DE102005018845A1

DE102005018845A1 - Miniaturisierte und multifunktionale optosensorische Meß- und Regelschleuse für die minimalinvasive Applikation von Mikrosensoren und Mikrowerkzeugen in lebenden und abiotischen Systemen zur quantitativen räumlich und zeitlich hochauflösenden Prozessanalyse, Präparation und experimentellen Manipulation unter Freiland- und Laborbedingungen

Info

Publication number: DE102005018845A1
Application number: DE102005018845A
Authority: DE
Inventors: Dirk Gansert
Original assignee: Gansert Dirk Dr
Current assignee: GANSERT, DIRK, DR., 37083 GOETTINGEN, DE
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2025-04-23
Also published as: DE102005018845B4

Abstract

Technische Problemstellung DOLLAR A Applikation von Mikrosensoren und -werkzeugen in biologischen und abiotischen Systemen für die Prozeßanalyse unter methodisch minimalinvasiven Bedingungen durch: DOLLAR A a) phasenunabhängige Messung im wäßrigen und gasförmigen Zustand, DOLLAR A b) mikrometrische Positionierung, DOLLAR A c) multiple optische Hybrid-Sensorik, DOLLAR A d) Vermeidung mechanischer Belastung, DOLLAR A e) Analyse sehr kleiner Probenvolumina, DOLLAR A f) experimentelle Manipulation und Mikropräparation unter sensorischer Kontrolle, DOLLAR A g) Wahrung der Sterilität. DOLLAR A Technische Problemlösung DOLLAR A Mikrosensoren und -werkzeuge werden in einem drehbaren Sensorgehäuse radiär-symmetrisch angeordnet und in einer miniaturisierten Meßkammer psitioniert (Abb. 1). Die Kammer funktioniert optional als geschlossene Meßzelle, Durchflußmeßzelle und als Schleuse, durch die Sensoren und Werkzeuge mittels Mikrometervorschub in ein Objekt appliziert werden. Durch Regulation der physiko-chemischen und biologischen Bedingungen in der Schleuse und den Einsatz optosensorischer Meßtechnik ist eine minimalinvasive Prozeßanalyse gewährleistet. Die Meß- und Regelschleuse ist autoklavierbar. DOLLAR A Anwendungsgebiete DOLLAR A a) Lebens- und Geowissenschaften einschließlich industrieller Branchen, DOLLAR A b) Land- und Forstwirtschaft, DOLLAR A c) Umweltanalytik und -monitoring.

Description

Eine miniaturisierte und multifunktionale optosensorische Meß- und Regelschleuse zur minimalinvasiven Prozeßanalyse mit hoher räumlicher usnd zeitlicher Auflösung in biologischen und abiotischen Systemen und zur experimentellen Manipulation physiko-chemischer und biologischer Parameter repräsentiert ein innovatives Werkzeug, das gegenüber konventionellen Meßvorrichtungen entscheidende Vorteile zum Zwecke der in situ Bio-Prozeßanalyse bietet.

Der Fortschritt zur Quantifizierung von Lebensprozessen unter natürlichen Umweltbedingungen im Freiland als auch unter kontrollierten Bedingungen im Labor erfordert heute den Einsatz von Techniken und Sensoren, die sich durch Miniaturisierung, Präzision, Langlebigkeit und minimale Störung des zu untersuchenden Systems auszeichnen. Die berührungsfreie und daher auch kontaminationsfreie Messung ist das Ziel der minimalinvasiven Untersuchung, wozu optische Sensoren erstmals in der Lage sind. Miniaturisierung und minimalinvasiver Eingriff in das zu untersuchende System sind zwei wesentliche Voraussetzungen für den Fortschritt des Verständnisses über den koordinierten Ablauf von Lebensprozessen in räumlich und zeitlich hoher Auflösung. Faseroptische Sensoren mit wenigen Mikrometer Durchmesser (Optoden) repräsentieren den aktuellen Stand der Meßtechnik im mikroskaligen Maßstab zur Quantifizierung biologisch relevanter physiko-chemischer Parameter, wie z.B. des Sauerstoffpartialdrucks (PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg). Desweiteren können auch die Temperatur, der CO₂-Partialdruck, der pH-Wert oder der Chlorophyllgehalt grüner Pflanzen optisch quantifiziert werden.

Hybridoptoden repräsentieren die neueste Generation optischer Sensoren, deren Markteinführung in ein bis zwei Jahren zu erwarten ist (HYBOP Forschungsverbundprojekt des BMBF-Schwerpunktprogramms BIOPHOTONIK an der Universität Düsseldorf, koordiniert durch den Antragsteller). Hybridoptoden können mittels analytspezifischer Mikropartikel jeweils zwei physiko-chemische Parameter gleichzeitig und im molekularen Maßstab ortsidentisch messen. Durch den Hybridcharakter wird die Zahl der für eine Prozeßanalyse erforderlichen Sensoren halbiert, wodurch ein entscheidender methodischer Fortschritt erzielt wird. So kann z.B. mit nur einer CO₂-O₂-Hybridoptode der respiratorische Quotient von Zellkulturen, Geweben und Organen aus der simultanen Messung des metabolischen O₂-Verbrauchs und der CO₂-Produktion bestimmt werden.

