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Die
Erfindung bezieht sich auf ein konfokales Laserscanningmikroskop
mit einer Beleuchtungsanordnung, die einen Beleuchtungsstrahl zum
Beleuchten eines Probenbereichs bereitstellt, einer Scananordnung,
die den Beleuchtungsstrahl scannend über die Probe führt, und
einer Detektoranordnung, die über
die Scananordnung den beleuchteten Probenbereich mittels einer konfokalen
Blende auf mindestens eine Detektoreinheit abbildet.
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Konfokale
Laserscanningmikroskope der eingangs genannten Art sind im Stand
der Technik bekannt, beispielhalber sei hierzu auf die
DE 197 02 753 A1 verwiesen.
In jüngster
Zeit wurden vermehrt mikroskopische Aufbauten, insbesondere konfokal abbildende
Laserscanningmikroskope, für
spektroskopische Aufnahmetechniken eingesetzt. Auf diese Weise ist
es möglich,
die spektroskopischen Eigenschaften eines ausgewählten Probenbereichs zerstörungs- und
berührungslos
zu vermessen. Die konfokale optische Mikroskopie ermöglicht dabei
die selektive Detektion optischer Signale, welche innerhalb eines
beugungsbegrenzten Konfokalvolumens erzeugt werden, dessen Größe im Mikrometerbereich
liegt. Laserscanningmikroskope mit abtastenden Laserstrahlen und/oder
Probenvorschubeinheiten können mit
hoher Ortsauflösung
zwei- oder dreidimensionale Darstellungen der untersuchten Probe
erzeugen. Durch diese Eigenschaft hat sich die konfokale Laserscanningmikroskopie
für fluoreszierende
Proben im biomedizinischen Bereich nahezu als Standard durchgesetzt.
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Aufgrund
des hohen chemischen Aussagegehaltes ist aus applikativer Sicht
insbesondere die konfokale Raman-Mikroskopie sehr attraktiv. Die
EP 0 542 962 B1 beschreibt
einen Aufbau zur konfokalen Raman-Mikroskopie, bei der geeignetes
Auslesen eines ortsauflösenden
Flächendetektors
zur Herstellung der Konfokalitätsbedingung
verwendet wird.
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Ein
Problem der Raman-Spektroskopie im Vergleich zur klassischen Fluoreszenz-Spektroskopie besteht
in den häufig
um mehrere Größenordnungen
geringeren Signalintensitäten.
Die Integrationszeit pro Meßpunkt
beträgt
in der Praxis häufiger
mehr als 1 Minute. Daraus resultieren Meßzeiten von oftmals vielen
Stunden oder Tagen, was einer konfokalen Raman-Mikroskopie für die Aufnahme
zwei- oder dreidimensionaler mikroskopischer Bilder mit hoher Punktdichte
naturgemäß enge Grenzen
setzt. Eine Verringerung der Integrationszeit wäre zwar theoretisch durch Erhöhung der
Laserleistung denkbar, jedoch führt
dies schnell zur Probenzerstörung.
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Vor ähnlichen
Problemen steht man im Bereich der nicht-linearen optischen Mikroskopie,
die z. B. mit der Second Harmonic Generation attraktive Kontrastierungsmethoden
anbietet, deren praktischer Einsatz jedoch ebenfalls durch geringe
Signalintensitäten
und damit verbundene lange Meßzeiten stark
begrenzt ist.
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Aus
der US 6.134.002 ist ein konfokaler Mikroskopaufbau bekannt, bei
dem als Detektor ein Spektralanalysator eingesetzt wird. Der Analysator nimmt
Strahlung in einem Eintrittsspalt auf, wobei der linienförmige Spaltbereich
einem Linienbereich auf der Probe entspricht. Es wird ein Punktbild
auf der Probe gescannt. Die zu detektierende Strahlung wird zum
Analysator über
einen als Hauptfarbteiler wirkenden Strahlteiler ausgekoppelt, welcher
entweder zwischen zwei Scanspiegeln einer Scaneinheit liegt oder
in Richtung auf die Probe gesehen der Scaneinheit vorgeordnet ist.
In der erstgenannten Variante ist das durch die zwei Scanspiegel
gescannte Punktbild auf der Probe nur in einer Raumrichtung descannt,
so daß der
Spektralanalysator mit längs
einer Zeile gescannter Strahlung beaufschlagt wird. In der zweiten
Variante ist die Strahlung durch die Scanspiegel vollständig descannt
und somit ruhend und wird deshalb nach einem Pinhole mit einer Zylinderoptik
nochmals aufgeweitet. Der aus US 6.134.002 bekannte Aufbau erreicht
eine Beschleunigung der Bildaufnahme durch Verkürzung der Spektralanalysezeiten,
weshalb er zwingend auf einen Spektralanalysator mit schlitzförmigem Eingangsbereich
als Detektor angewiesen, also hinsichtlich der Vielfalt möglicher
Detektoren stark eingeschränkt
ist. Die eingangs genannte Problematik hinsichtlich einer möglichen
Probenbeschädigung
durch hohe Laserleistung ist auch bei einem Aufbau nach US 6.134.002
gegeben.
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Der
Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Laserscanningmikroskop
so weiterzubilden, daß es
auch spektroskopische Signale geringer Intensität in möglichst kurzer Zeit aufnehmen
kann.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem
konfokalen Laserscanningmikroskop der eingangs genannten Art gelöst, bei
dem die Beleuchtungsanordnung der Scananordnung einen linienförmigen Beleuchtungsstrahl
bereitstellt, die Scananordnung den linienförmigen Beleuchtungsstrahl scannend über die
Probe führt
und die konfokale Blende als Schlitzblende oder als konfokale Blende wirkender
schlitzförmiger
Bereich der Detektoreinheit ausgebildet ist.
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Die
vorliegende Erfindung widmet sich der beschriebenen Problematik
durch Kombination einer linienförmigen
Probenbeleuchtung und einer konfokalen Detektion mittels einer Schlitzblende
oder eines als Schlitzblende wirkenden Bereiches. Im Gegensatz zu
Punktscannern, wie sie die US 6.134.002 verwendet, wird also ein
linienförmiger
Bereich auf der Probe beleuchtet und konfokal auf einen zumindest
linienförmigen
Detektor abgebildet.
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Verglichen
mit einem konfokalen, herkömmlichen
Punkt-Laserscanningmikroskop ist bei gleicher Bildaufnahmezeit,
bei gleicher in der Probe abgebildeter Fläche, bei gleichem Sehfeld und
bei gleicher Laserleistung pro Pixel ein um einen Faktor verbessertes
Signal/Rausch-Verhältnis realisiert,
wenn man mit n die Anzahl der Pixel in der Detektorzeile bezeichnet.
Hierfür
ist ein Wert von 500 bis 2.000 typisch. Die Voraussetzung hierzu
ist, daß die
die Probe beleuchtende Linie die n-fache Leistung, eines Laserfokus
eines vergleichbaren konfokalen Punktscanners aufweist.
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Möchte man
mit dem erfindungsgemäßen Laserscanningsmikroskop
nicht die Detektionsgeschwindigkeit bzw. das Signal/Rausch-Verhältnis verbessern,
kann alternativ im Vergleich zum konfokalen Punktscanner bei gleicher
Bildaufnahmezeit und gleichem Signal/Rausch-Verhältnis die Strahlenbelastung
der Probe um den Faktor n gesenkt werden, wenn die für einen
konfokalen Punktscanner punktförmig
aufgebrachte Strahlungsleistung nun auf die Beleuchtungslinie verteilt
wird.
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Das
zeilenabtastende Laserscanningmikroskop ermöglichst also im Vergleich zum
konfokalen Punktscannern, intensitätsschwache Signale empfindlicher
Probensubstanzen bei gleichen Signal/Rausch-Verhältnis und gleicher Probenbelastung um
den Faktor n schneller, bei gleicher Aufnahmezeit mit einem um den
Faktor √n verbesserten Signal/Rausch-Verhältnis oder
bei gleiche Aufnahmezeit mit gleichem Signal/Rausch-Verhältnis und
einer um den Faktor n geringeren Probenbelastung abzubilden.
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Je
nach gewünschter
Auflösung
wird man eine unterschiedlich breite Linie auf der Probe beleuchten
und konfokal detektieren wollen. Eine veränderliche Beleuchtung ist deshalb
bevorzugt. Dies kann prinzipiell bereits bei der Erzeugung der linienförmigen Beleuchtung
bewirkt werden. Da die Erzeugung einer linienförmigen Beleuchtung jedoch in
einem Laserscanningmikroskop zweckmäßigerweise in einem Beleuchtungsmodul
erfolgt, kann der Aufwand für
eine Verstellbarkeit relativ groß werden, wenn im Beleuchtungsmodul
Strahlung aus unterschiedlichen Strahlquellen zusammengeführt wird. Es
ist deshalb bevorzugt, eine Zoomoptik zu verwenden, welche eine
Zoomfunktion realisiert werden dazu die Linienbreite eines bereits
erzeugten linienförmigen
Beleuchtungsstrahls variiert und welche vorzugsweise in einem Bereich
des Strahlengangs liegt, in dem Beleuchtungsstrahlung und zu detektierende
Strahlung durch dieselben optischen Elemente geführt werden, d. h. noch nicht
separiert sind. Bei Laserscanningmikroskopen kann der abgetastete Bildbereich
durch geeignete Ansteuerung des Scanners in einer Zoomfunktion ausgewählt werden,
allerdings nur bei Einzelpunktabtastung in Kombination mit einem
Galvanometerscanner. Bei den hier vorliegenden parallel scannenden,
d. h. mehrere Punkte gleichzeitig abtastenden Laserscanningmikroskopen ist
eine Zoomfunktion durch Verstellung der Scananordnung nicht realisierbar,
da die einzelnen abgetasteten Punkte der Linie in einem festen geometrischen Verhältnis zueinander
stehen. Die durch die Zoom-Optik erreichte variable Vergrößerung ermöglicht eine
Größenverstellung
des abgescannten Feldes für
solche parallel arbeitende Multipunktscanner, bei denen eine Zoomfunktion
durch Eingriff an der Scananordnung aufgrund der festen geometrischen Beziehung
der parallel über
die Probe geführten Punkte
nicht möglich
ist. Der für
einzelpunktabtastende konfokale Raster-Mikroskope an und für sich bekannte
Ansatz, die Ablenkeinrichtung so anzusteuern, daß ein Bildfeld in gewünschter
und einstellbarer Größe abgetastet
wird, ist bei solchen parallel abtastenden Systemen ebensowenig
möglich,
wie bei Systemen, die mit Resonanzscannern, d. h. in Resonanzschwingung
angetriebenen Drehspiegeln, arbeiten, da dort die maximale Auslenkung
so gut wie nicht verstellbar ist.
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Eine
möglich
Lage für
die Zoomoptik ist direkte Vorordnung zur Scannereinheit (auf die
Probe hin gesehen). Eine vorzugsweise motorisiert angetriebene Zoomoptik
ermöglicht über eine
Anpassung des von ihr bewirkten Zoom-Faktors, das diagonale Sehfeld
in einem bestimmten Verstellbereich kontinuierlich zu variieren.
Besonders bevorzugt ist eine Zoomoptik, die in drei optischen Freiheitsgraden
verstellbar ist, so daß bei
Variation der Linienbreite wichtige Parameter wie Fokuslage, Pupillenlage
und Abbildungsmaßstab
unverändert
bleiben.
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Ein
Objektiv erreicht dann seine maximale Auflösung, wenn die Eintrittspupille
vollständig
ausgeleuchtet ist. Es ist deshalb zweckmäßig, geeignete Mittel vorzusehen,
daß die
Zoom-Optik die Eintrittspupille
des Objektives immer vollständig
ausleuchtet, unabhängig
von der Einstellung der Zoom-Optik. Eine zweckmäßige Weiterbildung der Erfindung
sieht folglich vor, daß in
der Austrittspupille der Zoom-Optik ein als Blende wirkendes Element
angeordnet ist, das nicht größer ist,
als die kleinste Austrittspupillengröße, die im Betrieb der Zoom-Optik
auftritt. Dadurch ist eine von der Einstellung der Zoom-Optik unabhängige Größe der Eintrittspupille
bewirkt. Zweckmäßigerweise
ist diese Größe gleich
oder kleiner als die Größe der Objektiv-Eintrittspupille.
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Im
Betrieb der Zoom-Optik kann bei Einstellung einer Vergrößerung kleiner
1,0 die Austrittspupille sehr klein werden. Möchte man diese geringe Austrittspupillengröße als untere
Grenze für
die Auslegung vermeiden, ist es zweckmäßig, der Zoom-Optik ein Teleskop
vorzuschalten, das eine entsprechende Pupillenaufweitung bewirkt.
Zweckmäßigerweise wird
man dieses Teleskop im Strahlengang nur dann aktivieren, wenn die
Zoomoptik verkleinernd wirkt. Die Begriffe „vergrößern" und „verkleinern" sind hier auf die
Abbildung der Probe bezogen.
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Die
Aktivierung dieses Teleskopes stellt sicher, daß die Ausgangspupille des Zooms,
die bei einer Vergrößerung von
1,0 gegeben ist, als untere Grenze bei der Auslegung zugrundegelegt werden kann,
ohne daß bei
verkleinernder Wirkung der Zoom-Optik die Ausgangspupille so klein
würde,
daß möglicherweise
die Objektivpupille unterfüllt
wird. Bedingt durch die Austauschbarkeit des Objektives ist es zweckmäßig, das
als Blende wirkende Element austauschbar zu gestalten, möchte man
bewußt
die Objektivpupille unterfüllen,
d. h. nicht vollständig
ausleuchten. Als Element kommt dann beispielsweise eine verstellbare
Irisblende oder ein Mechanismus mit verschiedenen austauschbaren
Blenden, beispielsweise ein Blendenrad mit verschiedenen Lochblenden
in Frage.
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In
einer besonders kompakt bauenden Ausführungsform ist das als Blende
wirkende Element durch die Scaneinheit realisiert; zum Beispiel
kann die begrenzte Ausdehnung von Scannerspiegeln als Blende wirken.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird also eine Zoom-Optik verwendet, welche eine ausgangsseitige
Pupille aufweist, in der eine Blende vorgesehen ist. In der Praxis kann
diese Blende auch durch die Begrenzung einer Spiegelfläche der
Scannereinheit realisiert sein. Durch die Wirkung dieser ausgangsseitigen
Blende der Zoom-Optik
wird unabhängig
vom Verstellen der Zoom-Vergrößerung immer
eine festgelegte Pupillengröße auf die
Scananordnung bzw. auf das Objektiv des konfokalen Laserscanningmikroskop
abgebildet. Vorteilhafterweise verhindert die Blende zusätzlich das
Auftreten von ungewolltem Streulicht im Bereich der Scananordnung.
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Möchte man
auch Zoom-Faktoren kleiner Eins einstellen, ist es zur Pupillenfüllung vorteilhaft, das
Zylinderteleskop vorzuschalten. Vorzugsweise erfolgt dieses Einschalten
automatisiert, beispielsweise in Form eines Einschwenkvorgangs.
Dadurch ist verhindert, daß die
ausgangsseitige Pupille, beispielsweise die erwähnte Blende des Zoom-Objektivs
unterstrahlt wird. Unabhängig
von der Verstellung der Zoom-Optik ist somit am Ort der Objektivpupille
stets eine Beleuchtungslinie einstellbarer Größe vorhanden, so daß Probenbereiche
einstellbarer Größe untersucht
werden können.
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Beim
Aktivieren des Zylinderteleskopes tritt unvermeidlich ein Bildhelligkeitssprung
auf, da zum einen das Zylinderteleskop Strahlung absorbiert und zum
anderen vor allem die Strahlungsintensität über eine nun längere Linie
verteilt wird. Um für
den Betrachter diese Wirkung auszugleichen, ist es in einer vorzugsweisen
Weiterbildung vorgesehen, daß eine Steuereinrichtung
bei in den Strahlengang geschaltetem Zylinderteleskop durch Verstellung
eines Verstärkungsfaktors
der Detektoranordnung oder der Scangeschwindigkeit der Scaneinrichtung
eine durch das Zylinderteleskop bedingte Bildhelligkeitsminderung
ausgleicht. Zweckmäßigerweise
wird diese Änderung,
die von der Steuereinrichtung vorgenommen wird, dem Benutzer angezeigt,
beispielsweise durch entsprechende Umschaltung von Reglern eines
Bedienprogrammes.
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Die
Erfinder erkannten, daß die
Problematik einer axial variierenden Lage der (in Beleuchtungsrichtung
gesehen) Eintrittspupille des Mikroskopobjektives überraschenderweise
durch geeignete Gestaltung der Zoom-Optik gelöst werden kann. Vorteilhaftetweise
wird die Zoomoptik also so ausgebildet, daß sie die Abbildungslänge (Abstand
zwischen Eintritts- und Austrittspupille der Zoom-Optik) variierbar gestaltet,
wodurch Schwankungen der axialen Pupillenlage der Eintrittspupille
des Mikroskopobjektives ausgleichbar sind. Die erfindungsgemäße Zoom-Optik
erreicht also eine Doppelfunktion, indem zum einen die Scanfeldgröße durch
Variation der Vergrößerung eingestellt
werden kann, und zum anderen die Übertragungslänge so einstellbar
ist, daß eine
axial variierende Pupillenlage des Mikroskopobjektives ausgeglichen
ist.
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Es
ist weiter zweckmäßig, daß die Zoom-Optik
von einer Steuereinheit angesteuert so verstellbar ist, daß in einer
ersten Betriebsart die variable Abbildungslänge realisiert ist. Um die
Zoom-Optik auf ein aktiviertes, z. B. eingeschwenktes Objektiv anzupassen,
ist es zweckmäßig, in
dieser Betriebsart die Vergrößerung konstant
zu halten.
