DE102005058185A1

DE102005058185A1 - Object e.g. fundus of eye, region`s fluorescence and/or reflection spectra detecting method, involves forming difference signal from accumulated signals for spectral evaluation and presentation of fluorescence and/or reflection spectra

Info

Publication number: DE102005058185A1
Application number: DE200510058185
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dr.-Ing. habil. Schweitzer; Frank Dr. Schweitzer; Martin Dr. Hammer
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2005-12-01
Filing date: 2005-12-01
Publication date: 2007-06-14

Abstract

The method involves selecting a region (2) from an object (1), and confocally reproducing spots in field screens (7, 13) within the selected region from the object. Radiation striking in the field screens is spectrally divided and detected. Local fluorescence and/or reflection signal and external light are accumulated for forming respective signals. A difference signal is formed from the accumulated signals for spectral evaluation and presentation of absolute fluorescence and/or reflection spectra free from an influence of the external light. An independent claim is also included for an arrangement for detecting fluorescence and/or reflection spectra of a selected region of an object e.g. fundus of eye, influenced by an external light.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Detektion von Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren in beliebig wählbaren Bereichen und Strukturen eines Objekts, dessen auszuwertendes Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht von störendem Fremdlicht beeinflusst wird, verursacht insbesondere durch Fluoreszenz bzw. Reflexion von dem Objekt vor- und/oder nachgelagerter sowie Licht streuender Medien bzw. Schichten. Die durch Beleuchtung bzw. Strahlungsanregung entstehenden Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren sollen dabei unter möglichst geringer Strahlenbelastung des Objekts registriert werden.The The invention relates to a method and an arrangement for detection from fluorescence or Reflection spectra in arbitrary selectable Areas and structures of an object whose fluorescence or reflection light from interfering extraneous light is influenced, caused in particular by fluorescence or Reflection of the object forward and / or downstream as well as light scattering media or layers. The by lighting or radiation excitation resulting fluorescence or reflection spectra are under as low as possible Radiation exposure of the object to be registered.

Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet der Erfindung ist die patientenschonende Erfassung der Fluoreszenzspektren von Bereichen des Augenhintergrundes, deren Position, Größe und Form beliebig wählbar sind. Dabei soll der Augenhintergrund, welchem die ebenfalls fluoreszierende und somit dessen Fluoreszenzspektren beeinflussende Augenlinse vorgelagert ist, lediglich mit geringer Exposition belastet werden.One preferred field of application of the invention is the patient-friendly Acquisition of the fluorescence spectra of areas of the fundus, their position, size and shape arbitrary are. Here, the ocular fundus, which is also the fluorescent and thus upstream of its fluorescence spectra influencing eye lens is to be charged only with low exposure.

Weitere Anwendungsgebiete sind z. B. die Bestimmung von Reflexionsspektren des Augenhintergrundes, dem die lichtstreuende Linse bei beginnender Katarakt vorgelagert ist, oder die Messung der Fluoreszenz lichtempfindlicher Substanzen, bei deren Untersuchung die Ausbleichung oder sonstige chemische Veränderungen durch das Anregungslicht vermieden werden können. Speziell bei der Charakterisierung mikroskopischer Proben ist das zu bestimmende Objekt nicht selten in ein oder mehrere ebenfalls fluoreszierende Medien eingebettet, so dass das Fluoreszenzspektrum von störendem Fremdlicht ganz oder teilweise überlagert ist.Further Application areas are z. B. the determination of reflection spectra of the ocular fundus, which the light-scattering lens at the beginning Cataract is upstream, or the measurement of fluorescence more sensitive Substances which, when examined, cause bleaching or other chemical effects changes can be avoided by the excitation light. Especially in the characterization microscopic specimens is not rare the object to be determined embedded in one or more equally fluorescent media, so that the fluorescence spectrum of interfering extraneous light is completely or partly superimposed is.

Die Überlagerung der auszuwertenden Spektren durch störendes Fremdlicht kann in der Praxis zu erheblichen Verfälschungen der Messauswertung führen.The overlay the spectra to be evaluated by interfering extraneous light can be used in practice to significant distortions lead the measurement evaluation.

In bekannten Anordnungen zur Detektion von Fluoreszenz- oder Reflexionsspektren, beispielsweise in Fluoreszenz- oder Reflexionsspektrometern, wird die gesamte Probe oder ein fest zugeordneter Bereich des Objekts beleuchtet und das angeregte Fluoreszenzlicht oder das Reflexionslicht auf einen Monochromator oder einen Spektrographen abgebildet, an dessen Ausgang das Fluoreszenz- oder Reflexionsspektrum detektiert wird.In known arrangements for the detection of fluorescence or reflection spectra, in fluorescence or reflection spectrometers, for example the entire sample or a dedicated area of the object illuminated and the excited fluorescent light or the reflection light mapped to a monochromator or spectrograph whose output detects the fluorescence or reflectance spectrum becomes.

So ist bekannt, in ophthalmologischen Anordnungen (beispielsweise DE 44 10 690 C1 und DE 199 07 479 A1 ), ein spaltförmiges Feld des Augenhintergrundes mit weißem Licht oder mit dem Anregungslicht zu beleuchten und dieses Feld auf den Eintrittsspalt eines Imaging Spektrographen abzubilden, wobei für jeden beleuchteten Ort am Augenhintergrund ein spezifisches Reflexions- oder Fluoreszenzspektrum detektiert wird.Thus, it is known in ophthalmological arrangements (for example DE 44 10 690 C1 and DE 199 07 479 A1 ), to illuminate a slit-shaped field of the fundus with white light or with the excitation light and to image this field on the entrance slit of an imaging spectrograph, wherein for each illuminated location on the fundus a specific reflection or fluorescence spectrum is detected.

