DE102004031258A1 - Proteinhybride mit polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen mit polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen mit polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen. Die natürlichen aromatischen Aminosäuren sind L-Phenylalanin (Phe), L-Tyrosin (Tyr) und L-Tryptophan (Trp). Da inzwischen auch das Vorkommen von D-Aminosäuren im Säugetier gesichert ist, sind auch D-Phenylalanin, D-Tyrosin und D-Tryptophan als Ausgangspunkt für solche Epitope denkbar. Gentechnisch herstellbare polyaromatische Aminosäure-Epitope bestehen aus n = 2-50 aromatischen Aminosäuren wie -(Phe)n-, -(Tyr)-, -(Trp)n-, die entweder am N- oder C-Terminus eines Zielproteins gebunden sind (Fusionsprotein). Die polyaromatischen Aminosäure-Epitope am Ende eines Fusionsproteins werden auch als "Tag" (englisch für Etikett, Markierung, bindungsaktive Molekülgruppe) bezeichnet. Poly-Phe, Poly-Tyr, Poly-Trp können auf Grund ihres aromatischen Charakters direkt über π-π oder d-π Donor-Akzeptor Wechselwirkungen mit entsprechenden π- oder d-elektronen-faltigen Verbindungen beispielsweise auf einer metallischen Oberfläche in Wechselwirkung treten. Ferner können sie nach Einführung von Hydroxylgruppen über Oxidationsverfahren in entsprechende Hydroxyverbindungen umgewandelt werden. Tyrosin ist beispielsweise eine natürliche aromatische Hydroxyverbindung. Durch Einführung einer weiteren Hydroxylgruppe in das Tyrosin entsteht beispielsweise Dihydroxyphenylalanin (DOPA) und aus einem entsprechenden Poly-Tyr (-(Tyr)n-) ein Poly-DOPA (-(DOPA)n-). Nach Untersuchungen an Muschelproteinen [1], die als "Klebstoff" für die Haftung von Muscheln (z.B. Zebramuschel) an Steinen oder Schiffskörpern dienen, spielen solche aromatischen Hydroxyverbindungen eine zentrale rolle. In diesen Proteinen findet man poylphenolische Sequenzen, die für die besonderen Haftungseigenschaften des "Klebstoffes" verantwortlich gemacht werden. Die besonderen Haftungseigenschaften beispielsweise von Poly-DOPA-Tags an Fusionsproteinen soll in dieser Erfindung genutzt werden, um Proteine selektiv und mit hoher Affinität an Metall- oder Glasoberflächen direkt zu immobilisieren.
  • Bisherige Konzepte zur Herstellung von Protein-Tags gehen in der Regel von allgemeinen Affinitätsreaktionen (Enzym-Substrat, Effektor-Rezeptor, Biotin-Avidin oder Antigen-Antikörper Reaktionen) aus und nutzen die hohen Affinitäten des einen Partners gebunden an einer Oberfläche aus um den zweiten Partner zu binden. Eine besonders verbreitete Methode ist die His-Tag Methode, bei der ein Poly-Histidin-Schwanz an einem Fusionsprotein dazu dient, einen Chelatkomplex mit immobilisierten Metallionen z.B. Zn2+, Cu2+, Ni2+ (=Metall-Chelat Affinitätstechnologie) auf einer Oberfläche zu bilden. Andere Konzepte und Techniken zur Bindung von Molekülen wie Proteinen auf Metalloberflächen beruhen beispielsweise darauf, eine nukleophile Gruppe mittels einer Silanisierungsreaktion auf der Metalloberfläche zu fixieren, die dann in einer zweiten Reaktion mit dem Protein zur Reaktion gebracht wurde und über eine kovalente Bindung die beiden Moleküle verknüpfte.
  • Nachteile der Silanisierungsverfahren sind darin zusehen, daß diese chemischen Reaktionen in wasserfreiem Milieu durchgeführt werden müssen und daher sehr arbeitsaufwendig und teuer sind. Außerdem führten diese drastischen Reaktionen häufig zur Denaturierung der immobilisierten Proteine. Ein großer Nachteil der oben geschilderten Tag-Techniken ist der, daß nicht nur das Protein gentechnisch durch Anbringung des His-Tags, sondern auch die den His-Tag bindende Oberfläche mit organischen chelatbildenden Molekülen modifiziert werden müssen, die die immobilisierten Zn2+, Cu2+ oder Ni2+-Ionen tragen, um mit dem Poly-Histidinrest reagieren zu können. Ein weiterer großer Nachteil der beschriebenen Methode ist, daß die ionentragende Oberfläche durch die relative niedrige Affinität der Chelatgruppe zu den immobilisierten Zn2+, Cu2+ oder Ni2+-Ionen instabil ist und so zur Bindung des His-Tag Proteins nur kurzzeitig genutzt werden kann.