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Wurde
die Einstellung der Pupillenlage vorgenommen, kann man vorteilhafterweise
eine weitere Betriebsart verwirklichen, in der für die Ausführung einer Zoomfunktion die
Vergrößerung unter
Ansteuerung durch die Steuereinheit verstellt wird, ohne daß Abbildungslänge variiert.
Durch die Wirkung der Zoom-Optik in dieser Betriebsart kann das
abgetastete Feld hinsichtlich seiner Größe verstellt werden. Verwendet
man gleichzeitig eine zweiachsig ansteuerbare Scaneinheit, kann
zusätzlich
und abhängig vom
Verstellen der Zoomvergrößerung ein
beliebiger Bereich innerhalb des maximal zulässigen Scanfeldes als sogenannten „region
of interest" ausgewählt werden,
wobei diese „region
of interest" nicht
symmetrisch zur optischen Achse liegen muß. Im Detektionsstrahlengang
wird dieser Versatz ebenso wie die Zoomvergrößerung in Richtung auf den
Detektor hin wieder aufgehoben, wodurch die Beobachtung spezifischer
Bereiche in einer Probe möglich
ist. Darüber hinaus
kann man Bilder aus verschiedenen „region of interest" gewinnen und anschließend zu
einem besonders hochaufgelösten
Bild zusammensetzen.
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Eine
besonders zweckmäßige Bauweise
der Zoom-Optik setzt vier Optikgruppen ein, um die variable Pupillenabbildung
auszuführen.
Es ist dann für die
Herstellung günstig,
die vier Optikgruppen in Beleuchtungsrichtung gesehen mit positiver
Brechkraft, negativer Brechkraft sowie zweimal positiver Brechkraft
zu versehen. Zweckmäßigerweise
sind zumindest drei Optikgruppen unabhängig voneinander mittels Antrieben
verstellbar, und die Bewegung erfolgt derart, daß die Fokussierung von unendlich
nach unendlich erhalten bleibt und je nach Betriebsart die Vergrößerung bzw.
Abbildungslänge
(Pupillenlage) verstellt wird. Auch kann es vorteilhaft sein, die
in Beleuchtungsrichtung gesehen letzte Gruppe mit einem üblicherweise
in einem konfokalen Raster-Mikroskop der Scaneinheit vorgeordneten
Scanobjektiv als eine Einheit auszubilden. Jede Gruppe besteht vorzugsweise
mindestens aus einer Linse. Um möglichst gute
Eigenschaften bezüglich
des verfügbaren
Spektralbereiches sowie die möglichen
Aperturen/Feldwinkel zu erreichen, sind die Gruppen bezüglich der Abbildungsfehler
vorzugsweise in sich selbst korrigiert.
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Die
erwähnte
Auswahl einer „region
of interest" entweder
nur durch die vom Zoom-Objektiv realisierte Zoomfunktion oder auch
zusätzlich
durch eine im möglichen
Scanfeld asymmetrische Scannerbetriebsweise kann zusätzlich noch
durch Verwendung eines den Strahlengang drehenden Elementes verbessert
werden. Setzt man in eine Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges
beispielsweise ein Abbe-König-Prisma,
kann das abgetastete, gezoomte Scanfeld gedreht werden. Im Detektionsstrahlengang
wird diese Verdrehung durch das Prisma wieder aufgehoben. Ein solches
Abbe-König-Prisma
ist beispielsweise von LINOS Photonics, Deutschland, erhältlich und
ist im Stand der Technik bekannt. Es wird für die erwähnte Bauweise drehbar im Strahlengang nahe
einer Pupille angeordnet, da hier die Strahlbündel am engsten zusammengeführt sind
und deshalb ein besonders kleines Prisma verwendet werden kann.
Es führt
je nach Drehwinkel eine Rotation um den doppelten Winkel des Bildfeldes
ein.
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Die
linienförmige
Beleuchtung kann auf vielfältige
Art und Weise erzeugt werden. Besonders vorteilhaft ist jedoch der
Einsatz mindestens eines asphärischen
Spiegels. Das Grundprinzip der Strahlformung in der Beleuchtungsvorrichtung
ist es dann, mittels eines asphärischen
Spiegels eine Energieumverteilung zumindest in einer Schnittebene
vorzunehmen und ein inhomogenes, insbesondere Gauß-verteiltes
Profil so umzuwandeln, daß in
der Schnittebene eine weitgehend homogene Energieverteilung vorliegt.
Bildet man den Spiegel in zwei Querschnittsrichtungen asphärisch aus,
erhält
man eine Homogenisierung in zwei Schnittebenen, also ein homogenisiertes
Feld. Durch den Einsatz eines asphärischen Spiegels kann eine
große
spektrale Bandbreite für die
Beleuchtungsstrahlung abgedeckt werden, bei gleichzeitiger homogener
Ausleuchtung. Dabei wurde erkannt, daß die reflektierende Asphäre, die
in einer Schnittebene im Bereich des Auftreffpunktes des Ursprungsstrahls
stärker
gekrümmt
ist als in auftreffpunktfernen Bereichen, geeignet ist, eine Wellenlängenabhängigkeit
bei Fokussierung und Energieumverteilung vermeidet, wobei gleichzeitig
das Konzept der variierenden Krümmung
des asphärischen
Spiegels eine große
Vielfalt an Energieumverteilungen eröffnet. Mit der Beleuchtungsvorrichtung
lassen sich Gaußbündel beispielsweise
derartig umformen, daß in über 80%
des ausgeleuchteten Bereiches die Intensität nicht unter 80% des Maximalwertes
fällt.
Dies ist eine im wesentlichen homogene Verteilung im hier relevanten
Sinne.
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Eine
Variante mit zweiachsiger asphärischer Krümmung kann
besonders vorteilhaft zur Homogenisierung in einer Zwischenbildebene
zum Einsatz kommen. Bei multipunktscannenden Mikroskopen ermöglicht die
homogene Ausleuchtung eines Zwischenbildes vor dem Element, das
die Punktwolke erzeugt (z.B. Nipkow-Scheibe), eine gleichmäßige Ausleuchtung
der Probe mit örtlich
im wesentlichen einheitlicher Strahlintensität. Auch ermöglicht die Konvertierungseinheit
die volle Ausleuchtung einer Objektivpupille, so daß eine besonders
gute (hoch aufgelöste)
Abbildung erreicht wird, da eine homogen gefüllte Pupille die optische Auflösung auszuschöpfen erlaubt.
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Eine
besonders einfach zu fertigende Ausführungsform ist ein Spiegel,
der keilförmig
und mit abgerundetem First ausgebildet ist. Ein solcher Spiegel
kann auf einfache Weise aus einem Quader hergestellt werden und
erzielt eine Brennlinie mit homogener Energieverteilung.
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In
einer mathematisch besonders einfach zu beschreibenden Variante
wird der Spiegel durch eine konische Konstante sowie den Abrundungsradius des
Firstes definiert und genügt
in (x,y,z)-Koordinaten hinsichtlich der z-Koordinate der Gleichung
y2/[c + (c2 – (1 + Q)y2)1/2], wobei c der
Abrundungsradius des Firstes und Q die konische Konstante ist.
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Für die zeilenförmige Beleuchtung
möchte man
die Strahlung nicht nur homogen entlang einer längserstreckten Linie verteilen,
sondern gegebenenfalls auch die Weite der Linie an den Durchmesser
der Eintrittspupille des nachfolgenden optischen Systems anpassen.
Um dies zu erreichen, muß der asphärische Spiegel
auch eine Strahlaufweitung quer zur Linienrichtung bewirken. Dies
kann bei der eingangs genannten Variante eines keilförmigen Spiegels
mit abgerundetem First besonders einfach dadurch erreicht werden,
daß die
Spiegelfläche
oder zumindest der First entlang der First-Längsachse sphärisch oder
asphärisch
gekrümmt
ist.
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Der
asphärische
Spiegel mit abgerundetem First ist also dann zweidimensional gekrümmt, wobei in
einer ersten Schnittrichtung (senkrecht zur Längsachse) ein Kegel mit abgerundeter
Spitze, in einer zweiten Schnittrichtung (längs des Firstes) eine parabolische,
sphärische
oder asphärische
Krümmung vorliegen
kann. Letztere Krümmung
stellt dann die Breite des ausgeleuchteten Feldes ein, wohingegen die
asphärische
Form senkrecht zur Längsachse
die Aufweitung längs
des Feldes bewirkt und aufgrund der Asphärizität eine Energieumverteilung
zur Folge hat. Längs
des Feldes ist damit eine weitgehend homogene Energieumverteilung
erreicht.
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Ein
zusätzlich
längs des
Firstes spährisch oder
parabolisch gekrümmter
Spiegel läßt sich
in einer einfachen mathematischen Beschreibung wie folgt fassen:
wobei r
x der
Krümmungsradius
entlang des Firstes, d. h. in der oben genannten zweiten Schnittrichtung ist.
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Um
bei dem in zwei Richtungen gekrümmten Spiegel
(z. B. in der ersten Schnittrichtung asphärisch, in der zweiten sphärisch) eine
Anpassung zur vollen Ausleuchtung eines Zwischenbildes oder einer Eintrittspupille
eines nachfolgenden optischen Systems zu bewirken, ist es zweckmäßig, dem
Spiegel eine Sammeloptik, z. B. in Form eines Sammelspiegels, nachzuordnen. Üblicherweise
wird man für
die Erzeugung eines rechteckigen Feldes dabei einen zylindrischen
oder torischen Sammelspiegel einsetzen. Für andere Feldformen mag die
Spiegelform abweichen, so kann man beispielsweise auch für diesen
zweiten Spiegel die genannte Asphäre verwenden, um eine Kombination
aus Homogenisierung der Pupillenfüllung in einer ersten Richtung
(durch eine der Asphären)
und des Zwischenbildes in der verbleibenden Richtung (durch die
andere Asphäre)
zu erreichen. Auch kann durch die zusätzliche Asphäre eine
Bildfehlerkompensation bewirkt werden. Natürlich kann man die zweite Asphäre auch
zusätzlich zum
Sammelspiegel vorsehen.
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Für die Ausführungsform
des asphärischen Spiegels
mit spährischer
Krümmung
in der zweiten Schnittebene ist es deshalb bevorzugt, daß der Sammelspiegel
in x-Richtung einen Krümmungsradius gleich
rx + 2·d
aufweist, wobei d der Abstand zwischen asphärischem Spiegel und Sammelspiegel
ist. Der Krümmungsradius
rx des asphärischen Spiegels in der zweiten
Schnittebene skaliert dann direkt die Höhe des ausgeleuchteten rechteckigen
Feldes bzw. des Profils des Beleuchtungsstrahls.
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Natürlich kann
zur homogenen Pupillenausleuchtung auch ein in beiden Schnittrichtungen
asphärischer
Spiegel verwendet werden. Bei einer rotationssymmetrischen Asphäre bewirkt
dies dann ein homogen ausgeleuchtetes Kreisfeld; ansonsten erhält man ein
elliptisches Feld. Aus der derart beleuchteten Pupille kann man
dann für
ein scannendes Verfahren einzelne Bereiche auswählen und verwenden, z. B. mittels
Nipkow-Scheiben, Schlitzblenden o. ä.
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Zur
Ausleuchtung des asphärischen
Spiegels ist es vorteilhaft, die Symmetrieachse des Spiegels unter
einem Winkel zwischen 4° und
20° zur
Einfallsachse des Ursprungsstrahles, der z. B. gaußförmig profiliert
ist, zu legen, da dann ein kompakter Aufbau erhalten werden kann.
Der nachgeordnete Sammelspiegel, der beispielsweise zylindrisch
oder torisch ausgebildet sein kann, sammelt die von der Asphäre umverteilte
Strahlungsenergie und kompensiert während der Propagation auflaufende
Wellenaberrationen. Spielen solche Wellenaberrationen in einfachen
Fällen
keine Rolle, kann anstelle des Sammelspiegels auch eine sphärische Linse
verwendet werden.
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Vorzugsweise
wird im Laserscanningmikroskop mittels einer zweiten optionalen
unabhängig
wirkenden Scaneinrichtung eine dezentrale Zoom-Funktion, d. h. Crop-Funktion
realisiert.
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Die
konfokale Abbildung kann im Laserscanningmikroskop durch eine Schlitzblende
bewirkt werden. Bevorzugt ist eine Schlitzblende, die hinsichtlich ihrer
Schlitzbreite kontinuierlich verstellt werden kann, um einen beliebigen
Airy-Durchmesser am Detektor zu erzeugen. Die kontinuierliche Verstellung kann
beispielsweise mittels Festkörpergelenk-Technologie
realisierter Schlitzblenden erreicht werden. Alternativ kann auch
eine Schlitzblendeneinheit mit mehreren austauschbaren Schlitzblenden
unterschiedlicher Schlitzbreite verwendet werden. Beispielsweise
kann man feste Spaltblenden, z. B. strukturierte Chrommasken, unterschiedlicher
Breite auf einem Schieber anordnen.
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In
einer besonders einfach zu realisierenden Lösung wirkt die Detektoreinheit
selbst als Schlitzblende. Dazu kann beispielsweise eine Detektorzeile mit
Pixeln in einer Reihe verwendet werden. Auch ist es möglich, daß die Detektoreinheit
einen quer zur Schlitzrichtung ortsauflösenden Flächenstrahlungssensor umfaßt, der
in der konfokalen Ebene angeordnet ist, wobei die Auswahl eines
Teilbereichs des Flächenstrahlungssensors
als konfokale Schlitzblende wirkt. Auf diese Weise kann der Effekt
einer Variation des Schlitzblenden-Durchmessers durch eine entsprechende
Auswahl des Auslesebereiches am Sensor, beispielsweise einem CCD-
oder CMOS-Detektor-Array, realisiert werden.
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Im
Laserscanningmikroskop können
natürlich
verschiedenste spektrale Kanäle
sowohl bei der Beleuchtung als auch bei der Detektion verwendet werden.
Es ist diesbezüglich
eine besonders große Vielfalt
möglich,
wenn die Scananordnung mittels eines Hauptfarbteilers die eingestrahlte
Beleuchtungsstrahlung von vom Probenbereich zurückkehrender Strahlung trennt,
wobei der Farbteiler der als Streifenspiegel gemäße der
DE 102 57 237 A1 , deren
Offenbarungsgehalt hier explizit eingebunden wird, realisiert sein
kann.
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Ein
solcher Streifenspiegel wirkt als spektral unabhängiger Hauptfarbteiler. Er
liegt in einer Pupillenebene der Scananordnung, in der in der Probenebene
reflektierte, d. h. kohärente
Beleuchtungsstrahlung linienförmig
abgebildet ist. Inkohärente,
zu detektierende Signalstrahlung füllt dagegen die gesamte Pupillenebene
aus und wird durch den schmalen Streifenspiegel nur unwesentliche
abgeschwächt. Der
Begriff „Farbteiler" umfaßt also
auch nichtspektral wirkende Teilersysteme. Anstelle des beschriebenen
spektral unabhängigen Farbteilers
kann auch ein homogener Neutralteiler (z.B. 50/50, 70/30, 80/20 o.ä.) oder
ein dichroitischer Teiler Verwendung finden.
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Damit
applikationsabhängig
eine Auswahl möglich
ist, ist der Hauptfarbteiler vorzugsweise mit einer Mechanik versehen,
die einen einfachen Wechsel ermöglicht,
beispielsweise durch ein entsprechendes Teilerrad, das einzelne,
austauschbare Teiler enthält.
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Ein
dichroitischer Hauptfarbteiler ist besonders dann vorteilhaft, wenn
kohärente,
d. h. gerichtete Strahlung detektiert werden soll, wie z.B. Reflexion,
Stokes'sche bzw.
anti-Stokes'sche Raman-Spektroskopie,
kohärente
Raman-Prozesse höherer
Ordnung, allgemein parametrische nicht-lineare optische Prozesse,
wie Second Harmonic Generation, Third Harmonic Generation, Sum Frequency
Generation, Zwei- und Mehrfotonenabsorption bzw. Fluoreszenz. Mehrere
dieser Verfahren der nicht-linearen optischen Spektroskopie erfordern
den Einsatz zweier oder mehrer Laserstrahlen, die kollinear überlagert werden.
Hierbei erweist sich die dargestellte Strahlvereinigung der Beleuchtungsstrahlung
aus mehreren Lasern als besonders vorteilhaft. Grundsätzlich können die
in der Fluoreszenzmikroskopie weltverbreiteten dichroitischen Strahlteiler
verwendet werden. Auch ist es für
Raman-Mikroskopie vorteilhaft, vor den Detektoren holografische
Notch-Teiler oder -Filter zu Unterdrückung eines Rayleigh-Streuanteils zu verwenden.
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Bei
Detektion mit mehreren separaten spektralen Kanälen wird die Signalstrahlung
mit Hilfe eines Nebenfarbteilers in spektrale Anteile separiert, wobei
jeder Nebenfarbteiler einen zusätzlichen Spektralkanal
bereitstellt. Die einzelnen spektralen Anteile werden dann mit Hilfe
von Rund- und/oder Zylinderoptiken auf den zur Objektebene konjugierten,
streifenförmigen
Bereich fokussiert. Dieser Schlitzblenden-Bereich weist Teilkonfokalität auf und wird
nach spektraler Filterung, beispielsweise durch ein Emissionsfilter,
mit Hilfe einer Optikgruppe (z. B. unter Verwendung von Zylinderlinsen)
auf einen geeigneten, in Schlitzrichtung ortsauflösenden Detektor abgebildet,
z. B. eine CCD-Zeilenkamera oder einen optical multichannel analyzer.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann als Detektor auch ein Spektrometer verwendet werden, das die
linienförmige
Strahlung quer zur Linie spektral aufteilt und auf einen Flächenstrahlungdetektor
leitet. Als konfokale Blende kann dabei ein Eintrittsspalt des Spektrometers
dienen. Möchte
man zeitaufgelöste Prozesse
analysieren, ist es zweckmäßig, als
Detektoreinheit eine Streak-Kamera
zu verwenden, welche die linienförmige
Strahlung quer zur Linie zeitlich aufteilt und auf einen Flächenstrahlungsdetektor
leitet.