Es ist auch eine Anordnung bekannt (Delori: „Fluorophotometer for noninvasive measurement of RPE lipofuscin" in Noninvasive Assessment of the Visual System, Vol. 1 OSA Technical Digest Series, Optical Society of America, 1992, 164–168), bei der ein fixierter ausgedehnter Bereich am Augenhintergrund zur Fluoreszenz angeregt wird und dieser ausgedehnte Bereich (Durchmesser 325 μm bis 1300 μm) auf eine ebenfalls ausgedehnte Konfokalblende abgebildet wird. Weiterhin wird die Aperturblende der Funduskamera auf den Eintrittsspalt eines Spektrographen abgebildet, an dessen Ausgang das Fluoreszenzspektrum dieses fixierten Bereichs, einschließlich des überlagerten Störlichtes, z. B. der Linsenfluoreszenz, detektierbar ist. In einem zweiten Schritt wird ein anderer fixierter und gleich großer Bereich des Augenhintergrundes beleuchtet, der aber nicht in die ausgedehnte Konfokalblende abgebildet wird. Das in diesem Falle von der Aperturblende der Funduskamera auf den Eintrittsspalt eines Spektrographen abgebildete Licht ist das störende Fremdlicht. Durch Differenzbildung des im ersten Fall erhaltenen Summen-Fluoreszenzspektrums und des im zweiten Fall erhaltenen überlagerten störenden Fremdlichts wird das Fluoreszenzspektrum des fixierten ausgedehnten Bereiches am Augenhintergrund erhalten.It An arrangement is also known (Delori: "Fluorophotometer for noninvasive measurement of RPE lipofuscin "in Noninvasive Assessment of the Visual System, Vol. 1 OSA Technical Digest Series, Optical Society of America, 1992, 164-168) the one fixed extended area at the ocular fundus to fluoresce is excited and this extended range (diameter 325 microns to 1300 microns) on a also expanded confocal aperture is displayed. Farther the aperture diaphragm of the fundus camera is placed on the entrance slit of a Spectrograph shown at the output of the fluorescence spectrum this fixed area, including the superimposed stray light, z. B. the lens fluorescence is detectable. In a second step becomes another fixed and equal area of the fundus illuminated, but is not displayed in the extended confocal. In this case, the aperture of the fundus camera on the Entrance slit of a spectrograph imaged light is the disturbing extraneous light. By subtraction of the sum fluorescence spectrum obtained in the first case and the superimposed interfering extraneous light obtained in the second case becomes the fluorescence spectrum of the fixed extended region obtained at the fundus.

Diese Lösung besitzt den entscheidenden Nachteil, dass durch die Abbildung der Aperturblende auf den Eintrittsspalt des Spektrographen prinzipiell immer zwei zeitlich getrennte Messungen notwendig sind, um das Fluoreszenzspektrum des Augenhintergrundes zu erhalten. Dabei ist (insbesondere für bewegte Objekte, wie der Augenhintergrund) nicht gesichert, dass in den separaten Messungen mit hoher Genauigkeit auch jeweils derselbe Bereich zur Auswertung erfasst wird. Speziell bei der Bewegung des Auges wird die Fluoreszenzmessung dann in der Praxis von unterschiedlichen Bereichen des Augenhintergrundes erfasst. Außerdem können mit dieser Lösung wegen des mindest erforderlichen Signal/Rausch Verhältnisses nur ausgedehnte Bereiche am Fundus untersucht werden, die mit einer hohen Exposition zur Fluoreszenz angeregt werden müssen. Ein großes Problem ist nach wie vor, die Fluoreszenz von beliebigen Bereichen des Augenhintergrundes mit hoher Ortsauflösung zu erfassen; insbesondere ist keine Messung der Fluoreszenz eines ausgewählten Bereiches mit beliebiger Kontur möglich.These solution possesses the decisive disadvantage that by the illustration of the Aperture aperture on the entrance slit of the spectrograph in principle always two time-separated measurements are necessary to determine the fluorescence spectrum of the fundus. It is (especially for moving Objects, such as the fundus) not secured in the separate measurements with high accuracy also the same Area is recorded for evaluation. Especially with the movement of the Eye fluorescence measurement is then in practice of different Areas of the fundus. Also, with this solution, because the minimum required signal to noise ratio only extended areas be examined at the fundus, which with a high exposure to Fluorescence must be excited. A big Problem is still the fluorescence of any areas of the fundus with high spatial resolution; especially is not a measurement of the fluorescence of a selected area with any Contour possible.

Die erforderliche hohe Bestrahlungsstärke bewirkt ein Ausbleichen der Fluoreszenz und stellt eine unangenehme Patientenbelastung dar.The Required high irradiance causes fading the fluorescence and represents an unpleasant patient burden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, die durch Strahlungsanregung bzw. Beleuchtung entstehenden Fluoreszenz- bzw. Reflexionsspektren in beliebig wählbaren Bereichen und Strukturen eines von Fremdlicht, insbesondere Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht vor- und/oder hinter dem Objekt befindlicher Medien bzw. Schichten, überlagerten Objekts bei geringer Strahlenbelastung, aber dennoch mit möglichst hohem Signal-Rausch-Verhältnis sowie zuverlässig und unverfälscht durch das störende Fremdlicht detektieren zu können.Of the Invention is based on the object, by radiation excitation or illumination resulting fluorescence or reflection spectra in arbitrary Areas and structures of extraneous light, in particular fluorescence or reflection light before and / or behind the object befindlicher Media or layers, superimposed Object at low radiation exposure, but still with as possible high signal-to-noise ratio as well as reliable and unadulterated through the disturbing extraneous light to be able to detect.

Dies soll insbesondere auch für bewegte Objekte ermöglicht werden, beispielsweise für den Augenhintergrund, der nur mit geringer Exposition belastet werden darf und dem die ebenfalls fluoreszierende Augenlinse bzw. die lichtstreuende Linse bei beginnender Katarakt vorgelagert ist.This especially for allows moving objects be, for example the fundus, which are burdened only with low exposure may and the also fluorescent eye lens or the light-scattering Lens is preceded by the onset of cataract.