Im Gegensatz zu konventionellen Sensoren zeichnet sich die neue optische Sensortechnologie neben der Miniaturisierung vor allem durch die Unabhängigkeit der Messung vom Aggregatszustand des Analyten aus. Mit optischen Sensoren sind Messungen in der wäßrigen und gasförmigen Phase gleichermaßen möglich, wohingegen konventionelle Meßverfahren durch den Aggregatszustand des Analyten definiert werden. Dies wird im folgenden für biologisch relevante Meßgrößen erläutert.

In wäßriger Phase werden CO₂ und O₂ elektrochemisch mittels Elektroden gemessen (z.B. Clark-Type O₂-Elektrode oder CO₂-Elektrode der Fa. Microelectrodes Inc., Bedford, USA). Der Nachteil elektrochemischer Messungen liegt im Verbrauch einer gewissen Analytmenge durch den Meßvorgang selbst, so daß eine durch das Meßinstrument unbeeinflußte Prozeßanalyse nicht gewährleistet ist. Ebenso ist die Langzeitstabilität elektrochemischer Sensoren eingeschränkt.

Messungen in der Gasphase werden mit Gasanalysatoren (Absolut- oder Differenzmessungen) oder auch Gaschromatographen durchgeführt, die für die Spurengasanalytik geeignet sind. Konventionell werden für die CO₂-Analyse Infrarotgasanalysatoren (IRGA) eingesetzt, deren Genauigkeit im Bereich von ± 1-2 ppm liegt. Für die Meßgenauigkeit mittels Gasanalysatoren sind jedoch definierte Massenflußraten ausschlaggebend, die mit einer aufwendigen Meß-und Regeltechnik erzeugt werden. Daher sind solche Systeme sehr teuer und wartungsintensiv. Räumlich hochauflösende Messungen in Geweben und Organen können damit ebenfalls nicht durchgeführt werden. Da es sich um offene Meßsysteme handelt, können sie auch nicht unter Sterilbedingungen eingesetzt werden. Die Gasanalyse mit Gaschromatographen ist technisch aufwendig, kosten- und zeitintensiv. Ferner ist ihr Einsatz für Feldmessungen nur mit hohem infrastrukturellen Aufwand (Labormeßwagen, Stromversorgung, Explosionsschutz etc.) zu bewerkstelligen.

Puls-Amplituden-Modulations (PAM) Fluorometer (Fa. Walz, Effeltrich, Deutschland; LI-COR Inc., Lincoln, USA) zur physiologischen Charakterisierung der Photosynthese grüner Pflanzen entspricht dem Stand der Technik im Bereich der Bio-Prozeßanalyse. In den Pflanzenwissenschaften hat sich die Chlorophyllfluoreszenzanalyse als leistungsfähige Methode etabliert. Einschränkend wird jedoch bei dieser Methode die tatsächliche photosynthetische O₂-Produktion und die CO₂-Fixierung nicht gemessen, sondern aus der Fluoreszenzintensität als Maß für die photochemische Ladungstrennrate der Antennenpigmente der Photosysteme berechnet. Eine Hybridoptode für die simultane Messung des Chrlorophyllgehalts und der O₂-Produktion ist eine praktikable quantitative und zugleich deutlich kostengünstigere Alternative zum fluorometrischen Verfahren.

Elektronische Messungen der Temperatur werden meist mit Absoluttemperatursensoren (Pt 100, Pt 1000) oder referenzabhängigen Thermocouples durchgeführt. Mit letzteren wird eine Miniaturisierung bis ca. 0.2 mm Durchmesser erzielt (z.B. World Precision Instruments Inc., Sarasota, USA), wobei jedoch eine zusätzliche Referenzmeßstelle der Absoluttemperatur erforderlich ist. Dagegen können mit temperatursensitiven Mikropartikeln räumlich hochauflösende Messungen der Temperatur durchgeführt werden, die lediglich von den Dimensionen des Trägers der temperatursensitiven Beschichtung abhängt.

Das den Sensoren zugrundeliegende Meßprinzip definiert maßgeblich die technische Ausführung geschlossener Meßzellen oder Durchflußmeßzellen mit multipler Sensorbestückung. Als Beispiel sei die Ausführung einer multiplen Sensorvorrichtung genannt (Offenlegungsschrift Pub. No.: US 2005/0016260 A1, Jan. 27, 2005), die der physiko-chemischen Analyse von Flüssigkeiten dient, jedoch für die Analyse von Gasen ungeeignet ist. Diesem Beispiel entsprechend, gibt es eine Reihe von Veröffentlichungen, die unterschiedliche Lösungen multipler Sensormessung vorstellen. Allerdings sind diese Vorrichtungen i.d.R. als monophasische Systeme ausgelegt, entweder für die gasförmige oder die wäßrige Stoffanalyse. Ferner sind multiple Sensorsysteme zum Zwecke der Analytik nur als geschlossene Meßzellen oder als Durchflußmeßzellen konzipiert. Eine integrative technische Lösung, die über die Funktion einer Meßzelle hinaus eine funktionale Synergie aus

1) multipler Mikrosensorik,
2) minimalinvasiver Präparation und Sensorapplikation zur online Messung unter in situ Bedingungen und
3) experimenteller Manipulation im Freiland und Labor, wie sie in der vorliegenden Meß- und Regelschleuse realisiert ist, liegt nach dem Ergebnis der fachlichen Recherche des Antragstellers bisher nicht vor.

