesem Keratom erhaltenen Horn hautgewebe weisen nur ca. 11%-12% des Volumens der bisher ge frierkonservierten Korneoskleralscheiben auf. Die Konservierung von hinteren Hornhautlamellen ist auch von klinischer Bedeutung, da bei eingetrübten Hornhäuten nämlich in den meisten Fällen schon eine Transplantation der Endothelzellen oder einer hinteren Hornhautschicht ausreichen würde, um die Transparenz wieder herzustellen.The advantages according to the first aspect of the invention are in particular special in that the mass of the corneal tissue to be frozen is significantly less than in the tests according to the state of the Technology. Such a preparation of the transplant is made possible the corneal tissue, for example, by using a special microkeratome. Such a cutting device is in the DE 34 33 581, the disclosure of which is hereby described by reference name is included. The horn obtained with this keratome Skin tissues represent only approx. 11% -12% of the volume of the previously used freeze-preserved corneoscleral discs. The conservation of posterior corneal lamella is also of clinical importance since clouded corneas in most cases already one Transplantation of the endothelial cells or a posterior corneal layer would be enough to restore transparency.

Wesentlicher Gedanke der Erfindung gemäß ihrem ersten Aspekt ist demnach, daß bei Verkleinerung des Volumens des Gewebeverbandes ein umso schnelleres Eindringen der Kryoprotektoren in das Gewebe und eine im wesentlichen gleichmäßige Temperaturverteilung im Ge friergut ermöglicht wird. Damit werden die Expositionszeiten gegenüber den Kryoprotektoren erheblich verkürzt. Zudem ermöglicht eine Reduk tion an Gewebe ein schnelleres und besser kontrolliertes Einfrieren und Erwärmen des Gewebes. The essential idea of the invention according to its first aspect is therefore that when the volume of the tissue bandage is reduced an even faster penetration of the cryoprotectors into the tissue and a substantially uniform temperature distribution in the Ge freezing is made possible. This compares the exposure times the cryoprotectors significantly shortened. In addition, a Reduk enables on tissue a faster and more controlled freezing and Heating the fabric.

Die Vorteile der Erfindung gemäß ihrem zweiten Aspekt bestehen ins besondere darin, daß mittels des erfindungsgemäßen Beutels nachteil hafte Wechselwirkungen zwischen Behälter und Hornhaut vermieden werden. Die bisher verwendeten Behälter waren alle derart ausgebildet, daß ein Kontakt aufgrund allein schon des Behältervolumens ausge schlossen wurde. Die Erfindung hat erkannt, daß Berührungen zwi schen Hornhautgewebe und Behälterinnenwand durchaus unschädlich sind, wenn nur die Innenseite des Behälters aus einem geeigneten Material besteht. Der zweite Aspekt der Erfindung ist nicht beschränkt auf die Vitrifizierung von Hornhautlamellen oder Teilen des Hornhaut gewebes. Vielmehr können auch ganze Hornhäute vitrifiziert werden.The advantages of the invention in its second aspect are special in that disadvantage by means of the bag according to the invention Avoid interactions between the container and the cornea become. The containers used so far were all designed that a contact is due to the volume of the container alone was closed. The invention has recognized that contact between the corneal tissue and the inner wall of the container are completely harmless if only the inside of the container is made from a suitable Material exists. The second aspect of the invention is not limited on the vitrification of corneal lamella or parts of the cornea tissue. Entire corneas can also be vitrified.

Insbesondere hat sich Polytetrafluorethylen (Teflon®) als innenseitiges Material als geeignet erwiesen. Generell scheinen Fluoropolymere ge eignet zu sein. Teflon® ist sehr inert und verhindert eine Adsorption wie auch eine Adhäsion der verwendeten hinteren Hornhautlamellen an der Teflon®-Innenseite des Behälters. Es konnten keine mechanischen Schädigungen bei Kontakt zwischen Endothel und Gefäßwand festge stellt werden.In particular, polytetrafluoroethylene (Teflon®) has proven to be an inside Material proved to be suitable. In general, fluoropolymers appear to be ge to be suitable. Teflon® is very inert and prevents adsorption like also an adhesion of the posterior corneal lamellae to the Teflon® inside of the container. There were no mechanical ones Damage caused by contact between endothelium and vessel wall be put.

Wird weiterhin vorteilhafterweise ein durchsichtiger Behälter verwendet, kann die Hornhautlamelle bzw. das Hornhautgewebe während des Ein frierens und Auftauens beobachtet werden.If a transparent container is also advantageously used, can the corneal lamella or corneal tissue during the freezing and thawing can be observed.