In lichtempfindlichen Proben soll die Ausbleichung der Fluoreszenz durch die Anregungsstrahlung minimiert werden.In Photosensitive samples should be the fading of fluorescence be minimized by the excitation radiation.

Erfindungsgemäß wird in dem zu untersuchenden Objekt ein Bereich ausgewählt, innerhalb dessen Kontur jeder Ort durch die Strahlung eines scannenden Spots einer Strahlungsquelle beleuchtet und gegebenenfalls zur Fluoreszenz angeregt wird. Alle dabei zur Fluoreszenz angeregten bzw. zur Reflexion beleuchteten Orte innerhalb dieses ausgewählten Bereiches vom Objekt werden jeweils konfokal in dieselbe Feldblende abgebildet, wobei die jeweils in diese konfokale Feldblende auftreffende Strahlung, einschließlich des überlagerten Fremdlichts (Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht von dem Objekt vor- und/oder nachgelagerter Medien bzw. Schichten), spektral zerlegt sowie detektiert wird. Aus der Summe aller dieser lokal ortsabhängigen Fluoreszenz- oder Reflexionssignale wird ein für den ausgewählten Bereich des Objektes spezifisches erstes akkumuliertes Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal gebildet. Zeitgleich oder danach wird das der besagten konfokalen Abbildung überlagerte Fremdlicht, welches außerhalb der Konfokalebene entsteht, vorzugsweise nicht konfokal auf den Eintrittsspalt vorzugsweise desselben Imaging Spektrographen abgebildet und spektral zerlegt. Aus der Summe aller dieser wiederum lokal ortsabhängigen Fluoreszenz- oder Reflexionssignale wird ein für den ausgewählten Bereich des Objektes spezifisches zweites akkumuliertes Fluoreszenz- bzw. Reflexionssignal gebildet.According to the invention is in the object to be examined has an area selected within its contour each location by the radiation of a scanning spot of a radiation source illuminated and optionally excited to fluorescence. All thereby excited to fluorescence or illuminated for reflection Places within this selected Area of the object are each confocal in the same field stop shown, wherein the respective incident in this confocal field stop radiation, including of the superimposed Extraneous light (fluorescence or reflection light from the object and / or downstream media or layers), spectrally decomposed as well as being detected. From the sum of all these locally spatially dependent fluorescence or reflection signals will be on for the selected area of the object specific first accumulated fluorescence or Reflection signal formed. At the same time or after that of the said confocal image overlaid Extraneous light, which outside the confocal plane arises, preferably not confocally on the Entry slit preferably imaged the same imaging spectrograph and spectrally decomposed. From the sum of all these in turn local location-dependent Fluorescence or reflection signals will be on for the selected area the object specific second accumulated fluorescence or reflection signal educated.

Das erste akkumulierte Signal entspricht dabei der Summe der für den ausgewählten Bereich repräsentativen Fluoreszenz- bzw. Reflexionsstrahlung mit dem überlagerten Fremdlicht, das zweite akkumulierte Signal entspricht dem im ersten Summensignal enthaltenen und für die Auswertung störenden Fremdlicht, welches durch Differenzsignalbildung eliminiert wird, so dass ein für den ausgewählten Bereich spezifisches Signal ohne störendes Fremdlicht mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis sowie unter geringer Strahlungsbelastung zur Fluoreszenzanregung bzw. Beleuchtung des beliebig auswählbaren Bereiches vom Objekt zur spektrometrischen Auswertung und Präsentation gelangt.The The first accumulated signal corresponds to the sum of the selected range representative Fluorescence or reflection radiation with the superimposed extraneous light, the second accumulated signal corresponds to that in the first sum signal contained and for the evaluation interfering extraneous light, which is eliminated by difference signal formation, so that a for the chosen Area specific signal without disturbing ambient light with high Signal-to-noise ratio and under low radiation exposure for fluorescence excitation or illumination of the arbitrarily selectable area of the object for spectrometric evaluation and presentation.

Die Messungen können auch nacheinander ausgeführt werden. So bewirkt beispielsweise das Einfügen einer Planplatte vor der feststehenden Konfokalblende, dass nunmehr nicht das Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht der durch den scannenden Spot strahlungsangeregten bzw. beleuchteten Orte, sondern jeweils das dafür störende Fremdlicht unter nicht konfokaler Abbildung nach der Konfokalblende in ein und demselben Spektrographen wellenlängenabhängig zerlegt sowie detektiert und summiert wird.The Measurements can also executed in succession become. For example, inserting a plane plate before fixed Konfokalblende that now not the fluorescence or Reflection light of the radiation excited by the scanning spot or illuminated places, but in each case the disturbing extraneous light under not Confocal image after the confocal in one and the same Spectrograph decomposed depending on wavelength as well as detected and summed.

Die Erfindung soll nachstehend anhand von teils in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The Invention will be described below with reference to part in the drawing embodiments be explained in more detail.

Es zeigen:It demonstrate:

1: Blockschema der erfindungsgemäßen Anordnung bei gleichzeitiger Detektion von konfokal abgebildetem Licht und von Fremdlicht 1 Block diagram of the arrangement according to the invention with simultaneous detection of confocal imaged light and extraneous light

2: Beleuchtung des Eintrittsspaltes eines abbildenden Imaging Spektrographen durch konfokal und nicht konfokal abgebildetes Licht für gleichzeitige Detektion von konfokal abgebildetem Licht und von Fremdlicht 2 Illuminating the entrance slit of an imaging imaging spectrograph by confocal and non-confocal imaged light for simultaneous detection of confocal imaged light and extraneous light

Von einem zu untersuchenden Objekt 1, dem eine fluoreszierende Schicht 19 vorgelagert ist, soll die strahlungsarm angeregte Fluoreszenz, speziell deren Spektrum, in einem ausgewählten Bereich 2 bestimmt werden, die nur in diesem entsteht. Der Einfluss der in 1 durch Pfeile 20 symbolisierten störenden Fluoreszenz der vorgelagerten Schicht 19 ist zu beseitigen. Für den selektierten Bereich 2 kann dabei eine beliebige Kontur gewählt werden.From an object to be examined 1 which has a fluorescent layer 19 is vorgelagert, the low-radiation excited fluorescence, especially their spectrum, in a selected area 2 be determined, which arises only in this. The influence of in 1 through arrows 20 symbolized disturbing fluorescence of the upstream layer 19 should be eliminated. For the selected area 2 can be chosen any contour.

