DE102007059939A1 - Noncovalently crosslinked spherical polymer particles for separating biological substances and cells can be dissolved by heating or adding a metal-complexing agent - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft sphärische, auflösbare Polymerpartikel die eine einfache Abtrennung bzw. Aufreinigung von Zellen und Biosubstanzen ermöglichen. Die Bindung der Biosubstanzen an die auflösbaren Polymermatrizes geschieht dabei über matrixgebundene Liganden, die die Biosubstanzen spezifisch zu binden vermögen. Durch Einkapselung magnetischer Nanopartikel in die Polymermatrix erhalten die Partikel magnetische Eigenschaften, die es dadurch ermöglichen, die gebundenen Biosubstanzen aus einer Mischung bzw Reaktionslösung durch einfaches Anlegen eines konventionellen Handmagneten an das Reaktionsgefäß zu isolieren. Die anschließende Gewinnung der abgetrennten Biosubstanzen geschieht durch einfache Zugabe eines Komplexbildners oder alternativ durch einfaches Erwärmen der Polymermatrix auf Temperaturen oberhalb 30°C, wobei diese aufgelöst wird und die abgetrennte Biosubstanz freigibt. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung und Verwendung der Polymerträger.The The invention relates to spherical, dissolvable polymer particles the one simple separation or purification of cells and biosubstances enable. The binding of the biosubstances to the dissolvable Polymer matrices are done via matrix-bound ligands, which are able to specifically bind the biosubstances. By Encapsulation of magnetic nanoparticles in the polymer matrix is obtained Particle magnetic properties that make it possible the bound biosubstances from a mixture or reaction solution by simply applying a conventional hand magnet to the Isolate reaction vessel. The subsequent Recovery of the separated biosubstances is done by simple Addition of a complexing agent or alternatively by simply heating the polymer matrix to temperatures above 30 ° C, wherein this is dissolved and releases the separated biosubstance. The invention further relates to the production and use of Polymeric carrier.
Verfahren
zur Herstellung von sphärischen Polymerpartikeln ("Beads")
sind mannigfach in der Literatur beschrieben. Die Herstellung sphärischer Partikel
durch Eintropfen einer Alginatlösung in ein Reservoir eines
ionogenen Vernetzers ("crosslinker") in Form von Kalziumchlorid
zur Einkapselung verschiedener Substanzen wie Pflanzenzellen, Säugetierzellen,
Hefezellen, Bakterien oder Therapeutika ist aus dem Stand der Technik
bekannt (
Covalent
vernetzte magnetische Polymerpartikel für analytische,
diagnostische oder medizinische Zwecke sind aus den Patentschriften
Thermosensitive,
magnetische Partikel aus N-Isopropylacrylamid-Copolymeren werden
von
In
der Anmeldung
Die zitierten magnetischen und unmagnetischen Polymerträger sowie alle anderen aus dem Stand der Technik bekannten Polymerpartikel sind, sofern sie für die Biosubstanzabtrennung entwickelt worden, nicht in der Lage, eine einfache Biosubstanzwiedergewinnung zu ermöglichen. Zwar werden von diversen Herstellern magnetische Polymerträger angeboten, die sehr gute Biosubstanzabtrennleistungen aufweisen, die anschließende Wiedergewinnung der Biosubstanzen gestaltet sich jedoch sehr kompliziert. Dies betrifft vor allem die im Zuge der Gen- und Zelltechnologie immer stärker ins Interesse gerückte Zellisolierung. So werden bei dem Verfahren der Firma Miltenyi die auf den Zellen anhaftenden Nanopartikel überhaupt nicht abgelöst, da durch die Feinheit der Nanopartikel (ca. 50 nm) keine Einschränkungen bzgl. der weiteren Analysenschritte auftreten sollen. Bei dieser Technik ein aufwendiges, separates magnetisches Abtrennsystem erforderlich. Im Gegensatz dazu werden bei dem Zellseparationsverfahren der Firma Invitrogen/Dynal Liganden-tragende Oligonucleotid-Linker als Fänger der Zellen benutzt, die nach dem magnetischen Separationsschritt mittels enzymatischer Spaltung vom Magnetträger abgetrennt werden. Auch kommen bei dem Verfahren dieser Firma spezielle Ablösungspartikel zum Einsatz, die die eigentliche Zellwiedergewinnung erschweren. Beide Verfahren sind aufwendig, kosten Zeit und sind in bezug auf die Abtrennverfahrensweisen (Miltenyi) nicht ideal.The cited magnetic and non-magnetic polymer carriers, as well as all other polymer particles known in the art, unless developed for biosubstance separation, are unable to facilitate easy biosubstance recovery. Although magnetic polymer carriers are offered by various manufacturers, which have very good Biosubstanzabtrennleistungen, the subsequent recovery of biosubstances designed but very complicated. Above all, this concerns cell isolation, which has become increasingly interesting in the course of gene and cell technology. Thus, in the process of Miltenyi, the nanoparticles adhering to the cells are not detached at all, since the fineness of the nanoparticles (about 50 nm) is said to impose no restrictions on the further analysis steps. This technique requires a complicated, separate magnetic separation system. In contrast, the Invitrogen / Dynal cell separation method employs ligand-bearing oligonucleotide linkers as scavengers of the cells that are after the magnetic separation step are separated by enzymatic cleavage from the magnetic carrier. Also come in the process of this company special separation particles are used, which complicate the actual cell recovery. Both methods are expensive, time consuming and not ideal in terms of the separation procedures (Miltenyi).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind Verfahren und Produkte, mittels derer eine einfache Abtrennung und Wiedergewinnung der separierten Biosubstanzen ermöglicht wird.task The present invention relates to methods and products by means of derer a simple separation and recovery of the separated biosubstances is possible.
Kernpunkt der neuen Separationsmedien sind Polymerträger in Form von Mikro- und Nanopartikeln, die sich nach dem Abtrennschritt in einfacher Weise auflösen lassen. Dies wird überraschenderweise entweder durch Zugabe eines Komplexbildners zu ionogen vernetzten Polymerträgern oder durch bloße Wärmezufuhr zu präzipitierten Polymerpartikeln bewerkstelligt.crux The new separation media are polymer carriers in the form of microparticles and nanoparticles that form after the separation step in easy to dissolve. This will be surprising either crosslinked by addition of a complexing agent to ionic Polymer carriers or by mere heat accomplished to precipitated polymer particles.
Die Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, dass spezielle Polymere oder Copolymere als Basismaterial für die Herstellung der Partikel verwendet werden, die entweder in einem bestimmten Lösungsmittel nur bei höheren Temperatur löslich und bei Raumtemperatur in demselben Lösungsmittel nicht löslich sind oder durch ionogene crosslinker verfestigt werden. Beispiele für solche, die Erfindung jedoch in keiner Weise einschränkenden Polymere sind Alginate, Agarose, Polyacrylate, Polyvinylalkohol, Polyäther, Polyoxyäthylen, Polypropylenoxide, Polyethylenglykolen, Gelatine, Chitosan, Polysaccharide oder Polysaccharid-Derivate oder (Block)copolymere dieser Substanzen. Die aus diesen beispielhaft aufgeführten Polymeren synthetisierten Polymerpartikel können sowohl als magnetische als auch unmagnetische Träger eingesetzt werden.The Problem is solved according to the invention characterized that special polymers or copolymers as base material for The production of the particles can be used either in one certain solvents soluble only at higher temperature and at room temperature in the same solvent not are soluble or solidified by ionic crosslinkers become. Examples of such, but the invention in no Way restricting polymers are alginates, agarose, Polyacrylates, polyvinyl alcohol, polyethers, polyoxyethylene, Polypropylene oxides, polyethylene glycols, gelatin, chitosan, polysaccharides or polysaccharide derivatives or (block) copolymers of these substances. Synthesized from these exemplified polymers Polymer particles can be both magnetic as well non-magnetic supports are used.
