DE102007061929A1

DE102007061929A1 - Modified polypeptide capable of lysing bacterial cell walls, useful as a medicament or diagnostic agent, has amino acid substitutions at protease cleavage sites that inhibit degradation by proteases

Info

Publication number: DE102007061929A1
Application number: DE102007061929A
Authority: DE
Inventors: Holger Grallert; Michael Forchheim
Original assignee: Profos AG
Current assignee: Hyglos Invest GmbH; Biomerieux SA
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2009-06-25

Abstract

Modified polypeptide (I) capable of lysing bacterial cell walls has amino acid substitutions at protease cleavage sites that inhibit degradation by proteases. Independent claims are also included for: (1) nucleic acid coding for (I); (2) expression vector comprising the nucleic acid; (3) host cell containing the nucleic acid or vector. ACTIVITY : Antibacterial. MECHANISM OF ACTION : Cell wall lysis.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität Zellwände von Bakterien zu lysieren, wobei das Polypeptid keine Caspase-, Enterokinase-, Faktor Xa, Granzyme B, Staphylococcus Peptidase I (V8 Protease) und/oder Thrombinschnittstelle aufweist. Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren mit einer Sequenz codierend für die erfindungsgemäßen Polypeptide.The The present invention relates to a modified polypeptide having biological activity cell walls of bacteria lysing the polypeptide without caspase, enterokinase, Factor Xa, Granzyme B, Staphylococcal Peptidase I (V8 Protease) and / or thrombin interface. The invention relates furthermore nucleic acids having a sequence coding for the polypeptides of the invention.

Pathogene Bakterien treten an vielen Stellen auf und verursachen enorme gesundheitliche Probleme durch Infektionen sowie hohe wirtschaftliche Kosten z. B. auch durch unerwünschten Bakterienbefall in der Nahrungsmittel-, Kosmetik- oder Umweltindustrie. Im Gesundheitswesen nehmen die Probleme aufgrund Antibiotika-resistenter Keime immer mehr zu, so dass händeringend nach Alternativen zu Antibiotika gesucht wird. In der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie wird zunehmend versucht, ohne die klassischen Konservierungsmittel auszukommen, die in der Bevölkerung immer weniger Akzeptanz finden. Als Lösung für diese Probleme bietet sich der Einsatz von Zellwand lysierenden Enzymen an, die auf natürliche Weise das Wachstum der unerwünschten Bakterien unterbinden und vorhandene Keime abtöten.pathogens Bacteria occur in many places and cause enormous health Problems caused by infections and high economic costs z. B. also by unwanted bacterial contamination in the food, Cosmetic or environmental industry. In healthcare, the problems take due to antibiotic-resistant germs becoming more and more, so much needed looking for alternatives to antibiotics. In the food and cosmetics industry is increasingly trying without the classic Preservatives get along in the population less and less accepted. As a solution for These problems are the use of cell wall lysierenden Enzymes that naturally increase the growth of the unwanted Prevent bacteria and kill existing germs.

Beispiele von Zellwand lysierenden Enzymen sind Endolysine, die aus Bakteriophagen, isoliert wurden. Bakteriophagen benutzen diese Enzyme am Ende ihres Vermehrungszyklus, um die innerhalb der Bakterienzelle gebildeten Bakteriophagen freizusetzen. Die Bakterienhülle wird dabei lysiert und das Wirtsbakterium auf diese Weise zerstört.Examples cell wall lysing enzymes are endolysins derived from bacteriophages, were isolated. Bacteriophages use these enzymes at the end of their life cycle Propagation cycle to those formed within the bacterial cell Release bacteriophages. The bacterial envelope is included lysed and destroyed the host bacterium in this way.

Ein weiteres Beispiel sind Enzyme, die der Bakteriophage am Anfang seines Vermehrungzyklus benötigt und in der Regel in Bakteriophagenschwanzproteinen lokalisiert sind. Diese Enzyme werden für den Aufbruch der Bakterienwand bei der Bakterieninfektion benötigt.One Another example are enzymes that the bacteriophage at the beginning of his Multiplication cycle is needed and usually in bacteriophage tail proteins are localized. These enzymes are for the departure the bacterial wall in the bacterial infection needed.

Ein drittes Beispiel sind Enzyme, die eine ähnliche Funktion und häufig auch eine sequenzielle Ähnlichkeit zu den Endolysinen aufweisen. Diese Enzyme sind die von Bakterien unter bestimmten Umständen gebildeten Autolysine, die zur Selbstlyse der Bakterien führen.One third example are enzymes that have a similar function and often a sequential similarity to the endolysins. These enzymes are those of bacteria autolysins formed in certain circumstances and used to Self-lysis of the bacteria lead.

Ein viertes Beispiel sind Enzyme, die ebenfalls von Bakterien gebildet werden und als Bakteriocine bekannt sind. Diese vier Gruppen von Zellwand lysierenden Enzyme werden bereits technisch eingesetzt und in Zukunft wohl noch an Bedeutung gewinnen. Ein Hauptanwendungsgebiet ist der medizinische Einsatz in der Prävention und Therapie, aber auch die Diagnostik von Bakterieninfektionen bei Mensch und Tier. Ein weiteres Feld ist die Anwendung in der Lebensmittel-, Umwelt- und Kosmetikindustrie zur Verhinderung eines unerwünschten Bakterienwachstums und zur Abtötung der Keime beispielsweise durch Desinfektion sowie der Bakteriennachweis.One Fourth example are enzymes that are also formed by bacteria and are known as bacteriocins. These four groups of Cell wall lysing enzymes are already used technically and in the future probably still gain in importance. A main application area is the medical use in prevention and therapy, but also the diagnosis of bacterial infections in humans and Animal. Another field is the application in the food, Environmental and cosmetics industry to prevent an undesirable Bacterial growth and to kill the germs, for example by disinfection and bacteria detection.

Praktisch alle Anwendungen der Bakterien lysierenden Enzyme stellen hohe Anforderungen an die Stabilität der eingesetzten Enzyme, damit sich ihr Einsatz wirtschaftlich lohnt. In der US 6,432,444 B1 wird zur Stabilisierung der Zellwand lysierenden Enzyme vorgeschlagen, z. B. einen stabilisierenden Puffer zu verwenden, um die optimale Enzymaktivität zu gewährleisten. Weiterhin wird der Zusatz von stabilisierenden Substanzen wie Reduktionsmittel, Metallchelatoren, Immuglobulinen, spezifischen Puffersalzen, physiologischen pH-Werten, Konservierungsmittel oder milden Detergentien vorgeschlagen.Practically all applications of the bacteria-lysing enzymes place high demands on the stability of the enzymes used, so that their use is economically worthwhile. In the US 6,432,444 B1 is proposed for stabilizing the cell wall lysing enzymes, for. B. to use a stabilizing buffer to ensure the optimal enzyme activity. Furthermore, the addition of stabilizing substances such as reducing agents, metal chelators, immunoglobulins, specific buffer salts, physiological pHs, preservatives or mild detergents is proposed.

Generell wird die Wirksamkeit von Proteinen häufig durch vorhandene Proteasen verringert. Generelle Strategien zur Erhöhung der Proteaseresistenz sind z. B. der Zusatz von Metallchelatoren, um Proteasen zu hemmen, die für ihre Aktivität Metallionen benötigen oder der Zusatz von speziellen Proteaseinhibitoren, wie sie zum Beispiel für Serinproteasen kommerziell erhältlich sind. Proteaseinhibitoren können zur Stabilität von Zellwand lysierenden Enzymen jedoch nur bedingt eingesetzt werden, weil sie auch andere essentielle Komponenten am Wirkort stören. Darüber hinaus sind spezifische Inhibitoren auch sehr teuer. Auch die Auswahl anderer Umgebungsbedingungen, in denen Proteasen weniger aktiv sind, ist in der Regel nicht möglich, da die Zellwand lysierenden Enzyme ganz ähnliche Bedingungen für ihre Aktivität brauchen wie die Proteasen. So arbeiten Zellwand lysierende Enzyme in einer wässrigen Umgebung und unter moderaten pH-Werten am besten, unter denen auch die Proteaseaktivität am größten ist. Die bekannten Stabilisierungsansätze sind für den Einsatz bei Zellwand lysierenden Enzymen nicht geeignet.As a general rule The effectiveness of proteins is often due to existing Proteases reduced. General strategies to increase the protease resistance are z. The addition of metal chelators, to inhibit proteases responsible for their activity Metal ions or the addition of special protease inhibitors, as commercially available, for example, for serine proteases are. Protease inhibitors may contribute to stability However, cell enzymes can only be used conditionally by cell wall lysing enzymes. because they also disturb other essential components at the site of action. In addition, specific inhibitors are also very expensive. Also, the selection of other environmental conditions in which proteases less active, is usually not possible because the cell wall lysing enzymes quite similar conditions for their activity need like the proteases. This is how cell wall lysing enzymes work in an aqueous environment Environment and under moderate pH values best, among which the protease activity is greatest. The known stabilization approaches are for not suitable for use in cell wall lysing enzymes.

Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zu Grunde, stabile Zellwand lysierende Enzyme zur Verfügung zu stellen.Therefore The present invention is based on the object, stable To provide cell wall lysing enzymes.

Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.The Task is defined by the in the claims Object solved.

Die nachfolgenden Abbildungen dienen der Erläuterung der Erfindung.The The following figures serve to explain the invention.