Vorzugsweise wird ein Behälter mit einem an seiner Außenseite ein Polyimid, insbesondere Kapton®, aufweisenden Material verwendet. Dies erlaubt insbesondere ein Beschriften des Behälters. Mit Teflon® auf der Innenseite und einem Polyimid, insbesondere Kapton®, auf der Außenseite weist der Behälter bevorzugt einen zweischichtigen Wandaufbau auf. Zusätzlich können auch noch ein oder mehrere in nenliegende Schichten vorgesehen sein.Preferably, a container with one on the outside thereof Polyimide, in particular Kapton®, material used. In particular, this allows the container to be labeled. With Teflon® on the inside and a polyimide, especially Kapton®, on the The outside of the container preferably has a two-layer structure Wall construction on. In addition, one or more in inner layers may be provided.

Weiterhin haben sowohl Teflon® als auch Kapton® den Vorteil, daß sie in flüssigem Stickstoff flexibel bleiben. Mechanische Spannungen in der Lösung, verursacht durch die hohen Temperaturbewegungen während des Einfrierens oder Auftauens, können daher besser abgefangen wer den.Furthermore, both Teflon® and Kapton® have the advantage that they Remain flexible in liquid nitrogen. Mechanical stresses in the Solution caused by the high temperature movements during of freezing or thawing, can therefore be intercepted better the.

Der erfindungsgemäß verwendete Beutel weist eine ausreichende Sta bilität auf und ist leicht zu handhaben, da die Hornhautlamelle bzw. die Hornhaut unkompliziert eingelegt, danach der Behälter in einfacher Weise verschweißt und nach Aufschneiden des Behälters die Horn hautlamelle bzw. die Hornhaut wieder herausgenommen werden kann.The bag used according to the invention has a sufficient sta bility and is easy to handle because the corneal lamella or Easy insertion of the cornea, then the container in easier Way welded and after cutting open the container the horn skin lamella or the cornea can be removed again.

Ein Lösungsvolumen von weniger als 1 ml gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung ermöglicht extrem hohe Einfrier- und Auftauraten, da die Wärmeausbreitung nur über kürzeste Entfernungen vonstatten gehen muß. Sehr gute Erfahrungen wurden bei einem Behältervolumen von ca. 0.1 ml gemacht. Hierbei wurde der oben beschriebene Behälter mit Teflon®-Innenseite verwendet, der als inert gegenüber den verwende ten hinteren Hornhautlamellen angesehen werden kann. Vor Einbrin gen des Hornhautgewebes in den Behälter wird dieser nahezu voll ständig glatt gestrichen, um sein Volumen weiter zu verkleinern.A solution volume of less than 1 ml according to the third aspect The invention enables extremely high freezing and thawing rates, since the Heat spread only over the shortest distances got to. Very good experiences were made with a container volume of made about 0.1 ml. The container described above was used Teflon® inside is used, which is inert to the use th posterior corneal lamellae can be viewed. Before Einbrin The corneal tissue in the container becomes almost full always smoothed out to further reduce its volume.

Der dritte Aspekt der Erfindung ist nicht beschränkt auf die Vitrifizierung von Hornhautlamellen oder Teilen des Hornhautgewebes. Es können auch ganze Hornhäute vitrifiziert werden. The third aspect of the invention is not limited to vitrification of corneal lamellae or parts of the corneal tissue. It can whole corneas can also be vitrified.

Bei dem vierten Aspekt der Erfindung sowie der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Vorteile insbesondere darin zu sehen, daß mittels des Protokolls keine Schäden, wie beispielsweise Risse, an dem Horn hautgewebe feststellbar sind. Durch schockartiges Abkühlen des Horn hautgewebes, insbesondere der Hornhautlamelle, auf eine geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg liegende Temperatur Ts wird eine nahezu sofortige Vitrifikation bei gleichzeitiger schonender Behandlung des Hornhautgewebes erreicht. Die beim bisherigen schockartigen Abkühlen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff ent standenen Risse wurden hierdurch vermieden. Das ebenfalls bisher bekannte Abkühlen mit Kühlraten von bis zu 45°C/min auf eine Tempe ratur von geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur ließ ent weder eine Eis- oder Rißbildung eintreten. Es kann bei diesen Kühlra ten nicht von einer schockartigen Abkühlung im Sinne der vorliegenden Erfindung gesprochen werden. Im Sinne dieser Erfindung sind unter "schockartiger" Abkühlung Abkühlraten von mehr als 150°C/min, insbe sondere mehr als 200°C/min, zu verstehen, welche auch durch die Verwendung der oben beschriebenen kleinvolumigen Behälter für die hinteren Hornhautlamellen bzw. eines Hornhautgewebes ermöglicht werden.In the fourth aspect of the invention and the invention The advantages of the device can be seen in particular in that no damage, such as cracks, to the horn skin tissues are detectable. By suddenly cooling the horn skin tissue, especially the corneal lamella, to a minor extent temperature Ts below the glass transition temperature Tg becomes an almost instant vitrification with gentle at the same time Treatment of corneal tissue achieved. The previous one shock-like cooling by immersion in liquid nitrogen standing cracks were thereby avoided. So far, too known cooling to a temperature with cooling rates of up to 45 ° C / min temperature slightly below the glass transition temperature neither ice or crack formation. It can be did not experience a sudden cooling in the sense of the present Invention are spoken. For the purposes of this invention are below "shock-like" cooling Cooling rates of more than 150 ° C / min, esp special more than 200 ° C / min to understand, which also by the Use of the small-volume container described above for the posterior corneal lamella or a corneal tissue become.