Für
die Synthese der auflösbaren, magnetischen Polymerträger
besteht der Ausgangspunkt in der Synthese magnetischer Nanopartikel
in kolloiddisperser- oder Pulverform, die der Polymerausgangslösung
zugemischt werden. Anschließend werden die Polymerlösungen
in heterogener Phase zu perlförmigen ("sphärischen")
Partikeln verfestigt bzw. vernetzt (Inverse Suspensionsvernetzung).
Während dieses Verfestigungs- bzw. Vernetzungsprozesses werden
die magnetischen Nanopartikel in die Polymerpartikel eingekapselt.
Als magnetische Substanzen kommen ferromagnetische, ferrimagnetische oder
superparamagnetische Nanopartikel zum Einsatz. Die zu diesem Zweck
vorzugsweise verwendete Substanz ist Magnetit (Fe3O4) oder y-Fe2O3. Die Präparation solcher Verbindungen
ist aus dem Stand der Technik allgemein bekannt:
Zur Herstellung von Magnetit oder γ-Fe2O3 wird durchweg von Eisen(III)- und Eisen(II)-Salzlösungen mit variierenden molaren Verhältnissen (2:1, 0,5:1–4:1) ausgegangen, die anschließend durch Zugabe von Basen oder durch Hitzezufuhr in entsprechend kolloidale Magnetdispersionen („Magnetkolloide") überführt werden. Um eine besonders durch die vander-Waals'schen Kräfte bedingtes Agglomeration der feinen Magnetpartikel zu verhindern, werden oberflächenaktive Stoffe zugesetzt, die allgemein unter der Bezeichnung „Tenside", „Emulgatoren" oder „Stabilisatoren" bekannt sind. Sie verhindern das Absetzen des Kolloides in der wäßrigen Phase. Stabilisierte Dispersionen solcher Art sind auch unter der Bezeichnung „Ferrofluide” bekannt und werden auch kommerziell angeboten: Ferrofluidics Corp., USA; Advanced Magnetics, USA; Taibo Co, Japan; Liquids Research Ltd., Wales; Schering AG, Deutschland. Die Art des verwendeten Stabilisators hängt, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, von dem jeweiligen Ziel in bezug auf Feinheit, Mischbarkeit mit dem Polymeren oder erreichbare Konzentration in der Polymerlösung ab. Geeignete Stabilisatoren hierfür sind entweder kationischer-, anionischer oder nicht-ionischer Natur. Die Erfindung in keiner Weise einschränkende Beispiele hierfür sind: Polyacrylsäure, Alkylarylpolyethersulfonate, Citrate, Ölsäure, Alkylnaphtalensulfonate, Laurylsulfonat, Phosphatester, Alkoholethersulfate, Alkylarylpolyethersulfate, Polystyrolsulfonsäure, Pyrophosphat oder Petroliumsulfonate als anionische Substanzen, Polyethylenimine oder Dodecyltrimethylammoniumchlorid als kationische Tenside sowie Alkylaryloxypolyethoxyethanole, Polyethylenglykole, Nonylphenoxypolyglycidol, Polyvinylalkohole, Polyvinylpyrrolidon oder Nonylphenol als nichtionische Substanzen. Die Teilchengrößen der mit Hilfe der vorgenannten Präparationsweisen dargestellten Magnetkolloide hängen, wie allgemein bekannt, von verschiedenen Versuchsparametern wie dem Eisensalzverhältnis, der Basenkonzentration, dem Basentyp (NaOH, NH3), dem pH-Wert, der Temperatur sowie der Nachbehandlungstemperatur ab. Die für die erfindungsgemäßen Mittel geeigneten Magnetkolloide weisen durchweg eine Teilchengröße von 5–800 nm, vorzugsweise eine solche von 20–200 nm auf. Dadurch ist gewährleistet, daß die Magnetkolloide bei der anschließenden Einkapselung in die Polymermatrix in kolloiddisperser Form vorliegen. Durch gezielte Zudosierung der entsprechenden Mengen des betreffenden Kolloids bzw Ferrofluids lassen sich die magnetischen Eigenschaften und damit das magnetische Separationsverhalten gezielt steuern. Die Konzentrationen der Magnetkolloide in der Polymerlösung betragen in der Regel 10 bis 40 Gew.-%.For the production of magnetite or γ-Fe 2 O 3 , it is assumed that iron (III) and iron (II) salt solutions with varying molar ratios (2: 1, 0.5: 1-4: 1) are used, which are subsequently passed through In order to prevent agglomeration of the fine magnetic particles caused by the van der Waals forces in particular, surfactants are added, generally referred to as "surfactants". , "Emulsifiers" or "stabilizers" are known. They prevent settling of the colloid in the aqueous phase. Stabilized dispersions of this type are also known under the name "ferrofluids" and are also commercially available: Ferrofluidics Corp., USA; Advanced Magnetics, USA; Taibo Co, Japan; Liquids Research Ltd., Wales; Schering AG, Germany. The type of stabilizer used, as known to those skilled in the art, depends on the particular target in terms of fineness, miscibility with the polymer, or attainable concentration in the polymer solution. Suitable stabilizers for this purpose are either cationic, anionic or non-ionic in nature. The invention are in no way limiting examples thereof: polyacrylic acid, alkylarylpolyethersulfonates, citrates, oleic acid, alkylnaphthalenesulfonates, laurylsulfonate, phosphate esters, alcohol ether sulfates, alkylarylpolyethersulfates, polystyrenesulfonic acid, pyrophosphate or petroleum sulfonates as anionic substances, polyethyleneimines or dodecyltrimethylammonium chloride as cationic surfactants and also alkylaryloxypolyethoxyethanols, polyethylene glycols, nonylphenoxypolyglycidol, Polyvinyl alcohols, polyvinylpyrrolidone or nonylphenol as nonionic substances. The particle sizes of the magnetic colloids shown with the aid of the abovementioned preparation methods depend, as is generally known, on various test parameters such as the iron salt ratio, the base concentration, the base type (NaOH, NH 3 ), the pH, the temperature and the aftertreatment temperature from. The magnetic colloids suitable for the compositions of the invention have a particle size of 5-800 nm, preferably one of 20-200 nm. This ensures that the magnetic colloids are present in the subsequent encapsulation in the polymer matrix in colloidally disperse form. By targeted addition of the appropriate amounts of the respective colloid or ferrofluid, the magnetic properties and thus the magnetic separation behavior can be controlled in a targeted manner. The concentrations of the magnetic colloids in the polymer solution are generally from 10 to 40% by weight.