1 zeigt die Aminosäuresequenz der CHAP-Domäne (Aminosäure 1–154), der Linkerregion (unterstrichen, Aminosäure 155–193) und der Amidase-Domäne (Aminosäure 194–393) eines Endolysins aus PlyPitti26. Potentielle Schnittstellen für V8 Protease, die nach dem Aminosäurerest E schneidet, sind fett hervorgehoben und befinden sich an den Aminosäurepositionen 163, 179 und 189. Die Thrombinschnittstelle ist grau unterlegt und befindet sich an Position R167. 1 Figure 4 shows the amino acid sequence of the CHAP domain (amino acid 1-154), the linker region (underlined, amino acid 155-193) and the amidase domain (amino acid 194-393) of an endolysin from PlyPitti26. Potential cleavage sites for V8 protease that cleave after amino acid residue E are highlighted in bold and located at amino acid positions 163, 179, and 189. The thrombin interface is shaded gray and is located at position R167.

2 zeigt das Ergebnis eines Proteaseverdaus und anschließendem Aktivitätstest von nicht modifiziertem PlyPitti26 mit den Proteasen Thrombin und V8 Protease. 2A zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel mit Proben von nicht modifizeirtem PlyPitti26 nach einen Verdau mit Thrombin (T), V8 Protease (V8) und einem Kontrollverdau mit Plasmin (P), für das keine Schnittstelle existiert. Unverdautes PlyPitti26 ist mit „-„ gekennzeichnet. M bezeichnet Molekulargewichtsstandards mit den am Rand angegebenen Proteingrößen in kDa. Am rechten Rand angegeben sind die Positionen der Banden für das Fragment N-terminal von der Thrombinschnittstelle (CHAP-Domäne), das Fragment C-terminal von der Schnittstelle (Ami-CBD) und die Bande vom zugesetzten Thrombin. 2B zeigt das Ergebnis eines Flüssiglysetests zur Bestimmung der spezifischen Aktivitäten von verdautem und nicht verdautem nicht modifiziertem PlyPitti26. Die Bakterienzelllyse wird über eine Lichtstreuungsmessung im Photometer verfolgt. Es sind die Lysekurven für unverdautes PlyPitti26 (___), Plasmin verdautes (-----) sowie mit Thrombin (_._.) oder V8 Protease (_.._..) verdautes Endolysin dargestellt. 2 shows the result of a protease digestion and subsequent activity test of unmodified PlyPitti26 with the proteases thrombin and V8 protease. 2A Figure 4 shows an SDS-polyacrylamide gel with samples of unmodified PlyPitti26 after digestion with thrombin (T), V8 protease (V8) and a control digest with plasmin (P) for which no interface exists. Undigested PlyPitti26 is marked with "-". M denotes molecular weight standards with the protein sizes given in kDa at the edge. The positions of the bands for the fragment N-terminal of the thrombin interface (CHAP domain), the fragment C-terminal of the interface (Ami-CBD) and the band of the added thrombin are indicated on the right-hand edge. 2 B shows the result of a liquid lysis test to determine the specific activities of digested and undigested unmodified PlyPitti26. The bacterial cell lysis is monitored by a light scattering measurement in the photometer. The lysis curves for undigested PlyPitti26 (___), plasmin digested (-----), and thrombin (_._.) Or V8 protease (_.._ ..) digested endolysin are shown.

3 zeigt das Ergebnis eines Proteaseverdaus von modifiziertem und nicht modifiziertem CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA. 3A zeigt das Ergebnis eines Thrombinverdaus des nicht modifizierten CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA und eines modifizierten Staphylococcus Endolysins CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (Mutante 4 auf Tabelle 3). Das nicht modifizierte CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA besitzt eine singuläre Thrombinschnittstelle zwischen der CHAP- und der Amidase-Domäne an Position R167, das modifizierte Polypeptid einen Austausch von R nach A an Position 167. Die 3A zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel der beiden Enzymvarianten vor und nach dem Thrombinverdau: M – Molekulargewichtsmarker (Molekulargewichte in kDa am Rand angegeben); 1 – nicht modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA ohne Thrombin; 2 – nicht modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA nach Thrombinverdau; 3 – modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA ohne Thrombin; 4 – modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA nach Thrombinzugabe. 3 shows the result of protease digestion of modified and unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA. 3A shows the result of thrombin digestion of the unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA and a modified Staphylococcus endolysin CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (mutant 4 on Table 3). The unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA has a unique thrombin interface between the CHAP and the amidase domain at position R167, and the modified polypeptide has an exchange from R to A at position 167. The 3A shows an SDS-polyacrylamide gel of the two enzyme variants before and after thrombin digestion: M - molecular weight markers (molecular weights in kDa indicated at the edge); 1 - unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA without thrombin; 2 - unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA after thrombin digestion; 3 - modified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA without thrombin; 4 - Modified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA after Thrombin Addition.

3B zeigt das Ergebnis eines V8 Protease Verdaus des nicht modifizierten CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA und eines modifizierten Staphylococcus Endolysins CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (Mutante 4 auf Tabelle 3). Das nicht modifizierte CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA besitzt eine V8 Protease Schnittstelle zwischen der CHAP- und der Amidase-Domäne an Position E163, das modifizierte Polypeptid einen Austausch von E nach A an Position 163. Die 3B zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel der beiden Enzymvarianten vor und nach dem Thrombinverdau: M – Molekulargewichtsmarker (Molekulargewichte in kDa am Rand angegeben); 1 – nicht modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA ohne V8 Protease; 2 – nicht modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 15 min V8 Protease Verdau; 3 – nicht modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 60 min V8 Protease Verdau; 4 – modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA ohne V8 Protease; 5 – modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 15 min V8 Protease Verdau; 6 – modifiziertes CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 60 min V8 Protease Verdau. 3B shows the result of V8 protease digestion of the unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA and a modified Staphylococcus endolysin CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (mutant 4 on Table 3). The unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA has a V8 protease cleavage site between the CHAP and the amidase domain at position E163, the modified polypeptide has an E to A at position 163. The 3B shows an SDS-polyacrylamide gel of the two enzyme variants before and after thrombin digestion: M - molecular weight markers (molecular weights in kDa indicated at the edge); 1 - unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA without V8 protease; 2 - unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 15 min V8 protease digestion; 3 - unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 60 min V8 protease digest; 4 - modified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA without V8 protease; 5 - modified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 15 min V8 protease digestion; 6 - modified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA 60 min V8 protease digest.

4A zeigt die Aminosäuresequenz des modifizierten Endolysins aus dem Cl. difficile Phagen Φ CD119 (CD119). Die im Wildtyp vorhandene singuläre Caspase 1 Schnittstelle an Aminosäure D214 wurde zu E214 modifiziert, die singuläre Thrombinschnittstelle R87 zu K87 modifiziert. 4B zeigt die Aminosäuresequenz des modifizierten Endolysins aus dem Cl. difficile Phagen Φ 630. Die im Wildtyp vorhandene singuläre Caspase 1 Schnittstelle an Aminosäure D214 wurde zu E214 modifiziert. 4A shows the amino acid sequence of the modified endolysin from the Cl. difficile phage Φ CD119 (CD119). The unique caspase 1 interface to amino acid D214, which is present in wild type, was modified to E214, which modified the unique thrombin cleavage site R87 to give K87. 4B shows the amino acid sequence of the modified endolysin from the Cl. difficile phage Φ 630. The wild-type singular caspase 1 site at amino acid D214 was modified to E214.

5 zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich der Region der Thrombinschnittstelle von verschiedenen Staphylococcus aureus Endolysinen. Die Position R167 ist fett hervorgehoben. 5 Figure 4 shows an amino acid sequence comparison of the region of the thrombin interface of various Staphylococcus aureus endolysins. Position R167 is highlighted in bold.

6A bis D zeigt die Aminosäuresequenz des nicht modifizierten CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (A) und modifizietem CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (B bis D). 6A to D shows the amino acid sequence of unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (A) and modified CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (B to D).

7A zeigt die Aminosäuresequenz des modifizieten Endolysins aus dem Cl. difficile Stamm 630 mit einem Austausch von D214 zu E214. 7B zeigt die Aminosäuresequenz des modifizieten Cl. difficile Endolysins aus dem Phagen phi CD119 mit einem Austausch von R87 zu K87 und D214 zu E214. 7A shows the amino acid sequence of the modified endolysin from Cl. difficile strain 630 with an exchange of D214 to E214. 7B shows the amino acid sequence of the modified Cl. difficile endo lysine from phage phi CD119 with an exchange of R87 to K87 and D214 to E214.

Der Begriff „Polypeptid" oder „Protein" wie hier verwendet bezeichnet Peptide aus mindestens 8 Aminosäuren. Die Polypeptide können pharmakologisch oder immunologisch aktive Polypeptide oder für diagnostische Zwecke verwendete Polypeptide sein. bezeichnet ein Molekül mit einer Aneinanderreihung von mehr als 8 Aminosäuren.Of the The term "polypeptide" or "protein" as used herein denotes peptides of at least 8 amino acids. The polypeptides may be pharmacologically or immunologically active polypeptides or polypeptides used for diagnostic purposes. denotes a molecule with a juxtaposition of more than 8 amino acids.

Der Begriff „Zellwand lysierende Enzyme" wie hier verwendet bezeichnet Enzyme, die in der Lage sind, bakterielle Zellhüllen zumindest teilweise aufzubrechen oder so zu beschädigen, dass in der Folge eine Zelllyse oder zumindest ein bakteriostatischer Effekt auftritt. Insbesondere bezeichnet der Begriff Endolysine, Autolysine, Bakteriophagenschwanzproteine und Bakteriocine.Of the Term "cell wall lysing enzymes" as used herein refers to enzymes that are capable of bacterial cell envelopes at least partially break up or damage so that in the consequence a cell lysis or at least a bacteriostatic Effect occurs. In particular, the term endolysins, autolysins, Bacteriophage tail proteins and bacteriocins.