Das langsame weitere Abkühlen von der Temperatur Ts auf die End temperatur Tt verhindert die Bildung von Rissen im Gefriergut.The slow further cooling from the temperature Ts to the end temperature Tt prevents the formation of cracks in the frozen food.

Der vierte Aspekt der Erfindung ist nicht beschränkt auf die Vitrifizie rung von Hornhautlamellen oder Teilen des Hornhautgewebes. Es kön nen auch ganze Hornhäute vitrifiziert werden.The fourth aspect of the invention is not limited to vitrification of corneal lamellae or parts of the corneal tissue. It can Whole corneas can also be vitrified.

Bevorzugt liegt die Temperatur Ts ungefähr 2°C bis 30°C unterhalb von Tg, insbesondere 10°C-20°C unterhalb von Tg. Bei einer vorteilhaften Glasübergangstemperatur Tg von ca. -120°C ist Ts dann beispielswei se im Bereich von ungefähr -122°C bis -150°C angesiedelt.The temperature Ts is preferably approximately 2 ° C. to 30 ° C. below Tg, especially 10 ° C-20 ° C below Tg. With an advantageous Glass transition temperature Tg of approx. -120 ° C is then Ts, for example It ranges from approximately -122 ° C to -150 ° C.

Mit Vorteil wird ein erstes Kühlmedium zur äußeren Kühlung des Be hälters verwendet, welches zuvor oder gleichzeitig mit Hilfe eines zweiten Kühlmediums auf eine Temperatur nahe Ts abgekühlt wurde bzw. wird. Auf diese Weise läßt sich die Temperatur des ersten Kühl mediums gezielt auf die gewünschte, knapp unterhalb Tg liegende Temperatur Ts einstellen.A first cooling medium for external cooling of the loading is advantageously used used previously or simultaneously with the help of a second cooling medium was cooled to a temperature close to Ts or will. In this way, the temperature of the first cooling mediums targeted to the desired, just below Tg Set temperature Ts.

Es bietet sich hierbei an, als erstes Kühlmedium verflüssigtes Propan zu verwenden. Der kostengünstige Stickstoff ist für das Abkühlen von Gefrierproben zum Zwecke der Vitrifikation zwar verbreitet, aber nicht sehr gut geeignet. Zwar weist die Dampfphase von Stickstoff eine gün stige Temperatur von ca. -130°C auf, aber die Einhaltung dieser Tem peratur ist problematisch, da bspw. beim Öffnen des entsprechenden Gefäßes Stickstoff entweichen kann. Zudem verdampft Stickstoff bei Kontakt mit dem das Hornhautgewebe aufnehmenden Behälter auf grund seines niedrigen Siedepunktes und die sich dabei bildende Dampfschicht behindert den Wärmeübergang (Leidenfrost-Phänomen). Der Siedepunkt von Propan hingegen liegt mit -42°C um 154°C höher als der von Stickstoff. Demzufolge ist beim Kontakt des Gefriergutträ gers mit Propan im Vergleich zum Stickstoff die Ausbildung einer Dampfschicht geringer. Dies bedingt vorteilhafterweise einen höheren Wärmeübergang.It is a good idea to use liquefied propane as the first cooling medium to use. The inexpensive nitrogen is for cooling Freeze samples for vitrification are common, but not very suitable. The vapor phase of nitrogen shows a green constant temperature of approx. -130 ° C, but compliance with this tem temperature is problematic, for example when opening the corresponding one Vessel nitrogen can escape. Nitrogen also evaporates Contact with the container holding the corneal tissue due to its low boiling point and the resulting Vapor layer hinders heat transfer (Leidenfrost phenomenon). In contrast, the boiling point of propane is -42 ° C, 154 ° C higher than that of nitrogen. As a result, when the frozen food is in contact gers with propane compared to nitrogen Vapor layer less. This advantageously requires a higher one Heat transfer.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver fahrens wird als Vitrifikationslösung eine Lösung mit den Substanzen Dimethylsulfoxid, 1,2-Propandiol, Formamid, Chondroitinsulfat verwen det. Geringe toxische Schädigungen der Hornhaut konnten nachgewiesen werden mit einer Lösung mit der Bezeichnung VS41a (s. obigen Artikel in Crybiology 31, 522-530), die eine Glasübergangstemperatur Tg von ca. -123°C besitzt.In a preferred embodiment of the method according to the invention, a solution with the substances dimethyl sulfoxide, 1,2-propanediol, formamide, chondroitin sulfate is used as the vitrification solution. Slight toxic damage to the cornea could be demonstrated with a solution called VS41a (see article above in Crybiology 31 , 522-530 ), which has a glass transition temperature Tg of approx. -123 ° C.