Zur Fluoreszenzanregung wird die Strahlung eines Anregungslasers 3 mittels eines konfokalen Laser Scanner Systems 4 so auf das zu untersuchende Objekt 1 abgebildet, dass ein scannender Spot 5 auf dem Objekt 1 nur den ausgewählten Bereich 2 zur Fluoreszenz anregt. Bei dieser Beleuchtung wird aber ebenfalls die vorgelagerte Schicht 19 zur Fluoreszenz angeregt, deren Licht als konfokal abgebildetes Fluoreszenzlicht 20 jedes durch den scannenden Spot angeregten Ortes innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 durch das Laser Scanner System 4 über einen dichroitischen Teiler 6 konfokal in eine Feldblende 7 abgebildet wird, die sich in der Ebene eines Eintrittsspaltes 23 eines abbildenden ortsauflösenden Imaging Spektrographen 8 befindet. Durch die Anwendung des konfokalen Prinzips ist der Einfluss des störenden Fremdlichtes der vorgelagerten Schicht 19 reduziert, jedoch nicht vollständig beseitigt. Damit ist dem konfokal abgebildeten Fluoreszenzlicht jedes durch den scannenden Spot angeregten Ortes im ausgewählten Bereich 2 das störende Fremdlicht der vorgelagerten Schicht 19 überlagert.For fluorescence excitation, the radiation of an excitation laser 3 by means of a confocal laser scanner system 4 so on the object to be examined 1 pictured that a scanning spot 5 on the object 1 only the selected area 2 stimulates fluorescence. With this lighting but also the upstream layer 19 excited to fluoresce, their light as confocal imaged fluorescent light 20 any location excited by the scanning spot within the selected area 2 through the laser scanner system 4 about a dichroic divider 6 confocal in a field stop 7 is pictured, which is in the plane of an entrance slit 23 an imaging spatially-resolving imaging spectrograph 8th located. By applying the confocal principle, the influence of the disturbing extraneous light of the upstream layer is 19 reduced, but not completely eliminated. Thus, the confocal-imaged fluorescent light of each spot excited by the scanning spot is within the selected range 2 the disturbing extraneous light of the upstream layer 19 superimposed.

Am Ausgang des Imaging Spektrographen 8, der das Fluoreszenzlicht spektral auflöst, ist ein Detektor 9 angeordnet, welcher nacheinander von jedem Ort innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 das dort entstehende Fluoreszenzlicht und das überlagerte Fremdlicht der vorgelagerten Schicht 19 spektral aufgelöst detektiert. Diese Signalfolge wird in einer Akkumulationsstufe 10 integriert und mittels eines Rechners 11 über ein Display 12 als Summenfluoreszenzspektrum dargestellt. Das überlagerte Fremdlicht der vorgelagerten fluoreszierenden Schicht 19 durchläuft ebenfalls das Laser Scanning System 4 und trifft als nicht konfokal abgebildetes Fluoreszenzlicht 21 außerhalb der Konfokalblende 7 auf den Eintrittsspalt der abbildenden Imaging Spektrographen 8 (vgl. auch 2).At the output of the imaging spectrograph 8th , which spectrally dissolves the fluorescent light, is a detector 9 arranged one after the other from any location within the selected area 2 the resulting fluorescent light and the superimposed extraneous light of the upstream layer 19 spectrally resolved detected. This signal sequence is in an accumulation stage 10 integrated and by means of a computer 11 via a display 12 shown as sum fluorescence spectrum. The superimposed extraneous light of the upstream fluorescent layer 19 also goes through the laser scanning system 4 and hits as non-confocal imaged fluorescent light 21 outside the confocal aperture 7 on the entrance slit of the imaging imaging spectrograph 8th (see also 2 ).

Der am Ausgang des Imaging Spektrographen 8 in 1 angeordnete Detektor 9, der vorteilhaft als Empfängermatrix ausgeführt ist, detektiert je nach spektraler Auflösung des Imaging Spektrographen 8 mit einigen Zeilen das Summen-Fluoreszenzlicht aus der Fluoreszenz der Orte im ausgewählten Bereich 2 mit dem überlagerten Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19, andere Zeilen des Detektors 9 hingegen detektieren nur das störende Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19. Dieses störende Fluoreszenzlicht wird ebenfalls und gleichzeitig mit dem Summen Fluoreszenzlicht in der Akkumulationsstufe 10 integriert und mittels des Rechners 11 über das Display 12 als Fluoreszenzspektrum des störenden Fremdlichtes dargestellt. Im Rechner 11 wird durch die Differenzbildung aus dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Summen-Fluoreszenzspektrums und dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Spektrums vom störenden Fluoreszenzlicht das reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 berechnet, das damit zur weiteren Auswertung zur Verfügung steht. Über das Display 12 wird das reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 dargestellt.The at the output of the imaging spectrograph 8th in 1 arranged detector 9 , which is advantageously designed as a receiver matrix, detected depending on the spectral resolution of the imaging spectrograph 8th with a few lines, the sum fluorescent light from the fluorescence of the locations in the selected area 2 with the superimposed fluorescent light of the upstream layer 19 , other lines of the detector 9 however, only the disturbing fluorescent light of the upstream layer detect 19 , This disturbing fluorescent light is also and simultaneously with the buzzing fluorescent light in the accumulation stage 10 integrated and by means of the computer 11 over the display 12 represented as a fluorescence spectrum of the disturbing extraneous light. In the calculator 11 By subtraction of the accumulated fluorescence signal of the sum fluorescence spectrum and the accumulated fluorescence signal of the spectrum from the interfering fluorescent light, the pure fluorescence spectrum of the selected region is determined 2 calculated, which is thus available for further evaluation. About the display 12 becomes the pure fluorescence spectrum of the selected area 2 shown.