Um eine möglichst homogene bzw. feine Dispersion der Magnetteilchen in der Polymerlösung zu erhalten, wird vorteilhafterweise vor der inversen Suspension die Magnetkolloid-Polymermischung kurzzeitig mit Hilfe eines Ultraschallfingers oder in einem Ultraschallbad beschallt. Für die Synthese der erfindungsgemäßen Polymerträger kommen je nach Polymerart die Suspensionspräzipitation und die ionogene Suspensionsvernetzung zum Einsatz. Bei der Suspensionspräzipitation werden die Polymere in solchen Lösungsmitteln gelöst, die nur in der Hitze als Lösungsmittel fungieren, bei niedrigeren Temperaturen oder Raumtemperatur jedoch nicht. In der Praxis hat sich dabei bewährt, die Polymeren zunächst bei höheren Temperaturen in dem jeweiligen Lösungsmittel zu lösen und nach Zugabe und Vermischung des Magnetkolloides diese Mischung in eine vorgeheizte organische, nicht mit Wasser mischbare Phase unter Rühren zu suspendieren. Diese Suspension wird dann einige Minuten bei der erhöhten Temperatur weitergerührt und anschließend auf niedrigere Temperatur heruntergekühlt. Wahlweise kann, um den Prozeß zu beschleunigen, auch ein Eiswasserbad benutzt werden. Beim anschließenden Abkühlungsprozeß auf Raumtemperatur bzw. Temperaturen < 40°C fallen die Polymere als sphärische Partikel aus. Beispiele für diese Synthesetechnologie in Frage kommenden Polymer-Lösungsmittelsysteme sind: Stärke-Wasser, Collagen-Wasser, Cellulose-ZnCl2-Lösung, Polyvinylalkohol-Dimethylsulfoxyd, Polyvinylalkohol-Ethylenglykol, Polyvinylalkohol-Glycerin, Gelatine-Wasser, Agarose-Wasser. Als organische Phase werden durchweg organische Lösungsmittel wie chlorierte Kohlenwasserstoffe, Xylol, Toluol, Benzol oder Öle in Form von Pflanzen-, Silikon- oder Mineralölen, die eine Viskosität zwischen 40 und 150 cp aufweisen, verwendet. Bei den Silikonölen liegen die Viskositäten im Bereich von 200 bis 800 cp. Die Volumenverhältnisse Polymerphase zu organischer Phase liegen durchweg zwischen 0,1 und 0,2.In order to obtain the most homogeneous or fine dispersion of the magnetic particles in the polymer solution, advantageously before the inverse suspension, the magnetic colloid polymer mixture is sonicated for a short time with the aid of an ultrasonic finger or in an ultrasonic bath. Depending on the type of polymer, suspension precipitation and ionic suspension crosslinking are used for the synthesis of the polymer carriers according to the invention. In suspension precipitation, the polymers are dissolved in solvents which act as solvents only in the heat, but not at lower temperatures or room temperature. In practice, it has proven useful to first dissolve the polymers in the respective solvent at elevated temperatures and, after addition and mixing of the magnetic colloid, to suspend this mixture with stirring in a preheated organic, water-immiscible phase. This suspension is then stirred for a few minutes at the elevated temperature and then cooled down to a lower temperature. Optionally, to speed up the process, an ice water bath can also be used. In the subsequent cooling process to room temperature or temperatures <40 ° C, the polymers precipitate out as spherical particles. Examples of polymer technology solvent systems which may be used in this synthesis technology are: starch-water, collagen-water, cellulose-ZnCl 2 solution, polyvinyl alcohol-dimethyl sulfoxide, polyvinyl alcohol-ethylene glycol, polyvinyl alcohol-glycerol, gelatin-water, agarose-water. As the organic phase, organic solvents such as chlorinated hydrocarbons, xylene, toluene, benzene or oils in the form of vegetable, silicone or mineral oils having a viscosity between 40 and 150 cp are used throughout. For the silicone oils, the viscosities are in the range of 200 to 800 cp. The volume ratios of polymer phase to organic phase are consistently between 0.1 and 0.2.
Für die Synthese der Polymerträger mittels des inversen Suspensionspräzipitations-Verfahrens werden in der Regel 1 bis 25%ige, vorzugsweise 5 bis 10 Gew.-%ige Polymerlösungen verwendet. Die Konzentrationen an zugesetztem Magnetkolloid beträgt in der Regel 10 bis 40 Gew.-%, bezogen auf die Polymerphase.For the synthesis of polymer carriers by the inverse suspension precipitation method usually 1 to 25%, preferably 5 to 10 wt .-% polymer solutions used. The concentrations of added magnetic colloid is usually 10 to 40 wt .-%, based on the polymer phase.
In bezug auf die Qualität der Suspensionen und Teilchengeometrien (Kugelform) hat sich für alle erfindungsgemäßen Polymerträger als vorteilhaft herausgestellt, den organischen Phasen ein bis drei verschiedene oberflächenaktive Substanzen zuzugeben. Diese werden vorzugsweise aus der Gruppe Polyethylen-propylenoxid-Blockcopolymere, Polyoxyethylenaddukte, Polyoxyethylensäuren, Alkylsulfosuccinate, Sorbitan-Fettsäureester, Polyoxyethylensorbitolester, Fettalkoholpolyethylenglykolether, Alkylphenoxypolyethoxyethanole, Fettalkoholglycolether-Phosphorsäureester, Sucrosestearat-Palmitatester, Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylensorbitan-Fettsäurester und/oder Polyglycerinester ausgewählt. Substanzen dieser Art sind u. a. auch unter der Warenbezeichnung Hostaphat, Isofol, Synperonic, Span, Tween, Brij, Plurafac, Lutensol, Aerosol OT, Hypermer, Myrj, Triton, Arlacel, Dehymuls, Eumulgin, Renex, Lameform, Pluronic oder Tetronic im Handel erhältlich. Um die während des Suspensionsprozesses gebildeten Polymertröpfchengröße zu kleinen Werten hin zu verschieben (< 5 μm), hat es sich als vorteilhaft erwiesen, der organischen Phase 0,05–15 Gew.-%, vorzugsweise 0,5–5 Gew.-%, eines oder mehrerer der oben beschriebenen Tenside zuzugeben.In with regard to the quality of the suspensions and particle geometries (Spherical shape) has for all invention Polymer carrier proved to be beneficial to the organic Phases one to three different surfactants admit. These are preferably selected from the group of polyethylene-propylene oxide block copolymers, Polyoxyethylene adducts, polyoxyethylene acids, alkylsulfosuccinates, Sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene sorbitol esters, fatty alcohol polyethylene glycol ethers, Alkylphenoxypolyethoxyethanols, fatty alcohol glycol ether phosphoric acid esters, Sucrose stearate palmitate ester, polyoxyethylene alcohols, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters and / or polyglycerol esters. Substances of this Art are u. a. also under the trade name Hostaphat, Isofol, Synperonic, Span, Tween, Brij, Plurafac, Lutensol, Aerosol OT, Hypermer, Myrj, Triton, Arlacel, Dehymul, Eumulgin, Renex, Lameform, Pluronic or Tetronic commercially available. To the during the suspension process formed polymer droplet size To move to small values (<5 microns), it has to be advantageous proven, the organic phase 0.05-15 wt .-%, preferably 0.5-5% by weight of one or more of those described above Add surfactants.
Der Suspensionsvorgang wird üblicherweise mit Hilfe eines konventionellen KPG-Rührers ("KPG") oder eines Dispergierwerkzeuges bewerkstelligt. Für Teilchengrößen im Bereich von 20–500 μm genügen herkömmliche Propellerrührer mit Rührgeschwindigkeiten zwischen 600 und 1500 U/min. Teilchengrößen von < 10 μm werden in der Regel unter Benutzung von Dispergierwerkzeugen, die nach den Rotor-Stator-Prinzip funktionieren (z. B. Ultra-Turrax, IKA-Werke, BRD) mit Rührgeschwindigkeiten von > 2000 U/min. erreicht.Of the Suspension process is usually using a conventional KPG stirrer ("KPG") or a dispersing tool accomplished. For particle sizes in the range of 20-500 microns satisfy conventional propeller stirrer with stirring speeds between 600 and 1500 U / min. Particle sizes of <10 microns are usually using dispersing tools that use the rotor-stator principle function (eg Ultra-Turrax, IKA-Werke, FRG) with stirring speeds from> 2000 rpm. reached.
