DE10080558B4 - Laser-compatible NIR marker dyes - Google Patents

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Abstract

Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen, enthaltend substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo- 3H-indolenin-, 2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridinderivate der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic

Figure 00000002
wobei
– X bzw. Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)2 steht,
– n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,
– R1-R15 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. R2 und R3, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
– mindestens einer der Substituenten R1-R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO3 -, PO3 -, COO-, oder NR3 +, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt,
– mindestens einer der Substituenten R1-R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche...Laser-compatible NIR marker dyes based on polymethines containing substituted benzooxazole, benzothiazole, 2,3,3-trimethylindolenine, the 2,3,3-trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenine , 2- and 4-picoline, lepidine, quinaldine and 9-methylacridin derivatives of the general formulas Ia or Ib or Ic
Figure 00000002
in which
X or Y is an element from the group O, S, Se or the structural element N-alkyl or C (alkyl) 2 ,
- n stands for the numerical values 1, 2 or 3,
- R 1 -R 15 are the same or different and may be hydrogen, one or more alkyl, or aryl, heteroaryl or heterocycloaliphatic radicals, a hydroxy or alkoxy group, an alkyl-substituted or cyclic amine function and / or two ortho radicals , z. B. R 2 and R 3 , together can form a further aromatic ring,
At least one of the substituents R 1 -R 15 can be an ionizable or ionized substituent, such as SO 3 - , PO 3 - , COO - , or NR 3 + , which determines the hydrophilic properties of these dyes,
- At least one of the substituents R 1 -R 15 may be a reactive group, which ...

Figure 00000001
Figure 00000001

Description

Die Erfindung betrifft sogenannte Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren. Typische Verfahrensanwendungen beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.The The invention relates to so-called laser-compatible NIR marker dyes based on polymethines for use in optical, in particular fluorescence-optical, determination and detection methods. typical Process applications are based on the reaction of dye-labeled Antigens, antibodies or DNA segments with the respective complementary species.

Einsatzmöglichkeiten ergeben sich beispielsweise in der Medizin und der Pharmazie, in der Bio- und Materialwissenschaft, bei der Umweltkontrolle und dem Nachweis von in Natur oder Technik vorkommenden organischen und anorganischen Mikroproben.applications arise, for example, in medicine and pharmacy, in of biology and materials science, in environmental control and the Evidence of occurring in nature or technology organic and inorganic micro samples.

Polymethine sind als NIR-Marker seit langem bekannt und zeichnen sich durch intensive, leicht in den NIR-Bereich verschiebbare Absorptionsmaxima aus (Fabian, J.; Nakazumi, H.; Matsuoka, M.: Chem.- Rev. 1992, 92, 1197). Bei geeignetem Substituentenmuster und π-Elektronensystem fluoreszieren sie mit ausreichender Quantenausbeute auch im NIR-Bereich. Entsprechend finden diese Verbindungen breite Anwendung in verschiedenen Bereichen der Technik, als Sensibilisatoren in AgX-Materialien, als Laserfarbstoffe, als Quantenzahler, als Indikator-Farbstoffe in der Sensorik und nicht zuletzt als Biomarker („Near-Infrared Dyes for High Technology Applications", herausgegeben von Daehne, S.; Resch-Genger, U.; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers-Dordrecht/Boston/London- 1998).polymethines have long been known and distinguished as NIR markers intense absorption maxima easily displaceable in the NIR range (Fabian, J .; Nakazumi, H .; Matsuoka, M .: Chem. Rev. 1992, 92; 1197). Fluorescent with a suitable substituent pattern and π-electron system they with sufficient quantum efficiency also in the NIR range. Corresponding These compounds find wide application in various fields technology, as sensitizers in AgX materials, as laser dyes, as quantum payer, as indicator dyes in sensor technology and not least as a biomarker ("Near-Infrared Dyes for High Technology Applications ", edited by Daehne, S .; Resch-Genger, U .; Wolfbeis, O.S., Kluwer, Academic Publishers-Dordrecht / Boston / London 1998).

Die Anzahl der als Biomarker verwendeten Polymethine ist begrenzt. Breite kommerzielle Anwendung haben in diesem Sinne bisher nur das sich vom Astraphloxin ( DE 415 534 ) abgeleitete Trimethin Cy3, bzw. das vinyloge Pentamethin Cy5 und das doppelt vinyloge Heptamethin Cy7 mit Absorptionsmaxima bei ca. 550 nm, ca. 650 nm und ca. 750 nm gefunden ( US-PS 5 627 027 ). Darüber hinaus wird das polysulfonierte, vom kommerziellen Heptamethin "Indocyaningreen" bzw. "Cardio Green" abgeleitete Trimethin Cy3.5 und Pentamethin Cy5.5 angeboten ( US-PS 5 569 766 ). In der Polymethinkette aliphatisch verbrückte Heptamethine wurden von Patonay entwickelt ( US-PS 5 800 995 ).The number of polymethines used as biomarkers is limited. Broad commercial application in this sense so far only from the Astraphloxin ( DE 415 534 ) or the vinylogous pentamethine Cy5 and the double vinylogous heptamethine Cy7 with absorption maxima at about 550 nm, about 650 nm and about 750 nm ( U.S. Patent No. 5,627,027 ). In addition, the polysulfonated trimethine Cy3.5 and pentamethine Cy5.5 derived from the commercial heptamethine "Indocyaningreen" or "Cardio Green" is available ( U.S. Patent 5,569,766 ). Aliphatic bridged heptamethines in the polymethine chain have been developed by Patonay ( U.S. Patent 5,800,995 ).

Charakteristisch für alle kommerziellen Biomarker sind die sich vom Inden (Fischer-Base) bzw. Heteroinden ableitenden terminalen Heteroaromaten. Werden methylsubstituierte Cycloimonium-Salze dieses Typs als terminale Polymethin-Bausteine verwendet, so ist es notwendig, mindestens fünf aufeinander folgende sp2-hybridisierte Kohlenstoffatome (Pentamethine) zwischen den Heterocyclen anzuordnen um Absorptionsmaxima an der Grenze zum NIR-Bereich zu erzeugen.Characteristic of all commercial biomarkers are the inden (Fischer base) or heteroindene-derived terminal heteroaromatics. When methyl-substituted cycloimonium salts of this type are used as terminal polymethine building blocks, it is necessary to arrange at least five consecutive sp 2 -hybridized carbon atoms (pentamethines) between the heterocycles to generate absorption maxima at the boundary to the NIR range.