Die Messung wird fortgeführt, bis dieses reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 mit einem ausreichenden Signal-Rausch Verhältnis zur Verfügung steht.The measurement is continued until this pure fluorescence spectrum of the selected area 2 with a sufficient signal-to-noise ratio is available.

Zum Festlegen des interessierenden Bereiches 2, aus dem das Fluoreszenzspektrum bestimmt werden soll, wird das beim Scannen erhaltene Fluoreszenzlicht oder das reflektierte Anregungslicht bzw. die reflektierte Strahlung eines nicht dargestellten weiteren Lasers, welche außerhalb des Anregungs- oder Fluoreszenzspektralbereiches liegt, über den dichroitischen Teiler 6 unter Abbildung in eine Feldblende 13 mit einem weiteren Detektor 14 registriert, aus dessen Signalen mittels eines Framegrabbers 15 und des Rechners 11 auf einem Display 16 das Bild des zu untersuchenden Objektes 1 erzeugt wird. In diesem Bild werden die Konturen des ausgewählten Bereiches 2 festgelegt.To set the area of interest 2 , from which the fluorescence spectrum is to be determined, the fluorescence light obtained during the scanning or the reflected excitation light or the reflected radiation of a further laser, not shown, which lies outside the excitation or fluorescence spectral range, via the dichroic divider 6 under picture in a field stop 13 with another detector 14 registered, from its signals by means of a frame grabber 15 and the computer 11 on a display 16 the image of the object to be examined 1 is produced. This image shows the contours of the selected area 2 established.

Mit einer Steuerung wird bewirkt, dass nur das Fluoreszenzlicht aus dem ausgewählten Bereich 2 detektiert wird. Das kann erreicht werden, indem nur innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 gescannt wird oder dass beim Abscannen des Objektes 1 der Anregungslaser 3 nur innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 eingeschaltet ist oder dass das Fluoreszenzlicht nur beim Abscannen des ausgewählten Bereiches 2 detektiert wird.Using a controller will cause only the fluorescent light from the selected area 2 is detected. This can be achieved by only within the selected area 2 is scanned or that when scanning the object 1 the excitation laser 3 only within the selected area 2 is turned on or that the fluorescent light only when scanning the selected area 2 is detected.

Zum Ausgleich von Bewegungen des Objektes 1 wird ein Bildstabilisierungssystem, bestehend aus einer Einheit 17 zur Bewegungsdetektion und Bildlagenkorrektur und einer Steuerstufe 18 zur Spotsteuerung, eingesetzt, dessen Informationen so auf das Laser Scanner System 4 übertragen werden, so dass immer der gleiche Bereich 2 des Objektes 1 gescannt wird.To compensate for movements of the object 1 becomes an image stabilization system consisting of a unit 17 for motion detection and image position correction and a control stage 18 used for spot control, whose information is so on the laser scanner system 4 be transferred so that always the same area 2 of the object 1 is scanned.

In 2 ist (zum besseren Verständnis der gemäß 1 beschriebenen zeitgleichen örtlich getrennten Detektion von konfokal abgebildetem Licht und von Fremdlicht) der Eintrittsspalt 23 vom Imaging Spektrograph 8 mit der unmittelbar in dessen Ebene angeordneter Feldblende 7 frontseitig gesondert dargestellt.In 2 is (for better understanding of the according to 1 described simultaneous spatially separate detection of confocal imaged light and extraneous light) of the entrance slit 23 from the imaging spectrograph 8th with the field stop arranged directly in its plane 7 shown separately on the front.

Das konfokal abgebildete Fluoreszenzlicht 21 (durch Pfeildarstellung angedeutet) trifft auf die im Zentrum des Eintrittsspaltes 23 angeordnete Feldblende 7, während das ebenfalls durch Pfeildarstellung symbolisierte nicht konfokal abgebildete Fluoreszenzlicht 22 (dem Fluoreszenzlicht des ausgewählten Bereiches 2 überlagertes störendes Fluoreszenzlicht von der Schicht 19 aus 1) außerhalb der Feldblende 7 auf Bereiche 24 des Eintrittsspaltes 23 fällt und dort räumlich getrennt vom konfokal abgebildeten Fluoreszenzlicht 21 in den Imaging Spektrographen 8 (vgl. 1) gelangt.The confocal fluorescence light 21 (indicated by arrow) meets the one in the center of the entrance slit 23 arranged field stop 7 while the non-confocal fluorescence light also symbolized by arrow representation 22 (the fluorescent light of the selected area 2 superimposed interfering fluorescent light from the layer 19 out 1 ) outside the field stop 7 on areas 24 of the entrance slit 23 falls and there spatially separated from confocal imaged fluorescent light 21 in the imaging spectrograph 8th (see. 1 ).

Als Objekt 1 können neben Anwendungen in der Ophthalmologie (Untersuchung des Augenhintergrundes) auch bewegte mikroskopische Proben untersucht werden, insbesondere bei denen die Fluoreszenzspektren innerhalb ausgewählter Strukturen bei nur geringer Lichtbelastung bestimmt werden sollen.As an object 1 In addition to applications in ophthalmology (examination of the ocular fundus), moving microscopic specimens may also be examined, in particular in which the fluorescence spectra within selected structures are to be determined with only low light exposure.