Der Begriff „Endolysin" wie hier verwendet bezeichnet Enzyme, die natürlicherweise von Bakteriophagen kodiert werden und die diese am Ende ihres Wirtszyklus herstellen, um die Wirtszelle zu lysieren und damit die Nachkommen freizusetzen. Endolysine sind aus mindestens einer enzymatisch aktiven Domäne (BAD) und einer nicht enzymatisch aktiven zellbindenden Domäne (CBD) aufgebaut. Die EADs können verschiedene Enzymaktivitäten aufweisen: N-Acetyl-Muramoyl-L-Alanin-Amidase (Amidase, z. B. Ami_2, Ami_5), (Endo)-Peptidase (z. B. CHAP), Transglykosylase, Glykosylhydrolase, (N-Acetyl)-Muramidase (Lysozyme), N-Acetyl-Glukosaminidase.Of the Term "endolysin" as used herein refers to enzymes, which are naturally encoded by bacteriophages and make these at the end of their host cycle to the host cell to lysieren and thus release the offspring. Endolysins are from at least one enzymatically active domain (BAD) and a Non-Enzymatically Active Cell-Binding Domain (CBD) built up. The EADs can have different enzyme activities N-acetyl-muramoyl-L-alanine amidase (amidase, eg Ami_2, Ami_5), (endo) -peptidase (eg CHAP), transglycosylase, glycosylhydrolase, (N-acetyl) -mutamidase (lysozyme), N-acetyl-glucosaminidase.

Der Begriff „Autolysin" wie hier verwendet bezeichnet bakterielle Peptidoglykanhydrolasen, die in bestimmten Situationen zu einer Selbstlyse der Bakterien führen. Funktionell und auch sequenziell sind Autolysine und Endolysine häufig verwandt. Verschiedene Domänen aus Endolysinen und Autolysinen können häufig modular kombiniert werden und bilden zum Teil funktionelle Chimären.Of the Term "autolysin" as used herein refers to bacterial Peptidoglycanhydrolases, which in certain situations to a Self-lysis of the bacteria lead. Functional and sequential Autolysins and endolysins are often related. Various Domains of endolysins and autolysins can often combined in a modular way and partly functional Chimeras.

Der Begriff „Bakteriophagenschwanzprotein" wie hier verwendet bezeichnet Phagenstrukturproteine, die am Anfang des Replikationszyklus des Bakteriophagen bei der Infektion die Funktion erfüllen, an Rezeptoren auf der Bakterienoberfläche zu binden und dabei über ihre enzymatische Funktion Komponenten der Zelloberfläche lysieren. Die entsprechenden Bakteriophagenproteine müssen nicht immer im Phagenschwanz lokalisiert sein, sondern können bei schwanzlosen Phagen auch direkt am Phagenkopf sitzen.Of the Term "bacteriophage tail protein" as used herein refers to phage structure proteins at the beginning of the replication cycle of the bacteriophage at the infection fulfill the function to bind to receptors on the bacterial surface and thereby via their enzymatic function components of the cell surface lyse. The corresponding bacteriophage proteins must not always localized in phage tail but can in brushless phages also sit directly on the phage head.

Der Begriff „Bakteriocin" wie hier verwendet bezeichnet proteinogene Toxine, die von Bakterien abgesondert werden, um das Größenwachstum ähnlicher Bakteriengattungen zu inhibieren. Sie bestehen aus einer Zellwand bindenden Domäne, einer Translokationsdomäne und aus dem „killing factor". Die in diesem Zusammenhang enthaltene Gruppe der Bakteriocine greift dabei bakterielle Membranen an. Beispiele sind Colicin, Microcin, Nisin, Epidermin und Lantibiotika (lanthioninhaltige Antibiotika).Of the Term "bacteriocin" as used herein refers to proteinogenic Toxins secreted by bacteria are more similar to the size growth To inhibit bacterial genera. They consist of a cell wall binding domain, a translocation domain and from the "killing factor." The included in this context Group of bacteriocins attack bacterial membranes. Examples are Colicin, Microcin, Nisin, Epidermin and Lantibiotika (lanthioninhaltige Antibiotics).

Der Begriff bakterielle „Zellwand" wie hier verwendet bezeichnet alle Komponenten, die die äußere Zellhülle der Bakterien aufbauen und so deren Unversehrtheit garantieren. Insbesondere ist darunter zu verstehen das Peptidoglykan, die äußere Membran der gram-negativen Bakterien mit dem Lipopolysaccharid, die Bakterienzellmembran, aber auch zusätzliche auf das Peptidoglykan aufgelagerte Schichten wie Kapseln, Schleime oder äußere Proteinschichten.Of the Term bacterial "cell wall" as used herein all the components that make up the outer cell shell build up the bacteria and thus guarantee their integrity. In particular, it is understood to mean the peptidoglycan, the outer one Membrane of Gram-negative bacteria with the lipopolysaccharide, the bacterial cell membrane, but also additional to that Peptidoglycan deposited layers such as capsules, mucus or outer Protein layers.

Der Begriff „Protease" wie hier verwendet bezeichnet ein Enzym, das in der Lage ist, Proteine und/oder Peptide hydrolytisch zu spalten.Of the Term "protease" as used herein refers to an enzyme which is capable of hydrolytically cleaving proteins and / or peptides.

Der Begriff „Domäne" wie hier verwendet bezeichnet einen Teilbereich einer Proteinsequenz, der entweder funktionell und/oder strukturell definiert ist. Domänen können aufgrund von Homologien häufig sehr gut über entsprechende Suchprogramme vorhergesagt werden, die sich auf entsprechende Datenbanken mit konservierten Domänen stützen (z. B. Conserved Domgin Database (CDD) an der NCBI ( Marchler-Bauer et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192–6 ), Pfam ( Finn et al., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247–D251 ) oder SMART ( Schultz et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864, Letunic et al., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257–D260 ).As used herein, the term "domain" refers to a portion of a protein sequence that is either functionally and / or structurally defined. "Domains can often be very well predicted based on homology through appropriate search engines that rely on corresponding databases of conserved domains (e.g. B. Conserved Domgin Database (CDD) at the NCBI ( Marchler-Bauer et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192-6 ), Pfam ( Finn et al., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247-D251 ) or SMART ( Schultz et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, Letunic et al., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257-D260 ).

Der Begriff „Wildtyp" wie hier verwendet bezeichnet die Proteinsequenz, die noch bestimmte Proteaseschnittstellen beinhaltet. Es kann sich dabei um Proteinsequenzen handeln so wie sie natürlicherweise in einem Bakteriophagen, Prophagen oder Bakterium vorkommen. Zusätzlich bezeichnet der Begriff alle in den Datenbanken vorkommenden Sequenzen von Zellwand lysierenden Enzymen, die noch bestimmte Proteaseschnittstellen enthalten, auch wenn die Sequenzen bereits gegenüber natürlich vorkommenden Proteinen verändert wurden.Of the Term "wild type" as used herein refers to the protein sequence, which still contains certain protease interfaces. It may be protein sequences are as they are naturally occur in a bacteriophage, prophage or bacterium. additionally the term refers to all sequences occurring in the databases of cell wall lysing enzymes that still have specific protease cleavage sites even though the sequences are already opposite of course occurring proteins were changed.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität Zellwände von Bakterien zu lysieren, wobei das Polypeptid keine Caspase-, Enterokinase-, Faktor Xa, Granzyme B, Staphylococcus Peptidase I (V8 Protease) oder Thrombinschnittstelle enthält. Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße modifizierte Polypeptide, die gram positive Bakterien lysieren, wobei die Bakterien aus der Gruppe bestehend aus Clostridien, Bazillen, Listerien, Staphylokokken, Lactobazillen, Enterokokken, Aerokokken, Pediokokken, Streptokokken, Mycoplasmen und/oder Leuconostoc stammen können. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polypeptid ein Endolysin, ein Bakteriophagenschwanzprotein, ein Autolysin oder ein Bakteriocin.The The present invention relates to a modified polypeptide having biological activity cell walls of bacteria lysing the polypeptide without caspase, enterokinase, Factor Xa, Granzyme B, Staphylococcal Peptidase I (V8 Protease) or thrombin interface. Preferably the present invention modified according to the invention Polypeptides that lyse gram positive bacteria, the bacteria from the group consisting of clostridia, bacilli, listeria, staphylococci, Lactobacilli, enterococci, aerococci, pediococci, streptococci, Mycoplasma and / or Leuconostoc. Preferably if the polypeptide according to the invention is an endolysin, a bacteriophage tail protein, an autolysin or a bacteriocin.

Überraschenderweise stellte sich heraus, dass die Zellwand lysierenden Enzyme in ihrer Aminosäuresequenz so verändert werden können, dass eine erhöhte Proteasestabilität erreicht werden kann, ohne dass man stabilisierende Substanzen zusetzen muss. Es ist allgemein bekannt, dass verschiedene Proteasen an einer bestimmten Aminosäure die Polypeptidkette schneiden oder Aminosäuresequenzmotive für ihre enzymatische Aktivität benötigen. Proteaseschnittstellen in Proteinen können bei vorhandener Aminosäuresequenz mit geeigneten Sequenzanalyseprogrammen vorausgesagt werden (z. B. ExPASy PeptideCutter, Gasteiger et al., Protein Identification and Analysis Tools an the ExPASy Server in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) . So ergeben sich für ein Protein mittlerer Größe mit etwa 300 bis 400 Aminosäuren in der Regel weit mehr als 100 potentielle Proteaseschnittstellen, so dass eine Stabilisierung von Proteinen nur dadurch zu erreichen ist, dass die Schnittstellen einer Vielzahl von Proteasen verändert werden müssten. Das ist jedoch unpraktikabel, da das Protein seine Wirkung und Aktivität ab einer bestimmten Anzahl von Aminosäuremodifikationen verliert. Tatsächlich haben die Erfinder in vielen Zellwand lysierenden Enzymen Schnittstellen und Aminosäuresequenzmotive für Proteasen gefunden. Das erscheint überraschend, wenn man davon ausgeht, dass die Zellwand lysierenden Enzyme eigentlich auf eine hohe Stabilität hin evolviert sein müssten.Surprisingly, it has been found that the cell wall lysing enzymes can be changed in their amino acid sequence so that increased protease stability can be achieved without having to add stabilizing substances. It is well known that various proteases on a particular amino acid intersect the polypeptide chain or require amino acid sequence motifs for their enzymatic activity. Protease cleavage sites in proteins can be predicted in existing amino acid sequence with appropriate sequence analysis programs (eg ExPASy PeptideCutter, Gasteiger et al., Protein Identification and Analysis Tools to the ExPASy Server in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) , Thus, for a protein of average size with about 300 to 400 amino acids generally far more than 100 potential protease cleavage sites, so that a stabilization of proteins can only be achieved by the fact that the interfaces of a variety of proteases would have to be changed. However, this is impractical because the protein loses its activity and activity after a certain number of amino acid modifications. Indeed, in many cell wall lysing enzymes, the inventors have found cleavage sites and amino acid motifs for proteases. This seems surprising when one assumes that the cell wall lysing enzymes would actually have evolved to a high stability.