Ein wesentlicher Nachteil der als Biomarker technisch genutzten NIR-Polymethin besteht darin, daß mit Verlängerung der Polymethinkette im steigenden Maße nucleopile bzw. elektrophile Angriffsmöglichkeiten auf die Kette gegeben sind, in deren Folge es zur Zerstörung des π-Systems kommt. Neben der ungenügenden thermischen und photochemischen Stabilität besteht ein weiterer wesentlicher Mangel der Polymethin darin, daß sie neben ihren intensiven Absorptionsmaxima keine weiteren Absorptionsbanden im sichtbaren Spektralbereich aufweisen und in diesem Spektrum, insbesondere durch Argon-Laser mit einer Emissonswellenlänge von λem = 488 nm oder He/Ne-Laser mit λem = 633 nm bzw. entsprechende Laserdioden ab λem = 670 nm, nicht unmittelbar angeregt werden können. Speziell die für "multiple color fluorescence assay's" geeigneten Biomarker können aber nur durch diskrete, vom π-System des Polymethins vorgegebene Lichtquellen (wie die vorgenannten) zur Anregung gebracht werden. Um dennoch derartige Anwendungen zu ermöglichen (bei der Nutzung von "multiple color fluorescence assay's" ist es notwendig mit beispielsweise einer dieser Anregungslichtquellen verschiedene Biomarker mit deutlich unterschiedlichen Emissionmaxima anzuregen), erfolgt die Anregung von Cy5 durch einen Argon-Laser, indem beispielsweise mit Hilfe von Energietransfer über die Anregung von Fluorescein → Rhodamin → Texas Red → Cy5 eine Emission über die Anregung von Licht an der Grenze zum NIR-Bereich bewirkt wird ( US-PS 5 800 996 ). Weitere Möglichkeiten zur Anregung von Cy5, beispielsweise durch einen Argon-Laser bestehen darin, Mikropartikel aus intrinsischen Fluorophoren (Phycobiliproteinen) und dem extrinsischen Cy5 zu erzeugen, die über Energiekaskaden die Anregung des bei 650 nm absorbierenden Cy5-Derivates gestatten (Szöllösi, J.; Damjanovich, S.; Matyus, L.: Cytometry 1998, 34, 159).A major disadvantage of the NIR polymethine, which is used industrially as a biomarker, is that with extension of the polymethine chain there are increasing amounts of nucleopile or electrophilic attack possibilities on the chain, as a result of which the π system is destroyed. In addition to the insufficient thermal and photochemical stability, another essential deficiency of polymethine is that apart from their intense absorption maxima, they have no further absorption bands in the visible spectral range and in this spectrum, in particular by argon lasers having an emisson wavelength of λ em = 488 nm or He / Ne laser with λ em = 633 nm or corresponding laser diodes from λ em = 670 nm, can not be directly excited. In particular, the biomarkers suitable for "multiple color fluorescence assay's" can only be excited by discrete light sources predefined by the π system of the polymethine (such as the abovementioned ones). In order nevertheless to enable such applications (when using "multiple color fluorescence assay's" it is necessary to excite different biomarkers with distinctly different emission maxima with, for example, one of these excitation light sources), the excitation of Cy5 by an argon laser, for example by means of Energy transfer via the excitation of fluorescein → rhodamine → Texas Red → Cy5 emission is caused by the excitation of light at the boundary to the NIR region ( U.S. Patent 5,800,996 ). Other possibilities for excitation of Cy5, for example by means of an argon laser, are to generate microparticles of intrinsic fluorophores (phycobiliproteins) and the extrinsic Cy5, which permit the excitation of the 650 nm absorbing Cy5 derivative via energy cascades (Szöllösi, J .; Damjanovich, S., Matyus, L .: Cytometry 1998, 34, 159).

Von Gupta ( US-PS 5 783 673 ) werden Farbstoff-Konjukate beschrieben, die durch die Reaktion von Phycobiliprotein mit aktivierten Fluorescein, Texas Red oder Cy5-Farbstoffen (Phycobiliprotein/Amine-Reactive Dye – PARD) dargestellt wurden. Diese so erhaltenen Farbstoff-Konjugate zeigen im sichtbaren Spektralbereich zusätzliche Absorptionsbanden, die zur Anregung genutzt werden können. Nachteilig an diesen Proben sind die hohe Molmasse, die aufwendige Präparation und die geringe Stabilität dieser Marker-Farbstoffe.From Gupta ( U.S. Patent 5,783,673 ) describes dye-conjugates which were prepared by the reaction of phycobiliprotein with activated fluorescein, Texas Red or Cy5 dyes (phycobiliprotein / amine-reactive dye-PARD). These dye conjugates thus obtained show additional absorption bands in the visible spectral range, which can be used for excitation. Disadvantages of these samples are the high molecular weight, the complicated preparation and the low stability of these marker dyes.

Ein weiteres Beispiel für die Anregung von an sich bei 488 nm nicht absorbierenden Pentamethinen gibt Glazer ( US-PS 5 760 201 ). Durch die kovalente Verknüpfung mit einem im gewünschten Bereich absorbierenden Monomethin über mehrere ammoniumhaltige optimierte Alkylspacer wird zusätzlich eine starke Affinität zur DNA erreicht (spezifische Ionenbindung). Auch hier ist ein entsprechender Verfahrensaufwand zur Anregung unumgänglich. Weitere Nachteile dieser Marker-Farbstoffe bestehen in einer ungenügenden Photo- oder Lagerstabilität, in aufwendigen Synthese- und Reinigungsschritten, in geringen Absorptionskoeffizienten bzw. einer unbefriedigenden Fluoreszenzquantenausbeute sowie in unerwünschten Änderungen der optischen Eigenschaften in Gegenwart von Proteinen oder Nucleinsäureoligomeren bzw. nach Bindung an diese.Another example of the excitation of per se at 488 nm non-absorbing pentamethines gives Glazer ( U.S. Patent 5,760,201 ). By covalent linkage with a monomethin absorbing in the desired range over several ammonium-containing optimized alkyl spacers, a strong affinity to the DNA is additionally achieved (specific ion binding). Again, a corresponding process cost for stimulation is inevitable. Further disadvantages of these marker dyes are insufficient photo- or storage stability, complicated synthesis and purification steps, low absorption coefficients or an unsatisfactory fluorescence quantum yield and undesirable changes in the optical properties in the presence of proteins or nucleic acid oligomers or after binding thereto.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, NIR-Marker-Farbstoffe auf Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im sichtbaren oder im nahen IR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht eines Argon-, Helium/Neon- oder Diodenlasers zur Fluoreszenz angeregt werden können.Of the Invention is based on the object, NIR marker dyes on Polymethine base with high photo and storage stability as well high fluorescence yield to create in the simplest possible way Laser radiation in the visible or in the near IR spectral range, in particular with light an argon, helium / neon or diode laser excited to fluoresce can be.