Zusammenfassend ergeben sich aus den genannten spezifischen Mängel konventioneller Sensoren und zugehöriger multipler Meßzellen zwei maßgebliche technische Defizite, die den Anforderungen moderner Bio-Prozeßanalyse nicht genügen:

1) die durch den Aggregatszustand des Analyten festgelegten Meßprinzipien und den daraus resultierenden Unzulänglichkeiten der Messung sowie den stark eingeschränkten Einsatzmöglichkeiten;
2) die unzureichende Miniaturisierung für den minimalinvasiven Einsatz.

Als Beispiel sei die Messung des CO₂-Partialdruckes im Blattgewebe höherer Pflanzen genannt. Obwohl CO₂ das Substrat der Photosynthese aller grünen Pflanzen ist, besteht bisher keine Möglichkeit der unmittelbaren Messung des CO₂-Partialdruckes im Blattinneren. Er wird näherungsweise aus dem atmosphärischen CO₂- Partialdruck und der stomatären Leitfähigkeit berechnet. Optische Sensoren, die mittels einer Schleuse in den Gasraum der Blätter eingeführt werden, bieten hier eine adäquate Problemlösung. In Anbetracht der Eigenschaft von CO₂ als klimarelevantes Treibhausgas ist der Fortschritt zum Verständnis der räumlichen und zeitlichen Heterogenität photosynthetischer CO₂-Fixierung als Bioprozeß in grünen Pflanzen unter natürlichen Bedingungen von großer Bedeutung.

Technische Problemstellung

Mikrosensoren, insbesondere optische Mikrosensoren (Optoden) sind aufgrund ihrer extremen Miniaturisierung sehr empfindliche Meßinstrumente, die keinen mechanischen Belastungen bei der Applikation und während des Meßvorgangs ausgesetzt werden dürfen. Daraus ergeben sich für den Anwender zahlreiche Probleme bei der Durchführung minimalinvasiver Prozeßanalysen hinsichtlich:

a) ihrer sicheren Applikation sowie der mikroskalig exakten und reproduzierbaren Positionierung in dem zu untersuchenden Objekt;
b) dem Schutz vor Beschädigung der Sensoren durch mechanische Beanspruchung während des Meßvorgangs, eine entscheidende Voraussetzung für Langzeituntersuchungen (Wochen – Monate);
c) der Erfordernis zur Applikation mehrerer Sensoren unterschiedlicher Analytspezifität auf kleinstem Raum;
d) der Messung mehrerer Parameter in einem sehr kleinen Probenvolumen (nur wenige Mikroliter);
e) der mikromanipulativen Präparation unter sensorischer Kontrolle und Wahrung der Sterilität.

Will der Anwender über online Messungen hinaus, experimentelle Manipulationen vornehmen, einschließlich Probenentnahme und/oder Stoffapplikation, so muß stets eine spezielle Vorrichtung geschaffen werden, die den jeweiligen meßtechnischen Erfordernissen Rechnung trägt. Dies gilt insbesondere für Untersuchungen im Freiland unter variablen Umweltbedingungen.

Die je spezifischen methodischen Probleme zu lösen ist technisch anspruchsvoll zeit- und kostenintensiv und kann vielerorts mangels Infrastruktur (feinmechanische und elektrotechnische Werkstätten) und fachlicher Qualifikation nicht realisiert werden.

Die multifunktionale Konzeption der optosensorischen Meß- und Regelschleuse (Omni-Lock) bietet eine integrative technische Lösung, die die genannten Anforderungen erfüllt und dadurch dem Anwender ein breites methodisches Spektrum zu minimalinvasiver Prozeßanalyse eröffnet.

Technische Problemlösung

Ein massiver zylindrischer Körper (Sensorgehäuse) mit horizontal umlaufender Nut in der unteren Hälfte und abgeschrägter Oberkante (Schrägfläche, 45° geneigt) wird drehbar und dichtend in eine zylindrische Wanne (Trägerteller) paßgenau eingesetzt. In die untere plane Fläche des Sensorgehäuses ist mittig ein kleiner Hohlraum in Form einer Halbkugel (Meßkammer) eingesenkt. In geringem konzentrischen Abstand zum Umkreis der Meßkammer befindet sich ein Einstich mit Dichtungsring. Ein in die Bodenfläche des Sensorgehäuses vollständig eingesenktes ringförmiges Peltierelement, dessen innere Öffnung an den Dichtungsring angrenzt, erlaubt die elektronische Regulation der Temperatur in der Meßkammer und in dem zu untersuchenden System im Bereich der Auflagefläche der Meß- und Regelschleuse. Das Peltierelement wird über einen PID-Regler (proportional, integral und differential) gesteuert, der drei Betriebsmodi der Temperaturregelung erlaubt: 1) eine mit der Umgebungstemperatur synchrone Nachlaufregulation, 2) eine von der Umgebungstemperatur um einen konstanten Betrag abweichende Nachlaufregulation und 3) eine von der Umgebungstemperatur unabhängige konstante Temperaturvorgabe. Diese Optionen zur thermischen Kontrolle sind vor allem für die Prozeßanalyse im Freiland von großer Bedeutung.