Überraschenderweise zeigte sich jedoch, dass die Schnittstellen und Aminosäuresequenzmotive für die Proteasen in geringer Anzahl, häufig sogar in singulärer Form in den Zellwand lysierenden Enzymen vorhanden sind. Dadurch ist eine Modifikation einiger weniger oder sogar nur einer Proteaseschnittstelle ausreichend, um die Stabilität der Zellwand lysierenden Enzyme zu erhöhen.Surprisingly However, it turned out that the interfaces and amino acid sequence motifs for the proteases in small numbers, often even in singular form in the cell wall lysing enzymes available. This is a modification of a few or even only one protease interface sufficient to maintain stability increase the cell wall lysing enzymes.

In der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise nur solche Proteaseschnittstellen verändert, die von bestimmten, potentiell am Wirkort der Zellwand lysierenden Enzyme vorhandenen Proteasen erkannt werden. Dabei werden die Aminosäuresequenzen der Zellwand lysierenden Enzyme so modifiziert, dass sie von den spezifischen Proteasen nicht mehr erkannt und folglich nicht mehr geschnitten werden. Das führt zu einer erhöhten Stabilität der Zellwand lysierenden Enzyme gegen am Wirkort vorhandene Proteasen. Somit wird ein proteasebedingter Verlust der Aktivität der Zellwand lysierenden Enzyme verhindert und eine längere Wirksamkeit erzielt.In Preferably, only such protease cleavage sites will be used in the present invention changed by certain, potentially at the site of action of Cell wall lysing enzymes are recognized by existing proteases. The amino acid sequences of the cell wall become lysing Enzymes so modified that they are not specific to the specific proteases be recognized more and therefore no longer be cut. Leading lysing to increased stability of the cell wall Enzymes against proteases present at the site of action. Thus becomes a proteasebedingter Loss of activity of the cell wall lysing enzymes prevented and achieved a longer effectiveness.

Es gibt eine Reihe von Proteasen, die für ihre enzymatische Aktivität eine spezifische Erkennungssequenz in ihren Substratproteinen benötigen. Einige Beispiele dafür sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. P1 bezeichnet die Position der Aminosäure, nach der geschnitten wird, P4, P3 und P2 sind die Positionen N-terminal vor der Schnittstelle P1. Die Bezeichnung P1' und P2' sind die Positionen C-terminal im Anschluss an P1. Das bedeutet, dass die Proteasen die Polypeptidkette zwischen P1 und P1' spalten. Die anstelle der Aminosäurereste aufgeführten Großbuchstaben stellen die international verwendeten Bezeichnungen der Aminosäurereste dar und sind allgemein bekannt. Werden in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung die Großbuchstaben verwendet, sind die entsprechenden Aminosäurerest gemeint. Tabelle 1 Protease Schnittstelle P4 P3 P2 P1 P1' P2' Caspase 1 F, W, Y oder L - H, A oder T D nicht P, E, D, Q, K oder R - Caspase 2 D V A D nicht P, E, D, Q, K oder R - Caspase 3 D M Q D nicht P, E, D, Q, K oder R - Caspase 4 L E V D nicht P, E, D, Q, K oder R - Caspase 5 L oder W E H D - - Caspase 6 V E H oder I D nicht P, E, D, Q, K oder R - Caspase 7 D E V D nicht P, E, D, Q, K oder R - Caspase 8 I oder L E T D nicht P, E, D, Q, K oder R - Caspase 9 L E H D - - Caspase 10 I E A D - - Clostripain (Clostridiopeptidase B) - - - R - Enterokinase D oder N D oder N D oder N K - - Faktor Xa A, F, G, I, L, T, V oder M D oder E G R - - Granzyme B I E P D - - Staphylococcus Peptidase I (V8 Protease) - - nicht E E - - Thrombin - - G R G - A, F, G, I, L, T, V oder M A, F, G, I, L, T, V, W or A P R nicht D, E nicht D, E There are a number of proteases that require a specific recognition sequence in their substrate proteins for their enzymatic activity. Some examples are listed in the following table. P1 indicates the position of the amino acid cut, P4, P3 and P2 are the positions N-terminal in front of the P1 interface. The designations P1 'and P2' are the positions C-terminal following P1. This means that the proteases cleave the polypeptide chain between P1 and P1 '. The capital letters listed in place of the amino acid residues represent the internationally used designations of amino acid residues and are well known. When capital letters are used in the description of the present invention, the corresponding amino acid residues are meant. Table 1 protease interface P4 P3 P2 P1 P1 ' P2 ' Caspase 1 F, W, Y or L - H, A or T D not P, E, D, Q, K or R - Caspase 2 D V A D not P, E, D, Q, K or R - Caspase 3 D M Q D not P, E, D, Q, K or R - Caspase 4 L e V D not P, E, D, Q, K or R - Caspase 5 L or W e H D - - Caspase 6 V e H or I D not P, E, D, Q, K or R - Caspase 7 D e V D not P, E, D, Q, K or R - Caspase 8 I or L e T D not P, E, D, Q, K or R - Caspase 9 L e H D - - Caspase 10 I e A D - - Clostripain (clostridiopeptidase B) - - - R - enterokinase D or N D or N D or N K - - Factor Xa A, F, G, I, L, T, V or M. D or E G R - - Granzyme B I e P D - - Staphylococcus peptidase I (V8 protease) - - not E e - - thrombin - - G R G - A, F, G, I, L, T, V or M. A, F, G, I, L, T, V, W or A P R not D, E not D, E

Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung ein modifiziertes Polypeptid mit der biologischen Aktivität Zellwände von Bakterien zu lysieren, wobei das erfindungsgemäße Polypeptid gegenüber der natürlicherweise vorkommenden eine oder mehrere Modifikationen in seiner Aminosäuresequenz an einer oder mehreren der in Tabelle 1 aufgezeigten Positionen aufweist, wobei die eine Modifikation oder die mehreren Modifikationen an den in Tabelle 1 aufgeführten Aminosäuren vorkommen. Dadurch erhöht sich die Stabilität des Polypeptids gegenüber der oder den Proteasen, deren Erkennungssequenz entsprechend geändert wurde.Preferably For example, the present invention relates to a modified polypeptide with the biological activity cell walls of bacteria to lyse, wherein the polypeptide of the invention towards the naturally occurring one or several modifications in its amino acid sequence at one or more of the positions shown in Table 1 wherein the one or more modifications occur on the amino acids listed in Table 1. This increases the stability of the polypeptide towards the protease (s), their recognition sequence was changed accordingly.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Aminosäure an der Position, nach der geschnitten wird (P1) durch eine andere geeignete Aminosäure ersetzt, so dass das erfindungsgemäße Polypeptid nicht mehr von der Protease geschnitten wird, dessen Erkennungsstelle entsprechend modifiziert wurde. Statt eines Aminosäureaustausches an Position P1 oder auch zusätzlich zu einem Austausch an Position P1 können weitere Aminosäurepositionen in der Erkennungsstelle vorzugsweise die in Tabelle 1 aufgeführten Positonen an P4, P3, P2, P1' und/oder P2', durch andere Aminosäuren ausgetauscht werden. Vorzugsweise werden pro Erkennungsstelle 6, 5, 4, 3, 2, 1 Sustitutionen vorgenommen, besonders bevorzugt insbesondere 1 bis 3 Substitutionen.In a preferred embodiment of the present invention, the amino acid at the position to be cut (P1) is replaced by another suitable amino acid so that the polypeptide according to the invention is no longer cut by the protease whose recognition site has been correspondingly modified. Instead of an amino acid exchange at position P1 or in addition to an exchange At position P1, further amino acid positions in the recognition site, preferably the positions listed in Table 1 at P4, P3, P2, P1 'and / or P2', can be exchanged for other amino acids. Preferably, 6, 5, 4, 3, 2, 1 institutions are made per recognition site, more preferably in particular 1 to 3 substitutions.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können in einem Polypeptid eine oder mehrere Proteaseschnittstellen wie zuvor beschrieben modifiziert werden.In another embodiment of the present invention may have one or more protease cleavage sites in a polypeptide modified as described above.

Wichtig ist, dass die erfindungsgemäße Proteinvariante nach der Mutation nicht nur eine höhere Proteaseresistenz aufweist, sondern auch weiterhin ihre Zellwand lysierende Aktivität behält. Die Aminosäuresubstitution wird daher wie nachfolgend beschrieben durchgeführt.Important is that the protein variant of the invention after the mutation not only a higher protease resistance but also continues its cell wall lysing activity reserves. The amino acid substitution therefore becomes as described below.