Erfindungsgemäß werden Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen eingesetzt, die substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenin-, 2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridinderivate der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic

Figure 00030001
enthalten mit Z als
Figure 00040001
wobei

  • – X bzw. Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)2 steht,
  • – n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht,
  • – R1-R15 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. R2 und R3, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
  • – mindestens einer der Substituenten R1-R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO3 -, PO3 -, COO-, oder NR3 +, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt,
  • – mindestens einer der Substituenten R1-R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht und
  • – U-V bzw. U'-V' gleich oder unterschiedlich sind und aus Wasserstoff, aus einer gesättigten aliphatischen, heteroaliphatischen oder aus einer Lacton- bzw. Thiolactongruppierung bestehen können.
According to the invention, marker dyes based on polymethines which contain substituted benzooxazole, benzothiazole, 2,3,3-trimethylindolenine, 2,3,3-trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenine, 2 - And 4-picoline, lepidine, quinaldine and 9-methylacridin derivatives of the general formulas Ia or Ib or Ic
Figure 00030001
included with Z as
Figure 00040001
in which
  • X or Y is an element from the group O, S, Se or the structural element N-alkyl or C (alkyl) 2 ,
  • - n stands for the numerical values 1, 2 or 3,
  • - R 1 -R 15 are the same or different and may be hydrogen, one or more alkyl, or aryl, heteroaryl or heterocycloaliphatic radicals, a hydroxy or alkoxy group, an alkyl-substituted or cyclic amine function and / or two ortho radicals , z. B. R 2 and R 3 , together can form a further aromatic ring,
  • At least one of the substituents R 1 -R 15 has an ionizable or ionized substituent, such as SO 3 - , PO 3 - , COO - , or NR 3 + , which determines the hydrophilic properties of these dyes,
  • - At least one of the substituents R 1 -R 15 may be a reactive group, which allows a covalent linkage of the dye with the above-mentioned carrier molecules and
  • - UV or U'-V 'are the same or different and may consist of hydrogen, a saturated aliphatic, heteroaliphatic or a lactone or Thiolactongruppierung.

In den Unteransprüchen 2–11 sind spezielle Ausführungsformen zu den Marker-Farbstoffen aufgeführt.In the dependent claims Are 2-11 special embodiments to the marker dyes listed.

Diese substituierten Indol-, Heteroindol-, Pyridin-, Chinolin- oder Acridinderivate der allgemeinen Formel Ia oder Ib oder Ic können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Mikropartikeln, z. B. von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische Zeilen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymerer Trägermaterialien verwendet werden.These substituted indole, heteroindole, pyridine, quinoline or acridine derivatives of general formula Ia or Ib or Ic can be used as dyes for optical Marking of organic or inorganic microparticles, eg. Of proteins, nucleic acids, DNA, biological cells, lipids, drugs or organic or inorganic polymeric support materials be used.

Die Markierung der Partikel kann dabei durch die Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Markern der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic und dem zu markierenden Materialien erfolgen.The Marking of the particles can be achieved by the formation of ionic Interactions between the markers of general formulas Ia or Ib or Ic and the materials to be marked.

Die gegenüber Nucleophilen aktivierten funktionellen Gruppen dieser Marker vermögen kovalent an eine OH-, NH2- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Materialien, wie den besagten Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren.The nucleophilic-activated functional groups of these labels are capable of covalently coupling to an OH, NH 2 or SH function. Thus, a system for the qualitative or quantitative determination of organic and inorganic materials, such as the said proteins, nucleic acids, DNA, biological cells, lipids, pharmaceuticals or organic or inorganic polymers.

Diese Kopplungsreaktion kann in wäßriger oder überwiegend wäßriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.These Coupling reaction can be in aqueous or predominantly aqueous solution and preferably be carried out at room temperature. It arises a conjugate with fluorescent properties.

Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic und davon abgeleitete Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), Erforschung des Genoms und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Troughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (Genchips).Either the compounds of the general formulas Ia or Ib or Ic and derived systems can in optical, in particular fluorescence optical, qualitative and quantitative determination method for the diagnosis of cell properties, in biosensors (point of care measurements), genome research and in miniaturization technologies. typical Applications are in cytometry and cell sorting, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in ultra-high-throughput screening (UHTS), in multicolor Fluorescence in situ hybridization (FISH) and in microarrays (gene chips).

Durch die Darstellung von nichtsymmetrischen Polymethinen, die einerseits als terminale Funktion einen leicht derivatisierbaren Heterocyclus vom Typ der Pyridin-, Chinolin-, Indol-, Heteroindol- bzw. Acridinderivate sowie andererseits einen neuartigen 6-Ringheterocyclus aufweisen, werden insbesondere nachfolgende Vorteile erreicht:
Bereits Trimethine absorbieren im Spektralbereich > 650 nm und zeigen eine gegenüber den bisher bekannten Polymethinen mit Absorptionsmaxima > 650 nm (Penta- und Heptamethine) eine wesentlich verbesserte photochemische und thermische Stabilität.By the representation of non-symmetrical polymethines, which have on the one hand as a terminal function an easily derivatizable heterocycle of the type of pyridine, quinoline, indole, heteroindole or acridine derivatives and on the other hand, a novel 6-ring heterocycle, in particular the following advantages are achieved:
Already trimethines absorb in the spectral range> 650 nm and show a significantly improved photochemical and thermal stability compared to the previously known polymethines with absorption maxima> 650 nm (penta- and heptamethines).

Durch „molecular engineering" ist es möglich, Lage und Intensität der Absorptions- und Emissionsmaxima beliebig zu steuern und den Emissionswellenlängen unterschiedlicher Anregungslaser, vor allem NIR-Laserdioden, anzupassen.By "molecular engineering "is it is possible Location and intensity to control the absorption and emission maxima arbitrarily and the Emission wavelengths different excitation laser, especially NIR laser diodes, adapt.

Bedingt durch die Auswahl geeigneter terminaler Heterocyclen zeigen die erfindungsgemäßen Farbstoffe zusätzliche Absorptionsmaxima im sichtbaren bzw. NIR-Spektralbereich, die zur Anregung, beispielsweise mit einem Argon-Laser genutzt werden können. Diese Farbstoffe sind insbesondere zur Anwendung in „multiple color fluorescence assay's" geeignet.conditioned by the selection of suitable terminal heterocycles show the dyes of the invention additional Absorption maxima in the visible or NIR spectral range, for excitation, for example can be used with an argon laser. These dyes are especially for use in "multiple color fluorescence assay's "suitable.

Die Marker-Farbstoffe sind durch relativ einfache und in zwei Stufen durchzuführende Synthese herstellbar, mit welcher eine Vielzahl unterschiedlich funktionalisierter Farbstoffe, beispielsweise hinsichtlich der Gesamtladung des Farbstoffes und der Anzahl, Spezifität und Reaktivität der zur Immobilisierung genutzten aktivierten Gruppen, anwendungsspezifisch zur Verfügung gestellt werden kann.The Marker dyes are relatively simple and in two stages to be performed Synthesis producible, with which a variety of different functionalized dyes, for example, in terms of total charge of the dye and the number, specificity and reactivity of the Immobilization used activated groups, application specific to disposal can be made.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The Invention will be described below with reference to the drawing embodiments be explained in more detail.