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Das
ortsaufgelöste
Signal des Detektors enthält
dann in einer Koordinate die Ortskoordinate, in der anderen die
Zeit- oder Wellnlängenkoordinate, die
die zeitliche Entwicklung oder die spektrale Zusammensetzung des
Strahlungssignals an den einzelnen Pixel entlang der Ortskoordinate
widerspiegelt.
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Bei
der Detektion linearer oder nicht-linearer Raman-Signale kann man
durch eine polarisationsabhängige
Beleuchtung bzw. Detektion eine Symmetrie der zu untersuchenden
Molekülschwingungen analysieren
bzw. störende
nicht-Raman-resonante Untergrundanteile unterdrücken. Es ist deshalb für solche
Anwendungen bevorzugt, daß mindestens
ein Polarisator in der Beleuchtungsanordnung und mindestens ein
Polarisationsanalysator in der Detektoranordnung verwendet werden.
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Bei
der erwähnten
Ausführungsform
mit mehreren spektralen Kanälen,
die jeweils eine Detektoreinheit umfassen, kann in jedem spektralen
Kanal eine eigenständige
Schlitzblende verwendet werden. Zur baulichen Vereinfachung kann
aber auch optional eine gemeinsame Schlitzblende allen spektralen
Kanälen
vorgeordnet werden.
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Zur
einfachen Justierung der Lage des konfokalen schlitzförmigen Elementes
(z. B. der Schlitzblende oder des Detektors) kann man dieses Element
entsprechend verschiebbar ausbilden. Baulich einfacher ist aber
eine in der Beleuchtungsanordnung und/oder der Detektoranordnung
vorgesehene Korrektur-Vorrichtung mit mindestens einer planparallelen
transparenten Platte, die in einer Halterung im Strahlengang gehalten
ist und durch diese in einer Kipp- und/oder Schwenkbewegung um mindestens eine
Achse antreibbar ist, um durch Veränderung der Kipplage der Platte
einen bestimmten Parallelversatz der Strahlen im Strahlengang einzustellen.
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Die
Korrektur-Vorrichtung hat den Vorteil, daß eine einfache Kompensation
oder Korrektur von in der Abbildung der optischen Anordnung entstehenden
Fehlern möglich
ist, insbesondere können einfach
Umgebungs- oder Systemtemperatur, Stellung von wechselbaren oder
beweglichen Elementen in der Anordnung, Farbfehler aufgrund Wellenlänge oder
Wellängebereichen
der genutzten Strahlung korrigiert werden. Je nach Anforderung kann
dabei eine einachsige Kipp- bzw. Schwenkbewegung genügen. Möchte man
einen zweiachsigen Parallelversatz vorsehen, kann entweder eine
zweiachsig kipp- bzw. schwenkbare Platte verwendet werden, oder man
kann zwei unterschiedlich einachsig kipp- oder schwenkbare Platten
vorsehen. Wesentlich für
die Erfindung ist es, daß die
planparallele Platte mit der Halterung auf definierte und bekannte
Weise im Strahlengang verkippt werden kann. Für eine zweiachsige Verstellung
ist jede Kombination von Kipp- und Schwenkbewegung tauglich. Eine
Kombination aus einer Kippbewegung und einer Schwenkbewegung ist
dabei mechanisch relativ einfach zu realisieren und bringt trotz
des bei der Schwenkbewegung auftretenden Verschiebens der planparallelen
Platte entlang der optischen Achse überraschenderweise keinen Nachteil.
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Die
von der Vorrichtung bewirkte Korrektur kann ein Benutzer manuell
einleiten, z.B. bei einer Justage im Werk. Besonders bevorzugt ist
jedoch eine Weiterbildung mit einer Stelleinrichtung, die mindestens
einen Betriebsparameter der optischen Anordnung erfaßt und die
Kipplage abhängig
vom Wert des Betriebsparameters einstellt. Die Kipplage kann beispielsweise
in Kalibriertabellen abgelegt werden. Auch ist es möglich über aktive
Regelkreise permanent, regelmäßig oder
auf Anforderung hin eine Korrektur durch Einstellen der Kipplage
zu optimieren. Für
eine solche Ausgestaltung ist es bevorzugt, einen Regelkreis vorzusehen,
der die Kipplage der Platte als Stellgröße verwendet, um die geschilderten
Auswirkungen auf die abbildende optische Anordnung auszugleichen.
So können
auf einfache Weise in der optischen Anordnung eventuell vorhandene
Temperatur- oder Langzeitdriftfehler ausgeglichen werden.
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Da
der Parallelversatz durch eine planparallele Platte bekanntermaßen von
der Brechzahl des transparenten Plattenmaterials abhängt, können bei polychromatischer
Strahlung im Strahlengang der optischen Anordnung Farbquerfehler
durch einen wellenlängenabhängigen Parallelversatz
aufgrund einer Dispersion des Plattenmaterials entstehen. Durch
Aufbau der planparallelen Platte aus einer oder mehrerer Teilplatten
kann man solche, durch die planparallele Platte bedingten Farbquerfehler
kompensieren.
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Die
Korrektur-Vorrichtung kann aber auch zur Verwendung betriebszustandabhängig variierender
Farbquerfehler der optischen Abbildung selbst eingesetzt werden.
Ist beispielsweise eine optische Anordnung in der Lage, mit unterschiedlichen
Wellenlängen
zu arbeiten, so kann ein wellenlängenabhängiger und
damit betriebszustandsabhängiger
Farbquerfehler auftreten. Die Korrektur-Vorrichtung kann dann die
planparallele Platte je nach gerade in der optischen Anordnung benutzten
Wellenlängenbereich
und dadurch verursachten Farbquerfehler in eine andere Kipplage
bringen, so daß im
Endeffekt trotz Betrieb mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen
dennoch eine unveränderte
optische Abbildung in der Anordnung erfolgt. Auch für diese
Korrektur kann natürlich
wieder, wie bereits erwähnt,
eine geeignete Stelleinrichtung, die auch einen Regelkreis aufweisen
kann, verwendet werden.
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Die
Anforderungen an die Genauigkeit oder Feinfühligkeit, mit der der Antrieb über die
Halterung erfolgt, ist, wie der zugängige Parallelversatzbereich auch, über die
Dicke der planparallelen Platte einfach vorgebbar.
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Die
Korrektur-Vorrichtung mindert, wie bereits erwähnt, die Anforderungen an verstellbare
optische Elemente in der abbildenden optischen Anordnung. Dieser
Vorteil ist besonders bedeutsam, wenn das konfokale Mikroskop austauschbare
Strahlteiler aufweist, mit denen eine Anpassung auf verschiedene
Applikationen, d.h. ein Wechsel der eingestrahlten oder ausgelesenen
Wellenlängen
erfolgt. Die Korrektur-Vorrichtung korrigiert die durch veränderbare
optische Elemente bedingten Fehler ohne Eingriff auf die optische
Abbildung. Darüber
hinaus kann die Korrektur-Vorrichtung auch zwischen konfokaler Blende und
Detektor eingesetzt werden und so den Strahlengang (Abbildung) zwischen
Blende und Detektor geeignet parallelverschieben.
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Über eine
entsprechende Einstellung der Kipplage der planparallelen transparenten
Plattekann man sowohl eine Kompensation von Abweichungen senkrecht
zur Schlitzblende als auch eine Kompensation von Abweichungen parallel
zur Schlitzblende ausgleichen.
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Im
ersteren Fall wird sichergestellt, daß das von der Probe kommende
Licht exakt auf die Schlitzblende trifft und nicht oberhalb oder
unterhalb der Schlitzblende dezentriert ist. Im zweiten Fall wird
sichergestellt, daß das
von der Probe kommende Licht den Zeilendetektor korrekt trifft und
zwischen Bildern von zwei Detektionskanälen im System, die beispielsweise
jeder einen eigenen Zeilendetektor aufweisen, kein Pixelversatz
besteht. Somit kann das konfokale Mikroskop eine subpixelgenaue
Bilddeckung bei Mehrkanalausbildung erreichen.
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Die
Korrektur-Vorrichtung ist im konfokalen Mikroskop weiter dahingehend
vorteilhaft, daß nunmehr
eine schmale Detektorzeile verwendet werden kann, ohne daß eine Bewegung
von Schlitzblende und Detektor nötig
wird. Es ist dann vermieden, daß bei
einer Dejustage (bedingt durch Kipp- und Keilfehler wechselbarer
Elemente) bei einem zur Auflösungserhöhung erfolgten
Abblenden der Schlitzblende unnötig
Lichtfluß verloren
geht und damit das Signal/Rausch-Verhältnis sinkt.
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Da
die Kipp- oder Keilfehler einzeln einschaltbarer optischer Elemente
in der Regel reproduzierbar sind, kann die Kipplage der transparenten planparallelen
Platte auf einfache Weise gewählt werden.
Bei Wechsel eines einschaltbaren optischen Elementes ist lediglich
ein bestimmter Antrieb der planparallelen transparenten Platte erforderlich,
um die für
die anzustrebende Konfiguration des Mikroskops neu erforderliche
Kipplage einzustellen. Es ist deshalb eine Weiterbildung des Mikroskops
bevorzugt, bei der im Strahlengang wechsel- oder verstellbare Elemente
vorgesehen sind und die Stelleinreichung eine Konfiguration der
wechsel- oder verstellbaren Elemente als Betriebsparameter erfaßt und die Kipplage
abhängig
vom Wert des Betriebsparameters einstellt.
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Ein
Beispiel für
einen solchen Parameter, bei dem nicht nur die Dejustierung der
optischen Abbildung bezogen auf die Schlitzblende ausgeglichen wird,
sondern auch ein Farbquerfehler, sieht in vorteilhafter Weise vor,
im Strahlengang des Mikroskops Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge zu führen, wobei
die Stelleinrichtung die Kipplage entsprechend der Wellenlänge einstellt.
Es ist dann jedem Detektionskanal eine oder mehrere planparallele
Platten dem Detektor vorgeordnet und die Kipplage der planparallelen
Platte wird von der Stelleinrichtung abhängig von der Wellenlänge bzw.
dem Wellenlängenbereich
im aktuellen Kanal eingestellt.
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Eine
besonders komfortable Benutzung erhält man, wenn ein Regelkreis
vorgesehen ist, der die Strahlungsintensität an der Detektoreinheit maximiert,
und/oder den Bildversatz minimiert indem die Kipplage der planparallelen
Platte als Stellgröße eingesetzt
wird. Somit können
Langzeiteffekte oder Temperaturveränderungen, die Dejustagen nach
sich ziehen, jederzeit ohne Einsatz eines Servicetechnikers auskorrigiert
werden.
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Das
erfindungsgemäße Mikroskop
sieht in einer Weiterbildung vor, daß die Probe weitfeldbeleuchtet
wird und durch Scannen des Punkt- oder Punktgruppenspots abgebildet
wird.
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Die
Erfindung setzt also nunmehr vorteilhafterweise eine Weitfeldbeleuchtung
in Kombination mit einer gescannten Detektion ein. Mit dieser überraschend
einfachen Maßnahme
wird ein separater Detektor verzichtbar. Gleichzeitig erreicht man
eine zusätzliche
Fülle von
Vorteilen.
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Für die Weitfeldbeleuchtung
können
Strahlungsquellen verwendet werden, die am Laserscanningmikroskop
für normale
optische Beobachtung ohnehin vorhanden sind. Ein Umschaltmechanismus wird
nicht mehr benötigt.
Es ergibt sich also insgesamt eine bauliche Vereinfachung. Vorzugsweise wird
die Weitfeldbeleuchtungsquelle eine Durchlichtbeleuchtung der Probe
realisieren. Alternativ und zusätzlich
ist natürlich
auch eine Weitfeld-Auflichtbeleuchtung
möglicht,
um beispielsweise Epi-Fluoreszenzmessungen oder Reflexionsmessungen
durchzuführen.
Auch kann man beide Modi (Auf- und Durchlicht) gleichzeitig realisieren.
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Die
Tiefendiskreminierungsfähigkeit
der konfokalen Detektoranordnung läßt damit eine tiefenaufgelöste Transmissionsmessung
zu.
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Durch
den Einsatz der meist ohnehin vorhandenen Weitfeldbeleuchtungsquellen,
die üblicherweise
verglichen mit dem zum Scannen vorgesehenen Anregungsbeleuchtungsquellen
sehr breitbandig sind, kann ein Weißlicht-Durchlichtbetrieb realisiert werden,
der aufgrund der Erfordernisse konfokaler Abbildung in herkömmlichen
Laserscanningmikroskopen so nicht oder nur unter enormem lichtquellenseitigen
Aufwand möglich
war. Gleiches gilt analog hinsichtlich Weitfeld-Auflichtfluoreszenzanregung.
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Durch
die Abtastung der weitfeldbeleuchteten Probe mit den gescannten
Detektoren kann eine im Laserscanningmikroskop vorhandene spektrale Analysefähigkeit
der Detektoranordnung auch im Transmissionsbetrieb ausgenutzt werden,
was zu einer besseren Probencharakterisierung führt.
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Die
Weitfeldbeleuchtung kann unabhängig von
der gescannten spotförmigen
Beleuchtung betrieben werden. Natürlich kann die Steuereinheit auch
einen gleichzeitigen Betrieb einleiten, in dem dann die Probe gleichzeitig
im Transmissions- wie auch im herkömmlichen Fluoreszenzbetrieb
analysiert wird.
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Beispielsweise
kann die Steuereinheit verschiedene spektrale Kanäle geeignet
auslesen, so daß in
einigen spektralen Kanälen
Fluoreszenzinformation über
die Probe, in anderen spektralen Kanälen Transmissionsinformation
anfällt.
Eine geeignete Zusammenführung
dieser Information, beispielsweise in einem überlagerten Bild, gibt eine
herkömmlichen
Systemen überlegene
Probenanalyse. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Steuereinheit die Spot-Beleuchtungsanordnung
und die Weitfeldbeleuchtungsquelle simultan im Betrieb steuert und
die spektralen Kanäle
der Spot-Detektoranordnung geeignet ausliest.
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Ein
weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Ansatzes liegt darin, daß nun auch
an mehreren Punkten gleichzeitig ein Durchlichtscan möglich ist, was
herkömmliche,
unter der Probe angeordneten separaten Detektoren mangels geeigneter
Ortsauflösung
nicht erlaubten. Die nun durch die Erfindung eröffnete Verwendung eines Multipunkt-
oder Punktgruppenscanners im Durchlichtbetrieb mindert eventuelle
Probleme durch zeitliche Fluktuationen der Weitfeldbeleuchtung,
da diese durch geeignete Verlängerung
der Integrationszeit bei Mehrpunkt- oder Punktgruppensystemen ausgeglichen
werden kann. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Weitfeldbeleuchtung und
die gescannte punkt- oder punktgruppenförmige Beleuchtung gleichzeitig
vorgenommen werden. Unter Punktgruppe wird dabei jede Anordnung von
mehreren Punkten verstanden, insbesondere in Form einer Linie, die
das Laserscanningmikroskop konfokal beleuchtet und abbildet. Durch
diesen Ansatz werden weiter vorteilhaft geringere Probenbelastungen
bzw. kürzere
Meßzeiten
realisiert, die im Stand der Technik so nicht möglich waren. Es ist deshalb
besonders bevorzugt, daß die
Spot-Detektoranordnung
eine konfokale Punktgruppenabbildung verwirklicht, z. B. mit mindestens
einer Nipkow-Scheibe und mindestens einem Matrixdetektor. Auch kann
die Spotdetektoranordnung auch eine konfokale Schlitzblende mit
einem Zeilendetektor verwenden, wenn eine Linie als Punktgruppe
dinet.
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Die
Verwendung einer Weitfeldbeleuchtung erschließt schließlich völlig neue Kontrastierungsverfahren
für die
Durchlichtmessung. Es sind jetzt alle Kontrastierungsverfahren möglicht,
wie sie im Stand der Technik für
herkömmliche
optische Lichtmikroskope bekannt sind. Um dies zu realisieren, ist
es zu bevorzugen, daß die
Weitfeldbeleuchtungsquelle einen Kondensor aufweist, in den Kontrastierungsmittel
schaltbar sind. Beispielsweise kann man Dunkelfeldbeleuchtung realisieren,
indem im Kondensor eine geeignete Ringlende angeordnet wird.
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Es
sind aber auch noch weitere Kontrastierungsmethoden denkbar, wenn
die Scananordnung ein Scanobjektiv aufweist, in dessen Pupillenebene geeignete
Kontrastierungsmittel schaltbar sind. In Kombination mit der Einbringung
von Kontrastierungsmitteln in den Kondensor sind dann nicht nur Dunkelfeldkontrast,
sondern auch Phasenkontrast, VAREL-Kontrast, Polarisationskontrast
oder Differentialinterferenzkontrast möglich.
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Eine
zusätzliche
Untersuchung zeitaufgelöster
Prozesse ist im Laserscanningmikroskop mit Hilfe gegateter Detektorarrays
und der bekannten Pump- und Probentechnik möglich.