Auf der kreisrunden Wand des Trägertellers sind drei um 120° versetzte sichelförmige Lamellen montiert, die unter einem Führungsring horizontal schwenkbar gelagert sind. Die Drehbarkeit des Sensorgehäuses im Trägerteller wird dadurch erreicht, in dem die Lamellen in die Nut des Sensorgehäuses eingeschwenkt werden. Hierzu muß das Sensorgehäuse mit leichtem Druck auf die Bodenplatte des Trägertellers angepreßt werden, wodurch die Meßkammer zur Bodenplatte hin abgedichtet wird. Der Führungsring dient hierbei als Widerlager.

Bleibt der Boden des Trägertellers geschlossen, so ist die Omni-Lock als geschlossene Meßzelle oder als Durchflußmeßzelle zu betreiben (siehe unten). Steht die Meßkammer über eine verschließbare Öffnung in der Bodenplatte mit einem biologischen oder abiotischen System in Verbindung, dann fungiert die Omni-Lock als Regelschleuse. Über die zentrale Öffnung in der Bodenplatte werden Sensoren und Mikrowerkzeuge durch die Meßkammer hindurch im Untersuchungsobjekt positioniert. Zur Gewährleistung einer dichtenden Verbindung zwischen Schleuse und Untersuchungsobjekt wird zuerst der Trägerteller mit Hilfe einer eigens dafür konstruierten Exzenterspannvorrichtung am Objekt fixiert. Danach wird das Sensorgehäuse in den Trägerteller eingesetzt.

Das Sensorgehäuse ist mit mehreren Bohrungen verschiedener Durchmesser versehen. Eine zentrale Bohrung in der Vertikalachse des Sensorgehäuses trifft die Meßkammer am Scheitelpunkt der Kalotte. Weitere Bohrungen sind radiärsymmetrisch im Winkel von 45° zur Vertikalen angeordnet und führen in gleichen Abständen von der Schrägfläche des Sensorgehäuses auf die Kalotte der Meßkammer. Mit einer Ausnahme haben die Achsen aller Bohrungen den geometrischen Mittelpunkt der Meßkammer als gemeinsamen Schnittpunkt. Die Ausnahme ist eine Bohrung, deren Achse den 'Äquator' der Meßkammer schneidet. Mit einem Ventil versehen, fungiert diese Bohrung als Auslaßöffnung zum rückstandsfreien Befüllen der Meßkammer mit Flüssigkeiten oder Gasen in vertikaler Position. Die Entnahme von Gas- oder Flüssigkeitsproben sowie die Applikation chemischer Substanzen erfolgt ebensfalls über diese Öffnung. Mehrere der radiärsymmetrisch angeordneten Bohrungen fungieren als Kanülen, durch die Sensoren oder/und Mikrowerkzeuge von außen in die Meßkammer und in das Untersuchungsobjekt eingeführt und gasdicht positioniert werden. Mittels eines Mikrometervorschubs können alle Sensoren und Mikrowerkzeuge individuell längs der Bohrachsen exakt und reproduzierbar vor- und zurück bewegt werden. Zwei weitere Bohrungen sind ebenfalls mit Ventilen versehen. Eine dient dem Befüllen der Meßkammer mit Flüssigkeiten und Gasen, während die andere für die Druckregulation in der Meßkammer zur Verfügung steht.

Durch die Wahl des Mittelpunktes der Meßkammer als gemeinsamen Schnittpunkt der Kanülen bietet die Meß- und Regelschleuse drei verschiedene Verwendungsmöglichkeiten zur Prozeßanalyse:

a) als geschlossene Meßzelle zur simultanen Messung physiko-chemischer und biologischer Parameter in einem sich in der Meßkammer befindlichen gasförmigen oder flüssigen Medium. In diesem Modus ist die Öffnung des Trägertellers verschlossen und der Stoffaustausch in der Meßzelle erfolgt über die Ein- und Auslaßventile. Die Sensoren werden auf der Kalotte der Meßkammer positioniert. Da nur der Eigendurchmesser der Sensoren den minimalen Abstand zueinander auf der Kalotte definiert, kann durch den Einsatz von Hybridoptoden die Zahl der in derselben Probe gleichzeitig zu erfassenden Parameter auf engstem Raum verdoppelt werden. Diese Meßanordnung eignet sich besonders zur Analyse sehr kleiner, nur wenige Mikroliter betragende Probenmengen eines gasförmigen oder flüssigen Stoffes oder Stoffgemisches, das in die Meßkammer eingeleitet wird.
b) als Durchflußmeßzelle mit geschlossenem Trägerteller und geöffneten Ein- und Auslaßventilen oder im Bypass-Modus. Hierzu ist die Meßkammer bei geschlossenen Ventilen aber geöffnetem Trägerteller mit dem Untersuchungsobjekt verbunden und der Stofftransport erfolgt als Bypass vom Untersuchungsobjekt durch die Meßkammer und wieder zurück.
c) als Regelschleuse zur ortsidentischen, sukzedanen Messung physiko-chemischer und biologischer Parameter und Mikropräparation in biologischen oder abiotischen Systemen. In dieser Konfiguration ist die Omni-Lock über die Öffnung im Trägerteller mit dem Untersuchungsobjekt verbunden. Mittels Mikrometervorschub werden die auf der Schrägfläche des Sensorgehäuses angeordneten Sensoren und Mikrowerkzeuge nacheinander in das Untersuchungsobjekt eingeführt. Die Drehbarkeit des Sensorgehäuses ist die konstruktive Voraussetzung zur freien Wahl der Meßstelle im Untersuchungsobjekt auf einem Umkreis, dessen Länge sich aus dem Winkel der Kanülen zur Horizontalen und der Tiefe der Meßstelle im Objekt ergibt. Dadurch kann mit zunehmender Tiefe ein dreidimensionales Raster von Meßpunkten erstellt werden, das sich kegelförmig in das Untersuchungsobjekt hinein erstreckt. Über die vertikale Kanüle des Sensorgehäuses kann ein weiterer Sensor senkrecht zur Oberfläche in das Untersuchungsobjekt appliziert werden, wodurch Messungen entlang der Rotationsachse des kegelförmigen Meßsektors möglich sind. Dies ist die einfachste Variante zur Erfassung einer Meßgröße in einem Untersuchungsobjekt, entweder in konstanter Tiefe oder im vertikalen Gradienten. Darüber hinaus dient die vertikale Kanüle der exakten Positionierung von Mikroendoskopen und -werkzeugen für die Mikropräparation im Untersuchungsobjekt.