Es zeigen:It demonstrate:

1: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 1 und 2 1 Syntheses according to embodiments 1 and 2

2: Synthese gemäß Ausführungsbeispiel 3 2 : Synthesis according to Embodiment 3

3: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 4 bis 6 3 Syntheses according to embodiment 4 to 6

4: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 7 und 8 4 Syntheses according to embodiment 7 and 8

5: Absorptionsspektrum von C 1601 5 : Absorption spectrum of C 1601

6: Emissionsspektrum von C 1601 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser) 6 : Emission spectrum of C 1601 (free, bound, 670 nm diode laser)

7: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 11 und 12 7 Syntheses according to embodiment 11 and 12

8: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 13 und 14 8th Syntheses according to exemplary embodiments 13 and 14

9: Absorptionsspektrum von C 1591 – NHS-ester 9 : Absorption spectrum of C 1591 - NHS ester

10: Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser) 10 : Emission spectrum of C 1591 (free, bound, 670 nm diode laser)

11: Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 488 nm Ar-Ionenlaser) 11 : Emission spectrum of C 1591 (free, bound, 488 nm Ar ion laser)

12: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 19 und 20 12 Syntheses according to embodiments 19 and 20

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 2-(2-Ethoxyethenyl)-7-diethylamino-benzo[b]pyrylium perchloraten C 1595 und L 107, vgl. 1:General procedure for the preparation of 3.1-bridged 2- (2-ethoxyethenyl) -7-diethylamino-benzo [b] pyrylium perchlorates C 1595 and L 107, cf. 1 :

0,01 mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]pyrylium perchlorat der Formel 1a oder 1b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 2,0 g Triethoxymethan kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt und aus Eisessig umkristallisiert.0.01 mol of a 2-methylene-7-diethylamine-benzo [b] pyrylium perchlorate of formula 1a or 1b are dissolved in 40 ml of acetic anhydride and with 2.0 g of triethoxymethane briefly heated. The failing after about an hour Precipitate is filtered off and recrystallized from glacial acetic acid.

1: 6-Diethylamino-4-ethoxymethylen-1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> perchlorat C 1595:1: 6-Diethylamino-4-ethoxymethylene-1,2,3,4-tetrahydro-dibenzo [b; e] pyrylium perchlorate C 1595:

  • 3,58 g (87%) Ausbeute, 178°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CDCl3): 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.78–1.82 (m, 2H), 2.54 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.59 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.53 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.3, J = 9.3 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 8.52 (s, 1H). – 13C NMR (CDCl3): 12.5, 15.6, 20.2, 21.8, 27.8, 45.8, 73.1, 97.1, 108.3, 115.4, 115.8, 120.3, 130.6, 145.6, 154.8, 157.8, 163.0, 167.9. – C20H26ClNO6 (411.88): ber. C 58.32, H 6.36, Cl 8.61, N 3.40, gef. C 57.75, H 6.58, Cl 8.43, N 3.46.3.58 g (87%) yield, 178 ° C melting point. 1 H NMR (CDCl 3 ): 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.78-1.82 (m, 2H), 2.54 (t, J = 6.0 Hz , 2H), 2.75 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.59 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.53 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.3, J = 9.3 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 8.52 (s, 1H). - 13 C NMR (CDCl3): 12.5, 15.6, 20.2, 21.8, 27.8, 45.8, 73.1, 97.1, 108.3, 115.4, 115.8, 120.3, 130.6, 145.6, 154.8, 157.8, 163.0, 167.9. C 20 H 26 ClNO 6 (411.88): calc. C 58.32, H 6.36, Cl 8.61, N 3.40, m.p. C 57.75, H 6.58, Cl 8.43, N 3.46.

2: 3-Diethylamino-6-ethoxymethylen-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat L 107:2: 3-Diethylamino-6-ethoxymethylene-7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene> perchlorate L107:

  • 3,96 g (93%) Ausbeute, 158-60°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CDCl3): 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.75–1.77 (m, 2H), 1.85–1.87 (m, 2H), 2.58–2.61 (m, 2H), 2.79–2.83 (m, 2H), 3.58 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.56 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.99 (dd, J = 2.4, J = 9.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 8.18 (s, 1H). – 13C NMR (CDCl3): 12.5, 15.5, 21.1,23.8, 25.1, 29.2, 45.8, 72.4, 96.3, 113.2, 116.1, 116.3, 124.2, 130.8, 149.0, 155.0, 157.9, 162.8, 171.0. – C21H28ClNO6 (425.91): ber. C 59.22, H 6.63, Cl 8.32, N 3.29, gef. C 58.76, H 6.39, Cl 8.75, N 3.34.3.96 g (93%) yield, 158-60 ° C melting point. 1 H NMR (CDCl 3 ): 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.75-1.77 (m, 2H), 1.85-1.87 (m, 2H) , 2.58-2.61 (m, 2H), 2.79-2.83 (m, 2H), 3.58 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.56 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.99 (dd, J = 2.4 , J = 9.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 8.18 (s, 1H). 13 C NMR (CDCl 3 ): 12.5, 15.5, 21.1, 23.8, 25.1, 29.2, 45.8, 72.4, 96.3, 113.2, 116.1, 116.3, 124.2, 130.8, 149.0, 155.0, 157.9, 162.8, 171.0. C 21 H 28 ClNO 6 (425.91): calc. C 59.22, H 6.63, Cl 8.32, N 3.29, m.p. C 58.76, H 6.39, Cl 8.75, N 3.34.

3: 3-Diethylamino-6-[3-(N-acetylanilino)-prop-2-yliden]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1590, vgl. 2:3: 3-Diethylamino-6- [3- (N-acetylanilino) -prop-2-ylidene] -7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene> perchlorate C 1590, cf. 2 :