In Erweiterung der oben dargelegten erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren können auflösbare Polymerträger überraschenderweise auch dadurch hergestellt werden, daß wäßrige Lösungen positiv oder negativ geladener Polymere in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase suspendiert und durch Zugabe entgegengesetzt geladenen Substanz während des Suspensionsvorganges zu sphärischen Polymerpartikeln verfestigt werden. Beispiele für solche, die Erfindung jedoch in keiner Weise einschränkende Stoffe sind: Polyacrylsäure, Alginate, carboxylierte Polysaccharide, Chitosan, Nukleinsäuren, Proteine und Polyaminosäuren. Die Herstellung dieser Polymerträger geschieht üblicherweise mittels einer 1 bis 10%ige (w/v) wäßrigen Lösung. Für die Synthese magnetischer Teilchen kann der Polymerlösung ein entsprechendes Magnetkolloid gemäß den obigen Angaben zugemischt werden. Während der anschließenden Suspension in der organischen, mit Wasser nicht-mischbaren Phase werden durch Zugabe der entgegengesetzt geladenen Substanzen, die suspendierten Polymertröpfchen zu festen, sphärischen Partikeln vernetzt. Für diese Art Polymerträger kommen z. B. folgende Vernetzer-Polymer-Kombinationen zur Anwendung: Kalziumchlorid-Polymethacrylsäure, Kalziumchlorid-Polyacrylsäure, Kalziumchlorid-Alginat, Kalziumchlorid-Nukleinsäure, Kalziumchlorid-Polyglutaminsäure, Polyphosphat-Polyethylenimin, Polyphosphat-Chitosan, Spermidin-Nukleinsäure, Spermin-Nukleinsäure, Spermin-Polypeptide, Protamin-Polyglutaminsäure in Frage. Als organische Phase haben sich besonders Pflanzen- und Siliconöle mit einer Viskosität zwischen 40 und 800 cp bewährt. Zur Herstellung magnetischer Polymerträger werden den Polymerlösungen analog den oben beschriebenen Verfahren solche Ferrofluide zugemischt, die mit einer nicht geladenen oberflächenaktiven Substanz stabilisiert sind.In extension of the compositions and methods of the invention set forth above, it is possible to prepare dissolvable polymer supports by suspending aqueous solutions of positively or negatively charged polymers in a water-immiscible organic phase and solidifying them by adding oppositely charged substance during the suspension process to form spherical polymer particles. Examples of such, but the invention are in no way limiting substances: polyacrylic acid, alginates, carboxylated polysaccharides, chitosan, nucleic acids, proteins and polyamino acids. The preparation of these polymer carrier usually takes place by means of a 1 to 10% (w / v) aqueous solution. For the synthesis of magnetic particles, the polymer solution may be a corresponding magnetic colloid id be mixed according to the above information. During the subsequent suspension in the organic, water-immiscible phase, by adding the oppositely charged substances, the suspended polymer droplets are crosslinked to form solid, spherical particles. For this type of polymer carrier z. For example, the following crosslinker-polymer combinations are used: calcium chloride-polymethacrylic acid, calcium chloride-polyacrylic acid, calcium chloride alginate, calcium chloride nucleic acid, calcium chloride-polyglutamic acid, polyphosphate-polyethyleneimine, polyphosphate-chitosan, spermidine nucleic acid, spermine nucleic acid, spermine polypeptides , Protamine polyglutamic acid in question. As the organic phase, especially vegetable and silicone oils having a viscosity of between 40 and 800 cp have proven to be useful. For the preparation of magnetic polymer carriers, the polymer solutions are admixed, analogously to the processes described above, with those ferrofluids which are stabilized with an uncharged surface-active substance.
Die Herstellung der sphärischen Partikel geschieht während der Suspension der Polymerlösung durch Zugabe eines geladenen Vernetzers, der die Polymertröpfchen innerhalb weniger Minuten in feste, perlförmige Partikel umwandelt. Es fallen je nach Rührbedingungen und Polymerkonzentration Partikel mit einer Größe zwischen 5 und 500 μm an. Durch Erhöhung der Rührgeschwindigkeit (500 bis 3000 U/min) und Verringerung der Polymerkonzentrationen (< 5 Gew.-%) lassen sich die Teilchen zu kleineren Größen hin verschieben; umgekehrt werden die Partikel mit abnehmender Rührgeschwindigkeit und steigender Polymerkonzentration entsprechend vergrößert.The Production of the spherical particles happens during the suspension of the polymer solution by adding a charged Crosslinker, the polymer droplets within less Minutes into solid, bead-shaped particles. It's falling Depending on the stirring conditions and polymer concentration particles with a size between 5 and 500 microns. By increasing the stirring speed (500 to 3000 rpm) and reducing the polymer concentrations (<5% by weight) the particles shift to smaller sizes; the particles are reversed with decreasing stirring speed and increasing polymer concentration increased accordingly.
Für
den Einsatz als Separationsmedien werden an die Polymerträger
im letzten Präparationsschritt Bioliganden gekoppelt, die
Biosubstanzen spezifisch zu binden in der Lage sind. Mit der Bezeichnung
"Bioliganden" werden im folgenden Antikörper, Antigene,
Zellrezeptoren, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Proteine,
Oligosaccharide, Oligonukleotide oder Enzymsubstrate definiert.
Diese trägergebundenen Bioliganden ermöglichen
nun die komplementäre Bindung der Biosubstanzen an den
Polymerträger, wobei unter "Biosubstanz" Antikörper,
Zellen, Bakterien, Antigene, Proteine, Toxine, Viren, Enzyme, Nukleinsäuren,
Ribonukleinsäuren zusammengefaßt werden. Die covalente
Kopplung der Bioliganden an die auflösbare Polymermatrix
geschieht dabei nach den bekannten Verfahren, die aus der Affinitätschromatographie
hinlänglich bekannt sind (vgl.
Für den Einsatz als Zellseparationsmedien werden als Bioliganden vor allem Antikörper gegen Zellrezeptoren ("cluster of differentiation") verwendet. Beispiele hierfür, die Erfindung jedoch in keiner Weise einschränkend, sind: CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD14, CD15, CD34, CD56, CD95 oder CD45. Über diese Bioliganden lassen sich beispielsweise T-Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Stammzellen, Tumorzellen, natürliche Killer oder Leukozyten an die Matrix binden. Für die zielgerichtete Applikation mittels Liganden-gekoppelter Polymerträger kommen vor allem die erfindungsgemäßen Polymerträger in Frage, die über funktionelle Gruppen in Form von Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen verfügen wie z. B. Polyacrylate, Collagen, Stärke, Gelatine, Agarose, Polyvinylalkohol, Polyaminosäuren oder Alginat.For their use as cell separation media are known as bioligands all antibodies against cell receptors ("cluster of differentiation") used. Examples of this, but the invention in no Restrictive are: CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD19, CD14, CD15, CD34, CD56, CD95 or CD45. About these bioligands For example, T cells, B lymphocytes, monocytes, granulocytes, Stem cells, tumor cells, natural killers or leukocytes bind to the matrix. For the targeted application Above all, ligand-coupled polymer carriers are used the polymer carrier according to the invention in Question about functional groups in the form of carboxyl, Hydroxyl or amino groups have such. B. polyacrylates, Collagen, starch, gelatin, agarose, polyvinyl alcohol, Polyamino acids or alginate.
Alternativ zu der direkten Anbindung der Zellen über die zellspezifischen Liganden (primäre anti-CD-Antikörper) kann die Zellanbindung auch über sekundäre Antikörper bewerkstelligt werden, die an die Träger covalent gebunden sind. Diese sekundären Antikörpern sind befähigt, eine Bindung mit dem Fc-Teil des primären Antikörpers einzugehen. Zur Zellseparation werden dazu die zu trennenden Zellen im ersten Schritt mit den primären Antikörper beschichtet und anschließend mit dem Sekundär-Antikörper-gekoppelten Träger inkubiert. Die sekundären Antikörper sind kommerziell erhältlich und werden analog den Verfahren für die primären Antikörper an die Polymermatrix gebunden. Die Beschichtung (coating) der Zellen mit primären Antikörpern ist aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt und kann von einem Fachmann auf diesem Gebiet jeder Zeit vorgenommen werden.alternative to the direct attachment of cells across the cell-specific Ligands (primary anti-CD antibodies) may be the Cell attachment also via secondary antibodies be accomplished covalently bound to the carrier are. These secondary antibodies are capable of a bond with the Fc portion of the primary antibody enter into. For cell separation, the cells to be separated in first step coated with the primary antibody and subsequently with the secondary antibody-coupled Carrier incubated. The secondary antibodies are commercially available and are analogous to the methods for the primary antibodies to the polymer matrix bound. The coating of the cells with primary antibodies is well known in the art and may be of be made by a person skilled in the art at any time.