Die Erfindung könnte prinzipiell auch so ausgeführt werden (nicht explizit in der Zeichnung dargestellt), dass die Messung von Summenfluoreszenzlicht und störendem Fremdlicht nacheinander erfolgt. In diesem Falle ist der Eintrittsspalt 23 des Spektrographen 8 nur im Bereich der Konfokalblende 7 freigegeben. Dieser Spektrograph 8 ist dann kein ortsauflösender abbildender Imaging Spektrograph, der (wie im Ausführungsbeispiel zu 1) die gleichzeitige spektrale Zerlegung von Licht unterschiedlicher Orte erlaubt. In einem ersten Schritt wird bei scannender konfokaler Beleuchtung der Orte innerhalb des ausgewählten Bereiches 2 das Licht aus der Fluoreszenz des ausgewählten Bereiches, überlagert mit dem störenden Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19, vom Spektrographen 8 spektral zerlegt, in der Akkumulationsstufe 10 integriert und an einen Rechner 11 zur weiteren Verarbeitung übergeben. In einem zweiten Schritt wird beispielsweise ein ablenkendes Element, vorzugsweise eine nicht in der Zeichnung dargestellte Glasplanplatte, im abbildenden Strahlengang des Fluoreszenzlichtes vor der Konfokalblende 7 angeordnet, so dass das Summenfluoreszenzlicht nicht in die Konfokalblende 7 gelangt, sondern daneben abgebildet wird und nicht in den Spektrographen 8 gelangt. In die Konfokalblende 7 dringt bei gleicher Abtastung des ausgewählten Bereiches 2 dann nur das störende Fluoreszenzlicht der vorgelagerten fluoreszierenden Schicht 19. Dieses wird im Spektrographen 8 spektral zerlegt, von dem Detektor 9, der in diesem Falle als Detektorzeile ausgebildet sein kann, detektiert, in der Akkumulationsstufe 10 integriert und dem Rechner 11 zur Verfügung gestellt. Im Rechner 11 wird das vom Einfluss des störenden Fremdlichtes befreite reine Fluoreszenzspektrum des ausgewählten Bereiches 2 aus der Differenz von Summenfluoreszenzspektrum und Spektrum des im zweiten Schritt registrierten störenden Fluoreszenzlichtes der vorgelagerten Schicht 19 berechnet sowie über das Display 12 ausgegeben.The invention could in principle also be carried out in this way (not explicitly illustrated in the drawing) provides) that the measurement of cumulative fluorescent light and interfering extraneous light takes place successively. In this case, the entrance slit 23 of the spectrograph 8th only in the area of the confocal aperture 7 Approved. This spectrograph 8th is then not a spatially resolving imaging Imaging Spectrograph, the (as in the embodiment to 1 ) allows the simultaneous spectral decomposition of light from different locations. In a first step, with scanning confocal illumination, the locations will be within the selected range 2 the light from the fluorescence of the selected area, superimposed with the disturbing fluorescent light of the upstream layer 19 , from the spectrograph 8th spectrally decomposed, in the accumulation stage 10 integrated and to a computer 11 for further processing. In a second step, for example, a deflecting element, preferably a glass plan plate not shown in the drawing, in the imaging beam path of the fluorescent light in front of the confocal 7 arranged so that the cumulative fluorescent light is not in the confocal 7 but is imaged next to it and not in the spectrograph 8th arrives. Into the confocal aperture 7 penetrates at the same sampling of the selected area 2 then only the disturbing fluorescent light of the upstream fluorescent layer 19 , This is in the spectrograph 8th spectrally decomposed, from the detector 9 , which may be formed in this case as a detector line detected, in the accumulation stage 10 integrated and the calculator 11 made available. In the calculator 11 becomes the pure fluorescence spectrum of the selected area freed from the influence of interfering extraneous light 2 from the difference between the sum fluorescence spectrum and the spectrum of the interfering fluorescent light of the upstream layer registered in the second step 19 calculated as well as over the display 12 output.

Es wäre ebenfalls möglich, das störende Fluoreszenzlicht der vorgelagerten Schicht 19 einzeln so zu erfassen, dass der scannende Spot 5 auf die Schicht 19 abgebildet und das entsprechende Fluoreszenzlicht konfokal in die Feldblende 7 abgebildet werden, die sich in der Ebene des Eintrittsspaltes 23 des Spektrographen 8 befindet. In diesem Falle wäre die Intensität des Fremdlichtes jedoch höher als bei der konfokalen Beleuchtung und Abbildung der ausgewählten Bereiche des Objektes in die Konfokalblende (Feldblende 7). Deshalb würde es erforderlich, vor der Differenzbildung aus beiden Spektren (Differenzbildung aus dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Summen-Fluoreszenzspektrums und dem akkumulierten Fluoreszenzsignal des Spektrums vom störenden Fluoreszenzlicht) eine Intensitätsanpassung dieser Fluoreszenzsignale vorzunehmen.It would also be possible, the disturbing fluorescent light of the upstream layer 19 individually capture so that the scanning spot 5 on the layer 19 imaged and the corresponding fluorescent light confocal in the field stop 7 be imaged, located in the plane of the entrance slit 23 of the spectrograph 8th located. In this case, however, the intensity of the extraneous light would be higher than in the case of confocal illumination and imaging of the selected areas of the object into the confocal diaphragm (field diaphragm 7 ). Therefore, it would be necessary to make an intensity adjustment of these fluorescence signals before the difference formation from both spectra (difference of the accumulated fluorescence signal of the sum fluorescence spectrum and the accumulated fluorescence signal of the spectrum of the interfering fluorescent light).