2,13 g (0,005 mol) 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]pyrylium perchlorat der Formel 1b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 1,29 g (0,005 mol) (3-Anilinopropenyliden)-phenyl-ammoniumchlorid kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert: 2,00 g (74%) Ausbeute, 216-20°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CD3NO2): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.64–1.69 (m, 2H), 1.82–1.87 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 2.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.61 (dd, J = 11.8 Hz, J = 13.5 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 2.4 Hz, J = 9.4 Hz, 1H), 7.36–7.39 (m, 2H), 7.54–7.65 (m, 4H), 8.21 (s, 1H), 8.27 (d, J = 13.5 Hz, 1H). – 13C NMR (CD3NO2): 12.8, 23.5, 25.2, 25.8, 25.9, 30.4, 47.2, 96.2, 109.9, 119.0, 119.3, 127.4, 129.9, 130.6, 130.7, 131.7, 132.0, 132.5, 140.1, 142.2, 151.3, 157.2, 160.1, 169.7, 171.2. – C29H33ClN2O6 (541.04): ber. C 64.38, H 6.15, Cl 6.55, N 5.18, gef. C 63.73, H 6.15, Cl 6.81, N 5.07.2.13 g (0.005 mol) of 2-methylene-7-diethylamine-benzo [b] pyrylium perchlorate of the formula 1b are dissolved in 40 ml of acetic anhydride and 1.29 g (0.005 mol) of (3-anilinopropenylidene) -phenyl-ammonium chloride briefly heated. The precipitate after about one hour precipitate is filtered off, washed with ether and recrystallized from glacial acetic acid: 2.00 g (74%) yield, 216-20 ° C melting point. 1 H NMR (CD 3 NO 2 ): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.64-1.69 (m, 2H), 1.82-1.87 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 2.49 ( t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.61 (dd, J = 11.8 Hz, J = 13.5 Hz, 1H) , 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 2.4 Hz, J = 9.4 Hz, 1H), 7.36-7.39 (m, 2H), 7.54-7.65 (m, 4H), 8.21 ( s, 1H), 8.27 (d, J = 13.5 Hz, 1H). 13 C NMR (CD 3 NO 2 ): 12.8, 23.5, 25.2, 25.8, 25.9, 30.4, 47.2, 96.2, 109.9, 119.0, 119.3, 127.4, 129.9, 130.6, 130.7, 131.7, 132.0, 132.5, 140.1, 142.2 , 151.3, 157.2, 160.1, 169.7, 171.2. C 29 H 33 ClN 2 O 6 (541.04): C 64.38, H 6.15, Cl 6.55, N 5.18, gef. C 63.73, H 6.15, Cl 6.81, N 5.07.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 2-[6-(N-acetylanilino)-hexatrien-1.3.5-yliden]-benzo[b]pyrylium und thiopyrylium perchloraten C 1586, C 1573 und C 1574, vgl. 3:General procedure for the preparation of 3,1-bridged 2- [6- (N-acetylanilino) hexatriene-1,3,5-ylidene] benzo [b] pyrylium and thiopyrylium perchlorates C 1586, C 1573 and C 1574, cf. 3 :

0,005 mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[b]-pyrylium perchlorat der Formel 1a, 1b oder ein 2-Methylen-4.6-diphenyl-thiopyrylium perchlorat der Formel 1c werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 1,42 g (0,005 mol) (5-Anilinopenta-2.4-dienyliden)-phenyl-ammonium chlorid kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert.0.005 mol of a 2-methylene-7-diethylamine-benzo [b] -pyrylium perchlorate of the formula 1a, 1b or a 2-methylene-4.6-diphenyl-thiopyrylium Perchlorate of formula 1c are dissolved in 40 ml of acetic anhydride and with 1.42 g (0.005 mol) of (5-anilinopenta-2,4-dienylidene) -phenyl-ammonium chloride briefly heated. The after about one hour failing precipitation is filtered off, washed with ether and recrystallized from glacial acetic acid.

4: 6-Diethylamino-4-[5-(N-Acetylanilino)-penta-2.4-dienyliden]-1.2.3.4.-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> perchlorat C 1586: 4: 6-Diethylamino-4- [5- (N-acetylanilino) -penta-2,4-dienylidene] -1.2.3.4.-tetrahydro- <dibenzo [b; e] pyrylium> perchlorate C 1586:

  • 2,65 g (96%) Ausbeute, 246-48°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CD3NO2): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.84–1.88 (m, 2H), 2.08 (s, 3H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.85 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.38 (dd, J = 11.4 Hz, J = 13.8 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1H), 7.00–7.08 (m, 2H), 7.27–7.33 (m, 3H), 7.56–7.62 (m, 3H), 7.71–7.75 (m, 2H), 8.00 (d, J 13.8 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H). – C30H33ClN2O6 (553.05): ber. C 65.15, H 6.01, Cl 6.41, N 5.07, gef. C 63.57, H 6.08, Cl 6.14, N 4.92.2.65 g (96%) yield, 246-48 ° C melting point. 1 H NMR (CD 3 NO 2 ): 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.84-1.88 (m, 2H), 2.08 (s, 3H), 2.67 (t, J = 5.7 Hz, 2H) , 2.85 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.38 (dd, J = 11.4 Hz, J = 13.8 Hz, 1H), 6.55 (dd, J = 11.9 Hz , J = 14.3 Hz, 1H), 7.00-7.08 (m, 2H), 7.27-7.33 (m, 3H), 7.56-7.62 (m, 3H), 7.71-7.75 (m, 2H), 8.00 (d, J 13.8 Hz, 1H), 8.12 (s, 1H). C 30 H 33 ClN 2 O 6 (553.05): calc. C 65.15, H 6.01, Cl 6.41, N 5.07, m.p. C 63.57, H 6.08, Cl 6.14, N 4.92.

5: 3-Diethylamino-6-[5-(N-acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1573: 5: 3-Diethylamino-6- [5- (N-acetylanilino) -penta-2,4-dienylidenes] -7.8.9,10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene perchlorate C 1573:

  • 2,61 g (92%) Ausbeute, 202°C Schmelzpunkt. – 1H NMR (CD3NO2): 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.78–1.82 (m, 2H), 1.90–1.94 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.76 (t, J = 6 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.75 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.39 (dd, J = 11.3 Hz, J = 13.9 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1H), 6.98–7.06 (m, 2H), 7.32–7.36 (m, 3H), 7.52–7.63 (m, 4H), 7.77 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H). – 13C NMR (CD3NO2): 12.3, 22.9, 25.2, 25.5, 25.7, 30.2, 46.8, 95.7, 114.5, 118.7, 119.1, 126.0, 127.7, 129.7, 130.1, 131.1, 131.5, 132.1, 137.8, 140.1, 142.1, 144.4, 150.8, 156.9, 159.8, 169.3, 170.3. – C31H35ClN2O6 (567.08): ber. C 65.66, H 6.22, Cl 6.25, N 4.94, gef. C 64.42, H 6.27, Cl 6.13, N 4.78.2.61 g (92%) yield, 202 ° C melting point. 1 H NMR (CD 3 NO 2 ): 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.78-1.82 (m, 2H), 1.90-1.94 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.76 ( t, J = 6 Hz, 2H), 2.95 (t, J = 6 Hz, 2H), 3.75 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.39 (dd, J = 11.3 Hz, J = 13.9 Hz, 1H) , 6.57 (dd, J = 11.9 Hz, J = 14.3 Hz, 1H), 6.98-7.06 (m, 2H), 7.32-7.36 (m, 3H), 7.52-7.63 (m, 4H), 7.77 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H). 13 C NMR (CD 3 NO 2 ): 12.3, 22.9, 25.2, 25.5, 25.7, 30.2, 46.8, 95.7, 114.5, 118.7, 119.1, 126.0, 127.7, 129.7, 130.1, 131.1, 131.5, 132.1, 137.8, 140.1 , 142.1, 144.4, 150.8, 156.9, 159.8, 169.3, 170.3. C 31 H 35 ClN 2 O 6 (567.08): calc. C 65.66, H 6.22, Cl 6.25, N 4.94, m.p. C 64.42, H 6.27, Cl 6.13, N 4.78.