Eine wichtige Erweiterung des oben beschriebenen Anwendungsspektrums vor allem im Hinblick auf die Zellabtrennung ergibt sich aus der Kopplung von Antikörpern bzw. Antikörper-Fragmenten, die gegen ein Tumorzellantigen bzw. -marker gerichtet sind. Dadurch eröffnet sich die Möglichkeit, Tumorzellen aus Gewebe- oder Blutproben zu isolieren, die nach entsprechender Ablösung von dem Polymerträger weiteren Tests, z. B. im Rahmen einer Frühdiagnostik, unterzogen werden können. Beispiele für solche, die Erfindung jedoch nicht einschränkende Tumormarker bzw. -Antigene sind: Caspase-8 (CASP-8), alpha-Fetoprotein (AFP), carzinoembryonales Antigen (CEA), tumorassoziiertes Transplantationsantigen (TATA), humaner Epidermis Rezeptor (HER-2), Onkofetales Antigen, tumorspezifisches Transplantationsantigen (TSTA), p53-Protein, Melanom-Antigene (MAGE-1, MAGE-B2, DAM-6, DAM-10), Mucin (MUC1), Helicose-Antigen (HAGE), humanes Papilloma Virus (HPV-E7), CD3, CD10, CD20, CD28, CD30, CD25, CD64, Interleukin-2, Interleukin-9, Mamma-CA-Antigen, Prostata-spezifisches Antigen (PSA), GD2-Antigen, Melanocortin-Rezeptor (MCIR), 138H11-Antigen. Die entsprechenden Antikörper können dabei wahlweise als monoklonale oder polyklonale Antikörper, als Antikörper-Fragmente (Fab, F(ab')2), als Einzelkettenmoleküle (scFv), als „Diabodies", „Triabodies", „Minibodies" oder bispezifische Antikörper eingesetzt werden.An important extension of the range of applications described above, especially with regard to cell separation, results from the Coupling of antibodies or antibody fragments which are directed against a tumor cell antigen or marker. This opens up the possibility of isolating tumor cells from tissue or blood samples which after appropriate detachment from the polymer carrier further tests, eg. B. in the context of early diagnosis, can be subjected. Examples of such non-limiting tumor markers or antigens are caspase-8 (CASP-8), alpha-fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), tumor-associated transplantation antigen (TATA), human epidermis receptor (HERA). 2), oncofetal antigen, tumor-specific transplantation antigen (TSTA), p53 protein, melanoma antigens (MAGE-1, MAGE-B2, DAM-6, DAM-10), mucin (MUC1), helicose antigen (HAGE), human Papilloma virus (HPV-E7), CD3, CD10, CD20, CD28, CD30, CD25, CD64, interleukin-2, interleukin-9, mammary CA antigen, prostate-specific antigen (PSA), GD2 antigen, melanocortin Receptor (MCIR), 138H11 antigen. The corresponding antibodies can be employed either as monoclonal or polyclonal antibodies, as antibody fragments (Fab, F (ab ') 2 ), as single chain molecules (scFv), as "diabodies", "triabodies", "minibodies" or bispecific antibodies ,
Neben der spezifischen Bindung der Biosubstanzen über gekoppelte Bioliganden hat sich überraschenderweise gezeigt, daß auch mit geladenen Gruppen versehene Polymerträger zur Abtrennung von Biosubstanzen eignen. Dazu werden in die nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellten Träger geladene Substituenten z. B. in Form von primären, sekundären oder tertiären Aminogruppen als kationische oder Sulfonsäure- oder Carboxylgruppen als anionische Substituenten eingeführt. Dazu werden die Träger nach den bekannten Verfahren entweder durch Addition der entsprechenden Aminoverbindung (primäre, sekundäre oder tertiäre Amine oder Ammoniak) an die epoxidierten Träger oder durch direkte Umsetzung von Hydroxylgruppen-tragenden Polymerträgern mit einer halogenierten, Aminofunktion-tragenden Verbindung (z. B. 2-Diethylamino-ethylchlorid) unter basischen Bedingungen hergestellt. Die Einführung anionischer Gruppen erfolgt, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, entweder durch Addition von Sulfaten oder Sulfiten (z. B. NaHSO3) an die epoxidierten Träger oder durch direkte Umsetzung von halogenierten Carbonsäuren (z. B. Chloressigsäure, Brompropionsäure) mit den Hydroxylgruppen-tragenden Polymeren. Die Abtrennung der Biosubstanzen mit Hilfe dieser geladenen Träger geschieht grundsätzlich in der Weise, daß zur Abreicherung von Zellen in der Regel kationische Polymerträger verwendet werden. Aufgrund der negativen Ladung der Zellmembran kommt es innerhalb weniger Minuten zu einer Bindung der Zellen an die positiv geladenen Polymerpartikel. Zur Abtrennung von Proteinen wird ein Inkubationspuffer gewählt, der die Proteine aufgrund des Isoelektrischen Punktes entweder mit einer positiven oder negativen Nettoladung versieht. Durch entsprechende Auswahl der Ladung des Trägers kann so ebenfalls eine Bindung des Proteins an den Träger herbeigeführt werden.In addition to the specific binding of the biosubstances via coupled bioligands, it has surprisingly been found that polymer carriers provided with charged groups are also suitable for the separation of biosubstances. For this purpose, in the support prepared by the method described above charged substituents z. B. introduced in the form of primary, secondary or tertiary amino groups as cationic or sulfonic acid or carboxyl groups as anionic substituents. For this purpose, the carriers are prepared by the known processes either by addition of the corresponding amino compound (primary, secondary or tertiary amines or ammonia) to the epoxidized carriers or by direct reaction of hydroxyl-carrying polymer carriers with a halogenated, amino-function-bearing compound (eg. 2-diethylamino-ethyl chloride) under basic conditions. The introduction of anionic groups takes place, as known to the person skilled in the art, either by addition of sulfates or sulfites (eg NaHSO 3 ) to the epoxidized carriers or by direct reaction of halogenated carboxylic acids (eg chloroacetic acid, bromopropionic acid) the hydroxyl group-carrying polymers. The separation of the biosubstances with the aid of these charged carriers is basically done in such a way that cationic polymer carriers are generally used to deplete cells. Due to the negative charge of the cell membrane, the cells bind to the positively charged polymer particles within a few minutes. For separation of proteins, an incubation buffer is chosen, which provides the proteins with either a positive or negative net charge due to the isoelectric point. By appropriate selection of the charge of the carrier, a binding of the protein to the carrier can thus likewise be brought about.