Im Stand der Technik sind eine Reihe von essentiellen Aminosäureresten bekannt, die für die Aktivität der Zellwand lysierenden Enzyme bekannt sind z. B. konservierte Cysteine und Histidine bei verschiedenen Amidasen oder CHAP Domänen. Die entsprechenden essentiellen Reste können auch mit Sequenzanalyseprogrammen gefunden werden, die speziell nach konservierten Domänen suchen (z. B. Conserved Domain Database (CDD) über NCBI ( Marchler-Bauer et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192–6 ), Pfam ( Finn et al., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247–D251 ) oder SMART ( Schultz et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864, Letunic et al., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257–D260 ).In the prior art, a number of essential amino acid residues are known, which are known for the activity of the cell wall lysing enzymes z. Conserved cysteines and histidines at various amidases or CHAP domains. The corresponding essential residues can also be found with sequence analysis programs that specifically search for conserved domains (eg, Conserved Domain Database (CDD) via NCBI ( Marchler-Bauer et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192-6 ), Pfam ( Finn et al., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247-D251 ) or SMART ( Schultz et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, Letunic et al., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257-D260 ).

Um die Stabilität, Struktur und Funktion der erfindungsgemäßen Polypeptide möglichst wenig zu destabilisieren, werden die auszutauschenden Aminosäuren aus der Proteaseerkennungssequenz durch Aminosäuren ersetzt, die von ihrer Struktur und Biochemie her möglichst nah verwandt sind und dennoch von der Protease nicht erkannt werden. Es ist mittlerweile allgemeines Fachwissen die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren in bestimmte Gruppen einzuteilen, die von ihrer Biochemie her unterschiedlich sind (z. B. saure, basische, hydrophobe, polare, aromatische Aminosäuren), innerhalb derer die Aminosäuren jedoch zueinander verwandt sind. Bevorzugte Austausche für die Aminosäuren in den erfindungsgemäßen Enzymen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die in Spalte 2 genannten Austauschmöglichkeiten stellen konservative Aminosäurealternativen dar, die entweder von ihrer Struktur her und/oder von ihrer Funktion her besonders ähnlich zur Aminosäure im Wildtyp sind. Dies sind besonders bevorzugte Austauschvarianten. Möglich sind jedoch für die erfindungsgemäßen proteasestabileren Zellwand lysierenden Enzyme auch weitere Austauschvarianten, die in Spalte 3 genannt sind. Tabelle 2 Aminosäure im Wildtyp Konservativer Austausch Weitere Austauschmöglichkeiten A (Ala) S T, G, V, E, D N (Asn) Q, D K, H, I, T, S, A D (Asp) E, N A, G, S R (Arg) K S, Q, A C (Cys) S M, G, A E (Glu) D, Q A, G, S, A Q (Gln) N, E H, L, R, A G (Gly) A S, N, D H (His) Q, N R, A I (Ile) V, L T, A L (Leu) V, I M, F, A K (Lys) R N, T, S, Q, A M (Met) L K, V, I, C, A F (Phe) Y L, I, M, A P (Pro) A S, Q S (Ser) A, T G, N, K T (Thr) S, A V, K, N W (Trp) Y F, S, R, A Y (Tyr) F H, N, C, A V (Val) I, A L, T In order to destabilize the stability, structure and function of the polypeptides according to the invention as little as possible, the amino acids to be exchanged are replaced from the protease recognition sequence by amino acids which are as close as possible to their structure and biochemistry and yet are not recognized by the protease. It is now common knowledge to classify the 20 naturally occurring amino acids into particular groups that differ in their biochemistry (eg, acidic, basic, hydrophobic, polar, aromatic amino acids) but within which the amino acids are related. Preferred substitutions for the amino acids in the enzymes of the invention are summarized in Table 2. The substitutions listed in column 2 represent conservative amino acid alternatives which, either structurally and / or functionally, are particularly similar to the wild-type amino acid. These are particularly preferred exchange variants. However, it is also possible for the protease-stable cell wall lysing enzymes according to the invention also other exchange variants, which are mentioned in column 3. Table 2 Amino acid in wild type Conservative exchange Further exchange possibilities A (Ala) S T, G, V, E, D N (Asn) Q, D K, H, I, T, S, A D (Asp) E, N A, G, S R (Arg) K S, Q, A C (Cys) S M, G, A E (Glu) D, Q A, G, S, A Q (Gln) N, E H, L, R, A G (Gly) A S, N, D H (His) Q, N R, A I (Ile) V, L T, A L (Leu) V, I M, F, A K (Lys) R N, T, S, Q, A M (Met) L K, V, I, C, A F (Phe) Y L, I, M, A P (Pro) A S, Q S (Ser) A, T G, N, K T (Thr) S, A V, K, N W (Trp) Y F, S, R, A Y (Tyr) F H, N, C, A V (Val) I, A L, T

Eine weitere Möglichkeit zu bestimmen, welche Aminosäure anstelle der zu substituierenden eingebaut wird, stellt die Dayhoff-Matrix dar; siehe z. B. in Creighton ( Proteins: Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., 1984, Freeman, New York ). Aus Untersuchungen homologer Proteine ist bekannt, dass die rein statistisch zufällige Mutation auf Nukleinsäureebene sich nicht in der Aminosäuresequenz der entsprechenden Proteine widerspiegelt. Es scheint somit für bestimmte Aminosäurepositionen in den homologen Proteinen ein Selektionsdruck auf bestimmte Aminosäuren zu bestehen, was in der Dayhoff-Matrix angegeben ist.Another way to determine which amino acid will be incorporated in place of the one to be substituted is the Dayhoff matrix; see, for. In Creighton ( Proteins: Structure and Molecular Properties, 2nd ed., 1984, Freeman, New York ). From studies of homologous proteins it is known that the purely random random mutation on nucleic acid level is not reflected in the amino acid sequence of the corresponding proteins. Thus, for certain amino acid positions in the homologous proteins, there appears to be a selection pressure on certain amino acids, as indicated in the Dayhoff matrix.

Eine weitere Möglichkeit zu bestimmen, welche Aminosäure anstelle der zu substituierenden eingebaut wird, bedient sich der Hilfe von Sequenzanalyseprogrammen z. B. des Programms BLAST, siehe Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403–410 . Damit kann nach verwandten Proteinen zu den zu mutierenden Zellwand lysierenden Enzymen gesucht werden. Der Suchalgorithmus findet dabei Ähnlichkeiten auf Sequenzebene. Wird auf Aminosäuresequenzebene gesucht ist das Programm „Protein BLAST" geeignet funktionale und/oder evolutionäre Verwandtschaften aufzeigen. Findet man in einem Bereich von etwa 100 oder 50 oder 20 Aminosäuren als Grenze um die potentielle Proteaseschnittstelle in nah Verwandten Proteinen Aminosäurevarianten mit mindestens etwa 60% oder mindestens etwa 80% oder mindestens etwa 90% Identität, kann die Aminosäuresequenz, die von der Proteaseerkennungssequenz abweicht, in das erfindungsgemäße Polypeptid eingebaut werden. Die Aminosäuresubstitutionen können dabei von den in Tabelle 2 aufgeführten Austauschmöglichkeiten abweichen.Another way to determine which amino acid is inserted in place of the substituted, using the help of sequence analysis programs z. B. the program BLAST, see Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403-410 , It is thus possible to search for related proteins for the enzymes to be mutated in the cell wall to be mutated. The search algorithm finds similarities at the sequence level. When searched at the amino acid sequence level, the protein BLAST program is likely to show functional and / or evolutionary relationships If amino acid variants of at least about 60% or more are found in a range of about 100 or 50 or 20 amino acids as the border around the potential protease cleavage site in closely related proteins At least about 80% or at least about 90% identity, the amino acid sequence which differs from the protease recognition sequence can be incorporated into the polypeptide of the invention.The amino acid substitutions may differ from the exchange possibilities listed in Table 2 here.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Polypeptid in einer oder mehreren Thrombinerkennungssequenzen modifiziert. Dabei wird das der mit R bezeichnete Aminosäurerest an Position P1 vorzugsweise gegen den mit K bezeichneten Aminosäurerest ausgetauscht. Ein Austausch gegen S, Q oder A ist ebenfalls bevorzugt. In der ersten Variante der Thrombinerkennungssequenz (G; R; G) können zusätzlich oder alternativ zum Austausch des R die beiden G oder nur eines davon gegen vorzugsweise A ausgetauscht werden. In der zweiten Variante der Thrombinerkennungssequenz (P; R; nicht D, E; nicht D, E) wird ebenfalls vorzugsweise das R gegen ein K oder gegen ein S, Q oder A ausgetauscht. Zusätzlich oder als Alternative kann das P an Position P2 gegen ein A, ein S oder Q ausgetauscht werden. Ferner können zusätzlich oder als Alternative eine oder beide Positionen P1' und P2' mit einem D oder E substituiert werden.In a preferred embodiment, the polypeptide of the invention is modified in one or more thrombin recognition sequences. In this case, the amino acid residue designated R at position P1 is preferably exchanged for the amino acid residue designated K. An exchange for S, Q or A is also preferred. In the first variant of the thrombin recognition sequence (G; R; G), in addition or as an alternative to the replacement of the R, the two Gs or only one of them can be exchanged for preferably A. In the second variant of the thrombin recognition sequence (P; R; not D, E, not D, E), it is also preferable to exchange the R for a K or for an S, Q or A. Additionally or alternatively, the P at position P2 may be replaced with an A, an S or a Q. Furthermore, in addition or alternatively one or both positions P1 'and P2' are substituted with a D or E.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind aufgeführt in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 und 5.Especially preferred embodiments are listed in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 and 5.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeführten Aminosäuresubstitutionen können mit Hilfe von molekularbiologischen Standardtechniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind und z. B. in Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual; 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 , aufgeführt sind. So können mit Hilfe von DNA-Primern in die DNA-Sequenz, die die erfindungsgemäßen Polypeptide codieren, die gewünschten Mutationen eingebaut werden. Die so erhaltenen modifizierten DNA-Sequenzen können dann in einem geeigneten Wirt, vorzugsweise E. coli, exprimiert und die Polypeptide aufgereinigt werden. Die DNA-Sequenz codierend die erfindungsgemäßen Polypeptide kann ferner mit dem sogenannten Codon-Usage an die entsprechende Wirtszelle angepasst werden, um eine bessere Expression zu erzielen. Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Nukleinsäuresequenz codierend die erfindungsgemäßen Polypeptide, entsprechende Expressionsvektoren und Wirtszellen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide.The amino acid substitutions introduced in the context of the present invention can be carried out with the aid of standard molecular biological techniques which are known to the person skilled in the art and are described by way of example. In Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual; 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 , are listed. Thus, by means of DNA primers in the DNA sequence encoding the polypeptides of the invention, the desired mutations can be incorporated. The modified DNA sequences thus obtained can then be expressed in a suitable host, preferably E. coli, and the polypeptides purified. The DNA sequence encoding the polypeptides of the invention can be further adapted with the so-called codon Usage to the corresponding host cell in order to achieve better expression. The present invention thus relates to the nucleic acid sequence encoding the polypeptides of the invention, corresponding expression vectors and host cells for the production of polypeptides of the invention.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können mit verschiedenen Tests auf Proteaseempfindlichkeit und/oder Enzymaktivität untersucht werden. Beispiele für solche Test sind Proteaseverdau und anschließende Auftrennung der Fragmente über SDS-Gelelektrophorese, Massenspektrometrie, Zelllysetest auf Agarplatten, Flüssiglysetest durch Messung der Lichtstreuung im Photometer, Zymogrammassay zum Aktivitätstest auf Gelen.The polypeptides of the invention can with various tests for protease sensitivity and / or enzyme activity to be examined. Examples of such tests are protease digestion and subsequent separation of the fragments via SDS gel electrophoresis, mass spectrometry, cell lysis test on agar plates, liquid lysis test by measuring the light scattering in the photometer, zymogram assay for Activity test on gels.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im medizinischen, therapeutischen, umwelttechnischen, kosmetischen oder Lebensmittelbereich eingesetzt werden.The polypeptides of the invention can in the medical, therapeutic, environmental, cosmetic or food sector.