6: 8-[5-(N-Acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-2.4-diphenyl-5.6.7.8-tetrahydro-<benzo[b]thiopyrylium>perchlorat C 1574:6: 8- [5- (N-acetylanilino) -penta-2,4-dienylidenes] -2,4-diphenyl-5,6,7,8-tetrahydro-benzo [b] thiopyrylium perchlorate C1574:

2,37 g (79%) Ausbeute, 216-18°C Schmelzpunkt. – C34H30ClNO5S (600.13): ber. C 68.05, H 5.04, Cl 5.91, N 2.33, S 5.34, gef. C 67.34, H 5.03, Cl 5.67, N 2.24, S 5.18.2.37 g (79%) yield, 216-18 ° C melting point. C 34 H 30 ClNO 5 S (600.13): calc. C 68.05, H 5.04, CI 5.91, N 2.33, S 5.34, et. C 67.34, H 5.03, Cl 5.67, N 2.24, S 5.18.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 7-Diethylamino-2-[3-(1-alkyl-3.3-dimetyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden)-propen-1-yl]-benzo[b]pyrylium perchloraten C 1592 und C 1601, vgl. 4:General procedure for the preparation of 3,1-bridged 7-diethylamino-2- [3- (1-alkyl-3,3-dimetyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) -propen-1-yl] -benzo [b] pyrylium perchlorate C 1592 and C 1601, cf. 4 :

In einer ersten Variante werden 0,005 mol von einem Indolderivat 2a bzw. 2b (Mujumdar, R. T.; Ernst, L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis, C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) zusammen mit 2,13 g (0,005 mol) L 107 in 30 ml Acetanhydrid und 10 Tropfen Piperidin für ca. zehn Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol/Aceton 1:1) gereinigt.In a first variant, 0.005 mol of an indole derivative 2a and 2b (Mujumdar, R.T., Ernst, L.A., Mujumdar, S.R., Lewis, C.J .; Wagoner, A. S .: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) with 2.13 g (0.005 mol) of L 107 in 30 ml of acetic anhydride and 10 drops Piperidine for heated under reflux for about ten minutes. To cooling the crude product is precipitated with ethyl ether and by column chromatography (Silica gel, methanol / acetone 1: 1).

In einer zweiten Variante kommen (wie in 4 angedeutet) anstelle von L 107 2,13 g (0,005 mol) von einem Perchlorat 3b (Kanitz, A.; Hartmann, H.; Czerney, P.: J. Prakt. Chem. 1998, 340, 34) zur Anwendung. Dabei ist es notwendig, die Reaktionszeit um ca. zehn Minuten zu erhöhen.In a second variant come (as in 4 indicated) instead of L 107 2.13 g (0.005 mol) of a perchlorate 3b (Kanitz, A., Hartmann, H., Czerney, P .: J. Prakt Chem., 1998, 340, 34) are used. It is necessary to increase the reaction time by about ten minutes.

7: 3-Diethylamino-6-[2-(1-n-butyl-3.3-dimethyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden)-ethylidenl]-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1592:7: 3-Diethylamino-6- [2- (1-n-butyl-3,3-dimethyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene) ethylidene] -7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene> perchlorate C 1592:

  • 1,87 g (63%) Ausbeute/Variante A, 1,34 g (45%) Ausbeute/Variante B, 216-18°C Schmelzpunkt. – HRMS-FAB (C34H43N2O): ber. 495.337539; gef. 495.335970; D = 1.569 mmU.1.87 g (63%) yield / variant A, 1.34 g (45%) yield / variant B, 216-18 ° C melting point. HRMS-FAB (C 34 H 43 N 2 O): calc. 495.337539; gef. 495.335970; D = 1,569 mmU.

8: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(4-sulfonatobutyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen>kalium C 1601:8: 3-Diethylamino-6- <2- [1- (4-sulfonatobutyl) -3,3-dimethyl-5-sulfonato-1,3-dihydro-indol-2-ylidene] -ethylidene> -7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene> potassium C 1601:

  • 1,25 g (36%) Ausbeute, 216-18°C Schmelzpunkt – HRMS-FAB (C34H42KN2O7S2): ber. 693.207053; gef. 693.203060; D = 3.99 mmU.1.25 g (36%) yield, 216-18 ° C melting point - HRMS-FAB (C 34 H 42 KN 2 O 7 S 2 ): calc. 693.207053; gef. 693.203060; D = 3.99 mmU.

9: Absorptionsspektren von C 1601:9: Absorption Spectra of C 1601:

5 zeigt das Absorptionsspektrum von C 1601 in reinem PBS (Phosphate Buffer Saline) und nach der Zugabe von Albumin aus Humanserun (HSA). 5 shows the absorption spectrum of C 1601 in pure PBS (Phosphate Buffer Saline) and after the addition of human serum albumin (HSA).

10: Fluoreszenzspekten von C 1601: 10: Fluorescence spectra of C 1601:

6 zeigt die Emissionsspektren von C 1601 (angeregt durch einen 670 nm Diodenlaser) in reinem PBS und nach der Zugabe von HSA. Die Intensität der Fluoreszenz hat sich nach der Zugabe von HSA um den Faktor fünf verstärkt. 6 shows the emission spectra of C 1601 (excited by a 670 nm diode laser) in pure PBS and after the addition of HSA. The intensity of the fluorescence has increased by a factor of five after the addition of HSA.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3.1-verbrückten 7-Diethylamino-2-[3-(1-(5-carboxypentyl-3.3-dimetyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2yliden)-propen-1-yl]-benzo[b]pyrylium perchloraten C 1602 und C 1591, vgl. 7:General procedure for the preparation of 3,1-bridged 7-diethylamino-2- [3- (1- (5-carboxypentyl-3,3-dimetyl-5-sulfonato-1,3-dihydro-indol-2ylidene) -propen-1-yl] -benzo [b] pyrylium perchlorates C 1602 and C 1591, cf. 7 :

1,77 g (0,005 mol) von einem Indolderivat 2c (Mujumdar, R. T.; Ernst, L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis, C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) und 0,005 mol C 1595 bzw. L 107 werden in 40 ml einer Mischung aus Pyridin/Acetanhydrid (1/1) für ca. zehn Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol) gereinigt.1.77 g (0.005 mol) of an indole derivative 2c (Mujumdar, R.T., Ernst, L.A .; Mujumdar, S. R .; Lewis, C.J .; Wagoner, A. S .: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) and 0.005 mol C 1595 or L 107 are in 40 ml of a mixture of pyridine / acetic anhydride (1/1) for about ten Heated to reflux for minutes. After cooling it will the crude product is precipitated with ethyl ether and by column chromatography (Silica gel, methanol).