    •
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin dem Fusionsproteine allein durch die Modifikation mit einem polyhydroxyaromatischen Tag hochaffine Bindungseigenschaften gegenüber Metalloberflächen, Glas und Keramiken zu verleihen ohne daß letztere Oberflächen vorher modifiziert werden müssen. Ferner sind die Wechselwirkungen zwischen dem polyphenolischen Tag und der Werkstoffoberfläche von wesentlich höherer Stabilität als die beispielsweise eines His-Tags, so daß Langzeitbeschichtungen möglich sind. Das Spektrum der Nutzungsmöglichkeiten einer solchen polyhydroxyaromatischen Tagtechnik würde dem der His-Tags entsprechen, jedoch mit einer beträchtlichen Erweiterung im Bereich des Tissue Engineering und der Biomaterialtechnologien.
  • Erfindungsgemäß läßt sich die oben dargestellte Aufgabe der Herstellung von Proteinen mit polyphenolischen Aminosäure-Tags dadurch lösen, daß in einem ersten Schritt chemisch (solid phase synthesis) oder bevorzugt gentechnisch polyaromatische Aminosäure-Epitope als C-terminaler oder N-terminaler Tag eines Fusionsproteins hergestellt werden. Bei einer chemischen Synthese wäre auch die Modifikation des Proteins mit einem polyhydroxyaromatischen Amniosäure-Epitop über die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes möglich. Im Falle des Fusionsproteins entspräche der Poly-Tyrosin-Tag bereits nach dem ersten Schritt einer polyphenolische Gruppe und wäre direkt für eine Bindungsreaktion z.B. auf Metalloberflächen einsetzbar. Es ist jedoch zu erwarten, daß die Einführung einer zweiten phenolischen Hydroxylgruppe in das Tyrosin zu einer Erhöhung der Spezifität der Bindung und der Affinität (=Bindungsenergie) führt. Daher sollen in einem zweiten Schritt eine oder mehrere phenolische Hydroxylgruppen in das aromatische Ringsystem des Phenylalanins, des Tyrosins oder des Tryptophans eingeführt werden. Beispielweise die Aminosäure Tyrosin (4 hydroxy Phenylalanin) kann auf diesem Wege in 3,4 Dihydroxy-phenylalanin (DOPA) überführt werden. So würde bsispielsweise aus einem Poyl-Tyrosin-Tag ein Poly-Dopa-Tag entstehen. Eine weitere Hydroxylierung zu 3,4,5-Trihydroxyphenylalanin (TOPA) ist ebenfalls möglich. Der Polyphenolische Tag z.B. Poly-DOPA-Tag soll dann wie bei den Muscheln den Proteinen besondere Haftungseigenschaften auf Metalloberflächen insbes. Übergangsmetallen, Glasoberflächen oder Keramiken verleihen, so daß eine stabile Beschichtung der Werkstoffoberflächen für vielfältige biologische, chemische und medizinische Anwendungen ermöglicht wird.
  • Polyphenolische Tags z.B. Poly-DOPA kann spezifische Bindungsreaktionen mit bestimmten Übergangsmetalloxiden auf Metalloberflächen eingehen. Folgende chemische Reaktionsweisen für die Bindung eines Proteins über einen Poly-DOPA Tag an einem einer Titanoberfläche sind denkbar:
    • 1. Ionische Wechselwirkung zwischen positiven Ladungen auf der Titanoberfläche ( 1B) und negativ geladenen Phenolat-Ionen des Poly-DOPA (2).
    • 2. Elektron-Donor-Akzeptor Komplexe in form einer d-π Wechselwirkung zwischen dem Titan (d-Orbitale) und den π-elektronen des Phenolringes.
    • 3. Möglicherweise kann auch eine direkte metallorganische Verbindung zwischen DOPA und der Titanoberfläche eingegangen werden.