Nach Abtrennung der üblicherweise mit aqua dest oder einer Pufferlösung gewaschenen Biosubstanz-gebundenen Polymerpartikel werden die ionogen vernetzten Matrizes durch Inkubation in einer Komplexbildnerlösung aufgelöst. Dies geschieht durch Komplexierung des ionogenen Vernetzers (z. B. Ca2+), woraus die Auflösung des Polymerträgers resultiert. Als Komplexbildner kommen die bekannten Verbindungen wie z. B. Nitrilotriessigsäure, Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA), Citrat, Dithiocarbamat, Hydroxychinolin üblicherweise als 0,1 bis 2 molare Lösungen zum Einsatz. Je nach Konzentration des Komplexbildners sowie Größe und Vernetzungsgrad des Polymerträgers reichen 3 bis 30 Minuten Inkubation zur vollständigen Auflösung der Partikel aus, wobei sich in der Regel kleinere Partikel (1–10 μm) schneller auflösen (1–5 Minuten) als größere (> 5 Minuten). Bei den nach dem Suspensionspräzipitationsverfahren hergestellten Polymerträgern erfolgt der Auflösungsprozeß durch eine Erwärmung auf 35°C. Je nach Polymertyp und Molgewicht des betreffenden Polymeren, reichen Temperaturen zwischen 30 und 40°C aus, um die Träger innerhalb eines Zeitraumes von 1 bis 5 Minuten vollständig aufzulösen. In der Regel lassen sich Polymerträger, bestehend aus einem Polymeren mit einer Molmasse von < 40 kDa, bei Temperaturen unterhalb < 35°C auflösen, wohingegen aus höheren Molmassen (> 40 kDa) gebildete Polymerträger längere Lösezeiten und höherer Temperaturen (> 35°C ) bedürfen. In bezug auf das Löseverhalten der verschiedenen Polymertypen ergibt sich grundsätzlich, dass Träger aus Stärke, Gelatine oder Collagen durchweg leichter löslich sind als z. B. solche aus Agarose oder Polyvinylalkohol. Um etwaige wärmebedingte Schädigungen der Zellen oder Biomoleküle während des wärmebedingten Auflösungsprozesses weitestgehend zu unterdrücken, hat sich überraschenderweise die Zugabe von Mono-, Di- oder Trisacchariden oder Polyolen und/oder Proteinen als sehr günstig erwiesen. Beispiele für solche präservierenden Zusätze sind: Glycerin, Inosit, Mannose, Sucrose, Glucose, Sorbit, Trehalose, Polyvinylalkohol, (Human/Rinder)Serum Albumin (HSA, BSA) und/oder Gelatine. Die Konzentrationen dieser Stoffe liegen durchweg im Bereich von 0,5 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Polymerträger-Lösung. Im Hinblick auf die Feinheit der Partikel ergeben sich durchweg analoge Zusammenhänge wie bei den ionogen vernetzten Trägern.After separation of the biosubstance-bound polymer particles usually washed with distilled water or a buffer solution, the ionogenically crosslinked matrices are dissolved by incubation in a complexing agent solution. This is done by complexing the ionic crosslinker (eg Ca 2+ ), which results in the dissolution of the polymer support. As complexing agents, the known compounds such. As nitrilotriacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citrate, dithiocarbamate, hydroxyquinoline usually as 0.1 to 2 molar solutions are used. Depending on the concentration of the complexing agent as well as the size and degree of crosslinking of the polymer carrier, 3 to 30 minutes of incubation are sufficient for complete dissolution of the particles, whereby smaller particles (1-10 μm) dissolve faster (1-5 minutes) than larger ones (> 5 minutes). In the polymer carriers prepared by the suspension precipitation method, the dissolution process is carried out by heating to 35 ° C. Depending on the polymer type and molecular weight of the polymer in question, temperatures between 30 and 40 ° C are sufficient to completely dissolve the carriers within a period of 1 to 5 minutes. As a rule, polymer carriers consisting of a polymer having a molecular weight of <40 kDa can be dissolved at temperatures below <35 ° C., whereas polymer carriers formed from higher molecular weights (> 40 kDa) allow longer dissolution times and higher temperatures (> 35 ° C.). require. With regard to the dissolving behavior of the different types of polymers, it basically results that starch, gelatin or collagen carriers are consistently more soluble than, for example, starch. As those of agarose or polyvinyl alcohol. Surprisingly, the addition of mono-, di- or trisaccharides or polyols and / or proteins has proved to be very favorable in order to suppress any possible heat-related damage to the cells or biomolecules during the heat-induced dissolution process. Examples of such preservative additives are: glycerol, inositol, mannose, sucrose, glucose, sorbitol, trehalose, polyvinyl alcohol, (human / bovine) serum albumin (HSA, BSA) and / or gelatin. The concentrations of these substances are consistently in the range of 0.5 to 5 wt .-%, based on the polymer carrier solution. With regard to the fineness of the particles, analogous contexts always result, as in the case of the ionogenically crosslinked supports.
Die Erfindung wird anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele, deren Angaben nicht einschränkend sind, erläutert.The Invention will be described with reference to subsequent embodiments, their details are not limiting explained.
Beispiel 1example 1
In 100 ml Silikonöl (Silikonöl AK 350; Wacker Chemie, BRD) werden unter Rühren 6,7 ml der Emulgatoren Hostaphat KL 340 N® (Hoechst, BRD) und Isofol 16 (CONDEA, BRD) sowie 13,3 ml des Emulgators Synperonic PE L62 (C. H. Erbslöh, BRD) eingetragen. Diese Mischung wird zur Homogenisierung einige Minuten gerührt (800 U/min). Danach werden unter Rühren 2 ml einer frisch bereiteten 1,5%igen Na-Alginatlösung (Sigma, BRD, medium viscosity) zugesetzt. Der Rührvorgang wird für 5 Minuten fortgesetzt; dem schließt sich die Zugabe von 7 ml einer wäßrigen 0.1 M CaCl2–Lösung unter Rühren an. Die Suspension wird 15 Minuten weitergerührt und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert und der Rückstand mehrfach mit einer ausreichenden Menge einer Aceton/Methanol-Mischung (1:1), Hexan und schließlich 1%iger CaCl2-Lösung gewaschen. Nach mehrstündiger Trocknung im Vakuum (0,1 mm Hg) fallen Partikel mit einer mittleren Teilchengröße von 28 um an (Meßmethodik: Streulicht/Laserbeugung, Malvern MasterSizer 2000, Malvern Instruments, BRD). Durch Inkubation mit 4 ml 0,5 M Na2-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) lösen sich die Partikel innerhalb von 5 Minuten vollständig auf.In 100 ml of silicone oil (silicone oil AK 350; Wacker Chemie, BRD) are added with stirring 6.7 ml of the emulsifiers Hostaphat KL 340 N ® (Hoechst, FRG) and Isofol 16 (CONDEA, Germany) and 13.3 ml of the emulsifier Synperonic PE L62 (CH Erbslöh, FRG) registered. This mixture is stirred for a few minutes (800 rpm) for homogenization. Then, with stirring, 2 ml of a freshly prepared 1.5% Na alginate solution (Sigma, BRD, medium viscosity) are added. Stirring is continued for 5 minutes; this is followed by the addition of 7 ml of an aqueous 0.1 M CaCl 2 solution with stirring. The suspension is stirred for 15 minutes and then centrifuged. The supernatant is decanted off and the residue is washed several times with a sufficient amount of an acetone / methanol mixture (1: 1), hexane and finally 1% CaCl 2 solution. After drying for several hours in vacuo (0.1 mm Hg), particles having an average particle size of 28 μm are obtained (measuring methodology: scattered light / laser diffraction, Malvern MasterSizer 2000, Malvern Instruments, FRG). By incubation with 4 ml of 0.5 M Na 2 -ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), the particles dissolve completely within 5 minutes.