Bei der Modifikation der Erkennungsstellen wird dabei vorzugsweise die Erkennungsstelle solcher Proteasen modifiziert, die in dem gewünschten Anwendungsgebiet erfahrungsgemäß vorkommen. So ist bekannt, dass im Menschen oder im Tier z. B. die Caspasen, Thrombin, Granzyme B, Enterokinase, Faktor Xa vorkommen. Ferner können darüber hinaus Proteasen aus pathogenen Bakterien vorliegen, die eine Infektion im Mensch oder Tier auslösen oder als Begleitflora mit vorhanden sind. Dazu zählen z. B. die V8 Protease aus Staphylococcus oder Clostridiopeptidase B aus Clostridien. Sollen die erfindungsgemäßen Polypeptide in der Therapie solcher Infektionen verwendet werden, werden vorzugsweise die Erkennungsstellen für die Proteasen modifiziert, die in den Bakterien vorliegen, die für eine zu therapierende Infektion verantwortlich sind. Ein Anwendungsgebiet für Zellwand lysierende Enzyme ist die topische Anwendung in Wunden in Form von Salben, Cremes, Tinkturen oder Wundabdeckungen wie Verbänden oder Bandagen, z. B. bei einer Infektion durch Staphylokokken oder Clostridien. Zusätzliche Stabilitätsprobleme für die Zellwand lysierenden Enzyme können dadurch auftreten, dass in der Wundversorgung teilweise Medikamente oder medizinische Produkte verwendet werden, die ebenfalls Proteasen enthalten. Beispielsweise wird bei Wunden der Haut versucht, eine sanfte Wundreinigung durch Fibrinolyse zu erreichen. Beispiele für Proteasen, die in der Wundversorgung eingesetzt werden sind Fibrinolysin, Plasmin, Streptokinase, Clostridiopeptidase A und Bacillus subtilis Protease. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide ebenfalls Modifikationen der Erkennungsstellen für diese Proteasen auf.at the modification of the recognition sites is preferably the Receptor of such proteases modified in the desired Application occur according to experience. So is known that in humans or animals z. The caspases, thrombin, Granzyme B, enterokinase, factor Xa occur. Furthermore, can moreover, proteases from pathogenic bacteria are present, which trigger an infection in humans or animals or as Accompanying flora are present with. These include z. B. the V8 Protease from Staphylococcus or Clostridiopeptidase B from Clostridia. Should the polypeptides of the invention in therapy such infections are preferably the recognition sites modified for the proteases present in the bacteria, responsible for an infection to be treated are. A field of application for cell wall lysing enzymes is the topical application in wounds in the form of ointments, creams, Tinctures or wound dressings such as dressings or bandages, z. B. in an infection by staphylococci or clostridia. Additional stability issues for the Cell wall lysing enzymes can occur by that in the wound care partial medication or medical products used, which also contain proteases. For example is tried on wounds of the skin, a gentle wound cleansing through To achieve fibrinolysis. Examples of proteases that used in wound care are fibrinolysin, plasmin, Streptokinase, clostridiopeptidase A and Bacillus subtilis protease. Preferably, the polypeptides of the invention also modifications of the recognition sites for these Proteases on.

In der Lebensmittel-, Umwelt- und Kosmetikindustrie können ebenfalls eine Vielzahl von Proteasen vorliegen, die entweder von Bakterien produziert werden, die z. B. in der Lebensmittelherstellung verwendet werden wie Laktobazillen, Lactococcen oder verschiedene Bazillenstämme, oder die von unerwünschten Keimen, die lysiert werden sollen, ausgeschieden werden (z. B. B. cereus, B. subtilis, Cl. perfringens, Cl. botulinum). Zusätzlich sind auch in den Lebensmitteln selbst Proteasen vorhanden. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide solche Modifikationen der Erkennungsstellen von Proteasen auf, die in der Lebensmittel-, Umwelt- und Kosmetikindustrie vorkommen.In food, environmental and cosmetics industries also a variety of proteases are present either from Bacteria are produced, the z. B. in food production can be used as lactobacilli, lactococci or various Bacteria strains, or those of unwanted germs, which are to be lysed (eg B. cereus, B. subtilis, Cl. perfringens, Cl. botulinum). additionally Proteases are also present in the foods themselves. Preferably the polypeptides of the invention have such Modifications of the recognition sites of proteases found in the Food, environmental and cosmetics industries.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das erfindungsgemäße Polypeptid als Arzneimittel sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids als Arzneimittel zur Prävention oder Therapie von Erkrankungen, die durch gram positive Bakterien insbesondere Clostridien, Bazillen, Listerien, Staphylokokken, Lactobazillen, Enterokokken, Aerokokken, Pediokokken, Streptokokken, Mycoplasmen und/oder Leuconostoc hervorgerufen werden.The The present invention further relates to the invention Polypeptide as a medicament and the use of the inventive Polypeptides as a medicament for prevention or therapy of diseases caused by gram positive bacteria in particular Clostridia, bacilli, listeria, staphylococci, lactobacilli, Enterococci, aerococci, pediococci, streptococci, mycoplasma and / or Leuconostoc.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids zur Unterdrückung des Wachstums von gram positiven Bakterien in der Umwelt-, Lebensmittel- oder Kosmetikindustrie.About that In addition, the present invention relates to the use of the invention Polypeptides to suppress the growth of gram positive Bacteria in the environmental, food or cosmetics industry.

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, sind jedoch nicht als einschränkend aufzufassen.The The following embodiments serve to explain of the invention, however, are not to be construed as limiting.

Beispiel 1: Proteaseverdau von PlyPitti26Example 1: Protease digestion of PlyPitti26

Es wurde ein Verdau von PlyPitti26 mit den Proteasen Thrombin und V8 durchgeführt. Jeweils 90 μl Proteinlösung (Proteinkonzentration 1,35 mg/ml) wurden mit 10 μl Thrombin und in Kontrollansätzen Plasmin versetzt. Für den V8 Protease Verdau wurden 99 μl Proteinlösung und 1 μl Proteaselösung verwendet. Die Proteasestammlösungen waren jeweils 500 μg/ml. Die Probenansätze wurden über Nacht bei 25°C in einem 20 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO₄ Puffer inkubiert. Ein Teil der Proben wurde mit SDS-Gel-Auftragspuffer versetzt und nach Aufkochen auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert.Digestion of PlyPitti26 with the proteases thrombin and V8 was performed. In each case 90 .mu.l protein solution (protein concentration 1.35 mg / ml) were mixed with 10 .mu.l of thrombin and in control plasmin. For the V8 protease digestion, 99 μl of protein solution and 1 μl of protease solution were used. The protease stock solutions were each 500 μg / ml. The samples were incubated overnight at 25 ° C. in a 20 mM Tris / HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO ₄ buffer. A portion of the samples were spiked with SDS gel loading buffer and analyzed after boiling on SDS-polyacrylamide gels.