Im folgenden wird eine spezifische technische Ausführung der optosensorischen Meß- und Regelschleuse bechrieben und in ihrer Funktionsweise am Beispiel der Applikation optischer Mikrosensoren (O₂- und CO₂-Optoden) im Splintholz von Bäumen zur Quantifizierung der Gaspartialdrücke unter Vermeidung von Embolien und dadurch der Aufrechterhaltung des Transpirationsstroms beschrieben.
Die Übersichtszeichnung (1) illustriert in vereinfachter Darstellung die wesentlichen Komponenten der Meß- und Regelschleuse. Im Querschnittsprofil (oberes Schema) ist das drehbare Sensorgehäuse mit Meßkammer und Peltierelement zu sehen, das in den Trägerteller eingesetzt und mit dem 3-teiligen Lamellenverschluß arretiert ist. Über eine kleine Öffnung in der Bodenplatte erfolgt ein gasförmiger oder flüssiger Stoffaustausch zwischen der Meßkammer und einem lebenden oder abiotischen System (Schleusenfunktion). Mikrosensoren werden durch Kanülen im Sensorgehäuse in die Meßkammer gasdicht eingeführt. Mit Hilfe eines umsetzbaren Mikrometervorschubs können alle Mikrosensoren und -werkzeuge durch die Meßkammer hindurch im Untersuchungsobjekt exakt positioniert werden. Die Anordnung der Sensoren im Sensorgehäuse erlaubt die Erstellung eines kegelförmigen Rasters von Meßpunkten, das sich mit zunehmendem Durchmesser in die Tiefe des Untersuchungsobjekts erstreckt. Die Aufsicht (unteres Schema) zeigt das uhrenförmige Gehäuse des Trägertellers mit den sichelförmigen Lamellen sowie eine optionale Belegung der Meßkammer mit Sensoren. Die Ein- und Auslaßventile und die Öffnung zur Druckregulation in der Meßkammer sind ebenfalls abgebildet.
Das Sensorgehäuse (d = 30 mm), hier aus PEEK-Kunstoff gefertigt, ist mit insgesamt neun Bohrungen verschiedener Durchmesser (d = 1 – 2.4 mm ) versehen. Die zentrale Bohrung (d = 2.4 mm) in der Vertikalachse des Sensorgehäuses trifft die Meßkammer (d = 5 mm; V = 35 ) am Scheitelpunkt der Kalotte. Weitere acht Bohrungen sind radiärsymmetrisch im Winkel von 45° zur Vertikalen angeordnet und führen in gleichen Abständen von der Schrägfläche des Sensorgehäuses auf die Kalotte der Meßkammer (2). Sieben dieser Bohrungen haben den geometrischen Mittelpunkt der Meßkammer als gemeinsamen Schnittpunkt. Nur Bohrung Nr.9 trifft den Äquator der Meßkammer (2A). Sie dient dem Auslaß von Flüssigkeiten und Gasen und zugleich der Probenentnahme und Stoffapplikation. Für diese Doppelfunktion wird eine verschließbare Infusionskanüle mit seitlichem Septum verwendet. Fünf der radiärsymmetrisch angeordneten Bohrungen (Nr. 1–5) fungieren als Kanülen, durch die Sensoren (Optoden und Hybridoptoden, Thermocouples und Elektroden) und Mikrowerkzeuge von außen in die Meßkammer und in das Untersuchungsobjekt eingeführt und gasdicht positioniert werden. Bohrung Nr.7 trägt ein Ventil und dient dem Befüllen der Meßkammer mit Flüssigkeiten und Gasen, während Bohrung Nr.8 mit einem einstellbaren Überdruckventil zur Druckregulation in der Meßkammer versehen ist.
Der Trägerteller (d = 40 mm) aus eloxiertem Aluminium hat die Form eines Uhrengehäuses. Bodenplatte (Dicke = 1 mm), Wand (Höhe = 5 mm, Dicke = 5 mm) und seitliche Halterungen für den Steg zur Befestigung des Spannngurtes und einer Nut zur Aufnahme eines Einhängebügels des Spanngurtes sind aus einem Stück gefertigt (3). Für die Benutzung der Omni-Lock als Meßzelle bleibt die Bodenplatte des Trägertellers geschlossen; für die Benutzung als Schleuse können je nach Verwendungszweck Bohrungen bis zu 5 mm Durchmesser gesetzt werden. Die drei schwenkbaren Lamellen sind horizontal auf der Wand des Trägertellers drehbar montiert. Sie sind so dimensioniert, daß sie nahezu den gesamten Umfang der Nut des Sensorgehäuses umgreifen. Dies ist die Voraussetzung zur Drehbarkeit des Sensorgehäuses unter Gewährleistung der Abdichtung der Meßkammer zur Bodenplatte. Ein Führungsring über den Lamellen dient als Widerlager zur Kraftaufnahme des Anpreßdruckes des Sensorgehäuses im Trägerteller.
Die Montage des Trägertellers am Objekt – hier ein Baumstamm – erfolgt mittels eines Exzenterspanners als besondere Ausführungsart (4). In eine 6 mm dicke Aluminiumplatte (Spannplatte: Höhe = 25 mm, Breite = 41 mm) sind zwei rechteckige Öffnungen im gleichen Abstand von der vertikalen Achse gefräst, in die je eine exzentrisch gelagerte Rändelwalze eingesetzt ist. Die Rändelwalze ist auf einer Achse befestigt, die in der Spannplatte drehbar gelagert ist. Eine Spiralfeder dreht die Achse und bewirkt dadurch einen Andruck der Rändelwalze auf die innere Öffnungsfläche. Zur Durchführung eines Spanngurtes zwischen der Innenfläche einer Öffnung und der Rändelwalze wird diese mit einem Rändelgriff gegen den Federandruck nach außen geschwenkt. Durch den permanenten Andruck der exzentrischen Rändelwalze auf den Spanngurt kann dieser nur in einer Richtung gezogen werden, der Gegenzug bleibt jedoch stets blockiert. Die Spannplatte wird mittels zweier Stehbolzen geführt, die fest auf einem Widerlager montiert sind. Eine zentrale Rändelschraube bewegt die Spannplatte auf den Stehbolzen über eine Strecke von 8 mm vor- und zurück. Diese Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Montage des Trägertellers am Untersuchungsobjekt, indem zwei Polyesterbänder zu beiden Seiten das Objekt umschließen und mittels der Exzenterwalzen vorgespannt werden. Durch die Verschiebung der Spannplatte auf den Stehbolzen wird auf kurzem Wege eine gleichmäßige Zugkraft auf beide Bänder ausgeübt, wodurch der Trägerteller verschiebungsfrei auf dem Untersuchungsobjekt arretiert wird. Darüber hinaus hat diese Ausführung der Spannvorrichtung den Vorteil, daß sie zur Montage der Omni-Lock auf sehr unterschiedlich geformten Objekten mit beliebigem Umfang geeignet ist, sogar auch dann, wenn der Durchmesser deutlich kleiner ist als der des Trägertellers.
Da Mikrosensoren und besonders Optoden keinen mechanischen Kräften ausgesetzt werden dürfen, ist es nicht möglich solche Sensoren ungeschützt in tierischen oder pflanzlichen Geweben und Organen zu applizieren, was den Anwender vielfach daran hindert sie überhaupt einzusetzen. Eine Lösung dieses Problems bietet die Omni-Lock dergestalt, daß mit diesem Gerät feine Kanülen in Gewebe und Organe eingeführt werden können, in denen dann die Sensoren bis an die Kanülenspitze geschoben werden. Über die Kanülen steht die Meßkammer der Omni-Lock mit dem Untersuchungsobjekt in Verbindung.
In Pflanzen wird die Applikation optischer Mikrosensoren durch feste Abschluß-, Verfestigungs- und Stützgewebe, vor allem aber durch die Verholzung erschwert. Darüber hinaus ist für den minimalinvasiven Zugang in die saftführenden pflanzlichen Gewebe die Vermeidung von Embolien durch das Eindringen von Luft während der Sensorapplikation eine entscheidende methodische Voraussetzung, um die Gewebefunktion während der in situ Messung aufrechtzuerhalten. Gefäße, in denen beim Applizieren von Sensoren ohne Luftabschluß der unter Unterdruck stehende Wasserfaden durch Embolie reißt, stehen für weitere Untersuchungen nicht mehr zur Verfügung. Die Omni-Lock löst dieses methodische Problem durch die Möglichkeit zur Applikation von Kanülen und Sensoren unter Luftabschluß in der flüssigen Phase. Zu diesem Zweck wird während des Einführens einer Kanüle in das zu untersuchende Gewebe die Meßkammer mit einer entgasten Flüssigkeit, z.B. eine sterile, wäßrige isotonische Lösung, durchströmt. Hierzu wird ein kontinuierlicher Flüssigkeitskreislauf zwischen dem Ein- und Auslaßventil der Meßkammer hergestellt. Durch Anlegen eines regelbaren Überdrucks in der Meßkammer wird das Eindringen von Luft in das Gewebe während der Sensorapplikation und der Messung verhindert. Diese Methode des Zugangs in verholzte pflanzliche Gewebe unter Luftabschluß zum Zwecke der Embolievermeidung wurde vom Antragsteller bereits erfolgreich erprobt [Gansert D, Burgdorf M, Lösch R (2001) A novel approach to the in situ measurement of oxygen concentrations in the sapwood of woody plants. Plant, Cell and Environment 24: 1055–1064]. Sie wurde zum Zwecke der Multifunktionalität in der technischen Realisierung der Omni-Lock berücksichtigt.
Für den mikropräparativen Eingriff, z.B. zur Entnahme von Gewebeproben oder der Applikation von Sonden, werden Mikroendoskope und -werkzeuge eingesetzt. Diese werden, wie auch die Sensoren, mit Hilfe eines Mikrometervorschubs im Objekt positioniert. Im vorliegenden Funktionsmuster wird dazu eine Einbaumeßschraube (Verstellbereich: 0–25 mm, Genauigkeit: 0.002 mm) mit stehender Spindel verwendet (5). Auf die Spindel ist eine Klemmplatte zur Fixierung von Senso ren und Mikrowerkzeugen aufgesetzt. Die Klemmplatte wird auf zwei Stangen (d = 3 mm, 1 = 41 mm) geführt, die mit der Aufnehmerplatte für die Meßschraube und einer Grundplatte fest verbunden sind. Die Grundplatte dient zugleich der Arretierung des Vorschubs auf einer Sensorbuchse mit Dichtungsring im Sensorgehäuse, durch die hindurch ein Sensor in die Meßkammer und in das Untersuchungsobjekt eingeführt wird. Sensorbuchse, Grundplatte und Klemmplatte sind übereinander auf einer Achse zentriert. Nach erfolgter Positionierung wird der Sensor von der Klemmplatte gelöst und die Sensorbuchse durch Drehen des Vorschubs festgezogen. Dadurch wird der Sensor im Gehäuse gasdicht arretiert. Danach wird die Arretierung der Grundplatte an der Sensorbuchse gelöst und der Mikrometervorschub entfernt. Nacheinander werden so alle Sensoren positioniert und abgedichtet. Diese technische Ausführung des Mikrometervorschubs hat drei wesentliche Vorteile: 1) Gewichtseinsparung bei der Meß- und Regelschleuse, 2) die Sensorkabel werden beim Positionieren nicht verdrillt, da sie ohne Eigenrotation bewegt werden, 3) Kosteneinsparung durch Herstellung nur eines normierten Mikrometervorschubs, der für alle Anschlußbuchsen am Sensorgehäuse passend gefertigt ist.