  • Durch die gleichzeitige Reaktion mehrerer DOPA-Reste in einem Poly-DOPA-Molekül mit der Titanoberfläche wird die Affinität der Bindung in einer Potenzfunktion zunehmen, so daß extrem hohe Bindungsaffinitäten (108-1015 M–1) erreicht werden können. Übergangsmetalloxidhaltige Oberflächen können somit zu Trägermaterialien für polyaromatischen Aminosäure-Epitope tragende Proteine werden und zur Synthese von biologisch aktiven Oberflächen im Bereich Tissue Engineering und Biomaterialengineering eingesetzt werden. Die Anwendung dieser Technologie ist auch auf Glasoberflächen möglich. So können Matrices für natürliche, rekombinante oder synthetetische Proteine oder Peptide erstellt werden, die sich auch im Bereich der Chromatographie, der Immunoassays und der Arraytechnik bewähren. Als mögliche bioaktive Mediatoren, Faktoren oder Gewebshormone dienen vorzugsweise Wachstumsfaktoren der TGF-β Superfamilie wie TGF-β1 oder Knochenwachstumsfaktoren wie BMP-2, BMP-7, Knorpelbildende Faktoren wie CDMP (GDF-5) oder Blutgefäßwachstumsfaktoren wie VEGF oder Angiotropin sowie PDGF. Die einfach oder mehrfach hydroxylierten aromatischen Polyaminosäuren in Fusion mit einem definierten Zielprotein wie einem Enzym, Wachstumsfaktor (s.o.) oder einem Strukturprotein dienen als Ankerstruktur für die feste Bindung des Zielproteins an eine siliziumoxid- oder metalloxidhaltige Matrix. Durch diese Bindung an die oxidhaltige Matrix kann das Fusionsprotein aus einem Extrakt gereinigt werden oder auf einer Metalloberfläche beispielsweise eines Titanimplantates in biologisch aktiver Form immobilisiert werden.
  • Die Synthese eines polyphenolischen Tags soll hier am Bespiel des Poly-L-Tyrosins und des Poly-L-DOPAs grob beschrieben werden. Analoge Methoden können für Poly-Phenylalanin- und Poly-Tryptophan-Tags erstellt werden. Es wird ein Verfahren beschrieben, das in wäßrigem Milieu und unter schonenden Bedingungen durchgeführt werden kann. Das gewünschte Fusionsprotein wird in folgenden drei Schritten hergestellt:
  • Die Triplettcodes für Tyrosin lauten UAU und UAC. Somit führen (UAU)n und (UAC)n in Fusion mit einem Zielprotein am C-Terminus zu Protein-(Tyr)n cDNA-(UAC)n → Protein-C-Term-(Tyr)n (1) (UAC)n-cDNA → (Tyr)n-N-Term-Protein (2)
  • Das gentechnisch so hergestellte Protein muß zunächst angereichert und gereinigt werden. Hierfür könnte man sich einen Doppeltag bestehend aus einem N-terminalen Poly-Tyr Tag und einem C-terminalen Poly-His Tag zur Aufreinigung vorstellen.
  • Im nächsten Schritt wird die aromatische Aminosäure hydroxyliert. Im Falle von Tyrosin kann dies entweder enzymatisch (siehe auch [2]) oder chemisch [3] erfolgen.
  • Peptidyltyrosine hydroxylase mit Sauerstoff und NADH + H+ (siehe auch [2]) könnte dann zu Protein-(Tyr)n → Protein-C-Term-(DOPA)n (3)führen.
  • Umgekehrt führen (UAU)n und (UAC)n in Fusion mit einem Zielprotein am N-Terminus unter ähnlichen Bedingungen zu: (Tyr)n-N-Term-Protein → (DOPA)n-N-Term-Protein (4)
  • Aufgleiche Weise ließen sich entsprechende polyhydroxyaromatischen Aminosäuren Epitope aus den Aminosäuren Phenylalanin und Tryptophan erstellen.