Es wurde festgestellt, dass PlyPitti26 durch Thrombin vollständig abgebaut wird, wobei zwei relativ große Proteinfragmente entstanden, von denen das eine die CHAP-Domäne enthielt und das andere die Amidase-Domäne und die CBD. Bei einem Verdau mit V8 Protease entstanden mehrere kleinere, aber ebenfalls definierte Proteinfragmente. Bei einem Kontrollverdau mit Plasmin erfolgte unter den gegebenen Bedingungen keine Fragmentierung des Proteins. Die Ergebnisse sind in 2A gezeigt.It was found that PlyPitti26 is completely degraded by thrombin, resulting in two relatively large protein fragments, one containing the CHAP domain and the other containing the amidase domain and the CBD. Digestion with V8 protease produced several smaller but also defined protein fragments. In a control with plasmin no fragmentation of the protein took place under the given conditions. The results are in 2A shown.

Beispiel 2: Aktivitätstest von unbehandeltem und mit Proteasen behandeltem PlyPitti26Example 2: Activity Test of untreated and protease-treated PlyPitti26

In weiteren Versuchen wurden die Proben im Flüssiglysetest auf die Lyseaktivität gegenüber Staphylococcus Zellen getestet. Der Flüssiglysetest ist ein Aktivitätstest für Zellwand lysierende Enzyme, bei dem die bakterielle Zelllyse in Echtzeit über Lichtstreuung im Photometer gemessen wird. Die Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm ist dabei ein Maß für die Anzahl an vorhandenen Bakterienzellen. Lysieren die Bakterienzellen wird die Probenlösung nach und nach klar und die gemessene Absorption nimmt im Idealfall bis auf einen Wert von Null ab. Staphylococcus Bakterien werden in BHI-Medium bis zu einer OD₆₀₀ von ungefähr 0,8 kultiviert. Die nicht hitzeinaktivierten Zellen werden geerntet und in TEST Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7.5, 60 mM NaCl, 0.1% Tween, 2 mM CaCl₂) resuspendiert mit einer OD₆₀₀ von ungefähr 1. 990 μl Zellsuspension wird jeweils mit 10 μl Enzymlösung versetzt (Enzymkonzentration im Test 10 μg/ml) und bei 30°C die Abnahme der Absorption bei 600 nm verfolgt.In further experiments, the samples were tested in the liquid lysis test for the lysis activity against Staphylococcus cells. The liquid lysis test is an activity test for cell wall lysing enzymes in which bacterial cell lysis is measured in real time via light scattering in the photometer. The absorption at a wavelength of 600 nm is a measure of the number of existing bacterial cells. When the bacterial cells lyse, the sample solution gradually becomes clear and the measured absorbance ideally decreases to a value of zero. Staphylococcus bacteria are cultured in BHI medium to an OD ₆₀₀ of approximately 0.8. The nonheat inactivated cells are harvested and resuspended in TEST buffer (20mM Tris / HCl pH 7.5, 60mM NaCl, 0.1% Tween, 2mM CaCl ₂ ) with an OD ₆₀₀ of approximately 1. 990μl of cell suspension is each loaded with 10μl of enzyme solution shifted (enzyme concentration in the test 10 ug / ml) and monitored at 30 ° C, the decrease in absorbance at 600 nm.

Es wurde festgestellt, dass bei nicht verdautem PlyPitti26 und bei der Plasminkontrolle nach etwa 1000 s eine vollständige Lyse der Staphylokokken eingetreten ist, während bei den mit Thrombin und V8 Protease verdauten Proben praktisch keine Zelllyse mehr stattfindet, das Zellwand lysierende Enzym also vollständig inaktiviert wurde. Die Ergebnisse sind in 2B gezeigt.It was found that in non-digested PlyPitti26 and in the plasma control after about 1000 s complete lysis of staphylococci has occurred, while in the thrombin and V8 protease digested samples virtually no cell lysis takes place, the cell wall lysing enzyme was thus completely inactivated. The results are in 2 B shown.

Beispiel 3. Stabilisierung von CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USAExample 3. Stabilization of CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA

Eine gegen Staphylokokken wirksame synthetisch hergestellte Endolysinvariante, die aus den enzymatisch aktiven Domänen CHAP und Ami des Endolysins von PlyPitti26 besteht und aus der Zellwand bindenden Domäne (CBD) des Endolysins des Prophagen Φ SA2USA, der aus dem Genom des MRSA Stamms USA300 stammt ( Diep et al., The Lancet, 2006, 367, 731–739 ; Datenbank Zugangsnummer NC_007793) wird als CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA bezeichnet.A staphylococcal synthetically produced endolysin variant consisting of the enzymatically active domains CHAP and Ami of the endolysin of PlyPitti26 and of the cell wall binding domain (CBD) of the endolysin of the prophage ΦSA2USA derived from the genome of the MRSA strain USA300 ( Diep et al., The Lancet, 2006, 367, 731-739 ; Database accession number NC_007793) is referred to as CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA.

Um dises Protein gegen Thrombinverdau und Verdau durch V8 Protease zu stabilisieren wurden mittels zielgerichteter Mutagenese sowohl die Thrombin-Schnittstelle als auch die im Linker zwischen CHAP- und Amidase-Domäne liegenden V8-Schnittstellen durch Aminosäuresubstitutionen modifiziert. Die zu diesem Zweck durchgeführten erfindungsgemäßen Einzel- und Doppel- und Vierfachmutationen sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3 Mutante Schnittstelle V8: V8 Protease T: Thrombin Austausch 1 E163 (V8) R167 (T) 163Q 167K 2 E163 (V8) R167 (T) 163Q 167A 3 E163 (V8) R167 (T) 163A 167K 4 E163 (V8) R167 (T) 163A 167A 5 E179 (V8) 179Q 6 E179 (V8) 179A 7 E189 (V8) 189Q 8 E189 (V8) 179A 9 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163Q 167A 179Q 189Q 10 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163Q 167A 179A 189Q 11 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163A 167A 179Q 189Q 12 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163A 167A 179A 189Q 13 R167 (T) 167A 14 E163 (V8) 163A To stabilize this protein against thrombin digestion and digestion by V8 protease, both the thrombin cleavage site and the V8 cleavage site in the linker between CHAP and amidase domains were modified by amino acid substitutions by site-directed mutagenesis. The single and double and quadruple mutations according to the invention carried out for this purpose are summarized in Table 3. Table 3 mutant Interface V8: V8 Protease T: thrombin exchange 1 E163 (V8) R167 (T) 163Q 167K 2 E163 (V8) R167 (T) 163Q 167A 3 E163 (V8) R167 (T) 163A 167K 4 E163 (V8) R167 (T) 163A 167A 5 E179 (V8) 179Q 6 E179 (V8) 179A 7 E189 (V8) 189Q 8th E189 (V8) 179A 9 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163Q 167A 179Q 189Q 10 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163Q 167A 179A 189Q 11 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163A 167A 179Q 189Q 12 E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163A 167A 179A 189Q 13 R167 (T) 167A 14 E163 (V8) 163A

Ein Thrombinverdau von Mutante 4 aus Tabelle 3 und dem nicht modifizeirten CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA ist in 3A gezeigt.Thrombin digestion of mutant 4 of Table 3 and the unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA is described in 3A shown.

Die Endolysine wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in den Verdau eingesetzt. Für den Thrombinverdau wurden 90 μl Protein und 10 μl humanes Thrombin (Stammlösung mit 50 μg/ml) eingesetzt. Die Probenansätze wurden über Nacht bei 25°C in folgendem Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO₄) inkubiert. Ein Teil der Proben wurde mit SDS-Gel-Auftragspuffer versetzt und nach Aufkochen auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Die Mutation von R an Position 167 gegen A führt zu einer vollständigen Insensibilisierung gegen Thrombin.The endolysins were used in the digest at a concentration of 1 mg / ml. For thrombin digestion, 90 μl of protein and 10 μl of human thrombin (stock solution with 50 μg / ml) were used. The samples were incubated overnight at 25 ° C. in the following buffer (20 mM Tris / HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO ₄ ). A portion of the samples were spiked with SDS gel loading buffer and analyzed after boiling on SDS-polyacrylamide gels. Mutation of R at position 167 to A leads to complete insensitization to thrombin.

Nicht modifizeirtes CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA und Mutante 4 wurden ebenfalls mit V8 Protease verdaut. Die Endolysine wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in den Verdau eingesetzt. Für den V8 Protease Verdau wurden 99 μl Protein und 1 μl V8 Protease (Stammlösung mit 500 μg/ml) eingesetzt. Die Probenansätze wurden für 15 min bzw. 60 min in 20 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO₄ Puffer inkubiert. Ein Teil der Proben wurde mit SDS-Gel-Auftragspuffer versetzt und nach Aufkochen auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Die Mutation von E an Position 163 gegen A führt zwar nicht zu einer vollständigen Insensibilisierung gegenüber V8 Protease, jedoch ist die erfindungsgemäße Mutante gegenüber dem Wildtyp, bei dem ein vollständiger Verdau eintritt, deutlich stabilisiert. Bei der modifizierten Polypeptid sind sowohl nach 15 min als auch nach 60 min noch zwei Fragmente von etwa 40 kDa vorhanden, die bei dem nicht modifizeirten Polypeptid nach 15 min nur noch schwach und nach 60 mm gar nicht mehr vorhanden sind. Das ergebnis des V8 Proteaseverdau ist in 3B gezeigt.Unmodified CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA and mutant 4 were also digested with V8 protease. The endolysins were used in the digest at a concentration of 1 mg / ml. For the V8 protease digestion, 99 μl of protein and 1 μl of V8 protease (stock solution of 500 μg / ml) were used. The samples were incubated for 15 min or 60 min in 20 mM Tris / HCl pH 7.5, 10 mM DTE, 0.1 mM ZnSO ₄ buffer. A portion of the samples were spiked with SDS gel loading buffer and analyzed after boiling on SDS-polyacrylamide gels. While the mutation of E at position 163 against A does not result in complete insensitization to V8 protease, however, the mutant of the present invention is clearly stabilized over the wild type in which complete digestion occurs. In the case of the modified polypeptide, two fragments of about 40 kDa are present both after 15 min and after 60 min, which after 15 min are only weakly present in the unmodified polypeptide and no longer present after 60 min. The result of the V8 protease digestion is in 3B shown.