1

1–9: Bohrungen mit verschiedenen Durchmessern für:
1: Temperatursensor
2: pH-O₂-Hybridoptode
3: pH-Mikroelektrode
4: T-O₂-Hybridoptode
5: O₂-Optode
6: CO₂-O₂-Hybridoptode und Mikrowerkzeuge
7: Flüssigkeits- und Gaseinlass
8: Druckregulation
9: Flüssigkeits- und Gasauslass, Probenentnahme und Stoffapplikation
10: Schwenkbare Lamelle des 3-teiligen Lamellenverschlusses im Trägerteller
11: Ringförmiges Peltierelement
12: Drehbares Sensorgehäuse
13: Mikrosensoren und -werkzeuge
14: Umsteckbarer Mikrometervorschub für Mikrosensoren und- werkzeuge
15: Mikrosensoren und -werkzeuge
16: Messkammer
17: Mikrosensoren und -werkzeuge
18: O-Ring zur Dichtung der Messkammer
19: Trägerteller mit dreiteiligem Lamellenverschluss
20: Lebendes oder abiotisches System

2

A: Sensorgehäuse: Schnitt mit Bohrungen 3, 6, 9
16: Messkamer
B: Schnitt mit Bohrungen 2, 4, 6
C: Aufsicht mit Positionen der Bohrungen 1–9

3

A: Trägerteller: Aufsicht
10: Schwenkbare Lamelle
22: Steg für Spanngurt
B: Seitenansicht
21: Verschließbare Öffnung in der Bodenplatte des Trägertellers
23: Nut für Einhängebügel
C: Einhängebügel für Spanngurt