11: 6-Diethylamino-4-<2-[1-(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> betain C 1602:11: 6-Diethylamino-4- <2- [1- (5-carboxypentyl) -3,3-dimethyl-5-sulfonato-1,3-dihydro-indol-2-ylidene] -ethylidene> -1.2.3.4-tetrahydro-dibenzo [b; e] pyrylium> betaine C 1602:

  • 2,20 g (71%) Ausbeute, > 310°C Schmelzpunkt. – C35H44KN2O7S (657.89·H2O): ber. C 62.20, H 6.56, N 4.14, S 4.74, gef. C 61.74, H 6.53, N 4.06, S 4.26. – HRMS-FAB (C35H43N2O6S): ber. 619.284184; gef. 619.286390; D = –2.205 mmU.2.20 g (71%) yield,> 310 ° C melting point. C 35 H 44 KN 2 O 7 S (657.89.H 2 O): calc. C 62.20, H 6.56, N 4.14, S 4.74, et. C 61.74, H 6.53, N 4.06, S 4.26. - HRMS-FAB (C 35 H 43 N 2 O 6 S): calc 619.284184;. gef. 619.286390; D = -2,205 mmU.

12: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> betain C 1591:12: 3-Diethylamino-6- <2- [1- (5-carboxypentyl) -3,3-dimethyl-5-sulfonato-1,3-dihydro-indol-2-ylidene] -ethylidene> -7.8.9.10-tetrahydro-6H- <5-oxonia-cyclohepta [b] naphthalene> betaine C 1591:

  • 2,15 g (68%) Ausbeute, > 340°C Schmelzpunkt. – C36H46KN2O7S (671.91·H2O): ber. C 62.68, H 6.73, N 4.06, S 4.64, gef. C 62.37, H 6.61, N 4.07, S 4.34. – HRMS-FAB (C36H45N2O6S): ber. 633.299834; gef. 633.308710; D = –8.875 mmU.2.15 g (68%) yield,> 340 ° C melting point. C 36 H 46 KN 2 O 7 S (671.91.H 2 O): calc. C 62.68, H 6.73, N 4.06, S 4.64, et. C 62.37, H 6.61, N 4.07, S 4.34. HRMS-FAB (C 36 H 45 N 2 O 6 S): calc. 633.299834; gef. 633.308710; D = -8,875 mmU.

Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von NHS-ester mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), vgl. 8:General procedure for the preparation of NHS esters with N-hydroxysuccinimide (NHS) /N.N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), cf. 8th :

15 mg C 1602 bzw. C 1591, 14 mg DCC und 4 mg NHS werden in 1 ml trockenem DMF gelöst und mit 10 μl Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet.15 mg C 1602 or C 1591, 14 mg DCC and 4 mg NHS are dissolved in 1 ml dry DMF solved and with 10 μl Triethylamine added. The reaction mixture is allowed to stand for 24 hours Room temperature stirred and subsequently filtered. After removal of the solvent, the residue washed with ether and oil pump vacuum dried.

13: C 1602 NHS-ester: 13: C 1602 NHS ester:

Die Reaktion verläuft quantitativ.The Reaction proceeds quantitatively.

14: C 1591-NHS-ester: 14: C1591 NHS ester:

Die Reaktion verläuft quantitativ.The Reaction proceeds quantitatively.

15: Kovalente Markierung von Albumin aus Humanserum (HSA) mit C 1591 NHS-ester:15: Covalent labeling of albumin Human serum (HSA) with C 1591 NHS ester:

C 1591-NHS-ester (ca. 0,5 mg) werden in 50 μl DMF und 5 mg HSA in 750 μl Bicarbonatpuffer (0.1 mol/l, pH = 9.0) gelöst. Beide Lösungen werden langsam vereint und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das markierte HSA durch Gelchromatographie vom nicht gebundenen Farbstoff getrennt. Als stationäre Phase dient Sephadex G50, als Laufmittel Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7.2).C 1591 NHS esters (about 0.5 mg) are dissolved in 50 μl DMF and 5 mg HSA in 750 μl bicarbonate buffer (0.1 mol / l, pH = 9.0). Both solutions are slowly combined and stirred for 20 hours at room temperature. Subsequently, will the labeled HSA by gel chromatography from unbound Dye separated. As stationary Phase serves Sephadex G50, as eluant phosphate buffer (22 mmol / l, pH 7.2).

16: Absorptionsspektren von C 1591-Derivaten: Figure 16: Absorption spectra of C 1591 derivatives:

9 zeigt das Absorptionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden an HSA. Als Lösungsmittel wurde für beide Messungen PBS (Phosphate Buffer Saline) verwendet. 9 shows the absorption spectrum of an activated C 1591 NHS ester and C 1591 covalently bound to HSA. The solvent used was PBS (phosphate buffer saline) for both measurements.

17: Fluoreszenzspektren von C 1591-Derivaten: 17: Fluorescence spectra of C 1591 derivatives:

10 zeigt das Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden ans HSA. Zur Anregung wurde ein 670 nm Diodenlaser (Spindler & Hoyer, Leistung max. 3 mW) verwendet. Als Lösungsmittel für beide Messungen diente PBS. 10 shows the emission spectrum of an activated C 1591 NHS ester and C 1591 covalently attached to the HSA. For excitation, a 670 nm diode laser (Spindler & Hoyer, power max 3 mW) was used. The solvent used for both measurements was PBS.

18: Fluoreszenzspektren von C 1591-Derivaten: 18: Fluorescence spectra of C 1591 derivatives:

11 zeigt das Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591-NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden an HSA. Zur Anregung wurde ein 488 nm Ar-Ionenlaser (Ion Laser Technology, Leistung max. 100 mW) verwendet. Als Lösungsmittel für beide Messungen diente PBS. 11 shows the emission spectrum of an activated C 1591 NHS ester and C 1591 covalently bound to HSA. For excitation, a 488 nm Ar ion laser (Ion Laser Technology, power max 100 mW) was used. The solvent used for both measurements was PBS.

19: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(3-acetoxypropyl)-3.3-dimethyl-1.3-dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cyclohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1594, vgl. 12:19: 3-Diethylamino-6- <2- [1- (3-acetoxypropyl) -3,3-dimethyl-1,3-dihydro-indol-2-ylidene] -ethylidene-7,8,9,10-tetrahydro-6H-5-oxonia -cyclohepta [b] naphthalene> perchlorate C 1594, cf. 12 :

1,94 g (0,005 mol) 1-(1-Acetoxypropyl)-2.3.3-trimethyl-3H-indolinium iodid 2d (Brush et al., US-PS 5 808 044 ) und 2,13 g (0,005 mol) L 107 werden in einer Mischung aus jeweils 20 ml Pyridin und 20 ml Acetanhydrid ca. 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die noch acetylierte Zwischenstufe mit Ether gefallt und im Vakuum getrocknet. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch präparative Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol). 0,87 g (29%) Ausbeute, 155-62°C Schmelzpunkt. – HRMS-FAB (C35H43N2O3): ber. 539.327368; gef. 539.328510; D = –1.142 mmU.1.94 g (0.005 mol) of 1- (1-acetoxypropyl) -2,3,3-trimethyl-3H-indolinium iodide 2d (Brush et al. U.S. Patent 5,808,044 ) and 2.13 g (0.005 mol) of L 107 are heated in a mixture of 20 ml of pyridine and 20 ml of acetic anhydride for about 20 minutes under reflux. After cooling, the still acetylated intermediate is precipitated with ether and dried in vacuo. The product is purified by preparative column chromatography (silica gel, methanol). 0.87 g (29%) yield, 155-62 ° C melting point. HRMS-FAB (C 35 H 43 N 2 O 3 ): calc. 539.327368; gef. 539.328510; D = -1,142 mmU.