Beispiel 4. Lysetest mit Proteasesensitiven und Proteaseresistenten EndolysinenExample 4. Lysis test with protease sensitive and protease resistant endolysins

Um zu untersuchen, ob die erfindungsgemäßen Polypeptide nach den Aminosäureaustauschen noch die gewünschte Aktivität besitzen, wurden sie in einem Plattenlysetest mit verschiedenen Staphylococcus Stämmen getestet. Die Bakterienstämme wurden über Nacht in 5 ml Kulturen in BHI-Medium angezogen und die Bakterienzellen 5 mm bei 4000 UpM in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Das Zellpellet wurde anschließend in 200 μl PBS-Puffer (10 mM NaPhosphat, 144 mM NaCl, 50 mM KCl, pH 7,4) resuspendiert und die Zellen 30 min bei 80°C hitzeinaktiviert. Die hitzeinaktivierten Zellen wurden mit 15 ml Topagar in Petrischalen gegossen und getrocknet. Anschließend wurden jeweils 5 μg Protein aufgetüpfelt und die Agarplatten für 1 h bei 30°C inkubiert. Enstehende Zelllysehöfe an den Stellen der aufgetüpfelten Proteine wurden visuell ausgewertet und je nach Größe mit +++, ++ und + bewertet oder mit -, falls keine Lyse auftrat.Around to investigate whether the polypeptides of the invention after the amino acid exchange nor the desired Have activity, they were in a plate lysis test tested with different Staphylococcus strains. The Bacterial strains were overnight in 5 ml cultures grown in BHI medium and the bacterial cells 5 mm at 4000 rpm centrifuged in the table centrifuge. The cell pellet was subsequently in 200 μl of PBS buffer (10 mM Na phosphate, 144 mM NaCl, 50 mM KCl, pH 7.4) and the cells are re-suspended for 30 min at 80 ° C heat inactivated. The heat-inactivated cells were washed with 15 ml Topagar poured into Petri dishes and dried. Subsequently 5 μg of protein were spotted and the Agar plates incubated for 1 h at 30 ° C. most Hende Zelllysehöfe in the places of the spotted Proteins were visually evaluated and depending on size rated +++, ++ and + or - if no lysis occurred.

Das Testergebnis für einige erfindungsgemäße Polyxpeptide ist in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4 Staphylococcus Spezies PlyPitti26 (nicht modifiziert) Mutante 10 aus Tabelle 3 (E163Q, R167A, E179A, E189Q) Mutante 4 aus Tabelle 3 (E163A, R167A) CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (nicht modifiziert) Staphylococcus aureus MRSA +++ +++ +++ +++ Staphylococcus aureus MRSA +++ +++ +++ +++ Staphylococcus aureus MRSA ++ +++ +++ +++ Staphylococcus epidermis +++ +++ +++ +++ Staphylococcus equorum + ++ ++ ++ Staphylococcus sciuri - ++ + ++ Staphylococcus saprophyticus - +++ ++ +++ Staphylococcus sciuri - - - - Staphylococcus aureus MRSA +++ +++ +++ +++ Staphylococcus epidermidis +++ +++ +++ +++ Staphylococcus epidermidis koagulase-negativ ++ ++ ++ ++ Staphylococcus haemolyticus koagulase-negativ ++ ++ ++ ++ Staphylococcus epidermidis koagulase-negativ +++ +++ +++ +++ The test result for some polyxpeptides according to the invention is summarized in Table 4. Table 4 Staphylococcus species PlyPitti26 (not modified) Mutant 10 from Table 3 (E163Q, R167A, E179A, E189Q) Mutant 4 from Table 3 (E163A, R167A) CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA (not modified) Staphylococcus aureus MRSA +++ +++ +++ +++ Staphylococcus aureus MRSA +++ +++ +++ +++ Staphylococcus aureus MRSA ++ +++ +++ +++ Staphylococcus epidermis +++ +++ +++ +++ Staphylococcus equorum + ++ ++ ++ Staphylococcus sciuri - ++ + ++ Staphylococcus saprophyticus - +++ ++ +++ Staphylococcus sciuri - - - - Staphylococcus aureus MRSA +++ +++ +++ +++ Staphylococcus epidermidis +++ +++ +++ +++ Staphylococcus epidermidis coagulase negative ++ ++ ++ ++ Staphylococcus haemolyticus coagulase negative ++ ++ ++ ++ Staphylococcus epidermidis coagulase negative +++ +++ +++ +++

Sowohl die nicht modifizierten PlyPitti26 als auch CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA weisen ein breites Lysespektrum gegenüber verschiedenen Staphylococcus Stämmen auf, wobei das CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA eine etwas bessere Lyseaktivität zeigt. Die beiden in der Tabelle gezeigten erfindungsgemäßen modifizierten Polypeptide Modul 4 und Modul 10 mit den Aminosäureaustauschen an der Thrombin- bzw. verschiedenen V8 Proteaseschnittstellen weisen eine praktisch identische Aktivität wie das nicht modifizierte Protein CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA auf. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Mutationen die Aktivität der Zellwand lysierenden Enzyme nicht negativ beeinflussen.Either the unmodified PlyPitti26 as well as CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA have a broad lysis spectrum over different ones Staphylococcus strains, the CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA shows a slightly better lysis activity. The two in the Table shown modified according to the invention Polypeptides Module 4 and Module 10 with the amino acid substitutions at the thrombin or different V8 protease cleavage sites a virtually identical activity as the unmodified one Protein CHAP-Ami_Pitti26-CBD_USA. This shows that the invention Mutations the activity of cell wall lysing enzymes do not negatively influence.

Beispiel 5: Modifizierte Zellwand bindende Enzyme gegen Clostridium difficileExample 5: Modified cell wall binding Enzymes against Clostridium difficile

Zwei Endolysine aus verschiedenen Cl. difficile Phagen (Zugangsnummern YP_529586 für das Endolysin aus dem Phagen Φ CD119 und YP_001087453 für das Endolysin aus dem Stamm Cl. difficile 630) weisen eine singuläre Caspase 1 Schnittstelle nach Aminosäure D214 auf, wohingegen eine singuläre Thrombinschnittstelle nur bei dem Endolysin aus dem Phagen Φ CD119 an Position 87 auftritt. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit der beiden Endolysine, wurde neben den Modifikationen der Caspase 1 Schnittstellen von D214 zu E214 beim Φ CD119 Endolysin R an Position 87 durch K ausgetauscht, das in dem homologen Endolysin aus dem Stamm Cl. difficile 630 an dieser Position vorhanden ist und von Thrombin nicht als Schnittstelle erkannt wird. Weitere erfindungsgemäße Modifikationen sind in Tabelle 2 dargestellt.Two endolysins from different Cl. difficile phages (accession numbers YP_529586 for the endolysin from the phage Φ CD119 and YP_001087453 for the endolysin from the strain Cl. difficile 630) have a singular caspase 1 site after amino acid D214, whereas a unique thrombin site only occurs at the endolysin from the phage Φ CD119 at position 87 occurs. Due to the high sequence similarity of the two endolysins, in addition to the modifications of the caspase 1, one of D214 to E214 in the Φ CD119 endolysin R at position 87 replaced by K, which in the homologous endolysin from strain Cl. difficile 630 is present at this position and is not recognized by thrombin as an interface. Further modifications according to the invention are shown in Table 2.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows Sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can of the official publication platform of the DPMA become.

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

- US 6432444 B1 [0007]

Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Marchler-Bauer et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192-6 [0028]
-. Finn et al, 2006, Nucleic Acids Research 34, D247-D251 [0028]
Schultz et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, Letunic et al., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257-D260 [0028]
Gasteiger et al., Protein Identification and Analysis Tools to the ExPASy Server in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) [0031]
Marchler-Bauer et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192-6 [0039]
- Finn et al., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247-D251 [0039]
Schultz et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, Letunic et al., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257-D260 [0039]
- Proteins: Structure and Molecular Properties, 2nd ed., 1984, Freeman, New York [0041]
- Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403-410 [0042]
Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual; 2nd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 [0045]
Diep et al., The Lancet, 2006, 367, 731-739 [0057]

Claims

A modified polypeptide with the biological Activity to lyse cell walls of bacteria, wherein the polypeptide is not caspase, enterokinase, factor Xa, granzyme B, Staphylococcus peptidase I (V8 protease) and / or thrombin having.

The polypeptide of claim 1, wherein the polypeptide the biological activity has cell walls of gram to lyse positive bacteria.

The polypeptide of claim 2, wherein the bacteria is selected are from the group consisting of clostridia, bacilli, listeria, Staphylococci, lactobacilli, enterococci, aerococci, pediococci, Streptococci, mycoplasma and / or Leuconostoc.

Polypeptide according to one of the preceding claims, wherein the polypeptide is an endolysin, a bacteriophage tail protein, an autolysin or a bacteriocin is.

Polypeptide according to SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5.

Nucleic acid encoding with a sequence for a polypeptide according to any one of claims 1 until 5.

Expression vector comprising a nucleic acid according to claim 6.

Host cell containing the nucleic acid according to Claim 6 or the expression vector according to claim 7.

Polypeptide according to one of claims 1 to 5 as a medicine.

Use of the polypeptide of any one of the claims 1 to 5 as a medicament for the prevention or therapy of Diseases caused by gram-positive bacteria, in particular clostridia, Bacilli, listeria, staphylococci, lactobacilli, enterococci, Aerococci, pediococci, streptococci, mycoplasmas and / or Leuconostoc be caused.

Use of the polypeptide of any one of the claims 1 to 5 to suppress the growth of gram positive Bacteria in the environmental, food or cosmetics industry.