Bei der Verwendung von VS41a wird das Gefriergut bevorzugt im er sten Schritt mit maximaler Kühlrate auf eine Temperatur von etwa - 130°C bis -145°C abgekühlt. Um diese Kühlung mit Hilfe des Propans zu erreichen, wird zunächst das Propan auf diese Temperatur herab gekühlt. Die Kühlung und die damit einhergehende Verflüssigung von Propan erfolgt vorzugsweise durch verflüssigtes Methylcyclopentan, welches auch für andere Vitrifikationslösungen mit ähnlich tiefen Glas übergangstemperaturen einsetzbar ist.When using VS41a, the frozen food is preferred in the oven first step with maximum cooling rate to a temperature of about - Cooled from 130 ° C to -145 ° C. To this cooling with the help of propane To achieve this, the propane is first brought down to this temperature cooled. The cooling and the associated liquefaction of Propane is preferably made from liquefied methylcyclopentane, which also for other vitrification solutions with similarly deep glass transition temperatures can be used.

Methylcyclopentan liegt bei Raumtemperatur als Flüssigkeit vor. Auf grund seines Gefrierpunkts bei -142,4°C kann es durch Abkühlung, die bevorzugt mit flüssigem Stickstoff vorgenommen wird, verfestigt wer den. Wenn der Verfestigungsvorgang einsetzt, weiß der Bediener, daß das Methylcyclopentan nun den Gefrierpunkt durchläuft. Nach Beendi gung der Kühlung beginnt Methylcyclopentan zu schmelzen und besitzt dann die angestrebte Temperatur von etwa -140°C. Der Wärmekontakt von Propan mit dem auf diese Temperatur gebrachten Methylcyclo pentan läßt das Propan dann auch eine Temperatur in diesem Tempe raturbereich einnehmen.Methylcyclopentane is a liquid at room temperature. on due to its freezing point at -142.4 ° C, it can be cooled by the is preferably carried out with liquid nitrogen, who solidifies the. When the solidification process begins, the operator knows that the methylcyclopentane now passes through the freezing point. After finishing After cooling, methylcyclopentane begins to melt and has then the desired temperature of about -140 ° C. The thermal contact of propane with the methylcyclo brought to this temperature Pentane then also leaves the temperature at this temperature occupy the natural environment.

Durch die Kühlung von Methylcyclopentan mit flüssigem Stickstoff, der Kühlung von Propan in dem abgekühlten flüssigen Methylcyclopentan und schließlich durch die Kühlung des Behälters samt eingebrachtem Hornhautgewebe in Propan kann demnach das erstrebte Ziel erreicht werden, die Hornhautlamellen bzw. das Hornhautgewebe im ersten Schritt schockartig auf eine Temperatur von etwa -140°C abzukühlen. By cooling methylcyclopentane with liquid nitrogen, the Cooling propane in the cooled liquid methylcyclopentane and finally by cooling the container together with the introduced Corneal tissue in propane can therefore achieve the desired goal the corneal lamellae or the corneal tissue in the first Cool down step by step to a temperature of around -140 ° C.

Prinzipiell ist es auch möglich, den Behälter direkt in flüssiges Me thylcyclopentan an der Schwelle zur Verfestigung zu tauchen. Es könnte hierbei der Kühlschritt des Propans mittels Methylcyclopentan bei sonst vorteilhafterweise gleichem Vorgehen eingespart werden.In principle, it is also possible to put the container directly in liquid me to dip thylcyclopentane on the threshold of solidification. It could be the cooling step of the propane using methylcyclopentane if otherwise advantageously the same procedure can be saved.

Wird eine andere Vitrifikationslösung verwendet, sind die verschiede nen Kühlmittel entsprechend geeignet zu wählen. Insbesondere das zweite Kühlmedium, welches die Temperatur des ersten Kühlmediums bestimmt, ist dann entsprechend zu wählen. Hier bieten sich insbeson dere flüssige Kühlmittel an, da mit flüssigen Medien ein schneller Wär meübergang zu realisieren ist.If a different vitrification solution is used, the different ones suitable coolant. Especially that second cooling medium, which is the temperature of the first cooling medium determined, is then to be chosen accordingly. Here are particularly: liquid coolant, since liquid media can heat up quickly transition is to be realized.