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Aufgrund
der an der Spaltblende erzeugten Teilkonfokalität wird eine im Vergleich zur
optischen Weitfeldbeleuchtung verbesserte Schnittdickenseparation
erzielt. In Kombination mit einer schnellen z-Fokussierung erreicht
der erfindungsgemäße Linienscanner
daher auch die 3D-Rekonstruktion
ausgedehnter Proben. Eine schnelle z-Abtastung kann realisiert werden
durch Bewegung der Probe in z-Richtung (z.B. durch schnelle mechanische
Antriebe bzw. eine piezoelektrische Probenbewegung), durch Bewegung
des Objektivs in z-Richtung (z.B. durch schnelle mechanische Antriebe
bzw. eine piezoelektrische Objektivbewegung), durch Objektivinnenfokussierungen
oder schnelle adaptive Optiken.
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Das
erfindungsgemäße Laserscanningmikroskop
ermöglicht
Verfahren zur Detektion schwacher spektroskopischer Signale in Mikroskopanordnungen.
Die Einsatzgebiete erstrecken sich von der Mikrospektroskopie und
Mikroanalytik zur „echten" 2D- und 3D-mikroskopische
Bildgebung. Ein bevorzugtes Verfahren beinhaltet hierbei die konfokale Stokes'sche bzw. anti-Stokes'sche Raman-Mikroskopie.
Grundsätzlich
kann jedoch jede spektroskopische Methode – und vorzugsweise solche mit
intensitätsschwachen
Signalen – mit
dem erfindungsgemäßen Mikroskop
zur mikroskopischen Kontrastierung verwendet werden. Als solche
Methoden sind z.B. denkbar: Lumineszenzspektroskopie (Fluoreszenz,
insbesondere Fluoreszenz-Polarisationsmessungen,
Chemolumineszenz, Biolumineszenz, Phosphoreszenz), Infrarotmikroskopie,
Circular-Dichroismus (CD)-Spektroskopie, Hyper-Raman-Spektroskopie,
Stimulierte Ramanspektroskopie, Kohärente Stokes'sche bzw. anti-Stokes'sche Raman-Spektroskopie (CARS,
CSRS sowie sämtliche
kohärente
Raman-Prozesse höherer
Ordnung sog. HORSES), allgemein parametrische nichtlineare optische
Prozesse, wie Second Harmonic Generation (SHG), Third Harmonic Generation
THG, Sum Frequency Generation (SFG), Zwei- und Mehrphotonen-Absorption bzw. -Fluoreszenz.
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Mehrere
der zuletzt aufgeführten
Methoden der nichtlinearen optischen Spektroskopie erfordern zwei
oder mehrere Laser, deren Strahlen kollinear überlagert werden. Hierbei erweist
sich die in dargestellte Strahlvereinigung mehrerer Laser als besonders
vorteilhaft.
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Potentielle
Verwendungen der Erfindung umfassen sämtliche Methoden, bei denen
routinemäßig eine
hohe mikroskopische Ortsauflösung
mit klassischer optischer Spektroskopie verknüpft wird. Die Verwendung der
Erfindung ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn routinemäßig, d.h.
ohne hohen Zeitaufwand 2D- und 3D-Substanzverteilungen quasi in Echtzeit
verfolgt werden sollen. Ein vielversprechendes Anwendungsgebiet
ist somit die chemischpharmazeutische Charakterisierung und Prozesskontrolle von
Wirkstoffverteilungen in Fasern, Folien, Lacken, Dispersionen, Suspensionen,
Emulsionen, Kunststoffen, Tabletten, etc. Besonders interessant
ist hierbei die Analyse kristalliner und amorpher Festkörper (z.B.
Analyse und Verteilung von Störstellen
in Kristallen). Neben der mikroanalytischen Charakterisierung bestehender
Substanzen ist auch Verfolgung chemischer Prozessabläufe denkbar,
z.B. bei Umsetzungen in mikrofluidischen Reaktionsträgern, bei Kristallumlagerungen
und der Festkörperpolymerisation.
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Im
Bereich der Medizintechnik ist insbesondere die ortsaufgelöste, nicht-invasive
Bestimmung von Wirkstoffen mit Hilfe Raman-spektroskopischer Methoden
von besonderem Interesse. Der Einsatz der Raman-Spektroskopie im
Bereich medizinischer Anwendungen wird häufig durch die erforderliche
Laserleistungsdichte im Fokus und die damit verbundene Zerstörung des
lebenden menschlichen Gewebes limitiert. Im Vergleich zu entsprechenden
Punktscannern ermöglicht
der Einsatz des erfindungsgemäßen Linienscanners
bei gleicher Aufnahmezeit und gleichem SNR die Durchführung von
Messungen mit einer um den Faktor n (n = 500-2000) geringeren Probenbelastung.
Als praktische Anwendung sei die Bestimmung der inhomogenen Verteilung
von Pigmenten und Antioxidantien im menschlichen Auge und der Haut
genannt.
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Ein
weiteres potentielles Anwendungsgebiet der beschriebenen Erfindung
bildet das High-Throughput-Raman-Screening
von Mikrotiterplatten (multiwell plates) im Bereich der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung.
Von besonderem Interesse sind hierbei oftmals Raman-spektroskopische
Polymorphie-Studien, welche apparativ nicht nur weniger aufwendig
als Röntgenstrukturanalysen
sind, sondern auch in Proben mit überstehender Lösung durchgeführt werden
können.
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber
noch näher erläutert. In
den Zeichnungen zeigen:
-
1 eine
schematische Darstellung eines Laserscanningmikroskops,
-
2 eine
schematische Darstellung eines Strahlungsquellenmoduls, eines Scanmoduls
sowie eines Detektormoduls für
ein Laserscanningmikroskop,
-
3 eine
schematische Darstellung des Strahlengangs in einer Beleuchtungsvorrichtung
des Laserscanningmikroskops der 2 in einer
ersten Schnittebene,
-
4 den
Strahlengang der 3 in einer zweiten, senkrecht
zur ersten Ebene gelegenen Schnittebene,
-
5 eine
Computerdarstellung eines Asphärenspiegels,
in der im Strahlengang der 3 und 4 verwendet
wird,
-
6 eine
Schnittdarstellung durch den Asphärenspiegel der 5 zur
Verdeutlichung der diesen Spiegel charakterisierenden Größen,
-
7 ein
mit dem Strahlengang der 1 und 2 erreichtes
Intensitätsprofil
in einer Schnittebene,
-
8 eine
schematische Darstellung eines Scanmoduls für das Laserscanningmikroskop
der 1 oder 2,
-
9 eine
schematische Darstellung zur Verdeutlichung des Korrekturbedarfs
bei der Anordnung der 8,
-
10 eine
schematische Darstellung einer planparallelen Platte in der Anordnung
der 8,
-
11 eine
perspektivische Darstellung der planparallelen Platte der 8 mit
motorischen Antrieb,
-
12 bis 15 weitere
Ausführungsformen
eines Laserscanningmikroskops in Darstellungen ähnlich der 2,
-
16 eine
schematische Darstellung eines Scanmoduls sowie eines Detektormoduls
eines Laserscanningmikroskops in Darstellungen ähnlich der 2,
-
17 zwei
Schemazeichnungen zur Veranschaulichung der Wirkungsweise des Detektormoduls
der 16.
-
18 eine
schematische Darstellung des Strahlenganges zwischen einer im Laserscanningmikroskop
der 2 vorgesehenen Zoom-Optik und der mit dem Laserscanningmikroskop
erfaßten
Probe,
-
19 eine
Kurve zur Veranschaulichung von Pupillendurchmessern im Aufbau gemäß 18,
-
20a, 20b und 21a, 21b sowie 22a, 22b unterschiedliche
Einstellungen der Zoomoptik der 2, wobei
die mit b bezeichneten Figuren eine Schnittdarstellung zeigen, die
um 90° gegenüber den
mit a bezeichneten Figuren gedreht ist,
-
23 ein
Diagramm mit der Verstellung der vier Optikgruppen der Zoom-Optik
der 20 bis 22 für einen
ersten Betriebsmodus mit konstanter Abbildungslänge,
-
24 ein
Diagramm mit der Einstellung der vier Optikgruppen für einen
zweiten Betriebsmodus mit konstanter Vergrößerung,
-
25 eine
Darstellung ähnlich
der 23 und 24, jedoch
für eine
Betriebsweise mit gleichzeitiger Variation von Abbildungslänge und
Vergrößerung,
-
26 eine
schematische Darstellung eines Scanfeldes zur Veranschaulichung
möglicher Zoom-Wirkungen,
-
27 eine
schematische Darstellung eines Laser-Scanningmikroskops mit einer
Nipkow-Scheibe,
-
28 eine
schematische Darstellung eines Laser-Scanningmikroskops mit paralleler
Mehrpunktbeleuchtung und -abtastung.
-
1 zeigt
schematisch ein Laserscanningmikroskop 1, das im wesentlichen
aus fünf
Komponenten aufgebaut ist: einem Strahlungsquellenmodul 2,
das Anregungsstrahlung für
die Laserscanningmikroskopie erzeugt, einem Scanmodul 3,
das die Anregungsstrahlung konditioniert und zum Scannen über eine
Probe geeignet ablenkt, einem Mikroskopmodul 4, das die
vom Scanmodul bereitgestellte scannende Strahlung in einem mikroskopischen Strahlengang
auf eine Probe richtet, sowie einem Detektormodul 5, das
optische Strahlung von der Probe erhält und detektiert. Das Detektormodul 5 kann
dabei, wie es in 1 dargestellt ist, spektral
mehrkanalig ausgeführt
sein.
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Das
Strahlungsquellenmodul 2 erzeugt Beleuchtungsstrahlung,
die für
die Laserscanningmikroskopie geeignet ist, also insbesondere Strahlung,
die Fluoreszenz auslösen
kann. Je nach Applikation weist das Strahlungsquellenmodul dazu
mehrere Strahlungsquellen auf. In einer dargestellten Ausführungsform
werden zwei Laser 6 und 7 im Strahlungsquellenmodul 2 vorgesehen,
denen jeweils ein Lichtventil 8 sowie ein Abschwächer 9 nachgeschaltet sind
und die ihre Strahlung über
ein Koppelstelle 10 in eine Lichtleitfaser 11 einkoppeln.
Das Lichtventil 8 wirkt als Strahlablenker, mit dem eine
Strahlabschaltung bewirkt werden kann, ohne den Betrieb der Laser
in der Lasereinheit 6 bzw. 7 selbst abschalten
zu müssen.
Das Lichtventil 8 ist beispielsweise als AOTF ausgebildet,
das zur Strahlabschaltung den Laserstrahl vor der Einkopplung in
die Lichtleitfaser 11 in Richtung einer nicht dargestellten
Lichtfalle ablenkt.
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In
der beispielhaften Darstellung der 1 weist
die Lasereinheit 6 drei Laser B, C, D auf, wohingegen die
Lasereinheit 7 nur einen Laser A beinhaltet. Die Darstellung
in 6 und 7 ist also beispielhaft für eine Kombination
aus Einzel- und Multiwellenlängenlaser,
die einzeln oder auch gemeinsam an eine oder mehrere Fasern angekoppelt
sind. Auch kann die Ankopplung über
mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung später nach
Durchlaufen einer Anpaßoptik
durch Farbvereiniger gemischt wird. Es ist somit möglich, verschiedenste
Wellenlängen
oder -bereiche für
die Anregungsstrahlung zu verwenden.
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Die
in die Lichtleitfaser 11 eingekoppelte Strahlung wird mittels
verschieblichen Kollimationsoptiken 12 und 13 über Strahlvereinigungsspiegel 14, 15 zusammengeführt und
in einer Strahlformungseinheit 16 hinsichtlich des Strahlprofils
verändert.
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Die
Kollimatoren 12, 13 sorgen dafür, daß die vom Strahlungsquellenmodul 2 an
das Scanmodul 3 zugeführte
Strahlung in einen Unendlichstrahlengang kollimiert wird. Dies erfolgt
jeweils vorteilhaft mit einer einzelnen Linse, die durch Verschiebung
entlang der optischen Achse unter Steuerung (einer nicht dargestellten)
zentralen Ansteuereinheit eine Fokussierungsfunktion hat, indem
der Abstand zwischen Kollimator 12, 13 und dem
jeweiligen Ende der Lichtleitfaser veränderbar ist.
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Die
Strahlformungseinheit 16, welche später noch eingehend erläutert wird,
erzeugt aus dem rotationssymmetrischen, gaußförmig profilierten Laserstrahl,
wie er nach den Strahlvereinigungsspiegeln 14, 15 vorliegt,
einen zeilenförmigen
Strahl, der nicht mehr rotationssymmetrisch ist, sondern im Querschnitt
zur Erzeugung eines rechteckig beleuchteten Feldes geeignet ist.
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Dieser
nachfolgend als zeilenförmig
bezeichnete Beleuchtungsstrahl dient als Anregungsstrahlung und
wird über
einen Hauptfarbteiler 17 zu einem Scanner 18 geleitet.
Auf den Hauptfarbteiler wird später
noch eingegangen, hier sei lediglich erwähnt, daß er die Funktion hat, vom
Mikroskopmodul 4 zurückkehrende
Probenstrahlung von der Anregungsstrahlung zu trennen.
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Der
Scanner 18 lenkt den zeilenförmigen Strahl einachsig ab,
wonach er durch ein Scanobjektiv 19 sowie eine Tubuslinse 20 und
ein Objektiv 21 in einen Fokus 22 gebündelt wird,
der in einem Präparat bzw.
in einer Probe 23 liegt. Die optische Abbildung erfolgt
dabei so, daß die
Probe 23 in einer Brennlinie mit Anregungsstrahlung beleuchtet
wird. Eine zweiachsige Ablenkung durch den Scanner 18 ist
optional; sie kann, wie noch erläutert
wird, zur Auswahl eines asymmetrisch zur optischen Achse liegenden Scan-Bereiches
ROI eingesetzt werden.
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Derart
im linienförmigen
Fokus 22 angeregte Fluoreszenz-Strahlung gelangt über das
Objektiv 21, die Tubuslinse 20 und das Scanobjektiv 19 zurück zum Scanner 18,
so daß in
Rückrichtung
nach dem Scanner 18 wieder ein ruhender Strahl vorliegt.
Man spricht deshalb auch davon, daß der Scanner 18 die Fluoreszenz-Strahlung
descannt. Die Probe wird auf der Linie parallel an mehreren Punkten
gleichzeitig beleuchtet und abgetastet. Die Linie stellt somit eine Punktgruppe
dar.
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Der
Hauptfarbteiler 17 läßt die in
anderen Wellenlängenbereichen
als die Anregungsstrahlung liegende Fluoreszenz-Strahlung passieren,
so daß sie über einen
Umlenkspiegel 24 im Detektormodul 5 umgelenkt
und dann analysiert werden kann. Das Detektormodul 5 weist
in der Ausführungsform
der 1 mehrere spektrale Kanäle auf, d.h. die vom Umlenkspiegel 24 kommende
Fluoreszenz-Strahlung wird in einem Nebenfarbteiler 25 in
zwei spektrale Kanäle
aufgeteilt.
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Jeder
spektrale Kanal weist eine Schlitzblende 26 auf, die eine
konfokale oder teil-konfokale Abbildung bezüglich der Probe 23 realisiert
und deren Größe die Tiefenschärfe, mit
der die Fluoreszenz-Strahlung detektiert werden kann, festlegt.
Die Geometrie der Schlitzblende 26 bestimmt somit die Schnittebene
innerhalb des (dicken) Präparates,
aus der Fluoreszenz-Strahlung
detektiert wird.
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Der
Schlitzblende 26 ist noch ein Blockfilter 27 nachgeordnet,
das unerwünschte,
in das Detektormodul 5 gelangte Anregungsstrahlung abblockt. Die
derart abseparierte, aus einem bestimmten Tiefenabschnitt stammende,
zeilenförmig
aufgefächerte Strahlung
wird dann von einem geeigneten Detektor 28 analysiert.
Analog zum geschilderten Farbkanal ist auch der zweite spektrale
Detektionskanal aufgebaut, der ebenfalls eine Schlitzblende 26a,
ein Blockfilter 27a sowie einen Detektor 28a umfaßt.
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Neben
der konfokalen Abtastung eines mit einer Brennlinie beleuchteten
Probenbereiches ermöglicht
das Laserscanningmikroskop 1 der 1 in der
dargestellten, diesbezüglich
optionalen Bauweise auch weitere Betriebsarten. Dazu ist eine Halogenleuchte 29 vorgesehen,
deren Strahlung über eine
Lampenoptik 30 und einen Kondensor 31 entgegen
der Blickrichtung der Scanoptik 19 auf die Probe 23 in
einer Weitfeldbeleuchtung gerichtet wird. Von dieser Beleuchtung
transmittierte Anteile werden ebenfalls durch das Objektiv 21,
die Tubuslinse 20, das Scanobjektiv 19 und den
Scanner 18 im Scanverfahren abgetastet und mittels des
Hauptfarbteilers 17 im Detektormodul 5 spektral
analysiert. Die Detektion über
den Scanner 18 bewirkt die Ortsauflösung in Form der Probenabtastung,
und zugleich ist eine Weitfeldbeleuchtung über die Halogenlampe 29 möglich.
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Das
gleiche Konzept kann auch zur Auswertung rückreflektierter Strahlung und
Epifluoreszenz-Strahlung
eingesetzt werden, in dem über
eine Quecksilberdampflampe 34 mit Lampenoptik 35 an einem
Strahlteiler 36 Beleuchtungsstrahlung in den Tubus des
Mikroskopmoduls 4 eingekoppelt wird. Diese Strahlung gelangt
dann über
das Objektiv 21 auf die Probe 23. Auch hier erfolgt
die Beleuchtung ohne Einwirkung des Scanners 18. Die Detektion
erfolgt dagegen wiederum über
die Scanoptik 19 und den Scanner 18 im Detektormodul 5.