  • Die in den dargestellten Verfahren hergestellten Fusionsproteine können dann über das polyhydroxyaromatische Aminosäure-Epitop an Metall-, Keramik- oder Glasoberflächen gebunden werden. In einer besonderen hier als Beispiel angegebenen Anwendungsform mit dem Knochenwachtumsfaktor BMP-2 (bone morphogenetic protein 2) könnte ein am N-Terminus fusionierter Poly-DOPA- oder Poly-TOPA-Tag dazu verwendet werden, BMP-2 in biologisch aktiver Form allein durch Inkubation mit einem Titanimplantat an der Titanoberfläche hochaffin zu binden und als bioaktives Zahn-, Hüft- oder Knieimplantat am Menschen einzusetzen. Mit einer hohen Bioaktivität des BMP-2 ist daher zu rechnen, daß N-terminale Peptidverlängerungen nach Art eines Poly-DOPA-Tags mit 5-10 Aminosäuren in der Regel nicht zu Einbußen in der biologischen Aktivität führen. Darüber hinaus würde eine Bindung des BMP-2 über einen N-terminalen Poly-DOPA-Tag zu einer orientierten Immobilisierung des BMP-2 auf der Titanoberfläche führen und damit eine außerordentlich hohe spezifische biologische Aktivität bedingen.
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Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung von Proteinhybriden mit polyhydroxyaromatischen D, oder L-Aminosäure-Epitopen, bei dem ein bioaktives Protein oder Polypeptid an einer definierten Stelle mit einem Polymer bestehend aus polyhydroxyaromatischen Aminosäuren in einer Zahl von n = 2-50 kovalent modifiziert wird und das Fusionsprotein aus bioaktivem Protein und polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Tag mit Hilfe ebendieses Tags an einer festen Oberfläche mit hoher Affinität unter Erhalt der Bioaktivität gebunden wird, und die so beschickte Oberfläche für analytische, präparative, biologische, chemische oder medizinische Zwecke Verwendung findet.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Synthese des polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitops nach einschlägigen chemischen Methoden erfolgt und das Epitop an einem Aminosäurerest eines Proteins oder Polypeptids kovalent fixiert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem gentechnisch ein Fusionsprotein mit einem polyaromatischen Aminosäure Tag in Pro- oder Eukaryontenzellen synthetisiert wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem Poly-Phe, Poly-Tyr oder Poly-Trp am N-Terminus fusioniert sind.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem Poly-Phe, Poly-Tyr oder Poly-Trp am C-Terminus fusioniert sind.
  6. Verfahren nach Ansprüchen 4 und 5 bei dem die Anzahl der Aminosäuren in Poly-Phe, Poly-Tyr oder Poly-Trp zwei bis fünfzig beträgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, bei dem der polyaromatische Aminosäure Tag durch einschlägige chemische oder enzymatische Verfahren ein- oder mehrfach an den jeweiligen Aminosäureresten hydroxyliert wird und die entsprechenden polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitope als Produkte entstehen.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem aus Poly-Phe über Poly-Tyr die Verbindung Poly-DOPA oder Poly-TOPA im Fusionstag gebildet wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem aus Poly-Tyr die Verbindung Poly-DOPA oder Poly-TOPA im Fusionstag gebildet wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem aus Poly-Trp die Verbindung Poly-5-Hydroxy Trp oder weitere Hydroxylierungsstufen des Tryptophans gebildet werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 1 und den Ansprüchen 2-10, bei dem als Protein Mediatoren, Faktoren, Gewebshormone oder Wachstumsfaktoren polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen am N- oder C-Terminus fusioniert werden. 12 Verfahren nach Anspruch 11, bei dem Wachstumsfaktoren der TGF-β Superfamilie wie TGF-β1 oder Knochenwachstumsfaktoren wie BMP-2, BMP-7, Knorpelbildende Faktoren wie CDMP (GDF-5) oder Blutgefäßwachstumsfaktoren wie VEGF oder Angiotropin sowie PDGF mit polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen am N- oder C-Terminus fusioniert werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem ein mit polyhydroxyaromatischen Aminosäure-Epitopen versehenes Fusionsprotein mit Hilfe des Epitopes an eine Werkstoffoberfläche gebunden wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Werkstoff ein Metall, eine Keramik oder ein Glas ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem ein Metall (Titan, Stahl, Cobalt-Chrom Legierung), eine Keramik oder ein Glas ein Biomaterial für die Herstellung von Implantaten in Tier oder Mensch darstellt.
  15. Verfahren nach Ansprüchen 12-15, bei dem BMP-2 oder BMP-7 mit einem Poly-DOPA oder Poly-TOPA-Tag versehen werden zur Beschichtung eines Implantates mit bioaktiver Oberfläche.
  16. Verfahren nach Ansprüchen 1-14, bei dem das über ein polyhydroxyaromatisches Aminosäuren-Epitop orientiert immobilisierte Protein für analytische, präparative oder andere Techniken aus dem Genomics- oder Proteomicsbereich Verwendung findet.
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