Als Vitrifikationslösung kommt vorteilhafterweise auch eine Lösung in Betracht, welche eine oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe der Polyvinylalkohole enthält. Zusätzlich oder alternativ kann 2,3-Butandiol eingesetzt werden, welches teilweise oder ganz 1,2-Propandiol erset zen kann. 2,3-Butandiol und insbesondere (+)- und (-)-2,3-Butandiol besitzen bei niedrigerer Konzentration die gleichen vitrifizierenden Ei genschaften wie 1,2-Propandiol.A solution is also advantageously used as the vitrification solution Consider which one or more compounds from the group of Contains polyvinyl alcohols. Additionally or alternatively, 2,3-butanediol be used, which partially or completely replaces 1,2-propanediol zen can. 2,3-butanediol and in particular (+) - and (-) - 2,3-butanediol have the same vitrifying egg at lower concentrations properties such as 1,2-propanediol.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zeichnet sich gegenüber herkömm lichen Einfrierautomaten dadurch aus, daß eine präzise und zudem schnelle Abkühlung auf die Temperatur Ts, d. h. eine Temperatur ge ringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg, ermöglicht wird. Der Wärmekontakt zwischen dem ersten Kühlmedium (mit einer Tem peratur geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg) in dem ersten Gefäß und dem Behälter samt dem Hornhautgewebe ermöglicht eine extrem schnelle Vitrifikation der Vitrifikationslösung und des Hornhautgewebes auf die Temperatur Ts. Es sind somit extrem hohe Kühl raten zu realisieren.The device according to the invention is distinguished from convention Lich freezers characterized by the fact that a precise and rapid cooling to temperature Ts, i.e. H. a temperature ge slightly below the glass transition temperature Tg. The thermal contact between the first cooling medium (with a tem temperature slightly below the glass transition temperature Tg) in the first vessel and the container together with the corneal tissue an extremely fast vitrification of the vitrification solution and the corneal tissue to the temperature Ts. It is extremely high cooling advise to realize.

Besonders bevorzugt sind das erste und/oder das zweite Gefäß zur Aufnahme von verflüssigt vorliegendem ersten und/oder zweiten Kühl medium ausgebildet.The first and / or the second vessel are particularly preferred Absorption of the first and / or second cooling liquid present medium training.

Bevorzugt umfaßt die Vorrichtung zur Wärmeübertragung eine Kühllei tung, durch die das erste Kühlmedium hindurchgeleitet wird. Die Kühl leitung ist vorzugsweise durch das zweite Gefäß geführt, kommt hierbei mit dem zweiten Kühlmedium in Wärmekontakt und mündet in das er ste Gefäß. Um schnell und effizient die Wärme bzw. die Kälte vom zweiten auf das erste Kühlmedium in der Kälteleitung zu übertragen, besteht die Kühlleitung bevorzugt aus Kupfer.The device for heat transfer preferably comprises a cooling cable device through which the first cooling medium is passed. The cooling Line is preferably led through the second vessel, comes here in thermal contact with the second cooling medium and flows into it most vessel. To quickly and efficiently heat or cool the second to transfer to the first cooling medium in the refrigeration line, the cooling line is preferably made of copper.

Der Wärmeübergang wird noch dadurch gefördert, wenn die Kühllei tung eine längere Passage in dem zweiten Kühlmedium zurücklegt und zu diesem Zweck vorteilhafterweise spiralförmig ausgebildet ist.The heat transfer is further promoted when the cooling cable a longer passage in the second cooling medium and is advantageously designed in a spiral shape for this purpose.

Auch das erste Gefäß ist bevorzugt aus Kupfer hergestellt. Dies bietet sich insbesondere dann an, wenn das erste Gefäß im zweiten Gefäß angeordnet ist und mit dem zweiten Kühlmedium in Berührungskontakt steht.The first vessel is also preferably made of copper. This offers especially when the first vessel is in the second vessel is arranged and in contact with the second cooling medium stands.

Eine Wärmetauscheinrichtung zwischen dem zweiten und einem dritten Kühlmedium ist vorteilhafterweise vorgesehen, um das zweite Kühlme dium auf eine Temperatur einzustellen, die geringfügig unterhalb der Glasübergangstemperatur Tg liegt. Vorteilhaft ist hierbei, wenn jene Temperatur einer Phasenübergangstemperatur des zweiten Kühlmediums entspricht, bspw. dem Gefrierpunkt des zweiten Kühlmediums. Es ist somit leicht beobachtbar, wann diese Temperatur erreicht ist.A heat exchange device between the second and a third Cooling medium is advantageously provided around the second cooling duct dium to a temperature slightly below the Glass transition temperature Tg is. It is advantageous here if that Temperature of a phase transition temperature of the second cooling medium corresponds, for example. The freezing point of the second cooling medium. It it is therefore easy to observe when this temperature is reached.