Beispiel 2Example 2
Zur
Herstellung magnetischer Alginatpartikel wird der Ansatz aus Beispiele
1 verwendet. Dazu werden der Alginatlösung 0,8 ml eines
Ferrofluides zugesetzt, das nach einer Vorschrift von
Beispiel 3Example 3
1
g Agarose (Sigma, BRD) werden in 50 ml 90°C heißem
Wasser gelöst. Der Lösung werden bei 90°C
0,15 g Kobalt-Ferrit-Nanopartikel (CoFe2O4), die nach einer Vorschrift von
Die
Träger lassen sich zur Bestimmung apoptotischer Zellen
gemäß
Beispiel 4Example 4
8
ml einer essigsauren 5%igen (w/v) Chitosan-Lösung werden
mit 10 ml 10% (w/v), auf 70°C vorgewärmte Collagen-Lösung
(Collagen Typ I, Fluka, BRD), in der 4 ml Ferrofluid (
Beispiel 5Example 5
5 ml einer 10%igen (w/v) Collagen-Lösung (Collagen Typ I, Fluka, BRD) werden durch Erwärmen auf 70°C hergestellt und anschließend sterilfiltriert. 4 ml dieser Lösung werden tropfenweise in 80 ml auf 70°C vorgewärmtes Rapsöl (Vandemoorlebe, BRD), in dem 0,4% Eumulgin R035 (Henkel, BRD) und 0,2% Pluronic L61 (Erbslöh, BRD) gelöst sind, unter Rühren (KPG, 600 U/min) zugegeben. Nach 10 Minuten wird die Suspension mittels eines Eisbades auf 4°C unter weiterem Rühren herruntergekühlt und der Rührvorgang für weitere 30 Minuten fortgesetzt. Die resultierenden Mikropartikel werden in kaltem Aceton mittels eines Dispergierwerkzeuges (Ultra-Turrax T25, 10.000 U/min) 15 Minuten homogenisiert. Danach werden die Polymerträger mittels Zentrifugation (5000 U/min, 4°C, 5 min) von der Ölphase abgetrennt. Es folgt fünfmaliges Waschen mit kaltem Petroläther und kalter Aceton/Wassermischung (1:1); dem schließt sich eine fünfstündige Vakuumtrocknung (0,1 mm Hg) an. Es werden Teilchen mit einer mittleren Partikelgröße von 4.3 μm gewonnen.5 ml of a 10% (w / v) collagen solution (collagen type I, Fluka, FRG) are prepared by heating to 70 ° C and then sterile filtered. 4 ml of this solution are preheated dropwise in 80 ml to 70 ° C Rapeseed oil (Vandemoorlebe, FRG) containing 0.4% Eumulgin R035 (Henkel, FRG) and 0.2% Pluronic L61 (Erbslöh, FRG) are added with stirring (KPG, 600 rpm). After 10 minutes the suspension is brought to 4 ° C by means of an ice bath further stirred undercurrent and the stirring continued for another 30 minutes. The resulting Microparticles are dissolved in cold acetone by means of a dispersing tool (Ultra-Turrax T25, 10,000 rpm) homogenized for 15 minutes. After that the polymer carriers are centrifuged (5000 rpm, 4 ° C, 5 min) separated from the oil phase. It follows Wash five times with cold petroleum ether and cold acetone / water mixture (1: 1); this is followed by a five hours of vacuum drying (0.1 mm Hg). It become particles with an average particle size of 4.3 microns won.
200 mg des getrockneten Produktes werden mit 3 ml Stickstoff durchspültem 0,1 M Tris/10 mM EDTA-Puffer, pH 8.0, in dem 45 mg 2-Iminothiolan (Pierce, USA) gelöst sind, 3 Stunden bei 4°C und unter ständiger Stickstoffeinleitung (2 cm3/min) inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit Aceton/Äthanol-Lösung (1:1) und Eiswasser wird der Sulfhydrylgruppen-haltige Träger mit 20 mg m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimid, das in 3 ml 0,1 M Na-Phosphat/0,15 M NaCl/10 mM EDTA-Puffer, pH 7.5, gelöst ist, drei Stunden bei 10°C unter Stickstoffeinleitung umgesetzt. Es folgt mehrfaches Waschen mit eiskalter Aceton/Wasserlösung (1:1) und zweimaligem Waschen mit 0,1 M Na-Phosphat/0,15 M NaCl/10 mM EDTA-Puffer, pH 7.2. Die Kopplung von anti-CD8-IgG (Invitrogen, BRD) erfolgt anschließend über einen Zeitraum von 6 Stunden in 3 ml Waschpuffer, in dem 4,2 × 10–6 mM Antikörper gelöst sind. Zur Entfernung restlicher, unreagierter Sulfhydrylgruppen wird der gekoppelte Träger in 4 ml 2 mM Jodacetamid enthaltendem PBS-Puffer für eine Stunde bei 10°C inkubiert. Nach mehrfachem Waschen mit PBS-Puffer, pH 7.2, wird der Träger analog Beispiele 2 zur Isolierung von CD8+ T Zellen aus 2 ml Vollblut analog Beispiele 2 genutzt. Eine einminütige Erwärmung auf 35°C löst den Träger vollständig auf und gibt 0.98 × 106 CD8+ Zellen frei.200 mg of the dried product are dissolved in 3 ml of nitrogen-purged 0.1 M Tris / 10 mM EDTA buffer, pH 8.0, in which 45 mg of 2-iminothiolane (Pierce, USA) are dissolved at 4 ° C. for 3 hours and more continuously Nitrogen inlet (2 cm 3 / min) incubated. After washing several times with acetone / ethanol solution (1: 1) and ice-water, the sulfhydryl-containing carrier with 20 mg of m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide dissolved in 3 ml of 0.1 M Na phosphate / 0.15 M NaCl / 10 mM EDTA buffer, pH 7.5, is reacted for three hours at 10 ° C with introduction of nitrogen. This is followed by repeated washing with ice-cold acetone / water solution (1: 1) and washing twice with 0.1 M Na phosphate / 0.15 M NaCl / 10 mM EDTA buffer, pH 7.2. The coupling of anti-CD8 IgG (Invitrogen, Germany) is then carried out over a period of 6 hours in 3 ml of washing buffer in which 4.2 × 10 -6 mM antibody are dissolved. To remove residual, unreacted sulfhydryl groups, the coupled support is incubated in 4 ml of PBS buffer containing 2 mM iodoacetamide for one hour at 10 ° C. After repeated washing with PBS buffer, pH 7.2, the support is used analogously to Examples 2 for the isolation of CD8 + T cells from 2 ml of whole blood analogously to Examples 2. Warming to 35 ° C for one minute completely dissolves the carrier and releases 0.98 x 10 6 CD8 + cells.
Beispiel 6Example 6
Die
Herstellung erfolgt gemäß Beispiele 5. Nach Umsetzung
des Trägers mit 2-Iminothiolan und Aktivierung mit m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimid
analog Beispiel 5 werden die Träger mit 5 ml 0,1 M Na-Phosphat/0,15
M NaCl/10 mM EDTA-Puffer, pH 7.2, in dem 0,8 mg Streptavidin (Sigma, BRD)
gelöst sind, über einen Zeitraum von 12 h bei 4°C
inkubiert. Der gewonnene Träger ist nach entsprechender
Deaktivierung mit Ethanolamin gemäß Beispiel 2
zur Abtrennung biotinylierter Biomoleküle analog den bekannten
Verfahren (
Beispiel 7Example 7
Die
Herstellung des Collagen-Chitosan-Trägers erfolgt analog
Beispiel 4. Zur kovalenten Ankopplung von Bioliganden werden 200
mg des vakuumgetrockneten Trägers mit 3 ml Stickstoff durchspültem
0,1 M Tris-Puffer, pH 8.0, in dem 45 mg 2-Iminothiolan (Pierce,
USA) gelöst sind, 12 Stunden bei 4°C inkubiert.