Das Detektormodul 5 hat für diese Weiterbildung somit
eine Doppelfunktion, zum einen dient es als Detektor für gescannt
eingestrahlte Anregungsstrahlung, wobei der Scanner 18 sowohl
zur Einstrahlung der Anregungsstrahlung als auch zum Descannen der
detektierenden Strahlung dient. Zum anderen wirkt das Detektormodul 5 als
ortsauflösender
Detektor, wenn auf die Probe nicht weiter strukturierte Strahlung
eingestrahlt wird, nämlich
entweder als Weitfeldbeleuchtung von unten oder über das Objektiv 21.
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Aber
auch der Scanner 18 hat doppelte Wirkung, da er die Ortsauflösung durch
punktgruppen- oder
punktförmige
Abtastung der Probe nicht nur bei punktgruppen- oder punktförmig eingestrahlter
Anregungsstrahlung, sondern auch bei Weitfeldbeleuchtung erreicht.
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Darüber hinaus
ermöglicht
das Laserscanningmikroskop 1 der 1 nun einen
Kombinationsbetrieb, bei dem sowohl punkt- oder punktgruppenförmig eingestrahlte
Anregungsstrahlung aus dem Strahlungsquellenmodul 2 als
auch Weitfeldbeleuchtung aus der Halogenlampe 29 bzw. der
Quecksilberdampflampe 34 auf die Probe 23 gerichtet
wird und mittels des Scanners 18 und des Detektormoduls 5 eine
entsprechend punkt- oder punktgruppenförmige Abtastung der derlei
mehrfach bestrahlten Probe erreicht wird. Durch geeignete Wahl der
Nebenfarbteiler 25 bis 25c kann somit die klassische
Transmissions- oder Reflektionsmikroskopie mit Laserfluoreszenz-Messung
kombiniert werden. Die so durch Abtastung mittels der Auswertung
der Signale der Detektoren 28 bis 28c gewonnenen
Bildinformationen können
dann eigenständig
oder überlagert
ausgewertet bzw. dargestellt werden.
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Für die Weitfeldbeleuchtung
ist vorzugsweise zwischen Lampenoptik 30 und Kondensor 31 eine Feldblende
vorgesehen, um den beleuchteten Bereich einstellen zu können. Weiter
ist in den Kondensor 31 eine Aperturblende schaltbar. Sie
liegt in konjugierter Lage zu den Pupillenebenen des Laserscanningmikroskops.
Bei diesen Pupillenebenen handelt es sich um die Pupillenebene,
in der der Scanner 18 liegt sowie die Ebene, in der der
Hauptfarbteiler 17 angeordnet ist. Als Aperturblende sowie in
der Pupillenebene kann man nun verschiedene optische Elemente einsetzen,
um aus der klassischen Mikroskopie bekannte Kontrastierungsmethoden
zu verwenden, wie beispielsweise Dunkelfeld, Phasenkontrast, VAREL-Kontrast
oder Differenzialinterferenzkontrast. Geeignete Aperturblenden oder
in die Pupillenebene einzubringenden Elemente sind beispielsweise
in der Publikation „Microscopy
from the very beginning",
Carl Zeiss Mikroskopie, D-07740 Jena, 1997, Seiten 18-23, erläutert sind.
Der Offenbarungsgehalt dieser Firmenpublikation wird diesbezüglich explizit
hier eingebunden. Für
solche Kontrastierungseingriffe ist natürlich nicht nur die Pupillenebene
geeignet. Auch andere Pupillenebenen sind dazu tauglich. Beispielsweise
könnte
der Eingriff auch in Nähe
des Hauptfarbteilers 17 oder mittels einer Relayoptik nach
dem Nebenfarbteiler 25 in einem (oder mehreren) spektralen
Kanälen
des Detektorstrahlenganges erfolgen.
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Die
Verwendung einer konfokalen Schlitz-Apertur im Detektormodul 5 ist
nur beispielhaft. Prinzipiell können
beliebige Mehrpunktanordnungen, wie Punktwolken oder Nipkow-Scheibenkonzepte,
zur parallelen Punktgruppenabtastung verwendet werden. Wesentlich
ist allerdings, daß der Detektor 28 ortsauflösend ist,
damit eine parallele Erfassung mehrerer Probenpunkte beim Durchlauf
des Scanners erfolgt.
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Durch
dieses Konzept entfallen die im Stand der Technik bislang erforderlichen
nichtdescannten Detektoren am Mikroskopmodul 4. Außerdem kann durch
die konfokale Detektion eine hohe Ortsauflösung erreicht werden, die ansonsten
bei nichtdescannter Detektion nur mit aufwendigen Matrixsensoren
machbar wäre.
Darüber
hinaus können
zeitliche Fluktuationen der einstrahlenden Weitfeldbeleuchtung,
z.B. der Halogenlampe 29 oder der Quecksilberdampflampe 34 u.ä., können durch
eine geeignete Integration im ortsauflösenden Detektor 28, 28a ausgeschaltet
werden.
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Für diese
Betriebsart des Laserscanningmikroskops 1 ist natürlich der
Hauptfarbteiler 17 sowie der Nebenfarbteiler 25 geeignet
eingestellt. Dies ermöglicht
auch, beide Beleuchtungsarten, d.h. Weitfeldbeleuchtung von unten
und Beleuchtung durch das Objektiv 21 gleichzeitig vorzunehmen,
wenn die Farbteiler als geeignete Dichroiten ausgestaltet sind. Auch
sind beliebige Kombinationen mit gescannter Beleuchtung aus dem
Strahlungsqellenmodul 2 möglich. Eine entsprechende überlagerte
grafische Darstellung der ausgewerteten Signale bietet dann eine gegenüber herkömmlichen
Konzepten überragende Bildinformation.
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Die
Kombination einer konfokalen Zeilenabbildung, d.h. eines Linienscanners,
mit einer spektralen mehrkanaligen Detektion ermöglicht eine hochparallele Datenaufnahme.
Es ist eine Bildaufnahmerate von über 200 Bildern pro Sekunde
erreichbar und eine Laserscanningmikroskopen bislang nicht realisierte
Echtzeit-Fähigkeit
gegeben. Alternativ ermöglicht
das Laserscanningmikroskop 1 auch eine hochsensitive Detektion
besonders schwacher Signalintensitäten. Verglichen mit einem konfokalen
herkömmlichen
Punkt-Laserscanningmikroskop
ist bei gleicher Bildaufnahmezeit, bei gleicher in der Probe abgebildeter
Fläche,
bei gleichem Sehfeld und bei gleicher Laserleistung pro Pixel ein
um einen Faktor √n verbessertes Signal-/Rauschverhältnis realisiert, wenn
man mit n die Anzahl der Pixel in der Detektorzeile bezeichnet.
Hierfür
ist ein Wert von 500 bis 2.000 typisch.
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Das
Strahlquellenmodul 2 der Laserscanningmikroskops 1 erfüllt die
dafür nötige Voraussetzung,
nämlich
daß die
Beleuchtungszeile, die von der Strahlformungseinheit 16 bereitgestellt
wird, die n-fache Leistung aufweist, wie der Laserfocus eines vergleichbaren
konfokalen Punktscanners.
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Alternativ
kann im Vergleich zum konfokalen Einzel-Punktscanner bei gleicher
Bildaufnahmezeit und gleichem Signal-/Rauschverhältnis die Probenbelastung,
d.h. die Strahlungsmenge der die Probe ausgesetzt wird und die zum
Ausbleichen der Probe führen
kann, um den Faktor n gesenkt werden, wenn die bislang in einem
konfokalen Punktscanner aufgewandte Strahlungsleistung nun auf die
Zeile verteilt wird.
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Das
zeilenabtastende Laserscanningmikroskop mit der Strahlformungseinheit 16 ermöglichst also
im Vergleich zum konfokalen Punktscannern, intensitätsschwache
Signale empfindlicher Probensubstanzen bei gleichen Signal-/Rauschverhältnis und gleicher
Probenbelastung um den Faktor n schneller, bei gleicher Aufnahmezeit
mit einem um den Faktor √n verbesserten Signal-/Rauschverhältnis oder
bei gleiche Aufnahmezeit mit gleichem Signal-/Rauschverhältnis und
einer um den Faktor n geringeren Probenbelastung abzubilden.
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2 zeigt
im Detail eine Ausführungsform für ein Strahlungsquellenmodul 2,
ein Scanmodul 3 sowie ein Detektormodul 5 für das Laserscanningmikroskop 1.
Bereits in 1 erscheinende Bauteile sind
in 2 mit denselben Bezugszeichen bezeichnet, weshalb
bezüglich
der Beschreibung der 2 zumindest teilweise auf die 1 verwiesen
wird.
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In 2 ist
zu sehen, daß die
nach den beweglichen, d.h. verschieblichen Kollimatoren 12 und 13 vorliegenden
Gauß'schen Strahlenbündel über eine
Spiegeltreppe in Form der Strahlvereinigungsspiegel 14, 16 vereinigt
und anschließend
in ein Strahlbündel
mit rechteckigem Strahlquerschnitt konvertiert werden. Im einfachsten
Fall handelt es sich bei der Strahlformungseinheit 16 der 1 um
eine Zylinderoptik. In der Ausführungsform
der 2 wird jedoch ein Zylinderteleskop 37 verwendet,
dem eine Asphäreneinheit 38 nachgeordnet
ist, auf das eine Zylinderoptik 39 folgt. Bauweise und
Funktion der Asphäreneinheit 37 werden
nun nachfolgend anhand der 3 bis 7 erläutert.
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Die 3 und 4 zeigen
eine Beleuchtungsanordnung, mit der Strahlung der Strahlquellen hinsichtlich
des Strahlprofils umgeformt werden kann. 3 ist ein
Schnitt in einer (z,x)-Ebene; 4 ist
ein Schnitt senkrecht dazu in einer (z,y)-Ebene. Ursprünglich liegt
ein Strahl vor, der in jeder Schnittrichtung senkrecht zur Ausbreitungsrichtung
gaußförmig profiliert
ist. Nach der Umformung liegt in einer Profilebene P ein Strahl
vor, der im wesentlichen ein rechteckiges Feld ausleuchtet, wobei
die Intensitätsverteilung
entlang der Feldlängsachse
nicht gaußförmig sondern
kastenförmig
ist.
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Zur
Strahlumformung wird ein Asphärenspiegel 38.1 genutzt,
der die Strahlung aufweitet. Die aufgeweitete Strahlung wird mittels
eines Sammelspiegels 38.2 wieder parallelisiert. Der Asphärenspiegel 38.1 ist
mit einem Ursprungsstrahl 38.3 aus der Strahlquelle beaufschlagt,
der ein rotationssymmetrisches gaußförmiges Strahlprofil aufweist.
Der Asphärenspiegel 38.1 ist
in dem in 3 dargestellten Schnitt gemäß einem
Krümmungsradius
rx gekrümmt,
in dieser Ebene also sphärisch.
Die asphärische
Komponente kommt erst in dem in 4 dargestellten
und noch zu erläuternden
Schnitt zum Tragen. Aufgrund der Sphärizität des Asphärenspiegels 38.1 entlang
der x-Achse wird der vom Asphärenspiegel 38.1 abgegebene
divergierende Strahl unter Beibehaltung des Gaußprofils aufgeweitet. Der Sammelspiegel 38.2,
der in der Schnittebene der 3 ebenfalls
sphärisch
ist, sorgt für
einen profilierten Strahl 38.5, der in der Profilebene
P in der Schnittdarstellung der 3 ebenfalls
Gaußprofil
hat. Natürlich kann
man, wenn diese Aufweitung unerwünscht
ist, Asphärenspiegel 38.1 und
Sammelspiegel 38.2 i der (z,x)-Ebene auch plan ausführen.
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4 zeigt
einen Schnitt senkrecht zur 3. In dieser
Ebene ist der Asphärenspiegel 38.1 asphärisch ausgebildet
und der von der Strahlquelle abgegebene Ursprungsstrahl 38.3 wird
nun energieumverteilend in einen divergierenden Strahl 38.4 umgesetzt.
Der Asphärenspiegel 38.1 reflektiert
mit zunehmenden Winkel zur optischen Achse OA zunehmend Strahlleistung,
so daß im
divergierenden Strahl 38.4 in der Schnittdarstellung der 2 Energie
umverteilt. Der Sammelspiegel 2 sammelt den in der Schnittdarstellung
der 4 im Querschnitt nicht mehr gaußförmigen,
divergierenden Strahl 4 und parallelisiert die Strahlung
zu einem profilierten Strahl 38.5. In dieser Ebene ist
deshalb in 4 im Gegensatz zu 3 eine
nicht äquidistante
Verteilung der zur Veranschaulichung eingezeichneten Teilstrahlen gezeigt.
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Die
Wirkung des in 3 und 4 auch mit einer
konvexen Krümmung
versehenen Asphärenspiegels 38.1 wird
noch besser erkennbar, wenn man dessen in 5 exemplarisch
dargestellte Spiegelfläche 38.6 betrachtet.
Die Spiegelfläche 38.6.
weist zwei Dachflächen 38.7, 38.8 auf,
die in einem First 38.9 zusammenlaufen. Gleichzeitig ist
die Spiegelfläche 38.6 entlang
der x-Achse sphärisch
gekrümmt (ein
optionales Merkmal, s.o.), wie auch an der Krümmung des Firstes 38.9 deutlich
wird. Die Spiegelfläche 38.6 ist
also in einem (z,y)-Schnitt (parallel zur y-Achse) kegelig mit abgerundeter
Spitze. In einem Schnitt parallel zur x-Achse ((z,x)-Schnitt) liegt
dagegen eine sphärische
Krümmung
vor. Natürlich
kann anstelle der spährischen
Krümmung
längs der
x-Achse eine plane Ausbildung oder ebenfalls eine asphärische Krümmung verwendet
werden.
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Die
asphärische
Krümmung
in der (z,y)-Ebene bewirkt die in 4 dargestellte
Energieumverteilung, da durch das nur im Bereich der Spitze abgerundete
Kegelprofil in zunehmende Winkel zur optischen Achse auch zunehmende
Energieanteile reflektiert werden. Die sphärische Krümmung in der (z,x)-Ebene bewirkt
dagegen eine profilbeibehaltende Aufweitung des Strahls, wie sie
in 3 dargestellt ist. Das ursprüngliche, rotationssymmetrische gaußförmige Profil
wird somit zu einem annähernd rechteckigen
Profil umgestaltet. Bei Asphärität in beiden
Schnittebenen ist das Feld in beiden Schnittebenen homogenisiert.
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6 zeigt
eine Schnittlinie 38.12 der Spiegelfläche 38.6 in einem
(z,y)-Schnitt, d. h. in einem Schnitt längs der y-Achse. Die Schnittlinie 38.12 ist zur
Verdeutlichung nicht nur in 6 sondern
auch als dickere Linie in 5 eingetragen.
Ihre Form ist im wesentlichen durch zwei geometrische Faktoren bestimmt – zum einen
durch eine Parabel 38.10, die die Form der abgerundeten
Spitze der Schnittlinie 38.12 festlegt, und zum anderen
durch eine Asymptote 38.13, die den Verlauf der Schnittlinie 38.12 fern der
Spitze 38.11 definiert. Die Parabel 38.10 kann durch
Angabe eines Krümmungsradius
für die
Spitze definiert werden. Die Asymptote 38.13 ist durch
eine konische Konstante Q festgelegt. Für gegen Unendlich gehende y-Werte
nähert
sich die Schnittlinie 12 an die Gerade 1/(Q·c) + y/(1 – (1 + Q)1/2) an. Die konische Konstante Q bestimmt
also den Anstieg 1/(1 – (1
+ Q))1/2 im äußeren sphärischen Bereich. Der Radius
c legt die Krümmung
im Bereich der Spitze 38.11 fest. Insgesamt wird die Schnittlinie
deshalb durch die Gleichung y2/[c + (c2 – (1
+ Q)y2)1/2] definiert.
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Die
für eine
Schnittrichtung erläuterte
Asphärizität kann natürlich auch
in der anderen Schnittrichtung vorgesehen werden. Man erreicht damit
ein homogen ausgeleuchtetes ellipsen- oder kreisförmiges Feld; letzteres bei
einem rotationssymmetrischen Asphärenspiegel 38.1. Alternativ
kann auf die Sphärizität in der
x-Richtung verzichtet werden. Der Asphärenspiegel 38.1 hat
dann zu jeder x-Koordinate die Profilform der Schnittlinie 38.12.
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Die
in 5 dargestellte Spiegelfläche hat einen Krümmungsradius
c = 10 mm, eine konische Konstante Q = –100 sowie einen Krümmungsradius entlang
der x-Achse von rx = 100 mm. Der Parameter rx wird üblicherweise
sehr viel größer als
der Durchmesser des Ursprungsstrahls 38.3 gewählt werden.
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7 zeigt
als Profil 38.14 dargestellte annähernde Gleichverteilung der
Intensität 1 in
der Profilebene als Darstellung entlang der y-Achse. Wie zu sehen
ist, liegt in 80% des ausgeleuchteten Bereiches die Strahlungsintensität bei über 80%
des Maximalwertes; ist also im wesentlichen homogen. Das Profil 38.14 ist
annähernd
kastenförmig,
jedenfalls einem Rechteck sehr viel näher als dem ursprünglich vorhandenen
Gaußprofil.
Bei Asphärität in beiden Raumrichtungen
wäre in 7 statt „y", der Radius eines
ausgeleuchteten Feldes aufgetragen.