Anhand des in der einzigen Figur dargestellten Ausführungsbeispiels wird das erfindungsgemäße Verfahren sowie die entsprechende Vor richtung näher erläutert:
In der Vorbereitung für die Vitrifizierung wird folgendermaßen vorge gangen: Es werden vorzugsweise doppelwandige, durchsichtige Be hälter 3 mit einem außenseitigen 0,025 mm starken Film aus beschrift barem Kapton® und einer innenseitigen, ebenfalls 0,025 mm starken Teflon®-Schicht verwendet, um darin Gewebe von hinteren Hornhaut lamellen 1 einzulegen. Die Kammergröße eines solchen Behälters 3 beträgt beispielsweise 2,4 cm × 2,4 cm. Durch Glattstreichen der Be hälterwände wird ein Behältervolumen von ca. 0.1 ml erhalten. Mittels einer Eppendorf-Pipette wird ein solches Volumen der 100%igen, oben beschriebenen Vitrifikationslösung 2 (VS41a) eingebracht. Die Glas übergangstemperatur Tg liegt für VS41a bei ca. -123°C. Zur Bildung von Kristallkeimen kommt es bei Temperaturen oberhalb von -90°C. Als Basismedium für die Vitrifikationslösung dient bevorzugt CPTES (Cor neal-Potassium-TES), eine kaliumreiche Elektrolytlösung, die den nicht zellgängigen anionischen pH-Puffer N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2- aminoethan-sulphon-Säure (TES) enthält. Dem CPTES wird 2,5% Chondroitinsulfat (Typ A) zugesetzt. Die Beutel bzw. Behälter 3 werden bis zum Einlegen der hinteren Hornhautlamellen 1 auf Eis gelagert. Vor dem Einlegen des Hornhautgewebes 1 in den Behälter 3 wird das Ge webe nacheinander in Schälchen mit aufsteigenden Konzentrationen an VS41a jeweils für mehrere Minuten an die Virifikationslösung ge wöhnt. Mit einem Färbelöffel wird anschließend das Hornhautgewebe in den Behälter unter Spreizung der Behälteröffnung mittels einer Pinzette eingebracht. Nach Einlegen der Hornhautlamellen 1 wird der Kap ton®/Teflon®-Behälter 3 dann mit einem Schweißgerät (335°C) wieder verschlossen, damit keine Vermischung mit den Kühlmedien oder der Luft stattfindet.On the basis of the embodiment shown in the single figure, the method according to the invention and the corresponding direction are explained in more detail:
The preparation for the vitrification is carried out as follows: Double-walled, transparent containers 3 with an outside 0.025 mm thick film of inscribable Kapton® and an inside, also 0.025 mm thick Teflon® layer are preferably used to store tissue from insert the rear cornea lamella 1 . The chamber size of such a container 3 is, for example, 2.4 cm × 2.4 cm. By smoothing the container walls, a container volume of approx. 0.1 ml is obtained. Such a volume of the 100% vitrification solution 2 (VS41a) described above is introduced using an Eppendorf pipette. The glass transition temperature Tg for VS41a is approx. -123 ° C. Crystal nuclei are formed at temperatures above -90 ° C. The base medium for the vitrification solution is preferably CPTES (Cor neal-Potassium-TES), a potassium-rich electrolyte solution that contains the non-cell-permeable anionic pH buffer N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid (TES). 2.5% chondroitin sulfate (type A) is added to the CPTES. The bags or containers 3 are stored on ice until the rear corneal lamellae 1 are inserted. Before inserting the corneal tissue 1 into the container 3 , the tissue is used to the virification solution in succession for several minutes in small bowls with increasing concentrations of VS41a. Using a staining spoon, the corneal tissue is then introduced into the container by spreading the opening of the container using tweezers. After inserting the corneal lamella 1 , the Kap ton® / Teflon® container 3 is then closed again with a welding machine (335 ° C) so that it does not mix with the cooling media or the air.

Wie der Figur zu entnehmen ist, ist ein erstes offenes Gefäß 5 aus vor zugsweise Kupfer an seinem Rand über einen schmalen Steg 11 in einem größeren, zweiten Gefäß 7 befestigt. Das erste Gefäß 5 dient zur Aufnahme eines ersten Kühlmediums 4, in welches der Behälter 3 mit der eingeschlossenen Vitrifikationslösung 2 und dem Hornhautge webe 1 eingelegt wird. Das zweite Gefäß 7 nimmt ein zweites Kühlme dium 6 auf, welches das erste Gefäß 5 möglichst gleichmäßig umspü len soll. Von außen ragt eine Kühlleitung 10 aus vorzugsweise Kupfer in das zweite Gefäß 7, verläuft darin in einigen Windungen und mündet im ersten Gefäß 5. Das andere Ende der Kühlleitung 10 ist an eine Propangasflasche (nicht dargestellt) angeschlossen.As can be seen from the figure, a first open vessel 5 made of preferably copper is attached at its edge via a narrow web 11 in a larger, second vessel 7 . The first vessel 5 serves to receive a first cooling medium 4 , in which the container 3 with the enclosed vitrification solution 2 and the corneal web 1 is inserted. The second vessel 7 receives a second Kühlme medium 6 , which should umspü len the first vessel 5 as evenly as possible. A cooling line 10 , preferably made of copper, protrudes from the outside into the second vessel 7 , runs in a few turns therein and opens into the first vessel 5 . The other end of the cooling line 10 is connected to a propane gas bottle (not shown).