20: Darstellung vom C 1594 phosphoramidit, vgl. 12:20: Representation of C 1594 phosphoramidite, cf. 12 :

Zur Hydrolyse werden 200 mg C 1594 in 10 ml Methanol gelöst und unter Zugabe von 50 mg Natriumcarbonat zwei Stunden gerührt. Im Anschluß daran wird filtriert sowie der entacylierte Farbstoff durch Zugabe von Ether ausgefällt und getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in trockenem DMF gelöst und mit 0.15 ml N.N-Diisopropylamin versetzt. Zu dieser Lösung gibt man im Verlauf einer Stunde dreimal je 40 μl 2-Cyanoethyl-N.N-Diisopropylchlorophosphoramidit. Dabei wird der Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch verfolgt und nach quantitativem Ablauf der Reaktion das Produkt direkt zum Markieren von DNA eingesetzt.to Hydrolysis 200 mg C 1594 dissolved in 10 ml of methanol and Add 50 mg of sodium carbonate stirred for two hours. in the Connection to it is filtered and the entacylated dye by adding Ether precipitated and dried. The product obtained is dissolved in dry DMF and washed with 0.15 ml of N.N-diisopropylamine was added. Gives to this solution 40 μl of 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylchlorophosphoramidite are added three times in the course of one hour. The course of the reaction is monitored by thin-layer chromatography and after quantitative completion of the reaction, the product directly to Marking DNA used.

Claims (11)

Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen, enthaltend substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo- 3H-indolenin-, 2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridinderivate der allgemeinen Formeln Ia oder Ib oder Ic
Figure 00140001
wobei – X bzw. Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N-alkyl oder C(alkyl)2 steht, – n für die Zahlenwerte 1, 2 oder 3 steht, – R1-R15 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei ortho-ständige Reste, z. B. R2 und R3, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können, – mindestens einer der Substituenten R1-R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO3 -, PO3 -, COO-, oder NR3 +, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt, – mindestens einer der Substituenten R1-R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit Trägermolekülen ermöglicht und – U-V bzw. U'-V' gleich oder unterschiedlich sind und aus Wasserstoff, aus einer gesättigten aliphatischen, heteroaliphatischen oder aus einer Lacton- bzw. Thiolactongruppierung bestehen können.Laser-compatible NIR marker dyes based on polymethines containing substituted benzooxazole, benzothiazole, 2,3,3-trimethylindolenine, the 2,3,3-trimethyl-4,5-benzo-3H-indolenine , 2- and 4-picoline, lepidine, quinaldine and 9-methylacridin derivatives of the general formulas Ia or Ib or Ic
Figure 00140001
wherein - X or Y is an element from the group O, S, Se or the structural element N-alkyl or C (alkyl) 2 , - n is the numerical value 1, 2 or 3, - R 1 -R 15 is the same or are different and can be hydrogen, one or more alkyl, or aryl, heteroaryl or heterocycloaliphatic radicals, a hydroxy or alkoxy group, an alkyl-substituted or cyclic amine function and / or two ortho radicals, for. B. R 2 and R 3 , together form another aromatic ring, - at least one of the substituents R 1 -R 15 an ionizable or ionized substituents such as SO 3 - , PO 3 - , COO - , or NR 3 + , can represent, which determines the hydrophilic properties of these dyes, - at least one of the substituents R 1 -R 15 may represent a reactive group which allows a covalent linkage of the dye with carrier molecules and - UV or U'-V 'same or different and may consist of hydrogen, of a saturated aliphatic, heteroaliphatic or of a lactone or Thiolactongruppierung. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt ist: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder Iodacetamide für Thiol-Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruchstücke.Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 1, characterized in that the reactive group is selected from the following functionalities: isothiocyanates, isocyanates, Monochlorotriazines, dichlorotriazines, aziridines, sulfonyl halides, N-hydroxysuccinimide ester, imido-ester, glyoxal or aldehyde for amine and hydroxy functions or maleimides or iodoacetamides for thiol functions as well as phosphoramidites for the labeling of the DNA or RNA or its fragments. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH2)m- am eigentlichen Chromophor gebunden ist, wobei m Werte von 1 bis 18 annehmen kann.Laser-compatible NIR marker dyes according to Claim 1, characterized in that the reactive group is bound to the actual chromophore via spacer groups of the general structure - (CH 2 ) m - where m can take values from 1 to 18. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- auch eine Verbrückung über vier-, fünf- und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich an dieser auch reaktive Gruppen befinden und die Substituenten A–G die gleiche Funktionalität wie die Substituenten R1-R15 besitzen können.Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 1, characterized in that the structural unit = CR 7 - also includes a bridging via four-, five- and six-membered ring systems, which are also reactive groups and the substituents A-G may have the same functionality as the substituents R 1 -R 15 . Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 2) für
Figure 00170001
Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the structural unit = CR 7 - (n = 2) for
Figure 00170001
 Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 2) für
Figure 00170002
Laser-compatible NIR marker dyes as claimed in claim 4, characterized in that the structural unit = CR 7 - (n = 2) for
Figure 00170002
 Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 3) für
Figure 00180001
Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the structural unit = CR 7 - (n = 3) for
Figure 00180001
 Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 3) für
Figure 00180002
Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the structural unit = CR 7 - (n = 3) for
Figure 00180002
 Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substituenten A–C für O, S, C(CN)2 bzw. N-R stehen, wobei R in N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einem reaktiven aliphatischen oder aromatischen Rest, wie (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2, stehen kann.Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the substituents A-C are O, S, C (CN) 2 or NR, where R in NR is an aliphatic or aromatic or a reactive aliphatic or aromatic radical such as (CH 2 ) n COOH or (CH 2 ) n NH 2 . Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent D für Cl oder ein aromatisches bzw. aliphatisches Ringsystem steht.Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 4, characterized in that the Substituent D for Cl or an aromatic or aliphatic ring system. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß an dem aromatischen bzw. aliphatischen Ringsystem reaktive Substituenten entsprechend den R1 bis R15 angebracht sind.Laser-compatible NIR marker dyes according to claim 10, characterized in that reactive substituents corresponding to R 1 to R 15 are attached to the aromatic or aliphatic ring system.
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