Nach mehrfachem Waschen mit eiskaltem Aceton/Äthanol Lösung
und Eiswasser werden 3 ml 0,1 M Na-Phosphat-Puffer/0,15 M NaCl/10
mM EDTA, pH 7.4, in dem 20 mg m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimid
gelöst sind, zugesetzt und die Mischung für eine
Stunde bei 15°C zur Reaktion gebracht. Es folgt mehrfaches
Waschen mit kalter Aceton/Wasserlösung (1:1) und zweimaliges
Waschen mit eiskaltem 0,1 M Na-Phosphat-Puffer/0,15 M NaCl/10 mM
EDTA, pH 7.4. Die Kopplung von anti-CD56-IgG (Invitrogen, BRD) erfolgt
anschließend in 3 ml Waschpuffer, in dem 3.12 10–6 mM des Antikörpers gelöst
sind, über einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C.
Dem schließt sich die Deaktivierung mit Jodacetamid analog
Beispiel 5 an. Der Träger wird zur spezifischen Abtrennung
natürlicher Killerzellen aus unstimulierten mononuklearen
Zellen analog
Beispiel 8Example 8
Eine 10%ige Polyvinylalkohol-Lösung, Molmasse 88 kDa (Höchst AG, BRD), wird durch Erhitzen von 30 ml Ethylenglykol bei 150°C hergestellt. Die Lösung wird sodann auf 70°C heruntergekühlt und in 350 ml auf 70°C vorgeheiztes Rapsöl (Vandemoortele, BRD), in dem 0,8% (v/v) Span 83 und 0,5% (v/v) Dehymuls HRE und 2% (v/v) Tween 85 gelöst sind, unter Rühren (1000 U/min) suspendiert. Die Mischung wird 5 Minuten bei dieser Temperatur weitergerührt und danach in einem Wasserbad auf Raumtemperatur heruntergekühlt, wobei innerhalb von 10 Minuten die Polymerträger als feste, perlförmige Partikel ausfallen. Die Polymerphase wird mittels Zentrifugation abgetrennt und mehrfach abwechselnd mit je 50 ml Petrolether und Äthanol unter Zuhilfenahme eines jeweiligen Zentrifugationsschrittes gewaschen; dem schließt sich dreimaliges Waschen mit Eiswasser an. Nach 5stündiger Trocknung im Vakuum (0,1 mm Hg) fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 8,4 μm an. Danach erfolgt eine dreitägige Gefriertrocknung. 100 mg des gefriergetrockneten Polymerträgers werden in 3 ml 4 M NaOH-Lösung, in der 150 mg Bromessigsäure gelöst sind, über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 10°C umgesetzt. Es folgt mehrfaches Waschen abwechselnd mit Eiswasser und Äthanol/Eiswasser-Mischungen (1:1).A 10% polyvinyl alcohol solution, molecular weight 88 kDa (max AG, FRG), by heating 30 ml of ethylene glycol at 150 ° C produced. The solution is then cooled down to 70 ° C and Rapeseed oil (Vandemoortele, preheated to 350 ° F) in 350 ml FRG), in which 0.8% (v / v) Span 83 and 0.5% (v / v) Dehymuls HRE and 2% (v / v) Tween 85 are dissolved, stirring (1000 Rpm). The mixture is kept at this temperature for 5 minutes further stirred and then in a water bath to room temperature cooled down, wherein within 10 minutes the polymer carrier precipitate as solid, bead-shaped particles. The polymer phase is separated by centrifugation and alternately several times with 50 ml of petroleum ether and ethanol with the aid of a each centrifugation step washed; that concludes Wash three times with ice water. After 5 hours Drying in vacuo (0.1 mm Hg) drops magnetic particles with a average particle size of 8.4 microns. This is followed by a three-day freeze-drying. 100 mg of the freeze-dried polymer carrier are dissolved in 3 ml of 4 M NaOH solution, dissolved in the 150 mg of bromoacetic acid are at 10 ° C over a period of 4 hours implemented. It is followed by several washing alternately with ice water and ethanol / ice water mixtures (1: 1).
Dem
Produkt werden 3 ml 0,1 M MES-Puffer, pH 4.5, in dem 0,2 mM N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat
und 1 mM N-Hydroxysuccinimid gelöst sind, zugegeben. Die
Mischung wird für 30 Minuten bei 15°C leicht geschüttelt.
Danach wird der aktivierte Träger fünfmal mit
Eiswasser gewaschen und mit 3 ml 0,1 M MES-Puffer/0,15 M NaCl, pH
6.5, in dem 3,5·10–6 mM anti-CD34-IgG
(Invitrogen, BRD) gelöst sind, bei 4°C über
einen Zeitraum von 6 Stunden zur Reaktion gebracht. Dem schließt
sich eine 30minütige Deaktivierung mit Ethanolamin gemäß Beispiel
2 an. Nach mehrfachem Waschen mit eiskaltem PBS-Puffer/0,01% Triton
X-100, pH 7.2, werden die Träger mit 3 ml PBS-Puffer, pH
7.2, in dem 0,1% HSA und 0,8% Polyvinylalkohol (Mw 22 kDa) gelöst
sind, inkubiert. Die Träger lassen sich gemäß dem
Verfahren von
Beispiel 9Example 9
10
ml einer 10%igen (w/v) wäßrigen Polymethacrylsäure-Lösung
(Mw 9.500, Aldrich, BRD) werden mit 0,8 g Kobalt-Ferrit-Nanopartikel
gemäß Beispiel 3 vermischt und mit Hilfe eines
Hochleistungsultraschallfingers (s. Beispiel 3) über eine
Zeitraum von 2 Minuten unter Eiskühlung homogenisiert.
Die Suspension wird anschließend in 250 ml Xylol, in dem 0,4%
Span 60 (v/v) und 0,85% (v/v) Hypermer A 60 (Fa. ICI, UK) gelöst
sind, mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (Ultra-Turrax T25, 12000
U/min) bei Raumtemperatur suspendiert. Während des Dispergiervorgangs
werden tropfenweise 8,5 ml 0,5 M CaCl2-Lösung
zugetropft. Nach der Zugabe des ionogenen Vernetzers wird noch 20
Sekunden weiter suspendiert und die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Danach erfolgt die magnetische Abtrennung der Polymerphase
gemäß obigem Beispiel mit Hilfe eines Nd-B-Fe
Handmagneten. Die Magnetpartikelfraktion wird mehrfach mit Äthanol und
schließlich dreimal mit Eiswasser/2%CaCl2 gewaschen.
Nach fünfstündiger Trocknung im Vakuum (0,1 mm
Hg) fallen feste, sphärische Partikel mit einem mittleren
Teilchengröße von 3.4 um an. Die Polymerfraktion
wird anschließend drei Tage gefriergetrocknet. 250 mg des
gewonnenen Produktes werden mit 4 ml 0,05 M MES/0,15 M NaCl-Puffer,
pH 4.6, der 0,2 mM N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat
und 1 mM N-Hydroxysuccinimid gelöst enthält, über
einen Zeitraum von 30 Minuten bei 10°C unter leichtem Rühren inkubiert.
Es wird fünfmal mit Eiswasser unter Zuhilfnahme des oben
beschriebenen magnetischen Abtrennschrittes gewaschen. 6.2 × 10–6 mM anti-CD19-IgG (Invitrogen,
BRD), gelöst in 3 ml 0,01 MES-Puffer/0,15 M NaCl, pH 6.5,
werden sodann mit dem aktivierten Träger über
eine Zeitraum von 6 Stunden bei 4°C zur Reaktion gebracht.
Danach wird mit eiskaltem MES- Puffer/0,15 M NaCl/0,05 Triton X-100,
pH 6.5, mehrfach nachgewaschen. Das gewaschene Produkt wird anschließend
zur Abtrennung von B-Lymphocyten aus Vollblut analog dem bekannten
Verfahren (
Beispiel 10Example 10
1
g Cellulose (Fluka, BRD) werden in 50 ml 95°C heißer
2 M ZnCl2-Lösung gelöst.
Der Lösung werden bei 90° 0,2 g des nach dem von
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