4

A: Exzenterspanner: Frontansicht
24: Exzentrisch gelagerte Rändelwalze
25: Rändelgriff
B: Aufsicht
26: Rändelschraube
27: Spannplatte
28: Widerlager mit kerbförmiger Auflagefläche

5

A: Mikrometervorschub: Seitenansicht
29: Einbaumessschraube mit stehender (nicht drehender) Spindel
30: Führungsstange für die Klemmplatte
B: Aufnehmerplatte der Einbaumessschraube
C: Klemmplatte zur Arretierung von Mikrosensoren und -werkzeugen
31: Arretierschraube
D: Grundplatte zur Fixierung des Mikrometervorschubs auf sechseckigem
: Sensorbuchsenkopf

Claims

Der Patentanspruch wird erhoben für eine miniaturisierte und multifunktionale optosensorische Meß- und Regelschleuse für die minimalinvasive Applikation von Mikrosensoren und Mikrowerkzeugen in lebenden und abiotischen Systemen zur quantitativen, räumlich und zeitlich hochauflösenden Prozeßanalyse, Präparation und experimentellen Manipulation unter Freiland- und Laborbedingungen. In der Funktion als Schleuse wird die technische Voraussetzung zur kontinuierlichen physiko-chemischen und biologischen Analyse gasförmiger oder flüssiger Stoffe im strömenden oder ruhenden Zustand unter Aufrechterhaltung der Kommunikation mit dem jeweiligen biologischen oder abiotischen System erfüllt. Über die gleichzeitige und ortsidentische Messung mehrerer biologisch relevanter Parameter (z.B. T, pH, O₂, CO₂, Chlorophyll) hinaus, erlaubt der Einsatz optischer Mikrosensoren erstmals eine vom Aggregatszustand unabhängige Prozeßanalyse. Durch experimentelle Manipulation und minimalinvasivem Eingriff am Untersuchungsobjekt unter sensorischer Kontrolle, ohne Unterbrechung des Meßvorgangs und unter Sterilbedingungen, bietet die Meß- und Regelschleuse eine integrative technische Lösung für die Kausalanalyse biologischer und physiko-chemischer Prozesse, wie sie bisher nicht zur Verfügung stand.
Nach Anspruch 1 werden mehrere Mikrosensoren unterschiedlicher Analytspezifität, insbesondere optische Sensoren (Optoden und Hybridoptoden), in einem um eine Achse drehbaren, gasdichten Sensorgehäuse in radiärsymmetrischer Anordnung aufgenommen und mittels Mikrometervorschub individuell in einer miniaturisierten Meßkammer positioniert. Die Kammer funktioniert wahlweise als a) geschlossene Meßzelle, b) als Durchflußmeßzelle und c) als regelbare Schleuse, durch die hindurch Sensoren und Mikrowerkzeuge, z.B. Mikroscheren und Mikroendoskope, in ein biologisches oder abiotisches System in variabler Tiefe positioniert werden können. Durch Anpassung der physiko-chemischen (gasförmige oder flüssige Phase, Temperatur, Druck, pH-Wert etc.) und biologischen Bedingungen (Isotonie, Nährstoffe, Sterilität etc.) in der Schleuse an das jeweils zu untersuchende System sowie dem Einsatz optosensorischer Mikromeßtechnik ist eine minimalinvasive in situ Prozeßanalyse gewährleistet. Zudem ist die Meß- und Regelschleuse autoklavierbar, so daß sie mikrobiologischen Sterilitätsansprüchen genügt.
Die technische Ausführung der Meß- und Regelschleuse nach Anspruch 1 erfüllt die Voraussetzungen für ein breites Einsatzspektrum zur Prozeßanalyse im Freiland und im Labor mittels: 1) multifunktionaler Verwendung durch: a) Miniaturisierung (Kammervolumen: 35 μl), b) Funktion als geschlossene Meßzelle, Durchflußmeßzelle und regelbare Schleuse im Kontakt mit dem Untersuchungsobjekt, c) einfacher und schneller Montage am Untersuchungsobjekt (plug & play) durch zweiteiligen Systemaufbau bestehend aus drehbarem Sensorgehäuse und Trägerteller mit Lamellenverschluß, d) Einsatz im Freiland und Labor, unter atmosphärischen und aquatischen Bedingungen; 2) simultaner Messung mehrerer physiko-chemischer und biologischer Parameter in derselben Probe: a) biotischen oder abiotischen Charakters, b) in direkter Kommunikation mit dem Untersuchungsobjekt (Bypass-Modus), b) im gasförmigen oder flüssigen Zustand, c) in strömender oder ruhender Phase; 3) minimalinvasiver Sensorapplikation und Mikropräparation unter sensorischer Kontrolle und Sterilbedingungen; 4) individueller Positionierung von Sensoren und Werkzeugen durch Mikrometervorschub ohne Kabelverdrillung; 5) Gewährleistung langfristiger Meßreihen durch sicheres Sensor-housing und maximalem Schutz der Sensoren vor mechanischer Belastung; 6) experimenteller Manipulation am Untersuchungsobjekt durch Veränderung physiko-chemischer und biologischer Parameter unter online Messung; 7) druckkompensierter Probenentnahme und Stoffzugabe.