Als zweites Kühlmittel 6 wird vorteilhafterweise flüssiges Methylcyclo pentan 6 in das zweite, im gezeigten Ausführungsbeispiel nach oben offene Gefäß 7 gefüllt, das beispielsweise als Dewar-Gefäß ausgebildet ist. Auf die Oberfläche des Methylcyclopentans 6 wird nun flüssiger Stickstoff (-196°C) gegossen, so daß das Methylcyclopentan 6 bei sei nem Gefrierpunkt von ca. -142°C in den festen Aggregatzustand über geht. Der Stickstoff 8 und das Methylcyclopentan 6 vermischen sich hierbei nicht. Wird diese Verfestigung des Methylcyclopentans 6 fest gestellt, wird die Zufuhr von flüssigem Stickstoff 8 gestoppt und eine Weile gewartet, bis das Methylcyclopentan 6 im wesentlichen wieder flüssig geworden ist. Dann wird die Kühlleitung 10 wie in der Figur dar gestellt in das zweite Gefäß 7 gehängt. Alternativ hängt die Kühlleitung 10 auch schon während des Abkühlvorgangs des Methylcyclopentans 6 in dem zweiten Gefäß 7. Durch die Kühlleitung 10 wird nun Propangas 4 aus der Propangasflasche in das erste Gefäß 5 eingeleitet, welches insbesondere auf der spiralförmigen Passage der Kühlleitung 10 durch das Methylcyclopentan 6 auf ca. -140°C abgekühlt und auf diese Weise verflüssigt wird. Das flüssige, -140°C kalte Propan 4 wird am Ende der Kühlleitung 10 im ersten Gefäß 4 aufgefangen. Durch Eintauchen des Gefriergutbehälters 3 in das Propan 4 wird nun die Hornhautlamelle 1 im ersten Schritt auf eine Temperatur von ca. -140°C abgekühlt.Liquid methylcyclopentane is advantageously filled pentan 6 in the second exemplary embodiment shown, upwardly open vessel 7 as a second cooling means 6, which is formed for example as a Dewar vessel. Liquid nitrogen (-196 ° C.) is now poured onto the surface of the methylcyclopentane 6 , so that the methylcyclopentane 6 changes to the solid state at its freezing point of approximately -142 ° C. The nitrogen 8 and the methylcyclopentane 6 do not mix here. If this solidification of the methylcyclopentane 6 is established, the supply of liquid nitrogen 8 is stopped and a while is waited until the methylcyclopentane 6 has essentially become liquid again. Then the cooling line 10 is hung as shown in the figure in the second vessel 7 . Alternatively, the cooling line 10 also hangs in the second vessel 7 during the cooling process of the methylcyclopentane 6 . Through the cooling line 10 , propane gas 4 is now introduced from the propane gas bottle into the first vessel 5 , which is cooled in particular on the spiral passage of the cooling line 10 through the methylcyclopentane 6 to approximately -140 ° C. and liquefied in this way. The liquid, -140 ° C cold propane 4 is collected at the end of the cooling line 10 in the first vessel 4 . By immersing the frozen goods container 3 in the propane 4 , the corneal lamella 1 is cooled to a temperature of approximately -140 ° C. in the first step.

Zur weiteren Temperaturabsenkung bis ca. -180°C wurde der Behälter 3 samt Hornhautgewebe 1 in einen Kühlautomaten eingebracht und dort mit einer Kühlrate von -2°C/min abgekühlt. Zur Aushärtung des Glases wurde die Temperatur bei -150°C für 10 Minuten konstant ge halten. Für die stufenweise Temperaturabsenkung in diesem zweiten Schritt wird bevorzugt ein programmierbarer Einfrierautomat (z. B. Cryo son BV-10) eingesetzt. Anschließend kann das Gefriergut direkt in flüs sigen Stickstoff eingebracht und bei -196°C gelagert werden.In order to further reduce the temperature down to approx. -180 ° C, the container 3 together with the corneal tissue 1 was placed in an automatic refrigerator and cooled there at a cooling rate of -2 ° C / min. To harden the glass, the temperature was kept constant at -150 ° C for 10 minutes. A programmable automatic freezer (e.g. Cryo son BV-10) is preferably used to gradually lower the temperature in this second step. The frozen food can then be placed directly in liquid nitrogen and stored at -196 ° C.

Claims

1. A method for vitrification of corneal tissue, wherein the corneal tissue ( 1 ) in a container ( 3 ) with a vitrification solution ( 2 ) is cooled to a temperature at which the corneal tissue ( 1 ) vitrifi ziert, characterized in that as virtrifying corneal tissue ( 1 ) tissue from posterior corneal lamella (parts of the stroma, the Descemet membrane, the endothelium) is used.