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Die
konvexe oder konkave Spiegelfläche 38.6 des
Asphärenspiegel 38.1 kann
auf verschiedenste Weise gefertigt werden. So kann in einen Zylinder,
der einen Krümmungsradius
hat, der dem Krümmungsradius
rx der Spiegelfläche in der (z,x)-Ebene entspricht,
das der Schnittlinie 38.12 entsprechende Profil eingearbeitet
werden. Will man eine Spiegelfläche 38.6,
die in der (z,x)-Ebene nicht gekrümmt ist, d. h. deren Krümmungsradius
in dieser Schnittebene als unendlich angenommen werden kann, kann
die Bearbeitung an einem Quader oder Keil erfolgen, der dann im
Bereich des Firstes entsprechend der durch die Parabel 38.10 vorgegebenen
Krümmung
c abgerundet wird. Bei rx Radien kleiner
0 können
Replika- oder Abformtechniken zur Ausbildung der Spiegelfläche 38.6 des
Asphärenspiegels 38.1 eingesetzt
werden.
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Zur
Erzeugung des profilierten Strahles 38.5 ist dem Asphärenspiegel 38.1,
wie in den 3 und 4 gezeigt,
ein Sammelspiegel 38.2 nachgeordnet. Dieser ist z. B. als
torischer Spiegel mit Krümmungsradien
rtx, rty ausgebildet
und parallelisiert den divergierenden Strahl 38.4. Dabei
läuft der
divergierende Strahl 38.4 sowohl bedingt durch die sphärische Krümmung (in
der (z,x)-Ebene)
des Asphärenspiegel 38.1 als
auch durch das asphärische
Profil gemäß der Schnittlinie 38.12 bedingt
auseinander. Zur Kollimation des divergierenden Strahles 38.4 ist der
Sammelspiegel 38.2 deshalb als torischer Spiegel mit unterschiedlichen
Krümmungsradien
rtx und rty ausgebildet.
Die erstgenannte Divergenz stellt die Höhe des vom profilierten Strahl 38.5 auszuleuchtenden
rechteckigen Feldes ein, die zweitgenannte Divergenz bewirkt die
Aufweitung entlang der längeren Ausdehnung.
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Um
die Höheneinstellung
des auszuleuchtenden rechteckigen Feldes besonders einfach vornehmen
zu können,
wird für
den torischen Spiegel der Radius rtx als
rtx + 2·d gewählt, wobei d den Abstand zwischen
Asphärenspiegel 38.1 und
Sammelspiegel 38.2 auf der optischen Achse beschreibt. Man
erhält
dann einen Strahlaufweitungsfaktor von rtx/rx und damit etwa 1 + 2d/rx.
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Anstelle
des Sammelspiegels 38.2 kann natürlich auch eine entsprechende
achromatische torische Linse verwendet werden. Ferner kann zur Behebung
des veränderten
Bündeldurchmessers
quer zur homogenisierten Richtung mindestens ein Zylinderspiegel
eingesetzt werden, welcher so dimensioniert ist, daß er zusammen
mit dem Radius rx des Asphärenspiegels 38.1 sowie
dem Radius rtx des Sammelspiegels 38.2 die
Fokussierung und den Bündeldurchmesser
quer zur homogenisierten Richtung gezielt verändert. Dieser Zylinderspiegel
kann vor dem Asphärenspiegel 38.1 oder
nach dem torischen Sammelspiegel 38.2 angeordnet werden.
Seine Funktion kann man auch durch mindestens eine achromatische
Zylinderlinse erreichen.
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Die
Beleuchtungsanordnung mit dem Asphärenspiegel 38.1 kann
zur gleichmäßigen Füllung einer
Pupille zwischen einer Tubuslinse und einem Objektiv dienen. Damit
kann die optische Auflösung
des Objektivs voll ausgeschöpft
werden. Diese Variante ist zweckmäßig in einem punkt-scannenden
Mikroskopsystem oder in einem linien-scannenden System (bei letzterem
zusätzlich
zu der Achse, in der auf bzw. in die Probe fokussiert wird).
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Die
wie erklärt
linienförmig
konditionierte Anregungsstrahlung wird auf den Hauptfarbteiler
17 gelenkt. Dieser ist in einer bevorzugten
Ausführungsform
als spektral-neutraler Teilerspiegel gemäß der
DE 10257237 A1 ausgeführt, deren
Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich
einbezogen ist. Der Begriff „Farbteiler" umfaßt also
auch nichtspektral wirkende Teilersysteme. Anstelle des beschriebenen
spektral unabhängigen
Farbteilers kann auch ein homogener Neutralteiler (z.B. 50/50, 70/30,
80/20 o.ä.)
oder ein dichroitischer Teiler Verwendung finden. Damit applikationsabhängig eine
Auswahl möglich
ist, ist der Hauptfarbteiler vorzugsweise mit einer Mechanik versehen,
die einen einfachen Wechsel ermöglicht,
beispielsweise durch ein entsprechendes Tellerrad, das einzelne,
austauschbare Teiler enthält.
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Ein
dichroitischer Hauptfarbteiler ist besonders dann vorteilhaft, wenn
kohärente,
d. h. gerichtete Strahlung detektiert werden soll, wie z.B. Reflexion,
Stokes'sche bzw.
anti-Stokes'sche Raman-Spektroskopie,
kohärente
Raman-Prozesse höherer
Ordnung, allgemein parametrische nicht-lineare optische Prozesse,
wie Second Harmonic Generation, Third Harmonic Generation, Sum Frequency
Generation, Zwei- und Mehrfotonenabsorption bzw. Fluoreszenz. Mehrere
dieser Verfahren der nicht-linearen optischen Spektroskopie erfordern
den Einsatz zweier oder mehrer Laserstrahlen, die kollinear überlagert werden.
Hierbei erweist sich die dargestellte Strahlvereinigung der Strahlung
mehrerer Laser als besonders vorteilhaft. Grundsätzlich können die in der Fluoreszenzmikroskopie
weltverbreiteten dichroitischen Strahlteiler verwendet werden. Auch
ist es für
Raman-Mikroskopie vorteilhaft vor den Detektoren holografische Notch-Teiler
oder -Filter zu Unterdrückung des
Rayleigh-Streuanteils zu verwenden.
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Vorteilhafterweise
wird, wie in 2, 12, 14 und 15 gezeigt,
die Anregungsstrahlung bzw. Beleuchtungsstrahlung dem Scanner 18 über eine
motorisch ansteuerbare Zoom-Optik 41 zugeführt. Damit
kann der Zoom-Faktor angepaßt werden
und das abgetastete Sehfeld ist in einem bestimmten Verstellbereich
kontinuierlich variierbar. Besonders vorteilhaft ist eine Zoom-Optik, bei der während Anpassung
der Fokuslage und des Abbildungsmaßstabes die Pupillenlage im
kontinuierlichen Durchstimmvorgang erhalten bleibt. Die z. B. in 2 dargestellten,
durch Pfeile symbolisierten, drei Freiheitsgrade der Zoom-Optik 41 entsprechen
genau der Zahl der Freitheitsgrade, die zur Anpassung der drei Parameter,
Abbildungsmaßstab,
Fokus-, Pupillenlage, vorgesehen sind. Besonders bevorzugt ist eine
Zoom-Optik 41, an deren ausgangsseitigen Pupille eine feste
Blende 42 angeordnet ist. In einer praktischen einfachen
Realisierung kann die Blende 42 auch durch die Begrenzung
der Spiegelfläche
des Scanners 18 vorgegeben sein. Die ausgangsseitige Blende 42 mit
der Zoom-Optik 41 erreicht,
daß unabhängig vom
Verstellen der Zoomvergrößerung immer ein
festgelegter Pupillendurchmesser auf das Scanobjektiv 19 abgebildet
wird. Somit bleibt die Objektivpupille auch bei beliebiger Verstellung
der Zoomoptik 41 vollständig
ausgeleuchtet. Die Verwendung einer eigenständigen Blende 42 verhindert
vorteilhaft das Auftreten ungewollter Streustrahlung im Bereich
des Scanners 18.
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Mit
der Zoom-Optik 41 wirkt das Zylinderteleskop 37 zusammen,
das ebenfalls motorisch betätigbar
ist und der Asphäreneinheit 38 vorgeordnet
ist. Dies ist in der Ausführungsform
der 2 aus Gründen
eines kompakten Aufbaus gewählt,
muß aber nicht
so sein.
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Wird
ein Zoom-Faktor kleiner 1,0 gewünscht, wird
das Zylinderteleskop 37 automatisiert in den optischen
Strahlengang eingeschwenkt. Es verhindert, daß die Aperturblende 42 unvollständig ausgeleuchtet
ist, wenn das Zoomobjektiv 41 verkleinert ist. Das einschwenkbare
Zylinderteleskop 37 gewährleistet somit,
daß auch
bei Zoom-Faktoren kleiner 1, d. h. unabhängig von der Verstellung der
Zoomoptik 41 am Ort der Objektivpupille stets eine Beleuchtungslinie
konstanter Länge
vorliegt. Im Vergleich zu einem einfachen Sehfeld-Zoom sind somit
Laserleistungsverluste in dem Beleuchtungsstrahl vermieden.
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Da
beim Einschwenken des Zylinderteleskops 37 ein Bildhelligkeitssprung
in der Beleuchtungslinie unvermeidlich ist, ist in der (nicht dargestellten)
Steuereinheit vorgesehen, daß die
Vorschubgeschwindigkeit des Scanners 18 oder ein Verstärkungsfaktor
der Detektoren im Detektormodul 5 bei aktiviertem Zylinderteleskop 37 entsprechend
angepaßt
ist, um die Bildhelligkeit konstant zu halten.
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18 zeigt
schematisch eine mögliche Ausführungsform
für den
Strahlengang der 1 zwischen dem Hauptfarbteiler 17 und
einer im Mikroskopmodul 4 angeordneten Probe 23.
Die Zoom-Optik 41, die zur Vereinfachung in der Darstellung
der 19 nur zweigliedrig eingetragen ist, bewirkt im Beleuchtungsstrahlengang
BS eine Pupillenabbildung. Gleichzeitig entsteht im Gegenstandsstrahlengang
GS, der in 18 gestrichelt gezeichnet ist,
ein Zwischenbild ZB1 in der Zoom-Optik 41. Die Zoom-Optik 41 fokussiert
von Unendlich nach Unendlich. Die Ausgangspupille AP der Zoom-Optik 41 ist
zweckmäßigerweise,
wie bereits erwähnt,
durch die Blende 42 beschnitten, so daß unabhängig vom Verstellen der Zoomvergrößerung immer
ein festgelegter Pupillendurchmesser am nachgeordneten Scanobjektiv 19 vorliegt.
Im Mikroskopmodul 4 ist zwischen Tubuslinse 20 und
Objektiv 21 in der Objektivpupille OP eine Objektivblende
OB angeordnet, die durch die Austrittspupille AP gefüllt oder
sogar überausgeleuchtet
wird. Dadurch kann die maximale Objektivauflösung erreicht werden.
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19 zeigt
die Wirkung der Blende 42 für die Füllung der Objektivpupille OP.
Dabei ist auf der vertikalen Achse der Pupillendurchmesser d und
auf der horizontalen Achse die von der Zoom-Optik 41 bewirkte
Vergrößerung v
aufgetragen. Kurve 60 ist die Funktion, gemäß der sich
der Pupillendurchmesser ohne die Blende 42 ändern würde. Die
gestrichelte Linie 61 zeigt den Pupillendurchmesser nach
der Blende 42 in Abhängigkeit
von der Vergrößerung v. Die
strichpunktierte Linie 62 veranschaulicht schließlich den
Verlauf des Pupillendurchmessers der Objektivpupille OP. Wie zu
sehen ist, ist durch die Objektivblende OB, die kleiner als die
Blende 42 ist, die Objektivpupille unabhängig von
der Vergrößerung v.
Natürlich
kann die Objektivblende OB auch durch entsprechende Fassungen im
Objektiv 21 gegeben sein; es muß sich nicht um ein separates
Bauteil handeln.
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Die 20a/b, 21a/b
sowie 22a/b zeigen unterschiedliche
Einstellungen des Zoomobjektivs 41, wobei die Darstellung
gegenüber
der Darstellung der 19 invertiert ist, d. h. die
Beleuchtungsrichtung verläuft
in den 20 bis 22 von
links nach rechts. Weiter ist in den 20 bis 22, wie in 19 auch,
zur Vereinfachung der Scanner 18 nicht eingezeichnet. Wie
zu sehen ist, besteht in der exemplarisch gezeigten Bauweise das
Zoom-Objetiv aus vier optischen Gruppen G1 bis G4, wobei die Gruppe G1
positive Brechkraft hat und fest angeordnet ist. Die zweite Gruppe
G2 hat negative Brechkraft und wird zusammen mit den Gruppen G3
und G4, die wieder positive Brechkraft haben, bewegt. Die Bewegung
erfolgt derart, daß die
Fokussierung von unendlich nach unendlich erhalten bleibt und die
Vergrößerung bzw.
die Pupillenlage je nach Betriebsart eingestellt wird.
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Weiter
ist es in einer Ausbildungsvariante zweckmäßig, die Gruppe G1 mit dem
nachfolgenden Scanobjektiv als Einheit auszubilden; in dieser Variante
ist das Scanobjektiv also in Beleuchtungsrichtung vor dem (nicht
gezeigten) Scanner angeordnet.
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Jede
Gruppe besteht aus mindestens einer Linse. Um den Anforderungen
an den gewünschten Spektralbereich
sowie die angestrebte Apertur/Feldwinkel zu genügen, sind die Gruppen bezüglich der Abbildungsfehler
so weit wie möglich
in sich korrigiert.
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Die 23 bis 25 zeigen
schematisch und beispielhaft die Bewegung der Variooptik mit den Gruppen
G1 bis G4, wobei die Brennweiten wie folgt lauten: Brennweite G1,
45 mm; Brennweite G2, –153 mm;
Brennweite G3, 45 mm; Brennweite G4, 89 mm. Die Brennweiten skalieren
mit der Übertragungslänge L.
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Zur
Veranschaulichung ist in den 23 bis 25 weiter
die Lage der Austrittspupille AP sowie der Eintrittspupille EP eingezeichnet.
Die Übertragungslänge L ergibt
sich aus dem Abstand zwischen Eintrittspupille EP und Austrittspupille
AP. Für 20a ist darüber
hinaus die z-Koordinate, die entlang der optischen Achse gemessen
wird, für
die vier Gruppen G1 bis G4 eingetragen. Die Eintrittspupille ist
dabei auf Position 0 gesetzt.
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Die
mit a bezeichneten Figuren zeigen jeweils eine Schnittebene, die
gegenüber
den mit b bezeichneten Figuren um 90° gedreht ist. Somit enthalten
die 20a, 21a und 22a den Pupillenstrahlengang sowie die 20b, 21b sowie 22b den Objektstrahlengang. Aufgrund der im Ausführungsbeispiel
verwendeten konfokalen Schlitzblendenanordnung mit linienförmiger Beleuchtung
liegt im Objektstrahlengang immer dann eine Linie vor, wenn im Pupillenstrahlengang
eine Pupille bzw. in den 20a, 21a, 22a ein
Knotenpunkt vorliegt. Bei einer andersartigen konfokalen Abbildung
(z. B. mit Nipkow-Scheibe, Multipunktscannner, Einzelpunktscanner)
sind die Verhältnisse natürlich anders.
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In
den 21a/b ist ein Vergrößerungsfaktor v
= 1,4 eingestellt, wogegen die Stellung der 22a/b
bei gleicher Abbildungslänge
eine Vergrößerung von
v = 2,0 bewirkt. Gegenüber
den Abbildungslängen
der 21 und 22 ist
in der Einstellung der 20a/b
die Abbildungslänge
beim selben Vergrößerungsfaktor
wie 21a/b um 10 mm verlängert. Die
in den Figuren eingezeichnete Lage der Austrittspupille AP zeigt
dies deutlich.
-
Das
Zoomobjektiv 41 kann also in zwei unterschiedlichen Betriebsmodi
betrieben werden. Zum einen ist es möglich, die Vergrößerung v
bei konstanter Abbildungslänge
L zu verstellen. Eine Verstellung von der in 21a/b
gezeichneten Lage in die Lage gemäß Figuren 22a/b ist beispielsweise
ein Betrieb im ersten Betriebsmodus, der einen Scanfeld-Zoom verwirklicht.
Die dafür
möglichen
Einstellungen der Gruppen G2 bis G4 sind in 23 zu
sehen, in der die Koordinaten der Gruppen G1 bis G4 auf der z-Achse,
wie sie zur 20a eingetragen ist, als Funktion
der Vergrößerung v
aufgetragen sind.
-
Der
Begriff „Vergrößerung" ist hier wiederum auf
die Wirkung der Zoom-Optik, d. h. die Bildvergrößerung bezogen. Eine Bildvergrößerung wird
natürlich
dann erreicht, wenn die Zoom-Optik
in Beleuchtungsrichtung tatsächlich
eine Verkleinerung des zugeführten
Bildes der Beleuchtungsquelle zur Folge hat, d. h. wenn beispielsweise
eine Brennlinie verkürzt
wird.
-
Entgegen
der Beleuchtungsrichtung, d. h. in Detektionsrichtung, findet dagegen
eine Vergrößerung statt.
-
24 zeigt
einen zweiten Betriebsmodus, der mit konstanter Vergrößerung die Übertragungslänge verändert. Da
die Auftragung entlang der z-Achse in Millimeter vorgenommen ist,
sieht man deutlich, daß durch
eine Verstellung der Zoom-Optik die Übertragungslänge z. B.
um bis zu 20 mm variiert werden kann. Die Lage der Austrittspupille
AP verschiebt sich gegenüber
der (bei 0 mm befindlichen) Eintrittspupille sich von 180 auf 200
mm. Die Werte der Figur betreffen dabei eine Veränderung der Übertragungslänge bei
einem Vergrößerungsfaktor
von 1,0.