Die Festlegung des ausgewählten Bereiches und die Erfassung der Bewegungen des Objektes oder des ausgewählten Bereiches sowie die Nachführung des Scannvorgangs erfolgen wie im ersten Ausführungsbeispiel beschrieben.The Determination of the selected Range and the detection of the movements of the object or the chosen Area as well as the tracking the scanning process as described in the first embodiment.

Die Erfindung kann in gleicher Weise zur Bestimmung der Reflexionsspektren von ausgewählten Bereichen des Objekts verwendet werden, vor und/oder hinter denen eine lichtstreuende Schicht angeordnet ist.The Invention can be used in the same way to determine the reflection spectra from selected areas of the object are used in front of and / or behind which a light-scattering Layer is arranged.

Prinzipiell ist es auch möglich, statt des Spektrographen einen Monochromator zu verwenden. Allerdings können dann während der Durchstimmung des Ausgangsspektrums ggf. zu berücksichtigende Bewegungen des Objektes nicht erfasst werden.in principle it is also possible instead of using the spectrograph a monochromator. Indeed can then while the tuning of the output spectrum, if necessary, to be considered Movements of the object can not be detected.

11: Objektobject
22: BereichArea
33: Anregungslaserexcitation laser
44: Laser Scanner Systemlaser Scanner system
55: scannender Spotbe scanned commercial
66: dichroitischer Teilerdichroic divider
7, 137, 13: Feldblendefield stop
88th: Imaging SpektrographImaging spectrograph
9, 149 14: Detektordetector
1010: Akkumulationsstufeaccumulation stage
1111: Rechnercomputer
1212: Display für Ausgabe der Fluoreszenzspektrendisplay for issue the fluorescence spectra
1515: FramegrabberFrame grabber
1616: Display zur Darstellung des Objektes 1 und Auswahl des Bereiches 2 Display for displaying the object 1 and selection of the area 2
1717: Einheit zur Bewegungsdetektion und Bildlagenkorrekturunit for motion detection and image position correction
1818: Steuerstufe zur Spotsteuerungcontrol stage for spot control
1919: Schichtlayer
2020: Pfeil (störende Fluoreszenz der Schicht 19)Arrow (disturbing fluorescence of the layer 19 )
2121: konfokal abgebildetes Fluoreszenzlichtconfocal imaged fluorescent light
2222: nicht konfokal abgebildetes FluoreszenzlichtNot confocal imaged fluorescent light
2323: Eintrittsspalt des Spektrographen 8 Entrance slit of the spectrograph 8th
2424: Bereich des Eintrittsspaltes 23 Area of entry gap 23

Claims

Method for detecting fluorescence or reflection spectra of arbitrarily selectable regions and structures of an object influenced by extraneous light, in particular the fluorescence or reflection and / or downstream media or layers, for example the fundus, where the object is exposed to radiation by a scanning Spots, preferably a laser, illuminated and the resulting by the illumination and / or radiation excitation fluorescence or reflection light for a subtraction separated by the extraneous light provided wavelength-dependent evaluation and presentation is detected, characterized ge indicates that an area is selected by the object, within the contour of which each location is illuminated by the radiation of the scanning spot, that each location illuminated for detecting the fluorescence or reflection spectra within the selected area of the object is confocally imaged in one and the same field stop that the incident radiation in the confocal field stop is spectrally decomposed and it is detected that the local fluorescence or reflection signal occurring for each illuminated location within the selected area is accumulated by the object in order to form a first signal. or reflectance spectrums during the illumination or radiation excitation of the locations within the selected area superimposed by the scanning spot over the object, preferably extraterrestructively decomposed under non-confocal imaging, detected and accumulated to form a second signal and that from the accumulated signals a difference signal for spectral evaluation and presentation of the freed from the influence of interfering extraneous light pure fluorescence or reflection spectrum is formed.

Method according to claim 1, characterized in that that the confocal mapping of the fluorescence capture or reflection spectra illuminated or radiation-excited places within the selected Area of the object in the field stop and the non-confocal Illustration of the fluorescence or reflection light of the selected area of the object upstream and / or downstream media or layers to respective spectral light separation simultaneously and locally separated on the entrance slit of a single imaging spatially-resolving imaging Spectrographs take place.

Method according to claim 1, characterized in that that the confocal mapping of the fluorescence capture or reflection spectra illuminated or radiation-excited places within the selected Range from the object to the field stop and the image of the fluorescence or reflection light of the selected area of the object. and / or downstream media or layers successively to the spectral Light decomposition in one and the same imaging spectrograph, whose entrance slit is accessible only in the area of the field diaphragm, while during the non-confocal figure shows the confocal figure on the field stop is prevented.

Process according to Claims 1 and 3, characterized that the image of the disturbing fluorescence or reflection light of the selected area of the object. and / or downstream media or layers in the entrance slit of Spectrograph is not confocal.

Process according to Claims 1 and 3, characterized that for detecting the spectrum of extraneous light, a confocal illumination the one selected Area of the object upstream and / or downstream media or layers through the scanning spot as well as a picture of this disturbing fluorescence Reflection light also in a in the plane of the entrance slit made of the spectrograph arranged confocal and that before the formation of the difference signal for spectral evaluation and presentation of the influence of the disturbing Of extraneous pure fluorescence or reflection spectrum, the accumulated Signals from confocal measured extraneous light and confocal measured Light of the object selected by the object Range in their intensity adapted to each other.

Method according to claim 1, characterized in that the contour of the selected area is determined in a reflection image of the object.

Method according to claim 1, characterized in that the contour of the selected area is determined in a fluorescence image of the object.

Method according to claim 1, that movements and / or contour changes of the selected area of the object, for example by the detection of phase-sensitive reflecting changes or other methods of image layer detection, detected and at Control of the scanning spot are taken into account.

Method according to claim 1, characterized in that that the illuminating spot is the location for their fluorescence excitation or reflection light generation only within the selected range scans from the object.