2. The method according to claim 1, characterized in that the used rear corneal lamellae ( 1 ) make up approximately 6% to 20%, preferably approximately 11% to 12%, of the volume of the entire cornea.

3. A method for vitrifying corneal tissue, in particular according to one of the preceding claims, wherein the corneal tissue ( 1 ) in a container ( 3 ) with a vitrification solution ( 2 ) is cooled to a temperature at which the corneal tissue ( 1 ) vitrifies, thereby characterized in that the container ( 3 ) used is one which is essentially inert to the corneal tissue ( 1 ) on the inside of the container.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a fluoropolymer, in particular Polytetrafluorethy len (Teflon®), is used as the inside material of the container ( 3 ).

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the container ( 3 ) with polyimide, in particular Kapton®, is used on its outside.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the container ( 3 ) after introducing the corneal tissue bes ( 1 ) is welded.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a transparent container ( 3 ) is used.

8. A method for vitrification of corneal tissue, in particular according to one of the preceding claims, wherein the corneal tissue ( 1 ) in a container ( 3 ) with a vitrification solution ( 2 ) is cooled to a temperature at which the corneal tissue ( 1 ) vitrifies, thereby indicates that less than 1 ml vitrification solution ( 2 ) in the loading container ( 3 ) are filled.

9. The method according to claim 1, characterized in that less than 0.2 ml of vitrification solution ( 2 ) in the container ( 3 ) are filled.

10. A method for vitrification of corneal tissue, in particular according to one of the preceding claims, wherein the corneal tissue ( 1 ) in a container ( 3 ) with a vitrification solution ( 2 ) is cooled to a temperature at which the corneal tissue ( 1 ) vitrifies, thereby indicates that the vitrification solution ( 2 ) is shocked to a temperature Ts slightly below the glass transition temperature Tg of the vitrification solution ( 2 ) and then further cooled in smaller temperature steps to a lower final temperature Tt.

11. The method according to claim 10, characterized in that Ts in loading range from approx. 2 ° C to 30 ° C, especially 10 ° C to 20 ° C below Tg lies.

12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a first cooling medium ( 4 ) by thermal contact with a second cooling medium ( 6 ) to a temperature below the glass transition temperature Tg of the vitrification solution ( 2 ), preferably to a temperature in the range Is temperature slightly below Tg, and that the container ( 3 ) is brought into thermal contact with the most cooling medium ( 4 ).

13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that liquefied propane or liquefied methylcyclopentane is used as the first cooling medium ( 4 ).

14. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that liquefied methylcy clopentane or nitrogen is used as the second cooling medium ( 6 ).

15. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the second cooling medium ( 6 ) via heat exchange with a third cooling medium ( 8 ), in particular liquid nitrogen, is cooled to a temperature below the glass transition temperature Tg of the vitrifi cation solution ( 2 ).

16. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a solution with the substances Dimethyl sulfoxide, 1,2-propanediol, formamide, chrondroitin sulfate is used as the vitrification solution ( 2 ).

17. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that 2,3-butanediol and / or a compound from the group of polyvinyl alcohol is used to prepare the vitrification solution ( 2 ).

18. Vitrification device for vitrification of corneal tissue for performing the method according to one of the preceding claims, with a first vessel ( 5 ) designed in this way for receiving a first cooling medium ( 4 ) that in the first cooling medium ( 4 ) a container ( 3 ) can be cooled to a temperature slightly below the glass transition temperature Tg of the vitrification solution ( 2 ) with a vitrification solution ( 2 ) and the corneal tissue ( 1 ) therein, with a second vessel ( 7 ) for receiving a second cooling medium ( 6 ) and with a device for heat transfer ( 10 ) from the second cooling medium ( 6 ) to the first cooling medium ( 4 ).

19. The apparatus according to claim 18, characterized in that the first vessel and / or the second vessel for receiving liquefied he stem and / or second cooling medium ( 4 , 6 ) are formed.

20. Device according to one of the preceding device claims, characterized in that the device for heat transfer ( 10 ) comprises a cooling line ( 10 ) for passing the first cooling medium ( 4 ) through the second vessel ( 7 ) for heat exchange with the second cooling medium ( 6 ) is guided and opens into the first vessel ( 5 ).

21. Device according to one of the preceding device claims, characterized in that the first vessel ( 5 ) and / or the cooling line ( 10 ) consist of copper.

22. Device according to one of the preceding device claims, characterized in that the section of the cooling line ( 10 ) to be brought into contact with the second cooling medium ( 6 ) is at least partially spiral-shaped.

23. Device according to one of the preceding device claims, characterized in that the first vessel ( 5 ) is arranged in the second vessel ( 7 ).

24. Device according to one of the preceding device claims, characterized by a heat exchange device for cooling the second cooling medium ( 6 ) by means of a third cooling medium ( 8 ), preferably before liquid nitrogen.