-
25 zeigt
eine Betriebsweise, die eine Mischung aus der genannten ersten Betriebsweise (23)
sowie der zweiten Betriebsweise (24) ist.
Mit der gezeigten Ansteuerung der Optikgruppen G2 bis G4 (Optikgruppe
G1 wird wiederum nicht verstellt) wird die Vergrößerung v gleichzeitig mit der Übertragungslänge L (letzteres
ergibt sich aus der veränderten
Lage der Austrittspupille in 25) variiert.
-
20 zeigt, wie mit Hilfe der Zoom-Optik 41 innerhalb
des zur Verfügung
stehenden maximalen Scanfeldes SF ein Bereich (region of interest)
ROI ausgewählt
werden kann. Beläßt man die
Ansteuerung des Scanners 18 so, daß die Amplitude sich nicht
verändert,
wie dies beispielsweise bei Resonanz-Scanner zwingend erforderlich
ist, bewirkt eine an der Zoom-Optik eingestellte Vergrößerung größer 1,0
eine Einengung des ausgewählten
Bereiches ROI zentriert um die optische Achse des Scanfeldes SF.
Steuert man den Scanner so an, daß er ein Feld asymmetrisch
zur optischen Achse, d. h. zur Ruhelage der Scannerspiegel abtastet,
so erhält
man im Zusammenhang mit einer Zoomwirkung eine Offsetverschiebung
OF des ausgewählten
Bereiches ROI. Dies wird auch als „crop"-Funktion bezeichnet.
-
Durch
die bereits erwähnte
Wirkung des Scanners 18, zu descannen, und durch den nochmaligen
Durchlauf durch die Zoom-Optik 41, wird die Auswahl des
interessierenden Bereiches ROI im Detektionsstrahlengang wieder
in Richtung auf den Detektor hin aufgehoben. Somit kann man eine
beliebige innerhalb des Scanbildes SF liegende Auswahl für den Bereich
ROI treffen. Zusätzlich
kann man für
verschiedene Auswahlen des Bereiches ROI Bilder gewinnen und diese
dann zu einem hochauflösenden Bild
zusammensetzen.
-
Möchte man
den ausgewählten
Bereich ROI nicht nur um einen Offset OF gegenüber der optischen Achse verschieben,
sondern auch zusätzlich drehen,
ist eine Ausführungsform
zweckmäßig, die
in einer Pupille des Strahlenganges zwischen Hauptfarbteiler 17 und
Probe 23 ein Abbe-König-Prisma vorsieht,
das bekanntermaßen
eine Bildfelddrehung zur Folge hat. Auch diese wird in Richtung
auf den Detektor hin wieder aufgehoben. Nun kann man Bilder mit
verschiedenen Offsetverschiebungen OF und verschiedenen Drehwinkeln
messen und anschließend
zu einem hochauflösenden
Bild verrechnen, beispielsweise gemäß einem Algorithmus, wie er
in der Veröffentlichung,
Gustafsson, M., „Doubling
the lateral resolution of wide-field fluorescence microscopy using
structured illumination",
in „Three-dimensional
and multidimensional microscopy: Image acquisition processing VII", Proceedings of
SPIE, Vol. 3919 (2000), p 141–150,
beschrieben ist.
-
Neben
der motorisch angetriebenen Zoomoptik 41 sowie dem motorisch
aktivierbaren Zylinderteleskop 37 sind auch im Detektormodul 5 des
Laserscanningmikroskops der 2 fernsteuerbare
Justierelemente vorgesehen. Zur Kompensation von Farblängsfehlern
sind beispielsweise vor der Schlitzblende eine Rundoptik 44 sowie
eine Zylinderoptik 39 und unmittelbar vor dem Detektor 28 eine
Zylinderoptik 39 vorgesehen, die jeweils in axialer Richtung
motorisch verschiebbar sind.
-
Zusätzlich ist
zur Kompensation eine Korrektureinheit 40 vorgesehen, die
nachfolgend anhand der 8 bis 11 beschrieben
wird.
-
8 zeigt
schematisch eine Ausführungsform
für das
Detektormodul 5 des Laserscanningmikroskopes 1.
Es weist als Detektor 28 eine CCD-Zeile 43 auf,
die über
den Farbteiler 25 in den Strahlengang des Laserscanningmikroskops 1 eingebunden ist.
Der Farbteiler 25 ist wechselbar, um mit Strahlung unterschiedlicher
Wellenlängebereiche
erfassen zu können.
Die Anpaßbarkeit
durch den wechselbaren Farbteiler 25 kann dabei sowohl
hinsichtlich im Laserscanningmikroskop verwendeter Anregungsstrahlung
als auch hinsichtlich zu detektierender (Fluoreszenz-)Strahlung
gegeben sein.
-
Die
CCD-Zeile 43 erhält über den
Farbteiler 25 Strahlung, die dann durch die als konfokale
Blende wirkende Schlitzblende 26 auf die CCD-Zeile 43 fällt.
-
Die
Schlitzblende 26 bildet zusammen mit einer vorgeordneten
Rundoptik 44 sowie der ebenfalls vorgeordneten ersten Zylinderoptik 39 sowie
der nachgeordneten zweiten Zylinderoptik ein Pinhole-Objektiv der
Detektoranordnung 5, wobei das Pinhole hier durch die Schlitzblende 26 realisiert
ist.
-
Der
zur Fluoreszenzanregung beleuchtete linien- oder zeilenförmige Bereich
der Probe 23, der konfokal abgebildet wird, ist in 8 schematisch dargestellt.
Um eine unerwünschte
Detektion von im System reflektierter Anregungsstrahlung an der CCD-Zeile 43 zu
vermeiden, ist der zweiten Zylinderlinse 39 noch das Blockfilter 27 vorgeschaltet,
das über
geeignete spektrale Eigenschaften verfügt, um lediglich gewünschte Fluoreszenzstrahlung
zu CCD-Zeile 43 gelangen zu lassen.
-
Ein
Wechsel des Farbteilers 25 oder des Blockfilters 27 bringt
unvermeidlich einen gewissen Kipp- oder Keilfehler bei Einschwenken
mit sich. Der Farbteiler kann einen Fehler zwischen Probenbereich
und Schlitzbelnd 26, das Blockfilter 27 einen Fehler
zwischen Schlitzblende 26 und CCD-Zeile 43 nach
sich ziehen. Um zu verhindern, daß dann eine Neujustierung der
Lage der Schlitzblende 26 bzw. der CCD-Zeile 43 erforderlich
ist, ist zwischen der Rundoptik 44 und der Schlitzblende 26,
d.h. im Abbildungsstrahlengang zwischen Proben 23 und CCD-Zeile 43 die
planparallele Platte 40 angeordnet, die unter Steuerung
eines Controllers C in verschiedene Kippstellungen gebracht werden
kann. Die planparallele Platte 40 ist dazu in einer geeigneten
(in 8 nicht dargestellten) Halterung angebracht, die später noch
anhand der 11 erläutert werden wird.
-
Die
planparallele Platte 40 bewirkt einen Parallelversatz,
der in 8 als leichter Versatz der optischen Achse OA
eingezeichnet ist. Dieser Parallelversatz ist schematisch auch in 10 zu
sehen, die eine (später
noch zu erläuternde)
Ausführungsform einer
zweitteiligen planparallelen Platte 40 betrifft. Das auf
die Platte 40 schräg
zur Plattenoberfläche einfallende
Strahlenbündel
E tritt als versetztes Strahlenbündel
A aus. Ohne planparallele Platte 40 wäre der in 10 gestrichelt
eingezeichnete ausfallende Strahl gegeben.
-
Eine
Veränderung
der Kippstellung der planparallelen Platte 40 ermöglicht es,
die Lage der Probenzeile gegenüber
der Schlitzblende 26 (sowie bei Einsatz der Platte 40 nach
der Schlitzblende 26 alternativ auch die Lage der Blende
zur ebenfalls als Blende wirkenden CCD-Zeile 43) so zu justieren,
daß für gegebene
Verhältnisse
im Strahlengang, die sich durch Wechsel des Farbteilers 25 ändern mögen, immer
eine optimale, d.h. zweiachsig zentrierte Lage gegeben ist. Dies
ist in 9 veranschaulicht, die in Draufsicht die Projektion
der Schlitzblende 26 auf die Probenzeile 23 zeigt.
Wie zu sehen ist, stellt sich aufgrund eines Kipp- oder Keilfehlers,
der beispielsweise durch den Farbteiler 17 oder 25 oder
den Blockfilter 27 bedingt sein kann, sowohl in x-Richtung
ein Versatz dx als auch in y-Richtung ein Versatz dy zwischen Schlitzblende 26 und
Probenzeile 23 ein.
-
Der
Versatz dx hat zur Folge, daß das
Signal-/Rauschverhältnis
unnötig
verschlechtert ist. Möchte
man durch Abblenden der Schlitzblende 26, d.h. durch Verringern
ihrer Ausdehnung in x-Richtung die Tiefenauflösung im konfokalen Mikroskop
verbessern, kann es geschehen, daß bei einem Versatz dx, der
größer als
die halbe Höhe
der Probenzeile 23 ist, gar keine Strahlung mehr auf die
CCD-Zeile gelangt. Der Versatz dx hat dann zur Folge, daß die mit
dem Laserscanningmikroskop erreichbare Tiefenauflösung geringer
ausfällt,
als mit dem Gerät eigentlich erreichbar
wäre. Analoges
gilt für
die alternativ oder kummulativ mögliche
Variante zur Justierung von Schlitzblende 26 und CCD-Zeile 23 Die
durch Einstellung der Kipplage der planparallelen Platte 40 erreichte
optische Justierung des Probenspotbildes zur Schlitzblende 26 bewirkt,
daß in
x-Richtung gesehen keine Flächenbereiche
der CCD-Zeile 43 unnötig
unbestrahlt bleiben.
-
Der
Versatz dy bewirkt dagegen, daß die
in y-Richtung durch die CCD-Zeile 43 erfaßte Ortsinformation
nicht den tatsächlichen
Emissions- oder Reflexionsverhältnissen
an der Probe 23 entspricht. Artefakte im Bild (oder ein
Bildersatz) können
die Folge sein. Die Einstellung der Kipplage der Platte 40 ermöglicht es,
den Versatz dy zu minimieren, vorzugsweise sogar auf Null zu bringen,
so daß die
Schlitzblende 26 mittig auf der CCD-Zeile 43 liegt
und alle Pixel der CCD-Zeile 43 korrekt ausgeleuchtet werden.
Dies ist insbesondere dann wichtig, wenn das Laserscanningmikroskop
mehrere Detektorkanäle aufweist,
die über
den Nebenfarbteiler 25 verschiedene Farbkanäle auslesen.
Da aufgrund der individuellen Justierungen der Kanäle ansonsten
unterschiedliche Versätze
dy vorliegen würden,
wäre bei einem
solchen Mehrkanallaserscanningmikroskop ein Fehler bei der Zuordnung
der einzelnen Farbkanäle
in einem zusammengesetzten Bild die Folge.
-
Je
nach Wellenlänge
oder Wellenlängenbereich,
die bzw. der in Detektormodul 5 ausgewertet wird, kann
das Pinhole-Objektiv einen unterschiedlichen Farbquerfehler aufweisen.
Gleiches gilt für
vorgeschaltete Elemente, beispielsweise den Farbteiler 17, 25 oder
andere auf der optischen Achse OA liegende Optiken. Durch Einstellung
der Kipplage der Platte 40 kann dieser Farbquerfehler gezielt
kompensiert werden. Der Controller C steuert dazu die Platte 40 in
eine Kipplage, wobei jede im Wellenlängebereich bzw. jeder Wellenlänge, für die das
Detektormodul 5 eingesetzt werden kann, eine eigene Kipplage zugeordnet
ist.
-
Wird
im Detektorkanal relativ breitbandig Strahlung geführt, kann
die planparallele Platte selbst einen Farbquerfehler bewirken, wenn
die Dispersion des transparenten Materials der planparallelen Platte 40 so
ist, daß ein
unterschiedlicher wellenlängenabhängiger Versatz
des ausfallenden Strahlbündels
A gegenüber
dem einfallenden Strahlenbündel
E gegeben ist. Zur Kompensation ist die in 10 dargestellte
Bauweise der planparallelen Platte 40 in einer Ausführungsform
vorgesehen, die aus zwei Teilplatten 40a, 40b besteht.
Die Materialien dieser Teilplatten 40a, 40b sind
unterschiedlich und so gewählt,
daß sich
im gegebenen Wellenlängenbereich die
dispersiv bedingten Farbquerfehler möglichst aufheben. Beispielsweise
bewirkt die Teilplatte 40a für kürzere Wellenlängen einen
stärkeren
Versatz als die Teilplatte 40b; umgekehrtes gilt für längere Wellenlängen. Somit
ist eine Kompensation des Farbquerfehlers der planparallelen 40 erreicht.
Zur Erzeugung eines farbunabhängigen
oder eines gezielt farbabhängigen
Parallelversatzes können
auch zwei getrennt kippbare Platten mit gegenläufiger Ablenkung und aus Materialien
mit unterschiedlicher Dispersion verwendet werden.
-
Der
Controller C stellt die Kipplage der Platte 40 auf Vorgabe
eines Benutzers hin, nach Auswertung der aktuellen Konfiguration
(insbesondere auch Umgebungs- oder Gerätetemperatur oder andere externe
Einflußgrößen) des
Laserscanningmikroskops oder in kontinuierlich oder intermittierend
ablaufenden Regelvorgängen
ein. Bei einer Regelung wird die Kipplage der Platte 40 als
Stellgröße verwendet.
Als geregelte Größe kann
in einem Kalibrierschritt die Strahlungsintensität oder der Bildversatz auf
der CCD-Zeile 43 ausgewertet werden.
-
Der
vom Controller C gesteuerte Antrieb 40.11 ist in 11 perspektivisch
dargestellt. Wie zu sehen ist, wird die planparallele Platte 40 mittels zweier
Schrittmotoren 40.12, 40.13 um die x- bzw. y-Achse verstellt.
Die Verstellung der x-Achse ist eine Kippbewegung mit einer Drehachse
in der Mitte der Platte 40. Die Drehung um die y-Achse
ist eine Schwenkbewegung um eine außerhalb der Platte gelegene
Achse.
-
Zur
Kippung um die x-Achse ist eine Halteplatte 40.14 vorgesehen,
an der ein Paar Blattfedern 40.15 angeschraubt ist, die
einen Rahmen 40.16 befestigen, in welchem die planparallele
Platte 40 gefaßt
ist. Die Blattfedern 40.15 legen die Kippachse fest. Sie
drücken
eine am Rahmen 40.16 befestigte Rolle 40.17 auf
eine Kurvenscheibe 40.18, die vom Schrittmotor 40.12 angetrieben
ist, welcher ebenfalls auf der Halteplatte 40.14 sitzt.
Je nach Stellung der Kurvenscheibe 40.18 wird somit die
Rolle 40.17 und damit der Rahmen 40.16 unterschiedlich
ausgelenkt, wodurch die Kippung der Platte 40 um die x-Achse erreicht
ist.
-
Die
Halteplatte 40.14 ist ihrerseits ein Arm eines Hebels 40.19,
der um eine Schwenkachse 40.20 drehbar ist. Die Schwenkachse 40.20 stellt
die Achse für
die Bewegung der Platte 40 um die y-Ebene dar. Der andere
Arm 40.21 des Hebels 40.19 trägt an seinem Ende eine Rolle 40.22,
die an einer Kurvenscheibe 40.23 anliegt, welche vom Schrittmotor 40.13 angetrieben
wird. Ähnlich
wie die Blattfedern 40.15 die Rolle 40.17 auf
die Kurvenscheibe 40.18 drücken, ist an der Schwenkachse 40.20 ein
Federelement vorgesehen, das die Rolle 40.22 auf die Kurvenscheibe 40.23 preßt.
-
Durch
Ansteuerung der Schrittmotoren 40.12, 40.13 kann
der Controller C, der über
nicht weiter bezeichnete Leitungen mit den Schrittmotoren verbunden
ist, die Kipp- bzw. Schwenklage der planparallelen Platte 40 im
Strahlengang der Detektoranordnung motorisch einstellen. Durch die
inkrementelle Ansteuerung der Schrittmotoren 40.12, 40.13 ist
in Kombination mit einer zum Betriebsbeginn angefahrenen Referenzposition
die aktuelle Stellung der Platte 40 zu jedem Betriebszeitpunkt
dem Controller C bekannt, so daß die
Stellung der Platte 40 in einem Regelkreis als Stellgröße verwendet
werden kann bzw. gemäß abgespeicherten
Vorgaben eingestellt werden kann.
-
Alternativ
zur zweiachsigen Verstellung, wie sie beispielhalber in 11 gezeigt
ist, können
auch zwei einachsig verstellbare Platten hintereinander geschaltet
werden.
-
Zusätzlich zur
Verstellung mittels der Korrektureinheit 40 bzw. 40a kann
auch die Schlitzblende 26, 26a selbst verstellt
werden. Dies geschieht insbesondere, um die Breite der Schlitzblende 26, 26a und damit
den Airy-Durchmesser am Detektor anzupassen. Durch die Verstellung
der Breite des Schlitzes der Schlitzblende 26 bzw. 26a wird
die Tiefenschärfe und
damit die Diskriminierung des Tiefenschnittes in z-Richtung, d.
h. entlang der optischen Achse in der Probe 23 eingestellt.
Eine zusätzliche
Querverschiebung dient zu einer Grobjustierung außerhalb
des Justierbereiches der Korrektureinheit 40 bzw. 40a.