Method according to claim 1, characterized in that that the illuminating spot scans the object over a large area, but the laser radiation of the Spots for the fluorescence excitation or reflection light generation only then activated is when the selected one Area overlined becomes.

Method according to claim 1, characterized in that that the lighting spot scans the object over a large area and every place to Fluorescence excitation or reflection light generation illuminated, however only when the fluorescent or reflected light is detected, if the spot is the selected one Area sweeps over.

Arrangement for the detection of fluorescence or reflection spectra arbitrarily selectable areas and structures of a foreign light, in particular the fluorescence or reflection of upstream and / or downstream media or layers, influenced object, such as the ocular fundus, in which the object by a scanning spot of a radiation source, preferably a laser beam illuminated and the resulting by the illumination and / or radiation excitation fluorescence or reflection light is detected for a subtraction separated from the extraneous light provided wavelength-dependent evaluation and presentation, characterized in that the radiation source ( 3 ) for illumination or fluorescence excitation with a control device ( 4 ) for the programmable beam deflection of the scanning spot ( 5 ) within a region of the object selected with selected contour ( 1 ), that an imaging optics ( 4 ) is provided, by which each illuminated for the detection of fluorescence or reflection spectra or radiation-excited place within the selected area ( 2 ) of the object ( 1 ) confocally on one and the same field stop ( 7 ) that in the plane of the field stop ( 7 ) the entrance slit ( 23 ) of an imaging spectrograph ( 8th ) arranged in the confocal ( 7 ) striking light ( 21 spectrally decomposed that at the output of the spectrograph ( 8th ) a detector ( 9 ) is arranged for the spectrally decomposed fluorescence or reflection signal whose output is connected to a unit ( 10 ) for the accumulation of the fluorescence or reflection signal respectively during the scanning process of the spot ( 5 ) for each location of the selected area ( 2 ) detected fluorescence or reflection spectra is in connection that a spectrograph is provided, preferably the same spectrograph ( 8th ), for the spectral decomposition of the scanning process of the spot ( 5 ) and not confocally into the entrance slit ( 23 ) of the spectrograph projected fluorescence or reflection light ( 22 ) of all the selected area ( 2 ) of the object ( 1 ) upstream and / or downstream media or layers ( 19 ), with the output also via a detector ( 9 ) for the spectrally decomposed fluorescence or reflection signal with a unit ( 10 ) is connected to the accumulation of the fluorescence or reflection signal, and that means, for example a computer ( 11 ), which of the confocal and non-confocal imaging on the spectrograph ( 8th ) accumulated fluorescence or reflection signals a difference signal for spectrometric evaluation and presentation in a preferably computer-aided unit ( 11 ) form.

Arrangement according to claim 12, characterized in that for the spectral decomposition of the light from the confocal image as well as from the non-confocal projection a single imaging spatially resolving imaging spectrograph ( 8th ) is provided at whose output a detector ( 9 ) is connected with different areas for registration of the spectrally decomposed fluorescence or reflection signals from the confocal imaging and from the non-confocal projection on the imaging spectrograph.

Arrangement according to claims 12 and 13, characterized in that the entrance slit of the spectrograph ( 8th ) only in the area of the field diaphragm ( 7 ) and that for the purpose of the separate spectral decomposition of the fluorescent or reflection light respectively from the confocal and non-confocal imaging means are provided for deflecting the fluorescence or reflection light, for example a plane plate, through which during the spectral decomposition of the fluorescence - or reflection light from the non-confocal image, the confocal image of the illuminated or radiation-excited places within the selected region ( 2 ) of the object ( 1 ) on the field diaphragm ( 7 ) is prevented.

Arrangement according to claim 12, characterized in that a control stage ( 4 . 18 ) for the radiation source ( 3 ) through which the spot ( 5 ) during the scanning process outside the contour of the selected area ( 2 ) of the object ( 1 ) is blanked out.

Arrangement according to claim 12, characterized in that means, for example a control stage for the detector ( 9 ) or a shutter in the detection beam path, are provided, through which respectively only fluorescence or reflection signals from within the contour of the selected area ( 2 ) of the object ( 1 ) are used for fluorescence or reflection signal detection and / or for fluorescence or reflection signal accumulation.

Arrangement according to claim 12, characterized in that as control device for the scanning spot ( 5 ) of the radiation source ( 3 ) and as confocal imaging optics a laser scanning system ( 4 ), for example a laser scanning ophthalmoscope or a laser scanning microscope.

Arrangement according to claim 12, characterized in that means ( 17 . 18 ) are provided for detecting movements and changes in shape of the object ( 1 ) or its selected area ( 2 ) as well as for influencing the scanning process of the spot ( 5 ) of the radiation source ( 3 ) and / or the detection of the fluorescence or reflection signals and / or the formation of the accumulated fluorescence or reflection signal.

Arrangement according to claim 18, characterized in that the means consist of a unit for image acquisition ( 17 ) exist, the output side with the control device ( 18 . 4 ) for the radiation source ( 3 ) and / or the detector ( 9 ) and / or other elements located in the evaluation beam path, such as the unit ( 10 ) are in communication with the accumulation of the fluorescence or reflection signal.

Arrangement according to claim 12, characterized in that a unit ( 16 ) for displaying the object ( 1 ) and definition of the selected area ( 2 ) with the control device ( 4 . 18 ) for the programmable beam deflection of the scanning spot ( 5 ).

Arrangement according to claim 12, characterized in that in the imaging beam path of the confocal imaging optics ( 4 ) a beam splitter, for example a dichroic splitter ( 6 ) is arranged, over which each illuminated for the detection of the fluorescence or reflection spectra or radiation-excited place within the selected area ( 2 ) from the object ( 1 ) to another confocal ( 13 ) in front of another detector ( 14 ), which via a frame grabber ( 15 ) and the preferably computer-aided unit ( 11 ) with a display ( 16 ) for displaying the object ( 1 ) and to select the area to be investigated ( 2 ).