-
12 zeigt
einen gegenüber 1, 2 abgewandelten
Aufbau, bei dem eine Schlitzblende mit unterschiedlich großen festen
Schlitzen auf einem Schieber angeordnet ist. Bei dieser Variante
der Schlitzblende 26 kann es sich beispielsweise um eine geeignet
strukturierte Chrommaske handeln, die motorisch verstellt wird.
Im Unterschied zum Aufbau der 2 ist die
Schlitzblende ebenfalls dem Nebenfarbteiler 25 angeordnet;
dies stellt eine Alternative zum Aufbau der 2 dar.
-
13 zeigt
eine vereinfachte Bauweise des Aufbaus der 12, bei
dem auf die Zoom-Verstellung
verzichtet wurde, d. h. die Zoomoptik 41 sowie das Zylinderteleskop 37 entfallen.
Auch ist 13 ein Beispiel für eine Bauweise
mit nur einem spektralen Kanal, d. h. auf die Ausbildung mehrerer
spektraler Kanäle
im Detektormodul 5 wurde verzichtet. Ein Nebenfarbteiler 25 ist
nicht vorgesehen. Um die Bauweise der 13 später einfach
auf ein mehrkanäliges
Detektormodul 5 aufrüsten
zu können,
ist es zweckmäßig anstelle
des Nebenfarbteilers 25 ein (in 13 nicht
dargestelltes) Kompensationsglas anzuordnen, das später durch
den Nebenfarbteiler ersetzt werden kann.
-
In 14 ist
eine weitere Ausführungsform eines
Laserscanningmikroskops 1 gezeigt, dessen Detektoren 28, 28a nun
als CCD-Zeilen ausgebildet sind, die in der konfokalen Ebene liegen,
die ansonsten die Spaltblenden beinhalten und die somit deren Funktion übernehmen.
Verwendet man ein geeignet auslesbares Detektorarray, kann der Effekt
einer Variation der Schlitzblendengröße durch eine entsprechende
Auswahl des Auslesebereichs auf dem Detektorarray realisiert werden.
-
15 zeigt
eine weitere Bauvariante, bei der im den Beleuchtungsstrahlengang
Polarisatoren 45, 46 und in die Detektorpfade
Analysatoren 47, 47a eingeschaltet sind. Diese
Baugruppen können
beispielsweise motorisch in den Strahlengang verfahrbar gestaltet
sein. Eine polarisationsempfindliche Anregung bzw. Detektion ist
insbesondere für
die Auswertung linearer oder nicht linearer Raman-Signale von Vorteile,
um eine Symmetrie einer untersuchten Molekülschwingung zuzuordnen zu können bzw.
um störende
nicht-Raman-resonante Untergrundsignale unterdrücken zu können.
-
Die
bisher beschriebenen Ausführungsformen
eines Laserscanningmikroskopes sehen spektral diskrete Detektorpfade
im Detektormodul 5 vor. Möchte man einen breitbandigen
spektralen Bereich simultan analysieren, kann die in 16 systematisch
dargestellte Konzeption zum Einsatz kommen. 16 zeigt
ausschnittsweise und vereinfacht das Scanmodul 3 sowie
das Detektormodul 5. Die die Schlitzblende 26 passierende
Strahlung von der Probe wird in das Eintrittsfenster 48 eines
Spektrometers 49 geleitet, das die zeilenförmig eintretende
Strahlung quer zur Zeilenrichtung spektral zerlegt und auf eine
zweidimensional auflösende
Detektoreinrichtung leitet, im Ausführungsbeispiel eine CCD-Kamera 50.
Eine in 17 dargestellte Brennlinie 51 auf der
Probe wird dann in das in 17 ebenfalls
gezeigte Bild 52 aufgespaltet, wobei die mit X bezeichnete Richtung
die Ortsauflösung
wiedergibt, die Richtung senkrecht dazu, in 17 mit λ bezeichnet,
kodiert dagegen die spektrale Zusammensetzung der Strahlung am gegebenen
Ort. Zur Veranschaulichung ist in das Bild 52 eine Reihe von Kurven 53 eingetragen,
die die spektrale Zusammensetzung symbolisieren. Realiter erhält man natürlich nicht
Kurven 53, sondern die in λ-Richtung angeordneten Pixel
der CCD-Kamera 50 werden abhängig von der spektralen Zusammensetzung
der am Ort aufgenommenen Strahlung von der Probe unterschiedlich
intensiv beleuchtet.
-
In
einer vereinfachten Ausführungsform kann
die Schlitzblende 26 durch einen Eintrittsspalt des Spektrometers 49 realisiert
werden, Schlitzblende 26 und als Eintrittsspalt ausgebildetes
Eintrittsfenster 48 fallen dann zusammen.
-
Insbesondere
bei Verwendung von holographischer Raman-Notch Filter ist es auch
in der Raman-Mikroskopie denkbar, dass anstelle von Zweifach- und
dReifach-Spektrometer Einfach-Monochromatoren
Verwendung finden.
-
27 zeigt
eine weitere mögliche
Bauweise für
ein Laserscanningmikroskop
1, bei dem ein Nipkowscheiben-Ansatz
zur Verwirklichung kommt. Das Lichtquellenmodul
2, das
in
27 stark vereinfacht dargestellt ist, beleuchtet über ein
Minilinsenarray
65 durch den Hauptfarbteiler
17 hindurch
eine Nipkow-Scheibe
64, wie sie beispielsweise in US 6.028.306, WO
88 07695 oder
DE 2360197
A1 beschrieben ist. Die über das Minilinsenarray
65 beleuchteten
Pinholes der Nipkow-Scheibe werden in die im Mikroskopmodul
4 befindliche
Probe abgebildet. Um auch hier die probenseitige Bildgröße variieren
zu können,
ist wiederum die Zoom-Optik
41 vorgesehen.
-
In
Abwandlung zur Bauweise z. B. der 2 ist beim
Nipkow-Scanner die Beleuchtung im Durchgang durch den Hauptfarbteiler 17 vorgenommen und
die zu detektierende Strahlung wird ausgespiegelt. Darüber hinaus
ist der Detektor 28 nun ortsauflösend ausgeführt, damit die mit der Nipkow-Scheibe 46 erreichte
Multipunktbeleuchtung auch entsprechend parallel abgetastet wird.
Ferner ist zwischen der Nipkow-Scheibe 64 und der Zoom-Optik 41 eine geeignete
feststehende Optik 63 mit positiver Brechkraft angeordnet,
welche die durch die Pinholes der Nipkow-Scheibe 64 divergent
austretende Strahlung in geeignete Bündeldurchmesser umwandelt.
Der Hauptfarbteiler 17 ist für den Nipkow-Aufbau der 11 ein
klassischer dichroitischer Strahlteiler, d. h. nicht der zuvor erwähnte Strahlteiler
mit schlitzförmig oder
punktförmig
reflektierendem Bereich.
-
Die
Zoom-Optik 41 entspricht z. B. der zuvor erläuterten
Bauweise, wobei natürlich
der Scanner 18 durch die Nipkow-Scheibe 64 überflüssig wird.
Er kann dennoch vorgesehen werden, wenn man die anhand 10 erläuterte Auswahl
eines Bereiches ROI vornehmen möchten.
Gleiches gilt für
das Abbe-König-Prisma.
-
Einen
alternativen Ansatz mit Multipunktabtastung zeigt in schematischer
Darstellung 28, bei der mehrere Lichtquellen
schräg
in die Scannerpupille einstrahlen. Auch hier läßt sich durch Nutzung der Zoom-Optik 41 zur
Abbildung zwischen Hauptfarbteiler 17 und Scanner 18 eine
Zoomfunktion wie in 26 dargestellt realisieren.
Durch gleichzeitiges Einstrahlen von Lichtbündeln unter verschiedenen Winkeln
in einer zur Pupille konjugierten Ebene, werden Lichtpunkte in einer
zur Objektebene konjugierten Ebene erzeugt, die vom Scanner 18 gleichzeitig über einen
Teilbereich des gesamten Objektfeldes geführt werden. Die Bildinformation
entsteht durch Auswertung sämtlicher
Teilbilder auf einem ortsauflösenden
Matrixdetektor 28.
-
Als
weitere Ausführungsform
kommt eine Multipunkt-Abtastung, wie in US 6.028.306 beschrieben,
in Frage, deren Offenbarung vollumfänglich diesbezüglich hier
einbezogen wird. Auch hier ist, wie in 27 und 28 ein
ortsauflösender
Detektor 28 vorzusehen. Die Probe wird dann durch eine
Multipunktlichtquelle beleuchtet, die durch einen Strahlexpander
mit nachgeordneten Mikrolinsenarray realisiert wird, das eine Multiaperturenplatte
so beleuchtet, daß dadurch
eine Multipunktlichtquelle realisiert ist.
-
Die
beschriebene Erfindung stellt eine bedeutende Ausweitung der Anwendungsmöglichkeiten
von schnellen konfokalen Laserscanmikroskopen dar. Die Bedeutung
einer solchen Weiterentwicklung lässt sich anhand der zellbiologischen
Standardliteratur und den dort beschriebenen schnellen zellulären und
subzellulären
Vorgängen1 und den eingesetzten Untersuchungsmethoden
mit einer Vielzahl von Farbstoffen2 ablesen.
-
Siehe
z.B.:
- 1B. Alberts et
al. (2002): Molecular Biology of the Cell; Garland Science.
- 1,2G. Karp (2002): Cell and Molecular
Biology: Concepts and Experiments; Wiley Text Books.
- 1,2R. Yuste et al. (2000): Imaging neurons – a laboratory
Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
- 2R.P. Haugland (2003): Handbook of fluorescent Probes
and research Products, 10th Edition; Molecular Probes Inc. and Molecular
Probes Europe BV.
-
De
Erfindung hat insbesondere große
Bedeutung für
die folgenden Prozesse und Vorgange:
-
Entwicklung von Organismen
-
Die
beschriebene Erfindung ist u.a. für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen
geeignet, die sich vor allem durch dynamische Prozesse im Zehntelsekunden
bis hin zum Stundenbereich auszeichnen. Beispielanwendungen auf
der Ebene von Zellverbänden
und ganzen Organismen sind z.B. hier beschrieben:
- • Abdul-Karim,
M.A. et al. beschreiben 2003 in Microvasc. Res., 66:113-125 eine
Langzeitanalyse von Blutgefässveränderungen
im lebenden Tier, wobei Fluoreszenzbilder in Intervallen über mehrere
Tage aufgenommen wurde. Die 3D-Datensätze wurden mit adaptiven Algorithmen
ausgewertet, um die Bewegungstrajektorien schematisch darzustellen.
- • Soll,
D.R. et al. beschreiben 2003 in Scientific World Journ. 3:827-841
eine softwarebasierte Bewegungsanalyse von mikroskopischen Daten
von Kernen und Pseudopodien lebender Zellen in allen 3 Raumdimensionen.
- • Grossmann,
R. et al. beschreiben 2002 in Glia, 37:229-240 eine 3D-Analyse der
Bewegungen von Mikrogliazellen der Ratte, wobei die Daten über bis zu
10 Stunden aufgenommen wurden. Gleichzeitig kommen nach traumatischer
Schädigung
auch schnelle Reaktionen der Glia vor, so dass eine hohe Datenrate
und entsprechendes Datenvolumen entsteht.
-
Das
betrifft insbesondere folgende Schwerpunkte:
- • Analyse
lebender Zellen in einer 3D Umgebung, deren Nachbarzellen empfindlich
auf Laserbeleuchtung reagieren und die von der Beleuchtung der 3D-ROI
geschützt
werden müssen;
- • Analyse
lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt
durch Laserbeleuchtung in 3D gebleicht werden sollen, z.B. FRET-Experimente;
- • Analyse
lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt
durch Laserbeleuchtung gebleicht und gleichzeitig auch ausserhalb der
ROI beobachtet werden sollen, z.B. FRAP- und FLIP-Experimente in
3D;
- • Gezielte
Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen und
Pharmaka, die manipulationsbedingte Änderungen durch Laserbeleuchtung
aufweisen, z.B. Aktivierung von Transmittern in 3D;
- • Gezielte
Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die
manipulationsbedingte Farbänderungen
durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede;
- • Gezielte
Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit sehr schwachen
Markierungen, die z.B. eine optimale Balance von Konfokalität gegen
Detektionsempfindlichkeit erfordern.
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit variierenden Mehrfachmarkierungen,
z.B. CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed u.ä.
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die funktionsabhängige Farbänderungen
aufweisen, z.B. Ca+-Marker
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die entwicklungsbedingte
Farbänderungen
aufweisen, z.B. transgene Tiere mit GFP
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die manipulationsbedingte
Farbänderungen
durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede
- • Lebende
Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit sehr schwachen Markierungen,
die eine Einschränkung
der Konfokalität
zugunsten der Detektionsempfindlichkeit erfordern.
- • Letztgenannter
Punkt in Kombination mit den Vorangehenden.
-
Transportvorgänge in Zellen
-
Die
beschriebene Erfindung ist für
die Untersuchung von innerzellulären
Transportvorgängen
exzellent geeignet, da hierbei recht kleine motile Strukturen, z.B.
Proteine, mit hoher Geschwindigkeit (meist im Bereich von Hundertstelsekunden)
dargestellt werden müssen.
Um die Dynamik von komplexen Transportvorgängen zu erfassen, kommen oft auch
Anwendungen wie FRAP mit ROI-Bleichen zum Einsatz. Beispiele für solche
Studien sind z.B. hier beschrieben:
- • Umenishi,
F. et al. beschreiben 2000 in Biophys J., 78:1024-1035 eine Analyse
der räumlichen
Beweglichkeit von Aquaporin in GFP-transfizierten Kulturzellen.
Hierzu wurden in den Zellmembranen Punkte gezielt lokal gebleicht
und die Diffusion der Fluoreszenz in der Umgebung analysiert.
- • Gimpl,
G. et al. beschreiben 2002 in Prog. Brain Res., 139:43-55 Experimente
mit ROI-Bleichen
und Fluoreszenzimaging zur Analyse der Mobilität und Verteilung von GFP-markierten
Oxytocin-Rezeptoren in Fibroblasten. Dabei stellen sich hohe Anforderungen
an die räumliche
Positionierung und Auflösung sowie
die direkte zeitliche Folge von Bleichen und Imaging.
- • Zhang
et al. beschreiben 2001 in Neuron, 31:261-275 live cell Imaging
von GFP-transfizierten Nervenzellen,
wobei die Bewegung von Granuli durch kombiniertes Bleichen und Fluoreszenzimaging
analysiert wurde. Die Dynamik der Nervenzellen stellt dabei hohe
Anforderungen an die Geschwindigkeit des Imaging.
-
Wechselwirkungen
von Molekülen
-
Die
beschriebene Erfindung ist insbesondere für die Darstellung molekularer
und anderer subzellulärer
Wechselwirkungen geeignet. Hierbei müssen sehr kleine Strukturen
mit hoher Geschwindigkeit (im Bereich um die Hundertstelsekunde)
dargestellt werden. Um die für
die Wechselwirkung notwendige räumliche
Position der Moleküle
aufzulösen,
sind auch indirekte Techniken wie z.B. FRET mit ROI-Bleichen einzusetzen.
Beispielanwendungen sind z.B. hier beschrieben:
- • Petersen,
M.A. und Dailey, M.E. beschreiben 2004 in Glia, 46:195-206 eine
Zweikanalaufnahme lebender Hippokampuskulturen der Ratte, wobei
die zwei Kanäle
für die
Marker Lectin und Sytox räumlich
in 3D und über
einen längeren
Zeitraum aufgezeichnet werden.
- • Yamamoto,
H. et al. beschreiben 2003 in Clin. Exp. Metastasis, 20:633-638
ein Zweifarbimaging von humanen fibrosarcoma Zellen, wobei grünes und
rotes fluoreszentes Protein (GFP und RFP) simultan in Echtzeit beobachtet
wurde.
- • Bertera,
S. et al. beschreiben 2003 in Biotechniques, 35:718-722 ein Multicolorimaging
von transgenen Mäusen
markiert mit Timer reporter Protein, welches seine Farbe nach Synthese
von grün
in rot ändert.
Die Bildaufnahme erfolgt als schnelle Serie 3-dimensional im Gewebe
am lebenden Tier.
-
Signalübertragung
zwischen Zellen
-
Die
beschriebene Erfindung ist für
die Untersuchung von meist extrem schnellen Signalübertragungsvorgängen hervorragend
sehr gut geeignet. Diese meist neurophysiologischen Vorgänge stellen höchste Anforderungen
an die zeitliche Auflösung, da
die durch Ionen vermittelten Aktivitäten sich im Bereich von Hundertstel-
bis kleiner als Tausendstelsekunden abspielen. Beispielanwendungen
von Untersuchungen im Muskel- oder Nervensystem sind z.B. hier beschrieben:
- • Brum
G et al. beschreiben 2000 in J Physiol. 528: 419-433 die Lokalisation
von schnellen Ca+ Aktivitäten
in Muskelzellen des Frosches nach Reizung mit Caffeine als Transmitter.
Die Lokalisation und Mikrometer-genaue Auflösung gelang nur durch Einsatz eines
schnellen, konfokalen Mikroskopes.
- • Schmidt
H et al. beschreiben 2003 in J Physiol. 551:13-32 eine Analyse von
Ca+ Ionen in Nervenzellfortsätzen
von transgenen Mäusen.
Die Untersuchung von schnellen Ca+-Transienten in Mäusen mit veränderten
Ca+ bindenden Proteinen konnte nur mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie
durchgeführt
werden, da auch die Lokalisation der Ca+ Aktivität innerhalb der Nervenzelle
und deren genaue zeitliche Kinetik eine wichtige Rolle spielt.